ES2272060T3 - Receptores unidos a membrana y su funcion; disfuncion cognitiva; tratamientos para la misma; y composiciones para su uso en dichos tratamientos. - Google Patents

Abstract

Uso de esmilagenina como agente activo en la preparación de una composición para el tratamiento de la disfunción cognitiva en un animal humano o no humano.

Description

Receptores unidos a membrana y su función; disfunción cognitiva; tratamientos para la misma; y composiciones para su uso en dichos tratamientos.

La presente invención se refiere a receptores unidos a membrana y su función; a una disfunción cognitiva y dolencias asociadas; a tratamientos para las mismas; y a composiciones para su uso en dichos tratamientos. Más particularmente, pero no exclusivamente, la invención concierne al tratamiento de dolencias que se caracterizan por una deficiencia en el número o en la función de receptores unidos a membrana. A continuación, la presente invención se describirá principalmente con referencia al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) y la demencia senil de tipo Alzheimer (DSTA), en las que se han demostrado deficiencias en varios tipos de receptores. Sin embargo, debe entenderse que la presente invención se refiere de forma general al tratamiento de dolencias atribuibles a dolencias patológicas intrínsecas y/o a la exposición a condiciones medioambientales adversas, caracterizándose estas dolencias por una deficiencia en el número o en la función de receptores unidos a membrana o por una deficiencia en la transmisión en las uniones entre las neuronas o en las uniones entre las neuronas y las células
efectoras.

Algunas dolencias del tipo mencionado anteriormente incluyen la enfermedad de Parkinson, demencia por cuerpos de Lewi, hipotensión postural, autismo, síndrome de fatiga crónica, miastenia grave, enfermedad de Lambert Eaton, enfermedades y problemas asociados con el síndrome de la guerra del golfo, exposición laboral a compuestos organofosforados y problemas asociados con envejecimiento.

La enfermedad de Alzheimer (EA) y la demencia senil de tipo Alzheimer (DSTA) son problemas graves y crecientes en todas las sociedades en las que, debido a un aumento de la esperanza de vida y a un control de las enfermedades accidentales, el perfil demográfico se está extendiendo progresivamente hacia una población más envejecida. Se requieren urgentemente agentes que puedan tratar o ayudar en la gestión de las EA/DSTA.

El deterioro de la memoria asociado a la edad (age-associated memory impairment, AAMI) es una característica de los pacientes ancianos quienes, aunque estén fisiológica y físicamente normales, se quejan de una pérdida de memoria. Es un síndrome deficientemente definido, pero los agentes que son eficaces en el tratamiento de las EA/DSTA también pueden ser de valor en estos pacientes.

Se está llevando a cabo una investigación sobre las EA/DSTA mediante procedimientos y disciplinas de investigación médica tradicionales y convencionales. En la medicina convencional existen numerosas metodologías para el tratamiento de las EA/DSTA. Se sabe que los procesos bioquímicos que favorecen la memoria en la corteza cerebral están mediados (al menos en parte) colinérgicamente. Los expertos en las materias sabrán que los mecanismos "mediados colinérgicamente" pueden ser atribuibles directamente a la acetilcolina que actúa sobre los receptores, y éstos son efectos directos. Otros efectos clínicamente útiles también pueden ser causados por la modulación de la liberación de la acetilcolina desde las terminaciones nerviosas presinápticas o por la inhibición de las enzimas que destruyen la acetilcolina. Estos factores moduladores pueden actuar a través de las neuronas, en las que el mediador no es colinérgico; éstos se denominan efectos indirectos. Algunos intentos de tratamiento se han centrado en el papel de otros mediadores tales como la 5-hidroxitriptamina, que es un mediador en otras áreas del cerebro, tales como los núcleos del mesencéfalo. Sin embargo, dado que las fibras procedentes de estas áreas se proyectan hacia el interior de la corteza cerebral, en la que el transmisor primario es la acetilcolina, la atención se ha centrado en la gestión de este mediador en la búsqueda de agentes terapéuticos apropiados.

Las estrategias colinérgicas para el tratamiento de EA/DSTA se han dirigido a numerosos puntos a lo largo de la vía de formación, la liberación sináptica y la eliminación de la acetilcolina liberada.

Una aproximación implica el tratamiento con altas dosis de lecitina y otros precursores de la acetilcolina. Esta es de uso limitado para producir mejoras continuas en el rendimiento cognitivo.

Otra aproximación implica el uso de fármacos vegetales tales como extracto de raíz de polígala que se ha demostrado que incrementa la actividad de la transferasa de colina-acetilcolina (CAT) y la secreción del factor de crecimiento nervioso (NGF) en el cerebro. La administración por vía oral del NGF no tiene ningún efecto sobre las neuronas del sistema nervioso central porque es una proteína de alto peso molecular que no puede atravesar la barrera hematoencefálica. Sin embargo, se han propuesto agentes que pueden atravesar la barrera hematoencefálica y que tienen un efecto estimulante sobre la síntesis del NGF en el sistema nervioso central, para la mejora del comportamiento relacionado con la memoria.

Los resultados de una tercera aproximación clínica, que usa inhibidores de la colinesterasa tales como el clorhidrato de tacrina, han sido ligeramente más positivos que los anteriores. Las sustancias obtenidas a partir de plantas usadas en la medicina china y occidental, por ejemplo, hupercina, galantamina y fisostigmina, han demostrado tener todas un cierto - aunque limitado - beneficio en el tratamiento de las EA/DSTA, en estudios clínicos y también en modelos de laboratorio. Todas estas sustancias son inhibidoras de la acetilcolinesterasa (ACE). En los pacientes con EA/DSTA puede haber una síntesis reducida de acetilcolina (AC), una eficacia reducida en la liberación de la AC desde su almacenamiento presináptico y un descenso en el número o en la función de los receptores postsinápticos (M_{1}). También se han demostrado reducciones en los receptores presinápticos M_{2}. El efecto beneficioso de los inhibidores de la ACE se atribuye a un incremento en los niveles de acetilcolina en las sinapsis del cerebro, frenando la destrucción del transmisor liberado.

Se sabe que composiciones que modulan la función colinérgica afectan a la memoria y al recuerdo. Por ejemplo, la nicotina estimula los receptores nicotínicos de la acetilcolina, y se cree que los efímeros efectos de incremento de la memoria por el consumo de cigarrillos son debidos al efecto de la nicotina. La escopolamina, un antagonista de la acetilcolina, producirá amnesia y un deterioro de la función cognitiva que se pone de manifiesto en pruebas psicomotrices como una prolongación de los tiempos de reacción simple, posiblemente como resultado de un deterioro en la atención, y se usa con este propósito como un tratamiento analgésico coadyuvante. El efecto amnésico de la escopolamina puede ser antagonizado por la nicotina.

Existen dos familias de subtipos de receptores nicotínicos (\alpha y \beta), y cada una incluye cuatro subgrupos que difieren en la especificidad de ligando. El papel de los receptores nicotínicos en el SNC no se comprende bien a nivel molecular. Es posible que los agentes que se unen a los receptores nicotínicos puedan modificar la tasa de recambio en los sitios de los receptores muscarínicos en el cerebro. Los receptores nicotínicos son canales iónicos operados por ligando, y su activación provoca un rápido aumento (milisegundos) en la permeabilidad celular al Na^{+} y al Ca^{++}, la despolarización y la excitación.

Otra clase de receptores colinérgicos pueden ser estimulados por la muscarina. Dichos receptores muscarínicos (M) son receptores acoplados a proteínas G. Las respuestas de los receptores muscarínicos son más lentas; pueden ser excitadores o inhibidores. No están necesariamente relacionados con cambios en la permeabilidad iónica. Se han detectado cinco tipos de receptores muscarínicos mediante clonación de receptores colinérgicos, y se designan como m_{1}-m_{5}. Los efectos farmacológicos están asociados con cuatro de los receptores clonados, y se designan como M_{1}-M_{4} basándose en su especificidad farmacológica.

Usando proteínas de receptor específicas y anticuerpos monoclonales ha sido posible localizar adicionalmente receptores muscarínicos en el cerebro como m_{1} (postsinápticos) y m_{2} (presinápticos). En el corazón, los receptores M_{2} son postsinápticos. Se cree que los receptores muscarínicos presinápticos son inhibidores, y la unión de la AC a estos receptores atenúa la liberación de AC adicional, para proporcionar un mecanismo de retroalimentación negativa para la liberación de AC. Los antagonistas selectivos de los receptores M_{2}, que están distribuidos preferentemente en el cerebro, pueden por lo tanto ser útiles para tratar la enfermedad de Alzheimer.

Se sabe que en estados patológicos tales como las EA/DSTA hay una pérdida neuronal general y una deficiencia en la función nerviosa colinérgica. Se ha especulado que los sitios de unión nicotínicos de alta afinidad en las neuronas colinérgicas remanentes podrían convertirse en sitios de unión de baja afinidad al tratar dichas enfermedades, manteniendo así la liberación del transmisor. Al disminuir la afinidad de los sitios de unión nicotínicos se evita un proceso de desensibilización rápida.

La activación agonista de los receptores nicotínicos del cerebro tiene un rápido inicio y fin. Una disminución de la afinidad de los receptores nicotínicos reducirá el proceso de desensibilización. Schwarz R. D. y col. (J. Neuro Chem 42, (1984), 1495-8) han demostrado que los sitios de unión de la nicotina están localizados presinápticamente en terminales axónicos colinérgicos (y también 5-hidroxitriptaminérgicos y catecolaminérgicos). Un cambio en los sitios de unión de alta afinidad en las EA/DSTA también puede inducir un cambio en el efecto modulador que los sitios de unión nicotínicos puedan tener sobre otros sistemas transmisores.

Los mecanismos colinérgicos presinápticos también están bajo el control inhibidor de las neuronas GABAérgicas, y se cree que esta inhibición está intensificada en las EA/DSTA. Una eliminación o una reducción de esta inhibición intensifica la actividad colinérgica presináptica cortical e incrementa el proceso cognitivo.

Las interacciones de las fibras interneuronales inervadas por la nicotina (que reducen la afinidad de unión), y la desinhibición de las fibras GABAérgicas tienen, ambas, un locus presináptico.

Este es un modelo simplista de la transmisión central, pero proporciona un marco para comprender los intentos que se han realizado para aumentar la concentración eficaz de acetilcolina en las sinapsis centrales. Esto ilustra adicionalmente el concepto de acción directa e indirecta. Existen inconvenientes ligados a estas tres metodologías terapéuticas convencionales para el tratamiento de las EA/DSTA mencionadas anteriormente: un complemento en el precursor de la AC, una sustitución del agonista y una inhibición de la acetilcolinesterasa. Estos tratamientos pueden dar como resultado un aumento a corto plazo en la disponibilidad de la AC que puede activar mecanismos de retroalimentación que den como resultado una desensibilización de los receptores postsinápticos. Sobre una base teórica, los beneficios a largo plazo no podrían ser predichos y, cuando se interrumpa el tratamiento, cualquier beneficio en la gestión de la EA/DSTA y del AAMI desaparece, y la dolencia puede incluso agravarse.

Se ha demostrado que un compuesto con actividad agonista de M_{1} y antagonista de M_{2}/M_{3} ha mejorado el rendimiento cognitivo en pacientes con SDAT (Sramak y col., Life Sciences vol. 2, nº 3, 195-202, 1997). Sin embargo, este compuesto provoca unos efectos secundarios colinérgicos inaceptables, tales como fatiga, diarrea y náuseas.

Una aproximación más radical para las EA/DSTA y el AAMI aspira a aumentar el número de receptores postsinápticos (M_{1}) en el cerebro. A partir de la patente china nº CN1096031A se sabe que la sarsasapogenina (SaG) puede aumentar los receptores colinérgicos M_{1} y también disminuir (es decir, modificar hacia los niveles normales de) los receptores \beta-adrenérgicos, cuyo número puede estar patológicamente aumentado en las EA/DSTA.

Un resumen titulado "The Mechanism of a Sapogenin from Anemarrhenae Asphodeloides Bge. in the Treatment of Senile Dementia", de los autores Ningyu Yi, Yaer Hu y Zongqin Xia, y publicado en el 6º International Symposium of the International Isotope Society en Philadelphia, EE.UU., del 14 al 18 de septiembre de 1997, describe una actividad de la sarsasapogenina frente a la demencia senil y frente a defectos cognitivos leves de memoria, aprendizaje y conocimiento en personas ancianas. Un informe completo de este trabajo se publicó el 1 de abril de 1998 bajo el título "Sarsasapogenin: Mechanism in Treating Senile Dementia" en Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds 1997, Ed. JR Heys y DG Melillo (Pub. J Wiley & Sons), páginas 315 a 320.

El documento WO-A-99/016786 (fecha de reivindicación prioritaria: 26 de septiembre de 1997; fecha de presentación internacional: 28 de septiembre de 1998; fecha de publicación internacional: 8 de abril de 1999; fecha de publicación de la solicitud de fase regional EP nºEP-A-1024146: 2 de agosto de 2000; estados de fase regional EP designados: DE, FR, GB, IT, SE) describe en términos genéricos, sin especificidad, el uso de un intervalo de saponinas y sapogeninas esteroideas contra la demencia, y ejemplifica algunas saponinas con la fórmula genérica.

Los inventores han descubierto varias saponinas y sapogeninas que muestran la capacidad de regular receptores.

Los expertos en la materia serán conscientes de la relación entre las saponinas y sus sapogeninas, y que los efectos deseados de las sapogeninas pueden mostrarse en los pacientes mediante la administración de las correspondientes saponinas, o una mezcla de las mismas. La hidrólisis de al menos una proporción de la saponina se produce en el tracto gastrointestinal. El experto también será consciente de la epimerización de algunas sapogeninas en condiciones de hidrólisis ácida.

No todas las saponinas ni sus aglicones son tratamientos útiles para las EA/DSTA, y algunas, tales como las saponinas y sapogeninas de la digital, tienen potentes acciones inotrópicas en el miocardio. Este grupo de saponinas no parece tener efectos sobre el sistema nervioso central (SNC), lo que confirmaría su uso terapéutico en las EA/DSTA; su potencia y su toxicidad a altas dosis también eliminarían esta posibilidad.

La presente invención es según se define en las reivindicaciones adjuntas.

Algunas de las principales sapogeninas tienen la siguiente fórmula general:

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Respecto a esta fórmula general, la estructura de algunas sapogeninas es según se indica en la Tabla, a continuación:

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La variación en las propiedades farmacológicas y en las acciones farmacodinámicas de los diversos tipos de sapogenina subraya la necesidad de seleccionar aquellos agentes que sean más útiles para el tratamiento de las EA/DSTA. El descubrimiento de nuevos datos sobre la acción de la SaG ha hecho posible determinar qué sustancias son más útiles para el tratamiento de las EA/DSTA y similares.

Las saponinas y las sapogeninas de principal interés en ciertos aspectos de la presente invención aparecen de forma natural en un intervalo de especies de plantas, notablemente de los géneros Smilax, Asparagus, Anemarrhena, Yucca y Agave. Las especies de mayor interés actualmente incluyen Smilax regelii Kilip & Morton - conocida habitualmente como zarzaparrilla hondureña; Smilax aristolochiaefolia Miller - conocida habitualmente como zarzaparrilla mexicana; Smilax ornata Hooker - conocida habitualmente como zarzaparrilla jamaicana; Smilax aspera - conocida habitualmente como zarzaparrilla española; Smilax glabra Roxburgh; Smilax febrifuga - Kunth - conocida habitualmente como zarzaparrilla ecuatoriana o peruana; Anemarrhena asphodeloides Bunge; Yucca schidigera Raezl ex Ortgies; y Yucca brevifolia Engelm. Las saponinas y las sapogeninas que pueden ser de interés también aparecen de forma natural en otros géneros, por ejemplo, Dioscorea, Trillium, Solanum, Strophanthus, Digitalis y Trigonella. Según se indicó anteriormente, algunas saponinas y sapogeninas de estas fuentes poseen propiedades indeseables, y por lo tanto no están recomendadas para su uso en la invención.

La presente invención pone por lo tanto a disposición una composición farmacéutica con propiedades para incrementar la función cognitiva que comprende una cantidad eficaz de esmilagenina como agente activo. Este agente activo es una sapogenina estereoidea no estrogénica.

Se apreciará que la invención también pone a disposición el uso de las composiciones definidas anteriormente. Por lo tanto, la presente invención hace posible un procedimiento para incrementar la función cognitiva que comprende administrar a un animal humano o no humano una dosis eficaz de una composición preparada según la invención.

La invención también pone a disposición un procedimiento para incrementar la función cognitiva en un animal humano o no humano, que comprende administrar una dosis eficaz de esmilagenina como agente activo.

Según se usa en este documento, el término "función cognitiva" se refiere a funciones tales como pensar, razonar, recordar, imaginar y aprender.

También pueden usarse uno o más de un astragalósido, tigogenina, hecogenina y diosgenina en la elaboración de un medicamento según la presente invención, junto con el agente activo según se definió previamente.

Los inventores también han descubierto que cuando se combina la sarsasapogenina con otras ciertas sapogeninas, se obtiene un inesperado efecto sinérgico.

Por lo tanto, la invención también pone a disposición una composición para el tratamiento de una dolencia según se define en las reivindicaciones anexas, comprendiendo la composición al menos dos de sarsasapogenina, esmilagenina, prazerigenina, un astragalósido, tigogenina, ruscogenina, hecogenina y diosgenina, siempre que esté presente la esmilagenina.

Las sustancias usadas en la invención no tienen una elevada actividad estrogénica ni/o androgénica ni/o anabólica ostensible en los pacientes. No obstante, en algunas formas de realización hay un bajo nivel de complementos estrogénicos y/o androgénicos.

Sorprendentemente, los inventores han averiguado que la SaG radiomarcada se concentra en los núcleos de las células cerebrales aisladas de ratas, y que los niveles de ARNm de receptor M están aumentados en ratas tratadas con SaG. Aunque los inventores no pretenden estar ligados a ninguna teoría, se cree que la SaG ejerce los efectos descritos en la patente china nº CN1096031A modulando la expresión del ADN.

Una posible explicación según esta invención es que la SaG sea un agonista intracelular de un receptor esteroideo, posiblemente el receptor de estrógenos, o un factor de transcripción o un promotor. Existen similitudes químicas entre la estructura de los esteroides y la de la SaG, y por lo tanto es posible que el mecanismo de transporte de la SaG desde el citoplasma hacia el núcleo sea el mismo que el de los esteroides. Por lo tanto, después de difundir a través de la membrana celular, la SaG se une a un receptor esteroideo presente en el citoplasma y promueve una transformación conformacional del receptor, de forma que se envía un complejo nuclear de alta afinidad a un sitio de respuesta en el complejo proteico del ADN nuclear. Allí incrementa la transcripción del ARNm, que migra desde el núcleo hasta los ribosomas, dando como resultado un aumento de la producción de los receptores muscarínicos.

Una segunda posibilidad es que la SaG sea un agonista de un receptor desconocido, que actúe para provocar un aumento de la expresión del ARNm uniéndose al complejo proteico del ADN en el núcleo y actuando como un promotor.

En cualquier caso, la unión del complejo SaG-receptor al ADN puede provocar un aumento de la expresión del ARNm que codifica para los receptores colinérgicos, los receptores dopaminérgicos o los receptores adrenérgicos, u otros receptores unidos a la membrana.

Alternativamente, la unión del complejo SaG receptor al ADN puede provocar un aumento de la producción de las proteínas ligadas tales como una proteína G; o impedir su degradación; o posteriormente, en la unión entre dichas proteínas y sus receptores asociados, provocando cambios secundarios en el número de receptores.

Los efectos de la SaG pueden estar mediados a través de aumentos en los niveles de uno o más factores neurotróficos, por ejemplo, el factor de crecimiento nervioso (NGF).

También se ha reconocido que, además de los mecanismos sinápticos neuronales y colinérgicos, es posible que sustancias tales como el óxido nítrico (NO) y los agonistas no colinérgicos puedan tener un efecto modulador sobre la transmisión colinérgica.

Cualquiera que sea la naturaleza exacta del componente celular al que se une la SaG con objeto de ejercer su efecto, esto proporciona una nueva vía sobre la que pueden dirigirse potenciales tratamientos para las EA/DSTA, el AAMI y similares.

Se ha demostrado que la SaG aumenta los niveles del ARNm del receptor unido a membrana, específicamente del ARNm del receptor m_{1}. Por lo tanto, es posible que cuando se active el receptor o el promotor citosólico o nuclear, aumente la producción de las moléculas de ARNm en el tejido, órgano, tipo celular u orgánulo que codifica para los receptores unidos a la membrana, o que disminuya la descomposición de las moléculas de ARNm en el tejido, órgano, tipo celular u orgánulo que codifica para los receptores unidos a la membrana.

El receptor citosólico o nuclear, cuando se activa, también puede aumentar la transcripción de las moléculas de ARNm en el tejido, órgano, tipo celular u orgánulo que codifica para los receptores unidos a la membrana.

Según se mencionó anteriormente, los receptores nicotínicos pueden modular el número y/o el recambio de los receptores unidos a la membrana. Consecuentemente, en un ejemplo de esto, la acción del receptor citosólico o nuclear puede ser modulada administrando una sustancia que sea al menos un agonista parcial de los receptores nicotínicos.

Actualmente se considera que la acción del receptor citosólico o nuclear puede ser modulada mediante la administración, según el tratamiento puesto a disposición por la presente invención, de una sustancia que sea al menos un agonista parcial del mismo.

El receptor puede estar localizado en el citosol de las células del tejido, órgano, tipo celular u orgánulo y, cuando se activa mediante la unión de un agonista, migra al núcleo de las células. También es posible que el receptor esté localizado en el núcleo de las células del tejido, órgano, tipo celular u orgánulo, difundiendo el agonista hacia el núcleo o siendo transportado allí por otro mecanismo.

En el tratamiento puesto a disposición por la presente invención, no es esencial que la sustancia administrada actúe directamente sobre el propio receptor citosólico o nuclear. En su lugar, la acción puede tener lugar retrógadamente o anterógradamente de la intervención del receptor o del promotor citosólico o nuclear en la vía. Por lo tanto, la acción del receptor citosólico o nuclear puede ser modulada administrando una sustancia que aumente la expresión de las molé-
culas de ARNm en el tejido, órgano, tipo celular u orgánulo que codifica para los receptores unidos a la membrana.

El papel de los estrógenos y otros compuestos relacionados como posibles tratamientos para la DSTA ha recibido un considerable interés. En los estudios realizados para observar los efectos de un inhibidor de la colinesterasa, la tacrina, sobre la función cognitiva en pacientes con SDAT, un análisis secundario sugirió que todas las mejoras se observaron en pacientes femeninas que también estaban recibiendo una terapia de sustitución hormonal (estrógenos) (ERT). Los datos epidemiológicos también sugieren que la ERT puede proteger frente al desarrollo de SDAT. Existe un amplio trabajo en ratas que sugiere que una ovariectomía da como resultado una reducción en la función cognitiva, y este efecto puede ser revertido al menos en parte mediante la administración de estrógenos. Los efectos de los estrógenos en este modelo pueden ser un aumento de la captación de colina de alta afinidad en ciertas áreas del cerebro, particularmente el hipocampo, mejorando así la transmisión colinérgica. En el mismo modelo se ha demostrado que la administración de estrógenos aumenta los niveles del ARNm del factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF) usando las técnicas adecuadas de hibridación in situ (Singh 1995).

Posibles mecanismos subyacentes a los efectos de los estrógenos han sido investigados en experimentos in vitro. Estos estudios se han emprendido usando una línea celular de neuroblastoma y la respuesta de las células a la privación de suero o los efectos de las fracciones beta amiloides (BA). Se cree que este último estímulo es de particular relevancia debido a la importancia de las placas amiloides en las etapas tardías de la DSTA. Tanto la privación de suero como las BA inducen la muerte celular. Se ha demostrado que el 17-\beta estradiol protege frente a la muerte celular inducida por la privación de suero y las BA. El efecto protector no se anuló cuando el 17-\beta estradiol se probó en presencia del antagonista de estrógenos tamoxifeno. El enantiómero no estrogénico, el 17-\alpha estradiol, era igual de eficaz inhibiendo la muerte celular. Un trabajo posterior ha sugerido que los efectos protectores de estos compuestos dependen de la presencia de un anillo fenólico A totalmente insaturado y de un grupo hidroxilo no bloqueado en la posición tres (Simpkins 1997; Green 1997). En cultivos de células de neuroblastoma, los compuestos estrogénicos mostraron aumentar la liberación del factor de crecimiento nervioso. La relevancia de estos hallazgos sobre los efectos de los estrógenos en la SDAT todavía no está clara.

Se han publicado solicitudes de patentes que reivindican la utilidad de varias sapogeninas esteroideas con estructuras de espirostano, furo-espirostano, espirosolano o solanidina, en el tratamiento de enfermedades. Aquí son de particular relevancia dos publicaciones de patentes: la solicitud de patente china nº CN1096031A describe efectos reguladores de doble vía de la sapogenina de espirostano, la sarsasapogenina, sobre los receptores \beta-adrenérgicos y M-colinérgicos. Sin embargo, la divulgación de este documento es breve. El otro documento de relevancia es la publicación de patente DE 4303214A1 que reivindica el uso de un intervalo muy amplio de saponinas y sapogeninas en el tratamiento de un completo intervalo de enfermedades que los inventores consideran de origen vírico. Esta divulgación tiene, sin embargo, un dudoso valor porque se sabe que no hay ningún elemento infeccioso en muchas de las dolencias que se caracterizan por una transmisión sináptica deficiente, y por tanto, la premisa básica de la invención alegada es deficiente. Además, no presentan ningún dato de ningún tipo que permita al experto en la materia ser capaz de seleccionar un compuesto preferido a partir del gran número que se
reivindica.

Para identificar los compuestos que podrían tener un uso en el tratamiento de la SDAT y otras enfermedades caracterizadas por una reducción en el número de receptores con la transmisión sináptica, los inventores han estimado la necesidad de identificar compuestos que pudieran tener el efecto deseado pero que estarían desprovistos de cualquier efecto estrogénico, ya que éstos serían inaceptables, particularmente en pacientes masculinos. Varios de los compuestos reivindicados por tener actividad en la solicitud de patente DE 4303214A1 tienen una notable actividad estrogénica, y son por lo tanto inaceptables. Estos datos se resumen a continuación en la Tabla 1.

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TABLA 1 Efectos estrogénicos de los compuestos de sapogeninas esteroideas y triterpenoides elegidos

Compuesto	Actividad estrogénica
Diosgenina	Positiva
Anzurogenina D	Negativa
Ruscogenina	Positiva
Sarsasapogenina	Negativa
Tigogenina	Negativa
Astragalósido	Negativa
Esmilagenina	Negativa

Además, estos compuestos se probaron en otros receptores esteroideos, ya que se consideró que los compuestos que podrían tener una demanda clínica no deberían tener efectos sobre los demás receptores esteroideos. No se encontró que ninguno de estos compuestos tuviera alguna actividad en cualquiera de los siguientes receptores:

Progesterona

Glucocorticoides

Testosterona

Por lo tanto, los compuestos que mostraron no tener una actividad sobre el receptor de estrógenos también eran inactivos en los demás receptores esteroideos importantes.

También se probó la actividad de los compuestos elegidos en varios ensayos in vitro. Los ensayos/experimentos que fueron considerados de importancia clave para determinar la posible actividad en la elevación del número de receptores unidos a la membrana fueron como sigue:

1. Células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con un fragmento de ADN que codifica para un receptor muscarínico. La línea celular usada para la mayoría de los experimentos fue una línea celular que expresaba el receptor m_{2}.

2. Se investigaron los efectos de la expresión del receptor muscarínico en líneas de células cultivadas de origen neuronal.

3. Células musculares cardiacas cultivadas obtenidas a partir de ratas neonatas Sprague Dawley. Las células del músculo cardíaco expresan receptores muscarínicos, típicamente m_{2}. El nivel de estos receptores cae en un cultivo prolongado, y se investigaron los efectos de los compuestos de interés para prevenir la caída en el número de receptores.

A su vez, se describen ahora los procedimientos y los resultados de estos experimentos.

1 Experimentos con la línea celular CHO

Se investigaron los efectos de diversos compuestos sobre la expresión de los receptores m_{2} en células CHO transfectadas con el ADN del receptor m_{2}. Se ensayó el número de receptores usando una unión con QNB tritiado y restando la unión no especifica. Los compuestos se disolvieron en DMSO, y se usó DMSO como control. Los compuestos se probaron en un intervalo de concentraciones finales. Los compuestos también se probaron en presencia y ausencia de tamoxifeno para intentar distinguir un mecanismo mediado por un receptor de estrógenos. Los resultados se resumen en la tabla 2, a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Efectos de los compuestos sobre la expresión de los receptores m_{2} en células CHO

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Por lo tanto, los experimentos indican que varios de los compuestos fueron capaces de aumentar el número de receptores muscarínicos expresados en la superficie de las células CHO cultivadas in vitro. El efecto no fue antagonizado por el tamoxifeno, lo que indica que el mecanismo implicado no implicaba al receptor de estrógenos. Al contrario que en el trabajo publicado por Simpkin y col., se descubrió que no había necesidad de un anillo fenólico A intacto. Igualmente, varios de los compuestos que son sapogeninas esteroideas estaban desprovistos de actividad. Adicionalmente, experimentos adicionales indicaron que el \beta-estradiol tenía un efecto similar para aumentar la expresión del receptor cuando se administraba a una concentración de 10^{-5 M.}

2 Efectos de los compuestos sobre la supervivencia de las células

Se han usado otros ensayos in vitro para distinguir entre compuestos activos y no activos. En particular, se han cultivado in vitro diversas líneas celulares de neuroblastoma, incluyendo células SKN-SN y SH-SY5Y, así como líneas celulares de feocromocitoma en presencia de fragmentos \beta-amiloides o con depleción de suero. Se investigaron varias técnicas para demostrar la eficacia de los compuestos para proteger las células cultivadas. Estas técnicas incluían una exclusión con azul de tripano, quimioluminiscencia y liberación de lactato deshidrogenasa. La observación de mayor interés fue que la incubación de las células, en particular de células PC12, con \beta-amiloides redujo el número de receptores muscarínicos medido usando técnicas de unión de ligandos radio-marcados. Se encontró que esta reducción en el número de receptores mejoraba con los compuestos activos.

3 Efectos de los compuestos sobre células musculares cardiacas cultivadas

Se aislaron células musculares cardiacas del músculo ventricular de ratas neonatas Sprague Dawley usando técnicas convencionales. Las células se cultivaron in vitro y se estimó el número de receptores muscarínicos expresados en fragmentos de membrana de la superficie celular después de la homogeneización de las células recogidas en diversos puntos temporales usando la unión específica de QNB tritiado. Los experimentos preliminares demostraron que el número de receptores expresado tendía a descender después de 10 días de cultivo. Los experimentos se diseñaron, por tanto, para investigar los efectos de los diversos compuestos para inhibir este descenso en número de receptores.

Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 3:

TABLA 3 Efectos de diversos compuestos sobre la expresión de receptores muscarínicos en células musculares cardiacas cultivadas

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NES = ningún efecto significativo

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Sorprendentemente, los inventores han averiguado que las sapogeninas se concentran preferentemente en los núcleos de las células cultivadas in vitro. Esto es sorprendente porque, según se discutió anteriormente, la sarasasapogenina (SaG) y algunos otros compuestos de los que se ha demostrado que aumentan en número de receptores muscarínicos no se unen a los receptores esteroideos conocidos. Además, es sorprendente que la SaG es captada preferentemente en el núcleo, porque los efectos de estos compuestos pueden observarse en sistemas de ensayo in vitro que expresan el receptor muscarínico, pero en los que el ADN del receptor ha sido transfectado al citoplasma, y por lo tanto, no está bajo el mecanismo normal de control nuclear.

La SaG y los otros compuestos que han sido probados y de los que se ha demostrado que regulan los niveles de receptores, han mostrado, todos, que no se unen directamente a ninguno de los receptores unidos a membrana de las principales clases conocidas. Por lo tanto, puede postularse que los efectos observados probablemente no son debidos a, por ejemplo, un efecto sobre el receptor nicotínico y un consecuente aumento en el número de receptores muscarínicos. Esta explicación parece ser incluso menos admisible (aunque no puede ser excluida) si se considera que los inventores también han demostrado que algunos de los compuestos aumentan el número de receptores \beta-adrenérgicos expresados en los linfocitos de la sangre periférica. Por lo tanto, el mecanismo parecería ser uno que tiene un efecto más general sobre la regulación de los receptores unidos a membrana.

Aquí se especula con que el efecto de los compuestos activos reivindicados en esta patente puede operar a través de un efecto sobre las proteínas G, y que los efectos sobre el número de receptores son secundarios a un efecto sobre una proteína G. Cuando un receptor ligado a proteínas G unido a la membrana es estimulado, se inician dos conjuntos básicos de acontecimientos: la respuesta efectora y la internalización del receptor. El subsiguiente procesado del receptor hasta el estado en el que está de nuevo en una forma en la superficie celular u otra superficie de membrana en la que puede interactuar con otro ligando de receptor parece estar sometido a varios factores. Varios de estos factores o mecanismos parecen estar ligados a proteínas G. Existen pruebas de que la activación de los receptores m_{3} puede tener un efecto sobre la expresión o el nivel de la proteína G. Se especula con que las acciones de los compuestos descritos en esta patente pueden ser debidas a una interacción en los procesos de regeneración del receptor, la unión a proteínas G o la homeostasis de las proteínas G.

Una hipótesis alternativa es que los compuestos están aumentando la síntesis o la liberación o una tasa disminuida de degradación de factores neurotrópicos tales como el factor de crecimiento derivado del cerebro y/o el factor de crecimiento nervioso. Estos efectos sobre los factores de crecimiento podrían ser debidos a un efecto del compuesto sobre un receptor citosólico o nuclear, o a la unión de un compuesto a una región promotora, con el consiguiente efecto directo sobre la tasa de producción del ARNm del factor de crecimiento, o como consecuencia del aumento de la producción de otro factor material tal como una proteína G, finalmente, los efectos pueden ser secundarios a un efecto sobre un receptor o una serie de proteínas G.

El aumento de la expresión y/o el procesado anormal de la proteína precursora amiloidea (APP) están asociados con la formación de placas amiloides y depósitos amiloides cerebrovasculares, que son las principales señales morfológicas de la enfermedad de Alzheimer. Son de particular interés los procesos que regulan la escisión proteolítica de la APP en fragmentos amiloidogénicos y no amiloidogénicos. La escisión de la APP por parte de la enzima \alpha-secretasa en la secuencia \beta-amiloide de la proteína da como resultado la formación de un fragmento C terminal no amiloidogénico, y el fragmento soluble APPs\alpha; se ha demostrado que este último fragmento tiene actividad neurotrópica y neuroprotectora, así como para incrementar la memoria en ratones cuando se inyecta por vía intracerebroventricular (ICV). Por el contrario, el procesado de la APP por la \beta-secretasa expone el extremo N terminal del \beta-amiloide, que es liberado por la escisión de la \gamma-secretasa en el extremo C terminal variable. Se ha demostrado que los péptidos \beta-amiloides resultantes, que contienen 39-43 aminoácidos, son neurotóxicos y se acumulan en placas que interfieren con las conexiones interneuronales.

Varios estudios han demostrado que la estimulación de los receptores muscarínicos M_{1} y M_{3} ligados a cinasa de proteínas (PKC) da como resultado un aumento de la actividad \alpha-secretasa. Como consecuencia, aumenta el procesado de la APP a APPs\alpha, junto con su efecto neuroprotector. Paralelamente, disminuye el procesado de la APP por la \beta y la \gamma-secretasa, y hay una reducción consecuente del \beta-amiloide. Otros transmisores, tales como el factor de crecimiento nervioso (NGF) y el factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF), así como la bradicinina y la vasopresina, pueden tener efectos similares para aumentar la proporción de la APP procesada a APPs\alpha. Puede haber varios factores implicados en los efectos del NGF, que pueden incluir la unión del factor a un receptor de cinasa de tirosina (TrkA) y la estimulación de la fosfolipasa C\gamma, con la subsiguiente fosforilación y activación de la cinasa de proteínas C (PKC) y el aumento de la actividad relativa de la \alpha-secretasa.

Podría esperarse, por tanto, que cualquier tratamiento que aumente la actividad de la cinasa de proteínas C selectivamente en el cerebro fuera de utilidad en la gestión de la enfermedad de Alzheimer. Hasta hace poco no han estado disponibles agonistas selectivos del receptor M_{1}. Se esperaría que los agonistas no selectivos estimularan los receptores M_{2} presinápticos, lo que provocaría una retroalimentación negativa, y por tanto, deterioraría adicional y gravemente la transmisión muscarínica. Ahora empiezan a estar disponibles los agonistas selectivos del receptor M_{1} (talsaclidina), dichos agentes se están investigando para el tratamiento de la AD. Sin embargo, existe un riesgo sustancial de que, al igual que con la administración crónica de cualquier agonista de un receptor, los beneficios clínicos observados estén gravemente limitados en términos del grado de beneficio, al reducir el número de receptores o al reducir la sensibilidad, y en términos de efectos secundarios, debido a la ausencia de especificidad de receptor. Por lo tanto, se esperaría que los compuestos según se describen en esta invención, que aumentan selectivamente el número de receptores muscarínicos M_{l}, con poco o ningún efecto sobre los receptores muscarínicos M_{2} en el cerebro, estén desprovistos de los problemas observados con un agonista muscarínico, y por lo tanto tengan una utilidad particular. De hecho, los beneficios pueden apreciarse en tres partes, como sigue.

1. Un aumento selectivo en el número de receptores M_{1} que da lugar a un aumento de la transmisión sináptica. La administración crónica de un agonista selectivo tendría, como mucho, ningún efecto adverso sobre la transmisión;

2. Secundariamente a un aumento en el número de receptores, un aumento de la estimulación de la PKC con un consiguiente aumento de la actividad de la \alpha-secretasa, que da lugar a:

2.1

Una reducción de la producción de \beta-amiloide y la consiguiente reducción de la formación de placas y de la pérdida neuronal;

2.2

Un aumento en la APPs\alpha, y una consiguiente mejora en la función cerebral, según se atestigua mediante una mejora en la memoria a corto y a largo plazo.

Finalmente, los efectos del sistema GABA para modular la transmisión han sido discutidos anteriormente. Se sabe que existe un sitio de unión esteroideo en el receptor GABA que es distinto a los sitios de unión de las benzodiacepinas, el cloruro y el GABA. Se sabe que varios compuestos terapéuticos se unen en este sitio, y se han usado para incrementar o reducir el nivel de consciencia. Se especula con que la administración crónica de un agonista parcial en este sitio podría dar lugar a una mejora de la transmisión.

La invención se describirá adicionalmente en el siguiente ejemplo.

Ejemplo Investigación de los niveles de ARNm usando una hibridación in situ

Se dividieron ratas macho SD de 20 meses de edad de raza pura aleatoriamente en 2 grupos. Un grupo recibió una media de 3 mg de sarsasapogenina por rata y por día mezclada con la comida diaria. El grupo de control recibió la comida y el agua normales. Cuatro meses después se usaron sus cerebros en experimentos con técnicas de hibridación, usando ratas de 4 a 6 meses de edad como grupo de control joven. Las demás distribuciones de alimento de cada grupo fueron completamente idénticas.

Se sintetizó una cadena de ADNc que se corresponde respectivamente con los ARNm de m_{1} y de m_{2}. m_{1} corresponde a la secuencia de aminoácidos 3-18 de la proteína del receptor, es decir, TGG TGC CAA GAC AGT GAT GTT GGG ACT GAC AGC AGG GGG CAC TGA GGT, y M_{2} con la secuencia de aminoácidos 1-16, es decir, ATG AAT AAC TCA ACA AAC TCC TCG AAC AAT GGC TTG GCT ATT ACC AGT. El ADNc se marcó usando un kit de reactivos de marcaje 3'-terminal con a-^{35}S-dATP (8,9 TBq/mmol) como material de marcaje. Una vez finalizada la reacción, se purificó con una columna de nucleótidos. Se estimó la actividad específica del lote (16,67-33,34) x 108 MBq/\mug. El a-^{35}S-dATP, el kit de reactivos de marcaje 3'-terminal y la columna de nucleótidos se obtuvieron de Du Pont Co., EE.UU..

En cada punto temporal se obtuvo una rata de cada grupo y se realizaron experimentos en paralelo. Las ratas se decapitaron y sus cerebros se extrajeron intactos. Se prepararon cortes en corona de 15 \mum de espesor en un criomicrotomo de congelación constante (criomicrotomo AS-600, Anglia Scientific Co, Reino Unido).

Los cortes se tomaron de diferentes áreas (lugares idénticos en cada rata) y se montaron sobre portaobjetos untados con polilisina, se secaron en una corriente de aire frío, se fijaron en una disolución de paraformaldehído al 4% (que contiene 1 x de solución salina tamponanda con fosfato (PBS), pH 7,0) durante 5 minutos antes de ser lavados dos veces con PBS. Entonces se colocaron en una disolución de anhídrido acético al 0,25% (que contiene clorhidrato de trietanolamina 0,1 M, pH 8,0, y cloruro sódico al 0,9%) durante 10 minutos, se deshidrataron con alcohol etílico al 70%, 80%, 95% y 100% durante 1 minuto, se desengrasaron con cloroformo durante 5 minutos, y finalmente se trataron sucesivamente con alcohol etílico al 100% y al 95% durante 1 minuto.

Se tomaron cortes que se usaron como controles negativos, y se deshidrataron con alcohol etílico etc., según se detalló anteriormente, pero previamente se trataron con una disolución de 100 mg/ml de ARNasa y una disolución 2 x de SSC (una disolución de sal/citrato sódico que contiene 300 mmol/L de cloruro sódico y 45 mmol/L de citrato sódico) durante 2 horas a 37ºC.

Para la hibridación se formó la matriz fluida de hibridación con reciente que contiene un 50% de formamida desionizada, 4 x de SSC, sulfato de dextrano al 10%, 250 \mug/\mul de ARNt de levadura, 5 x de disolución Denhard, 500 \mug/ml de ADN de protamina de desnaturalización, 10 mmol/L de ditíotreitol. Finalmente se añadió la sonda oligonucleotídica [(16,67-33,34) x 10 MBq/50 \mul) marcada con ^{35}S y se mezcló uniformemente. Se vertieron 50 \mul de la matriz sobre cada corte y se colocó livianamente por encima un cubreobjetos de vidrio de silicato, evitando las burbujas de aire. Entonces los cortes se colocaron en una caja de hibridación con 2 x de SSC en el fondo para conservar la humedad, y se incubaron a 37ºC durante de 18 a 24 horas.

Después de la hibridación, los cortes se empaparon con una disolución 1 x de SSC y se agitaron levemente para aclarar el cubreobjetos de vidrio. Se lavaron brevemente con una disolución 1 x de SSC, y después se hicieron vibrar suavemente en 2 x de SSC que contenía formamida al 50% a 37ºC durante 20 minutos, cambiando la disolución cuatro veces; y después se transfirieron a una disolución 1 x de SSC para ser vibrados a la temperatura de laboratorio durante 30 minutos (se repitió dos veces). Finalmente, los cortes se lavaron con agua bidestilada, se deshidrataron con alcohol etílico al 70% y después al 95%, y se secaron al aire.

Se prepararon autorradiografías en un cuarto oscuro, prensando conjuntamente el espécimen y el hiperfilm beta max usando el método de contacto, y se colocaron en un casete con un desecante, expuesto a 4ºC durante de 2 a 3 semanas. Se desarrollaron (D196) y se fijaron (F5). Finalmente, las autorradiografías se analizaron usando un analizador de imagen informatizado (analizador de imagen VIDAS, Kontron, Alemania).

La sonda m_{2} no consiguió mostrar ningún área localizada de actividad. La sonda m_{1} mostró actividad en el núcleo dentado, la corteza cerebral y el estriado.

La comparación de estas tres áreas para los diferentes grupos animales se muestra en la Tabla 4:

TABLA 4

Comparación
Área	Ancianos frente a jóvenes	SaG frente a ancianos
Corteza	-5,14 \pm 2,68 (23)	5,77 \pm 3,82 (20)
Hipocampo	-3,18 \pm 2,87 (12)	0,96 \pm 4,26 (10)
Estriado	-12,2 \pm 3,6*	15,71 \pm 3,27* (10)

Medias positivas aumentadas en comparación con el comparador.

\text{*}p<0,01. Cifras entre paréntesis = número de cortes.

Hubo una reducción significativa en la expresión del ARNm de los receptores m_{1} del estriado de las ratas ancianas en comparación con los controles jóvenes. La administración de SaG dio como resultado un aumento significativo en el ARNm de los receptores m_{1} en la misma área cerebral cuando se compararon los animales tratados con los controles ancianos no tratados.

Claims (13)

1. Uso de esmilagenina como agente activo en la preparación de una composición para el tratamiento de la disfunción cognitiva en un animal humano o no humano.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que se usan al menos dos agentes activos, que comprenden esmilagenina y sarsasapogenina.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el animal es un ser humano que padece la enfermedad de Alzheimer o DSTA.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece la enfermedad de Parkinson.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece la demencia por cuerpos de Lewi.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece hipotensión postural.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece autismo.

8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece el síndrome de fatiga crónica.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece miastenia grave.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece la enfermedad de Lambert Eaton.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece el síndrome de la guerra del golfo.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el animal es un ser humano que padece una exposición laboral a compuestos organofosforados.

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el animal es un ser humano anciano.