ES2308759T3 - Receptores acoplados a proteina g humanos huerfanos. - Google Patents
Receptores acoplados a proteina g humanos huerfanos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2308759T3 ES2308759T3 ES07008841T ES07008841T ES2308759T3 ES 2308759 T3 ES2308759 T3 ES 2308759T3 ES 07008841 T ES07008841 T ES 07008841T ES 07008841 T ES07008841 T ES 07008841T ES 2308759 T3 ES2308759 T3 ES 2308759T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- receptor
- protein
- dna
- homo sapiens
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Método de rastreo de compuestos candidatos para identificar un agente farmacéutico para una enfermedad o estado de desorden relacionado con el páncreas, el método comprendiendo: proporcionar una membrana de una célula que expresa un receptor acoplado a proteína G que es una versión activa independiente de ligando de un receptor que tiene la SEQ ID NO: 8, donde el receptor acoplado a proteína G se acopla a una proteína G; y rastrear compuestos candidatos contra dicho receptor acoplado a proteína G.
Description
Receptores acoplados a proteína G humanos
huérfanos.
La invención descrita en este documento de
patente se relaciona con los receptores transmembrana, y más
particularmente con los receptores acoplados a proteína G humanos,
huérfanos, endógenos, ("GPCRs", G
protein-coupled receptors). La presente invención
se relaciona sólo con Rup3; se tratan otros GPCRs solamente de
referencia.
Aunque existen varias clases de receptores en
los humanos, con diferencia la más abundante y terapéuticamente
relevante es la representada por los receptores acoplados a proteína
G (GPCR o GPCRs). Se estima que hay unos 100.000 genes en el genoma
humano, y de estos, aproximadamente el 2%, o 2.000 genes, se estima
que codifican para GPCRs. Los receptores, incluyendo los GPCRs,
para los cuales ha sido identificado su ligando endógeno son
referidos como receptores "conocidos", mientras que los
receptores para los cuales no se ha identificado el ligando
endógeno son referidos como receptores "huérfanos". Los GPCRs
representan una importante área para el desarrollo de productos
farmacéuticos: a partir de aproximadamente 20 de los 100 GPCRs
conocidos se han desarrollado el 60% de todos los fármacos de
prescripción. Esta distinción no es sólo semántica, particularmente
en el caso de los GPCRs. Así, los GPCRs huérfanos son a la
industria farmacéutica lo que fue el oro para California a finales
del siglo XIX-una oportunidad de crecimiento,
expansión, mejora y desarrollo.
Los GPCRs comparten un motivo estructural común.
Todos estos receptores tienen siete secuencias de entre 22 y 24
aminoácidos hidrofóbicos que forman siete hélices alfa, cada una de
las cuales atraviesa la membrana (cada región transmembrana se
identifica con un número, es decir, transmembrana-1
(TM-1), transmembrana-2
(TM-2), etc.). Las hélices transmembrana están
unidas mediante cadenas de aminoácidos entre la
transmembrana-2 y la
transmembrana-3, la transmembrana-4
y la transmembrana-5, y la
transmembrana-6 y la transmembrana-7
en el exterior, o lado "extracelular", de la membrana celular
(llamadas regiones "extracelulares" 1, 2 y 3
(EC-1, EC-2 y
EC-3), respectivamente). Las hélices transmembrana
también están unidas por cadenas de aminoácidos entre la
transmembrana-1 y la
transmembrana-2, la transmembrana-3
y la transmembrana-4, y la
transmembrana-5 y la
transmembrana-6 en el interior, o lado
"intracelular", de la membrana celular (llamadas regiones
"intracelulares" 1, 2 y 3 (IC-1,
IC-2 y IC-3) respectivamente). El
"carboxi" ("C") terminal del receptor se localiza en el
espacio intracelular en la célula, y el "amino" ("N")
terminal del receptor se localiza en el espacio extracelular fuera
de la célula.
Generalmente, cuando un ligando endógeno se une
con el receptor (a menudo referido como "activación" del
receptor), hay un cambio en la conformación de la región
intracelular que permite el acoplamiento entre la región
intracelular y una "proteína-G" intracelular.
Se ha descrito que los GPCRs son "promiscuos" respecto a las
proteínas G, es decir, que un GPCR puede interactuar con más de una
proteína G. Ver, Kenakin, T., 43 Life Sciences 1095
(1988). Aunque existen otras proteínas G, actualmente, Gq, Gs, Gi y
Go son proteínas G que han sido identificadas. El acoplamiento de
GPCR activado por ligando endógeno con la proteína G, inicia un
proceso en cascada de señalización (llamado "transducción de
señal"). Bajo condiciones normales, la transducción de señal
resulta en último término en la activación celular o la inhibición
celular. Se piensa que el bucle IC-3, así como el
carboxi terminal del receptor interactúan con la proteína G.
Bajo condiciones fisiológicas, los GPCRs existen
en la membrana celular en equilibrio entre 2 conformaciones
diferentes: un estado "inactivo" y un estado "activo". Un
receptor en un estado inactivo es incapaz de enlazar el circuito de
transducción de señal intracelular para producir una respuesta
biológica. Cambiando la conformación del receptor al estado activo
se permite el enlace al circuito de transducción (vía la proteína G)
y se produce una respuesta biológica. Un receptor puede
estabilizarse en un estado activo mediante un ligando endógeno o un
compuesto tal como un fármaco.
La presente invención proporciona un método de
rastreo de compuestos candidatos para identificar un agente
farmacéutico para una enfermedad o estado de desorden relacionado
con el páncreas, el método comprendiendo:
- proporcionar una membrana de una célula que expresa un receptor acoplado a proteína G que es una versión activa independiente de ligando de un receptor que tiene la SEQ ID NO: 8, donde el receptor acoplado a proteína G se acopla a una proteína G; y
- rastrear compuestos candidatos contra dicho receptor acoplado a proteína G.
Las Figuras 1A y 1B proporcionan "tablas"
de referencia para ciertos dot-blots proporcionados
aquí (ver también, Figuras 2A y 2B, respectivamente).
Las Figuras 2A y 2B proporcionan reproducciones
de los resultados de ciertos análisis de dot-blot
resultantes de hCHN3 y hCHN8, respectivamente (ver también,
Figuras 1A y 1B, respectivamente).
La Figura 3 proporciona una reproducción de los
resultados del análisis de hRUP3 por RT-PCR.
La Figura 4 proporciona una reproducción de los
resultados del análisis de hRUP4 por RT-PCR.
La Figura 5 proporciona una reproducción de los
resultados del análisis de hRUP6 por RT-PCR.
La literatura científica que se ha desarrollado
en torno a receptores ha adoptado un número de términos para
referirse a ligandos con diferentes efectos sobre los receptores.
Para la claridad y consistencia, se usarán las siguientes
definiciones a lo largo de este documento de patente. En el caso de
que estas definiciones entren en conflicto con otras definiciones
para estos términos, las siguientes definiciones prevalecerán:
Las Abreviaturas de aminoácidos usadas
aquí se definen en la Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Composición significa un material que
comprende al menos un componente.
Endógeno significará un material que un
mamífero produce naturalmente. Por ejemplo, y sin ser una
limitación, Endógeno en relación al término "receptor",
significará aquél que es producido naturalmente por un mamífero
(por ejemplo, y sin ser una limitación, un humano) o un virus. En
contraste, el término No endógeno en este contexto
significará aquél que no es producido naturalmente por un mamífero
(por ejemplo, y sin ser una limitación, un humano) o un virus.
Célula hospedadora significará una célula
capaz de tener incorporado un Plásmido y/o un Vector en su interior.
En el caso de una Célula Hospedadora procariota, un Plásmido se
replica típicamente como una molécula autónoma mientras la Célula
Hospedadora se replica (generalmente, el Plásmido se aísla entonces
para su introducción en una Célula Hospedadora eucariota); en el
caso de una Célula Hospedadora eucariota, un Plásmido se integra en
el ADN celular de la Célula Hospedadora de manera que cuando la
Célula Hospedadora se replica, se replica el Plásmido. La Célula
Hospedadora puede ser eucariota, más preferiblemente, de mamífero, y
más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en las
células 293, 293T y COS-7.
Ligando significará una molécula de
origen natural, endógena, específica para un receptor de origen
natural y endógeno.
Receptor no huérfano significará una
molécula de origen natural, endógena, específica para un ligando de
origen natural y endógeno, en el que la unión de un ligando a un
receptor activa un circuito de señalización intracelular.
Receptor huérfano significará un receptor
endógeno para el cual el ligando endógeno específico para ese
receptor no ha sido identificado o no es conocido.
Plásmido significará la combinación de un
Vector y ADNc. Generalmente, un Plásmido es introducido en una
Célula Hospedadora con el propósito de la replicación y/o la
expresión del ADNc como una proteína.
Vector, en referencia a ADNc, significará
un ADN circular capaz de incorporar al menos un ADNc y capaz de
incorporarse en una Célula Hospedadora.
El orden de las siguientes secciones está
pensado para una mejor eficiencia en la descripción y no se
pretende, ni debe interpretarse, como una limitación en la
descripción o en las reivindicaciones que le siguen.
Los esfuerzos del proyecto Genoma Humano han
llevado a la identificación de una plétora de información respecto
a secuencias de ácido nucleico localizadas en el genoma humano; en
este esfuerzo se ha dado el caso de que la información de secuencia
genética se ha hecho disponible sin una comprensión o reconocimiento
de si alguna secuencia genómica en particular contiene o podría
contener información de marco abierto de lectura que traduzca
proteínas humanas o no. Varios métodos de identificación de
secuencias de ácido nucleico dentro del genoma humano están dentro
del ámbito de conocimiento de aquéllos expertos en la materia. Por
ejemplo, y sin suponer una limitación, una variedad de GPRCs,
descritos aquí, fueron descubiertos revisando la base de datos
GenBank^{TM}, mientras que otros GPRCs fueron descubiertos usando
una secuencia de ácido nucleico de un GPRC, previamente
secuenciado, para llevar a cabo una búsqueda BLAST^{TM} en la base
de datos EST. La Tabla A, a continuación, lista los GPRCs huérfanos
endógenos, descritos con un GPCR homólogo respectivo de GPCR:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La homología del receptor es útil en términos de
conseguir una apreciación del papel de los receptores descritos en
el cuerpo humano. Adicionalmente, esta homología puede proporcionar
ideas de posibles ligando(s) endógenos que puedan ser
activadores naturales para los GPRCs huérfanos descritos.
Las técnicas se han vuelto más fácilmente
accesibles durante los últimos años para la identificación de
ligandos endógenos (esto, en principio, con el propósito de
proporcionar una manera de llevar a cabo ensayos de unión de
receptor que requieren un ligando endógeno del receptor) porque el
estudio tradicional de receptores siempre se ha basado en el
supuesto a priori (basado históricamente) de que el ligando
endógeno debe ser identificado en primer lugar antes de que el
descubrimiento pueda continuar buscando antagonistas y otras
moléculas que puedan afectar al receptor. Incluso en casos donde un
antagonista pudiera ser conocido previamente, la búsqueda se
extendería inmediatamente a buscar el ligando endógeno. Este modo de
pensar ha perdurado en la investigación de receptores incluso
después del descubrimiento de receptores activados
constitutivamente. Lo que no había sido reconocido hasta ahora es
que es el estado activado del receptor el más útil para el
descubrimiento de agonistas, agonistas parciales y agonistas
inversos del receptor. Para aquellas enfermedades que resultan de
un receptor demasiado activado o de un receptor infraactivado, lo
deseado en un fármaco terapéutico es un compuesto que actúe
reduciendo el estado activo del receptor o aumentando la actividad
del receptor, respectivamente, no necesariamente un fármaco que sea
un antagonista del ligando endógeno. Esto es debido a que un
compuesto que reduce o aumenta la actividad del estado activo del
receptor no necesita unirse en el mismo sitio que el ligando
endógeno. Así, como enseña un método de esta invención, cualquier
búsqueda de compuestos terapéuticos debería comenzar rastreando
compuestos contra el estado activo independiente de ligando.
Como es conocido en el estado de la técnica, los
GPCRs pueden ser "activos" en su estado endógeno incluso sin
la unión del ligando endógeno del receptor. Tales receptores
naturalmente activos pueden ser probados para identificación
directa (es decir, sin la necesidad del ligando endógeno del
receptor) de, en particular, agonistas inversos. Alternativamente,
el receptor puede ser "activado" vía, por ejemplo, mutación del
receptor para establecer una versión no endógena del receptor que
será activa en ausencia del ligando endógeno del receptor.
Rastreando compuestos candidatos contra una
versión endógena o no endógena activada constitutivamente de los
GPCRs humanos huérfanos descritos aquí, se pueden proporcionar para
la identificación directa de compuestos candidatos que actúan en
este receptor de la superficie celular, sin necesitar el uso del
ligando endógeno del receptor. Mediante la determinación de las
áreas del cuerpo donde se expresa y/o se sobreexpresa la versión
endógena de los GPCRs humanos descritos aquí, es posible determinar
estados de enfermedad/desórden relacionados que estén asociados con
la expresión y/o sobreexpresión del receptor; en este documento de
patente se describe una aproximación a ello.
En relación a la creación de una mutación que
pueda probar la activación constitutiva de los GPCRs humanos
huérfanos descritos aquí, se basa en la distancia del residuo de
prolina donde se presume que está localizada dentro del TM6 del
GPCR típicamente cercano a la interfaz TM6/IC3 (tal residuo de
prolina parece estar bastante conservado). Mutando el residuo de
aminoácido localizado a 16 residuos de este residuo (presumiblemente
localizado en la región IC3 del receptor) a, preferiblemente, un
residuo de lisina, se puede obtener tal activación. Otros residuos
de aminoácido pueden ser útiles en la mutación de esta posición para
conseguir este objetivo.
Preferiblemente, la secuencia de ADN del GPCR
humano huérfano se puede usar para hacer una sonda para (a)
análisis dot-blot contra ARNm tisular, y/o (b)
identificación por RT-PCR de la expresión del
receptor en muestras de tejido. La presencia de un receptor en un
tejido, o en un tejido enfermo, o la presencia del receptor en
concentraciones elevadas en tejido enfermo comparado con un tejido
normal, puede ser preferiblemente utilizada para identificar una
correlación con un régimen de tratamiento, incluyendo pero no
limitado a, una enfermedad asociada a esa enfermedad. Mediante esta
técnica los receptores pueden igualmente ser localizados en
regiones de órganos. Basándose en las funciones conocidas de los
tejidos específicos donde el receptor está localizado, se puede
deducir el rol funcional putativo del receptor.
Cuando un receptor de proteína G se vuelve
constitutivamente activo (es decir, activo en ausencia de unión con
ligando endógeno), se une a una proteína G (por ejemplo, Gq, Gs, Gi,
Go) y estimula la unión de GTP a la proteína G. Entonces la
proteína G actúa como una GTPasa e hidroliza lentamente el GTP a
GDP, por lo cual el receptor, bajo condiciones normales, queda
desactivado. Sin embargo, los receptores activados constitutivamente
continúan cambiando GDP a GTP. Un análogo no hidrolizable de GTP,
[^{35}S]GTP\gammaS, puede usarse para monitorizar
uniones mejoradas a membranas que expresan receptores activados
constitutivamente. Se ha descrito que [^{35}S]GTP\gammaS
puede ser usado para monitorizar acoplamiento de proteína G a
membranas en ausencia y presencia de ligando. Un ejemplo de esta
monitorización, entre otros ejemplos bien conocidos y disponibles
para los expertos en la materia, fue descrito por Traynor y Nahorski
en 1995. El uso preferido de este sistema de ensayo es para el
rastreo inicial de compuestos candidatos ya que el sistema es
genéricamente aplicable a todos los receptores acoplados a proteína
G, cual sea la proteína G en particular que interacciona con el
dominio intracelular del receptor.
Una vez los compuestos candidatos están
identificados usando el ensayo "genérico" de receptores
acoplados a proteína G (es decir, un ensayo para seleccionar
compuestos que son agonistas, agonistas parciales, o agonistas
inversos), es preferible rastrear más para confirmar que los
compuestos han interactuado en el sitio del receptor. Por ejemplo,
un compuesto identificado mediante el ensayo "genérico" podría
no unirse con el receptor, pero en cambio podría simplemente
"desacoplar" la proteína G del dominio intracelular.
Gs estimula la enzima adenilil ciclasa. Gi (y
Go), al contrario, inhiben esta enzima. La adenilil ciclasa
cataliza la conversión de ATP en AMPc; así, los GPCRs activados
constitutivamente que acoplan la proteína Gs están asociados a
niveles celulares incrementados de AMPc. Por otra parte, GPCRs
activados constitutivamente que acoplan la proteína Gi (o Go) están
asociados a niveles celulares reducidos de AMPc. Ver, en
general, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission,"
Chpt. 8, From Neuron To Brain (3ª Ed.) Nichols, J.G. et
al eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). De esta manera, se
pueden utilizar ensayos que detectan AMPc para determinar si un
compuesto candidato es, por ejemplo, un agonista inverso al receptor
(es decir,un compuesto así descendería los niveles de AMPc). Se
pueden utilizar varias aproximaciones para medir AMPc conocidas en
el estado de la técnica; una aproximación más preferida radica en
el uso de anticuerpos antiAMPc en un formato basado en ELISA. Otro
tipo de ensayo que puede ser utilizado es un ensayo de sistema de
detección de segundo mensajero de la célula entera. Los promotores
en los genes dirigen la expresión de las proteínas que un gen en
particular codifica. El AMP cíclico dirige la expresión génica
promoviendo la unión de una proteína de unión a ADN sensible a AMPc
o un factor de trascripción (CREB) que se une al promotor en sitios
específicos llamados elementos de respuesta a AMPc, y lleva a la
expresión del gen. Se pueden construir sistemas de detección que
tengan un promotor que contenga múltiples elementos de respuesta a
AMPc antes del gen de detección, p. ej.,
\beta-galactosidasa o luciferasa. Así, un
receptor activado constitutivamente unido a Gs causa la acumulación
de AMPc, el cual activa el gen y la expresión de la proteína de
detección. De esta manera, la proteína de detección como la
\beta-galactosidasa o la luciferasa pueden ser
detectadas usando ensayos bioquímicos estándares (Chen et
al. 1995).
Gq y Go están asociadas a la activación de la
enzima fosfolipasa C, que, a su vez, hidroliza al fosfolípido
PIP_{2}, liberando dos mensajeros intracelulares: diacicloglicerol
(DAG) e inistol 1,4,5-trifosfato (IP_{3}). La
acumulación creciente de IP_{3} está asociada a la activación de
los receptores asociados a Gq y Go. Ver, en general,
"Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Chpt. 8,
From Neuron To Brain (3ª Ed.) Nichols, J.G. et al
eds. Sinauer Associates, inc. (1992). Los ensayos que detectan la
acumulación de IP_{3} pueden ser utilizados para determinar si un
compuesto candidato es, p. ej., un agonista inverso de un receptor
asociado a Gq o Go (es decir, un compuesto así disminuiría los
niveles de IP_{3}). Los receptores asociados a Gq también pueden
ser examinados utilizando un ensayo de detección AP1 en el cual la
fosfolipasa C dependiente de Gq provoca la activación de genes que
contienen elementos AP1; así, los receptores asociados a Gq
activados provocarán un aumento en la expresión de dichos genes,
por lo que los agonistas inversos provocarán un descenso de tal
expresión, y los agonistas provocarán un aumento de tal expresión.
Se encuentran disponibles comercialmente ensayos para tal
detección.
El uso de un GPCR endógeno huérfano activado
constitutivamente, o de un GPCR no endógeno huérfano activado
constitutivamente, para el rastreo de compuestos candidatos para la
identificación directa de agonistas inversos, agonistas y agonistas
parciales tiene la dificultad única de que, por definición, el
receptor sea activo incluso en ausencia de unión con un ligando
endógeno. Así, a menudo es útil utilizar una aproximación que mejore
la señal obtenida por el receptor activado. Una aproximación
preferida es el uso de una Proteína de Fusión GPCR.
En general, una vez se determina que un GPCR
está o ha estado constitutivamente activado, utilizando las
técnicas de ensayo descritas anteriormente (así como otras), es
posible determinar la proteína G predominante que se acopla con el
GPCR endógeno. El acoplamiento de la proteína G al GPCR proporciona
un circuito de señalización que puede ser analizado. Debido que es
más preferido que el rastreo se lleve a cabo usando un sistema de
expresión mamífero, se espera que tal sistema tenga proteína G
endógena. De esta manera, por definición, en un sistema así, el
GPCR huérfano activado constitutivamente dará señal continuamente.
En relación a esto, es preferido que esta señal sea mejorada, de
manera que en presencia de, p. ej., un agonista inverso al receptor,
es más probable que permita diferenciar más fácilmente,
particularmente en el contexto de rastreo, entre el receptor cuando
está en contacto con el agonista inverso.
Se pretende que la Proteína de Fusión GPCR
mejore la eficacia del acoplamiento de la proteína G con el GPCR.
La Proteína de Fusión GPCR se prefiere para rastreos con un GPCR no
endógeno activado constitutivamente, ya que esa aproximación
incrementa la señal que se utiliza más preferentemente en este tipo
de técnicas de rastreo, aunque la Proteína de Fusión GPCR también
puede ser (y preferiblemente lo es) utilizada con un GPCR endógeno
activado constitutivamente. Esto es importante para dar una relación
"señal-ruido" significativa; tal relación
significativa es preferible para el rastreo de los compuestos
candidatos como se describe aquí.
La realización de una construcción útil para la
expresión de una Proteína de Fusión GPCR está dentro del ámbito del
experto en la materia. Los vectores de expresión y sistemas
disponibles comercialmente ofrecen una variedad de aproximaciones
que se pueden ajustar a las necesidades particulares de un
investigador. El criterio de importancia para tal construcción de
una Proteínas de Fusión GPCR es que la secuencia del GPCR y la
secuencia de la proteína G sean ambas de marco interno
(preferentemente, la secuencia para el GPCR esta más arriba
(upstream) de la secuencia de la proteína G) y que el codón de
"terminación" del GPCR debe ser eliminado o sustituido de tal
manera que tras la expresión del GPCR, la proteína G también pueda
ser expresada. El GPCR puede estar enlazado directamente a la
proteína G, o pueden haber residuos espaciadores entre los dos
(preferiblemente, no más de unos 12, aunque este número puede ser
fácilmente determinado por el experto en la materia). Tenemos una
preferencia (basada en la conveniencia) del uso de un espaciador en
algunos de aquellos sitios de restricción que no son usados
efectivamente y que bajo expresión se convierten en espaciadores.
Más preferiblemente, la proteína G que se acopla al GPCR habrá sido
identificada previamente a la creación de la construcción de la
Proteína de Fusión GPCR. Ya que sólo unas pocas proteínas G han sido
identificadas, es preferible que una construcción que comprende la
secuencia de la proteína G (es decir, una construcción de proteína
G universal) sea válida para la inserción de una secuencia de un
GPCR endógeno; esto proporciona eficiencia en el contexto de
rastreos a gran escala de varios GPCRs diferentes con
diferentes
secuencias.
secuencias.
Un uso preferido de los GPCRs humanos huérfanos
descritos aquí puede ser para la identificación directa de
compuestos candidatos como agonistas inversos, agonistas, o
agonistas parciales (preferiblemente para uso como agentes
farmacéuticos). Estas versiones de GPCRs humanos también pueden ser
utilizadas en investigación. Por ejemplo, sistemas in vitro
e in vivo que incorporen GPCRs pueden utilizarse tanto para
descubrir además y comprender el papel que estos receptores juegan
en la condición humana, sana o patológica, como para entender el
papel de la activación constitutiva como aplica en la cascada de
señalización. El valor de los GPCRs humanos huérfanos es que su
utilidad como herramienta de investigación se puede mejorar
determinando la localización(es) de esos receptores en el
cuerpo, los GPCRs se pueden usar para entender el papel de estos
receptores en el cuerpo humano antes de que se identifique el
ligando endógeno. Otros usos de los receptores descritos serán
evidentes para los expertos en la materia basándose en, inter
alia, el análisis de este documento de patente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se presentan con el
propósito de aclarar, y no limitar, la presente invención y para
proporcionar información de referencia. Aunque se describen
secuencias específicas de ácido nucleico y aminoácido, se considera
al experto en la materia con la capacidad de hacer pequeñas
modificaciones a estas secuencias mientras consiga los mismos
resultados u otros sustancialmente similares a los proporcionados a
continuación. Excepto cuando se especifica lo contrario, todas las
secuencias de ácido nucleico para los GPCRs humanos huérfanos
endógenos han sido secuenciadas y verificadas. En relación a
receptores equivalentes, el experto en la materia apreciará
fácilmente que pueden llevarse a cabo sustituciones conservativas a
las secuencias descritas con el objetivo de obtener receptores
funcionalmente equivalentes.
Varios de los GPCRs humanos endógenos descritos
fueron identificados en base a la revisión de la información de la
base de datos GenBank. Buscando en la base de datos, fueron
identificados los siguientes clones de ADNc según se describe a
continuación:
Otros GPCRs humanos endógenos fueron
identificados mediante una búsqueda BLAST de la base de datos EST
(dbest), utilizando los siguientes clones EST como secuencias de
búsqueda. Fueron identificados los siguientes clones EST y usados a
continuación como sonda para rastrear una librería genómica
humana.
Se usó el clon EST de ratón 1179426 para obtener
un clon genómico humano que contuviera las tres secuencias
codificantes de aminoácidos hG2A. El extremo 5' de esta secuencia
codificante se obtuvo mediante 5'RACE^{TM}, y el molde para PCR
fue ADNc de bazo humano Marathon-ready^{TM} de
Clontech. El G2A humano descrito se amplificó mediante PCR
utilizando, durante el primer y segundo ciclo de PCR, los cebadores
específicos para ADNc de G2A como se muestran en las SEQ.ID.NO.: 39
y SEQ.ID.NO.: 40 :
5'-CTGTGTACAGCAGTTCGCAGAGTG-3'
(SEQ.ID.NO.: 39; 1^{r} ciclo PCR)
5'-GAGTGCCAGGCAGAGCAGGTAGAC-3'
(SEQ.ID.NO.: 40; 2º ciclo PCR). La PCR se llevó a cabo usando el
kit Advantage^{TM} GC Polymerase (Clontech; se seguirán las
instrucciones de fabricación), a 94ºC durante 30 seg. seguido de 5
ciclos a 94ºC durante 5 seg. y 72ºC durante 4 min.; y 30 ciclos a
94º durante 5 seg. y 70º durante 4 min. Se purificó un fragmento de
aproximadamente 1,3 kb mediante gel de agarosa, se digirió con Hind
III y Xba I y se clonó en el vector de expresión pRC/CMV2
(Invitrogen). El inserto clonado se secuenció mediante el kit T7
Sequenase^{TM} (USB Amersham; se seguirán las instrucciones del
fabricante) y la secuencia se comparó con la secuencia presentada.
Se detectará la expresión de G2A humano sondeando un
dot-blot de ARN (Clontech; se seguirán las
instrucciones del fabricante) con el fragmento marcado con
P^{32}.
La secuenciación del clon EST 1541536 indicó que
hCHN9 es un clon parcial de ADNc que sólo tiene un codón de
iniciación; es decir, el codón de terminación se perdió. Cuando se
utilizó hCHN9 para lanzarlo contra la base de datos (nr), la
secuencia 3' de hCHN9 fue 100% homóloga a la región 5' no traducida
del ADNc del receptor luecotrieno B4, que contenía un codón de
terminación en el marco con secuencia codificante de hCHN9. Para
determinar si la región 5' no traducida del ADNc de LTB4R era la
secuencia 3' de hCHN9, se realizó un PCR usando cebadores basados
en la secuencia 5' que flanquea el codón de iniciación encontrado en
hCHN9 y la secuencia 3' alrededor del codón de terminación
encontrado en la región 5' no traducida de LTB4R. La secuencia del
cebador 5' fue la siguiente:
La PCR se realizó usando ADNc de timo como molde
y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema tampón proporcionado
por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada
uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de ciclado fueron 30
ciclos a 94ºC durante 1 min., 65ºC durante 1 min. y 72ºC durante 1
min. y 10 seg. De la PCR se obtuvo un fragmento de 1,1 kb coherente
con el tamaño esperado. Este fragmento de PCR se subclonó en pCMV
(ver a continuación) y se secuenció (ver, SEQ.ID.NO.:
33).
Se clonó la longitud total de hRUP4 mediante
RT-PCR con ADNc de cerebro humano (Clontech) como
molde:
La PCR se realizó usando TaqPlus^{TM}
Precision^{TM} polimerasa (Stratagene; se seguirán las
instrucciones de fabricación) con los siguientes ciclos: 94ºC
durante 2 min.; 94ºC 30 seg.; 55ºC durante 30 seg., 72ºC durante 45
seg., y 72ºC durante 10 min. Los ciclos del 2 al 4 se repitieron 30
veces.
Los productos de PCR se separaron en un gel de
agarosa al 1% y se aisló un fragmento de PCR de 500 pb que fue
clonado en el vector pCRII-TOPO (Invitrogen) y
secuenciado mediante el kit T7 DNA Sequenase^{TM} (Amsham) y los
cebadores SP6/T7 (Stratagene). El análisis de la secuencia reveló
que el fragmento de PCR era de hecho una forma de AI307658
empalmada alternativamente que tenía un marco abierto de lectura
continuo con similitud a otros GPRCs. La secuencia completa de este
fragmento de PCR era la siguiente:
Basándose en la secuencia anterior, se
utilizaron como cebadores dos conjuntos de oligonucleótidos
sentido, con las siguientes secuencias:
y dos conjuntos de oligonucleótidos
antisentido, con las secuencias
siguientes:
para la PCR 3'- y 5- RACE con ADNc
de cerebro humano Marathon-Ready^{TM} (Clontech,
Cat# 7400-1) como molde, según las instrucciones
del fabricante. Los fragmentos de ADN generados por la RACE PCR se
clonaron en el vector pCRII-TOPO^{TM}
(Invitrogen) y se secuenciaron utilizando los cebadores SP6/T7
(Stratagene) y algunos cebadores internos. El producto 3' RACE
contenía una cola poli(A) y un marco abierto de lectura
completo finalizando en un codón de terminación TAA. El producto 5'
RACE contenía un final 5' incompleto; es decir, el codón de
iniciación ATG no estaba
presente.
Basándose en la nueva secuencia 5', el oligo 3 y
el siguiente cebador:
fueron utilizados para un segundo
proceso 5' RACE PCR y los productos de PCR se analizaron como antes.
Un tercer proceso de 5' RACE PCR se llevó a cabo usando los
cebadores
antisentido:
La secuencia de los productos 5' RACE PCR reveló
la presencia del codón de iniciación ATG, y un proceso más de 5'
RACE PCR no generó más secuencia 5'. La secuencia 5' completada se
confirmó por RT-PCR utilizando el cebador sentido
5'-GCAATGCAGGCGCTTAACATTAC-3'
(SEQ.ID.NO.: 53; oligo 8) y oligo 4 como cebadores y el análisis de
secuencia del producto de PCR de 650 pb generado a partir de moldes
de ADNc de corazón y cerebro humano (Clontech, Cat#
7404-1). La secuencia 3' completada fue confirmada
mediante RT-PCR utilizando oligo 2 y el siguiente
cebador antisentido:
y el análisis de secuencia del
producto de PCR de 670 pb generado a partir de moldes de ADNc de
cerebro y corazón humano (Clontech, Cat#
7404-1).
La longitud total de hRUP5 se clonó mediante
RT-PCR usando un cebador sentido más arriba,
upstream, de ATG, el codón de iniciación (SEQ.ID.NO.: 55), y un
cebador antisentido que contenía TCA como codón de terminación
(SEQ.ID:NO.: 56), el cual tenía las siguientes secuencias:
y un ADNc de leucocito periférico
humano (Clontech) como molde. Para la amplificación se usó Advantage
cDNA polimerasa (Clontech) en una reacción de 50 \muL mediante
los siguientes ciclos, repitiendo 30 veces desde el paso 2 al 4:
94ºC durante 30 seg.; 94ºC durante 15 seg.; 69º durante 40 seg.;
72ºC durante 3 min.; 72ºC durante 6 min. Se aisló un fragmento de
PCR de 1,4 kb, se clonó con el vector
pCRII-TOPO^{TM} (Invitrogen) y se secuenció
completamente utilizando el kit T7 ADN Sequenase^{TM} (Amsham).
Ver, SEQ.ID.NO.:
9
La longitud total de hRUP6 se clonó mediante
RT-PCR utilizando los cebadores:
y ADNc de timo humano
Marathon-Ready^{TM} (Clontech) como molde. Para la
amplificación se usó Advantage cDNA polimerasa (Clontech, de
acuerdo con las instrucciones del fabricante) en una reacción de 50
\mul con los siguientes ciclos: 94ºC durante 30 seg.; 94ºC
durante 5 seg.; 66ºC durante 40 seg.; 72ºC durante 2,5 seg. y 72ºC
durante 7 min. Los ciclos del 2 hasta el 4 se repitieron 30 veces.
Se aisló un fragmento de PCR de 1,3 kb y se clonó en el vector
pCRII-TOPO^{TM} (Invitrogen) y se secuenció
completamente (ver, SEQ.ID.NO.: 11) utilizando el kit ABI
Big Dye Terminator^{TM} (P.E.
Biosystem).
La longitud total de hRUP7 se clonó mediante
RT-PCR usando los cebadores:
y ADNc de leucocito periférico
humano (Clontech) como molde. Para la amplificación se usó
Advantage^{TM} cDNA polimerasa (Clontech) en una reacción de 50
\mul con los siguientes ciclos, repitiendo 30 veces desde el paso
2 al 4: 94ºC durante 2 min.; 94ºC durante 15 seg.; 60ºC durante 20
seg.; 72ºC durante 2 min.; 72ºC durante 10 min. Se aisló un
fragmento de PCR de 1,25 kb y se clonó en el vector
pCRII-TOPO^{TM} (Invitrogen) y se secuenció
completamente utilizando el kit ABI Big Dye Terminator^{TM} (P.E.
Biosystem). Ver, SEQ.ID.NO.:
13.
La longitud total de hARE-5 se
clonó mediante PCR utilizando los cebadores específicos para hARE5
5'-CAGCG
CAGGGTGAAGCCTGAGAGC-3' SEQ.ID.NO.: 69 (sentido, 5' del codón de iniciación ATG) y 5'-GGCACCTGCT
GTGACCTGTGCAGG-3' SEQ.ID.NO.: 70 (antisentido, 3' del codón de terminación TGA) y ADN genómico humano como molde. Para la amplificación se usó TaqPlus Precision^{TM} DNA polimerasa (Stratagene) con el siguientes ciclos, con los pasos de 2 a 4 repetidos 35 veces: 96ºC, 2 minutos; 96ºC, 20 segundos; 58ºC, 30 segundos; 72ºC, 2 minutos; y 72ºC, 10 minutos.
CAGGGTGAAGCCTGAGAGC-3' SEQ.ID.NO.: 69 (sentido, 5' del codón de iniciación ATG) y 5'-GGCACCTGCT
GTGACCTGTGCAGG-3' SEQ.ID.NO.: 70 (antisentido, 3' del codón de terminación TGA) y ADN genómico humano como molde. Para la amplificación se usó TaqPlus Precision^{TM} DNA polimerasa (Stratagene) con el siguientes ciclos, con los pasos de 2 a 4 repetidos 35 veces: 96ºC, 2 minutos; 96ºC, 20 segundos; 58ºC, 30 segundos; 72ºC, 2 minutos; y 72ºC, 10 minutos.
Se aisló un fragmento de PCR de 1,1 kb del
tamaño predicho y se clonó en el vector
pCRII-TOPO^{TM} (Invitrogen) y se secuenció
completamente (SEQ.ID.NO.: 5) utilizando el kit T7 DNA
Sequenase^{TM} (Amsham).
La longitud total de hARE-4 se
clonó mediante PCR utilizando los cebadores específicos de
hARE-4 5'-CTGGTG
TGCTCCATGGCATCCC-3' SEQ.ID.NO.: 67 (sentido, 5' del codón de iniciación ATG) y 5'-GTAAGCCTCCCA
GAACGAGAGG-3' SEQ.ID.NO.: 68 (antisentido, 3' del codón de terminación TGA) y ADN genómico humano como molde. Para la amplificación se usó Taq DNA polimerasa (Stratagene) y 5% DMSO mediante los siguientes ciclos, con los pasos de 2 al paso 3 repetidos 35 veces: 94ºC, 3 minutos; 94ºC, 30 segundos; 59ºC, 2 minutos; 72ºC, 10 minutos.
TGCTCCATGGCATCCC-3' SEQ.ID.NO.: 67 (sentido, 5' del codón de iniciación ATG) y 5'-GTAAGCCTCCCA
GAACGAGAGG-3' SEQ.ID.NO.: 68 (antisentido, 3' del codón de terminación TGA) y ADN genómico humano como molde. Para la amplificación se usó Taq DNA polimerasa (Stratagene) y 5% DMSO mediante los siguientes ciclos, con los pasos de 2 al paso 3 repetidos 35 veces: 94ºC, 3 minutos; 94ºC, 30 segundos; 59ºC, 2 minutos; 72ºC, 10 minutos.
Se aisló un fragmento PCR de 1,12 kb del tamaño
predicho y se clonó en el vector pCRII-TOPO^{TM}
(Invitrogen) y se secuenció completamente (SEQ.ID.NO.: 3) utilizando
el kit T7 DNA Sequenase^{TM} (Amsham).
La longitud total de hARE-3 se
clonó mediante PCR utilizando los cebadores específicos de
hARE-3 5'-gat
caagcttCCATCCTACTGAAACCATGGTC-3' SEQ.ID.NO.: 65 (sentido, los nucleótidos en minúscula representan Hind III saliente, ATG como codón de iniciación) y 5'-gatcagatctCAGTTCCAATATTCACACCACCGTC-3'
SEQ.ID.NO.: 66 (antisentido, los nucleótidos en minúscula representan Xba I saliente, TCA como codón de terminación) y ADN genómico humano como molde. Para la amplificación se usó ADN polimerasa TaqPlus Precision^{TM} con los siguientes ciclos, los pasos del 2 al 4 repetidos 35 veces: 94ºC, 3 minutos; 94ºC, 1 minuto; 55ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos; 72ºC, 10 minutos.
caagcttCCATCCTACTGAAACCATGGTC-3' SEQ.ID.NO.: 65 (sentido, los nucleótidos en minúscula representan Hind III saliente, ATG como codón de iniciación) y 5'-gatcagatctCAGTTCCAATATTCACACCACCGTC-3'
SEQ.ID.NO.: 66 (antisentido, los nucleótidos en minúscula representan Xba I saliente, TCA como codón de terminación) y ADN genómico humano como molde. Para la amplificación se usó ADN polimerasa TaqPlus Precision^{TM} con los siguientes ciclos, los pasos del 2 al 4 repetidos 35 veces: 94ºC, 3 minutos; 94ºC, 1 minuto; 55ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos; 72ºC, 10 minutos.
Se aisló un fragmento PCR de 1,3 kb del tamaño
predicho, se digirió con Hind III y Xba I, se clonó en el vector
pRC/CMV2 (Invitrogen) en los sitios Hind III y Xba I y se secuenció
completamente (SEQ.ID.NO.: 1) utilizando el kit T7 DNA
Sequenase^{TM} (Amsham).
La longitud total de hRUP3 se clonó mediante PCR
utilizando los cebadores específicos de hRUP3
5'-GTCCTGC
CACTTCGAGACATGG-3' SEQ.ID.NO.: 71 (sentido, ATG como codón de iniciación) y 5'-GAAACTTCTCTGCC
CTTACCGTC-3' SEQ.ID.NO.: 72 (antisentido, 3' del codón de terminación TAA) y ADN genómico humano como molde. Para la amplificación se usó TaqPlus Precision^{TM} DNA polimerasa (Stratagene) mediante los siguientes ciclos, los pasos del 2 al 4 repetidos 35 veces: 94ºC, 3 minutos; 94ºC, 1 minuto; 58ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos;72ºC, 10 minutos.
CACTTCGAGACATGG-3' SEQ.ID.NO.: 71 (sentido, ATG como codón de iniciación) y 5'-GAAACTTCTCTGCC
CTTACCGTC-3' SEQ.ID.NO.: 72 (antisentido, 3' del codón de terminación TAA) y ADN genómico humano como molde. Para la amplificación se usó TaqPlus Precision^{TM} DNA polimerasa (Stratagene) mediante los siguientes ciclos, los pasos del 2 al 4 repetidos 35 veces: 94ºC, 3 minutos; 94ºC, 1 minuto; 58ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos;72ºC, 10 minutos.
Se aisló un fragmento PCR de 1,0 kb del tamaño
predicho y se clonó en el vector pCRII-TOPO^{TM}
(Invitrogen) y se secuenció completamente (SEQ.ID.NO.: 7)
utilizando el kit T7 DNA Sequenase^{TM} (Amsham).
Aunque está disponible una variedad de células
para la expresión de proteínas, es más preferible que se utilizen
células mamíferas. La razón principal para ello es práctica, es
decir, la utilización de, p.ej., células de levadura para la
expresión de un GPCR, cuando es posible, introduce en el protocolo
una célula no mamífera la cual puede no (de hecho, en el caso de
levadura, no lo hace) incluir el acoplamiento de receptor, el
mecanismo genético y las rutas de secreción que han evolucionado en
sistemas mamíferos - así, los resultados obtenidos en células no
mamíferas, respecto al uso potencial, no son tan preferidos como
aquéllos obtenidos a partir células mamíferas. De las células
mamíferas, las células COS-7, 293 y 293T son
particularmente preferidas, aunque la célula mamífera específica
utilizada puede ser predicha en base a las necesidades particulares
del artesano. El procedimiento general para la expresión de los
GPCRs descritos es como sigue.
En el día uno, se cultivaron en placa 1X10^{7}
células 293T por placa de 150 mm. En el día dos, se prepararán dos
tubos de reacción (las proporciones a seguir para cada tubo son por
placa): el tubo A se preparará mezclando 20 \mug de ADN (p. ej.,
vector pCMV; vector pCMV con ADNc de receptor, etc.) en 1,2 ml de
DMEM libre de suero (Irvine Scientific, Irvine, CA); el tubo B se
preparará mezclando 120 \mul de lipofectamine (Gibco BRL) en 1,2
ml de DMEM libre de suero. Los tubos A y B son mezclados mediante
inversiones (varias veces), seguido de incubación a temperatura
ambiente durante 30-45 min. La mezcla puede ser
referida como la "mezcla de transfección". Se lavan las
células cultivadas 293T con 1XPBS, seguido por la adición de 10 ml
de DMEM libre de suero. Se añadirán entonces a las células 2,4 ml
de la mezcla de transfección, seguido de incubación durante 4 h a
37ºC/5% de CO_{2}. Entonces, se eliminó por aspiración la mezcla
de transfección, seguido de la adición de 25 ml de DMEM/10% de
Suero Fetal Bovino. Entonces, las células serán incubadas a 37ºC/5%
de CO_{2}. Después de 72 h de incubación, las células entonces
pueden ser recolectadas y utilizadas para análisis.
Se pueden utilizar varias aproximaciones para la
determinación de la distribución tisular de los GPCRs aquí
descritos.
Usando un formato de dot-blot
para tejidos humanos disponible comercialmente, se sondearon GPCRs
huérfanos endógenos para una determinación de las áreas donde se
localizan tales receptores. Los fragmentos de ADNc de los GPCRs del
Ejemplo 1 (marcados radioactivamente) fueron (o pueden ser)
utilizados como sonda: la sonda marcada radioactivamente fue o
(puede ser) generada utilizando el ADNc completo del receptor
(escindido del vector) usando un kit Prime-It
II^{TM} Random Primer Labelling (Stratagene, #300385); según las
instrucciones del fabricante. Se hibridizó un RNA Master
Blot^{TM} humano (Clontech, #7770-1) con la sonda
marcada radioactivamente de GPCR humano endógeno y se lavó bajo
condiciones severas según instrucciones del fabricante. El blot se
expuso al Kodak BioMax^{TM} Autoradiography film durante la noche
a -80ºC. Los resultados están resumidos para varios receptores en
la Tabla B y C (ver Figuras 1 A y 1 B para una tabla
identificando los varios tejidos y sus localizaciones,
respectivamente). Se proporcionan dot-blots
ejemplares en la Figura 2A y 2B para resultados derivados usando
hCHN3 y hCHN8, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para averiguar la distribución tisular de ARNm
hRUP3, se realizó una RT-PCR usando cebadores
específicos para hRUP3 y paneles de ADNc de múltiples tejidos
humanos (MTC, Clonetech) como moldes. Se utilizó Taq DNA polimerasa
(Stratagene) para la reacción de PCR, utilizando los siguientes
ciclos de reacción en una reacción de 40 \mul: 94ºC durante 2
min.; 94ºC durante 15 seg.; 55ºC durante 30 seg.; 72ºC durante 1
min.; 72ºC durante 10 min. Los cebadores fueron como sigue:
Se cargaron 20 \mul de la reacción en un gel
de agarosa al 1%; los resultados se presentan en la Figura 3.
Como se soporta por los datos de la Figura 3, de
los 16 tejidos humanos del panel de ADNc utilizado (cerebro, colon,
corazón, riñón, ovario, páncreas, placenta, próstata, esqueleto,
intestino delgado, bazo, testículos, leucocito de timo, e hígado)
sólo en el páncreas se evidencia una banda simple hRUP3. Análisis
comparativos adicionales de la secuencia de proteínas de hRUP3 con
otros GPCRs sugieren que hRUP3 está relacionado con GPCRs que
tienen moléculas pequeñas como ligandos endógenos así que se predijo
que el ligando endógeno para hRUP3 es una molécula pequeña.
Se realizó una RT-PCR usando los
oligo 8 y 4 de hRUP4 como cebadores y los paneles de ADNc de
múltiples tejidos humanos (MTC, Clontech) como moldes. Para la
amplificación se usó Taq DNA polimerasa (Stratagene) en una
reacción de 40 \mul mediante los siguientes ciclos: 94ºC durante
30 segundos, 94ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos,
72ºC durante 2 minutos, y 72ºC durante 5 minutos con los ciclos del
2 al 4 repetidos 30 veces.
Para analizar los productos
RT-PCR se cargaron 20 \mul de la reacción en un
gel de agarosa al 1%, y se encontró ARNm de hRUP4 expresado en
muchos tejidos humanos, con la expresión más fuerte en corazón y
riñón. (ver, Figura 4). Para confirmar la autenticidad de los
fragmentos de PCR, se usó como sonda para el análisis Southern Blot
un fragmento de 300 pb derivado del extremo 5' de hRUP4. La sonda se
marcó con ^{32}P-dCTP usando el kit
Prime-It II^{TM} Random Primer Labeling
(Stratagene) y se purificó utilizando las microcolumnas
ProbeQuant^{TM} G-50 (Amersham). La hibridación se
hizo durante la noche a 42ºC después de 12 horas de prehibridación.
Finalmente, se lavó el blot a 65ºC con 0,1 x SCC. El Southern blot
confirmó los fragmentos de PCR como hRUP4.
Se realizó una RT-PCR usando los
siguientes cebadores específicos para hRUP5:
y los paneles de ADNc de múltiples
tejidos humanos (MTC, Clontech) como moldes. Para la amplificación
se usó Taq DNA polimerasa (Stratagene) en una reacción de 40 \mul
mediante los siguientes ciclos: 94ºC durante 30 segundos, 94ºC
durante 10 segundos, 62ºC durante 1,5 minutos, 72ºC durante 5
minutos, y con los ciclos del 2 al 3 repetidos 30 veces. Se
cargaron 20 \mul de la reacción en un gel de agarosa al 1,5% para
analizar los productos de RT-PCR, y el ARNm hRUP5
se encontró expresado sólo en los leucocitos de sangre periférica
(datos no
facilitados).
Se aplicó RT-PCR para confirmar
la expresión y para determinar la distribución tisular de hRUP6. Los
oligonucleótidos usados, basados en un alineamiento de los
segmentos AC005871 y GPR66, tenían las siguientes secuencias:
y se utilizaron los paneles de ADNc
de múltiples tejidos humanos (MTC, Clontech) como
moldes.
La PCR se realizó utilizando TaqPlus
Precision^{TM} polimerasa (Stratagene; se seguirán las
instrucciodes de fabricación) en una reacción de 40 \mul mediante
los siguientes ciclos: 94ºC durante 30 segundos, 94ºC durante 5
segundos, 66ºC durante 40 segundos, 72ºC durante 2,5 minutos, y 72ºC
durante 7 min. Los ciclos del 2 al 4 se repitieron 30 veces.
Se cargaron 20 \mul de la reacción en un gel
de agarosa al 1,2% para analizar los productos de
RT-PCR, y un fragmento específico de ADN de 760 pb
que representaba hRUP6 se expresó predominantemente en el timo y
con menos expresión en el corazón, riñón, pulmón, próstata,
intestino delgado y testículos. (ver, Figura 5).
Aunque está disponible una variedad de Vectores
para aquéllos en la materia, con el objetivo de la utilización para
GPCRs humanos, tanto endógenos como no endógenos, es más preferido
que el Vector utilizado sea pCMV. Este vector se depositó con la
Colección de Cultivos Tipo Americana (American Type to Culture
Collection, ATCC) el 13 de Octubre de 1998 (10801 University Blvd.,
Manassas, VA 20110-2209 USA) bajo las condiciones
del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en
Materia de Patentes. El ADN fue probado por la ATCC y determinado el
serlo. La ATCC ha asignado el siguiente número de depósito a pCMV:
ATCC #203351.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo para la comodidad del lector. No forma parte del
documento de patente europea. Aunque se ha puesto atención en
compilar las referencias, no se puede excluir que haya errores u
omisiones y la EPO deniega toda responsabilidad respecto a esta
cuestión.
- \bullet EP 05003040 A [0058]
- \bullet US 60137131 B [0058]
- \bullet EP 99972682 A [0058]
- \bullet US 60141448 B [0058]
- \bullet US 9923687 W [0058]
- \bullet US 60156653 B [0058]
- \bullet US 60109213 B [0058]
- \bullet US 60156333 B [0058]
- \bullet US 60120416 B [0058]
- \bullet US 60156555 B [0058]
- \bullet US 60121852 B [0058]
- \bullet US 60156634 B [0058]
- \bullet US 60123946 B [0058]
- \bullet US 60157280 B [0058]
- \bullet US 60123949 B [0058]
- \bullet US 60157294 B [0058]
- \bullet US 60136436 B [0058]
- \bullet US 60157281 B [0058]
- \bullet US 60136437 B [0058]
- \bullet US 60157293 B [0058]
- \bullet US 60136439 B [0058]
- \bullet US 60157282 B [0058]
- \bullet US 60136567 B [0058]
- \bullet US 09417044 B [0058]
- \bullet US 60137127 B [0058]
- \bullet US 09416760 B [0058]
\bulletKENAKIN, T. Life
Sciences, 1988, vol. 43, 1095 [0004]
\bullet Indirect Mechanism of Synaptic
Transmission. From Neuron To Brain. Sinauer Associates, Inc,
1992 [0019] [0020]
<110> Arena Pharmaceuticals, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Receptores acoplados a Proteína G
humanos huérfanos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> JEC/FP6461016
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Divisional de EP 05003040.2
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 1999 10 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 05003040.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 99972682.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US99/23687
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/109,213
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1998 11 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/120,416
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 02 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/121,852
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 02 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/123,946
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 03 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/123,949
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 03 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/136,436
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 05 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/136,437
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 05 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/136,439
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 05 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/136,567
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 05 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/137,127
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 05 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/137,131
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 05 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/141,448
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 06 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/156,653
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 09 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/156,333
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 09 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/156,555
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 09 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/156,634
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 09 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/157,280
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/157,294
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/157,281
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/157,293
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/157,282
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/417,044
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/416,760
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999 10 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentin Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1.3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1008
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1413
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 468
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1173
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 390
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1002
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1122
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1053
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1080
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1503
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1029
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1077
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1005
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1296
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 431
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (13)
1. Método de rastreo de compuestos candidatos
para identificar un agente farmacéutico para una enfermedad o
estado de desorden relacionado con el páncreas, el método
comprendiendo:
- proporcionar una membrana de una célula que expresa un receptor acoplado a proteína G que es una versión activa independiente de ligando de un receptor que tiene la SEQ ID NO: 8, donde el receptor acoplado a proteína G se acopla a una proteína G; y
- rastrear compuestos candidatos contra dicho receptor acoplado a proteína G.
2. Método de la reivindicación 1, donde la
célula es una célula hospedadora eucariota.
3. Método de la reivindicación 2, donde la
célula es una célula hospedadora de mamífero o una célula
hospedadora de levadura.
4. Método de cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, donde dicho rastreo comprende detectar AMPc.
5. Método de la reivindicación 4, donde dicha
detección de AMPc comprende ELISA utilizando un anticuerpo
anti-AMPc.
6. Método de cualquiera de las reivindicaciones
1-3, donde el rastreo comprende utilizar
[^{35}S]GTP\gammaS para monitorizar proteína G acoplada
a una membrana que comprende el receptor acoplado a proteína G.
7. Método de cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, donde el método comprende identificar un agonista del
receptor acoplado a proteína G.
8. Método de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, donde el método comprende identificar un agonista parcial
del receptor acoplado a proteína G.
9. Método de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, donde el método comprende identificar un agonista inverso
del receptor acoplado a proteína G.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, donde el método además comprende confirmar
que el compuesto candidato se une al receptor.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10, donde el método además comprende formular
dicho agonista, agonista parcial o agonista inverso como un
fármaco.
12. Método de cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, donde el receptor es un receptor endógeno que tiene la
SEQ ID NO: 8.
13. Método de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 11, donde dicho receptor es un receptor no endógeno que tiene
una mutación localizada 16 residuos de aminoácido
N-terminal desde el residuo conservado de prolina
dentro del dominio TM6 de la SEQ ID NO: 8.
Applications Claiming Priority (46)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10921398P | 1998-11-20 | 1998-11-20 | |
| US109213P | 1998-11-20 | ||
| US12041699P | 1999-02-16 | 1999-02-16 | |
| US120416P | 1999-02-16 | ||
| US12185299P | 1999-02-26 | 1999-02-26 | |
| US121852P | 1999-02-26 | ||
| US12394699P | 1999-03-12 | 1999-03-12 | |
| US12394999P | 1999-03-12 | 1999-03-12 | |
| US123949P | 1999-03-12 | ||
| US123946P | 1999-03-12 | ||
| US13643799P | 1999-05-28 | 1999-05-28 | |
| US13713199P | 1999-05-28 | 1999-05-28 | |
| US13712799P | 1999-05-28 | 1999-05-28 | |
| US13643699P | 1999-05-28 | 1999-05-28 | |
| US13656799P | 1999-05-28 | 1999-05-28 | |
| US13643999P | 1999-05-28 | 1999-05-28 | |
| US136436P | 1999-05-28 | ||
| US136439P | 1999-05-28 | ||
| US137131P | 1999-05-28 | ||
| US136437P | 1999-05-28 | ||
| US136567P | 1999-05-28 | ||
| US137127P | 1999-05-28 | ||
| US14144899P | 1999-06-29 | 1999-06-29 | |
| US141448P | 1999-06-29 | ||
| US15663399P | 1999-09-29 | 1999-09-29 | |
| US15655599P | 1999-09-29 | 1999-09-29 | |
| US15663499P | 1999-09-29 | 1999-09-29 | |
| US15665399P | 1999-09-29 | 1999-09-29 | |
| US156555P | 1999-09-29 | ||
| US156653P | 1999-09-29 | ||
| US156633P | 1999-09-29 | ||
| US156634P | 1999-09-29 | ||
| US15729399P | 1999-10-01 | 1999-10-01 | |
| US15728199P | 1999-10-01 | 1999-10-01 | |
| US15728099P | 1999-10-01 | 1999-10-01 | |
| US15728299P | 1999-10-01 | 1999-10-01 | |
| US15729499P | 1999-10-01 | 1999-10-01 | |
| US157293P | 1999-10-01 | ||
| US157280P | 1999-10-01 | ||
| US157281P | 1999-10-01 | ||
| US157282P | 1999-10-01 | ||
| US157294P | 1999-10-01 | ||
| US41676099A | 1999-10-12 | 1999-10-12 | |
| US41704499A | 1999-10-12 | 1999-10-12 | |
| US416760 | 1999-10-12 | ||
| US417044 | 1999-10-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2308759T3 true ES2308759T3 (es) | 2008-12-01 |
Family
ID=27586698
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05003040T Expired - Lifetime ES2289610T3 (es) | 1998-11-20 | 1999-10-13 | Receptor acoplado a proteina g humano huerfano rup3. |
| ES07008841T Expired - Lifetime ES2308759T3 (es) | 1998-11-20 | 1999-10-13 | Receptores acoplados a proteina g humanos huerfanos. |
| ES99972682T Expired - Lifetime ES2243095T3 (es) | 1998-11-20 | 1999-10-13 | Receptores acoplados a proteina g humanos huerfanos. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05003040T Expired - Lifetime ES2289610T3 (es) | 1998-11-20 | 1999-10-13 | Receptor acoplado a proteina g humano huerfano rup3. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99972682T Expired - Lifetime ES2243095T3 (es) | 1998-11-20 | 1999-10-13 | Receptores acoplados a proteina g humanos huerfanos. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (8) | EP1580271A3 (es) |
| JP (5) | JP2003534767A (es) |
| KR (5) | KR100926208B1 (es) |
| AT (3) | ATE301673T1 (es) |
| AU (2) | AU770056B2 (es) |
| CA (2) | CA2645717A1 (es) |
| DK (3) | DK1133559T3 (es) |
| ES (3) | ES2289610T3 (es) |
| IL (2) | IL142538A0 (es) |
| NZ (3) | NZ527622A (es) |
| PT (3) | PT1133559E (es) |
| WO (1) | WO2000031258A2 (es) |
Families Citing this family (92)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1690939B8 (en) | 1998-03-12 | 2010-10-13 | Astellas Pharma Inc. | Novel G protein-coupled receptor proteins |
| US6071722A (en) * | 1998-04-24 | 2000-06-06 | Smithkline Beecham Corporation | Nucleic acids encoding a G-protein coupled 7TM receptor (AXOR-1) |
| JP2002512780A (ja) * | 1998-04-24 | 2002-05-08 | スミスクライン ビーチャム コーポレーション | 新規７ｔｍ受容体ａｘｏｒ−２のクローニング |
| WO2000026339A2 (en) * | 1998-11-03 | 2000-05-11 | Smithkline Beecham Corporation | Axor14, a g-protein coupled receptor |
| USRE42190E1 (en) | 1998-11-20 | 2011-03-01 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Method of identifying a compound for inhibiting or stimulating human G protein-coupled receptors |
| US20030017528A1 (en) | 1998-11-20 | 2003-01-23 | Ruoping Chen | Human orphan G protein-coupled receptors |
| US7816492B2 (en) | 1998-11-20 | 2010-10-19 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Human G protein-coupled receptors |
| US6221660B1 (en) | 1999-02-22 | 2001-04-24 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding SNORF25 receptor |
| EP1157038A4 (en) * | 1999-02-26 | 2005-01-19 | Smithkline Beecham Corp | CLONING OF A P2Y-LIKE 7TM RECEPTOR (AXOR17) |
| US6620615B1 (en) * | 1999-04-23 | 2003-09-16 | Curagen Corporation | G-protein coupled receptor—encoding nucleic acids |
| EP1189944A4 (en) * | 1999-06-21 | 2002-09-11 | Smithkline Beecham Corp | AXOR16, R CEPTEUR COUPL UNE PROT INE G |
| JP2003504054A (ja) * | 1999-07-13 | 2003-02-04 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | Ｇ−タンパク質共役型受容体およびそのｄｎａ配列 |
| CA2381437A1 (en) * | 1999-07-30 | 2001-02-08 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | G-protein coupled receptor and dna sequences thereof |
| CA2382889A1 (en) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Takuya Watanabe | Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof |
| US6998255B1 (en) | 1999-09-24 | 2006-02-14 | Solvay Pharmaceuticals B.V. | Human G-protein coupled receptor |
| GB9923177D0 (en) * | 1999-09-30 | 1999-12-01 | Pfizer Ltd | Novel polypeptide |
| US6204017B1 (en) | 1999-10-07 | 2001-03-20 | Schering Corporation | Polynucleotide encoding a histamine receptor |
| GB9923890D0 (en) * | 1999-10-08 | 1999-12-08 | Pfizer Ltd | Novel polypeptide |
| GB9923893D0 (en) * | 1999-10-08 | 1999-12-08 | Pfizer Ltd | Novel polypeptide |
| GB9924960D0 (en) * | 1999-10-21 | 1999-12-22 | Pfizer Ltd | Novel polypeptide |
| GB9924956D0 (en) * | 1999-10-21 | 1999-12-22 | Pfizer Ltd | Novel polypeptide |
| AU1575601A (en) * | 1999-10-27 | 2001-05-08 | Pharmacia & Upjohn Company | G protein-coupled receptors expressed in brain |
| ATE375390T1 (de) * | 1999-10-29 | 2007-10-15 | Pfizer | G-protein-gekoppelter rezeptor-ähnliche proteine |
| WO2001032864A2 (en) * | 1999-11-03 | 2001-05-10 | Merck Patent Gmbh | Gpcr-kd5 polypeptides and dna sequences thereof |
| US6461836B1 (en) * | 1999-11-05 | 2002-10-08 | Smithkline Beecham Corporation | Molecular cloning of a 7TM receptor (AxOR34) and screening methods thereof |
| AU784543B2 (en) * | 1999-11-16 | 2006-04-27 | Pharmacia & Upjohn Company | Novel G protein-coupled receptors |
| US7029857B1 (en) | 1999-12-17 | 2006-04-18 | H. Lundbeck A/S | Processes for obtaining compounds employing SNORF72 receptors |
| WO2001046414A1 (fr) * | 1999-12-20 | 2001-06-28 | Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. | Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine de fixation de guanosine triphosphate, bg26 |
| AU2288601A (en) | 1999-12-23 | 2001-07-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | P2Y12 receptor |
| AU2230401A (en) * | 1999-12-28 | 2001-07-09 | Helix Research Institute | Novel guanosine triphosphate-binding protein-coupled receptors, genes thereof and production and use of the same |
| GB0001700D0 (en) * | 2000-01-25 | 2000-03-15 | Glaxo Group Ltd | Novel protein |
| DE60129933T2 (de) | 2000-02-04 | 2008-02-14 | Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. | Verfahren zum screening |
| EP1266005B1 (en) * | 2000-03-14 | 2007-03-07 | Bayer HealthCare AG | Regulation of human lipoxin a4 receptor-like protein |
| WO2001068844A2 (en) * | 2000-03-17 | 2001-09-20 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human leukotriene b4-like g protein-coupled receptor |
| US20030077709A1 (en) * | 2000-03-21 | 2003-04-24 | Masazumi Kamohara | Novel leukotriene B4 receptor |
| AU2001242800A1 (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-08 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof |
| WO2001073023A1 (fr) * | 2000-03-31 | 2001-10-04 | Helix Research Institute | Nouveau recepteur gprv53 couple a une proteine se liant a la guanosine-triphosphate, gene correspondant et procede de production et d'utilisation associe |
| WO2001077326A1 (fr) * | 2000-04-12 | 2001-10-18 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Proteine receptrice couplee a la proteine g et son adn |
| EP1178110A1 (en) * | 2000-08-01 | 2002-02-06 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | EDG8 receptor for sphingosine 1-phosphate , its preparation and use |
| EP1287133B1 (en) * | 2000-05-18 | 2006-12-13 | Bayer HealthCare AG | Regulation of human dopamine-like g protein-coupled receptor |
| WO2002000719A2 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-03 | Tularik Inc. | Human and mouse g-protein couipled receptors |
| WO2002000725A2 (en) * | 2000-06-26 | 2002-01-03 | Akzo Nobel N.V. | G-protein coupled receptor org10 |
| WO2002002599A2 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Ingenium Pharmaceuticals Ag | HUMAN G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR IGPcR17, AND USES THEROF |
| AU2001271838A1 (en) | 2000-07-06 | 2002-01-21 | Bayer Corporation | Human neuropeptide y-like g protein-coupled receptor |
| EP1311546A2 (en) * | 2000-08-09 | 2003-05-21 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Methods for using 14266, a human g protein-coupled receptor |
| US6790608B2 (en) | 2000-09-20 | 2004-09-14 | The Regents Of The University Of California | Methods of identifying and ADP-glucose receptor ligand, agonist or antagonist |
| AU2002210982A1 (en) | 2000-11-01 | 2002-05-15 | Yamanouchi Pharmaceutical Co..Ltd. | Method of screening antiplatelet |
| JP4178028B2 (ja) * | 2000-11-07 | 2008-11-12 | タケダ ケンブリッジ リミテッド | 受容体 |
| AU1989002A (en) * | 2000-11-27 | 2002-06-03 | Arena Pharm Inc | Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors |
| EP1338651B9 (en) | 2000-12-01 | 2007-05-09 | Astellas Pharma Inc. | Method of screening remedy for diabetes |
| AU2002246680A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-07-30 | University Of South Florida | Sphingosine 1-phosphate receptor gene, sppr |
| WO2002052047A2 (en) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Mergen Ltd. | Methods for identifying g-protein coupled receptors associated with diseases |
| GB0100782D0 (en) * | 2001-01-11 | 2001-02-21 | Glaxo Group Ltd | Assay |
| ES2311601T3 (es) * | 2001-04-25 | 2009-02-16 | Astellas Pharma Inc. | Receptores acoplado a proteina que se une a trifosfato de guanosina place 6002312 y su gen y produccion y uso del mismo. |
| US7858755B2 (en) | 2001-07-09 | 2010-12-28 | Euroscreen S.A. | Monoclonal antibodies that bind Chemerin polypeptide |
| US7419658B2 (en) | 2001-07-09 | 2008-09-02 | Euroscreen S.A. | Isolated ligand of ChemerinR |
| US20030096299A1 (en) | 2001-07-09 | 2003-05-22 | Valerie Wittamer | Natural ligand of G protein coupled receptor ChemR23 and uses thereof |
| US6946244B2 (en) | 2001-08-07 | 2005-09-20 | Euroscreen, S.A. | Methods of identifying a ligand, an agonist, and an antagonist of G protein coupled receptor GPR86 (P2Y13) |
| CN1324047C (zh) | 2002-04-12 | 2007-07-04 | 先灵公司 | G蛋白偶联受体的配体与方法 |
| AU2003261874A1 (en) * | 2002-09-02 | 2004-03-29 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Adrenocortical hormone secretion controller |
| JPWO2004033687A1 (ja) * | 2002-10-11 | 2006-02-09 | アステラス製薬株式会社 | 腎不全治療薬をスクリーニングする方法 |
| US7056685B1 (en) | 2002-11-05 | 2006-06-06 | Amgen Inc. | Receptor ligands and methods of modulating receptors |
| JP4516430B2 (ja) | 2002-12-20 | 2010-08-04 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | １−（アミノ）インダン並びに（１，２−ジヒドロ−３−アミノ）−ベンゾフラン、ベンゾチオフェン及びインドール |
| CA2512899A1 (en) | 2003-01-14 | 2004-08-05 | Arena Pharmaceuticals Inc. | 1,2,3-trisubstituted aryl and heteroaryl derivatives as modulators of metabolism and the prophylaxis and treatment of disorders related thereto such as diabetes and hyperglycemia |
| US7083933B1 (en) | 2003-05-09 | 2006-08-01 | Prosidion Limited | Methods for identification of modulators of OSGPR116 activity |
| US7524638B1 (en) | 2003-06-27 | 2009-04-28 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Methods for identification of modulators of OSGPR114 or OSGPR78 activity, and their use in the treatment of disease |
| CN1812803A (zh) * | 2003-06-27 | 2006-08-02 | 唐纳士公司 | 人类肥大细胞表达的膜蛋白 |
| DOP2006000008A (es) * | 2005-01-10 | 2006-08-31 | Arena Pharm Inc | Terapia combinada para el tratamiento de la diabetes y afecciones relacionadas y para el tratamiento de afecciones que mejoran mediante un incremento de la concentración sanguínea de glp-1 |
| GB0508990D0 (en) * | 2005-05-03 | 2005-06-08 | Novartis Ag | Organic compounds |
| EP1971862B1 (en) | 2006-04-11 | 2010-11-10 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using gpr119 receptor to identify compounds useful for increasing bone mass in an individual |
| US7638541B2 (en) | 2006-12-28 | 2009-12-29 | Metabolex Inc. | 5-ethyl-2-{4-[4-(4-tetrazol-1-yl-phenoxymethyl)-thiazol-2-yl]-piperidin-1-yl}-pyrimidine |
| BRPI0814294A2 (pt) | 2007-07-19 | 2015-02-03 | Metabolex Inc | Agonistas de receptor heterocíclico ligado a n para o tratamento do diabetes e de desordens metabólicas. |
| JP5465177B2 (ja) | 2007-09-20 | 2014-04-09 | アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | Ｇｐｒ１１９活性のモジュレーターとしての化合物および組成物 |
| EP2108960A1 (en) | 2008-04-07 | 2009-10-14 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using A G protein-coupled receptor to identify peptide YY (PYY) secretagogues and compounds useful in the treatment of conditons modulated by PYY |
| AR077642A1 (es) | 2009-07-09 | 2011-09-14 | Arena Pharm Inc | Moduladores del metabolismo y el tratamiento de trastornos relacionados con el mismo |
| US8410127B2 (en) | 2009-10-01 | 2013-04-02 | Metabolex, Inc. | Substituted tetrazol-1-yl-phenoxymethyl-thiazol-2-yl-piperidinyl-pyrimidine salts |
| US8791100B2 (en) | 2010-02-02 | 2014-07-29 | Novartis Ag | Aryl benzylamine compounds |
| JP2013523819A (ja) | 2010-04-06 | 2013-06-17 | アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | Ｇｐｒ１１９レセプターのモジュレーターおよびそれに関連する障害の処置 |
| BR112012032248A2 (pt) | 2010-06-23 | 2016-09-13 | Metabolex Inc | composições de 5-etil-2-{4-[-4(-4-tetrazol-1-il-fenoximetil)-tiazol-2-il]-piperidin-1-il}-pirimidina |
| CN103539791B (zh) | 2010-09-22 | 2017-01-11 | 艾尼纳制药公司 | Gpr119 受体调节剂和对与其相关的障碍的治疗 |
| US20140018371A1 (en) | 2011-04-01 | 2014-01-16 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Modulators Of The GPR119 Receptor And The Treatment Of Disorders Related Thereto |
| WO2012145361A1 (en) | 2011-04-19 | 2012-10-26 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto |
| WO2012145604A1 (en) | 2011-04-22 | 2012-10-26 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto |
| WO2012145603A1 (en) | 2011-04-22 | 2012-10-26 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto |
| WO2012170702A1 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto |
| WO2013055910A1 (en) | 2011-10-12 | 2013-04-18 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of the gpr119 receptor and the treatment of disorders related thereto |
| WO2014074668A1 (en) | 2012-11-08 | 2014-05-15 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of gpr119 and the treatment of disorders related thereto |
| CA3002540C (en) | 2015-01-06 | 2023-11-07 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Use of (r)-2-(7-(4-cyclopentyl-3-(trifluoromethyl)benzyloxy)-1,2,3,4-tetrahydrocyclopenta[b]indol-3-yl)acetic acid for treating conditions related to the s1p1 receptor |
| WO2016209809A1 (en) | 2015-06-22 | 2016-12-29 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Crystalline l-arginine salt of (r)-2-(7-(4-cyclopentyl-3-(trifluoromethyl)benzyloxy)-1,2,3,4-tetrahydrocyclo-penta[b]indol-3-yl)acetic acid(compound1) for use in sipi receptor-associated disorders |
| AU2017305392A1 (en) | 2016-08-03 | 2019-02-21 | Cymabay Therapeutics, Inc. | Oxymethylene aryl compounds for treating inflammatory gastrointestinal diseases or gastrointestinal conditions |
| MA49456A (fr) | 2017-06-19 | 2020-04-29 | Arena Pharm Inc | Composés et procédés pour le traitement de nafld et de nash |
| ES2987794T3 (es) | 2018-06-06 | 2024-11-18 | Arena Pharm Inc | Procedimientos de tratamiento de afecciones relacionadas con el receptor S1P1 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2237937A1 (en) * | 1995-11-15 | 1997-06-05 | Cor Therapeutics, Inc. | Novel purinergic receptor |
| WO1997024929A1 (en) * | 1996-01-11 | 1997-07-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Human g-protein coupled receptor |
| WO1998031810A2 (en) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | Schering Corporation | Mammalian chemokines; receptors; reagents; uses |
| US6221627B1 (en) * | 1997-02-24 | 2001-04-24 | Smithkline Beecham Corporation | cDNA clone HDPB130 that encodes a novel human 7-transmembrane receptor |
| US5955303A (en) * | 1997-03-06 | 1999-09-21 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human chemokine receptor-like protein |
| US6555339B1 (en) * | 1997-04-14 | 2003-04-29 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors |
| US6060272A (en) * | 1997-05-07 | 2000-05-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Human G-protein coupled receptors |
| EP0899332A3 (en) * | 1997-08-15 | 2000-07-05 | Smithkline Beecham Corporation | The G-protein coupled receptor HFIAO41 |
| CA2239255A1 (en) * | 1997-10-23 | 1999-04-23 | Smithkline Beecham Corporation | Cdna clone hneaa81 that encodes a human 7-transmembrane receptor |
| US5932445A (en) * | 1997-11-07 | 1999-08-03 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Signal peptide-containing proteins |
| KR100629185B1 (ko) * | 1997-11-11 | 2006-09-28 | 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 | 인간 리조포스파티드산 수용체 물질 및 그 용도 |
| US6207412B1 (en) * | 1997-11-13 | 2001-03-27 | The Regents Of The University Of California | Identification of a G protein-coupled receptor transcriptionally regulated by protein tyrosine kinase signaling in hematopoietic cells |
| EP1054903A4 (en) * | 1998-02-20 | 2002-10-09 | Smithkline Beecham Corp | FISHBOY, A G PROTEIN COUPLED RECEPTOR |
| EP1690939B8 (en) * | 1998-03-12 | 2010-10-13 | Astellas Pharma Inc. | Novel G protein-coupled receptor proteins |
| AU3749499A (en) * | 1998-04-16 | 1999-11-01 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Novel molecules of the bgckr-related protein family and uses thereof |
| JP2002512780A (ja) * | 1998-04-24 | 2002-05-08 | スミスクライン ビーチャム コーポレーション | 新規７ｔｍ受容体ａｘｏｒ−２のクローニング |
| SE9801455D0 (sv) * | 1998-04-24 | 1998-04-24 | Astra Pharma Inc | New receptor |
| US6071722A (en) * | 1998-04-24 | 2000-06-06 | Smithkline Beecham Corporation | Nucleic acids encoding a G-protein coupled 7TM receptor (AXOR-1) |
| JP2002531057A (ja) * | 1998-08-19 | 2002-09-24 | ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｅｄｇ受容体ファミリーに関連したｇタンパク質結合受容体である１４２７４受容体 |
| EP1104465A1 (en) * | 1998-08-20 | 2001-06-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 14400 receptor, a g-protein coupled receptor |
| WO2000011015A1 (en) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Alphagene, Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
| WO2000012707A1 (en) * | 1998-09-02 | 2000-03-09 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 14926 receptor, a novel g-protein coupled receptor |
| NZ510712A (en) * | 1998-10-13 | 2004-11-26 | Arena Pharm Inc | Non-endogenous, constitutively activated human G protein-coupled receptors |
| WO2000023588A2 (en) * | 1998-10-16 | 2000-04-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | G-protein coupled receptors |
| EP1127128A1 (en) * | 1998-11-04 | 2001-08-29 | Chiron Corporation | Isolated vshk-1 receptor polypeptides and methods of use thereof |
| DE69933688T2 (de) * | 1998-11-06 | 2007-08-23 | Bayer Healthcare Ag | G-protein-gekoppelter rezeptoren, die holomog zu ebv-induzierter gpcr (ebi-2) sind, verfahren zur identifizierung von ihren entsprechenden liganden |
| US6221660B1 (en) * | 1999-02-22 | 2001-04-24 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding SNORF25 receptor |
| US6689866B1 (en) * | 1999-03-09 | 2004-02-10 | Curagen Corporation | Polynucleotides and proteins encoded thereby |
| US6590938B1 (en) * | 1999-09-30 | 2003-07-08 | Conexant Systems, Inc. | DCT domain conversion of a higher definition signal to lower definition signal |
| GB9923177D0 (en) * | 1999-09-30 | 1999-12-01 | Pfizer Ltd | Novel polypeptide |
-
1999
- 1999-10-13 EP EP05005946A patent/EP1580271A3/en not_active Ceased
- 1999-10-13 NZ NZ527622A patent/NZ527622A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-10-13 KR KR1020077018185A patent/KR100926208B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-13 ES ES05003040T patent/ES2289610T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-13 PT PT99972682T patent/PT1133559E/pt unknown
- 1999-10-13 IL IL14253899A patent/IL142538A0/xx unknown
- 1999-10-13 CA CA002645717A patent/CA2645717A1/en not_active Withdrawn
- 1999-10-13 EP EP99972682A patent/EP1133559B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-13 WO PCT/US1999/023687 patent/WO2000031258A2/en not_active Ceased
- 1999-10-13 DK DK99972682T patent/DK1133559T3/da active
- 1999-10-13 AT AT99972682T patent/ATE301673T1/de active
- 1999-10-13 KR KR1020087003578A patent/KR100963367B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-13 EP EP05003040A patent/EP1584683B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-13 NZ NZ537625A patent/NZ537625A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-10-13 JP JP2000584067A patent/JP2003534767A/ja not_active Withdrawn
- 1999-10-13 EP EP07001452A patent/EP1780280A1/en not_active Ceased
- 1999-10-13 PT PT07008841T patent/PT1849866E/pt unknown
- 1999-10-13 NZ NZ511087A patent/NZ511087A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-10-13 ES ES07008841T patent/ES2308759T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-13 PT PT05003040T patent/PT1584683E/pt unknown
- 1999-10-13 EP EP10008862A patent/EP2295572A1/en not_active Withdrawn
- 1999-10-13 CA CA002348377A patent/CA2348377C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-13 AT AT07008841T patent/ATE396400T1/de active
- 1999-10-13 DK DK05003040T patent/DK1584683T3/da active
- 1999-10-13 AT AT05003040T patent/ATE366815T1/de active
- 1999-10-13 KR KR1020017006279A patent/KR100765039B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-13 DK DK07008841T patent/DK1849866T3/da active
- 1999-10-13 EP EP10010303A patent/EP2295573A1/en not_active Withdrawn
- 1999-10-13 KR KR1020087003575A patent/KR100926209B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-13 ES ES99972682T patent/ES2243095T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-13 KR KR1020087024998A patent/KR20080104062A/ko not_active Withdrawn
- 1999-10-13 EP EP07008841A patent/EP1849866B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-13 EP EP10010658A patent/EP2295574A1/en not_active Withdrawn
- 1999-10-13 AU AU37904/00A patent/AU770056B2/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-04-11 IL IL142538A patent/IL142538A/en not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-04-28 JP JP2004132989A patent/JP2004267216A/ja not_active Withdrawn
- 2004-05-12 AU AU2004202147A patent/AU2004202147A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-05-15 JP JP2007129923A patent/JP2007209352A/ja active Pending
-
2008
- 2008-02-14 JP JP2008033839A patent/JP2008133300A/ja active Pending
-
2009
- 2009-07-03 JP JP2009159339A patent/JP2009298791A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2308759T3 (es) | Receptores acoplados a proteina g humanos huerfanos. | |
| US8097452B2 (en) | Human orphan G protein-coupled receptors | |
| US8198049B2 (en) | Nucleic acids encoding RUP3 and methods of using same | |
| US8440391B2 (en) | Constitutively activated human G protein coupled receptors | |
| USRE42190E1 (en) | Method of identifying a compound for inhibiting or stimulating human G protein-coupled receptors | |
| AU2009202228B2 (en) | Human Orphan G protein-Coupled receptor hRUP3 | |
| US20070072248A1 (en) | Constitutively activated human G protein coupled receptors | |
| HK1077082A (en) | Human orphan g protein-coupled receptors | |
| HK1098510A (en) | Human orphan g protein-coupled receptors | |
| HK1103763B (en) | Human orphan g protein-coupled receptor rup3 | |
| HK1155771A (en) | Human orphan g protein-coupled receptors | |
| HK1037675B (en) | Human orphan g protein-coupled receptor rup3 | |
| HK1077081B (en) | Human orphan g protein-coupled receptor rup3 | |
| HK1077081A1 (en) | Human orphan g protein-coupled receptor rup3 |