ES2276460T3

ES2276460T3 - Extractos de plantas que tienen actividad supresora del apetito.

Info

Publication number: ES2276460T3
Application number: ES98917372T
Authority: ES
Inventors: Fanie Retief Van Heerden; Robert Vleggaar; Roelof Marthinus Horak; Robin Alec Learmonth; Vinesh Maharaj; Rory Desmond Whittal
Original assignee: Council for Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council for Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2018-04-15
Also published as: ES2321162T3; US20040228935A1; GB2338235A; GT199800076A; GT199800076AA; JP2003026591A; DE69836321D1; AP9901673A0; GEP20022788B; EP1222927A3; IL131659A; PL201487B1; US20030086984A1; EP1222927B1; HUP0000838A3; CN1252000A; EA200200392A1; GEP20022709B; TW200300093A; SA98190501B1

Abstract

Se describe una composición farmacéutica que contiene un extracto que se puede obtener de una planta del género Trichocaulon o Hoodia que contiene un agente supresor del apetito que tiene la fórmula (1) . También se proporcionan un procedimiento para obtener el extracto y un procedimiento para sintetizar el compuesto (1) y sus análogos y derivados. La invención también se refiere al uso de dichos extractos y compuesto (1) y sus análogos para la fabricación de medicamentos que tienen actividad supresora del apetito. La invención proporciona, además, nuevos intermedios para la síntesis del compuesto (1).

Description

Extractos de plantas que tienen actividad supresora del apetito.

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Esta invención se refiere al uso de un extracto de planta preparado a partir de plantas del grupo que comprende el género Trichocaulon y el género Hoodia y que tiene actividad supresora del apetito.

El extracto puede prepararse a partir de material de planta tal como los tallos y raíces de dichas plantas del género Trichocaulon o del género Hoodia. El género Trichocaulon y el género Hoodia incluyen plantas carnosas que crecen en regiones áridas tales como las que se encuentran en África del Sur. En una aplicación de la invención, el extracto supresor del apetito activo se obtiene de la especie Trichocaulon piliferum. La especie Trichocaulon officinale también puede usarse para proporcionar un extracto supresor del apetito activo. En otra aplicación de la invención, el extracto supresor del apetito activo puede obtenerse de la especie Hoodia currorii, Hoodia gordonii u Hoodia lugardii. Los bioensa-
yos realizados por el solicitante en ratas han indicado que ciertos extractos tienen actividad supresora del apetito.

El material de planta puede homogeneizarse en presencia de un disolvente adecuado, por ejemplo, un disolvente de metanol/cloruro de metileno, mediante un dispositivo tal como un mezclador Waring. La solución de extracción después puede separarse del material de planta residual por un procedimiento de separación apropiado tal como, por ejemplo, filtración o centrifugación. El disolvente puede retirarse mediante un rotavapor, preferiblemente en un baño de agua a una temperatura de 60ºC. El extracto bruto separado después puede extraerse adicionalmente con cloruro de metileno y agua antes de separarse en un extracto de cloruro de metileno y un extracto acuoso. Se puede retirar el disolvente del extracto de cloruro de metileno preferiblemente mediante evaporación en un rotavapor y el extracto resultante puede purificarse adicionalmente mediante extracción con metanol/hexano. El producto de extracción con metanol/hexano después puede separarse para producir un extracto de metanol y un extracto de hexano. El extracto metanol puede evaporarse para retirar el disolvente para producir un extracto activo parcialmente purificado.

El extracto activo parcialmente purificado puede disolverse en metanol, y puede fraccionarse adicionalmente por cromatografía en columna, empleando gel de sílice como medio de adsorción y una mezcla de cloroformo/metanol al 30% como eluyente. Puede obtenerse una pluralidad de diferentes fracciones, y cada una puede evaluarse por procedimientos de bioensayo adecuados, para determinar la actividad supresora del apetito de las mismas.

Una fracción que tenga actividad supresora del apetito puede preferiblemente fraccionarse adicionalmente tal como por cromatografía en columna usando gel de sílice como medio de adsorción y un disolvente de cloroformo:metanol 9:1, y las subfracciones resultantes se pueden bioensayar para su actividad supresora del apetito. Una subfracción que presente actividad supresora del apetito puede, si se desea, fraccionarse adicionalmente y purificarse, convenientemente usando un procedimiento cromatográfico en columna con gel de sílice como medio de adsorción y un disolvente de acetato de etilo:hexano 9:1. Las fracciones purificadas resultantes pueden evaluarse de nuevo por procedimientos de bioensayo adecuados para su actividad supresora del apetito.

El solicitante ha descubierto que al menos una de dichas fracciones purificadas tiene buena actividad supresora del apetito, y el principio activo de la fracción se identificó por técnicas químicas convencionales incluyendo resonancia magnética nuclear, y se descubrió que era un compuesto de la fórmula estructural

1

De acuerdo con la nomenclatura del S.I., el principio activo (1) es el compuesto 3-O-[-\beta-D-tevetopiranosil-(1\rightarrow4)-\beta-D-cimaropiranosil-(1\rightarrow4)-\beta-D-cimaropiranosil]-12\beta-O-tigloiloxi-14-hidroxi-14\beta-pregn-50-en-20-ona (C_{47}H_{74}O_{15}
M^{+}878).

El compuesto (1) es un nuevo compuesto y este trisacárido esteroideo tiene propiedades supresoras del apetito.

La presente invención proporciona por tanto, en un primer aspecto, el uso, en la fabricación de un medicamento que tiene actividad supresora del apetito para tratar, prevenir o combatir la obesidad de un ser humano o animal, de un extracto de una planta del género Trichocaulon o el género Hoodia, conteniendo dicho extracto una cantidad eficaz de un glicósido esteroideo supresor del apetito de dicha planta, donde el glicósido esteroideo tiene la fórmula

2

La presente invención proporcionan, en un segundo aspecto, un procedimiento no terapéutico para reducir la ingesta calórica total de un ser humano o animal, comprendiendo el procedimiento a administrar a dicho ser humano o animal un producto alimenticio o bebida que comprenda un extracto de una planta del género Trichocaulon o el género Hoodia, conteniendo dicho extracto una cantidad eficaz de un glicósido esteroideo supresor del apetito de dicha planta, donde el glicósido esteroideo tiene la fórmula (1) como se ha indicado anteriormente.

El extracto puede, por ejemplo, obtenerse por un procedimiento que incluye las etapas de tratar el material de planta con un disolvente para extraer una fracción que tenga actividad supresora del apetito, separar la solución de la extracción del resto del material de planta, retirar el disolvente de la solución de extracción y recuperar el extracto.

El extracto puede, por ejemplo, obtenerse por un procedimiento que incluye las etapas de prensar el material de planta para separar la savia del material de planta sólido y recuperar la savia libre del material de planta sólido para formar el extracto.

La planta del género Trichocaulon o el género Hoodia puede, por ejemplo, seleccionarse entre las especies Trichocaulon piliferum y Trichocaulon officinale y la planta del género Hoodia puede, por ejemplo, seleccionarse entre las especies Hoodia currorii, Hoodia gordonii y Hoodia lugardii.

La planta puede, por ejemplo, seleccionarse entre Hoodia currorii, Hoodia gordonii y Hoodia lugardii. En un ejemplo, la planta es Hoodia gordonii.

El extracto de dicha planta puede, por ejemplo, ser un extracto en el que se han retirado sustancialmente todas las impurezas no activas.

El procedimiento puede, por ejemplo, incluir la etapa de concentrar el agente activo en el material extraído por extracción adicional con un disolvente.

El disolvente en la etapa o etapas de extracción con disolvente del procedimiento puede, por ejemplo, ser uno o más de cloruro de metileno, agua, metanol, hexano, acetato de etilo o mezclas de los mismos.

El procedimiento puede, por ejemplo, incluir la etapa de concentrar el agente activo en el material extraído por separación cromatográfica. La separación cromatográfica puede, por ejemplo, emplear uno o más de cloroformo, metanol, acetato de etilo, hexano y mezclas de los mismos como eluyentes. El procedimiento puede incluir, por ejemplo, realizar la separación cromatográfica en una columna, recoger el eluato en fracciones de la columna, evaluar las fracciones para determinar su actividad supresora del apetito, y seleccionar la al menos una fracción que contenga el agente supresor del apetito.

En el procedimiento para obtener dicho extracto, el extracto puede, por ejemplo, procesarse para formar un polvo no aglomerante. Por ejemplo, el extracto puede secarse para retirar la humedad, por ejemplo, por secado por pulverización, secado por congelación o secado al vacío, para formar un polvo no aglomerante.

El extracto puede, por ejemplo, incorporarse en una composición o formulación que incluye también otros ingredientes farmacéuticamente aceptables. Por tanto, el medicamento puede prepararse, por ejemplo, mezclando una composición que tiene actividad supresora del apetito, que comprende dicho extracto, con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutico.

El medicamento se prepara opcionalmente en forma de dosificación unitaria.

El agente supresor del apetito de fórmula (1) puede, por ejemplo, obtenerse en forma de un compuesto aislado (compuesto químico natural) de dicha planta, concretamente una planta del género Trichocaulon o el género Hoodia, por ejemplo una planta de la especie Trichocaulon piliferum o Trichocaulon officinale o de la especie Hoodia currorii, Hoodia gordonii u Hoodia lugardii. El compuesto aislado puede procesarse para proporcionar una composición que tenga actividad supresora del apetito que comprende el compuesto (1) mezclando el compuesto con un excipiente, dilu-
yente o vehículo farmacéutico. Dicha composición puede, por ejemplo, prepararse en forma de dosificación unitaria.

El compuesto de fórmula (1) puede, por ejemplo, aislarse y/o purificarse de una planta de la especie Trichocaulon piliferum o Trichocaulon officinale o de la especie Hoodia currorii, Hoodia gordonii u Hoodia lugardii. El compuesto aislado y/o purificado puede procesarse para proporcionar una composición que tenga actividad supresora del apetito que comprenda el compuesto (1) mezclando el compuesto con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutico. Dicha composición puede, por ejemplo, prepararse en forma de dosificación unitaria.

El compuesto de fórmula (1) puede, por ejemplo, aislarse y/o purificarse de un extracto obtenido de una planta de la especie Trichocaulon piliferum o Trichocaulon officinale o de la especie Hoodia currorii, Hoodia gordonii u Hoodia lugardii. El compuesto aislado y/o purificado puede procesarse para proporcionar una composición que tenga actividad supresora del apetito que comprenda el compuesto (1) mezclando el compuesto con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutico. Dicha composición puede, por ejemplo, prepararse en forma de dosificación unitaria.

El agente supresor del apetito puede, por ejemplo, ser un compuesto químico natural aislado de fórmula:

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La composición o formulación supresora del apetito puede constar del agente supresor del apetito mezclado con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutico. Pueden añadirse otros aditivos adecuados, incluyendo un estabilizante u otros de dichos ingredientes que puedan desearse.

Por tanto, se posibilita un procedimiento para suprimir el apetito administrando un ser humano o un animal una dosificación eficaz de una composición descrita anteriormente.

La invención posibilita de este modo el uso de un extracto obtenido de material de planta del género Trichocaulon u Hoodia y que contiene un glicósido esteroideo sustancialmente puro de fórmula (1).

La invención también posibilita el uso de un producto alimenticio o bebida que contenga una cantidad eficaz del glicósido esteroideo de fórmula (1) para que tenga un efecto supresor del apetito cuando se ingiere.

Los estudios genéticos moleculares han conducido a un aumento considerable en la comprensión de la regulación del apetito, la saciedad y el peso corporal. Estos estudios han revelado numerosas vías reguladoras centrales, mediadas por varios neuropéptidos. El mantenimiento de un peso corporal normal se consigue por un equilibrio complejo entre la ingesta de energía, el consumo de alimento, y el gasto de energía. La homeostasis de la energía está sometida a un amplio intervalo de influencias, finalmente controladas por el cerebro. Las diferentes señales incluyen cosas tales como el sentido del olfato y el gusto y señales gastrointestinales tales como la dilatación del tracto gastrointestinal, señales químicas a la mucosa gástrica y metabolitos en la sangre tales como ácidos grasos y glucosa.

De forma central, el neuropéptido "Y" (NPY) que está regulado de forma negativa por la leptina, se ha establecido como uno de los reguladores positivos del comportamiento de la alimentación. La expresión del antagonista endógeno para receptores de melanocortina también ha demostrado ser la base para la obesidad en un modelo particular (el ratón ob/ob). De hecho, la deficiencia en el receptor de melanocortina MC4 replica completamente el síndrome de obesidad. Otros mediadores que han demostrado tener papeles en el equilibrio energético incluyen la bombesina, la galonina y el péptido 1 de tipo glucagón.

La invención y su eficacia se describirán ahora adicionalmente, sin limitación del alcance de la invención, con referencia a los siguientes ejemplos y dibujos.

En los dibujos,

la Figura 1 muestra un diagrama de flujo de un procedimiento general para extraer un primer extracto supresor del apetito bruto y un extracto supresor del apetito purificado a partir del material de planta del género Trichocaulon u Hoodia;

la Figura 2 muestra una representación gráfica de un bioensayo realizado en ratas usando un extracto de metanol parcialmente purificado de Trichocaulon piliferum;

las Figuras 3 y 4 juntas muestran una representación esquemática de un procedimiento para producir un extracto de material de planta del género Trichocaulon u Hoodia; y

las Figuras 5 y 6 muestran una representación gráfica del porcentaje de cambio en la masa corporal de las ratas para diferentes grupos durante los días -7 a 7 y los días 0 a 7 respectivamente en un estudio de dosis repetida usando un extracto de savia y un extracto de savia secada por pulverización de material de planta de la especie Hoodia gordonii.

Ejemplo 1

El procedimiento general para extraer un primer extracto supresor del apetito bruto y un extracto supresor del apetito purificado a partir de material de planta del género Trichocaulon o del género Hoodia se ilustra a modo de diagrama de flujo de la Figura 1.

Ejemplo 2

Los bioensayos realizados en ratas usando un extracto de metanol parcialmente purificado obtenido del modo ilustrado en el Ejemplo 1, indicaron que el extracto muestra de hecho actividad supresora del apetito. La actividad supresora del apetito del extracto activo puede ilustrarse a modo de ejemplo típico del efecto del extracto de metanol de Trichocaulon piliferum sobre ratas, a modo de representación gráfica en la Figura 2.

Será evidente a partir de la Figura 2 que el grupo de ensayo de ratas dosificadas con el extracto en el día 5 mostraron una ingesta de alimento sustancialmente disminuida sobre los siguientes dos días, mientras que el grupo de control no describe una ingesta de alimento reducida comparable. La ingesta de alimento del grupo de ensayo volvió a la normalidad, y de hecho aumento desde el día 8 en adelante.

Ejemplo 3

Se ilustra un procedimiento para producir un extracto que tiene actividad supresora del apetito de forma esquemática a modo de ejemplo en las Figuras 3 y 4, ilustrando las dos Figuras juntas el procedimiento completo. Sin embargo, pueden usarse diversos procedimientos diferentes, como entenderán los especialistas en la técnica.

Con referencia a la Figura 3, se suministra material de planta del género Trichocaulon o el género Hoodia en un mezclador 3, por ejemplo un mezclador Waring, mediante el conducto de suministro 1, con un disolvente en forma de una solución de cloruro de metileno/metanol introducida por el conducto de suministro 2. El producto homogeneizado se suministra por el conducto 4 a una fase de separación 5, por ejemplo en forma de un filtro o centrifuga, y el material de planta residual se retira por el conducto 27.

La mezcla de disolvente/extracto se suministra mediante el conducto 6 a una fase de evaporación 7, donde el disolvente se retira, por ejemplo, mediante un rotavapor. El extracto bruto secado se suministra por el conducto 8 a una fase de extracción adicional 9 con la adición de una solución de cloruro de metileno/agua introducida por el conducto de suministro 29 para la extracción adicional, y después a una fase de separación 13 mediante el conducto 11, donde la fracción acuosa se retira mediante el conducto 31. La fracción del extracto disuelto se suministra mediante el conducto 15 a una fase secadora 17 donde se evapora el disolvente, por ejemplo por un rotavapor.

Con referencia a la Figura 4, el extracto secado se suministra mediante el conducto 10 a una fase de extracción 12. También se suministra una solución de metanol/hexano mediante el conducto 14 a la fase de extracción 12 para purificación adicional y extracción del extracto secado. La mezcla de extracto/metanol/hexano se suministra mediante el conducto 16 a una fase de separación 18, se retira la fracción de hexano mediante el conducto 20, y después se suministra la mezcla de metanol/extracto mediante el conducto 22 a una fase de secado 24. En la fase de secado 24, se retira el disolvente, por ejemplo por evaporación en un rotavapor.

El extracto activo parcialmente purificado y secado se suministra mediante el conducto 26 y con la adición de metanol mediante el conducto 28 en una fase de solución 30, y la fracción disuelta se suministra mediante el conducto 36 a una columna de cromatografía 38.

En la columna 38, se fracciona adicionalmente la fracción soluble en metanol, usando gel de sílice y un disolvente de cloroformo/metanol al 30%, en diferentes fracciones esquemáticamente indicadas como fracciones I a V. De acuerdo con un procedimiento de fraccionamiento real realizado por el solicitante, el procedimiento de fraccionamiento produjo los siguientes pesos de fracción: I(3,9 g); II(2,6 g); III(2,1 g); IV(1,1 g) y V(2,0 g). Estas fracciones se evalúan individualmente por un procedimiento de bioensayo adecuado (en una etapa no mostrada) en las fracciones identificadas como fracciones I y II, que presentan una marcada actividad supresora del apetito, se suministran por los conductos de suministro 40 y 42 en las columnas 44 y 46 respectivamente donde se fraccionan adicionalmente y se purifican por cromatografía en columna, de nuevo usando gel de sílice y un sistema de cloroformo:metanol 9:1.

Las subfracciones II(A)-(C) obtenidas de la columna 44 no presentan, cuando se ensayan, una actividad supresora del apetito notable, y pueden reciclarse para cromatografía adicional.

Las subfracciones I(A)-(L) obtenidas de la columna 46 también se evalúan (por una etapa de ensayo no mostrada), y se descubre que la subfracción I(C) tiene una marcada actividad supresora del apetito.

La subfracción I(C) se suministra mediante el conducto 48 en la columna 50 para un fraccionamiento y purificación adicionales, usando gel de sílice y el eluyente acetato de etilo:hexano 9:1. De las fracciones purificadas resultantes, se descubre que la fracción I(C)(ii), después del ensayo, tiene una marcada actividad supresora del apetito.

El producto purificado se identifica por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (como se indica en las Tablas 1 y 2 a continuación) como el compuesto (1).

TABLA 1 Datos de ^{1}H r.m.n. (300,13 MHz) para el compuesto (1) CDCl_{3}

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TABLA 2 Datos de ^{13}C r.m.n. (75,25 MHz) relevantes para el compuesto (1) en CDCl_{3}

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Compuesto 1

Datos IR: 3440 cm^{-1} (OH) 2910 cm^{-1} (CH), 1700 cm^{-1} (C=0) [\alpha_{D}]^{20}_{589} = 12,67º (C=3, CHCl_{3}) p.f. 147ºC - 152ºC.

Ejemplo 4

Los resultados de los siguientes tres bioensayos sobre la suspensión del apetito se exponen a continuación viz.

a): Ensayo de Irwin;

b): Ensayo de Toxicidad Aguda; y

c): Ensayo Anoréctico de Dosis Oral.

a) Ensayo de Irwin

El propósito de este ensayo fue evaluar el agente supresor del apetito de la invención producido a partir de un extracto de planta como se ha descrito anteriormente en este documento, de acuerdo con el ensayo de Irwin reducido en animales para la acción tranquilizante y sedante.

Procedimiento Experimental

El agente supresor del apetito se extrajo del material de planta por el solicitante por el procedimiento que se ha descrito anteriormente en este documento y se administró a dos de cuatro grupos de tres animales cada uno: un grupo no recibió tratamiento, un grupo recibió el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO), un grupo recibió la muestra de ensayo a 50 mg/kg, y un grupo recibió la muestra de ensayo a 300 mg/kg. El tratamiento tuvo lugar por inyección intraperitoneal, y se hicieron observaciones a intervalos específicos hasta cinco horas después del tratamiento. En la interpretación de los resultados se usaron solamente los síntomas diferentes a los observados en los animales tratados con DMSO.

Resultados

Quedó claro que el disolvente, DMSO, tenía un efecto marcado sobre los animales, especialmente sobre el mecanismo regulador del calor. Las temperaturas corporales de todos los animales tratados con el disolvente, solo o junto con la muestra de ensayo, mostraron una disminución marcada.

Los animales en el grupo de dosis baja mostraron una dispersión disminuida en la jaula y una actividad locomotora disminuida, como en todos los demás grupos, incluyendo el grupo de control. Se observó apatía en el mismo grado que en el grupo tratado con DMSO. La respiración disminuida se observó 15-60 minutos después del tratamiento. También se observó ptosis (cierre de los párpados de los ojos) a un grado superior que en el grupo de DMSO. Se observó una respuesta de la pinna (oreja) así como una respuesta positiva a los dedos, indicando timidez. La temperatura corporal bajó hasta 32,7ºC después del tratamiento

Los animales en el grupo de dosis elevada mostraron, como en los otros grupos, una dispersión inicial disminuida en la jaula y actividad locomotora disminuida, pero mostraron una dispersión y actividad locomotora aumentadas antes de la muerte, que sucedía aproximadamente 1 hora después del tratamiento. Hubo varias convulsiones simétricas clónicas 30 minutos después del tratamiento. La respiración disminuyó inicialmente, pero aumentó antes de la muerte. Se retardó la respuesta de la pinna (oreja) y se observó una respuesta positiva a los dedos, indicando timidez, como se observó en animales en el grupo de dosis baja. La temperatura corporal bajó hasta 30,7ºC después del tratamiento. Se observó una pasividad posicional aumentada así como un tono corporal disminuido. Se observó una rotación anormal de las extremidades, la fuerza de agarre disminuyó, no estuvo presente una respuesta al dolor y sucedió una pérdida del reflejo de estiramiento.

Análisis

Cuando se comparan con los animales de control y tratados con DMSO, los animales que recibieron solamente la dosis baja (50 mg/kg) mostraron una respiración disminuida y un grado aumentado de ptosis. Los animales que recibieron la dosis elevada (300 mg/kg) de la muestra de ensayo reaccionaron de forma muy intensamente mostrando convulsiones y muerte. Todas las demás observaciones hechas en estos animales pueden atribuirse a los animales que tienen convulsiones y mueren. No se observaron signos que sugieran acciones tranquilizantes y sedantes tales como una marcada dispersión disminuida en las jaulas, actividad locomotora disminuida y apatía que pudieran atribuirse a la muestra de ensayo en los grupos de ensayo.

Por lo tanto puede concluirse que la muestra de ensayo es letal para ratones a 300 mg/kg y tiene efectos supresores de la respiración en ratones a 50 mg/kg, cuando se da forma de forma intraperitoneal con DMSO como disolvente.

b) Ensayo de Toxicidad Aguda

El propósito de este ensayo fue obtener información sobre la toxicidad de la muestra de ensayo.

Procedimiento Experimental

Se purificó un extracto de planta preparado de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente en este documento, y que tiene acción supresora del apetito y se ensayó una muestra de ensayo a dosis crecientes por tratamiento oral en ratones. Se usaron dos animales por grupo de dosis, excepto en el grupo de la dosis más alta donde sólo se trató un animal. Los animales se examinaron para la buena salud y se determinaron sus masas corporales en el día de tratamiento.

Las dosis variaron de 100 mg/kg hasta 3.028,5 mg/kg. La dosis se calculó y se mezcló en almidón de patata preparado, de modo que cada animal recibió una dosis total de 0,2 ml. El animal 13 recibió 0,25 ml. El almidón de patata se preparó mezclando 20 g de almidón en un pequeño volumen de agua fría, y añadiéndolo a agua hirviendo, para componer un volumen de 1 litro. La suspensión se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de dosificarla.

Los animales en los grupos 1 y 2 se trataron en el mismo día. Se observaron durante 24 horas y si no se desarrollaban signos de toxicidad, se trataba el segundo grupo. Se siguió el mismo enfoque hasta que se trataron todos los animales. Este programa se siguió para asegurar que los animales no se trataran innecesariamente cuando se hubiera alcanzado una dosis tóxica aguda en el grupo previo.

Los animales se observaron para los signos clínicos de toxicidad inmediatamente (1-2 horas) después del tratamiento y diariamente después de ello. Se determinó la masa corporal una vez a la semana y se midió la ingesta total de alimento y agua de cada animal.

Los animales supervivientes se sacrificaron con eutanasia por inyección intraperitoneal de pentobarbitona sódica (disponible en el mercado con el nombre comercial Euthanaze, Centaur^{R}) en el día 14 del experimento. Se realizó un examen post-mortem de estos animales, así como del animal que murió durante el experimento. Se recogieron muestras para histopatología.

Resultados

Grupo 1 (Grupo de Control)

No se observaron signos clínicos de toxicidad durante el periodo de observación de 14 días. La ingesta de alimento y agua estuvo en los parámetros normales. Los cambios en la masa corporal también estuvieron en los parámetros normales. No se registraron cambios histopatológicos en las muestras hepáticas.

Grupo 2 (100 mg/kg)

No se observaron signos clínicos de toxicidad durante el periodo de observación. La ingesta de alimento y agua fue normal y los cambios en la masa corporal durante el periodo de observación también fueron normales. No se observó patología macroscópica ni se registraron cambios histopatológicos o morfológicos en las muestras hepáticas.

Grupo 3 (200 mg/kg)

Los animales en este grupo no mostraron signos clínicos de toxicidad durante el experimento. La ingesta de alimento y agua fue normal, así como el cambio en la masa corporal. No se observó patología macroscópica, pero los hígados mostraron cambios histopatológicos en el examen. La hinchazón de aspecto opaco de los hepatocitos fue leve en el animal 6, pero moderada en el animal 5. También sucedió degeneración hidrópica moderada en los hepatocitos del animal 5.

Grupo 4 (400 mg/kg)

No se observaron signos clínicos de toxicidad durante el periodo de observación, y no se observó patología macroscópica durante el examen post-mortem. Se observó hinchazón de aspecto opaco moderada y cambios hidrópicos leves de los hepatocitos en la histología.

La ingesta de agua y alimento y el aumento en la masa corporal del animal 7 fueron normales. El animal 8 consumió casi el doble de la ingesta total de alimento del animal 7 (144,6 g y 73,9 g respectivamente), pero el aumento en la masa corporal fue sólo de 0,81 g comparado con 2,7 g.

Grupo 5 (800 mg/kg)

Un animal (animal 10) murió tres horas después de la dosificación sin mostrar ningún signo específico. El otro animal (animal 9) sobrevivió al periodo completo de observación sin ningún signo de toxicidad. La ingesta de agua del animal superviviente fue normal (42,42 ml), mientras que la ingesta de alimento fue elevada (134,2 g). La masa corporal aumentó en 2,85 g que fue la más elevada de todos los animales del experimento.

En el examen post-mortem del animal 10, que murió poco después de la dosificación oral, se congestionaron los pulmones. No se presentó ninguna reacción por cuerpos extraños que hubiera indicado inhalación de material de ensayo. No se observó patología macroscópica en el animal 9. Hubo vacuolización citoplásmica leve (degeneración hidrópica) en el animal 10, pero moderada en el animal 9. El aspecto citoplásmico glandular del hígado se clasificó como moderado en ambos animales.

Grupo 6 (1.600 mg/kg)

Ninguno de los animales presentó ningún signo clínico de toxicidad durante el transcurso del experimento. No se observó patología macroscópica en el examen post-mortem, pero se observaron cambios degenerativos moderados en el hígado del animal 11 en el examen histopatológico. El animal 12 mostró hinchazón de aspecto opaco moderada y cambios hidrópicos leves de los hepatocitos. La ingesta de alimento y agua fue normal, así como el aumento en la masa corporal durante el periodo experimental.

Grupo 7 (3.028,5 mg/kg)

Se trató sólo una animal en esta dosis. Este animal no mostró signos de toxicidad durante el periodo de observación, y no se observó patología macroscópica. En el examen histopatológico se observó hinchazón de aspecto opaco moderada y degeneración hidrópica de los hepatocitos. El animal mostró una pérdida de masa corporal durante el periodo de observación (-0,82 g), pero la ingesta de alimento y agua fue normal.

Análisis

Como se usó una cantidad muy pequeña de animales en cada grupo de dosis, es difícil hacer ninguna conclusión. El hecho de que sólo un animal muriera a un índice bajo de dosis, sin mostrar ningún síntoma, puede indicar que la muerte no estaba relacionada con la muestra de ensayo, sino debida al estrés durante y/o después del tratamiento. Ningún animal en grupos de dosis más altas murió o mostró ningún signo de toxicidad, que apoya adicionalmente esta suposición.

La ingesta de alimento aumentada observada en el animal 8 podría atribuirse posiblemente a un excesivo vertido de comida como se reflejó en el pequeño aumento en la masa corporal. Debe tenerse también en mente que todos los animales en este experimento se trataron sólo una vez, y que es improbable que un supresor del apetito tuviera una influencia marcada sobre la ingesta de alimento o agua, o la masa corporal en un periodo de 14 días, como fue el caso en este experimento.

A partir del examen histopatológico de las muestras hepáticas, quedó claro que los cambios patológicos estaban relacionados con la dosis, mostrando los animales que recibieron dosis más altas cambios extensivos. La patología observada no era de naturaleza metabólica, sino que posiblemente estaba inducida por la muestra de ensayo. Los cambios fueron sólo degenerativos y por lo tanto reversibles. No se observaron signos de cambios hepatocelulares irreversibles.

Puede, por lo tanto, concluirse que sólo un animal murió a una dosis inferior (800 mg/kg), pero que la muerte posiblemente no estaba relacionada con la muestra de ensayo. Ninguno de los demás animales en ninguno de los grupos de dosis mostró ningún signo de toxicidad durante el periodo de observación de 14 días después del tratamiento, o murió como resultado del tratamiento. Una dosis oral única de la muestra de ensayo indujo cambios hepatocelulares reversibles relacionados con la dosis.

c) Ensayo Anoréctico de Dosis Oral

El propósito de este ensayo fue determinar la actividad de un extracto de planta preparado de acuerdo con la invención, y la dosis eficaz mínima, y en el mismo momento investigar cualquier posible efecto secundario tal como supresión de la respiración, como se experimenta en le ensayo de Irwin (mencionado anteriormente).

Procedimiento Experimental

Se asignaron animales a grupos de tratamiento usando tablas de aleatorización. Cada grupo de tratamiento constaba de tres animales, con 6 animales en el grupo de control. La muestra de ensayo se dosificó a ratas hembras jóvenes con un peso corporal de 100-150 g en la aclimatación, durante tres días consecutivos. Los animales se identificaron mediante crotales metálicos y marcas cutáneas de KMnO_{4} para una fácil identificación. Los animales se alojaron individualmente en jaulas de policarbonato convencionales para roedores, y estuvieron disponibles ad libitum agua y gránulos en polvo comerciales para roedores. Se midió la ingesta de agua y alimento y se calculó para cada día. Para encontrar la dosis eficaz mínima de la muestra de ensayo, se ensayaron cinco dosis. El tratamiento fue por sonda oral, con la muestra de ensayo suspendida en almidón de patata.

La sustancia de ensayo era compuesto (1), un polvo granular blanco preparado a partir de un extracto de material de planta de acuerdo con la invención, y la cantidad medida de la muestra de ensayo se mezcló con almidón de patata preparado y se dosificó. La mezcla con almidón de patata tuvo lugar inmediatamente antes de la dosificación en cada día. Antes de retirar el volumen de dosificación para cada animal, las suspensiones mezclaron minuciosamente usando un agitador Vortex.

Se ensayó un intervalo de cinco dosis, recibiendo un grupo de control sólo la sustancia de vehículo. Las dosis se eligieron en base a los efectos observados en el ensayo de Irwin descrito anteriormente y fueron:

Grupo 1:	0,00 mg/kg (Grupo de Control)
Grupo 2:	6,25 mg/kg
Grupo 3:	12,50 mg/kg
Grupo 4:	25,00 mg/kg
Grupo 5:	37,50 mg/kg
Grupo 6:	50,00 mg/kg

Resultados

El tratamiento no afectó a la salud de los animales durante el periodo de estudio. Los animales tratados con la muestra de ensayo en todos los grupos de dosis, mostraron una ganancia de masa corporal media significativamente reducida durante el periodo total del estudio, y animales en tres de los cinco grupos de tratamiento realmente perdieron masa corporal.

La ingesta media de alimento para todos los grupos de tratamiento se redujo durante el periodo de estudio. Los animales en los grupos de dosis más altas mostraron un consumo de agua aumentado.

La velocidad respiratoria en ninguno de los animales en ningún grupo de dosis se vio afectada significativamente.

Los animales en todos los grupos de dosis presentaron hígados desmenuzables en el examen post-mortem, pero no se observó patología macroscópica.

Análisis

Los datos recogidos durante el periodo de aclimatación confirmaron que todos los animales incluidos en el experimento estaban sanos y la ganancia de masa corporal era comparable entre los animales.

La reducción, y en algunos animales incluso una pérdida, en la ganancia de masa corporal, en combinación con la ingesta reducida de alimento es fuertemente indicativa de supresión del centro del apetito.

La ingesta reducida de alimento y la ganancia reducida de masa corporal se experimentó incluso con el grupo de dosis más baja (6,25 mg/kg). Se experimentó una pérdida real de masa corporal en el grupo de 12,50 mg/kg.

Es importante observar que todos los grupos de tratamiento tuvieron un consumo de agua aumentado cuando disminuyó el consumo de alimento (Figura 2). Esto podía deberse a un efecto diurético de la muestra de ensayo, o a la estimulación del centro de la sed en el cerebro.

El hecho de que no sucediera supresión respiratoria como se había observado en el ensayo de toxicidad aguda mencionado anteriormente, con la vía intraperitoneal, se ve como un aspecto positivo. Esto podría deberse a una absorción reducida del tracto gastrointestinal, con una consecuente biodisponibilidad reducida. La biodisponibilidad a las dosis orales ensayadas fue, sin embargo, suficiente para que la muestra de ensayo fuera eficaz. La ligera reducción en la velocidad de la respiración 1 hora después del tratamiento en la mayoría de los grupos podría atribuirse al llenado del estómago con el volumen de dosis y la consecuente pasividad de los animales.

Los hígados desmenuzables observados en los grupos de tratamiento podrían deberse a un cambio en el metabolismo energético después de la ingesta reducida de alimento, causando un metabolismo aumentado de las grasas y una sobrecarga en el hígado. Si de hecho éste el caso, estos cambios probablemente podrían considerarse como transitorios que podrían recuperarse con el tiempo después de que se haya alcanzado un estado estacionario, o después de la retirada de la muestra de ensayo. El posible efecto sobre el hígado también tiene que investigarse adicional-
mente.

Como este estudio estaba pretendido principalmente como ensayo de exploración, se usaron grupos pequeños de animales de ensayo. Esto hace que la interpretación estadística de los datos sea difícil, especialmente cuando los animales individuales reaccionaron de forma totalmente diferente. Sin embargo, los datos indican que la muestra de ensayo tiene acción supresora del apetito, incluso la dosis más baja ensayada (6,25 mg/kg). No sucedieron signos clínicos de supresión respiratoria a las dosis ensayadas.

Ejemplo 5

Las plantas Hoodia recogidas recibidas del entorno natural o a través de un programa de cultivo se almacenan primero a 4ºC durante un máximo de 48 horas. Las plantas se lavan en agua corriente y después se trocean en porciones de \pm 1 cm. Los pedazos troceados se combinan todos y después se prensan a través de una prensa hidráulica a 30 MPa (300 bares) de presión durante un mínimo de 0,5 horas por prensado. Durante el prensado se recoge por separado la savia de la planta. La savia se almacena a -18ºC hasta que se requiere el procesamiento adicional.

La savia se seca por pulverización en condiciones adecuadas para obtener un polvo no aglomerante. El contenido de humedad en el polvo es preferiblemente menor del 5% después del secado por pulverización y, si es necesario, se seca adicionalmente en un horno de vacío o usando un secador de lecho fluido.

Tanto la savia como el material secado por pulverización han demostrado ser eficaces como agente supresor del apetito en ensayos biológicos en ratas.

Parte Experimental

Se lavaron 50 kg de Hoodia gordonii con agua corriente y después se trocearon en porciones de 1 cm. Las plantas troceadas se prensaron después a través de una prensa hidráulica a 30 MPa (300 bares) durante un mínimo de 0,5 horas por lote. La savia se recogió y se descubrió que la masa era de 10 kg cuando se usaron plantas de Hoodia gordonii del entorno, y 20 kg cuando se usaron plantas de Hoodia gordonii del programa de cultivo. La savia (500 g) se secó por pulverización usando las siguientes condiciones:

Caudal	:	2,85 ml/min
Temperatura de entrada	:	110ºC
Temperatura de salida	:	70ºC
Temperatura de la cámara	:	78ºC

El polvo secado por pulverización obtenido era un polvo no aglomerante (22 g) con un contenido de humedad del 6,9%.

El polvo secado por pulverización se analizó para la concentración de ingrediente activo usando técnicas de HPLC. Se determinó que la concentración del activo era de 13 g/kg de polvo secado por pulverización.

Procedimiento de Análisis por HPLC

Eluyente	:	Acetonitrilo: agua (7:3), isocrático
Columna	:	C-18 fase inversa
Absorbancia UV	:	225 nm
Caudal	:	1 ml/min
Volumen de inyección	:	10 \mul

Procedimiento

Se disolvió el polvo secado por pulverización (10 mg) en agua (0,5 ml) y acetonitrilo (0,5 ml) y se inyectaron 10 \mul de esta solución en la HPLC y se determinó la concentración del compuesto activo (1) usando una curva patrón que se preparó a partir del compuesto puro (1).

Ejemplo 6

A continuación se presentan los resultados de un estudio diseñado para evaluar los posibles efectos anorécticos del compuesto (1) en ratas. En lo siguiente, las muestras ensayadas son savia pura (Muestra 1), savia secada por pulverización (Muestra 2) y un resto activo (Muestra 3). Las Muestras 1 y 2 son la savia y la savia secada por pulverización respectivamente, como se describe en el Ejemplo 5 anterior. La Muestra 3 es compuesto (1) extraído con disolvente de una pureza de \geq 95%.

Las Muestras 1 a 3 se administraron cada una como una dosis oral única a ratas Wistar macho. Dos grupos de control adicionales recibieron vehículo (agua destilada o DMSO). Se incluyó fenfluramina administrada por vía oral (7,5 mg/kg) como patrón de referencia.

La Muestra 1 (savia pura) administrada por vía oral, produjo reducciones dependientes de la dosis en el consumo de alimento que fueron estadísticamente significativas a dosis de 1600 mg/kg y superiores en comparación con los controles tratados con vehículo. También se registraron reducciones concomitantes en el peso corporal (o índice de crecimiento). En el día de la dosificación, se registraron aumentos estadísticamente significativos en el consumo de agua 3 horas después de la dosis (6.400 y 10.000 mg/kg) y 6 horas después de la dosis (10.000 mg/kg). Entre 24 y 48 horas después de la dosis, se registraron reducciones estadísticamente significativas en el consumo de agua a dosis de 3.200 mg/kg y superiores.

La Muestra 2 (savia secada por pulverización) administrada por vía oral a 76 mg/kg también produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de alimento y el peso corporal en comparación con animales tratados con vehículo. No se registraron efectos estadísticamente significativos sobre el consumo de agua.

La Muestra 3 (resto activo) produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de alimento a una dosis oral de 5,0 mg/kg. No se produjeron efectos estadísticamente significativos sobre los pesos corporales por el resto activo aunque el examen de los datos reveló un ligero retardo en el crecimiento en comparación con animales de control tratados con vehículo. No se registraron efectos estadísticamente significativos sobre el consumo de
agua.

El patrón de referencia, fenfluramina (7,5 mg/kg), produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de alimento a las 6 y 24 horas después de la dosis en comparación con el grupo de control relevante tratado con vehículo. No se registraron efectos estadísticamente significativos sobre el consumo de agua o el peso corpo-
ral.

No se registraron efectos relacionados con el tratamiento en los hígados.

104

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Procedimiento Experimental

Se usaron cincuenta y cinco ratas Wistar macho para el estudio.

Se registraron los pesos corporales, consumo de alimento (peso de la tolva de comida) y consumo de agua (peso del frasco) diariamente en el mismo momento cada día desde el día de la llegada hasta la terminación del estudio.

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En el día 1, las ratas recibieron una dosis oral única (sonda) de acuerdo con la siguiente tabla:

105

Se dosificó a los grupos 1 - 8 usando un volumen de dosis constante de 10 ml/kg y se dosificó a los grupos 9 - 12 usando un volumen de dosis de 1 ml/kg.

También se midió el consumo de alimento y agua a las 1,3 y 6 horas después de la dosificación en el Día 1.

Después de las mediciones del Día 8, se sacrificó a los animales por asfixia con dióxido de carbono, y se escindieron los hígados y se colocaron en formalina tamponada al 10%, antes de la histología.

Se tomaron secciones en cera parafina de cada hígado a 4 - 5 \mum y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se cortaron secciones adicionales en un criostato a 12 \mum y se tiñeron para las grasas con Aceite Rojo O (ORO).

Análisis de los Datos

Se compararon las mediciones de consumo de alimento y agua después de la dosis y los pesos corporales en cada momento puntual para los animales tratados con P57 con las del grupo de control relevante tratado de forma similar vehículo usando el análisis de la varianza seguido por el ensayo de Williams para comparaciones con los controles.

Los datos de los animales tratados con fenfluramina se compararon con los del grupo de control tratado con vehículo usando el ensayo t de Student.

Resultados

Los resultados se resumen en las tablas.

La Muestra 1 (savia pura) administrada por vía oral produjo reducciones marcadas relacionadas con la dosis en el consumo diario de alimento. La duración y amplitud de estas reducciones en el consumo de alimento fueron dependientes de la dosis. A las 24 horas después de la dosis, la Muestra 1 (savia pura) produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de alimento a dosis de 1.600 mg/kg y superiores en comparación con los controles tratados con vehículo. La dosis más elevada de Muestra 1 (savia) (10.000 mg/kg) produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de alimento en una base diaria hasta 5 días después de la dosis.

La Muestra 2 (savia secada por pulverización) y la Muestra 3 (resto activo) produjo reducciones marcadas y estadísticamente significativas en el consumo de alimento a dosis orales de 76 y 5,0 mg/kg respectivamente. En ambos casos los efectos duraron 48 horas después de la dosis.

El patrón de referencia, fenfluramina (7,5 mg/kg, p.o.) produjo reducciones estadísticamente significativas en el consumo de alimento a las 6 y 24 horas después de la dosis en comparación con el grupo de control relevante tratado con vehículo (Grupo 12).

La Muestra 2 (savia secada por pulverización) y la Muestra 3 (resto activo) no produjeron efectos marcados relacionados con la dosis sobre el consumo de agua. En el día de la dosificación, la savia pura produjo aumentos estadísticamente significativos en el consumo de agua a las 3 horas después de la dosis (6.400 y 10.000 mg/kg) y 6 horas después de la dosis (10.000 mg/kg). Dos días después de la dosificación, sin embargo, se registraron disminuciones estadísticamente significativas en el consumo de agua en animales que recibieron Muestra 1 (savia) a 3.200, 6.400 y 10.000 mg/kg. Estas reducciones, sin embargo, no estuvieron claramente relacionadas con la dosis y solamente sucedieron entre 1 y 2 días después de la dosis. El significado biológico de estos efectos, por lo tanto, sigue sin estar claro.

La Muestra 1 (savia pura) produjo efectos estadísticamente significativos relacionados con la dosis en los pesos corporales en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (Grupo 1). Cuando se administraron por vía oral, a dosis de 3.200 mg/kg y superiores, la Muestra 1 (savia pura) produjo reducciones estadísticamente significativas en el peso corporal o índices de crecimiento disminuidos en comparación con los animales tratados con vehículo. Estos efectos fueron estadísticamente significativos desde 48 horas después de la dosis hasta el final del estudio.

La Muestra 2 (savia secada por pulverización) administrada por vía oral a 76 mg/kg también produjo reducciones estadísticamente significativas en el crecimiento de los animales en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (Grupo 1). Estos efectos fueron estadísticamente significativos entre los Días 3 (48 horas después de la dosis) y 5, ambos incluidos.

Aunque la Muestra 3 (resto activo) pareció retardar el crecimiento de los animales a la dosis más elevada (5,0 mg/kg) en comparación con el grupo de control relevante tratado con vehículo (Grupo 12), este efecto no fue estadísticamente significativo.

La fenfluramina (7,5 mg/kg) no produjo efectos marcados o estadísticamente significativos sobre el consumo de agua o los pesos corporales en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (Grupo 12).

No se registraron efectos relacionados con el tratamiento en los hígados.

TABLA 1a

4

TABLA 1b

5

TABLA 2a

6

TABLA 2b

7

TABLA 3a

8

9

10

Informe histopatológico

El examen histológico se restringió al hígado. No se detectaron cambios relacionados con el tratamiento para la Muestra 1 (líquido), Muestra 2 (savia secada por pulverización), Muestra 3 (resto activo), fenfluramina o el grupo de control con DMSO.

Los descubrimientos registrados fueron de una incidencia similar en los grupos de control y tratados.

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TABLA

11

12

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Ejemplo 7

A continuación se describe un bioensayo adicional, que empleó las mismas muestras de ensayo que las descritas en el Ejemplo 6. Los animales en este estudio recibieron una dieta restringida, es decir, los animales sólo recibieron comida entre las 12:00 y 3:00 pm diariamente. Esto es diferente de todos los otros ensayos biológicos realizados hasta ahora, en los que el alimento estaba disponible para las ratas ad libitum. Los animales se aclimataron durante un periodo de siete días (días -7 a -1), la dosificación tuvo lugar desde el día 0 al día 6 a las 9:00 am por sonda oral. El periodo de recuperación fue del día 7 al día 13. Los grupos de dosificación se describen en la siguiente Tabla 1. Debe observarse que el grupo de control real está marcado como Grupo 09. El Grupo 5 es un grupo controlado que recibió una dieta equivalente a la del Grupo 4. El propósito de este grupo fue evaluar el efecto que una dieta restringida tiene sobre la vida de los animales.

Resultados

Los resultados generados durante el estudio mostraron que el periodo de aclimatación fue demasiado corto. Las ratas se alimentaron principalmente durante la noche y el cambio repentino a un acceso restringido al alimento durante 3 horas durante el periodo de día, produjo una ingesta diaria inferior. La ingesta diaria de comida aún aumentaba en la mayoría de los grupos al final del periodo de aclimatación cuando comenzó la dosificación con los artículos de ensayo. Como resultado de esto, el efecto de los materiales de ensayo no afecto significativamente a la ingesta de alimento de las ratas durante el periodo de dosificación.

Las masas corporales medias para los diferentes grupos durante los días -7 a -1 y los días 0 a 6 se muestran en la Tabla D1 y Tabla D2. El efecto de las diferentes dosificaciones de la savia y savia secada por pulverización se muestra en los gráficos adjuntos como % de cambio en la masa corporal del día 0 a 7 (Figura 5), y % de cambio en la masa corporal del día -7 a 7 (Figura 6). La pérdida en la masa corporal está claramente relacionada con la dosis especialmente con las dosificaciones más elevadas.

El examen histopatológico de los hígados no mostró ninguna patología significativa en los grupos que recibieron los artículos de ensayo.

Alimento

El consumo de alimento se midió diariamente, durante la aclimatación y durante el estudio. El alimento estuvo disponible durante un periodo diario de alimentación de 3 horas, comenzando a las 12:00 y finalizando a las 15:00. Los animales estuvieron en ayunas durante el resto del tiempo. Los animales del Grupo 5 recibieron una cantidad medida de alimento en el Día 1, equivalente al consumo promedio de alimento del Grupo 4 en el Día 0. Este patrón de alimentación controlado para el Grupo 5, determinado a partir del consumo promedio de alimento del Grupo 4 del día previo, se siguió durante los Días 1 - 7.

Agua

El agua se proporcionó en recipientes convencionales. El agua (Agua Corriente de Magalies Water Board, adecuada para el consumo humano) estuvo disponible ad libitum. El consumo de agua se midió una vez al día, en el mismo momento cada día, después de la determinación del consumo de alimento.

Aclimatación

Los animales se aclimataron durante siete días antes del inicio del estudio, tiempo durante el cual se determinó el consumo de alimento y agua como se ha descrito anteriormente. Se determinaron las masas corporales en una base diaria durante este tiempo.

Diseño del Estudio y Procedimientos TABLA 1

13

Vía de Administración

Los artículos de ensayo se administraron en una base diaria durante siete días, usando una aguja intra-gástrica. Los animales se dejaron en ayunas durante 18 horas antes de la administración del artículo (comenzando a las 09:00).

Duración del Tratamiento

Se trató a los animales durante 7 días consecutivos (desde el Día 0 - Día 6). Tres animales de cada grupo se sacrificaron 24 horas después de la última dosis (Día 7). Los tres animales restantes se sacrificaron 7 días después del último tratamiento (Día 13). Este procedimiento se siguió para todos los grupos excepto para el Grupo 5 en el que se sacrificaron tres animales 24 horas después de la última alimentación controlada (Día 8), los tres animales restantes se sacrificaron 7 días después del último tratamiento (Día 13).

Masas Corporales

Las masas corporales se determinaron diariamente, a aproximadamente el mismo momento cada día durante el transcurso del estudio, incluyendo durante el periodo de aclimatación.

Eutanasia

Se sacrificaron tres animales de cada grupo 24 horas después de la última dosificación (Día 7).

Los tres animales restantes se sacrificaron 7 días después del último tratamiento. Este procedimiento se siguió para todos los grupos excepto para el Grupo 5 en el que se sacrificaron tres animales 24 horas después de la última alimentación controlada (Día 8), los tres animales restantes se sacrificaron 7 días después del último tratamiento (Día 13). Los animales se sacrificaron con eutanasia al final del periodo de estudio con gas CO_{2}.

Exámenes Oftalmoscópicos

Los exámenes oftalmoscópicos, usando un oftalmoscopio, se hicieron antes de la primera administración del artículo de ensayo y al final, en todos los animales en todos los grupos.

Patología Macroscópica

Se realizó un examen post-mortem completo en cada animal que se sacrificó con eutanasia al final del periodo de estudio.

Histopatología

Se realizó el examen histopatológico del hígado de cada uno de los animales.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA D.1

14

TABLA D.2

16

TABLA D.3

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19

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TABLA 1 Evaluación histológica de secciones hepáticas de ratas macho

Muestra 1

20

21

Grupo 5: Control: Agua purificada Elga opción 4: ingesta de alimento restringida

22

Leyenda

C: = Congestión

DHS: = Hinchazón celular hidrópica difusa

FHS: = Hinchazón celular hidrópica focal

NPL: = Si lesiones del parénquima

MLC: = Agrupamiento linfocítico mínimo

1+: = leve

2+: = moderado

3+: = grave

TABLA 2 Evaluación histológica de secciones hepáticas de ratas macho

Muestra 2

23

24

Grupo 9: Control: Agua purificada Elga opción 4

25

Leyenda

C: = Congestión

DHS: = Hinchazón celular hidrópica difusa

FHS: = Hinchazón celular hidrópica focal

NPL: = Si lesiones del parénquima

MLC: = Agrupamiento linfocítico mínimo

1+: = leve

2+: = moderado

3+: = grave

No se registraron lesiones específicas en las secciones hepáticas de las ratas experimentales que recibieron la savia congelada así como la savia secada por pulverización que podría atribuirse a la administración oral de los compuestos químicos mencionados anteriormente. La hinchazón celular hidrópica registrada en las ratas tanto de control como experimentales puede indicar una hinchazón celular metabólica normal y cambios anóxicos. Se encontraron focos mínimos de agrupamiento perivascular linfocítico en algunos animales y muy probablemente es una observación fortuita. En unas pocas ratas se presentó congestión de grado leve en los sinusoides hepáticos y deben considerarse como una observación fortuita.

Una característica importante de la invención mostrada por los resultados de este estudio es que no se desarrolló tolerancia a ninguna de las muestras durante el periodo de ensayo. Esto puede proporcionar un beneficio considerable, particularmente en relación con el tratamiento de la obesidad.

Aunque los compuestos y composiciones se han descrito principalmente en relación a sus propiedades como supresores del apetito, debe observarse que esta expresión -"supresor del apetito"- se usa en este documento para indicar la actividad que tiende a limitar el apetito y/o aumentar la sensación saciedad, y por tanto tiende a reducir la ingesta calórica total; esto a su vez tiende a contrarrestar la obesidad. Por consiguiente, esta invención deja disponible un procedimiento para tratar, prevenir o combatir la obesidad en un ser humano o animal no humano que comprende administrar de dicho ser humano o animal no humano una cantidad de tratamiento, prevención o combate de la obesidad de una composición o extracto que contenga un compuesto de fórmula (1).

El término "animal" como se usa en este documento se extiende a, pero sin restricción, animales de compañía, por ejemplo, mascotas del hogar y animales domesticados; incluyendo ejemplos no limitantes de dichos animales, ganado, ovejas, hurones, cerdos, camellos, caballos, aves, peces, conejos, cabras, perro y gatos.

Como agente anoréctico o en el tratamiento o prevención de la obesidad en un ser humano, un compuesto de fórmula (1), o la composición definida en una cualquiera de las reivindicaciones a continuación en este documento, se administra de forma ventajosa a dicho ser humano en una cantidad de dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día. Un intervalo de dosificación preferido es de 0,05 mg/kg/día a 0,5 mg/kg/día. Cuando se usa la forma en polvo secado por pulverización del extracto, un intervalo de dosificación preferido es de 0,1 mg/kg/día a 20 mg/kg/día; se prefiere especialmente de 0,5 mg/kg/día a 5 mg/kg/día.

Claims

1. Uso, en la fabricación de un medicamento que tiene actividad supresora del apetito para tratar, prevenir o combatir la obesidad de un ser humano o animal, de un extracto de una planta del género Trichocaulon o el género Hoodia, conteniendo dicho extracto una cantidad eficaz de un glicósido esteroideo supresor del apetito de dicha planta, en el que el glicósido esteroideo tiene la fórmula

26

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el extracto se puede obtener por un procedimiento que incluye las etapas de tratar el material de planta con un disolvente para extraer una fracción que tiene actividad supresora del apetito, separar la solución de extracción del resto del material de planta, retirar el disolvente de la solución de extracción y recuperar el extracto.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el extracto se puede obtener por un procedimiento que incluye las etapas de prensar el material de planta para separar la savia del material de planta sólido y recuperar la savia libre del material de planta sólido para formar el extracto.

4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la planta del género Trichocaulon o el género Hoodia se selecciona entre las especies Trichocaulon piliferum y Trichocaulon officinale y la planta del género Hoodia se selecciona entre las especies Hoodia currorii, Hoodia gordonii y Hoodia lugardii.

5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el procedimiento incluye la etapa de concentrar el agente activo en el material extraído por extracción adicional con un disolvente.

6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 ó 5, en el que el disolvente en la etapa o etapas de extracción con disolvente del procedimiento es uno o más de cloruro de metileno, agua, metanol, hexano, acetato de etilo o mezclas de los mismos.

7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el procedimiento incluye la etapa de concentrar el agente activo en el material extraído por separación cromatográfica.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la separación cromatográfica emplea uno o más de cloroformo, metanol, acetato de etilo, hexano o mezclas de los mismos como eluyente.

9. Uso de acuerdo con las reivindicación 7 u 8, en el que el procedimiento incluye realizar la separación cromatográfica en una columna, recoger el eluato en fracciones de la columna, evaluar las fracciones para determinar su actividad supresora del apetito, y seleccionar la al menos una fracción que contiene el agente supresor del apetito.

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que en el procedimiento, el extracto se procesa para formar un polvo no aglomerante.

11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se prepara un medicamento en forma de dosificación unitaria.

12. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la planta se selecciona entre Hoodia currorii, Hoodia gordonii y Hoodia lugardii.

13. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la planta es Hoodia gordonii.

14. Un procedimiento no terapéutico para reducir la ingesta calórica total de un ser humano o animal, comprendiendo el procedimiento administrar a dicho ser humano o animal un producto alimenticio o bebida que comprenda un extracto de una planta del género Trichocaulon o el género Hoodia, conteniendo dicho extracto una cantidad eficaz de un glicósido esteroideo supresor del apetito de dicha planta, en el que el glicósido esteroideo tiene la fórmula

27

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el extracto puede obtener por un procedimiento que incluye las etapas de tratar material de planta con un disolvente para extraer una fracción que tiene actividad supresora del apetito, separar la solución de extracción del resto del material de planta, retirar el disolvente de la solución de extracción y recuperar el extracto.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el extracto se puede obtener por un procedimiento que incluye las etapas de prensar el material de planta para separar la savia de dicho material de planta y recuperar la savia libre del material de planta sólido para formar el extracto.

17. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que la planta del género Trichocaulon o el género Hoodia se selecciona entre las especies Trichocaulon piliferum y Trichocaulon officinale y la planta del género Hoodia se selecciona entre las especies Hoodia currorii, Hoodia gordonii y Hoodia lugardii.

18. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el procedimiento incluye la etapa de concentrar el agente activo en el material extraído por extracción adicional con un disolvente.

19. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15, 17 ó 18, en el que el disolvente en la etapa o etapas de extracción con disolvente del procedimiento es uno o más de cloruro de metileno, agua, metanol, hexano, acetato de etilo o mezclas de los mismos.

20. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que el procedimiento incluye la etapa de concentrar el agente activo en el material extraído por separación cromatográfica.

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la separación cromatográfica emplea uno o más de cloroformo, metanol, acetato de etilo, hexano o mezclas de los mismos como eluyente.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, en el que el procedimiento incluye realizar la separación cromatográfica en una columna, recoger el eluato en fracciones de la columna, evaluar las fracciones para determinar su actividad supresora del apetito, y seleccionar al menos una fracción que contiene el agente supresor del apetito.

23. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en el que en el procedimiento, el extracto se procesa para formar un polvo no aglomerante.

24. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, en el que la planta se selecciona entre Hoodia currorii, Hoodia gordonii y Hoodia lugardii.

25. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, en el que la planta es Hoodia gordonii.