ES2306484T3

ES2306484T3 - Ensayos y kits de alta capacidad basados en el uso de fragmentos de proteccion contra nucleasas.

Info

Publication number: ES2306484T3
Application number: ES98964187T
Authority: ES
Inventors: Stephen Felder; Richard Kris
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2018-12-21
Also published as: PL342898A1; CA2315776C; JP2001526904A; JP5049395B2; NZ505319A; IL136862A; JP2009183286A; PL193762B1; NO20003115L; NO20003115D0; US6232066B1; CN1290306A; JP2011135884A; CZ302381B6; CN1292076C; JP2010046072A; AU2003234756A1; NO329977B1; KR20010033324A; EP1038033B1

Abstract

Un método de detección de al menos una diana de ácido nucleico, que comprende (a) poner en contacto una muestra que puede comprender dicha o dichas dianas de ácido nucleico con uno o más fragmentos de protección contra las nucleasas específico(s) para y que se fijan a dicha o dichas dianas de ácido nucleico en condiciones eficaces para que dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleares se fijen a dicha o dichas dianas de ácido nucleico, (b) exponer la muestra resultante a una nucleasa eficaz para digerir los ácidos nucleicos monocatenarios remanentes, (c) poner en contacto la muestra resultante con una combinación que comprende, antes de la adición de dicha muestra, (i) una superficie que comprende regiones múltiples espacialmente discretas, al menos dos de las cuales son sustancialmente idénticas, comprendiendo cada región (ii) al menos dos anclas diferentes, cada uno en asociación con (iii) un enlazador bifuncional, que tiene una primera porción que es específica para el ancla y una segunda porción que comprende una sonda que es específica para dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleasas; en condiciones eficaces para que dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleasas se fijen a dicha combinación, (d) detectar dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleasas fijados, en donde dichos fragmentos de protección contra las nucleasas, anclas y enlazadores bifuncionales son oligonucleótidos.

Description

Ensayos y kits de alta capacidad basados en el uso de fragmentos de protección contra nucleasas.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere, v.g., a kits y métodos útiles para realizar simultáneamente ensayos múltiples biológicos o químicos, utilizando redes de sondas repetidas. Una pluralidad de regiones contienen cada una una red de moléculas de ancla genéricas. Las anclas están asociadas con moléculas enlazadoras bifuncionales, conteniendo cada una una porción que es específica para al menos uno de las anclas y una porción que es una sonda específica para una diana de interés. La red de sondas resultante se utiliza para analizar la presencia de una o más moléculas diana que interaccionan específicamente con las sondas. La invención se refiere a diversos campos que se distinguen por la naturaleza de la interacción molecular, con inclusión pero sin carácter limitante del descubrimiento de productos farmacéuticos, biología molecular, bioquímica, farmacología y tecnología de diagnósticos médicos.

Pluralidades de sondas moleculares dispuestas sobre superficies o "chips" han sido utilizadas en una diversidad de ensayos biológicos y químicos. Los ensayos se realizan para determinar si las moléculas diana de interés interaccionan con cualquiera de las sondas. Después de exposición de las sondas a moléculas diana en condiciones de test seleccionadas, los dispositivos de detección determinan si una molécula diana ha interaccionado con una sonda
dada.

Estos sistemas son útiles en una diversidad de procedimientos de cribado para obtener información acerca, o bien de las sondas, o de las moléculas diana. Por ejemplo, dichos sistemas han sido utilizados para cribado respecto a péptidos o fármacos potenciales que se fijan a un receptor de interés, entre otros; para cribado de muestras respecto a la presencia de, por ejemplo, mutaciones genéticas, variantes alélicas en una población, o un patógeno o cepa de patógeno particular, entre muchos otros; para estudiar la expresión génica, por ejemplo a fin de identificar los mRNAs cuya expresión está correlacionada con una condición fisiológica, etapa de desarrollo, o estado de enfermedad particular, etc.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona kits y métodos para realizar simultáneamente ensayos biológicos o químicos múltiples, y permite análisis de alta capacidad de muestras múltiples - por ejemplo, muestras múltiples de pacientes que deben someterse a cribado en un ensayo de diagnóstico, o fármacos o agentes terapéuticos potenciales múltiples a testar en un método de descubrimiento de fármacos. Se proporciona una combinación que es útil para la detección de una o más dianas en una muestra. Esta combinación comprende una superficie que comprende una pluralidad de regiones espacialmente discretas, que pueden denominarse regiones de test y que pueden ser pocillos, al menos dos de los cuales son sustancialmente idénticos. Cada superficie comprende al menos dos, preferiblemente al menos veinte o más, v.g., al menos aproximadamente 25, 50, 96, 864, o 1536, etc., de dichas regiones sustancialmente idénticas. Cada región de test define un espacio para la introducción de la muestra que contiene (o que contiene potencialmente) una o más dianas y contiene una red biológica o química. (Frases tales como "muestra que contiene una diana" o "detección de una diana en una muestra") no deben entenderse en el sentido de excluir muestras o determinaciones (tentativas de detección) en las cuales no se contiene o detecta diana alguna. En un sentido general, esta invención implica redes para determinar si una diana está contenida en una muestra con indiferencia de si la misma se detecta o no). Esta red comprende "anclas" genéricas, cada uno en asociación con una molécula enlazadora bifuncional que tiene una primera porción que es específica para el ancla y una segunda porción que comprende una sonda que es específica para al menos una de las dianas posibles. La combinación se pone en contacto con una muestra que contiene una o más dianas, que reaccionan opcionalmente con una o más moléculas detectoras, y es interrogada luego por un dispositivo de detección que detecta reacciones entre las moléculas diana y las sondas en las regiones de test, generando con ello los resultados del ensayo.

La invención proporciona métodos y kits particularmente útiles para ensayos biológicos de alta capacidad. En realizaciones especialmente preferidas, la invención puede utilizarse para cribado de alta capacidad para el descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, un ensayo de alta capacidad puede ejecutarse en muchas (por ejemplo 100) microplacas de 96 pocillos a un mismo tiempo. Cada pocillo de una placa puede tener, v.g., 36 tests diferentes realizados en el mismo por utilización de una red de aproximadamente 36 anclas y pares de enlazadores. Es decir, 100 placas, con 96 pocillos por placa, y cada una con 36 tests por pocillo, pueden permitir un total de 345.000 tests; por ejemplo, cada uno de 9600 candidatos diferentes de fármaco puede testarse simultáneamente respecto a 36 parámetros o ensayos diferentes. Los ensayos de alta capacidad proporcionan mucho más información para cada fármaco candidato que lo hacen los ensayos que someten a test exclusivamente un solo parámetro a un mismo tiempo. Por ejemplo, es posible en un ensayo de cribado inicial de alta capacidad determinar si un fármaco candidato es selectivo, específico y/o no tóxico. Los métodos que no poseen alta capacidad exigen ensayos de seguimiento extensivos para testar tales parámetros para cada fármaco candidato de interés. Varios tipos de ensayos de cribado de alta capacidad se describen, v.g., en los Ejemplos 15-17. La capacidad para realizar simultáneamente una gran diversidad de ensayos biológicos y realizar un número muy grande de ensayos al mismo tiempo (es decir, con capacidad muy alta) son dos ventajas importantes de la invención.

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En una realización, por ejemplo, utilizando placas DNA Bind de 96 pocillos (Corning Costar) fabricadas de poliestireno con una superficie derivatizada para la fijación de aminas primarias, tales como aminoácidos u oligonucleótidos modificados, puede aplicarse por puntos una colección de 36 oligonucleótidos diferentes sobre la superficie de cada pocillo de cada placa para servir como anclas. Las anclas pueden fijarse covalentemente al poliestireno derivatizado, y los mismos 36 anclas pueden utilizarse para todos los ensayos de cribado. Para cualquier ensayo particular, puede utilizarse una serie de enlazadores dada a fin de programar la superficie de cada pocillo de modo que sea específica para tantas como 36 dianas diferentes o tipos de ensayo de interés, y pueden aplicarse diferentes muestras de ensayo a cada uno de los 96 pocillos en cada placa. La misma serie de anclas puede utilizarse múltiples veces para reprogramar la superficie de los pocillos para otras dianas y ensayos de interés, o puede reutilizarse múltiples veces con la misma serie de enlazadores. Esta flexibilidad y la reutilizabilidad representan ventajas adicionales de la
invención.

Una realización de la invención es un método para detectar al menos una diana, como se define en las reivindicaciones 1 y 2.

A modo de ejemplo, las Figuras 1 y 2 ilustran una combinación de la invención y un método de utilizar la misma para detectar una diana de mRNA. La superficie, que se muestra en Fig. 2, contiene 15 regiones de test idénticas; en una realización especialmente preferida de la invención, cada una de estas regiones de test es un pocillo de una placa de microtitulación. Cada una de las regiones de test contiene seis anclas diferentes, indicados aquí como números 1-6. Fig. 1 ilustra esquemáticamente uno de dichos anclas, el ancla 1, que, en una realización muy preferida de la invención, es un oligonucleótido. El ancla 1 está fijada a una molécula enlazadora, enlazador 1, que comprende dos porciones. La primera porción, que es específica para el ancla, es en esta ilustración un oligonucleótido que puede hibridarse específicamente al ancla. La segunda porción, que es una sonda específica para la diana de interés - en este caso, la diana mRNA 1 - es en esta ilustración un oligonucleótido que puede hibridarse a dicha diana. Aunque no se ilustra en esta figura, cada uno de los 5 anclas restantes puede hibridarse a su propio enlazador por la vía de la porción específica de ancla; cada enlazador puede contener una porción de sonda específica para, v.g., un mRNA diferente de (o igual que) el mRNA 1. Esta combinación ilustrada puede utilizarse para ensayar tantas como 15 muestras diferentes al mismo tiempo respecto a la presencia de mRNA 1 (o, simultáneamente, para dianas de mRNA que están especificadas (programadas) por las otras 5 sondas en la red). Para realizar el ensayo, cada muestra, que en este Ejemplo puede ser un extracto de RNA de, digamos, una de 15 líneas de células independientes, se añade en un volumen pequeño a una de las regiones, o pocillos, y se incuba en condiciones eficaces para hibridación de la sonda y la diana. Con objeto de determinar si está presente mRNA 1 en una muestra, se emplea un dispositivo de detección que puede reconocer patrones, y/o puede interrogar localizaciones específicas dentro de cada región respecto a la presencia de una señal. Si las líneas de células se incuban en condiciones en las cuales sus mRNAs están marcados in vivo con una etiqueta, y si está presente mRNA 1 en una muestra, el detector detectará una señal procedente del mRNA identificado en la localización definida por el complejo 1 ancla/sonda. Alternativamente, el mRNA puede marcarse directamente in vitro, antes o después de añadirse a las regiones (pocillos). Alternativamente, como se ilustra en Fig. 1, el mRNA puede identificarse indirectamente, antes o después de haberse hibridado a la sonda, v.g., por incubación del RNA con un oligonucleótido "detector" identificado (oligonucleótido informador específico de la diana) que es complementario a una secuencia distinta de la reconocida por la sonda. En el ejemplo ilustrado, pueden analizarse simultáneamente 15 muestras. Dado que al menos 20 o más, v.g., tantas como 1536 o más, muestras pueden analizarse simultáneamente con esta invención, se trata de un sistema de ensayo de capacidad muy alta.

Cualquier superficie compatible puede utilizarse en asociación con esta invención. La superficie (usualmente un sólido) puede ser cualquiera de una diversidad de materiales orgánicos o inorgánicos o combinaciones de los mismos que incluyen, simplemente a modo de ejemplo, plásticos tales como polipropileno o poliestireno; cerámica; silicio; sílice (fundida), cuarzo o vidrio que pueden tener el espesor de, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio de microscopio o un cubreobjetos de vidrio; papel, tal como papel de filtro; celulosa diazotada, filtros de nitrocelulosa, membrana de nailon, o una pastilla de gel de poliacrilamida. Los sustratos que son transparentes a la luz son útiles cuando el método de realización de un ensayo implica detección óptica. En una realización preferida, la superficie es la superficie de plástico de una cápsula de pocillos múltiples, v.g., cápsula de cultivo de tejidos, por ejemplo una placa de 24, 96, 256, 384, 864 ó 1536 pocillos (v.g., una placa modificada tal como una placa Corning Costar DNA Bind). Las anclas pueden estar asociados, v.g., unidos, directamente con una superficie, o pueden estar asociados con un solo tipo de superficie, v.g., vidrio que está a su vez en contacto con una segunda superficie, v.g., con un "pocillo" de plástico en una cápsula de microtitulación. La forma de la superficie no es crítica. La misma puede, por ejemplo, ser una superficie plana tal como un cuadrado, rectángulo, o círculo; una superficie curva; o una superficie tridimensional tal como una cuenta, partícula, hebra, precipitado, tubo, esfera; etc.

La superficie comprende regiones que son espacialmente discretas y direccionables o identificables. Cada región comprende una serie de anclas. El modo en que están separadas las regiones, sus características físicas, y su orientación relativa mutua no son críticos. En una realización, las regiones pueden estar separadas unas de otras por cualquier barrera física que sea resistente al paso de los líquidos. Por ejemplo, en una realización preferida, las regiones pueden ser pocillos de una cápsula de pocillos múltiples (v.g., de cultivo de tejidos), por ejemplo una placa de 24, 96, 256, 384, 864 o 1536 pocillos. Alternativamente, una superficie tal como una superficie de vidrio puede atacarse a fin de que tenga, por ejemplo, 864 o 1536 pocillos discretos poco profundos. Alternativamente, una superficie puede comprender regiones sin separaciones o pocillos de ningún tipo, por ejemplo una superficie plana, v.g., una pieza de plástico, vidrio o papel, y las regiones individuales pueden definirse ulteriormente por superposición de una estructura (v.g., una pieza de plástico o vidrio) que delinea las regiones separadas. Opcionalmente, una superficie puede comprender ya una o más redes de anclas, o anclas asociados con enlazadores, antes que se delineen las regiones individuales. En otra realización, redes de anclas dentro de cada región pueden estar separados unos de otros por espacios en blanco en la superficie en los cuales no existe ancla alguno, o por superficies límite químicas, tales como cera o siliconas, a fin de prevenir la extensión de las gotitas. En otra realización adicional, las regiones pueden estar definidas como tubos o canales de control de fluido, v.g., diseñados para ensayos de flujo continuo, como se describe, por ejemplo, en Beattie et al. (1995). Clin. Chem. 4, 700-706). Regiones situadas dentro o encima de, etc. una superficie pueden definirse también por modificación de la superficie propiamente dicha. Por ejemplo, una superficie de plástico puede comprender porciones hechas de plástico modificado o derivatizado, que pueden servir, v.g., como sitios para la adición de tipos específicos de polímeros (v.g., PEG puede unirse a una superficie de poliestireno y derivatizarse luego con grupos carboxilo o amino, enlaces dobles, aldehídos, etcétera). Alternativamente, una superficie de plástico puede comprender estructuras moldeadas tales como protrusiones o resaltos, que pueden servir como plataformas para la adición de anclas. La orientación relativa de las regiones de test puede tomar cualquiera de una diversidad de formas que incluyen, pero sin carácter limitante, redes paralelas o perpendiculares dentro de un cuadrado o rectángulo u otra superficie, redes que se extienden radialmente dentro de una superficie circular o diferente, o redes
lineales, etc.

Las regiones espacialmente discretas de la invención se presentan en copias múltiples. Es decir, existen al menos dos regiones espacialmente discretas (separadas), preferiblemente al menos veinte, o al menos aproximadamente 24, 50, 96, 256, 384, 864, 1536, 2025, o más, etc., sustancialmente idénticas. Números crecientes de regiones repetidas pueden permitir ensayos de capacidad cada vez mayor. La expresión regiones sustancialmente idénticas, como se utilizan en esta memoria, hace referencia a regiones que contienen redes idénticos o sustancialmente idénticos de anclas y/o complejos ancla/enlazador. El término sustancialmente idéntico, como se utiliza en esta memoria, significa que se pretende que una red o región sirva esencialmente para la misma función que otra red o región en el contexto de analizar una diana de acuerdo con esta invención. Las diferencias que no afectan esencialmente a la función, es decir, a la detectabilidad de las dianas, son por ejemplo pequeñas imperfecciones de nucleótidos (omisiones/inserciones/sustituciones) o imperfecciones de oligonucleótidos (fijación deficiente a la superficie), etc., que no afectan significativamente dentro de la exactitud del ensayo a los resultados de determinación de la diana.

Por supuesto, una persona con experiencia en la técnica reconocerá que no todas las regiones de una superficie precisan ser sustancialmente idénticas unas a otras. Por ejemplo, si dos conjuntos de redes diferentes deben testarse en paralelo, podría ser ventajoso incluir ambos conjuntos de redes en una sola superficie. Por ejemplo, las dos conjuntos de redes diferentes pueden estar dispuestas en patrones de bandas alternantes, para facilitar la comparación entre las mismas. En otra realización, el técnico puede desear incluir una o más regiones que puedan ser detectadas de una manera distinguible de las otras regiones en la superficie y pueden utilizarse por tanto como "región(es) de registro". Por ejemplo, una región de registro puede comprender oligonucleótidos o péptidos que exhiben un patrón distintivo de moléculas fluorescentes que pueden ser reconocidas por un dispositivo de detección por escaneo como un "punto de partida" para alinear las localizaciones de las regiones sobre una superficie.

El tamaño y la separación física de las regiones de test no son limitantes. Las regiones típicas tienen un área de aproximadamente 1 a aproximadamente 700 mm^{2}, preferiblemente 1 a aproximadamente 40 mm^{2}, y están separadas aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mm de distancia, y se seleccionan rutinariamente dependiendo de las áreas implicadas. En una realización preferida, las regiones están espaciadas aproximadamente a una distancia de 5 mm. Por ejemplo, cada región podría comprender una cuadrícula rectangular, con, por ejemplo 8 filas y 6 columnas, de puntos de anclas aproximadamente circulares que tienen un diámetro de aproximadamente 100 micrómetros y una separación de 500 micrómetros; una región de este tipo cubriría aproximadamente un área de 20 milímetros cuadrados. Se incluyen áreas y espaciamientos de región mayores y menores.

Las regiones pueden subdividirse también adicionalmente de tal manera que algunas o todas las anclas dentro de una región estén separadas físicamente de las anclas vecinos por medios, v.g. de una indentación o depresión. Por ejemplo, el número de subdivisiones (subregiones) en una región puede variar desde aproximadamente 10 a aproximadamente 100, poco más o menos. En una realización, una región que es un pocillo de una cápsula de 1536 pocillos puede subdividirse ulteriormente en pocillos más pequeños, v.g., de aproximadamente 4 a aproximadamente 900, con preferencia aproximadamente 16 a aproximadamente 36 pocillos, formando con ello una red de pocillos-dentro de-pocillos. Véase Fig. 4. Una superficie deprimida de este tipo reduce la tolerancia requerida para situar físicamente un solo ancla (o grupo de anclas) en cada uno de los espacios (locus) diseñados, y el tamaño de las áreas que contienen las anclas es más uniforme, facilitando con ello la detección de dianas que se fijan a la sonda.

El término "ancla" como se utiliza en esta memoria, hace referencia a moléculas de ácido nucleico (véase, v.g., Fig. 7)) que están asociadas con (v.g., inmovilizadas sobre, o unidas covalentemente o no covalentemente a) la superficie, o que es una porción de dicha superficie (v.g., porción derivatizada en una superficie de plástico), y que puede sufrir interacción o asociación específica con un enlazador u otra sustancia como se describe en esta memoria. El ancla es un ácido nucleico, que puede ser de cualquier longitud (v.g., un oligonucleótido) o tipo (v.g., DNA, RNA, PNA o un producto PCR de una molécula de RNA o DNA). El ácido nucleico puede estar modificado o sustituido (v.g., comprendiendo nucleótidos no existentes naturalmente tales como, v.g., inosina; unido por diversos eslabones conocidos tales como sulfamato, sulfamida, fosfotionato, metilsulfonato, carbamato, etc.; o una molécula semisintética tal como un conjugado DNA-estreptavidina, etc.). Se prefieren ácidos nucleicos monocatenarios.

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El número de anclas en una región de test puede ser al menos dos, estando comprendido con preferencia entre aproximadamente 8 y aproximadamente 900 (estando incluidos más o menos), de modo más preferible entre aproximadamente 8 y aproximadamente 300, y de modo muy preferible entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100 (v.g., preferiblemente 64). En algunas realizaciones preferidas, existen aproximadamente 16, 36, 45 ó 100 anclas/región de test para una superficie con 96 regiones de test (v.g., pocillos), o aproximadamente 9, 16 ó 25 anclas/región de test para una superficie con 384 regiones de test (v.g., pocillos). En una realización muy preferida, cada ancla en una región de test tiene una especificidad diferente de todas las restantes anclas en la red. Sin embargo, dos o más de las anclas pueden compartir la misma especificidad y la totalidad de las anclas pueden ser idénticos. En una realización, en la cual una combinación de la invención comprende un número muy grande de regiones de test (v.g., aproximadamente 864, 1536, o más), de tal modo que puede procesarse un gran número de muestras de test a un mismo tiempo, podría ser interesante testar dichas muestras para sólo un número limitado (v.g., aproximadamente 2, 4, 6 ó 9) de parámetros. Dicho de otro modo, para combinaciones que comprenden un número muy grande de regiones, podría ser ventajoso tener sólo aproximadamente 2 a 9 anclas por región.

El espaciamiento físico y la orientación relativa de las anclas en o sobre una región de test no son limitantes. Por lo general, la distancia entre las anclas es aproximadamente 0,003 a aproximadamente 5 mm o menos, con preferencia entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 1. Se incluyen espaciamientos (y áreas) de ancla mayores y menores. Las anclas pueden estar configurados en cualquier orientación mutua relativa y con respecto a los límites de la región. Por ejemplo, los mismos pueden estar dispuestos en una orientación bidimensional, tal como una disposición cuadrada, rectangular, hexagonal o de otra forma, o una disposición circular con anclas procedentes del centro en líneas radiales o anillos concéntricos. Las anclas pueden estar dispuestos también en una disposición lineal unidimensional. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden hibridarse a posiciones específicas a lo largo de una secuencia de DNA o RNA para formar una disposición supramolecular. Alternativamente, las anclas pueden desplegarse en una formación semejante a un "código de barras". (Véase Fig. 6). Por ejemplo, las anclas pueden extenderse como líneas largas paralelas unas a otras. El espaciamiento entre o la anchura de cada línea larga puede modificarse de manera regular para proporcionar un patrón simple y reconocible que se asemeja mucho a un código de barras, v.g., las líneas primera y tercera pueden ser de doble anchura que el resto, pueden omitirse líneas, etc. Una línea vacía adicional puede situarse después de la última línea para delimitar una sola región de test, y el patrón del código de barras puede repetirse en regiones de test sucesivas.

El patrón de anclas no precisa encontrarse en coincidencia estricta con las posiciones de los pocillos de ensayo (regiones de test) separados o separar las gotitas de ensayo. El término "posiciones de ensayo" se utilizará para hacer referencia a las posiciones de la superficie del ensayo en la que se aplican las muestras de ensayo. (Estas pueden definirse por la posición de las gotitas separadas de muestra de ensayo o por la posición de paredes o separadores que definen pocillos de ensayo individuales en una placa de pocillos múltiples, por ejemplo). El patrón de ancla propiamente dicho (v.g., un patrón semejante a un "código de barras" de anclas de oligonucleótidos) se utiliza para definir en qué punto está posicionado exactamente cada ancla separado por reconocimiento de patrones - exactamente igual que cada línea de un código de barras es reconocida por su posición relativa a las líneas restantes. Por tanto, la primera ancla no precisa estar situado en un borde o un vértice de cada posición de ensayo. La primera ancla se encontrará por reconocimiento del patrón, en lugar de la posición con respecto a la posición de ensayo. Con tal que el área utilizada por cada posición de ensayo (el área de la gotita o el área del pocillo por ejemplo) sea suficientemente grande para estar seguro de que contiene al menos una unidad entera del patrón repetitivo de anclas, entonces cada punto de ensayo testará la muestra para dicha posición de ensayo para la totalidad de las dianas especificadas por el patrón (codificado por barras) siempre que el patrón se encuentre dentro del área de la posición de
ensayo.

Las anclas no precisan estar dispuestos en un patrón estricto o incluso fijo dentro de cada región de test. Por ejemplo, cada ancla puede estar unido a una partícula, cuenta, o análogos, que asume una posición aleatoria dentro de una región de test. La localización de cada ancla puede determinarse por el uso, v.g., de una etiqueta detectable. Por ejemplo, la molécula enlazadora específica para cada tipo de ancla puede marcarse con una etiqueta fluorescente, luminiscente, etc., diferente, y la posición de una partícula que comprende un par enlazador/ancla particular puede identificarse por la naturaleza de la señal que procede del enlazador, v.g., el espectro de excitación o emisión. Un experto en la técnica puede preparar una serie de enlazadores con una diversidad de dichos etiquetas fijados, cada una de ellas con un espectro distinguible. Alternativamente, las anclas pueden marcarse directamente. Por ejemplo, cada tipo de ancla puede marcarse con una etiqueta que emite fluorescencia con un espectro diferente de las etiquetas existentes en otros tipos de anclas. Alternativamente, las partículas, cuentas o análogas pueden ser diferentes unas de otras en tamaño o forma. Puede emplearse cualquiera de los métodos de marcación y detección descritos en esta memoria. Por ejemplo, la fluorescencia puede medirse por un sistema de obtención de imágenes basado en CCD, por un microscopio de fluorescencia de barrido o por un instrumento Fluorescence Activated Cell Sorter
(FACS).

Un ancla puede interaccionar o llegar a asociarse específicamente con una porción - la porción específica de ancla - de una molécula enlazadora. Por los términos "interaccionar" o "asociarse", se entiende en esta memoria que dos sustancias o compuestos (v.g., el ancla y la porción específica de ancla de un enlazador, una sonda y su diana, o una diana y un informador específico de la diana) están unidos (v.g., fijados, enlazados, hibridados, reunidos, reasociados, enlazados covalentemente, o asociados de cualquier otro modo) uno a otro suficientemente para que pueda realizarse el ensayo propuesto. Por los términos "específico" o "específicamente", se entiende en esta memoria que dos componentes (v.g., ancla y región específica de ancla de un enlazador, una sonda y su diana, o una diana y un informador específico de la diana) se unen selectivamente uno a otro y, en ausencia de cualquier técnica de protección, no lo hacen generalmente a otros componentes no intencionados para unirse a los componentes en cuestión. Los parámetros requeridos para conseguir interacciones específicas pueden determinarse rutinariamente, v.g., utilizando métodos convencionales en la técnica.

Una persona con experiencia en la técnica puede determinar por vía experimental las características (tales como longitud, composición de bases, y grado de complementariedad) que permitirán que un ácido nucleico (v.g., un ancla oligonucleotídica) se hibride a otro ácido nucleico (v.g., la porción específica de ancla de un enlazador) en condiciones de severidad seleccionada, al tiempo que se minimiza la hibridación inespecífica a otras sustancias o moléculas (v.g., otros enlazadores oligonucleotídicos). Típicamente, el DNA u otra secuencia de ácido nucleico de un ancla, una porción de un enlazador, o un oligonucleótido detector tendrá complementariedad suficiente para su pareja de fijación a fin de permitir que la misma se hibride en condiciones severas de hibridación seleccionadas, y el valor T_{m} será aproximadamente 10º a 20ºC por encima de la temperatura ambiente (v.g., aproximadamente 37ºC). En general, un ancla oligonucleotídica puede comprender desde aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, con preferencia aproximadamente 15, 20, 25 ó 30 nucleótidos. Como se utiliza en esta memoria, "condiciones de hibridación de severidad alta" significa cualesquiera condiciones en las cuales se producirá hibridación cuando existe al menos 95%, con preferencia aproximadamente 97 a 100%), de complementariedad (identidad) de nucleótidos entre los ácidos nucleicos. Sin embargo, dependiendo del propósito deseado, pueden seleccionarse condiciones de hibridación que requieran menos complementariedad, v.g., aproximadamente 90%, 85%, 75%, 50%, etc. Entre los parámetros de la reacción de hibridación que pueden modificarse se encuentran la concentración de sal, tampón, pH, temperatura, tiempo de incubación, cantidad y tipo de desnaturalizante tal como formamida, etc. (Véase, v.g., Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Nueva York; Hames et al. (1985). Nucleic Acid Hybridization, IL Press; Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Sciences Publishing, Inc., Nueva York). Por ejemplo, puede añadirse ácido nucleico (v.g. oligonucleótidos enlazadores) a una región de test (v.g., un pocillo de una placa de pocillos múltiples - en una realización preferida, una placa de 96 ó 384 o más pocillos), en un volumen comprendido entre 0,1 y aproximadamente 100 o más \mul (en una realización preferida, aproximadamente 1 a aproximadamente 50 \mul, de modo muy preferible aproximadamente 40 \mul), a una concentración comprendida entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 5 \mum (en una realización preferida, aproximadamente 0,1 \mum), en un tampón tal como, por ejemplo, 6X SSPE-T (NaCl 0,9M, NaH_{2}PO_{4} 60 mM, EDTA 6 mM, y 0,05% de Triton X-100), e hibridarse a una pareja de fijación (v.g., un ancla oligonucleotídica en la superficie) en un tiempo comprendido entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente al menos 3 horas (en una realización preferida, al menos aproximadamente 15 minutos) a una temperatura comprendida entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 37ºC (en una realización preferida, aproximadamente a la temperatura ambiente). Las condiciones pueden seleccionarse para permitir alta capacidad. En una realización de la invención, las condiciones de reacción pueden aproximarse a las condiciones fisiológicas.

En algunas realizaciones de la invención, cada ancla en una red puede interaccionar con la porción específica de ancla de su enlazador correspondiente sustancialmente en el mismo grado que lo hacen los otros anclas de la red, en condiciones de reacción seleccionadas. Esto puede asegurar que las anclas especifiquen una red sustancialmente uniforme de enlazadores y, por consiguiente, de sondas.

Las anclas dentro de una región de test pueden ser una red "genérico", cada ancla del cual puede interaccionar con uno o más de una diversidad de enlazadores diferentes, cada uno de los cuales tiene una porción específica para dicho ancla pero con porciones "sonda" diferentes; así, puede utilizarse una red simple de anclas genéricos para programar o definir una serie diversificada de sondas. La naturaleza flexible de un ensayo genérico de anclas de este tipo puede ilustrarse con referencia a las Figuras 1 y 2. Fig. 2 ilustra una superficie que comprende 15 regiones de test, cada una de las cuales contiene una red de 6 anclas diferentes, que en este ejemplo pueden ser oligonucleótidos. Fig. 1 ilustra esquemáticamente uno de estas anclas (oligonucleótidos), el ancla 1, que está en contacto con el enlazador 1, que comprende una porción que es específica para el ancla 1 y una segunda porción que es específica para el mRNA diana 1. Alternativamente, podría sustituirse, v.g., un enlazador 2, que, al igual que el enlazador 1, comprende una porción que es específica para el ancla 1, pero que comprende una segunda porción que es específica para el mRNA diana 2 en lugar del mRNA diana 1. Así pues, el ancla 1 puede utilizarse para especificar (o programar, o definir, o determinar) sondas para uno cualquiera de dos o más mRNAs diana diferentes. El proceso de generación y fijación de un patrón (red) de alta resolución de oligonucleótidos o péptidos puede ser costoso, consumir mucho tiempo y/o ser físicamente difícil. La posibilidad de utilizar una red preformada de anclas para programar una gran diversidad de redes de sondas es una ventaja de esta invención.

Aunque las anclas genéricos ilustrados en Fig. 2 definen un patrón de sondas oligonucleotídicas, la red de anclas idénticos podría utilizarse también fuera del alcance de la invención para programar una red de otras sondas, por ejemplo proteínas receptoras (véase, v.g., Fig. 3).

En una realización de la invención, las anclas pueden interaccionar reversiblemente con los enlazadores; así, una serie genérica de anclas puede reutilizarse para programar una serie diversificada de sondas. Por ejemplo, un ancla oligonucleotídica puede separarse de la porción oligonucleotídica de un enlazador mediante, por ejemplo, un paso de calentamiento que hace que los dos oligonucleótidos se disocien, y puedan unirse luego nuevamente a un segundo enlazador. La posibilidad de reutilizar redes de ancla, que puede ser costosa, consumir mucho tiempo y/o ser físicamente difícil de realizar, es otra ventaja de la invención.

Un ancla no tiene que interaccionar necesariamente con un enlazador. Por ejemplo, un ancla puede estar acoplado (directa o indirectamente) a una molécula detectable, tal como un fluorocromo, y puede servir por ello para localizar un punto dentro de una cuadrícula, v.g., para el propósito de coincidencia entre la superficie de test y el detector. Alternativamente, un ancla puede marcarse con una cantidad conocida de una molécula detectable a fin de servir como marcador de cuantificación interno, v.g., para propósitos de calibración.

El término "enlazador" tal como se utiliza en esta memoria hace referencia una sustancia bifuncional que comprende una primera porción (o resto o parte) que es específica para un ancla seleccionado (designado) o subconjunto de las anclas ("específica de ancla") y una segunda porción que es una sonda que es específica para una diana de interés ("específica de diana").

Al ser el ancla un oligonucleótido, la porción del enlazador que interacciona con el mismo es un ácido nucleico que puede hibridarse eficiente y específicamente al mismo en condiciones de hibridación severa seleccionadas. El ácido nucleico puede ser, v.g., un oligonucleótido, DNA, RNA, PNA, producto PCR, o ácido nucleico sustituido o modificado (v.g., que comprende oligonucleótidos no existentes naturalmente tales como, v.g., inosina; unirse por diversos eslabones conocidos tales como sulfamato, sulfamida, fosforotionato, metilfosfonato, carbamato; o una molécula semisintética tal como un conjugado DNA-estreptavidina, etc). Se prefieren restos monocatenarios. La porción de un enlazador que es específica para un ancla oligonucleotídica puede variar desde aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, con preferencia aproximadamente 15, 20, 25 ó 30 nucleótidos.

La naturaleza química de la porción específica de la diana del enlazador es, por supuesto, una función de la diana para la cual aquélla es una sonda y con la cual interacciona. Por ejemplo, si la diana es un mRNA particular, la porción específica de la diana del enlazador puede ser, v.g., un oligonucleótido que se fija específicamente a la diana pero no a los RNAs o DNAs interferentes, en condiciones de hibridación seleccionadas. Una persona con experiencia en la técnica puede, utilizando métodos reconocidos en la técnica, determinar experimentalmente las características de un oligonucleótido que se hibridarán óptimamente a la diana, con hibridación mínima a DNA o RNA interferentes inespecíficos (v.g., véase arriba). En general, la longitud de una sonda oligonucleotídica utilizada para distinguir un mRNA diana presente en un sustrato de un gran exceso de RNAs no direccionados puede variar desde aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, con preferencia aproximadamente 18, 20, 22 ó 25 nucleótidos. Una sonda oligonucleotídica para uso en un ensayo bioquímico en el cual no existe un sustrato amplio de dianas competidoras puede ser más corta. Utilizando procedimientos reconocidos en la técnica (v.g., el programa de computadora BLAST), las secuencias de sondas oligonucleotídicas pueden seleccionarse de tal manera que las mismas no están relacionadas mutuamente y son diferentes de las secuencias potencialmente interferentes en bases de datos de genética conocidas. La selección de las condiciones de hibridación que permitirán la hibridación específica de una sonda oligonucleotídica a un RNA puede determinarse rutinariamente, utilizando procedimientos reconocidos en la técnica (v.g., véase arriba). Por ejemplo, el RNA diana [v.g., RNA o mRNA total extraído de tejidos o células cultivadas (y tratado opcionalmente con un agente de interés) en cualquier recipiente, tal como el pocillo de una placa de microtitulación de pocillos múltiples (v.g., 96 ó 384 pocillos o más)] puede añadirse a una región de test que contiene una red de sondas oligonucleotídicas (véase arriba) en un tapón tal como 6X SSPE-T u otros, que contienen opcionalmente un agente para reducir la fijación inespecífica (v.g., aproximadamente 0,5 mg/ml de DNA degradado de esperma de arenque o salmón, o RNA de levadura), e incubarse a una temperatura determinada empíricamente durante un periodo comprendido entre aproximadamente 10 minutos y al menos 18 horas (en una realización preferida, aproximadamente 3 horas). La severidad de la hibridación puede ser la misma que, o menor que, la severidad empleada para asociar las anclas con la porción específica de ancla de los enlazadores. El diseño y uso de otros tipos de sondas son también rutina en la técnica, v.g., como se ha expuesto anteriormente.

Después que se asocian dos sustancias (v.g., por incubación de dos ácidos nucleicos, dos proteínas, una proteína más un ácido nucleico, u otros) para formar un complejo (tal como, v.g., un complejo ancla/enlazador) el complejo resultante puede tratarse opcionalmente (v.g., lavarse) para eliminar las sustancias no fijadas (v.g., enlazadores), utilizando condiciones que se determinan empíricamente para dejar intactas las interacciones específicas, pero que eliminan el material no fijado específicamente. Por ejemplo, las mezclas de reacción pueden lavarse entre aproximadamente 1 y 10 veces o más en las mismas condiciones de severidad o en condiciones algo más severas que las utilizadas para obtener el complejo (v.g., complejo ancla/enlazador).

Las combinaciones de esta invención pueden fabricarse rutinariamente, utilizando tecnología convencional.

Algunas de las superficies que pueden utilizarse en la invención están disponibles fácilmente de suministradores comerciales. En una realización preferida, la superficie es una placa de microtitulación de 96, 384 ó 1536 pocillos tal como placas modificadas vendidas por Corning Costar. Alternativamente, una superficie que comprende pocillos que, a su vez, comprenden indentaciones o "depresiones" puede formarse por micromecanización de una sustancia tal como aluminio o acero para preparar un molde, seguido por microinyección de plástico o un material similar en el molde para formar una estructura tal como la ilustrada en Fig. 4. Alternativamente, una estructura tal como la que se muestra en Fig. 4, constituida por vidrio, plástico, cerámica, o análogos, puede ensamblarse, v.g., a partir de tres piezas tales como las ilustradas en Fig. 5: una primera sección, denominada un separador de pocillos (Fig. 5a), que formará las separaciones entre los pocillos de la muestra; una segunda sección, denominada un subdivisor (Fig. 5b), que formará las separaciones o depresiones, dentro de cada pocillo de test; y una tercera sección, denominada una base (Fig. 5c), que formará la base de la placa y la superficie inferior de los pocillos de test. El separador puede ser, por ejemplo, una pieza de material, v.g., silicona, con orificios espaciados en toda su longitud, de tal manera que cada orificio formará las paredes de un pocillo de ensayo cuando se unen las tres piezas. El subdivisor puede ser, por ejemplo, una pie3za delgada de material, v.g., silicona, conformada en la forma de un filtro o una malla fina. La base puede ser una pieza plana de material, v.g., vidrio, en, por ejemplo, la forma de la porción inferior de una microplaca típica utilizada para un ensayo bioquímico. La superficie superior de la base puede ser plana, como se ilustra en Fig. 5c, o puede estar formada con indentaciones que se alinearán con la forma del subdivisor para proporcionar subdivisiones completas, o pocillos, dentro de cada pocillo de muestra. Las tres piezas pueden unirse por procedimientos estándar, por ejemplo por procedimientos utilizados en el ensamblaje de obleas de silicio.

Las anclas oligonucleotídicas, restos enlazadores, o detectores pueden sintetizarse por tecnología convencional, v.g., con un sintetizador comercial de oligonucleótidos y/o ligando juntos subfragmentos que han sido sintetizados de este modo. En una realización de la invención, las anclas de ácido nucleico preformadas, tales como anclas oligonucleotídicas, pueden situarse encima de o dentro de la superficie de una región de test por cualquiera de una diversidad de técnicas convencionales, con inclusión de fijación fotolitográfica o fijación química por serigrafía, disposición por tecnología de chorro de tinta, un capilar, un filtro o un chip de canal fluido, configuración electroquímica utilizando redes de electrodos, contacto con un husillo o una husillo, o desnaturalización seguida por horneado o irradiación UV sobre filtros (véase, v.g. Rava et al. (1996), Patente U.S. No. 5.545.531; Fodor et al. (1996), Patente U.S. No. 5.510.270; Zanzucchi et al. 1997, Patente U.S. No. 5.643.738; Brennan (1995), Patente U.S. No. 5.474.796; PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070). Las anclas pueden estar situadas encima de la superficie de una región de test o pueden, por ejemplo, en el caso de una pastilla de gel de poliacrilamida, embebidas, incrustadas dentro de la superficie de tal manera que alguna parte del ancla sobresale de la superficie y está disponible para interacciones con el enlazador. En una realización preferida, anclas oligonucleotídicas preformadas están derivatizados en el extremo 5' con un grupo amino libre; disuelto a una concentración que se determina rutinariamente por vía empírica (v.g., aproximadamente 1 \muM) en un tampón tal como tampón de fosfato 50 mM, pH 8,5 y EDTA 1 mM; y distribuirse con un dispensador nanochorro Pixus (Cartesian Technologies) en gotitas de aproximadamente 10,4 nanolitros en localizaciones específicas dentro de un pocillo de test cuya superficie superior es la de una placa DNA Bind seca reciente (Corning Costar). Dependiendo de la tasa relativa de fijación y evaporación de los oligonucleótidos, puede ser necesario controlar la humedad en los pocillos durante la preparación. En otra realización, pueden sintetizarse directamente anclas oligonucleotídicas en la superficie de una región de test, utilizando métodos convencionales tales como, v.g., desprotección activada por la luz de cadenas oligonucleotídicas en crecimiento (v.g., en asociación con el uso de una "máscara" de direccionamiento) o por dispensación configurada de gotitas de nanolitros de compuesto desactivador utilizando un dispensador de nanochorro. La desprotección de todas las secuencias en crecimiento que han de recibir un nucleótido simple puede realizarse, por ejemplo, y el nucleótido puede añadirse después a través de la superficie.

En algunas realizaciones de la invención, las combinaciones descritas se utilizan en una diversidad de procedimientos de cribado y/o para obtener información acerca del nivel, actividad o estructura de las sondas moléculas diana. Tales ensayos se denominan métodos o ensayos Multi Array Plate Screen (MAPS), y las superficies que comprenden redes de anclas o anclas más sondas que se utilizan para los ensayos se designan como ensayos MAPS o placas MAPS.

Cada uno de los ensayos o procedimientos descritos más adelante puede realizarse en una modalidad de alta capacidad, en la cual un gran número de muestras (v.g., tantas como aproximadamente 864, 1036, 1536, 2025 o más, dependiendo del número de regiones en la combinación) se ensayan en cada placa o superficie rápida y simultáneamente. Adicionalmente, muchas placas o superficies pueden procesarse al mismo tiempo. Por ejemplo, en los métodos de descubrimiento de fármacos, un gran número de muestras, cada una de las cuales comprende un fármaco candidato (v.g., un miembro de una genoteca química combinatoria, tales como variantes de moléculas pequeñas, péptidos, oligonucleótidos, u otras sustancias), puede añadirse a regiones separadas de una combinación como se describe o pueden añadirse a muestras biológicas o bioquímicas que se añaden luego a regiones separadas de una combinación, y se incuban con redes de sondas localizadas en las regiones; y los ensayos pueden realizarse sobre cada una de las muestras. Con la aparición reciente y el desarrollo continuado de microplacas de alta densidad, las herramientas de aplicación por puntos de DNA y de métodos tales como la tecnología láser para generar y recoger datos de microplacas todavía más densas, robótica, dispensadores mejorados, sistemas de detección complejos y software de tratamiento de datos, los métodos de esta invención pueden utilizarse para cribar o analizar miles o decenas de miles de compuestos al día o más.

El ensayo puede ser un cribado de ácido nucleico o polinucleótidos de diagnóstico (v.g., un ensayo de fijación u otro tipo de ensayo) de un gran número de muestras respecto a la presencia de variaciones o defectos genéticos (v.g., polimorfismos o mutaciones específicas asociadas con enfermedades tales como la fibrosis quística. Véase, v.g., Iitia et al. (1992), Molecular and Cellular Probes 6, 505-512)); organismos patógenos (tales como bacterias, virus, y protozoos, cuyos hospedadores son animales, con inclusión de humanos, o plantas), o patrones de transcripción de mRNA que son diagnósticos de estados fisiológicos o enfermedades particulares. Las redes de sondas de ácido nucleico que comprenden porciones de ESTs (con inclusión de copias de longitud total) pueden utilizarse para evaluar patrones de transcripción producidos por células de las cuales se derivaron los ESTs (u otras).

Por supuesto, pueden utilizarse ensayos MAPS para determinar la cantidad (medir, cuantificar), la cantidad de diana activa en una muestra, con la condición de que la sonda no esté totalmente ocupada, es decir, no más de aproximadamente 90% de los sitios sonda disponibles estén fijados (o hayan reaccionado o se hayan hibridado) con la diana. En estas condiciones, la diana puede cuantificarse debido a que la disposición de más diana dará como resultado la posesión de más sonda fijada. Por el contrario, en condiciones en las que más de aproximadamente 90% de sitios sonda disponibles están fijados, el hecho de tener más diana presente no aumentaría sustancialmente la cantidad de diana fijada a la sonda. Cualquiera de los tipos de dianas mencionados hasta ahora puede cuantificarse de esta manera. Por ejemplo, el Ejemplo 6 describe la cuantificación de dianas oligonucleotídicas. Adicionalmente, el mismo demuestra que incluso si una diana está presente en gran exceso (v.g., si la misma está presente en cantidades tan grandes que satura la cantidad de sonda disponible en una red de sondas de MAPS), por adición de cantidades conocidas de diana sin marcar a la superficie de fijación, es posible "desplazar la sensibilidad" de la reacción con objeto de tener cantidades aún mayores de diana para cuantificar.

En otra realización, pueden utilizarse los métodos de la invención para cribado en busca de agentes que modulen un patrón de expresión génica. Pueden utilizarse redes de oligonucleótidos, por ejemplo, para identificar especies de mRNA cuyo patrón de expresión a partir de una serie de genes está correlacionado con un estado fisiológico o etapa de desarrollo particular, o con una condición de enfermedad (genes "correlativos", RNAs, o patrones de expresión). Por los términos "correlacionar" o "correlativo", se entiende que el patrón de síntesis de RNA está asociado con la condición fisiológica de una célula, pero no necesariamente que la expresión de un RNA dado sea responsable de o causante de un estado fisiológico particular. Por ejemplo, puede identificarse una pequeña subserie de mRNAs que se expresan, se regulan en sentido creciente y/o se regulan en sentido decreciente en células que sirven como modelo para un estado de enfermedad particular; este patrón de expresión alterado comparado con el de una célula normal, que no exhibe un fenotipo patológico, puede servir como indicador del estado de enfermedad (genes, RNAs, o patrones de expresión "indicadores"). Los términos "correlativo" e "indicador" pueden utilizarse intercambiablemente. Por ejemplo, células tratadas con un promotor tumoral tal como el miristato de forbol podrían exhibir un patrón de expresión génica que mimetiza el observado en las etapas precoces del crecimiento del tumor. En otro modelo de cáncer, células de insulinoma de ratón (v.g., la línea de células TGP61), cuando se infectan con adenovirus, exhiben un aumento en la expresión de, v.g., c-Jun y MIP-2, mientras que la expresión de genes internos tales como GAPDH y L32 se mantiene sustancialmente inafectada.

Los agentes que, después del contacto de la célula con un modelo de enfermedad, sea directa o indirectamente, y sea in vivo o in vitro (v.g., en cultivo de tejidos), modulan el patrón de expresión del indicador, podrían actuar como agentes terapéuticos o fármacos para organismos (v.g., humanos u otros pacientes animales, o plantas) que padecen la enfermedad. Los agentes pueden modular también patrones de expresión poniendo en contacto el ácido nucleico directamente, v.g., en un sistema de expresión in vitro (tubo de ensayo). Como se utiliza en esta memoria, "modular" significa causar un aumento o una disminución de la cantidad y/o actividad de una molécula o análogo que está implicada en una reacción medible. Las combinaciones de la invención pueden utilizase para cribar en busca de tales agentes. Por ejemplo, una serie de células (v.g. de un modelo de enfermedad) pueden ponerse en contacto con una serie de agentes (v.g., durante un periodo de tiempo que va desde aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 48 horas o más) y, utilizando métodos rutinarios reconocidos en la técnica (v.g., kits disponibles comercialmente), pueden producirse extractos de RNA total o mRNA. Si se desea amplificar la cantidad de RNA, pueden utilizarse procedimientos estándar tales como la amplificación RT-PCR (véase, v.g., Innis et al., compiladores (1996) PCR Protocols: A Guide to Methods in Amplification, Academic Press, Nueva York). Los extractos (o productos amplificados de los mismos) pueden dejarse en contacto (v.g., incubarse con) una pluralidad de redes sustancialmente idénticas que comprenden sondas para RNAs indicadores apropiados, y aquellos agentes que se asocian con un cambio en el patrón de expresión del indicador pueden identificarse. El Ejemplo 15 describe un ensayo de alta capacidad para cribado en busca de compuestos que pueden alterar la expresión de genes que son correlativos con un estado de enfermedad.

Análogamente, pueden identificarse agentes que modulan los patrones de expresión asociados con estados fisiológicos o etapas de desarrollo particulares. Tales agentes pueden ser sustancias producidas por el hombre o existentes naturalmente, con inclusión de factores ambientales tales como sustancias implicadas en el desarrollo embrionario o en la regulación de reacciones fisiológicas, o sustancias importantes en la industria agropecuaria tales como plaguicidas o herbicidas. Asimismo, dichos agentes pueden emplearse en su estado inalterado o como agregados con otras especies; y los mismos pueden estar unidos, covalente o no covalentemente, a un miembro de fijación, sea directamente o a través de una sustancia de fijación específica.

En un kit útil para la detección de al menos una diana en una muestra, que comprende:

a): una superficie que comprende regiones múltiples espacialmente discretas, al menos dos de las cuales son sustancialmente idénticas, comprendiendo cada región al menos 8 anclas diferentes (oligonucleótido, o uno de los otros tipos descritos en esta memoria),

b): un envase que comprende al menos una molécula enlazadora bifuncional, que tiene una primera porción específica para al menos uno de dichos anclas y una segunda porción que comprende una sonda que es específica para al menos una de dichas dianas;

y una serie de instrucciones para fijación a al menos uno de dichos anclas una molécula enlazadora bifuncional, que tiene una primera porción específica para al menos uno de dichos anclas y una segunda porción que comprende una sonda que es específica para al menos una diana. Las instrucciones pueden incluir, por ejemplo (pero sin carácter limitante), una descripción de cada uno de las anclas en la superficie, una indicación de cuántos anclas existen y dónde están localizados los mismos en la superficie, y un protocolo para fijar específicamente (asociar, unir, etc.) los enlazadores a las anclas. Por ejemplo, las instrucciones pueden incluir la secuencia de cada ancla, a partir de la cual un técnico puede diseñar restos de enlazadores complementarios específicos de las anclas para interaccionar específicamente con (v.g., hibridarse a) las anclas. Las instrucciones pueden incluir también un protocolo para asociar las anclas y enlazadores, v.g., condiciones y reactivos para hibridación (u otro tipo de asociación) tales como temperatura y tiempo de incubación, condiciones y reactivos para eliminar moléculas no asociadas (v.g., lavados), y análogos. Adicionalmente, las instrucciones pueden incluir información acerca de la construcción y el uso de cualquiera de los tipos de enlazadores de control considerados en esta memoria, y de métodos, v.g., para cuantificar, normalizar, "ajustar finamente" o calibrar los ensayos a realizar con las combinaciones. Las instrucciones pueden abarcar cualquiera de los parámetros, condiciones o realizaciones descritos en esta solicitud, todos los cuales pueden realizarse rutinariamente, con procedimientos convencionales, por una persona con experiencia en la técnica.

Como se expone en otro lugar de esta solicitud, un técnico puede unir a una superficie de la invención que comprende una red (o redes) dada(s) de anclas, una gran diversidad de tipos de enlazadores, programando con ello cualquiera de una gran diversidad de redes de sondas. Además, un técnico puede eliminar una serie de enlazadores dada de una superficie de la invención y añadir a la misma otra serie de enlazadores (sean iguales o diferentes de la primera serie), permitiendo que una superficie dada se reutilice muchas veces. Esta flexibilidad y reutilizabilidad constituyen ventajas adicionales de la invención.

En otra realización, pueden utilizarse combinaciones de la invención para mapear ESTs (Etiquetas de Secuencia Expresadas). Es decir, pueden utilizarse ensayos MAPS para determinar cuáles, si acaso, de un grupo de ESTs se generaron a partir de porciones diferentes (o parcialmente solapantes) del mismo o los mismos genes, y cuáles, si acaso, son únicos. Las Figuras 18, 19, 20 y 21 ilustran un ensayo de este tipo; en este ejemplo, un ensayo para determinar cuáles, si acaso, de 16 ESTs están "enlazados" a un gen común. Un primer paso del ensayo (véase la Figura 18) consiste en ensamblar redes en las cuales cada uno de los ESTs a mapear está representado por al menos una sonda oligonucleotídica que corresponde al mismo. Cierto número de redes iguales a (o mayores que) el número de ESTs a mapear se distribuyen en regiones separadas (v.g., pocillos) de una superficie; en el ejemplo ilustrado, la superficie de la combinación comprende 16 pocillos, cada uno de los cuales contiene una red de 16 oligonucleótidos diferentes específicos de EST, numerados de 1 a 16. Un oligonucleótido que "se corresponde con" un EST (es "EST-específico") es uno que es suficientemente complementario para un EST tal que, en condiciones de hibridación severas seleccionadas, el oligonucleótido se hibridará específicamente a dicho EST, pero no a otro u otros ESTs no afines. Un oligonucleótido correspondiente a EST de este tipo puede fijarse específicamente (en condiciones óptimas) a la cadena codificante o no codificante de un cDNA sintetizado a partir del gen del cual se generó originariamente el EST o a un mRNA sintetizado a partir del gen del cual se generó originariamente el EST. Factores a considerar en el diseño de oligonucleótidos, y parámetros de hibridación a optimizar con objeto de conseguir hibridación específica, se exponen en otro lugar de esta solicitud. Con objeto de ensamblar las redes, se preparan moléculas enlazadoras, cada una de las cuales comprende un resto específico para una de las anclas de una red genérica más un resto que comprende una sonda oligonucleotídica que corresponde a uno de los ESTs a mapear; y los enlazadores se fijan a las anclas como se describe en otro lugar de esta solicitud de patente. En un paso subsiguiente, una parte alícuota de una muestra que comprende una mezcla de ácidos nucleicos (v.g., mRNA o cDNA monocatenario o desnaturalizado), que puede contener secuencias que son complementarias para una o más de las sondas oligonucleotídicas, se añade a cada una de las regiones (pocillos) que comprende una red de sondas; la mezcla se incuba luego en condiciones óptimas determinadas rutinariamente, permitiendo con ello que el ácido nucleico se fije a sondas complementarias. Si varias de las sondas específicas de EST son complementarias para porciones diferentes de un solo ácido nucleico, dicho ácido nucleico se fijará a cada uno de los loci en la red en la cual está localizada una de dichas sondas.

En un paso subsiguiente, un oligonucleótido detector diferente (en el ejemplo ilustrado, los detectores #1 a 16) se añade a cada región (pocillo) (véase Fig. 19)). Un oligonucleótido detector se diseña para cada uno de los ESTs a mapear. Cada detector específico de EST corresponde a una porción diferente (al menos parcialmente no solapante) del EST que lo hace el oligonucleótido sonda, de tal modo que la sonda y los oligonucleótidos detectores no interfieren unos con otros. Considérense, por ejemplo, los ESTs representados en la Figura 21, que corresponden a los ESTs 1, 2 y 6 de las Figuras 18-20. La Figura 21 indica que los ESTs #1 y #2 se obtuvieron ambos del gen X (están "enlazados"), mientras que EST #6 se obtuvo a partir de un gen diferente, no afín. Si se incuban partes alícuotas de una muestra que contiene una mezcla de mRNAs, con inclusión de uno generado a partir de gen X con las redes de sondas que se muestran en las Figuras 18-20, el mRNA del gen X se hibridará, en condiciones óptimas, en los loci con las sondas 1 y 2, pero no en los correspondientes a la sonda 6. (Por supuesto, cada mRNA debe añadirse en exceso molar con respecto a la suma de las sondas a las cuales puede hibridarse). Si se añade el oligonucleótido detector 1 a la región (pocillo) 1, el mismo se hibridará al mRNA del gen X que está unido en los loci 1 y 2 de la red de sondas, pero no en el locus 6. Análogamente, si el oligonucleótido detector 2 se añade a otro pocillo - por ejemplo, el pocillo #2, el mismo se fijará también en los loci 1 y 2, pero no en 6. De este modo, es posible determinar en una modalidad de alta capacidad cuáles de los ESTs están enlazados, es decir, codifican porciones del mismo gen, y cuáles son ESTs únicos. Para el ejemplo hipotético que se muestra en Fig. 20, los tres primeros ESTs codifican porciones del mismo gen, los últimos cinco ESTs codifican porciones de otro gen, y los ESTs restantes no parecen estar enlazados. Las condiciones de hibridación, los pasos de lavado opcionales, métodos de detección, y análogos se exponen en otro lugar de esta solicitud de patente con relación a otros ensayos MAPS. Con objeto de confirmar los datos de enlace obtenidos por el ensayo MAPS, podrían efectuarse reacciones PCR utilizando pares de sondas oligonucleotídicas específicas de EST como iniciadores de sentido y antisentido. Cada par de ESTs enlazados debería proporcionar un producto PCR. Obsérvese que este test PCR apareado podría realizarse para determinar directamente los enlaces sin utilizar el ensayo MAPS Linkage; sin embargo, podrían requerirse muchas reacciones, y cada iniciador EST tendría que sintetizarse como cadenas tanto de sentido como antisentido. Para el ejemplo ilustrado, se requerirían 180 reacciones
de este tipo.

Se contempla un método de determinación de cuál o cuáles de una pluralidad de ESTs son complementarios para un ácido nucleico dado, que comprende,

a): incubar una red inmovilizada de sondas oligonucleotídicas, al menos una de las cuales corresponde a cada uno de dichos ESTs, con una muestra de test que puede contener dicho ácido nucleico dado, a fin de obtener un producto de hibridación entre dichas sondas oligonucleotídicas y dicho ácido nucleico,

b): incubar dicho producto de hibridación con un oligonucleótido detector, que corresponde a un EST al cual corresponde una de dichas sondas oligonucleotídicas, pero que es específico para una porción diferente del EST que es dicha sonda oligonucleotídica, y

c): detectar qué sondas oligonucleotídicas de dicha red están marcadas por dicho oligonucleótido detector,

en donde dicha red de sondas oligonucleotídicas está inmovilizada en una región de una combinación, en donde dicha combinación comprende

1): una superficie que comprende cierto número de regiones espacialmente discretas y sustancialmente idénticas igual al número de ESTs a estudiar, comprendiendo cada región

2): cierto número de anclas diferentes igual al número de ESTs a estudiar, estando cada ancla en asociación con

3): un enlazador bifuncional que tiene una primera porción que es específica para el ancla, y una segunda porción que comprende una sonda oligonucleotídica que corresponde a al menos uno de dichos ESTs.

Uno o más de dichos ESTs puede(n) ser complementario(s) a dicho ácido nucleico, y en donde cada uno de dichos ESTs comprende dos secuencias oligonucleotídicas diferentes, la primera de las cuales define una sonda oligonucleotídica correspondiente a dicho EST, definiendo la segunda de las cuales un oligonucleótido detector correspondiente a dicho EST, que comprende,

a): poner en contacto una muestra que comprende moléculas de dicho ácido nucleico con al menos una región de una combinación, en donde dicha región comprende una red de sondas oligonucleotídicas, al menos una de las cuales corresponde a cada uno de dichos ESTs,

b): incubar dicha muestra con dicha región, permitiendo con ello que moléculas de dicho ácido nucleico se fijen a dichas sondas oligonucleotídicas correspondientes a EST que son complementarias para porciones de dicho ácido nucleico,

c): incubar dicha región que comprende moléculas de dicho ácido nucleico unidas a una o más de dichas sondas oligonucleotídicas correspondientes a EST con un oligonucleótido detector que corresponde a un EST al cual corresponde una sonda dada de las sondas oligonucleotídicas de dicha red, uniendo de este modo los oligonucleótidos detectores con moléculas de ácido nucleico que se han unido a dicha sonda oligonucleotídica dada o a otras sondas oligonucleotídicas que son complementarias de dicho ácido nucleico,

d): detectar la presencia de dichos oligonucleótidos detectores, identificando con ello qué sondas oligonucleotídicas correspondientes a EST de dicha red son complementarias a porciones de un ácido nucleico que se une a dicha sonda correspondiente a EST oligonucleotídico dada, identificando con ello qué ESTs son complementarios a dicho ácido nucleico dado, en donde dicha red de sondas oligonucleotídicas está inmovilizado en una región de una combinación, en donde dicha combinación comprende

2): un número de anclas diferentes igual al número de ESTs a estudiar, estando cada ancla en asociación con

Los componentes de un ensayo de mapeado de EST pueden ensamblarse en cualquier orden. Por ejemplo, las anclas, enlazadores y ESTs pueden ensamblarse secuencialmente; o los enlazadores y ESTs, en presencia o ausencia de informadores, pueden ensamblarse en solución y añadirse luego a las anclas.

Adicionalmente, se contempla un método de determinación de cuáles de una pluralidad de ESTs son complementarios para un ácido nucleico dado, que comprende,

a): incubar una colección de moléculas enlazadoras oligonucleotídicas bifuncionales, cada una de las cuales comprende una primera porción que es una sonda que corresponde a al menos uno de dichos ESTs, y una segunda porción que es específica para un oligonucleótido de ancla, con una muestra de ensayo que puede contener dicho ácido nucleico, a fin de obtener un primer producto de hibridación entre dichas sondas oligonucleotídicas y dicho ácido nucleico,

b): incubar dicho primer producto de hibridación con una red inmovilizada de oligonucleótidos de ancla, en donde cada oligonucleótido de ancla corresponde a la porción específica de ancla de al menos una de dichas moléculas enlazadoras, para formar un segundo producto de hibridación que comprende dichos anclas, dichas sondas oligonucleotídicas y dicho ácido nucleico, y

c): incubar dicho primer o dicho segundo producto de hibridación con un oligonucleótido detector, que corresponde a un EST al cual corresponde una de dichas sondas oligonucleotídicas, pero que es específico para una porción diferente del EST que lo es dicha sonda oligonucleotídica, y

d): detectar qué sondas oligonucleotídicas están marcadas por dicho oligonucleótido detector,

en donde dicha red de oligonucleótidos de ancla está inmovilizada en una región de una combinación, en donde dicha combinación comprende

1): una superficie que comprende cierto número de regiones espacialmente discretas, y sustancialmente idénticas, iguales al número de ESTs a estudiar, comprendiendo cada región

2): cierto número de anclas diferentes iguales al número de ESTs a estudiar.

Por supuesto, los métodos anteriores para mapeado de ESTs pueden utilizarse para mapear secuencias de test (v.g., polinucleótidos) en cualquier ácido nucleico de interés. Por ejemplo, es posible determinar si dos o más fragmentos de cDNA clonados o cDNAs mapean al mismo DNA genómico. Un procedimiento de este tipo podría servir de ayuda, por ejemplo, en la elucidación estructural de genes largos complejos. De manera similar, es posible determinar si una o más secuencias sometidas a corte y empalme o secuencias codificantes mapean al mismo DNA genómico. Una determinación de este tipo podría utilizarse, por ejemplo, en un test de diagnóstico para distinguir entre una condición normal y una condición de enfermedad que se caracterizan por patrones de corte y empalme diferenciales. Muchas otras aplicaciones del método de mapeado serán evidentes para una persona con experiencia en la técnica.

Adicionalmente, se contempla un método de determinación de cuáles de una pluralidad de polinucleótidos son complementarios para un ácido nucleico dado

en donde uno o más de dichos polinucleótidos pueden ser complementarios para dicho ácido nucleico, y en donde cada uno de dichos polinucleótidos comprende dos secuencias oligonucleotídicas diferentes, la primera de las cuales define una sonda oligonucleotídica que corresponde a dicho polinucleótido, y la segunda de las cuales define un oligonucleótido detector correspondiente a dicho polinucleótido, que comprende,

a): poner en contacto una muestra que comprende moléculas de dicho ácido nucleico con al menos una región de una combinación, en donde dicha región comprende una red de sondas oligonucleotídicas, al menos una de las cuales corresponde a cada uno de dichos polinucleótidos,

b): incubar dicha muestra con dicha región, permitiendo con ello que moléculas de dicho ácido nucleico se fijen a dichas sondas oligonucleotídicas correspondientes a dichos polinucleótidos que son complementarias para porciones de dicho ácido nucleico,

c): incubar dicha región que comprende moléculas de dicho ácido nucleico unidas a una o más de dichas sondas oligonucleotídicas correspondientes dichos polinucleótidos con un oligonucleótido detector que corresponde a un polinucleótido al cual corresponde una sonda dada de las sondas oligonucleotídicas de dicha red, uniendo de este modo los oligonucleótidos detectores con moléculas de ácido nucleico que se han unido a dicha sonda oligonucleotídica dada o a otras sondas oligonucleotídicas que son complementarias de dicho ácido nucleico,

d): detectar la presencia de dichos oligonucleótidos detectores, identificando con ello qué sondas oligonucleotídicas correspondientes a polinucleótidos de dicha red son complementarias a porciones de un ácido nucleico que se une a dicha sonda oligonucleotídica dada correspondiente a polinucleótido, identificando con ello qué polinucleótidos son complementarios a dicho ácido nucleico dado,

1): una superficie que comprende cierto número de regiones espacialmente discretas y sustancialmente idénticas igual al número de polinucleótidos a estudiar, comprendiendo cada región

2): un número de anclas diferentes igual al número de polinucleótidos a estudiar, estando cada ancla en asociación con

3): un enlazador bifuncional que tiene una primera porción que es específica para el ancla, y una segunda porción que comprende una sonda oligonucleotídica que corresponde a al menos uno de dichos polinucleótidos.

Los métodos anteriores para mapear ESTs u otros polinucleótidos pueden comprender adicionalmente eliminar porciones no fijadas de la muestra entre uno o más de los pasos.

Una o más dianas de RNA de interés (v.g., mRNA, u otros tipos de RNA) pueden convertirse en cDNAs por una transcriptasa inversa, y estos cDNAs se hibridan luego a una red de sondas. Este tipo de ensayo se ilustra esquemáticamente en la Figura 8. Se preparan extractos de RNA (o mRNA purificado) a partir de células o tejidos como se describe en esta memoria. Se añaden luego a la muestra de RNA transcriptasa inversa e iniciadores oligonucleotídicos que son específicos para los RNAs de interés, y, utilizando condiciones y procedimientos reconocidos en la técnica, que pueden determinarse y optimizarse rutinariamente, se generan las primeras cadenas de cDNAs. El término iniciador "específico" hace referencia a uno que es suficientemente complementario para un mRNA de interés a fin de fijarse al mismo en condiciones de hibridación severa seleccionadas y ser reconocido por transcriptasa inversa, pero que no se fija a un ácido nucleico no deseado (véase anteriormente para una exposición de las condiciones de reacción apropiadas a fin de conseguir la hibridación específica). Los RNA-mRNAs residuales que no fuesen reconocidos por los iniciadores específicos, y/u otros tipos de RNAs contaminantes en un extracto de RNA, tales como tRNA o rRNA - pueden eliminarse por cualquiera de una diversidad de ribonucleasas o por procedimientos químicos, tales como tratamiento con álcali, dejando atrás el cDNA monocatenario, que se pone subsiguientemente en contacto con una red de sondas MAPS. El uso de transcriptasa inversa en este método minimiza la necesidad de manipulación extensiva del RNA, que puede ser sensible a degradación por las nucleasas y por tanto difícil de trabajar con él. Adicionalmente, la especificidad adicional generada por los iniciadores específicos de transcriptasa inversa imparte un estrato añadido de especificidad al ensayo.

Opcionalmente, los cDNAs arriba descritos pueden amplificarse antes de la hibridación a la red de sondas para aumentar la fuerza de la señal. Los iniciadores oligonucleotídicos de transcriptasa inversa arriba descritos pueden comprender, en sus extremos 5', secuencias (que pueden tener una longitud de aproximadamente 22-27 nucleótidos) que especifican los sitios de iniciación para una RNA-polimerasa (v.g., polimerasa T7, T3 o SP2, o análogas). En el ejemplo que se muestra en la Figura 8, se ha añadido una secuencia promotora T7 al iniciador de transcriptasa inversa. El sitio de reconocimiento de la polimerasa llega a incorporarse en el cDNA y puede servir luego como sitio de reconocimiento para tandas múltiples de transcripción por la RNA-polimerasa apropiada (transcripción in vitro, o IVT). Opcionalmente, los mRNAs así generados pueden amplificarse ulteriormente, utilizando PCR e iniciadores apropiados, o puede amplificarse de este modo el cDNA propiamente dicho. Procedimientos para transcripción y PCR son rutinarios y bien conocidos en la técnica.

El método arriba descrito, en el cual las dianas de mRNA se convierten en cDNA con transcriptasa inversa antes del ensayo en placas MAPS, puede utilizarse en lugar del procedimiento de ensayo estándar MAPS para cualquiera de los ensayos basados en RNA arriba descritos.

De acuerdo con la invención, una o más dianas de ácido nucleico de interés se hibridan a fragmentos de protección de polinucleótidos específicos y se someten a un procedimiento de protección contra las nucleasas, y dichos fragmentos de protección que se han hibridado a la o las dianas de interés se ensayan en placas MAPS. Si la diana de interés es un RNA y el fragmento de protección es DNA, un Nuclease Protection/MAPS Assay (NPA-MAPS) puede reducir la necesidad de manipulación extensiva de RNA, que puede ser sensible a la degradación por nucleasas contaminantes y por tanto difícil de trabajar con él. En dicho ensayo NPA-MAPS, las sondas en la red de sondas son oligonucleótidos de la misma clase de cadena que las dianas de ácido nucleico de interés, en lugar de ser complementarias a ellas, como en un ensayo MAPS estándar. Un ejemplo de ensayo NPA-MAPS se representa esquemáticamente en la Figura 9.

En un ensayo NPA-MAPS, la diana de interés puede ser cualquier ácido nucleico, v.g., DNA genómico, cDNA, DNA viral o RNA, rRNA, tRNA, mRNA, oligonucleótidos, fragmentos de ácido nucleico, ácidos nucleicos modificados, ácidos nucleicos sintéticos, o análogos. En una realización preferida de la invención, el procedimiento se utiliza para ensayar una o más dianas de mRNA que están presentes en un tejido o extracto de RNA celular. Una muestra que contiene la o las dianas de interés se hibrida primeramente en condiciones severas seleccionadas (véase arriba para una exposición de condiciones de reacción apropiadas para conseguir la hibridación específica) a uno o más fragmentos de protección específicos. Un fragmento de protección es un polinucleótido, que puede ser, v.g., RNA, DNA (con inclusión de un producto PCR), PNA o ácido nucleico modificado o sustituido, que es específico para una porción de una diana de ácido nucleico de interés. Por fragmento de protección "específico" se entiende un polinucleótido que es suficientemente complementario a su pareja de fijación propuesta para fijarse a la misma en condiciones de hibridación seleccionadas, pero que no se fijará a otros ácidos nucleicos no deseados. Un fragmento de protección puede tener una longitud de al menos 10 nucleótidos, preferiblemente 50 a aproximadamente 100, o aproximadamente tan largo como un cDNA de longitud total. En una realización preferida, los fragmentos de protección son oligonucleótidos de DNA monocatenario. Fragmentos de protección específicos para tantas como 100 dianas o más pueden incluirse en una sola reacción de hibridación. Después de la hibridación, la muestra se trata con un cóctel de una o más nucleasas a fin de destruir sustancialmente todo el ácido nucleico excepto el o los fragmentos de protección que se han hibridado al o a los ácidos nucleicos de interés y (opcionalmente) la o las porciones de diana de ácido nucleico que se han hibridado y han sido protegidas contra la digestión por las nucleasas durante el procedimiento de protección contra las nucleasas (se encuentran en un híbrido convertido en dúplex). Por ejemplo, si la muestra comprende un extracto celular, los ácidos nucleicos no deseados, tales como DNA genómico, tRNA, rRNA y mRNA's distintos de los de interés, pueden ser destruidos sustancialmente en este paso. Puede utilizarse cualquiera de una diversidad de nucleasas, con inclusión, v.g., de RNAsa pancreática, nucleasa de haba mung, nucleasa S1, RNAsa A, Ribonucleasa T1, Exonucleasa III, o análogas, dependiendo de la naturaleza de los complejos hibridados y de los ácidos nucleicos indeseables presentes en la muestra. La RNAsa H puede ser particularmente útil para digerir el RNA residual unido a un fragmento de protección de DNA. Las condiciones de reacción para estas enzimas son bien conocidas en la técnica y pueden utilizarse empíricamente. Asimismo, pueden utilizarse procedimientos químicos, v.g., hidrólisis de RNA con álcali. En caso requerido, las muestras pueden tratarse ulteriormente por procedimientos bien conocidos en la técnica para eliminar el material no hibridado y/o desactivar o eliminar enzimas residuales (v.g., extracción con fenol, precipitación, filtración en columna, etc.). El proceso de hibridación, seguido por digestión con nucleasas y (opcionalmente) degradación Exonucleasa química, se denomina procedimiento de protección contra las nucleasas; una variedad de procedimientos de protección contra las nucleasas han sido descritos (véase, v.g., Lee et al. (1987), Meth. Enzymol. 152, 633-648. Zinn et al. (1983), Cell 34, 865-879). Las muestras tratadas por protección contra las nucleasas, seguido por un procedimiento (opcional) para desactivar las nucleasas, se ponen en contacto con una red de sondas MAPS y se llevan a cabo los pasos usuales de un ensayo MAPS. Los fragmentos de protección unidos pueden detectarse por hibridación a informadores específicos de dianas marcados, como se describe en esta memoria para los ensayos MAPS estándar, o los fragmentos de protección propiamente dichos pueden marcarse, covalente o no covalentemente, con una molécula detectable.

En una realización preferida, el fragmento de protección se marca directamente, v.g., en lugar de marcarse por hibridación a un informador específico de la diana. Por ejemplo, el informador se fija al fragmento de protección a través de una interacción ligando-antiligando, v.g., se añade un complejo estreptavidina-enzima a un oligonucleótido de protección biotinilado. En otro ejemplo, el fragmento de protección se modifica químicamente (v.g., por acoplamiento directo de peroxidasa de rábano picante (HRP) o de un tinte fluorescente) y esta modificación química se detecta, sea con la porción de ácido nucleico del fragmento de protección o sin ella (v.g., después de escisión de la modificación mediante, por ejemplo, un tratamiento enzimático o químico). En cualquiera de los métodos arriba indicados, un fragmento de protección puede marcarse antes o después que el mismo se haya hibridado a una molécula enlazadora correspondiente.

Con objeto de controlar que el procedimiento de protección contra las nucleasas ha funcionado adecuadamente, es decir, que los ácidos nucleicos no hibridados han sido digeridos de acuerdo con lo deseado, pueden diseñarse uno o más fragmentos de protección que contienen segmentos colgantes (no hibridables) que deberían ser escindidos por las nucleasas si el procedimiento se verifica adecuadamente. La presencia o ausencia de los fragmentos colgantes puede determinarse por hibridación con una sonda de detección marcada complementaria, o la porción colgante del fragmento de protección propiamente dicha puede marcarse, covalente o no covalentemente, con una molécula detectable. Este control puede realizarse antes que la muestra se ponga en contacto con la red de sondas, o como parte del ensayo MAPS propiamente dicho. Un ejemplo de un ensayo de control de este tipo se describe en el Ejemplo 15. Por supuesto, dado que los marcadores diferentes pueden distinguirse fácilmente (v.g., fluoróforos con espectros de absorción diferentes), pueden incluirse en un ensayo simple varios oligonucleótidos marcados diferentemente. Adicionalmente, el ensayo de protección estándar contra las nucleasas tal como se analiza por electroforesis en gel puede utilizarse durante el desarrollo del ensayo para comprobar que los fragmentos de protección se procesan como era de
esperar.

Pueden utilizarse ensayos NPA-MAPS para cuantificar la cantidad de una diana en una muestra. Si el fragmento de protección se añade en un exceso molar suficientemente grande con respecto a la diana para conducir la reacción de hibridación hasta su finalización, la cantidad de fragmento de protección restante después del paso de protección contra las nucleasas reflejará cuanta diana estaba presente en la muestra. Un ejemplo de una realización de cuantificación de este tipo se describe en los Ejemplos 12 y 13.

Pueden utilizarse ensayos NPA-MAPS para implementar cualquiera de los métodos arriba descritos que utilizan ensayos MAPS estándar.

En una realización preferida, los fragmentos de protección polinucleotídicos se miden por el espectrómetro de masas en lugar de hacerlo en placas MAPS. En una realización muy preferida, ninguno de los polinucleótidos están unidos (fijados) a una superficie sólida durante los pasos de hibridación o digestión con nucleasa. Después de la hibridación, la diana hibridada puede degradarse, v.g., por nucleasas o por tratamientos químicos, dejando el fragmento de protección en proporción directa a la cantidad de fragmento que se había hibridado a la diana. Alternativamente, la muestra puede tratarse a fin de dejar la porción hibridada (monocatenaria) de la diana, o el dúplex formado por la diana hibridada y el fragmento de protección, para ser analizado(a) ulteriormente. Las muestras a analizar se separan del resto de la mezcla de hibridación y nucleasa (por ejemplo por precipitación con etanol o por adsorción o cromatografía de afinidad, etc.), se eluyen o se solubilizan, y se inyectan en el espectrómetro de masas por inyección de bucle para capacidad alta. En una realización preferida, las muestras a analizar (v.g., fragmentos de protección) se adsorben a una superficie y se analizan por desorción con láser, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Para la sensibilidad máxima puede utilizarse la Espectrometría de Masas según la Transformada de Fourier (FTMS) (u otra técnica avanzada similar), de tal modo que pueden detectarse femtomoles o menos de cada fragmento de protección.

Los fragmentos de protección que deben detectarse en una (o más) muestras pueden diseñarse de modo que den una señal única para el espectrómetro de masas utilizado. En una realización, los fragmentos de protección tienen cada uno un peso molecular único después de la hibridación y el tratamiento con nucleasa, y sus pesos moleculares y el patrón característico de ionización y fragmentación serán suficientes para medir su concentración. Para adquirir una mayor sensibilidad o como ayuda en el análisis de mezclas complejas, los fragmentos de protección pueden modificarse (v.g., derivatizarse) con restos químicos diseñados para proporcionar señales claras únicas. Por ejemplo, cada fragmento de protección puede derivatizarse con un aminoácido natural o no natural diferente fijado por un enlace amídico a la cadena del oligonucleótido en una o más posiciones a lo largo de la porción de hibridación de la cadena. Con un espectrómetro de masas de energía apropiada, se produce fragmentación en los enlaces amídicos, liberando una proporción característica de los aminoácidos. Esta clase de método en la cual se utilizan como etiquetas para la espectrometría de masas restos químicos de tamaño moderado (aproximadamente peso molecular 80 a 200) es deseable, debido a que las moléculas de este tamaño son generalmente más fáciles de detectar. En otro ejemplo, la modificación química es una molécula orgánica con una señal definida por el espectrómetro de masas, tal como un grupo tetraalquilamonio que puede, por ejemplo, derivatizar otra molécula tal como v.g., un aminoácido. En otro ejemplo, las señales de iones positivos o negativos se mejoran por reacción con cualquiera de cierto número de agentes. Por ejemplo, para mejorar la detección de los iones positivos, es posible hacer reaccionar una sal de pirilio (tal como, v.g., 2,4-ditenilo, tetrafluoroborato de 6-etil-pirilio, o muchos otros) con una amina a fin de formar una sal de piridinio; cualquiera de cierto número de otros agentes mejoradores pueden utilizarse para formar otros grupos funcionales cargados positivamente (véase, v.g., Quirke et al. (1994). Analytical Chemistry 66, 1302-1315). Análogamente, es posible hacer reaccionar cualquiera de cierto número de agentes reconocidos en la técnica para formar especies mejoradoras iónicas negativas. La modificación química puede detectarse, por supuesto, o bien después de haber sido escindida del ácido nucleico, o mientras se encuentra en asociación con el ácido nucleico. Al permitir que cada fragmento de protección se identifique de una manera distinguible, es posible ensayar (v.g., cribar) respecto a un gran número de dianas diferentes (v.g., durante 2, 6, 10, 16 o más dianas diferentes) en un solo ensayo. Muchos ensayos de este tipo pueden realizarse rápida y fácilmente. Un ensayo o serie de ensayos de este tipo puede conducirse, por tanto, con alta capacidad como se define en esta memoria.

Con indiferencia de si los oligonucleótidos se detectan directamente por su masa o si se utilizan etiquetas moleculares únicas, las señales para cada molécula a detectar pueden caracterizarse plenamente en preparaciones puras de concentración conocida. Esto permitirá que la señal sea cuantificada (medida, evaluada) exactamente. Para cualquier molécula a detectar por espectrometría de masas, la intensidad y el perfil no pueden predecirse con exactitud. La tendencia de la molécula a ionizarse, la sensibilidad de todos los enlaces químicos dentro de la molécula a la fragmentación, el grado en que cada fragmento se carga múltiplemente o se carga simplemente, son todos ellos demasiado complejos para poder predecirse. Sin embargo, para un instrumento dado con características fijas de energía y manipulación de la muestra, la intensidad y el perfil de la señal es muy reproducible. Por tanto, para cada sonda la señal puede carac terizarse con estándares puros, y las señales experimentales pueden interpretarse cuantitativamente con exactitud.

En un aspecto, la invención se refiere a un método para detectar uno o más ácidos nucleicos de interés, que comprende someter una muestra que comprende el o los ácidos nucleicos de interés a protección contra las nucleasas con uno o más fragmentos de protección, y detectar las moléculas dúplex hibridadas, o el ácido nucleico protegido, o el fragmento de protección, con espectrometría de masas.

Métodos de análisis de ácidos nucleicos por espectrometría de masas son bien conocidos en la técnica. Véase, v.g., Alper et al. (1998), Science 279, 2044-2045 y Koster, Patente U.S. No. 5.605.798.

Además de la diversidad de ensayos de alta capacidad arriba descritos, muchos otros serán evidentes para una persona con experiencia en la técnica.

Una ventaja de la utilización de ensayos multisonda es la capacidad para incluir cierto número de sondas de "control" en cada red de sondas que se someten a la mismas condiciones de reacción que las sondas experimentales reales. Por ejemplo, cada región en la red puede comprender controles positivos y/o negativos. El término, una "sonda de control positiva", se utiliza en esta memoria para significar una sonda de control que es conocida (v.g., que interacciona sustancialmente con la diana, o para interaccionar con la misma de una manera conocida cuantitativa o cualitativamente, actuando por ello como un estándar (interno) para la interacción sonda/diana. Una sonda de este tipo puede controlar la eficiencia de hibridación, por ejemplo. El término, una "sonda de control negativa" se utiliza en esta memoria para significar una sonda de control que se sabe no interacciona sustancialmente con la diana. Una sonda de este tipo puede controlar la especificidad de hibridación, por ejemplo. Como ejemplos de los tipos de controles que pueden emplearse, consideremos un ensayo en el cual una red de sondas oligonucleotídicas se utiliza para efectuar un cribado respecto a agentes que modulen la expresión de una serie de genes correlativos para una enfermedad. Como un control de normalización interno para variables tales como el número de células lisadas para cada muestra, la recuperación de mRNA, o la eficiencia de hibridación, una red de sondas puede comprender sondas que son específicas para uno o más genes internos de nivel basal o constitutivos, tales como genes estructurales (v.g., actina, tubulina, u otros) o proteínas de fijación de DNA (v.g., factores reguladores de la transcripción, u otros) cuya expresión no se espera que sea modulada por los agentes a testar. Adicionalmente, para determinar si los agentes a testar dan como resultado efectos secundarios indeseables, tales como muerte celular o toxicidad, una red de sondas puede comprender sondas que son específicas para genes que se sabe son inducidos como parte del proceso de apoptosis (muerte celular programada), o que son inducidos en condiciones de traumatismo celular (v.g., proteínas del choque térmico) o toxicidad celular (v.g., genes p450).

Otras sondas de control pueden incluirse en una red para "ajustar finamente" la sensibilidad de un ensayo. Por ejemplo, consideremos un ensayo para un agente que modula la producción de mRNAs asociados con un estado de enfermedad particular. Si los análisis previos han indicado que uno de los mRNAs correlativos (digamos, mRNA-A) en esta serie se produce en cantidades tan altas comparado con los otros, que su señal enmascara los otros mRNAs, los enlazadores pueden ajustarse para "ajustar finamente" el ensayo a fin de ecualizar las intensidades de las señales. "Enlazadores bloqueados", que comprenden la secuencia de oligonucleótidos específica del ancla diseñada para el mRNA-A diana, pero que carecen de la secuencia específica de la sonda, pueden añadirse para diluir la agrupación de enlazadores específicos de la diana y reducir con ello la sensibilidad del ensayo para dicho mRNA. Las relaciones apropiadas de enlazadores bloqueados y no bloqueados pueden ser determinadas con métodos rutinarios y convencionales por una persona con experiencia en la técnica.

Las muestras a testar en un ensayo de la invención pueden comprender cualquiera de las dianas arriba descritas, u otras. Las muestras líquidas a ensayar pueden ser de cualquier volumen apropiado para el tamaño de la región de test, comprendido entre aproximadamente 100 nanolitro y aproximadamente 100 microlitros. En una realización preferida, se aplican gotas líquidas de aproximadamente 1 microlitro a cada pocillo de una placa de microtitulación de 1536 pocillos. Las muestras pueden ponerse en contacto con las redes de sondas por cualquiera de una diversidad de métodos adecuados para análisis de alta capacidad, v.g., por pipeteado, dispensación basada en chorro de tinta o por el uso de una herramienta de husillos de replicación. Las muestras se incuban en condiciones (v.g., concentración de sal, pH, temperatura, tiempo de incubación, etc. - véase arriba) eficaces para conseguir la fijación u otra interacción estable de la sonda y la diana. Estas condiciones pueden determinarse rutinariamente. Después de la incubación, las muestras se pueden tratar opcionalmente (v.g., lavarse) para eliminar la diana no fijada, utilizando condiciones que se determinan empíricamente para dejar intactas las interacciones específicas, pero que eliminan el material fijado inespecíficamente. Por ejemplo, las muestras pueden lavarse entre aproximadamente 1 y 10 veces o más en las mismas condiciones o condiciones algo más severas que las utilizadas para conseguir la fijación sonda/diana.

Las muestras que contienen RNA diana, v.g., mRNA, rRNA, tRNA, RNA viral o RNA total, pueden prepararse por cualquiera de una diversidad de procedimientos. Por ejemplo, cultivos de células in vitro de los cuales debe extraerse el mRNA pueden extenderse en placas en las regiones de una superficie, tales como los pocillos individuales de una placa de microtitulación. Opcionalmente, estas células, después de alcanzar una densidad de células deseada, pueden tratarse con un agente de interés, tal como un agente estimulante o agente terapéutico potencial, que puede añadirse a las células por cualquiera de una diversidad de medios, v.g., con una herramienta de husillos de replicación (tal como las herramientas de 96 ó 384 husillos disponibles de Beckman), por pipeteado o por dispensación de chorro de tinta, y se incuban con las células durante un periodo de tiempo apropiado, v.g., entre aproximadamente 15 minutos y aproximadamente 48 horas, dependiendo del ensayo. El RNA total, mRNA, etc. extractos de tejidos o células procedentes de una fuente in vitro o in vivo pueden prepararse utilizando métodos rutinarios reconocidos en la técnica (v.g., kits disponibles comercialmente).

Opcionalmente, el ácido nucleico que podría competir con un RNA de interés para hibridación a una sonda específica (es decir DNA genómico, rRNA, tRNA o mRNA que comparte al menos una homología parcial de secuencia con el RNA de interés) puede eliminarse al menos en parte de una muestra de RNA por pretratamiento de la muestra con un procedimiento de protección contra las nucleasas (NP) antes de someterlo a hibridación. Un ácido nucleico (un "fragmento de protección", que puede ser, v.g., RNA, DNA o PNA), que es complementario para al menos una porción del RNA de interés y cuya secuencia se superpone parcial o completamente a la de la sonda que es específica para el RNA de interés, se introduce en exceso en la muestra y se incuba con ella en condiciones de hibridación severas seleccionadas en las cuales el fragmento de protección se hibrida específicamente al RNA de interés (véase arriba para una exposición de condiciones de reacción apropiadas). En este paso, pueden añadirse fragmentos de protección específicos para cualquiera o la totalidad de los RNAs de interés en la muestra (v.g., tantos como 100 o más). Después de hibridación, la muestra se trata con un cóctel de una o más nucleasas a fin de destruir sustancialmente la totalidad del ácido nucleico excepto las porciones de cada RNA de interés que son complementarias al o a los fragmentos de protección, o excepto a los dúplex formados entre el o los fragmentos de protección y el RNA protegido. En un paso subsiguiente, el o los fragmentos de protección puede(n) eliminarse de tales dúplex por desnaturalización de los dúplex y digestión con una enzima apropiada que degradará el o los fragmentos de protección, dejando el RNA protegido sustancialmente intacto. Cualquiera de una diversidad de nucleasas pueden utilizarse para los pasos de digestión arriba expuestos, con inclusión, v.g., de RNAsa pancreática, nucleasa de haba mung, RNAsa H, nucleasa S1 (en condiciones de digestión con contenido alto o bajo de sal), RNAsa A, Ribonucleasa T1, Exonucleasa III, Exonucleasa VII, RNAsa CL3, RNAsa PhyM, RNAsa U2, y análogas, dependiendo de la naturaleza de los complejos hibridados y de los ácidos nucleicos indeseables presentes en la muestra. Las condiciones de reacción para estas enzimas son bien conocidas en la técnica y pueden optimizarse empíricamente. En caso requerido, las muestras pueden tratarse por procedimientos bien conocidos en la técnica para eliminar material no hibridado y/o desactivar o eliminar enzimas residuales (v.g., extracción con fenol, precipitación, filtración en columna, etc.). Las muestras tratadas se ponen luego en contacto con la red de sondas. Con objeto de controlar que la hibridación específica y la protección subsiguiente contra las nucleasas ha tenido lugar adecuadamente, pueden incluirse en la mezcla de reacción fragmentos de protección marcados. Con objeto de controlar que el procedimiento de protección contra las nucleasas ha tenido lugar adecuadamente, es decir que los ácidos nucleicos no hibridados se han digerido como se desea, pueden diseñarse uno o más fragmentos de protección que contengan segmentos colgantes (no hibridables) que deberían ser escindidos por las nucleasas si el ensayo funciona adecuadamente. La presencia o ausencia de los fragmentos colgantes puede determinarse por hibridación con una sonda marcada complementaria, o bien la porción colgante del fragmento de protección propiamente dicha puede marcarse con una molécula detectable.

Para cualquiera de los métodos de esta invención, las dianas pueden marcarse (etiquetarse) por cualquiera de una diversidad de procedimientos que son bien conocidos en la técnica y/o que se describen en otro lugar de esta memoria (v.g., para la detección de fragmentos de protección contra las nucleasas). Por ejemplo, las moléculas diana pueden acoplarse directa o indirectamente con grupos químicos que proporcionan una señal para detección, tales como moléculas quimioluminiscentes, o enzimas que catalizan la producción de moléculas quimioluminiscentes, o moléculas fluorescentes tales como fluoresceína o cy5, o una molécula fluorescente de resolución temporizada como uno de los metales lantánidos en forma de quelato, o un compuesto radiactivo. Alternativamente, las dianas pueden marcarse después que las mismas han reaccionado con la sonda por uno o más informadores específicos de la diana (v.g., anticuerpos, oligonucleótidos como se muestra en Fig. 1, o cualquiera de los tipos generales de moléculas expuestos anteriormente en conjunción con sondas y dianas). Pueden emplearse también una diversidad de procedimientos de detección más complejos de tipo sándwich. Por ejemplo, una diana puede hibridarse a una molécula bifuncional que contiene un primer resto que es específico de la diana y un segundo resto que puede ser reconocido por un reactivo informador común (es decir, el mismo), v.g., un polinucleótido, anticuerpo o análogo marcado. Las moléculas bifuncionales pueden diseñarse de tal modo que cualquier número deseado de informadores comunes puede utilizarse en cada ensayo.

Métodos por los cuales pueden incubarse dianas con uno o más informadores específicos de la diana en condiciones eficaces para conseguir fijación u otra interacción estable pueden determinarse rutinariamente (véase arriba). Por ejemplo, informadores oligonucleotídicos fluorescentes (a una concentración de aproximadamente 10 nM hasta aproximadamente 1 \muM o más, con preferencia aproximadamente 30 nM, en un tampón tal como 6X SSPE-T u otros) pueden incubarse con las dianas combinadas durante entre aproximadamente 15 minutos y 2 horas o más (con preferencia aproximadamente 30 a 60 minutos), a una temperatura comprendida entre aproximadamente 15ºC y aproximadamente 45ºC (con preferencia aproximadamente la temperatura ambiente). Después de la incubación, las muestras pueden tratarse opcionalmente (v.g., lavarse) para eliminar los informadores específicos de la diana no fijados, utilizando condiciones que se determinan empíricamente que dejan intactas las interacciones específicas, pero que eliminan el material fijado inespecíficamente. Por ejemplo, las muestras pueden lavarse entre aproximadamente 1 y 10 veces o más en las mismas condiciones o condiciones algo más severas que las utilizadas para conseguir la fijación diana/informador.

El etiquetado con uno o más informadores específicos de la diana puede proporcionar un estrato adicional de especificidad a la reacción de hibridación inicial, v.g., en el caso en que un informador oligonucleotídico específico de la diana está direccionado a una porción diferente de la secuencia de un ácido nucleico diana que es el oligonucleótido sonda, o en el que la sonda y los anticuerpos informadores reconocen diferentes epítopes de un antígeno diana. Adicionalmente, el etiquetado con informadores específicos de la diana puede permitir el "ajuste" de la sensibilidad de la reacción. Por ejemplo, si un mRNA diana que forma parte de un patrón de expresión correlativo se expresa a niveles muy bajos, el nivel de señal puede mejorarse (amplificación de la señal) por hibridación de la diana fijada a varios (v.g., aproximadamente 2 a aproximadamente 5 o más) informadores oligonucleotídicos específicos de la diana, cada uno de los cuales se hibrida específicamente a una porción diferente del mRNA diana.

La posibilidad de detectar dos tipos de marcadores independientemente permite un tipo adicional de control en los ensayos MAPS. Algunos (v.g., aproximadamente 10 a aproximadamente 100%) de los enlazadores diseñados para un locus de ancla particular (Fig. 7 muestra tres loci de ancla típicos, cada uno de los cuales comprende una pluralidad de anclas sustancialmente idénticas (A, B o C)), pueden tener un marcador (v.g., un fluoróforo) unido a un extremo. Por ejemplo, un fluoróforo de rodamina o Cy5 puede unirse al extremo 5' del enlazador. Tales enlazadores modificados se denominan "enlazadores de control". Después que una mezcla de enlazares y enlazadores de control se ha asociado con anclas y una muestra que contiene una diana se ha incubado con la red de sondas resultante, puede utilizarse un informador específico de la diana que lleva un fluoróforo diferente (v.g., fluoresceína u otro marcador de detección tal como un marcador quimioluminiscente) (o la diana puede marcarse directamente con un fluoróforo u otro marcador de detección); y puede determinarse la relación de las dos señales. La presencia de enlazadores de control permite la calibración del número de anclas funcionales (v.g., capaces de interaccionar con enlazadores) dentro de y entre las regiones de test (es decir, testa la capacidad de cada locus de la red para fijarse a la diana, para propósitos de normalización de las señales)), sirve como base para la cuantificación de la cantidad de diana fijada, ayuda a la localización de los loci de ancla y/o proporciona un control positivo, v.g., en los casos en que no existe señal alguna como resultado de la ausencia de diana en una muestra. En una realización de la invención, pueden utilizarse también dos marcadores (v.g., fluoróforos) diferentes para detectar dos poblaciones diferentes de moléculas diana; sin embargo, la capacidad para reconocer la presencia de dianas por resolución espacial de las señales permite el uso de un solo tipo de marcador para moléculas diana diferentes.

En otra realización de la invención, "anclas" que son específicas para una o más dianas de interés no están asociados con enlazadores, sino que más bien se asocian directamente con la o las dianas; su vez, la o las dianas pueden interaccionar opcionalmente con uno o más informadores específicos de la diana.

Las dianas, marcadas o sin marcar, pueden ser detectadas por cualquiera de una diversidad de procedimientos, que son rutinarios y convencionales en la técnica (véase, p.e. Fodor et al (1996). U.S. Pat. No. 5,510,270; Pirrung et al (1992). U.S. Pat. No. 5,143,854; Koster (1997). U.S. Pat. No. 5,605,798; Hollis et al (1997) U.S. Pat. No. 5,653,939; Heller (1996). U.S. Pat. No. 5,565,322; Eggers et al (1997). U.S. Pat. Nº 5,670,322; Lipshutz et al (1995). Bio Techniques 19, 442-447; Southern (1996). Trends in Genetics 12, 110-115).

Los métodos de detección incluyen detección basada en enzimas, métodos colorimétricos, SPA, autorradiografía, espectrometría de masas, métodos eléctricos, detección de la absorbancia o luminiscencia (con inclusión de quimioluminiscencia o electroluminiscencia), y detección de la dispersión de la luz por, v.g., partículas microscópicas utilizadas como etiquetas. Asimismo, pueden detectarse marcadores fluorescentes, v.g., por formación de imágenes con un dispositivo acoplado a carga (CCD) o microscopía de fluorescencia (v.g., escaneo o microscopía de fluorescencia confocal) o por acoplamiento de un sistema de escaneo con una red CCD o tubo fotomultiplicador, o por utilización de tecnología basada en redes para detección (v.g., puede detectarse el potencial de superficie de cada parte de 10 micrómetros de una región de test o se puede utilizar resonancia de plasmones de superficie si la resolución puede hacerse suficientemente alta). Alternativamente, una red puede contener un marcador (v.g., uno de un par de sondas de transferencia de energía, tales como fluoresceína y rodamina) que puede detectarse por transferencia de energía a (o modulación por) el marcador en un enlazador, diana o informador. Entre los sistemas hospedadores de detección basados en fluorescencia se encuentran intensidad de fluorescencia, polarización de fluorescencia (FP), fluorescencia temporizada, transferencia de energía de resonancia por fluorescencia y fluorescencia homogénea temporizada (HTRF). El análisis de patrones semejantes a códigos de barras repetitivos puede realizarse por reconocimiento de patrones (descubrimiento del punto o línea apropiado para cada diana específica marcada por su posición relativa a los otros puntos o líneas) seguido por cuantificación de la intensidad de los marcadores. Dispositivos de reconocimiento de códigos de barras y software de computador para el análisis de redes mono- o bidimensionales se generan rutinariamente y/o están disponibles comercialmente (v.g., véase Rava et al. (1996), Patente U.S. No. 5.545.531).

Métodos de fabricación y utilización de las redes de esta invención, que incluyen preparación de superficies o regiones tales como las descritas en esta memoria, síntesis o purificación y fijación o ensamblaje de sustancias tales como las de las anclas, enlazadores, sondas y sondas detectoras descritos en esta memoria, y detección y análisis de sustancias marcadas o etiquetadas como se describe en esta memoria, son tecnología bien conocida y convencional. Además de los métodos descritos en las referencias arriba citadas, véanse, v.g., las patentes asignadas a Affymax, Affymetrix, Nanogen, Protogene, Spectragen, Millipore y Beckman (de los cuales están disponibles productos útiles para la invención); libros de texto estándar de biología molecular y ciencia de proteínas, con inclusión de los arriba citados; y Cozette et al. (1991), Patente U.S. 5.063.081; Southern (1996), Current Opinion in Biotechnology 1, 85-88; Chee et al (1996), Science 274, 610-614; y Fodor et al (1993), Nature 364, 555-556.

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Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 ilustra un esquema de diseño para oligonucleótidos, en el cual un enlazador 1 contiene una porción que es específica para el ancla 1 y otra porción (una sonda) que es específica para el mRNA diana 1, y en el cual una sonda de detección marcada 1 es específica para una secuencia de mRNA diana 1 que es diferente de la secuencia de la porción específica de la diana del enlazador.

Fig. 2 ilustra una superficie que comprende 15 regiones de test, cada una de las cuales comprende una red de 6 oligonucleótidos de ancla.

Fig. 3 ilustra el diseño de un enlazador para un ensayo de fijación de receptores, en el cual la porción específica de ancla del enlazador está asociada con la porción de sonda (la proteína receptora) por moléculas de biotina y estreptavidina, y en el cual un ligando específico para el receptor está marcado con una molécula marcadora fluorescente. B: biotina, SA: estreptavidina, Rec: proteína receptora, Ligando: un ligando natural o sintético para el receptor, *: una molécula marcadora fluorescente unida al ligando.

Fig. 4 ilustra una superficie que comprende 21 regiones de test, cada una de las cuales se subdivide ulteriormente en 16 sub-regiones (indentaciones, depresiones).

Figs. 5a, 5b y 5c ilustran tres piezas a partir de las cuales puede ensamblarse una superficie tal como la representada en Fig. 4. Fig. 5a representa un separador de pocillos; Fig. 5b representa un subdivisor; y Fig. 5c representa una base.

Fig. 6 representa dos regiones de test, cada una de las cuales comprende una red lineal de sondas (o anclas) que se encuentran en una formación semejante a un "código de barras".

Fig. 7 representa esquemáticamente una región de test que comprende tres anclas (A, B y C), cada una de las cuales está presente en copias múltiples (un "grupo"). La localización de cada grupo de anclas se denomina un "locus".

Fig. 8 ilustra un ensayo en el cual uno o más cDNA(s) generados por transcriptasa inversa específica se ensayan en placas MAPS.

Fig. 9 ilustra un ensayo que utiliza un procedimiento de protección contra las nucleasas (ensayo NPA-MAPS). El RNA muestra se prepara a partir de células o de tejidos y se representa como líneas onduladas delgadas. Se añade a la muestra de RNA un grupo de fragmentos de fragmentos de protección polinucleotídicos, representados como líneas gruesas oscuras y claras. Las secciones oscuras de los fragmentos de protección representan segmentos que son complementarios para dianas de RNA específicas y se hibridan a dichas dianas. Las secciones claras representan porciones colgantes: secuencias contiguas con la secuencia complementaria pero no complementarias a la diana. Los fragmentos de protección se añaden en exceso. Después de la hibridación de toda la diana disponible a los fragmentos de protección, las muestras se tratan con un cóctel apropiado de nucleasas y con tratamientos químicos que destruyen el RNA indeseable no hibridado y el polinucleótido no hibridado. Por ejemplo, la nucleasa S 1 puede destruir cualquier DNA monocatenario presente. Por tanto, el fragmento de protección en exceso se hidroliza al igual que la porción no hibridada colgante del fragmento de protección fijado. El RNA puede hidrolizarse por adición de ribonucleasas que incluyen la ribonucleasa H y/o por calentamiento de las muestras en base. Queda una colección de fragmentos de protección escindidos que reflejan cuánto de cada RNA diana había estado presente en la muestra. Los fragmentos de protección restantes se miden por un ensayo de hibridación MAPS.

Fig. 10 ilustra la especificidad de hibridación en un ensayo MAPS.

Fig. 11 ilustra la cinética de fijación de un ancla a un enlazador.

Fig. 12 ilustra un ensayo MAPS de 2 dianas oligonucleotídicas.

Fig. 13 ilustra la cuantificación de un cambio de sensibilidad.

Fig. 14 ilustra determinaciones de la temperatura de fusión para cuatro combinaciones enlazador oligonucleotídico/ancla.

Fig. 15 ilustra un ensayo de mRNA por NPA-MAPS.

Fig. 16 ilustra una curva de dilución con NPA-MAPS.

Fig. 17 ilustra un ensayo para detectar péptidos que contienen residuos fosfotirosina.

Fig. 18 ilustra el primer paso en un ensayo para mapear ESTs: el ensamblaje de enlazadores que corresponden a cada uno de los ESTs a mapear en redes de anclas genéricas sobre una placa MAPS. A la superficie de cada uno de 16 pocillos de una microplaca se fijan enlazadores que comprenden 16 sondas oligonucleotídicas diferentes, dispuestas en una matriz 4 x 4. El primer locus tiene el oligonucleótido 1, que es complementario a una porción de la primera secuencia EST, y así sucesivamente para los 16 ESTs a testar. cDNAs o mRNAs generados a partir de los genes de los que se obtuvieron los ESTs se añaden a la totalidad de los 16 pocillos y se dejan hibridar en condiciones apropiadas. Por tanto, cada cDNA o mRNA que contiene una de las 16 secuencias EST se ensamblará en el locus en el que se puso su sonda complementaria.

Fig. 19 ilustra un paso subsiguiente en un ensayo para mapear ESTs: la adición de oligonucleótidos detectores a la placa MAPS. Cada pocillo de la placa recibe un oligonucleótido detector que corresponde a uno de los ESTs a mapear. Cada oligonucleótido detector es un oligonucleótido acoplado a una molécula utilizada para detección, v.g., fluoresceína en el caso de que el método de detección sea formación de imágenes por fluorescencia. Cada oligonucleótido detector es complementario a uno de los ESTs, pero diferente de la sonda específica de EST, de tal modo que una sonda y un oligonucleótido detector que son complementarios para un solo EST pueden unirse ambos al mismo tiempo.

Después del lavado, se añade un solo oligonucleótido detector a cada pocillo, como se numera en la Figura. Es decir, el oligonucleótido detector con secuencias complementarias para el primer EST se añade al primer pocillo, y así sucesivamente.

Fig. 20a y b ilustran los resultados del ensayo de mapeado de ESTs representado en las Figs. 18 y 19. Después de la hibridación de los oligonucleótidos detectores y lavado con condiciones de severidad apropiadas, se obtiene la imagen de los 16 pocillos de la microplaca con un formador de imágenes de fluorescencia basado en CCD, por ejemplo. Fig. 20a muestra resultados estilizados. Se espera que cada oligonucleótido detector específico de EST marque el mRNA o cDNA retenido por la sonda específica de EST correspondiente. Por ejemplo, la sonda 5 ensambla el cDNA o mRNA que contiene la quinta secuencia EST en dicho locus, por lo que el quinto oligonucleótido detector debería hibridarse también al cDNA o mRNA en el mismo locus. Esto es lo que ocurre para estos datos estilizados, marcando cada oligonucleótido de detección la sonda coincidente. Adicionalmente, los tres primeros oligonucleótidos detectores marcan cada uno cDNA o mRNA retenido por las tres primeras sondas, demostrando que estas secuencias corresponden al mismo gen. Análogamente, los 5 últimos ESTs parecen estar enlazados. Los enlaces asignados a partir de estos datos se representan gráficamente en Fig. 20b.

Fig. 21 ilustra las relaciones de las sondas, los oligonucleótidos detectores y los ESTs #1, 2 y 6 representados en las Figuras 18-20.

Fig. 22 ilustra un ensayo de alta capacidad.

Ejemplos Ejemplo 1 Especificidad de Hibridación (véase Figura 10)

Se produjo una placa MAPS genérica utilizando un dispensador de chorro de tinta, el sistema Pixus (Cartesian Technologies, Inc., Irvine, CA) para formar una cuadrícula idéntica de DNA en cada pocillo de una placa de microtitulación. Todos los oligonucleótidos se adquirieron de Biosource International (Camarillo, CA). Para esta placa, se dispensaron 7 anclas oligonucleotídicas diferentes en cada pocillo en el patrón que se muestra como la Clave (lado izquierdo de la figura). Cada oligonucleótido se dispensó como una gotita de 10 nanolitros en dos puntos, a partir de una solución 2 \muM que contenía 500 mM de fosfato de sodio de pH 8,5 y EDTA 1 mM a los pocillos de una placa DNA Bind (Corning Costar) y se dejó secar. Después de la fijación, se bloquearon los pocillos con Tris 50 mM de pH 8, y después de ello el oligonucleótido que no se había fijado covalentemente a la superficie se eliminó por lavado con 0,1% SDS en tampón 5x SSP.

A la placa lavada se añadieron oligonucleótidos enlazadores marcados fluorescentemente y se dejaron hibridar en 6x SSPE con 0,1% de Triton X-100 a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Este es un protocolo preferido para fijación de enlazadores. Los oligonucleótidos enlazadores se derivatizaron en cy5 durante la síntesis, y eran complementarios en segmentos de 25 pares de bases a los oligonucleótidos de ancla específicos. Las secuencias de los siete anclas y enlazadores era como sigue (representadas todas ellas en la dirección 5' a 3'):

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(Secuencia pasa a página siguiente)

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A cada pocillo se añadió a granel un solo enlazador o una mezcla de enlazadores (como se indica en la figura). (Al pocillo marcado "todos" se añadió una mezcla de los 7 enlazadores). Después de incubación y lavado en 5x SSP tres veces, se tomó la imagen de fluorescencia que se representa en la porción derecha de la Figura con un instrumento de producción de imágenes Tundra (IRI, St. Catherines, Ontario). Como puede verse, los enlazadores de autoensamblaban en la superficie, asociándose específicamente con sus anclas complementarios.

Este proceso se repite excepto que se dispersan 8 anclas diferentes en cada pocillo y los enlazadores se asocian con ellos después preferentemente. El proceso entero se repite con 36, 64, etc. anclas diferentes en cada pocillo de una placa de 24, 96, 384, 864 o 1536 pocillos.

Ejemplo 2 Cinética de Fijación (véase la Figura 11)

Se muestra la tasa de hibridación del enlazador derivatizado en Cy5 número 1 a su ancla complementario unido, para diferentes concentraciones de enlazador. La placa MAPS genérica se preparó como para la figura 1, excepto que el ancla 1 se fijó en 4 puntos por pocillo. Se realizaron incubaciones a la temperatura ambiente en 5x SSP con 0,1% de Tween-20, se lavaron los pocillos tres veces con 5x SSP, y se midió la fluorescencia fijada. Se tomó una imagen de fluorescencia de la placa con el instrumento Tundra y se sustrajo el ruido de fondo, calculándose la intensidad integrada de cada punto dentro de cada pocillo con software Tundra. Se representan gráficamente el valor medio y la desviación estándar para la intensidad integrada para los 4 puntos en cada uno de dos pocillos duplicados.

Ejemplo 3 Enlazador Fluorescente

Se produce una placa MAPS genérica con un solo oligonucleótido de ancla aplicado, o bien a un solo punto por pocillo (las dos filas superiores), 4 puntos por pocillo (las 4 filas siguientes) o 16 puntos por pocillo (las dos filas inferiores), de acuerdo con los métodos expuestos anteriormente. A cada pocillo complementario, marcado fluorescentemente, se fija un enlazador por el protocolo preferido descrito en el Ejemplo 1. Después de lavado, se toma la imagen de fluorescencia de la placa con el Tundra. La cantidad de fluorescencia en cada punto informa de la cantidad de enlazador funcional que está disponible para hibridarse a la diana. La cantidad de señal detectada en puntos repetidos es altamente reproducible.

Ejemplo 4 Curvas de Fijación

A la placa preparada como se describe en el Ejemplo 3, se añaden diferentes concentraciones de un oligonucleótido diana. El enlazador que se ha asociado contiene un secuencia 25-mera complementaria a una porción de la diana. La diana se añade en 5x SSC con 0,05% de SDS en un volumen total de 30 ó 100 microlitros, y la placa se cubre y se incuba a 50ºC durante una noche. Después de la hibridación de la diana al enlazador fijado, se visualiza la diana por un protocolo preferido utilizando quimioluminiscencia. Se añade un oligonucleótido detector biotinilado, que contiene una secuencia 25-mera complementaria a una porción separada de la diana (no a la misma porción complementaria para el enlazador) a 30 nM. El detector biotinilado puede añadirse durante 30 minutos después de eliminar por lavado el exceso de diana no fijada, o puede añadirse junto con la diana durante todo el tiempo de la hibridación a lo largo de la noche. Después de la fijación del detector, se lava la superficie dos veces con 5x SSC, una sola vez con 1x SSP que contiene 0,1% de Tween-20 y 1% de PEG (SSPTP), y se añade una dilución 1:50.000 de 250 \mug/ml de peroxidasa de rábano picante conjugada a estreptavidina (HRP:SA, de Pierce, Rockford, III.) durante 5 horas en SSPTP a la temperatura ambiente. Los pocillos se lavan 4 veces por SSPTP, y se lavan una sola vez y se incuban luego con reactivo Super Signal Ultra (Pierce). Después de unos cuantos minutos, se recogen las imágenes de luminiscencia con el productor de imágenes Tundra, v.g., la imagen puede acumularse en la red CCD durante 5 minutos. Pueden visualizarse niveles bajos de diana en algunos pocillos a una concentración de diana tan pequeña como \sim5 x 10^{-13}M; la cantidad de señal llega a saturarse generalmente para una concentración de diana de \sim10^{-10}M. La cantidad de señal detectada en puntos repetidos es altamente reproducible.

Ejemplo 5 Ensayo de Dos Oligonucleótidos (véase la Figura 12)

Se muestra una curva de fijación que demuestra un ensayo de hibridación MAPS utilizando el protocolo preferido arriba expuesto para dos oligonucleótidos diana diferentes. Se preparó una placa MAPS genérica con 4 oligonucleótidos de ancla diferentes aplicados cada uno por puntos 4 veces en cada pocillo. Para la segunda y la cuarta anclas, se autoensamblaron en la superficie oligonucleótidos enlazadores complementarios como se ha descrito. Se añadieron dos dianas a las concentraciones indicadas en 40 microlitros a cada pocillo como se ha descrito, y se incubaron a 50ºC durante una noche. La cantidad de cada diana fijada se visualizó por fijación del oligonucleótido de detección biotinilado específico para cada diana seguida por HRP:SA y formación de imágenes por quimioluminiscencia como se ha descrito. En el panel inferior se cuantifica la intensidad de imagen. Se utilizó software que forma parte del paquete de imágenes Tundra para escanear la intensidad de las imágenes a lo largo de líneas entre las flechas representadas en el panel superior. Para la concentración mínina de diana, 1,1 pM, las imágenes escaneadas muestran picos gaussianos bien definidos en cada punto, mientras que no se observa pico de ruido de fondo apreciable alguno en la muestra situada más a la izquierda, para concentración 0 de diana.

Ejemplo 6 Cambio de Sensibilidad (véase la Figura 13)

Puede utilizarse un ensayo de hibridación MAPS para medir la concentración de una serie de oligonucleótidos, por fijación de los mismos a una superficie, seguida por marcación. Esto da buen resultado para aquellos oligonucleótidos que se encuentran en concentración moderada o baja. Pueden distinguirse dos muestras en un caso de este tipo, debido a que si una muestra contiene más oligonucleótido, se fijará más. Por el contrario, si la concentración de oligonucleótido direccionado es saturante para la superficie (es decir, si la misma es suficientemente alta para ocupar todos los sitios de fijación), entonces si la concentración aumenta no puede fijarse más, por lo que la cantidad no puede medirse. No obstante, la curva de fijación de una diana puede cambiar por adición de ligando competidor sin marcar.

Se obtienen datos de fijación para 4 dianas oligonucleotídicas diferentes, todas las cuales saturan la superficie (es decir, alcanzan la fijación máxima) para aproximadamente 3 nM. Por adición de dianas competitivas sin marcar a todos los pocillos, se cambia la fijación de oligonucleótido marcado, por lo que se fija menos para la concentración inferior, y el nivel al que ocurre la saturación se hace más alto. Pueden añadirse oligonucleótidos competitivos para, por ejemplo, las dianas 1 y 3 pero no para las dianas 2 y 4. Esto desplaza la sensibilidad del ensayo únicamente para las dianas 1 y 3. De este modo pueden medirse dianas oligonucleotídicas de concentraciones muy diferentes dentro de un solo pocillo de ensayo, si la cantidad relativa de oligonucleótido esperada es conocida.

Los datos pueden cuantificarse como se ha explicado arriba para la fijación de una sola de las dianas oligonucleotídicas. La Figura 13 representa cuantitativamente que la inclusión de un oligonucleótido competitivo en el ensayo desplaza la curva de fijación utilizada para el ensayo de esta diana a concentraciones mayores.

Ejemplo 7 Temperatura de Fusión de Cuatro Sondas (véase la Figura 14)

La cantidad de cuatro oligonucleótidos enlazadores diferentes marcados fluorescentemente que se hibridan específicamente a los oligonucleótidos de ancla por el ensayo MAPS se representa gráficamente a medida que se eleva la temperatura. Los cuatro oligonucleótidos se dejaron hibridar primeramente a 50ºC durante 1 hora a 300 nM. A continuación se lavaron los pocillos con SSC sin sondas, y la cantidad fijada se midió por fluorescencia como anteriormente (punto de 50ºC). A continuación se incubó la superficie a 55ºC durante 30 minutos y se midió la fluorescencia fijada, y así sucesivamente para todas las temperaturas presentadas.

Ejemplo 8 Métodos de Detección

Pueden compararse directamente dos métodos de detección. A una placa MAPS con 4 anclas oligonucleotídicos fijados, cada uno en 4 puntos por pocillo, se añaden dos oligonucleótidos a cada pocillo, incluyendo ambos un resto cy5 fijado covalentemente o conteniendo ambos un grupo biotina. La medida de epi-fluorescencia se realiza como se ha descrito para la observación y medida del enlazador fluorescente. Las medidas de quimioluminiscencia se realizan como se ha descrito para el ensayo MAPS utilizando adición subsiguiente de HRP:SA y un sustrato de quimioluminiscencia. Las señales generadas son aproximadamente de la misma magnitud. Sin embargo, para la geometría de las microplacas, que contienen paredes que separan cada pocillo, y burbujas ocasionales de líquido o un menisco de fluido, las reflexiones en las imágenes de epi-fluorescencia pueden causar interferencia en la interpretación de los datos.

Ejemplo 9 Productos de Quimioluminiscencia

Dos productos disponibles como sustratos de quimioluminiscencia para peroxidasa de rábano picante pueden compararse como procedimientos de detección para el ensayo MAPS. Se prepara una placa MAPS como para el Ejemplo 8, y se incuba con oligonucleótidos enlazadores biotinilados. A continuación se añade o bien fosfatasa alcalina acoplada a estreptavidina (AlkPhos:SA) o HRP:SA, seguido por lavado y adición de CDP-Star (Tropix) a los pocillos con alkPhos:SA o ECL-Plus a los pocillos con HRP-SA. La marcación con enzimas y sustratos derivatizados de SA es como se sugiere por los fabricantes para uso en marcación de transferencias Western. Estos dos (así como otros sustratos disponibles) pueden utilizarse ambos para evaluar la hibridación de los oligonucleótidos a las placas MAPS.

Ejemplo 10 Resolución a 0,6 mm

La resolución del sistema actual para el ensayo MAPS se testa por preparación de una placa MAPS con 4 anclas oligonucleotídicos diferentes por pocillo, aplicados cada uno 4 veces por pocillo, con un paso (separación de centro a centro) de 0,6 mm. A continuación, se hibridan enlazadores derivatizados en cy5 o enlazadores biotinilados, y se realiza la detección y el escaneo como anteriormente. Para la medida de la epi-fluorescencia, la resolución es mayor (y el paso podría reducirse probablemente). Para el procedimiento de detección por quimioluminiscencia, los puntos vecinos no están completamente separados, pero para esta separación pueden resolverse los picos individuales inequívocamente por descomposición en ordenador.

Ejemplo 11 Ensayo de Protocolo de Protección contra las Nucleasas

En un ensayo para testar las condiciones óptimas para hibridación y tratamiento con nucleasas para el protocolo de protección contra las nucleasas, se utiliza el kit Nuclease Protecction Assay de Ambion (Austin, Texas) a fin de proporcionar condiciones, tampones y enzimas. Se preparan 8 muestras en uno de tres tampones. Hyb Buff 1 es 100% Tampón de Hibridación (Ambion); Hyb Buff 2 es 75% Tampón de Hibridación y 25% Tampón de Hibridación-Dilución (Ambion); y Hyb Buff 3 es 50% de cada uno. Se sintetiza un oligonucleótido 70-mero que contiene 60 residuos complementarios para un mRNA de test (Biosource International, Camarillo, CA) y se marca con Psoraleno-fluoresceína (Schleicher and Schuell, Keene, NH) siguiendo el protocolo sugerido para la marcación de Psoraleno-biotina por Ambion. Resumidamente, el fragmento de protección se diluye hasta 50 \mug/ml en 20 \mul de tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8), se hierve durante 10 minutos, y se enfría rápidamente en agua helada. Se añaden 4 \mul de Psoraleno-fluoresceína de 130 \mug/ml en DMF, y la muestra se ilumina durante 45 minutos a 40ºC con una fuente UV portátil de longitud de onda larga. Se elimina el Psoraleno-fluoresceína libre por extracción con butanol saturado. El mRNA utilizado es mRNA GAPDH antisentido, preparado a partir del plásmido antisentido (Molde de Control pTRI-GAPDH-Ratón antisentido, de Ambion) utilizando el promotor T7 y el kit MaxiScript (Ambion). El fragmento de protección corto es la porción complementaria 60-mera sintetizada por separado y marcada análogamente. Las secuencias de los fragmentos de protección son como sigue:

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(Secuencia pasa a página siguiente)

3

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Las hibridaciones se realizan mezclando los fragmentos de protección a 20 nM y mRNA GAPDH a 60 nM en 10 \mul de volumen final durante 2 horas a 22ºC o 37ºC. Después de la hibridación, se añaden 200 \mul de una mezcla de nucleasas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ambion Nuclease Protection Kit, dilución 1:200 de mezcla de nucleasas) y se incuba de nuevo a las mismas temperaturas durante 30 minutos. La hidrólisis se para con Tampón de Inhibición de la Hibridación (Ambion), y los oligonucleótidos se reducen a un sedimento y se lavan con etanol. Se añaden 10 \mul de 1x Tampón de Carga de Gel (Ambion) y se separan los oligonucleótidos en un gel TBE-urea al 15%. El gel se agita de modo turbulento en tampón de desplazamiento durante 30 minutos, se pone en una placa de plástico y se obtiene su imagen con el instrumento Tundra utilizando filtros de fluoresceína para seleccionar las longitudes de onda de excitación y emisión. La imagen se acumula en la red CCD durante 2 minutos. Las condiciones óptimas son las indicadas para las muestras incubadas en Hyb Buff 2 a 37ºC o en Hyb Buff 3 a 22ºC. En estas muestras no queda ningún fragmento detectable de protección de longitud total, y se observan cantidades significativas de una porción del fragmento
de protección de longitud total para un tamaño que es aparentemente el mismo que el fragmento de protección corto.

Ejemplo 12 Ensayo de mRNA por NPA-MAPS (véase Figura 15)

Se utilizó el protocolo NPA-MAPS completo, con condiciones para hibridación y tratamiento con nucleasas similares a las descritas en el Ejemplo 11. Se utilizaron 10 muestras para el ensayo. Todas ellas contenían la misma cantidad del fragmento de protección oligonucleotídico 70-mero y cantidades diferentes de mRNA GAPDH. Las muestras de hibridación de 10 \mul en 50% de Tampón de Hibridación y 50% de Tampón de Dilución que contenía 0,08 mg/ml de RNA de levadura (Ambion) se calentaron a 90ºC durante 6 minutos, se centrifugaron brevemente, se calentaron a 70ºC durante 5 minutos, y se dejaron enfriar a 19ºC después de lo cual se incubaron durante 19 horas. Se añadieron luego 200 \mul de la mezcla de nucleasas a cada muestra durante 30 minutos a 19ºC. Se tomaron partes alícuotas de 60 \mul de cada muestra para el ensayo MAPS. Se añadieron 2 \mul de NaOH 10N y 2 \mul de EDTA 0,5M, y la muestra se calentó a 90ºC durante 15 minutos, a 37ºC durante 15 minutos, y se dejó sedimentar a la temperatura ambiente durante 20 minutos. Se neutralizaron luego las muestras con 2 ml de HCl 10M, y 12 \mul de 20x SSC que contenía HEPES 2M de pH 7,5 y se añadió el oligonucleótido detector biotinilado 200 nM específico para el fragmento de protección junto con 1 \mul de SDS al 10%. Se mezclaron las muestras, se calentaron a 80ºC durante 5 minutos, y se pipetearon dos partes alícuotas de 35 ml de cada muestra en dos pocillos de una placa MAPS (cada muestra se dividió en dos y se corrió por duplicado en la placa MAPS). La placa se había preparado como para el protocolo MAPS estándar, con enlazador autoensamblado derivatizado en CY5 específico para el fragmento de protección ya fijado. La placa MAPS se cubrió y se incubó a 50ºC durante una noche, y se realizaron la detección y la luminiscencia como se ha descrito. En la última muestra, no se añadió nucleasa alguna durante el ensayo como control a fin de visualizar de qué modo podría detectarse el fragmento de protección sólo por MAPS. En la porción inferior de la figura, se presenta el escaneo de intensidad (como se analizó por el aparato de producción de imágenes) para la fila de pocillos superior. La cantidad de mRNA GAPDH presente en la muestra (es decir la cantidad en cada pocillo duplicado después de la adición de las partes alícuotas de la placa MAPS) se indica en la figura.

Los oligonucleótidos utilizados para las placas MAPS eran como sigue:

4

Ejemplo 13 Curva de Dilución, NPA-MAPS (véase la Figura 16)

Los datos expuestos en el Ejemplo 12 y representados en la Figura 15 se cuantificaron y representaron gráficamente como una curva de dilución. El valor medio y las desviaciones estándar para la totalidad de los 8 puntos de los dos pocillos duplicados se representan gráficamente para cada concentración de mRNA. Se superpone una curva de fijación, de la forma:

Fracción Fijada = Fijación Máxima * 1/(1 + CI_{50}/L)

donde Fijación Máxima es el máximo fijado en la saturación, Fracción Fijada es la cantidad fijada para la concentración de ligando, L, y el valor CI_{50} es la concentración de ligando para la cual la Fracción Fijada es la mitad de la Fijación Máxima. La curva se muestra como puntos rojos en la Figura, trazada con un valor de ajuste óptimo de CI_{50} = 4,2 femtomoles como se marca en la Figura.

Ejemplo 14 Ensayo NPA-MAPS de mRNA GAPDH en un extracto de RNA de hígado total de ratón

Se ensaya un extracto de RNA total de ratón para mRNA GAPDH con un ensayo NPA-MAPS y se obtiene una curva de dilución. Se prepara RNA total de hígado de ratón utilizando un kit de Qiagen. Se precipita el RNA en EtOH al 70% con acetato de magnesio 0,5M, y se resuspende en 10 \mul de 5x SSC con 0,05% SDS y con fragmento de protección 1,8 nM. El fragmento de protección añadido es un oligonucleótido de 70 bases de longitud, 60 bases de las cuales son complementarias a GAPDH de ratón. Se utiliza un fragmento complementario a mRNA GAPDH de ratón ("fragmento de protección"), o se utiliza el complemento de la secuencia como control negativo ("fragmento antisentido").

Muestras de RNA con fragmentos de protección se calientan a 90ºC durante 5 minutos, y se realizan las hibridaciones llevando las muestras a 70ºC y dejando que las mismas se enfríen lentamente a la temperatura ambiente durante una noche. Se añade nucleasa S1 (Promega) a dilución 1:10 en 30 \mul de Tampón Nucleasa 1 x S1 (Promega) durante 30 minutos a 19ºC, y se para con 1,6 \mul de NaOH 10N y 2,7 \mul de EDTA 0,5M. Las muestras se calientan a 90ºC durante 15 minutos y luego a 37ºC durante 15 minutos para desnaturalizar y destruir el RNA, se neutralizan con 1,6 \mul de HCl 10M, y se incuban en placas MAPS durante una noche en 5 x SSC con 0,05% de SDS suplementado con HEPES 200 mM de pH 7,5 al que se añaden 30 nM de oligonucleótido de detección biotinilado. El lavado y la visualización con SA-HRP se realizan como se ha descrito. la cantidad de señal disminuye en parelelo con las cantidades decrecientes de RNA de ratón (las muestras incluyen 500, 170, 50, 5, o 0,5 \mug de RNA total de ratón). Se incluyen dos muestras de control a las cuales no se añade cantidad alguna de nucleasa S1. La señal se aprecia únicamente para el fragmento de protección complementario.

5

Ejemplo 15 Un Ensayo MAPS de Protección contra Nucleasas con Controles

Se extrae mRNA de hígado de ratón y se realiza la protección contra las nucleasas esencialmente como se describe en el Ejemplo 14, excepto que el fragmento de protección específico GADPH comprende 60 nucleótidos que son complementarios a GAPDH de ratón, seguidos por 15 nucleótidos "colgantes" en el extremo 3' del fragmento que no son complementarios a la diana. Después de hibridación y digestión con nucleasas, el fragmento de protección restante se hibrida a una placa MAPS como se indica en el Ejemplo 14, excepto que se utilizan dos fragmentos de detección oligonucleotídicos diferentes para detectar el fragmento de protección inmovilizado. Un fragmento de detección es complementario a la porción específica de GAPDH del fragmento de protección, y el otro, un control, es complementario a la porción colgante de 15 bases del fragmento de protección. Cada fragmento de detección se utiliza en muestras replicadas diferentes (es decir, en pocillos diferentes), de tal modo que ambos fragmentos de detección pueden marcarse con la misma molécula de detección. En el ejemplo presente, ambos fragmentos se marcan con HRP. Sin la adición de nucleasa, se observan señales de los dos fragmentos de detección; en tanto que, cuando se realiza la digestión con nucleasas, puede detectarse únicamente la señal correspondiente a las secuencias GAPDH. La cantidad de señal específica de GAPDH está reducida con relación a la observada en ausencia de la digestión con nucleasas, debido a que el fragmento de protección se añade en un exceso con relación a la cantidad de mRNA GAPDH presente. Esto permite que la cantidad de mRNA GAPDH se limite a la hibridación protectora, por lo que la cantidad de híbrido bicatenario formada (y por consiguiente la cantidad de fragmento de protección que está protegido contra la nucleasa) refleja la cantidad de mRNA. Cuando no se incluye cantidad alguna de mRNA en la mezcla de reacción, no puede detectarse señal alguna cuando se añaden las nucleasas. Los descubrimientos arriba indicados demuestran que los pasos de hibridación y digestión del ensayo ocurrían como era de desear.

Cuando se incluyen fragmentos de protección correspondientes a una diversidad de dianas en un ensayo dado, cada uno de los fragmentos de protección puede comprender la misma porción colgante de 15 bases. Esto permite que se utilice un solo fragmento de detección para testar el colgante remanente para todas las muestras.

Ejemplo 16 Un ensayo de transcripción de cribado para compuestos que pueden alterar la expresión de genes que son correlativos con un estado de enfermedad

Se utiliza una línea de células derivada de un tumor humano. Se encuentra que expresa 30 genes a niveles mayores que lo hacen las células normales. (Es decir, estos 30 genes están siendo utilizados más que en las células normales, para producir mRNA y fabricar luego la proteína para la cual los genes son las instrucciones). Un ensayo de transcripción mide la cantidad de genes que se están utilizando por medida de la cantidad mRNA que está presente para cada gen). Utilizando un ensayo de protección contra las nucleasas en placas MAPS (NPA-MAPS), se testan 8800 compuestos químicos para ver si el crecimiento de las células en presencia de los compuestos puede reducir la expresión de algunos de los 30 genes correlativos sin afectar a la expresión de 6 genes normales (constitutivos, "internos"). Cualesquiera compuestos que tengan dicho efecto podrían ser útiles en el desarrollo futuro de fármacos para el tratamiento de esta clase de tumor.

Se añaden aproximadamente 10.000 a 100.000 células a cada pocillo de 100 placas de poliestireno de 96 pocillos, y las células se dejan crecer durante 2 días hasta que las mismas cubren la superficie de cada pocillo. Para 8 pocillos de cada placa, se dejan crecer las células sin adiciones. A los 88 pocillos restantes de cada placa, se añade un compuesto químico diferente a fin de que pueda testarse el efecto del mismo aisladamente. Para las 100 placas utilizadas a un mismo tiempo, pueden testarse o cribarse 8800 compuestos. Las células se dejan crecer durante 24 horas en presencia de los compuestos, después de lo cual se recogen las células para el ensayo. Las células contenidas en cada placa se tratan de acuerdo con las instrucciones para la preparación de RNA en muestras de placas de 96 pocillos (por ejemplo de acuerdo con el kit Qiagen RNeasy 96). Después de preparar el RNA, se cuantifica la cantidad de cada una de 36 especies diferentes de mRNA por el método NPA-MAPS, incluyendo los 30 genes correlativos y 6 genes normales "internos". Se añaden a cada pocillo 36 fragmentos de protección de oligonucleótidos de DNA, cada uno de los cuales corresponde a uno de los genes de interés, y se dejan hibridar en condiciones severas seleccionadas a sus secuencias mRNA diana. Se añade a continuación nucleasa S1 para destruir el exceso de DNA no hibridado, y se tratan las muestras químicamente para destruir el RNA asimismo. A la izquierda se representa el fragmento de protección oligonucleotídico para cada uno de los 36 genes en proporción a la cantidad de mRNA que había estado presente en las células tratadas para cada muestra.

Se preparan cien placas de 96 pocillos, cada una de las cuales comprende una red de una pluralidad de 36 oligonucleótidos de ancla diferentes en cada pocillo, por adición a cada pocillo de 36 oligonucleótidos enlazadores diferentes. Los enlazadores se autoensamblan en la superficie de cada pocillo, convirtiendo las placas genéricas en placas MAPS que comprenden sondas específicas para cada uno de los 36 fragmentos de protección oligonucleotídicos. Cada enlazador tiene una porción específica para uno de los 36 anclas y una porción específica para un segmento de uno de los 36 oligonucleótidos de protección. La muestra de oligonucleótidos de cada pocillo de las 100 placas de muestra se añade a un pocillo correspondiente de las 100 placas MAPS. Después de hibridación en condiciones severas seleccionadas, se añade un oligonucleótido de detección para cada diana con una enzima quimioluminiscente fijada, de tal modo que cada punto específico de cada pocillo se enciende en proporción a la cantidad de mRNA que había estado presente en la muestra. Cualesquiera pocillos que exhiban cantidades reducidas de genes correlativos sin efecto alguno sobre los 6 genes internos son interesantes. Los compuestos añadidos a las células para dichas muestras son puntos de partida posibles para el desarrollo de agentes antitumorales.

Ejemplo 17 Expresión de genes inducidos y constitutivos

Se preparó RNA esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 14, a partir de los hígados de ratones no infectados ("control") o una hora después de la infección ("infectados") por adenovirus. Se utilizaron 60 \mug de RNA hepático para cada muestra, y se prepararon muestras por duplicado. Cada pocillo de ensayo contenía tres series de loci duplicados, correspondientes a los tres genes arriba descritos. Cada locus contenía un ancla, unida a un enlazador que comprendía una sonda que era complementaria para un fragmento de protección correspondiente a uno de los tres genes. Se realizó un ensayo MAPS de protección contra las nucleasas esencialmente como se describe en la Figura 12, y las imágenes se recogieron y escanearon como se ha descrito. Se muestran los datos de imagen brutos recogidos y los escaneos de intensidad para pocillos duplicados para cada una de las tres dianas de mRNA. Los números sobre las líneas de escaneo son los valores de intensidad integrados y las desviaciones estándar para cada condición (n = 4).
El gen interno, GAPDH, cuyo cambio no era de esperar, exhibía un aumento moderado de 1,3 veces en la muestra infectada que no era estadísticamente significativo. La transcripción MIP-2 y c-jun aumentaba 4 y 6 veces, respectivamente. Estos descubrimientos demuestran que dos genes, MIP-2 y c-jun exhiben expresión intensificada en respuesta a la infección de adenovirus, en comparación con un control, gen GAPDH expresado constitutivamente.

Ejemplo 18 Un ensayo enzimático de cribado para compuestos que inhiben selectivamente las tirosina- o serina-quinasas (véase la Figura 17)

Las quinasas son enzimas que fijan un fosfato a las proteínas. Se ha demostrado que muchas de ellas estimulan el crecimiento de las células normales y neoplásticas. Por tanto, los compuestos que inhiben quinasas específicas (pero no todas las quinasas) pueden utilizarse para testar si las quinasas están involucradas en la patología y, si es así, para servir como puntos de partida para el desarrollo farmacéutico. Por ejemplo, cinco tirosina-quinasas que están involucradas en la estimulación del crecimiento celular o en la regulación de la respuesta inflamatoria son src, lck, fyn, Zap70 y yes. Cada quinasa tiene sustratos que están identificados parcialmente, como péptidos cortos que contienen una tirosina. Algunas de las especificidades de quinasas se superponen de tal manera que diferentes quinasas pueden fosforilar algunos péptidos igualmente, pero otros preferentemente. Para las cinco quinasas, se seleccionan 36 sustratos peptídicos que exhiben un espectro de especificidades específicas y solapantes.

Se utilizan cien placas de 96 pocillos; cada pocillo comprende 36 anclas oligonucleotídicos genéricos. Se preparan 36 enlazadores para convertir la red genérica de oligonucleótidos (con anclas solamente) en redes que comprenden sustratos peptídicos. Los 36 sustratos peptídicos se sintetizan y cada uno se fija covalentemente por un enlace amídico, por ejemplo, a un oligonucleótido que contiene un grupo amino 5'. Los oligonucleótidos contienen secuencias que se hibridan específicamente a los anclas. Los enlazadores péptido/oligo se autoensamblan en la superficie por adición de los mismos a todos los pocillos de las placas MAPS.

Para el cribado, se añaden las 5 quinasas a concentraciones apropiadas (de tal modo que las tasas de fosforilación de los sustratos están equilibradas en el mayor grado posible) a cada pocillo junto con uno de 8.800 compuestos diferentes a testar. Los compuestos se testan respecto a su aptitud para inhibir directamente las enzimas aisladas. La cantidad de fosforilación de cada péptido comprendido en la red se detecta por adición de anticuerpos marcados que se fijan únicamente a péptidos que están fosforilados en la tirosina. Cualesquiera pocillos que exhiban una reducción en algunos de los puntos de fosfotirosina pero no en la totalidad de los puntos son interesantes. Los compuestos que se habían añadido a dichos pocillos pueden testarse ulteriormente como posibles inhibidores selectivos de algunas de las quinasas testadas.

El esquema del ensayo se muestra en el panel superior de la Figura 17. Se prepara una molécula enlazadora quimérica en la cual un oligonucleótido de 25 pares de bases complementario a uno de los anclas está reticulado a un sustrato peptídico de una enzima tirosina-fosfoquinasa. El sustrato quimérico oligo-péptido se autoensambla en una red de anclas oligonucleotídicos, utilizándose la enzima quinasa para fosforilar la porción peptídica de la quimera, y después de dejar que transcurra la reacción enzimática, se determina la cantidad de fosforilación del péptido por anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-fosfoserina con un fluoróforo o enzima de detección fijado.

Los resultados del ensayo se muestran en el panel inferior. Se utilizó el reticulador homobifuncional, DSS (Pierce), para fijar el grupo amino 5' de un enlazador oligonucleotídico al término N de un péptido sintetizado con una tirosina fosforilada. La secuencia del péptido en el código de una sola letra era: TSEPQpYQPGENL (SEQ ID 32), donde pY representa fosfotirosina. La quimera se utilizó luego directamente o se llevó primeramente a pH 14 durante 60 minutos a fin de hidrolizar parcialmente el grupo fosfato de la tirosina. Las moléculas quiméricas fosforiladas o parcialmente desfosforiladas se autoensamblaron en moléculas de ancla complementarias dentro de una placa MAPS a las concentraciones que se muestran durante 1 hora. Después de lavado y bloqueo de los pocillos con 0,3% de BSA en SSPTP, se añadió anticuerpo antifosfotirosina reticulado a HRP (anticuerpo 4G10 de Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) a una dilución 1:3000 en SSPTP durante 1 hora, y la cantidad de anticuerpo fijada se detectó con el sustrato de quimioluminiscencia, Super Signal Blaze. La imagen representada se guardó en la red CCD durante 1 minuto. Como era de esperar, se observó una diferencia en la cantidad de fosfato fijada al oligo-péptido. Esta diferencia constituye la base de un ensayo que mide el grado de actividad que puede exhibir una serie de quinasas cuando se trata con diferentes inhibidores posibles.

Ejemplo 19 Un ensayo de fijación para la detección de inhibidores selectivos de la interacción entre los dominios SH2 y péptidos fosforilados

Los dominios SH2 sirven como subunidades de acoplamiento de algunas proteínas reguladoras del crecimiento. Los dominios se fijan a fosfotirosina que contiene proteínas o péptidos con especificidad imperfecta. Es decir, algunos péptidos de fosfotirosina se fijan específicamente a una o a un pequeño número de proteínas SH2, mientras que otros se fijan extensamente a muchas proteínas SH2.

Para este ensayo, los enlazadores son péptidos fosforilados unidos covalentemente a oligonucleótidos. Los restos peptídicos se seleccionan en cuanto a su capacidad para fijarse a un grupo de proteínas SH2 seleccionadas. Los enlazadores convierten las placas genéricas MAPS a placas con ligandos específicos para el grupo de proteínas SH2. Se generan cien placas MAPS de 96 pocillos que llevan los ligandos. Se aíslan las proteínas y se marcan con, por ejemplo, una molécula fluorescente cy5.

Con objeto de realizar un cribado respecto a inhibidores de la interacción dominio SH2/fosfopéptido, se añade el grupo de proteínas SH2 marcadas a cada pocillo de las cien placas MAPS de 96 pocillos, y se añade a cada pocillo un compuesto de test diferente. De este modo se testa el efecto de cada compuesto individualmente en cuanto a la interacción de las proteínas SH2 con sus ligandos fosfopeptídicos. El ensayo tiene por objeto medir la fluorescencia de la proteína SH2 fijada asociada con cada enlazador peptídico fijado a la superficie. Para cada pocillo que muestra fluorescencia reducida en algunos puntos pero no en todos los puntos, el compuesto añadido puede testarse adicionalmente como un inhibidor selectivo supuesto del acoplamiento de SH2.

Ejemplo 20 Cribado de Alta Capacidad (véase la Figura 22)

Se muestra una placa MAPS de alta capacidad que demuestra la detección de la señal de 96 pocillos en un solo experimento. La hibridación al mismo oligonucleótido se midió con 16 réplicas en 80 pocillos. Como se muestra, la reproducibilidad de los 1280 ensayos de hibridación era muy alta. Las columnas situadas más a la izquierda y más a la derecha sirvieron como controles para estandarizar la señal para concentraciones diferentes del oligonucleótido.

De manera similar, pueden testarse 16 oligonucleótidos diferentes en cada pocillo, y el test puede repetirse en los 80 pocillos diferentes de la placa. Por supuesto, puede ensayarse un número mayor aún de oligonucleótidos diferentes u otras sondas (v.g., 100 sondas nucleotídicas) en cada pocillo, y pueden testarse muchas placas simultáneamente (v.g., 100 placas, tales como placas de microtitulación de 96 pocillos). El gran número de ensayos que pueden realizarse sobre cada muestra (v.g., en el último caso, aproximadamente 100 ensayos diferentes) y el gran número de muestras que pueden ensayarse simultáneamente (v.g., en el último caso, aproximadamente 96 x 100, o sea 9600 muestras diferentes) proporciona una capacidad muy alta.

<110> Felder, Stephen

\hskip1cm Kris, Richard

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<120> SISTEMA DE ENSAYO DE ALTA CAPACIDAD

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<130> NEOGEN-1-PO

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<140> PCT/US9/27191

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<141> 1998-12-21

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/068,291

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<151> 1997-12-19

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/109,076

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<151> 1998-07-02

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<160> 32

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ancla

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<400> 1

\hskip0,5cm6

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<210> 2

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<211> 60

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

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<400> 2

\hskip0,5cm7

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<210> 3

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<211> 60

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<212> DNA

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<213> murino

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<220>

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<223> mimético de RNA

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<220>

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<223> C-jun

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<400> 3

\hskip0,5cm8

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<210> 4

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido detector

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<400> 4

\hskip0,5cm9

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<210> 5

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ancla

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<400> 5

\hskip0,5cm10

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<210> 6

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<211> 50

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

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<400> 6

\hskip0,5cm11

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<210> 7

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<211> 60

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<212> DNA

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<213> murino

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<220>

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<223> mimético de RNA

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<220>

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<223> MIP-2

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<400> 7

\hskip0,5cm12

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<210> 8

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido detector

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<400> 8

\hskip0,5cm13

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<210> 9

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: ancla

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<400> 9

\hskip0,5cm14

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<210> 10

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<211> 50

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

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<400> 10

\hskip0,5cm15

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<210> 11

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<211> 60

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<212> DNA

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<213> murino

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<220>

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<223> mimético de RNA

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<220>

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<223> GAPDH

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<400>11

\hskip0,5cm16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido detector

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip0,5cm17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ancla

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip0,5cm18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip0,5cm19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mimético de RNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip0,5cm20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido detector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip0,5cm21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ancla

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip0,5cm22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip0,5cm23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ancla

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip0,5cm24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip0,5cm25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ancla

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip0,5cm26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip0,5cm27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip0,5cm28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip0,5cm29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ancla

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip0,5cm30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip0,5cm31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de protección

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complementario a mRNA antisentido de ratón para GAPDH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip0,5cm32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido detector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip0,5cm33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: enlazador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip0,5cm34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de protección

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complementario a mRNA antisentido de ratón para GAPDH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip0,5cm35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido detector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip0,5cm36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 6 es fosfotirosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido fosforilado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,5cm37

Claims

1. Un método de detección de al menos una diana de ácido nucleico, que comprende

(a): poner en contacto una muestra que puede comprender dicha o dichas dianas de ácido nucleico con uno o más fragmentos de protección contra las nucleasas específico(s) para y que se fijan a dicha o dichas dianas de ácido nucleico en condiciones eficaces para que dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleares se fijen a dicha o dichas dianas de ácido nucleico,

(b): exponer la muestra resultante a una nucleasa eficaz para digerir los ácidos nucleicos monocatenarios remanentes,

(c): poner en contacto la muestra resultante con una combinación que comprende, antes de la adición de dicha muestra,

(i): una superficie que comprende regiones múltiples espacialmente discretas, al menos dos de las cuales son sustancialmente idénticas, comprendiendo cada región

(ii): al menos dos anclas diferentes, cada uno en asociación con

(iii): un enlazador bifuncional, que tiene una primera porción que es específica para el ancla y una segunda porción que comprende una sonda que es específica para dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleasas;

: en condiciones eficaces para que dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleasas se fijen a dicha combinación,

(d): detectar dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleasas fijados,

en donde dichos fragmentos de protección contra las nucleasas, anclas y enlazadores bifuncionales son oligonucleótidos.

2. Un método para detectar al menos una diana de ácido nucleico, que comprende

(a): poner en contacto una muestra que puede comprender dicha o dichas dianas de ácido nucleico con uno o más fragmentos de protección contra las nucleasas específico(s) para y que se fija a dicha o dichas dianas de ácido nucleico, formando de este modo un dúplex fragmento de protección contra las nucleasas/diana de ácido nucleico,

(ii): al menos dos anclas diferentes, cada uno en asociación con

(iii): un enlazador bifuncional, que tiene una primera porción que es específica para el ancla y una segunda porción que comprende una sonda que es específica para dicha diana de ácido nucleico

: en condiciones eficaces para hibridación,

(d): detectar dicho dúplex fijado,

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, que comprende adicionalmente, después del paso (c)

(a): poner en contacto dicha combinación y cualquier o cualesquiera fragmentos de protección contra las nucleasas fijados o cualquier dúplex fijado con al menos una molécula, que comprende un primer resto específico para uno de dicho o dichos fragmentos o dúplex de protección contra las nucleasas y un segundo resto específico para un reactivo informador común,

(b): poner en contacto dicha o dichas moléculas con dicho o dichos reactivos informadores comunes, y

(c): detectar dicho o dichos fragmentos o dúplex de protección contra las nucleasas fijados por detección de dicho o dichos reactivos informadores comunes.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho reactivo informador está marcado.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho reactivo informador es un polinucleótido marcado o anticuerpo marcado.

6. El método de la reivindicación 4 ó 5, en donde dicho reactivo informador produce una señal quimioluminiscente o fluorescente.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde cada región comprende al menos 4 anclas oligonucleotídicos diferentes, preferiblemente al menos 8 anclas oligonucleotídicos diferentes y más preferiblemente al menos 64 anclas oligonucleotídicos diferentes.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la superficie comprende al menos 96 a 1536 regiones sustancialmente idénticas y espacialmente discretas.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la superficie comprende hasta 1536 regiones sustancialmente idénticas y espacialmente discretas, y en donde cada reacción comprende 8 a 100 anclas oligonucleotídicos diferentes.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la superficie comprende 8, 96 ó 384 regiones sustancialmente idénticas y espacialmente discretas, y en donde cada región comprende 8 a 100 anclas oligonucleotídicos diferentes.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde cada sonda es específica para un fragmento o dúplex de protección contra las nucleasas diferente.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dichas regiones se subdividen ulteriormente en subregiones más pequeñas.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde cada una de dichas regiones es un pocillo de una placa de microtitulación.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dichos anclas son oligonucleótidos de 30 a 50 nucleótidos de longitud.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde una o más regiones comprenden adicionalmente controles para eficiencia o especificidad de hibridación, o controles para la capacidad de un locus para fijar la diana.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende adicionalmente

(a): someter la muestra que comprende una o más dianas de ácido nucleico fijadas a uno o más fragmentos de protección contra las nucleasas a tratamiento con una o más nucleasas a fin de destruir sustancialmente todo el ácido nucleico excepto el o los fragmentos de protección contra las nucleasas que se han hibridado al o a los ácidos nucleicos de interés, y

(b): eliminar el material de ácido nucleico distinto de dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleasas que se han hibridado a dicho o dichos ácidos nucleicos de interés, para proporcionar una muestra que contiene el o los fragmentos de protección contra las nucleasas.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que identifica un patrón de expresión de RNA, en donde al menos dos de dichos fragmentos de protección contra las nucleasas son específicos para moléculas de RNA diferentes.

18. Uso del método de la reivindicación 17 para identificar un agente que modula un patrón de expresión de RNA, que comprende adicionalmente comparar el patrón de expresión de RNA producido en presencia de dicho agente con el patrón de expresión de RNA producido en una serie de condiciones diferentes.

19. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para identificar un agente que modula la interacción de dicho o dichos fragmentos o dúplex de protección contra las nucleasas con dicha o dichas sondas.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o el uso de la reivindicación 18 ó 19, en donde dicho fragmento de protección contra las nucleasas es DNA.

21. El método o uso de la reivindicación 20, en donde el DNA se amplifica antes de poner dicha muestra que comprende dicho o dichos fragmentos de protección contra las nucleasas en contacto con dicha combinación, preferiblemente por amplificación PCR.

22. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en donde dicha diana de ácido nucleico comprende un polimorfismo.

23. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde el método es un método de alta capacidad.

24. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende adicionalmente eliminar dichos enlazadores bifuncionales de dichos anclas oligonucleotídicos y reemplazar los mismos con enlazadores sustancialmente idénticos o con enlazadores bifuncionales diferentes, reprogramando de este modo dichas superficies, y repetir dicho método de detección de una diana de ácido nucleico.

25. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde dicha muestra se genera por incubación o crecimiento de células que pueden contener dicha o dichas dianas de ácido nucleico y extracción de los ácidos nucleicos de las células.

26. Uso de un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 ó 20 a 25 para identificar un agente que modula un patrón de expresión génica asociado con un estado fisiológico o estado de desarrollo particular.

27. Uso de un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 ó 20 a 25 en un test de diagnóstico para distinguir entre una condición normal y una condición enferma, que se caracteriza por una variante diferencial de corte y empalme.

28. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde al menos una de dichas dianas de ácido nucleico es una molécula de DNA o una molécula de RNA.

29. El método o uso de la reivindicación 28, en donde al menos uno de dichos fragmentos de protección contra las nucleasas es específico para una molécula de DNA.

30. El método o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde dichas dianas de ácido nucleico son moléculas de DNA.

31. Un kit útil para la detección de al menos una diana de ácido nucleico en una muestra que comprende,

(a): al menos un fragmento de protección contra las nucleasas específico para dicho o dichos ácidos nucleicos, pero no para cualquiera de los anclas oligonucleotídicos en dicho kit;

(b): una superficie, que comprende regiones múltiples espacialmente discretas, al menos dos de las cuales son sustancialmente idénticas, comprendiendo cada región al menos dos anclas oligonucleotídicos diferentes, y

(c): un recipiente que comprende al menos una molécula enlazadora bifuncional, que tiene una primera porción específica para al menos uno de dichos anclas oligonucleotídicos y una segunda porción que comprende una sonda que es específica para, y se fija en dicha detección a, al menos uno de dichos fragmentos de protección contra las nucleasas.

32. El kit de la reivindicación 31, que comprende adicionalmente una o más nucleasas eficaces para la digestión de dicho ácido nucleico monocatenario y/o la cadena de RNA de un dúplex DNA/RNA.

33. Un kit útil para la detección de al menos una diana de ácido nucleico en una muestra, que comprende

(a): una superficie, que comprende regiones múltiples espacialmente discretas, al menos dos de las cuales son sustancialmente idénticas, comprendiendo cada región al menos dos anclas oligonucleotídicos diferentes,

(b): un recipiente que comprende al menos una molécula enlazadora bifuncional, que tiene una primera porción específica para una de dichas anclas oligonucleotídicas y una segunda porción que comprende una sonda que es específica para un fragmento de protección contra las nucleasas que es específico para uno de dichos ácidos nucleicos, y

(c): una o más nucleasas eficaces para digerir el ácido nucleico monocatenario y/o la cadena de RNA de un dúplex DNA/RNA.