ES2299476T3 - Expresion hibrida de proteinas de neisseria. - Google Patents

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Abstract

Una proteína híbrida de fórmula NH2-A-B-COOH, en la que A comprende la proteína BG287 de Neisseria, y B comprende la proteína 953 de Neisseria, y en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína híbrida es la descrita en SEQ ID NO:6, o es una secuencia que tiene más de 70% de coincidencia de secuencia con ésta.

Description

Expresión híbrida de proteínas de Neisseria.
Campo técnico
Esta invención pertenece al campo de la expresión de proteínas. En particular, se refiere a la expresión heteróloga de proteínas de Neisseria (por ejemplo, N. gonorrhoeae o, preferiblemente, N. meningitidis).
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Antecedentes de la técnica
Las solicitudes de patente internacional WO99/24578, WO99/35544, WO99/57280 y WO00/22430 describen proteínas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Estas proteínas se describen, de forma típica, expresadas en E. coli (es decir, una expresión heteróloga) como fusiones con GST N-terminales o como fusiones con marcador de His C-terminales, aunque también se describen otros sistemas de expresión, incluyendo la expresión en Neisseria nativa.
Guillén et al., Biotecnología aplicada, 1996, vol. 13, nº 4, pp. 271-275 describen una proteína de fusión de la proteína P.1.15 de Neisseria con la proteína P64K, y su expresión en E. coli.
Un objeto de la presente invención es proporcionar estrategias alternativas y mejoradas para la expresión heteróloga de estas proteínas. Estas estrategias afectan, de modo típico, al nivel de expresión, la facilidad de purificación, la localización celular de la expresión y/o las propiedades inmunológicas de la proteína expresada.
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Descripción de la invención
Según la invención, se expresan dos proteínas de Neisseria como una única proteína híbrida. Se prefiere no utilizar un compañero de fusión que no provenga de Neisseria (por ejemplo, GST o poli-His).
Esto ofrece dos ventajas. En primer lugar, una proteína que puede ser inestable, o que se expresa poco por sí sola, puede mejorarse añadiendo un compañero de hibridación adecuado que solucione el problema. En segundo lugar, se simplifica la fabricación comercial, ya que sólo es necesario emplear una expresión y purificación para producir dos proteínas útiles por separado.
Por tanto, la invención proporciona una proteína híbrida de fórmula NH_{2}-A-B-COOH, en la que A comprende la proteína \DeltaG287 de Neisseria, y B comprende la proteína 953 de Neisseria, y en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína híbrida es la descrita en SEQ ID NO:6, o es una secuencia que tiene más de 70% de coincidencia de secuencia con ésta.
Las proteínas proceden preferiblemente de la cepa 2996 o de la cepa 394/98.
Preferiblemente, las proteínas constituyentes (A y B) en una proteína híbrida según la invención procederán de la misma cepa.
Las proteínas fusionadas en el híbrido pueden unirse directamente o pueden unirse a través de un péptido conector, por ejemplo, mediante un conector de poliglicina (es decir, G_{n} en el que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), o a través de una secuencia peptídica corta que facilite la clonación. Evidentemente, se prefiere no unir una proteína \DeltaG al C-terminal de un conector de poliglicina.
Las proteínas fusionadas pueden carecer de los péptidos conductores nativos, o pueden incluir la secuencia peptídica conductora del compañero de fusión N-terminal.
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Hospedante
Se prefiere utilizar un hospedante heterólogo. El hospedante heterólogo puede ser procariota o eucariota. Preferiblemente es E. coli, pero otros hospedantes adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etc.
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Secuencias
La invención también proporciona una proteína que presenta coincidencia de secuencia con la proteína de SEQ ID NO 6. Tal como se describió anteriormente, el grado de "coincidencia de secuencia" es preferiblemente mayor que 70% (por ejemplo, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor).
El grado de "coincidencia de secuencia" se determina preferiblemente mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, ejecutado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), empleando una búsquedad de huecos afines con los parámetros penalización de hueco abierto = 12 y penalización de extensión de hueco = 1. De forma típica, se considera que 50% o más de coincidencia entre dos proteínas es una indicación de equivalencia funcional.
Las proteínas de la invención se encuentran en el serogrupo B de N. meningitidis.
Las proteínas de la invención preferidas son las del serogrupo B de la cepa 2996 (Petterson et al., Intect. Immun., 1993, 61(11):4724-4733) o de la cepa 394/98 (una cepa de Nueva Zelanda) (Martín et al., JID, 1998, 177:447-500) de N. meningitidis. A menos que se indique lo contrario, las proteínas mencionadas en la presente proceden de la cepa 2996 de N. meningitidis. Sin embargo, se apreciará que la invención no está limitada, en general, por la cepa.
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Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1 a 6 muestran las proteínas híbridas descritas en la presente.
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Modos de realizar la invención
Ejemplo 1
Híbridos de \DeltaG287
Se descubrió que la deleción de la secuencia (Gly)_{6} en 287 tiene un profundo efecto sobre la expresión proteica. La proteína que carece de los aminoácidos N-terminales hasta GGGGGG se denomina "\Delta287". En la cepa MC58, su secuencia básica (el péptido conductor está subrayado) es:
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La \DeltaG287, con o sin un marcador de His ("\DeltaG287-His" y "\DeltaG287K", respectivamente) se expresa a niveles muy buenos, comparada con "298-His" o "297^{sin \ marcar}".
Basándose en los datos de variabilidad genética, se expresaron variantes de \Delta-G287-His en E. coli de una serie de cepas MenB, en particular de las cepas 2996, MC58, 1000 y BZ232. Los resultados también fueron buenos; cada uno de ellos produjo altas valoraciones con ELISA y también unas valoraciones bactericidas séricas >8192. La \DeltaG287K, expresada a partir de pET-24b, produjo excelentes valoraciones en el ensayo ELISA y bactericida sérico.
La deleción de secuencias de poli-Gly también es aplicable a Tbp2 (NMB0460), 741 (NMB1870) y 983
(NMB1969). Cuando se clonan en el vector pET y se expresan en E. coli sin la secuencia que codifica sus péptidos conductores y sin poli-Gly (es decir, como "formas \DeltaG"), se observa el mismo efecto: la expresión es satisfactoria en clones que portan la deleción del tramo de poliglicina, y baja o ausente si las glicinas están presentes en la proteína expresada.
\newpage
La \DeltaG287 se fusionó directamente dentro de marco cadena arriba de 919, 953, 961 (las secuencias que aparecen a continuación) y ORF46.1:
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5 
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La eficacia bactericida (cepa homóloga) de anticuerpos generados contra las proteínas híbridas se comparó con anticuerpos generados contra mezclas sencillas de los antígenos componentes (empleando 287-GST) para 919 y ORF46.1:
6 
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También se obtuvieron los datos para la actividad bactericida contra cepas MenB heterólogas y contra los serotipos A y C:
7
Las proteínas híbridas con \DeltaG287 en el N-terminal son, por tanto, inmunológicamente superiores a las mezclas sencillas, siendo \DeltaG287-ORF46.1 particularmente eficaz, incluso contra cepas heterólogas. La \DeltaG287-ORF46.1K puede expresarse en pET-24b.
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Se prepararon las mismas proteínas híbridas utilizando la cepa 394/98 de Nueva Zelanda en lugar de 2996:
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Ejemplo 2
Híbridos de 287
La expresión de 287, de longitud completa con un marcador de His C-terminal, o sin su péptido conductor pero con un marcador de His C-terminal, produce unos niveles de expresión bastante bajos. Se logró una mejor expresión empleando una fusión con GST N-terminal. Como alternativa a la utilización de GST como compañero de fusión N-terminal, se introdujo 287 en el C-terminal de la proteína 919 ("919-287"), de la proteína 953 ("953-287"), y de las proteínas ORF46.1 ("ORF46.1-287"). En estos casos se delecionaron los péptidos conductores, y los híbridos eran fusiones dentro de marco directas.
Para generar el híbrido 953-287, los péptidos conductores de las dos proteínas se omitieron diseñando un cebador director cadena abajo del conductor de cada secuencia; la secuencia del codón de fin se omitió en el cebador inverso de 953 pero se incluyó en el cebador inverso de 287. Para el gen 953, los cebadores 5' y 3' empleados para la amplificación incluían un sitio de restricción NdeI y BamHI, respectivamente, mientras que para la amplificación del gen 287, los cebadores 5' y 3' incluían un sitio de restricción BamHI y XhoI, respectivamente. De esta manera puede lograrse una clonación direccional secuencial de los dos genes en pET21b+, empleando NdeI-BamHI (para clonar el primer gen), y posteriormente BamHI-XhoI (para clonar el segundo gen).
El híbrido 919-287 se obtuvo clonando la secuencia codificadora para la porción madura de 287 en el sitio XhoI en el extremo 3' del clon 919-His en pET21b+. Los cebadores utilizados para la amplificación del gen 287 se diseñaron para introducir un sitio de restricción SalI en el extremo 5', y un sitio XhoI en el extremo 3' del fragmento de PCR. Puesto que los extremos cohesivos producidos por las enzimas de restricción SalI y XhoI son compatibles, el producto de PCR de 287 digerido con SalI-XhoI puede insertarse en el clon pET21b-919 roto con XhoI.
El híbrido ORF46.1-287 se obtuvo de forma similar.
Se comparó la eficacia bactericida (cepa homóloga) de anticuerpos generados contra las proteínas híbridas, con anticuerpos generados contra mezclas sencillas de los antígenos componentes:
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También se obtuvieron los datos para la actividad bactericida contra cepas MenB heterólogas y contra los serotipos A y C para 919-287 y 953-287:
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También se construyeron híbridos de ORF46.1 y 919. Los mejores resultados (valoración cuatro veces mayor) se lograron con 919 en el N-terminal.
También se ensayaron los híbridos 919-519His, ORF97-225His y 225-ORF97His. Produjeron moderadas valoraciones de ELISA y respuestas de anticuerpos bactericidas.
Puesto que los híbridos de dos proteínas A y B pueden ser NH_{2}-A-B-COOH o NH_{2}-B-A-COOH, también se prepararon los híbridos "inversos" con 287 en el N-terminal, pero utilizando \DeltaG287. Se empleó un panel de cepas, incluyendo la cepa homóloga 2996. Se usó FCA como adyuvante:
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Las mejores valoraciones bacterianas se obtienen, en general, con 287 en el N-terminal.
Cuando se fusiona con la proteína 961 (la secuencia NH_{2}-\DeltaG287-961-COOH mostrada anteriormente), la proteína resultante es insoluble y debe desnaturalizarse y renaturalizarse para la purificación. Después de la renaturalización, se descubrió que aproximadamente 50% de la proteína permanecía insoluble. Las proteínas soluble e insoluble se compararon, y se obtuvieron unas valoraciones bactericidas mucho mejores con la proteína soluble (FCA como adyuvante):
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Sin embargo, las valoraciones con la forma insoluble mejoraron utilizando un adyuvante de alumbre:
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También se usó 961c en las proteínas híbridas (véase anteriormente). Puesto que 961 y sus variantes de dominio dirigen una expresión eficaz, son idealmente adecuados como porción N-terminal de una proteína híbrida.
Se entenderá que la invención se ha descrito sólo como ejemplo y pueden realizarse modificaciones permaneciendo dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se prevé el uso de proteínas procedentes de otras cepa (por ejemplo, véase el documento WO00/66741 para secuencias polimórficas para 287 y 953).
Detalles experimentales Estrategia de clonación y diseño de oligonucleótidos
Los genes que codifican los antígenos de interés se amplificaron mediante PCR, utilizando oligonucleótidos diseñados basándose en la secuencia genómica de N. meningitidis B MC58. Siempre se utiliza ADN genómico de la cepa 2996 como molde en las reacciones de PCR, a menos que se indique lo contrario, y los fragmentos amplificados se clonaron en el vector de expresión pET21b+ (Novagen) para expresar la proteína como producto marcado con His C-terminal, o en pET-24b+ (Novagen) para expresar la proteína en forma "no marcada" (por ejemplo, \DeltaG287K).
Cuando una proteína se expresa sin un compañero de fusión y con su propio péptido conductor (si está presente), se realiza una amplificación del marco de lectura abierto (codones desde ATG hasta FIN).
Cuando una proteína se expresa en forma "no marcada", el péptido conductor se omite diseñando el cebador de amplificación del 5'-terminal cadena abajo de la secuencia conductora predicha.
La temperatura de fusión de los cebadores utilizados en la PCR depende del número y tipo de nucleótidos hibridantes en el cebador completo, y se determinó empleando las fórmulas:
(sin la cola)T_{m1} = 4(G+C) + 2(A+T)
(cebador completo)T_{m2} = 64,9 + 0,41 (GC%) - 600/N
Las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos seleccionados eran normalmente de 65-70ºC para el oligonucleótido completo, y de 50-60ºC para la región de hibridación sola.
Se sintetizaron oligonucleótidos utilizando un sintetizador de ADN/ARN Perkin Elmer 394, se eluyeron de las columnas en 2,0 ml de NH_{4}OH, y se desprotegieron mediante 5 horas de incubación a 56ºC. Los oligonucleótidos se precipitaron mediante la adición de acetato de Na 0,3 M y 2 volúmenes de etanol. Las muestras se centrifugaron y los sedimentos se resuspendieron en agua.
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En todos los constructos que comienzan con un ATG no seguido por un sitio NheI exclusivo, el codón ATG es parte del sitio NheI utilizado para la clonación. Los constructos fabricados utilizando NheI como sitio de clonación en el extremo 5' (por ejemplo, los que contienen 287 en el N-terminal) tienen dos codones más (GCT AGC) fusionados a la secuencia codificadora del antígeno.
Preparación de moldes de ADN cromosómico
Las cepas 2996, MC58, 394.98, 1000 y BZ232 (y otras) de N. meningitidis se cultivaron hasta la fase exponencial en 100 ml de medio GC, se recogieron mediante centrifugación, y se resuspendieron en 5 ml de tampón (sacarosa al 20% p/v, Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM, pH 8). Después de 10 min de incubación en hielo, las bacterias se lisaron añadiendo 10 ml de disolución de lisis (NaCl 50 mM, Na-Sarkosyl al 1%, proteinasa K 50 \mug/ml), y la suspensión se incubó a 37ºC durante 2 horas. Se realizaron dos extracciones con fenol (equilibrado a pH 8) y una extracción con CHCl_{3}/alcohol isoamílico (24:1). El ADN se precipitó mediante la adición de acetato de sodio 0,3 M y 2 volúmenes de etanol, y se recogió mediante centrifugación. El sedimento se lavó una vez con etanol al 70% (v/v) y se redisolvió en 4,0 ml de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). Se midió la concentración de ADN mediante una lectura de DO_{260}.
Amplificación mediante PCR
El protocolo de PCR convencional fue el siguiente: se utilizó como molde 200 ng de ADN genómico procedente de las cepas 2996, MC581000 o BZ232, o 10 ng de preparación de ADN de plásmido de clones recombinantes, en presencia de 40 \muM de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos, disolución de dNTP 400-800 \muM, 1x tampón de PCR (que incluye MgCl_{2} 1,5 mM), 2,5 unidades de TaqI ADN polimerasa (utilizando Perkin-Elmer AmpliTaQ, molde largo Boehringer Mannheim Expand^{TM}).
Después de una incubación preliminar de 3 minutos de la mezcla completa a 95ºC, cada muestra se sometió a una amplificación en dos etapas: los primeros 5 ciclos se realizaron utilizando la temperatura de hibridación que excluye la cola de enzimas de restricción del cebador (T_{m1}). Después siguieron 30 ciclos según la temperatura de hibridación calculada para los oligonucleótidos de longitud completa (T_{m2}). Los tiempos de alargamiento, realizado a 68ºC o 72ºC, varían según la longitud del Orf (marco de lectura abierto) que se va a amplificar. En el caso de Orf1, el tiempo de alargamiento, comenzando a partir de 3 minutos, aumento en 15 segundos cada ciclo. Los ciclos se completaron con una etapa de extensión de 10 minutos a 72ºC.
El ADN amplificado se cargó directamente sobre un gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN que corresponde a la banda del tamaño correcto se purificó del gel utilizando el kit de extracción de gel de Qiagen, siguiendo el protocolo del fabricante.
Digestión de los fragmentos de PCR y de los vectores de clonación
El ADN purificado que corresponde al fragmento amplificado se digirió con las enzimas de restricción apropiadas para clonarlo en pET-21b+, pET22b+ o pET-24b+. Los fragmentos digeridos se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (siguiendo las instrucciones del fabricante) y se eluyeron con H_{2}O, o con Tris 10 mM, pH 8,5. Los vectores plásmidos se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas, se cargaron sobre un gel de agarosa al 1,0%, y la banda correspondiente al vector digerido se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick de Qiagen.
Clonación
Los fragmentos que correspondían a cada gen, previamente digeridos y purificados, se acoplaron a pET-21b+, pET22b+ o pET-24b+. Se empleó una proporción molar de fragmento/vector 3:1 con ADN ligasa de T4 en el tampón de acoplamiento suministrado por el fabricante.
El plásmido recombinante se transformó en E. coli DH5 o HB101 competente mediante la incubación de la disolución de reacción de ligasa y bacterias durante 40 minutos en hielo, y después a 37ºC durante 3 minutos. A esto le siguió la adición de 800 \mul de caldo de cultivo LB y una incubación a 37ºC durante 20 minutos. Las células se centrifugaron a velocidad máxima en una microcentífuga Eppendorf, se resuspendieron en aproximadamente 200 \mul del sobrenadante, y se colocaron en placas con agar con ampicilina y LB (100 mg/ml).
La selección de los clones recombinantes se realizó cultivando colonias, seleccionadas aleatoriamente, durante la noche a 37ºC en 4,0 ml de caldo de cultivo LB + ampicilina 100 \mug/ml. Las células se sedimentaron y el ADN del plásmido se extrajo utilizando el kit de minipreparaciones de centrifugación QIAprep de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se digirió aproximadamente 1 \mug de cada minipreparación individual con las enzimas de restricción apropiadas, y el digerido se cargó sobre un gel de agarosa al 1-1,5% (dependiendo del tamaño esperado del inserto), en paralelo con el marcador de peso molecular (1 kb de DNA Ladder, GIBCO). Los clones positivos se seleccionaron basándose en el tamaño del inserto.
Expresión
Después de clonar cada gen en el vector de expresión, los plásmidos recombinantes se transformaron en cepas de E. coli adecuadas para la expresión de la proteína recombinante. Se empleó 1 \mul de cada constructo para transformar E. coli BL21-DE3 como se describió anteriormente. Se inocularon colonias recombinantes individuales en 2 ml de LB + ampicilina (100 \mug/ml), se incubaron a 37ºC durante la noche, después se diluyeron 1:30 en 20 ml de LB + ampicilina (100 \mug/ml) en matraces de 100 ml, para producir una DO_{600} entre 0,1 y 0,2. Los matraces se incubaron a 30ºC o a 37ºC en un agitador de baño de agua giratorio hasta que la DO_{600} indicó un crecimiento exponencial adecuado para la inducción de la expresión (0,4-0,8 DO). La expresión de las proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 1,0 mM. Después de 3 horas de incubación a 30ºC o a 37ºC, se midió la DO_{600} y se estudió la expresión. Se centrifugaron 1,0 ml de cada muestra en una microcentrífuga, el sedimento se resuspendió en PBS y se analizó mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie.
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Purificación de proteínas marcadas con His
Se clonaron diversas formas de 287 a partir de las cepas 2996 y MC58. Se construyeron con una fusión de un marcador de His C-terminal e incluían una forma madura (aa 18-427), constructos con deleciones (\Delta1, \Delta2, \Delta3 y \Delta4), y clones compuestos de dominios B o C. Para cada clon purificado como una fusión con His, se realizó una siembra en estría de una única colonia y se cultivó durante la noche a 37ºC sobre una placa de agar con LB/ampicilina (100 \mug/ml). Una colonia aislada de esta placa se inoculó en 20 ml de medio líquido de LB/ampicilina (100 \mug/ml) y se cultivó durante la noche a 37ºC con agitación. El cultivo de la noche se diluyó 1:30 en 1,0 l de medio líquido de LB/ampicilina (100 \mug/ml) y se dejó que creciese a la temperatura óptima (30ºC o 37ºC) hasta que la DO_{550} alcanzó un valor de 0,6-0,8. La expresión de la proteína recombinante se indujo mediante la adición de IPTG (concentración final 1,0 mM) y el cultivo se incubó durante 3 horas más. Las bacterias se recolectaron mediante centrifugación a 8000 g durante 15 min a 4ºC. El sedimento bacteriano se resuspendió en 7,5 ml de (i) tampón A frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0) para proteínas solubles, o (ii) tampón B (Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 8,8 y, opcionalmente, urea 8 M) para proteínas insolubles. Las proteínas purificadas en forma soluble incluían 287-His, \Delta1, \Delta2, \Delta3 y \Delta4287-His, \Delta4287MC58-His, 287c-His y 287c-MC58-His. La proteína 287bMC58-His era insoluble y se purificó en consecuencia. Las células se rompieron mediante sonicación sobre hielo cuatro veces durante 30 seg a 40 W utilizando un sonicador 450 Branson, y se centrifugaron a 13000 x g durante 30 min a 4ºC. Para las proteínas insolubles, los sedimentos se resuspendieron en 2,0 ml de tampón C (clorhidrato de guanidina 6 M, tampón fosfato 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5), y se trataron con 10 pases con un homogeneizador Dounce. El homogeneizado se centrífugo a 13000 g durante 30 min y se guardó el sobrenadante. Los sobrenadantes de las preparaciones soluble e insoluble se mezclaron con 150 \mul de resina Ni^{2+} (previamente equilibrada con tampón A o tampón B, según sea apropiado) y se incubaron a temperatura ambiente con una agitación suave durante 30 min. La resina era Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), preparada según las instrucciones del fabricante. La preparación discontinua se centrífugo a 700 g durante 5 min a 4ºC y se rechazó el sobrenadante. La resina se lavó dos veces (de forma discontinua) con 10 ml de tampón A o B durante 10 min, se resuspendió en 1,0 ml de tampón A o B, y se cargó en una columna desechable. La resina continuó lavándose con (i) tampón A a 4ºC, o (ii) tampón B a temperatura ambiente, hasta que la DO_{280} de la corriente alcanzó un valor de 0,02-0,01. La resina se volvió a lavar con (i) tampón C frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0), o (ii) tampón D (Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 6,3 y, opcionalmente, urea 8 M) hasta que la DO_{280} de la corriente alcanzó un valor de 0,02-0,01. La proteína de fusión-His se eluyó mediante la adición de 700 \mul de (i) tampón de elución A frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0), o (ii) tampón de elución B (Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 4,5 y, opcionalmente, urea 8 M), y las fracciones se recogieron hasta que la DO_{280} indicó que se había obtenido toda la proteína recombinante. Se analizaron partes alícuotas de 20 \mul de cada fracción de elución mediante SDS-PAGE. Se estimaron las concentraciones de proteínas utilizando el ensayo de
Bradford.
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Renaturalización de las proteínas de fusión-His desnaturalizadas
Se requiere una desnaturalización para solubilizar 287bMC8, por tanto se empleó una etapa de renaturalización antes de la inmunización. Se añadió glicerol a las fracciones desnaturalizadas obtenidas anteriormente para producir una concentración final de 10% v/v. Las proteínas se diluyeron hasta 200 \mug/ml utilizando tampón de diálisis I (glicerol al 10% v/v, arginina 0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5,0 mM, glutatión oxidado 0,5 mM, urea 2,0 M, pH 8,8), y se dializaron contra el mismo tampón durante 12-14 horas a 4ºC. Se realizó otra diálisis con tampón II (glicerol al 10% v/v, arginina 0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5,0 mM, glutatión oxidado 0,5 mM, pH 8,8) durante 12-14 horas a 4ºC. Se estimó la concentración de proteína utilizando la fórmula:
Proteína (mg/ml) = (1,55 x DO_{280}) - (0,76 x DO_{260})
Immunización
Se inmunizaron ratontes Balb/C con antígenos en los días 0, 21 y 35, y se analizaron los sueros el día 49.
Análisis de los sueros - ELISA
Las cepas MenB M7 acapsuladas y las capsuladas se cultivaron en placas de agar de chocolate y se incubaron durante la noche a 37ºC con CO_{2} al 5%. Las colonias bacterianas se recogieron de las placas de agar utilizando un hisopo Dracon estéril y se inocularon en caldo de cultivo Mueller-Hinton (Difco) que contenía glucosa al 0,25%. El crecimiento bacteriano se controló cada 30 minutos siguiendo la DO_{620}. Se dejaron crecer las bacterias hasta que la DO alcanzó un valor de 0,4-0,5. El cultivo se centrífugo durante 10 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se eliminó y las bacterias se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en PBS que contenía formaldehído al 0,025%, y se incubaron durante 1 hora a 37ºC, y después durante la noche a 4ºC con agitación. Se añadieron 100 \mul de células bacterianas a cada pocillo de una placa Greiner de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 4ºC. Los pocillos entonces se lavaron tres veces con tampón de lavado PBT (Tween-20 al 0,1% en PBS). Se añadieron 200 \mul de tampón de saturación (polivinilpirrolidona 10 al 2,7% en agua) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con PBT. Se añadieron 200 \mul de los sueros diluidos (tampón de dilución: BSA al 1%, Tween-20 al 0,1%, NaN_{3} al 0,1% en PBS) a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con PBT. Se añadieron 100 \mul a cada pocillo de suero antirratón de conejo conjugado con HRP (Dako) diluido 1:2000 en tampón de dilución, y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón PBT. Se añadieron 100 \mul de tampón sustrato para HRP (25 ml de tampón citrato, pH 5, 10 mg de O-fenildiamina, y 10 \mul de H_{2}O_{2}) a cada pocillo, y las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 100 \mul de H_{2}SO_{4} al 12,5% a cada pocillo y se siguió la DO_{490}. Las valoraciones de ELISA se calcularon de manera arbitraria como la dilución de los sueros que produce un valor de DO_{490} de 0,4 por encima del nivel de los sueros preinmunológicos. El ELISA se consideró positivo cuando la dilución de los sueros con una DO_{490} de 0,4 era mayor que 1:400.
Análisis de los sueros - Ensayo de unión de bacterias con barrido FACS
La cepa MenB M7 acapsulada se cultivó en placas de agar de chocolate y se incubó durante la noche a 37ºC con CO_{2} al 5%. Las colonias bacterianas se recogieron de las placas de agar utilizando un hisopo Dracon estéril y se inocularon en 4 tubos que contenían cada uno 8 ml de caldo de cultivo Mueller-Hinton (Difco) que contenía glucosa al 0,25%. El crecimiento bacteriano se controló cada 30 minutos siguiendo la DO_{620}. Se dejaron crecer las bacterias hasta que la DO alcanzó un valor de 0,35-0,5. El cultivo se centrífugo durante 10 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se eliminó y el sedimento se resuspendió en tampón de bloqueo (BSA al 1% en PBS, NaN_{3} al 0,1% en PBS) y se centrífugo durante 5 minutos a 4000 rpm. Las células se resuspendieron en tampón de bloqueo para alcanzar una DO_{620} de 0,05. Se añadieron 100 \mul de células bacterianas a cada pocillo de una placa Costar de 96 pocillos. Se añadieron 100 \mul de los sueros diluidos (1:100, 1:200, 1:400) (en tampón de bloqueo) a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 2 horas a 4ºC. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm, el sobrenadante se aspiró y las células se lavaron mediante la adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo en cada pocillo. Se añadieron 100 \mul de F(ab)_{2} de cabra antirratón conjugado con R-ficoeritrina, diluido 1:100, a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 1 hora a 4ºC. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos, y se lavaron mediante la adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 200 \mul/pocillo de PBS, formaldehído al 0,25%. Las muestras se trasladaron a tubos FACScan y se leyeron. Los ajustes del FACScan (potencia del láser 15 mW) fueron: FL2 activo; umbral de FSC-H: 92; voltaje de FSC PMT: E 01; SSC PMT: 474; ganancias de amp. 61; FL-2 PMT: 586; valores de compensación: 0.
Análisis de los sueros - Ensayo bactericida
Se cultivó la cepa 2996 de N. meningitidis durante la noche a 37ºC sobre placas de agar de chocolate (a partir de una cepa congelada) con CO_{2} al 5%. Las colonias se recogieron y se utilizaron para inocular 7 ml de caldo de cultivo Mueller-Hinton que contenía glucosa al 0,25% hasta alcanzar una DO_{620} de 0,05-0,08. El cultivo se incubó durante aproximadamente 1,5 horas a 37ºC con agitación hasta que la DO_{620} alcanzó un valor de 0,23-0,24. Las bacterias se diluyeron en tampón fosfato 50 mM, pH 7,2, que contenía MgCl_{2} 10 mM, CaCl_{2} 10 mM, y BSA al 0,5% (p/v) (tampón de ensayo) con una dilución de trabajo de 10^{5} CFU/ml. El volumen total de la mezcla de reacción final era de 50 \mul, con 25 \mul de dilución en dos veces en serie del suero de ensayo, 12,5 \mul de bacterias en la dilución de trabajo, y 12,5 \mul de complemento de cría de conejo (concentración final 25%).
Los controles incluían bacterias incubadas con suero de complemento, sueros inmunológicos incubados con bacterias y con complemento inactivado mediante calentamiento a 56ºC durante 30 minutos. Inmediatamente después de la adición del complemento de cría de conejo, 10 \mul de los controles se cultivaron en placas de agar Mueller-Hinton utilizando el procedimiento de plano inclinado (tiempo 0). La placa de 96 pocillos se incubó durante 1 hora a 37ºC con rotación. Se colocaron 7 \mul de cada muestra sobre placas de agar Mueller-Hinton como gotas, mientras que 10 \mul de los controles se cultivaron en placas de agar Mueller-Hinton utilizando el procedimiento de plano inclinado (tiempo 1). Las placas de agar se incubaron durante 18 horas a 37ºC y se contaron las colonias correspondientes al tiempo 0 y tiempo 1.
Análisis de los sueros - Análisis de la transferencia Western
Proteínas purificadas (500 ng/carril), vesículas de membrana externa (5 \mug) y extractos de células totales (25 \mug) procedentes de la cepa 2996 MenB se cargaron sobre un gel de SDS al 12%-poliacrilamida y se trasladaron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 2 horas a 150 mA a 4ºC, utilizando tampón de transferencia (base Tris al 0,3%, glicina al 1,44%, metanol al 20% (v/v)). La membrana se saturó mediante una incubación durante la noche a 4ºC en tampón de saturación (leche desnatada al 10%, Triton X100 al 0,1% en PBS). La membrana se lavó dos veces con tampón de lavado (leche desnatada al 3%, Triton X100 al 0,1% en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37ºC con sueros de ratón diluidos 1:200 en tampón de lavado. La membrana se lavó dos veces y se incubó durante 90 minutos con una dilución 1:2000 de anti-Ig de ratón marcada con peroxidasa de rábano. La membrana se lavó dos veces con Triton X100 al 0,1% en PBS y se reveló con el kit de sustrato Opti-4CN (Bio-Rad). La reacción se detuvo añadiendo agua.
Las VME (vesículas de membrana externa) se prepararon como sigue: la cepa 2996 de N. meningitidis se cultivó durante la noche a 37ºC con CO_{2} al 5% en 5 placas GC, se recolectó con un asa de siembra y se resuspendió en 10 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM. La inactivación con calor se realizó a 56ºC durante 45 minutos y las bacterias se rompieron mediante sonicación durante 5 min en hielo (50% del ciclo de servicio, 50% de salida, micropunta de 3 mm de sonicador Branson). Las células sin romper se retiraron mediante centrifugación a 5000 g durante 10 minutos, el sobrenadante que contenía la fracción de la envuelta celular total se recuperó y se volvió a centrifugar durante la noche a 50000 g a una temperatura de 4ºC. El sedimento que contenía las membranas se resuspendió en Sarkosyl al 2%, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos para solubilizar las membranas internas. La suspensión se centrífugo a 1000 g durante 10 minutos para retirar los agregados, y el sobrenadante se volvió a centrifugar a 50000 g durante 3 horas. El sedimento, que contenía las membranas externas, se lavó en PBS y se resuspendió en el mismo tampón. La concentración de proteínas se midió mediante el ensayo de proteínas D.C. Bio-Rad (procedimiento de Lowry modificado), utilizando BSA como patrón.
Los extractos de células totales se prepararon como sigue: la cepa 2996 de N. meningitidis se cultivó durante la noche en una placa GC, se recolectó con un asa de siembra y se resuspendió en 1 ml de Tris-HCl 20 mM. La inactivación con calor se realizó a 56ºC durante 30 minutos.
<110> Chiron SpA
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<120> Expresión híbrida de proteínas de Neisseria 
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<130> P026783WO
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<140> PCT/IB01/00420
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<141> 28 de febrero 2001
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<150> GB 0004695.3
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<151> 28 de febrero 200
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<150> BG0027875.8
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<151> 13 de noviembre 2000
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<160> 121
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<170> SeqWin99, versión 1.02
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<210> 1
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<211> 608
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<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis 
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<400> 1
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17
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<210> 2
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<211> 464
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 2505
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287-919
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<400> 3
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<211> 832
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287-919
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<400> 4
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<211> 1746
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287-953
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<211> 579
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<211> 2388
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287-961
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<211> 793
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287-961
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<210> 9
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<211> 2700
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287NZ-919
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<400> 9
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<211> 897
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287NZ-919
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<210> 11
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<211> 1941
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287NZ-953
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<400> 12
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42
43
44 
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<210> 13
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<211> 2583
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> deltaG287NZ-961
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45 
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<210> 14
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<211> 858
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> deltaG287NZ-961
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<400> 14
46
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49

Claims (5)

1. Una proteína híbrida de fórmula NH_{2}-A-B-COOH, en la que A comprende la proteína \DeltaG287 de Neisseria, y B comprende la proteína 953 de Neisseria, y en la que la secuencia de aminoácidos de la proteína híbrida es la descrita en SEQ ID NO:6, o es una secuencia que tiene más de 70% de coincidencia de secuencia con ésta.
2. La proteína de la reivindicación 1, en la que \DeltaG287 es de la cepa 2996 de N. meningitidis o de la cepa 394/98 de N. meningitidis.
3. La proteína de la reivindicación 1, en la que 953 es de la cepa 2996 de N. meningitidis o de la cepa 394/98 de N. meningitidis.
4. La proteína de la reivindicación 1, en la que A y B son de la misma cepa de N. meningitidis.
5. La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:6.
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