ES2297481T3

ES2297481T3 - Metodo para purificar macrolidos.

Info

Publication number: ES2297481T3
Application number: ES04779384T
Authority: ES
Inventors: Vilmos Keri; Zoltan Czovek; Ferenc Rantal; Andrea Csorvasi
Original assignee: Teva Pharmaceutical Works PLC
Current assignee: Teva Pharmaceutical Works PLC
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2008-05-01
Anticipated expiration: 2024-07-26
Also published as: WO2005010015B1; US20050027112A1; JP2007521013A; US20070117976A1; TW200523266A; DE602004010059T2; DE602004010059D1; PL1558622T3; DK1558622T3; PT1558622E; ATE378345T1; CA2533548A1; US7220357B2; EP1558622A1; WO2005010015A1; CA2533548C; KR20060052874A; EP1558622B1

Abstract

Método para separar un macrólido seleccionado de entre el grupo constituido por tacrolimus, ascomicina, sirolimus, everolimus y pimecrolimus, de las impurezas que contiene, que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una carga del macrólido que tiene un nivel inicial de impurezas, b) cargar la carga en un lecho de resina de sorción, c) eluir con un eluyente el lecho de resina de sorción cargada, eluyente el cual comprende agua y tetrahidrofurano, y adicionalmente, cuando el macrólido es tacrolimus, el eluyente puede comprender agua, acetonitrilo y ácido fosfórico, para obtener un efluente, y d) recoger por lo menos una fracción del efluente que comprende el macrólido.

Description

Método para purificar macrólidos.

La presente invención se refiere a un método para purificar macrólidos, especialmente tacrolimus, ascomicina, sirolimus, everolimus, o pimecrolimus, mediante un método de separación que usa resinas de sorción.

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica los beneficios de la solicitud provisional US serie nº 60/490.070, presentada el 24 de julio de 2003, y de la solicitud provisional US serie nº 60/539.363, presentada el 26 de enero de 2004, cuyos contenidos de las mismas se incorporan aquí como referencia.

Antecedentes de la invención

Los macrólidos son anillos de lactona de múltiples miembros que tienen como sustituyentes uno o más desoxiazúcares. La eritromicina, azitromicina y claritromicina son macrólidos que tienen actividad bacteriostática y/o bactericida.

El tacrolimus (FK 506) también es un antibiótico macrólido que es igualmente un agente inmunosupresor. Más potente que la ciclosporina, el tacrolimus tiene de forma conocida un efecto inhibidor selectivo sobre linfocitos T.

El pimecrolimus es una macrolactama y un derivado de ascomicina que inhibe de forma conocida la producción de citoquinas proinflamatorias mediante células T y mastocitos. The Merck Index 1331 (Maryadele J. O'Neil et al. eds., 13ª ed. 2001). El pimecrolimus se usa de forma conocida como un inmunosupresor. Id.

Se ha dado a conocer que el sirolimus, otro macrólido, es un inmunosupresor. El sirolimus se ha administrado con ciclosporina y corticosteroides después del transplante, para evitar el rechazo del injerto. Martindale: The Complete Drug Reference 568 (Sean C. Sweetman ed., Pharmaceutical Press 33ª ed. 2002).

Se ha dado a conocer que el everolimus, un derivado de sirolimus, es un inmunosupresor usado en el transplante de órganos. Martindale en 539.

Los macrólidos se obtienen típicamente mediante fermentación, aunque se conocen rutas sintéticas para algunos. Los macrólidos, según se obtienen, contienen típicamente varias impurezas que se pueden detectar por diversos medios, por ejemplo cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC). La presencia de impurezas en un compuesto farmacéutico es indeseable, y las autoridades sanitarias en muchas jurisdicciones (por ejemplo, la Food and Drug Administration de los Estados Unidos de América) han establecido guías que se refieren a los niveles aceptables de impurezas en fármacos. La necesidad y la utilidad comercial de métodos para reducir el nivel de impurezas en cualquier fármaco son evidentes por sí mismas.

Song, Z. et al., (J. Org. Chem., 1999, 64, 1859-1867) describe un procedimiento que usa la resina HP-20S y eluyente de acetonitrilo-agua para la separación del macrólido sintético L733.735 de la ascomicina, siendo este último un material de partida en la síntesis de L733.735.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para separar impurezas de (es decir, reducir el nivel de impurezas en) un macrólido seleccionado de tacrolimus, ascomicina, sirolimus (rapamicina), everolimus y pimecrolimus. El método comprende las etapas siguientes:

a): proporcionar una carga del macrólido que tiene un nivel inicial de impurezas,

b): cargar la carga en un lecho de resina de sorción,

c): eluir con un eluyente el lecho de resina de sorción cargada, eluyente el cual comprende agua y tetrahidrofurano, y adicionalmente, cuando el macrólido es tacrolimus, el eluyente puede comprender agua, acetonitrilo y ácido fosfórico, para obtener un efluente, y

d): recoger por lo menos una fracción del efluente que comprende el macrólido.

Descripción detallada de la invención

Como se usa aquí, la expresión temperatura ambiente se refiere a una temperatura de 0º hasta 40ºC, preferentemente de 10º hasta 35ºC.

Como se usa aquí, la expresión presión reducida se refiere a una presión menor que 760 mm Hg (101,325 kPa).

Como se usa aquí, el término antidisolvente se refiere a una sustancia, normalmente líquida a temperatura ambiente, en la que el macrólido es, en el mejor de los casos, apenas soluble.

Como se usa aquí, el término "impureza" se refiere a cualquier compuesto que tiene un tiempo de retención diferente del macrólido deseado. El tiempo de retención diferente se puede medir, por ejemplo, mediante el método de HPLC descrito aquí más abajo.

Como se usa aquí, los términos RRT0.95 y RRT1.25 se refieren a ascomicina y dihidrotacrolimus, respectivamente, que son impurezas del tacrolimus, que tienen tiempos de retención relativos (con respecto a tacrolimus) de alrededor de 0,95 y 1,25 en el análisis de HPLC, tal como el descrito aquí más abajo.

Como se usa aquí en relación con mezclas o combinaciones de líquidos, la expresión por ciento en volumen o por ciento por volumen (vol-%) se refiere a la fracción de volumen calculada según lo siguiente (ilustrada para la
especie A):

vol-%_{A} = Wt_{A} \ x \ \rho_{A}/(Wt_{A} \ x \ \rho_{A} + Wt_{B} \ x \ \rho_{B})

en la que:

Wt_{A} y Wt_{B} son los pesos en gramos de la especie A y B, respectivamente, y

\rho_{A} y \rho_{B} son las densidades, en g/ml, de la especie A y B, respectivamente.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un método cromatográfico para separar macrólidos, seleccionados de tacrolimus, ascomicina, sirolimus, everolimus y pimecrolimus, de las impurezas contenidas en ellos (es decir, para reducir el nivel de impurezas en el macrólido). La separación (reducción) se efectúa cargando el macrólido sobre un lecho de resina de sorción, y eluyendo con un eluyente que contiene THF y agua. Cuando el macrólido es tacrolimus, el eluyente puede comprender agua, acetonitrilo y ácido fosfórico. Cuando el macrólido es tacrolimus, las impurezas reducidas incluyen por lo menos ascomicina y dihidrotacrolimus, cuya cuantificación mediante HPLC se describe aquí más abajo. Cuando el macrólido es ascomicina, las impurezas reducidas incluyen por lo menos tacrolimus. El macrólido usado puede proceder de cualquier fuente.

En la práctica de la presente invención, la reducción (separación) se efectúa eluyendo con un eluyente un lecho de resina de sorción, cargada con una carga de macrólido, para obtener un efluente. Las resinas de sorción, útiles en la práctica de la presente invención, son bien conocidas en la técnica, y son preferentemente materiales de estireno-divinilbenceno no iónicos, reticulados, pero pueden estar químicamente modificados. También son conocidas las resinas de sorción de tipo acrílico. Las resinas de sorción tienen estructuras muy porosas, cuyas superficies pueden absorber -y después desorber- diversas especies químicas. La absorción y desorción están influidas por el entorno, por ejemplo por el disolvente usado. En presencia de disolventes polares (por ejemplo agua), las resinas de sorción muestran un comportamiento hidrófobo. Cuando se usan disolventes no polares (por ejemplo hidrocarburos), las resinas de sorción pueden mostrar cierto comportamiento polar. Típicamente, las resinas de sorción tienen una estructura macrorreticular, y tienen superficies específicas de por lo menos 300 m^{2}/g.

Las resinas de sorción útiles en la práctica de la presente invención incluyen las resinas Amberlite® XAD, disponibles de Rohm and Haas; XAD 4, XAD 7 HP, XAD 16 HP, XAD 761, y XAD 1180, por citar sólo unas pocas. También son útiles las resinas de sorción de Diaion, disponibles de Mitsubishi: HP10, HP 20, HP 21, HP 30, HP40, HP 50, SP 800, SP 825, SP 850, SP 875, SP 205, SP 206, SP 207, HP1MG y HP2MG, por citar sólo unas pocas. Amberlite® XAD 1180 es un ejemplo de una resina de sorción preferible para uso en la práctica de la presente invención. Amberlite XAD 1180 es un polímero aromático reticulado macrorreticular. Es un polímero reticulado, hidrófobo, no iónico, cuyas propiedades adsorbentes derivan de su estructura macrorreticular patentada (que contiene tanto una fase polimérica continua como una fase porosa continua), de su elevada superficie específica, y de la naturaleza aromática de su superficie. La superficie específica es 500 m2/g o superior. La porosidad es 0,60 ml/ml o superior. La hoja de datos del producto de PDS 0205 A - Jan.98-1/2 da información adicional sobre esta resina.

En una primera etapa del método de la presente invención, la carga del macrólido se carga sobre un lecho de resina de sorción. La carga se puede proporcionar como una disolución del macrólido en un disolvente orgánico, combinado con un antidisolvente.

Como alternativa, la carga del macrólido se adsorbe sobre (se deposita sobre) una porción de carga de la resina de sorción, antes de cargarla sobre el lecho de la resina de sorción. Una disolución del macrólido en un disolvente orgánico, que contiene opcionalmente agua, se combina con una porción de la resina de sorción y con un antidisolvente. La resina de sorción puede ser la misma que la usada para preparar el lecho, o puede ser una resina de sorción diferente. La porción de carga de la resina de sorción puede ser 33% hasta 50% del volumen del lecho. La porción de carga se yuxtapone entonces a un lecho de sorción húmedo, para proporcionar un lecho cargado con la carga.

El disolvente orgánico usado para preparar la disolución a partir de la que se carga o deposita la carga se selecciona preferentemente de entre el grupo constituido por tetrahidrofurano (THF), acetona, acetonitrilo (ACN), metanol, etanol, n-butanol, n-propanol, iso-propanol, ésteres (por ejemplo acetato de etilo), y disolventes apróticos dipolares tales como dimetilformamida (DMF). Lo más preferible, el disolvente orgánico es THF, acetona o ACN. Cuando el macrólido es tacrolimus, los disolventes preferidos son THF y ACN. Preferentemente, el antidisolvente es agua o un alcano de cadena lineal o ramificada, o un cicloalcano, tal como hexano, heptano o ciclohexano. La adición de un antidisolvente reduce la solubilidad del macrólido en la disolución, y, se piensa, facilita la adsorción de la muestra sobre la porción de carga de la resina de sorción. El antidisolvente se añade lentamente para evitar grandes gradientes de concentración que puedan dar como resultado la precipitación parcial en masa del macrólido, lo que puede conducir al ensuciamiento y obturación. Preferentemente, la relación de disolvente:antidisolvente es 40% o menos.

La combinación de disolución de macrólido, porción de carga de la resina de sorción, y antidisolvente, se puede hacer en cualquier vasija conveniente equipada con un agitador (por ejemplo, un reactor de tanque agitado).

En una forma de realización particular, la porción de carga de resina de sorción está contenida en una columna y se pone en contacto con un caudal de disolución de macrólido que pasa a través de la columna en un sistema recirculante. Gradualmente se introduce un antidisolvente en la corriente de disolución que fluye a través y alrededor de la porción de carga de resina de sorción, con lo que la muestra de macrólido se adsorbe gradualmente sobre la porción de carga de la resina de sorción.

A título de ejemplo, cuando el macrólido es tacrolimus, la disolución puede ser alrededor de 100 g/l, y el volumen de antidisolvente puede ser por lo menos cinco veces el volumen de la disolución. El volumen aparente de la porción de carga de la resina de sorción puede ser aproximadamente igual al volumen de la disolución. La persona experta sabrá cómo optimizar las proporciones, mediante experimentación normal, para obtener la adsorción del macrólido sobre la porción de carga de la resina de sorción.

Después de que la adsorción está sustancialmente terminada, lo cual se puede monitorizar haciendo un seguimiento de la concentración de macrólido que queda en la disolución, la carga de alimentación se separa de la disolución que queda. La separación puede ser mediante filtración. Cuando se usa el método de la columna recirculante para obtener la carga de alimentada, la columna se desacopla simplemente del sistema recirculante.

En una etapa subsiguiente de esta forma de realización, la porción de carga cargada ahora con macrólido se yuxtapone a un lecho preparado de resina de sorción húmeda. El lecho está confinado en una vasija adecuada. Preferentemente, el lecho está confinado en una columna, preferentemente de sección transversal circular. Para preparar el lecho, se suspende la cantidad deseada de resina de sorción con agua o con una mezcla de agua y un disolvente (por ejemplo THF o ACN). Es ventajosa una combinación de agua con disolvente cuando el lecho tiene un gran diámetro. La suspensión se transfiere entonces a la vasija deseada, preferentemente una columna cilíndrica tal como se usa para la cromatografía en columna. El agua (o la combinación de agua con disolvente) se extrae para dejar un lecho de resina de sorción húmeda. La práctica para preparar y empaquetar columnas cromatográficas es bien conocida por la persona experta y personal afín, y las prácticas conocidas se adaptan fácilmente a la práctica de la presente invención.

La porción de carga se puede yuxtaponer al lecho de resina de sorción húmeda simplemente como una capa sobre el mismo. Cuando la carga alimentada se prepara en un sistema recirculante, la vasija que contiene la carga alimentada se puede acoplar al recipiente que contiene el lecho de resina de sorción húmeda mediante cualquier medio que establezca una comunicación fluida entre ellos.

La separación del macrólido (es decir, tacrolimus, ascomicina, sirolimus, everolimus, o pimecrolimus) e impurezas, con lo que se reduce el nivel de impurezas en el macrólido, se efectúa haciendo pasar un eluyente a través de la carga alimentada, y subsiguientemente a través del lecho de resina de sorción yuxtapuesto a aquella y en comunicación fluida con ella.

El eluyente incluye agua y THF. Adicionalmente, cuando el macrólido es tacrolimus, el eluyente puede comprender agua, acetonitrilo y ácido fosfórico. Un eluyente preferido, especialmente cuando el macrólido es tacrolimus, es esencialmente una mezcla de THF y agua que tiene 20% en volumen a 50% en volumen, 31% en volumen a 40% en volumen, de THF. Cuando se usa un disolvente orgánico tal como metanol, acetonitrilo, acetona o n-butanol con el eluyente de THF-agua, el contenido de THF es menor que 38% en volumen, preferentemente entre 4 y 38% en volumen. Otro eluyente preferido para tacrolimus es una mezcla de acetonitrilo y agua que tiene 30% en volumen a 70% en volumen, lo más preferible 40% en volumen a 65% en volumen, de acetonitrilo y ácido fosfórico, preferentemente 0,0005 a 0,003 partes de fosfórico por 1 parte de eluyente.

El eluyente se eluye a través de la porción de carga y del lecho de resina de sorción yuxtapuesto a la misma, a una velocidad que depende del área de sección transversal total del lecho (medida perpendicular al flujo del eluyente). Preferentemente, el caudal (con relación al área de sección transversal) es menor que 25 cm/h, preferentemente menor que 15 cm/h. Velocidades más bajas de elución aumentan el tiempo, pero mejoran la eficacia de la separación. Una velocidad preferida de elución para un aumento de la eficacia de separación es alrededor de 90 ml/hora.

El eluyente que sale del lecho de la resina de sorción (es decir, el efluente) se recoge en una o más fracciones, como es normal para la persona experta que usa métodos de separación, como cromatografía, dependiendo aquéllas de la retención preferente de la especie química en una fase estacionaria (por ejemplo, un lecho estático). Se puede añadir al efluente un ácido inorgánico, tal como ácido fosfórico.

Preferentemente, tras eluir el lecho con una cantidad de eluyente, el lecho se pone en comunicación fluida con un segundo lecho, de forma que el efluente del primer lecho eluye a través del segundo lecho. Después de la elución de los lechos primero y segundo, el segundo lecho se puede y preferentementemente se desacopla del primer lecho (es decir, se rompe la comunicación fluida), y la elución se continúa a través del segundo lecho solo. El eluyente es una mezcla de TFA y agua que tiene 33% en volumen a 35% en volumen de THF, y es el eluyente preferido.

Opcionalmente, se pueden conectar columnas adicionales al sistema.

La concentración y composición de las fracciones se pueden monitorizar por cualquier medio conveniente. La detección y cuantificación de impurezas en un macrólido, en particular ascomicina y dihidrotacrolimus en tacrolimus, se pueden llevar a cabo mediante el método de HPLC descrito aquí más abajo.

Dependiendo, entre otros, de la carga de la columna y de la composición y caudal del eluyente, se recoge una fracción principal (la fracción de interés) de efluente que incluye más de 60%, preferentemente entre 60% en peso y 90% en peso del macrólido presente originalmente en la disolución. Cuando el macrólido es tacrolimus, y el eluyente es THF-agua (31 a 40% en volumen de THF), la fracción principal se recoge de forma que el producto aislado final tiene 0,1% de área o menos (mediante HPLC descrita más abajo) de impureza RRT0.95.

Si se desea, el macrólido separado de las impurezas, y por lo tanto que tiene un nivel reducido de impurezas, se puede aislar del efluente por cualquier medio convencional (por ejemplo, extracción, liofilización, evaporación, adición de antidisolvente). Como antidisolventes útiles, se pueden mencionar agua, alcanos y cicloalcanos. Los métodos de aislamiento se pueden combinar. Por ejemplo, el antidisolvente se puede combinar con un eluyente concentrado.

Un método preferido de aislamiento incluye la concentración de la fracción principal a 70ºC o menos, preferentemente 60ºC o menos, preferentemente a la presión de 760 mm Hg, hasta alrededor de 50% de su volumen inicial, con lo que se obtienen cristales de producto. Preferentemente, antes de la concentración, se añade un ácido, 1 a 10 ml por litro de eluyente, para estabilizar el macrólido.

Opcionalmente, la fracción principal concentrada se mantiene a temperatura ambiente durante un tiempo de reposo. Cuando se usa un tiempo de reposo, el tiempo de reposo preferido es 1-4 días. Los cristales de macrólido que tienen una cantidad reducida de impurezas se recuperan por cualquier medio convencional, por ejemplo nitración (gravedad o vacío).

La reducción adicional de impurezas se puede lograr sometiendo el producto recuperado a varios tratamientos adicionales según el método de la presente invención.

La reducción de impurezas en un macrólido, lograda por el método de la presente invención, se puede monitorizar mediante el método de HPLC descrito aquí más abajo.

En otra forma de realización, el macrólido es tacrolimus, y por lo menos se reducen los niveles de impurezas de ascomicina y dihidrotacrolimus. También se reducen los niveles de otras impurezas. El método incluye las etapas siguientes: preparar una carga alimentada de tacrolimus que comprende una disolución de tacrolimus con o sin una porción de carga de una resina de sorción, especialmente una resina macrorreticular tal como Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20; cargar la carga alimentada a una resina de sorción húmeda, especialmente Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20, que puede estar contenida en una vasija, especialmente una columna; eluir la porción de carga y la resina de sorción con un eluyente que es una mezcla de tetrahidrofurano (THF) y agua, 20% en volumen a 50% en volumen, especialmente 31% en volumen a 40% en volumen de THF, o una mezcla de acetonitrilo (ACN), agua y ácido fosfórico, en la que el acetonitrilo está presente en una cantidad de 30% en volumen a 70% en volumen, y lo más especialmente 40% en volumen a 65% en volumen; recoger por lo menos una fracción principal (fracción de interés) de eluyente, que contiene más de 60%, preferentemente entre 60% y 90% del tacrolimus inicial (dependiendo de la pureza inicial), y, opcionalmente, aislar de la fracción principal el tacrolimus que tiene una cantidad reducida de impurezas, por ejemplo concentrando la o las fracciones principales, por ejemplo a presión reducida, en presencia de un ácido, y opcionalmente recuperar el producto así obtenido.

En aún otra forma de realización, el macrólido es ascomicina, y se reducen por lo menos los niveles de impureza de tacrolimus. También se reducen los niveles de otras impurezas. El método incluye las etapas siguientes: preparar una carga de alimentación de ascomicina que comprende una disolución de ascomicina con o sin una porción de carga de una resina de sorción, especialmente una resina macrorreticular tal como Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20; cargar la carga de alimentación a la resina de sorción húmeda, especialmente Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20, que puede estar contenida en una vasija, especialmente una columna; eluir la porción de carga y la resina de sorción con un eluyente que es una mezcla de tetrahidrofurano (THF) y agua, 20% en volumen a 50% en volumen, especialmente 31% en volumen a 40% en volumen de THF; recoger por lo menos una fracción principal (fracción de interés) del eluyente, que contiene más de 60%, preferentemente entre 60% y 90% de la ascomicina inicial (dependiendo de la pureza inicial), y, opcionalmente, aislar la ascomicina que tiene una cantidad reducida de impurezas a partir de la fracción principal, por ejemplo concentrando la fracción o fracciones principales, por ejemplo a presión reducida en presencia de un ácido, y opcionalmente recuperar el producto así obtenido.

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En aún otra forma de realización, el macrólido es sirolimus. El método para separar impurezas de sirolimus incluye las etapas siguientes: preparar una carga de alimentación de sirolimus que comprende una disolución de sirolimus con o sin una porción de carga de una resina de sorción, especialmente una resina macrorreticular tal como Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20; cargar la carga de alimentación a una resina de sorción húmeda, especialmente Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20, que puede estar contenida en una vasija, especialmente una columna; eluir la porción de carga y la resina de sorción con un eluyente que es una mezcla de tetrahidrofurano (THF) y agua, 20% en volumen a 50% en volumen, especialmente 31% en volumen a 40% en volumen de THF; recoger por lo menos una fracción principal (fracción de interés) de eluyente, que contiene más de 60%, preferentemente entre 60% y 90% del sirolimus inicial (dependiendo de la pureza inicial), y, opcionalmente, aislar sirolimus que tiene una cantidad reducida de impurezas a partir de la fracción principal, por ejemplo concentrando la fracción o fracciones principales, por ejemplo a presión reducida en presencia de un ácido, y opcionalmente recuperar el producto así
obtenido.

En aún otra forma de realización, el macrólido es everolimus. El método para separar impurezas de everolimus incluye las etapas siguientes: preparar una carga de alimentación de everolimus que comprende una disolución de everolimus con o sin una porción de carga de una resina de sorción, especialmente una resina macrorreticular tal como Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20; cargar la carga de alimentación a la resina de sorción húmeda, especialmente Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20, que puede estar contenida en una vasija, especialmente una columna; eluir la porción de carga y la resina de sorción con un eluyente que es una mezcla de tetrahidrofurano (THF) y agua, 20% en volumen a 50% en volumen, especialmente 31% en volumen a 40% en volumen de THF; recoger por lo menos una fracción principal (fracción de interés) de eluyente, que contiene más de 60%, preferentemente entre 60% y 90% del everolimus inicial (dependiendo de la pureza inicial), y, opcionalmente, aislar everolimus que tiene una cantidad reducida de impurezas a partir de la fracción principal, por ejemplo concentrando la fracción o fracciones principales, por ejemplo a presión reducida en presencia de un ácido, y opcionalmente recuperar el producto así
obtenido.

En aún otra forma de realización, el macrólido es pimecrolimus. El método para separar impurezas de pimecrolimus incluye las etapas siguientes: preparar una carga de alimentación de pimecrolimus que comprende una disolución de pimecrolimus con o sin una porción de carga de una resina de sorción, especialmente una resina macrorreticular tal como Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20; cargar la carga de alimentación a una resina de sorción húmeda, especialmente Amberlite® XAD 1180 y Diaion HP 20, que puede estar contenida en una vasija, especialmente una columna; eluir la porción de carga y la resina de sorción con un eluyente que es una mezcla de tetrahidrofurano (THF) y agua, 20% en volumen a 50% en volumen, especialmente 31% en volumen a 40% en volumen de THF; recoger por lo menos una fracción principal (fracción de interés) de eluyente, que contiene más de 60%, preferentemente entre 60% y 90% del pimecrolimus inicial (dependiendo de la pureza inicial), y, opcionalmente, aislar pimecrolimus que tiene una cantidad reducida de impurezas a partir de la fracción principal, por ejemplo concentrando la fracción o fracciones principales, por ejemplo a presión reducida en presencia de un ácido, y opcionalmente recuperar el producto así obtenido.

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Condiciones cromatográficas

Columna:: ZORBAX SB-C18 75 x 4,6 mm; 3,5 \mum

Precolumna:: SymmetryShield PP18 3,9 x 20 mm; 5 \mum

Eluyente:: A: midánse 200 ml de acetonitrilo en un matraz volumétrico de 2000 ml, dilúyanse después hasta un {}\hskip0,4cm volumen con agua destilada, hasta un volumen total de 2000 ml. Después, añádanse 100 \mul de ácido {}\hskip0,4cm acético al 50%.

\quad: B: añádanse 100 \mul de ácido acético al 50% a 2000 ml de acetonitrilo.

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TABLA DE GRADIENTES

1

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Caudal:: 2,3 ml/min.

Longitud de onda de detección:: 210 nm

Volumen inyectado:: 20 \mul

Disolvente de la muestra:: acetonitrilo

Temp. de la unidad de columna:: 60ºC

Tiempo de análisis:: 27 min.

Tiempo de retención de tacrolimus:: aprox. 14 min.

Los tiempos de retención de las impurezas ascomicina (RRT0.95) y dihidrotacrolimus (RRT1.25) se dan con relación a tacrolimus, y se expresan como un porcentaje de área con relación al área de todos los picos en el cromatograma.

Los tiempos de retención de la impureza tacrolimus (RRT1.00) se dan con relación a ascomicina, y se expresan como un porcentaje de área con relación al área de todos los picos en el cromatograma.

El método de la presente invención se puede ejemplificar mediante los siguientes ejemplos no limitados.

Ejemplo 1

Los porcentajes de área se refieren al porcentaje de área de cromatogramas de HPLC obtenidos mediante el método descrito aquí anteriormente.

El procedimiento a continuación se llevó a cabo a una temperatura de 28ºC hasta 32ºC.

Se preparó un lecho de resina de sorción (Amberlite® XAD 1180) en una columna (diámetro de 45 cm) usando agua:THF para cargar la columna (aprox. 100 l de resina de sorción húmeda).

Se añadió lentamente agua (86 l), con agitación, a una disolución de tacrolimus (1227 g) en acetonitrilo (10 l), en la que se suspendió con agitación la resina de sorción (Amberlite® XAD 1180; 9 l). El tacrolimus usado contenía alrededor de 2,6% de área de RRT0.95, y alrededor de 2,9% de área de RRT1.25. Cuando la adición del agua estuvo terminada, la carga de alimentación de la resina de sorción se recogió por filtración.

La carga de alimentación recogida se cargó (se yuxtapuso) como una capa sobre la parte superior del lecho de la resina de sorción húmeda.

La columna se eluyó en primer lugar con aprox. 1800 l de un primer eluyente formado por THF/agua (33% en volumen de THF). La columna se eluyó entonces con un segundo eluyente formado por THF/agua (40% en volumen de THF). La velocidad de elución fue alrededor de 11 a 13 l/h (6,9 a 8,2 cm/h). Se recogió una fracción principal, aprox. 460 l, que contiene alrededor de 820 g de tacrolimus (rendimiento 67%). También se recogió una fracción previa, aprox. 80 l, que contiene aprox. 190 g de tacrolimus.

La fracción principal (460 l) se combinó con ácido fosfórico, 85% (460 ml), y se concentró a presión reducida hasta un volumen de alrededor de 230 l. El concentrado se mantuvo a temperatura ambiente durante un día. (Nota: en experimentos subsiguientes se intentaron tiempos de reposo más prolongados. Los cristales obtenidos se filtraron de forma más fácil que los obtenidos aquí). Los cristales se lavaron con hexano, y se secaron a 40ºC.

El producto aislado de la fracción principal tuvo alrededor de 0,1% de área de RRT0.95, y alrededor de 1,7% de área de RRT1.25.

El producto aislado de la fracción previa tuvo alrededor de 3% de área de RRT0.95, y alrededor de 0,3% de área de RRT1.25.

Ejemplo 2

Se repitió el procedimiento general del ejemplo 1 para investigar el efecto de la composición del eluyente y del caudal.

A través de estos experimentos, se pudo establecer que la reducción del caudal de elución aumenta la eficacia de separación de la cromatografía. El aumento del caudal de elución reduce la eficacia de la cromatografía. Un caudal de 25 cm/cm^{2}.hora (en lugar de 6,9-8,2 cm/cm^{2}.hora) dio como resultado una reducción significativa de la eficacia, pero se pudo recoger una fracción principal que tiene la calidad de aquella descrita en el Ejemplo 1.

Además se estableció que el primer eluyente de 34% en volumen de THF (en lugar de 33% en volumen) incrementó el rendimiento de la cromatografía. El rendimiento fue 69%. El nivel de impureza de RRT0.95 de la fracción principal fue 0,10% de área.

Cuando se usó un eluyente que tiene 31% en volumen de THF, aumentó el tiempo de elución de tacrolimus. Se encontró que las concentraciones de eluyente mencionadas (31%, 33%, 34%, 40% en volumen de tetrahidrofurano) eran usables para la elución de tacrolimus, sin incrementar la concentración del disolvente.

Estos experimentos adicionales también establecieron que igualmente eran eficaces mezclas de eluyentes de
agua:tetrahidrofurano:disolventes. Los disolventes ensayados usados para los eluyentes de agua:tetrahidrofurano:di-
solvente fueron metanol, acetonitrilo, acetona, n-propanol y n-butanol. En todos los casos, se obtuvo una calidad adecuada.

Ejemplo 3

Los porcentajes de área se refieren al porcentaje de área de los cromatogramas de HPLC obtenidos mediante el método descrito aquí anteriormente.

El procedimiento a continuación se llevó a cabo a 20ºC hasta 25ºC.

Se preparó un lecho de resina de sorción (Diaion SP 207) en una columna (diámetro de 3,2 cm) que usa agua para cargar la columna (aprox. 550 ml de resina de sorción húmeda).

Se disolvió tacrolimus (7,2 g) en una mezcla de acetonitrilo (30 ml) y agua (20 ml). El tacrolimus contenía alrededor de 2,6% de área de RRT0.95 (ascomicina), y alrededor de 2,9% de área de RRT1.25 (dihidrotacrolimus).

La disolución de tacrolimus se cargó como una capa sobre la parte superior del lecho de resina de sorción húmeda.

La columna se eluyó con aprox. 8 l de eluyente constituido de acetonitrilo/agua/ácido fosfórico (600:400:1). El caudal de elución fue 90 ml/hora.

Las fracciones 32-45 se combinaron. Las fracciones combinadas contenían 1,9 g de tacrolimus. El contenido de impurezas de las fracciones combinadas fue alrededor de 2,9% de área de RRT0.95 (ascomicina), y alrededor de 1,2% de área de RRT1.25 (dihidrotacrolimus).

El proceso de purificación descrito es adecuado para la reducción de dihidrotacrolimus. Preferentemente, el eluyente tiene un contenido de acetonitrilo de alrededor de 30% hasta 70%, preferentemente alrededor de 40% hasta 65%.

El contenido de ácido inorgánico se usa para evitar la descomposición del tacrolimus durante la cromatografía. Preferentemente, el ácido inorgánico es ácido fosfórico. Preferentemente, el contenido de ácido fosfórico está entre alrededor de 0,0005 a 0,003 partes de ácido por 1 parte de eluyente.

El proceso de purificación descrito aumenta la eficacia de los procesos descritos por los ejemplos 1 y 2.

Ejemplo 4

Se prepararon dos columnas para cromatografía según el ejemplo 1. Antes de la cromatografía, se adsorbieron
3000 g de sustancia activa que contiene tacrolimus sobre una resina de sorción XAD 1180 según el siguiente procedimiento. El tacrolimus se disolvió en 15 l de acetona. Se añadió resina de sorción (33 l) a la disolución, y se añadieron 90 l de agua lentamente a la mezcla de disolución/resina, con agitación continua. La carga de alimentación de resina de sorción se colocó encima (se yuxtapuso) como una capa sobre la parte superior de la resina de sorción contenida en la primera columna.

La primera columna se eluyó con una mezcla de tetrahidrofurano:agua (34% en volumen de THF). El caudal de elución fue 15 l/hora. Se recogieron fracciones de 20 l cada una. El volumen de cada fracción fue 20 l. Después de la elución de la 35ª fracción, la segunda columna se conectó (se acopló de forma fluida) en serie con la primera columna, y la elución se continuó en las columnas en serie.

Después de que eluyese la 95ª fracción, se desconectó la primera columna, y la elución se continuó sólo en la segunda columna. Las fracciones adecuadas purificadas se combinaron.

La parte principal de THF se eliminó de las fracciones combinadas mediante evaporación a presión reducida. El concentrado se extrajo con acetato de etilo, y las fases se separaron. La fase de acetato de etilo separada se concentró a presión reducida (aprox. 1 parte de tacrolimus y 1 parte de acetato de etilo). Se añadieron lentamente ciclohexano y agua al extracto de acetato de etilo concentrado. El tacrolimus precipitado se recuperó de la mezcla a 0-30ºC. Los cristales se filtraron y se secaron.

La sustancia de partida contenía aprox. 0,5% de área de ascomicina (RRT0.95) y aprox. 1,3% de dihidrotacrolimus (RRT1.25). Los cristales producidos contenían menos de 0,1% de área de ascomicina, y aprox. 0,4% de área de dihidrotacrolimus.

Ejemplo 5

Se disolvió tacrolimus en una mezcla de agua:tetrahidrofurano (67 volúmenes:33 volúmenes). La concentración del disolvente lograda fue aprox. 30 g/litro. La disolución se hizo pasar sobre resina de sorción XAD 1180. La resina de sorción adsorbió el tacrolimus.

Tras la adsorción, la elución de tacrolimus continuó como en el ejemplo 1.

Ejemplo 6

Se disolvió tacrolimus en una mezcla de agua:tetrahidrofurano (67 volúmenes:33 volúmenes). La concentración de disolvente lograda fue aprox. 30 g/litro. La disolución se hizo pasar sobre resina de sorción HP20. La resina de sorción adsorbe el tacrolimus.

Tras la adsorción, la elución de tacrolimus continúa como en el ejemplo 1.

Ejemplo 7

Se preparó un lecho de resina de sorción (Amberlite® XAD 1180) en una columna (diámetro de 45 cm) que usa agua:THF para cargar la columna (aprox. 100 l de resina de sorción húmeda).

Se añadió agua (86 l) lentamente, con agitación, a una disolución de ascomicina (1227 g) en acetonitrilo (10 l), en la que se suspendió la resina de sorción (Amberlite® XAD 1180; 9 l) con agitación. La ascomicina usada contenía RRT1.00 (tacrolimus). Cuando la adición de agua estuvo terminada, la carga de alimentación de resina de sorción se recogió por filtración.

La carga de alimentación recogida se cargó (se yuxtapuso) como una capa sobre la parte superior del lecho de resina de sorción húmeda.

La columna se eluye en primer lugar con aproximadamente 1800 l de un primer eluyente constituido de THF/agua (33% en volumen de THF). La columna se eluyó entonces con un segundo eluyente constituido de THF/agua (40% en volumen de THF). El caudal de elución es alrededor de 11 a 13 l/h (6,9 a 8,2 cm/h). Se recogió una fracción principal, aprox. 460 l, que contiene ascomicina. También se recogió una fracción previa, aprox. 80 l, que contiene ascomicina.

La fracción principal (460 l) se combinó con ácido fosfórico, 85% (460 ml), y se concentró a presión reducida hasta un volumen de alrededor de 230 l. El concentrado se mantuvo a temperatura ambiente durante un día. Los cristales se lavaron con hexano y se secaron a 40ºC.

Ejemplo 8

Se prepararon dos columnas para cromatografía según el ejemplo 1.

Antes de la cromatografía, se adsorbieron 3000 g de sustancia activa, que contiene ascomicina, sobre la resina de sorción XAD 1180 según el siguiente procedimiento. La ascomicina se disolvió en 15 l de acetona. Se añadió resina de sorción (33 l) a la disolución, y se añadieron lentamente 90 l de agua a la mezcla de disolución/resina, con agitación continua. La carga de alimentación de resina de sorción se puso en la parte superior (se yuxtapuso) como una capa sobre la parte superior de la resina de sorción contenida en la primera columna.

La primera columna se eluyó con una mezcla de tetrahidrofurano:agua (34% en volumen de THF). El caudal de elución es 15 l/hora. Se recogieron fracciones de 20 l cada una. El volumen de cada fracción fue 20 l. Después de la elución de la 35ª fracción, se conectó la segunda columna (se acopló de forma fluida) en serie a la primera columna, y la elución se continuó en las columnas en serie.

La mayor parte del THF se eliminó de las fracciones combinadas mediante evaporación a presión reducida. El concentrado se extrajo con acetato de etilo, y las fases se separaron. La fase de acetato de etilo separada se concentró a presión reducida (aprox. 1 parte de ascomicina y 1 parte de acetato de etilo). Se añadieron lentamente ciclohexano y agua al extracto de acetato de etilo concentrado. La ascomicina precipitada se recuperó de la mezcla a 0-30ºC. Los cristales se filtraron y se secaron.

Ejemplo 9

Se añadió agua (86 l) lentamente, con agitación, a una disolución de sirolimus (1227 g) en acetonitrilo (10 l), en la que la resina de sorción (Amberlite® XAD 1180; 9 l) se suspendió con agitación. El sirolimus usado contiene impurezas. Cuando la adición de agua estuvo terminada, la carga de alimentación de resina de sorción se recogió por filtración.

La columna se eluye en primer lugar con aprox. 1800 l de un primer eluyente constituido de THF/agua (33% en volumen de THF). La columna se eluyó entonces con un segundo eluyente constituido de THF/agua (40% en volumen de THF). El caudal de elución es alrededor de 11 a 13 l/h (6,9 a 8,2 cm/h). Se recogió una fracción principal, aprox. 460 l, que contiene sirolimus. También se recogió una fracción previa, aprox. 80 l, que contiene sirolimus.

Ejemplo 10

Se prepararon dos columnas para cromatografía según el ejemplo 1.

Antes de la cromatografía, se adsorbieron 3000 g de sustancia activa, que contiene sirolimus, sobre la resina de sorción XAD 1180 según el siguiente procedimiento. El sirolimus se disolvió en 15 l de acetona. Se añadió resina de sorción (33 l) a la disolución, y se añadieron lentamente 90 l de agua a la mezcla de disolución/resina, con agitación continua. La carga de alimentación de resina de sorción se puso en la parte superior (se yuxtapuso) como una capa sobre la parte superior de la resina de sorción contenida en la primera columna.

La mayor parte del THF se eliminó de las fracciones combinadas mediante evaporación a presión reducida. El concentrado se extrajo con acetato de etilo, y las fases se separaron. La fase de acetato de etilo separada se concentró a presión reducida (aprox. 1 parte de sirolimus y 1 parte de acetato de etilo). Se añadieron lentamente ciclohexano y agua al extracto de acetato de etilo concentrado. El sirolimus precipitado se recuperó de la mezcla a 0-30ºC. Los cristales se filtraron y se secaron.

Ejemplo 11

Se añadió agua (86 l) lentamente, con agitación, a una disolución de everolimus (1227 g) en acetonitrilo (10 l), en la que la resina de sorción (Amberlite® XAD 1180; 9 l) se suspendió con agitación. El everolimus usado contiene impurezas. Cuando la adición de agua estuvo terminada, la carga de alimentación de resina de sorción se recogió por filtración.

La columna se eluye en primer lugar con aprox. 1800 l de un primer eluyente constituido de THF/agua (33% en volumen de THF). La columna se eluyó entonces con un segundo eluyente constituido de THF/agua (40% en volumen de THF). El caudal de elución es alrededor de 11 a 13 l/h (6,9 a 8,2 cm/h). Se recogió una fracción principal, aprox. 460 l, que contiene everolimus. También se recogió una fracción previa, aprox. 80 l, que contiene everolimus.

Ejemplo 12

Se prepararon dos columnas para cromatografía según el ejemplo 1.

Antes de la cromatografía, se adsorbieron 3000 g de sustancia activa, que contiene everolimus, sobre la resina de sorción XAD 1180 según el siguiente procedimiento. El everolimus se disolvió en 15 l de acetona. Se añadió resina de sorción (33 l) a la disolución, y se añadieron lentamente 90 l de agua a la mezcla de disolución/resina, con agitación continua. La carga de alimentación de resina de sorción se puso en la parte superior (se yuxtapuso) como una capa sobre la parte superior de la resina de sorción contenida en la primera columna.

La mayor parte del THF se eliminó de las fracciones combinadas mediante evaporación a presión reducida. El concentrado se extrajo con acetato de etilo, y las fases se separaron. La fase de acetato de etilo separada se concentró a presión reducida (aprox. 1 parte de everolimus y 1 parte de acetato de etilo). Se añadieron lentamente ciclohexano y agua al extracto de acetato de etilo concentrado. El everolimus precipitado se recuperó de la mezcla a 0-30ºC. Los cristales se filtraron y se secaron.

Ejemplo 13

Se añadió agua (86 l) lentamente, con agitación, a una disolución de pimecrolimus (1227 g) en acetonitrilo (10 l), en la que la resina de sorción (Amberlite® XAD 1180; 9 l) se suspendió con agitación. El pimecrolimus usado contiene impurezas. Cuando la adición de agua estuvo terminada, la carga de alimentación de resina de sorción se recogió por filtración.

La columna se eluye en primer lugar con aprox. 1800 l de un primer eluyente constituido de THF/agua (33% en volumen de THF). La columna se eluyó entonces con un segundo eluyente constituido de THF/agua (40% en volumen de THF). El caudal de elución es alrededor de 11 a 13 l/h (6,9 a 8,2 cm/h). Se recogió una fracción principal, aprox. 460 l, que contiene pimecrolimus. También se recogió una fracción previa, aprox. 80 l, que contiene pimecrolimus.

Ejemplo 14

Se prepararon dos columnas para cromatografía según el ejemplo 1.

Antes de la cromatografía, se adsorbieron 3000 g de sustancia activa, que contiene pimecrolimus, sobre la resina de sorción XAD 1180 según el siguiente procedimiento. El pimecrolimus se disolvió en 15 l de acetona. Se añadió resina de sorción (33 l) a la disolución, y se añadieron lentamente 90 l de agua a la mezcla de disolución/resina, con agitación continua. La carga de alimentación de resina de sorción se puso en la parte superior (se yuxtapuso) como una capa sobre la parte superior de la resina de sorción contenida en la primera columna.

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La mayor parte del THF se eliminó de las fracciones combinadas mediante evaporación a presión reducida. El concentrado se extrajo con acetato de etilo, y las fases se separaron. La fase de acetato de etilo separada se concentró a presión reducida (aprox. 1 parte de pimecrolimus y 1 parte de acetato de etilo). Se añadieron lentamente ciclohexano y agua al extracto de acetato de etilo concentrado. El pimecrolimus precipitado se recuperó de la mezcla a 0-30ºC. Los cristales se filtraron y se secaron.

Claims

1. Método para separar un macrólido seleccionado de entre el grupo constituido por tacrolimus, ascomicina, sirolimus, everolimus y pimecrolimus, de las impurezas que contiene, que comprende las etapas siguientes:

b): cargar la carga en un lecho de resina de sorción,

2. Método según la reivindicación 1, en el que la carga de un macrólido contiene además una porción de carga de una resina de sorción.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la carga se deposita sobre la porción de carga a partir de su disolución en un disolvente orgánico, en una etapa que incluye combinar la disolución con un antidisolvente.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el disolvente orgánico se selecciona de entre el grupo constituido por tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo, metanol, etanol, n-butanol, n-propanol, iso-propanol, ésteres, y disolventes apróticos dipolares.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el disolvente orgánico se selecciona de entre el grupo constituido por tetrahidrofurano, acetona y acetonitrilo.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el antidisolvente se selecciona de entre el grupo constituido por agua, alcanos lineales o ramificados, o cicloalcanos.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el antidisolvente es agua.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que la relación de disolución combinada a antidisolvente combinado es 40% o menos.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además la etapa de aislar el macrólido de dicha por lo menos una fracción, en el que el macrólido tiene un nivel final de impurezas que es menor que el nivel inicial de impurezas.

10. Método según la reivindicación 9, en el que el aislamiento comprende la etapa de concentrar dicha por lo menos una fracción a presión atmosférica (alrededor de 101.300 Pa) o a una presión menor que 101.300 Pa, y una temperatura de 70ºC o menor, preferentemente 60ºC o menor.

11. Método según la reivindicación 10, que comprende además la etapa de, antes de concentrar, combinar dicha por lo menos una fracción con un ácido inorgánico.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el ácido inorgánico es ácido fosfórico.

13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que la cantidad del ácido es 1 a 10 ml por litro de eluyente.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el aislamiento comprende la etapa de combinar un antidisolvente con dicha por lo menos una fracción de eluyente.

15. Método según la reivindicación 14, en el que, antes de la combinación, dicha por lo menos una fracción de efluente se concentra a una presión menor que 101.300 Pa.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la resina de sorción es una resina macrorreticular.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la resina macrorreticular se selecciona de entre el grupo constituido por resinas Amberlite® XAD y resinas de sorción de Diaion.

18. Método según la reivindicación 17, en el que la resina macrorreticular es Amberlite® XAD 1180.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el lecho de resina de sorción está confinado en una columna.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el volumen de efluente recogido en por lo menos una fracción comprende 60% a 90%, en peso, del macrólido inicialmente presente en la carga.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el caudal del eluyente es menor que 25 cm/h.

22. Método según la reivindicación 21, en el que el caudal del eluyente es menor que 15 cm/h.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en el que el macrólido es tacrolimus.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el eluyente comprende una mezcla de tetrahidrofurano y agua que tiene 20% en volumen a 50% en volumen de tetrahidrofurano.

25. Método según la reivindicación 24, en el que el eluyente tiene 31% en volumen a 40% en volumen de tetrahidrofurano, preferentemente 33% en volumen a 35% en volumen de tetrahidrofurano.

26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el eluyente comprende una mezcla de acetonitrilo y agua que tiene 30% en volumen a 70% en volumen de acetonitrilo, preferentemente 40% en volumen a 65% en volumen de acetonitrilo.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que el eluyente incluye hasta 0,003 partes de ácido fosfórico por 1 parte de eluyente, en volumen.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que la carga se carga sobre la porción de carga de resina de sorción en un sistema recirculante.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se conecta por lo menos un lecho adicional de resina de sorción al lecho de resina de sorción de la etapa b.

30. Método según la reivindicación 29, en el que, tras una serie adicional de fracciones de eluyente, se desconecta el lecho de resina de la etapa b.

31. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el macrólido es tacrolimus, y las impurezas en él son ascomicina y dihidrotacrolimus.