ES2298789T3 - Dispositivo de aferesis. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo de aféresis con un soporte sólido que puede entrar en contacto con el flujo de sangre o de plasma, caracterizado porque el soporte sólido comprende un receptor que se une a la proteína precursora de a-amiloide (APP).
Description
Dispositivo de aféresis.
La presente invención se refiere a un
dispositivo de aféresis, que comprende un soporte sólido que puede
entrar en contacto con el flujo de sangre o de plasma.
Por aféresis se entienden métodos de tratamiento
cuyos efectos terapéuticos se basan en la eliminación extracorpórea
de proteínas patógenas, sustancias patógenas unidas a proteínas,
sustancias patógenas libres o células patógenas de la sangre. Si la
proteína patógena puede eliminarse solamente del plasma libre de
células, del plasma se eliminan anteriormente las células
sanguíneas por medio de un separador de plasma de membrana
(separación de plasma) o por medio de una hemocentrífuga. En el
intercambio de plasma no selectivo (plasmaféresis), el plasma del
paciente intercambiado se separa en su totalidad, eliminando, además
de las sustancias patógenas, también todas las otras proteínas
vitales. Esto hace necesaria una substitución del plasma eliminado
con electrolitos, albúmina humana o plasma fresca. En los métodos
de aféresis de plasma selectivos, es posible eliminar las proteínas
de plasma separado de forma completamente específica por medio de
adsorción, precipitación o filtración, permitiendo la
re-infusión del plasma sin pérdida sustancial del
volumen una vez realizada la eliminación. Dichos métodos selectivos
presentan la ventaja de que se puede prescindir de una solución de
substitución. En los métodos de aféresis selectivos de la sangre
entera, las proteínas patógenas se adsorben específicamente y sin
separación de plasma anterior directamente a partir de la sangre sin
tratamiento previo, con lo cual - al contrario de los métodos de
separación de plasma - puede prescindirse tanto de la separación de
plasma como de la adición de una solución de substitución. Otra
forma subordinada de la aféresis es la citaféresis, en la que se
eliminan células de la sangre. Esto permite la obtención selectiva
de leucocitos, eritrocitos, trombocitos, granulocitos o incluso
células madre.
A pesar de que en la actualidad la aféresis (por
ejemplo en forma de plasmaféresis o citaféresis) se utiliza
predominantemente para la obtención de plasma de donante (como
conserva de plasma, para el aislamiento de fracciones de plasma
distintas o para la obtención de productos sanguíneos), los métodos
de aféresis se hacen cada vez más importantes también en el campo
terapéutico. Así, en la actualidad, se están tratando toda una
serie de enfermedades metabólicas con los métodos de aféresis (por
ejemplo hipercolesterinemia (familial), enfermedad coronaria
progrediente con incremento (aislado) de Lp(a), síndrome de
quilomicronemia, insuficiencia de hígado, ...), enfermedades
renales (síndrome Good Pasture, lupus eritematoso sistémico con
nefritis por lupus, granulomatosis de Wegener, síndrome
hemolítico-urémico, glomerulonefritis
focal-esclerosante idiopática, síndromes asociados
a la paraproteinemia, púrpura crioglobulinémica, sensibilización HLA
en los trasplantes renales, ...) enfermedades del sistema nervioso
central (miastenia gravis, síndrome de
Guillain-Barri, poliradiculoneutritis
demielinisante crónica, polineuropatía paraproteinémica, síndrome de
Lambert-Eaton, síndrome de Refsum, ...),
enfermedades del sistema inmune (artritis reumatoide, hemofilia de
inhibidores, pemfigus, ...), enfermedades de la circulación
sanguínea y de la microcirculación (síndrome de hiperviscosidad,
síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, microangiopatía
trombótica tras un implante de medula de hueso, degeneración de la
mácula dependiente de la edad, caída de oído, disfunciones
periféricas de la microcirculación, cardiomiopatía dilatativa
idiopática, vasculapatía de transplante tras un trasplante de
corazón, hipercolesterinemia familial homocigoto,
glomeruloesclerosis focal segmentaaria, síndrome
hemolítico-urémico, ...), intoxicaciones,
insuficiencia de hígado aguda, neoplasmas, hiperhidratación,
tireotoxicosis, etc., (ver Psycherembel (257ª Edición) término
"Plasmaféresis"; www.nephrologie.de/172Apharese.htm).
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una
perturbación neurológica, progresiva para la que no existe en la
actualidad un tratamiento eficaz. El aspecto típico de dicha
enfermedad son las placas cerebrales que contienen el péptido
\beta-amiloide y estructuras neuronales en forma
de filamentos constituidas por la proteína TAU asociado al
microtúbulo. Aunque tanto el \beta-amiloide y TAU
se consideran relevantes para la patogénesis, los resultados de
investigación más recientes parecen indicar que el
\beta-amiloide es el agente predominante en la
patogénesis. Por tanto, se están desarrollando cada vez más
terapéuticos cuyo objetivo es impedir la producción de
\beta-amiloide, la agregación de
\beta-amiloide o los eventos neurotóxicos causados
por dichos agregados. Una reseña detallada de las estrategias
terapéuticas tomadas hasta la actualidad para EA puede encontrarse
en el artículo sinóptico de Wolfe (Nature Review Drug Discovery 1
(2002) 859-866).
Las placas de \beta-amiloide
se forman a partir de la denominada proteína precursora
\beta-amiloide (APP), que es una proteína
transmembrana integral (para la cual tampoco existe una función
fisiológica documentada; sin embargo, los resultados de
investigación más recientes hacen suponer que la APP funciona como
el denominado receptor Cargo de membrana para quinesina I). La APP
es degradada proteolíticamente por las denominadas secretasas,
formando fisiológicamente en particular un péptido A\beta de 40
aminoácidos (A\beta_{40}). Otras formas más cortas y más largas
del péptido A\beta se forman tambien, en particular una versión de
42 aminoácidos (A\beta_{42}), que presenta una alta capacidad
de agregación. Por tanto, dicha forma A\beta_{42} es la forma
predominante en las placas amiloideas. Las secretas responsables de
dichas degradaciones distintas (\alpha-, y en particular \beta,
y gamma-secretasa) son las dianas de ataque
primarias de una posible estrategia de tratamiento de EA. Por
tanto, se ha intentado utilizar moduladores o inhibidores para
dichas enzimas para el tratamiento de EA (tales como por ejemplo
benzodiazepinas, sulfonamidas, benzocaprolactamas.
Otro gen asociado a la EA es la apolipoproteína
E, para la que existen tres variantes alelas (APOE2, APOE3 y
APOE4). Se ha hallado las personas con una o dos copias de la APOE4
presentan un mayor riesgo de EA, mientras que los portadores de
APOE2 presentan un menor riesgo en comparación con la población
total. También se ha hallado que las personas que toman estatinas,
es decir, medicamentos que inhiben la biosíntesis de colesterinas,
presentan un riesgo sustancialmente reducido de EA. Por tanto, otra
estrategia de tratamiento de EA se centra en la inhibición de la
biosíntesis de colesterinas, precisamente por medio de por ejemplo
estatinas.
Otro planteamiento para el tratamiento de EA se
refiere a la inhibición de la agregación de amiloides en las placas
cerebrales, que podría llevarse a cabo también por medio de
inhibidores de secretas, entre otros. Además, se ha propuesto
reducir el contenido de cinc, puesto que cinc es capaz de inducir la
agregación de A\beta al estar presente en concentraciones
fisiológicamente relevantes.
Finalmente, se han descrito también estrategias
inmunológicas, por ejemplo una inmunización con A\beta42, que,
sin embargo, tuvo que pararse dentro de un estudio clínico debido a
los efectos secundarios graves (Willke, Bild der Wissenschaft, 9
(2003), 24-28).
Otras estrategias de tratamiento de EA
propuestas en el estado de la técnica se refieren a la prevención de
la expresión de APP y al aumento del aclaramiento (clearance)
A\beta, buscándose para la primera sustancias que interactúan con
la región de APP Promoter. Con relación al aclaramiento A\beta, se
ha propuesto un aumento de la actividad de proteasas determinadas,
tal como la enzima que degrada la insulina y la neprolisina o la
aplicación periférica de anticuerpos anti-A\beta
(De Mattos et al., PNAS 98 (15) (2001),
8850-8855). Finalmente, se ha intentado también
volver a disolver las placas amiloideas ya existentes por ejemplo
por medio de la reducción del nivel de
\beta-amiloide en el suero de pacientes de EA. En
esto contexto, se ha propuesto también reducir los depósitos de
plaque de las proteínas \beta-amiloide en el
cerebro por medio de métodos de aféresis (US nº 6
551 266, en la que se ha propuesto la eliminación de macromoléculas
con un peso molecular de más de 500 kD por aféresis), sin que haya
podido demostrarse su eficacia para EA. Sin embargo, los métodos de
aféresis no son capaces de disolver directamente las placas ya
existentes en las células del cerebro (la barrera sangre/cerebro es
insuperable para las placas y para las moléculas con más de 500
kD).
Por tanto, el objetivo de la presente invención
es proporcionar una nueva estrategia de tratamiento y prevención
para la enfermedad de Alzheimer.
De este modo, la presente invención proporciona
un dispositivo de aféresis, que comprende un soporte sólido que
puede hacer contacto con la sangre o el plasma, tal como conocido
por ejemplo por el documento US-A-4
770 774, que presenta un receptor que se une a la proteína
precursora de \beta-amiloide (APP). El dispositivo
de aféresis presente permite realizar de forma selectiva en los
pacientes de EA o las personas con alto riesgo de EA un
aclaramiento de APP o productos de degradación de APP, en particular
A\beta40 o A\beta42, por medio de aféresis. Es conocido que
existe un equilibrio dinámico de A\beta42 entre el sistema
nervioso central (SNC) y el plasma. Se ha podido demostrar en un
modelo de ratón (DeMattos PNAS 2001, ver arriba) que la aplicación
periférica de anticuerpos anti-A\beta afecta al
"aclaramiento" A\beta_{42} del SNC y del plasma y reduce
la carga de A\beta_{42} en el cerebro, sin que los anticuerpos
anti-A\beta superen la barrera sangre/cerebro.
Estos resultados fueron confirmados por Matsuoka et al.
(Journal of Neuroscience 2003: 29-33) por medio de
la aplicación periférica de otras moléculas que se unen a A\beta42
(gelsolin y GM1). Esto significa que el proceso de formación de las
placas en el cerebro puede suprimirse captando A\beta_{42} en la
sangre. En este proceso, no es crítico si los receptores presentes
en el dispositivo de aféresis y contactados con la sangre o el
plasma del paciente son específicos para A\beta_{42} u otras
formas de degradación de APP, lo único importante es que esta
adsorción específica elimine APP y sus productos de degradación
(proteolíticos), en particular A\beta_{42}, de la sangre, para
que no tenga lugar una degradación de proteína "incorrecta"
(es decir dando A\beta42). De este modo, la presente invención se
basa en un planteamiento de aplicación para la aféresis
completamente distinto de la patente US nº 6.551.g266, es decir, en
la eliminación de los elementos constituyentes potenciales de
plaque y no de las placas finales. Por cierto, la eliminación de las
placas por medio de aféresis es descartada desde el principio como
método eficaz para el tratamiento de EA, puesto que la aféresis de
la sangre ni siquiera puede llegar a las regiones del cerebro donde
se forman las placas.
Por otro lado, frente a los métodos que producen
una reducción de la concentración de A\beta en el cuerpo mismo
(tal como por ejemplo en DeMattos et al., PNAS 98 (15)
(2001), 8850-8855 con anticuerpos
anti-A\beta periféricos), la aféresis según la
invención presenta la ventaja decisiva de que no se pueden disparar
respuestas autoinmunes. Además, según la invención, tampoco hay que
administrar al paciente sustancias que no pueden actuar hasta que
lleguen dentro del cuerpo (posiblemente no hasta que sean
transportadas a un sitio determinado), sino que se elimina el
agente patógeno selectivamente, es decir, se separa la causa de la
enfermedad de forma específica y extracorpórea, sin que tengan que
eliminarse los productos de reacción en el cuerpo.
Esto permite, según la invención, adaptar los
dispositivos de aféresis ya existentes y conocidos en todas sus
formas de realización fácilmente a la presente invención. En
particular, la selección del soporte sólido (y del dispositivo de
aféresis) debería tener en cuenta su aptitud médica. Soportes,
procedimientos y dispositivos de este tipo se han descrito, entre
otros, en el documento WO 97/48483 A, y las patentes US nº
5.476.715, nº 6.036.614, nº 5.817.528 ó nº 6.551.266. Los aparatos
de aféresis comerciales correspondientes se venden, entre otras, en
las empresas Fresenius, Affina, Plasmaselect, ASAHI, Kaneka, Braun,
etc., tales como por ejemplo el LDL-Therasorb®, el
Immunosorba®, el Prosorba®, el Globaffin®, el
Ig-Therasorb®, el Immusorba®, el Liposorba®, el
HELP®, el DALI®, el Absorber BR-350 de
bilirrubina/ácido gállico, el destoxificador Prometheus®, el MARS®,
el sistema ADAsorb de Medicap o el sistema Plasma FLO. Todos estos
sistemas - aunque en su forma comercial no sean dirigidos en primer
lugar a la eliminación específica de una sola proteína - pueden ser
adaptados por un experto en la materia de aféresis sin más a la
presente invención, por ejemplo como inmunaféresis y/o instalando
el soporte sólido según la invención (por ejemplo como columna) en
el dispositivo de aféresis.
Por tanto, la expresión "receptores que se
unen a APP" se refiere según la invención también a todas las
sustancias que presenten una afinidad para el ligando APP y sus
productos secundarios biológicos, en particular A\beta_{42}, y
que son capaces de eliminar dichos polipéptidos de la sangre o del
plasma de pacientes de EA o de personas con un riesgo de EA. Dichos
receptores para APP o A\beta_{42} pueden ser preferentemente
anticuerpos (poli- o monoclonales), proteínas, péptidos,
gangliósidos o ácidos nucleicos.
Se prefieren en particular anticuerpos
anti-APP, anticuerpos
anti-A\beta40, o anticuerpos
anti-A\beta_{42} proteínas que se unen a APP,
en particular gelsolin, apoJ, o apoE, péptidos que se unen a APP,
gangliósidos que se unen a APP, en particular G_{M1}, o ácidos
nucleicos que se unen a APP, en particular aptámeros) o mezclas de
dichos receptores.
Entre los ejemplos de anticuerpos de este tipo,
se incluyen 3D6 (A\beta_{1-5}), 2H3
(A\beta_{1-12}), 2G3
(A\beta_{33-40}), 21F12
(A\beta_{33-42}), 12H7
(A\beta_{33-42}) (Johnson-Wood
et al., PNAS 1997:1550-1555), 10D5, 16C11
(Bard et al., Nature Medicine 2000:916-919),
los anticuerpos (m266, m243) descritos por DeMattos et al.
(2001) así como los anticuerpos de la misma especificidad. Los
anticuerpos de este tipo se obtienen por ejemplo al inmunizar
mamíferos con formulaciones de vacunas que contienen APP,
A\beta42 o fragmentos o variantes de las mismas, seguido, si se
desea, de fusión celular y protocolos de selección de clones (en
caso de anticuerpos monoclonales).
Gelsolin (Matsuoka et al 2003, ver
arriba), apoJ y apoE (DeMattos et al 2001, ver lo expuesto
anteriormente) son otros ejemplos de receptores de proteína que se
unen a APP. GM1 es un ejemplo de un receptor de gangliósido que se
une a APP (Matsuoka et al 2003, ver arriba).
Otros ejemplos de proteínas que se unen a APP
son la CETP (proteína de transferencia de ésteres de colesterol) y
la proteína ERAB (con un tamaño de 261 AA; He et al., JBC 273
(17) (1998), 10741-10746; Lustbader et al.,
Science 304 (2004), 448-452; en particular AA
1-186 o 1-158). Ejemplos de péptidos
que se unen a APP son los fragmentos que se unen a APP y son
derivados de las proteínas que se unen a APP. Ejemplos concretos de
los péptidos que se unen a APP son KTYNLKKGQT-C
("Péptido 4077"), GIAVASKTYNLKKGQTHTLEDFQRVLDV (ERAB
93-120), SKTYNLKKG-QTHT (ERAB
98-110), C-HQKLVFFAED ("Péptido
1323"), C-EVHHQKLVFFAEDVGS ("Péptido 1324"),
C-HQKIVFFAED ("Péptido 1325"), y
FGFPEHLLVDFLQSLS-C ("Péptido 1208") (o también
todos los demás fragmentos ERAB, CETP o
\beta-breaker que contienen las zonas que se unen
a APP) (las cisteinas terminales de dichos péptidos no forman parte
de la secuencia de proteína nativa, sino que se incluyen para
acoplar los péptidos).
Los péptidos que funcionan como receptores que
se unen a APP pueden componerse de D- o
L-aminoácidos o combinaciones de D- y
L-aminoácidos y pueden haberse modificado, si se
desea, por modificaciones adicionales, cierre de anillos o
formación de derivados. Los receptores de péptidos adecuados para
por ejemplo A\beta_{42} pueden ser proporcionados por
bibliotecas de péptidos, que están disponibles en el mercado.
Preferentemente, dichos péptidos presentan una longitud de por lo
menos 5, preferentemente 6, aminoácidos, en particular por lo menos
8 aminoácidos, cuyas longitudes preferidas pueden extenderse hasta
11, preferentemente hasta 14 ó 20, aminoácidos. Sin embargo, según
la invención, pueden utilizarse como receptores que se unen a APP
también sin más péptidos más largos. Además, entre los receptores
adecuados, se incluyen oligómeros (tales como por ejemplo
polietilenimina y polilisina).
Naturalmente, para la preparación de los
receptores de este tipo que se unen a APP, también son aptas
bibliotecas de fagos, bibliotecas de péptidos, por ejemplo
producidas por la química combinatoria por medio de técnicas de
throughput-screening para una amplia gama de
estructuras (ver, por ejemplo, en Phage Display: A Laboratory
Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al; Willats WG, Phage
Display: Practicalities and Prospects, Plant Mol Biol. 2002 Dec;
50(6): 837-54;
http://www.microcollections.de/showpublications.php#). Además de las
bibliotecas de fagos a base de randomización, también son aptas
bibliotecas que utilizan un display ribosomal o un display
bacteriano. Las bibliotecas correspondientes y los procedimientos
para su generación son conocidos por los expertos en la materia y
se han descrito, entre otros, en los documentos US 2004/0110281 A,
WO 00/72880 A y WO 02/059148 A.
Además, pueden utilizarse también los receptores
que se unen a APP a base de ácidos nucleicos ("aptámeros";
pero también oligodesoxinucleótidos "decoy" (oligonucleótidos
ds que, a base de su secuencia, constituyen sitios de unión para
los factores de transcripción), que pueden encontrarse también por
medio de una amplia gama de bibliotecas (de oligonucleótidos) (por
ejemplo los que presentan 2-180 radicales de ácido
nucleico (por ejemplo Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug
Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700; Famulok et
al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer
et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, y muchos
otros). El esqueleto de ácido nucleico puede encontrarse por
ejemplo por medio de los compuestos de fosfodiéster, pero también
por medio de fosforotioatos o combinaciones o variaciones químicas
(por ejemplo como PNA), en las que, según la invención, pueden
utilizarse como bases en particular U, T, A, C, G, H y mC. Los
radicales 2' de los nucleótidos que pueden utilizarse según la
invención son preferentemente H, OH; F, Cl, NH_{2},
O-metilo, O-etilo,
O-propilo u O-butilo en los que los
ácidos nucleicos pueden estar modificados también de otra manera, es
decir, pueden proveerse por ejemplo de grupos protectores tales
como se utilizan normalmente en la síntesis de oligonucleótidos.
Por tanto, para los fines de la presente invención, los aptámeros
que se unen a APP también constituyen moléculas de afinidad
preferidas que se unen a APP.
Los aptámeros para APP pueden encontrarse por
ejemplo utilizando el procedimiento descrito a continuación. Se
contacta APP inmovilizada (u otra de las formas descritas
anteriormente) con una mezcla de ácidos nucleicos, separando los
ácidos nucleicos que se unen con alta afinidad de los ácidos
nucleicos que se unen con baja afinidad o no se unen en absoluto.
Las mezclas de los ácidos nucleicos son típicamente bibliotecas de
ácidos nucleicos, que se prepararon por ejemplo por la ruta de la
química combinatoria. Una biblioteca de ácidos nucleicos contiene
un gran número de ácidos nucleicos distintos uno del otro, en los
que por lo menos en una parte de la secuencia se ha establecido una
randomización (con nucleótidos naturales y/o no naturales). Puede,
pero no debe, haberse previsto una parte de la secuencia conservada.
Una randomización en n posiciones con m nucleótidos distintos
produce una biblioteca con nm elementos.
Con el fin de encontrar ácidos nucleicos de
afinidad específicos de APP, se llevan a cabo las siguientes etapas:
a) una columna se carga (por el interior) con APP (etc.), y APP
(etc.) se inmoviliza dentro de la columna, b) la mezcla de ácidos
nucleicos se introduce por un extremo de la columna, habiéndose
establecido un caudal definido de la sustancia portadora, que va
del primer extremo al segundo extremo de la columna, c) los ácidos
nucleicos se unen a APP con afinidad descendiente para APP (etc.) a
una distancia ascendiente del primer extremo de la columna y se
inmovilizan, d) el caudal de la sustancia portadora por la columna
se termina tras un tiempo de marcha definido, e) la columna se
separa en segmentos de columna por medio de una pluralidad de
divisiones y a cada segmento se asigna una coordenada de camino
transcurrido, f) de por lo menos un segmento se desorben los ácidos
nucleicos inmovilizados de manera no específica y se obtienen
asignando la coordenada de camino transcurrido al segmento. El
término por el interior de la columna significa dentro de un lumen
en toda su generalidad. El término columna debería comprender
cualquier
tipo de sistemas de soportes sólidos, por ejemplo también sistemas de soporte que no estén completamente encerrados.
tipo de sistemas de soportes sólidos, por ejemplo también sistemas de soporte que no estén completamente encerrados.
La inmovilización de APP (etc.) puede realizarse
según los métodos convencionales de la cromatografía en columna. El
término columna se refiere a cualquier constructo mecánico que
presente un lumen con dos extremos. Entre los materiales
estructurales aptos, se incluyen todos los materiales convencionales
para columnas, tales como metales, vidrio y/o plásticos. Por su
interior, la columna puede estar provista de una matriz que se une a
APP (etc.) y/o el material estructural puede ser apto o haberse
preparado para la unión directa de las moléculas de destino. Una
mezcla de ácidos nucleicos se denomina biblioteca de ácidos
nucleicos de típicamente 10^{6} a 10^{22} /mol, en particular
de 10^{10} a 10^{21}/mol, de especies de ácidos nucleicos ácidos
nucleicos distintas una de otra. En la biblioteca introducida en la
columna, cada especie de ácido nucleico está representada
estadísticamente con un número de típicamente 10 a 10^{17}, en
particular de 100 a 10^{13}, moléculas. La sustancia portadora es
normalmente un líquido en la que la biblioteca de ácidos nucleicos
es soluble y estable. Aptos para esto son todos los tampones
convencionales para bibliotecas de ácidos nucleicos y similares. El
caudal de la sustancia portadora puede ajustarse antes de aplicar la
biblioteca de ácidos nucleicos. A continuación, la biblioteca de
ácidos nucleicos se adiciona al caudal de la sustancia portadora por
el lado de entrada de la columna. Sin embargo, también es posible
introducir la biblioteca de ácidos nucleicos directamente. Tras un
tiempo de marcha determinado por la estructura de la columna y el
caudal ajustado, el "tapón" aplicado por medio de la
biblioteca de ácidos nucleicos sale por el lado de salida de la
columna (ampliado por pliegue con la difusión), lo cual separa los
ácidos nucleicos ligados del "tapón" y los inmoviliza en la
columna. Ventajosamente, el caudal se ajusta a un flujo poco o no
turbulento, preferentemente laminar (suma de los vectores de
aceleración de la sustancia portadora sobre el volumen de la
columna, en particular sobre la sección transversal, a un mínimo,
en el caso ideal 0). El número total de las moléculas de APP en la
columna es típicamente de 10^{2} a 10^{16} más, en particular
10^{3} a 10^{15} más, que el número de las moléculas de los
ácidos nucleicos de una sola especie en la biblioteca de ácidos
nucleicos aplicada. La unión de los ácidos nucleicos a las
moléculas de APP se realiza preferentemente en las condiciones que
corresponden a la utilización posterior de los ácidos nucleicos
durante la aféresis, por ejemplo en un tampón adecuado, adaptado de
forma adecuada con relación a la temperatura, fuerza iónica, valor
pH y las condiciones de tampón. La sustancia portadora así como el
disolvente de la biblioteca de ácidos nucleicos deben seleccionarse
entonces de forma adecuada con relación a sus componentes. La
división de la columna en una pluralidad de segmentos de la columna
puede realizarse cortando la columna, realizándose los cortes
preferentemente ortogonalmente al vector del caudal. Sin embargo,
la columna puede haberse compuesto también anteriormente por
segmentos de la columna, en cuyo caso un segmento de columna se
enfila estrechamente con el próximo segmento de columna
preferentemente en la dirección del vector de caudal (sección
transversal de junta ortogonal al vector de caudal). En este caso,
la división puede realizarse deshaciendo el conjunto de segmentos de
columna formado anteriormente. La desorción no específica puede
llevarse a cabo por elución con un ligando lo suficientemente fuerte
por desplazamiento, formación de complejos, modificación y/o
destrucción de APP fisicoquímica o térmicamente. Métodos mecánicos,
por ejemplo ultrasonido, pueden utilizarse también para la desorción
o para reforzar la desorción. Pueden aplicarse también
combinaciones de los métodos de desorción citados anteriormente. Se
da por entendido que los ácidos nucleicos no deben ser destruidos
por los métodos de desorción utilizados.
Las etapas descritas anteriormente se basan en
el hallazgo de que una biblioteca de ácidos nucleicos puede
separarse espacialmente por cromatografía de afinidad de forma
análoga a una mezcla de proteínas según su afinidad para la
molécula de destino, en el caso descrito aquí para APP (etc.). La
invención se basa asimismo en el hallazgo de que un mezclado de los
ácidos nucleicos desorbidos de afinidades distintas obtenido como
resultado de la desorción no específica puede evitarse dividiendo la
columna que contiene los ácidos nucleicos unidos a la misma, antes
la desorción no específica, por decir así en secciones de afinidad,
lo que permite desorber de forma no específica los ácidos nucleicos
unidos a las secciones de afinidad o segmentos de columna así
obtenidos fácilmente y sin interferencias por acoplamiento de
ligandos por ejemplo dentro de una PCR o RT-PCR y
también amplificarlos de forma igualmente no específica. De esta
manera, se eviten los artefactos de selección subsiguientes.
Tampoco se necesitan ligandos, en particular altas concentraciones
de ligandos, para la desorción. Finalmente, todas las moléculas de
los ácidos nucleicos unidas y después desortas están disponibles
para una amplificación. Esto permite trabajar con bajas
concentraciones de ácidos nucleicos. En principio, ya es suficiente
si cada especie está representada en la biblioteca de ácidos
nucleicos en el promedio estadístico con una molécula. Si el número
de las moléculas de APP en un segmento de columna es
estadísticamente 1, es posible separar incluso especies de ácidos
nucleicos individuales según su afinidad para la molécula de
destino.
Una ventaja particular de dicho procedimiento se
ilustrará a continuación. De la separación de los ácidos nucleicos
según su afinidad resulta que los ácidos nucleicos en un segmento de
columna presentan una afinidad similar, pero una especificidad
diferente (se unen a regiones diferentes de APP o las mismas son
sitios de unión para los ácidos nucleicos de afinidad para
APP).
En principio, es suficiente si un segmento al
que se ha asignado la afinidad deseada se somete (aislado) a un
procesamiento ulterior por desorción. Sin embargo, esto supone -
excepto cuando la afinidad es máxima, en cuyo caso se somete el
primer segmento de columna (relativo al vector de caudal) a un
procesamiento ulterior - que se tenga una idea de la distribución
de afinidad de la biblioteca de ácidos nucleicos aplicada. Por
tanto, por lo general, es preferido que se desorban los ácidos
nucleicos inmovilizados por separado de cada segmento y se obtengan
asignando en cada caso las coordenadas del camino transcurrido de
cada segmento a los ácidos nucleicos obtenidos del mismo.
En principio, cualquier tipo de desorción es
posible. Preferentemente, la desorción no específica se realizará
por medio de los métodos fisicoquímicos o térmicos convencionales.
La desorción térmica se efectúa calentando el segmento de columna o
de la solución contenida en el mismo. El calentamiento puede
realizarse por ejemplo por calentamiento eléctrico o irradiación
con microondas o IR. Son aptas en particular las técnicas de
calentamiento de la tecnología PCR. Naturalmente, además de la
amplificación de ácidos nucleicos o aptámeros por medio de
polimerasa, pueden aplicarse también otros métodos de amplificación,
tal como por ejemplo por medio de ligasa. La desorción no
específica puede ser asistida por modificación química de APP, por
ejemplo oxidación con periodato sódico o similares, o por formación
de complejo no específica, por ejemplo por medio de borato o similar
para bloquear los enlaces de
cis-trans-diol en carbohidratos.
Por tanto, se prefiere realizar la desorción no
específica por desorción térmica en una fase de alta temperatura,
preferentemente alargada, de una PCR o RT-PCR. Esto
produce un efecto sinérgico, puesto que por lo general, en
particular cuando se trabaja con bibliotecas de ácidos nucleicos a
bajas concentraciones de la especie de ácido nucleico, es necesaria
de todas formas una amplificación. Para aumentar el rendimiento, se
trabajará por ejemplo con entre 5 y 60, preferentemente entre 20 y
60, más preferentemente entre 45 y 55, ciclos. Dentro de la
amplificación, es posible trabajar por lo menos con un cebador
marcado. El cebador puede comprender por lo menos un punto de corte
de endonucleasa. Un punto de corte de este tipo sirve por ejemplo
para eliminar la mayor parte de la secuencia del cebador del
amplificado. Los elementos constituyentes de ácido nucleico, o bien
en el cebador o bien en los ácidos nucleicos a seleccionar, pueden
ser marcados por ejemplo con colorantes fluorescentes. Como
ejemplos de colorantes fluorescentes pueden citarse: Alexa TM Fluor
488, Fluor 532, Fluor 546, Fluor 568, Fluor 594, Oregon Green 488,
fluoresceína, rodaminas 6G, tetrametilrodaminas, rodaminas B y
Texas Red. El amplificado puede ser marcado también con dos
modificaciones químicas distintas por extremos distintos, siempre
que los grupos introducidos por la modificación sean aptos cada uno
para unirse como ligando a una matriz de afinidad distinta.
Para la separación segura de los ácidos
nucleicos no afines o poco afines, se recomienda incorporar etapas
de lavado entre etapas adecuadas del procedimiento. En particular,
se prefiere llevar a cabo por lo menos una etapa de lavado entre
las etapas del procedimiento d) y e). Apto para el lavado es por
ejemplo el disolvente o el medio de la biblioteca de ácidos
nucleicos o la sustancia portadora.
Es preferido realizar el recubrimiento de la
columna por el interior con APP (etc.) y su inmovilización por
medio de enlaces covalentes, preferentemente tras activación con
grupos de alta reactividad química (por ejemplo cloruro de tresilo,
cianobromuro y/o periodato) o a través de compuestos espaciadores
bifuncionales tras modificación con grupos de baja reactividad
química (por ejemplo amino, hidroxi, keto y/o carboxilo). Entre los
ejemplos de los compuestos espaciadores aptos para los esqueletos
espaciadores se incluyen: grupos
C2-C10-alquilo substituidos y no
substituidos, grupos
C2-C10-alquenilo substituidos y no
substituidos, grupos
C2-C10-alquinilo substituidos y no
substituidos, grupos
C4-C7-carbocicloalquilo substituidos
y no substituidos, grupos
C4-C7-carbocicloalquenilo
substituidos y no substituidos grupos
C7-C14-aralquilo substituidos y no
substituidos, una molécula heterocíclica con heteroátomos
seleccionados entre nitrógeno, oxígeno, azufre, en los que dichas
sustituciones pueden consistir en alquilo, alquenilo, alquinilo,
alcoxi, tiol, tioalcoxi, hidroxi, arilo, bencilo, fenilo, nitro,
halógeno, grupos éter con entre 2 y 10 átomos de carbono entre 1 y
4 átomos de oxígeno o azufre, polialquilglicol, halógeno, hidroxi,
tiol, keto, carboxilo, amidas, compuestos de éter, tioéter,
derivados de arnidina, derivados de guanidina, derivados de
glutamilo, nitrato (ONO_{2}), Nitro (NO_{2}), nitrilo,
trifluorometilo (-CF_{3}), trifluorometoxi (-OCF_{3}),
O-alquilo, S-alquilo,
NH-alquilo, N-dialquilo,
O-aralquilo, S-aralquilo,
NH-aralquilo, amino, azido (N_{3}), hidrazino
(NHNH_{2}), hidroxilamino (ONH_{2}), sulfóxidos (SO), sulfonas
(SO_{2}), sulfuros (S-), disulfuros (S-S),
sililo. Típicamente, los compuestos espaciadores son bifuncionales,
en los que las funcionalidades pueden ser iguales o diferentes y
están seleccionadas por ejemplo del grupo constituido por
"N-hidroxisuccinimido y hidrazidas".
Para reducir la variedad dentro de los ácidos
nucleicos obtenibles de un segmento de columna, se prefiere que
cada segmento de columna contenga en el promedio estadístico 0,1 a
10^{3}, preferentemente 1 a 10^{2}, de forma más preferida 1 a
10, moléculas de APP (etc.). Adaptada a esto, la biblioteca de
ácidos nucleicos, tal como se ha aplicado, puede contener en el
promedio estadístico 0,1 a 10^{3}, preferentemente 1 a 10^{2},
de forma más preferida 1 a 10, moléculas de ácido nucleico de una
especie.
Los materiales que son aptos para el material
estructural de la columna son básicamente todos los materiales
conocidos por ejemplo de la cromatografía de afinidad. Entre ellos
se incluyen gel de sílice o polímeros, tales como polietileno tras
activación por formación de derivados química o activación por
plasma. Ventajosamente, la longitud de los segmentos de columna se
sitúa en el intervalo comprendido entre 0,1 \mum y 1 mm,
preferentemente entre 0,1 y 100 \mum, de forma más preferida
entre 0,05 y 10 \mum. Cortes de este tipo son fáciles de preparar
por ejemplo por medio de un micrótomo. Ventajosamente, el diámetro
interno de la columna está comprendido entre 0,5 y 1 mm,
preferentemente entre 0,1 y 0,5 mm, de forma más preferida entre 0,2
y 0,4 mm.
Es ventajoso eliminar los ácidos nucleicos no
deseados antes de la separación propiamente dicha (unión o
separación mecánica). Los ácidos nucleicos no deseados son por
ejemplo los ácidos nucleicos que se unen a las superficies internas
libres de APP. En este caso, una columna libre de APP puede
conectarse corriente arriba y la biblioteca de ácidos nucleicos
puede pasarse primero por la misma.
En los procedimientos citados anteriormente,
puede trabajarse de forma continua, es decir, conectando las
columnas por ejemplo en serie, o de forma discontinua, recogiendo el
eluado en el entretanto por ejemplo de la columna anterior.
Para conseguir otra mejora de la separación por
afinidad, es básicamente posible proceder de maneras distintas.
Así, los ácidos nucleicos que han sufrido desorción de uno o más
segmentos, si se desea tras una amplificación, pueden someterse de
forma repetida al procedimiento según la invención, y/o la elutropia
de las condiciones de desorción puede aumentarse (temperatura,
fuerza iónica, valor pH, condiciones de tampones). Alternativamente,
puede disminuirse la densidad espacial de la APP y por consiguiente
de los ácidos nucleicos unidos, es decir, el número de las moléculas
de APP, en un segmento de columna.
Por tanto, para los objetivos de la presente
invención, los aptámeros que se unen a APP (que incluyen, según la
invención, tal como se ha definido anteriormente, también los
aptámeros que se unen a A\beta42) son también receptores
preferidos que se unen a APP.
Por tanto, según la invención, los receptores
que se unen a APP, constituidos preferentemente por péptidos,
anticuerpos o ácidos nucleicos, se utilizan unidos a un material de
soporte, para la eliminación extracorpórea de APP y de sus
productos de degradación del cuerpo de los pacientes (a riesgo) de
Alzheimer.
La aplicación de la presente invención a la
práctica rutinaria de médica requiere que el portador sea estéril y
libre de pirógeno, con lo cual cualquier sustancia portadora o
cualquier combinación de receptor/portador que cumple con dichas
características es preferida según la invención (ver, por ejemplo,
las patentes US nº 6.030.614 o US nº 5.476.715).
Entre los ejemplos que son aptos, se incluyen homopolímeros
porosos, co- o terpolímeros de monómeros que contienen vinilo (por
ejemplo ácido acrílico, tales como por ejemplo TSK Toyopearl,
Fractogel TSK), portadores con modificaciones (activaciones) con
compuestos que contienen oxirano (por ejemplo epiclorhidrina) y,
dado el caso, otras reacciones con compuestos que contienen
NH_{3}, amino o carboxilo, o adsorbentes de CNBr o CNCl, tal como
se ha descrito en los documentos EP 110 409 A y DE 36 17 672 A. Los
materiales adsorbentes particularmente preferidos para fines
terapéuticos son aptos para evitar una pérdida de células
sanguíneas, no activan el sistema de complemento o sólo en menor
grado y, si es posible, retardan la formación de agregados en el
circuito extracorpóreo. Además, los materiales de soportes deberían
ser también en forma acoplada a los receptores preferentemente lo
suficientemente estables frente a las medidas de esterilización, en
particular frente a la saturación con óxido de etileno, saturación
con glutaraldehído, irradiación gamma, tratamiento con vapor,
tratamiento UV, tratamiento con disolventes y/o tratamiento con
detergente, etc. Por ejemplo, pueden utilizarse también productos a
base de sefarosa, agarosa, acrilo, vinilo, dextrano, etc., que
preferentemente ya contienen, en su forma disponible en el mercado,
grupos funcionales que son aptos para enlazar con los receptores
que se unen a APP. Entre los portadores adicionales aptos, se
incluyen también monolitos (portadores a base del polímero
metacrilato de glicidilo/co-dimetacrilato de
etilenglicol) Subpol (Poschalko et al., J Am Chem Soc. 2003
Nov 5; 125 (44): 13415-26).
Para el acoplamiento de los receptores a los
portadores aptos, puede utilizarse la química conocida por los
expertos en la materia (por ejemplo Bioconjugate Techniques, Greg T
Hermanson, Ed., Academic Press, Inc, San Diego, CA, 1995, 785
pp).
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere a la utilización del dispositivo según la invención para
proporcionar un dispositivo para el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer o para la prevención de una enfermedad de este tipo
preparando el dispositivo para ser apto para el tratamiento del
paciente respectivo. El tratamiento se realiza conectando un
paciente al aparato de aféresis durante un periodo de tiempo
suficiente para una eliminación eficaz de los polipéptidos de APP y
contactando el flujo de la sangre o del plasma del paciente con el
soporte sólido que comprende el receptor que se une a APP, lo cual
da lugar a la unión de APP y/o de los productos de degradación
proteolíticos de APP, en particular A\beta42. En el transcurso del
tratamiento de aféresis, hay que asegurar naturalmente el acceso a
las venas periféricas o centrales o fístulas
arterio-venosas, y también una
anti-coagulación suficiente, así como registrar los
datos de cuantificación y de medición. Además, en la mayoría de los
procedimientos de aféresis será necesario realizar una separación
primaria de las células sanguíneas y del plasma antes del
tratamiento del plasma propiamente dicho. Las personas especiales
para las que es necesaria una medida preventiva son las personas con
antecedentes familiares, personas mayores (>50, >60 o >70
años) o personas con otro factor de riesgo para EA, en particular
factores genéticos.
A continuación, la invención se ilustrará con
mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos así
como a las figuras de los dibujos, a los cuales no estará
naturalmente limitado, en los que:
La Fig. 1 muestra el enlace de A\beta_{42}
con el péptido 1208 (acoplado con BSA y aplicado a una placa
ELISA);
La Fig. 2 muestra el enlace del péptido 1208 (y
de 1208-BSA) con A\beta_{42} (aplicado a una
placa ELISA);
La Fig. 3 muestra la unión competitiva de
A\beta_{42} en 1208-BSA.
Una columna CIM® Epoxy Monolithic (BIA
Separations, SI) se equilibra según las especificaciones del
fabricante con un tampón de fosfato sódico 0,5 M a un pH de 8,0, y
se activa un anticuerpo monoclonal contra el péptido A\beta
también según las especificaciones del fabricante y se acopla a la
columna CIM. La columna se lava varias veces con el tampón de
fosfato (+ NaCl 1 M) y cualquier grupo epoxi presente en exceso se
bloquea.
Se asegura la calidad mediante un control en el
eluado de equlibración y lavado, utilizándose sólo las columnas sin
grupos epoxi activos y sin fugas de anticuerpos en el eluado para el
procesamiento posterior, instalándose en un aparato de
aféresis.
Un material de agarosa a granel (Sepharose CL4B)
se introduce de forma aséptica en un recipiente estéril y libre de
pirógeno, y el material se lava de forma aséptica, secando el
material de gel completamente al vacío entre cada etapa de lavado.
A continuación, la sefarosa se esteriliza al vapor de agua en una
autoclave a 115ºC durante 30 minutos.
Tras la esterilización, la sefarosa se introduce
en acetona/agua al 60% en un recipiente estéril y se activa con
CNBr y trietilamina (14 g de CNBr por 96 ml de acetona; 30 ml de
trietilamina en 66,2 ml de acetona al 87%). A continuación, se
adicionó una solución de acetona/HCl (392 ml de agua estéril, libre
de pirógeno; 16,3 ml de HCl 5 N, 408 ml de acetona). La sefarosa
activada se lava y se somete a la reacción de acoplamiento dentro
de 2 h, con el fin de impedir la hidrólisis de los grupos
activados.
Una solución de anticuerpo filtrada en
condiciones estériles (m266 o m243) se introduce en el recipiente de
reacción y se agita durante por lo menos 90 min. Finalmente, la
solución de reacción se lava cuidadosamente (con un tampón de
fosfato isotónico) hasta que ya no se detecten productos de la
reacción en el eluado, y la sefarosa acoplada a los anticuerpos se
introduce en columnas de vidrio estériles y depirogenizadas de
vidrio sinterizado y se somete a un control de calidad final
(análisis del eluado con respecto a los productos de reacción,
metales pesados, etc.; análisis de partículas, pirogenicidad;
esterilidad).
En el Instituto Para Diabetes "Gerhard
Katsch", se ha desarrollado un sistema miniaturizado
extracorpóreo para la aplicación de la terapia de aféresis en el
modelo de animales pequeño rata. Un sistema de prueba aferético de
este tipo está disponible por todo el mundo sólo de forma limitada.
El tratamiento aferético repetido en el mismo animal de prueba y
las investigaciones subsiguientes en la fase de observación
posterior para la evaluación del éxito terapéutico son de gran
valor novedoso y no han sido descritos en las publicaciones
internacionales.
La aféresis es un método de terapia alternativa,
en el que se eliminan de la sangre fuera del cuerpo las sustancias
que provocan enfermedades. En la medicina humana, la aféresis se ha
utilizado hasta la actualidad para el tratamiento de más de 100
enfermedades. La aféresis ha permitido eliminar por lo menos
parcial- o totalmente de la sangre sustancias relevantes de
enfermedades, entre otros, en las enfermedades autoinmunes, tales
como artritis reumatoide, miastenia grave, oftalmopatía endocrina,
esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, síndrome
Stiff-Man y diabetes tipo 1. Sin embargo, hasta la
actualidad la aféresis está reconocida sólo como un método
alternativo para el tratamiento de enfermedades crónicas resistentes
a la terapia y asociadas a gran estrés y a una restricción
sustancial de la calidad de vida de los pacientes involucrados. Un
motivo principal de esto es el hecho de que hasta la actualidad no
están disponibles conocimientos detallados referentes a los
mecanismos de acción de una terapia de la aféresis eficaz.
La utilización de los modelos animales
reconocidos, tales como por ejemplo los para la diabetes tipo 1 y la
artritis reumatoide, permite tanto elucidar más los mecanismos de
acción de los procedimientos de aféresis como ensayar
preclínicamente nuevos tipos de indicación para el tratamiento
aferético. Para realizar los tratamientos, los animales de prueba
fueron provistos primero con catéteres vasculares crónicos. A
continuación, por el circuito extracorpóreo se separaron los
componentes plasmáticos y celulares de la sangre pasándolos por
filtros de plasma. Mientras que los componentes celulares son
devueltos inmediatamente al animal, el plasma puede purificarse,
antes de ser devuelto, por medio de métodos de adsorción distintos
(adsorción inmune u otros). La buena compatibilidad de los
tratamientos aferéticos repetidos de este tipo ya ha sido
documentada para distintas especies de ratas (peso corporal,
hematocrito, condición general). El sistema de prueba aferético ha
sido ensayado con éxito en animales con un peso mínimo de 250
g
y ha sido utilizado en los modelos de ratas para las enfermedades autoinmunes (diabetes tipo I, artritis inducida por colágeno tipo II).
y ha sido utilizado en los modelos de ratas para las enfermedades autoinmunes (diabetes tipo I, artritis inducida por colágeno tipo II).
El sistema extracorpóreo para la plasmaféresis
en el modelo de animales pequeños puede utilizarse para tipos
diferentes de adsorción. La aplicación de dicho sistema de prueba a
los modelos para las enfermedades crónicas permite (A) ensayar
nuevos estrategias de tratamiento y prevención, (B) la elucidación
de los mecanismos de acción de diferentes tecnologías aferéticas y
(C) la determinación del tipo de indicación para los procedimientos
de terapia aferéticos. El IDK es su socio competente para el ensayo
preclínico de los procedimientos aferéticos recién desarrollados y
puede contribuir sustancialmente a transferir e introducir en el
mercado nuevos procedimientos terapéuticos desde la fase de
desarrollo hasta la prueba experimental en animales y la aplicación
clínica en el paciente (http://www.praeklinik.de).
Antes de comenzar la terapia aferética
experimental, los animales están provistos de los catéteres
arteriales y venosos o se utilizan ratas crónicamente cateterizadas
(catéteres vasculares aptos para la administración de sustancias de
prueba y para la toma de muestras de sangre así como para la
realización de la terapia aferética y las investigaciones Clamp en
el modelo animal). En un primer paso de la aféresis, primero se
separan las células sanguíneas del plasma mediante un filtro de
plasma. Mientras que las células sanguíneas se devuelven
inmediatamente al animal por difusión (mediante el catéter venoso),
el plasma obtenido por la separación se pasa por el agente de
adsorción preparado en el Ejemplo 1 (separando los ligandos del
plasma uniéndolos a los péptidos de afinidad inmovilizados), antes
de devolverlo al animal.
Por la columna se pasa una corriente de acetona.
Para su activación, se pasa una solución anhidra (2 ml de acetona,
1 ml de cloruro de tresilo, algunas gotas de piridina) por la
columna (diez veces el volumen de la columna) y la misma se incuba
sobre hielo durante la noche. A continuación, se pasa una corriente
de acetona al 100% (anhidra) con veinte veces el volumen de la
columna. La columna activada puede guardarse en HCl 1 mM.
Por un tubo de polietileno se pasa una solución
(permanganato de potasio al 2% (KMnO_{4}) (p/v) en ácido
sulfúrico concentrado (H_{2}SO_{4})) con 20 veces el volumen de
la columna y luego la columna se lava con una corriente de agua
destilada. Para el acoplamiento adicional de la superficie de la
columna, pueden utilizarse para la reticulación moléculas bi- o
polivalentes que contienen por lo menos un grupo aldehídico
reactivo (por ejemplo 1% de glutaraldehído). Dichas moléculas se
pasan por la columna a 4ºC durante 1 h. A continuación, la reacción
se estabiliza por condiciones reductoras (por ejemplo utilizando
cianoborohidruro sódico (0,00025% p/v en NaCl 0, 15 M, pH 3,9).
Por la columna activada por cloruro de tresilo,
se pasa una corriente de Na_{2}CO_{3} 0,1 M (pH 8,5). Para el
acoplamiento, se pasa repetidamente un péptido o proteína (2 mg/ml
de Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 8,5) a 37ºC durante 2 h y a
continuación sobre hielo por la columna durante 4 h. A continuación,
para bloquear los sitios de unión libres de la columna, se pasa un
exceso de glicina 0,2 M, pH 8, para la columna.
Por la columna activada, se pasa una corriente
de Na_{2}CO_{3} 0,1 M (pH 8,5). Para el acoplamiento se pasa
A\beta_{42} de (2 mg/ml de Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 8,5)
varias veces por la columna a 37ºC durante 2 h y a continuación
sobre hielo durante 4 h. Para bloquear los sitios de unión libres,
se pasa a continuación un exceso de glicina 0,2 M, pH 8, por la
columna. Para mejorar la reacción, es posible adicionar
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC), al 5% p/v.
Por la columna activada por cloruro de tresilo
se pasa una corriente de Na_{2}CO_{3} 0,1 M (pH 8,5). Si se
desea eliminar una molécula con una o más aminas primarias o
secundarias, dicha molécula o la mezcla (2 mg/ml de
Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 8,5) se pasa por la columna repetidas
veces a temperatura ambiente durante la noche. Para bloquear los
sitios de unión libres de la columna, se pasa a continuación un
exceso de glicina 0,2 M, pH 8, por la columna. Si no se desea una
eliminación de moléculas determinadas con una o más aminas
primarias o secundarias, todos los sitios de unión de la columna se
bloquean con glicina.
Otros procedimientos para la formación de
derivados pueden encontrarse por ejemplo en las siguientes
referencias: Patterson, W. J., National Aeronautics and Space
Administration, Technical Memorandum, NASA
TMX-73311, U.S. Government Printing Office,
Washington D.C., 1976, Ma, S. M., Gregonis D. E., von Wagenen, R.
A., and Andrade, J. D., en "Hydrogels for Medical and Related
Applications" (J. D. Andrade, Ed.), Amer. Chem. Soc. Symp.
Series, Vol. 31, p. 241, 1976, Harris, J. M., Struck, E. C., Case,
M. G., Paley, M. S., Van Alstine, J. M., and Brooks, D. E., J.
Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 22, 341 (1984), Regnier and Noel,
Regnier, F. E., and Noel, R. J., J. Chromatog. Sci., 14 (1976),
Yalpani, M. and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed.,
23, 395 (1985).
Las columnas recubiertas se conectan en serie
sin fuga, primero las columnas para la eliminación de las moléculas
no deseadas y entonces la columna de A\beta_{42}. Para la
equilibración, se pasa un tampón adecuado, por ejemplo una solución
de tampón (Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5
mM y gelatina al 0,001% (p/v), pH 8,3) sobre hielo por la columna
durante 1 h. Los ácidos nucleicos de la biblioteca de ácidos
nucleicos combinatoria se introducen en 1 ml del mismo tampón y,
para fundir las dobles hebras, se calientan a 95ºC durante 10 min
y, a continuación, se pasan repetidas veces (4-30
veces) por la columna. A continuación, las columnas se separan y se
lavan sobre hielo con el tampón seleccionado (ver arriba) durante la
noche. La separación de la columna en dirección del flujo se
efectúa con una herramienta de corte adecuada.
Para el análisis de la unión de
beta-amiloide al péptido 1208, se acopló el péptido
en primer lugar a una proteína portadora (BSA), siendo la
concentración del péptido de 500 \mumol (aproximadamente 1 mg/ml).
El 1208 conjugado con BSA se unió a una placa ELISA, uniéndose 100
ng de péptido por pozo. La placa ELISA se saturó con PBS, BSA al 1%
y, a continuación, la unión de beta-amiloide
(1-42) se analizó en un intervalo de
concentraciones de 8 a 1000 ng/pozo. El
beta-amiloide unido se detectó con un anticuerpo
específico de ratón. Utilizando un anticuerpo
anti-ratón biotinilado y peroxidasa acoplada a
estreptavidina, se determinó finalmente la cantidad del
beta-amiloide unido. El substrato utilizado era
ABTS, que se analizó en un lector ELISA a una longitud de onda de
405 nm. (Fig. 1).
Para analizar la unión del péptido 1208, se unió
beta-amiloide (1-42) a una placa
ELISA (500 ng por pozo). A continuación, la placa ELISA se saturó
con PBS, BSA al 1% y entonces se adicionó el péptido 1208 libre o
el 1208 conjugado con BSA (1,6-50 ng). El péptido
unido se detectó con un anticuerpo monclonal específico. Para la
cuantificación final, se utilizó un anticuerpo
anti-ratón biotinilado y peroxidasa acoplada a
estreptavidina. El substrato utilizado era ABTS, que se analizó en
un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm. (Fig. 2).
El 1208 conjugado con BSA se unió a una placa
ELISA (100 ng de péptido por pozo), y la placa ELISA se saturó con
PBS, BSA al 1%. A continuación, la unión de
beta-amiloide (1-42) (1000 ng por
pozo) se analizó en presencia del péptido 1208 libre o del péptido
de control (intervalo de concentración 30-2000
ng/pozo). La detección del beta-amiloide unido se
realizó tal como se ha descrito. (Fig. 3).
Claims (4)
1. Dispositivo de aféresis con un soporte
sólido que puede entrar en contacto con el flujo de sangre o de
plasma, caracterizado porque el soporte sólido comprende un
receptor que se une a la proteína precursora de
\beta-amiloide (APP).
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el receptor que se une a APP se ha
seleccionado de entre anticuerpos anti-APP,
anticuerpos anti-A\beta_{40}, anticuerpos
anti-A\beta_{42}, proteínas que se unen a APP,
en particular gelsolin, apoJ o apoE, péptidos que se unen a APP,
gangliósidos que se unen a APP, en particular GM1, o ácidos
nucleicos que se unen a APP, en particular aptámeros o mezclas de
dichos receptores.
3. Dispositivo según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el soporte es una columna estéril y
libre de pirógeno.
4. Utilización de un dispositivo según una de
las reivindicaciones 1 a 3, para proporcionar un dispositivo de
tratamiento destinado al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o
para la prevención de la misma.
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