ES2301823T3

ES2301823T3 - Aislamiento de acidos nucleicos usando un polimero policationico como agente de precipitacion.

Info

Publication number: ES2301823T3
Application number: ES03761887T
Authority: ES
Inventors: Igor Yu Galaev; Per-Erik Gustavsson; Vladimir A Polymer Chemistry Dpt. IZUMRUDOV; Per-Olof Larsson; Per-Olof Wahlund
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2008-07-01
Anticipated expiration: 2023-06-26
Also published as: AU2003243108A1; EP1517990B1; SE0202074D0; CA2488616A1; JP2005531329A; SE0301034D0; EP1517990A1; US20050222404A1; ATE389718T1; DE60319825D1; DE60319825T2; WO2004003200A1

Abstract

Un método de aislamiento de un plásmido de una solución biológica, cuyo método comprende precipitar selectivamente el ácido nucleico deseado añadiendo un agente de precipitación policatiónico a la solución y permitiéndole formar un complejo insoluble con dicho ácido nucleico, en el que el agente de precipitación se selecciona del grupo constituido por poli(cloruro de N,N''-dimetildialilamonio), un bromuro de ioneno alifático y un poli(haluro de N-alquil-4-vinilpiridinio).

Description

Aislamiento de ácidos nucleicos usando un polímero policatiónico como agente de precipitación.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para aislar ácidos nucleicos, tales como ADN y/o ARN, de una solución biológica. Más específicamente, el presente método utiliza un agente de precipitación, por lo que se forma un complejo, de un ácido nucleico deseado y dicho agente de precipitación o de un ácido nucleico indeseado y dicho agente.

Fundamento

En los años 1860, F. Miescher aisló una estructura ácida de los núcleos de células que denominó nucleína y más tarde ácido nucleico. La función biológica de este material no se descubrió hasta casi un siglo más tarde, cuando se estableció que el material ácido nucleico, y específicamente ADN, era responsable de llevar información hereditaria. Cuando se informó en 1953 de la solución a la estructura molecular de ADN, comenzó una nueva era de la bioquímica y la biología.

Como es bien sabido ahora, el ácido nucleico son polímeros con una alta densidad de grupos fosfato cargados negativamente en las cadenas. Hay dos clases de ácidos nucleicos encontrados en todos los organismos vivos, a saber, ácido ribonucleico (ARN) y ácido desoxirribonucleico (ADN). Los virus, por otra parte, contienen sólo un tipo, ARN o ADN. Las funciones biológicas de los ácidos nucleicos incluyen el almacenamiento, replicación, recombinación y transmisión de información genética. El ADN puede agruparse en ADN nuclear, ADN citoplásmico, ADN plásmido, ADN mitocondrial, ADN de cloroplasto y ADN vírico. El ARN puede agruparse por otra parte en ARN mensajero, ARN ribosómico, ARN de transferencia, ARN nuclear pequeño, ARN vírico y ARN subvírico.

Las diversas clases de ácidos nucleicos se usan en la actualidad principalmente en investigación científica, pero también en una extensión creciente en los campos farmacéutico y de diagnóstico. Así, los ácidos nucleicos son por ejemplo útiles en procedimientos biotecnológicos en los que se expresan productos proteínicos a partir de ácidos nucleicos en células, tales como células recombinantes, como herramientas en métodos para manipulación genética y más recientemente también para aplicaciones médicas y de diagnóstico. Con el fin de obtener un producto de ácido nucleico útil, se requiere un esquema de purificación cuidadosa para eliminar componentes indeseados, tales como restos de células, contaminantes, tales como sustancias tóxicas, por ejemplo, endotoxinas, etc.

La forma más común de aislar ácidos nucleicos ha sido hasta ahora usar cromatografía. Así, los métodos de purificación disponibles actualmente se basan en ultrafiltración, cromatografía líquida a alta presión (HPLC) o extracción de fragmentos de ácidos nucleicos de geles de agarosa en presencia de sales caotrópicas por precipitación en partículas de vidrio o gel de sílice.

Sin embargo, para la separación de mezclas de ácidos nucleicos que comprenden por ejemplo un fragmento de ADN de doble cadena y un oligonucleótido de cadena sencilla más pequeño, estos métodos son sólo útiles con baja eficacia.

Otros esquemas de purificación sugeridos más recientemente se basan en la carga de los ácidos nucleicos. Puesto que los ácidos nucleicos son polímeros con una alta densidad de grupos fosfato cargados negativamente en las cadenas, pueden considerarse polianiones. Así, se han descrito diversos métodos en los que se precipitan ácidos nucleicos.

Se ha descrito una forma específica de precipitación selectiva de ADN en la solicitud de patente de los EE.UU. 20020010145 (Willson et al.). Más específicamente, se sugiere purificación de ADN, preferiblemente ADN plásmido, de una preparación obtenida de lisado de células tras precipitación con disolvente orgánico seguida por resolubilización en tampón de baja fuerza iónica, mediante precipitación selectiva por adición de agentes de compactación. El ARN, que es comúnmente el principal contaminante en preparaciones de ADN, puede dejarse en solución mientras se precipita directamente el ADN plásmido deseado. Los agentes de compactación son moléculas pequeñas, tales como espermina y espermidina. Puesto que la precipitación descrita sólo tiene lugar con bajas concentraciones de sal, el método sugerido no es aplicable directamente en un lisado de células. Así, hay todavía necesidad en este campo de métodos simplificados, por los que se reduzca el número total de etapas requeridas para obtener un producto de ADN purificado y se reduzca por ello el coste total.

Un método alternativo basado en precipitación de ácidos nucleicos se describe en el documento USP 5.622.822 (Ekeze et al.) como métodos para captura y liberación selectiva de ácidos nucleicos usando polietilenimina y un tensioactivo éster fosfato aniónico. Más específicamente, se han hecho disponibles ácidos nucleicos, por ejemplo, para multiplicación después de lisis poniendo en contacto el lisado con polietilenimina para formar un precipitado. Los ácidos nucleicos se liberan después del precipitado con una base fuerte, y los ácidos nucleicos liberados se mantienen en solución con un tensioactivo éster fosfato aniónico. Sin embargo, el tratamiento con una base fuerte es duro en la estructura de los ácidos nucleicos y, en consecuencia, el método no puede usarse para precipitar, por ejemplo, ADN plásmido. Además, como la etilenimina no está cargada a todos los valores de pH, es esencial realizar el método a un pH controlado.

Así, hay aún necesidad de métodos alternativos, que sean útiles con todas las formas de ácidos nucleicos y que sean más simples de practicar.

Un método alternativo de precipitación de ácidos nucleicos se describe en el documento EP 1.031.626 (Erbacher et al.), en el que se sugiere un método para estabilizar y/o aislar ácidos nucleicos en una muestra biológica usando sales de amonio o fosfonio constituidas por 1-24 unidades repetitivas. Sin embargo, la precipitación es no selectiva, es decir, el método no permite una precipitación específica de un tipo particular de ácido nucleico, por ejemplo, ADN genómico, ADN plásmido, ARN, permaneciendo en solución el resto de ácidos nucleicos.

Además, en la última década, complejos de ácidos nucleicos con policationes han atraído una atención enorme y creciente de los científicos como vehículos para suministro de genes. Puesto que el vehículo deben interactuar y unirse fuertemente con membranas de células cargadas negativamente, debe estar cargado positivamente y ser soluble. Estos requisitos se cumplen sólo con una cierta relación de policatión/ácido nucleico. Así, al contrario de los procedimientos de purificación biotecnológicos, en los que factores de simplicidad obligan a añadir una cantidad no demasiado específica de aglomerante de complejo atractiva, en métodos de suministro de genes es una necesidad añadir una cantidad específica de policatión.

Sumario de la presente invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método selectivo de aislamiento de un ácido nucleico de una solución que puede contener otros ácidos nucleicos, proteínas, otros compuestos de alto peso molecular, sales y otras sustancias de bajo peso molecular, mientras se dejan en solución dichas otras especies. Esto se consigue por un método como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método de aislamiento de un ácido nucleico de una solución biológica, cuyo método es simple y adecuado para funcionamiento a gran escala. Un objeto relacionado de la invención es proporcionar tal método, que también es eficaz en coste especialmente en funcionamiento a gran escala.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método de aislamiento selectivo de un ácido nucleico, que es útil independientemente del pH de la solución y evita por ello el uso de agentes reguladores del pH tales como ácidos y bases.

Otro objeto todavía es proporcionar un método selectivo de aislamiento de un ácido nucleico como se ha descrito antes, cuyo método permite su precipitación dentro de una amplia ventana de pH y concentraciones de sal y que no es sensible a la adición de un exceso de agente de precipitación.

Un objeto específico de la invención es proporcionar un método selectivo de aislamiento del ácido nucleico ADN plásmido sin tener ningún efecto esencial en la estructura superarrollada del plásmido. Un objetivo particular es proporcionar un método de aislamiento selectivo para plásmidos disponibles en un lisado alcalino clarificado que contiene altas concentraciones de sales y ARN.

Aparecerán realizaciones adicionales y ventajas de la invención de la siguiente descripción detallada de la invención y de la parte experimental.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de solubilidad que ilustra la solubilidad de los complejos formados según la invención por agentes de precipitación policatiónicos con diferentes plásmidos o ARN frente a diferentes relaciones de carga, [+]/[-].

La Figura 2 muestra un análisis cromatográfico del resultado de un experimento modelo con ADN plásmido y ARN realizado en acetato potásico 1 M, pH 5,5.

La Figura 3 muestra los resultados de electroforesis en gel de agarosa obtenidos por las adiciones subsiguientes de agente de precipitación policatiónico al mismo ADN plásmido que contiene lisado alcalino clarificado.

La Figura 4 muestra los resultados de electroforesis en gel de agarosa que ilustran cómo puede precipitarse selectivamente ADN plásmido de un lisado alcalino clarificado diluido dos veces.

La Figura 5 es un gráfico del porcentaje de ácido nucleico en solución (eje y) frente a la concentración de sal (eje x), que muestra la dependencia de la porción de ADN que queda en el sobrenadante de sistemas ADN/PDMDAAC (1), ADN/bromuro de 2,5-ioneno (2) y ADN/bromuro de 10,10-ioneno (3) en la concentración de la sal externa.

La Figura 6 muestra el ácido nucleico soluble frente a la relación de carga con diferentes concentraciones de sal.

\newpage

Definiciones

La expresión "solución biológica" se usa aquí para cualquier solución en la que pueda estar presente material biológico tal como ácidos nucleicos. Así, la expresión incluye soluciones acuosas, tales como tampones, lisados de células, etc.

La expresión "ácido nucleico" según se usa aquí incluye cualquier forma de ácido nucleico, tal como se discute en la sección Fundamento de la presente memoria descriptiva.

El término "policatión" se usa aquí de forma intercambiable con la expresión "agente de precipitación policatiónico".

Un "policatión de tipo integral" indica una molécula en la que el grupo amina cuaternaria es parte de una cadena de polímero, mientras que la expresión "policatión de tipo colgante" indica una molécula en la que el grupo amina cuaternaria está colgante de dicha cadena.

La "relación de carga" se define como [+]/[-], en la que [+] es la concentración de grupos amino cuaternario en el policatión y [-] es la concentración de grupos fosfato en ADN plásmido.

El término "insoluble" que se usa aquí para indicar una precipitación o un complejo significa una precipitación o complejo que puede separarse de la solución en la que se ha formado por centrifugación ordinaria.

Descripción detallada de la invención

Un primer aspecto de la presente invención es un método de aislamiento de un ácido nucleico de una solución biológica, cuyo método comprende precipitar selectivamente el ácido nucleico deseado añadiendo un agente de precipitación policatiónico a la solución y permitiéndole formar un complejo insoluble con dicho ácido nucleico, en el que el agente de precipitación es un polímero lineal altamente cargado que comprende grupos amino cuaternario. El método es selectivo en el sentido de que se precipita el ácido nucleico deseado, mientras que no se precipitan otros ácidos nucleicos, así como otras moléculas de la solución. Preferiblemente, dicho agente se añade en presencia de sal en una cantidad tal que la relación de carga [+]/[-] entre el agente de precipitación policatiónico y el ácido nucleico es \geq aproximadamente 0,5 durante la precipitación. Como se discutirá después con mayor detalle, la concentración de sal se controla preferiblemente durante la precipitación. En una realización ventajosa, dicha relación de carga es \geq aproximadamente 0,9, preferiblemente \geq 1, durante la precipitación.

Así, el precipitado formado según la invención también es conocido como complejo de polielectrólito insoluble y los agentes de precipitación usados aquí son policationes sintéticos o naturales. Los complejos de polielectrólitos solubles se han utilizado anteriormente principalmente en estudios, por ejemplo, de suministro de genes, en los que sus propiedades se han interpretado y predicho, en lugar de para purificación en bioprocedimientos a escala industrial. El complejo de polielectrólito, que es insoluble en las condiciones usadas para precipitación, puede redisolverse o incluso destruirse completamente para formar componentes individuales. Esto se consigue adaptando las condiciones de concentración de sal y/o pH en la solución, y se discutirá después con mayor detalle.

En el presente método, el ácido nucleico deseado es un plásmido.

La solución biológica de la que se aísla el ácido nucleico deseado puede ser cualquier solución, que no tenga ningún impacto perjudicial sobre el ácido nucleico y en la que la carga del ácido nucleico esté esencialmente intacta. Así, en una realización, la solución biológica es un lisado de células. El lisado puede ser resultado de una ruptura mecánica de células. Alternativamente, el lisado puede ser un lisado alcalino clarificado, preparado tratando células con un reactivo fuertemente alcalino que contiene detergente, seguido por neutralización y centrifugación, produciendo una solución que contiene ácido nucleico con una alta concentración de sal. Así, una ventaja principal del presente método es que es aplicable también en soluciones en las que la concentración de sal es alta.

Se dan ejemplos ilustrativos de la capacidad del método para manejar lisados alcalinos en los Ejemplos 9, 10 y 12. En estos ejemplos, la concentración de sal es muy alta durante la etapa de precipitación de ácido nucleico, a saber, alrededor de 0,6 M con respecto a potasio y 1 M con respecto a acetato. Esta concentración de sal es mucho más alta que las descritas en las referencias dadas en la sección de fundamento.

En los Ejemplos 9 y 10, el lisado clarificado preparado según el Ejemplo 2 se sometió primero a un pre-tratamiento (Ejemplo 2.1), para mejorar la etapa de precipitación de polielectrólito. El pre-tratamiento quiere decir simplemente almacenar el lisado clarificado a 4ºC durante varios días y separar después el precipitado formado espontáneamente por centrifugación.

En el Ejemplo 12, el lisado clarificado se sometió primero a un pre-tratamiento alternativo (Ejemplo 2.2) para mejorar la etapa de precipitación de polielectrólito. El pre-tratamiento implicó adición de zeolita hidrófoba. Este pre-tratamiento alternativo tenía la ventaja de ser muy rápido en contraste con el tratamiento anterior que requería almacenamiento durante varios días.

Se sabe que las zeolitas hidrófobas usadas en el Ejemplo 2.2 adsorben SDS (dodecilsulfato sódico), un compuesto añadido en la etapa de lisis alcalina (Experimento 2). Podría suponerse que SDS o SDS en combinación con otras sustancias interfieren adversamente con la etapa de precipitación de polielectrólito y su separación debería ser así beneficiosa. La elección de una zeolita con una composición adecuada fue guiada por las instrucciones dadas por Eriksson y Green (The use of zeolite Y in the purification of intracellular accumulated proteins from genetically engineered cells. Biotechnol. Tech. 6 (1992) 239-244).

En una realización alternativa, se aplica una etapa de pre-tratamiento, tal como una separación cromatográfica, en la solución biológica antes de la precipitación según la invención.

Como se ha mencionado antes, el agente de precipitación es un polímero lineal catiónico, altamente cargado, que comprende grupos amino cuaternario, como parte de la cadena de polímero, conocidos como policationes integrales, o incorporados como sustituyentes a la cadena, conocidos como policationes colgantes. En este contexto, la expresión "altamente cargado" significa que la relación de peso molecular de polímero (gramos por mol)/carga de polímero es menos de 1.000 y preferiblemente menos de 400. En una realización específica, dicha relación es menos de aproximadamente 250, tal como menos de aproximadamente 215. En una realización, el agente de precipitación policatiónico comprende al menos aproximadamente 25 cargas positivas, es decir, grupos amina cuaternaria. En una realización específica, el agente de precipitación policatiónico comprende al menos aproximadamente 50, más preferiblemente al menos aproximadamente 500 y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 1.000 cargas positivas, es decir, grupos amina cuaternaria. Usualmente, cada unidad repetitiva del polímero comprenderá un grupo amina tal, y por eso los números dados antes se aplican también al número de unidades repetitivas en el agente de precipitación usado. Así, en una realización, el agente de precipitación está constituido por al menos 1.000 unidades repetitivas.

En una realización, el agente de precipitación es un polímero que comprende aproximadamente 1.400 DP y presenta una relación peso molecular de polímero/carga de polímero de 160, a saber, poli(cloruro de N,N'-dimetildialilamono) (DMDAAC), que es un producto disponible comercialmente (Polysciences, Inc. Washington, PA). En esta realización, el precipitado, es decir, el complejo polielectrolítico insoluble, se forma en la región 0,5 \leq [+]/[-] \leq 10 y preferiblemente en la región 0,7 \leq [+]/[-] \leq 5, dependiendo de la concentración de sal.

En otra realización, el agente de precipitación es un polímero que comprende un bromuro de ioneno alifático que comprende aproximadamente 80 DP y presenta una relación peso molecular de polímero/carga de polímero de 172.

En otra realización todavía, el agente de precipitación es un polímero que comprende poli(haluros de N-alquil-4-vinilpiridinio). Así, en una realización específica, el agente de precipitación se selecciona del grupo constituido por poli(cloruro de N-metil-4-vinilpiridinio), poli(bromuro de N-etil-4-vinilpiridinio) y poli(bromuro de N-propil-4-vinilpiridinio). Algunos de ellos están disponibles comercialmente (Polysciences, Inc. Warrington, PA). Por consiguiente, la longitud de cadena preferida está por encima de DP 25 y la más preferida está por encima de DP 100, y la relación peso molecular de polímero/carga de polímero es 214.

Así, el agente de precipitación se selecciona del grupo constituido por poli(cloruro de N,N'-dimetildialilamonio), un bromuro de ioneno alifático y un poli(haluro de N-alquil-4-vinilpiridinio).

Como se ha mencionado antes, en una realización, la concentración de sal de la solución se controla durante la adición del agente de precipitación para permitir la precipitación selectiva cuantitativa del complejo ácido nucleico/policatión. En este contexto, la persona experta habrá reconocido que la relación de carga óptima para formar un complejo específico se moverá dependiendo de la concentración de sal en la solución biológica durante la precipitación. Así, el hallazgo inesperado que proporciona la base para la presente invención es que la presente precipitación de ácidos nucleicos puede obtenerse dentro de una amplia ventana de concentraciones de sal en comparación con la técnica anterior. Esta ventaja aparece claramente de la Figura 5 de la presente solicitud. Como se ha mencionado antes, se han obtenido precipitaciones selectivas previas de ácidos nucleicos con ciertas relaciones. Por el contrario, la precipitación según la invención puede realizarse en presencia de sal añadiendo una cantidad de agente de precipitación policatiónico para proporcionar un cierto número de cargas positivas que sean equivalentes o superiores al número de cargas negativas presentes en los ácidos nucleicos. En este contexto, véase la Figura 6 de la presente solicitud, en la que se ilustran las ventajas obtenidas con diversas relaciones de carga para diferentes concentraciones de sal. Por consiguiente, una ventaja con la invención es que no supondrá ningún inconveniente añadir un exceso de agente de precipitación policatiónico, porque produce una relación de carga más alta, que permite aún una precipitación eficaz. Por razones de simplicidad, para asegurar que se ha añadido una cantidad suficiente de agente de precipitación policatiónico, se añade a menudo en exceso.

En la presente invención, es ventajoso determinar el número de cargas negativas presentes en el ácido nucleico de la solución biológica antes de añadir agente de precipitación. Por consiguiente, en una realización, el presente método comprende una etapa de estimar el número de cargas negativas de la muestra antes de añadir el agente de precipitación. La persona experta en este campo puede determinar fácilmente el número de cargas negativas en una muestra que comprende ácidos nucleicos según métodos estándares, véase, por ejemplo, el siguiente Ejemplo 6. Brevemente, tal estimación incluirá, por ejemplo, las etapas de medir la absorbancia a 260 nm de una muestra de una solución que contenga ADN a fin de determinar el número de grupos fosfato según la fórmula bien conocida A = \varepsilon*c*l, en la que A es absorbancia, \varepsilon es el coeficiente de extinción y l es la longitud que atraviesa la luz a través de la cubeta. El coeficiente de extinción para ADN es 6.500 M^{-1}cm^{-1} (Olins, D.E.; Olins, A.L.; Von Hippel, P.H. Journal of Molecular Biology 1967, 24, 157-176). La concentración de cargas negativas de la muestra de ADN se determina dividiendo el valor de absorbancia por el coeficiente de extinción. El valor resultante es la concentración total de cargas negativas. Puede hacerse una estimación suficiente para ARN usando el mismo coeficiente de extinción. Si la solución que se desea analizar contiene cantidades desconocidas de ácido(s) nucleico(s), como por ejemplo un lisado, se toma convenientemente una pequeña muestra y se hace pasar por una columna analítica para separar ADN de
ARN.

En una realización, el presente método incluye también recuperar el ácido nucleico deseado disolviendo el precipitado formado por nueva adición de una sal. Así, en una realización, el presente método comprende también recuperar el ácido nucleico deseado del precipitado formado así separando el precipitado de la solución y disolución subsiguiente del precipitado, por lo que se forma un complejo soluble. En tal complejo soluble, el agente de precipitación está unido al ácido nucleico, pero no de manera lo suficientemente firme para permitir su aislamiento por centrifugación ordinaria. Así, en una realización específica, el presente método comprende también destruir el complejo de polielectrólito por adición de una sal, por lo que el ácido nucleico deseado está presente libre en solución. En tal complejo destruido, no tiene lugar esencialmente interacción entre los polímeros de cargas opuestas, y el agente de precipitación policatiónico y los ácidos nucleicos existen separadamente/libres en solución. Tales ácidos nucleicos libres se recuperan convenientemente por cromatografía, electroforesis o cualquier otro método bien conocido. Incluso aunque la persona experta en este campo apreciará que los valores exactos de concentración de sal dependerán de los otros parámetros, tales como la naturaleza y cantidad del agente de precipitación, esta clase de complejos se destruye con concentraciones de sal aumentadas. Por consiguiente, en una realización específica, la disolución y destrucción de la precipitación se realiza con una concentración de sal por encima de 0,5 M, preferiblemente por encima de 3 M, dependiendo de la relación de carga [+]/[-] y la naturaleza de la sal.

La sal puede ser virtualmente cualquier sal que sea bien conocida en el campo de la cromatografía y usada comúnmente para desorción de intercambiadores de iones, tales como cloruro sódico, cloruro potásico, acetato amónico, acetato potásico, etc. Los únicos requisitos de las sales usadas en el presente método son que sean capaces de desplazar del complejo el agente de precipitación policatiónico, liberando por ello los ácidos nucleicos, y que no tengan un impacto perjudicial sobre los ácidos nucleicos deseados. Opcionalmente, el precipitado puede lavarse, por ejemplo, con agua o tampón adecuado, antes de su disolución.

Otro aspecto de la invención es el uso de un método según la invención para aislar ácidos nucleicos que se han sometido a reacciones de modificación. Así, tales ácidos nucleicos pueden ser por ejemplo fragmentos de ácido nucleico.

Un último aspecto de la invención es un juego que comprende materiales suficientes para realizar el método según la invención, por ejemplo, precipitando, y opcionalmente añadir sal en compartimientos separados, junto con instrucciones escritas sobre cómo realizar tal método.

Descripción detallada de los dibujos

La Figura 1 es un cromatograma de solubilidad que ilustra cómo se estudió la solubilidad de los complejos formados por agente de precipitación policatiónico con diferentes plásmidos o ARN con diferentes relaciones de carga, es decir, diferentes [+]/[-], con acetato potásico 1 M (véase Ejemplo 7). Los datos obtenidos estudiando mezclas de ADN plásmido o ARN con agente de precipitación policatiónico se muestran como la porción de ADN que queda en el sobrenadante frente a [+]/[-].

La Figura 2 muestra un análisis cromatográfico de los resultados de un experimento modelo con ADN plásmido y ARN que se realizó con acetato potásico 1 M, según el siguiente Ejemplo 8. Se usaron condiciones similares a las de un lisado alcalino clarificado, es decir, la cantidad de ARN >> la cantidad de ADN plásmido. La relación entre agente de precipitación policatiónico y ADN plásmido fue 1,4, es decir, [+]/[-] = 1,4.

La Figura 3 muestra los resultados de una electroforesis en gel de agarosa obtenidos por adiciones subsiguientes de agente de precipitación policatiónico a la misma solución que contiene plásmido según el siguiente Ejemplo 9. Se añadió a un lisado alcalino clarificado que contenía ADN plásmido diluido dos veces solución de agente de precipitación policatiónico, correspondiente a [+]/[-] = 1. Después de la precipitación, se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo de ensayo y se añadió de nuevo un agente de precipitación policatiónico de la misma cantidad. Este procedimiento se repitió cuatro veces. El testigo es un lisado diluido dos veces, que se centrifugó también y produjo un pequeño glóbulo que no contenía ningún ADN plásmido. [+]/[-] = 5 significa que la cantidad de agente de precipitación policatiónico [+]/[-] = 1 se ha añadido subsiguientemente cinco veces a la misma solución. S indica sobrenadante y P glóbulo. Los glóbulos se disolvieron en acetato potásico 2 M. Las muestras se analizaron en electroforesis en gel de agarosa como se describe en el siguiente Ejemplo 5. De la Figura 3 se evidencia que el método según la invención con [+]/[-] = 5 produjo precipitación selectiva de ADN plásmido. Como se comprende fácilmente por la persona experta, por adición de agente de precipitación policatiónico se consiguió por supuesto en cada etapa alguna dilución, que se ve en la Figura 3 como una disminución de la intensidad de las bandas en el gel de agarosa.

La Figura 4 ilustra el resultado de electroforesis en gel de agarosa de un lisado alcalino clarificado que estaba diluido dos veces y al que se añadió agente de precipitación policatiónico, correspondiente a [+]/[-] = 4. Después de la precipitación, no se detectó ARN o ADN plásmido en el glóbulo disuelto (Pista 2). Se prepararon cinco muestras idénticas según el Ejemplo 10 en tubos de ensayo. Después de la precipitación, los cinco sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos. Se añadieron a los cinco sobrenadantes diferentes volúmenes de solución de policatión 2 mM (basada en la concentración de monómero correspondiente) según la invención, correspondiente a [+]/[-] = 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente. Como testigo, se usó la solución de lisado alcalino clarificado y agua destilada. Todos los glóbulos se redisolvieron en 1 ml de acetato potásico 2 M, pH 5,5. Las muestras se analizaron en electroforesis en gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 5. Los resultados de la segunda precipitación con [+]/[-] = 4 + 2 se dan en las Pistas 5-6, 4 + 3 en las Pistas 7-8, 4 + 4 en las Pistas 9-10 y 4 + 5 en las Pistas 11-12. La Pista 1 muestra el lisado alcalino clarificado diluido dos veces. La precipitación de dos etapas produjo una precipitación parcial del ADN plásmido con [+]/[-] = 4 + 1, pero una precipitación completa y selectiva en todo el resto.

La Figura 5 muestra la dependencia de la porción de ADN restante en el sobrenadante de sistemas ADN/
PDMDAAC (1), ADN/bromuro de 2,5-ioneno (2) y ADN/bromuro de 10,10-ioneno (3) de la concentración de la sal externa. Otras condiciones son las mismas que en la Fig. 6.

La Figura 6 muestra la dependencia de la porción de ADN que queda en el sobrenadante del sistema ADN/
PDMDAAC de la composición \phi = [+]/[-] en ausencia de sal externa (1) y en presencia de diferente concentración M de NaCl: 0,04 M (2), 0,06 M (3), 0,09 M (4) y 0,12 M (5). Tris-HCl 0,02 M, pH 9,0, 25ºC.

Parte experimental

Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no han de considerarse como limitativos de la presente invención, como se define por las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias dadas después o en cualquier sitio en la presente solicitud se incluyen como referencia.

Materiales

Medios de fermentación:

30 g de caldo de soja triptona/l (OXOID)

10 g de extracto de levadura/l (Gistex)

10 g de dextrosa/l

100 mg de ampicilina/l (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.)

Plásmido de expresión y cepa bacteriana

E. coli XL1 Blue que albergaba el plásmido pBluescript II KS (+/-) de 2,9 kpb que tenía un inserto de gen de xilanasa de Rhodothermus marinus (3 kpb) dando un tamaño de plásmido total de 5,9 kpb (Eva Nordberg Karlsson, Xylan degradation by the Thermophilic bacterium Rhodothermus marinus: Characterization and function of a thermostable xylanase. tesis doctoral, Departamento de Biotecnología, Lund University, Suecia, 1999, ISBN 91-628-3598-X).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Crecimiento de células

Se desarrollaron células de E. coli que albergaban el plásmido en un matraz de sacudidas de 500 ml que contenía 100 ml de medio de fermentación (37ºC, 160 rpm, 9 h) hasta una densidad óptica de 2 (OD_{600 \ nm}). Se usaron 10 ml cada vez de estos cultivos durante la noche para inocular cuatro matraces de sacudidas de 500 ml que contenían cada uno 100 ml de medio de fermentación, y las células se desarrollaron adicionalmente durante 9 h (37ºC, 160 rpm) hasta una densidad óptica de 6,5 (OD_{600 \ nm}). Todo este cultivo (400 ml) se usó para inocular un fermentador de 15 l (Electrolux) que contenía 10 l de medio de fermentación. Las células se desarrollaron durante 8,5 h (37ºC, 600 rpm) hasta una densidad óptica de 12,5 (OD_{600 \ nm}). Durante la fermentación, se mantuvo el pH del medio en 7 por adición de NaOH 1 M y se inhibió la espuma por adición ocasional de adekanol (Asahi Denka Kogyo K.K:, Japón). El cultivo de células de 10 l se bombeó a través de tubos estériles a un fermentador de 784 l (Belach bioteknik AB, Estocolmo, Suecia) que contenía 400 l de medio de fermentación. Las células se desarrollaron durante 10 h (37ºC) hasta una densidad óptica de 13 (OD_{600 \ nm}). Durante la fermentación, se mantuvo el pH del medio en 7 por adición de NaOH 5 M y se inhibió la espuma por adición de adekanol (unidad de control). Se bombearon también al fermentador 3,5 kg de dextrosa en 8 l de agua durante el cultivo (partida de alimentación, unidad de control). La velocidad de agitación se controló por la demanda de oxígeno. Las células se cosecharon por centrifugación a 15.000 rpm en una centrífuga Sharpless actuada con un caudal de alimentación de 1,2 l/min. La pasta de células obtenida se guardó como partes alícuotas de 5, 25 y 300 g a -80ºC.

Ejemplo 2 Lisis de células

La lisis de células se realizó por el método de lisis alcalina como sigue: se descongelaron 5 g de pasta de células del Ejemplo 1 y se resuspendieron completamente mediante formación de torbellino suave en 36 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8, glucosa 61 mM, EDTA 50 mM. La suspensión de células se transfirió a un vaso de boca ancha de plástico equipado con agitación magnética, se añadieron 78 ml de NaOH 0,2 M que contenían 1% de SDS y se continuó la agitación suave durante 7 minutos a temperatura ambiente. Después de este período de incubación, se añadieron 59 ml de KAc 3 M frío (5ºC), pH 5,5, y la solución se mezcló suavemente por agitación magnética durante 20 minutos en un baño de hielo. El precipitado blanco formado se separó por centrifugación durante 30 minutos a 4ºC y 10.000 rpm en un rotor Sorvall GSA. El sobrenadante se filtró finalmente a través de una red de nylon (Falcon Cell Strainer, tamaño de poros 35 \mum).

Ejemplo 2.1

Pre-tratamiento de lisado clarificado por almacenamiento a 4ºC

El lisado clarificado del Ejemplo 2 se guardó a 4ºC durante 6 días. El precipitado formado se separó por centrifugación durante 30 minutos a 4ºC y 10.000 rpm en un rotor Sorvall GA.

Ejemplo 2.2

Pre-tratamiento de lisado clarificado mediante zeolita

Se preparó una suspensión de zeolita (160 mg/ml) mezclando Zeolita Y sólida (la Zeolita Y, con una relación en moles SiO_{2}/Al_{2}O_{3} de 430, se obtuvo de Tosoh Co., Japón) con Tris-HCl 25 mM, pH 8 y NaCl. La concentración final de Tris-HCl fue 2 mM y la concentración de NaCl fue 0,2 M. La suspensión se incubó a temperatura ambiente con mezclado suave durante 20 min. Se añadieron después 52,5 ml de la suspensión de zeolita a 105 ml de lisado clarificado, preparado como se ha descrito en el Ejemplo 2, se mezcló durante 60 s y se centrifugó después durante 10 min a 13.000 x g a 4ºC. Se recogió el sobrenadante y se guardó en un refrigerador hasta usarlo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Preparación de ADN plásmido

Se descongeló pasta de células del Ejemplo 1 y se purificó el ADN plásmido mediante el juego Qiagen Plasmid Mega (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) según la instrucción del fabricante.

Se obtuvo de Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) una preparación de plásmido puro (pJV4, 50 \mug/ml) consistente en pUC 19 (2,7 kpb) que tenía un inserto de 3,4 kpb (gen JV4-dmgA-demA) de Streptococcus dysgalactiae dando un tamaño de plásmido total de 6,1 kpb.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Análisis por separación de grupos en columna de Sephacryl S-500

Se rellenó con perlas Sephacryl® S-500 (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) una columna XK 16/20 (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) y se integraron a un sistema explorador 10 de ÄKTA® (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia). La columna se equilibró con KAc 2 M pH 5,5. Se inyectó 1 ml de la muestra y se hizo pasar con un caudal de 1 ml/min (30 cm/h). Los picos eluidos se detectaron a 260 y 280 nm.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Análisis por electroforesis en gel

Se realizó electroforesis en gel en geles de agarosa del 0,7% en tampón TBE (Tris-borato 0,089 M, pH 8,0, EDTA 2 mM). Se cargaron 15 \mul de las muestras en cada pocillo y se hicieron pasar las muestras a 60 v durante 60 minutos en una unidad submarina horizontal Hoefer® HE 33 Mini (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) accionada por un suministro de energía de electroforesis (EPS 301, Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia). Después de la pasada, se coloreó el gel de agarosa con bromuro de etidio empapando el gel en 100 ml de tampón TBE que contenía 1,5 \mug de bromuro de etidio/ml. El gel de agarosa se analizó y fotografió usando el software de documentación de gel Alphalmager 2200 v5.5 de Alpha Innotech Corporation (San Leandro, CA, EE.UU.).

Ejemplo 6 Determinación de la cantidad de cargas negativas en ácidos nucleicos

La concentración de ácido nucleico se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm y suponiendo el coeficiente de extinción molar 6500 M^{-1}cm^{-1}, calculado por un grupo fosfato. La concentración de ácido nucleico se presenta como concentración de grupos fosfato, es decir, concentración de cargas negativas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Solubilidad de complejos formados por el agente de precipitación policatiónico, poli(cloruro de N,N'-dimetildialilamonio), con ADN plásmido o ARN

Se mezclaron 0,1 ml de solución de ADN plásmido (pJV4 o pBluescript, 6 kpb), preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3, o 0,1 ml de solución de ARN (de levadura de panadero, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) con una concentración de 0,05 mg/ml, con una solución de acetato potásico 3 M, pH 5,5 y solución de policatión (2-50 \mul con una concentración de 2 mM (basada en la concentración de monómero correspondiente)). El volumen final fue 1,0 ml y la concentración de acetato potásico final 1 M. Después de sacudidas vigorosas durante al menos 1 min y centrifugación a 14.100 g durante 10 min, se comprobó la formación de complejos de polielectrólito midiendo la cantidad (absorbancia a 260 nm) de ácido nucleico residual en los sobrenadantes. Los resultados se presentan en la Figura 1 como ácido nucleico que queda en solución frente a la relación de cargas [+]/[-].

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Separación de ADN plásmido de un lisado alcalino clarificado "artificial" por poli(cloruro de N,N'-dimetildialilamonio)

Se mezclaron vigorosamente 0,75 ml de solución de ADN plásmido (pJV4, preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3) con una concentración de 0,05 mg/ml, 0,075 ml de solución de ARN (de levadura de panadero, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) de 10 mg/ml, 0,5 ml de solución de acetato potásico 3 M, pH 5,5 y 0,175 ml de agua destilada con 0,08 ml de agente de precipitación policatiónico 2 mM (en base a la concentración de monómero correspondiente) (corresponde a [+]/[-] = 1,4). Después de centrifugar a 14.100 g durante 10 min, se separó el sobrenadante y se disolvió el glóbulo en 1,5 ml de acetato potásico 2 M, pH 5,5. Se realizó el análisis en solución de partida (ADN plásmido, ARN y tampón sin agente de precipitación policatiónico añadido), sobrenadante y glóbulo disuelto según el método descrito en el Ejemplo 4. El resultado se muestra en la Figura 2.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Determinación de la relación de carga óptima cuando se separa ADN plásmido de un lisado alcalino clarificado mediante poli(cloruro de N,N'-dimetildialilamonio)

A 0,5 ml del lisado, preparado según el Ejemplo 2.1, se añadieron 0,5 ml de agua destilada. Se añadieron a esta solución 4,7 \mul de agente de precipitación policatiónico 2 mM (en base a la concentración de monómero correspondiente) (correspondiente a [+]/[-] = 1). Después de sacudidas vigorosas y centrifugación a 14.100 g durante 10 min, se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se añadió de nuevo la misma cantidad de agente de precipitación policatiónico. Este procedimiento se repitió cuatro veces. Como testigo, se usó la solución de ADN plásmido y agua destilada. Todos los glóbulos se disolvieron en 1 ml de acetato potásico 2 M, pH 5,5. Las muestras se analizaron en electroforesis en gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 5.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Separación de ADN plásmido de un lisado alcalino clarificado usando poli(cloruro de N,N'-dimetildialilamonio)

Se añadieron 0,480 ml de agua destilada a 0,5 ml de un lisado alcalino clarificado, que se había preparado según el Ejemplo 2.1. Se prepararon cinco muestras idénticas en tubos de ensayo añadiendo a cada uno 18,9 \mul de solución de policatión 2 mM (basado en la concentración de monómero correspondiente) (correspondiente a [+]/[-] = 4). Después de mezclado vigoroso y centrifugación a 14.100 g durante 10 min, los cinco sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Se añadieron a los sobrenadantes 4,7, 9,7, 14,2, 18,9 y 23,6 \mul (correspondientes a [+]/[-] = 1, 2, 3, 4, 5) de solución de policatión respectivamente con una concentración de 2 mM. Se usó como testigo la solución de lisado alcalino clarificado y agua destilada. Todos los glóbulos se disolvieron en 1 ml de acetato potásico 2 M, pH 5,5. Las muestras se analizaron en electroforesis en gel de agarosa como se ha descrito en el Ejemplo 5.

Ejemplo 11 Análisis por cromatografía de intercambio aniónico en columna MiniQ

La recuperación de plásmido superarrollado se determinó por cromatografía analítica de intercambio iónico en una columna MiniQ (4,6 x 50 mm) integrada a un sistema explorador ÄKTA® (obtenidos todos de Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) y se equilibró con Tris-HCl 25 mM, pH 8, que contenía NaCl 0,5 M. Para evitar la interferencia de ARN en la cuantificación de plásmido en muestras de lisado alcalino clarificado, éstas se incubaron con RNasa (100 \mug/ml) durante 15 minutos antes del análisis. Se inyectaron en la columna muestras de 100 \mul y se eluyeron después los ácidos nucleicos adsorbidos aplicando un gradiente de NaCl 0,5 a 0,8 M en 18 volúmenes de columna. El eluato de la columna se comprobó por absorbancia UV a 260 nm y 280 nm. El análisis se realizó con un caudal de 0,4 ml/min.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 Precipitación selectiva de ADN plásmido de un lisado alcalino clarificado tratado con zeolita

Se añadieron al lisado tratado con zeolita (Ejemplo 2.2) 11,1 ml de PDMDAAC 2 mM (basado en la concentración de monómero correspondiente). El volumen final se fijó en 210 ml por adición de agua. La muestra se mezcló durante aproximadamente 60 s y se centrifugó durante 10 min a 14.100 g (15-20ºC). Después de decantar el sobrenadante, se redisolvió el glóbulo en 5 ml de Tris-HCl 25 mM, pH 8, incluyendo NaCl 2 M. Se realizó análisis por cromatografía (Ejemplos 4 y 11) para determinar el contenido de ADN plásmido y ARN mientras que se usó el método BCA para proteínas (procedimiento Sigma Nº TPRO-562). Se analizaron por estos métodos el lisado clarificado, el lisado tratado con zeolita y el glóbulo redisuelto. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Análisis de precipitación de ADN plásmido de un lisado clarificado. (Todos los valores se dan como porcentaje de la cantidad inicial)

1

El ADN plásmido y el ARN se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaños (Ejemplo 4) o por cromatografía de intercambio aniónico (Ejemplo 11). La proteína se analizó por el método BCA (procedimiento Sigma Nº TPRO-562).

Claims

1. Un método de aislamiento de un plásmido de una solución biológica, cuyo método comprende precipitar selectivamente el ácido nucleico deseado añadiendo un agente de precipitación policatiónico a la solución y permitiéndole formar un complejo insoluble con dicho ácido nucleico, en el que el agente de precipitación se selecciona del grupo constituido por poli(cloruro de N,N'-dimetildialilamonio), un bromuro de ioneno alifático y un poli(haluro de N-alquil-4-vinilpiridinio).

2. Un método según la reivindicación 1ª, en el que la solución biológica es un lisado de células.

3. Un método según la reivindicación 2ª, en el que el lisado de células es un lisado de células alcalino.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de sal de la solución se controla durante la adición del agente de precipitación para permitir la precipitación selectiva cuantitativa del complejo ácido nucleico/policatión.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende también recuperar el ácido nucleico deseado del precipitado formado así separando el precipitado de la solución y disolviendo y/o destruyendo a continuación el complejo.

6. Un método según la reivindicación 5ª, en el que el complejo de polielectrólito se disuelve y/o destruye por adición de una sal para liberar el ácido nucleico deseado en la solución.

7. Un método según la reivindicación 6ª, en el que la disolución y/o destrucción del complejo se realiza con una concentración de sal por encima de 0,5 M dependiendo de la relación de carga [+]/[-] y de la naturaleza de la sal.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los plásmidos se han sometido a reacciones de modificación.