ES2301581T3 - Aislamiento de acidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

Método de extracción de ácido nucleico a partir de un lisado celular, método que comprende: poner el lisado celular en contacto con una fase sólida a un primer pH al que la fase sólida tiene una carga positiva de modo que el ácido nucleico se une a la fase sólida con preferencia con respecto a los contaminantes en el lisado celular; liberar el ácido nucleico a un segundo pH superior por encima del pKa de la fase sólida para invertir o neutralizar la carga positiva para liberar el ácido nucleico unido de la fase sólida; en el que la fase sólida es vidrio de poro controlado, un polisacárido, un material cerámico, un material plástico poroso, un material plástico, perlas de poliestireno, perlas paramagnéticas o un tapón de plástico poroso que es una única pieza moldeada o es una pieza de inserción para un recipiente; y en el que el ácido nucleico se libera usando un tampón de baja salinidad.

Description

Aislamiento de ácidos nucleicos.

La presente invención se refiere a un método para extraer ácidos nucleicos a partir de material biológico, particularmente sangre.

Existe una demanda muy grande de análisis de ADN para una gama de fines y esto ha conducido al requisito de métodos rápidos, seguros y de alto rendimiento para el aislamiento y la purificación de ADN y otros ácidos nucleicos.

Pueden tomarse muestras para su uso para la identificación o el análisis de ADN de una amplia gama de fuentes tales como material biológico tal como tejido, heces, células de animales y plantas, etc., también pueden tomarse muestras de suelo, productos alimenticios, agua, etc.

Los métodos existentes para la extracción de ADN incluyen el uso de fenol/cloroformo, precipitación con sales, el uso de sales caotrópicas y resinas de sílice, el uso de resinas de afinidad, cromatografía de intercambio iónico y el uso de perlas magnéticas. Se describen métodos en las patentes estadounidenses 5057426, 4923978, las patentes europeas 0512767 A1 y EP0515484B y los documentos WO 95/13368, WO 97/10331 y WO 96/18731. Estas patentes y solicitudes de patente dan a conocer métodos de adsorción de ácidos nucleicos sobre un soporte sólido y luego el aislamiento de los ácidos nucleicos. Los métodos usados previamente usan algún tipo de disolvente para aislar los ácidos nucleicos y estos disolventes son inflamables, combustibles o tóxicos.

El documento EP 0 707077A describe la captura y liberación selectiva de ácido nucleico a partir de un lisado usando un polímero soluble en agua, débilmente básico para formar un precipitado con el polímero. Entonces se separa el precipitado y se libera el ácido nucleico del polímero usando condiciones de salinidad extremadamente alta, una base fuerte o calentamiento.

La sangre es una de las fuentes de muestra más abundantes para el análisis de ADN ya que se extraen muestras de sangre rutinariamente por una amplia gama de motivos. Sin embargo, debido a la naturaleza viscosa y proteínica de la sangre, se ha demostrado que el uso de métodos de extracción de ADN conocidos es difícil de conseguir usando automatización debido a las dificultades del manejo de grandes volúmenes que contienen cantidades relativamente pequeñas de ADN. Hasta la fecha, se ha automatizado parcialmente la extracción de ácidos nucleicos solamente mediante el uso de reactivos peligrosos y tiempos de procesamiento lentos.

Se ha ideado ahora un método mejorado para la extracción de ácidos nucleicos y otras biomoléculas a partir de la sangre y otros materiales biológicos.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de extracción de ácido nucleico a partir de un lisado celular tal como se expone en las reivindicaciones.

El método es particularmente útil si el material biológico es sangre, pero puede usarse el método para una gama de sustancias de aplicaciones tales como el aislamiento de plásmidos y vectores y la extracción de ADN de plantas.

Preferiblemente, se lisan las células en la sangre para liberar ácidos nucleicos y pueden usarse métodos y agentes de lisado conocidos, tales como la puesta en contacto con detergentes iónicos y no iónicos, disoluciones hipotónicas de sales, proteasas, agentes caotrópicos, disolventes, el uso de cambios de pH o calor. Se describe un método de lisado de células para aislar ácido nucleico en el documento WO 96/00228.

Cuando el material biológico consiste en sangre, las muestras pueden diluirse opcionalmente con agua u otro diluyente con el fin de hacerlo más fácil de manipular y procesar.

Pueden usarse diluciones de hasta diez veces y en general puede ser mejor una mayor dilución y es una característica de la presente invención que permite que sea posible una baja dilución de la sangre.

La fase sólida con la que se pone en contacto la sangre puede estar formada por un material que tiene una afinidad natural por los ácidos nucleicos o puede estar formada por un material cuya superficie se ha tratado con un agente que provocará que los ácidos nucleicos se unan a ella o aumentará su afinidad por los ácidos nucleicos. Los materiales adecuados incluyen vidrio de poro controlado, polisacárido (agarosa o celulosa), otros tipos de sílice/vidrio, materiales cerámicos, materiales plásticos porosos tales como tapones de plástico poroso que están en una única pieza moldeada o como una pieza de inserción en un tubo convencional, perlas de poliestireno, perlas paramagnéticas, etc. El tamaño y la porosidad no son críticos y pueden variar y seleccionarse para aplicaciones particulares.

Los medios adecuados para tratar la superficie de la fase sólida o para derivatizarla incluyen tratarla con una sustancia que puede introducir una carga, por ejemplo una carga positiva sobre la superficie o una superficie hidrófila o hidrófoba sobre la fase sólida, por ejemplo grupos hidroxilo, grupos nitrato, grupos autorreactivos, colorantes y otros compuestos aromáticos.

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En una realización preferida de la invención, la fase sólida provocará que el ADN se una a ella a un pH con preferencia con respecto a los contaminantes en la muestra de sangre y permitirá que el ácido nucleico unido se libere cuando se ponga en contacto con un eluyente a un pH diferente. Este sistema puede usarse con una fase sólida que incorpora histidina o una polihistidina que tenderá a unirse a ácidos nucleicos a un pH bajo, por ejemplo inferior a 6 y luego se liberarán los ácidos nucleicos unidos cuando el pH se aumenta, por ejemplo, hasta más de 8. Alternativamente, los ácidos nucleicos se unen a pH sustancialmente neutro a una superficie aminada y se liberan a pH muy alto.

En otra realización de la invención, una pieza moleada de plástico puede incorporar un agente de unión, por ejemplo en un pocillo en una placa, etc., de modo que el agente de unión se incorpora en la superficie, entonces se pone en contacto la muestra de sangre con la superficie de modo que se provoca que los ácidos nucleicos se unan a la superficie. Entonces se retira la muestra de sangre y se trata la superficie con un agente de elución para liberar los ácidos nucleicos unidos. Cuando la superficie es parte de un pocillo en una placa de múltiples pocillos, el sistema total puede adaptarse fácilmente para técnicas de extracción y toma de muestras a gran escala rápidas.

Los agentes de unión que pueden usarse incluyen resinas de intercambio iónico de carga conmutable que usan una fase sólida cargada positivamente que puede invertirse o neutralizarse cambiando el pH por encima de su pKa, por ejemplo nucleótidos, poliaminas, grupos imidazol y otros reactivos similares con un valor de pKa adecuado.

Además, pueden unirse ácidos nucleicos mediante la intercalación usando una variedad de compuestos de intercalación incorporados en la fase sólida, por ejemplo actinomicina D, bromuro de etidio, etc.

En una realización adicional de la invención, puede modificarse una superficie de plástico para que incluya grupos funcionales. El plástico puede ser cualquier plástico usado para contener muestras, por ejemplo polipropileno. Los grupos funcionales pueden estar cargados positiva o negativamente, de modo que se unan a los ácidos nucleicos en la disolución tampón correcta.

Alternativamente, los grupos funcionales pueden ser grupos químicos que pueden acoplarse covalentemente a otros ligandos o polímeros.

Cuando el plástico se usa en una pieza moldeada de plástico, por ejemplo en un pocillo en una placa, o como un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las características de superficie del plástico pueden modificarse adecuadamente para su uso en la presente invención incluyendo o añadiendo los productos químicos apropiados en el compuesto de moldeo, por ejemplo como en un compuesto de moldeo por inyección.

Cuando esto se usa en un tubo de PCR o en una placa con pocillos profundos, pueden usarse los tubos o los pocillos para aislar e inmovilizar pequeñas cantidades de ADN o ARN que generan un molde puro para una PCR posterior u otros análisis y manipulación genéticos.

Cuando el plástico es polipropileno, por ejemplo está en forma de un tubo de PCR de pared fina, la superficie de polipropileno puede modificarse oxidando la superficie con un agente oxidante tal como permanganato de potasio y ácido sulfúrico para crear una superficie carboxilada (grupos COOH). Entonces puede usarse este tubo para mejorar el aislamiento de ADN a partir de disoluciones o a partir de muestras en bruto, por ejemplo sangre. Ajustando el pH, la constante dieléctrica, solubilidad o fuerza iónica, puede inmovilizarse el ADN o ARN sobre las paredes del tubo, lavado libre de contaminantes, listo para PCR u otras técnicas analíticas.

Los grupos carboxilo pueden modificarse adicionalmente acoplando covalentemente un grupo aniónico tal como imidazol o polihistidina o cualquier intercambiador iónico fuerte o débil, para permitir la unión de ácidos nucleicos mediante una interacción de cargas. Entonces podría usarse este tubo para mejorar el aislamiento de ADN a partir de disoluciones o a partir de muestras en bruto, por ejemplo de sangre. De nuevo, ajustando el pH, la constante dieléctrica o fuerza iónica, puede inmovilizarse el ADN o ARN sobre las paredes del tubo, lavado libre de contaminantes, listo para PCR u otras técnicas analíticas.

Los ácidos nucleicos pueden eluirse en un tampón de baja salinidad de modo que esté listo para PCR u otros análisis.

La fase sólida puede ponerse en contacto con una muestra de sangre mezclando con la fase sólida en un dispositivo de mezclado/agitación, haciendo pasar la muestra de sangre sobre la fase sólida o la fase sólida puede ser paramagnética y manipularse mediante un campo magnético. Aunque la invención es particularmente adecuada para la separación o el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de la sangre, puede usarse con una gama de biomoléculas, particularmente aquéllas que requieren la eliminación de los desechos de paredes celulares o partículas insolubles.

En una realización preferida de la invención, la fase sólida está en forma granular en una columna y la muestra de sangre se extrae a través de la columna por medio de una presión diferencial que está aplicándose a través de la columna, se extrae la muestra de sangre con aire y el material sólido granular puede fluidizarse aumentando así las tasas de mezclado y puesta en contacto y minimizando la obstrucción.

El método de la invención es adecuado para su uso en un formato de múltiples pocillos cuando puede tener lugar sustancialmente de manera simultánea una serie de extracciones a partir de diferentes muestras y esto facilitará la automatización del procedimiento de extracción permitiendo que tenga lugar una extracción rápida de alto rendimiento y permitiendo que se realice química combinatoria. Esto posibilitará que exista un alto rendimiento en una serie de pocillos convencionales, por ejemplo una serie de ocho por doce de modo que puedan tratarse automáticamente un gran número de tipos de muestras al mismo tiempo.

La invención se describe en los ejemplos.

Ejemplo 1

Extracción de ácidos nucleicos a partir de sangre completa

Se preparó un intercambiador iónico de carga conmutable acoplando covalentemente polihistidina a perlas de vidrio de 100 \mum usando glutaraldehído mezclando 1 gramo de las perlas de vidrio aminadas con glutaraldehído al 0,01% (v/v) en bicarbonato de sodio 0,1 M a pH 8 que contiene 20 mg de polihistidina. Tras la incubación durante la noche, se lavaron las perlas exhaustivamente para eliminar el material unido no covalentemente y se almacenaron en MES 10 mM, pH 5 que contenía Tween 20 al 0,1% (v/v).

Se añadieron aproximadamente 300 mg de las perlas de vidrio derivatizadas de 100 \mum a una columna de plástico de 1 ml cerrada en ambos extremos.

Se incubó una muestra de sangre con un volumen igual de MES 10 mM pH 5, que contenía Tween 20 al 1%, proteasas (200 \mug/ml) y EDTA 1 mM. Tras completarse la digestión, se aspiró la sangre de la columna que contenía las perlas de vidrio y se inmovilizó el ADN permitiendo que las proteínas contaminantes pasaran hasta el desecho.

Se lavaron las perlas de vidrio que contenían el ADN inmovilizado con un tampón que comprendía MES 10 mM pH 5, que contenía Tween 20 al 1% y EDTA 1 mM y se repitió esto hasta que la disolución de lavado era incolora.

Tras el lavado, se secaron las perlas con aire y se eluyó el ADN con una pequeña cantidad de Tris HCl 10 mM, pH 8,5 y se recogieron en un tubo estéril listo para análisis. Por tanto, se separó el ADN de la sangre.

Para diferentes biomoléculas, el tampón, etc. pueden modificarse de manera adecuada.

Ejemplo 2

Se lavó un gramo de perlas paramagnéticas carboxiladas en tampón imidazol 50 mM pH 6 y luego se mezclaron con 100 mg de polihistidina en 50 ml de tampón imidazol 50 mM pH 6. Se añadió un agente de acoplamiento químico (EDC) a una concentración final de 5 mg por ml y se mezcló durante la noche. Se lavaron las perlas en agua, cloruro de sodio 0,5 M, Tween 20 al 1%, Tris HCl 100 mM pH 8 y se almacenaron en MES 10 mM, Tween 20 al 0,1% pH 5.

Para extraer el ADN de la sangre, se mezcló 1 mg de perlas con sangre diluida en Tween 20 al 10% con MES 25 mM, EDTA 1 mM pH 5. Se separaron las perlas con un imán y se lavaron resuspendiendo en MES 1 mM, Tween 20 al 0,1%. Para eluir el ADN, se resuspendieron las perlas en Tris HCl 10 mM pH 8,5 y se separaron con un imán dejando el ADN en la disolución.

Claims (23)

1. Método de extracción de ácido nucleico a partir de un lisado celular, método que comprende:

poner el lisado celular en contacto con una fase sólida a un primer pH al que la fase sólida tiene una carga positiva de modo que el ácido nucleico se une a la fase sólida con preferencia con respecto a los contaminantes en el lisado celular;

liberar el ácido nucleico a un segundo pH superior por encima del pKa de la fase sólida para invertir o neutralizar la carga positiva para liberar el ácido nucleico unido de la fase sólida;

en el que la fase sólida es vidrio de poro controlado, un polisacárido, un material cerámico, un material plástico poroso, un material plástico, perlas de poliestireno, perlas paramagnéticas o un tapón de plástico poroso que es una única pieza moldeada o es una pieza de inserción para un recipiente; y

en el que el ácido nucleico se libera usando un tampón de baja salinidad.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el lisado celular es un lisado de células vegetales o células animales.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico es un plásmido.

4. Método según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico es ADN.

5. Método según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico es ARN.

6. Método según la reivindicación 1, en el que el lisado celular es un lisado de células sanguíneas.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material plástico está en forma de una punta de pipeta, una placa con pocillos o una placa con pocillos profundos, o un tubo de PCR.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico eluido está listo para análisis o amplificación usando PCR sin necesidad de purificación adicional.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico se une a la fase sólida a un pH inferior a 6 y se libera de la fase sólida a un pH superior a 8.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico se une a la fase sólida a un pH sustancialmente neutro y se libera de la fase sólida a un pH superior a 10.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase sólida está formada por un material que tiene una afinidad natural por los ácidos nucleicos.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase sólida está formada por un material cuya superficie se ha tratado con un agente que introduce una carga positiva para provocar que los ácidos nucleicos se unan a ella o para aumentar su afinidad por los ácidos nucleicos.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase sólida es una resina de intercambio iónico de carga conmutable que tiene una carga positiva que puede invertirse o neutralizarse cambiando el pH por encima de su pKa.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la resina de intercambio iónico comprende un nucleótido, una poliamina o un compuesto que contiene un resto de imidazol.

15. Método según la reivindicación 12, en el que la superficie del material sólido se trata con histidina o una polihistidina.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase sólida comprende una superficie de plástico modificada para que incluya grupos funcionales.

17. Método según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que el material plástico es polipropileno.

18. Método según la reivindicación 17, en el que la superficie de polipropileno se modifica oxidando la superficie con un agente oxidante para crear una superficie carboxilada.

19. Método según la reivindicación 18, en el que los grupos carboxilo se modifican adicionalmente acoplando covalentemente un grupo de intercambio aniónico para permitir la unión de ácidos nucleicos mediante una interacción de carga.

20. Método según la reivindicación 19, en el que el grupo de intercambio aniónico es imidazol, polihistidina o un intercambiador iónico fuerte o débil.

21. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase sólida es un tubo de PCR o una placa con pocillos que se usa para aislar e inmovilizar cantidades pequeñas de ácido nucleico, generando de ese modo un molde para una PCR posterior u otros análisis y manipulación genéticos.

22. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase sólida es una placa con múltiples pocillos que permite de ese modo que tenga lugar sustancialmente de manera simultánea una serie de extracciones de ácido nucleico de diferentes muestras.

23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además amplificar dicho ácido nucleico liberado usando PCR.