ES2266093T3

ES2266093T3 - Utilizacion de peptidos y/o proteinas para la preparacion de un medicamento terapeutico y/o preventivo.

Info

Publication number: ES2266093T3
Application number: ES01270546T
Authority: ES
Inventors: Peter Petzelbauer
Original assignee: Fibrex Medical Research and Development GmbH
Current assignee: Fibrex Medical Research and Development GmbH
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2021-12-07
Also published as: CN1518558A; EP1341819B1; ATE425184T1; PL209419B1; US20090137464A1; EP1341819A2; NO330767B1; BR0116122A; DK1586586T3; US7271144B2; US20070037749A1; HK1084400A1; ATE329614T1; CA2430972C; CN101676299A; HUP0401536A3; ZA200304545B; PL209752B1; AU2002221316A1; US8067373B2

Abstract

Utilización de péptidos o proteínas de fórmula general: (Ver fórmula) donde R1 y R2 significa, simultánea o independientemente, hidrógeno, un resto hidrocarbonato saturado o insaturado de 1 a 3 átomos de carbono, en particular hasta 10, donde a) Z5 significa un resto peptídico con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 11): (Ver secuencia) y Z1 significa resto de histidina Arg significa resto de arginina Z3 significa resto de prolina Z4 significa resto de leucina o donde b) Z5 significa un resto peptídico con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 12): (Ver secuencia) y Z1 significa un resto prolina Arg significa un resto arginina Z3 significa resto de valina Z4 significa resto de valina así como sus sales, amidas o mezclas de dichas substancias entre sí y/o como mínimo una sustancia adicional para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de inflamaciones locales y/o generalizadas del cuerpo de origen infeccioso, sobre la base de una reacción inmune, sobre la base de una enfermedad reumática, sobre la base de una alteración del sistema inmune, sobre la base de una enfermedad genética, para la prevención y/o el tratamiento de una reacción de rechazo en el transplante de órganos, de la arteriosclerosis, del trauma de reperfusión, sobre la base de enfermedades arterioscleróticas y/o de enfermedades trombóticas y del aumento de la deposición de fibrina.

Description

Utilización de péptidos y/o proteínas para la preparación de un medicamento terapéutico y/o preventivo.

La invención se refiere a la utilización de péptidos y/o proteínas para la preparación de un medicamento terapéutico y/o preventivo.

Hasta ahora, las sustancias utilizadas en la profilaxis y terapia para la detención o inhibición de reacciones inflamatorias, es decir, los agentes denominados inmunosupresores, comprenden substancialmente dos grupos diferentes. En primer lugar, los derivados de una hormona presente de forma natural en el cuerpo, la cortisona y en segundo lugar los agentes inmunosupresores extraños, como por ejemplo la ciclosporina y sus derivados, la azatioprina, la ciclofosfamida, etc. Es común a dichas sustancias un efecto antiinflamatorio; sin embargo dichas substancias tienen efectos secundarios graves en la terapia a largo plazo. Dichos efectos secundarios limitan una terapia a largo plazo, de aquí que dichas sustancias se utilicen de forma alternada o en combinación para reducir los efectos secundarios a una medida tolerable o principalmente para poder continuar la terapia. Como efectos secundarios se han nombrado las fracturas patológicas, las cuales se producen por un efecto osteoporoso de la cortisona o el fallo renal, al que da origen la ciclosporina. Ambos efectos secundarios incumben a ambos grupos de composiciones, por lo tanto, el momento en que debe retirarse la terapia sólo es cuestión de la duración de la terapia y de la dosis
global.

Es objeto de la presente invención, conseguir nuevos fármacos que sean apropiados para impedir o inhibir reacciones inflamatorias y que presenten solamente efectos secundarios menores. Un objeto adicional de la invención consiste en proporcionar una terapia a largo plazo.

A continuación se indican los aminoácidos de los péptidos utilizados según la invención con las abreviaturas comunes, indicando dichas abreviaturas \alpha-aminoácidos.

El objeto de la invención se resuelve mediante la utilización de péptidos o proteínas de fórmula general:

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1

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donde R_{1} y R_{2} significa, simultánea o independientemente, hidrógeno, un resto hidrocarbonato saturado o insaturado de 1 a 3 átomos de carbono, en particular hasta 10,

donde

a) Z_{5} significa un resto peptídico con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 11):

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100

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y

Z_{1} significa resto de histidina

Arg significa resto de arginina

Z_{3} significa resto de prolina

Z_{4} significa resto de leucina

o donde

\newpage

b) Z_{5} significa un resto peptídico con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 12):

101

y

Z_{1} significa un resto prolina

Arg significa un resto arginina

Z_{3} significa resto de valina

Z_{4} significa resto de valina

así como sus sales, amidas o mezclas de dichas substancias entre sí y/o como mínimo una sustancia adicional para la preparación de un medicamento para su utilización terapéutica o preventiva en la medicina humana y/o veterinaria para impedir la adhesión de células del torrente sanguíneo a las células endoteliales de la pared celular y/o una transmigración posterior a partir de la sangre en un tejido.

Se ha descrito que el fibrinógeno presenta las cadenas peptídicas alfa y beta y que en procesos inflamatorios aumenta fuertemente la síntesis del fibrinógeno (Eric et al., The Internacional Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol. 31, 1999, pág. 741-746). Además, se menciona el péptido B\beta_{15-42} (Ikematsu, Rinsho Kensa, vol. 28, Nr. 1, 1984, pág. 20-24). En Trombosis Research, 56, 1989, pág. 757-762 se describen diferentes tri- y tetrapéptidos, que presentan actividad antitrombótica. El papel fisiológico de los productos de corte y empalme del fibrinógeno se abordan también en Blood, vol. 71, 1988, pág. 1475-1479.

Era completamente sorprendente que la secuencia de aminoácidos definida más arriba impidiera la adhesión de células del torrente sanguíneo sobre las células endoteliales de la pared celular y/o su subsiguiente transmigración de la sangre en el tejido.

Además era totalmente sorprendente, que los fragmentos de secuencia, los péptidos y los fragmentos de degradación del fibrinógeno presentaran un efecto antiinflamatorio. Sin limitarse a este razonamiento teórico, dicho efecto podría basarse en el hecho de que la fibrina se une a las células endoteliales a través del extremo neo-N-terminal de la cadena B beta y a las células del torrente sanguíneo a través de la cadena A alfa y de esta manera conduce a la adhesión y transmigración de células al tejido. Dichas composiciones tienen un efecto secundario, en concreto inhiben la formación de fibrina. Sin embargo, dicha inhibición no supone ninguna desventaja potencial para los pacientes, dado que la coagulación de la sangre incluso en ausencia de fibrina es suficiente en el caso de heridas banales. Únicamente en el caso de intervenciones quirúrgicas podría ser conveniente retirar una terapia de este tipo. Se excluyen sustancialmente otros efectos secundarios, dado que dichas sustancias sólo interaccionan con los ligandos naturales. Además, no se influencia de forma negativa la defensa natural a través de los leucocitos en sangre. Así pues, la composición del mismo permanece inalterada, por ejemplo los granulocitos, los linfocitos y los monocitos, de manera que se mantiene el proceso de defensa natural y permanece inalterada la defensa contra las infecciones en sangre.

El fibrinógeno se forma en el hígado y en esta forma es biológicamente inactivo y se encuentra normalmente en concentraciones alrededor de 3 g/l en sangre. Mediante el proceso de segregación proteolítica de la proenzima protrombina, se forma trombina, la cual disocia el fibrinógeno en los fibrinopéptidos A y B. De esta forma se transforma el fibrinógeno en su forma biológicamente activa. Se forma la fibrina y los productos de disociación de la fibrina.

La trombina se forma en cualquier activación de la coagulación de la sangre, es decir, en cualquier daño de tejido, sea de origen inflamatorio, traumático o degenerativo. La formación de fibrina mediada por trombina es principalmente un proceso protector, destinado a solucionar rápidamente los defectos producidos en el sistema vascular. Sin embargo, la formación de fibrina también es un proceso patogénico. La creación de un trombo de fibrina como causa desencadenante de un infarto de corazón es uno de los problemas más prominentes de la medicina humana.

Hasta ahora no se ha investigado, o no de forma suficiente, el papel de la fibrina en la extravasación de células inflamatorias desde el torrente sanguíneo hacia el tejido, un procedimiento que por un lado es deseable en la defensa contra microorganismos patógenos o células tumorales presentes en el tejido, pero que por otro lado es un procedimiento que induce por si mismo daños al tejido o que los mantiene. La fibrina se une a las células endoteliales a través del extremo neo-N-terminal de la B beta por medio de la secuencia B beta y a las células del torrente sanguíneo por medio de la secuencia de la cadena A alfa y de esta manera conduce a la adhesión y transmigración de células al tejido.

Los péptidos o proteínas utilizados según la invención pueden impedir la adhesión de células de la corriente sanguínea a las células endoteliales de la pared vascular y/o su subsiguiente transmigración desde la sangre hacia el tejido.

Un péptido o proteína utilizado según la invención, donde Z_{5} significa un resto peptídico con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 11):

102

y

Z_{1} significa un resto histidina

Arg un resto arginina

Z_{3} un resto prolina

Z_{4} un resto leucina,

impide una deposición o una adhesión de fragmentos de degradación de la fibrina sobre la pared vascular. De esta manera, no pueden adherirse células inflamatorias sobre las células endoteliales de la pared vascular de arterias y venas y se impide que

\hbox{las células de este tipo
permanezcan en la pared vascular y de esta manera puedan alcanzar el
tejido.}

Un péptido o proteína utilizado según la invención, donde Z_{5} significa un resto peptídico con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 12):

103

y

Z_{1} significa un resto prolina

Arg un resto arginina

Z_{3} un resto valina

Z_{4} un resto valina,

determina que las células de la sangre periférica no puedan adherirse a la fibrina o los fragmentos de degradación de la fibrina y de esta manera impide su migración en el tejido.

Los productos de disociación descritos también se conocen en la literatura como péptido B beta y péptido A alfa. La ruta proadhesiva y promigratoria indicada más arriba es una ruta completamente nueva para el sistema de control de la migración de células desde la sangre en el tejido. Dicha función de la fibrina puede bloquearse tanto mediante el péptido B beta como mediante el péptido A alfa.

Dichos péptidos utilizados según la invención se ofrecen por tanto como agentes terapéuticos en el hombre y en los animales, para bloquear la migración de células desde la sangre hacia el tejido. Dado que la fibrina y otros productos del fibrinógeno que se forman mediante la segregación proteolítica, como por ejemplo el activador del plasminógeno uroquinasa proveniente de la segregación del fibrinógeno, se forman solamente de forma específica y delimitados regionalmente, es decir, en las zonas de inflamación, alteración de la coagulación, arteriosclerosis, trombosis y/o crecimiento tumoral, se trata de agentes terapéuticos de efecto delimitado regionalmente, de manera que no se esperan efectos secundarios patológicos en otras zonas, o sólo en una medida limitada.

Por lo tanto, algunos campos de aplicación completamente inesperados de los péptidos y/o proteínas según la invención se encuentran en la preparación de medicamentos para la terapia o prevención de inflamaciones locales y/o generalizadas del cuerpo de origen infeccioso, sobre la base de una reacción autoinmune, sobre la base de una enfermedad reumática, sobre la base de una alteración del sistema inmune, sobre la base de una enfermedad genética, para la prevención y/o terapia de una reacción de rechazo en el transplante de órganos, de la arteriosclerosis, de un trauma de reperfusión, sobre la base de enfermedades arterioscleróticas y/o trombóticas y deposición de fibrina aumentada. Uno de dichos péptidos, en particular el B beta, también es extraordinariamente apropiado para la preparación de un medicamento que lleve a cabo el transporte de otro medicamento a las células endoteliales humanas o animales. Para ello el medicamento a transportar se acopla al péptido en un extremo y de esta manera interacciona con una posición libre de la pared celular, por ejemplo, con una célula endotelial, a través de la VE-cadherina.

A continuación se explica más detalladamente la invención con la ayuda de algunos ejemplos.

Ejemplo 1 Preparación de productos de disociación del fibrinógeno

Se obtuvieron productos de degradación del fibrinógeno no polimerizables mediante digestión con bromuro de cianógeno según Blombäck et al. (Nature 1968, 218; 130-134). El fibrinógeno digerido de esta manera está formado en una gran parte por un fragmento de 63 kD, en concreto la trama disulfuro N-terminal, NDSK y contiene la cadena A alfa 1-51, la cadena B beta 1-118 y la cadena gamma 1-78. Para obtener NDSK-II (NDSK menos los fibrinopéptidos A y B), los aminoácidos N-terminales de las cadenas A alfa y B beta se disocian con trombina (20 unidades/1 \mug de NDSK) durante tres horas a temperatura ambiente y a continuación se trató con fluorofosfato de diisopropilo para bloquear la actividad de la trombina. El NDSK-II obtenido de esta manera está formado por la cadena A alfa 17-51, la cadena B beta 15-118 y la cadena gamma 1-78.

Para obtener NDSK-uPA, se trataron 500 \mug de NDSK con 200 unidades de activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) de la compañía Technoclone, Viena, Austria, durante una hora a 37ºC. La reacción se detuvo con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 5 mM. El NDSK-uPA obtenido de esta manera es un NDSK y no presenta fibrinopéptido
B.

Como control negativo se obtuvo una segunda fracción a partir del producto de disociación del fibrinógeno obtenido tras el tratamiento con bromuro de cianógeno, denominada FCB-2, según Nieuwenhuizen et al. (Biochem. Biophys. Acta, 1983, 755; 531-533). FCB-2 es una proteína de 43 kD de tamaño y está formado por la cadena A alfa 148-208, la cadena B beta 191-305 y la cadena gamma 95-265. Dicha proteína se trató de la misma manera con trombina y con fluorofosfato de diisopropilo como control. Sin embargo, no se produjo ninguna modificación de la proteína (denominada en adelante FCB-2-thr).

Para otros controles negativos se trató medio de cultivo (RPMI de la compañía Life Techn. Inc., Paisky, UK) con trombina, de la misma manera que se ha indicado más arriba y a continuación se inactivó (RPMI-thr) o se trató con uPA, tal como se ha indicado más arriba y se inactivó (RPMI-uPA).

Ejemplo 2

El péptido A alfa (SEQ ID NO 12) corresponde a los aminoácidos 1 a 28 y a la secuencia de la cadena alfa de la fibrina y es idéntico a los aminoácidos 17 a 45 de la cadena A alfa del fibrinógeno:

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104

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El péptido B beta (SEQ ID NO 11) corresponde a los aminoácidos 1 a 28 y a la secuencia de la cadena beta de la fibrina y es idéntico a los aminoácidos 15 a 43 de la cadena B beta del fibrinógeno, presentando la siguiente
secuencia:

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105

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Ambos péptidos se sintetizaron mediante síntesis peptídica en fase fija según Merrifield R.B., J. AMER. Chem. Soc. 1963; 85, 2149-2154, con un sintetizador de péptidos múltiple utilizando una estrategia de grupo protector con fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), según Carpino L.A. y Han. G.Y., J. Amer. Chem. Soc., 1981; 37; 3404-3409. La purificación del péptido crudo se llevó a cabo mediante HPLC de fase reversa preparativa a través de una columna C18 de nucleosilo 100-10, según Engelhart H. Y Müller H., Chromatography, 1984, 19:77, así como Henschen A., Hupe K.P. y Lottspeich F. High Performance Liquid Chromatography-cromatografía líquida de alta resolución-VCH 1985. Como péptidos control se utilizaron péptidos con la misma longitud pero con secuencias de aminoácidos al
azar.

Ejemplo 3 Modelo en ratón HU-SCID

Se transplantó piel humana en la espalda de ratones SCID y dos semanas después se inyectaron linfocitos humanos en el peritoneo. Se procedió según Petzelbauer et al. (J. Invest. Dermatol., 1996, 107; 576-581). Para ello se inyectó a quince ratones preparados de esta manera en la vena de la cola:

a): 100 \mug de NDSK-II humano

b): 100 \mug de FCB-2 humano

c): 100 \mug de péptido A alfa

d): 100 \mug de péptido B beta

e): 100 \mug de A alfa al azar

f): 100 \mug de B beta al azar

Veinticuatro horas más tarde se extrajo la piel humana y se calculó la cantidad de posiciones de inflamación, expresado en células por 0,3 mm^{2} y se determinó la media con la desviación estándar.

En a:	22	\pm	2,8
En b:	9	\pm	2,1
En c:	4	\pm	1,1
En d:	6	\pm	1,1
En e:	5	\pm	1,2
En f:	7	\pm	1,3

De aquí se deduce que NDSK-II conduce a inflamación y en adelante se utilizó dicha proteína como sustancia patógena. Las otras preparaciones no muestran por sí solas un aumento significativo de las células inflamatorias.

Ejemplo comparativo 4

A quince ratones según el Ejemplo 3 se les inyectó en la vena del rabo:

: 100 \mug de NDSK-II humano y

: 100 \mug de péptido A alfa aleatorizado

Se procedió a continuación según el Ejemplo 3. Se obtuvo como resultado 23 \pm 3,5 posiciones de inflamación por 0,3 mm^{2}.

Ejemplo comparativo 5

A quince ratones según el Ejemplo 3 se les inyectó en la vena del rabo:

: 100 \mug de NDSK-II humano y

: 100 \mug de péptido B beta aleatorizado

Se procedió a continuación según el Ejemplo 3. Se obtuvo como resultado 24 \pm 2 posiciones de inflamación por 0,3 mm^{2}.

Ejemplo 6

A quince ratones según el Ejemplo 3 se les inyectó en la vena del rabo:

: 100 \mug de NDSK-II humano y

: 100 \mug de péptido A alfa sintético

Se procedió a continuación según el Ejemplo 3. Se obtuvo como resultado 21 \pm 2,2 posiciones de inflamación por 0,3 mm^{2}.

Ejemplo 7

A quince ratones según el Ejemplo 3 se les inyectó en la vena del rabo:

: 100 \mug de NDSK-II humano y

: 100 \mug de péptido B beta sintético

Se procedió a continuación según el Ejemplo 3. Se obtuvo como resultado 14 \pm 2 posiciones de inflamación por 0,3 mm^{2}.

De los ejemplos 4 a 7 se deduce que el péptido B beta bloquea la inflamación linfocitaria.

Ejemplo comparativo 8

Se marcaron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con colorante de fluorescencia roja (Cell Tracker Orange, 1 \mul/ml, Molecular Probes, Eugene, OR) y se cultivaron sobre una matriz de colágeno (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Tras la confluencia de las células endoteliales, se superpusieron células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) (105 células por 25 mm^{2}) marcadas con colorante de fluorescencia verde (Cell Tracker Green, 1 \mul/ml, Molecular Probes de la compañía Eugene Origon). Después se incubaron las células durante doce horas a 37ºC.

Las células adheridas y transmigradas al gel se fotografiaron con un microscopio de exploración por láser, se transformó en Píxels y se valoró mediante "NIH Image" según Gröger et al. (J. Immunol. Method 1999; 222: 101-109).

Se calculó el número de células adheridas por 0,1 mm^{2}, indicado más abajo como adhesión. Se calculó el número de células migradas por 0,04 mm^{2}, indicado más abajo como migración. Se determinó el valor medio, conjuntamente con la desviación estándar, de tres ensayos, cada uno de ellos realizado tres veces.

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		Adhesión	Migración

a) RPMI-uPA	0,1 \mug/ml	40 +/- 4	4 +/- 3
	1,0 \mug/ml	38 +/- 2	5 +/- 2
	10,0 \mug/ml	32 +/- 4	5 +/- 1

b) NDSK	0,1 \mug/ml	31 +/- 18	6 +/- 3
	1,0 \mug/ml	35 +/- 18	5 +/- 2
	10,0 \mug/ml	36 +/- 24	6 +/- 13

c) NDSK-II	0,1 \mug/ml	55 +/- 3	12 +/- 5
	1,0 \mug/ml	67 +/- 3,5	19 +/- 12
	10,0 \mug/ml	65 +/- 3	19 +/- 10

d) NDSK-uPA	0,1 \mug/ml	58 +/- 3	10 +/- 2
	1,0 \mug/ml	60 +/- 3,5	14 +/- 3
	10,0 \mug/ml	65 +/- 3	18 +/- 1,5

e) FCB2	0,1 \mug/ml	30 +/- 26	6 +/- 4
	1,0 \mug/ml	10 +/- 10	3 +/- 2
	10,0 \mug/ml	21 +/- 7	5 +/- 4

f) FCB-2-thr	0,1 \mug/ml	20 +/- 12	6 +/- 5
	1,0 \mug/ml	23 +/- 13	7 +/- 5
	10,0 \mug/ml	26 +/- 11	4 +/- 2

g) RPMI-thr	0,1 \mug/ml	29 +/- 15	4 +/- 5
	1,0 \mug/ml	26 +/- 14	5 +/- 5
	10,0 \mug/ml	41 +/- 20	5 +/- 4

De aquí se deriva que NDSK-II conduce en mayor grado que NDSK-uPA a migraciones significativas de células monocelulares de la sangre periférica (PBMC) y por ello actúa como un patógeno. Ninguno de los controles a), b), e), f) y g) condujo a una migración significativa.

Ejemplo 9

La matriz de colágeno según el Ejemplo 8 con la suspensión extraída de PBMC se trató con 100 \mug de NDSK-II y B beta o B beta aleatorizada y se continuó procediendo según el Ejemplo 8.

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	Adhesión	Migración

a) sin adición de NDSK-II	38 +/- 15	6 +/- 4

b) sólo 100 \mug de NDSK-II	73 +/- 29	16 +/- 7

c) 10 \mug de B beta + NDSK-II	63 +/- 33	7 +/- 4

d) 100 \mug de B beta + NDSK-II	47 +/- 34	5 +/- 4

e) 1000 \mug de B beta + NDSK-II	52 +/- 27	10 +/- 6

f) 10 \mug de B beta aleator. + NDSK-II	77 +/- 33	16 +/- 6

g) 100 \mug de B beta aleator. + NDSK-II	86 +/- 35	15 +/- 6

h) 1000 \mug de B beta aleator. + NDSK-II	78 +/- 31	13 +/- 8

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Como se deduce de estos resultados de ensayo, el péptido B beta bloquea las inflamaciones.

Ejemplo 10

La matriz de colágeno según el Ejemplo 8 con la suspensión extraída de PBMC se trató con 100 \mug de NDSK-II y A alfa o A alfa aleatorizada y se continuó procediendo según el Ejemplo 8.

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	Adhesión	Migración

a) sin adición de NDSK-II	42 +/- 6	10 +/- 1

b) sólo NDSK-II	96 +/- 11	24 +/- 3

c) 10 \mug de A alfa + NDSK-II	69 +/- 12	21 +/- 4

d) 100 \mug de A alfa + NDSK-II	73 +/- 13	15 +/- 6

e) 1000 \mug de A alfa + NDSK-II	70 +/- 6	13 +/- 5

f) 10 \mug de A alfa aleator. + NDSK-II	70 +/- 6	25 +/- 2

g) 100 \mug de A alfa aleator. + NDSK-II	65 +/- 16	24 +/- 3

h) 1000 \mug de B beta aleator. + NDSK-II	70 +/- 12	26 +/- 3

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A partir de estos resultados de los ensayos puede deducirse que el péptido A alfa sólo bloquea parcialmente la migración de los PBMC.

Ejemplo 11

Dado que los PBMC están formados substancialmente por una mezcla de linfocitos y monocitos, se utilizaron linfocitos puros en vez de PBMC (utilizado en los Ejemplos 8 - 10) en el Ejemplo 11.

A la matriz de colágeno según el Ejemplo 8 con células endoteliales y linfocitos, se le añadieron 100 \mug de NDSK-uPA ó 100 \mug de NDSK-II y A alfa, o B beta, respectivamente.

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	Adhesión	Migración

a) sin adición de NDSK-II	68 +/- 8	16 +/- 3

b) NDSK-uPA	143 +/- 11	53 +/- 5

c) NDSK-II	119 +/- 11	43 +/- 4

d) sólo 100 \mug de B beta	58 +/- 18	14 +/- 1

e) NDSK-uPA + 100 \mug de B beta	74 +/- 8	19 +/- 2

f) NDSK-II + 100 \mug de B beta	74 +/- 8	17 +/- 3

g) Sólo 100 \mug de A alfa	77 +/- 4	18 +/- 1

h) NDSK-uPA + 100 \mug de A alfa	131 +/- 4	40 +/- 3

i) NDSK-II + 100 \mug de A alfa	131 +/- 4	44 +/- 4

j) Sólo 100 \mug de B beta aleatorizada	75 +/- 5	19 +/- 1

k) NDSK-uPA + 100 \mug de B beta aleatorizada	134 +/- 13	46 +/- 4

l) NDSK-II + 100 \mug de B beta aleatorizada	120 +/- 12	42 +/- 4

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A partir de estos resultados de los ensayos se deriva

1): que tanto NDSK-II como también NDSK-uPA promueve la inflamación por linfocitos,

2): que el péptido B beta bloquea completamente la adhesión y migración de linfocitos inducida por NDSK-II y NDSK-uPA; por el contrario el péptido A alfa no tiene efecto bloqueador, de lo cual se deduce que la cadena alfa libre no es necesaria para la inducción de la adhesión y migración de los linfocitos.

Ejemplo 12

Se procedió según el Ejemplo 11, pero en vez de linfocitos se utilizaron monocitos puros. Se añadió a 100 \mug de NDSK-uPA ó 100 \mug de NDSK-II, péptido A alfa, A alfa aleatorizado, B beta aleatorizado o B beta.

	Adhesión	Migración

a) sin adición	43 +/- 8	7 +/- 1

b) NDSK-uPA	48 +/- 10	10 +/- 2

c) NDSK-II	90 +/- 11	19 +/- 6

d) 100 \mug de B beta	59 +/- 7	5 +/- 1

e) NDSK-uPA + 100 \mug de B beta	61 +/- 11	6 +/- 3

(Continuación)

	Adhesión	Migración

f) NDSK-II + 100 \mug de B beta	70 +/- 7	7 +/- 5

g) 100 \mug de B beta aleator.	40 +/- 7	6 +/- 1

h) NDSK-uPA + 100 \mug de B beta aleatorizado	45 +/- 5	8 +/- 3

i) NDSK-II + 100 \mug de B beta aleatorizado	92 +/- 10	20 +/- 7

j) 100 \mug de A alfa	59 +/- 6	5 +/- 1

k) NDSK-uPA + 100 \mug de A alfa	62 +/- 4	8 +/- 5

l) NDSK-II + 100 \mug de A alfa	68 +/- 10	9 +/- 6

m) 100 \mug de A alfa aleator.	58 +/- 7	6 +/- 1

n) NDSK-uPA + 100 \mug de A alfa aleatorizado	50 +/- 10	10 +/- 4

o) NDSK-II + 100 \mug de A alfa aleatorizado	108 +/- 8	21 +/- 5

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A partir de estos resultados de los ensayos se deriva que sólo NDSK-II y no NDSK-uPA promueve la migración de monocitos, ahora bien, tanto la cadena alfa como también la cadena beta deben presentar un extremo N-terminal libre y bloquean la migración de monocitos.

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Ejemplo 13

Se procedió según el Ejemplo 11, se utilizaron linfocitos puros. Se añadió a 100 \mug de NDSK-uPA ó 100 \mug de NDSK-II, sales peptídicas cortas, derivada de A alfa acetato de Gly Pro Arg (Pro)-NH_{2} (derivado de A alfa) o derivada de B beta acetato de Gly His Arg Pro-OH (derivado de B beta).

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	Adhesión	Migración

a) sin adición	60 +/- 8	14 +/- 1

b) NDSK-uPA	149 +/- 12	57 +/- 5

c) NDSK-II	121 +/- 11	48 +/- 7

d) Sólo 100 \mug de derivado de B beta	58 +/- 10	12 +/- 9

e) NDSK-uPA + 100 \mug de derivado de B beta	70 +/- 8	16 +/- 3

f) NDSK-II + 100 \mug de derivado de B beta	69 +/- 7	14 +/- 5

g) Sólo 100 \mug de derivado de A alfa	77 +/- 4	18 +/- 1

h) NDSK-uPA + 100 \mug de derivado de A alfa	134 +/- 4	48 +/- 5

i) NDSK-II + 100 \mug de derivado de A alfa	131 +/- 7	49 +/- 6

(Continuación)

	Adhesión	Migración

j) Sólo 100 \mug de derivado de B beta aleatorizado	70 +/- 5	14 +/- 7

k) NDSK-uPA + 100 \mug de derivado de B beta aleatorizado	130 +/- 12	49 +/- 6

l) NDSK-II + 100 \mug de derivado de B beta aleatorizado	120 +/- 10	55 +/- 8

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A partir de estos resultados de los ensayos se deduce que en la inhibición de la migración de linfocitos, dichos péptidos cortos tienen el mismo efecto que los péptidos largos, bajo la correspondiente adición continua.

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Ejemplo 14

Se procedió según el Ejemplo 11, se utilizaron monocitos puros. Se añadió a 100 \mug de NDSK-uPA ó 100 \mug de NDSK-II, sales peptídicas cortas, derivada de A alfa acetato de Gly Pro Arg (Pro)-NH_{2} (derivado de A alfa) o derivada de B beta acetato de Gly His Arg Pro-OH (derivado de B beta).

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	Adhesión	Migración

a) sin adición	40 +/- 8	5 +/- 1

b) NDSK-uPA	59 +/- 9	7 +/- 2

c) NDSK-II	85 +/- 11	22 +/- 6

d) Sólo 100 \mug de derivado de B beta	52 +/- 7	6 +/- 1

e) NDSK-uPA + 100 \mug de derivado de B beta	61 +/- 11	8 +/- 3

f) NDSK-II + 100 \mug de derivado de B beta	68 +/- 7	8 +/- 4

g) Sólo 100 \mug de derivado de A alfa	40 +/- 7	6 +/- 1

h) NDSK-uPA + 100 \mug de derivado de A alfa	44 +/- 6	8 +/- 2

i) NDSK-II + 100 \mug de derivado de A alfa	92 +/- 10	23 +/- 7

j) Sólo 100 \mug de derivado de B beta aleatorizado	50 +/- 5	4 +/- 4

k) NDSK-uPA + 100 \mug de derivado de B beta aleatorizado	60 +/- 5	7 +/- 6

l) NDSK-II + 100 \mug de derivado de B beta aleatorizado	64 +/- 11	8 +/- 2

m) Sólo 100 \mug de derivado de A alfa aleatorizado	54 +/- 10	6 +/- 3

n) NDSK-uPA + 100 \mug de derivado de A alfa aleatorizado	50 +/- 10	10 +/- 4

o) NDSK-II + 100 \mug de derivado de A alfa aleatorizado	99 +/- 8	21 +/- 7

A partir de estos resultados de los ensayos se deduce que en la inhibición de la migración de monocitos, dichos péptidos cortos tienen el mismo efecto que los péptidos largos, bajo la correspondiente adición continua.

Ejemplo 15

Se llevaron a cabo los ensayos con ratas Wistar macho con un peso entre los 220 g y los 280 g. Las ratas se alimentaron con una dieta estándar y agua. Para llevar a cabo los ensayos, se anestesiaron las ratas y se llevó a cabo una respiración artificial con una frecuencia de 70 pulsos por minutos, suministrándose de 8 ml a 10 ml por kilogramo de un gas con un 30% en volumen de oxígeno con una sobrepresión de 1 mm a 2 mm de mercurio. La arteria coronaria derecha se proveyó con una cánula de medición y se determinó la tensión sanguínea en la arteria así como los latidos. Se determinó el índice de tensión como el producto de la tensión sanguínea en la arteria y del valor del latido cardíaco con las dimensiones mm de mercurio/minuto/10^{3}. La vena derecha se proveyó con una cánula de medición para suministrar las sustancias de ensayo. Después de la preparación quirúrgica, se administraron 2 ml de sangre de rata al corazón. Después de treinta minutos, se obturó la arteria coronaria izquierda. Después de veinticinco minutos adicionales, se retiró la obturación, para irrigar de sangre de nuevo el área isquémica. En este instante, se administró a la mitad de los animales 800 \mug/kg de péptido B beta o péptido B beta aleatorizado de forma intravenosa y se dejó transcurrir dos horas.

Para diferenciar entre tejido dañado y tejido no dañado del corazón, se le añadió a continuación a la arteria del corazón izquierda el colorante azul de Evans en una concentración del 2% en peso. El corazón extraído se dividió entonces en cinco secciones horizontales, se separó la pared venosa derecha y se trataron las secciones con cloruro de trifeniltetratol (1% en peso) durante veinte minutos a 37ºC, para diferenciar entre tejido normal y tejido en infarto. Las secciones se valoraron con planimetría soportada por computadora.

A través de la obturación de conducto, en el corazón de las ratas de comparación se amenazó el 62,5% del músculo cardíaco; en los corazones de las ratas de ensayo, el 60%. En los corazones de las ratas de comparación, se murió el 46% del tejido afectado, en contraposición con el 29% en los corazones de las ratas de ensayo. Esto corresponde a una reducción de tejido muerto en un 37% (p < 0,05).

Las sustancias utilizadas según la invención tienen especial importancia para la preparación de un medica-
mento:

En el caso de un medicamento para la terapia de enfermedades producidas por la acción perjudicial para el tejido de linfocitos autoreactivos.

Entre ellas se encuentran las enfermedades del formenkreis de la autoinmunidad, como por ejemplo la colagenosis, las enfermedades reumáticas, la psoriasis y las enfermedades post-/para-infecciosas y las enfermedades producidas por una reacción injerto contra huésped. Se produce un efecto curativo, dado que dicho medicamento bloquea la migración de los linfocitos en el tejido. Los linfocitos permanecen así en el torrente sanguíneo y no pueden producir ningún efecto autoreactivo perjudicial para el tejido.

En el caso de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de reacciones de rechazo en transplantes de órganos se produce un efecto curativo, dado que dicho medicamento impide la migración de linfocitos de la corriente sanguínea en el órgano extraño y de esta manera el órgano extraño no puede ser destruido por los linfocitos autoreactivos.

En el caso de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la arteriosclerosis en el transplante de órganos se produce un efecto curativo, dado que dicho medicamento impide la migración de linfocitos y monocitos a la pared vascular y de esta manera impide la activación de las células de la pared vascular. De esta manera, se minimiza o impide la arteriosclerosis subsiguiente al transplante de órganos.

En el caso de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención del trauma de reperfusión después de una reirrigación sanguínea inducida quirúrgica- o farmacéuticamente, por ejemplo después de un infarto de corazón, de un fallo cardíaco, de operaciones vasculares, de operaciones de by-pass y del transplante de órganos, se produce un efecto curativo, dado que dicho medicamento inhibe la migración de linfocitos y monocitos a la pared vacular. El trauma de reperfusión se produce por carencia de oxígeno/acidosis de las células de los vasos sanguíneos durante la reirrigación sanguínea y conduce a su activación. De esta manera, los linfocitos y monocitos se adhieren a la pared vascular y migran a su través. La inhibición de la adhesión y migración de los linfocitos y monocitos en la pared vascular disminuye los daños producidos por hipoxia/acidosis sin que se produzcan un daño vascular permanente después de la reacción inflamatoria subsiguiente.

En el caso de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de arteriosclerosis como consecuencia de enfermedades metabólicas o de procesos de envejecimiento, se produce un efecto curativo, dado que dicho medicamento impide la migración de linfocitos y monocitos en la pared vascular y de esta manera inhibe el progreso de la placa arteriosclerótica resultante.

El medicamento proporcionado por la presente invención también puede emplearse para transportar otro medicamento. El medicamento según la invención se une de forma específica a una molécula de superficie de las células endoteliales. De esta manera, medicamentos acoplados al mismo pueden introducirse en las células endoteliales en alta concentración sin que puedan provocar efectos secundarios en otros lugares. Como ejemplo, se menciona la utilización de sustancias inhibidoras de la división celular, las cuales pueden producir un efecto antiangiogenético dirigido de forma específica a las células endoteliales. Se produce en este caso un efecto curativo en pacientes con tumores, dado que el crecimiento de tumor se bloquea mediante la inhibición de la proliferación de las células endoteliales y como consecuencia mediante la inhibición de la neoangiogénesis.

<110> FIBREX Medical Research & Development GMBH

\hskip0,98cm

Petzelbauer, Peter

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<120> péptidos y/o proteínas así como la utilización de las mismas para la preparación de un medicamento terapéutico y/o preventivo

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<130> 2760 PCT

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<140> PCT/AT 01/00387

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<141> 2003-12-07

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<150> AT A 2063/2000

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<151> 2000-12-12

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<160> 2

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<170> PatenIn versión 3.1

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<210> 11

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial;

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = corresponde a los aminoácidos 6-28 de la secuencia de la cadena B beta de la fibrina

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<400> 1

106

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<210> 12

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<221> fuente

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<400> 2

107

Claims

1. Utilización de péptidos o proteínas de fórmula general:

2

donde

a) Z5 significa un resto peptídico con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 11):

108

y

Z_{1} significa resto de histidina

Arg significa resto de arginina

Z_{3} significa resto de prolina

Z_{4} significa resto de leucina

o donde

109

y

Z_{1} significa un resto prolina

Arg significa un resto arginina

Z_{3} significa resto de valina

Z_{4} significa resto de valina

así como sus sales, amidas o mezclas de dichas substancias entre sí y/o como mínimo una sustancia adicional para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de inflamaciones locales y/o generalizadas del cuerpo de origen infeccioso, sobre la base de una reacción inmune, sobre la base de una enfermedad reumática, sobre la base de una alteración del sistema inmune, sobre la base de una enfermedad genética, para la prevención y/o el tratamiento de una reacción de rechazo en el transplante de órganos, de la arteriosclerosis, del trauma de reperfusión, sobre la base de enfermedades arterioscleróticas y/o de enfermedades trombóticas y del aumento de la deposición de fibrina.