ES2269189T3

ES2269189T3 - Enzima termoestable que promueve la fidelidad de las polimerasas de dna termoestables para la mejora de la sintesis y amplificacion de acidos nucleicos in vitro.

Info

Publication number: ES2269189T3
Application number: ES00969312T
Authority: ES
Inventors: Waltraud Ankenbauer; Frank Laue; Harald Sobek; Michael Greif
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-09-28
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2020-09-27
Also published as: NO20012561L; JP3655240B2; WO2001023583A2; DE60029927D1; RU2260055C2; IL143141A0; DE69923180D1; AU7907700A; DE69923180T2; US7410782B2; CA2351634A1; CN1343254A; EP1144653A2; EP1088891B1; US20060078928A1; EP1144653B1; DE60029927T2; JP2003510084A; CA2351634C; AU777229B2

Abstract

Una composición que comprende una primera enzima termoestable que muestra actividad exonucleasa 3'' pero no actividad polimerasa de DNA y una segunda enzima termoesta- ble que muestra actividad polimerasa de DNA, en la que la fidelidad de un proceso de amplificación está potenciada por la utilización de la composición comparado con el uso de la segunda enzima únicamente.

Description

Enzima termoestable que promueve la fidelidad de las polimerasas de DNA termoestables para la mejora de la síntesis y amplificación de ácidos nucleicos in vitro.

La presente invención está relacionada con el campo de la biología molecular, y más concretamente, con la síntesis de polinucleótidos. La presente invención también está relacionada con una exonucleasa termoestable sustancialmente pura, el clonaje y expresión de una exonucleasa termoestable III en E. coli, y su utilización en reacciones de amplificación. La invención facilita la amplificación de DNA con una elevada fidelidad en condiciones que permiten eliminar la contaminación cruzada y la síntesis de productos largos. La invención puede utilizarse para una serie de propósitos industriales, médicos y forenses.

La síntesis in vitro de ácido nucleico se realiza de forma rutinaria con polimerasas de DNA con o sin polipéptidos adicionales. Las polimerasas de DNA son una familia de enzimas involucradas en la replicación y reparación del DNA. Se han realizado investigaciones extensivas en el aislamiento de polimerasas de DNA a partir de microorganismos mesófilos como E. coli. Véase, por ejemplo, Bessman et al., (1957) J. Biol. Chem. 223:171-177, y Buttin y Kornberg, (1966) J. Biol. Chem. 241:5419-5427.

También se han realizado investigaciones sobre el aislamiento y purificación de polimerasas de DNA a partir de termófilos, como Thermus aquaticus. Chien A. et al., (1976) J. Bacteriol. 127:1550-1557 describe el aislamiento y purificación de una polimerasa de DNA con una temperatura óptima de 80ºC a partir de la cepa Thermus aquaticus YT1. La patente estadounidense Nº 4.889.818 describe una polimerasa de DNA termoestable purificada a partir de T. aquaticus, la polimerasa Taq, con un peso molecular de entre alrededor de 86.000 y 90.000 daltons. Además, la Solicitud de Patente europea 0 258 017 describe la polimerasa Taq como la enzima preferida para su uso e el proceso de PCR.

Las investigaciones indican que mientras la polimerasa de DNA Taq tiene una función exonucleasa dependiente de polimerasa 5'-3', la polimerasa de DNA Taqno posee una función exonucleasa III 3'-5' (Lawyer F.C. et al., (1989) J. Biol. Chem., 264:6427-6437; Bernad A, et al. (1989) Cell 59:219). La actividad exonucleasa 3'-5' de las polimerasas de DNA se denomina típicamente "actividad de corrección de pruebas". La actividad exonucleasa 3'-5' elimina bases que no están bien emparejadas en el extremo 3' de un dúplex cebador-molde. La presencia de actividad exonucleasa 3'-5' puede ser ventajosa ya que da lugar a un aumento de la fidelidad de la replicación de las cadenas de ácido nucleico y la elongación de productos terminados prematuramente. Como la polimerasa de DNA Taqno es capaz de eliminar los extremos de cebador mal emparejados tiende a cometer errores de incorporación de bases, haciendo que su uso en ciertas aplicaciones no es adecuado. Por ejemplo, intentar clonar un gen amplificado es problemático ya que cualquier copia del gen puede contener un error debido a un suceso de incorporación errónea al azar. En función del ciclo en el que aparece este error (por ejemplo, en un ciclo de replicación temprano), todo el DNA amplificado podría contener la base incorporada erróneamente, dando lugar así a un producto génico
mutado.

Hay varias polimerasas de DNA termoestables conocidas en la materia que muestran actividad exonucleasa 3'-5', como las polimerasas tipo B de las arqueobacterias termófilas que se utilizan para la amplificación de DNA con una elevada fidelidad. Las polimerasas termoestables que muestran actividad exonucleasa 3'-5' pueden aislarse o clonarse a partir de Pyrococcus (Polimerasa de DNA termoestable purificada de Pyrococcus furiosus, Mathur E., Stratagene, WO 92/09689, US 5.545.552; Polimerasa de DNA termoestable purificada a partir de especies de Pyrococcus, Comb D.G. et al., New England Biolabs Inc., PE 0 547 359; Organización y secuencia nucleotídica del gen de la polimerasa de DNA a partir de la arqueobacteria Pyrococcus furiosus, Uemori T. et al. (1993) Nucl. Acids Res., 21:259-265.), a partir de especies de Pyrodictium (Polimerasa de ácido nucleico termoestable, Gelfand D.H., F. Hoffmann-La Roche AG, PE 0 624 641; Polimerasa de ácido nucleico termoestable purificada y secuencias de DNA codificantes de especies de Pyrodictium, Gelfand D.H., Hoffmann-La Roche Inc., US 5.491.086), a partir de Thermococcus (por ejemplo la polimerasa de DNA termoestable de especies de Thermococcus, TY, Niehaus F., et al., WO 97/35988; Polimerasa de DNA purificada de Thermocccus barossii, Luhm R.A., Pharmacia Biotech Inc., WO 96/22389; Polimerasa de DNA de Thermococcus barossii con actividad exonucleasa intermedia y mejor estabilidad a largo plazo a temperaturas elevadas, útil en la secuenciación de DNA, PCR, etc., Dhennezel O.B., Pharmacia Biotech Inc., WO 96/22389; Una polimerasa de DNA termoestable purificada a partir de Thermococcus litoralis para su utilización en manipulaciones de DNA, Comb D.G., New England Biolabs, Inc., US 5.322.785, PE 0 455 430; Polimerasas de DNA termoestable recombinante a partir de arqueobacterias, Comb D.G., New England Biolabs, Inc., US 5.352.778, PE 0 547 920, PE 0 701 000; Nueva polimerasa de DNA termoestable aislada obtenida a partir de Thermococcus gorgonarius, Angerer B. et al. Boehringer Mannheim GmbH, WO 98/14590.

Otra posibilidad de realizar una PCR en presencia de función de corrección de prueba es la utilización de una mezcla de enzimas polimerasa, con una polimerasa que muestre tal actividad de corrección de prueba (por ejemplo, Polimerasa de DNA termoestable con termoestabilidad mejorada y longitud y eficiencia de la extensión de cebadores mejoradas, Barnes W.M., US 5.436.149, PE 0 693 078; Nuevas composiciones de polimerasa y utilización de las mismas, Sorge J.A, Stratagene, WO 95/16028, y amplificación de secuencias largas de ácido nucleico mediante PCR, Cheng S., PE 0 669 401). Es común la utilización de una formulación de una polimerasa de DNA termoestable que comprende un componente mayoritario de al menos una polimerasa de DNA termoestable que carece de actividad exonucleasa 3'-5' y un componente minoritario que muestra actividad exonucleasa 3'-5', por ejemplo polimerasa Taq y polimerasa de DNA Pfu. En estas mezclas la procesividad la confiere la enzima tipo pol I como la polimerasa Taq y la función de corrección de pruebas por la polimerasa termoestable tipo B como la Pfu. La síntesis de DNA de elevada fidelidad es un parámetro deseable en la amplificación de ácidos nucleicos y otra característica importante es la posibilidad de eliminar la contaminación.

La reacción en cadena de la polimerasa puede amplificar una única molécula alrededor de un billón de veces. Por lo tanto, incluso cantidades minúsculas de un contaminante pueden amplificarse y dar lugar a un resultado de falso positivo. Tales contaminantes son a menudo productos de amplificaciones por PCR previas (contaminación cruzada). Así pues, los investigadores han desarrollado métodos para evitar tal contaminación.

El procedimiento se basa en la sustitución del TTP por dUTP durante la amplificación por PCR para generar DNA que contiene uracilo (U-DNA). El tratamiento de las subsiguientes mezclas de reacción de PCR con glicosilasa de uracil-DNA (UNG), previamente a la amplificación por PCR, degrada el ácido nucleico contaminante y ya no es apropiado para una amplificación. El dUTP puede incorporarse con las polimerasas termoestables tipo pol I pero no por las polimerasas de tipo B (G. Slupphaug, et al. (1993) Anal. Biochem. 211:164-169). La baja incorporación de dUTP por las polimerasas de tipo B limita su uso en los laboratorios en los que se analiza el mismo tipo de molde repetidamente mediante la amplificación por PCR.

Las polimerasas de DNA termoestables que muestran actividad exonucleasa 3'-5' también se han aislado a partir de cepas de eubacterias como Thermotoga (Polimerasas de DNA termófilas a partir de Thermotoga neapolitana, Slater M.R. et al., Promega Corporation, WO 96/41014; Polimerasas de DNA clonadas a partir de Thermotoga neapolitana y los mutantes de la misma, Hughes A.J. et al., Life Technologies, Inc. WO 96/10640; Enzima polimerasa de ácido nucleico termoestable purificada a partir de Termotoga marítima, Gelfand D.H. et al., CETUS Corporation, WO 92/03556). Estas enzimas tienen una fuerte actividad exonucleasa 3'-5' que es capaz de eliminar las bases mal incorporadas o mal emparejadas. Una versión modificada por ingeniería genética de esta enzima está disponible comercialmente como ULTma, una polimerasa de DNA que puede utilizarse sin polipéptidos adicionales en el proceso de PCR. Esta enzima es capaz de eliminar las bases mal incorporadas e incorporar dUTP, pero por razones desconocidas la fidelidad no es mayor que la de la polimerasa Taq (Exactitud de la replicación de la reacción en cadena de la polimerasa. Diaz R.S. et al. Braz. J. Med. Biol. Res. (1998) 31:1239-1242; Fidelidad en la PCR de la polimerasa de DNA Pfu y otras polimerasas de DNA termoestables, Cline J. et al., Nucleic Acids Res. (1996) 24:
3546-3551).

Para la síntesis de DNA de elevada fidelidad puede utilizarse otra alternativa al uso de las polimerasas de tipo B o mezclas que las contengan, que es la utilización de holoenzima polimerasa de DNA III termófila, un complejo de 18 cadenas polipeptídicas. Estos complejos son idénticos a las replicasas cromosómicas bacterianas, comprenden todos los factores necesarios para sintetizar una cadena de DNA de varios cientos de kilobases o cromosomas completos. Las 10 subunidades diferentes de esta enzima, algunas de las cuales están presentes en múltiples copias, pueden generarse mediante técnicas recombinantes, reconstituidas y utilizadas para la síntesis de DNA in vitro. Se propone como un posible uso de estos complejos la amplificación por PCR de ácidos nucleicos de varios cientos a ciento de miles pares de bases. (Enzima derivada de organismos termófilos que funciona como una replicasa cromosómica, y la preparación y usos de la misma, Yurieva O. et al., Universidad Rockefeller, WO 98/45452; Nueva holoenzima polimerasa III termófila, McHenry C., ENZYCO Inc., WO 99/13060)

De acuerdo con esta invención, se ha pretendido desarrollar y proporcionar un sistema de PCR de elevada fidelidad mejorado en el que preferiblemente se pueda incorporar de forma concomitante dUTP. De acuerdo con la presente invención, se proporciona una enzima termoestable que muestra actividad exonucleasa 3', pero no actividad polimerasa de DNA, lo que aumenta la fidelidad de un proceso de amplificación si esta enzima se añade a una segunda enzima termoestable que muestra actividad polimerasa. La primera enzima que se proporciona puede escindir los extremos de cebadores mal emparejados para permitir a la segunda enzima con actividad polimerasa, como por ejemplo la polimerasa Taq, que se reasocie y finalice la elongación durante un proceso de síntesis de DNA. La primera enzima es capaz de cooperar como enzima correctora de pruebas con la segunda enzima con actividad polimerasa. La enzima que se encontró era adecuada para esta tarea es, por ejemplo, una exonucleasa III termoestable. Es preferible una exonucleasa III que funcione en dirección de 3' a 5', cortando en 5' los grupos hidroxilo salientes en 3' del fosfato, y idealmente que funcione solo en DNA de doble cadena. Las funciones exonucleasa 3'-5' de las polimerasas de DNA son activas sobre DNA de cadena doble y sencilla. Esta última actividad puede resultar en la degradación de cebadores, lo que no se desea en los ensayos de PCR. Es preferible que la enzima sea activa a entre 70ºC y 80ºC, lo suficientemente estable para sobrevivir a los ciclos de desnaturalización e inactiva a temperaturas menores para no degradar los productos de PCR tras la finalización del proceso de PCR. Pueden obtenerse enzimas que muestran estas características de eubacterias termófilas o enzimas relacionadas a partir de arqueobacterias termófilas. Los genomas de tres arqueobacterias termoestables se han secuenciado, Methanococcus jannaschii (Secuencia del Genoma Completo de la arqueobacteria metanogénica, Methanococcus jannaschii, Bult C.J. et al., (1996) Science 273:1058-1072), Methanobacterium thermoautotrophicum (Secuencia Genómica Completa de Methanobacterium thermoautotrophicum\DeltaH: Análisis Funcional y Genómica Comparativa, Smith D.R. et al., J. of Bacteriology (1997) 179:7135-7155) y Archaeoglobus fulgidus (La secuencia del Genoma Completo de la arqueobacteria hipertermófila, reductora de azufre Archaeoglobus fulgidus, Klenk H.-P. et al. (1997) Nature 390:
364-370).

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En particular, se proporciona una enzima termoestable que se puede obtener de Archaeoglobus fulgidus, que cataliza la degradación de extremos mal emparejados de los cebadores o polinucleótidos en dirección de 3' a 5' en DNA de doble cadena. El gen que codifica la termoestable exonucleasa III que se puede obtener de Archaeoglobus fulgidus (Afu) se ha clonado, expresado en E. coli y aislado. La enzima es activa en las condiciones de incubación y temperatura que se utilizan en las reacciones de PCR. La enzima apoya a las polimerasas de DNA como las Taq en la realización de la síntesis de DNA a tasas de error bajas y la síntesis de productos de más de 3 kb en DNA genómico -el rango superior de los productos sintetizados por la polimerasa Taq- con un buen rendimiento con o sin dUTP presente en la mezcla de reacción. Preferiblemente, se utilizaron 50-500 ng de la exonucleasa III que se puede obtener de Afu por cada 2,5 U de polimerasa Taq para conseguir un funcionamiento óptimo de la PCR. Más preferiblemente se utilizan entre 67 ng y 380 ng de la exonucleasa III que se puede obtener de Afu por cada 2,5 U de la polimerasa Taq en la reacción de PCR.

La ventaja del uso de la primera enzima comparado con otras enzimas es que la primera enzima es preferiblemente activa sobre DNA de doble cadena. La enzima termoestable de esta invención puede utilizarse para cualquier propósito en el que tal actividad enzimática sea necesaria o deseada. En particular, la enzima se utiliza en combinación con una polimerasa de DNA termoestable en la reacción de amplificación de ácido nucleico conocida como PCR para eliminar los extremos de cebadores mal emparejados que dan lugar a una parada prematura, para proporcionar extremos de cebadores se son elongados de forma más efectiva por la polimerasa, para corregir errores de la incorporación de bases y para permitir que la polimerasa genere productos de PCR largos.

Así, el contenido de la presente invención es una composición que comprende una primera enzima termoes-
table que muestra actividad exonucleasa 3' pero no actividad polimerasa de DNA, y una segunda enzima que muestra actividad polimerasa, en la que la fidelidad de un proceso de amplificación se mejora mediante la utilización
de esta composición comparado con la utilización de la segunda enzima únicamente. La primera enzima ter-
moestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA incluye también las enzimas apro-
piadas con actividad polimerasa de DNA reducida o sin nada de actividad. La actividad polimerasa de DNA reducida
de acuerdo con la invención significa menos del 50% de dicha actividad de una enzima con actividad
polimerasa de DNA. En una realización preferida, la segunda enzima de la composición de la invención carece de
actividad de corrección de pruebas. Es particularmente preferible que la segunda enzima sea la polimerasa
Taq.

Es también un contenido de la presente invención un método de síntesis de DNA utilizando una mezcla que comprende una primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3'pero sin actividad polimerasa de DNA y una segunda enzima termoestable que muestra actividad polimerasa. De acuerdo con este método, las cadenas terminadas prematuramente se cortan por la degradación de 3' a 5'. De acuerdo con este método, los extremos mal emparejados de un cebador o una cadena en formación se eliminan.

La invención también comprende un método de acuerdo con la descripción anterior en el que el dUTP está presente en la mezcla de reacción, reemplazando en parte o completamente al TTP. Es preferible que de acuerdo con este método se utilice la glicosilasa de uracil-DNA (UDG o UNG) para la degradación de los ácidos nucleicos contaminan-
tes.

Preferiblemente, de acuerdo con este método la mezcla de una primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA y una segunda enzima termoestable que muestra actividad polimerasa genera productos de PCR con tasas de error menores comparado con los productos de PCR producidos por la segunda enzima con actividad polimerasa en ausencia de la primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA. El método en el que la mezcla de la primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA y una segunda enzima termoestable que muestra actividad polimerasa genera productos de PCR de mayor longitud comparado con los productos de PCR producidos por la segunda enzima con actividad polimerasa en ausencia de la primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA. Además, la primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA está relacionada con la exonucleasa III de E. coli, pero es termoestable de acuerdo con este método. Una realización diferente del método anteriormente descrito es el método en el que se obtienen productos de PCR con extremos romos.

Son también contenido de la presente invención los métodos para la obtención de la enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA de la invención, y los medios y materiales para la producción de esta enzima, como por ejemplo vectores y células huésped (por ejemplo DSM Nº 13021).

Los siguientes ejemplos se ofrecen con el propósito de ilustrar, sin limitar, el contenido de la invención.

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas Breve descripción de las figuras

Figura 1

Secuencia de DNA y la secuencia de aminoácidos deducida del gen que codifica la polimerasa de DNA de la exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus.

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Figura 2

Resistencia a la desnaturalización por calor de la exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus recombinante expresada en E. coli como se describe en el Ejemplo V.

Carril 1:: Incubación a 50ºC

Carril 2:: Incubación a 60ºC

Carril 3:: Incubación a 70ºC

Carril 4:: Incubación a 80ºC

Carril 5:: Incubación a 90ºC

Carril 6:: Extracto de las células huésped E. coli no transformadas con el gen que codifica la exonucleasa III Afu

Carril 7:: Exonucleasa III de E. coli

Carril 8:: Marcador de peso molecular

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Figura 3

Actividad exonucleasa de la exonucleasa III Afu en fragmentos de DNA como se describe en el Ejemplo VI.

Carril 1:: 10 unidades de exonucleasa III de E. coli, incubación a 37ºC

Carril 2:: 50 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 3:: 100 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 4:: 150 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 5:: 100 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 6:: 200 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 7:: 300 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 8:: 250 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 9:: 750 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 10:: 1 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 11:: 500 ng de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 12:: 1 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 13:: 1,5 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 14:: 1,5 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 15:: 3 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 16:: 4,5 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 17:: 7,6 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 18:: 15,2 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 19:: 22,8 \mug de exonucleasa III Afu, incubación a 72ºC

Carril 20:: no se añade exonucleasa

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Figura 4

Principio del ensayo de corrección de emparejamientos erróneos.

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Figura 5

Corrección de emparejamientos erróneos de los cebadores en la PCR como se describe en el Ejemplo VII.

Carril 1:: Marcador de peso molecular de DNA V (ROCHE Molecular Biochemicals Nº 821705)

Carril 2:: Cebador con mal emparejamiento G:A, amplificación con la polimerasa de DNA Taq

Carril 3:: Lo mismo que en el carril 2, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 4:: Cebador con mal emparejamiento G:A, amplificación con el sistema de PCR Expand HiFi

Carril 5:: Lo mismo que en el carril 4, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 6:: Cebador con mal emparejamiento G:A, amplificación con polimerasa Taq/exonucleasa III Afu

Carril 7:: Lo mismo que en el carril 6, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 8:: Cebador con mal emparejamiento G:A, amplificación con la polimerasa de DNA Tgo

Carril 9:: Lo mismo que en el carril 8, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 10:: Cebador con mal emparejamiento G:T, amplificación con la polimerasa de DNA Taq

Carril 11:: Lo mismo que en el carril 10, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 12:: Cebador con mal emparejamiento G:T, amplificación con el sistema de PCR Expand HiFi

Carril 13:: Lo mismo que en el carril 12, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 14:: Cebador con mal emparejamiento G:T, amplificación con polimerasa Taq/exonucleasa III Afu

Carril 15:: Lo mismo que en el carril 14, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 16:: Cebador con mal emparejamiento G:T, amplificación con la polimerasa de DNA Tgo

Carril 17:: Lo mismo que en el carril 16, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 18:: Marcador de peso molecular de DNA V

Carril 19:: Marcador de peso molecular de DNA V

Carril 20:: Cebador con mal emparejamiento G:C, amplificación con la polimerasa de DNA Taq

Carril 21:: Lo mismo que en el carril 20, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 22:: Cebador con mal emparejamiento G:C, amplificación con el sistema de PCR Expand HiFi

Carril 23:: Lo mismo que en el carril 22, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 24:: Cebador con mal emparejamiento G:C, amplificación con polimerasa Taq/exonucleasa III Afu

Carril 25:: Lo mismo que en el carril 24, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 26:: Cebador con mal emparejamiento G:C, amplificación con la polimerasa de DNA Tgo

Carril 27:: Lo mismo que en el carril 26, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 28:: Cebador con mal emparejamiento CG:AT, polimerasa de DNA Taq

Carril 29:: Lo mismo que en el carril 28, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 30:: Cebador con mal emparejamiento CG:AT, sistema de PCR Expand HiFi

Carril 31:: Lo mismo que en el carril 2, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 32:: Cebador con mal emparejamiento CG:AT, polimerasa Taq/exonucleasa III Afu

Carril 33:: Lo mismo que en el carril 2, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 34:: Cebador con mal emparejamiento CG:AT, amplificación con la polimerasa de DNA Tgo

Carril 35:: Lo mismo que en el carril 2, pero subsiguientemente cortado con BsiEI

Carril 36:: Marcador de peso molecular de DNA V.

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Figura 6A

Tasas de error de las diferentes polimerasas en la PCR

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Figura 6B

Mejora de la fidelidad por la exonucleasa III Afu presente en la mezcla de PCR como se describe en el Ejemplo VIII.

Se observó la proporción de colonias azules: blancas y se probaron varias mezclas de polimerasa de DNA Taq y exonucleasa III Afu (Taq/Exo 1:30, Taq/Exo 1:20, Taq/Exo 1:15, Taq/Exo 1:12,5, Taq/Exo 1:10, que corresponden a 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq mezclada con 125 ng, 175 ng, 250 ng, 375 ng y 500 ng de exonucleasa III Afu, respectivamente) comparando con la polimerasa de DNA Taq (Taq), el sistema de PCR Expand HiFi (HiFi) y la polimerasa de DNA Pwo (Pwo).

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Figura 7

Incorporación de dUTP por la mezcla de polimerasa de DNA Taq/exonucleasa III Afu como se describe en el Ejemplo IX.

Carril 1:: Marcador de peso molecular de DNA XIV (Roche Molecular Biochemicals Nº 1721933)

Carril 2:: Amplificación con 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq

Carril 3:: Amplificación con 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq y 125 ng de exonucleasa III Afu

Carril 4:: Amplificación con 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq y 250 ng de exonucleasa III Afu

Carril 5:: Amplificación con 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq y 375 ng de exonucleasa III Afu

Carril 6:: Amplificación con 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq y 500 ng de exonucleasa III Afu

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Figura 8

Degradación de los productos de PCR que contienen dUTP mediante la glicosilasa de uracil-DNA como se describe en el Ejemplo IX.

Carril 2:: 1 \mul del producto de amplificación obtenido con la polimerasa de DNA Taq y 125 ng de exonucleasa III Afu, y el subsiguiente tratamiento con la UNG y calor.

Carril 3:: 2 \mul del producto de amplificación obtenido con la polimerasa de DNA Taq y 125 ng de exonucleasa III Afu, y el subsiguiente tratamiento con la UNG y calor.

Carril 4:: 3 \mul del producto de amplificación obtenido con la polimerasa de DNA Taq y 125 ng de exonucleasa III Afu, y el subsiguiente tratamiento con la UNG y calor.

Carril 5:: 4 \mul del producto de amplificación obtenido con la polimerasa de DNA Taq y 125 ng de exonucleasa III Afu, y el subsiguiente tratamiento con la UNG y calor.

Carril 6:: 5 \mul del producto de amplificación obtenido con la polimerasa de DNA Taq y 125 ng de exonucleasa III Afu, y el subsiguiente tratamiento con la UNG y calor.

Carril 7:: 5 \mul del producto de amplificación obtenido con la polimerasa de DNA Taq y 125 ng de exonucleasa III Afu, sin el subsiguiente tratamiento con la UNG y calor.

Carril 8:: 5 \mul del producto de amplificación obtenido con la polimerasa de DNA Taq y 125 ng de exonucleasa III Afu, sin el subsiguiente tratamiento con la UNG, pero sí con calor.

Carril 9:: Marcador de peso molecular de DNA XIV (Roche Molecular Biochemicals Nº 1721933)

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Figura 9

Efecto de la exonucleasa III Afu en la longitud de los productos de PCR. La mezcla de polimerasa de DNA Taq/exonucleasa III Afu se analizó en DNA genómico humano como se describe en el Ejemplo X.

Carril 1:: fragmento tPA de 9,3 kb con la mezcla Taq/Exo III

Carril 2:: ''con pol-Taq.

Carril 3:: fragmento tPA de 12 kb con la mezcla Taq/Exo III

Carril 4:: ''con pol-Taq

Carril 5:: fragmento tPA de 15 kb con la mezcla Taq/Exo III

Carril 6:: ''con pol-Taq

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Figura 10

La exonucleasa III termoestable puede reemplazarse con una polimerasa mutante con actividad polimerasa reducida pero con actividad exonucleasa 3' aumentada, como se describe en el Ejemplo XI.

Carril 1:: Marcador de peso molecular

Carril 2:: Reacción 1, polimerasa Taq, fragmento de 4,8 kb

Carril 3:: Reacción 2, polimerasa Taq más polimerasa mutante Tag, fragmento de 4,8 kb

Carril 4:: Reacción 3, sin polimerasa Taq, polimerasa mutante Tag, fragmento de 4,8 kb

Carril 5:: Reacción 4, polimerasa Taq más Exo III Afu, fragmento de 4,8 kb

Carril 6:: Reacción 5, polimerasa Taq, fragmento de 9,3 kb

Carril 7:: Reacción 6, Taq polimerasa más polimerasa mutante Tag, fragmento de 9,3 kb

Carril 8:: Reacción 7, sin polimerasa Taq, polimerasa mutante Tag, fragmento de 9,3 kb

Carril 9:: Reacción 8, polimerasa Taq más Exo III Afu, fragmento de 9,3 kb

Carril 10:: Marcador de peso molecular de DNA

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Figura 11

La exonucleasa III Afu no es activa sobre DNA lineal de cadena sencilla, como se describe en el Ejemplo XII

Carril 1:: Exo III Afu, sin incubación

Carril 2:: Exo III Afu, 1 h a 65ºC

Carril 3:: Exo III Afu, 2 h a 65ºC

Carril 4:: Exo III Afu, 3 h a 65ºC

Carril 5:: Exo III Afu, 4 h a 65ºC

Carril 6:: Exo III Afu, 5 h a 65ºC

Carril 7:: Tampón de reacción sin enzima, sin incubación

Carril 8:: Tampón de reacción sin enzima, 5 h a 65ºC

Carril 9:: Marcador de peso molecular

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Figura 12

Comparación de la exonucleasa III Afu con una polimerasa termoestable tipo B en la actividad de degradación de cebadores, como se describe en el Ejemplo XIII.

Carril 1:: Marcador de peso molecular

Carril 2:: 1 u de Tgo, preincubada (reacción 1)

Carril 3:: 1,5 u de Tgo, preincubada (reacción 2)

Carril 4:: 1 u de Tgo, no preincubada (reacción 3)

Carril 5:: 1,5 u de Tgo, no preincubada (reacción 4)

Carril 6:: 1 u de Tgo, preincubada en ausencia de dNTP (reacción 5)

Carril 7:: 1,5 u de Tgo, preincubada en ausencia de dNTP (reacción 6)

Carril 8:: 1 u de Tgo, no preincubada en ausencia de dNTP (reacción 7)

Carril 9:: 1,5 u de Tgo, no preincubada en ausencia de dNTP (reacción 8)

Carril 10:: 1 u de Tgo, preincubada en ausencia de dNTP, suplementada con cebador adicional (reacción 9)

Carril 11:: 1,5 u de Tgo, preincubada en ausencia de dNTP, suplementada con cebador adicional (reacción 10)

Carril 12:: polimerasa Taq, preincubada (reacción 11)

Carril 13:: Taq más 37,5 ng de Exo III Afu, preincubada (reacción 12)

Carril 14:: Taq más 75 ng de Exo III Afu, preincubada (reacción 13)

Carril 15:: polimerasa Taq, no preincubada (reacción 14)

Carril 16:: Taq más 37,5 ng de Exo III Afu, no preincubada (reacción 15)

Carril 17:: Taq más 75 ng de Exo III Afu, no preincubada (reacción 16)

Carril 18:: Marcador de peso molecular

\newpage

Ejemplo I

Aislamiento de secuencias codificantes

La enzima termoestable preferida aquí es una exodesoxiribonucleasa extremadamente termoestable que se puede obtener a partir de Archaeoglobus fulgidus cepa VC-16 (DSM Nº 4304). La cepa se aisló de sistemas hidrotermales marinos en la isla Vulcano y en Stufe di Nerone, Nápoles, Italia (Stetter, K.O. et al., Science (1987) 236:822-824). Este organismo es una arqueobacteria extremadamente termófilo, metabolizador de azufre, con un rango de crecimiento de entre 60ºC y 95ºC, con el óptimo en 83ºC (Klenk, H.P. et al., Nature (1997) 390:364-370). La secuencia genómica está depositada en la base de datos TIGR. El gen que presuntamente codifica la exonucleasa III (xthA) tiene el Nº de acceso AF0580.

El peso molecular aparente de la exodesoxiribonucleasa que se puede obtener de Archaeoglobus fulgidus es de alrededor de 32.000 daltons al compararlo con estándares de proteína de peso molecular conocido (SDS-PAGE). El peso molecular exacto de la enzima termoestable de la presente invención puede determinarse a partir de la secuencia codificante del gen de la exodesoxiribonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus.

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Ejemplo II

Clonaje del gen que codifica la exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus

Se utilizaron alrededor de 6 ml del cultivo celular de DSM Nº 4304 para el aislamiento del DNA cromosómico de Archaeoglobus fulgidus.

Los siguientes cebadores se diseñaron con dianas de restricción compatibles con el sitio de clonaje múltiple del vector de expresión deseado, y complementarios al extremo N- y C-terminal del gen de la exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus:

ID de SEC Nº:1

: N-terminal (diana BamHI): 5'-GAA ACG AGG ATC CAT GCT CAA AAT CGC CAC C-3'

ID de SEC Nº:2

: C-terminal (diana PstI): 5'-TTG TTC ACT GCA GCT ACA CGT CAA ACA CAG C-3'

Inicialmente se recogieron las células mediante centrifugaciones repetidas en un eppendorf con tapa de 2 ml a 5.000 rpm. El aislamiento del DNA puede realizarse con cualquier método descrito para el aislamiento a partir de células bacterianas. En este caso, el DNA genómico de Archaeoglobus fulgidus se preparó con el equipo de preparación de moldes de PCR High Pure™ (ROCHE Diagnostics GmbH, Nº 1796828). Con este método se obtienen alrededor de 6 mg de DNA cromosómico a una concentración de 72 ng/\mul.

La PCR se realizó con los cebadores descritos anteriormente, en el sistema de PCR Expand™ High Fidelity (ROCHE Diagnostics GmbH, Nº 1732641) y 100 ng de DNA genómico de Archaeoglobus fulgidus por tubo en cuatro preparaciones idénticas. La PCR se realizó con las siguientes condiciones:

1x: 94ºC, 2 min;

10x: 94ºC, 10 s; 54ºC, 30 s; 68ºC, 3 min;

20x: 94ºC, 10 s; 54ºC, 30 s; 68ºC, 3 min con 20 s de elongación del ciclo en cada ciclo;

1x: 68ºC, 7 min;

Tras la adición de MgCl_{2} hasta una concentración final de 10 mM, el producto de PCR se cortó con BamHI y PstI, 10 unidades de cada uno, a 37ºC durante 2 horas. Los productos de la reacción se separaron en un gel de agarosa de bajo punto de fusión. Tras la electroforesis se recortaron las bandas apropiadas, se combinaron los recortes de gel, se fundieron, se aislaron los fragmento de DNA mediante digestión de la agarosa y se precipitaron con EtOH. El botón seco se diluyó en 30 \mul de H_{2}O.

Se digirió el vector de expresión adecuado, aquí el pDS56_T, con las mismas enzimas de restricción utilizadas para el inserto y se limpiaron con el mismo método.

Tras la ligación del inserto y el vector con el equipo Rapid DNA Ligation (ROCHE Diagnostics GmbH, Nº 1635379), se transformó el plásmido en el pUBS520 de expresión huésped de E. coli 392 (Brinkmann, U. et al. (1989) Gene 85:109-114).

\newpage

El DNA plasmídico de los transformantes se aisló utilizando el equipo de aislamiento de plásmidos High Pure^{TM} (ROCHE Diagnostics GmbH, Nº 1754777) y se caracterizó mediante digestión por restricción con BamHI y PstI y electroforesis en gel de agarosa.

Los transformantes de E. coli pUBS520 Exo III positivos se almacenaron en medio de cultivo con glicerol a -70ºC. La secuencia del gen que codifica la exonucleasa III se confirmó por secuenciación de DNA. Se muestra en la Figura Nº 1.

El clonaje y expresión de la exonucleasa III a partir de Archaeoglobus fulgidus u otros organismos termófilos también puede realizarse mediante otras técnicas utilizando métodos convencionales en la materia (véase por ejemplo Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Lab., 1989).

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Ejemplo III

Expresión de la exonucleasa III Afu recombinante

El transformante del Ejemplo 1 se cultivó en un fermentador en un medio rico que contenía el antibiótico apropiado.

Las células se recogieron a una densidad óptica a [A_{540}] de 5,5 mediante centrifugación y se congelaron hasta ser necesitadas o se lisaron mediante un tratamiento con lisozima para producir un extracto celular crudo que contiene la actividad exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus.

El extracto crudo que contiene la actividad exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus se purificó mediante el método descrito en el Ejemplo IV, o mediante otras técnicas de purificación como la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico o la cromatografía de interacción hidrofóbica.

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Ejemplo IV

Purificación de la exonucleasa III Afu recombinante

El pUBS520 Exo III de E. coli (DSM Nº 13021) del Ejemplo I se hizo crecer en un fermentador de 10 l en un medio con triptona (20 g/l), extracto de levadura (10 g/l), NaCl (5 g/l) y ampicilina (100 mg/l) a 37ºC, se indujo con IPTG (0,3 mM) en la mitad de la fase exponencial de crecimiento y se incubó l4 horas adicionales. Se recogieron alrededor de 45 g de células mediante centrifugación y se almacenaron a -70ºC. Se descongelaron 2 g de células y se resuspendieron en 4 ml de tampón A (Tris/HCl 40 mM, pH 7,5; EDTA 0,1 mM; 2-mercaptoetanol 7 mM; Pefabloc SC 1 mM). Las células se lisaron en agitación por la adición de 1,2 mg de lisozima durante 30 minutos a 4ºC y la adición de 4,56 mg de deoxicolato sódico durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido de 20 minutos a 0ºC. El extracto crudo se ajustó a 750 mM de KCl, se calentó durante 15 minutos a 72ºC y se centrifugó para eliminar las proteínas desnaturalizadas.

También puede utilizarse una temperatura de calentamiento de hasta 90ºC sin destruir (desnaturalización) la exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus. El sobrenadante se dializó contra tampón B (tampón A que contiene un 10% de glicerol) ajustado a 10 mM de MgCl_{2} y se aplicó en una columna Blue Trisacryl M (SERVA, Nº 67031) con las dimensiones 1 x 7 cm y 5,5 ml de volumen de lecho, equilibrada con tampón B. La columna se lavó con 16,5 ml de tampón B y la proteína exonucleasa se eluyó con un gradiente lineal de 82 ml de NaCl de 0 a 3 M en tampón B. En las fracciones de la columna se analizó la presencia de la proteína exodesoxiribonucleasa de Archaeoglobus fulgidus mediante electroforesis en geles de SDS-PAGE 10-15% con gradiente. Las fracciones activas, 16,5 ml, se agruparon, concentraron con Aquacide II (Calbiochem Nº 17851) y se dializaron contra el tampón de almacenamiento C (Tris/HCl 10 mM, pH 7,9; 2-mercaptoetanol 10 mM; EDTA 0,1 mM; KCl 50 mM; glicerol al 50%). Tras la diálisis se añadieron Thesit y Nonidet P40 hasta una concentración final de cada uno de 0,5%. Esta preparación se almacenó a -20ºC.

La exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus obtenida era de una pureza del 95% según se estimó mediante la electroforesis en gel con SDS. El rendimiento fue de 50 mg de proteína por cada 2,3 g de masa celular (peso húmedo).

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Ejemplo V

Termoestabilidad de la exonucleasa III recombinante de Archaeoglobus fulgidus

La termoestabilidad de la exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus clonada tal y como se describe en el Ejemplo II se determinó mediante el análisis de la resistencia a la desnaturalización por calor. Tras una lisis como la descrita en el Ejemplo IV se centrifugaron 100 ml del extracto crudo a 15.000 rpm durante 10 min en una centrífuga de Eppendorf. El sobrenadante se alicuotó en cinco nuevos tubos Eppendorf. Los tubos se incubaron durante 10 minutos a cinco temperaturas diferentes, 50ºC, 60ºC, 70ºC, 80ºC y 90ºC. Tras la centrifugación descrita anteriormente, se analizaron las alícuotas de los sobrenadantes mediante electroforesis en geles de SDS-PAGE al 10-15% con gradiente. Como se muestra en la Figura 2, la cantidad de proteína exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus tras la incubación a 90ºC fue la misma que la de las muestras tratadas a temperaturas menores. No hubo una pérdida significativa detectable por desnaturalización por calor. A partir de este resultado puede concluirse que la vida media es mayor a diez minutos a 90ºC.

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Ejemplo VI

Actividad de la exonucleasa III Afu

La exonucleasa III cataliza la eliminación secuencia de mononucleótidos del extremo hidroxilo 3' del dúplex de DNA (Rogers G.S. y Weiss B. (1980) Methods Enzymol. 65:201-211). Durante cada suceso de unión se eliminan un número limitado de nucleótidos. El sustrato preferido son los extremos 3' romos o planos. La enzima no es activa sobre DNA de cadena sencilla, y los extremos 3' protuberantes son más resistentes al corte. El marcador de peso molecular de DNA VI (ROCHE Molecular Biochemicals, Nº 1062590) consiste en pBR328 digerido con BglI mezclado con pBR328 digerido con HinfI. Los productos de la digestión con HinfI tienen extremos 3' romos y se espera que sean sustratos preferidos para la degradación por la exonucleasa III, los productos del corte con BglI tienen extremos 3' protuberantes con 3 bases sobresalientes y debería ser más resistente al corte con la exonucleasa III.

Diluciones seriadas de la exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus del Ejemplo IV se incubaron durante 2 horas a 72ºC con 0,5 \mug de marcador de peso molecular de DNA VI (ROCHE Molecular Biochemicals, Nº 1062590) en 25 \mul del siguiente tampón de incubación: Tris/HCl 10 mM, pH 8,0; MgCl_{2} 5 mM; 2-mercaptoetanol 1 mM; NaCl 100 mM con una cubierta de parafina. Se incluyeron como control 10 unidades de la exonucleasa III de E. coli (ROCHE Molecular Biochemicals, Nº 779709). La reacción control se realizó a 37ºC. Tras la adición de 5 \mul de solución de parada (Agarosa al 0,2%, EDTA 60 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,8, glicerol al 10%, azul de bromofenol al 0,01%), las mezclas se separaron en un gel de agarosa al 1%. El resultado se muestra en la Figura 3. La exonucleasa III Afu discrimina entre los dos tipos diferentes de sustrato. El sustrato preferido son los fragmentos con extremos 3' romos (por ejemplo el fragmento de 1766 pb) y los extremos 3' protuberantes (por ejemplo los fragmentos de 2176 pb, 1230 pb y 1033 pb) son más resistentes a la degradación. Con cantidades mayores de proteína el sustrato se degrada en una proporción similar a la del carril 1, en el que se analizan los productos de la exonucleasa III de E. coli. Con cantidades crecientes de proteína exonucleasa Afu solo quedó una pequeña cantidad de DNA sustrato (carriles 15 a 19), el retraso de los fragmentos restantes puede ser debido a proteínas de unión al DNA presentes en la preparación como
impurezas.

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Ejemplo VII

Corrección de cebadores mal emparejados en una PCR con la exonucleasa III Afu

La eficiencia reparadora de la mezcla de exonucleasa III Afu/polimerasa Taq durante la PCR se analizó con cebadores mal emparejados en el extremo 3'. El principio del ensayo se muestra en la Figura 4. Para la amplificación por PCR se utilizan juegos de cebadores en los que el cebador directo tiene uno o dos nucleótidos en el extremo 3' que no se emparejan con las bases del DNA molde. La escisión de los extremos de los cebadores mal emparejados y la amplificación del cebador reparado genera un producto que puede cortarse subsiguientemente con la endonucleasa de restricción BsiEI, mientras que el producto que se genera del cebador mal emparejado es resistente al corte.

Las secuencias de los cebadores utilizados:

1. reverso:

: 5'-GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG-3' (ID de SEC Nº: 3)

2. directo 1 (mal emparejamiento g:a):

: 5'-TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCA-3' (ID de SEC Nº:4)

3. directo 2 (mal emparejamiento g:t):

: 5'-TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCT-3' (ID de SEC Nº:5)

4. directo 3 (mal emparejamiento g:c):

: 5'-TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCC-3' (ID de SEC Nº:6)

5. directo 4 (mal emparejamiento de 2 bases):

: 5'-TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TAT-3' (ID de SEC Nº:7)

La PCR se llevó a cabo utilizando 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq (ROCHE Diagnostics GmbH, Nº 1435094), 0,25 \mug de la exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus del Ejemplo IV, 10 ng de DNA del bacteriófago \lambda, cada uno de los cebadores a 0,4 \muM, dNTP a 200 \muM, MgCl_{2} a 1,5 mM, Tris-HCl a 50 mM, pH 9,2, (NH_{4})_{2}SO_{4} a 16 mM. La PCR se realizó en un volumen de 50 \mul de PCR en las siguientes condiciones:

1x: 94ºC, 2 min;

40x: 94ºC, 10 s; 60ºC, 30 s; 72ºC, 1 min;

1x: 72ºC, 7 min;

La función de la mezcla de exonucleasa/polimerasa Taq se comparó con controles como 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq, 0,3 unidades de polimerasa de DNA Tgo (ROCHE Diagnostics GmbH) y 0,75 \mul de sistema de PCR Expand™ High Fidelity (ROCHE Diagnostics GmbH, Nº 1732641). Como indica la correcta digestión de los productos de PCR con BsiEI, la exonucleasa III de A. fulgidus muestra actividad correctora de todos los emparejamientos incorrectos descritos con una efectividad del 90 al 100% (Figura 5).Como se esperaba, la polimerasade DNA Taq no mostró actividad correctora, mientras que la polimerasade DNA Tgo con su actividad exonucleasa 3'-5' también los corrigió completamente. El sistema de PCR Expand™ High Fidelity solo mostró actividad correctora al 100% con los emparejamientos incorrectos de dos bases. El resto de emparejamientos incorrectos se repararon con una efectividad de aproximadamente el 50%.

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Ejemplo VIII

Fidelidad de las mezclas de exonucleasa III Afu/polimerasa de DNA Taq en el proceso de PCR

La fidelidad de las mezclas de exonucleasa III Afu/polimerasa de DNA Taq en el proceso de PCR se determinó en un ensayo basado en la amplificación, circularización y transformación del derivado del pUC19, pUCIQ17, que contiene un alelo lac I^{q} funcional(Frey, B. y Suppmann B. (1995) Biochemica 2:34-35). Las mutaciones derivadas de la PCR en lac I resultan en una desrepresión de la expresión de lac Z\alpha y la subsiguiente formación de una enzima \beta-galactosidasa funcional que puede detectarse fácilmente en placas indicadoras con X-Gal. Las tasas de error de las mezclas de polimerasa Taq/exonucleasa Afu determinadas con este ensayo de fidelidad de la PCR basado en lac I se determinaron comparando con las de la polimerasa de DNA Taq, el sistema de PCR Expand HiFi (Roche Molecular Biochemicals) y la polimerasa de DNA Pwo (Roche Molecular Biochemicals) como controles.

El plásmido pUCI017 se linearizó mediante la digestión con DraII para poder utilizarse como sustrato para la amplificación por PCR con los enzimas testados.

Ambos cebadores utilizados tienen dianas ClaI en sus extremos 5 prima:

ID de SEC Nº:8

: Cebador 1: 5'-AGCTTATCGATGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3'

ID de SEC Nº:9

: Cebador 2: 5'-AGCTTATCGATAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGC-3'

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La longitud del producto de PCR resultante es de 3493 pb.

La PCR se realizó en un volumen final de 50 \mul en presencia de MgCl_{2} 1,5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5 (25ºC), (NH_{4})_{2}SO_{4} 12,5 mM, KCl 35 mM, dNTP 200 \muM y 2,5 unidades de polimerasa Taq y 125 ng, 175 ng, 250 ng, 375 ng y 500 ng, respectivamente de exonucleasa III Afu.

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Las condiciones de ciclado fueron como sigue:

1x: desnaturalización del molde durante 2 min a 95ºC

8x: desnaturalización a 95ºC durante 10 s.

\quad: hibridación a 57ºC durante 30 s.

\quad: elongación a 72ºC durante 4 min.

\newpage

16x: desnaturalización a 95ºC durante 10 s.

\quad: hibridación a 57ºC durante 30 s.

\quad: elongación a 72ºC durante 4 min

\quad: + elongación del ciclo de 20 s. en cada ciclo

Tras la PCR, los productos de PCR se precipitaron con PEG (Barnes, W.M. (1992) Gene 112:229), el DNA se sometió a restricción con ClaI y se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. El DNA aislado se ligó utilizando el equipo Rapid DNA Ligation (Roche Molecular Biochemicals) y los productos de ligación se transformaron en E. coli DH5\alpha y seplaquearon en placas TN Amp X-Gal. La cepa de E. coli que complementa en \alpha, DH5\alpha, transformada con el plásmido resultante pUCIQ17 (3632 pb), muestra colonias blancas (lac I+) en placas TN (Bactotriptona al 1,5%, NaCl al 1%, Agar al 1,5%) que contienen ampicilina (100 \mug/ml) y X-Gal (al 0,004% p/v). Las mutaciones resultan en colonias azules.

Tras la incubación a 37ºC durante toda la noche, se contaron las colonias azules y blancas. La tasa de error (f) por pb se calculó con una ecuación transformada como han publicado Keohavong y Thilly (Keohavong, P. y Thilly, W. (1989) PNAS USA 86:9253):

f = -lnF / d x b pb

en la que F es la fracción de colonias blancas:

F = colonias blancas (lac I +)/número total de colonias;

d es el número de duplicaciones del DNA:

2^{d} = DNA obtenido/DNA de partida;

y b es el tamaño de diana efectivo del gen lac I (1080 pb), que es de 349 pb de acuerdo con Provost et al. (Provost et al. (1993) Mut. Res. 288:133).

Los resultados que se muestran en la Figura 6A y Figura 6B demuestran que la presencia de exonucleasa III termoestable en la mezcla de reacción resulta en tasas de error menores. En función de la proporción entre polimerasa y exonucleasa la tasa de error disminuye. La fidelidad que se alcanza con la mezcla de polimerasa Taq/exonucleasa III Afu más óptima (4,44 x 10^{-6}) está en un rango similar al de la mezcla Taq/Pwo (Expand HiFi; 2,06 x 10^{-6}). La evaluación de las condiciones óptimas de tampón proporcionarán una mejora de la fidelidad. La proporción entre la polimerasa y la exonucleasa debe optimizarse. Las cantidades elevadas de exonucleasa reducen el rendimiento de producto, aparentemente al reducir la eficiencia de la amplificación (Taq/Exo 1:10 que corresponden a 2,5 unidades de polimerasa Taq y 500 ng de exonucleasa III Afu).

La fidelidad de este sistema puede además optimizarse utilizando técnicas convencionales en la materia, por ejemplo alterando los componentes del tampón, optimizando la concentración de los componentes individuales o cambiando las condiciones de ciclado.

Ejemplo IX

Incorporación de dUTP en presencia de la exonucleasa III Afu durante la PCR

Se analizó la síntesis de DNA de la mezcla de exonucleasa Afu/polimerasa Taq con el TTP completamente reemplazado por dUTP. La comparación de la incorporación de TTP o dUTP se determinó en una PCR utilizando 2,5 unidades de polimerasa de DNA Taq, en presencia de 0,125 \mug, 0,25 \mug, 0,375 \mug y 0,5 \mug de exonucleasa III de Archaeoglobus fulgidus del Ejemplo IV en DNA genómico humano nativo como molde utilizando el gen de la \beta-globina como diana. Se utilizaron los siguientes cebadores:

directo:

5'-TGGTTGAATTCATATATCTTAGAGGGAGGGC-3'

(ID de SEC Nº:10)

reverso:

5'-TGTGTCTGCAGAAAACATCAAGGGTCCCATA-3'

(ID de SEC Nº: 11)

La PCR se realizó en 50 \mul de volumen con las siguientes condiciones de ciclado:

1x: 94ºC, 2 min;

40x: 94ºC, 10 s; 60ºC, 30 s; 72ºC, 1 min;

1x: 72ºC, 7 min;

Alícuotas de la reacción de PCR se separaron en geles de agarosa. Como se muestra en la Figura 7, la síntesis de DNA con este sistema de molde/cebador en presencia de dUTP es posible con hasta 375 ng de exonucleasa III Afu. La incorporación de dUTP puede demostrarse mediante el tratamiento con la glicosilasa de uracil-DNA (ROCHE Diagnostics GmbH, Nº 1775367) de alícuotas de los productos de reacción de PCR durante 30 min a temperatura ambiente y la subsiguiente incubación durante 5 min a 95ºC para cortar los polinucleótidos en los lugares apurínicos, lo que da lugar a la completa degradación de los fragmentos. El análisis de los productos de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa se muestra en la Figura 8.

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Ejemplo X

Efecto de la exonucleasa III Afu sobre la longitud del producto de PCR

La polimerasa Taq es capaz de sintetizar productos de PCR de hasta 3 kb de longitud en moldes genómicos. Para estimar la capacidad de la mezcla de polimerasa Taq/exonucleasa Afu de sintetizar productos de mayor longitud, se analizó la mezcla de enzimas con DNA genómico humano como molde con tres parejas de cebadores diseñados para amplificar productos de 9,3 kb, 12 kb y 15 kb de longitud. Los sistemas de tampón utilizados son del sistema de PCR Expand Long Template (Roche Molecular Biochemicals Nº Cat. 1 681 834). Las reacciones se realizaron en 50 \mul de volumen con 250 ng de DNA genómico humano, 220 ng de cada cebador, 350 \muM de dNTP y 2,5 unidades de polimerasa Taq y 62,5 ng de exonucleasa Afu con las condiciones que se indican en la Tabla 1:

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TABLA 1

1

2

\newpage

Los cebadores específicos para la amplificación de los genes tPA utilizados:

Cebador 7a directo:

: 5'-GGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGCAGCACCCCTGC-3' (ID de SEC Nº:12)

Cebador 14a reverso:

: 5'-CAAAGTCATGCGGCCATCGTTCAGACACACC-3' (ID de SEC Nº:13)

Cebador 1 directo:

: 5'-CCTTCACTGTCTGCCTAACTCCTTCGTGTGTCCC-3' (ID de SEC Nº:14)

Cebador 2 reverso:

: 5'-ACTGTGCTTCCTGACCCATGGCAGAAGCGCCTTC-3' (ID de SEC Nº:15)

Cebador 3 reverso

: 5'-CCTTCTAGAGTCAACTCTAGATGTGGACTTAGAG-3' (ID de SEC Nº:16)

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Como se muestra en la Figura 9 es posible sintetizar productos de al menos 15 kb de longitud con la mezcla de polimerasa Taq/exonucleasa Afu.

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Ejemplo XI

La exonucleasa III termoestable puede reemplazarse por una polimerasa mutante con actividad polimerasa reducida pero con mayor actividad exonucleasa en 3'.

La polimerasa de DNA de Thermococcus aggregans (Tag) descrita por Niehaus F., Frey B. y Antranikian G. en la W0 97/35988 o en Gene (1997) 204(1-2), 153-8, con un cambio de aminoácido en la posición 385 en la que la tirosina está reemplazada por asparagina (Boehlke et al. pendiente de publicación y solicitud de patente europea 00105 155.6), muestra solo un 6,4% de la actividad polimerasa pero un 205% de la actividad exonucleasa de la polimerasa de DNA salvaje. Esta enzima se utilizó para demostrar que la invención no está restringida a las enzimas de tipo exonucleasa III sino que también incluye otros tipos de enzimas que aportan una actividad exonucleasa 3'.

Las reacciones se realizaron en 50 \mul de volumen con 200 ng de DNA genómico humano, dNTP 200 \muM, 220 ng de cada cebador y tampón Expand HiFi con Mg^{++} en las reacciones 1-4 o tampón Expand Long Template 1 en las reacciones 5-8 (Figura 10). Para amplificar un fragmento de 4,8 kb del gen tPA, se utilizaron los cebadores tPA 7a directo (5'-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3', ID de SEC Nº:12) y tPA 10a reverso (5'-GAT GCG AAA CTG AGG CTG GCT GTA CTG TCT C-3', ID de SEC Nº:17) en las reacciones 1-4. Para amplificar un fragmento de 9,3 kb del gen tPA, se utilizaron los cebadores tPA 7a directo y tPA 14a reverso (5'-CAA AGT CAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C-3', ID de SEC Nº:13) en las reacciones 5-8. Se añadieron 2,5 unidades de polimerasa Taq a las reacciones 1, 2, 4, 5, 6 y 8, no a las reacciones 3 y 7, que se utilizaron como controles negativos. Se añadieron 11 ng de polimerasa mutante Tag a las reacciones 2, 3, 6 y 7, y se añadieron 150 ng de Exonucleasa III Afu a las reacciones 4 y 8.

Programas de ciclado utilizados en las reacciones 1-4:

1x: 94ºC, 2 min,

10x: 94ºC, 10 s

\quad: 62ºC, 30 s

\quad: 68ºC, 4 min

20x: 94ºC, 10 s

\quad: 62ºC, 30 s

\quad: 68ºC, 4 min, más elongación de ciclo de 20 s por ciclo

1x: 68ºC durante 7 min

\newpage

Para las reacciones 5-8:

1x: 94ºC, 2 min,

10x: 94ºC, 10 s

\quad: 65ºC, 30 s

\quad: 68ºC, 8 min

20x: 94ºC, 10 s

\quad: 65ºC, 30 s

\quad: 68ºC, 8 min, más elongación de ciclo de 20 s por ciclo

1x: 68ºC durante 7 min

Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio (Figura 10). Los datos muestran que la polimerasa Taq es capaz de amplificar el fragmento de 4,8 kb pero con bajo rendimiento. La combinación de polimerasa Taq con polimerasa mutante Tag o Exo III Afu resulta en un fuerte aumento del rendimiento del producto. La enzima polimerasa mutante Tag por sí misma no es capaz de sintetizar este producto.

Se obtienen resultados similares con el sistema de 9,3 kb. Utilizando la polimerasa Taq sola no se detecta producto. En combinación con la polimerasa mutante Tag o Exo III Afu, el producto de PCR esperado se obtiene con un alto rendimiento.

Estos resultados demuestran que la polimerasa Taq no es capaz de amplificar fragmentos de DNA de varias kb a partir de DNA genómico y apoya la hipótesis de Barnes (Barnes W.M. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2216-2220) de que la limitación en longitud de la amplificación por PCR es causada por la baja eficiencia de extensión en los lugares de incorporación de pares de bases mal emparejados. Tras la eliminación de los nucleótidos mal emparejados en el extremo del cebador, la polimerasa Taq es capaz de continuar la síntesis de DNA. La cadena de ácido nucleico finalizada como un producto completo puede servir entonces como molde para la unión de cebadores en los subsiguientes ciclos.

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Ejemplo XII

La exo III Afu no es activa sobre DNA lineal de cadena sencilla

Las reacciones se realizaron en 50 \mul de volumen con 270 ng de exo III Afu, 5 mg de un oligonucleótido de 49 pb en tampón de PCR Expand HiFi con MgCl_{2} y se incubaron durante 0, 1, 2, 3, 4 y 5 horas a 65ºC. Tras la adición de 10 \mul de solución de proteinasa K (20 mg/ml), las muestras se incubaron durante 20 min a 37ºC. Los productos de reacción se analizaron en un gel de agarosa al 3,5% que contenían bromuro de etidio.

El resultado se expone en la Figura 11. Ésta muestra que el ácido nucleico tiene el mismo tamaño en todos los carriles. El producto obtenido tras la incubación de hasta 5 horas (carril 6) con Exo III Afu tiene el mismo tamaño que los controles (carriles 1, 7 y 8). No se pudo observar una reducción significativa en la intensidad del oligonucleótido de tamaño completo ni una pincelada derivada de los productos degradados.

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Ejemplo XIII

Comparación de la actividad de degradación de cebadores entre la Exonucleasa III Afu y una polimerasa termoestable tipo B

Las polimerasas termoestable de tipo B se ha descrito que tienen actividad nucleasa en cadena sencilla y doble (Kong H. et al. (1993) Journal Biol. Chem. 268:1965-1975). Esta actividad es capaz de degradar moléculas de cebador sin tener en cuenta si están hibridados con el molde o en cadena sencilla. El reemplazo de una polimerasa termoestable de tipo B por una exonucleasa termoestable en la mezcla de reacción podría ser ventajoso respecto a la estabilidad de los cebadores de cadena sencilla u otros ácidos nucleicos presentes en la mezcla de reacción.

Para analizar la actividad de degradación de cebadores, las mezclas de reacción sin DNA molde se incubaron durante 1 hora a 72ºC, luego se añadió DNA y se realizó la PCR. Los resultados se compararon con las reacciones que contenían polimerasa Tgo como ejemplo de polimerasa termoestable tipo B (Angerer B. et al. WO 98/14590). Como control, se utilizaron las mismas mezclas sin incubación previa. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2

3

Como diana de la amplificación se escogió un fragmento del gen p53, los cebadores utilizados fueron: p53I 5'-GTC CCA AGC AAT GGA TGA T-3' (ID de SEC Nº:18) y p53II 5'-TGG AAA CTT TCC ACT TGA T-3' (ID de SEC Nº:19). Las reacciones de PCR se realizaron en 50 \mul de volumen.

\newpage

Las reacciones Nº 1-10 contenían 200 ng de DNA genómico humano, 40 pmol de cada cebador, Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, (NH_{4})_{2}SO_{4} 17,5 mM, MgCl_{2} 1,25 mM, Tween al 0,5%, DMSO al 2,5%, BSA 250 \mug/ml y 1 unidad (reacciones número 1, 3, 5, 7 y 9) o 1,5 unidades (reacciones número 2, 4, 6, 8 y 10) de polimerasa Tgo y dNTP 200 \muM.

Las reacciones número 11 a 16 contenían 2,5 unidades de polimerasa Taq, tampón con Mg^{++} Expand HiFi, 40 pmol de cebadores, dNTP 200 \muM y 100 ng de DNA genómico humano. Las reacciones número 12 y 15 contenían 37,5 ng de exo III Afu, y las reacciones número 13 y 16 contenían 75 ng de Exo III Afu.

Como se describe en la tabla 2, las reacciones 1, 2, 5, 6 y de 11 a 13 se incubaron durante 1 hora a 72ºC en ausencia de DNA molde. El DNA molde se añadió antes de que se iniciara la PCR. Las reacciones 5, 6, 9 y 10 se preincubaron en ausencia de nucleótidos, las reacciones 9 y 10 se suplementaron con 40 pmol adicionales de cebador tras el paso de preincubación. A causa de la actividad exonucleasa 5' de la polimerasa Taq, a las reacciones de 11 a 13 se les añadió la enzima tras la preincubación.

Condiciones de la PCR:

1x: 94ºC, 2 min

35x: 94ºC, 10 s

\quad: 55ºC, 30 s

\quad: 72ºC, 4 min

1x: 72ºC durante 10 min

Los productos de reacción se analizaron en un gel de agarosa y se tiño con bromuro de etidio (Figura 12).

Cuando la polimerasa Tgo se incubó con el cebador en ausencia de DNA molde (reacciones 1, 2, 5 y 6) y se comparó con las correspondientes reacciones sin preincubación (3, 4, 7 y 8) se observó una clara diferencia. La preincubación resulta en una marcada reducción del producto PCR, obviamente afecta al menos a uno de los componentes esenciales, más probablemente el cebador de la PCR. La adición de 40 pmol más de cebador de PCR (reacciones 9 y 10) tras el paso de preincubación resulta en señales fuertes con una intensidad comparable a la de la reacción control que no se preincubó. Esto indica que la polimerasa Tgo, una polimerasa termoestable de tipo B, degrada los cebadores de la PCR en ausencia de molde, independientemente de si los dNTP están o no presentes.

Los productos de PCR obtenidos de las reacciones 12 y 13, en las que los cebadores se preincubaron con Exonucleasa III Afu antes de la adición de DNA molde y polimerasa Taq dieron lugar a bandas similares a las obtenidas en las reacciones 15 y 16, en las que no se introdujo el paso de preincubación. De estas bandas de fuerte intensidad similares puede concluirse que no ha ocurrido o ha ocurrido poca degradación de los cebadores y que los oligonucleótidos de cadena sencilla son sustratos pobres para la Exonucleasa III Afu. De las bandas de fuerte intensidad o de la potenciación del rendimiento de productos de PCR puede concluirse que la enzima potencia la fidelidad de un proceso de amplificación.

<110> Roche Diagnostics GmbH

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<120> Enzima termoestable que promueve la fidelidad de las polimerasas de DNA termoestables para la mejora de la síntesis y amplificación de ácidos nucleicos in vitro

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<130> 5304/OA/

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<140>

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<141>

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<160> 21

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 1

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gaaacgagga tccatgctca aaatcgccac c

\hfill

31

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<210> 2

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttgttcactg cagctacacg tcaaacacag c

\hfill

31

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<210> 3

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<211> 23

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggttatcgaa atcagccaca gcg

\hfill

23

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<210> 4

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 4

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tggatacgtc tgaactggtc acggtca

\hfill

27

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<210> 5

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 5

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tggatacgtc tgaactggtc acggtct

\hfill

27

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<210> 6

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

tggatacgtc tgaactggtc acggtcc

\hfill

27

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<210> 7

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 7

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tggatacgtc tgaactggtc acggtat

\hfill

27

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<210> 8

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

agcttatcga tggcactttt cggggaaatg tgcg

\hfill

34

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 36

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 9

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agcttatcga taagcggatg ccgggagcag acaagc

\hfill

36

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<210> 10

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 10

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tggttgaatt catatatctt agagggaggg c

\hfill

31

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<210> 11

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 11

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tgtgtctgca gaaaacatca agggtcccat a

\hfill

31

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<210> 12

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaagtacag ctcagagttc tgcagcaccc ctgc

\hfill

34

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<210> 13

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 13

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caaagtcatg cggccatcgt tcagacacac c

\hfill

31

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<210> 14

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 14

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ccttcactgt ctgcctaact ccttcgtgtg tccc

\hfill

34

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<210> 15

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 15

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actgtgcttc ctgacccatg gcagaagcgc cttc

\hfill

34

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<210> 16

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 16

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ccttctagag tcaactctag atgtggactt agag

\hfill

34

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<210> 17

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 17

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gatgcgaaac tgaggctggc tgtactgtct c

\hfill

31

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<210> 18

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 18

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gtcccaagca atggatgat

\hfill

19

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<210> 19

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador

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<400> 19

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\hskip-.1em\dddseqskip

tggaaacttt ccacttgat

\hfill

19

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<210> 20

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<211> 774

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<212> DNA

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<213> Archaeoglobus fulgidus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(774)

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<400> 20

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4

5

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<210> 21

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<211> 258

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<212> PRT

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<213> Archaeoglobus fulgidus

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<400> 21

6

60

Claims

1. Una composición que comprende una primera enzima termoestable que muestra actividad exonucleasa 3' pero no actividad polimerasa de DNA y una segunda enzima termoestable que muestra actividad polimerasa de DNA, en la que la fidelidad de un proceso de amplificación está potenciada por la utilización de la composición comparado con el uso de la segunda enzima únicamente.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que la primera enzima se puede obtener de Archeoglobus fulgidus.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que la segunda enzima carece de actividad de corrección de pruebas.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 en la que la segunda enzima es la polimerasa Taq.

5. Un método para preparar o amplificar DNA utilizando una composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El método de la reivindicación 5 en el que las cadenas terminadas prematuramente se recortan por degradación de 3' a 5'.

7. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 o 6 en el que se eliminan los extremos mal emparejados de un cebador o de la cadena en formación.

8. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7 en el que en la mezcla de reacción está presente dUTP en lugar de TTP.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8 en el que se utiliza una glicosilasa de uracil-DNA (UNG) para la degradación de ácidos nucleicos contaminantes.

10. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 9 en el que la mezcla de

-: una primera enzima termoestable que muestra actividad exonucleasa 3' pero no actividad polimerasa de DNA y

-: una segunda enzima termoestable que muestra actividad polimerasa de DNA

produce productos de PCR con tasas de error menores comparado con los productos de PCR generados por la segunda enzima con actividad polimerasa de DNA en ausencia de la primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA.

11. El método de la reivindicación 10 en el que la mezcla de la primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA y la segunda enzima termoestable con actividad polimerasa de DNA produce productos de PCR de mayor longitud comparado con los productos de PCR generados por la segunda enzima con actividad polimerasa de DNA en ausencia de la primera enzima termoestable con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa de DNA.

12. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 11 en el que la primera enzima termoestable que muestra actividad exonucleasa 3' pero no actividad polimerasa de DNA está relacionada con la exonucleasa III derivada de E. coli, pero es termoestable.

13. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 12 en el que se obtienen productos de PCR con extremos romos.