ES2325044T3 - Metodos para la clonacion de cdna entero. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE PROCEDIMIENTOS PARA LA SINTESIS Y LA CLONACION DE ADNC DE LONGITUD COMPLETA, O DE FRAGMENTOS DE ADNC, QUE SE CORRESPONDEN CON LA SECUENCIA COMPLETA DE LOS EXTREMOS 5 TERMINALES DE MOLECULAS DE ARNM. EL PROCEDIMIENTO DE LA PRESENTE INVENCION INCLUYE PONER EN CONTACTO EL ARN CON UN CEBADOR DE SINTESIS DE ADNC QUE PUEDE ASOCIARSE CON EL ARN, UNA ENZIMA ADECUADA QUE POSEE ACTIVIDAD TRANSCRIPTASA INVERSA, Y UN OLIGONUCLEOTIDO ACTIVADOR DE MOLDES EN UNAS CONDICIONES SUFICIENTES PARA PERMITIR LA EXTENSION DEPENDIENTE DE MOLDE DEL CEBADOR PARA GENERAR UN HIBRIDO DE ARNM - ADNC. EL OLIGONUCLEOTIDO ACTIVADO DE MOLDES SE HIBRIDA CON EL SITIO CAP EN EL EXTREMO 5 TERMINAL DE LA MOLECULA DE ARN Y SIRVE COMO UN MOLDE EXTENDIDO Y CORTO PARA LA EXTENSION DEPENDIENTE DE CAP DEL EXTREMO 3 TERMINAL DEL ADNC MONOCATENARIO QUE ES COMPLEMENTARIO CON EL OLIGONUCLEOTIDO ACTIVADOR DE MOLDES. EL ADNC MONOCATENARIO DE LONGITUD COMPLETA RESULTANTE INCLUYE EL EXTREMO 5 TERMINAL COMPLETO DELA MOLECULA DE ARN, ASI COMO LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA AL OLIGONUCLEOTIDO ACTIVADOR DE MOLDES, QUE ENTONCES PUEDE SERVIR COMO UN SITIO CEBADOR UNIVERSAL EN LA POSTERIOR AMPLIFICACION DEL ADNC. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN TRATA DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS ACTIVADORES DE MOLDES QUE PUEDEN UTILIZARSE SEGUN EL PRESENTE PROCEDIMIENTO. DENTRO DEL ALCANCE DE LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE INCLUYEN ESTUCHES DE ENSAYO QUE CONTIENEN EL OLIGONUCLEOTIDO ACTIVADOR DE MOLDES.
Description
Métodos para la clonación de cDNA entero.
La presente invención se refiere a una
tecnología mejorada para sintetizar selectivamente cDNA de longitud
completa que tiene información secuencial total sobre mRNA de
longitud completa.
Una tecnología básica en el campo de la biología
molecular es la conversión de poli(A)+RNA (mRNA) en DNA
complementario (cDNA) de doble cadena (ds; del inglés,
double-stranded), el cual puede ser luego insertado en
un vector de clonación para generar un banco de cDNA o la expresión
en una célula huésped apropiada. Los progresos en la tecnología
para construcción de bancos de cDNA han hecho posible el
descubrimiento y la producción de una gran variedad de proteínas
biológicamente importantes.
En Methods in Enzymology (1987), volumen
152, redactado por Wu, se revisan en conjunto diversos
procedimientos para generar bancos de cDNA que han sido usados
durante los últimos 15 años. En su mayor parte, en las tecnologías
para construcción de bancos de cDNA se usa poli(A)+RNA como
material de partida. El poli(A)+RNA intacto se caracteriza
por una "cola" poliadenilada en su extremo 3' y por una
característica "estructura de caperuza (CAP) o sitio de
caperuza" en el extremo 5'. Un requisito crítico para la
construcción de bancos de cDNA es copiar completamente el
poli(A)+RNA hasta cDNA de longitud completa y conservar la
información secuencial total sobre la estructura de la proteína
codificada por el mRNA.
En un método generalizado y comúnmente utilizado
mediante el cual se copia el poli(A)+RNA hasta cDNA se emplea
transcriptasa inversa, que comienza en el extremo 3' del mRNA a
partir de un cebador de oligo-d(T) y continúa
hacia el extremo 5' para generar un híbrido de cDNA:mRNA (Gubler
et al., 1983). Después se separa del híbrido la cadena de
RNA por la acción de RNasa H, y luego se sintetiza una segunda
cadena de DNA usando DNA polimerasa I. La mezcla heterogénea
resultante de moléculas de cDNA ds puede ser luego clonada en
adecuadas moléculas vector de DNA recombinante usando una
diversidad de técnicas. Desafortunadamente, para la mayoría de los
mRNAs, este método no permite la síntesis de cDNA de "longitud
completa" porque la transcriptasa inversa no los puede copiar
eficazmente hasta cDNAs de longitud completa. La eficacia de la
copia es inversamente proporcional a la longitud del mRNA; por lo
tanto, el problema de la síntesis de cDNA de "longitud
completa" es más crítico para los mRNAs más largos. Además, con
la tecnología actual se pueden generar deleciones en los extremos 5'
y 3' del cDNA.
En un planteamiento alternativo, las colas de
poli(A) de las moléculas de mRNA son primero hibridadas a un
conector de oligo (dT) con DNA vector linealizado (cebador del
vector) (Okayama et al., 1982; Pruitt, Solicitud nº
89110816.9 de Patente Internacional). Luego, la primera cadena de
cDNA sintetizada por la transcriptasa inversa es añadida al extremo
3' por el oligo dt, lo que facilita la subsiguiente clonación por
circularización en el cebador del vector. Con este método también
se generan grandes cantidades de clones de cDNA que contienen cDNAs
truncados a causa de la síntesis de cDNA de longitud no
completa.
Como resultado de los inconvenientes que
resultan del uso de las tecnologías presentes para generar bancos
de cDNA convencionales, la mayoría de los clones de cDNA carecen de
secuencias próximas al extremo 5' de los mRNAs. Esto da lugar a la
pérdida de una importante información necesaria para producir
proteínas funcionales. Se han desarrollado dos procedimientos de
selección en los esfuerzos para enriquecer los bancos de cDNA en
cuanto a clones de cDNA de "longitud completa". En el
procedimiento de retención de CAP (CAPture), se usó la
proteína ligante de la caperuza (factor 4E eucariótico de
iniciación) en combinación con RNasa A para purificar híbridos de
cDNA:mRNA de longitud completa (Edery et al., 1995; Sonenberg
et al., Patente de EE.UU. nº 5.219.989). Los dúplex más
cortos que corresponden a fragmentos de cDNA de longitud no completa
no son seleccionados ya que la estructura de CAP del mRNA es
separada de la porción de RNA por tratamiento con nucleasa. Aunque
el método CAPture podría enriquecer potencialmente bancos de
cDNA en cuanto a clones que contienen los extremos 5' auténticos,
la producción de cDNAs de longitud completa es muy baja,
especialmente para cDNAs largos (1-5%). La baja
producción es una desventaja significativa de esta tecnología.
En el método de
"oligo-formación de caperuza"
(oligo-capping en inglés), la estructura de
CAP del mRNA es selectivamente sustituida por un
oligorribonucleótido, generándose de esta forma productos
intermedios quiméricos de oligonucleótido/mRNA de longitud completa
que son posteriormente utilizados para la síntesis de cDNAs de
longitud completa (Maruyama et al., 1994;
Fromomt-Racine et al., 1993; Kato et
al., Publicación nº 0.625.572 A1 de Patente Europea, Solicitud
nº 93921061.3). Sin embargo, este método es complicado, implicando
el tratamiento del mRNA con una fosfatasa alcalina, la eliminación
de la caperuza del mRNA con pirofosfatasa ácida de tabaco, y la
ligación del oligonucleótido al extremo 5' del mRNA mediante RNA
ligasa de T4. Estas múltiples operaciones enzimáticas degradan el
mRNA, generándose por ello fragmentos de cDNA incompletos para los
subsiguientes procedimientos de clonación. La distribución de
tamaños de los insertos de cDNA en los bancos de cDNA generados al
utilizar el método de "oligo-formación de
caperuza" es típicamente inferior a 3 kb. Ésta es mucho menor
que la distribución de tamaños del mRNA de longitud completa (Kato
et al., 1994) e indica la baja eficacia de la clonación de
cDNA de "longitud completa" mediante la tecnología de
"oligo-formación de caperuza".
Como se puede entender de lo precedente, los
métodos convencionales para construir bancos de cDNA que contengan
clones de cDNA de longitud completa están limitados por la baja
eficacia y por el uso de múltiples operaciones de larga duración.
En consecuencia, es muy deseable un método sencillo que genere cDNA
de longitud completa y alta calidad a partir de RNA.
La presente invención proporciona un método
ventajoso para la síntesis y clonación de cDNA de longitud completa,
o de fragmentos de cDNA, que corresponda a la secuencia total de
los extremos 5' de moléculas de mRNA. El método de la presente
invención comprende hibridar un cebador para síntesis de cDNA con
dicha molécula de RNA y sintetizar una primera cadena de cDNA con
una transcriptasa inversa para formar un producto intermedio de
RNA-cDNA; poner dicho producto intermedio de
RNA-cDNA en contacto con un oligonucleótido de
cambio de molde, en que dicho oligonucleótido de cambio de molde se
hibrida con el término de dicho producto intermedio de
RNA-cDNA que comprende el extremo 3' de dicha
primera cadena de cDNA y el extremo 5' de dicho RNA, dicho
oligonucleótido de cambio de molde sirve como molde para la
extensión de dicho extremo 3' de dicha primera cadena de cDNA, y
dicho oligonucleótido de cambio de molde tiene una preseleccionada
secuencia de nucleótidos arbitraria en su extremo 5' y al menos un
resto ribonucleotídico en su extremo 3'; y extender dicho extremo 3'
de dicha primera cadena de cDNA para
producir un DNA que es complementario de dicha molécula de RNA y dicho oligonucleótido de cambio de molde.
producir un DNA que es complementario de dicha molécula de RNA y dicho oligonucleótido de cambio de molde.
En la Figura 1 se muestra una representación de
un mecanismo de la tecnología de cambio de molde de acuerdo con la
invención objetivo.
En la Figura 2 se muestra una representación de
un procedimiento en que se utilizan los métodos y materiales de la
presente invención para clonar la secuencia 5' terminal del DNA de
longitud completa.
En la Figura 3 se muestra una representación de
métodos y materiales de la presente invención, basados en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés,
polymerase chain reaction), para la
construcción de bancos de cDNA de longitud completa de acuerdo con
la invención objetivo.
En la Figura 4 se muestra una representación de
la tecnología CAPswitch para construcción de bancos de cDNA de
longitud completa, basada en una estrategia de adaptador
PRE-cebador.
La invención objetivo trata de métodos para
construir bancos de cDNA a partir de nanogramos de RNA total o
poliA+RNA. También se describen composiciones para los mismos. Se
describen aquí las composiciones y métodos en que se emplean
oligonucleótidos de cambio de molde. El método de la presente
invención comprende poner RNA en contacto con un cebador que se
puede hibridar con RNA, una transcriptasa inversa, y un
oligonucleótido de cambio de molde bajo unas condiciones
suficientes para permitir la extensión, dependiente del molde, del
cebador hibridado para generar un híbrido de
mRNA-cDNA. El oligonucleótido de cambio de molde se
puede hibridar con el sitio de CAP del extremo 5' de la molécula de
RNA y sirve como un corto molde extendido para la extensión,
dependiente del CAP, del extremo 3' del cDNA de cadena sencilla (ss;
del inglés, single-stranded) que es complementario
del oligonucleótido de cambio de molde. El resultante cDNA ss de
longitud completa incluye el extremo 5' completo de la molécula de
RNA, así como la secuencia complementaria del oligonucleótido de
cambio de molde. La secuencia complementaria del oligonucleótido de
cambio de molde puede luego servir como un sitio de cebado universal
en la subsiguiente multiplicación del cDNA.
Específicamente, la invención objetivo
proporciona un método para la síntesis de cDNA de cadena sencilla
(ss) y longitud completa, o de fragmentos de cDNA ss, a partir de
RNA. El cDNA sintetizado mediante el método presente tiene una
secuencia ancla arbitraria en el extremo 3', seguida de una
secuencia de nucleótidos complementaria de la molécula de RNA a
partir del sitio de caperuza del mRNA. En una realización preferida,
el procedimiento de la invención objetivo comprende las operaciones
siguientes:
- 1.
- Incubar una muestra de poli(A)+RNA o RNA total en presencia de un cebador para síntesis de cDNA (cebador de CDS) que se puede hibridar con mRNA, y una enzima que posee actividad transcriptasa inversa bajo unas condiciones suficientes para permitir que la extensión del cebador, dependiente del molde, genere un híbrido de mRNA-cDNA; y
- 2.
- Incubar la mezcla para síntesis de cDNA de primera cadena, obtenida en la operación 1, con un oligonucleótido de cambio de molde de la presente invención (al que también se hace aquí referencia como "oligonucleótido CAPswitch"), lo que puede proporcionar la extensión, dependiente de CAP, de cDNA de longitud completa por la transcriptasa inversa utilizando como molde el oligonucleótido de cambio de molde, y la adición por ello de una secuencia de nucleótidos complementaria del oligonucleótido de cambio de molde al extremo 3' del cDNA ss de longitud completa (al que aquí se hace referencia como "híbrido de cDNA:mRNA anclado"). El oligonucleótido de cambio de molde tiene una preseleccionada secuencia de nucleótidos arbitraria en su extremo 5' y al menos un resto de riboguanina en su extremo 3'.
Las operaciones 1 y 2 del método están sólo
separadas en el tiempo. En una realización preferida, la operación
1 va seguida de la operación 2. Sin embargo, se entiende que la
mezcla para síntesis de cDNA de primera cadena de la operación 1
puede incluir un oligonucleótido de cambio de molde que será
utilizado en la operación 2. Alternativamente, se puede añadir un
oligonucleótido de cambio de molde a la mezcla de reacción en el
momento de la síntesis del cDNA de primera cadena o después de la
síntesis. En una realización preferida, el cebador para la síntesis
de cDNA es un cebador de oligo(dT) modificado.
También se describe un método para aislar un
fragmento de cDNA de longitud completa correspondiente a un extremo
5' del (de los) mRNA(s) diana usando como molde el híbrido de
cDNA:mRNA anclado, generado en la operación 2. Este método
comprende la realización de las operaciones 1 y 2, seguidas por la
operación 3A o la operación 3B alternativa, que se describen a
continuación:
- 3A.
- Incubar un híbrido de cDNA:mRNA anclado, generado en la operación 2, con una combinación de (a) un cebador oligonucleotídico que corresponde parcial o completamente a la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido de cambio de molde, (b) un(os) cebador(es) oligonucleotídico(s) que es(son) complementario(s) de una secuencia de nucleótidos del(de los) mRNA(s) diana, y (c) una cantidad eficaz de otros reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La incubación se lleva a cabo bajo unas condiciones suficientes para que se realice la PCR y se genere por ello un producto de multiplicación correspondiente al fragmento de longitud completa del extremo 5' del cDNA diana.
- 3B.
- Tratar el híbrido de cDNA:mRNA anclado de la operación 2 bajo unas condiciones bajo las cuales se sintetice una segunda cadena de cDNA, utilizando la primera cadena de cDNA anclada como molde.
También se describe un método para generar
bancos de cDNA que contengan cDNAs de longitud completa. En este
método se usa como molde el híbrido de cDNA:mRNA anclado, generado
en la operación 2. Este método comprende la realización de las
operaciones 1 y 2, seguidas por la operación 3C o la operación 3D
alternativa, que se describen a continuación:
- 3C.
- Incubar el híbrido de cDNA:mRNA anclado, generado en la operación 2, con una combinación de cebadores que corresponden parcial o completamente a la secuencia del oligonucleótido de cambio de molde y del cebador para la síntesis de cDNA, respectivamente, y una cantidad eficaz de otros reactivos necesarios para llevar la PCR a cabo. La incubación se realiza bajo unas condiciones suficientes para que se lleve la PCR a cabo, para generar un producto de multiplicación que corresponda al banco representativo de cDNA ds de longitud completa.
- 3D.
- Tratar el híbrido de cDNA:mRNA anclado de la operación 2 bajo unas condiciones bajo las cuales se sintetice una segunda cadena de cDNA, utilizando la primera cadena de cDNA anclada como molde.
En un aspecto de la presente invención, el
resultante producto de cDNA generado en la operación 2 ó 3 se puede
insertar en vehículos de clonación recombinantes y, de acuerdo con
métodos convencionales bien conocidos en la técnica (Kimmel et
al., 1987), se pueden transformar huéspedes con estos
vehículos.
La invención objetivo permite la síntesis de
cDNA de longitud completa, el cual ha sido difícil de sintetizar
por métodos convencionales. La presente invención incluye la nueva
operación 2 anteriormente descrita, que puede ser utilizada en
procedimientos estándares para preparación/clonación de cDNA que son
bien conocidos en la técnica. El uso de oligonucleótidos de cambio
de molde en el método objetivo permite ventajosamente una selección
negativa de los cDNAs que no son complementarios del extremo 5' del
RNA molde, mientras que los cDNAs de longitud completa pueden ser
fácilmente seleccionados. Además, los métodos objetivos pueden
simplificar significativamente la síntesis y clonación de cDNA.
Puesto que los clones de cDNA obtenidos a partir del banco de cDNA
de longitud completa preparado de acuerdo con el presente método
contienen información completa sobre la estructura primaria de la
proteína, la invención también se refiere a un procedimiento para
utilizar los clones, obtenidos a partir de dicho banco de cDNA de
longitud completa, para producir las proteínas codificadas.
En otro aspecto, la invención proporciona
métodos mediante los cuales el resultante producto de cDNA generado
en la operación 3 puede ser utilizado como material de partida para
uso en métodos para sustracción de cDNA. Específicamente, el método
de la invención objetivo puede ser utilizado junto con
procedimientos para sustracción de cDNA, para preparar una
población de cDNA que contenga una representación muy enriquecida de
las especies de cDNA que están presentes en una población de DNA
(la población comprobadora) pero que son menos abundantes o están
ausentes en otra población de DNA (la población conductora).
Preferiblemente, se utiliza cDNA ds comprobador y conductor,
multiplicado mediante métodos y materiales de la presente invención,
en combinación con la tecnología de Hibridación Sustractiva por
Supresión descrita por Chenchik et al. (Patente de EE.UU. nº
5.565.340). También se pueden emplear otros métodos de hibridación
sustractiva descritos, por ejemplo, por Wigler et al.
(Patente de EE.UU. nº 5.436.142), Hampson et al. [Nucl.
Acids Res. 20: 2899 (1992)], Yang et al. [Anal. Biochem. 237:
109-114 (1996)], Balzer et al. [Nucl. Acids
Res. 22: 2853-2854 (1994)] y otros.
El cDNA ds preparado de acuerdo con la presente
invención puede ser también utilizado como una sonda de hibridación.
Como se utiliza aquí, la expresión "sonda de hibridación"
significa que el cDNA generado a partir de RNA total aislado de
organismos sanos, enfermos o infectados, o como sustraído del modo
descrito por Chenchik et al. (Patente de EE.UU. nº
5.565.340), puede ser marcado con radioisótopos, grupos
fluorescentes y otros grupos informadores mediante procedimientos
convencionales para marcación química o enzimática. El cDNA marcado
puede ser luego utilizado en ensayos de hibridación estándares
conocidos en la técnica; es decir, el cDNA marcado es puesto en
contacto con los oligonucleótidos/polinucleótidos definidos que
corresponden a un conjunto particular de los genes inmovilizados
sobre una superficie sólida, durante un tiempo suficiente para
permitir la formación de patrones de hibridación sobre las
superficies causados por la hibridación entre ciertas secuencias
polinucleotídicas de la sonda de hibridación y ciertos
oligonucleótidos/polinucleótidos definidos inmovilizados. Los
patrones de hibridación se obtienen usando técnicas convencionales
disponibles, tales como cuenta de centelleo, autorradiografía,
medición de fluorescencia, medición calorimétrica y medición de
emisión lumínica. Las técnicas y condiciones para la marcación,
hibridación y detección son bien conocidas en este campo técnico
(véanse, por ejemplo, Maniatis et al., 1989, y Keller et
al., 1993).
El cDNA marcado puede ser también utilizado para
identificar genes que se expresan diferentemente en dos estados
predeterminados diferentes de un organismo (véanse, por ejemplo,
Maniatis et al., 1989, y la Patente Internacional WO
95/21944).
El cDNA ss generado después del procedimiento de
síntesis de cDNA de primera cadena-cambio de molde
(operación 2) o el cDNA ds generado después de la operación de
multiplicación por 5'-RACE (operación 3) puede ser
utilizado como una sonda de hibridación para recuperar
selectivamente una deseada molécula de ácido nucleico diana
complementaria a partir de una mezcla o un banco de ácido nucleico
ss o ds que contiene dicha molécula. El método mediante el que la
sonda de hibridación es haptenilada y es usada para obtener una
fuente enriquecida de la molécula de ácido nucleico diana se basa
en un planteamiento de hibridación como el descrito con detalle en
la Patente de EE.UU. nº 5.484.702 del 16 de Enero de 1996 y la
Patente de EE.UU. nº 5.500.356 del 19 de Marzo de 1996, o en una
hibridación mediada por la proteína RecA, como se describe con
detalle en la Patente de EE.UU. nº 4.888.274 del 19 de Diciembre de
1989.
En la presente invención se utilizan
oligonucleótidos de cambio de molde o "CAPswitch" útiles para
la preparación de bancos de cDNA que contienen clones de cDNA de
longitud completa. Los oligonucleótidos CAPswitch tienen al menos
dos funciones. Una función es la capacidad para interaccionar
selectivamente con productos intermedios de longitud completa de
transcriptasa inversa-mRNA-cDNA que
se generan en el extremo 5' de mRNA de longitud completa después de
la síntesis de cDNA de primera cadena. Una segunda función de los
oligonucleótidos CAPswitch de la invención objetivo es como un
molde eficaz para la transcriptasa inversa a partir de los productos
intermedios de longitud completa anteriormente mencionados, que
puede permitir la extensión 5' mRNA-terminal (en la
mayoría de los casos, dependiente de CAP) del cDNA de longitud
completa por la transcriptasa inversa al usar el oligonucleótido
CAPswitch como molde. De esta manera, se puede añadir una secuencia
complementaria del oligonucleótido CAPswitch al extremo 3' del cDNA
de longitud completa.
La estructura o secuencia del oligonucleótido
CAPswitch puede ser modificada para obtener una ventaja en cuanto a
la unión selectiva a la estructura de CAP del mRNA. Una modificación
puede incluir, por ejemplo, la unión covalente de oligonucleótidos
CAPswitch a una proteína capaz de unirse a la estructura de CAP del
mRNA (véase la Patente de EE.UU. nº 5.219.984).
La invención atañe particularmente a las
realizaciones de los métodos anteriores en que el oligonucleótido
CAPswitch está representado por la fórmula siguiente:
5'-dN_{1}-dN_{2}-...dN_{m}-rN_{1}-rN_{2}...rN_{n}-3'
en que dN representa un
desoxirribonucleótido seleccionado entre dAMP, dCMP, dGMP y dTMP; m
representa un número entero igual o superior a cero,
preferiblemente de 10 a 50; rN representa un ribonucleótido
seleccionado entre AMP, CMP, GMP y UMP, siendo preferiblemente GMP;
y n representa un número entero igual al menos a uno o superior,
preferiblemente de 3 a 7. Dentro del alcance de la presente
invención están ciertas modificaciones obvias, y bien conocidas en
la técnica, en la estructura del oligonucleótido CAPswitch, tales
como la sustitución de 1-10 nucleótidos por
nucleótidos aleatorios, compuestos nucleotídicos análogos, o
nucleótidos marcados con diferentes grupos haptenos (tales como,
por ejemplo, biotina, digoxigenina y fluoresceína), la incorporación
de un nucleótido terminador (tal como, por ejemplo,
3'-amino-NMP,
3'-fosfato-NMP y
3'-fluoro-NMP), usando DNA de
cadena parcialmente doble que contiene una extensión de una
secuencia de oligonucleótido CAPswitch de cadena sencilla
5'-dN_{1}-dN_{2}-...dN_{m}-rN_{1}-rN_{2}...rN_{n}-3',
la incorporación de sitios de restricción, y la incorporación de
secuencias promotoras para RNA polimerasa de bacteriófago, que
simplifican la purificación y clonación subsiguientes del cDNA pero
que aún conservan sustancialmente la misma actividad funcional que
un oligonucleótido CAPswitch no modificado, es decir, la extensión
mRNA 5'-terminal del cDNA de longitud completa por
la transcriptasa inversa usando un oligonucleótido CAPswitch como
molde.
En la invención objetivo también se incluyen
kits para la construcción de bancos de cDNA; por ejemplo, kits para
la construcción de bancos que incluyen los nuevos oligonucleótidos
de acuerdo con la invención objetivo para uso en procedimientos de
PCR.
Los métodos y materiales de la presente
invención se basan esencialmente en el uso de oligonucleótidos
CAPswitch únicos en la síntesis de cDNA. La síntesis del cDNA
objetivo puede incluir una operación de síntesis de cDNA de primera
cadena a partir de poliA+RNA utilizando transcriptasa inversa,
conectada con una síntesis de cDNA de segunda cadena o una
multiplicación por PCR en una segunda operación para generar una
elevada producción de cDNA ds de longitud completa. Cuando se
incluyen en la mezcla de reacción para la síntesis de cDNA de
primera cadena, los oligonucleótidos CAPswitch crean un molde
extendido corto. En el curso de la síntesis de cDNA de primera
cadena, la enzima transcriptasa inversa se detiene en el extremo 5'
del molde de mRNA. El extremo 5' incluye típicamente una estructura
de CAP de 7-metilguanosina, presente en los extremos
5' de todos los mRNAs eucarióticos. La actividad de la enzima
transferasa terminal añade luego algunos nucleótidos adicionales,
principalmente desoxicitidina, al extremo 3' de la cadena de cDNA
recién sintetizada. El oligonucleótido CAPswitch, que tiene una
secuencia de oligo-(rG) en su extremo 3', se aparea por bases con el
tramo de nucleótidos, rico en desoxicitidina, presente en la cadena
de cDNA creando un molde extendido. La transcriptasa inversa cambia
luego los moldes y continúa la síntesis de cDNA que es
complementario del oligonucleótido CAPswitch. El resultante cDNA ss
de longitud completa lleva incorporada en su extremo 3' una
secuencia que es complementaria tanto del extremo 5' completo del
mRNA como de la secuencia del oligonucleótido CAPswitch.
Se identifica aquí una estructura
oligonucleotídica (oligonucleótido CAPswitch) que puede proporcionar
una eficaz reacción de cambio de molde en el curso de la síntesis
de cDNA de primera cadena a partir de poli(A)+RNA
utilizando, como dador, mRNA de longitud completa con
5'-caperuza y, como aceptor, un oligonucleótido
químicamente sintetizado. Los productos de cDNA quiméricos que
tenían una secuencia oligonucleotídica en el extremo 3' del cDNA de
longitud completa fueron revelados mediante la multiplicación
subsiguiente (por ejemplo, por 5'-RACE) usando una
combinación de un cebador génicamente específico (GSP; del inglés,
gene-specific primer) y un cebador
complementario de una porción del oligonucleótido de cambio de
molde. Mediante las secuencias polinucleotídicas siguientes se
representa un conjunto de oligonucleótidos para uso en el método de
la presente invención, que tienen una secuencia arbitraria en el
extremo 5' y una secuencia aleatoria en el extremo 3':
| CzR1 | 5'-d(TGTAGCGTGAAGACGACAGAA)r(N)_{12}-3' | (ID. SEC. nº 1) |
| CzR2 | 5'-d[TGTAGCGTGAAGACGACAGAA(N)_{11}]r(N)_{1}-3' | (ID. SEC. nº 2) |
| CzR3 | 5'-d[TGTAGCGTGAAGACGACAGAA(N)_{11}]-3' | (ID. SEC. nº 3) |
| CzR4 | 5'-d[TGTAGCGTGAAGACGACAGAAGGATG(N)_{9}]r(N)_{1}-3' | (ID. SEC. nº 4) |
| Na21-N4 | 5'-d(TGTAGCGTGAAGACGACAGAA)r(N)_{4}-3' | (ID. SEC. nº 5) |
| Na21-N8 | 5'-d(TGTAGCGTGAAGACGACAGAA)r(N)_{8}-3' | (ID. SEC. nº 6) |
| Na21-N12 | 5'-d(TGTAGCGTGAAGACGACAGAA)r(N)_{16}-3' | (ID. SEC. nº 7) |
en que d( ) representa una
secuencia desoxirribonucleotídica; (N)_{11} y
(N)_{9} representan, respectivamente, una secuencia
desoxirribonucleotídica aleatoria de 11 ó 9 bases de longitud, de
dAMP, dGMP, dCMP y DTTP en cada posición de base; y
r(N)_{1-16} representa una secuencia
aleatoria de 1 a 16 bases de longitud, de AMP, GMP, CMP y UMP en
cada posición de
base.
Basándose en la eficacia de la multiplicación de
los extremos 5' (5'-RACE) de cuatro cDNAs humanos
(\alpha-actina de músculo liso,
\gamma-actina de músculo liso,
\gamma-actina citoesquelética y receptor de
transferrina, y RNAs modelo con y sin estructura de cap en el
extremo 5') y en el subsiguiente análisis secuencial del producto
multiplicado, se han identificado estructuras conservativas en el
extremo 3' de un oligonucleótido que puede ser utilizado para
generar una reacción de cambio de molde muy eficaz, dependiente de
CAP. Un análisis mutacional de regiones conservativas y no
conservativas de la secuencia oligonucleotídica (véanse las
secuencias de los oligonucleótidos CAPswitch analizados
adicionales, ID. SEC. números 19-66) reveló que se
alcanzaba la máxima eficacia de cambio de molde dependiente de CAP
al utilizar un oligonucleótido CAPswitch quimérico de
DNA-RNA básico que tenía una secuencia arbitraria
en su extremo 5' y una secuencia de
oligo-ribo(G) conservativa en el extremo 3'.
Este oligonucleótido se representa mediante la fórmula general:
5'-dN_{x}-rG_{y}-3'
en que dN representa una secuencia
desoxirribonucleotídica arbitraria de 18-21 bases de
longitud y rG_{y} representa una secuencia de
oligo-rG de 3-5 bases de longitud.
La secuencia de oligo-rG es responsable de la
función de cambio de molde principal asociada con el oligonucleótido
CAPswitch. La secuencia desoxirribooligonucleotídica arbitraria
puede ser seleccionada para que sea útil para las subsiguientes
operaciones de síntesis y clonación de
cDNA.
Además, la reacción de cambio de molde es muy
eficaz para cDNAs que tienen una secuencia complementaria del
extremo 5' del mRNA, en comparación con los cDNAs que fueron
prematuramente terminados durante la transcripción inversa de la
primera cadena y, por lo tanto, no tienen secuencias complementarias
del extremo 5' de la molécula de mRNA. La presencia de la
estructura de CAP en el extremo 5' del mRNA no es un requisito
necesario para la reacción de cambio de molde, pero la reacción de
cambio de molde es muy eficaz para productos de DNA de longitud
completa sintetizados sobre un mRNA que tiene la estructura de CAP
presente en el extremo 5'.
Dentro del alcance de la presente invención se
contemplan modificaciones en la estructura de los oligonucleótidos
de cambio de molde. Específicamente, la invención objetivo contempla
aquellas modificaciones que pueden afectar a la eficacia del cambio
de molde pero en que el oligonucleótido de cambio de molde conserva
sustancialmente la misma actividad funcional que los
oligonucleótidos de cambio de molde no modificados, es decir, la
extensión, dependiente de CAP, de cDNA de longitud completa por la
transcriptasa inversa usando el oligonucleótido como molde. Los
oligonucleótidos modificados pueden ser utilizados como alternativas
a los oligonucleótidos CAPswitch no modificados. Las reglas
siguientes resumen aquellas modificaciones que son útiles de acuerdo
con la invención objetivo:
- 1a.
- El uso de secuencias 3'-terminales de oligo-rG más cortas (1-2 bases), la sustitución de uno o varios restos de rG por rA, rC o rU, o la sustitución de oligo-rG por oligo-dG reduce la eficacia de la estructura básica; las secuencias de oligo-rG más largas (7-9 bases) no influyen significativamente en la eficacia del cambio de molde.
- 1b.
- La modificación del grupo 3'-OH del resto de ribosa del G 3'-terminal por un grupo amino, biotina, fosfato, fluoro o glicerol puede reducir significativamente el fondo en las subsiguientes operaciones de multiplicación por PCR (operación 3A).
- 1c.
- Los cambios en la secuencia de la porción arbitraria de un oligonucleótido de cambio de molde, la sustitución parcial o completa de desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos, incluyendo el(los) sitio(s) de restricción, no influyen significativamente en la eficacia del cambio de molde. La utilización de una secuencia arbitraria más larga (aproximadamente 22 a 42 bases) en el extremo 3' del oligonucleótido de cambio de molde reduce la eficacia del cambio de molde, mientras que las secuencias más cortas (aproximadamente 15 a 17 bases) aumentan ligeramente la eficacia del cambio de molde pero hacen que las subsiguientes operaciones de multiplicación por PCR (operaciones 3A y 3C) sean menos eficaces.
- 1d.
- Una persona experta en este campo técnico que tenga la ventaja de la descripción actual reconocerá que se pueden realizar fácilmente otras modificaciones en la estructura de los oligonucleótidos de cambio de molde de al presente invención. Estas modificaciones pueden aumentar la eficacia y la especificidad de la reacción de cambio de molde dependiente de CAP. Por ejemplo, utilizando la tecnología de selección de aptámeros (oligonucleótidos aleatorios) (Kenan et al., 1994) es posible hallar las secuencias ribonucleotídicas o desoxirribonucleotídicas de la porción arbitraria del oligonucleótido de cambio de molde que se unen eficazmente a la estructura de CAP de una molécula de mRNA y, por lo tanto, aumentan la eficacia de la reacción de cambio de molde. Se puede alcanzar el mismo resultado mediante la sustitución de nucleótido(s) natural(es) por nucleótidos modificados con objeto de aumentar la afinidad de los oligonucleótidos de cambio de molde que se unen a la estructura de CAP.
- También se pueden construir proteína-oligonucleótidos de cambio de molde quiméricos para que la porción proteínica reconozca la estructura de CAP y se una a ella, los cuales pueden aumentar la eficacia de la reacción de cambio de molde. Estas proteínas o porciones proteínicas que se unen a la caperuza son bien conocidas en la técnica e incluyen preferiblemente anticuerpos contra la estructura de CAP y el factor 4E eucariótico de iniciación (eIF-4E; del inglés, eukaryotic initiation factor 4E).
\vskip1.000000\baselineskip
Otra ventaja del uso de los métodos de la
presente invención es la elevada flexibilidad de este procedimiento
que hace posible utilizar esta nueva tecnología con los
procedimientos convencionales para clonación de cDNA bien conocidos
en la técnica. Ventajosamente, la invención objetivo permite
eliminar la necesidad de los múltiples procedimientos enzimáticos o
de purificación utilizados en los procedimientos convencionales. El
método objetivo puede proporcionar la adición automática y directa,
dependiente de CAP, de una secuencia oligonucleotídica de cambio de
molde al extremo 5' de un híbrido de mRNA:cDNA en el curso de la
síntesis de cDNA de primera cadena. Además, los métodos y
composiciones de al invención objetivo se pueden combinar con
procedimientos bien conocidos en la técnica para la síntesis y
clonación de cDNA. Resultará evidente a los expertos en la técnica
que se pueden variar el orden de algunas de las operaciones
individuales, la estructura exacta de los cebadores de CDS, y los
vectores utilizados para la construcción del banco de cDNA. La
descripción posterior detalla sólo operaciones preferidas que dan
lugar a la generación eficaz de cDNA de longitud completa a partir
de RNA.
Utilizando el método objetivo con procedimientos
convencionales, se puede llevar a cabo la síntesis de cDNA de
primera cadena usando un complejo hibridado que comprende un cebador
para síntesis de cDNA:mRNA como molde para la transcripción
inversa. La extensión del cebador puede ser catalizada por la
transcriptasa inversa, o por una DNA polimerasa que posea actividad
transcriptasa inversa, en presencia de cantidades adecuadas de
otros componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, tales
como, por ejemplo, los desoxirribonucleósido trifosfatos ATP, CTP,
GTP y TTP, Mg^{2+} y un tampón óptimo. Para la síntesis del cDNA
de primera cadena, se puede utilizar una diversidad de DNA
polimerasas que posean actividad transcriptasa inversa. Los ejemplos
de DNA polimerasas que pueden ser utilizadas en los métodos de la
presente invención incluyen las DNA polimerasas procedentes de
organismos tales como bacterias termófilas y arqueobacterias,
retrovirus, levaduras, Neurospora, Drosophila,
primates y roedores. Preferiblemente, la DNA polimerasa se aísla del
virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV; del
inglés, Moloney murine leukemia virus)
(Patente de EE.UU. nº 4.943.531) o la transcriptasa inversa de
M-MLV que carece de actividad RNasa H (Patente de
EE.UU. nº 5.405.776), el virus tipo I de la leucemia humana de
células T (HTLV-I; del inglés, human
T-cell leukemia virus type I), el virus
de la leucemia bovina (BLV; del inglés, bovine
leukemia virus), el virus del sarcoma de Rous (RSV;
del inglés, Rous sarcoma virus), el virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH) o Thermus aquaticus (Taq) o
Thermus termophilus (Tth) (Patente de EE.UU. nº 5.322.770).
Estas DNA polimerasas pueden ser aisladas del propio organismo o,
en ciertos casos, ser obtenidas comercialmente. Las DNA polimerasas
útiles con la invención objetivo pueden ser también obtenidas de
células que expresan genes clonados que codifican la polimerasa.
Como material de partida para la síntesis de cDNA, se puede usar
poli(A)+RNA o RNA total de levadura y de organismos
superiores tales como vegetales y animales.
La operación de síntesis de cDNA de primera
cadena del método objetivo puede incluir oligonucleótidos de cambio
de molde de al presente invención en la mezcla de reacción, pero
estos no son un componente necesario para llevar a cabo la síntesis
de cDNA de primera cadena. Los oligonucleótidos de cambio de molde
se pueden añadir en el momento de la operación de cambio de molde
que sigue a la operación de síntesis de la primera cadena. De esta
manera, se entiende que se pueden incluir las moléculas
oligonucleotídicas de cambio de molde en la composición de la
reacción para la primera cadena (por ejemplo, durante la hibridación
del cebador para síntesis de cDNA con el RNA o cuando se pone el
RNA en contacto con una enzima que posee actividad transcriptasa
inversa), o se pueden añadir los oligonucleótidos en el curso de la
reacción para la síntesis de cDNA de primera cadena o tras la
compleción de esta reacción.
Dependiendo de la estrategia que se va a emplear
para la clonación del cDNA, se pueden utilizar numerosas
estructuras de cebadores para síntesis de cDNA para la síntesis de
cDNA de primera cadena utilizando poli(A)+RNA como molde y
catálisis por la actividad transcriptasa inversa. El cebador para
síntesis de cDNA puede ser un oligonucleótido de cadena sencilla,
un oligonucleótido de cadena doble que tenga una porción de cadena
sencilla [un adaptador de
extremo-restricción-cebador o PRE
(del inglés, primer-restriction-end), como
describen Coleclough et al., 1985], o un cebador de vector,
que represente un vector ds con una porción de cadena sencilla
(Okayama et al., 1982). En los tres casos, una porción de
cadena sencilla del cebador para síntesis de cDNA es responsable de
la unión con poli(A)+RNA y del inicio de la síntesis de cDNA
de primera cadena. En una realización preferida del método
objetivo, para la construcción de bancos de cDNA de longitud
completa, un cebador de CDS que contiene una cola de
oligo-dT en su extremo 3' se hibrida con la porción
de poli(A) del mRNA. Para una rápida multiplicación o
clonación de los extremos 5' del cDNA y para la clonación selectiva
de genes concretos, el cebador de CDS puede poseer una secuencia
aleatoria o una secuencia arbitraria que puede corresponder a una
secuencia concreta de un gen diana que se va a clonar.
La invención objetivo atañe particularmente a
las realizaciones de los métodos anteriores en que el cebador de
CDS se puede hibridar con:
- 1a.
- La cola de poli(A) del poli(A)+RNA. El cebador para la síntesis de cDNA puede ser seleccionado entre un oligonucleótido de cadena sencilla, cualquier fragmento de DNA de cadena parcialmente doble y cualquier cebador de vector lineal. En una realización preferida, el cebador oligonucleotídico tiene la secuencia: 5'-dN_{1}-dN_{2}-...dN_{m}-dT_{n}-dN_{1}-dN_{2}-...dN_{p}-3' en que m representa un número entero igual o superior a 0, preferiblemente de 0 a 20; n representa un número entero igual o superior a 8, preferiblemente de 8 a 30; p es preferiblemente de 0 a 3; dN representa un desoxirribonucleótido seleccionado entre, o representa una mezcla de, dAMP, dCMP, dGMP y dTMP; y dT representa dTMP. Dentro del alcance de la presente invención están ciertas modificaciones en la estructura del cebador, tales como la sustitución de 1-10 nucleótidos por nucleótidos que contienen diferentes grupos haptenos (biotina, digoxigenina, fluoresceína, etc.), compuestos nucleotídicos análogos, ribonucleótidos o nucleótidos artificiales, y la incorporación de sitios de restricción o de la región promotora para RNA polimerasa de bacteriófago, que simplifican la purificación, utilización y clonación subsiguientes del cDNA pero que aún conservan la función principal del cebador, es decir, la actividad cebadora de la porción de poli(A) del poli(A)+RNA. La utilización de un cebador de DNA de cadena parcialmente doble o de vectores plasmídicos lineales que tienen la secuencia de cola de cadena sencilla 5'-dN_{1}-dN_{2}-...dN_{m}-dT_{n}-dN_{1}-dN_{2}-...dN_{p}-3' anteriormente descrita y que poseen actividad cebadora para la síntesis de cDNA de primera cadena a partir de la porción de poli(A) del poli(A)+RNA, es también considerada una parte de al invención objetivo. Con objeto de simplificar el procedimiento de clonación, se puede fijar el oligonucleótido CAPswitch al otro extremo del cebador del vector. En este caso, el cebador del vector poseerá en un extremo una secuencia que corresponde al cebador de CDS y, en el otro extremo, el oligonucleótido CAPswitch (tecnología de CAPswitch-cebador del vector). La síntesis de cDNA y el cambio automático de molde subsiguientes generarán un producto quimérico de cDNA:vector, el cual puede ser fácilmente clonado como describen Okayama et al. (1982).
\newpage
- 1b.
- Porción interna del mRNA que no es poli(A). Este(estos) cebador(es) oligonucleotídico(s) tiene(n) la fórmula general dN_{1}-dN_{2}-...dN_{q}, en la que dN representa un desoxirribonucleótido seleccionado entre dAMP, dCMP, dGMP y dTMP o representa una mezcla de 2-4 de estas bases; y q representa un número entero igual o superior a 6, preferiblemente de 6 a 50. Estos cebadores pueden tener una secuencia aleatoria, es decir, se pueden hibridar con todos los mRNAs, una secuencia arbitraria, es decir, se pueden hibridar con al menos un mRNA arbitrario, o una secuencia complementaria de al menos un mRNA. Además, la secuencia de este(estos) cebador(es) puede incluir un(os) sitio(s) de restricción o bases modificadas (por ejemplo, biotiniladas) para facilitar el subsiguiente procedimiento de purificación o clonación.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de cDNA de primera cadena basada en
la tecnología de CAPswitch genera productos intermedios de
moléculas híbridas de mRNA:cDNA de longitud completa (o el
correspondiente extremo 5' de un fragmento de longitud completa),
flanqueados por un cebador de CDS en su extremo 3' y un
oligonucleótido CAPswitch en su extremo 5'. Dichos productos
intermedios pueden ser fácilmente convertidos en una forma de cDNA
ds adecuada para la subsiguiente clonación utilizando
procedimientos convencionales. Estos procedimientos son bien
conocidos e incluyen:
- 1.
- Multiplicación directa del cDNA de longitud completa por combinación de un cebador de PCR que corresponde a CDS y porciones flanqueadoras de CAPswitch de un híbrido de mRNA:cDNA, y cantidades eficaces de otros reactivos bajo las condiciones necesarias para llevar a cabo la PCR. Preferiblemente, las condiciones son las desarrolladas para la multiplicación de secuencias de ácido nucleico largas, y descritas por Cheng [Patente Internacional (1995)] y Barnes (Patente de EE.UU. nº 5.436.149, de 25 de Julio de 1995).
- 2.
- Sustitución de la porción de mRNA del híbrido de mRNA:cDNA por un cDNA de segunda cadena, esencialmente del modo descrito por Okayama et al. (1982) y Gubler et al. (1983). Este proceso acarrea la digestión del RNA con una ribonucleasa tal como RNasa H de E. coli, una síntesis reparadora utilizando una DNA polimerasa que tiene las actividades de la DNA polimerasa I, y ligación. El procedimiento depende de la estructura del cebador de CDS utilizado para la síntesis de cDNA de primera cadena. La síntesis de cDNA de segunda cadena puede ser llevada a cabo utilizando como molde un híbrido de mRNA:cDNA o un producto quimérico de mRNA:cDNA:vector usando el cebador del vector para la síntesis de la primera cadena (véase más atrás la tecnología de CAPswitch-cebador del vector). Alternativamente, el híbrido de mRNA:cDNA anteriormente descrito, generado mediante la estrategia del adaptador PRE, puede ser digerido en las secuencias flanqueadoras 5' y 3', que corresponden al adaptador PRE y el oligonucleótido CAPswitch, por al menos una enzima de restricción y ser luego ligado a un vector convencional digerido por la(s) misma(s) enzima(s) de restricción. Se puede(n) usar cual(es)quier enzima(s) de restricción con tal de que no corte(n) dentro del híbrido de mRNA:cDNA.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de usarse una estrategia de cebador
de vector (CAPswitch-cebador del vector) o de
adaptador PRE, el cDNA ds generado después de la síntesis de cDNA
de segunda cadena está ya insertado en el vector y no se requiere
esta operación. Cuando se utiliza un cebador oligonucleotídico de
CDS, el cDNA ds preparado en la segunda operación por PCR o por
tecnología de sustitución de mRNA puede ser ligado con adaptadores o
ser sometido a digestión con enzima(s) de restricción en
secuencias que corresponden a porciones flanqueadoras del CDS y el
oligonucleótido CAPswitch, generándose de esta forma moléculas de
cDNA ds que se ligarán a cualquier vector de clonación convencional
(incluyendo un plásmido, cósmido, fago, vector retrovírico, etc.)
después de ser digeridas con la(s) misma(s)
enzima(s) de restricción.
A continuación, las moléculas de DNA
recombinante que comprenden un banco de cDNA de longitud completa
pueden ser introducidas en huéspedes procarióticos, y opcionalmente
en huéspedes eucarióticos, útiles en la clonación de alta
frecuencia de cDNA ds de longitud completa y en la expresión de
proteínas recombinantes a partir de ellos.
Una vez que se ha completado la clonación de
acuerdo con la invención, el(los) clon(es)
deseado(s) puede(n) ser detectado(s) mediante
una sonda marcada o mediante anticuerpos monoclonales o policlonales
preparados contra el producto en un inmunoensayo convencional, o
enriquecido(s) en cuanto a la diana deseada mediante un
planteamiento de selección por hibridación descrito, por ejemplo,
por Li et al. en la Patente Internacional WO 95/04745 de 9
de Agosto de 1994.
El uso de un oligonucleótido CAPswitch en la
síntesis y clonación de cDNA simplifica y mejora significativamente
la tecnología para la construcción de bancos de cDNA de longitud
completa. Las principales ventajas son las siguientes:
- 1.
- El procedimiento en una fase que incluye la síntesis de cDNA de primera cadena y la adición de una secuencia definida al extremo 3' del cDNA reduce significativamente el número de operaciones (de 5-7 a 2-3 operaciones) necesarias en la tecnología convencional para la construcción estándar de bancos de cDNA, basada en PCR. Un número menor de operaciones significa que los nuevos métodos y materiales de al presente invención son más eficaces y más sencillos de utilizar, requieren menos trabajo y son más reproducibles que los métodos convencionales para la construcción de bancos de cDNA.
- 2.
- De acuerdo con la presente invención, el mecanismo de cambio de molde dependiente de CAP proporciona una tecnología significativamente más eficaz para sintetizar cDNA de longitud completa y generar bancos de cDNA que contengan sobre todo cDNAs de longitud completa. Los métodos y materiales de la presente invención pueden proporcionar un nuevo método para seleccionar fácilmente los cDNAs de longitud completa que se van a clonar en el banco de cDNA.
Como aquí se usa, la expresión "DNA
complementario o cDNA de longitud completa" se define como
cDNA(s) o fragmento(s) de cDNA de cadena sencilla
(ss) o cadena doble (ds) y longitud completa que contienen la
información secuencial completa del(de los)
extremo(s) 5' de mRNA(s). El cDNA de longitud completa
puede contener la información secuencial completa del extremo 5' de
un mRNA particular (diana) o de la población total de
poli(A)+RNA utilizada como molde para la síntesis de cDNA de
primera cadena.
Como aquí se usa, la expresión "banco de cDNA
de longitud completa" se refiere a la población total de cDNAs
ss o ds sintetizados a partir de poli(A)+RNA como molde. El
banco de cDNA de longitud completa se puede utilizar directamente
para diferentes aplicaciones conocidas en la técnica o se puede
clonar en cualquier vehículo de clonación recombinante adecuado, y
se puede transformar un huésped con el vehículo de clonación.
La expresión "reacción de cambio de molde"
se refiere a un proceso de síntesis, dependiente de molde, de la
cadena complementaria por una DNA polimerasa usando dos moldes en
orden consecutivo y que no están covalentemente unidos entre sí por
enlaces fosfodiéster. La cadena complementaria sintetizada será una
sola cadena continua, complementaria de ambos moldes. Típicamente,
el primer molde es poli(A)+RNA, y el segundo molde es un
oligonucleótido de cambio de molde o "CAPswitch".
Como aquí se usa, la expresión "secuencia
arbitraria" o "secuencia ancla" se refiere a cualquier
secuencia desoxirribonucleotídica, ribonucleotídica o mixta
desoxirribo/ribonucleotídica, definida o preseleccionada, que
contiene una secuencia particular de nucleótidos naturales o
modificados.
Como aquí se usa, la expresión "secuencia
aleatoria" se define como una secuencia desoxirribonucleotídica,
ribonucleotídica o mixta desoxirribo/ribonucleotídica que contiene
cualquier nucleótido natural o modificado en cada posición
nucleotídica.
Como aquí se usa, la expresión "cDNA anclado
de longitud completa" se define como un cDNA ss de longitud
completa que tiene una secuencia arbitraria definida en el extremo
3'.
Como aquí se usa, la expresión "híbrido de
mRNA:cDNA" se refiere a un producto después de la síntesis de
cDNA de primera cadena catalizada por la transcriptasa inversa
utilizando poli(A)+RNA como molde. El "híbrido de
mRNA:cDNA" puede ser de longitud completa si la porción de cDNA
incluye la secuencia entera de los extremos 5' del mRNA molde.
Como aquí se usa, la expresión "transcriptasa
inversa" se define como cualquier DNA polimerasa que posee
actividad transcriptasa inversa que puede ser utilizada para la
síntesis de cDNA de primera cadena utilizando poli(A)+RNA o
RNA total como molde.
Como aquí se usa, se dice que dos secuencias son
"complementarias" entre sí si son capaces de hibridarse entre
sí para formar una estructura antiparalela de ácido nucleico de
doble cadena.
Como aquí se usa, el término "hapteno" se
refiere a una molécula que está unida a una molécula de ácido
nucleico y puede ser reconocida y unida por otra molécula o
"ligando de unión" tal como, por ejemplo, un anticuerpo,
estreptavidina y biotina, un metal de transición y otros agentes
conocidos en la técnica. Los ejemplos de haptenos incluyen un grupo
quelante, biotina, fluoresceína, digoxigenina, un antígeno y otros
agentes conocidos en la técnica.
Como aquí se usa, la expresión "soporte
sólido" se refiere a cualquier sustrato conocido que puede ser
utilizado para la inmovilización de un ligando de unión o de
secuencias oligonucleotídicas/polinucleotídicas mediante cualquier
método conocido.
Como aquí se usa, la expresión "grupo
informador" se refiere a cualquier grupo incorporado a cDNA de
longitud completa mediante procedimientos de marcación química o
enzimática convencionales y que puede ser detectado mediante el uso
de técnicas convencionales tales como cuenta de centelleo,
autorradiografía, medición de fluorescencia, medición
calorimétrica, medición de emisión lumínica y otros medios conocidos
en la técnica. Los ejemplos de grupos informadores incluyen
radioisótopos, grupos fluorescentes, quimiofluorescentes,
quimioluminiscentes y haptenos, y otros grupos conocidos en la
técnica.
Como aquí se usa, la expresión "hibridación
sustractiva" se refiere a una tecnología que permite la
recuperación de una población de cDNA que contiene una
representación muy enriquecida de las especies de cDNA que están
presentes en una población de cDNA (comprobadora) pero que son menos
abundantes o no se encuentran en otra población de cDNA
(conductora). Los ejemplos de tecnologías de hibridación sustractiva
incluyen la tecnología de Hibridación Sustractiva por Supresión
(Chenchik et al., Patente de EE.UU. nº 5.565.340), el
análisis de diferencias de representación (Wigler et al.,
Patente de EE.UU. nº 5.436.142), y la sustracción por captura de
conectores [Yang et al., Anal. Biochem. 237:
109-114 (1996)].
Como aquí se usa, la expresión "compuesto
nucleotídico análogo" se refiere a un nucleótido que no se
encuentra típicamente en el DNA ni el RNA y que posee ciertas
características adicionales que permiten mejorar la eficacia de la
reacción de cambio de molde o mejorar la utilización del generado
cDNA anclado. Por ejemplo, los compuestos nucleotídicos análogos
adecuados incluyen una modificación en la base o la cadena principal
de azúcar-fosfato, tal como ácido nucleico
peptídico, inosina,
5-nitroindol-desoxirribofuranosilo,
5-metildesoxicitosina y
5,6-dihidro-5,6-dihidroxidesoxitimidina.
Otros compuestos nucleotídicos análogos serán evidentes para los
expertos en la técnica.
A continuación se incluyen ejemplos que ilustran
procedimientos para llevar la invención a la práctica. Estos
ejemplos no deben ser considerados restrictivos. Todos los
porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezclas de
disolventes son en volumen a menos que se indique otra cosa.
La obtención de un cDNA de longitud completa es
una de las tareas más importantes, y a menudo una de las más
difíciles, a la ahora de caracterizar genes. Con los métodos
tradicionales para la construcción de bancos de cDNA se producen
normalmente fragmentos de cDNA sólo parciales. Para facilitar la
recuperación del resto de la secuencia de codificación, se propuso
en 1988 (Frohman et al., 1988) un método in vitro para
la multiplicación rápida de extremos de cDNA (RACE; del inglés,
rapid amplification of cDNA ends). A
pesar de las diversas modificaciones que se han desarrollado, las
tecnologías RACE actuales son complicadas e ineficaces. Los métodos
y materiales de al presente invención proporcionan un método que
simplifica significativamente y hace más eficaz el procedimiento
5'-RACE. En la Figura 2 se muestra el diagrama de
flujo que describe el procedimiento 5'-RACE basado
en CAPswitch, y más adelante se describe el protocolo preferido.
Dentro del alcance de la presente invención caen ciertas
modificaciones obvias en el protocolo, tales como, por ejemplo, la
utilización de otras enzimas que poseen actividades enzimáticas
similares para la operación de síntesis de la primera cadena y la
PCR, la utilización de otras secuencias del cebador de
oligo(dT) y el oligonucleótido CAPswitch, y la utilización
de un cebador génicamente específico en lugar de un cebador de
oligo(dT) para la síntesis de la primera cadena.
Operación
1
Se hibridaron 10 picomoles del cebador para la
síntesis de cDNA [cebador de oligo-d(T)]
| CDS1: | 5'-d(TCTAGAATTCAGCGGCCGC(T)_{30}VN) - 3' | (ID. SEC. nº 8) |
(en que V = G o A o C; N = G o A o T o C)
\vskip1.000000\baselineskip
y 50 picomoles del oligonucleótido CAPswitch
(CSO1):
| CSO1: | 5'-d(CTAATACGACTCACTATAGGGC)r(GGGp)-3' | (ID. SEC. nº 9) |
(en que p es un grupo
3'-fosfato)
con 1 \mug de poli(A)+RNA de placenta
humana (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, California, EE.UU.)
en un volumen de 5 \mul de agua desionizada, calentando la mezcla
durante 2 minutos a 70ºC y enfriando luego sobre hielo durante 2
minutos. Luego se inició la síntesis de cDNA de primera cadena
mezclando el cebador hibridado-RNA con 200 unidades
de RNasa H de M-MLV-transcriptasa
inversa (transcriptasa inversa Superscript II, Life Technologies)
en un volumen final de 10 \mul que contenía
Tris-HCl 50 mM (pH de 8,3 a 22ºC), KCl 75 mM;
MgCl_{2} 6 mM, DTT 1 mM, y dATP, dGTP, dCTP y dTTP, cada uno 1 mM.
La mezcla de reacción para síntesis de cDNA de primera
cadena-cambio de molde fue incubada a 42ºC durante
1,5 horas en una incubadora con aire y fue luego enfriada sobre
hielo. También se sintetizó un cDNA de primera cadena utilizando
cebadores aleatorios d(N)_{6} (500 ng) o el cebador
génicamente específico antisentido de la beta-actina
humana:
| ACT1: | 5'-d(ACTCGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC)-3' | (ID. SEC. nº 10) |
o el cebador génicamente específico antisentido
del receptor humano de la transferrina:
| TFR1: | 5'-d(GTCAATGTCCCAAACGTCACCAGAGA)-3' | (ID. SEC. nº 11) |
en lugar del cebador de
oligo-d(T).
La mezcla de reacción fue luego diluida por un
factor de 500 mediante la adición de 5 ml de
Tricina-KOH 10 mM (pH de 8,5 a 22ºC) y EDTA 0,1 mM,
incubada a 94ºC durante 1,5 minutos, enfriada sobre hielo y guardada
a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación 2
Se llevó a cabo la multiplicación por PCR
utilizando la mezcla de polimerasas Advantage KlenTaq (CLONTECH
Laboratories, Inc.). Este kit contiene una mezcla de las DNA
polimerasas KlenTaq-1 y DeepVent (New England
BioLabs) y el anticuerpo TaqStart (CLONTECH Laboratories, Inc.). El
anticuerpo TaqStart proporciona una PCR de inicio automático en
caliente. La multiplicación se llevó a cabo en un volumen de 50
\mul que contenía 5 \mul de cDNA de primera cadena diluido,
Tricina-KOH 40 mM (pH de 9,2 a 22ºC),
Mg(OAc)_{2} 3,5 mM, KOAc 10 mM, 75 \mug/ml de
BSA; 200 \muM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, 0,2 \muM
de cada uno del cebador CAPswitch (CSP1):
5'-d(CTAATACGACTCACTATAGGGC)-3'
(ID. SEC. nº 12) y el cebador génicamente específico (GSP1 para la
beta-actina o el receptor de transferrina), y 1
\mul de la mezcla de polimerasas KlenTaq 50x. Los parámetros
térmicos de las reacciones PCR fueron los siguientes: 1 minuto a
94ºC seguido de 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y 72ºC durante
5 minutos; luego 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y 70ºC
durante 5 minutos; y luego 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y
68ºC durante 5 minutos; seguidos de una extensión final de 10
minutos a 68ºC. Los productos de la PCR fueron examinados en geles
de agarosa al 1,2%/EtBr en tampón TBE 1x. Como marcador de tamaños
de DNA se utilizó una Escalera de DNA de 1 kb (Life
Technologies).
Las reacciones de 5'-RACE del
cDNA tanto de la beta-actina humana como del
receptor de transferrina humano generan una sola banda que
corresponde al tamaño esperado del producto multiplicado de
5'-RACE de longitud completa. La clonación y el
análisis de secuencia subsiguientes de 18 clones de
5'-RACE aleatoriamente escogidos confirman su
identidad con fragmentos 5'-terminales de la
beta-actina y del receptor de transferrina. Además,
secuencias 5'-terminales del producto multiplicado
de 5'-RACE corresponden exactamente a secuencias de
mRNAs de longitud completa de la beta-actina y el
receptor de transferrina, seguidas de secuencias que corresponden
al oligonucleótido CAPswitch. Este ejemplo ilustra que se puede
utilizar eficazmente la 5'-RACE de CAPswitch no
sólo para la multiplicación de secuencias
5'-terminales de longitud completa de cDNAs sino
también para el mapeo exacto de sitios de inicio de la
transcripción.
Los métodos y materiales de la presente
invención pueden ser usados eficazmente para la construcción de
bancos de cDNA utilizando 10-100 ng de RNA total
como molde. Para purificar esta pequeña cantidad de RNA total a
partir de 10-50 mg de células o tejidos
"difíciles", tales como tejidos de biopsias humanas,
microorganismos patógenos, tejidos en diferentes fases de
desarrollo, etc., se puede utilizar cualquier procedimiento
convencional bien conocido en la técnica. En el diagrama de flujo
de la Figura 3 se muestra la operación principal de este
procedimiento. Resultará evidente a los expertos en la técnica que
se pueden variar ciertas operaciones individuales no esenciales, la
estructura del cebador de CDS, el oligonucleótido CAPswitch y los
adaptadores mostrados en la Figura 3 sin que cambie la eficacia del
procedimiento global. Por ejemplo, en lugar de la operación de
ligación del adaptador (operación 3), el cDNA ds generado por PCR
puede ser sometido a digestión mediante endonucleasa(s) de
restricción de corte raro, en secuencias que corresponden a
porciones flanqueadoras del CDS y del oligonucleótido CAPswitch, y
ser clonado directamente en el vector. Además, para la clonación y
la generación de bancos de cDNA de longitud completa por CAPswitch,
se pueden utilizar otros procedimientos convencionales bien
conocidos en la técnica para la clonación directa del producto de
PCR, tales como el vector de clonación TA, la ligación de extremos
romos, y similares. Cualesquiera de dichas variaciones en el
protocolo preferido que se basen en la utilización de métodos y
materiales de la invención objetivo están dentro del alcance de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación
1
Se hibridaron 10 picomoles del cebador CDS1
[cebador de oligo-d(T)] para la síntesis de
cDNA:
| 5'-d(TCTAGAATTCAGCGGCCGC(T)_{30}VN) - 3' | (ID. SEC. nº 8) |
(en que V = G o A o C; N = G o A o T o C)
\vskip1.000000\baselineskip
y 10 picomoles del oligonucleótido CAPswitch
(CSO2):
| CSO2: | 5'-d(CTAATACGACTCACTATAGGGC)r(GGG)-3' | (ID. SEC. nº 13) |
con 100 ng de RNA total de músculo esquelético
humano (CLONTECH Laboratories, Inc.) en un volumen de 5 \mul de
agua desionizada, calentando la mezcla durante 2 minutos a 70ºC y
enfriando luego sobre hielo durante 2 minutos. Luego se inició la
síntesis de cDNA de primera cadena mezclando el cebador
hibridado-RNA con 200 unidades de RNasa H de
M-MLV-transcriptasa inversa
(transcriptasa inversa Superscript II, Life Technologies) en un
volumen final de 10 \mul que contenía Tris-HCl 50
mM (pH de 8,3 a 22ºC), KCl 75 mM; MgCl_{2} 6 mM, DTT 1 mM, y
dATP, dGTP, dCTP y dTTP, cada uno 1 mM. La mezcla de reacción para
síntesis de cDNA de primera cadena-cambio de molde
fue incubada a 42ºC durante 1,5 horas en una incubadora con aire y
fue luego enfriada sobre
hielo.
hielo.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación
2
Se llevó a cabo la multiplicación del cDNA de
longitud completa por PCR usando la mezcla de polimerasas Advantage
KlenTaq (CLONTECH Laboratories, Inc.). La multiplicación se llevó a
cabo en un volumen de 100 \mul que contenía 2 \mul de cDNA de
primera cadena, Tricina-KOH 40 mM (pH de 9,2 a
22ºC), Mg(OAc)_{2} 3,5 mM, KOAc 10 mM, 75 \mug/ml
de BSA; 200 \muM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, 0,2
\muM de cada uno del cebador CAPswitch (CSP1) y el cebador CDS1,
y 1 ml de la mezcla de polimerasas KlenTaq. Los parámetros térmicos
de las reacciones PCR fueron los siguientes: 1 minuto a 95ºC
seguido de 20-22 ciclos de 95ºC durante 15 segundos
y 68ºC durante 5 minutos; seguidos de una extensión final de 10
minutos a 68ºC. Los productos de la PCR fueron examinados en geles
de agarosa al 1,2%/EtBr en tampón TBE 1x. Como marcador de tamaños
de DNA se utilizó una Escalera de DNA de 1 kb (Life
Technologies).
\vskip1.000000\baselineskip
Operación
3
Los 50 \mul del cDNA ds generado en la
operación de PCR fueron combinados con 2 \mul de proteinasa K (2
mg/ml) e incubados a 45ºC durante 1 hora, lo que fue seguido de una
operación de desnaturalización a 70ºC durante 10 minutos. Luego se
añadieron 3 \mul (15 unidades) de DNA polimerasa de T4 a la mezcla
de reacción y se realizó una incubación adicional a 16ºC durante 30
minutos. El cDNA ds fue luego precipitado mediante la adición de
medio volumen de acetato amónico 4 M (aproximadamente 35 \mul) y
3,7 volúmenes de etanol al 95% (aproximadamente 260 \mul). Tras
revolvimiento con formación de remolinos, se centrifugó
inmediatamente el tubo a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante
20 minutos. El residuo de centrifugación fue lavado con etanol al
80% sin revolvimiento, centrifugado como antes durante 10 minutos,
dejado secar al aire y disuelto en 16 \mul de agua desionizada.
El cDNA ds fue luego ligado a un adaptador durante la noche a 16ºC
bajo las condiciones siguientes: 16 \mul de disolución de cDNA
ds, Tris-HCl 50 mM (pH de 7,8 a 22ºC), MgCl_{2}
10 mM, DTT 1 mM, ATP 1 mM, polietilenglicol (peso molecular de 8000)
al 5%, 2 \muM de adaptador (Ad1):
| Ad1: | 5' - d(AATTCGCGGCCGCGTCGAC) - 3' | (ID. SEC. nº 14) |
| 3' - d(GCGCCGGCGCAGCTGp) - 5' | (ID. SEC. nº 15) |
(en que p = un grupo 3'-fosfato)
y 1 unidad de DNA ligasa de T4 (Life Technologies, Inc.) en un
volumen total de 30 \mul. Luego se detuvo la reacción de ligación
mediante la adición de 70 \mul de EDTA 10 mM. El cDNA ds fue
sometido una vez a extracción con fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (25:24:1, volumen/volumen) y una vez con
cloroformo/alcohol isoamílico (24:1, volumen/volumen) y fue luego
precipitado mediante la adición de 10 \mul de acetato sódico 3 M
y 250 \mul de etanol al 95%. Después de revolvimiento con
formación de remolinos, se centrifugó inmediatamente el tubo a
14.000 rpm en una microcentrífuga durante 20 minutos. El sedimento
de centrifugación fue lavado con etanol al 80% sin revolvimiento,
centrifugado como antes durante 10 minutos, dejado secar al aire y
disuelto en 20 \mul de agua desionizada. El cDNA ds ligado al
adaptador fue luego fosforilado a 37ºC durante 30 minutos bajo las
condiciones siguientes: 20 \mul de disolución de cDNA ds ligado a
adaptador, Tris-HCl 50 mM (pH de 7,8 a 22ºC),
MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, ATP 1 mM, y 30 unidades de
polinucleótido quinasa de T4 (Epicenter Technology) en un volumen
final de 30 \mul. Luego se terminó la reacción de fosforilación
mediante la adición de 2 \mul de EDTA 0,2 M y se inactivo
térmicamente la mezcla de reacción a 70ºC durante 15 minutos.
\newpage
Operación
4
El cDNA ds ligado a adaptador y fosforilado
generado en la operación previa fue fraccionado en una columna de
1,2 ml de Sephacryl S500 0 (Pharmacia) para filtración en gel,
equilibrada mediante Tris-HCl 10 mM (pH de 7,4),
NaCl 30 mM y EDTA 0,5 mM. La distribución de los tamaños del cDNA
en las fracciones fue analizada mediante un gel de agarosa al
1,1%/EtBr junto con un marcador de tamaños de DNA de 1 kb (Life
Technologies). Las fracciones que correspondían a cDNAs con tamaños
superiores a 0,5 kb fueron reunidas (volumen total de 250 \mul) y
fueron precipitadas mediante la adición de 1/10 volúmenes (25
\mul) de acetato sódico 3 M, 1,5 \mul de glucógeno a 20 mg/ml,
y 2,5 volúmenes (400 \mul) de etanol al 95%.
Tras revolvimiento con formación de remolinos,
se centrifugó inmediatamente el tubo a 14.000 rpm en una
microcentrífuga durante 20 minutos. El residuo de centrifugación
fue lavado con etanol al 80% sin revolvimiento, centrifugado como
antes durante 10 minutos, dejado secar al aire y disuelto en 15
\mul de agua desionizada. El cDNA ds fue luego ligado al brazo
del vector EcoRI de \lambdagt11 (CLONTECH
Laboratories, Inc.) durante la noche a 16ºC bajo las condiciones
siguientes: 5 \mul de disolución de cDNA ds,
Tris-HCl 50 mM (pH de 7,8 a 22ºC), MgCl_{2} 10
mM, DTT 1 mM, ATP 1 mM, polietilenglicol (peso molecular de 8000) al
5%, 2,5 \mug de brazos EcoRI de \lambdagt11 y 2,5
unidades de DNA ligasa de T4 (Life Technologies) en un volumen
total de 25 \mul. La mezcla de ligación fue luego empaquetada
usando protocolos estándares como los descritos en el manual de
laboratorio de Sambrook et al.
(1989).
(1989).
Con objeto de confirmar la elevada calidad del
banco generado al utilizar los métodos y composiciones de la
presente invención, se seleccionaron al azar 50 clones de fago
recombinantes para la determinación del tamaño del inserto. La
distribución de los tamaños de los insertos estaba en el intervalo
de 0,5-4,5 kb, con un máximo de
2,0-3,0 kb que corresponden a la distribución de
tamaños de poli(A)+RNA de músculo esquelético en el RNA
total utilizado para la construcción de bancos de cDNA. Se
secuenciaron los mismos 50 insertos utilizando el kit de
secuenciación con DNA polimerasa Delta Tth (CLONTECH Laboratories,
Inc.). Diez de las secuencias fueron identificadas en una búsqueda
en la base de datos GenBank; son: el receptor de transferrina, la
proteína ribosómica L7, la cadena ligera 2 de miosina, la proteína
del dominio LIM, el factor 6 de ATPasa, la citocromo C oxidasa, la
\gamma-actina citoesquelética, la
\alpha-actina de músculo liso y la
\gamma-actina de músculo liso. Para tres cDNAs,
las secuencias de los clones eran más largas que las publicadas en
GenBank. Para siete cDNAs, sus secuencias correspondían exactamente
con secuencias de mRNA de longitud completa a partir del sitio de
caperuza.
Estos datos muestran que los métodos y
composiciones de la presente invención se pueden utilizar para la
construcción de bancos de cDNA, para generar un banco de cDNA de
alta calidad con un altísimo nivel de clones de cDNA de longitud
completa.
\vskip1.000000\baselineskip
La tecnología CAPswitch puede ser también
eficazmente combinada con tecnologías convencionales (no basadas en
PCR) estándares bien conocidas en la técnica. Como resultado, los
procedimientos convencionales pueden resultar significativamente
simplificados y se generará un banco de cDNA de longitud completa en
lugar de un banco de fragmentos de cDNA. En este ejemplo, como
material de partida para la síntesis de cDNA, se usó
poli(A)+RNA. En el diagrama de flujo de la Figura 4 se
ilustra la operación principal de la tecnología CAPswitch para la
construcción de bancos de cDNA de longitud completa, basada
esencialmente en el procedimiento convencional de adaptador
PRE-cebador descrito por Coleclough et al.
(1985). Resultará evidente a los expertos en la técnica que se
pueden variar la elección de enzimas que posean actividades
enzimáticas similares, la estructura del cebador de CDS (adaptador
PRE-cebador), el oligonucleótido CAPswitch y el
vector, y la elección de los sitios de restricción utilizados para
la clonación, como se muestra en la Figura 4, sin que cambie la
eficacia del procedimiento objetivo. Una modificación del
procedimiento puede ser llevar primero a cabo la síntesis de la
segunda cadena (operación 3), seguida por la digestión de
restricción (operación 2) y la clonación en un vector (operación
4). Otra modificación puede incluir utilizar el procedimiento de
ligación del adaptador, descrito en el Ejemplo 2, en lugar de la
digestión de restricción (operación 2). También se puede emplear el
uso del cebador del vector en lugar del adaptador
PRE-cebador para la síntesis de cDNA de primera
cadena (operación 1). En este caso, el cebador del vector puede
tener una secuencia de oligo-d(T) en un
extremo para iniciar la síntesis de la primera cadena, y una
secuencia oligonucleotídica CAPswitch en el otro extremo para
proporcionar el cambio de molde automático después de la compleción
de la síntesis de cDNA de primera cadena y longitud completa.
Cualesquiera de dichas variaciones en el protocolo preferido en que
se usen métodos y materiales de la invención objetivo están dentro
del alcance de la
invención.
invención.
\newpage
Operación 1
Se hibridaron 10 picomoles de cebador (CDS3)
para la síntesis de cDNA:
| 5' - d[TCTAGAATTCTCGAGGCGGCCGC(T)_{30}VN] - 3' | (ID. SEC. nº 16) | |
| 3' - d(AGATCTTAAGAGCTCCGCCGGCG) - 3' | (ID. SEC. nº 17) |
(en que V = G o A o C; N = G o A o T o C)
\vskip1.000000\baselineskip
y 10 picomoles del oligonucleótido CAPswitch
(CSO3):
| 5'-d(TGCTGCGAGAAGACGACAGAATTCGG)r(GGG)-3' | (ID. SEC. nº 18) |
con 5 \mug de poli(A)+RNA de músculo
esquelético humano (CLONTECH Laboratories, Inc.) en un volumen de
12,5 \mul de agua desionizada, calentando la mezcla durante 2
minutos a 70ºC y enfriando luego sobre hielo durante 2 minutos.
Luego se inició la síntesis de cDNA de primera
cadena-cambio de molde mezclando el cebador
hibridado-RNA con 1000 unidades de RNasa H de
M-MLV-transcriptasa inversa
(transcriptasa inversa Superscript II, Life Technologies) en un
volumen final de 25 \mul que contenía Tris-HCl 50
mM (pH de 8,3 a 22ºC), KCl 75 mM; MgCl_{2} 6 mM, DTT 1 mM, y
dATP, dGTP, dCTP y dTTP, cada uno 1 mM. Se incubó la mezcla de
reacción para síntesis de cDNA de primera
cadena-cambio de molde a 42ºC durante 1,5 horas en
una incubadora con aire y se detuvo la reacción mediante la adición
de 75 \mul de glucógeno (150 \mug/ml) y EDTA 10 mM. El híbrido
de mRNA:cDNA fue sometido una vez a extracción con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1, volumen/volumen) y una
vez con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1, volumen/volumen) y fue
luego precipitado mediante la adición de medio volumen de acetato
amónico 4 M (aproximadamente 40 \mul) y 3,7 volúmenes de etanol al
95% (aproximadamente 300 \mul). Después de revolvimiento con
formación de remolinos, se centrifugó inmediatamente el tubo a
14.000 rpm en una microcentrífuga durante 20 minutos. El sedimento
de centrifugación fue lavado con etanol al 80% sin revolvimiento,
centrifugado como antes durante 10 minutos, dejado secar al aire y
disuelto en 50 \mul de agua
desionizada.
desionizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación
2
El híbrido de mRNA:cDNA generado en la operación
1 fue sometido a digestión para clonación no direccional mediante
la endonucleasa de restricción EcoRI (EcoRI y
NotI o EcoRI y XhoI para la clonación
direccional) durante 1 hora a 37ºC en 100 ml de una mezcla de
reacción que contenía Tris-HCl 50 mM (pH de 7,5),
NaCl 100 mM; MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM y 50 unidades de la
endonucleasa de restricción EcoRI (New England BioLabs). Se
detuvo luego la reacción mediante la adición de 5 \mul de
glucógeno (2 mg/ml) y EDTA 0,2 M. El híbrido de mRNA:cDNA con
extremos EcoRI fue sometido una vez a extracción con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1, volumen/volumen) y
una vez con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1, volumen/volumen) y
fue luego precipitado mediante la adición de medio volumen de
acetato amónico 4 M (aproximadamente 40 \mul) y 3,7 volúmenes de
etanol al 95% (aproximadamente 300 \mul). Después de revolvimiento
con formación de remolinos, se centrifugó inmediatamente el tubo a
14.000 rpm en una microcentrífuga durante 20 minutos. El sedimento
de centrifugación fue lavado con etanol al 80% sin revolvimiento,
centrifugado como antes durante 10 minutos, dejado secar al aire y
disuelto en 5 \mul de agua
desionizada.
desionizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación
3
El híbrido de mRNA:cDNA sometido a digestión con
EcoRI fue luego ligado al brazo del vector EcoRI de
\lambdagt11 (CLONTECH Laboratories, Inc.) durante la noche a
16ºC bajo las condiciones siguientes: 5 \mul de disolución de
híbrido de mRNA:cDNA, Tris-HCl 50 mM (pH de 7,8 a
22ºC), MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, ATP 1 mM, polietilenglicol (peso
molecular de 8000) al 5%, 2,5 \mug de brazos EcoRI de
\lambdagt11 y 2,5 unidades de DNA ligasa de T4 (Life
Technologies) en un volumen total de 20 \mul.
\newpage
Operación 4
La síntesis del cDNA de segunda cadena se llevó
a cabo en un volumen total de 100 \mul que contenía 20 \mul del
híbrido de mRNA:cDNA ligado al vector, Tris-HCl 20
mM (pH de 7,5 a 22ºC), KCl 100 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4}
10 mM, MgCl_{2} 5 mM, \beta-NAD 0,15 mM, 50
\mug/ml de BSA, 300 unidades/ml de DNA polimerasa I de E.
coli, 12 unidades/ml de RNasa H de E. coli y 60
unidades/ml de DNA ligasa de E. coli. Se incubó la mezcla de
reacción a 16ºC durante 1,5 horas y se detuvo la reacción mediante
la adición de 4 \mul de glucógeno (2 mg/ml) y EDTA 0,2 M. El cDNA
ds fue sometido una vez a extracción con fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (25:24:1, volumen/volumen) y una vez con
cloroformo/alcohol isoamílico (24:1, volumen/volumen) y fue luego
precipitado mediante la adición de medio volumen de acetato amónico
4 M (aproximadamente 35 \mul) y 3,7 volúmenes de etanol al 95%
(aproximadamente 260 \mul). Después de revolvimiento con formación
de remolinos, se centrifugó inmediatamente el tubo a 14.000 rpm en
una microcentrífuga durante 20 minutos. El sedimento de
centrifugación fue lavado con etanol al 80% sin revolvimiento,
centrifugado como antes durante 10 minutos, dejado secar al aire y
disuelto en 10 \mul de agua desionizada.
El banco de cDNA de longitud completa fue luego
empaquetado usando un protocolo estándar descrito en el manual de
laboratorio de Sambrook et al. (1989). Con objeto de
confirmar la calidad del banco generado mediante los métodos y
materiales de la presente invención, se llevaron a cabo los mismos
experimentos de control de calidad que en el Ejemplo 2 para la
tecnología basada en PCR. La distribución de tamaños y la clonación
de alta eficacia del banco de cDNAs de longitud completa fueron
similares en ambos bancos.
Estos datos muestran que los métodos y
composiciones de la presente invención se pueden utilizar para la
construcción de bancos de cDNA basándose en la estrategia del
adaptador PRE-cebador, para generar bancos de cDNA
de alta calidad con un altísimo nivel de clones de cDNA de longitud
completa.
\vskip1.000000\baselineskip
También se utilizaron los métodos y materiales
de la invención objetivo para producir cDNA de alta calidad a
partir de nanogramos de RNA total o poliA+RNA. En el diagrama de
flujo de la Figura 1 (operaciones 1 y 2) se muestran las
operaciones principales de este procedimiento. Resultará evidente a
los expertos en la técnica que se pueden realizar ciertas
modificaciones en el protocolo preferido, tales como la estructura
del cebador de CDS, el oligonucleótido CAPswitch y el momento de
adición de los diferentes componentes de reacción, sin que cambie
la eficacia del procedimiento global.
En una realización del objeto de la invención,
el cDNA ds multiplicado mediante métodos y materiales de la
presente invención se ha utilizado en combinación con la tecnología
de sustracción de cDNA. Cuando se utiliza RNA total para la
síntesis de cDNA por métodos convencionales, el RNA ribosómico es
transcrito junto con la fracción de poliA+RNA aun cuando la
síntesis sea cebada con oligo(dT). Si se utiliza este cDNA en
el procedimiento de sustracción de cDNA, el exceso de RNA
ribosómico, las impurezas de DNA genómico y la baja concentración
de cDNA correspondiente a la fracción de poliA+RNA dan lugar a una
hibridación sustractiva ineficaz. Sin embargo, el cDNA generado al
utilizar métodos y materiales de la presente invención puede ser
utilizado directamente en el procedimiento de hibridación
sustractiva aun cuando se utilice RNA total como material de
partida. En una subrealización preferida, se utilizó cDNA ds
comprobador y conductor, multiplicado mediante métodos y materiales
de la presente invención, en combinación con la tecnología de
Hibridación Sustractiva por Supresión (Chenchik et al.,
Patente de EE.UU. nº 5.565.340). Se pueden emplear otros métodos de
hibridación sustractiva, descritos, por ejemplo, por Wigler et
al. (Patente de EE.UU. nº 5.436.142), Hampson et al.
[Nucl. Acids Res. 20: 2899 (1992)], Yang et al. [Anal.
Biochem. 237: 109-114 (1996)], Balzer et al.
[Nucl. Acids Res. 22: 2853-2854 (1994)] y otros,
utilizando cDNA ss o ds correspondiente al comprobador y/o el
conductor y multiplicado de acuerdo con los métodos de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación 1
Se hibridaron 10 picomoles del cebador CDS3
[cebador de oligo-d(T)] para la síntesis de
cDNA:
| 5' - d[AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)_{30}] - 3' | (ID. SEC. nº 67) | |
\vskip1.000000\baselineskip
y 10 picomoles de oligonucleótido CAPswitch
(Na1smG3):
| 5' - d(AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGC)r(GGG) - 3' | (ID. SEC. nº 68) |
en dos tubos de ensayo separados con 1 mg de
cada RNA total comprobador y conductor (CLONTECH Laboratories,
Inc.) en un volumen de 5 ml de agua desionizada, calentando la
mezcla durante 2 minutos a 70ºC y enfriando luego sobre hielo
durante 2 minutos. Luego se inició la síntesis de cDNA de primera
cadena mezclando el cebador hibridado-RNA con 200
unidades de RNasa H de
M-MLV-transcriptasa inversa
(transcriptasa inversa Superscript II, Life Technologies) en un
volumen final de 10 ml que contenía Tris-HCl 50 mM
(pH de 8,3 a 22ºC), KCl 75 mM; MgCl_{2} 6 mM, DTT 1 mM, y 1 mM de
cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP. La mezcla de reacción para la
síntesis de cDNA de primera cadena-cambio de molde
fue incubada a 42ºC durante 1,5 horas en una incubadora con aire y
fue luego diluida por adición de 40 ml de tampón TE [Tris 10 mM (pH
de 7,6) y EDTA 1 mM] y calentada a 72ºC durante 7 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación 2
Se llevó a cabo la multiplicación del cDNA de
longitud completa por PCR usando la mezcla de polimerasas Advantage
KlenTaq (CLONTECH Laboratories, Inc.). La multiplicación se llevó a
cabo en un volumen de 100 ml que contenía 5 ml de cDNA de primera
cadena diluido, Tricina-KOH 40 mM (pH de 9,2 a
22ºC), Mg(OAc)_{2} 3,5 mM, KOAc 10 mM, 75 mg/ml de
BSA, 200 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, 0,2 mM del
cebador de PCR (Na1sm):
| 5' - AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT - 3' | (ID. SEC. nº 69) |
y 2 ml de la mezcla de polimerasas KlenTaq. Los
parámetros térmicos de las reacciones PCR fueron los siguientes: 1
minuto a 95ºC seguido de 17-19 ciclos de 95ºC
durante 15 segundos y 68ºC durante 5 minutos; seguidos de una
extensión final de 10 minutos a 68ºC. Los productos de la PCR fueron
examinados en geles de agarosa al 1,2%/EtBr en tampón TAE 1x. Como
marcador de tamaños de DNA se utilizó una Escalera de DNA de 1 kb
(Life Technologies). Se terminó la reacción por adición de 2 ml de
EDTA 0,5 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación 3
Se añade un volumen igual de
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) a los productos de PCR
comprobador y conductor combinados de cada uno de los dos tubos de
reacción. Se revuelve a fondo con formación de remolinos. Se
centrifugan los tubos a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar
las fases. Se separa la capa superior (acuosa) y se pone en un tubo
limpio de 1,5 ml de capacidad. Se añaden 700 ml de
n-butanol y se revuelve la mezcla a fondo con
formación de remolinos. La extracción con butanol permite concentrar
el producto de PCR hasta un volumen de 40-70 ml. Se
centrifuga la disolución a temperatura ambiental y 14.000 rpm
durante 1 minuto. Se separa y desecha la fase superior (fase
orgánica de n-butanol). Si no se termina con un
volumen de 40-70 ml, se repite la operación de
extracción con butanol, con el mismo volumen de
n-butanol. Se invierte varias veces una columna
CHROMA SPIN-1000 (CLONTECH Laboratories, Inc.) de
0,75 ml para resuspender completamente la matriz de gel. Se quita
la tapa superior de la columna y luego se quita la tapa inferior. Se
pone la columna en un tubo de centrifuga de 1,5 ml de capacidad o
un tubo de 17 x 100 mm. Se desecha todo tampón de columna que se
recoja inmediatamente en el tubo y se añaden 1,5 ml de tampón TNE 1x
[Tris-HCl 10 mM (pH de 8,0), NaCl 10 mM y EDTA 0,1
mM]. Se deja que el tampón se filtre a través de la columna por
flujo gravitatorio hasta que se pueda ver la superficie de los
glóbulos de gel en la matriz de la columna. Se desecha el tampón
recogido y se continúa con la purificación. Se aplica cuidadosa y
lentamente la muestra al centro de la superficie plana de glóbulos
de gel. No hay que dejar que la muestra fluya a lo largo de la pared
interna de la columna. Se aplican 25 ml de tampón TNE 1x y se deja
que el tampón atraviese completamente la columna. Se aplican 150 ml
de tampón TNE 1x y se deja que el tampón atraviese completamente la
columna. Se transfiere la columna a un tubo limpio de
microcentrífuga de 1,5 ml de capacidad. Se aplican 320 ml de tampón
TNE 1x y se recogen como la fracción de cDNA purificada. Para
confirmar que el producto de PCR está presente en la
fracción de cDNA purificada, se lleva a cabo el análisis en gel de agarosa/EtBr como se describe en la operación 2.
fracción de cDNA purificada, se lleva a cabo el análisis en gel de agarosa/EtBr como se describe en la operación 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Operación 4
Se llevan a cabo una digestión con RsaI y
una sustracción de cDNA del modo descrito con detalle por Chenchik
et al. (Patente de EE.UU. nº 5.565.340).
Ha de entenderse que los ejemplos y las
realizaciones aquí descritos son solamente con fines
ilustrativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Kimmel, A. R., y S. L. Berger
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de EE.UU. nº 4.888.274; fecha de la Patente: 19 de Diciembre de
1989.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INFORMACIÓN SOBRE EL SOLICITANTE:
| Nombre(s) del Solicitante: | CLONTECH LABORATORIES, INC. | |
| Dirección; Calle: | 1020 East Meadow Circle | |
| Ciudad: | Palo Alto | |
| Estado/Provincia: | California | |
| País: | Estados Unidos | |
| Código postal: | 94303 | |
| Número de teléfono: | (415) 424-8222; \hskip0,5cm Fax: (415) 424-1352 |
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA CLONACIÓN DE cDNA DE LONGITUD COMPLETA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 66
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Saliwanchik & Saliwanchik
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2421 N. W. 41st. Street, Suite A-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Gainesville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Florida
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 32606
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con ordenador personal IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn, emisión nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE DE PATENTES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Saliwanchik, David R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31,794
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: CL-7
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (904) 375-8100
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (904) 372-5800
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Oligonucleótidos CAPswitch adicionales:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Un método para preparar DNA que sea
complementario de una molécula de RNA y un oligonucleótido de cambio
de molde, método que comprende las operaciones de:
hibridar un cebador para síntesis de cDNA con
dicha molécula de RNA y sintetizar una primera cadena de cDNA con
una transcriptasa inversa para formar un producto intermedio de
RNA-cDNA;
poner dicho producto intermedio de
RNA-cDNA en contacto con un oligonucleótido de
cambio de molde, en que dicho oligonucleótido de cambio de molde se
hibrida con el término de dicho producto intermedio de
RNA-cDNA que comprende el extremo 3' de dicha
primera cadena de cDNA y el extremo 5' de dicho RNA, dicho
oligonucleótido de cambio de molde sirve como molde para la
extensión de dicho extremo 3' de dicha primera cadena de cDNA, y
dicho oligonucleótido de cambio de molde tiene una preseleccionada
secuencia de nucleótidos arbitraria en su extremo 5' y al menos un
resto ribonucleotídico en su extremo 3'; y
extender dicho extremo 3' de dicha primera
cadena de cDNA para producir un DNA que es complementario de dicha
molécula de RNA y dicho oligonucleótido de cambio de molde.
2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
que comprende además multiplicar dicha primera cadena de cDNA
usando un segundo cebador oligonucleotídico que comprende una
secuencia de nucleótidos que es complementaria de al menos una
porción de dicha preseleccionada secuencia de nucleótidos de dicho
oligonucleótido de cambio de molde.
3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
en que dicha molécula de RNA tiene una estructura de CAP de
7-metilguanosina fijada al extremo 5' de dicho
RNA.
4. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
en que dicho oligonucleótido de cambio de molde tiene al menos tres
restos de riboguanina en su extremo 3'.
5. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
en que el grupo 3'-OH de la ribosa de dicho resto de
riboguanina comprende un grupo químico seleccionado del grupo que
consiste en los grupos amino, biotina, fosfato, glicerol y
fluoro.
6. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
en que dicho oligonucleótido de cambio de molde comprende una
proteína que se une a la estructura de CAP 5' de dicho RNA.
7. Un método de acuerdo con la Reivindicación 6,
en que dicha proteína es seleccionada del grupo que consiste en el
factor 4E eucariótico de iniciación y un anticuerpo
anti-estructura de CAP.
8. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
en que dicho oligonucleótido de cambio de molde se representa
mediante la fórmula:
5'-dN_{1}-dN_{2}-...dN_{m}-rN_{1}-rN_{2}...rN_{n}-3'
en
que
dN representa un desoxirribonucleótido
seleccionado del grupo que consiste en dAMP, dCMP, dGMP y dTMP;
m representa un número entero igual o superior a
0;
rN representa un ribonucleótido seleccionado
entre AMP, CMP, GMP y UMP; y
n representa un número entero igual o superior a
1.
9. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
en que dicho oligonucleótido de cambio de molde es seleccionado del
grupo que consiste en las ID. SEC. números 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9,
13, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,
51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 68,
84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,
100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 y 108.
10. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, en que dicho cebador para la síntesis de cDNA comprende una
secuencia complementaria de al menos un mRNA diana.
11. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, en que dicho cebador para la síntesis de cDNA comprende una
secuencia complementaria de la porción de poli(A) de
poliA+RNA.
\newpage
12. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, en que dicho cebador para la síntesis de cDNA es seleccionado
del grupo que consiste en las ID. SEC. números 8, 16, 67, 109, 110 y
111.
13. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, en que dicho cDNA anclado de longitud completa contiene al menos
un grupo hapteno y el método comprende además las operaciones de
incubar dicho cDNA anclado y haptenilado con el ligando de unión
del hapteno de dicho cDNA anclado y haptenilado, estando dicho
ligando de unión conjugado con un soporte, y siendo dicha
incubación bajo unas condiciones suficientes para permitir que dicha
sonda de cDNA anclada y haptenilada llegue a unirse con dicho
ligando de unión de dicho soporte; recuperar luego dicho cDNA
anclado y haptenilado unido al soporte, de las moléculas no unidas,
e incubar dicha sonda de cDNA anclada y haptenilada, unida al
soporte, bajo unas condiciones suficientes para que se libere dicho
cDNA anclado y haptenilado.
14. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, que comprende además la operación de tratar dicho cDNA anclado
de longitud completa, generado en la operación (c), bajo unas
condiciones bajo las cuales se sintetiza una segunda cadena de cDNA
por DNA polimerasa, utilizando la citada cadena de cDNA anclada de
longitud completa como molde, generándose de este modo un cDNA ds
de longitud completa.
15. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, que comprende además las operaciones de incubar dicho cDNA
anclado de longitud completa, generado en la operación (c), con una
combinación de cebadores que comprenden una secuencia de
nucleótidos que se corresponde con al menos una porción del citado
oligonucleótido de cambio de molde y del citado cebador para la
síntesis de cDNA, respectivamente, y una cantidad eficaz de otros
reactivos necesarios para llevar la PCR a cabo; siendo la
incubación bajo unas condiciones suficientes para que se lleve la
PCR a cabo, para generar por ello un cDNA ds de longitud
completa.
16. Un método de acuerdo con la Reivindicación
15, en que dichos cebadores son seleccionados del grupo que
consiste en las ID. SEC. números 10, 11, 12, 17, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 y 83.
17. Un método de acuerdo con la Reivindicación
15, que comprende además las operaciones de marcar dicho cDNA ds de
longitud completa mediante grupos informadores; poner dicho cDNA ds
marcado de longitud completa en contacto con los
oligonucleótidos/polinucleótidos definidos que corresponden a un
conjunto particular de los genes inmovilizados sobre un soporte
sólido, bajo unas condiciones suficientes para permitir la formación
de patrones de hibridación sobre las superficies causados por la
hibridación entre ciertas secuencias polinucleotídicas del citado
cDNA ds marcado de longitud completa y ciertos
oligonucleótidos/polinucleótidos definidos inmovilizados; y revelar
esos patrones citados mediante la detección de dichos grupos
informadores.
18. Un método de acuerdo con la Reivindicación
4, en que dicha transcriptasa inversa posee actividad transferasa
terminal.
19. Un método de acuerdo con la Reivindicación
18, en que dicho oligonucleótido de cambio de molde se une al
extremo 3' de dicha primera cadena de cDNA de dicho molde de
RNA-cDNA.
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