ES2281937T3 - Nuevas ariloxi-alquil-dialquilaminas. - Google Patents

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ES2281937T3 ES98953459T ES98953459T ES2281937T3 ES 2281937 T3 ES2281937 T3 ES 2281937T3 ES 98953459 T ES98953459 T ES 98953459T ES 98953459 T ES98953459 T ES 98953459T ES 2281937 T3 ES2281937 T3 ES 2281937T3
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Abstract

Sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula: en el que: R1 y R2 se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C1-C12 o alquilo C1-C6 perfluorado; X se selecciona de entre halógeno, -O-SO2-CH3, -O-SO2-CF3, o una fracción de la estructura: Z es -NO2, halógeno, -CH3 o -CF3; A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o -SO2-; m es un número entero de 0 a 3; R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, halógeno, -NO2, alquilo, alcoxi, alquilo C1-C6 perfluorado, OH o los ésteres C1-C4 o éteres alquílicos de los mismos, -CN, -O-R1, -O-Ar, -S-R1, -S-Ar, SO-R1, -SO-Ar, -SO2-R1, -SO2-Ar, -CO-R1, -CO-Ar, -CO2-R1, o -CO2-Ar; e Y se selecciona de entre: a) la fracción: en la que R7 y R8 se combinan con -(CH2)p-, en el que p es 6, de manera que forman un anillo, estando el anillo así formado opcionalmente sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por alquilo C1-C3, trifluorometilo, halógeno, hidrógeno, fenilo, -NO2 y CN, o

Description

Nuevas ariloxi-alquil-dialquilaminas.
La presente invención proporciona nuevos compuestos útiles en la producción de compuestos con actividad biológica, así como procedimientos para su producción. Más en particular, la presente invención proporciona nuevas ariloxialquil-dialquilaminas que pueden utilizarse en la producción de productos farmacéuticos.
Antecedentes de la invención
Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) son un grupo de enzimas que han sido implicadas en la destrucción del tejido conjuntivo y de las membranas basales [Woessner, J.F., Jr. FASEB J. 1991, 5, 2145; Birkedal-Hansen, H.; Moore, W.G.I.; Bodden, M.K.; Windsor, L.J.; Birkedal-Hansen, B.; DeCarlo, A.; Engler, J.A. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1993, 4, 197; Cawston, T.E. Pharmacol. Ther. 1996, 70, 163; Powell, W.C.; Matrisian, L.M. Cur. Top. Microbiol. and Immunol. 1996, 213, 1]. Estas endopeptidasas que contienen cinc se dividen en varias subclases de enzimas, entre ellas las colagenasas, estromelisinas y gelatinasas. De entre estas clases, se ha demostrado que las gelatinasas son las MMP más estrechamente involucradas en el crecimiento y en el desarrollo de tumores, mientras que las colagenasas se han asociado a la patogénesis de la artrosis [Howell, D.S.; Pelletier, J.-P. En Arthritis and Allied Conditions; McCarthy, D.J.; Koopman, W.J., Eds.; Lea y Febiger: Philadelphia, 1993; 12^{a} Edición Vol. 2, pág. 1723; Dean, D.D. Sem. Arthritis Rheum. 1991, 20, 2; Crawford, H.C; Matrisian, L.M. Invasion Metast. 1994-95, 14, 234; Ray, J.M.; Stetler-Stevenson, W.G. Exp. Opin. Invest. Drugs, 1996, 5, 323].
La utilización de la hormonoterapia sustitutiva para la prevención de la osteopenia en mujeres posmenopáusicas está bien establecida. El protocolo normal implica el aporte complementario de estrógenos utilizando formulaciones que contienen estrona, estriol, etinilestradiol o estrógenos conjugados de origen natural (por ejemplo, Premarin® estrógenos conjugados, de Wyeth-Ayerst). En algunas pacientes, el tratamiento puede estar contraindicado debido a los efectos proliferativos que tienen los estrógenos sin antagonistas (estrógenos no administrados de forma combinada con progestágenos) en el tejido uterino. Esta proliferación está asociada a un aumento del riesgo de endometriosis y/o cáncer de endometrio. Los efectos de los estrógenos sin antagonistas en el tejido mamario están menos claros, pero son motivo de preocupación. Resulta evidente la necesidad de encontrar estrógenos que mantengan el efecto de protección ósea y que al mismo tiempo reduzcan al mínimo los efectos proliferativos en el útero y en la mama. Se ha demostrado que algunos antiestrógenos no esteroideos mantienen la masa ósea en el modelo de rata ovariectomizada, así como en ensayos clínicos en seres humanos. El tamoxifeno (comercializado con la marca Novadex®, citrato de tamoxifeno, por Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, Delaware), por ejemplo, es útil como paliativo en el tratamiento del cáncer de mama, y se ha demostrado que ejerce un efecto de tipo agonista estrogénico en el hueso, en seres humanos. Sin embargo, también es un agonista parcial en el útero, por lo que es motivo de preocupación. Se ha demostrado que el raloxifeno, un antiestrógeno benzotiofénico, estimula el crecimiento uterino en la rata ovariectomizada en menor medida que el tamoxifeno, manteniendo al mismo tiempo la capacidad para proteger el hueso. Una revisión adecuada de los estrógenos histoselectivos puede consultarse en el artículo "Tissue-Selective Actions Of Estrogen Analogs", Bone Vol. 17, n.º 4, octubre 1995, 181S-190S.
La presente invención proporciona nuevos intermediarios que pueden utilizarse en la producción de compuestos farmacéuticos para su utilización como agentes estrogénicos e inhibidores de las MMP. La utilización de compuestos de cloruro de 4-carbamoilmetoxi-metoxi-bencilo con las estructuras:
1
se describe en los documentos NL 6402393; 1964; y Chem. Abstr. 1965, 62, 7698.
La utilización de compuestos de cloruro de 4-(2-dialquilamino-etoxi)benzoílo con las estructuras:
2
se describe en Sharpe, C. J. et al. J. Med. Chem. 1972, 15, 523 y Jones, C. D. et al. J. Med. Chem. 1984, 27, 1057. De forma similar, la utilización de cloruro de 4-(2-quinolinilmetoxi)bencilo
3
se describe en Huang, F-C. et al. J. Med. Chem. 1990, 33, 1194.
Ciertos derivados de haluro de alcoxibencilo se conocen a partir de los documentos Collect. Czech. Chem. Commun., 55, 1602-1612 (1990); J. Chem. Soc. 1965, 954-973; Arzneim. Forsch., 29, 591-4 (1979); Chem. Abst. 54, 648d y 568h; y EP 00428312.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona nuevos compuestos, así como procedimientos para la producción de los mismos, que pueden utilizarse en la producción de compuestos con actividad farmacéutica. Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en especial como intermediarios en la producción de compuestos farmacéuticos, tales como inhibidores de bajo peso molecular, no peptídicos, de las metaloproteinasas de la matriz (por ejemplo, gelatinasas, estromelisinas y colagenasas) y de la enzima conversora del TNF-_ (TACE, enzima conversora del factor de necrosis tumoral-_) que son útiles en el tratamiento de enfermedades en las que estas enzimas están involucradas, tales como artritis, metástasis de tumores, ulceración tisular, cicatrización anómala de heridas, enfermedad periodontal, enfermedad ósea, proteinuria, aneurisma de la aorta, pérdida degenerativa del cartílago tras lesión articular traumática, enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso e infección por VIH. Además, los compuestos de la presente invención pueden utilizarse para producir compuestos que se comportan como agonistas estrogénicos, reduciendo el nivel de colesterol y previniendo la osteopenia. Por consiguiente, dichos compuestos son útiles en el tratamiento de muchos trastornos, entre ellos osteoporosis, hipertrofia prostática, esterilidad, cáncer de mama, hiperplasia y cáncer de endometrio, enfermedades cardiovasculares, anticoncepción, enfermedad de Alzheimer y melanoma.
La presente invención incluye nuevas sales farmacéuticamente aceptables, de compuestos de fórmula (I):
4
en los que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C_{1}-C_{12}, preferentemente alquilo C_{1}-C_{6}; o alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado, preferentemente -CF_{3};
X es un grupo saliente, seleccionado de entre halógeno, -O-SO_{2}-CH_{3}, -O-SO_{2}-CF_{3}, o una fracción que tiene la estructura:
5
Z se selecciona de entre -NO_{2}, halógeno, -CH_{3} o -CF_{3};
A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o -SO_{2}-;
m es un número entero de 0 a 3, preferentemente 1;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se seleccionan independientemente de entre H, halógeno, -NO_{2}, alquilo (preferentemente alquilo C_{1}-C_{12}, más preferentemente alquilo C_{1}-C_{6}), alcoxi (preferentemente alcoxi C_{1}-C_{12}, más preferentemente alcoxi C_{1}-C_{6}), alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado (preferentemente -CF_{3}), OH o los ésteres C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos, -CN, -O-R^{1}, -O-Ar, -S-R^{1}, -S-Ar, SO-R^{1}, -SO-Ar, -SO_{2}-R^{1}, -SO_{2}-Ar, -CO-R^{1}, -CO-Ar, -CO_{2}-R^{1}, o -CO_{2}-Ar;
Y se selecciona de entre:
a) la fracción:
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6 
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en la que R^{7} y R^{8} se combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de manera que forman un anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por alquilo C_{1}-C_{3}, trifluorometilo, halógeno, hidrógeno, fenilo, NO_{2} y CN;
o
b) un heterociclo saturado, insaturado o parcialmente insaturado de siete miembros, que contiene hasta dos heteroátomos seleccionados de entre el grupo constituido por -O-, -NH-, -N(alquilo C_{1}-C_{4})-, -N=, y -S(O)_{n}-, en el que n es un número entero de 0-2, opcionalmente sustituido con 1-3 sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{4}, trihalometilo, alcoxi C_{1}-C_{4}, trihalometoxi, aciloxi C_{1}-C_{4}, alquiltio C_{1}-C_{4}, alquilsulfinilo C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo (C_{1}-C_{4}), fenilo opcionalmente sustituido con 1-3 alquilo (C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H, -CN, -CONHR^{1}, -NH_{2}, alquilamino C_{1}-C_{4}, dialquilamino C_{1}-C_{4}, -NHSO_{2}R^{1}, -NHCOR^{1}, -NO_{2}.
Se entiende en la descripción genérica anterior y en el resto de los grupos de la presente memoria que, en todo los casos en los que aparecen, R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entrel grupo de sustituyentes mencionados en la lista. Cualquier grupo R^{1} mencionado en cualquier estructura de la presente memoria no representa necesariamente el mismo sustituyente que otro grupo R^{1}, ni tampoco tiene que ser cualquier grupo R^{2} el mismo sustituyente que cualquier otro grupo R^{2}, incluso si más de un R^{1} o R^{2} están presentes en la misma estructura.
En la descripción anterior, el símbolo "Ar" indica grupos arilo o heteroarilo monocíclicos o policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados a partir de halógeno, alquilo C_{1}-C_{6} o -CF_{3}. Los ejemplos de grupos arilo preferidos incluyen grupos antracenilo y fenantrenilo, así como los grupos más preferidos de fenilo, cumenilo, mesitilo, tolilo, xililo y naftalenilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo preferidos incluyen grupos indolizinilo, indazolilo, indazolilo, purinilo, quinozinilo, isoquinolinilo, quinolinilo, ftalozinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo y pteridinilo, y similares, así como los grupos más preferidos de piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridizinilo e indolilo.
La invención incluye formas de sales aceptables preparadas por reacción de adición con ácidos inorgánicos u orgánicos. Son útiles ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico; así como ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido cítrico, ácido maleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido ftálico, ácido succínico, ácido metanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido naftalenosulfónico, ácido camforsulfónico, ácido bencenosulfónico. Se sabe que los compuestos que poseen un nitrógeno básico pueden formar complejos con muchos ácidos distintos (tanto próticos como no próticos), y es generalmente preferida la administración de un compuesto de la presente invención en forma de sal por adición de ácido. Además, la presente invención incluye sales de amonio cuaternario de los compuestos de la presente memoria, que pueden prepararse haciendo reaccionar las aminas nucleófilas de la cadena lateral con un agente alquilante reactivo adecuado, tal como un haluro de alquilo o haluro de bencilo
Entre los compuestos preferidos de la presente invención se encuentran los de fórmula (I):
7
en la que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C_{1}-C_{12}, preferentemente alquilo C_{1}-C_{6}; o alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado, preferentemente -CF_{3};
X es halógeno, -O-SO_{2}-CH_{3}, -O-SO_{2}-CF_{3} o una fracción que tiene la estructura:
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8 
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Z se selecciona de entre -NO_{2}, halógeno, -CH_{3} o -CF_{3};
A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o -SO_{2}-;
m es un número entero de 0 a 3, preferentemente 1;
Y se selecciona de entre:
un grupo seleccionado de entre acepina, diacepina, oxacepina, tiacepina, oxapina y tiepina, en el que el grupo está opcionalmente sustituido con 1-3 sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{4}, trihalometilo, alcoxi C_{1}-C_{4}, trihalometoxi, aciloxi C_{1}-C_{4}, alquiltio C_{1}-C_{4}, alquilsulfinilo C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo (C_{1}-C_{4}), fenilo opcionalmente sustituido con 1-3 alquilo (C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H, -CN, -CONHR^{1}, -NH_{2}, alquilamino C_{1}-C_{4}, dialquilamino C_{1}-C_{4}, -NHSO_{2}R^{1}, -NHCOR^{1}, -NO_{2}.
Otros compuestos preferidos de la presente invención son aquellos de fórmula (I):
Entre los compuestos más preferidos de la presente invención se encuentran los que tienen la fórmula general
9
en los que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C_{1}-C_{6} o alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado; preferentemente, entre los grupos alquilo perfluorados, -CF_{3};
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos, halógeno, -CN, alquilo C_{1}-C_{6}, o trifluorometilo,
m es un número entero de 0 a 3, preferentemente 1;
R^{7} y R^{8} se combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de modo que forman un anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con hasta tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{3}, trifluorometilo, alquiltio, alquilsulfinilo C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo C_{1}-C_{4}, hidroxi-alquilo (C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H, -CN y -NO_{2}; y
X es como se ha definido anteriormente.
Entre los compuestos más preferidos de la presente invención también se encuentran los que tienen la fórmula general
10
en los que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C_{1}-C_{6} o alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado, preferentemente, entre los grupos alquilo perfluorados, -CF_{3};
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos, halógeno, -CN, alquilo C_{1}-C_{6}, o trifluorometilo,
m es un número entero de 0 a 3, preferentemente 1;
A se selecciona de entre -S-, -SO- o -SO_{2}-;
R^{7} y R^{8} se combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de modo que forman un anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con hasta tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{3}, trihalometilo, alquiltio, alquilsulfinilo C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo C_{1}-C_{4}, hidroxi-alquilo (C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H, -CN y -NO_{2}; y
X es como se ha definido anteriormente.
La presente invención también incluye un procedimiento para la preparación de los compuestos anteriores.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la invención pueden prepararse mediante un procedimiento que comprende una de las siguientes etapas:
a) convertir un alcohol de fórmula
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11 
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en un compuesto correspondiente de fórmula I, en el que X es un grupo saliente, empleando medios apropiados, por ejemplo, utilizando un agente halogenante, sulfonilante o acilante que contiene el grupo saliente X; si es necesario convirtiendo el compuesto de fórmula (I) formado en una sal del mismo farmacéuticamente aceptable;
o
b) oxidar un compuesto de fórmula I en el que A es S, para obtener el correspondiente compuesto de fórmula I en el que A es SO o -SO_{2}-; si es necesario convirtiendo el compuesto de fórmula (I) formado en una sal del mismo farmacéuticamente aceptable;
o
c) convertir un compuesto de fórmula (I) en una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos de fórmula A pueden prepararse haciendo reaccionar un fenol de fórmula
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12 
\newpage
en el que P es un grupo protector de radicales hidroxi, y A y R^{1-6} soncomo se ha definido anteriormente (por ejemplo, R^{1} y R^{2} son cada uno H o alquilo C_{1}-C_{12}), con un compuesto de fórmula
13
en el que Y, R^{1}, R^{2} y m son como se ha definido anteriormente, y halo es F, Cl, Br o I, seguido por la eliminación del grupo protector.
Los compuestos de la presente invención en los que "A" es oxígeno pueden sintetizarse empleando un procedimiento con las etapas de:
a) alquilar un hidroxibenzaldehído correspondiente de fórmula:
14
en el que R^{3}-R^{6} son como se ha definido anteriormente, con un haluro de alquilo correspondiente de fórmula:
15
en el que Y, R^{1}, R^{2} y m son como se ha definido anteriormente en los grupos genéricos y subgenéricos, y halo puede ser Cl, F, Br o I, para producir un aldehído de fórmula:
16
b) reducir el producto de aldehído de la etapa a), para dar lugar al alcohol correspondiente de fórmula:
17
c) convertir el alcohol de la etapa b) en su sal de clorhidrato, por ejemplo, con HCl/THF; y
d) convertir el alcohol en un grupo saliente preferido, por ejemplo, por tratamiento con cloruro de metanosulfonilo, cloruro de toluenosulfonilo, o anhídrido trifluoroacético en presencia de una base tal como piridina o trietilamina.
De modo similar, la presente invención proporciona un procedimiento para producir compuestos de la presente invención en los que "A" es azufre, por medio de las etapas siguientes:
a) alquilar un compuesto de fórmula
18
con un agente alquilante de fórmula:
19
en el que Y y m son como se ha definido anteriormente y halo se selecciona de entre Cl, F, Br o I, para producir un aldehído de fórmula:
20
b) reducir el producto de aldehído de la etapa a), por ejemplo, con borohidruro de sodio, hasta obtener un alcohol de fórmula;
21
c) tratar el alcohol de la etapa b) con HCl gaseoso, para generar su clorhidrato; y
d) convertir el producto de clorhidrato del alcohol de la etapa c) en un grupo saliente preferido, por ejemplo, mediante tratamiento con cloruro de metanosulfonilo, cloruro de toluenosulfonilo, o anhídrido trifluoroacético en presencia de una base tal como piridina o trietilamina, o mediante tratamiento continuo con HCl para formar el correspondiente cloruro de bencilo; y,
e) opcionalmente, completar la oxidación controlada del azufre a sulfóxido o a sulfona, por ejemplo, con ácido m-cloroperbenzoico.
El material de partida de tiofenóxido-aldehído de la etapa a), descrito anteriormente, puede generarse a partir de su correspondiente tiofenol-aldehído, por ejemplo con hidruro de sodio, que puede considerarse, o no, una etapa del procedimiento anterior.
Descripción detallada de la invención
Los siguientes Esquemas de reacción I a IV demuestran la síntesis de compuestos de la presente invención, o de análogos de los mismos, utilizando diferentes variables para "Y". Los reactivos y disolventes de las etapas individuales se presentan exclusivamente a título ilustrativo, y pueden sustituirse por otros reactivos y disolventes conocidos por los expertos en la materia.
Esquema I
22 
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Esquema II
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Esquema IIa
230
El Esquema IIa ofrece una síntesis alternativa de los alcoholes bencílicos de la presente invención, ilustrando la síntesis del alcohol 4-(2-piperidiniletoxi)bencílico. En esta síntesis, el alcohol 4-hidroxibencílico se trata con un cloruro de aril-amino-alquilo deseado, para dar lugar al correspondiente alcohol alcoxi-bencílico. En el ejemplo específico del Esquema IIa, el alcohol 4-hidroxibencílico puede tratarse con clorhidrato de 1-(2-cloroetil)-piperidina en presencia de K_{2}CO_{3}/Me_{2}CO, para dar lugar al alcohol 4-(2-piperidiniletoxi)bencílico.
El Esquema IIa también ilustra de forma más específica otra forma de realización preferida de la presente invención. La presente invención comprende asimismo un procedimiento para producir compuestos alcohólicos útiles de fórmula:
24
en los que Y representa
un anillo heterocíclico insaturado o parcialmente insaturado de cinco, seis o siete miembros, que contiene uno o dos átomos de nitrógeno, en el que el anillo heterocíclico está unido al puente etoxi en un átomo de nitrógeno del anillo, y está opcionalmente sustituido por 1 a 3 grupos seleccionados a partir de halógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, tioalquilo C_{1}-C_{6}, -CF_{3}, o -NO_{2}.
Entre los grupos Y preferidos de dicho procedimiento se encuentran acepina o hexametilenoimina.
El procedimiento comprende hacer reaccionar, en un medio alcalino, el alcohol 4-hidroxibencílico con una sal, tal como una sal de acetato, clorhidrato, bromhidrato o yodhidrato, de un compuesto de fórmula:
25
en el que Y es como se ha definido anteriormente.
Esta reacción se lleva cabo en un disolvente o sistema de disolventes orgánico, por ejemplo, en acetona, dimetilformamida o tetrahidrofurano. Preferentemente, el pH del medio se mantiene por encima de pH 8, más preferentemente por encima de pH 9.
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Esquema III
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Esquema IV
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Utilizando etapas similares pueden producirse los compuestos de la presente invención en los que "A" es azufre, como se muestra a continuación en el Esquema V. En una primera etapa, puede producirse tiofenóxido con hidruro de sodio, seguido por la alquilación y reducción del aldehído correspondiente, por ejemplo, con borohidruro de sodio, o de forma catalítica con hidrógeno y catalizadores como níquel Raney o platino o paladio en carbono. El alcohol resultante puede tratarse a continuación con HCl gaseoso, para generar su clorhidrato, con tratamiento continuo con HCl para formar un cloruro de bencilo. El producto final puede formarse después mediante oxidación controlada del azufre hasta sulfóxido, y después hasta sulfona, por ejemplo con ácido m-cloroperbenzoico.
Esquema V
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28
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar, y no para limitar, el alcance de de la invención.
En los procedimientos anteriores, los compuestos de fórmula (I) en los que R^{1} y R^{2} adyacentes a la fracción X representan hidrógeno se preparan a partir de alcoholes primarios (por ejemplo, en el Esquema I, los compuestos 3a-c) que, a su vez, se preparan reduciendo los precursores de aldehído (por ejemplo, en el Esquema I, los compuestos 2a-c).
Los compuestos análogos de fórmula (I) en los que uno de R^{1} y R^{2} adyacentes a la fracción X es alquilo o perfluoroalquilo, y el otro es hidrógeno, pueden prepararse a partir de los alcoholes secundarios adecuados, que, a su vez, pueden prepararse a partir de las cetonas correspondientes, por ejemplo, los compuestos que tienen una fracción COR^{1} en el que R^{1} es alquilo o perfluoroalquilo.
Los compuestos análogos de fórmula (I) en los que tanto R^{1} como R^{2} adyacentes a la fracción X se seleccionan cada uno a partir de alquilo o perfluoroalquilo, pueden prepararse a partir de los alcoholes terciarios adecuados.
Los siguientes Ejemplos y Esquemas ilustran la preparación y la utilización de los compuestos de fórmula I. Los Ejemplos 1, 3-5, 7, 8, 10, 11, 13, 15, 18-20 y 24-26 son comparativos.
Ejemplo 1 Aldehído 4-(2-piperidina-1-il-etoxi)-bencílico (2a)
A una suspensión espesa, bien agitada, de p-hidroxibenzaldehído (83,5 g, 0,68 mol, 1,05 eq.) y K_{2}CO_{3} (224 g, 1,6 mol, 2,5 eq.) en DMF (1 l) se le añade clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina (120 g, 0,65 mol, 1,0 eq.). La mezcla de reacción se somete a reflujo durante 2 h con agitación mecánica intensa. En ese momento la TLC no muestra material de partida, siendo la mayor parte producto (EtOAc/hexano 1:1). La mezcla de reacción se filtra a través de Celite, se diluye con EtOAc (2 l), y se lava con agua (3 x 500 ml). La capa orgánica se concentra en un evaporador rotatorio, para dar lugar a 147 g (97%) del aldehído (2a) en forma de aceite de color amarillo.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 9,87 (s, 1H), 7,81 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,01 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 4,18 (t, 2H, J = 6,03 Hz), 2,79 (t, 2H, J = 6,03 Hz), 2,51 (m, 4H), 1,6-1,4 (m, 6H)
Ejemplo 2 Aldehído 4-(2-hexametilenoimina-1-il-etoxi)-bencílico (2b)
A una suspensión espesa, bien agitada, de NaH (65 g, dispersión al 60% en aceite, 1,6 mol, 2,2 eq.) en DMF (500 ml) se le añade una solución de clorhidrato de p-hidroxibenzaldehído (90 g, 0,74 mol, 1,0 eq.) gota a gota a 0ºC. La mezcla de reacción se agita durante 30 min, después se añade cloruro de 4-[2-(hexametilenoimino)]etilo (153 g, 0,77 mol, 1,0 eq.) en porciones. La mezcla de reacción se agita durante 1 h. En ese momento la TLC muestra poco material de partida, siendo la mayor parte producto (EtOAc/hexano 1:1). La mezcla de reacción se diluye con agua (1 l), y se extrae con éter (5 l). La capa orgánica se seca con MgSO_{4}, y se concentra en un evaporador rotatorio, para dar lugar a 176,8 g (97%) de aldehído (2b) en forma de aceite de color amarillo.
Ejemplo 3 Aldehído 4-(2-dimetilamino-etoxi)-bencílico (2c)
A una suspensión espesa, bien agitada, de p-hidroxibenzaldehído (9,54 g, 0,078 mol, 1,00 eq.) y K_{2}CO_{3} (27 g, 0,195 mol, 2,5 eq.) en DMF (100 ml), se le añade clorhidrato de 1-(2-cloroetil)dimetilamina (11,26 g, 0,078 mol, 1,0 eq.). La mezcla de reacción se agita durante 2 h a 60 -70ºC. En ese momento la TLC no muestra material de partida, siendo la mayor parte producto (EtOAc/hexano/Et_{3}N 3:7:1). La mezcla de reacción se vierte en una mezcla de agua/hielo (200 ml), y se extrae con Et_{2}O (3 x 200 ml). La capa orgánica se seca con MgSO_{4}, y se concentra en un evaporador rotatorio, para dar lugar a 5,9 g (39%) de aldehído (2c) en forma de líquido de color rosado.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 9,88 (s, 1H), 7,8 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,02 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 4,15 (t, 2H, J = 5,64 Hz), 2,77 (t, 2H, J = 5,64 Hz), 2,35 (s, 6H).
Ejemplo 4 Alcohol 4-(2-piperidina-1-il-etoxi)-bencílico (3a)
A una solución agitada del aldehído 2a (115 g, 0,494 mol, 1,0 eq.) en metanol (360 ml) a 0 / +5ºC se le añade borohidruro de sodio (9,44 g, 0,249 mol, 0,5 eq.) en porciones. La reacción se agita durante 30 min. En ese momento la TLC no muestra material de partida, siendo la mayor parte producto (EtOAc/hexano/trietilamina 3:7:1). La mezcla de reacción se vierte en agua (1,1 l), se extrae con cloruro de metileno (3 x 550 ml), y se seca con MgSO_{4}. La solución se concentra en un evaporador rotatorio, para dar lugar a 91,6 g (80%) del alcohol 3a en forma de aceite espeso, que cristaliza de forma instantánea al reposar que cristaliza de forma instantánea durante la nucleación.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,23 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 6,80 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,56 (s, 2H) 3,99 (t, 2H, J = 6,12 Hz), 2,69 (t, 2H, J = 6,14 Hz), 2,47 (m, 4H), 1,6-1,25 (m, 6H)
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}): 158,23, 135,34, 128,70, 114,84, 66,42, 63,44, 58,27, 55,29, 26,45, 24,80.
Ejemplo 5 Alcohol 4-(2-piperidina-1-il-etoxi)-bencílico (3a)
Se disolvió alcohol 4-hidroxibencílico (6,2 g, 0,05 mol) en hidróxido de sodio acuoso (5 N, 30 ml). Se añadió tolueno (30 ml), seguido por clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina (9,29 g, 0,05 mol) y bromuro de benciltrietilamonio (0,3 g). La mezcla de reacción se calentó con agitación intensa durante 1,5 h. Las capas se separaron, la capa acuosa se extrajo con tolueno (2 x 15 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, y la capa orgánica se lavó con agua (50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con sulfato de sodio, y se concentró en un evaporador rotatorio, para dar lugar a 8,725 g (75%) del alcohol (3a) en forma de aceite de color marrón amarillento.
Ejemplo 6 Alcohol 4-(2-hexametilenoimina-1-il-etoxi)-bencílico (3b)
A una solución agitada del aldehído 2b (200 g, 0,72 mol, 1,0 eq.) en metanol (400 ml) a 0 /+5ºC se le añade borohidruro de sodio (15,6 g, 0,41 mol, 0,57 eq.) en porciones. La reacción se agita durante 30 min. En ese momento la TLC no muestra material de partida, siendo la mayor parte producto (EtOAc/hexano/trietilamina 3:7:1). La mezcla de reacción se diluye con agua (400 ml), se extrae con cloruro de metileno (3 x 400 ml), y se seca con MgSO_{4}. La solución se concentra en un evaporador rotatorio, para dar lugar a 201 g (100%) del alcohol 3b en forma de aceite espeso.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,27 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 6,87 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,60 (s, 2H), 4,05 (t, 2H, J = 6,21 Hz), 2,93 (t, 2H, J = 6,15 Hz), 2,77 (m, 4H), 1,7-1,5 (m, 8H)
Ejemplo 7 Alcohol 4-(2-dimetilamino-etoxi)-bencílico (3c)
A una solución agitada del aldehído 2c (5,9 g, 0,031 mol, 1,0 eq.) en metanol (20 ml) a 22ºC se le añade borohidruro de sodio (0,58 g, 0,015 mol, 0,5 eq.) en porciones. La reacción se agita durante 30 min. En ese momento la TLC no muestra material de partida, siendo de la mayor parte producto (EtOAc/hexano/trietilamina 5:5:1). La mezcla de reacción se diluye con agua (50 ml), se extrae con cloruro de metileno (3 x 40 ml), y se seca con MgSO_{4}. La solución se concentra en un evaporador rotatorio, para dar lugar a 5,25 g (88%) del alcohol 3c en forma de aceite espeso.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,25 (d, 2H, J = 8,64 Hz), 6,85 (d, 2H, J = 8,64 Hz), 4,52 (s, 2H), 3,99 (t, 2H, J = 5,88 Hz), 2,67 (t, 2H, J = 5,79 Hz), 2,29 (s, 6H)
Ejemplo 8 Clorhidrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-piperidin-1-ilo (1a)
Una solución del alcohol 3a (61,3 g, 0,26 mol, 1 eq.) en THF (500 ml) se enfría hasta 0 / -5ºC (baño de agua con hielo) y se somete a burbujeo con HCl gaseoso. El burbujeo se continúa hasta que la mezcla de reacción deja de espesarse. Se retira el baño de refrigeración. Se añade cloruro de tionilo (29 ml, 0,39 mol, 1,5 eq.) a la suspensión espesa del clorhidrato 4a, y la mezcla se calienta hasta 50ºC hasta que se hace transparente. La mezcla de reacción se enfría hasta -3ºC y se agita durante 30 min. El sólido blanco obtenido se filtra y se seca, para dar lugar a 72 g (96%) del cloruro 1a.
4a: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 10,9 (s, HCl), 7,25 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 6,94 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,42 (m, 4H), 3,41 (m, 4H)
1a: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 11 (s amplio, HCl), 7,39 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 6,99 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,74 (s, 2H), 4,46 (m, 2H), 3,45 (m, 4H), 2,69 (m, 2H) y 1,9-1,2 (m, 6H)
Ejemplo 9 Clorhidrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-hexametilenoimina-1-ilo (1b)
A una solución del alcohol 3b (179 g, 0,72 mol, 1 eq.) en THF (300 ml) se le añade una solución de HCl (26,3 g de HCl en 263 ml de THF, 0,72 mol, 1,0 eq.) gota a gota a 0/ + 10ºC. Se forma un precipitado blanco. Se añade cloruro de tionilo (80 ml, 1,1 mol, 1,5 eq.) a la suspensión espesa del clorhidrato 4b, y la mezcla se calienta hasta 50ºC hasta que se hace transparente. La mezcla de reacción se concentra hasta 350 ml, y se mantiene en el refrigerador durante toda la noche. El sólido blanco obtenido se filtra, se lava con THF frío (100 ml), y se seca, para dar lugar a 147 g (67%) del cloruro 1b.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 11 (s amplio, HCl), 7,40 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 7,00 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 4,74 (s, 2H), 4,44 (t, 2H, J = 5,25), 3,64 -3,39 (m, 4H), 3,25 -3,17 (m, 2H), 1,84-1,54 (m, 8H)
Ejemplo 10 Clorhidrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-dimetilamino (1c)
Una solución del alcohol 3c (5,25 g, 0,027 mol, 1 eq.) en THF (100 ml) se sometió a burbujeo con HCl gaseoso a 0 / + 25ºC durante 15 min. Se forma un precipitado blanco. Se añade cloruro de tionilo (6 ml, 9,6 g, 0,081 mol, 3,0 eq.) a la suspensión espesa del clorhidrato 4c, y la mezcla se calienta a 30ºC hasta que se hace transparente. La mezcla de reacción se concentra a 350 ml, y se mantiene en el refrigerador durante toda la noche. El sólido blanco obtenido se filtra, se lava con THF frío (100 ml), y se seca, para dar lugar a 4,57 g (68%) del cloruro 1c.
Entre los compuestos farmacológicamente activos que pueden producirse utilizando los compuestos de la presente invención se encuentran compuestos de 2-fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-bencil]-indol que son útiles como agentes estrogénicos. Dichos compuestos comprenden los de fórmulas IV y V, presentados a continuación:
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29 
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en los que:
R^{11} se selecciona de entre H, OH o los ésteres C_{1}-C_{12} (de cadena lineal o ramificada) o éteres alquílicos C_{1}-C_{12} (de cadena lineal o ramificada o cíclica) de los mismos, o halógenos, o éteres halogenados, incluidos éter trifluorometílico y éter triclorometílico.
R^{12}, R^{9} y R^{10} se seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres C_{1}-C_{12} (de cadena lineal o ramificada) o éteres alquílicos C_{1}-C_{12} (de cadena lineal o ramificada o cíclica) de los mismos, halógenos, o éteres halogenados C_{1}-C_{3}, incluidos éter trifluorometílico y éter triclorometílico, ciano, alquilo C_{1}-C_{6} (de cadena lineal o ramificada), o trifluorometilo, con la salvedad de que, cuando R^{1} es H, R^{2} no es OH.
R^{13} se selecciona de entre H, alquilo C_{1}-C_{6}, ciano, nitro, trifluorometilo, halógeno; y
Y, A, m, R^{3} y R^{4} son como se ha definido en la presente memoria.
Los compuestos de 2-fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-bencil]-indol de este tipo son agonistas estrogénicos parciales y presentan elevada afinidad por el receptor de estrógenos. Sin embargo, a diferencia de lo que sucede con muchos estrógenos, estos compuestos no provocan aumentos en el peso húmedo uterino. Dichos compuestos son antiestrogénicos en el útero y pueden antagonizar completamente los efectos tróficos de los agonistas estrogénicos en el tejido uterino. Dichos compuestos son útiles para el tratamiento o la prevención en un mamífero de enfermedades o síndromes causados por, o asociados a, una insuficiencia de estrógenos.
Dichos compuestos tienen la capacidad de actuar como agonistas estrogénicos, reduciendo el nivel de colesterol y previniendo la osteopenia. Por consiguiente, dichos compuestos son útiles en el tratamiento de muchos trastornos, incluidos osteoporosis, hipertrofia prostática, esterilidad, cáncer de mama, cáncer de endometrio, enfermedades cardiovasculares, anticoncepción, enfermedad de Alzheimer, y melanoma. Además, estos compuestos pueden usarse para la hormonoterapia sustitutiva en mujeres posmenopáusicas, o en otros estados carenciales de estrógenos en los que pueda resultar beneficioso el aporte complementario de estrógenos.
Los compuestos de 2-fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-bencil]-indol producidos con los compuestos de la presente invención también pueden utilizarse en métodos para el tratamiento de la osteopenia, que puede provenir de un desequilibro entre la formación de nuevos tejidos óseos y la reabsorción de tejidos viejos en un individuo, que se traduce en una osteopenia neta. Dichas reducciones del tejido óseo tienen lugar en diversos individuos, particularmente en mujeres posmenopáusicas, mujeres histerectomizadas, personas que reciben, o han recibido, tratamientos prolongados con corticosteroides, personas con disgenesia gonadal, y personas que sufren el síndrome de Cushing. También pueden tratarse necesidades especiales de sustitución ósea utilizando dichos compuestos en individuos con fracturas óseas, estructuras óseas defectuosas y personas sometidas a cirugía ósea y/o implante de prótesis. Además de los problemas descritos anteriormente, dichos compuestos pueden utilizarse en tratamientos para la artrosis, enfermedad de Paget, osteomalacia, osteohalistéresis, cáncer de endometrio, mieloma múltiple y otras formas de cáncer que tienen efectos perjudiciales en los tejidos óseos. Se entiende que los métodos de tratamiento de los trastornos mencionados en la presente memoria comprenden la administración, a un individuo que necesite dicho tratamiento, de una cantidad farmacéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos de la presente invención, o de una sal de los mismos farmacéuticamente aceptable. La presente invención comprende asimismo composiciones farmacéuticas que utilizan uno o más de los dichos compuestos y/o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos farmacéuticamente, junto con uno o más vehículos, excipientes, etc. farmacéuticamente aceptables.
Se entiende que las dosis, pauta y forma de administración de estos compuestos de fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-bencil]-indol variarán en función del trastorno y del individuo que se va a tratar, y estarán sujetas al juicio del personal médico encargado. Se prefiere que la administración de uno o más de los compuestos de la presente memoria comience a una dosis baja y se incremente hasta que se alcancen los efectos deseados.
La administración eficaz de dichos compuestos puede realizarse a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 1.000 mg/día. Preferentemente, la administración se realizará desde aproximadamente 50 mg/día a aproximadamente 600 mg/día en una dosis única o en dos o más dosis divididas. Dichas dosis pueden administrarse de cualquier forma que sea útil para dirigir los compuestos activos de la presente memoria al torrente sanguíneo del paciente, incluidas las formas orales, parenterales (entre ellas las inyecciones intravenosas, intraperitoneales y subcutáneas) y transdérmicas. Para los efectos de la presente descripción, se entiende que las administraciones transdérmicas incluyen todas las administraciones a través de la superficie corporal y los revestimientos interiores de los conductos corporales, incluidos los tejidos epiteliales y las mucosas. Dichas administraciones pueden llevarse a cabo utilizando los compuestos de la presente memoria, o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en lociones, cremas, espumas, parches, suspensiones, soluciones y supositorios (por vía rectal y vaginal).
Las formulaciones orales que contienen los compuestos activos de la presente invención pueden comprender cualquiera de las formas orales utilizadas habitualmente, incluidos comprimidos, cápsulas, formas para administración bucofaríngea, tabletas, pastillas para chupar y líquidos, suspensiones o soluciones orales. Las cápsulas pueden contener mezclas del compuesto o compuestos activos con rellenos inertes y/o diluyentes tales como almidones farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, almidón de maíz, de patata o de tapioca), azúcares, edulcorantes artificiales, celulosas en polvo, tales como celulosas cristalinas y microcristalinas, harinas, gelatinas, gomas, etc. Pueden prepararse formulaciones útiles para comprimidos por métodos convencionales de compresión, granulación por vía húmeda y granulación por vía seca, utilizando diluyentes, aglutinantes, lubricantes, disgregantes, dispersantes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, que incluyen, sin limitarse a los mismos, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, lauril sulfato de sodio, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa de calcio, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido algínico, goma arábiga, goma xantana, citrato de sodio, silicatos complejos, carbonato de calcio, glicina, dextrina, sacarosa, sorbitol, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, lactosa, caolín, manitol, cloruro de sodio, talco, almidones secos y azúcar en polvo. Las formulaciones orales descritas en la presente memoria pueden utilizar formulaciones estándar de retardo o de liberación controlada para alterar la absorción del compuesto o compuestos activos. Las formulaciones de supositorios pueden prepararse con materiales tradicionales, incluidos manteca de cacao, con o sin adición de ceras para alterar el punto de fusión del supositorio, y glicerina. También pueden utilizarse las bases hidrosolubles de supositorios, tales como polietilenglicoles de varios pesos moleculares.
Como se muestra en el Esquema VI, los compuestos de este grupo pueden sintetizarse por alquilación del nitrógeno del indol con compuestos de la presente invención, como se ilustra a continuación en los Ejemplos 11-13, utilizando el clorhidrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-piperidin-1-ilo del Ejemplo 8, el clorhidrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-hexametilenoimina-1-ilo del Ejemplo 9 y el clorhidrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-dimetilamino del Ejemplo 10, respectivamente. Además de NaH, pueden utilizarse otras bases, incluido t-butóxido de potasio o t-butóxido de sodio.
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Esquema VI
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30
Los Esquemas VII y VIII ilustran la síntesis del clorhidrato de 1-[4-(2-acepan-1-il-etoxi)-bencil]2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1H-indol-5-ol utilizando intermediarios de la presente invención.
Esquema VII
31
El Esquema VII ilustra la alquilación del 4-hidroxibenzaldehído con clorhidrato de cloruro de 2-(hexametilamino)etilo, que puede llevarse a cabo en presencia de carbonato de potasio, para dar lugar al correspondiente aldehído I (Etapa 1). Cuando la reacción se completa, puede aclararse la mezcla, mezclarse con tolueno y lavarse con agua. La solución de tolueno puede concentrarse después, y el residuo resultante puede tratarse con isopropanol, para dar lugar a una solución del aldehído I. La solución isopropanólica de I puede someterse a reducción catalítica, por ejemplo con níquel Raney, para proporcionar al alcohol II (Etapa 2). Tras la reducción, la mezcla de reacción puede aclararse y concentrarse, y el residuo resultante se disuelve en dicloruro de etileno, para dar lugar a una solución que contiene el alcohol II. Esta solución puede tratarse con cloruro de tionilo, seguido por la concentración. El residuo resultante puede tratarse después con 1,2-dimetoxietano, para dar lugar al producto cristalino III (Etapa 3).
Esquema VIII
32
En el Esquema VIII, Etapa 4, la 4-benciloxipropiofenona se somete a bromación en ácido acético con bromo. Cuando se completa la reacción, la mezcla puede desactivarse con agua, y el precipitado resultante se lava con ácido acético diluido, agua y heptano. El sólido resultante se seca, para dar lugar a IV, clorhidrato de 4-benciloxianilina. En la Etapa 5, una mezcla de IV, N,N-diisopropiletilamina y tolueno se calienta en condiciones de reflujo, con eliminación de agua. Cuando se completa la reacción, la mezcla puede enfriarse y diluirse con metanol. Los sólidos producidos pueden recogerse, lavarse con metanol y secarse, para dar lugar al compuesto de indol V. Una mezcla de los compuestos V y III puede mezclarse en la Etapa 6 con ter-butóxido de sodio en N,N-dimetilformamida y agitarse hasta completar la reacción. A continuación, la mezcla puede desactivarse con salmuera, y extraerse con tolueno. Los extractos se concentran y el residuo se diluye con metanol. Los sólidos resultantes pueden recogerse, disolverse en acetato de etilo, aclararse, y diluirse con metanol. Los sólidos pueden recogerse a partir de esta dilución y secarse, para dar lugar al compuesto VI.
En una Etapa 7 (no mostrada), el compuesto VI en una solución de etanol puede hidrogenarse con un catalizador de Pd-carbón. Tras el aclaramiento, el material hidrogenado puede mezclarse con una pequeña cantidad de ácido ascórbico y tratarse con ácido acético. El precipitado cristalino resultante puede después recogerse, lavarse con etanol y secarse, para dar lugar al producto final, clorhidrato de 1-[4-(2-acepan-1-il-etoxi)-bencil]2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1H-indol-5-ol. A continuación, el producto puede recristalizarse en etanol, que contiene opcionalmente una pequeña cantidad de ácido ascórbico, preferentemente, por ejemplo, de aproximadamente 0,5% en peso a aproximadamente 3,0% en peso.
En las descripciones anteriores, los intermediarios III a VI pueden aislarse fácilmente en forma de sólidos. Todos los demás intermediarios pueden utilizarse más preferentemente en forma de soluciones en disolventes orgánicos.
Los Esquemas IX a XII ilustran la síntesis de 2-(4-hidroxi-fenil)-metil-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol-5-ol utilizando intermediarios de la presente invención. El Esquema IIa, descrito anteriormente, puede considerarse una primera etapa del Esquema IX, o una etapa anterior del mismo. En esta etapa, el alcohol 4-hidroxibencílico se trata con un cloruro de aril-alquil-amino deseado, para dar lugar al correspondiente alcohol alcoxi-bencílico. En el ejemplo específico del Esquema IIa, el alcohol 4-hidroxibencílico se trata con clorhidrato de 1-(2-cloroetil)-piperidina en presencia de K_{2}CO_{3}/Me_{2}CO, para dar lugar al alcohol 4-(2-piperidiniletoxi)bencílico. Pueden añadirse tolueno y salmuera a la mezcla del alcohol resultante para separar sus fases. La fase de tolueno puede lavarse después sucesivamente con álcali acuoso y salmuera. El lote resultante puede después concentrarse, y puede añadírsele dicloruro de etileno para formar una solución del intermediario, alcohol 4-(2-piperidiniletoxi)bencílico.
La solución del alcohol 4-(2-piperidiniletoxi)bencílico en dicloruro de etileno puede combinarse con cloruro de tionilo y calentarse hasta que se complete la reacción. Tras enfriar, la mezcla puede concentrarse, seguido por la adición de 1,2-dimetoxietano y la concentración adicional. El precipitado puede recogerse y secarse, para proporcionar el intermediario de clorhidrato de cloruro de 4-(2-piperidiniletoxi)bencilo, como se muestra en el Esquema IX.
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Esquema IX
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Como se muestra en el Esquema IX, una solución de alcohol 4-(2-piperidiniletoxi)bencílico puede combinarse con cloruro de etileno y cloruro de tionilo, y calentarse hasta crear una mezcla de reacción. Tras enfriar, la mezcla de reacción puede tratarse con 1,2-dimetoxietano y concentrarse de nuevo. El precipitado resultante, clorhidrato de cloruro de 4-(2-piperidiniletoxi)bencilo, puede después recogerse y secarse.
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Esquema X
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El Esquema X ilustra la bromación de 4-benciloxipropiofenona en ácido acético con bromo, para dar lugar a 4'-(benciloxi)-2-bromopropiofenona. Cuando se completa esta reacción, la mezcla puede desactivarse con agua. El precipitado resultante puede recogerse, lavarse con ácido acético diluido, agua y heptano, y secarse.
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Esquema XI
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El producto de 4'-(benciloxi)-2-bromopropiofenona del Esquema X puede calentarse con clorhidrato de 4-benciloxianilina en presencia de N,N-diisopropiletilamina y tolueno en condiciones de reflujo, con eliminación azeotrópica de agua, como se muestra en el Esquema XI. Cuando se completa la reacción, la mezcla puede enfriarse y diluirse con metanol. Los sólidos resultantes de 3-metil-2-(4-benciloxi)fenil-5-benciloxiindol pueden recogerse, lavarse con metanol, y secarse.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Esquema XII
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El producto de 3-metil-2-(4-benciloxi)fenil-5-benciloxiindol del Esquema XI puede hacerse reaccionar después con clorhidrato de cloruro de 4-(2-piperidiniletoxi)bencilo en presencia de ter-butóxido de sodio en N,N-dimetilformamida. La mezcla resultante puede desactivarse con salmuera, y extraerse con tolueno. Después del aclarado, los extractos pueden concentrarse y diluirse con metanol. Los sólidos resultantes de 5-benciloxi-2-(4-benciloxifenil)-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)bencil]-1H-indol pueden recogerse, disolverse en acetato de etilo y diluirse con metanol, y secarse. Estos sólidos pueden disolverse en etanol-tetrahidrofurano y someterse a hidrogenación utilizando catalizador de Pd-carbón. La solución puede después aclararse, opcionalmente mezclarse con una pequeña cantidad de ácido ascórbico, y después tratarse con HCl acuoso. A continuación puede recogerse el precipitado, lavarse con etanol-tetrahidrofurano y agua, y secarse, para dar lugar al producto final de 2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol-5-ol.
Ejemplo 11 5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol
A una solución de 5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-metil-1H-indol (117,5 g, 0,28 mol, 1,0 eq.) en DMF (1,3 l) se le añadió NaH (28,0 g, dispersión al 60% en aceite, 0,7 mol, 2,5 eq.) en porciones a -5 / -8ºC durante 1 h. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h. Se añadió una solución del cloruro del Ejemplo 8 en THF (1,0 l), gota a gota, a -10 /
0ºC durante 2 h. La mezcla de reacción se agitó a 25ºC durante toda la noche. En ese momento la TLC no mostró material de partida, siendo de la mayor parte producto (EtOAc/hexano 1:5). La mezcla de reacción se diluyó con agua (6 l), se extrajo con EtOAc (2 x 3 l), y se secó con Na_{2}SO_{4}. La solución se concentró hasta 1 l, se vertió en MeOH (2,5 l), y se agitó durante 1 h. El precipitado se filtró y se secó, para dar lugar al compuesto del título (129 g, 73%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,64 - 6,63 (m, 21H), 5,12 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,07 (s, 2H), 4,07 (t, 2H, J = 6,06 Hz), 2,72 (t, 2H, J = 6,06 Hz), 2,48 (m, 4H), 2,24 (s, 3H), 1,62 - 1,24 (m, 6H).
Ejemplo 12 5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-1-[4-(2-hexametilenoimina-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol
A una suspensión espesa de NaH (20,0 g, dispersión al 60% en aceite, 0,5 mol, 2,5 eq.) se le añadió solución de 5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-metil-1H-indol (84 g, 0,2 mol, 1,0 eq.) en DMF (100 ml) a 0 / + 10°C durante 1 h. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. Se añadió una solución del cloruro del Ejemplo 9 (67 g, 0,22 mol, 1,1 eq.) en DMF (200 ml), gota a gota, a 0 / + 10ºC durante 2 h. La mezcla de reacción se agitó a 25ºC durante 2 h. En ese momento la TLC no mostró material de partida, siendo la mayor parte producto (EtOAc/hexano 1:5). La mezcla de reacción se diluyó con agua (1 l), se extrajo con EtOAc (3 x 1 l), y se secó con MgSO_{4}. La solución se concentró hasta 150 ml, se vertió en MeOH (750 ml), y se agitó durante toda la noche. El precipitado se filtró y se secó, para dar lugar al compuesto del título (99 g, 76%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,48 - 6,74 (m, 21H), 5,13 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 4,00 (t, 2H, J = 6,24 Hz), 2,91 (t, 2H, J = 6,27 Hz), 2,75 (m, 4H), 2,24 (s, 3H), 1,71 - 1,52 (m, 8H)
Ejemplo 13 5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-1-[4-(2-dimetilaminoetoxi)-bencil]-1H-indol
A una suspensión espesa de NaH (1,1 g, dispersión al 60% en aceite, 0,05 mol, 2,5 eq.) se le añadió una solución del indol 5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-metil-1H-indol (6,97 g, 0,017 mol, 1,0 eq.) en DMF (100 ml) a 0/+ 10ºC durante 0,5 h. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. Se añadió una solución del cloruro del Ejemplo 10 (4,57 g, 0,018 mol, 1,1 eq.), en porciones, a 0/ + 10ºC durante 2 h. La mezcla de reacción se agitó a 25ºC durante 0,5 h. En ese momento la TLC no mostró material de partida, siendo de la mayor parte producto. (EtOAc/hexano 1:5). La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml), se extrajo con EtOAc (3 x 200 ml), y se secó con MgSO_{4}, La solución se concentró hasta 150 ml, se vertió en MeOH (300 ml), y se agitó durante toda la noche. El precipitado se filtró y se secó, para dar lugar al compuesto del título (5,6 g, 53%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,50-6,66 (m, 21H), 5,13 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 3,99 (t, 2H, J = 5,76 Hz), 2,69 (t, 2H, J = 5,73 Hz), 2,31 (s, 6H), 2,42 (s, 3H)
Ejemplo 14 5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-metil-1H-indol
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Se cargó un matraz con 4-benciloxianilina (45 g, 0,23 mol), 4'-benciloxi-2-bromofenilpropiofenona (66414-19-5) (21 g, 0,066 mol) y 50 ml DMF. La reacción se calentó en condiciones de reflujo durante 30 minutos, y después se enfrió hasta temperatura ambiente y se repartió entre 250 ml EtOAc y 100 ml de HCl 1 N (acuoso). El EtOAc se lavó con NaHCO_{3} (acuoso) y salmuera, se secó con MgSO_{4}. La solución se concentró y el residuo se recogió en CH_{2}Cl_{2}, y se añadieron hexanos, para precipitar 25 g de un sólido crudo. El sólido se disolvió en CH_{2}Cl_{2}, y se evaporó en gel de sílice y se cromatografió utilizando CH_{2}Cl_{2}/hexano (1:5), para dar lugar a 9,2 g de un sólido de color canela (33%): T.p.f. = 150-152ºC; ^{1}H RMN (DMSO) 10,88 (s, 1 H), 7,56 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,48 (d, 4 H, J = 7,9 Hz), 7,42-7,29 (m, 6 H), 7,21 (d, 1 H, J = 7,0 Hz), 7,13 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,08 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 6,94 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,16 (s, 2 H), 5,11 (s, 2 H), 2,33 (s, 3 H); IR (KBr) 3470, 2880, 2820, 1620 cm^{-1}; EM eI m/z 419.
Ejemplo 15 2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol-5-ol
Una suspensión de Pd al 10% /C (1,1 g) en EtOH se trató con una solución del compuesto del título del Ejemplo 11 (2,2 g, 3,4 mmol) en THF/EtOH. Se añadió ciclohexadieno (6,0 ml, 63 mmol) y la reacción se agitó durante 48 horas. El catalizador se filtró a través de Celite, y la mezcla de reacción se concentró y se cromatografió en gel de sílice, utilizando una elución con gradiente de MeOH/CH_{2}Cl_{2} (1:19 hasta 1:10), para dar lugar a 0,8 g del producto en forma de sólido blanco. T.p.f. = 109-113ºC; CHN calculado para C_{29}H_{32}N_{2}O_{3} + 0,5 H_{2}O; ^{1}H RMN 9,64 (s, 1 H), 8,67 (s, 1 H), 7,14 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,05 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 6,84 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 6,79 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 6,74 (s, 4 H), 6,56 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,09 (s, 2 H), 3,95-3,93 (m, 2 H), 2,60-2,51 (m, 2 H), 2,39-2,38 (m, 4 H), 2,09 (s, 3 H), 1,46-1,45 (m, 4 H), 1,35-1,34 (m, 2 H); IR (KBr) 3350 (br), 2920, 1620, 1510 cm^{-1}; EM (EI) m/z 456.
Ensayo de fijación al receptor de estrógenos in vitro Preparación de receptores
Se cultivaron células CHO que sobreexpresaban el receptor de estrógenos en placas de 150 mm^{2}, en DMEM + 10% de suero bovino fetal tratado con carbón recubierto con dextrano. Las placas se lavaron dos veces con PBS y una vez con Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM. Las células se recogieron raspando la superficie, y después se colocó la suspensión de células en hielo. Las células se rompieron con un homogeneizador de tejidos manual, equipado con un motor, utilizando dos pasadas de 10 segundos. La preparación cruda se centrifugó a 12.000 x g durante 20 minutos, seguido por una centrifugación de 60 minutos a 100.000 x g, para obtener un citosol exento de ribosomas. A continuación se congeló el citosol y se almacenó a -80ºC. La concentración de proteínas del citosol se estimó utilizando el ensayo BCA con proteína patrón de referencia.
Condiciones del ensayo de fijación
El ensayo de competición se realizó en una placa de 96 pocillos (poliestireno*) que fija < 2,0% del [^{3}H]-17_-estradiol total añadido, y se registró cada punto de medida por triplicado. Se repartieron partes alícuotas de 100 \mug/100 \mul de la preparación de receptores por pocillo. Se añadió una dosis saturante de [^{3}H]-17_-estradiol 2,5 nM + competidor (o tampón) en un volumen de 50 \mul, en la competición preliminar; cuando se evaluaron concentraciones de competidor de 100x y 500x, sólo se utilizó [^{3}H]-17_-estradiol 0,8 nM. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 2,5 h. Al final de este período de incubación se añadieron a cada pocillo 150 \mul de carbón recubierto con dextrano y enfriado con hielo (5% de carbón activado recubierto con 0,05% de dextrano de 69 K) y la placa se centrifugó inmediatamente a 99 x g durante 5 minutos a 4ºC. A continuación se extrajeron 200 \mul de la solución sobrenadante para recuento por centelleo. Las muestras se contaron hasta 2% o 10 minutos, lo que tuviese lugar antes. Dado que el poliestireno absorbe una pequeña cantidad de [^{3}H]-17_-estradiol, se incluyeron pocillos que contenían radiactividad y citosol, pero que no habían sido tratados con carbón, para cuantificar las cantidades de isótopo disponibles. Asimismo, se trataron con carbón pocillos que contenían radiactividad pero no citosol, para estimar las DPM no eliminables de [^{3}H]-17_-estradiol. Se emplearon placas de 96 pocillos Corning n.º 25880-96, ya que se ha demostrado que fijan la cantidad mínima de estradiol.
Análisis de los resultados
Las cuentas por minuto (CPM) de radiactividad se convirtieron automáticamente a desintegraciones por minuto (DPM) por el contador de centelleo Beckman LS 7500 utilizando un conjunto de patrones atenuados, para generar el valor de H# para cada muestra. Para calcular el % de fijación de estradiol en presencia de una cantidad 100 o 500 veces mayor de competidor, se aplicó la siguiente fórmula:
((DPM de la muestra-DPM no eliminadas por carbón)/(DPM del estradiol-DPM no eliminadas
por carbón)) x 100 % = % de fijación de estradiol
Para la generación de las curvas de CI_{50} se representa el % de fijación frente al compuesto. Las CI_{50} se generan para compuestos que muestran > 30% de competición a una concentración de competidor de 500x. Para una descripción de estos métodos, véase Hulme, E.C., ed. 1992, Receptor-Ligand Interactions: A Practical Approach. IRL Press, Nueva York. (Véase especialmente el capítulo 8). La referencia en las tablas siguientes al compuesto del Ejemplo 1 se refieren al producto final, 2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol-5-ol.
Afinidad por el receptor de estrógenos (expresada como RBA: 17_-estradiol = 100)
Compuesto RBA
Raloxifeno 200
Tamoxifeno 1,8
Equilina 5,3
Ejemplo 15 400
Ensayo de la fosfatasa alcalina en células de Ishikawa Mantenimiento y tratamiento de las células
Se mantuvieron células de Ishikawa en DMEM/F12 (50%:50%) que contenía rojo fenol + suero bovino fetal al 10%, y se añadió al medio un aporte complementario de Glutamax 2 mM, penicilina/estreptomicina al 1%, y piruvato de sodio 1 mM. Cinco días antes del comienzo de cada experimento (tratamiento de células) se cambió el medio a DMEM exento de rojo fenol /F12 + suero al 10% tratado con carbón recubierto de dextrano. El día anterior al tratamiento se recogieron las células utilizando tripsina al 0,5%/EDTA y se sembraron a una densidad de 5 x 10 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Los compuestos de prueba se añadieron a concentraciones de 10^{-6}, 10^{-7} y 10^{-8} M, además de 10^{-6} M (compuesto) + 17_-estradiol 10^{-9} M para evaluar la capacidad de los compuestos para actuar como antiestrógenos. Las células se trataron durante 48 h antes del ensayo. Cada placa de 96 pocillos contenía un testigo de 17_-estradiol. La población de la muestra para cada dosis fue
n=8.
Ensayo de la fosfatasa alcalina
Al final del período de 48 h, se aspira el medio y se lavan las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añaden 50 \mul de tampón de lisis (Tris-HCl, 0,1 M, pH 9,8, Triton X-100 al 0,2%) a cada pocillo. Las placas se colocan a -80ºC durante un mínimo de 15 minutos. Las placas se descongelan a 37ºC, y después se añaden a cada pocillo 150 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 9,8, que contiene para-nitrofenilfosfato (pNPP) 4 mM (concentración final, pNPP 3 mM). Los cálculos de la absorbancia y de la pendiente se realizaron utilizando el programa KineticCalc Application (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). Los resultaron se expresaron como la media \pm D.T. de la velocidad de reacción enzimática (pendiente) calculada como promedio de la porción lineal de la curva de reacción cinética (lecturas de la densidad óptica cada 5 minutos durante 30 minutos de lectura de la absorbancia). Los resultados para los compuestos se resumen como porcentaje de la respuesta relativa a 17_-estradiol 1 nM. Se ensayaron varios compuestos para determinar su actividad estrógenica por el método de la fosfatasa alcalina, y se calcularon los correspondientes valores de ED_{50} (I.C. del 95%). Los cuatro compuestos mencionados a continuación fueron utilizados como patrones de referencia:
17_-estradiol 0,03 nM 17_-estradiol 1,42 nM
estriol 0,13 nM estrona 0,36 nM
Una descripción de estos métodos puede consultarse en Holinka, C.F., Hata, H., Kuramoto, H. y Gurpide, E. (1986) Effects of steroid hormones and antisteroids on alkaline phosphatase activity in human endometrial cancer cells (Ishikawa Line). Cancer Research, 46: 2771-2774, y en Littlefield, B.A., Gurpide, E., Markiewicz, L., McKinley, B. y Hochberg, R.B. (1990) A simple and sensitive microtiter plate estrogen bioassay based on stimulation alkaline phosphatase in Ishikawa cells; Estrogen action of D5 adrenal steroids. Endocrinology, 6: 2757-2762.
Ensayo de la fosfatasa alcalina en células de Ishikawa
Compuesto % de activación
17_-estradiol 100% de actividad
Tamoxifeno 0% de actividad (45% con 17_-estradiol 1 nM)
Raloxifeno 5% de actividad (5% con 17_-estradiol 1 nM)
Ejemplo 15 1% de actividad (1% con 17_-estradiol 1 nM)
Ensayo de transfección 2X VIT ERE Mantenimiento y tratamiento de las células
Se mantuvieron células de ovario de hámster chino (CHO), que habían sido transfectadas de forma estable con el receptor de estrógenos humano, en DMEM + suero bovino fetal al 10% (FBS). El medio de cultivo se sustituyó, 48 h antes del tratamiento, por DMEM exento de rojo fenol + FBS al 10% tratado con carbón recubierto de dextrano (medio de tratamiento). Las células se sembraron a una densidad de 5000 células/pocillo en placas de 96 pocillos que contenían 200 \mul de medio/pocillo.
Transfección con fosfato de calcio
Se combinó ADN indicador (plásmido pGL2 de Promega, que contenía dos copias en tándem del sector ERE de la vitelogenina antes del promotor mínimo de la timidina quinasa que controla la expresión del gen de la luciferasa) con el plásmido de expresión pCH110 (Pharmacia) de la \beta-galactosidasa y con ADN portador (pTZ18U) en la siguiente relación:
10 \mug de ADN indicador
5 \mug de ADN de pCH110
5 \mug de pTZ18U
20 \mug de ADN/1 ml de solución de transfección
Se disolvió el ADN (20 \mug) en 500 \mul de CaCl_{2} 250 mM estéril, y se añadió gota a gota a 500 \mul de 2 X HeBS (NaCl 0,28 M, HEPES 50 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, pH 7,05) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 20 \mul de esta mezcla a cada pocillo de células, y se mantuvieron en contacto con las células durante 16 h. Al final de esta incubación se eliminó el precipitado, las células se lavaron con medio, se introdujo un nuevo medio de tratamiento, y se trataron las células con vehículo, 17_-estradiol 1 nM, compuesto 1 \muM o compuesto 1 \muM + 17_-estradiol 1 nM (pruebas para antagonismo estrogénico). Cada tipo de tratamiento se llevó a cabo en 8 pocillos (n=8), que se incubaron durante 24 h antes del ensayo de la luciferasa.
Ensayo de la luciferasa
Tras 24 h de exposición a los compuestos, el medio se eliminó y cada pocillo se lavó 2 veces con 125 \mul de PBS exenta de Mg^{++} y Ca^{++}. Tras eliminar la PBS, se añadieron 25 \mul de tampón de lisis de Promega a cada pocillo, y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 min, seguido por 15 min a -80ºC y 15 min a 37ºC. Se transfirieron 20 \mul del lisado a una placa de 96 pocillos opaca, para la evaluación de la actividad de la luciferasa, y el resto del lisado (5 \mul) se utilizó para la evaluación de la actividad de la \beta-galactosidasa (normalización de la transfección). Se añadió a cada pocillo de modo automático, por medio del luminómetro, el sustrato de luciferina (Promega) en partes alícuotas de 100 \mul, y se registró la luz producida (unidades lumínicas relativas) 10 segundos después de la adición.
Ensayo de infección con luciferasa
Compuesto % de activación
17_-estradiol 100% de actividad
Estriol 38% de actividad
Tamoxifeno 0% de actividad (10% con 17_-estradiol 1 nM)
Raloxifeno 0% de actividad (0% con 17_-estradiol 1 nM)
Ejemplo 15 0% de actividad (0% con 17_-estradiol 1 nM)
Ensayo de la \beta-galactosidasa
A los 5 \mul restantes del lisado se les añadieron 45 \mul de PBS. Después se añadieron 50 \mul del tampón 2X de ensayo de la \beta-galactosidasa de Promega, se mezcló bien y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Para cada tanda experimental se preparó una placa que contenía una curva patrón (de 0,1 a 1,5 miliunidades, por triplicado). Las placas se analizaron en un lector de placas espectrofotométrico de Molecular Devices, a 410 nm. Se convirtieron las densidades ópticas de las incógnitas en miliunidades de actividad por extrapolación matemática a partir de la curva patrón.
Análisis de los resultados
Los datos de la luciferasa se obtuvieron en forma de unidades lumínicas relativas (ULR) acumuladas durante un período de medición de 10 segundos, y se transfirieron automáticamente a un archivo JMP (SAS Inc), en el que se sustrajeron las ULR de fondo. Los valores de la \beta-galactosidasa se importaron automáticamente al archivo, y estos valores se dividieron por las ULR para normalizar los datos. La media y las desviaciones típicas se determinaron a partir de n=8 en cada tratamiento. La actividad de los compuestos se comparó con la del 17_-estradiol en cada placa. El porcentaje de actividad, comparada con la del 17_-estradiol, se calculó utilizando la fórmula %= ((Estradiol-testigo)/(valor del compuesto)) X 100. Estas técnicas se describen en Tzukerman, M.T., Esty, A., Santiso-Mere, D., Danielian, P., Parker, M.G., Stein, R.B., Pike, J.W. y McDonnel, D.P. (1994). Human estrogen receptor transactivational capacity was determined by both cellular and promoter context and mediated by two functionally distinct intramolecular regions (véase Molecular Endocrinology, 8:21-30).
Bioensayo uterotrófico/antiuterotrófico en ratas
Las propiedades estrogénicas y antiestrogénicas de los compuestos se determinaron en un ensayo uterotrófico en ratas inmaduras (4 días) descrito previamente por L.J. Black y R.L. Goode, Life Sciences, 26, 1453 (1980). Se analizaron ratas Sprague-Dawley inmaduras (hembras, 18 días de edad) en grupos de seis. Se trataron los animales con inyecciones i.p. diarias de 10 \mug del compuesto, 100 \mug del compuesto, (100 \mug del compuesto + 1 \mug de 17_-estradiol) para verificar la capacidad antiestrogénica, y 1 \mug de 17_-estradiol, con DMSO al 50% /solución salina al 50% como vehículo de inyección. En el día 4 se sacrificaron los animales por asfixia con CO_{2}, se extrajeron los úteros y se eliminó el exceso de lípidos, así como todos los líquidos, y se determinó el peso húmedo. Una pequeña sección de una de las trompas se remitió para análisis histológico y el resto se utilizó para aislar el ARN total con el fin de evaluar la expresión del gen del componente 3 del complemento.
Modelo de rata ovariectomizada de 3 días
Compuesto 10 \mug 100 \mug
Tamoxifeno 69,6 mg 71,4 mg
Raloxifeno 47,5 mg 43,2 mg
Testigo = 42,7 mg 1 \mug de 17_-estradiol = 98,2
Compuesto 10 \mug 100 \mug 100 \mug + 1 \mug de 17_-estradiol
Ejemplo 15 39,9 mg 27,4 mg 24,3 mg
Testigo = 30,7 mg 1 \mug de 17_-estradiol = 63,2 mg
El compuesto raloxifeno, clorhidrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-(1-piperidinil)etoxi]fenil-metanona, es representativo de una clase de compuestos que se sabe que son moduladores selectivos del receptor de estrógenos, que ejercen acciones de tipo agonista en los tejido óseos y los lípidos séricos, mientras presentan antagonismo estrogénico en los tejidos uterino y mamario. Palkowitz et al. describen en J. Med. Chem. 1997, 40, 1407, análogos activos de raloxifeno, que pueden también producirse utilizando los compuestos de la presente invención. Por ejemplo, el compuesto 4a descrito por dichos autores, clorhidrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-(1-piperidinil)etoxi]-fenil-metano, puede prepararse siguiendo el siguiente esquema general de reacción.
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Ejemplo 16 Éster metílico del ácido 2-(4-metoxi-bencenosulfonilamino)-benzoico
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A una solución de 2,00 g (0,013 mol) de antranilato de metilo disuelto en 20 ml de cloroformo se le añadieron 3,2 ml (0,039 mol) de piridina, seguido por 2,733 g (0,013 mol) de cloruro de p-metoxibencenosulfonilo. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 h, y se lavó a continuación con HCl 3 N y agua. Los productos orgánicos se secaron después con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron en vacío. El sólido blanco resultante se lavó con éter y se secó en vacío, para dar lugar a 3,7 g (87%) de la sulfonamida deseada. Espectrometría de masas con CI: 322 (M+H).
Ejemplo 17 Éster metílico del ácido 2-(4-metoxi-bencenosulfonilamino)-3-metil-benzoico
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De la misma manera descrita en el Ejemplo 16, 6,24 g (0,038 mol) de metil-3-metil-antranilato proporcionaron 6,21 g (49%) de la sulfonamida deseada en forma de sólido blanco. Espectrometría de masas con electronebulización: 336,2 (M+H).
Ejemplo 18 Cloruro de 4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencilo
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A una solución agitada de 4-hidroxi-benzaldehído (12,2 g, 0,1 mol) y K_{2}CO_{3} (25 g, exceso) en N,N-dimetilformamida (250 ml) se le añadió monoclorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina (20,0 g, 1,08 mol). La mezcla de reacción se calentó hasta 80ºC durante 24 h y se enfrió hasta la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se desactivó con agua enfriada con hielo, y se extrajo con cloroformo. Los productos orgánicos se lavaron con agua, se secaron con MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron en vacío. El residuo se disolvió en metanol, y se le añadió lentamente borohidruro de sodio (10 g, exceso) a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, y después se desactivó con agua. El alcohol se extrajo con cloroformo, los productos orgánicos se lavaron bien con agua, se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron al vacío.
El alcohol crudo así obtenido se disolvió en THF (200 ml), y se sometió a burbujeo con HCl gaseoso durante 30 minutos a 0ºC. A la suspensión de clorhidrato así obtenida se le añadió lentamente cloruro de tionilo (30 ml, exceso). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante treinta minutos, y se enfrió hasta la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró después hasta sequedad, y se trituró con éter anhidro. El sólido precipitado se filtró y se secó en vacío a temperatura ambiente, para proporcionar 25 g (86%) del producto en forma de sólido blanco. P.f. 145 -148ºC. Espectrometría de masas con electronebulización: 256 (M+H).
Ejemplo 19 Cloruro de 4-(2-N,N-dietil-etoxi)-bencilo
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A una solución agitada de 4-hidroxi-benzaldehído (12,2 g, 0,1 mol) y K_{2}CO_{3} (25 g, exceso) en N,N-dimetilformamida (250 ml) se le añadió monoclorhidrato de cloruro de 2-dietilaminoetilo (20,0 g, 1,2 mol). La mezcla de reacción se calentó hasta 80ºC durante 24 h y se enfrió hasta la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se desactivó con agua enfriada con hielo, y se extrajo con cloroformo. Los compuestos orgánicos se lavaron con agua, se secaron con MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron en vacío. El residuo se disolvió en metanol, y se le añadió lentamente borohidruro de sodio (10 g, exceso) a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y después se desactivó con agua. El alcohol se extrajo con cloroformo, se lavó bien con agua, se secó, se filtró y se concentró al vacío.
El alcohol crudo así obtenido se disolvió en THF (200 ml) y se sometió a burbujeo con HCl gaseoso durante 30 minutos a 0ºC. A la suspensión de clorhidrato así obtenida se le añadió lentamente cloruro de tionilo (30 ml, exceso). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante treinta minutos, y se enfrió hasta la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró después hasta sequedad y se trituró con éter anhidro. El sólido precipitado se filtró y se secó en vacío a temperatura ambiente, para proporcionar 18 g (65%) del producto en forma de sólido blanco, p.f. 76-79ºC. Espectrometría de masas con electronebulización: 244 (M+H).
Ejemplo 20 N-hidroxi-2-[[(4-metoxifenil)sulfonil][[4-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]metil]amino]-3-metilbenzamida
A una solución de 1,00 g (2,985 mmol) del éster metílico del ácido 2-(4-metoxi-bencenosulfonilamino)-3-metil-benzoico en 5 ml de DMF se le añadieron 0,952 g (3,284 mmol) de cloruro de 4-(2-piperidin-1-il-etoxi)bencilo y 1,65 g (11,9 mmol) de carbonato de potasio. La mezcla de reacción se agitó después a temperatura ambiente durante 18 h, se diluyó con agua y se extrajo con éter. Los productos orgánicos se extrajeron después con solución de HCl 6 N, y la capa ácida acuosa se alcalinizó después con solución de NaOH 6 N y se extrajo con éter. La capa de éter resultante se secó con sulfato de sodio, se filtró y se concentró en vacío, para dar lugar a 0,965 g del éster de piperidina en forma de aceite incoloro. Espectrometría de masas con electronebulización: 553,5 (M+H)^{+}.
A una solución de 0,889 g (1,611 mmol) del éster de piperidina en 7 ml de THF se le añadieron 0,203 g de hidróxido de litio monohidrato. La mezcla resultante se calentó hasta reflujo durante 15 h, y después se concentró en vacío hasta obtener un residuo. El residuo se diluyó con agua, se neutralizó con solución de HCl al 5% y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se secó con Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró en vacío, para dar lugar a 0,872 g del ácido carboxílico en forma de espuma blanca. Espectrometría de masas con electronebulización: 539,2 (M+H)^{+}.
A una solución de 0,814 g (1,513 mmol) del ácido carboxílico en 10 ml de DMF se le añadieron 0,245 g (1,82 mmol) de HOBT y 0,386 g (2,01 mmol) de EDC. La reacción se agitó después durante 1 h a temperatura ambiente, y se le añadieron 0,46 ml (7,57 mmol) de una solución de hidroxilamina al 50% en agua. La reacción se agitó durante toda la noche y después se concentró en vacío hasta obtener un residuo. El residuo se diluyó con EtOAc, se lavó con agua y solución de bicarbonato de sodio, se secó con Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró en vacío hasta obtener un residuo. El residuo se disolvió en 5 ml de diclorometano, y se le añadieron 0,69 ml de solución de HCl 1 N en éter. Después de 1 h, la reacción se diluyó con éter y el sólido resultante se filtró y se secó en vacío, para dar lugar a 0,179 g de la sal de hidroxamato-amina en forma de sólido blanco. Espectrometría de masas con electronebulización: 554,5 (M+H)^{+}.
Ejemplo 21 2-[[4-(2-dietilamino-etoxi)-bencil]-(4-metoxi-bencenosulfonil)-amino]-N-hidroxi-3-metil-benzamida
A una solución de 1,0 g (2,653 mmol) del éster metílico del ácido 2-(4-metoxibenceno-sulfonilamino)-3-metilbenzoico en 10 ml de DMF se le añadieron 0,811 g (2,918 mmol) de cloruro de 4-(2-N,N-dietil-etoxi)-bencilo y 1,5 g (10,9 mmol) de carbonato de potasio. La mezcla de reacción se agitó después a temperatura ambiente durante 18 h, se diluyó con agua y se extrajo con éter. Los productos orgánicos se extrajeron después con solución de HCl 6 N, y la capa ácida acuosa se alcalinizó después con solución de NaOH 6 N y se extrajo con éter. La capa de éter resultante se secó con sulfato de sodio, se filtró y se concentró en vacío, para dar lugar a 0,575 g (37%) del N,N-dietilamino-éster en forma de espuma de color canela. Espectrometría de masas con electronebulización: 583,1 (M+H)^{+}.
A una solución de 0,539 g (0,926 mmol) del N,N-dietilamino-éster en diclorometano se le añadieron 2 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y después se concentró en vacío hasta obtener un residuo. El residuo se trituró con éter y el sólido resultante se recogió por filtración y se secó en vacío, para dar lugar a 0,369 g del ácido carboxílico en forma de sólido blanco. Espectrometría de masas con electronebulización: 525,2 (M-H)^{-}.
A una solución de 0,328 g (0,513 mmol) del ácido carboxílico en 6,5 ml de diclorometano se le añadieron 0,12 ml de DMF, seguido por 0,77 ml de cloruro de oxalilo 2,0 M en CH_{2}Cl_{2}, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h.
En un matraz separado se añadieron 8 ml de THF y 1,7 ml de agua, a 0ºC, a una mezcla de 0,47 ml (7,7 mmol) de una solución de hidroxilamina al 50% en agua. Una vez agitada esta mezcla durante 15 minutos a 0ºC, se le añadió la solución del cloruro de ácido en una porción, y la solución resultante se dejó calentar hasta la temperatura ambiente con agitación durante toda la noche. La mezcla de reacción se acidificó después hasta pH 3 con HCl al 10% y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron en vacío hasta obtener un residuo. El residuo se trituró con éter, para dar lugar a 0,194 g de la sal de hidroxamato-amina en forma de sólido blanco. Espectrometría de masas con electronebulización: 542,3 (M+H)^{+}.
Ejemplo 22 Éster etílico del ácido 2-(4-metoxi-fenilsulfanil)-propiónico
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A una solución agitada de 4-metoxibencenotiol (2,5 g, 14 mmol) y K_{2}CO_{3} anhidro (4,0 g, exceso) en acetona seca (100 ml), se le añadió 2-bromo-propionato de etilo (3,0 g, 16 mmol) en un matraz de fondo redondo, y la mezcla de reacción se calentó en condiciones de reflujo durante 8 horas con agitación intensa. Al final, se dejó enfriar la reacción, se filtró, y la mezcla de reacción se concentró hasta obtener un residuo. El residuo se extrajo con cloroformo y se lavó con H_{2}O, y la capa orgánica se secó con MgSO_{4}, se filtró y se concentró, para dar lugar al éster etílico del ácido 2-(4-metoxi-fenilsulfanil)-propiónico en forma de aceite de color amarillo claro. Rendimiento: 3,6 g (94%).
Ejemplo 23 Éster etílico del ácido 2-(4-metoxi-bencenosulfonil)-propiónico
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A una solución agitada de 12,0 g (50 mmol) del éster etílico del ácido 2-(4-metoxi-fenilsulfanil)-propiónico en 300 ml de cloruro de metileno a 0ºC se le añadió lentamente a una velocidad suficiente para controlar la reacción exotérmica. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, y se diluyó con 600 ml de hexanos. La mezcla de reacción se filtró, y el filtrado se agitó con 500 ml de una solución saturada de Na_{2}SO_{3} durante 3 horas. La capa orgánica se separó, se lavó bien con agua, se secó y se evaporó en vacío, para dar lugar a 12 g de un semisólido.
Ejemplo 24 Éster etílico del ácido 2-(4-metoxi-bencenosulfonil)-2-metil-3-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-fenil]propiónico
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Una mezcla agitada de 2,7 g (10 mmol) del éster etílico del ácido 2-(4-metoxi-bencenosulfonil)propiónico, 3,03 g (10 mmol) de cloruro de 4-(2-piperidin-1-il-etoxi)bencilo, 10 g de K_{2}CO_{3} y 500 mg de 18-corona-6 en 250 ml de acetona se sometió a reflujo durante 16 horas. Al final, la mezcla de reacción se filtró, y la capa de acetona se concentró hasta obtener un residuo. El residuo se extrajo con cloroformo, se lavó bien con agua, se secó con MgSO_{4} anhidro, se filtró y se concentró hasta obtener un residuo. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo al 50%-hexanos, para dar lugar a 4,8 g (92%) del producto deseado en forma de aceite. EM: 490 (M+H)^{+}.
Ejemplo 25 Ácido 2-(4-metoxibencenosulfonil)-2-metil-3-[4-(2-piperidinil-1-il-etoxi)-fenil]-propiónico
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A una solución agitada del éster etílico del ácido 2-(4-metoxibencenosulfonil)-2-metil-3-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)fenil]propiónico (4,9 g, 10 mmol) en alcohol metílico se le añadió NaOH 10 N (20 ml, exceso). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. Al final, la mezcla de reacción se concentró y se neutralizó con cuidado empleando HCl diluido. El residuo obtenido se extrajo con cloroformo, se lavó bien con agua, se secó y se concentró. El producto obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:metanol (95:5), para dar lugar al producto del ejemplo en forma de cristales incoloros, p.f. 106ºC; EM: 462,5 (M+H)^{+}. Rendimiento: 4,1 g, 88-1.
Ejemplo 26 2-(4-metoxibencenosulfonil)-2-metil-3-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-fenil]-propionamida
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A una solución agitada del ácido 2-(4-metoxi-fenilsulfonil)-2-metil-3-fenil-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)]propiónico (2,3 g, 5 mmol), de DMF (2 gotas) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) a 0ºC, se le añadió cloruro de oxalilo (1,2 g, 10 mmol) gota a gota. Tras la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. De forma simultánea, se agitó en un matraz separado una mezcla de clorhidrato de hidroxilamina (3,4 g, 50 mmol) de trietilamina (10,1 g, 100 mmol) en THF:agua (5:1, 50 ml) a 0ºC durante 1 hora. Al final del período de 1 hora, la mezcla de reacción de cloruro de oxalilo se concentró, y el residuo de color amarillo pálido se disolvió en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}, y se añadió lentamente a la hidroxilamina a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y se concentró. El residuo obtenido se extrajo con cloroformo y se lavó bien con agua. El producto obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice, y se eluyó con acetato de etilo. El producto del ejemplo se aisló en forma de sólido incoloro. P.f. 98ºC; rendimiento: 48%; EM: 477 (M+H)^{+}; ^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}): _ 1,2 (s, 3H), 3,5-1,5 (m, 16H), 3,9 (s, 3H), 4,4 (m,1H); 6,5-7,8 (m, 8H); 10,8 (bs, 1H).
Se analizó la actividad biológica de los compuestos objeto de la presente invención de acuerdo con los siguientes procedimientos.
Ensayo de gelatinasa in vitro
El ensayo se basa en la escisión del sustrato tiopeptídico ((Ac-Pro-Leu-Gly(2-mercapto-4-metilpentanoil)-Leu-Gly-OEt, Bachem Bioscience) por la enzima gelatinasa, que da lugar a la liberación de un sustrato que reacciona colorimétricamente con DTNB (ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)). La actividad enzimática se mide siguiendo la velocidad de aumento del color. El sustrato tiopeptídico se prepara en forma de solución madre 20 mM en DMSO al 100% y el DTNB se disuelve en DMSO al 100% en forma de solución madre 100 mM, y se conserva en la oscuridad a temperatura ambiente. Tanto el sustrato como el DTNB se diluyen conjuntamente hasta 1 mM con el tampón del sustrato (HEPES 50 mM pH 7,5, CaCl_{2} 5 mM) antes de su utilización. La solución madre de gelatinasa B de neutrófilos humanos se diluye con el tampón de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 5 mM, Brij al 0,02%) hasta una concentración final de 0,15 nM. El tampón de ensayo, la enzima, y el DTNB/sustrato (concentración final de 500 \muM) y el vehículo o el inhibidor se añaden a una placa de 96 pocillos (volumen total de reacción de 200 \mul) y el aumento del color se mide espectrofotométricamente durante 5 minutos a 405 nm en un lector de placas. El aumento en la DO_{405} se representa gráficamente y se calcula la pendiente de la línea, que representa la velocidad de reacción. Se confirma la linealidad de la velocidad de reacción (r^{2} > 0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de la velocidad del testigo y se compara, en busca de significación estadística (p < 0,05), con las velocidades de los casos tratados con fármaco, utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden generarse relaciones dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del fármaco y los valores de CI_{50} con IC del 95% se calculan utilizando regresión lineal (IPREB, HTB).
Referencias: Weingarten, H y Feder, J., Spectrophotometric assay for vertebrate collagenase, Anal. Biochem. 147, 437-440 (1985).
Ensayo de colagenasa in vitro
El ensayo se basa en la escisión del sustrato peptídico ((Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMa)-NH_{2}, Peptide International, Inc.) por la colagenasa, que da lugar a la liberación del grupo fluorescente NMa, que se cuantifica con un fluorímetro. El Dnp desactiva la fluorescencia del NMa en el sustrato intacto. El ensayo se lleva a cabo en tampón de ensayo HCBC (HEPES 50 mM pH 7,0, Ca^{+2} 5 mM, Brij al 0,02%, cisteína al 0,5%) con colagenasa recombinante de fibroblastos humanos (truncada, p.m. = 18.828, WAR, Radnor). El sustrato se disuelve en metanol y se almacena congelado en partes alícuotas de 1 mM. La colagenasa se almacena congelada en tampón, en partes alícuotas de 25 \muM. Para realizar el ensayo, el sustrato se disuelve en tampón HCBC hasta una concentración final de 10 \muM y la colagenasa hasta una concentración final de 5 nM. Los compuestos se disuelven en metanol, DMSO o HCBC. El metanol y el DMSO se diluyen en HCBC hasta <1,0%. Los compuestos se añaden a la placa de 96 pocillos que contiene la enzima y la reacción se pone en marcha añadiendo el sustrato. La reacción se lee (excitación: 340 nm, emisión: 444 nm) durante 10 min y se representa gráficamente el aumento en la fluorescencia frente al tiempo en forma de trazado lineal. Se calcula la pendiente de la línea, que representa la velocidad de reacción. Se confirma la linealidad de la velocidad de reacción (r^{2} > 0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de la velocidad del testigo y se compara su significación estadística (p <0,05) con las velocidades de los casos tratados con fármaco, utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden generarse relaciones dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del fármaco y se calculan los valores de CI_{50} con IC del 95% utilizando regresión lineal (IPRED, HTB).
Referencias: Bickett, D. M. et al., A high throughput fluorogenic substrate for interstitial collagenase (MMP-1) and gelatinase (MMP-9), Anal. Biochem. 212, 58-64 (1993).
Procedimiento de medición de la inhibición de la TACE
Se utilizan placas de microvaloración de 96 pocillos, negras, y cada pocillo recibe una solución compuesta de 10 \mul de TACE (Immunex, concentración final: 1 \mug/ml), 70 \mul de tampón Tris, pH 7,4, que contiene glicerol al 10% (concentración final: 10 mM), y 10 \mul de solución del compuesto de prueba en DMSO (concentración final: 1 \muM, concentración de DMSO < 1%) y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se inicia añadiendo el sustrato de peptidilo fluorescente (concentración final: 100 \muM) a cada pocillo y agitando a continuación en un agitador 5 durante segundos. La reacción se lee (excitación: 340 nm, emisión: 420 nm) durante 10 min y se representa gráficamente el aumento en la fluorescencia frente al tiempo en forma de trazado lineal. Se calcula la pendiente de la línea, que representa la velocidad de reacción. Se confirma la linealidad de la velocidad de reacción
(r^{2} > 0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de la velocidad del testigo y se compara su significación estadística (p <0,05) con las velocidades de los casos tratados con fármaco, utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden generarse relaciones dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del fármaco, y se calculan los valores de CI_{50} con IC del 95% utilizando regresión lineal.
Los resultados obtenidos siguiendo dichos procedimientos estándar de análisis experimental se presentan en la siguiente tabla.
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Procedimientos de medición de la inhibición de MMP-1, MMP-9 y MMP-13
Estos procedimientos estándar de análisis farmacológico se basan en la escisión de sustratos tiopeptídicos tales como Ac-Pro-Leu-Gly (2-mercapto-4-metilpentanoil)-Leu-Gly-OEt por las metaloproteinasas de la matriz MMP-1, MMP-13 (colagenasas) o MMP-9 (gelatinasa), que da lugar a la liberación de un sustrato que reacciona colorimétricamente con DTNB (ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)). La actividad enzimática se mide siguiendo la velocidad de aumento del color. El sustrato tiopeptídico se prepara en forma de solución madre 20 mM en DMSO al 100% y el DTNB se disuelve en DMSO al 100% en forma de solución madre 100 mM y se almacena en la oscuridad a temperatura ambiente. Tanto el sustrato como el DTNB se diluyen conjuntamente hasta 1 mM con el tampón del sustrato (HEPES 50 mM pH 7,5, CaCl_{2} 5 mM) antes de su utilización. La solución madre de enzima se diluye con tampón de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 5 mM, Brij al 0,02%) hasta la concentración final deseada. El tampón de ensayo, la enzima, vehículo o inhibidor y el DTNB/sustrato se añaden, por este orden, a una placa de 96 pocillos (volumen total de reacción de 200 \mul) y el aumento del color se mide por espectrofotometría durante 5 minutos a 405 nm en un lector de placas, y el aumento del color con el tiempo se representa gráficamente en forma de trazado
lineal.
Como alternativa, se utiliza un sustrato peptídico fluorescente. En este ensayo, el sustrato peptídico contiene un grupo fluorescente y un grupo desactivador. Cuando se produce la escisión del sustrato por una MMP, se cuantifica la fluorescencia que se genera con el lector de placas de fluorescencia. El ensayo se lleva a cabo en un tampón de ensayo HCBC (HEPES 50 mM, pH 7,0, Ca+^{2} 5 mM, Brij al 0,02%, cisteína al 0,5%), con MMP-1, MMP-9 o MMP-13 recombinantes humanas. El sustrato se disuelve en metanol y se conserva congelado en partes alícuotas de 1 mM. Para el ensayo, se diluyen el sustrato y las enzimas con tampón HCBC hasta alcanzar las concentraciones deseadas. Se añaden los compuestos a la placa de 96 pocillos que contiene la enzima y se inicia la reacción mediante la adición sustrato. La reacción se lee (excitación: 340 nm, emisión: 444 nm) durante 10 min y se representa gráficamente el aumento en la fluorescencia frente al tiempo en forma de trazado lineal.
Tanto para el ensayo con el sustrato tiopeptídico como con el péptido fluorescente, se calcula la pendiente de la línea, que representa la velocidad de reacción. Se confirma la linealidad de la velocidad de reacción (r^{2} > 0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de la velocidad del testigo y se compara su significación estadística (p <0,05) con las velocidades de los casos tratados con fármaco, utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden generarse relaciones dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del fármaco, y los valores de CI_{50} con IC del 95% se calculan utilizando regresión lineal.
Inhibición de MMP in vivo
Un trozo de un tubo de diálisis de 2 cm (umbral discriminatorio de peso molecular: 12-14.000, 10 mm de anchura plana) que contenía enzima de metaloproteinasa de la matriz (estromelisina, colagenasa o gelatinasa en 0,5 ml de tampón) se implanta por vía intraperitoneal o subcutánea (en la espalda) de una rata (Sprague-Dawley, 150-200 g) o ratón (CD-1, 25-50 g) con anestesia. Los fármacos se administran PO, IP, SC o IV a través de una cánula en la vena yugular. Los fármacos se administran en un volumen de dosis de 0,1 a 0,25 ml/animal. El contenido de los tubos de diálisis se recoge, y se mide la actividad enzimática.
Se calculan las velocidades de reacción enzimática para cada tubo de diálisis. Se utilizan tubos de por lo menos 3 animales diferentes para calcular la media + ETM. La significación estadística (p < 0,05) de los animales tratados con vehículo frente a los animales tratados con fármaco se determina por análisis de la varianza. (Agents and Actions 21: 331, 1987).
Procedimiento de medición de la inhibición de la TACE
Se utilizan placas de microvaloración de 96 pocillos, negras, y cada pocillo recibe una solución compuesta de 10 \mul de TACE (concentración final: 1 \mug/ml), 70 \mul de tampón Tris, pH 7,4, que contiene glicerol al 10% (concentración final: 10 mM), y 10 \mul de solución del compuesto de prueba en DMSO (concentración final: 1 \muM, concentración de DMSO <1%) y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se inicia añadiendo el sustrato de peptidilo fluorescente (concentración final: 100 \muM) a cada pocillo y agitando a continuación en un agitador 5 durante segundos.
La reacción se lee (excitación: 340 nm, emisión: 420 nm) durante 10 min, y se representa gráficamente el aumento en la fluorescencia frente al tiempo en forma de trazado lineal. Se calcula la pendiente de la línea, que representa la velocidad de reacción.
Se confirma la linealidad de la velocidad de reacción (r^{2} >0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de la velocidad del testigo y se compara su significación estadística (p <0,05) con las velocidades de los casos tratados con fármaco, utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden generarse relaciones dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del fármaco, y los valores de CI_{50} con IC del 95% se calculan utilizando regresión lineal.
Los resultados de los anteriores procedimientos estándar de análisis farmacológico de la inhibición in vitro e in vivo de las metaloproteinasas de la matriz y de la inhibición de la TACE se presentan a continuación en la Tabla I.
TABLA I Inhibición de MMP y TACE
49

Claims (14)

1. Sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula:
50 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C_{1}-C_{12} o alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado;
X se selecciona de entre halógeno, -O-SO_{2}-CH_{3}, -O-SO_{2}-CF_{3}, o una fracción de la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
51
Z es -NO_{2}, halógeno, -CH_{3} o -CF_{3};
A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o -SO_{2}-;
m es un número entero de 0 a 3;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se seleccionan independientemente de entre H, halógeno, -NO_{2}, alquilo, alcoxi, alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado, OH o los ésteres C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos, -CN, -O-R^{1}, -O-Ar, -S-R^{1}, -S-Ar, SO-R^{1}, -SO-Ar, -SO_{2}-R^{1}, -SO_{2}-Ar, -CO-R^{1}, -CO-Ar, -CO_{2}-R^{1}, o -CO_{2}-Ar; e
Y se selecciona de entre:
a) la fracción:
52 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{7} y R^{8} se combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de manera que forman un anillo, estando el anillo así formado opcionalmente sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por alquilo C_{1}-C_{3}, trifluorometilo, halógeno, hidrógeno, fenilo, -NO_{2} y CN,
o
b) un heterociclo saturado, insaturado o parcialmente insaturado de siete miembros, que contiene hasta dos heteroátomos seleccionados de entre el grupo constituido por -O-, -NH-, -N(alquilo C_{1}-C_{4})-, -N=, y -S(O)_{n}-, en el que n es un número entero de 0 a 2, opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{4}, trihalometilo, alcoxi C_{1}-C_{4}, trihalometoxi, aciloxi C_{1}-C_{4}, alquiltio C_{1}-C_{4}, alquilsulfinilo C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo C_{1}-C_{4}, hidroxi-alquilo (C_{1}-C_{4}), fenilo opcionalmente sustituido con 1 a 3 alquilo (C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H, -CN, -CONHR^{1}, -NH_{2}, alquilamino C_{1}-C_{4}, dialquilamino C_{1}-C_{4}, -NHSO_{2}R^{1}, -NHCOR^{1}, -NO_{2}.
\newpage
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que:
53
en el que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C_{1}-C_{12} o alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado;
X es halógeno, -O-SO_{2}-CH_{3}, -O-SO_{2}-CF_{3} o una fracción de estructura:
54
Z es -NO_{2}, halógeno, -CH_{3} o -CF_{3};
A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o -SO_{2}-;
m es un número entero de 0 a 3; e
Y se selecciona de entre:
un grupo seleccionado a partir de acepina, diacepina, oxacepina, tiacepina, oxapina y tiepina, estando el grupo opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{4}, trihalometilo, alcoxi C_{1}-C_{4}, trihalometoxi, aciloxi C_{1}-C_{4}, alquiltio C_{1}-C_{4}, alquilsulfinilo C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo C_{1}-C_{4}, hidroxi-alquilo (C_{1}-C_{4}), fenilo opcionalmente sustituido con 1 a 3 alquilo (C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H, -CN, -CONHR^{1}, -NH_{2}, alquilamino C_{1}-C_{4}, dialquilamino C_{1}-C_{4}, -NHSO_{2}R^{1}, -NHCOR^{1}, -NO_{2}.
3. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
55
en la que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C_{1}-C_{6} o alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos, halógeno, -CN, alquilo C_{1}-C_{6}, o trifluorometilo,
m es un número entero de 0 a 3;
R^{7} y R^{8} se combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de manera que forman un anillo, estando el anillo opcionalmente sustituido con hasta tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alquilo C_{1}-C_{3}, trifluorometilo, -CN y -NO_{2}; y
X es halógeno, -O-SO_{2}-CH_{3}, -O-SO_{2}-CF_{3}, o una fracción de estructura:
56
Z se selecciona de entre -NO_{2}, halógeno, -CH_{3} o -CF_{3};
4. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:
57
en la que:
A se selecciona de entre -S-, -SO- o -SO_{2}-;
R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C_{1}-C_{6} o alquilo C_{1}-C_{6} perfluorado;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos, halógeno, -CN, alquilo C_{1}-C_{6}, o trifluorometilo,
m es un número entero de 0 a 3;
Y es -NR^{7}R^{8}, en el que R^{7} y R^{8} se combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de manera que forman un anillo, estando el anillo opcionalmente sustituido con hasta tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{3}, trifluorometilo, -CN y -NO_{2};
X es halógeno, -O-SO_{2}-CH_{3}, -O-SO_{2}-CF_{3} o una fracción de estructura:
58
Z se selecciona de entre -NO_{2}, halógeno, -CH_{3} o -CF_{3}.
5. Compuesto según la reivindicación 1, que es el clorhidrato de (4-clorometil-fenoxi)-etil-hexametilenoimina-1-ilo.
6. Procedimiento para la preparación de una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una de las etapas siguientes:
a) convertir un alcohol de fórmula
59
en la que m, A, Y e R^{1-6} son como se ha definido en la reivindicación 1, para proporcionar un compuesto correspondiente de fórmula (I) en la que X es un grupo saliente mediante unos medios adecuados, por ejemplo, utilizando un agente halogenante, sulfonilante o acilante que contiene el grupo saliente X; si es necesario convertir el compuesto de fórmula (I) formado en una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
o
b) oxidar un compuesto de fórmula (I) en la que A es S, para proporcionar un compuesto correspondiente de fórmula (I) en la que A es SO o -SO_{2}-; si es necesario convertir el compuesto de fórmula (I) formado en una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
o
c) convertir un compuesto de fórmula (I) en una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (I) en la que A es O, que comprende las etapas siguientes:
a) alquilar un hidroxibenzaldehído de fórmula:
60
en la que R^{3}-R^{6} son como se ha definido en la reivindicación 1, con un haluro de alquilo de fórmula:
61
en la que Y, R^{1}, R^{2} son como se ha definido en la reivindicación 1, m es un número entero de 0 a 3, y halo se selecciona de entre Cl, F, Br o I, para producir un aldehído de fórmula:
62
b) reducir el producto de aldehído de la etapa a), para proporcionar un alcohol de fórmula:
63
c) convertir el alcohol de la etapa b) en su sal de clorhidrato; y
d) convertir el alcohol en el compuesto de la etapa c) en un grupo saliente.
8. Procedimiento para la producción de compuestos según la reivindicación 1, en los que A es S, comprendiendo procedimiento las etapas siguientes:
a) alquilar un compuesto de la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
64 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{3-6} son como se ha definido en la reivindicación 1, con un agente alquilante de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
65 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y, R^{1}, R^{2} y m son como se ha definido en la reivindicación 1, halo puede ser Cl, F, Br o I, para producir un aldehído de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
66 
\vskip1.000000\baselineskip
b) reducir el aldehído, por ejemplo, con borohidruro de sodio, para obtener un alcohol de fórmula;
\vskip1.000000\baselineskip
67 
\vskip1.000000\baselineskip
c) tratar el alcohol de la etapa b) con HCl gaseoso, para generar su clorhidrato; y
d) convertir el producto de clorhidrato del alcohol de la etapa c) en un grupo saliente.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, que comprende además la etapa de oxidación controlada del azufre en el clorhidrato del alcohol de la etapa d) a sulfóxido o a sulfona.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el alcohol se convierte en un grupo saliente mediante tratamiento con cloruro de metanosulfonilo, cloruro de toluenosulfonilo, o anhídrido trifluoroacético en presencia de piridina o trietilamina.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que halo es Cl, m es 1.
12. Procedimiento para la producción de compuestos de fórmula:
68
en la que Y representa un anillo heterocíclico insaturado o parcialmente insaturado de siete miembros, que contiene uno o dos átomos de nitrógeno, estando el anillo heterocíclico unido al puente etoxi en un átomo de nitrógeno en el anillo, y estando opcionalmente sustituido por 1 a 3 grupos seleccionados de entre alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, tioalquilo C_{1}-C_{6}, -CF_{3}, o -NO_{2};
comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar, en un medio alcalino, el alcohol 4-hidroxibencílico con una sal de un compuesto de fórmula:
69
en la que Y es como se ha definido anteriormente.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el medio alcalino se mantiene a un pH de 9 o superior.
14. Utilización de un compuesto según la reivindicación 5 en un procedimiento para preparar clorhidrato de 1-[4-(2-acepan-1-il-etoxi)-bencil]-2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1H-indol-5-ol, que comprende hacer reaccionar un compuesto según la reivindicación 5 con 3-metil-2-(4-benciloxi)fenil-5-benciloxiindol en presencia de una base, seguido por la desprotección, para proporcionar el producto deseado.
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