ES2293682T3 - Anticuerpo anti-apo2. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal que (a) se une al polipéptido Apo-2 que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 411 de la SEC ID No: 1 y (b) induce la apoptosis en por lo menos un tipo de células de mamífero in vivo o ex vivo que expresa dicho polipéptido Apo-2.

Description

Anticuerpo anti-Apo-2.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la identificación, aislamiento y producción recombinante de polipéptidos, designados en la presente invención como Apo-2, en particular a anticuerpos anti-Apo-2, composiciones que los comprenden y sus utilizaciones.

Antecedentes de la invención Apoptosis o "Muerte celular programada"

Se cree que el control del número de células en mamíferos viene determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, a la que a veces se hace referencia como muerte celular necrótica, se caracteriza habitualmente como una forma patológica de muerte celular causada por algún traumatismo o lesión celular. En cambio, hay otra forma "fisiológica" de muerte celular que habitualmente se produce de una forma ordenada o controlada. A menudo se hace referencia a esta forma de muerte celular ordenada o controlada como "apoptosis" [véase, por ejemplo, Barr et al., Bio/Technology, 12: 487-493 (1994); Steller et al., Science, 267: 1445-1449 (1995)]. La muerte celular apoptótica tiene lugar de forma natural en muchos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario y la selección clonal en el sistema inmunitario [Itoh et al., Cell, 66: 233-243 (1991)]. Los índices bajos de muerte celular apoptótica se han asociado con una variedad de condiciones patológicas, incluyendo cáncer, lupus e infección con virus del herpes [Thompson, Science, 267: 1.456-1.462 (1995)]. Los índices elevados de muerte celular apoptótica pueden estar asociados con una variedad de condiciones patológicas, incluyendo SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar, anemia aplásica, infarto de miocardio, apoplejía, daño por repercusión, enfermedad hepática inducida por toxinas [véase, Thompson, supra.].

La muerte celular apoptótica habitualmente se acompaña de uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en células, tales como la condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades en la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Se cree que hay una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas que desencadenan o inducen tales cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356: 397-400 (1992); Steller, supra; Sachs et al., Blood, 82: 15 (1993)]. Por ejemplo, pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales como hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así como la eliminación de determinados factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356: 314-317 (1992)]. Además, se ha descrito que algunos de oncogenes identificados tales como myc, rel y E1A, y de supresores tumorales, como p53, tienen un papel en la inducción de la apoptosis. Asimismo, se ha observado que algunos fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de radiación tienen actividad inductora de apoptosis [Thompson, supra].

Familia TNF de citoquinas

Varias moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral \alpha ("TNF-\alpha"), el factor de necrosis tumoral \beta ("TNF-\beta" o "linfotoxina"), el ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1 (al que también se hace referencia como ligando Fas o ligando CD95), y el ligando Apo-2 (al que también se hace referencia como TRAIL) se han identificado como miembros de la familia de las citoquinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") [véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85: 3.378-3.404 (1995); Wiley et al, Immunity, 3: 673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996); WO 97/01633, publicada el 16 de enero de 1997]. Entre estas moléculas, se ha descrito que el TNF-\alpha, el TNF-\beta, el ligando CD30, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1 y el ligando Apo-2 (TRAIL) están implicados en la muerte celular apoptótica. Se ha descrito que tanto el TNF-\alpha como el TNF-\beta inducen muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Schmid et al., Proc. Natl. Acad, Sci., 83: 1981 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17: 689 (1987)]. Zheng et al. han descrito que el TNF-\alpha está implicado en la apoptosis posterior a la estimulación de células T CD8-positivas [Zheng et al., Nature, 377: 348-351 (1995)]. Otros investigadores han descrito que el ligando CD30 puede estar implicado en la deleción de células T autorreactivas en el timo [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. N.º 10, (1995)].

Las mutaciones en el receptor de ratón Fas/Apo-1 o en los genes del ligando (denominados lpr y gld, respectivamente) se han relacionado con algunos trastornos autoinmunitarios, lo que indica que el ligando Apo-1 puede desempeñar algún papel en la regulación de la deleción clonal de linfocitos autorreactivos en la periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267: 1.449-1.456 (1995)]. También se ha descrito que el ligando Apo-1 induce la apoptosis posterior a la estimulación en linfocitos T CD4-positivos y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Se ha descrito que los anticuerpos monoclonales de ratón agonistas que se unen específicamente al receptor Apo-1 muestran actividad citotóxica que es comparable o similar a la del TNF-\alpha [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169: 1.747-1.756 (1989)].

Familia de receptores de TNF

Se cree que la inducción de las diversas respuestas celulares mediadas por dichas citoquinas de la familia de TNF es iniciada por su unión con receptores celulares específicos. Se han identificado dos receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNF-R1) y 75 kDa (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264: 14.927-14.934 (1989); Brockhaus et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3.127-3.131 (1990); EP 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991], y se han aislado y caracterizado los ADNc humanos y de ratón correspondientes a ambos tipos de receptores [Loetscher et al., Cell, 61: 351 (1990); Schall et al., Cell, 61: 361 (1990); Smith et al., Science, 248: 1.019-1.023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2.830-2.834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell, Biol., 11: 3.020-3.026 (1991)]. Se han asociado polimorfismos extensos con ambos genes de receptores de TNF [véase, por ejemplo, Takao et al., Immunogenetics, 37: 199-203 (1993)]. Ambos TNFRs comparten la estructura típica de los receptores de superficie celular incluyendo las regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores también se encentran de forma natural como proteínas de unión a TNF solubles [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990); y Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8331 (1990)]. La clonación de receptores de TNF solubles recombinantes fue descrita por Hale et al. [J. Cell. Biochem. Suplemento 25 F, 1991, página 113 (P424)].

La parte extracelular de TNFRs de tipo 1 y de tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón de secuencia de aminoácidos repetitivo de cuatro dominios ricos en cisteína (CRDs) designado de 1 a 4, empezando desde el extremo NH_{2}. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de longitud y contiene de 4 a 6 residuos de cisteína en las posiciones que están bien conservadas [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra]. En TNFR1, los límites aproximados de los cuatro CRDs son los siguientes: CRD1 - aminoácidos 14 hasta aproximadamente 53; CRD 2 - aminoácidos desde aproximadamente 54 hasta aproximadamente 97; CRD3 - aminoácidos desde aproximadamente 98 hasta aproximadamente 138; CRD4 - aminoácidos desde aproximadamente 139 hasta aproximadamente 167. En TNFR2, CRD1 incluye los aminoácidos 17 hasta aproximadamente 54; CRD 2 - aminoácidos desde aproximadamente 55 hasta aproximadamente 97; CRD 3 - aminoácidos desde aproximadamente 98 hasta aproximadamente 140; y CRD 4 - aminoácidos desde aproximadamente 141 hasta aproximadamente 179 (Banner et al., Cell, 73: 431-435 (1993)]. El papel potencial de los CRDs en la unión de ligando también está descrito por Banner et al., supra.

Existe un patrón repetitivo similar de CRDs en otras proteínas de la superficie celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGFR) [Johnson et al., Cell, 47: 545 (1986); Radeke et al., Nature, 325: 593 (1987)], el antígeno CD40 de células B [Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403 (1989)], el antígeno OX40 de células T [Mallet et al., EMBO J., 9: 1063 (1990)] y el antígeno de Fas [Yonehara et al., supra e Itoh et al., supra]. Los CRDs también se hallan en las proteínas T2 de tipo TNFR (TNFRs) solubles de los virus de Shope y poxvirus de mixoma [Upton et al., Virology, 160: 20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Común., 176: 335 (1991); Upton et al., Virology, 184: 370 (1991). La alineación óptima de estas secuencias indica que las posiciones de los residuos de cisteínas están bien conservadas. A estos receptores se les hace referencia de forma colectiva como miembros de la superfamilia de receptores de TNF/NGF. Estudios recientes sobre p75NGFR mostraron que la deleción de CRD1 [Welcher, A. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 159-163 (1991)] o una inserción de 5 aminoácidos en este dominio [Yan, H. Y Chao, M. V., J. Biol. Chem. 266: 12099-12104 (1991)]no tenían efecto o bien escaso sobre la unión a NGF [Yan, H. Y Chao, M.V., supra]. El NGFr p75 contiene un tramo rico en prolinas de aproximadamente 60 aminoácidos, ente su CRD4 y la región transmembrana, que no está implicada en la unión a NGF [Peetre, C. et al., Eur. J. Hematol., 41: 414-419 (1988); Seckinger, P. et al., J. Biol. Chem., 264: 11966-11973 (1989); Yan H. y Chao, M.V., supra]. En TNFR2, pero no en TNFR1, se halla una región rica en prolinas similar.

Itoh et al. describen que el receptor de Apo-1 puede señalar una muerte celular apoptótica similar a la señalada por el TNF-R1 de 55 kDa [Itoh et al., supra]. También se ha descrito que la expresión del antígeno de Apo-1 se regula por disminución junto con la de TNF-R1 cuando las células son tratadas con TNF-\alpha o con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Apo-1 [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Por consiguiente, algunos investigadores han establecido la hipótesis de que las líneas celulares que co-expresan receptores de Apo-1 y TNF-R1 pueden mediar la muerte celular a través de mecanismos de señalización comunes [Id.].

Los ligandos de la familia del TNF identificados hasta la fecha, a excepción de la linfotoxina-\alpha, son proteínas transmembrana de tipo II, cuyo extremo C es extracelular. En cambio, los receptores de la familia de receptores del TNF (TNFR) identificados hasta la fecha son proteínas transmembrana de tipo I. No obstante, en ambas familias de ligandos y receptores de TNF la homología identificada entre los miembros de una familia se ha hallado principalmente en el dominio extracelular ("ECD"). Varias de las citoquinas de la familia del TNF, incluyendo el TNF-\alpha, el ligando Apo-1 y el ligando CD40, se dividen proteolíticamente en la superficie celular; la proteína resultante en cada caso forma habitualmente una molécula homotrimérica que actúa como una citoquina soluble. Las proteínas de la familia de receptores del TNF habitualmente también se dividen proteolíticamente para liberar los ECD del receptor soluble que pueden actuar como inhibidores de las citoquinas análogas.

Recientemente, se han identificado otros miembros de la familia de TNFR de mamífero. En Marsters et al., Curr. Biol. 6: 750 (1996), los investigadores describen un polipéptido humano de secuencia nativa de longitud completa, denominado Apo-3, que muestra similitud con la familia de TNFR en sus repeticiones extracelulares ricas en cisteínas y se parece a TNFR1 y CD95 en que contiene una secuencia de dominio citoplásmico de muerte [véase también Marsters et al., Curr. Biol., 6: 1669 (1996)]. A Apo-2 otros investigadores también han hecho referencia como DR3, wsl-1 y TRAMP [Chinnaiyan et al., Science, 274: 990 (1996); Kitson et al., Nature, 384: 372 (1996); Bodmer et al., Immunity, 6: 79 (1997)].

Pan et al. Han descrito otro miembro de la familia de receptores de TNF al que se hace referencia como "DR4" [Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997)]. Se descrició que el DR4 contenía un dominio citoplásmico de muerte capaz de participar en el aparato de suicidio celular. Pan et al. Describen que se cree que DR4 es un receptor para el ligando conocido como ligando Apo-2 o TRAIL.

El complejo señalizador inductor de la apoptosis

Tal como se entiende actualmente, el programa de muerte celular contiene por lo menos tres elementos importantes - activadores, inhibidores y efectores; en C. elegans, estos elementos son codificados respectivamente por tres genes, Ced-4, Ced-9 y Ced-3 [Steller, Science, 267: 1445 (1995); Chinnaiyan et al., Science, 275: 1122-1126 (1997)]. Dos de los miembros de la familia de TNFR, TNFR1 y Fas/Apol (CD95), pueden activar la muerte celular apoptótica [Chinnaiyan y Dixit, Current Biology, 6: 555-562 (1996); Fraser y Evan, Cell; 85: 781-784 (1996)]. También se sabe que TNFR1 media en la activación del factor de transcripción, NF-\kappaB [Tartaglia et al., Cell, 74: 845-853 (1993); Hsu et al., Cell, 84: 299-308 (1996)]. Además de cierta homología de ECD, estos dos receptores comparten homología en su dominio intracelular (ICD) en una zona interfacial de oligomerización conocido como el dominio de muerte [Tartaglia et al., supra; Nagata, Cell, 88: 355 (1997)]. Los dominios de muerte también se hallan en varias proteínas "metazoanas" que regulan la apoptosis, concretamente, la proteína de Drosophila, Reaper, y las proteínas de mamífero a las que se hace referencia como FADD/MORT1, TRADD y RIP [Cleaveland y Ihle, Cell, 81: 479-482 (1995)]. Utilizando el sistema de dos híbridos de levadura, Raven et al. describen la identificación de la proteína, wsl-1, que se une al dominio de muerte de TNFR1 [Raven et al., Programmed Cell Death Meeting, Septiembre 20-24, 1995, Resumen en la página 127; Raven et al., European Cytokine Network, 7: Resumen 82 en la página 210 (Abril-Junio 1996)]. La proteína ws1-1 se describe como homólogo con respecto a TNFR1 (identidad del 48%) y que tiene una distribución de tejido limitada. Según Raven et al., la distribución de tejido de ws1-1 es significativamente diferente de la proteína de unión a TNFR1, TRADD.

Tras la unión del ligando y agrupamiento con el receptor, se cree que TNFR1 y CD95 reclutan FADD en un complejo de señalización inductor de la muerte. CD95 supuestamente se une directamente a FADD, mientras que TNFR1 se une a FADD indirectamente a través de TRADD [Chinnaiyan et al., Cell, 81: 505-512 (1995); Boldin et al., J. Biol. Chem., 270: 387-391 (1995); Hsu et al., supra; Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem. 271, 4961-4965 (1996)]. Se ha descrito que FADD actúa como una proteína adaptadora que recluta la proteasa relacionada con Ced-3, MACH\alpha/FLICE (caspasa 8), en el complejo de señalización de la muerte [Boldin et al., Cell, 85: 803-815 (1996); Muzio et al., Cell, 85: 817-827 (1996)]. MACH\alpha/FLICE parece ser el desencadenante que inicia una cascada de proteasas apoptóticas, incluyendo la enzima conversora de interleuquina-1\beta (ICE) y CPP32/Yama, que pueden ejecutar algunos aspectos críticos del programa de muerte celular [Fraser y Evan, supra].

Recientemente se ha descrito que la muerte celular programada implica la actividad de miembros de una familia de proteasas de cisteína relacionadas con el gen de la muerte celular de C-elegans, ced-3, y a la enzima conversora de IL-1 de mamífero, ICE. La actividad de las proteasas ICE y CPP32/Yama puede ser inhibida por el producto del gen del virus de la viruela de las vacas ("cowpox"), crmA [Ray et al., Cell, 69: 597-604 (1992); Tewari et al., Cell, 81: 801-809 (1995)]. Estudios recientes muestran que CrmA puede inhibir la muerte celular inducida por TNFR-1 y C095 [Enari et al., Nature, 375: 78-81 (1995); Tewari et al., J. Biol. Chem., 270: 3255-3260 (1995)].

Tal como revisó recientemente Tewari et al., TNFR1, TNFR2 y CD40 modulan la expresión de citoquinas proinflamatorias y coestimulantes, los receptores de citoquinas, y las moléculas de adhesión celular a través de la activación del factor de transcripción, NF-\kappaB [Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop., 6:39-44 (1996)]. NF-\kappaB es el prototipo de una familia de factores de transcripción diméricos cuyas subunidades contienen regiones ReI conservadas [Verma et al., Genes Develop, 9: 2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14: 649-681 (1996)]. En su forma latente, NF-\kappaB se compleja con miembros de la familia de inhibidores I\kappaB; tras la inactivación del I\kappaB en respuesta a ciertos estímulos; el NF-\kappaB se transloca al núcleo donde se une a secuencias de ADN específicas y activa la transcripción de los genes.

Para una revisión de la familia TNF de citoquinas y sus receptores, véase Gruss y Dower, supra.

Descripción resumida de la invención

Los Solicitantes han identificado clones de ADNc que codifican los polipéptidos, designados en la presente invención como "Apo-2". Se cree que Apo-2 es un miembro de la familia de TNFR; el polipéptido Apo-2 humano de secuencia nativa de longitud completa muestra algunas similitudes con algunos TNFRs conocidos, incluyendo una región de dominio citoplásmico de muerte. El Apo-2 humano de secuencia nativa de longitud completa también muestra similitud con la familia de TNFR en sus repeticiones extracelulares ricas en cisteína. Se ha observado que el polipéptido Apo-2 es capaz de desencadenar la apoptosis dependiente de caspasa y activar NF-\kappaB. Sorprendentemente, los solicitantes observaron que un dominio extracelular soluble de Apo-2 se una a ligando de Apo-2 ("Apo-2L") y pueden inhibir la función del ligando de Apo-2. Actualmente se cree que el ligando de Apo-2 puede transmitir señales a través de por lo menos dos receptores diferentes, DR4 y el Apo-2 descrito recientemente en la presente invención.

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que (a) se una al polipéptido Apo-2 que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 411 de SEC ID No: 1 y (b) induce la apoptosis in vivo o ex vivo en por lo menos un tipo de célula de mamífero que expresa dicho polipéptido Apo-2.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula homodimérica que comprende cualquiera de los dos anticuerpos de la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal o molécula homodimérica de la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal o molécula homodimérica de la presente invención para utilizar en terapia y, más particularmente, para el tratamiento del cáncer.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la utilización de un anticuerpo de Apo-2 de la presente invención para la preparación de un medicamento para inducir la apoptosis en células de mamífero que expresan el receptor de Apo-2. A modo de ejemplo, las células de mamífero que expresan el receptor de Apo-2 pueden ser células cancerígenas, tales como células de cáncer de pulmon, células de cáncer de colon, células de sarcoma, células de linfoma o células de glioma. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la utilización de un anticuerpo de Apo-2 de la presente invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de colon, sarcoma, linfoma o glioma.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro de inducción de apoptosis en células de mamífero que expresan el receptor de Apo-2 que comprende la exposición de células que expresan el receptor de Apo-2 a un anticuerpo de Apo-2 de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc de Apo-2 humano de secuencia nativa (SEC ID No: 2) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID No: 1).

La figura 2A muestra la secuencia de aminoácidos derivada de Apo-2 humana de secuencia nativa - la secuencia señal putativa está subrayada, el dominio transmembrana putativo está encerrada y la secuencia de minio de muerte putativa está subrayada de forma discontinua. Las cisteínas de los dos dominios ricos en cisteína están subrayadas de forma individual.

La figura 2B muestra una alineación y comparación de las secuencias de dominio de muerte de Apo-2, DR4, Apo-3/DR3, TNFR1 y Fas/Apo-1 (CD95) humano de secuencia nativa. Los asteriscos indican los residuos que son esenciales para la señalización de la muerte por TNFR1 [Tartaglia et al., supra].

La figura 3 muestra la interacción del ECED de Apo-2 con Apo-2L. Los sobrenadantes de células 293 transfectadas con mock o de células 293 transfectadas con ECD de Apo-2 etiquetado con epítopo Flag se incubaron con Apo-2L etiquetado con poli-His y se sometieron a inmunoprecipitación con gránulos de agarosa conjugada con anti-Flag o níquel. Las proteínas precipitadas se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, y se detectaron mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-Apo-2L o anti-Flag.

La figura 4 muestra la inducción de apoptosis por Apo-2 y la inhibición de la actividad de Apo-2L por ECD de Apo-2 soluble. Se transfectaron células 293 humanas (A, B) o células HeLa (C) mediante el vector pRK5 o mediante plásmidos basados en pRK5 que codifican Apo-2 y/o CrmA. La apoptosis se valoró mediante la morfología (A), la fragmentación de ADN (B) o mediante FACS (C-E). El Apo-2L soluble se preincubó con tampón o ECD de Apo-2 purificado por afinidad junto con anticuerpo anti-Flag o inmunoadhesina de ECD de Apo-2 o inmunoadhesinas de DR4 o TNFR1 y se añaden a células HeLa. Posteriormente se analizó la apoptosis de las células (D). También se determinó el análisis de la respuesta-dosis utilizando Apo-2L con inmunoadhesina de ECD de Apo-2 (E).

La figura 5 muestra la activación de NF-\kappaB por Apo-2, DR4 y Apo-2L. (A) Las células HeLa se transfectaron que plásmidos de expresión que codificaban las proteínas indicadas. Los extractos nucleares se prepararon y analizaron mediante un ensayo electroforético del desplazamiento de la movilidad. (B) Las células HeLa o MCF7 se trataron con tampón, Apo-2L o TNF-alfa y se ensayaron para la actividad de NF-\kappaB. (C) Las células HeLa se preincubaron con tam-
pón, ALLN, o ciclohexamida antes de la adición de Apo-2L. La apoptosis se analizó posteriormente mediante FACS.

La Figura 6A muestra la expresión de ARNm de Apo-2 en tejidos humanos al analizarse mediante hibridación Northern de manchas de poli A ARN de tejido humano.

La figura 6B muestra la expresión de ARNm de Apo-2 en líneas celulares de cáncer humano al analizarse mediante hibridación Northern de manchas de poli A ARN de líneas celulares de cáncer humano.

La figura 7 muestra el análisis FACS de un anticuerpo de Apo-2, 3F11.39.7 (ilustrado por las líneas en negrita) en comparación con los controles de IgG (líneas discontinuas). El anticuerpo 3F11.39.7 reconoció el receptor de Apo-2 expresado en células 9D humanas.

La figura 8 es un gráfico que muestra el porcentaje (%) de apoptosis inducido en células 9D por el anticuerpo de Apo-2 3F11.39.7 en ausencia de Fc de IgG anti-ratón de cabra.

La figura 9 es un diagrama de barras que muestra el porcentaje (%) de apoptosis, en comparación con Apo-2L, en células 9D por el anticuerpo de Apo-2 3F11.39.7 en presencia o ausencia de Fc de IgG anti-ratón de cabra.

La figura 10 es un diagrama de barras que ilustra la capacidad del anticuerpo de Apo-2 3F11.39.7 para bloquear la apoptosis inducida por Apo-2L en células 9D.

La figura 11 es un gráfico que muestra los resultados de la unión en una prueba ELISA de anticuerpo de Apo-2 3F11.39.7 a Apo-2 y a otros receptores Apo-2L conocidos a los que se hace referencia como DR4, DcR1 y DcR2.

La figura 12A es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de unión en un ensayo ELISA del anticuerpo 16E2 a Apo-2, DR4, DcR1, DcR2 y CD4-Ig.

La figura 12B es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de unión en un ensayo ELISA del anticuerpo 20E6 a Apo-2, DR4, DcR1, DcR2 y CD4-Ig.

La figura 12C es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de unión en un ensayo ELISA del anticuerpo 24C4 a Apo-2, DR4, DcR1, DcR2 y CD4-Ig.

La figura 13A es un gráfico que muestra la actividad agonista del anticuerpo 16E2, en comparación con Apo-2L, en un ensayo de apoptosis (tinción de violeta cristal utilizando células SK-MES-1.

La figura 13B es un diagrama de barras que muestra la actividad agonista del anticuerpo 16E2, en comparación con el anticuerpo scFv 7D5 (un anticuerpo de factor antitisular), en un ensayo de apoptosis (tinción de violeta cristal) utilizando células SK-MES-1.

La figura 13C es un diagrama de barras que muestra la actividad agonista del anticuerpo 16E2, en comparación con el anticuerpo scFv 7D5, en un ensayo de apoptosis (anexina V-biotina/estreptavidina-[S^{35}]) utilizando células SK-MES-1.

La figura 14A es un gráfico que muestra la actividad agonista del anticuerpo 20E6, en comparación con Apo-2L, en un ensayo de apoptosis (tinción de violeta cristal) utilizando células SK-MES-1.

La figura 14B es un gráfico que muestra la actividad agonista del anticuerpo 20E6 por comparación entre los resultados obtenidos en los ensayos de apoptosis de violeta cristal y anexina V-biotina/estreptavidina-[S^{35}].

La figura 14C es un gráfico que muestra la actividad agonista del anticuerpo 16E2 etiquetado con gD, en comparación con Apo-2L, en un ensayo de apoptosis (tinción de violeta cristal) utilizando células SK-MES-1.

La figura 15A muestra la secuencia de nucleótidos del fragmento del anticuerpo de cadena única (scFv) al que se hace referencia como 16E2 (SEC ID No: 6).

La figura 15B muestra la secuencia de nucleótidos del fragmento del anticuerpo de cadena única (scFv) al que se hace referencia como 20E6 (SEC ID No: 7).

La figura 15C muestra la secuencia de nucleótidos del fragmento del anticuerpo de cadena única (scFv) al que se hace referencia como 24C4 (SEC ID No: 8).

La figura 16 muestra fragmentos del anticuerpo de cadena única (scFv) a los que se hace referencia como 16E2, 20E6 y 24C4 con las secuencias de aminoácidos respectivas para la secuencia señal y las regiones CDR de la cadena ligera y pesada identificadas (las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 están subrayadas).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Los términos "polipéptido Apo-2" y "Apo-2" cuando se utilizan en la presente invención comprenden Apo-2 de secuencia nativa y variantes de Apo-2 (que se definen posteriormente en la presente invención). Estos términos comprenden Apo-2 de una serie de mamíferos, incluyendo humanos. El Apo-2 se puede aislar de una serie de fuentes, tales como tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o puede prepararse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.

Un "Apo-2 de secuencias nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un Apo-2 derivado de la naturaleza. De este modo, un Apo-2 de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de Apo-2 natural de cualquier mamífero. Dicho Apo-2 de secuencia nativa se puede aislar de la naturaleza o se puede producir mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "Apo-2 de secuencia nativa" comprende específicamente formar truncadas o secretadas naturales del Apo-2 (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativas) y variantes alélicas naturales del Apo-2. Una forma variante natural del Apo-2 incluye un Apo-2 que tiene una sustitución de aminoácido en el residuo 410 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 1). En una realización de dicha forma variante natural, el residuo de leucina en la posición 410 está sustituido por un residuo de metionina. En la figura 1 (SEC ID No: 1), el residuo de aminoácido en la posición 410 se identifica como "Xaa" para indicar que el aminoácido puede ser, opcionalmente, leucina o metionina. En la figura 1 (SEC ID No: 2), el nucleótido en la posición 1367 se identifica como "W" para indicar que el nucleótido puede ser adenina (A) o timina (T) o uracilo (U). En una realización de la descripción, el Apo-2 de secuencia nativa es un Apo-2 de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 411 de la figura 1 (SEC ID No: 1). Opcionalmente, el Apo-2 se obtiene o es obtenible mediante la expresión del polipéptido codificado por la inserción de ADNc del vector depositado como ATCC 20921.

EL "dominio extracelular de Apo-2" o "ECD de Apo-2" se refiere a una forma de Apo-2 que está esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplásmico de Apo-2. Habitualmente, el ECD de Apo-2 tendrá menos de un 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplásmico y, preferiblemente, tendrá menos de un 0,5% de dichos dominios. Opcionalmente, el ECD de Apo-2 comprenderá los residuos de aminoácidos 54 a 182 de la figura 1 (SEC ID No: 1) o los residuos de aminoácidos 1 a 182 de la figura 1 (SEC ID No: 1). Opcionalmente, el ECD de Apo-2 comprenderá uno o más dominios ricos en cisteína y, preferiblemente, uno o ambos de los dominios ricos en cisteína identificados en la presente invención (véase la figura 2A). Un experto en la materia entenderá que el dominio transmembrana identificado para el polipéptido Apo-2 de la presente invención se identifica según el criterio utilizado de forma rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembrana puede variar, pero probablemente por no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio mencionado específicamente en la presente invención.

"Variante de Apo-2" significa un Apo-2 biológicamente activo tal y como se define a continuación, que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con el Apo-2 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la figura 1 (SEC ID No: 1) para un Apo-2 humano de secuencia nativa de longitud completa o las secuencias identificadas en la presente invención para el ECD o dominio de muerte de Apo-2. Entre dichas variantes de Apo-2 se incluyen, por ejemplo, polipéptidos Apo-2 en los que se añaden, o se eliminan, uno o más residuos de aminoácidos en el extremo N- o C-terminal de la secuencia de la figura 1 (SEC ID No: 1) o las secuencias identificadas en la presente invención para el ECD o dominio de muerte de Apo-2. Normalmente, una variante de Apo-2 tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la figura 1 (SEC ID No: 1) o las secuencias identificadas en la presente invención para el ECD o dominio de muerte de Apo-2.

El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de Apo-2 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de Apo-2, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software ALIGN^{TM} o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo de alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

El término "etiquetado en un epítopo" cuando se utiliza en la presente invención hace referencia a un polipéptido quimérico que comprende Apo-2 o el anticuerpo Apo-2, o una secuencia de dominio del mismo, fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiquetatiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual puede fabricarse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto de manera que no interfiere con la actividad de Apo-2 o anticuerpo de Apo-2. El polipéptido etiqueta es también preferiblemente bastante único, de manera que el anticuerpo sustancialmente no reacciona de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiquetasadecuados generalmente tienen por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 residuos).

"Aislado" cuando se utiliza para describir los diversas polipéptidos descritos en la presente invención, significa un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que habitualmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos interna o del extremo terminal N utilizando un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Un polipéptido aislado incluye un polipéptido in situ dentro de células recombinantes, ya que por lo menos faltará un componente del entorno natural de Apo-2. No obstante, normalmente, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácidos nucleicos "aislada" de Apo-2 es una molécula de ácidos nucleicos que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácidos nucleicos contaminante con la que generalmente se asocia en la fuente natural del ácido nucleico de Apo-2. Una molécula de ácidos nucleicos "aislada" de Apo-2 difiere en la forma o el contexto en el cual se halla en la naturaleza. Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas de Apo-2 se diferencian por lo tanto de la molécula de ácidos nucleicos de Apo-2 tal como se encuentra en células naturales. No obstante, una molécula de ácidos nucleicos aislada de Apo-2 incluye moléculas de ácidos nucleicos de Apo-2 contenidas en células que generalmente expresan ligando Apo-2 en las que, por ejemplo, la molécula de ácidos nucleicos tiene una localización cromosómica distinta de la de las células naturales.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico se "une operativamente" cuando se establece una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o de una secuencia líder secretora se une operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se une operativamente a una secuencia codificante si influye en la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se une operativamente a una secuencia codificante si se coloca de manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan adaptadores o conectores sintéticos de oligonucleótidos según la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en su sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales anti-Apo-2 (incluidos anticuerpos agonistas, antagonistas, y bloqueadores o neutralizantes) y composiciones de anticuerpos anti-Apo-2 con especificidad poliepitópica.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, cada uno de los anticuerpos que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que habitualmente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos mediante corte y empalme de un dominio variable (incluido hipervariable) de un anticuerpo anti-Apo-2 con un dominio constante, o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen o la designación de la clase o subclase de inmunoglobulina, así como los fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2} y Fv), con tal que muestren la actividad biológica deseada. Véase, por ejemplo Patente de Estados Unidos No. 4.816.567 y Mage et al., en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. páginas. 79-97 (Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, 1987).

De este modo, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por obtenerse de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse que se requiere la producción de anticuerpos mediante ningún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar según la presente invención pueden fabricarse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975), o pueden fabricarse mediante procedimientos de ADN recombinante tales como los descritos en la patente de EE.UU. 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos generadas utilizando, por ejemplo, las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990).

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994). Entre los fragmentos de anticuerpo scFv de la presente invención se incluyen, pero no exclusivamente, los anticuerpos 16E2, 20E6 y 24C4 descritos a continuación con detalle. Dentro del alcance de los anticuerpos ScFv de la presente invención están los anticuerpos scFv que comprenden dominios VH y VL que incluyen una o más de las regiones CDR identificadas para los anticuerpos 16E2, 20E6 y 24C4.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como un ratón, una rata o un conejo que presentan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de armazón ("framework region") (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR importada ni en las secuencias de armazón. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos, de por lo menos un dominio variable, y habitualmente dos, en el cual todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera óptima por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana.

"Biológicamente activo" y "actividad biológica deseada" para los propósitos de la presente invención significa (1) que tiene la capacidad de modular la apoptosis (ya sea de forma agonística o estimulante o en forma antagonística o de bloqueo) in vivo o ex vivo en por lo menos un tipo de célula de mamífero; (2) que tiene la capacidad de unirse al ligando Apo-2; o (3) que tiene la capacidad de modular la señalización del ligando Apo-2 y la actividad del ligando Apo-2.

Los términos "apoptosis" y "actividad apoptótica" se utilizan en un sentido amplio y hacen referencia a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que habitualmente se acompaña de uno o más cambios celulares característicos, entre los que se incluyen la condensación del citoplasma, la pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad puede determinarse y medirse, por ejemplo, mediante análisis de viabilidad celular, análisis FACS o electroforesis de ADN, todas ellas conocidas en la técnica.

Los términos "tratar," "tratamiento" y "terapia" tal como se utilizan en la presente se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la enfermedad fisiológica en mamíferos que habitualmente se caracteriza por un crecimiento celular descontrolado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero no exclusivamente, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Algunos ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen el carcinoma de células escamosas, el cáncer microcítico de pulmón, el cáncer no microcítico de pulmón, el blastoma, el cáncer gastrointestinal, el cáncer renal, el cáncer de páncreas, el glioblastoma, neuroblastoma, el cáncer cervical, el cáncer ovárico, el cáncer de hígado, el cáncer de estómago, el cáncer de vejiga urinaria, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de hígado, el cáncer de próstata, el cáncer de vulva, el cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "mamífero" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero, incluidos humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un humano.

II. Composiciones y Procedimientos de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos Apo-2. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado varios polipéptidos Apo-2 humanos. Las propiedades y características de algunos de estos polipéptidos Apo-2 y anticuerpos anti-Apo-2 se describen con mayor detalle en los siguientes Ejemplos. En base a las propiedades y características de los polipéptidos Apo-2 descritos en la presente invención, los Solicitantes creen actualmente que Apo-2 es un miembro de la familia de TNFR.

A continuación se encuentra la descripción de cómo se pueden preparar el Apo-2, así como moléculas quiméricas de Apo-2 y anticuerpos anti-Apo-2.

A- Preparación de Apo-2

La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de Apo-2 mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico del Apo-2. Naturalmente, está contemplado el uso de procedimientos alternativos que son bien conocidos en el estado de la técnica para preparar Apo-2.

1. Aislamiento del ADN que codifica Apo-2

El ADN que codifica Apo-2 se puede obtener a partir de cualquier biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm de Apo-2 y expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN de Apo-2 humano puede obtenerse convenientemente de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejidos humanos, tales como las bibliotecas de bacteriófagos de ADNc de páncreas y riñón humano descritas en el ejemplo 1. El gen que codifica Apo-2 también se puede obtener de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

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Las bibliotecas se pueden cribar con sondas (tales como anticuerpos para Apo-2 u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o de la biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar, tales como los que se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica Apo-2 es utilizar la metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Un procedimiento de cribado preferido utiliza secuencias de oligonucleótidos seleccionadas para analizar bibliotecas de ADNc de diversos tejidos humanos. El ejemplo 1 que se ofrece a continuación describe técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían tener suficiente longitud y suficientemente inequívocas, de manera que se minimizan los falsos positivos. Preferiblemente, se marca el oligonucleótido de manera que se puede detectar después de la hibridación a ADN en la biblioteca sometida a cribado. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en el estado de la técnica e incluyen el uso de marcadores radioactivos como el ATP marcado con ^{32}P, la biotinilización o el marcado enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y astringencia elevada, se describen en Sambrook et al., supra.

El ácido nucleico que presenta toda la secuencia codificante de la proteína se puede obtener mediante cribado de ADNc seleccionado o de bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión del cebador como los descritos en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesar intermedios de ARNm que es posible que no se transcrito de forma inversa en el ADNc.

Pueden prepararse variantes de Apo-2 mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de Apo-2, o mediante síntesis del polipéptido de Apo-2 deseado. Los expertos en la materia entenderán que los cambios en aminoácidos pueden alterar procesos postraduccionales del Apo-2, tales como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclaje a la membrana.

Las variaciones en el Apo-2 de secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios del Apo-2 descritos en la presente invención pueden realizarse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, una deleción o una inserción de uno o más codones que codifican el Apo-2 que dan lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos del Apo-2 en comparación con el Apo-2 de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de la molécula de Apo-2. Las variaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como mutagénesis mediada por oligonucléotidos (dirigida de sitio), rastreo de alaninas y mutagénesis por PCR. Para producir el ADN de la variante de Apo-2 se pueden realizar sobre el ADN clonado una mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.

El análisis de aminoácidos por rastreo también se puede utilizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que está implicada en la interacción con un ligando o receptor concretos. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos están los aminoácidos pequeños y neutros. Entre dichos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es el aminoácido de rastreo preferido de este grupo, ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. También se prefiere la alanina, ya que es el aminoácido más habitual. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un aminoácido isotérico.

Una vez se han producido las variantes de Apo-2 seleccionadas, se pueden poner en contacto con, por ejemplo, Apo-2L, y se puede determinar la interacción, si es que la hay. La interacción entre la variante de Apo-2 y Apo-2L se puede medir mediante un ensayo in vitro, tal como se describe en los Ejemplos siguientes. Aunque se puede utilizar cualquier cantidad de mediciones analíticas para comparar las actividades y propiedades entre un Apo-2 de secuencia nativa y una variante de Apo-2, una conveniente para la unión es la constante de disociación K_{d} del complejo formado ente la variante de Apo-2 y Apo-2L en comparación con la K_{d} para el Apo-2 de secuencia nativa. Generalmente, un aumento o descenso igual o superior a 3 veces en la K_{d} por residuo sustituido indica que el residuo o residuos sustituidos son activos en la interacción del Apo-2 de secuencia nativa con el Apo-2L.

Opcionalmente, los sitios representativos en la secuencia de Apo-2 adecuada para la mutagénesis incluiría sitios en el dominio extracelular, y particularmente, en uno o ambos dominios ricos en cisteína. Dichas variaciones pueden realizarse utilizando los procedimientos descritos anteriormente.

2. Inserción de un ácido nucleico en un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica Apo-2 se puede insertar en un vector replicable para su posterior clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Varios vectores se hallan disponibles públicamente. Entre los componentes del vector generalmente se incluyen, pero no exclusivamente, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción, cada uno de los cuales se describe a continuación.

(i) El componente secuencia señal

El Apo-2 se puede producir de manera recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio específico de división en el extremo N-terminal de la proteína o el polipéptido maduros. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede formar parte del ADN de Apo-2 que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferiblemente una que sea reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa señal) por la célula huésped. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de las líderes de fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o estables al calor de la enterotoxina II. En el caso de la secreción de levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la líder de la invertasa de levadura, la líder del factor alfa (que incluye las líderes del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en la patente de Estados Unidos 5.010.182), o la líder de la fosfatasa ácida, la líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero la presecuencia nativa de Apo-2 que normalmente dirige la inserción de Apo-2 en la membrana celular de células humanas in vivo es satisfactoria, aunque pueden utilizarse otras secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tal como las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como las líderes de secreción vírica, por ejemplo, la señal de la glucoproteína D del herpes simplex.

El ADN para dicha región precursora se halla preferiblemente unido en el marco de lectura al ADN que codifica Apo-2.

(ii) El componente origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permiten al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es la que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una serie de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para la levadura, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (habitualmente puede utilizarse el origen SV40 porque contiene el promotor temprano).

La mayor parte de los vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicarse en por lo menos una clase de organismos pero se pueden transfectar a otro organismo para su expresión. Por ejemplo, un vector es clonado en E. coli y a continuación el mismo vector es transfectado a células de levaduras o mamíferos para su expresión aunque éste no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El ADN también puede amplificarse mediante la inserción en el genoma del huésped. Esto se consigue fácilmente utilizando la especie Bacillus como huésped, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia hallada en el ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da lugar a una recombinación homóloga con el genoma y la inserción del ADN de Apo-2. No obstante, la recuperación del ADN genómico que codifica Apo-2 es más compleja que la de un vector replicado de manera exógena porque se requiere la digestión con enzimas de restricción para escindir el ADN de Apo-2.

(iii) El componente gen de selección

Los vectores de expresión y clonación habitualmente contienen un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección habituales codifican proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina; (b) complementan deficiencias auxotróficas; o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y, de este modo, sobrevive al régimen de selección. Algunos ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina [Southern et al., J. Molec, Appl. Genet., 1: 327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science, 209: 1.422 (1980)] o higromicina [Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985)]. Los tres ejemplos anteriores utilizan genes bacterianos bajo control eucariota para transferir resistencia a los fármacos apropiados G.418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico de Apo-2, tal como DHFR o timidina quinasa. Los transformantes celulares de mamífero se colocan bajo condiciones de presión de selección a las que sólo los transformantes están adaptados para sobrevivir por haber incorporado el marcador. La presión de selección viene impuesta por el cultivo de los transformantes en condiciones en las que se modifica sucesivamente la concentración del agente de selección en el medio, conduciendo de este modo a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica Apo-2. La amplificación es el proceso mediante el cual los genes con mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento son repetidos en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. A partir del ADN amplificado se sintetizan cantidades mayores de Apo-2. Otros ejemplos de genes amplificables son la metalotioneína I y II, la adenosina desaminasa y la ornitina descarboxilasa.

Las células transformadas con el gen de selección de DHFR se pueden identificar en primer lugar mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo del DHFR. Una célula huésped adecuada cuando se utiliza DHFR natural es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO), que carece de actividad DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.216 (1980). Las células transformadas son expuestas a continuación a mayores niveles de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen de DHFR, y, concomitantemente, a múltiples copias de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica Apo-2. Esta técnica de amplificación puede utilizarse con cualquier otro huésped adecuado, por ejemplo, ATCC N.º CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de DHFR endógena si, por ejemplo, se utiliza un gen de DHFR mutante que es muy resistente a Mtx (EP 117.060).

Alternativamente, las células huésped (en particular los huéspedes naturales que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican Apo-2, la proteína DHFR natural y otro marcador seleccionable, tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), pueden seleccionarse mediante cultivo celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo kanamicina, neomicina, o G418. Véase patente de Estados Unidos 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para utilizar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC N.º 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. La presencia de la alteración en trp1 en el genoma de la célula huésped de la levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De un modo parecido, las cepas de levadura
deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) son complementadas por plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.

Además, pueden utilizarse vectores derivados del plásmido circular pKD1 de 1,6 \mum para la transformación de levaduras de Kluyveromyces [Bianchi et al., Curr, Genet., 12: 185 (1987)]. Más recientemente, se ha descrito un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis [Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990)]. También se han descrito múltiples copias estables de vectores de expresión para la secreción de albúmina sérica humana madura recombinante por cepas industriales de Kluyveromyces [Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)].

(iv) El componente promotor

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y se halla unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de Apo-2. Los promotores son secuencias sin traducir que se localizan en dirección 5' con respecto al codón de inicio de un gen estructural (generalmente en el intervalo de aproximadamente 100 a 1.000 pb) que controlan la transcripción y traducción de una secuencia de ácidos nucleicos concreta, tal como la secuencia de ácidos nucleicos de Apo-2, a la que están unidos operativamente. Dichos promotores habitualmente se clasifican en dos clases: inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician un mayor nivel de transcripción del ADN bajo su control como respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Actualmente se conocen un gran número de promotores reconocidos por una serie de células huésped potenciales. Estos promotores se hallan unidos operativamente a ADN que codifica Apo-2 eliminando el promotor de la fuente de ADN mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia aislada del promotor en el vector. Para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN de Apo-2 puede utilizarse tanto la secuencia nativa del promotor de Apo-2 como muchos de los promotores heterólogos.

Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4.057 (1980); EP 36.776] y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. No obstante, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, lo que permite a un trabajador competente unirlas operativamente al ADN que codifica Apo-2 [Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)] utilizando conectores o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica Apo-2.

Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotas. Casi todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente entre 25 y 30 bases en dirección 5' desde el inicio de la transcripción. Otra secuencia hallada entre 70 y 80 bases en dirección 5' desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayor parte de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para añadir la cola poli A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en los vectores de expresión eucariotas.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizar con huéspedes de levaduras se incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4.900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y
glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de que la transcripción se controla mediante las condiciones del cultivo, son las regiones promotoras del alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, las enzimas degradadoras de la fosfatasa ácida asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables del uso de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en EP 73.657. Los potenciadores de levaduras también se utilizan ventajosamente con promotores de levaduras.

La transcripción de Apo-2 a partir de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus, tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente del Reino Unido 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferiblemente el virus de los simios 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulinas, a partir de promotores del choque térmico y a partir del promotor normalmente asociado con la secuencia de Apo-2, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40 [Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209: 1.422-1.427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7.399-7.402 (1981)]. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E [Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 (1982)]. En la patente de Estados Unidos 4.419.446 se describe un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos que utiliza el virus del papiloma bovino como vector. Una modificación de este sistema se describe en la patente de Estados Unidos 4.601.978 [véase también Gray et al., Nature, 295: 503-508 (1982) relativa a la expresión de ADNc que codifica el interferón inmunitario en células de mono; Reyes et al., Nature, 297: 598-601 (1982) relativa a la expresión de ADNc de interferón \beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5.166-5.170 (1982) relativa a la expresión del gen del interferón humano en células cultivadas de ratón y de conejo; y Gorman et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 79: 6.777-6.781 (1982) relativa a la expresión de secuencias bacterianas CAT en células renales de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células ováricas de hámster chino, células HeLa y células de ratón NIH-3T3 que utilizan como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous].

(v) El componente elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica Apo-2 por eucariotas superiores puede aumentarse mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN de acción cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores tienen una orientación y posición relativamente independientes, habiéndose hallado en posición 5' [Laimins et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 78: 993 (1981)] y 3' [Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3: 1.108 (1983)] con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón [Banerji et al., Cell, 33: 729 (1983)], así como dentro de la propia secuencia codificante [Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4: 1.293 (1984)]. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, no obstante, se utilizará un potenciador de un virus de una célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador SV40 en el extremo tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el extremo tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) sobre potenciación de elementos para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede empalmarse en el vector en la posición 5' o 3' con respecto a la secuencia que codifica Apo-2, pero se localiza preferiblemente en el sitio 5' del promotor.

(vi) El componente finalización de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias se hallan habitualmente disponibles en las regiones sin traducir 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte sin traducir del ARNm que codifica Apo-2.

(vii) Construcción y análisis de vectores

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes mencionados anteriormente utiliza técnicas de ligación estándar. Para generar los plásmidos necesarios los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se dividen, se adaptan y se vuelven a unir en la forma deseada.

Para el análisis de confirmación de las secuencias correctas en plásmidos construidos, pueden utilizarse mezclas de unión para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) y los transformantes satisfactorios seleccionados por la resistencia a ampicilina o tetraciclina si es adecuado. Los plásmidos de los transformantes se preparan, se analizan mediante digestión con una endonucleasa de restricción y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

(viii) Vectores de expresión transitoria

Pueden emplearse vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de ADN de mamíferos que codifican Apo-2. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse de manera eficaz en una célula huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza una concentración elevada de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión [Sambrook et al., supra]. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión y una célula huésped adecuados, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADNs clonados, así como el cribado rápido de dichos polipéptidos para las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De este modo, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles para los propósitos de identificar variantes de Apo-2.

(ix) Ejemplos de vectores celulares vertebrados adecuados

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuados para su adaptación a la síntesis de Apo-2 en un cultivo de células recombinantes de vertebrados se describen en Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058.

3. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención son las células de procariotas, las levaduras, o las células de eucariotas superiores descritas anteriormente. Entre los procariotas adecuados para este propósito se incluyen, pero no exclusivamente, eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican Apo-2. Entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores, Saccharomyces cerevisiae, o levadura común, es el que se utiliza más habitualmente. No obstante, para la presente invención son útiles y están disponibles un conjunto de otros géneros, especies y cepas.

Las células huésped adecuadas para la expresión de Apo-2 glicosilado derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de procesados complejos y actividades de glicosilación. En principio, cualquier cultivo celular de eucariotas superiores sirve, independientemente de si procede de un cultivo de vertebrados o de invertebrados. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variedades de baculovirus y las correspondientes células huésped de insecto facultativas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca del vinagre) y Bombyx mori [véase, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology, 6: 47-55 (1988); Miller et al., en: Genetic Engineering, Setlow et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), págs. 277-279; y Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985)]. Están disponibles públicamente una serie de cepas víricas para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 de un NPV de Autographa californica y cepa Bm-5 de un NPV de Bombyx mori.

Los cultivos celulares vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como huéspedes. Habitualmente, las células vegetales se transfectan mediante incubación con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Durante la incubación del cultivo celular vegetal con A. tumefaciens, se puede transferir el ADN que codifica Apo-2 a la célula vegetal huésped, de manera que se transfecta, y, en las condiciones apropiadas, expresará el ADN que codifica Apo-2. Además, están disponibles secuencias reguladoras y señal compatibles con células vegetales, tales como el promotor de la nopalina sintetasa y las secuencias señal de poliadenilación [Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 (1982)]. Además, los segmentos de ADN aislados de la región en dirección 5' del gen ADN-T 780son capaces de activar o aumentar el nivel de transcripción de los genes expresables en vegetales en el tejido vegetal que contiene el ADN recombinante [EP 321.196 publicada el 21 de junio de 1989].

La propagación de células de vertebrados en un cultivo (cultivo tisular) también es bien conocida en el estado de la técnica [véase, por ejemplo, Tissue Culture. Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)]. Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles se incluyen una línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); una línea de riñón embrionario humano (células 293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células ováricas de hámster chino/DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; y células FS4.

Las células huésped son transfectadas y preferiblemente transformadas con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de Apo-2 y cultivadas en medios de nutrientes convencionales modificados, según sea apropiado, para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección hace referencia a la captación de un vector de expresión por una célula huésped independientemente de que se exprese cualquier secuencia codificante. El experto en la materia conoce numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Generalmente se sabe que la transfección es satisfactoria cuando cualquier indicación de la actividad de este vector tiene lugar dentro de la célula huésped.

Transformación significa introducir ADN en un organismo, de manera que el ADN es replicable, bien como elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook et al., supra, o electroporación se utiliza generalmente para células procariotas u otras células que contienen sustanciales barreras en la pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de determinadas células vegetales, tal como se describe en Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) y en el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Además, las plantas pueden ser transfectadas utilizando un tratamiento de ultrasonidos tal como se describe en el documento WO 91/00358 publicado el 10 de junio de 1991.

En el caso de las células de mamífero sin dichas paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). Los aspectos generales de la transformación de un sistema de células huésped de mamífero se han descrito en la patente de Estados Unidos 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se realizan habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3.829 (1979). No obstante, para introducir ADN a células, también pueden utilizarse otros procedimientos tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas de transformación de células de mamífero, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).

4. Cultivo de las células huésped

Las células procariotas utilizadas para producir Apo-2 se pueden cultivar en medios adecuados tal como se describe en general en Sambrook et al., supra.

Las células huésped de mamífero utilizadas para producir Apo-2 se pueden cultivar en una serie de medios. Entre los ejemplos de medios comercialmente disponibles se incluyen medio F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ("MEM", Sigma), medio RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Cualquiera de dichos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamicina), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos que están habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo de micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas que serían conocidas para los expertos en la materia. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH, y similares, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el técnico en la materia.

En general, los principios, los protocolos y las técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares de mamíferos pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991).

Las células huésped a las que hace referencia en esta descripción comprenden las células del cultivo, así como las células que están dentro de un animal huésped.

5. Detección de la amplificación/expresión génica

La amplificación y/o expresión génicas pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5.201-5.205 (1980)], transferencia en mancha (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, en base a las secuencias proporcionadas en la presente invención. Se pueden utilizar varios marcadores, con mayor frecuencia radioisótopos y en particular ^{32}P. No obstante, también se pueden emplear otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para introducirlos en un polinucleótido. A continuación, la biotina actúa como el sitio de unión a la avidina o a anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como radionucleótidos, fluorescentes o enzimas. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer dobles cadenas específicas, incluyendo dobles cadenas de ADN, dobles cadenas de ARN, y dobles cadenas híbridas de ARN-ADN o dobles cadenas de proteína-ADN. A su vez, los anticuerpos pueden estar marcados y el ensayo puede llevarse a cabo en el lugar donde la doble cadena está unida a la superficie, de manera que tras la formación de la doble cadena en la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido a la doble cadena.

Alternativamente, la expresión génica puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones tisulares y el ensayo de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de un producto génico. Con técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra celular, habitualmente mediante deshidratación y fijación, seguido de reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto génico acoplado, en la que los marcadores suelen ser visualmente detectables, tales como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes o marcadores luminescentes.

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el análisis de fluidos de la muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido Apo-2 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada al ADN de Apo-2 y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

6. Purificación de polipéptido Apo-2

Se pueden recuperar formas de Apo-2 del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si el Apo-2 está unido a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o puede liberarse su región extracelular mediante división enzimática.

Cuando el Apo-2 es producido en una célula recombinante distinta de una célula de origen humano, el Apo-2 carece de proteínas o polipéptidos de origen humano. No obstante, puede desearse purificar Apo-2 de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparados que son sustancialmente homogéneos en relación a Apo-2. En una primera etapa, el medio de cultivo o lisado puede centrifugarse para eliminar residuos de partículas celulares. A continuación, se purifica el Apo-2 de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, y los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amoníaco; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas Sefarosa de proteína A para eliminar contaminantes tales como IgG.

Las variantes de Apo-2 en las que se han eliminado, insertado o sustituido residuos, se pueden recuperar del mismo modo que el Apo-2 de secuencia nativa, teniendo en cuenta los cambios en las propiedades ocasionados por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión de Apo-2 con otra proteína o polipéptido, por ejemplo, un antígeno bacteriano o vírico, secuencia de inmunoglobulina, o secuencia del receptor, puede facilitar la purificación; puede utilizarse una columna de inmunoafinidad que contiene anticuerpo para la secuencia para adsorber el polipéptido de fusión. También se pueden utilizar otros tipos de matrices de afinidad.

Un inhibidor de la proteasa tal como el fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes fortuitos. Un experto en la materia entenderá que los procedimientos de purificación adecuados para Apo-2 de secuencia nativa pueden requerir modificaciones para tener en cuenta cambios en el carácter de Apo-2 o en sus variedades después de la expresión en cultivo celular recombinante.

7. Modificaciones covalentes de polipéptidos Apo-2

Son posibles modificaciones covalentes de Apo-2. Un tipo de modificación covalente del Apo-2 se introduce en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos marcados del Apo-2 con un agente orgánico de derivatización que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos terminales N o C del Apo-2.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular Apo-2 con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua que se utilizará en el procedimiento de purificación de anticuerpos anti-Apo-2, y viceversa. La derivatización con uno o más agentes bifuncionales también será útil para reticular moléculas de Apo-2 para generar dímeros de Apo-2. Dichos dímeros pueden aumentar la avidez de unión y extender la vida media de la molécula in vivo. Entre los agentes de reticulación utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluidos disuccinimidil ésteres tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivatización tales como metil-3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato producen intermedios fotoactivables que son capaces de formar retículas en presencia de luz. Alternativamente, para inmovilizar las proteínas se utilizan matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de Estados Unidos 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537, y 4.330.440.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los residuos correspondientes de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina del extremo N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxílico del extremo C-terminal. Las formas modificadas de los residuos están dentro del alcance de la presente invención.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido Apo-2 comprende alterar el patrón nativo de glicosilación del polipéptido. Para los propósitos de la presente invención, "alterar el patrón de glicosilación nativo" significa eliminar una o más grupos carbohidrato hallados en Apo-2 de secuencia nativa y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el Apo-2 de secuencia nativa.

La glicosilación de polipéptidos se realiza habitualmente mediante unión a N o a O. Unión a N se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un potencial sitio de glicosilación. La glicosilación mediante unión a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidro-
xilamino, más habitualmente serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido Apo-2 puede llevarse a cabo alterando la secuencia de aminoácidos de tal modo que contenga uno o más de las secuencias de tripéptido mencionadas anteriormente (para sitios de glicosilación mediante unión a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en el Apo-2 de secuencia nativa (para sitios de glicosilación mediante unión a O). La secuencia de aminoácidos de Apo-2 puede alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel del ADN, en particular produciendo mutaciones en el ADN que codifica el polipéptido Apo-2 en bases preseleccionadas, de manera que generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. La mutación mutaciones de ADN se pueden realizar utilizando los procedimientos descritos anteriormente y en la patente de EE.UU. US 5.364.934, supra.

Otra forma de aumentar el número de grupos carbohidrato en el polipéptido Apo-2 es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Dependiendo de la modalidad de acoplamiento utilizada, el azúcar o azúcares pueden unirse a: (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de la fenilalanina, la tirosina, o el triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en el documento WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981).

La eliminación de los grupos carbohidrato presentes en el polipéptido Apo-2 puede llevarse a cabo química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican para los residuos de aminoácidos que actúan como dianas para la glicosilación. Por ejemplo, la desglicosilación química mediante exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o a un compuesto equivalente, puede dar lugar a la división de la mayor parte o de todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras el polipéptido permanece intacto. La desglicosilación química está descrita por Hakimuddin et al., Arch, Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La división enzimática de los grupos carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo y exoglucosidasas tal como describen Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).

La glicosilación en potenciales sitios de glicosilación puede prevenirse utilizando el compuesto tunicamicina tal como describen Duskin et al., J. Biol. Chem., 257: 3.105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación de uniones proteína-N-glucósido.

Otro tipo de modificación covalente de Apo-2 comprende unir el polipéptido Apo-2 a uno de una serie de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera establecida anteriormente, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192, o 4.179.337.

8. Quimeras de Apo-2

Se pueden preparar moléculas quiméricas que comprenden Apo-2 fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos.

La molécula quimérica puede comprender una fusión del Apo-2 con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo etiqueta generalmente se coloca en el extremo amino o carboxilo del Apo-2. La presencia de dichas formas etiquetadas en el epítopo del Apo-2 pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión del epítopo etiqueta permite purificar fácilmente el Apo-2 mediante purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una al epítopo etiqueta.

Varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen el polipéptido etiqueta de la gripe HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2.159-2.165 (1988)]; la etiqueta c-myc y sus anticuerpos 8F9,3C7,6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3.610-3.616 (1985)]; y la etiqueta de la glucoproteína D (gD) del virus del herpes simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1.204-1.210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; un péptido epítopo de la \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15.163-15.166 (1991)], y la etiqueta del péptido proteínico del gen 10 del T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6.393-6.397 (1990)]. Una vez se ha seleccionado el polipéptido etiqueta, puede generarse su anticuerpo utilizando las técnicas descritas en la presente invención.

Generalmente, el Apo-2 etiquetado en el epítopo puede construirse y producirse según los procedimientos descritos anteriormente. El Apo-2 etiquetado en el epítopo también se describe en los Ejemplos siguientes. Las fusiones polipéptido etiqueta-Apo-2 se construyen preferiblemente mediante la fusión de la secuencia de ADNc que codifica la parte de Apo-2 en marco con la secuencia de ADN del polipéptido etiqueta y la expresión de la construcción de la fusión de ADN resultante en células huésped apropiadas. Normalmente, cuando se preparan las quimeras polipéptido etiqueta-Apo-2 de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el Apo-2 se fusionará en su extremo 3' con el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal del polipéptido etiqueta; no obstante, las fusiones 5' también son posibles. Por ejemplo, una secuencia de polihistidina de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 residuos de histidina se pueden fusionar al extremo N-terminal o C-terminal y se pueden utilizar como una agarre en la purificación en cromatografía de afinidad.

El Apo-2 etiquetado en el epítopo puede purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo anti-etiqueta. La matriz a la cual se une el anticuerpo de afinidad puede incluir, por ejemplo, agarosa, cristal de poro controlado o poli(estirendivinil)benceno). A continuación, el Apo-2 etiquetado en el epítopo puede eluirse de la columna de afinidad utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica.

La molécula quimérica puede comprender un polipéptido Apo-2 fusionado a una secuencia de inmunoglobulina. La molécula quimérica también puede comprender una secuencia de dominio particular de Apo-2, tal como una secuencia de dominio extracelular de Apo-2, fusionada a una secuencia de inmunoglobulina. Esto incluye quimeras en formas monoméricas, homo- o heteromultiméricas, y particularmente, homo- o heterodiméricas, o tetraméricas; opcionalmente, las quimeras pueden estar en formas diméricas o formas de cadena pesada homodiméricas. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán unidades estructurales conocidas tal y como se representan mediante los siguientes diagramas.

1

1000

Una unidad estructural básica de cuatro cadenas está en la forma en que IgG, IgD e IgE existen. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de peso molecular más elevado; IgM existe generalmente como un pentámero de unidades básicas de cuatro cadenas mantenidas unidas mediante puentes disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden existir en el suero en una forma multimérica. En el caso de multímeros, cada unidad de cuatro cadenas puede ser la misma o diferente.

Los siguientes diagramas representan algunos ejemplos de estructuras de monómeros, homo- y heterodímeros y homo- y heteromultímeros. Estos diagramas son meramente ilustrativos y las cadenas de los multímeros se cree que están unidos por puentes disulfuro de la misma manera que las inmunoglobulinas nativas.

Monómero:

2

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Homodímero:

3

\newpage

Heterodímero:

4

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Homotetrámero:

5

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Heterotetrámero:

6

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y

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7

\newpage

En los diagramas anteriores, "A" significa una secuencia de Apo-2 o una secuencia de Apo-2 fusionada a una secuencia heteróloga; X es un agente adicional, que puede ser el mismo que A o diferente, una parte de un miembro de una superfamilia de las inmunoglobulinas, tal como una región variable o dominio del tipo de región variable, incluyendo una región variable de inmunoglobulina nativa o quimérica, una toxina, tal como una exotoxina de pseudomonas o ricina, o una secuencia que se une funcionalmente a otra proteína, tal como otras citoquinas (es decir, IL-1, interferón-\gamma) o moléculas de la superficie celular (es decir, NGFR, CD40, OX40, antígeno Fas, proteínas T2 de Shope y poxviruses de mixoma), o un agente terapéutico de polipéptido no asociado normalmente con un dominio constante; Y es un enlazador u otra secuencia de receptor; y V_{L}, V_{H}, C_{L} y C_{H} representan dominios variables o constantes de cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina. Se incluyen específicamente las estructuras que comprenden por lo menos un CRD de una secuencia de Apo-2 como "A" y otra proteína de la superficie celular que tiene un patrón repetitivo de CRDs (tal como TNFR) como "X".

Se entenderá que los diagramas anteriores están a modo de ejemplo de las posibles estructuras de las quimeras de la presente invención y no comprenden todas las posibilidades. Por ejemplo, de forma deseable podría haber diversas "A"s, "X"s o "Y"s diferentes en cualquiera de estas construcciones. Además, los dominios constantes de cadena pesada o cadena ligera pueden tener como origen la misma o diferente inmunoglobulina. Todas las posibles permutaciones de las estructuras ilustradas y similares están dentro del alcance de la presente invención.

En general, las moléculas quiméricas se pueden construir de una forma similar a los anticuerpos quiméricos donde un dominio variable de un anticuerpo de una especie se sustituye por el dominio variable de otra especie. Véase, por ejemplo EP 0125023; EP 173,494; Munro, Nature, 312: 597 (13 de diciembre de 1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (13 de diciembre de 1984); Sharon et al., Nature, 309: 364-367 (24 de mayo de 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984); Morrison et al., Science, 229: 1202-1207 (1985); Boulianne et al., Nature, 312: 643-646 (13 de diciembre de 1984); Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature, 339: 68-70 (1989).

Alternativamente, las moléculas quiméricas se pueden construir de la siguiente manera. El ADN que incluye una región que codifica la secuencia deseada, tal como una secuencia de Apo-2 y/o TNFR, se divide mediante un enzima de restricción en l extremo 3' o próximo al mismo del ADN que codifica el dominio o dominios de tipo inmunoglobulina y en un punto en el ADN o próximo al mismo que codifica el extremo N-terminal del polipéptido Apo-2 o TNFR (donde se contempla el uso de una secuencia líder diferente) en la región codificante del extremo N-terminal para TNFR o próximo a la misma (donde se utiliza la señal nativa). A continuación, este fragmento de ADN se inserta fácilmente de forma proximal al ADN que codifica una región constante de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina y, si es necesario, la construcción resultante se adapta mediante mutagénesis de deleción. Preferiblemente, la Ig es una inmunoglobulina humana cuando la molécula quimérica se pretende utilizar para una terapia in vivo para humanos. El ADN que codifica las regiones constantes de cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas es conocido o está fácilmente disponible a partir de bibliotecas de ADNc o se sintetiza. Véase, por ejemplo, Adams et al., Biochemistry, 19: 2711-2719 (1980); Gough et al., Biochemistry, 19: 2702-2710 (1980); Dolby et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 6027-6031 (1980); Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 79: 7862-7865 (1982); Falkner et al., Nature, 298: 286-288 (1982); y Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2: 239-256 (1984).

En las publicaciones que se refieren a la preparación de inmunoadhesinas se encuentran más detalles de cómo preparar dichas fusiones. Las inmunoadhesinas, en general, y las moléculas de fusión CD4-Ig específicamente se describen en el documento WO 89/02922, publicado el 6 de abril de 1989. Las moléculas que comprenden la parte extracelular de CD4, el receptor para el virus de inmunodeficiencia humano (VIH) unido a una región constante de cadena pesada de IgG, son conocidas en el estado de la técnica y se ha observado que tienen una vida media notablemente más larga y un menor aclarado que la parte extracelular soluble de CD4 [[Capon et al., supra; Byrn et al., Nature, 344: 667 (1990)]. La construcción de moléculas quiméricas específicas TNFR-IgG también se describe en Ashkenazi et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991); Lesslauer et al. [J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, página 115 (P 432)]; y Peppel y Beutler, J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, página 118 (P 439)].

B. Usos terapéuticos y no terapéuticos para Apo-2

El Apo-2, tal como se describe en la presente memoria, se puede utilizar terapéuticamente para inducir la apoptosis en células de mamífero. Esta terapia puede realizarse, por ejemplo, utilizando técnicas de terapia génica in vivo o ex vivo e incluye la utilización de las secuencias de dominio de muerte descritas en la presente invención. Las moléculas quiméricas de Apo-2 (incluyendo las moléculas quiméricas que contienen una secuencia de dominio extracelular de Apo-2) que comprenden secuencias de inmunoglobulina también se pueden utilizar terapéuticamente para inhibir la apoptosis o inducción de NF-\kappaB por Apo-2L o por otro ligando al que se une Apo-2.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el Apo-2 pueden utilizarse como diagnóstico para la tipificación específica de tejido. Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos tales como la hibridación in situ, la transferencia Northern y Southern, y el análisis por PCR para determinar si el ADN y/o el ARN que codifica el Apo-2 está presente en el tipo o tipos celular que se evalúan. El ácido nucleico de Apo-2 también será útil para la preparación de Apo-2 mediante técnicas recombinantes descritas en la presente invención.

El Apo-2 aislado puede utilizarse en ensayos de diagnóstico cuantitativo como control frente al cual se pueden preparar muestras que contengan cantidades desconocidas de Apo-2. Los preparados de Apo-2 también también son útiles para generar anticuerpos como referencias en ensayos de Apo-2 (por ejemplo, marcando el Apo-2 para utilizarlo como referencia en un radioinmunoensayo, un ensayo con radiorreceptor, o inmunoensayo unido a enzima), en técnicas de purificación por afinidad, y en ensayos de unión al receptor de tipo competitivo cuando se ha marcado, por ejemplo, con yodo radioactivo, enzimas, o fluoróforos.

Las formas modificadas del Apo-2, tales como las moléculas quiméricas Apo-2-IgG (inmunoadhesinas) descritas anteriormente, se pueden utilizar como inmunógenos en la producción de anticuerpos anti-Apo-2.

Los ácidos nucleicos que codifican Apo-2 o sus formas modificadas también se pueden utilizar para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y el cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual fue introducido en el animal o en un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, en una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que se halla integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. El ADNc que codifica Apo-2 o una secuencia apropiada del mismo (tal como Apo-2-IgG) se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica Apo-2 según las técnicas establecidas y usar las secuencias genómicas para generar animales transgénicos que contengan células que expresen ADN que codifica Apo-2. Los procedimientos para generar animales transgénicos, en particular animales tales como ratones o ratas, han pasado a ser convencionales en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 4.736.866 y 4.870.009. Habitualmente, se identificarían células particulares para la incorporación de un transgén de Apo-2 con potenciadores específicos de tejido. Pueden utilizarse animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica Apo-2 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria, para examinar el efecto del aumento en la expresión de ADN que codifica Apo-2. Dichos animales pueden utilizarse como animales de prueba para reactivos pensados para conferir protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con una apoptosis excesiva. Los animales transgénicos que portan una forma soluble de Apo-2, tal como un ECD de Apo-2 o una quimera de inmunoglobulina de dicha forma podría construirse para probar el efecto de la neutralización crónica de Apo-2L, un ligando de Apo-2.

Alternativamente, se pueden utilizar homólogos no humanos de Apo-2 para construir un animal "knock out" con Apo-2 que presenta un gen defectuoso o alterado que codifica Apo-2 como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica Apo-2 y el ADN genómico alterado que codifica el Apo-2 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica Apo-2 se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica Apo-2 según las técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica Apo-2 se puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para monitorizar la integración. Habitualmente, en el vector se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante sin alterar (ambos en los extremos 5' y 3') [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno [véase por ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)]. A continuación, se inyectan las células seleccionadas en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase por ejemplo, Bradley, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), páginas 113-152]. A continuación, se puede implantar un embrión quimérico en una hembra adoptiva pseudopreñada adecuada y hacer nacer el embrión para crear un animal "knock out". La progenie que alberga el ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los que todas las células del animal contengan el ADN recombinado de forma homóloga. Los animales knockout se pueden caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de defensa contra determinadas enfermedades patológicas y por su desarrollo de enfermedades patológicas debido a la ausencia del polipéptido Apo-2, incluyendo por ejemplo, el desarrollo de tumores.

C. Preparación de anticuerpos anti-Apo-2

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-Apo-2 tal y como se establece en las reivindicaciones. Los anticuerpos contra Apo-2 se pueden preparar tal y como se indica a continuación. Entre los anticuerpos de ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos Apo-2 pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden desarrollar en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido Apo-2 o una proteína de fusión del mismo. Un ejemplo de un agente inmunizante adecuado es una proteína de fusión Apo-2-IgG, tal como una proteína de fusión ECD de Apo-2-IgG. También se pueden utilizar células que expresan Apo-2 en su superficie. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas que se pueden utilizar se incluyen, pero no exclusivamente, a hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. También se puede utilizar un agente de agregación, tal como alumbre para potenciar la respuesta inmunitaria del mamífero. Entre los ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar se incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización se puede seleccionar por un experto en la materia sin una gran experimentación. A continuación, puede sacarse sangre al mamífero y analizar el suero en busca de titulación de anticuerpos. Si se desea, puede volverse a estimular el mamífero hasta que aumente la titulación de anticuerpos o hasta que alcance un nivel constante ("plateaus").

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos Apo-2 pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, supra. En un procedimiento de hibridoma, se inmuniza (tal como se ha descrito anteriormente) habitualmente un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

El agente inmunizante incluirá habitualmente el polipéptido Apo-2 o una proteína de fusión del mismo. Un ejemplo de un agente inmunizante adecuado es una proteína de fusión o molécula quimérica Apo-2-IgG. Un ejemplo específico de un inmunogén ECD de Apo-2-IgG se describe en el siguiente ejemplo 9. También se pueden utilizar células que expresan Apo-2 en su superficie. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PLBs") si se desean células de origen humano, o células de bazo o se utilizan células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia Press, (1986), páginas 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, soportan un nivel de expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas, 51-63].

A continuación, en el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se puede ensayar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra Apo-2. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en el estado de la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede situar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de ningún modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas [Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención, o se pueden sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.

Tal y como se describe en los siguientes ejemplos, se han preparado anticuerpos monoclonales anti-Apo-2. Uno de estos anticuerpos, 3F11.39.7 se ha depositado con la ATCC y se le ha asignado el no. de acceso de depósito HB-12456. En una realización, los anticuerpos monoclonales de la presente invención tendrán las mismas características biológicas que los anticuerpos monoclonales secretados por la línea o líneas de células de hibridoma depositadas bajo el no. de Acceso HB-12456. El término "características biológicas" se utiliza para referirse a las actividades o propiedades in vitro y/o in vivo del anticuerpo monoclonal, tales como la capacidad para unirse específicamente a Apo-2 o para bloquear, inducir o potenciar sustancialmente la activación de Apo-2. Tal y como se describe en la presente memoria, el anticuerpo monoclonal 3F11.39.7 (HB-12456) se caracteriza por tener actividad agonista para inducir la apoptosis, unirse al receptor de Apo-2, tener la actividad de bloqueo según se describe en los siguientes ejemplos y tener cierta reactividad cruzada con DR4, pero no en DcR1 o DcR2. Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal se unirá al mismo epítopo que el anticuerpo 3F11.39.7 descrito en la presente invención. Esto se puede determinar mediante la realización de diversos ensayos, tales como los descritos en la presente invención y en los Ejemplos. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que el anticuerpo 3F11.39.7 descrito específicamente, se puede comparar la actividad en los ensayos de bloqueo de Apo-2 y la inducción de la apoptosis, tales como los descritos en los ejemplos siguientes.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, la digestión se puede realizar con papaína. Algunos ejemplos de digestión con papaína se describen en WO 94/29348 publicada el 22/12/94 y la Patente de Estados Unidos No. 4.342.566. La digestión con papaína de anticuerpos habitualmente produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual Fc. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación al antígeno y que aún es capaz de formar reticulaciones con el antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH_{1}) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH_{1} de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente invención para un Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')_{2} de los anticuerpos originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

3. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos Apo-2 de la presente invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo destinatario) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del destinatario se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo destinatario ni en las secuencias de la CDR o el armazón importados. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de forma óptima también comprenderá por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en el estado de la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo de un origen que es no humano. A estos residuos de aminoácidos no humanos se les hace referencia frecuentemente como residuos "importados", que se adquieren habitualmente de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizarlos en la fabricación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el procedimiento de "ajuste óptimo", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda una biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. A continuación, se acepta la secuencia humana más cercana a la de un roedor como la región de armazón (FR) humana para el anticuerpo humanizado [Sims et al., J. Immunol., 151: 2.296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]. Otro procedimiento utiliza una región de armazón particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede utilizarse la misma región de armazón para diversos anticuerpos humanizados diferentes [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4.285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2.623 (1993)].

Además es importante que los anticuerpos se humanicen conservando una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y de varios productos conceptuales humanizados que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de la inmunoglobulina se encuentran normalmente disponibles y son conocidos por los expertos en la materia. Hay disponibilidad de programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La exploración de estas estructuras permite analizar el probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de la inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de la secuencia de consenso y la secuencia de importación, de modo que se consigue la característica deseada del anticuerpo, tal como un aumento de la afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno [véase, documento WO 94/04679 publicado el 3 de marzo de 1994].

Pueden utilizarse animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. La transferencia de la serie de genes de la inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos después de la estimulación de antígenos [véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 90: 2.551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)].

Los anticuerpos humanos también se pueden producir en bibliotecas de expresión de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cote et al. y Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]. Se han revisado algunos procedimientos adecuados para la preparación de bibliotecas de fagos y se describen en Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12: 433-55 (1994); Soderlind et al., Immunological Reviews, 130: 109-123 (1992); Hoogenboom, Tibtech Febrero 1997, Vol. 15; Neri et al., Cell Biophysics, 27: 47-61 (1995). Las bibliotecas de anticuerpos de cadena única también se pueden preparar mediante los procedimientos descritos en los documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388. Las bibliotecas de anticuerpos también están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Cambridge Antibody Technologies (C.A.T.), Cambridge, Reino Unido.

Tal y como se describe en los siguientes Ejemplos, se han identificado anticuerpos Fv de cadena única (scFv) anti-Apo-2 utilizando una biblioteca de expresión de fagos. Tres de estos anticuerpos, a los que se hace referencia en la presente invención como 16E2, 24C4 y 20E6 se han secuenciado y caracterizado. Las respectivas secuencias de ADN y aminoácidos y regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos se muestran en las figuras 15A-15C y 16. En una realización de la presente invención, los anticuerpos de Apo-2 scFv tendrán las mismas características biológicas que los anticuerpos 16E2, 24C4 o 20E6 identificados en la presente invención. El término "características biológicas" se utiliza para referirse a las actividades o propiedades in vitro y/o in vivo del anticuerpo scFv, tal como la capacidad para unirse específicamente a Apo-2 o para inducir o aumentar sustancialmente la activación de Apo-2. Tal y como se describe en la presente memoria, los anticuerpos 16E2, 24C4 y 20E6 se caracterizan por la unión a Apo-2, por tener actividad agonista para inducir la apoptosis y por no tener reactividad cruzada con DR4 u otras moléculas reconocidas por el ligando de Apo-2. Opcionalmente, el anticuerpo de Apo-2 scFv se unirá al mismo epítopo u epítopos reconocidos por los anticuerpos 16E2, 24C4 y 20E6 descritos en la presente invención. Esto se puede determinar mediante la realización de varios ensayos, tales como los descritos en la presente invención y en los Ejemplos. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo scFv tiene la misma especificidad que los anticuerpos 16E2, 24C4 y 20E6 descritos específicamente, se puede comparar la actividad en los ensayos de inducción de apoptosis, tales como los descritos en los Ejemplos siguientes.

Opcionalmente, los anticuerpos scFv para Apo-2 pueden incluir anticuerpos que contienen una cadena VH y VL que incluyen una o más secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) identificadas en la figura 16 para los anticuerpos 16E2, 20E6 o 24C4.

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidad de unión para por lo menos dos antígenos distintos. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por Apo-2, la otra es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por una proteína de la superficie celular o receptor o una subunidad de receptor.

Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en el estado de la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas ligeras/cadenas pesadas de la inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades distintas [Millstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. A causa de la distribución aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una potencial mezcla de diez moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta normalmente se lleva a cabo mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3.655-3.659 (1991).

Según un enfoque distinto y más preferido, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseada (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de los dominios constantes de la inmunoglobulina. La fusión tiene lugar, preferiblemente, con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, CH2, y las regiones CH3. Se prefiere que tenga la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para unirse a la cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan a un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad a la hora de ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. No obstante, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da lugar a rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen una importancia particular. En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada/cadena ligera de una inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones no deseadas de cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se describe en el documento WO 94/04690 publicado el 3 de marzo de 1994. Para más detalles sobre cómo generar anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario hacia células no deseadas [Patente de Estados Unidos 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [documento WO 91/00360; documento WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que se pueden preparar los anticuerpos in vitro utilizando procedimientos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluidos aquellos que implican agentes reticulantes. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 4.676.980.

6."Triabodies"

Los "triabodies" también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Dichos anticuerpos están descritos por ejemplo en Iliades et al., FEBS Letters, 409: 437-441 (1997) y Korrt et al., Protein Engineering, 10: 423-433 (1997).

7. Otras modificaciones

Se contemplan otras modificaciones de los anticuerpos Apo-2. Por ejemplo, se puede desear modificar los anticuerpos de la presente invención con respecto a la función efectora, con el fin de aumentar la efectividad terapéutica de los anticuerpos. Por ejemplo, se pueden introducir el residuo o residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación en esta región de enlaces disulfuro entre cadenas. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor citólisis mediada por complemento [véase, por ejemplo, Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992); Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos también se pueden preparar utilizando reticulantes heterobifuncionales tal y como se describen en Wolf et al., Cancer research, 53: 2560-2565 (1993). Ghetie et al., Proc. Natl Acad. Sci., 94: 7509-7514 (1997), describen además la preparación de homodímeros IgG-IgG y dan a conocer que dichos homodímeros pueden aumentar la actividad apoptótica en comparación con los monómeros. Alternativamente, los anticuerpos se pueden diseñar para que tengan regiones Fc duales [véase, Stevenson et al., AntiCancer Drug design, 3: 219-230 (1989)].

Se puede desear la modificación de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente invención. Las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad scFv o enlazadoras (tal como se muestra en la figura 16) se pueden modificar, por ejemplo, para modular las actividades biológicas de estos anticuerpos. Las variaciones en la secuencia scFv de longitud completa o en varios dominios de las moléculas scFv descritos en la presente invención se pueden realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican una scFv que da lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos de scFv en comparación con scFv de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de la molécula scFv. Las variaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como mutagénesis mediada por oligonucléotidos (dirigida de sitio), rastreo de alaninas y mutagénesis por PCR. Para producir el ADN de la variante scFv se pueden realizar sobre el ADN clonado una mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas.

Los anticuerpos se pueden opcionalmente unir covalentemente o conjugarse a uno o más grupos químicos. Un poliol, por ejemplo, se pueden conjugar a una molécula de anticuerpo en uno o más residuos de aminoácidos, incluyendo residuos de lisina tal y como se describe en WO 93/00109. Opcionalmente, el poliol es un poli (alquilenglicol), tal como poli (etilenglicol) (PEG), aunque, otros expertos en la materia saben que se pueden utilizar otros polioles, tales como, por ejemplo, poli (propilenglicol) y copolímeros polietileno-polipropilenglicol utilizando técnicas para conjugar PEG a polipéptidos. Se han descrito un conjunto de procedimientos para incorporar PEG a polipéptidos. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 4.179.337 que describe la conjugación de un conjunto de hormonas y enzimas a PEG y propilenglicol para producir composiciones fisiológicamente activas que tienen inmunogenicidades reducidas.

Los anticuerpos también se pueden fusionar o unir a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heteróloga, tal como una etiqueta epítopo. Los polipéptidos etiquetas epítopo y procedimientos para su utilización se describen anteriormente en la Sección A, párrafo 8. Cualquiera de las etiquetas descritas en la presente invención pueden estar unidas a los anticuerpos. Los Ejemplos siguientes, por ejemplo, describen anticuerpos de cadena única etiquetados con His y gD.

D. Usos terapéuticos para anticuerpos de Apo-2

Los anticuerpos de Apo-2 de la presente invención tienen utilidad terapéutica. Los anticuerpos de Apo-2 agonistas, por ejemplo, se pueden utilizar para activar o estimular la apoptosis en células de cáncer. Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos para tratar el cáncer utilizando dichos anticuerpos Apo-2. Naturalmente, se contempla que los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar combinados con otras técnicas terapéuticas tales como la cirugía.

El agonista se administra preferiblemente al mamífero en un portador. Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo et al. Habitualmente, en la formulación se utiliza una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para que la formulación sea isotónica. Entre los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Algunos portadores adicionales incluyen preparados de liberación controlada, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el agonista, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Para los expertos en la materia será evidente que determinados portadores pueden ser más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración de agonista que se administra.

El anticuerpo agonista puede administrarse al mamífero mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular), o mediante otros procedimientos, tales como infusión, que aseguran su liberación al torrente circulatorio de manera eficaz. El agonista también se puede administrar mediante las vías intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional para ejercer efectos terapéuticos locales, así como sistémicos. Se prefiere la inyección local o intravenosa.

Se pueden determinar empíricamente dosificaciones y pautas eficaces para la administración del anticuerpo agonista, y hacer tales determinaciones forma parte de la experiencia en la materia. Los expertos en la materia entenderán que la dosificación de agonista que debe administrarse variará dependiendo, por ejemplo, del mamífero que recibirá el agonista, la vía de administración, el tipo particular de agonista utilizado y otros fármacos que se administran al mamífero. Las directrices para seleccionar las dosis apropiadas para los anticuerpos agonistas se encuentran en la literatura en los usos terapéuticos de los anticuerpos, por ejemplo, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985), capítulo 22 y páginas 303-357; Smith et al, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, Nueva York (1977), páginas 365-389. Una dosificación diaria habitual del agonista utilizado solo podría variar entre aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

El anticuerpo agonista también se puede administrar al mamífero combinado con cantidades eficaces de uno o más agentes terapéuticos o conjuntamente con tratamiento de radiación. Entre los agentes contemplados se incluyen agentes quimioterapéuticos, así como inmunoadyuvantes y citoquinas. Entre las quimioterapias contempladas por la presente invención se incluyen sustancias químicas o fármacos que son conocidos en el estado de la técnica y que se hallan comercialmente disponibles, tales como doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxol, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina y carboplatino. El agonista se puede administrar de manera secuencial o simultáneamente con uno o más de otros agentes terapéuticos. Las cantidades de agonista y agente terapéutico dependerán, por ejemplo, de qué tipo de fármacos se utilizan, el cáncer de tratamiento, y las pautas y vías de administración, pero, en general, serían inferiores que si se utilizaran individualmente.

Después de la administración de agonista al mamífero, el cáncer del mamífero y la condición psicológica se puede seguir de varias maneras conocidas para un profesional en la materia. Por ejemplo, la masa tumoral se puede observar físicamente o mediante técnicas de imagen por rayos X estándar.

Los anticuerpos de Apo-2 de la presente invención pueden ser útiles en el aumento de la muerte celular inducida por el sistema inmune de células que expresan Apo-2, por ejemplo, a través de la fijación de complemento o ADCC. Alternativamente, los anticuerpos antagonistas se pueden utilizar para bloquear la apoptosis excesiva (por ejemplo, en una enfermedad neurodegenerativa) o para bloquear los potenciales efectos autoinmunes/inflamatorios de Apo-2 resultante de la activación de NF-\kappaB. Dichos anticuerpos antagonistas se pueden utilizar según los procedimientos terapéuticos y técnicas descritas anteriormente.

E. Usos no terapéuticos de los anticuerpos de Apo-2

Los anticuerpos de Apo-2 se pueden utilizar también en ensayos de diagnóstico para el Apo-2, por ejemplo, la detección de su expresión en células, tejidos, o suero específicos. Se pueden utilizar diversas técnicas de ensayos diagnósticos conocidas en el estado de la técnica, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos "sandwich" directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas o en fases homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) páginas 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos diagnósticos pueden estar marcados con una parte detectable. La parte detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la parte detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Para conjugar el anticuerpo con la parte detectable se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica, incluidos aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:
1.014 (1974); Pain et al., J. Immunol, Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982).

Los anticuerpos de Apo-2 también son útiles para la purificación por afinidad de Apo-2 de un cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este proceso, se inmovilizan los anticuerpos contra Apo-2 en un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o un papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el Apo-2 a purificar, y después se limpia el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra excepto el Apo-2 que está unido al anticuerpo inmovilizado. Por último, se lava el soporte con otro disolvente adecuado que liberará el Apo-2 del anticuerpo.

F. Kits que contienen Apo-2 o anticuerpos de Apo-2

Se proporcionan artículos de fabricación y kits que contienen Apo-2 o anticuerpos de Apo-2 que se pueden utilizar, por ejemplo, para las aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas descritas anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente con una etiqueta. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados de una serie de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que incluye un agente activo que es eficaz para aplicaciones terapéuticas y no terapéuticas, tales como las descritas anteriormente. El agente activo en la composición es Apo-2 o un anticuerpo de Apo-2. La etiqueta en el recipiente indica que la composición se utiliza para una terapia o aplicación no terapéutica específicas y también puede indicar directrices para el uso in vivo o in vitro, tales como las descritas anteriormente.

El kit comprenderá habitualmente el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos del envase con las instrucciones de uso.

Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con propósitos ilustrativos y no pretenden de ningún modo limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Todas las enzimas de restricción a las que se hace referencia en los ejemplos se obtuvieron de New England Biolabs y se utilizaron según las instrucciones del fabricante. Todos los demás reactivos comercialmente disponibles a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron según las instrucciones del fabricante a no ser que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la memoria, por los números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc que codifica Apo-2 humano

Se buscaron en bases de datos de ADN de etiquetas de secuencias expresadas (EST) (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) y se identificó una EST que mostraba homología con el dominio de muerte del receptor de Apo-3 [Marsters et al., Curr. Biol. 6: 750 (1996)]. Se unieron bibliotecas de ADNc de bacteriófagos Igt10 de páncreas y rinón humanos (ambos adquiridos en Clontech) en vectores pRK5 tal como se indica a continuación. Se añadieron juntos los reactivos y se incubaron a 16ºC durante 16 horas: 5X tampón de T4 ligasa (3 ml); vector pRK5 digerido con Xho1, Not1, 0,5 mg, 1 ml); ADNc (5 ml) y agua destilada (6 ml). Posteriormente, se añadieron agua destilada adicional (70 ml) y 10 mg/ml de ARNt (0,1 ml) y se extrajo la reacción completa mediante fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1). Se extrajo la fase acuosa, se recogió y se diluyó en NaCl 5 M (10 ml) y etanol absoluto (-20ºC, 250 ml). A continuación, se centrifugó durante 20 minutos a 14.000 x g, se decantó y los pélets se resuspendieron en etanol al 70% (0,5 ml) y se centrifugó de nuevo durante 2 minutos a 14.000 x g. A continuación, el pélet de ADN se secó en un "speedvac" y se eluyó en agua destilada (3 ml) para utilizar en el siguiente procedimiento.

El ADN del ADNc ligado/vector pRK5 preparado previamente se enfrió sobre hielo al que se añadió bacterias DH10B electrocompetentes (Life Tech, 20 ml). A continuación, la mezcla de vector con bacterias se electroporó según la recomendación de los fabricantes. Posteriormente, se añadió medio SOC (1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. A continuación, los transformantes se emplacaron en placas LB de 150 mm de estándar 20 que contenían ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37ºC) para permitir el crecimiento de las colonias. A continuación, las colonias positivas se rascaron y se aisló el ADN del pélet bacteriano utilizando protocolos de gradiente Cs-Cl.

A continuación, se construyó una biblioteca rica en 5'-ADNc para obtener una parte de fragmentos de ADNc que preferencialmente representa los extremos 5' de los ADNc contenidos en la biblioteca. Se combinaron 10 mg de la agrupación de ADN plásmido aislado de biblioteca de longitud completa (41 ml) con el tampón de restricción Not1 (New England Biolabs, 5 ml) y Not1 (New England Biolabs, 4 ml) y se incubaron a 37ºC durante una hora. La reacción se extrajo mediante fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1, 50 ml), se extrajo la fase acuosa, se recogió y se diluyó en NaCl 5 M (5 ml) y etanol absoluto (-20ºC, 150 ml). A continuación, se centrifugó durante 20 minutos a 14.000 x g, se decantó y se resuspendió en etanol al 70% (0,5 ml) y se centrifugó de nuevo durante 2 minutos a 14.000 x g. A continuación, se extrajo el sobrenadante, el pélet se secó en un "speedvac" y se resuspendió en agua destilada (10 ml).

Se mezclaron los siguientes reactivos y se incubaron a 37ºC durante 2 horas: agua destilada (3 ml); biblioteca de ADN linealizado (1 mg, 1 ml); mezcla de ribonucleótidos (Invitrogen, 10 ml); tampón de transcripción (Invitrogen, 2 ml) y mezcla de enzimas Sp6. A continuación, la reacción se extrajo mediante fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1, 50 ml) y la fase acuosa se extrajo, se recogió y se resuspendió en NaCl 5 M (5 ml) y etanol absoluto (-20ºC, 150 ml) y se centrifugó durante 20 minutos a 14.000 x g. A continuación, el pélet se decantó y se resuspendió en etanol al 70% (0,5 ml), se centrifugó de nuevo durante 2 minutos a 14.000 x g, se decantó, se secó en un "speedvac" y se resuspendió en agua destilada (10 ml).

Se mezclaron los siguientes reactivos y se incubaron a 16ºC durante 16 horas: 5X tampón de T4 ligasa (Life Tech., 3 ml); vector pRK5 digerido con Cla-Sal, 0,5 mg, 1 ml); ADNc (5 ml); agua destilada (6 ml). Posteriormente, se añadieron agua destilada adicional (70 ml) y 10 mg/ml de ARNt (0,1 ml) y se extrajo la reacción completa mediante fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1, 100 ml). Se extrajo la fase acuosa, se recogió y se diluyó en NaCl 5 M (10 ml) y etanol absoluto (-20ºC, 250 ml) y se centrifugó durante 20 minutos a 14.000 x g. El pélet de ADN se decantó, se resuspendió en etanol al 70% (0,5 ml) y se centrifugó de nuevo durante 2 minutos a 14.000 x g. Se extrajo el sobrenadante y el pélet de residuo se secó en un "speedvac" y se resuspendió en agua destilada (3 ml). El ADN del ADNc ligado/vector pSST-amy.1 se enfrió sobre hielo al que se añadió bacterias DH10B electrocompetentes (Life Tech, 20 ml). A continuación, la mezcla de vector con bacterias se electroporó según la recomendación del fabricante. Posteriormente, se añadió medio SOC (Life Tech., 1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. A continuación, los transformantes se emplacaron en placas LB de 150 mm de estándar 20 que contenían ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37ºC). Las colonias positivas se rascaron de las placas y se aisló el ADN del pélet bacteriano utilizando protocolos estándar, por ejemplo, de gradiente Cs-Cl.

Las bibliotecas de ADNc se cribaron mediante hibridación con una sonda de oligonucleótidos sintética: GGGAGCCGCTCATGAGGAAGTTGGGCCTCATGGACAATGAGATAAAGGTGGCTAAAGCTGAGGCAGC GGG
(SEC ID No: 3) basada en la EST.

Se secuenciaron tres clones de ADNc en su totalidad. Las regiones codificantes solapantes de los ADNc eran idénticas a excepción del codón 410 (utilizando el sistema de numeración para la figura 1); esta posición codificaba un residuo de leucina (TTG) en ambos ADNc pancreáticos, y un residuo de metionina (ATG) en el ADNc de riñón, posiblemente debido a un polimorfismo.

La secuencia completa de nucleótidos de Apo-2 se muestra en la figura 1 (SEC ID No: 2). El clon 27868 (al que también se hace referencia como pRK5-Apo-2 depositado como ATCC 209021, tal como se indica a continuación) contiene un único marco de lectura abierto con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de nucleótidos 140-142 [Kozak, et al., supra] y de finalización en el codón de parada hallado en las posiciones de nucleótidos 1373-1375 (figura 1; SEC Id No: 2). El precursor del polipéptido previsto tiene 411 aminoácidos de largo, una proteína transmembrana de tipo I, y tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 45 kDa. El análisis de hidropatía (no mostrado) sugirió la presencia de una secuencia señal (residuos 1-53), seguida por un dominio extracelular (residuos 54-182), un dominio transmembrana (residuos 183-208) y un dominio intracelular (residuos 209-411) (figura 2A; SEC ID No: 1). El análisis N-terminal de las secuencias de aminoácidos de Apo-2-IgG expresadas en células 293 mostró que el polipéptido maduro empieza en el residuo de aminoácido 54, indicando que la secuencia señal real comprende los residuos 1-53. El polipéptido Apo-2 se obtiene o es obtenible mediante la expresión de la molécula codificada por el inserto de ADNc del vector ATCC 209021 depositado.

Las proteínas de la familia de receptores de TNF se caracterizan habitualmente por la presencia de múltiples (habitualmente cuatro) dominios ricos en cisteína en sus regiones extracelulares - teniendo cada dominio rico en cisteína aproximadamente 45 aminoácidos de largo y conteniendo aproximadamente 6 residuos de cisteína, espaciados de forma regular. En base a la estructura cristalina del receptor de TNF de tipo 1, las cisteínas de cada dominio forman habitualmente tres enlaces disulfuro en los que habitualmente las cisteínas 1 y 2, 3 y 5, y 4 y 6 están emparejadas. Al igual que DR4, Apo-2 contiene dos pseudorepeticiones ricos en cisteínas extracelulares (figura 2A), mientras que otros miembros de la familia de TNF de mamífero identificados contienen tres o más de dichos dominios [Smith et al., Cell, 76: 959 (1994)].

La región citoplasmática de Apo-2 contiene un dominio de muerte (residuos de aminoácidos 324-391 mostrados en la figura 1; véase también la figura 2A) que muestra significativamente más identidad en la secuencia de aminoácidos con el dominio de muerte de DR4 (64%) que el dominio de muerte de TNFR1 (30-%); CD95 (19%); o Apo-3/DR3 (29%) (figura 2B). Cuatro de los seis aminoácidos del dominio de muerte que son necesarios para la señalización por TNFR1 [Tartaglia et al., supra] se conservan en Apo-2, mientras que los otros dos residuos se semiconservan (véase la figura 2B).

En base al análisis de alineación (utilizando el programa informático ALIGN^{TM}) de la secuencia de longitud completa, Apo-2 muestra más identidad en la secuencia con DR4 (55%) que los otros receptores unidos a apoptosis, tales como TNFR1 (19%); CD95 (17%); o Apo-3 (al que también se ha ce referencia como DR3, WSL-1 o TRAMP) (29%).

Ejemplo 2 A. Expresión de ECD de Apo-2

Se preparó una construcción de fusión de dominio extracelular (ECD) soluble. Se obtuvo un ECD de Apo-2 (residuos de aminoácidos 1-84 mostrados en la figura 1) mediante PCR y se fusionó a una etiqueta epítopo Flag C-terminal (Sigma). La construcción de ECD de Apo-2 incluía los residuos 183 y 184 mostrados en la figura 1 para proporcionar flexibilidad en la unión, aunque los residuos 183 y 184 se prevé que estén en la región transmembrana). A continuación, la molécula etiquetada con epítopo Flag se insertó en pRK5 y se expresó mediante transfección transitoria en células 293 humanas (ATCC CRl 1573).

Después de una incubación de 48 horas, los sobrenadantes de células se recogieron y se utilizaron directamente para estudios de coprecipitación (véase el ejemplo 3) o se sometieron a purificación del ECD con Flag de Apo-2 mediante cromatografía de afinidad sobre gránulos de agarosa anti-Flag, según las instrucciones del fabricante (Sigma).

B. Expresión de ECD de Apo-2 como Inmunoadhesina

Se preparó una construcción de inmunoadhesina con ECD de Apo-2. El ECD de Apo-2 (aminoácidos 1-184 mostrados en la figura 1) se fusionó a la región bisagra y Fc de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana G_{1} en pRK5 tal y como se ha descrito anteriormente [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991)]. La inmunoadhesina se expresó mediante transfección transitoria en células 293 y se purificó de sobrenadantes celulares mediante cromatografía de afinidad de proteína A, tal y como se ha descrito por Ashkenazi et al., supra.

Ejemplo 3 Ensayo de inmunoprecipitación que muestra la interacción de unión entre Apo-2 y ligando de Apo-2

Para determinar si Apo-2 y Apo-2L interaccionan o se asocian entre sí, se incubaron los sobrenadantes de células 293 transfectadas con mock o de células 293 transfectadas con ECD con Flag de Apo-2 (descrito en el ejemplo 2 anterior) (5 ml) con 5 \mug de APO-2L soluble etiquetado con poli-histidina [Pitti et al., supra] durante 30 minutos a tempe-
ratura ambiente y, a continuación, se analizó para la formación de complejo mediante un ensayo de coprecipitación.

Las muestras se sometieron a inmunopecipitación utilizando 25 \mul de gránulos de agarosa conjugados con anti-Flag (Sigma) o gránulos de agarosa conjugados con níquel (Qiagen). Después de una incubación de 1,5 horas a 4ºC, se centrifugaron los gránulos y se lavaron cuatro veces en tampón fosfato salino (PBS). Mediante la utilización de agarosa anti-Flag, el Apo-2L se precipitó mediante ECD de Apo-2 etiquetado con Flag; mediante la utilización con níquel-agarosa, el ECD de Apo-2 se precipitó mediante el Apo-2L etiquetado con His. Las proteínas precipitadas se liberaron mediante la ebullición de las perlas durante 5 minutos en tampón SDS-PAGE, se separaron mediante eletroforesis en geles de poliacrilamida al 12% y, a continuación, se detectaron mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-Apo-2L o anti-Flag (2 \mug/ml) según se ha descrito en Marsters et al., J. Biol. Chem. (1997).

Los resultados mostrados en la figura 3 indican que el ECD de Apo-2 y Apo-2L se pueden asociar entre sí.

La interacción de unión se analizó posteriormente mediante purificación del ECD de Apo-2L de los sobrenadantes de células 293 transfectadas con gránulos anti-Flag (véase ejemplo 2) y, a continuación, el análisis de las muestras en un instrumento BIACORE^{TM}. El análisis con BIACORE^{TM} indicó una constante de disociación (K_{d}) de aproximadamente 1 nM. El análisis con BIACORE^{TM} también mostró que el ECD de Apo-2 no es capaz de unirse a otros miembros de la familia de TNF inductores de apoptosis, concretamente TNF-alfa (Genentech, Inc., Pennica et al., Nature, 312: 712 (1984), linfotoxina-alfa (Genentech, Inc) o ligando Fas/Apo-1 (Alexis Biochemicals). De este modo, los datos muestran que el Apo-2 es un receptor específico para Apo-2L.

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Ejemplo 4 Inducción de apoptosis por Apo-2

Dado que los dominios de muerte pueden actuar como zona interfacial de oligomerización, la sobreexpresión de receptores que contienen dominios de muerte puede conducir a la activación de la señalización en ausencia de ligando [Frazer et al., supra, Nagat et al., supra]. Para determinar si Apo-2 era capaz de inducir la muerte celular, se transfectaron transitoriamente células 293 o células HeLa humanas (ATCC CCl 2.2) mediante precipitación con fosfato de calcio (células 293) o electroporación (células HeLa) con un vector pRK5 o plásmidos basados en pRK5 que codifican Apo-2 y/o CrmA. Cuando es aplicable, la cantidad total de ADN de plásmido se ajustó mediante la adición ADN del vector. La apoptosis se evaluó 24 horas después de la transfección mediante morfología (figura 4A); fragmentación del ADN (figura 4B); o mediante análisis FACS de exposición a fosfatidilserina (figura 4C) tal y como se ha descrito en Marsters et al., Curr. Biol., 6: 1669 (1996). Tal y como se muestra en las figuras 4A y 4B, las células 293 transfectadas con Apo-2 experimentaron una notable apoptosis.

Para muestras ensayadas mediante FACS, las células HeLa se cotransfectaron con pRK5-CD4 como marcador para la transfección y se determinó la apoptosis en células que expresaban CD4; FADD se cotransfectó con el plásmido de Apo-2; los datos son la media \pm SEM de por los menos tres experimentos, tal y como se ha descrito en Marsters et al., Curr. Biol., 6: 1669 (1996). Los inhibidores de caspasa, DEVD-fmk (Enzyma Systems) o z-VAD-fmk (Research Biochemicals, Intl.) se añadieron en 200 \muM en el momento de la transfección. Tal y como se muestra en la figura 4C, los inhibidores de caspasa CrmA, DEVD-fmk y z-VAD-fmk bloquearon la inducción de apoptosis por Apo-2, indicando la implicación de proteasas del tipo Ced-3 en esta respuesta.

FADD es una proteína adaptadora que media en la activación de la apoptosis por CD95, TNFR1 y Apo-3/DR3 [Nagata et al. supra], pero no parece necesaria para la inducción de la apoptosis por Apo-2L [Marsters et al., supra] o por DR4 [Pan et al., supra]. Una forma mutante dominante negativa de FADD, que bloquea la inducción de la apoptosis por CD95, TNFR1 o Apo-3/DR3 [Frazer et al. supra; Nagata et al. supra; Chinnayian et al. supra] no inhibió la inducción de la apoptosis por Apo-2 cuando se se transfectó en células HeLa con Apo-2 (figura 4C). Estos resultados sugieren que el Apo-2 induce la apoptosis independientemente de FADD. En concordancia con esta conclusión, una proteína de fusión de glutatión-S-transferasa que contenía la región citoplasmática de Apo-2 no se unió in vitro a FADD transcrita y traducida (datos no mostrados).

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Ejemplo 5 Inhibición de la actividad de Apo-2L mediante el ECD de Apo-2 soluble

El Apo-2 soluble (0,5 \mug/ml, preparado tal y como se ha descrito en Pitti et al., supra) se preincubó durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón PBS o ECD de Apo-2 purificado por afinidad (5 \mug/ml) junto con anticuerpo anti-Flag (Sigma) (1 \mug/ml) y se añadió a células HeLa. Después de una incubación durante 5 horas, se analizó la apoptosis de las células mediante FACS (como se ha indicado anteriormente) (figura 4D).

El Apo-2L indujo una apoptosis notable en células HeLa, y el ECD de Apo-2 soluble era capaz de bloquear la acción de Apo-2L (figura 4D), confirmando una interacción específica entre Apo-2L y Apo-2. Se obtuvieron resultados similares con la inmunoadhesina de ECD de Apo-2 (figura 4D). El análisis dosis-respuesta mostró una inhibición semi máxima en aproximadamente 0,3 nM de inmunoadhesina de Apo-2 (figura 4E).

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Ejemplo 6 Activación de NF-\kappaB por Apo-2

Se llevó a cabo un ensayo para determinar si Apo-2 activa a NF-\kappaB.

Se transfectaron células HeLa con plásmidos de expresión pRK5 que codifican la secuencia nativa de longitud completa de Apo-2, DR4 o Apo-3 y se recogieron 24 horas después de la transfección. Se prepararon extractos nucleares y se hizo reaccionar 1 \mug de proteína nuclear con una sonda de oligonucleótidos sintéticos específicos de NF-\kappaB marcados con ^{32}P ATCAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCG (SEC ID No:4) [véase, también, MacKay et al., J. Immunol., 153:5274-5284 (1994)], sola o junto con un exceso de 50 veces la sonda no marcada, o con un oligonucleótido sintético marcado con ^{32}P irrelevante AGGATGGGAAGTGTGTGATATATCCTTGAT (SEC ID No. 5). En algunas muestras, se añadió anticuerpo para subunidades de p65/ReIA de NF-\kappaB (1 \mug/ml; Santa Cruz Biotechnology). Se analizó la unión a ADN mediante un ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética tal y como ha descrito Hsu et al., supra; Masters et al., supra, y MacKay et al., supra.

Los resultados se muestran en la Figura 5. Tal y como se muestra en la Figura 5A, después de la transfección en las células HeLa, tanto Apo-2 como DR4 indujeron una activación de NF-\kappaB significativa tal y como se midió mediante el ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética; el nivel de activación fue comparable a la activación observada para Apo-3/DR3. El anticuerpo para la subunidad p65/ReIA de NF-\kappaB inhibió la movilidad de la sonda NF-\kappaB, implicando a p65 en la respuesta a los 3 receptores.

También se llevó a cabo un ensayo para determinar si la propia Apo-2L puede regular la actividad de NF-\kappaB. Las células HeLa o las células MCF7 (línea celular de adenocarcinoma de mama humana, ATCC HTB 22) se trataron con tampón de PBS, Apo-2L soluble (Pitti et al., supra) o el TNF-alfa (Genentech, Inc., ver Pennica et al.; Nature, 312:721 (1984)) (1 \mug/ml) y se analizó la actividad de NF-\kappaB tal y como se hizo anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 5B. Apo-2L indujo una activación de NF-\kappaB significativa en las células HeLa tratadas pero no en las células MCF7; el TNF-alfa indujo una activación más pronunciada en ambas líneas celulares. Diversos estudios han revelado que la activación de NF-\kappaB por TNF puede proteger a las células contra la apoptosis inducida por TNF [Nagata, supra].

También se analizaron los efectos de un inhibidor de NF-\kappaB, ALLN (N-acetil-Leu-Leu-norleucinal) y un inhibidor de la trascripción, la ciclohexamida. Las células HeLa (emplacadas en placas de 6 pocillos) se preincubaron con tampón de PBS, ALLN (Calbiochem) (40 \mug/ml) o ciclohexamida (Sigma) (50 \mug/ml) durante 1 hora antes de añadir Apo-2L (1 \mug/ml). Tras una incubación de 5 horas, se analizó la apoptosis mediante FACS (ver Figura 5C).

Los resultados se muestran en la Figura 5C. Tanto ALLN como la ciclohexamida incrementaron el nivel de apoptosis inducida por Apo-2L en las células HeLa. Los datos indican que Apo-2L puede inducir a genes protectores dependientes de NF-\kappaB. Los datos también indican que Apo-2L es capaz de activar el NF-\kappaB en ciertas líneas de células y que tanto Apo-2 como DR4 pueden mediar en esa función.

Ejemplo 7 Expresión de Apo-2 en tejidos de mamíferos A. Análisis de transferencia Northern

La expresión de ARNm de Apo-2 en tejidos humanos se examinó mediante análisis de transferencia Northern. Las transferencias de ARN humano se hibridaron a una sonda de ADN marcado con ^{32}P de 4,6 kilobases basado en el ADNc de Apo-2 de longitud completa; la sonda se generó mediante la digestión del plásmido pRK5-Apo-2 con EcoRI. La transferencias de ARN fetal humano MTN (Clontech), la transferencias de ARN adulto humano MTN-II (Clontech) y la transferencias de ARN de la línea celular de cáncer humano (Clontech) se incubaron con las sondas de ADN. Las transferencias se incubaron con las sondas en tampón de hibridación (5X SSPE; 2X solución de Denhardt; 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado fragmentado; 50% de formamida; SDS al 2%) durante 60 horas a 42ºC. Las transferencias se lavaron varias veces en 2X SSC; SDS al 0,05% durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de un lavado de 30 minutos en 0,1X SSC; SDS al 0,1% a 50ºC. Las transferencias se desarrollaron después de la exposición durante toda la noche.

Tal y como se muestra en la figura 6A, se detectó un transcrito de ARNm predominante de aproximadamente 4,6 kb en múltiples tejidos. La expresión fue relativamente elevada en hígado y pulmón fetal y humano y en ovario y leucocitos de sangre periférica (PBL) adultos, mientras que no se detectó expresión de ARNm en cerebro fetal y adulto. Se observaron niveles intermedios de expresión en colon, intestino delgado, testículos, próstata, timo, páncreas, riñón, músculo esquelético, placenta y corazón adultos. Se ha observado previamente que diversos tejidos adultos que expresan Apo-2, por ejemplo, PBL, ovario y bazo expresan DR4 [Pan et al., supra], aunque, los niveles relativos de expresión de cada ARNm de receptor parecen ser diferentes.

Tal y como se muestra en la figura 6B, el ARNm de Apo-2 se expresó de forma relativamente elevada en 6 de 8 líneas de células cancerígenas humanas examinadas, concretamente, leucemia promielocítica HL60, carcinoma cervical S3 de HeLa, leucemia mielógena crónica K562, adenocarcinoma colorrectal SW 480, carcinoma de pulmón A549 y melanoma G361. También hubo una expresión detectable en células de linfoma de Burkitt (Raji). De este modo, Apo-2 puede ser útil como diana para inducir la apoptosis en células de cáncer de linfoide así como tumores que no son de linfoides.

B. Hibridación in situ

La expresión de Apo-2 en tejidos humanos normales y cancerosos se examinó mediante hibridación in situ. Además, se examinó la expresión de Apo-2 en diversos tejidos diferentes de monos rhesus y chimpancé. Entre estos tejidos se incluyen: tejidos fetales humanos (semanas E12-E16) - placenta, cordón umbilical, hígado, riñón, glándula adrenal, tiroides, pulmón, corazón, vasos grandes, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro, ojo, médula espinal, pared corporal, pelvis y limbo inferior; tejidos humanos adultos - riñón, vejiga, glándula adrenal, bazo, nódulo linfático, páncreas, pulmón, piel, retina, hígado; tejidos de chimpancé - glándulas salivares, estómago, tiroides, paratiroides, lengua, timo, ovario, nódulo linfático y nervios periféricos; tejidos de mono rhesus - córtex cerebral, hipocampo, cerebelo y pene; tejidos tumorales humanos - adenocarcinoma de pulmón, testículos, carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, fibroadenoma, sarcoma de tejido blando.

Las muestras de tejido se incrustaron en parafina y se seccionaron. Posteriormente, los tejidos seccionados se desparafinaron y los portaobjetos se colocaron en agua. Los portaobjetos se enjuagaron dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente en 2X SSC. Después del enjuage, los portaobjetos se colocaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (en tampón sin ARNasa) durante 15 minutos a 37ºC (para tejidos fetales) o 8X proteinasa K durante 30 minutos a 37ºC (para tejidos en formalina). A continuación, los portaobjetos se enjuagaron de nuevo en 0,5X SSC y se deshidrataron. Antes de la hibridación, los portaobjetos se colocaron en una caja de plástico recubierta de papel de filtro saturado con tampón (4X SSC, formamida al 50%). Los tejidos se cubrieron con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano más 6 ml de agua; se centrifugó y calentó durante 2 minutos; se enfrió sobre hielo y se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml 20X SSC y 9 ml de agua) y se incubaron a 42ºC durante 1 a 4 horas.

La hibridación se realizó utilizando una sonda marcada con ^{32}P que consistía en los oligonucleótidos 706-1259 de la SEC ID No: 2. La sonda se añadió a los portaobjetos en el tampón de hibridación y se incubó durante toda la noche a 55ºC. A continuación, se realizaron múltiples etapas de lavado de forma secuencial tal como se indica a continuación: dos veces durante 10 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC, tampón de EDTA (400 ml de 20X SSC, 16 ml de EDTA 0,25 M); una vez durante 30 minutos a 37ºC en 20 \mug/ml de ARNasa A; dos veces durante 10 minutos a temperatura ambiente en 0,5X SSC, tampón de EDTA; una vez cada dos horas a 55ºC en 0,1XSSC, tampón de EDTA; dos veces durante 10 minutos a temperatura ambiente en 0,5X SSC. La deshidratación se llevó a cabo durante 2 minutos cada vez con EtOH al 50%, 70%, 90% que contenía NH_{4}Ac 0,3 M. finalmente, los portaobjetos se secaron al aire durante 2 horas y se expusieron a la película.

La expresión de Apo-2 en los tejidos fetales pareció más fuerte sobre hepatocitos del hígado, glomérulos en desarrollo en el riñón, córtex adrenal, y el epitelio del tracto gastrointestinal. Se observó una expresión moderada sobre las células epiteliales del pulmón y en puntos de vascularización de una placa de crecimiento óseo. Se observó un nivel de expresión relativamente bajo sobre las células epiteliales de tiroides y las células de los ventrículos cardíacos. Se observó expresión sobre células de linfoides en la médula del timo, glándulas linfáticas en desarrollo y células de citotrofoblastos de placenta.

Se observó expresión de Apo-2 en tejidos adultos sobre los oocitos restantes en folículos primordiales y niveles bajos sobre células de la granulosa de folículos en desarrollo en ovario de chimpancé. Se observó expresión en hígados cirróticos sobre hepatocitos en el extremo de los nódulos (es decir, área de daño en hígado de adulto normal era negativo). Otros tejidos fueron negativos en la expresión.

En los tejidos de cáncer examinados, se halló expresión de Apo-2 en dos adenocarcinomas de pulmón y dos tumores de células germinales de los testículos. Dos carcinomas de pulmón adicionales (uno escamoso) fueron negativos. Uno de los cinco carcinomas de mama fue positivo (hubo expresión en el tejido de mama normal). En un fibroadenoma, pareció haber expresión sobre ambos elementos epiteliales y estromales. Un sarcoma de tejido blando también fue positivo. Otros tejidos examinados fueron negativos.

Ejemplo 8 Localización cromosómica del gen de Apo-2

La localización cromosómica del gen de Apo-2 humano se examinó mediante un análisis en conjunto de híbridos de radiación (RH). El mapeo de RH se realizó mediante PCR utilizando un panel de híbridos de radiación de células de humano-ratón (Research Genetics) y cebadores basados en la región codificante de ADNc de Apo-2 [Gelb et al., Hum. Genet., 98: 141 (1996)]. El análisis de los datos de la PCR utilizando la Base de Datos del Centro de Genoma Humano de Stanford indica que el Apo-2 está unido al marcador D8S481, con un LOD de 11,05; D8S481 está unido a su vez a D8S2055, que mapea el cromosoma humano 8p21. Un análisis similar de DR4 mostró que DR4 está unido al marcador D8S2127 (con un LOD de 13,00), que también mapea el cromosoma humano 8p21.

Para el conocimiento actual de los Solicitantes, hasta la fecha, ningún otro miembro de la familia de genes de TNFR ha sido localizado en el cromosoma 8.

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Ejemplo 9 Preparación de anticuerpos monoclonales específicos para Apo-2

Se inmunizaron ratones Balb/c (obtenidos de los Laboratorios charles River) mediante la inyección de 0,5 \mug/50 \mul de una proteína de inmunoadhesina de ECD de Apo-2 (diluida en adyuvante MPL-RDM adquirido de Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 11 veces en cada planta de las patas traseras en intervalos de 3-4 días. La proteína de inmunoadhesina de ECD de Apo-2 se generó mediante la fusión de una secuencia de dominio extracelular de Apo-2 (aminoácidos 1-184 mostrados en las figura 1) a la región bisagra y Fc de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana G_{1} en pRK5 tal y como se ha descrito previamente [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991)]. La proteína de inmunoadhesina se expresó mediante la transfección transitoria en células 293 humanas y se purificó a partir de sobrenadantes celulares mediante cromatografía de afinidad con proteína A, tal y como se ha descrito por Ashkenazi et al., supra (Véase también el ejemplo 2B anterior).

Tres días después de la estimulación final, se extrajeron de los ratones los nódulos linfáticos popliteales y se preparó una suspensión de células individuales en medio DMEM (obtenido de Biowhitakker Corp.) complementado con un 1% de penicilina-estreptomicina. A continuación, las células de los nódulos linfáticos se fusionaron con células de mieloma murino P3X63AgU.1 (ATTC CRL 1597) utilizando polietilenglicol al 35% y se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos. Se seleccionaron los hibridomas resultantes de la fusión en medio HAt. Diez después de la fusión, se cribaron los sobrenadantes del cultivo de hibridomas en un ELISA para analizar la presencia de anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína de inmunoadhesina de ECD de Apo-2.

En el ELISA, las placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) se recubrieron mediante la adición de 50 \mul de 2 \mug/ml de Fc de IgG de cabra antihumano (adquirida de Cappel Laboratories) en PBS a cada pocillo y la incubación a 4ºC durante toda la noche. A continuación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (PBS que contenía 0,05% de Tween 20). A continuación, los pocillos de las placas de microtitulación se bloquearon con 50 \mul de albúmina de suero bovino al 2,0% en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, las placas se lavaron de nuevo tres veces con tampón de lavado.

Después de la etapa de lavado, se añadieron 50 \mul de 0,4 \mug/ml de proteína de inmunoadhesina de ECD de Apo-2 (tal y como se ha descrito anteriormente) en un tampón de ensayo a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un aparato de agitación, seguido de tres lavados con tampón de lavado.

Después de las etapas de lavado, se añadieron 100 \mul de los sobrenadantes de hibridoma o anticuerpo purificado (utilizando columnas de proteína A-sefarosa) (1 \mug/ml) a las células designadas en presencia de CD4-IgG. Se añadieron 100 \mul de medio acondicionado con células de mieloma P3X63AgU.1 a otros pocillos designados como controles. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en un aparato de agitación y, a continuación, se hicieron tres lavados con tampón de lavado.

A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de Fc de IgG anti-ratón de cabra conjugada a HRP (adquirido en Cappel Laboratories), diluidos 1:1000 en tampón de ensayo (albúmina de suero bovino al 0,5%, Tween-20 al 0,05%, Thimersol al 0,01% en PBS) y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un aparato de agitación. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado seguido de la adición a cada pocillo de 50 \mul de sustrato (sustrato de peroxidasa en micropocillos de TMB, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición a cada pocillo de 50 \mul de solución de detención de 1 componente en TMB (dietilglicol, Kirkegaard & Perry) y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtitulación automatizado.

De los sobrenadantes de los hibridomas cribados en el ELISA, 22 sobrenadantes dieron positivo (calculado como aproximadamente 4 veces por encima del valor base). Los sobrenadantes que dieron positivo en el ELISA se analizaron posteriormente mediante análisis FACS utilizando células 9D (una línea de células de linfoide B humano que expresa Apo-2; Genentech, Inc.) e IgG de cabra anti-ratón conjugada con FITC. Para este análisis, se añadieron a pocillos de microtitulación con base en forma de U, 25 \mul de células suspendidas (a 4 x 10^{6} células/ml) en tampón clasificador de células (PBS que contiene FCS al 1% y NaN_{3} al 0,02%), se mezclaron con 100 \mul de sobrenadante de cultivo o anticuerpo purificado (purificado en columnas de Proteína A-sefarosa) (10 \mug/ml) en tampón clasificador de células y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. A continuación, las células se lavaron y se incubaron con 100 \mul de IgG de cabra anti-ratón conjugada con FITC durante 30 minutos a 4ºC. A continuación, las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en 150 \mul de tampón clasificador de células y, a continuación, se analizaron mediante FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). El análisis por FACS mostró que 8/22 de los sobrenadantes fueron positivos para anticuerpos anti-Apo-2.

La figura 7 muestra la tinción en FACS de células 9D incubadas con uno de los anticuerpos de Apo-2, al que se hace referencia como 3F11.39.7. Tal y como se muestra en la figura 7, el anticuerpo 3F11.39.7 reconoce el receptor de Apo-2 expresado en células 9D.

Ejemplo 10 Ensayo de la capacidad de Abs de Apo-2 para inducir agonísticamente la apoptosis

Se ensayaron los sobrenadantes de hibridoma y los anticuerpos purificados (tal y como se describe en el Ejemplo 9 anterior) por su actividad para inducir la apoptosis mediada por Apo-2 en las células 9D. Se incubaron las células 9D (5 X 10^{5} células/0,1 ml) con concentraciones variables de anticuerpos en 100 \mul de medio RPMI completo a 4ºC durante 15 minutos. A continuación, se incubaron las células durante 5 minutos a 37ºC y se añadieron a algunas de las muestras de células 10 \mug de anticuerpo Fc de IgC anti-ratón de cabra (Cappel Laboratories) en 300 \mul de RPMI completo. En este punto, se incubaron las células toda la noche a 37ºC en presencia de un 7% de CO_{2}. A continuación, se recogieron las células y se lavaron una vez con PBS. Se determinó la viabilidad de las células mediante la tinción de la unión de FITC-anexina V a fosfatidilserina de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Clontech). Se lavaron las células en PBS y se resuspendieron en 200 \mul de tampón de unión. Se añadieron a las células 10 \mul de anexina-V-FITC (1 \mug/ml) y 10 \mul de yoduro de propidio. Después de la incubación durante 15 minutos en la oscuridad, se analizaron las células 9D mediante FACS.

Tal y como se muestra en la Figura 8, el anticuerpo 3F11.39.7 (en ausencia del Fc de IgG anti-ratón de cabra) indujo la apoptosis en las células 9D en comparación con los anticuerpos de control. Sin embargo, la actividad agonística aumentó mediante la reticulación del receptor de Apo-2 en presencia de Fc de IgG anti-ratón de cabra (ver Figura 9). Esta mayor apoptosis (Figura 9) por la combinación de anticuerpos es comparable con la actividad apoptótica de Apo-2L en células 9D (datos no mostrados).

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Ejemplo 11 Ensayo de la capacidad del anticuerpo para bloquear la apoptosis inducida por el ligando de Apo-2

Se ensayaron los sobrenadantes de hibridoma y los anticuerpos purificados (tal y como se describe en el Ejemplo 9 anterior) por su actividad para bloquear la apoptosis inducida por el ligando de Apo-2 en las células 9D. Se suspendieron las células 9D (5 X 10^{5} células/0,1 ml) en medio RPMI completo (RPMI más FCS al 10%, glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina, piruvato sódico) y se colocaron en tubos Falcon 2052 individuales. A continuación, se incubaron las células con 10 \mug de anticuerpos en 200 \mul de medio durante 15 minutos sobre hielo. Se suspendieron en medio RPMI completo 0,2 ml de ligando de Apo-2 (2,5 \mug/ml) (Apo-2L etiquetado con His soluble preparado tal y como se describe en WO 97/25428; véase también Pitti et al., supra), y a continuación se añadió en los tubos que contenían las células 9D. Se incubaron las células 9D durante la noche a 37ºC y en presencia de un 7% de CO_{2}. A continuación, se recogieron las células incubadas y se lavaron una vez con PBS. Se determinó la viabilidad de las células mediante la tinción de la unión de la FITC-anexina V a fosfatidilserina de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Clontech). De manera específica, se lavaron las células en PBS y se resuspendieron en 200 \mul de tampón de unión. Se añadieron a las células 10 \mul de anexina-V-FITC (1 \mug/ml) y 10 \mul de yoduro de propidio. Después de la incubación durante 15 minutos en la oscuridad, se analizaron las células 9D mediante
FACS.

Los resultados se muestran en la Figura 10. Dado que las células 9D expresan más de un receptor de la Apo-2L, el Apo-2L puede inducir la apoptosis en las células 9D mediante la interacción con Apo-2 o el receptor de DR4. De este modo, para detectar cualquier actividad de bloqueo de los anticuerpos de Apo-2, la interacción entre DR4 y Apo-2L necesitó ser bloqueada. En combinación con el anticuerpo anti-DR4, 4H6.17.8 (ATCC HB-12455), el anticuerpo Apo-2 3F11.39.7 era capaz de bloquear aproximadamente el 50% de la apoptosis inducida por Apo-2L. La actividad apoptótica restante de aproximadamente el 50% se cree que es debida a las actividades agonísticas de estos dos anticuerpos por sí mismos, tal y como se muestra en la figura 10. Por consiguiente, se cree que el anticuerpo 3F11.39.7 es un anticuerpo Apo-2 de bloqueo o un anticuerpo que se une a Apo-2 de un modo que compite con la unión entre el ligando de Apo-2 y Apo-2.

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Ejemplo 12 Ensayo ELISA para analizar la unión de los anticuerpos de Apo-2 a otros receptores de ligandos de Apo-2

Se realizó un ELISA para determinar si el anticuerpo monoclonal descrito en el ejemplo 9 era capaz de unirse a otros receptores de Apo-2L además de Apo-2. Específicamente, se analizó el anticuerpo 3F11.39.7 en la unión a DR4 [Pan et al., supra], DcR1 [Sheridan et al., supra] y DcR2 [Marsters et al., Curr. Biol., 7: 1003-1006 (1997)]. El ELISA se realizó esencialmente tal y como se ha descrito en el ejemplo 9 anterior.

Los resultados se muestran en la figura 11. El anticuerpo de Apo-2 3F11.39.7 se unió a Apo-2. El anticuerpo 3F11.39.7 también mostró cierta reactividad cruzada con DR4, pero no con DcR1 o DcR2.

Ejemplo 13 Isotipado de anticuerpos

El isotipo del anticuerpo 3F11.39.7 (tal y como se ha descrito anterior) se determinó cubriendo las placas de microtitulación con Ig de cabra anti-ratón específica para el isotipo (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) durante toda la noche a 4ºC. A continuación, se lavaron las placas con tampón de lavado (tal y como se ha descrito en el ejemplo 9 anterior). A continuación, se bloquearon los pocillos de las placas de microtitulación con 200 \mul de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron de nuevo las placas tres veces con tampón de lavado. A continuación, se añadieron 100 \mul de 5 \mug/ml de anticuerpo 3F11.39.7 purificado a los pocillos designados. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP (tal y como se ha descrito anteriormente). Se incubaron las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente. El nivel de HRP unido a la placa se detectó utilizando sustrato HRP tal y como se ha descrito anteriormente.

El análisis de isotipado mostró que el anticuerpo 3F11.39.7 es un anticuerpo IgG1.

Ejemplo 14 Anticuerpos de Apo-2 de cadena única A. Selección de fagos para anticuerpos utilizando perlas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina

Se seleccionó una biblioteca de fagos utilizando antígeno biotinilado soluble y perlas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina. El antígeno, una inmunoadhesina de ECD de Apo-2 preparada tal y como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2B, se biotiniló utilizando IMMUNOPURE NHS-biotin (biotini-N-hidroxi-succinimida, Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se realizaron dos experimentos de rastreo ("panning"). El primer experimento se diseñó para aislar clones de fagos específicos para Apo-2 y que no reaccionaron de forma cruzada con DR4 o DcR1. Se llevaron a cabo tres rondas de rastreo. Para la primera ronda, se bloquearon 10 \mul de la biblioteca de fagos de la Cambridge Antibody Technologies con 1 ml de MPBST (3% de leche en polvo seca, 1X de PBS, 0,2% de TWEEN) que contenía 800 \mug de CD4-Ig, 300 \mug de DR4-Ig y 200 \mug de DcR1-Ig durante 1 hora en una rueda de rotación a temperatura ambiente (CD4-Ig, DR4, y DcR1 están descritos en Capon et al., Nature, 337:525 (1989); Pan et al., supra; y Sheridan et al., supra). A continuación, se añadió inmunoadhesina de ECD de Apo-2 biotinilada hasta una concentración final de 100 nM, y se dejó que el fago se uniera al antígeno durante una hora a 37ºC. Mientras tanto, se lavaron 3 veces con 1 ml de MPBST 300 \mul de DYNABEADS M-280, recubiertas de estreptavidina (DYNAL) (utilizando un Concentrador de Partículas Magnéticas DYNAL) y, a continuación, se bloqueó durante 2 horas a 37ºC con 1 ml de MPBST nuevo en un rotador. Las perlas se recogieron con el MPC, se resuspendieron en 50 \mul de MPBST, y se añadieron a la solución de fago-más-antígeno. El mezclado continuó en una rueda a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, se lavaron los DYNABEADS y el fago unido un total de 7 veces: 3 veces con 1 ml de PBS-TWEEN, una con MPBS, seguido de 3 veces con PBS.

Se eluyeron los fagos de las perlas mediante la incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente con 300 \mul de 100 mM de trietilamina. El sobrenadante que contenía fagos se extrajo y se neutralizó con 150 \mul de 1 M de Tris-HCl (pH 7,4). Los fagos neutralizados se utilizaron para infectar células huésped TG1 semilogarítmicas y se emplacaron en agar 2YT complementado con glucosa al 2% y 100 \mug/ml de carbenicilina. Después del crecimiento durante toda la noche a 30ºC, se rascaron las colonias en 10 ml de 2YT. Se utilizaron 50 \mul de esta solución para inocular 25 ml de 2YT con carbenicilina y glucosa y se incubaron, agitando durante 2 horas a 37ºC. Se añadieron fagos auxiliares M13K07 (Pharmacia) a una m.o.i. de 10. Después de la adsorción, las células se pusieron en gránulos y se resuspendieron en 25 ml de 2YT con carbenicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml) y continuó el desarrollo a 30ºC durante 4 horas. Se extrajo el E. coli de los fagos mediante centrifugación, y se utilizó 1 ml de estos fagos (aproximadamente 10^{12} c.f.u.) en las rondas posteriores de selección.

Para la segunda ronda de selección, el ml de fagos recogidos se ajustó hasta el 3% de leche en polvo, 1X de PBS, 0,2% de TWEEN y, a continuación, se añadieron para el bloqueo 100 \mug de DR4-Ig, 65 \mug de DcR1-Ig, y 500 \mug de CD4-Ig. Para la selección, se añadió Apo-2 biotinilado a 10 nM. Se incrementó la astringencia del lavado hasta dos ciclos de 7 lavados.

Para la tercera ronda de selección, se bloquearon los fagos sólo con MPBST. Se añadió Apo-2 biotinilado hasta 1 nM, y la astringencia del lavado se incrementó hasta tres ciclos de 7 lavados. Se obtuvieron relativamente pocos clones en esta ronda, por tanto se realizó el Panel 2B, Ronda 3 utilizando 5 nM de Apo-2 biotinilado con todas las otras condiciones repetidas tal y como se hizo anteriormente.

Se realizó un segundo experimento de rastreo de forma similar al anterior con la excepción de que en las Rondas 1 y 2 el bloqueo de las soluciones de fagos se llevó a cabo con MPBST que contenía 1,0 mg/ml de CD4-Ig (ninguna otra inmunoadhesina) y la Ronda 3 se bloqueó tan sólo con MPBST. Se añadió el Apo-2 biotinilado a 200 nM en la Ronda 1, a 60 nM en la Ronda 2, y a 12 nM en la Ronda 3. En cada ronda, se eluyeron los fagos de las perlas magnéticas con 300 \mul de trietilamina 100 nM, a continuación con 300 \mul de Tris-HCl a 0,1 M (pH 7,5) y, a continuación, 300 \mul de glicina-HCl a 0,1 M (pH 2,2) que contenía 1 mg/ml de BSA. Los fagos obtenidos de las tres eluciones secuenciales se agruparon y utilizaron para infectar el huésped de la cepa TG1 tal y como se ha explicado anteriormente.

B. Exploración ELISA de clones seleccionados

Después de cada ronda de selección, se cribaron las colonias individuales resistentes a carbenicilina mediante ELISA para identificar aquellas que producían fagos de unión a Apo-2. Sólo aquellos clones que dieron positivo en dos o más formatos de ensayo fueron estudiados con mayor profundidad.

Los clones individuales se inocularon en 2TY con glucosa al 2% y carbenicilina a 100 \mug/ml en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se desarrollaron hasta turbidez. A continuación, se infectaron los cultivos a una m.o.i. de 10 con el fago auxiliar M12K07, y las células infectadas se transfirieron a medio 2YT que contenía carbenicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml) para desarrollarse durante toda la noche a 30ºC con agitación suave.

Las placas de microtitulación NUNC MAXISORP se recubrieron con 50 \mul por pocillo de la inmunoadhesina de ECD de Apo-2, o CD4-IgG, a 2 \mug/ml en 50 nM de tampón de carbonato (pH 9,6), a 4ºC durante toda la noche. Después de retirar el antígeno, se bloquearon las placas con un 3% de leche en polvo en PBS (MPBS) durante 2 horas a temperatura ambiente.

Se centrifugaron los cultivos de fagos y se bloquearon 100 \mul de sobrenadantes que contenían fagos con 20 \mul de 6 x PBS/18% de leche en polvo durante 1 hora a temperatura ambiente. Se extrajo el bloqueo de las placas de titulación y se añadieron los fagos bloqueados y se dejó que se unieran durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, se detectaron los fagos con una dilución 1:5000 de anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (Pharmacia) en MPBS seguido de 3',3',5',5'-tetrametilbenzidina (TMB). Las reacciones se detuvieron mediante la adición de H_{2}SO_{4} y las lecturas se realizaron restando A_{405 \ nm} de A_{450 \ nm}.

C. Huellas dactilares del ADN de clones

La diversidad de clones de unión a Apo-2 se determinó mediante la amplificación por PCR de la inserción de scFv utilizando los cebadores pUC19R (5'AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG 3') (SEC. ID. No: 12) que se hibrida en dirección 5' de la secuencia líder y fdtetseq (5' GTC GTC TTT CCA GAC GGT AGT 3') (SEC. ID. No: 13) que se hibrida en el extremo 5' del gen II, seguido de la digestión con la enzima de restricción de corte frecuente BstNI.

Huellas dactilares del ADN: Protocolo

100

Se colocaron 90 \mul de la Mezcla A en un tubo de reacción y, a continuación, se inocularon con una parte muy pequeña de colonia de E. coli utilizando una punta amarilla. A continuación, se calentó la mezcla de reacción en un bloque de PCR hasta los 98ºC, durante 3 minutos, se extrajo y se colocó sobre hielo. A continuación se añadieron 10 \mul de Mezcla B y la mezcla de la reacción se termocicló a 95ºC, 30 segundos, 55ºC 30 segundos, 72ºC 1 minuto 20 segundos, durante 25 ciclos en un termociclador Perkin Elmer 2400. A continuación, se extrajeron 10 \mul del producto de reacción resultante y se le hizo pasar por un gel de agarosa al 1% para analizar una banda de 1 kB. La mezcla restante se llevó a un tampón de reacción 1 x BstNI, se añadieron 5 unidades de BstNI y se dejó que el ADN se digiriera durante 2 horas a 60ºC. Las muestras resultantes se sometieron a continuación a electroforesis en un gel de acrilamida al 12,5% GeneGel Excel (Pharmacia Biotech).

D. Secuenciación de clones

Se obtuvieron las secuencias de nucleótidos de clones representativos de cada modelo de huella dactilar. Las colonias se inocularon en 50 ml de medio LB complementado con glucosa al 2% y 100 \mug/ml de carbenicilina, y se desarrollaron durante toda la noche a 30ºC. Se aisló el ADN utilizando Qiagen Tip-100s y el protocolo del fabricante y el ciclo se secuenció con terminaciones de cadena didesoxi fluorescente (Applied Biosystems). Se hicieron pasar las muestras por un Secuenciador de ADN Automatizado Applied Biosystems 373ª y se analizaron las secuencias utilizando el programa "Sequencher" (Gene Codes Corporation). Las secuencias de nucleótidos de los anticuerpos seleccionados 16E2, 20E6 y 24C4 se muestran en SEC. ID. No: 6, SEC. ID. No: 7, y SEC. ID No: 8, respectivamente, (en las Figuras 15ª, 15B y 15C respectivamente). Las secuencias de aminoácidos correspondientes de los anticuerpos 16E2, 20E6 y 24C4 se muestran en SEC. ID. No: 9, SEC. ID. No: 10, y SEC. ID No: 11, respectivamente (y en la Figura 16). Además, la Figura 16 identifica la región señal, y las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada y la ligera (subrayado) de estas moléculas scFv. Las regiones CDR mostradas en la Figura 16 fueron asignadas de acuerdo con los procedimientos de Kabal y otros, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," NIH Publ. Nº 91-3242, 5ª Edición.

E. Purificación de scFvs con (his)_{6}

Para la purificación proteica del anticuerpo soluble, la cepa 33D3 de E.coli se transformó con ADN de fagémido. Se utilizaron 5 ml de 2YT con carbenicilina y glucosa para desarrollar cultivos durante toda una noche a 30ºC. Se diluyeron 2,5 ml de estos cultivos en 250 ml del mismo medio y se desarrollaron hasta una DO_{600} de aproximadamente 1,2. Se agruparon las células en pélets y se resuspendieron en 500 ml de 2YT que contenía IPTG (1mM) y carbenicilina (100 \mug/ml) para inducir la expresión y se desarrollaron durante 16 horas más a 22ºC. Se recogieron los pélets de células y se congelaron a -20ºC.

Se purificaron los anticuerpos mediante la cromatografía de afinidad a quelato metálico inmovilizado (IMAC). Los pélets congelados se resuspendieron en 10 ml de tampón de "shockate" enfriado con hielo (25 mM de TRIS-HCl, 1 mM de EDTA, 500 mM de NaCl, sacarosa al 20%, 1 mM de PMSF) mediante agitación sobre hielo durante 1 hora. Se añadió imidazol hasta 20 mM y se extrajeron restos de células mediante centrifugación. Los sobrenadantes se ajustaron hasta 1 mM de MgCl_{2} y 50 mM de tampón fosfato de pH 7,5. Se utilizó una resina de agarosa Ni-NTA de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La resina se equilibró con 50 mM de tampón de fosfato de sodio de pH 7,5, 500 mM NaCl, 20 mM de imidazol y el "shockate" añadido. La unión ocurrió de modo discontinuo o en una columna de flujo gravitacional. A continuación, la resina se lavó dos veces con 10 volúmenes de lecho de tampón de equilibrio, y dos veces con el tampón que contenía imidazol aumentado hasta 50 mM. La elución de proteínas fue con 50 mM de tampón fosfato de pH 7,5, 500 mM de NaCl y 250 mM de imidazol. Se extrajeron las sales y el imidazol excedentes en una columna PD-10 (Pharmacia), y se concentraron las proteínas utilizando un Centricom 10 hasta un volumen de aproximadamente 1 ml.

Se estimó la concentración de espectrofotométricamente suponiendo una A280 nm de 1,0 = 0,6 mg/ml.

F. Ensayos para determinar la especificidad de la unión de scFvs anti-Apo-2

Para evaluar la especificidad de cada uno de los clones de scFv, se realizaron ensayos ELISA para evaluar la unión de 16E2, 20E6 y 24C4 a Ig de ECD de Apo-2, Ig de DR4, Ig de DcR1, Ig de DcR2 e Ig de CD4 (descritos anteriormente y en el Ejemplo 12).

Brevemente, se recubrieron las placas NUNC ELISA con 50 \mul de una molécula de inmunoadhesina de Ig-receptor de 1 \mug/ml en 0,05 M de tampón de carbonato de sodio, pH 9,5, y se dejaron incubando durante toda la noche a 4ºC. A continuación, se bloquearon las placas con 285 \mul de diluyente ELISA (PBS complementado con BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,05%, pH 7,4) durante por lo menos una hora a temperatura ambiente. Se añadieron 50 \mul de las scFvs a las placas en una dilución en serie 1:5 y se dejó incubando durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras esta hora de dilución, se lavaron las placas 6 veces con PBS/Tween al 0,05%. Tras la unión a las placas recubiertas de antígeno, se detectó scFv soluble mediante la adición en cada pocillo de 50 \mul de Mab 9E10 de 1 \mug/ml (un anticuerpo anti-c-myc; ATCC CRL 1729) y se dejaron incubando las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar las placas 6 veces con PBS/Tween al 0,05%, se añadieron a las placas 50 \mul de una dilución 1:5000 de anticuerpo IgG anti-murino conjugado con peroxidasa de rábano picante (catálogo Cappel: 55569) en MPBS y se dejaron incubando durante 1 hora. Se generó una señal observable mediante la adición de 50 \mul de sustrato peroxidasa de 3',3',5',5'-tetrametilbencidina (TMB) (catálogo KPL #: 50-76-00). Las reacciones se detuvieron mediante la adición de H_{2}SO_{4} y las lecturas se realizaron restando A_{405 \ nm} de A_{450 \ nm}.

Tal y como se ilustra en las Figuras 12ª, 12B y 12C, los ensayos ELISA mostraron que cada uno de estos anticuerpos exhibieron un grado de especificidad relativamente elevado para Apo-2.

Los ensayos adicionales utilizando células transfectadas también mostraron la especificidad del anticuerpo 16E2 por Apo-2. Específicamente, se realizaron experimentos inmunohistoquímicos para evaluar la especificidad de unión del anticuerpo 16E2 por Apo-2 y células CHO transfectadas con DR4. Las células CHO se transfectaron con un único vector o un vector que contenía el gen para Apo-2 o DR4. Las células transfectadas se extrajeron de las placas de cultivo, se agruparon en pélets, y se lavaron dos veces con PBS. Los pélets se resuspendieron a continuación en O.C.T. (Fisher), se congelaron rápidamente en isopentano y LN_{2}, y posteriormente se segmentaron utilizando los protocolos estándar. Se realizó la tinción de las células segmentadas utilizando un kit de Vectastain Elite ABC. Se incubaron los segmentos con un anticuerpo anti-Apo-2 16E2 o un anticuerpo de cadena única de control negativo. El anticuerpo secundario utilizado fue un anticuerpo 9E10 anti-c-myc biotinilado o un anticuerpo His anti-Penta (Qiagen) seguido de IgG anti-ratón biotinilado.

El ensayo de la inmunohistoquímica mostró una tinción específica de las células trasfectadas con Apo-2 pero no de las células transfectadas con DR4. La tinción celular fue predominantemente citoplasmática.

Ejemplo 15 Ensayo de la capacidad de scFvs etiquetados con His para inducir apoptosis agonísticamente A. Ensayos en 96 pocillos de anexina V-biotina/Estreptavidina-[S-35]

Se examinó la capacidad de inducir apoptosis mediada por Apo-2 por parte de los anticuerpos ScFv purificados (tal y como se describe anteriormente en el ejemplo 14).

Brevemente, se pusieron en alicuotas en placas de 96 pocillos células SK-MES-1 (línea celular de carcinoma de pulmón humano; ATCC HTB 58) o células HCT 116 (línea celular de carcinoma de colon humano; ATCC CCL 247) (4 X 10^{4} células/pocillo) en medio de ensayo (mezcla 1:1 de medio onti modificado por Dulbecco libre de rojo de fenol y mezcla de nutriente F-12 de Ham libre de rojo de fenol complementado con suero bovino fetal al 10%, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina) y se dejó que se unieran durante toda la noche a 37ºC. A continuación, se extrajo el medio y se añadió a los pocillos 0,1 ml de medio de ensayo que contenía scFv con una concentración final de 50 ug/ml (16E2 ó 20E6) (diluciones en serie de 1:2 realizadas en las placas) y se dejaron incubando durante una hora a temperatura ambiente. Se utilizaron otros anticuerpos de cadena única como controles negativos: un clon de scFv anti-factor tisular, 7D5, o un scFv al que se hace referencia como 19B8. Tras la incubación de 1 hora con anticuerpo scFv, se añadieron en los pocillos apropiados 0,1 ml de clon de anti-His a 10 ug/ml, (Qiagen, cat. Nº 1007671) o anticuerpos anti-c-myc. Los pocillos que no recibían un anticuerpo reticulante recibieron sólo medio. A continuación, las placas se dejaron incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación de 30 minutos, se añadieron a los pocillos apropiados 0,1 ml de IgG anti-ratón de cabra a 10 ug/ml (ICN cst. Nº 67-029). Los pocillos que no recibían un anticuerpo anti-IgG recibieron sólo medio. A continuación, se colocaron las placas en una incubadora durante 15 minutos para permitir que el pH volviera a 7,0. Para los controles positivos, se añadió a los pocillos apropiados 2 ug/ml de solución de ligando de Apo-2 (Apo-2L) (preparado tal y como se describe en el Ejemplo 11) en un tampón de fosfato de potasio de pH 7,0, con diluciones de 2 veces en serie llevadas a cabo en la placa. Los pocillos del control negativo recibieron sólo medio. A continuación, se incubaron las células durante toda la noche a 37ºC en presencia de un 5% de CO_{2}. Se añadieron a continuación a los pocillos 0,05 ml de anexina V-biotina (1 ug/ml) en 2X de tampón de unión a Ca^{2-} (NeXins B. V.) y entonces se dejó mezclar en un agitador durante 30 minutos. A continuación, se añadieron a los pocillos 0,05 ml de estreptavidina-[S-35] (concentración final de 2,5 x 10^{4} cpm/pocillo) (Amersham) en 2X de tampón de unión a Ca^{2-} y, a continuación, se dejó mezclar en un agitador durante 30 minutos. A continuación, las placas se sellaron y se centrifugaron durante 4 minutos a 1500 rpm. Con el fin de evaluar la extensión de la apoptosis, se hizo entonces el recuento sobre las placas en un Trialux Microbeta Counter (Wallace) para obtener valores de cpm correspondientes a la unión a Anexina-V.

Tal y como se muestra en las Figuras 13C y 14B, los anticuerpos 16E2 y 20E6 indujeron agonísticamente apoptosis en células SK-MES-1.

B. Ensayos con violeta cristal

Además del ensayo de la anexina V-biotina/estreptavidina-[S-35] descrito anteriormente, se ensayaron los anticuerpos scFv (tal y como se describe en el Ejemplo 14 anterior) por la actividad de inducir apoptosis mediada por Apo-2 mediante ensayos que utilizan violeta cristal.

Brevemente, se emplacaron las células SK-MES-1 a 4x10^{4} células/pocillo en medio de ensayo (descrito en la Sección A anterior) y se dejó que se unieran durante toda la noche a 37ºC. Se extrajo el medio y se añadieron a los pocillos apropiados 0,1 ml de medio de ensayo que contenía scFv (tal y como se describe en la Sección A anterior) a una concentración final de 50 \mug/ml (los pocillos sin scFv añadido recibieron un cambio de medio). Los pocillos seleccionados recibieron muestras "pre-complejadas" en las cuales se combinó 10 ug/ml de scFv de 16E2 con 100 ug/ml anticuerpo anti-His durante 5 horas a 4ºC con mezclado continuo antes de la adición a la placa. Las placas se dejaron incubando durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se extrajo el medio de scFv y se añadieron a los pocillos 0,1 ml de anticuerpos anti-His 10 \mug/ml (Qiagen, cat. Nº 1007671) o anticuerpos anti-c-myc diluidos en el medio de ensayo (los pocillos sin reticulante reciben un cambio de medio). Las placas se dejaron incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, se extrajo el medio y se añadieron a los pocillos apropiados 0,1 ml de IgG de cabra anti-ratón a 10 \mug/ml (fragmento Fc específico-ICN cst. Nº 67-029) diluido en medio de ensayo (los pocillos sin anti-Fc reciben un cambio de medio). A continuación, se colocaron las placas en la incubadora durante 15 minutos para permitir que el pH volviese a 7,0.

Se diluyó Apo-2L (disponible a 100 \mug/ml en un tampón de fosfato de potasio de pH 7,0) hasta 2 \mug/ml y se añadieron 0,1 ml a los pocillos apropiados. Las diluciones de dos veces en serie se llevaron a cabo en la placa. A continuación, se incubaron las placas durante toda la noche a 37ºC.

Se extrajo todo el medio de los pocillos y las placas se llenaron a continuación de solución de violeta cristal. Se dejó que las placas se tiñeran durante 15 minutos. Se retiró el violeta cristal llenando las placas con agua corriente del grifo. A continuación, las placas se dejaron secar durante toda la noche.

Se leyeron las placas en un lector de placas SLT a 540 nm y se analizaron los datos utilizando un macro Excel y un ajuste 4p.

Tal y como se muestra en las Figuras 13ª, 13B, 14ª y 14B, los anticuerpos 16E2 y 20E6 indujeron apoptosis agonísticamente en las células SK-MES-1.

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Ejemplo 16 Ensayo de la capacidad de los scFvs etiquetados con gD para inducir la apoptosis agonísticamente

Se analizó la capacidad de inducir apoptosis mediada por Apo-2 por una forma de scFv de 16E2 etiquetada con gD y purificada en un ensayo con violeta cristal tal y como se describe en el Ejemplo 15 anterior.

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A. Construcción de scFv con la etiqueta gD

El fragmento de SfiI a Not I de la forma scFv de 16E2 se subclonó en un derivado de pAK19 (Carter et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 183-192 (1991)) que contenía el promotor phoA y la secuencia señal stII en lugar del promotor lacZ y la secuencia señal híbrida de la biblioteca original. Para mayor facilidad en la purificación, se sintetizó un fragmento de ADN que codificaba para 12 aminoácidos (met-ala-asp-pro-asn-arg-phe-arg-gly-lys-asp-leu SEC. ID No: 14) derivados de la glicoproteína D de tipo 1 del virus del herpes simple (Lasky et al., DNA, 3: 23-29 (1984)) y se insertó en el extremo 3' del dominio VL en el lugar de (his)_{6} y el epítopo c-myc presente originalmente en los clones de las bibliotecas de Cambridge Antibody Technologies.

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B. Expresión en E. coli

El plásmido que contenía el gen para el gD de scFv de 16E2 se transformó en una cepa 33D3 de E. coli para la expresión en cultivos en matraces de agitación. Se utilizaron 5 ml de 2YT con carbenicilina y glucosa para hacer crecer cultivos durante toda la noche a 30ºC. Se diluyeron 2,5 ml de estos cultivos en 250 ml del mismo medio y crecieron hasta una DO_{600} de aproximadamente 1,0. Las células se agruparon en pélets y se resuspendieron en 500 ml de Medio Mínimo AP-5 Modificado que contenía carbenicilina (100 \mug/ml) y crecieron durante unas 16 horas adicionales a 30ºC. A continuación, las células se agruparon en pélets y se congelaron.

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C. Purificación de scFv con la etiqueta gD

Se resuspendió la pasta de células congeladas en 1 mg/10ml de tampón de "shockate" (25 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 500 mM de NaCl, sacarosa al 20%, 1 mM de PMSF, pH 7,2) y se agitó suavemente en hielo durante 4 horas. A continuación, la suspensión de células se procesó a través de un microfluidizador Polytron (Brinkman). Se extrajeron los restos de células mediante una centrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos. Tras la filtración a través de un filtro de 0,22 micras, se cargó el sobrenadante en una columna de afinidad (2,5 x 9,0 cm) que consistía en un anticuerpo 5B6 anti-gD (Paborsky et al., Protein Engineering, 3: 597-553 (1990)) acoplado a CnBr Sefarosa la cual había sido equilibrada con PBS. La columna se lavó 18 horas con PBS hasta que la absorbancia del efluente de la columna era equivalente a la línea base. Todas las etapas se realizaron a 4ºC a una velocidad de flujo lineal de 25 cm/hora. La elución se realizó con 0,1 M de ácido acético, 0,5 M de NaCl, pH 2,9. Las fracciones de la columna se monitorizaron mediante la absorbancia a 280 nm y las fracciones de los picos se juntaron, se neutralizaron con 1,0 M de Tris, pH 8,0, se dializaron contra el PBS y el filtrado estéril. Se analizaron las preparaciones de proteína resultantes mediante SDS-PAGE no reductor.

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D. Ensayo de violeta cristal

El ensayo de apoptosis se realizó esencialmente tal y como se describe en el Ejemplo 15(B) anterior excepto que las muestras fueron diluidas en serie 1:3 en las placas y se analizó el anticuerpo 16E2 etiquetado con gD además de otras dos preparaciones de scFv de 16E2 (a las que se hace referencia como Prep. A y Prep. B en la Figura 14C). Los resultados del ensayo que muestran una inducción de la apoptosis en las células SK-MES-1 por el anticuerpo 16E2 con gD se ilustran en la Figura 14C.

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Depósito de material

Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manasssas, Virginia, Estados Unidos (ATCC):

101

Este depósito se realizó según lo estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del depósito. El depósito estará disponible mediante la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito al uso público tras la publicación de la respectiva patente estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para alguien determinado por el Comisionario de Patentes y Marcas de Estados Unidos para tener el derecho a la misma de acuerdo con 35 USC \NAK 122 y las normas del Comisionario según las mismas (incluyendo 37 CFER \NAK 1.14 con referencia concreta a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente reemplazados en una notificación por otros iguales. La disponibilidad del material depositado no se interpreta como una licencia para realizar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.

La memoria escrita anteriormente se considera que es suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la invención. La presente invención no se limita en su alcance por la construcción depositada, ya que la realización depositada pretende ser una ilustración individual de ciertos aspectos de la presente invención y cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente están dentro del alcance de la presente invención. El depósito del material de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente invención sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el modo óptimo de la misma, ni se interpreta como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De hecho, para los expertos en la materia serán evidentes diversas modificaciones de la presente invención a partir de la descripción anterior, además de las mostradas y descritas en el presente documento, y caen dentro del alcance de las reivindicaciones que se adjuntan.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9701633 A [0004]

\bullet EP 417563 A [0006]

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\bullet US 5364934 A [0055] [0110] [0161]

\bullet US 5010182 A [0060]

\bullet EP 362179 A [0060]

\bullet WO 9013646 A [0060]

\bullet EP 117060 A [0068] [0084]

\bullet US 4965199 A [0069]

\bullet EP 36776 A [0073]

\bullet EP 73657 A [0076]

\bullet GB 2211504 A [0077]

\bullet US 4419446 A [0078]

\bullet US 4601978 A [0078]

\bullet EP 117058 A [0084]

\bullet DD 266710 [0085]

\bullet EP 321196 A [0088]

\bullet WO 8905859 A [0092]

\bullet WO 9100358 A [0092]

\bullet US 4399216 A [0093]

\bullet US 3969287 A [0106]

\bullet US 3691016 A [0106]

\bullet US 4195128 A [0106]

\bullet US 9247642 A [0106]

\bullet US 4229537 A [0106]

\bullet US 4330440 A [0106]

\bullet WO 8705330 A [0111]

\bullet US 4640835 A [0114]

\bullet US 4496689 A [0114]

\bullet US 4301144 A [0114]

\bullet US 4670417 A [0114]

\bullet US 4791192 A [0114]

\bullet US 4179337 A [0114] [0162]

\bullet EP 0125023 A [0125]

\bullet EP 173494 A [0125]

\bullet WO 8902922 A [0127]

\bullet US 4736866 A [0132]

\bullet US 4870009 A [0132]

\bullet WO 9429348 A [0145]

\bullet US 4342566 A [0145]

\bullet WO 9404679 A [0150]

\bullet WO 9201047 A [0152]

\bullet WO 9220791 A [0152]

\bullet WO 9306213 A [0152]

\bullet WO 9311236 A [0152]

\bullet WO 9319172 A [0152]

\bullet WO 9501438 A [0152]

\bullet WO 9515388 A [0152]

\bullet WO 9308829 A [0156]

\bullet WO 9404690 A [0157]

\bullet US 4676980 A [0158] [0158]

\bullet WO 9100360 A [0158]

\bullet WO 92200373 A [0158]

\bullet EP 03089 A [0158]

\bullet WO 9300109 A [0162]

\bullet WO 9725428 A [0227]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

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\global\parskip0.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptor de Apo-2

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1 DNA Way

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Francisco Sur

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CP: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete 3,5 pulgadas, 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WinPatin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/857216

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-mayo-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 09/020746

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 9-febrero-1998

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/REPRESENTANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Marschang, Diane L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35.600

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE INFORME/EXPEDIENTE: P1101R2PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 650/225-5416

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650/952-9881

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 411 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 1:

8

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1799 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

11

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCAGGGACT TTCCGCTGGG GACTTTCCG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGATGGGAA GTGTGTGATA TATCCTTGAT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 930 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 939 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 933 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 309 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 9:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 312 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 310 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCGGATAAC AATTTCACAC AGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGTCTTTC CAGACGGTAG T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

103

Claims (21)

1. Anticuerpo monoclonal que (a) se une al polipéptido Apo-2 que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 411 de la SEC ID No: 1 y (b) induce la apoptosis en por lo menos un tipo de células de mamífero in vivo o ex vivo que expresa dicho polipéptido Apo-2.

2. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que se une a una secuencia de dominio extracelular de un polipéptido Apo-2 que consiste en los aminoácidos 54 a 182 de la SEC ID No: 1.

3. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que se une a una secuencia de dominio extracelular de un polipéptido Apo-2 que consiste en los aminoácidos 1 a 182 de la SEC ID No: 1.

4. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 que (a) se une a la secuencia del dominio extracelular del polipéptido Apo-2 que consiste en los aminoácidos 54 a 182 de la SEC ID No: 1 y (b) induce la apoptosis en por lo menos un tipo de células de cáncer de mamífero in vivo o ex vivo.

5. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

6. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.

7. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 6, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende una secuencia de inmunoglobulina.

8. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

9. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano.

10. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho por lo menos un tipo de célula de mamífero es una célula cancerígena.

11. Molécula homodimérica que comprende cualquiera de dos anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

12. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal o una molécula homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Anticuerpo monoclonal o molécula homodimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en terapia.

14. Utilización de un anticuerpo de Apo-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento para inducir la apoptosis en células de mamífero que expresan el receptor de Apo-2.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que las células de mamífero que expresan el receptor de Apo-2 son células cancerígenas.

16. Utilización según la reivindicación 15, en el que las células cancerígenas son células de cáncer de pulmón, células de cáncer de colon, células de sarcoma, células de linfoma o células de glioma.

17. Utilización de un anticuerpo de Apo-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

18. Utilización según la reivindicación 17, en la que el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de colon, sarcoma, linfoma o glioma.

19. Procedimiento in vitro de inducción de apoptosis en células de mamífero que expresan el receptor de Apo-2 que comprende la exposición de las células de mamífero que expresan el receptor de Apo-2 a un anticuerpo de Apo-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que las células de mamífero que expresan el receptor de Apo-2 son células cancerígenas.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que las células cancerígenas son células de cáncer de pulmón, células de cáncer de colon, células de sarcoma, células de linfoma o células de glioma.