ES2308805T3 - Celulas de levadura que comprenden al menos dos copias de un gen deseado integradas en el genoma cromosomico en mas de un domicio que codifica el arn no ribosomico particularmente con kluyveromyces. - Google Patents
Celulas de levadura que comprenden al menos dos copias de un gen deseado integradas en el genoma cromosomico en mas de un domicio que codifica el arn no ribosomico particularmente con kluyveromyces. Download PDFInfo
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Abstract
Una célula de levadura que comprende al menos dos copias de un gen deseado integradas en su(s) cromosoma(s), donde dicho(s) cromosoma(s) comprende(n) al menos dos dominios de ADN apropiados para la integración de una o más copias de dicho gen deseado, cuyos dominios comparten una homología sustancial de secuencias y son dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico, y donde al menos dos de dichos dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico sustancialmente homólogos tienen al menos una copia de dicho gen deseado integrada.
Description
Células de levadura que comprenden al menos dos
copias de un gen deseado integradas en el genoma cromosómico en más
de un dominio que codifica el ARN no ribosómico particularmente con
Kluyveromyces.
La presente invención se encuentra en el campo
de la modificación genética de la levadura usando técnicas de ADN
recombinante. La invención concierne más particularmente a la
producción de células de levadura que incorporan en el genoma
múltiples copias de un gen deseado, así como las células de levadura
así obtenidas. La invención concierne adicionalmente a la
producción de proteínas, péptidos y metabolitos, cultivando las
células de levadura así obtenidas bajo condiciones que conducen a la
expresión de dicho gen deseado, mientras la producción de la
proteína, el péptido o el metabolito es lograda.
Un método conocido para obtener cepas de
levadura que hospedan múltiples copias de un gen deseado está en el
uso de plásmidos de múltiples copias. Los plásmidos, sin embargo
tienen varias desventajas: (i) el nivel de expresión expresado en
términos de la proporción de proteína deseada producida con relación
al número de copias del gen deseado es generalmente inferior para
los plásmidos que para las copias integradas del gen deseado; de
esta forma, los plásmidos imponen una prueba metabólica más grande
para la célula que las copias integradas, lo cual puede resultar en
una penalidad en términos de acumulación de biomasa; (ii) los
plásmidos son propensos a inestabilidad estructural lo que puede
conducir a la perdida del gen deseado a partir del plásmido o a un
producto de proteína parcial; (iii) los plásmidos pueden ocasionar
inestabilidad segregacional que conlleva a la pérdida de plásmidos.
Lo último especialmente ocurre si es deseado un nivel alto de
expresión lo que impone una prueba metabólica fuerte para la
célula.
Para superar la inestabilidad mitótica asociada
con los plásmidos, la integración de múltiples copias de un gen
deseado se ha encontrado con algún éxito en la levadura. Múltiples
copias de genes deseados han sido integradas en un único sitio de
integración en el genoma, mayoritariamente en el ADN ribosómico del
genoma de la levadura. La integración de múltiples copias en un
único locus es casi invariablemente lograda por la integración de
múltiples copias en tándem en el genoma de la levadura; esto
conlleva de manera fácil a la inestabilidad debido a la
recombinación abierta de las copias de la construcción como una
consecuencia de la presencia de repeticiones directas que flanquean
la construcción que contiene el gen deseado. Mientras más copias son
encontradas en tándem, más fácil esto conlleva a la escisión por
recombinación abierta de copias simples, decreciendo de esta forma
los niveles de producción de proteínas hasta un nivel impredecible,
pero no inferior.
Para superar algo de la inestabilidad, un
sistema fue concebido para obtener la integración de números de
copias altos en el ADN ribosómico usando un marcador de selección
deficiente, por ejemplo donde un promotor débil es clonado en
frente del marcador de selección (EP 0 481 008). Una primera
desventaja es la necesidad de los marcadores de selección en la
cepa de producción. Los marcadores resistentes a los antibióticos
dominantes son menos deseables desde un punto de vista regulatorio
mientras por otra parte los marcadores autótrofos no son útiles
frecuentemente debido a que ellos requieren cepas hospederas
receptoras mutantes. Además, la presencia de los marcadores de
selección puede también añadir una complejidad no deseada de la
fermentación. Como segundo aspecto, el locus del ADN que codifica
el ARN ribosómico es encontrado en un organuelo nuclear llamado
nucleolo, el cual no es el lugar ideal para obtener la expresión
óptima de un gen que codifica para una proteína, ya que los genes
que codifican para las proteínas son genes transcriptos por ARN
polimerasa II.
Es un objeto de la invención proporcionar
células de levadura que tienen múltiples copias de un gen deseado
integradas en el genoma sin ninguno o sin algunos de los problemas
encontrados con las células de levadura conocidas en el arte
anterior.
La presente invención proporciona por primera
vez, como un clon aislado, una célula de levadura que comprende al
menos dos copias de un gen deseado integradas en su genoma
cromosómico, donde dicho genoma cromosómico comprende al menos dos
dominios de ADN apropiados para la integración de una o más copias
de dicho gen deseado, cuyos dominios comparten una homología
sustancial de secuencias y son dominios de ADN que codifican el ARN
no ribosómico, y donde al menos dos de dichos dominios de ADN que
codifican el ARN no ribosómico sustancialmente homólogos incorporan
al menos una copia de dicho gen deseado.
Preferidas de acuerdo a la invención son las
células de levadura, donde al menos dos de dichos dominios de ADN
que codifican el ARN no ribosómico sustancialmente homólogos
apropiados para la integración de una o más copias de dicho gen
deseado incorporan dos o más copias de dicho gen deseado, más
preferiblemente, donde cada dominio de ADN que codifica el ARN no
ribosómico sustancialmente homólogo apropiado para la integración de
una o más copias de dicho gen deseado incorpora un número idéntico
de copias de dicho gen deseado. Dichos dominios de ADN que
codifican el ARN no ribosómico sustancialmente homólogos apropiados
para la integración de una o más copias de dicho gen deseado pueden
ser duplicados sustanciales de unos y otros, preferiblemente formas
alélicas de unos y otros. Una célula de levadura preferida de
acuerdo a la invención es una la cual es una célula de la levadura
Kluyveromyces, tal como una K. lactis o K.
fragilis.
Preferidos de acuerdo a la invención son los
genes deseados que son genes recombinantes, que significa que al
menos alguna parte del gen deseado ha sido manipulado usando
técnicas modernas de ingeniería genética. De acuerdo a una
realización el gen deseado es un gen de levadura. De acuerdo a otra
realización el gen deseado no es un gen de levadura. En cualquier
caso, "gen" significa un gen capaz de ser expresado cuando está
presente en el hospedero de la levadura seleccionado. La presente
invención es ejemplificada por un gen de levadura que codifica para
la \beta-galactosidasa (LAC4, de la K.
lactis) y un gen que no es de levadura que codifica para la
quimosina. El gen LAC4 es un gen intracelular, el gen de la
quimosina realmente codifica para una
pre-proproteína que es segregada como proquimosina,
la cual puede ser activada de manera auto catalítica para formar el
producto de proteína maduro quimosina. Un gen que codifica para la
quimosina es aquí entendido que incluye todas las formas de las
secuencias de ADN que codifican el polipéptido que puede ser
procesado o madurado en una proteína con actividad quimosina y de
esta forma incluir específicamente cADN que codifican la prepro- y
la proquimosina. El gen deseado puede ser un gen recombinante que
comprende una región promotora de transcripción, y opcionalmente de
manera adicional una región de terminación de la transcripción,
funcional en dicha célula de levadura, donde al menos una de dichas
regiones, o ambas no están enlazadas de manera natural al marco de
lectura abierto que codifica para una proteína o un péptido. Estará
claro que los genes deseados que tienen regiones regulatorias que
son por su naturaleza ya funcionales en la célula de levadura
seleccionada pueden ser expresados en las células de levadura en su
estado natural.
De acuerdo a una realización preferida el número
de los dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico
apropiados para la integración de una o más copias de dicho gen
deseado es dos y el número de copias de dicho gen deseado por
dominio es tres, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente
al menos cuatro, más preferiblemente al menos 5.
De acuerdo a una realización la célula de
levadura de acuerdo a la invención es una célula de levadura libre
de genes marcadores.
De acuerdo a otra realización una célula de
levadura es proporcionada donde dichos dominios de ADN que codifican
el ARN no ribosómico sustancialmente homólogos son alélos del
LAC4.
La invención adicionalmente proporciona un
método para producir una proteína o un péptido, que comprende el
paso de cultivar una célula de levadura de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones anteriores bajo condiciones que conducen a la
producción de dicha proteína o péptido. Opcionalmente, dicho método
adicionalmente comprende el paso de recuperar la proteína, el
péptido o el metabolito de las células y/o el medio de cultivo.
De acuerdo a aún otra realización un método es
proporcionado de obtener una célula de levadura capaz de producir
un péptido o una proteína deseada que comprende los pasos de: (a)
transformar una célula de levadura que tiene un genoma el cual
comprende al menos dos dominios de ADN apropiados para la
integración de una o más copias de un gen deseado, cuyos dominios
comparten una homología sustancial de secuencias y son dominios de
ADN que codifican el ARN no ribosómico, con una molécula de ADN que
comprende un gen deseado que codifica para dicho péptido o
proteína, o un precursor de los mismos, y una región de homología
con dicho dominio; (b) seleccionar o tamizar las células que hayan
obtenido al menos una copia de dicho gen deseado integrada en al
menos uno de dichos dominios de ADN que codifican el ARN no
ribosómico apropiados para la integración de una o más copias del
gen deseado; y, (c) propagar las células obtenidas en (b) y tamizar
o seleccionar las células que hayan obtenido al menos una copia de
dicho gen deseado integrada en al menos dos de dichos dominios de
ADN que codifican el ARN no ribosómico.
Preferido de acuerdo a la invención es un método
que comprende en adición al paso (a), (b) y (c) el paso de: (d)
propagar las células obtenidas en (c) y tamizar o seleccionar las
células que hayan obtenido al menos una copia de dicho gen deseado
integrada en una copia adicional de dichos dominios de ADN que
codifican el ARN no ribosómico.
Aún adicionalmente preferido de acuerdo a la
invención es un método que comprende en adición al paso (a), (b),
(c) y (d) el paso de: (e) repetir el paso (d) hasta que cada copia
de de dichos dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico
haya obtenido al menos una copia integrada de dicho gen deseado.
Aún adicionalmente preferido de acuerdo a la
invención son los métodos donde, un marcador seleccionable
bidireccional es usado en la transformación de las células de
levadura en el paso (a), y donde la remoción de del marcador
seleccionable es efectuada antes del paso (c). Preferiblemente el
marcado seleccionable bidireccional es un marcador dominante, más
preferiblemente un gen de la acetamidasa. En aún otro método
preferido de acuerdo a la invención, el paso (a) es repetido al
menos una vez, subsiguiente a la remoción del marcador seleccionable
bidireccional.
En otra realización preferida de acuerdo a la
invención se proporciona un método de obtener una célula de
levadura capaz de producir un péptido o una proteína deseada que
comprende los pasos de: (a) transformar una célula de levadura que
tiene un genoma el cual comprende al menos dos dominios de ADN
apropiados para la integración de una o más copias de un gen
deseado, cuyos dominios comparten una homología sustancial de
secuencias y son dominios de ADN que codifican el ARN no
ribosómico, con una molécula de ADN que comprende un gen deseado que
codifica para dicho péptido o proteína, o un precursor de los
mismos, y una región de homología con dicho dominio; (b)
seleccionar o tamizar las células que hayan obtenido al menos una
copia de dicho gen deseado integrada en al menos uno de dichos
dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico apropiados para
la integración de una o más copias de un gen deseado; (c)
transformar una célula obtenida en (b) con una segunda molécula de
ADN que comprende un gen marcador seleccionable, y una región de
homología con uno dicho dominio; (d) seleccionar o tamizar las
células que hayan obtenido al menos una copia de dicho gen marcador
seleccionable integrada en uno de dichos dominios de ADN que
codifican el ARN no ribosómico sin una o más copias del gen
deseado; y (e) propagar las células obtenidas en (d) y tamizar o
seleccionar las células que hayan perdido el gen marcador
seleccionable y hayan obtenido al menos una copia de dicho gen
deseado integrada en al menos dos de dichos dominios de ADN que
codifican el ARN no ribosómico. Preferiblemente, el gen marcador
seleccionable es un gen marcador bidireccional, más preferiblemente
un gen de la acetamidasa.
De acuerdo a aún otra realización se proporciona
un método para obtener una célula de levadura capaz de producir un
péptido o una proteína deseada, donde dicho método comprende los
pasos de: (a) obtener una célula de levadura transformada con al
menos una copia de un gen deseado integrada en uno de sus
cromosomas, donde el gen deseado es flanqueado por repeticiones
directas; (b) aislar colonias simples de la descendencia de la
célula obtenida en (a); (c) tamizar los aislados de colonias
simples que tienen células que hayan obtenido al menos una copia
integrada en forma de tándem adicional del gen deseado, y,
opcionalmente; (d) repetir los pasos (a) hasta (c) en las células
obtenidas en (c) hasta que un número deseado de copias repetidas en
forma de tándem del gen deseado sea obtenido. Preferido de acuerdo
a la invención es un método donde la célula de levadura transformada
es una célula de levadura que tiene un genoma el cual comprende al
menos dos dominios de ADN apropiados para la integración de una o
más copias de un gen deseado, cuyos dominios comparten una homología
sustancial de secuencias y son dominios de ADN que codifican el ARN
no ribosómico, y donde el gen deseado está integrado en al menos
una copia de dicho dominio de ADN, y donde el método comprende
adicionalmente los pasos de: (e) propagar las células obtenidas en
(c) o (d) y tamizar o seleccionar las células que hayan obtenido
copias de dicho gen deseado integradas en al menos dos de dichos
dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico, y,
opcionalmente; (f) repetir la propagación y el tamizado o la
selección de (e) en las células obtenidas en (e) hasta que un
número deseado de dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico
haya obtenido copias integradas de dicho gen deseado.
La invención adicionalmente proporciona una
célula de levadura del género Kluyveromyces la cual es no
haploide para al menos un dominio diferente al locus de ADN que
codifica el ARN ribosómico, preferiblemente una célula de la
Kluyveromyces lactis. De acuerdo a otra realización, la
célula de levadura es no haploide para el locus del LAC4.
Preferiblemente, la célula de levadura de acuerdo a la invención
incorpora en cada alelo de dicho locus no haploide una o más copias
de un gen deseado. Más preferiblemente la célula de levadura
incorpora el mismo número de copias de dicho gen deseado en cada
alelo.
La invención adicionalmente proporciona un
método para hacer una proteína, un péptido o un metabolito en
células de levadura, donde una célula de levadura del género
Kluyveromyces la cual es no haploide para al menos un
dominio de ADN que codifica el ARN no ribosómico, preferiblemente
una célula de la Kluyveromyces lactis, es cultivada bajo
condiciones que provocan la producción de dicha proteína, péptido o
metabolito.
La invención también proporciona el uso de un
gen marcador bidireccional para la selección de convertidores de
genes putativos de las células de levadura no haploide.
La invención también proporciona una célula de
la levadura Kluyveromyces que tiene al menos tres copias de
un gen que codifica la lactosa, o un derivado de la misma,
incorporadas en su genoma cromosómico, es decir sin importar
el (los) sitio(s) de integración cromosómica. Igualmente, la
invención proporciona por primera vez una célula de la levadura
Kluyveromyces que tiene al menos tres copias de un gen que
codifica la quimosina, o un precursor o derivado de la misma,
incorporadas en su genoma cromosómico, sin importar el (los)
sitio(s) de integración cromosómica.
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La invención adicionalmente proporciona un
método de obtener una célula de levadura que comprende al menos dos
copias de un gen deseado integradas en su genoma cromosómico, donde
dicho genoma comprende al menos dos dominios de ADN apropiados para
la integración de una o más copias de dicho gen deseado, cuyas
dominios comparten una homología sustancial de secuencias y son
dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico, y donde cada
dicho dominio de ADN que codifica el ARN no ribosómico
sustancialmente homólogo incorpora el mismo número de copias de
dicho gen deseado, que comprende los pasos de
(1) seleccionar una célula de levadura que
comprende al menos una copia de un gen deseado integrada en su
genoma, donde dicho genoma comprende al menos dos dominios de ADN
apropiados para la integración de una o más copias de dicho gen
deseado, cuyos dominios comparten una homología sustancial de
secuencias y son dominios de ADN que codifican el ARN no
ribosómico, y donde al menos uno de dichos dominios de ADN que
codifican el ARN no ribosómico sustancialmente homólogos incorpora
una copia de dicho gen deseado, y donde al menos uno de dichos
dominios incorpora menos copias que al menos algún otro dominio en
dicha célula;
(2) propagar dicha célula para obtener células
descendencia, y
(3) identificar entre dicha descendencia una
célula que comprenda al menos dos copias de un gen deseado
integradas en su genoma, donde dicho genoma comprende al menos dos
dominios de ADN apropiados para la integración de una o más copias
de dicho gen deseado, cuyos dominios comparten una homología
sustancial de secuencias y son dominios de ADN que codifican el ARN
no ribosómico, y donde al menos cada uno de dichos dominios de ADN
que codifican el ARN no ribosómico sustancialmente homólogos
incorpora un número idéntico de copias de dicho gen deseado.
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La invención adicionalmente proporciona un
método de obtener una célula de levadura que comprende un número
incrementado de copias de un gen deseado integrado en su genoma,
donde dicho genoma comprende al menos dos dominios de ADN
apropiados para la integración de una o más copias de dicho gen
deseado, cuyas dominios comparten una homología sustancial de
secuencias y son dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico,
que comprende los pasos de:
(1) seleccionar una célula de levadura que
comprende al menos una copia de un gen deseado integrada en su
genoma cromosómico, donde dicho genoma cromosómico comprende al
menos dos dominios de ADN apropiados para la integración de una o
más copias de dicho gen deseado, cuyos dominios comparten una
homología sustancial de secuencias y son dominios de ADN que
codifican el ARN no ribosómico, y donde al menos uno de dichos
dominios de ADN que codificas el ARN no ribosómico sustancialmente
homólogos incorpora una copia de dicho gen deseado, y donde al
menos uno de dichos dominios incorpora menos copias que al menos
algún otro dominio en dicha célula;
(2) propagar dicha célula para obtener células
de descendencia, e
(3) identificar entre dichas células de
descendencia una célula que comprenda al menos dos copias de un gen
deseado integradas en su genoma cromosómico, donde dicho genoma
comprende al menos dos dominios de ADN apropiados para la
integración de una o más copias de dicho gen deseado, cuyos dominios
comparten una homología sustancial de secuencias y son dominios de
ADN que codifican el ARN no ribosómico.
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La invención adicionalmente proporciona un
método de obtener una célula de levadura que comprende al menos dos
copias de un gen deseado integradas en su genoma cromosómico, donde
dicho genoma cromosómico comprende al menos dos dominios de ADN
apropiados para la integración de una o más copias de dicho gen
deseado, cuyas dominios comparten una homología sustancial de
secuencias y son dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico,
y donde al menos dos de dicho dominios de ADN que codifica el ARN
no ribosómico sustancialmente homólogos incorporan al menos una
copia de dicho gen deseado, que comprende los pasos de:
(1) transformar las células de levadura con una
molécula de ADN que comprende (a) un gen deseado, (b) una región de
homología con uno de dichos dominios en el genoma, y (c) un marcador
de selección bidireccional para seleccionar las células
transformadas;
(2) seleccionar las células transformadas sobre
la base de la presencia del marcador, y
(3) propagar las células transformadas que
tienen la molécula de ADN integrada en dicho dominio, bajo presión
contra selectiva que favorece la pérdida del marcador
bidireccional,
(4) transformar las células de descendencia del
marcador de las células propagadas en el paso (3) que aún
incorporan una o más copias del gen deseado con una molécula de ADN
que comprende (a) un marcador bidireccional y (b) una región de
homología con dicho dominio, y (5) seleccionar las células que hayan
obtenido dicho marcador bidireccional integrado en dicho dominio de
tal forma que un dominio tenga al menos un marcador bidireccional y
algún otro dominio tenga una o más copias del gen deseado,
(6) propagar las células del marcador^{+}
bidireccional bajo presión contra selectiva que favorece la perdida
del marcador bidireccional, e
(7) identificar entre las células descendencia
del marcador bidireccional obtenidas en el paso (6) las células de
descendencia que tienen al menos dos dominios, cada uno incorporando
una o más copias del gen deseado. De acuerdo a una realización
preferida, las células obtenidas tienen el mismo número de copias
del gen deseado en cada uno de dichos dominios.
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Figura 1: Ruta de la construcción del pGBG418Lac
(M = metilado en la E. coli JM109)
Figura 2: Ruta de la construcción del
pGBLAC4AmdS (XbaI M = metilado en la E. coli
JM109)
Figura 3: El resultado de la película expuesta a
rayos X del ADN genómico digerido con KpnI de la CBS 685.97
y 18 transformantes del pGBLACAmdS-1 de la CBS 685.97 después
de la hibridación con la sonda Lac-T; Para la sonda
Lac-T ver la Fig. 4. El carril 0 es el carril de
control. Los carriles 1-10 y los carriles 13 a 21
son transformantes independientes.
Figura 4: Representación esquemática de la
estructura cromosómica del locus del LAC4 en las cepas CBS
685.97 (4a), la cepa LCT101 la cual es la CBS 685.97 transformada
con el pGBLACAmdS-1 (4b) y la cepa LTC105 la cual es la
LTC101 después de la recombinación abierta del ADN heterólogo a
través de la LacT1 y la LacT2 (4c);
Símbolos: LacP: promotor del LAC4;
LAC4: secuencias que codifican la lactasa; lacT1, lacT2,
lacT: secuencias del terminador del LAC4; sonda: sonda del
promotor del LAC4; LacTp: sonda del terminador del
LAC4. Los números encima de las figuras indican la longitud
de los fragmentos de restricción relevantes usados para determinar
la estructura del locus del ADN. Solamente los sitios de restricción
relevantes son indicados.
Figura 5: El resultado del ADN genómico digerido
con MluI de la CBS 685.97 y 14 transformantes del
pGBLACAmdS de la CBS 685.97 después de la hibridación con la
sonda LacP; Para la sonda LacP ver la Fig. 4. El carril 0 es el
carril de control. Los carriles 1-9 y los carriles
10 a 21 son transformantes independientes. Los números entre los
carriles 9 y 10 representan el tamaño de los fragmentos del marcador
en pares de kilo bases.
Figura 6: Ruta de la construcción para el
pGBamdS 61.
Figura 7: Los resultados del análisis del número
de copias de la GBA-CHY22,
GBA-CHY33, GBA-CHY43,
GBA-CHY53 y GBA-CHY54. El ADN
cromosómico fue digerido con MluI e hibridado con la sonda
LacP. Los fragmentos esperados para las copias 1, 2, 3, 4 y 5 del
casete de expresión de la quimosina son indicados.
Figura 8: Presentación esquemática de la
estructura cromosómica del locus del LAC4 con dos casetes de
expresión de la quimosina integrados en forma de tándem
pKS105(cepa GBA-CHY22). Símbolos: pLAC4:
promotor del LAC4; LAC4: secuencias que codifican la
lactasa; te: secuencia del terminador del LAC4; sonda: sonda
del promotor del LAC4. Solamente los sitios de restricción
relevantes y la longitud de los fragmentos esperados son
indicados.
Figura 9: Resultado del análisis cromosómico de
las cepas GBA-CHY22, GBA-CHY33,
GBA-CHY43, GBA-CHY53 y
GBA-CHY54. El ADN cromosómico fue digerido con
HindIII e hibridado con la sonda indicada. Cuando 3 o más
copias de la quimosina pKS105 son integradas en forma de tándem en
el locus de lactosa la intensidad del fragmento de hibridación de
3.6 kb es mayor.
Las células de levadura de acuerdo con la
invención comprenden al menos dos copias de un gen deseado
integradas en su genoma cromosómico, donde dicho genoma cromosómico
comprende al menos dos dominios de ADN apropiados para la
integración de una o más copias de dicho gen deseado, cuyos dominios
comparten una homología sustancial de secuencias y son dominios de
ADN no ribosómico, y donde al menos dos de dichos dominios de ADN no
ribosómico sustancialmente homólogos incorporan una copia de dicho
gen deseado. Por genoma cromosómico se entiende la totalidad de los
cromosomas en la célula, incluidos los cromosomas de la levadura
artificial (YAC).
Preferiblemente, cada dominio comprende más de
dos copias, aún más preferible más de tres copias, aún más
preferible entre tres y seis copias del gen deseado. De acuerdo con
otra realización preferida, cada dominio comprende el mismo número
de copias del gen deseado.
La invención proporciona por primera vez un
método de obtener células de levadura de acuerdo a la invención. La
invención será mejor entendida tomando la siguiente descripción como
ejemplo.
Una célula de levadura que hospeda al menos dos
dominios sustancialmente homólogos apropiados para la integración
de ADN, por ejemplo una cepa la cual es diploide para un locus dado,
es transformada con una molécula de ADN de entrada que comprende
(a) un gen deseado, (b) una región de homología con dichos dominios
en el genoma, (c) opcionalmente, un marcador de selección para
detectar los transformantes. Si un marcador de selección esta
siendo usado, un marcador bidireccional, tal como amdS es
preferido pero no requerido, debido a que después de la
transformación este puede ser eliminado del genoma (o inactivado)
por contra selección. De manera alternativa, la perdida del
marcador puede ser tamizada (por ejemplo por replicación en
placas), en cuyo caso la contra selección no es llevada a la
práctica y el gen puede ser cualquier gen apropiado para usarlo
como un marcador en una célula de levadura. (En el caso del
amdS la contra selección puede ser hecha usando
fluoroacetamida como agente selectivo; detalles acerca del gen
amdS y su uso son proporcionados en la solicitud Europea de
patente 0 635 574, publicada en Enero 25, de 1991, a nombre de
Gist-Brocades N.V., las partes relevantes de la
cual han sido incorporadas aquí como referencia).
Preferiblemente, el gen marcador (bidireccional)
es flanqueado por repeticiones directas, permitiendo la
recombinación abierta desde el genoma en una etapa posterior. En
los ejemplos de aquí, las repeticiones directas son proporcionadas
en forma de fragmentos que comprenden parte de la región del
terminador del LAC4. Las células transformadas son
seleccionada (o tamizadas) primero en base a la presencia del
marcador, y a la presencia y la correcta localización cromosómica
del gen deseado usando técnica de análisis genómicos rutinarias, tal
como amplificación de genes, Southern blots o TAFE (infra).
Las células así seleccionadas son propagadas, preferiblemente bajo
presión contra selectiva, y tamizadas o seleccionadas para
determinar la eliminación del marcador bidireccional.
Subsiguientemente, las células del marcador negativo son
transformadas con una molécula de ADN que contiene un marcador
(bidireccional) y una región de homología con los dominios
suficiente para la integración recombinatoria en el genoma. Las
células transformadas son seleccionadas o tamizadas para determinar
la presencia del marcador (bidireccional), y entre las células del
marcador^{+} un clon es seleccionado el cual tiene el marcador
(bidireccional) integrado en dominio no ocupado o
sub-ocupado, no y sub-ocupado se
entiende como, dominios los cuales no tienen ninguna copia del gen
deseado, o menos copias que otro dominio homólogo, respectivamente.
Este clon es propagado para permitir la eliminación del marcador
(bidireccional), preferiblemente bajo presión contra selectiva. Las
células de descendencia que hayan perdido el marcador
(bidireccional) (la frecuencia está entre 1:100 y 1:5000) son
analizadas en relación con su estructura genómica; de las células
del marcador^{+} entre alrededor del 1 y 20% es encontrado que
tiene, a cambio por la perdida del marcador, una copia virtual del
primer dominio que incluye una copia/copias de los genes deseados
integrados allí. Este proceso, el cual puede ser seleccionado como
fue descrito anteriormente, es de aquí en lo adelante referido como
"conversión de genes". Se ha encontrado que la conversión de
genes tiene lugar sin importar el número de genes deseados que son
incorporados en el dominio ocupado. De esta forma, una célula que
comprende dos copias de un gen deseado integradas en su genoma
puede dar origen a la descendencia de una célula de cuatro copias
del gen deseado por la conversión de genes, una descendencia de una
célula de tres copias a una célula de seis copias, etc. La
frecuencia de la conversión de genes es generalmente bastante baja;
hemos observado una frecuencia de alrededor de 1:15000 con el gen
de la quimosina, pero las frecuencias pueden variar con la
naturaleza del gen deseado.
La capacidad para tamizar un numero elevado de
copias del gen deseado integrado en el genoma cromosómico es
importante, ya que el tamizado de números de copias elevadas
determinando la productividad de las proteínas o los metabolitos ya
no es confiable a escala de laboratorio más allá de un punto donde
la contribución de la productividad de cada copia adicional a la
productividad se estabiliza. Debe entenderse, que como la
productividad determinada a escala de laboratorio se estabiliza con
el incremento del número de copias más allá de cierto punto,
todavía una mayor ventaja puede ser vista en las fermentaciones a
escala industrial.
La invención es ejemplificada en la
Kluyveromyces lactis como una levadura representativa. Estará
claro que la invención es igualmente apropiada para llevarla a la
práctica con otras especies de levadura del género
Kluyveromyces, tal como la Kluyveromyces fragilis, así
como levadura que pertenezca a otro género del reino de las
levaduras, tal como la Saccharomyces, la
Schizosaccharomyces, la Schwanniomyces, la
Yarrowia, la Pichia, la Hansenula, la
Candida, la Phaffia, y similares. En principio
cualquier especie de levadura que tenga dos o más dominios que
compartan una homología de secuencias por ejemplo por duplicación
de genes o multiplicación de genes (también referido como
amplificación de genes), cualquiera que pueda ser el caso, y que
sean apropiados para la integración de un gen deseado, tal como un
gen deseado, puede ser usada para obtener una cepa que tenga más de
una copia integrada en el genoma en más de un dominio. De acuerdo a
una realización las cepas de levadura que están siendo usadas son
diploides o polidiploides para un dominio apropiado para integrar
un gen deseado. Las cepas pueden ser diploides o polidiploides para
un dominio dado, mientras haploides, o x-ploides,
para otros; tales cepas son generalmente referidas como aneuploides.
Para facilitar la referencia estos serán referidos de aquí en lo
delante de manera colectiva como especies "no haploides". Un
ejemplo de una solicitud Europea de patente que describe la
transformación de la especie Saccharomyces no haploide es la
EP 0 163 491. En los ejemplos el locus HO está siendo usado para la
integración del gen lacZ en la Saccharomyces carlsbergensis.
Las células de levadura que tienen una o más copias de un gen
deseado integradas en más de un dominio pueden ser, en teoría,
seleccionadas directamente a partir de transformantes primarios
descritos en los ejemplos de EP 0 163 491, usando el método de
acuerdo a la invención. Para identificar las células que tienen al
menos una copia en más de un dominio es preferido propagar los
transformantes primarios, remover el marcador, retransformar con el
marcador bidireccional, seleccionar los transformantes que tienen
el marcador en el domino no ocupado, contra seleccionar las células
que hayan perdido el marcador y seleccionar entre las células
marcadoras aquellas las cuales sean convertidoras de genes
analizando sus genomas. Cepas de partida preferidas son aquellas
que tienen ya más de una copia (en forma de tándem) integradas en
el primer dominio, debido a que los convertidores de genes
resultantes de tales cepas tienen su copia del gen deseado
doble.
En los ejemplos de aquí, se hace uso de la CBS
685.97 de la K. lactis la cual es diploide para el locus del
LAC4 y para varios otros loci. Sin embargo, la CBS 685.97 de
la K. lactis si tiene un tipo cruzamiento y es así que no es
una célula diploide verdadera.
Estará claro, que la invención no está limitada
por ningún medio a un locus dado en el genoma cromosómico de la
K. lactis, o cualquier otro locus en otras especies de
levaduras, para ese asunto. La invención no está limitada a los
loci en el estricto significado de la expresión. De manera clásica
la expresión "locus" se refiere a una localización física de
un "gen" en el cromosoma. Debe estar claro que la integración
de una o más copias de un gen deseado no necesariamente tiene que
tener lugar en o cerca de un gen. La integración puede bien
igualmente tener lugar en alguna otra forma del ADN ribosómico
genético que no sea un gen, tal como el ADN repetitivo, pero
distinto a las repeticiones de ADN ribosómico. Por esta razón el uso
de la expresión "dominio" es usado para el propósito de esta
invención, en lugar de locus. Será obvio que el dominio de acuerdo
a la invención debe ser apropiado para la integración; esto
significa, que la integración no debe intervenir de manera negativa
con una función deseada de dicho dominio. Por ejemplo si el dominio
es un gen activo (un locus de hecho) la integración no debe
interferir con la expresión de ese gen residente, si la expresión de
ese gen no va a ser afectada de manera negativa. Si el
funcionamiento del gen residente no es importante, o incluso no
deseado, entonces la integración puede también ser en un dominio
dentro del gen, deteriorando de esta manera el funcionamiento de
los genes. Se hace énfasis, que se pretende que el genoma
cromosómico comprenda la totalidad de los cromosomas en cualquier
hospedero de levadura dado, incluyendo cualquier cromosoma
artificial que el hospedero de la levadura pueda portar. De esta
forma, los dominios que codifican el ARN no ribosómico pueden estar
en el mismo cromosoma (amplificado) y/o en diferentes cromosomas,
y/o en cromosomas artificiales de levadura (YAC).
Aunque esta situación puede ser menos preferida,
un dominio puede ser apropiado para la integración aún si esto
afecta el funcionamiento de un gen deseado, a condición de que otra
copia que no hospeda un gen integrado sobreviva intacta.
De acuerdo a una realización un dominio
apropiado para la integración es un gen que codifica para una
actividad proteasa no deseable, endógena. Eliminar, o deteriorar la
expresión de tal gen, puede resultar en una mayor recuperación de
proteínas, para mencionar un ejemplo. Un ejemplo de tal dominio es
la Aspartil proteasa de la Levadura (Yap3) EP 0 749 478 (publicada
como WO 95/23857 el 8-09-1995).
De acuerdo a otra realización las células de
levadura pueden ser obtenidas donde una multiplicidad de dominios
apropiados para la integración de una o más copias de un gen deseado
son incorporados en el genoma cromosómico mediante transformación.
Por ejemplo una célula de levadura puede ser obtenida integrando dos
o más copias de una secuencia de ADN en el genoma, en una forma
aleatoria o de otra forma, esto no es crítico, para crear
"plataformas" para la integración seleccionada subsiguiente de
una o más copias de un gen deseado. Estas plataformas están también
concebidas como "dominios apropiados para la integración" de
acuerdo a la invención.
Los dominios apropiados para la integración
tienen que ser loci de ADN no ribosómico. Por locus de ADN no
ribosómico se entiende el locus de ADN que codifica el ARN
ribosómico, es decir aquellas regiones en el genoma que comprenden
las repeticiones del ADN ribosómico. De esta forma, no están
excluidos para la integración los loci que codifican para proteínas
ribosómicas, ya que estos últimos son claramente loci transcritos de
ARN polimerasa II.
La expresión "apropiada para la
integración" también implica que la longitud de los dominios es
tal que la recombinación tiene lugar con una frecuencia razonable.
Es generalmente conocido que la frecuencia de la recombinación de
dos secuencias homologas (parciales) se incrementa con la longitud y
el grado de homología de las moléculas de ADN recombinantes. Es
difícil proporcionar un grado mínimo estricto de homología o
longitud de los alargamientos homólogos, pero aquellos expertos son
capaces de llevar a la práctica la invención si la longitud de los
alargamientos homólogos es más de 100, preferiblemente más de 300
bp. Los alargamientos de homología de 2000 bp o más incrementan aún
más la frecuencia de integración mediante la recombinación homóloga.
No existe un límite superior estricto para la longitud de la
homología. Generalmente, la región de homología entre los dominios
en el genoma de las células de levadura puede ser tan grande como
varios miles de pares de bases hasta varios cientos de miles de
pares de bases, esto no es crítico. Estará claro, que la región de
homología en el ADN que se transforma puede ser mucho más corta que
la longitud de los dominios en el genoma, ya que solamente una
porción del dominio es necesaria para la recombinación
homóloga.
Los mejores resultados son obtenibles usando
dominios que son idénticos, o si no idénticos lo más homólogos
posibles. El hecho de que la invención trabaje con variantes
alélicas, que no se suponen que sean idénticas, indica que la
identidad de los dominios no es un requerimiento.
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Sin desear ser confinados por la teoría, se
piensa que la identidad, u homología, de los dominios apropiados
para la integración es preferible por dos razones:
(1) para promover la recombinación, y la
integración, de las moléculas de ADN de entrada (que comprenden el
gen deseado) en más de un dominio, sobre la base del mismo
alargamiento de homología o uno muy similar; estos eventos son
independientes;
(2) para obtener "la igualación" de dos
dominios homólogos mediante un proceso el cual es de aquí en lo
adelante referido como la "conversión de genes". El proceso
mediante el cual esta así llamada conversión de genes tiene lugar
no está dilucidado aún, pero no es una preocupación, ya que el
conocimiento de su mecanismo no es crucial para llevar a la
práctica la invención.
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El proceso de la conversión de genes, el uso del
cual forma parte de esta invención, es manifiesta por la
ocurrencia, en una sub-población pequeña de la
población total de células, de dominios los cuales han adquirido la
misma o una estructura similar que el dominio homólogo. De esta
forma, como es ilustrado en los presentes ejemplos, una población
de células que tiene un dominio que hospeda una copia del gen
deseado y un dominio (homólogo) que hospeda dos copias del gen
deseado cuenta con células (entre sus células de descendencia) con
una copia en ambos dominios, así como la célula que tiene dos copias
del gen deseado en ambos dominios. Tan pronto como el número de
copias es igual en cada uno de los dominios homólogos la situación
es más estable que cuando las copias son distribuidas de manera no
uniforme entre los dominios de acuerdo a la invención. El número de
copias, sin embargo, tiende a decrecer no obstante, aunque en el
caso de la lactosa, la productividad de la proteína, el péptido o
el metabolito es estable bajo las condiciones de fermentación
industrial por al menos 50 generaciones. Experimentos similares con
células que hospedan hasta 15 dominios, han conducido a células que
tienen un número igual de copias (una o más) en cada uno de los 15
dominios. Parece haber una fuerte correlación entre el número de
copias y la expresión de los genes, medida determinando la cantidad
de producto de proteína producido, hasta un cierto número de copias.
El factor de correlación puede depender de gen a gen, y parece
estabilizarse al aumentar el número de copias. La ventaja, como será
claro para una persona experta en el arte, es que cada copia extra
contribuye de manera significativa a un nivel de expresión mas alto
del gen deseado, y consecuentemente con un mínimo de gasto de la
energía metabólica para la célula hospedera.
Adicionalmente, la estabilidad sorprendentemente
alta del número de copias en la población de células, en ausencia
de cualquier presión selectiva, hará claro que las células de
acuerdo a la invención tienen una ventaja significativa cuando son
usadas en un proceso de fermentación industrial. Las ventajas son ya
significativas en una fermentación de alimentación por lotes a
escala industrial, en un proceso continuo las ventajas son
presumiblemente más altas.
Correspondientemente, las células de acuerdo a
la invención pueden ser usadas de manera ventajosa para producir
grande cantidades de compuestos valiosos, tales como proteínas,
péptidos y metabolitos. En adición, o alternativamente, las células
pueden de manera ventajosa ser usadas para hacer metabolitos los
cuales acumulan, o acumulan en grandes cantidades, como resultado
de números de copias más altos, y como consecuencia de niveles de
expresión más altos, del gen deseado.
El significado de la palabra gen para los
propósitos de esta invención debe ser tomado en un sentido amplio.
Este se refiere al ADN genómico, así como a la copia de ADN (cADN),
o ADN sintético de manera parcial o total. Un gen de acuerdo a esta
invención se refiere a una secuencia de ADN, conjuntamente con las
secuencias que regulan la expresión que operan en la levadura
seleccionada, la cual codifica una proteína, es decir una
proteína estructural o una enzima, de cualquier tamaño. También los
péptidos (proteínas más pequeñas), tal como las hormonas
peptídicas, están incluidas. Un gen puede codificar para un ARN
mensajero monocistrónico o policistrónico (mARN), es decir que
codifica para dos o más cadenas de polipéptidos, las cuales pueden
ser las mismas o diferentes, o un mARN que codifica para un péptido
de fusión. La proteína o el péptido pueden ser producidos como una
proproteína que requiere procesamiento adicional de la cadena del
polipéptido para obtener la proteína madura deseada. Una proteína o
un péptido pueden ser producidos en forma de una
prepo-proteína o prepo-péptido
(como en el caso con muchas proteínas eucarióticas). La parte pre
comúnmente se refiere a un péptido líder que es escindido desde el
péptido o la proteína que madura durante el pasaje a través de la
ruta de secreción de la célula de levadura.
El gen puede ser modificado en sus elementos
regulatorios, es decir un terminador, promotor diferentes y/o otros
elementos regulatorios que actúan en la expresión de la modulación
del gen. En adición, o alternativamente, una modificación puede
envolver la secuencia de codificación del gen, incluyendo las
modificaciones que dejan la secuencia de aminoácidos de la proteína
codificada, o su forma precursora, como tal inalterada así como la
modificación la cual cambia la secuencia de aminoácidos.
Todos estos cambios pueden ser hechos de manera
rutinaria por aquellos de pericia en el arte, y ellos no se apartan
de la esencia de la invención.
Un gen deseado como es usado aquí no está
limitado a ningún tipo de proteína o péptido que pueda codificarse.
El gen deseado puede ser que tenga como origen la levadura o ser un
gen que "no es de levadura". Ejemplos de genes de levadura son
aquellos que codifican para enzimas involucradas en las rutas
metabólicas de la misma levadura, tales como la biosíntesis de los
carotenoides, la síntesis de la xantofila, la síntesis del
ergosterol, la síntesis de los nucleótidos, y similares. La sobre
expresión de los genes de las rutas metabólicas de las levaduras
pueden servir para sobre producir ciertos metabolitos intermedios o
productos finales en dichos rutas. Otros genes de levadura deseados
de acuerdo a la invención son aquellos que codifican enzimas tales
como la invertasa, la glucosa oxidasa, la lactosa, la enzima
malo-etanólica, y similares. También concebidos
como genes deseados de acuerdo a la invención están los genes que
codifican para enzimas que ajustan las rutas metabólicas
existentes, o extienden las rutas metabólicas tal como mejorar el
repertorio metabólico de la célula de levadura. Ejemplos de diseño
de rutas metabólicas son los legio.
Los genes deseados que no son de levadura de
acuerdo a la invención pueden ser derivados de plantas, animales,
bacterias y hongos, o sus virus, y ellos pueden codificar péptidos,
proteínas estructurales, tales como péptidos hormonas, o enzimas.
Las enzimas, péptidos o proteínas codificadas pueden tener
aplicaciones médicas o industriales. Ejemplos de enzimas
industriales son las lipasas (por ejemplo usadas en la
industria del detergente), las proteasas (usadas inter alia
en la industria del detergente, en la fabricación de cervezas y
similares), las enzimas que degradan las paredes de las células
(tal como, las celulasas, las pectinasas, las
\beta-1,3/4- y
\beta-1,6-glucanasas, las
ramnogalacturonasas, las mananasas, las xilanasas, las pululanasas,
las galactanasas, las esterasas y similares, usadas en la
fabricación de vinos por procesamiento de frutas y similares o en
la alimentación), las fitasas, las fosfolipasas, las glicosidasas
(tales como las amilasas, las \beta-glucosidasas,
las arabinofuranosidasas, las ramnosidasas, las apiosidasas y
similares), enzimas de productos lácteos (por ejemplo la
quimosina).
Las proteínas, polipéptidos y/o enzimas con
aplicaciones terapéuticas, cosméticas y de diagnóstico incluyendo
pero no limitadas a la insulina, la albumina del suero humano (HSA),
el activador plasminógeno del tejido (tPA), la eritroproietína
(EPO), los factores de necrosis tumoral (TNF), los factores del
crecimiento (G-CSF, GM-CSF,
M-CSF, PDGF, EGF, y similares), hormonas peptídicas
(por ejemplo la calcitonina, la somatomedina, las hormonas del
crecimiento, la hormona estimuladora del folículo (FSH), las
interleucinas (IL-x), los interferones
(IFN-\gamma), los antígenos virales y bacterianos,
las vacunas, los receptores y similares. También incluidos están
los genes que codifican para mutantes o análogos de dichas
proteínas.
La presente invención es especialmente ventajosa
cuando el gen deseado es un clúster de genes cuyos genes codifican
para enzimas que están involucradas en una ruta bioquímica en la
célula de levadura seleccionada. Un clúster de genes deseados puede
ser integrado en el genoma cromosómico de la levadura exactamente
como se describió para un gen deseado individual de acuerdo a la
invención; en ese caso la molécula de ADN con la cual la célula de
levadura es transformada es un clúster de genes deseados que
codifican para un número de enzimas, (b) una región de homología
con dicho dominio y (c) un gen marcador funcional en dicha célula
de levadura, donde la células que hayan obtenido integrar el clúster
de genes en el ADN que codifica el ARN no ribosómico son
seleccionadas o tamizadas. De manera alternativa, los genes deseados
que componen el clúster de genes son integrados uno o dos a la vez;
esto puede ser hecho de manera ventajosa usando un gen marcador
bidireccional el cual es eliminado después de cada ronda de
transformación. De acuerdo a la experiencia, al retransformar las
células, la integración de la molécula de ADN de entrada tiene lugar
en el dominio ya ocupado con una frecuencia más alta, que en el
dominio no ocupado. Así, se puede hacer una selección o tamizado
para una situación, donde un dominio eventualmente tiene todos los
genes en el clúster de genes integrados, mientras el (los)
otro(s) dominio(s) no tenga(n) ninguno, o
tenga(n) un conjunto incompleto. Subsiguientemente, el
dominio sub ocupado de la cepa que tiene el clúster completo
integrado en el otro dominio es provisto con un marcador y la
selección o el tamizado tiene lugar en la conversión de genes
exactamente como se describió para los genes deseados simples,
resultando en que tiene lugar la duplicación (o multiplicación si la
ploidía para el dominio es mayor que dos) del clúster completo.
Mediante estos métodos las cepas de levadura que tienen múltiples
copias de clusters de genes completos son integradas de manera
ventajosa en el genoma cromosómico donde son mantenidas y
expresadas de manera estable. Como un ejemplo de un clúster de genes
uno involucrado en la biosíntesis de los carotenoides en la
levadura Phaffia rhodozyma, puede ser mencionado, el clúster
comprende un gen que codifica para una enzima que tiene
geranilgeranil pirofosfato sintasa (crtE), actividad fitoena
sintasa (crtB), actividad fitoena desaturasa (crtI) y
actividad licopena ciclasa (crtY); la clonación de estos
genes esta descrita en PCT/EP96/05887, una copia de la cual esta
incorporada aquí como referencia. Como esta solicitud no ha sido
aún publicada una copia del texto es presentada con esta solicitud
como Anexo.
Los genes anteriores son meramente mencionados
para propósitos de ilustración, ellos de ninguna forman sirven para
limitar la invención.
Los genes de acuerdo a la invención pueden estar
bajo el control de sus propios elementos regulatorios, en tanto los
elementos regulatorios sean funcionales en la célula hospedera.
Preferiblemente, las regiones regulatorias son optimizadas para su
uso en una especie de levadura particular. De acuerdo a una
realización el gen deseado es un gen recombinante que comprende una
región promotora de transcripción, y adicionalmente de manera
opcional una región de terminación de la transcripción, funcional
en dicha célula de levadura. Promotores de transcripción apropiados
para la expresión de genes de levadura así como los que no son de
levadura son los promotores glicolíticos, tal como los promotores
de la fosfofructoquinasa (PPK), la triosa fosfato isomerasa (TPI),
la gliceraldehído-3-fosfato
dehidrogenasa (GAPDH), la piruvato quinasa (PK), la fosfoglicerato
quinasa (PGK); más detalles acerca de tales promotores pueden ser
encontrados en (WO 93/03159). Otros promotores útiles son los
promotores de genes que codifican proteínas ribosómicas, el
promotor del gen de la lactosa (LAC4), el promotor de la
alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH4, y similares), la
enolasa (ENO), el promotor de la fosfatasa ácida
(PHO5). También los promotores híbridos pueden ser
considerados. La elección del promotor no es crítica y depende del
gen deseado, el propósito y la preferencia de la persona experta.
La selección del terminador no es crítica, este puede ser de
cualquier gen de levadura, aunque los terminadores pueden algunas
veces funcionar si son de un gen, eucariótico, que no es de
levadura.
Con respecto al número de dominios apropiados
para la integración de un gen deseado, la invención es ilustrada
por dos dominios (dos alelos del locus del LAC4), pero las
células que tienen 15 dominios sustancialmente homólogos cada uno
incorporando uno o más genes deseados han sido obtenidas a través de
la conversión de genes. El número de copias de un gen deseado el
cual se mantiene estable dentro de un dominio puede depender de la
identidad del gen deseado. Para el gen de la lactosa, la situación
donde cada uno de los dos dominios incorporan tres copias del gen
de la lactosa, que totalizan 6 copias, parece ser una situación muy
estable, dando una expresión relativa la cual es casi dos veces y
media más alta que la cepa de dos copias CBS 685.97, por más de 50
generaciones; compare la LCT124 con la CBS 685.97. El número de
copias en cualquier dominio dado parece estar limitado por el
hecho, de que la integración tiende a tener lugar en un arreglo en
forma de tándem; para otros genes deseados diferentes al gen
LAC4 el número de copias por dominio puede ser más alto o
más bajo. Cualquiera que sea el número de copias por dominio, una
situación donde cada dominio contenga el mismo número de copias
parece ser mucho más estable que aquel donde un dominio contiene
menos copias; la situación de (3 + 3) es más favorable que la
situación de (2 + 4); esta última tiende a replegarse a la situación
de (2 + 2) presumiblemente debido a la conversión de genes.
De acuerdo a una realización preferida las
células de levadura están libres de genes marcadores. Esta situación
puede ser obtenida por la contra selección de un marcador de
selección dominante bidireccional, tal como el gen de la
acetamidasa (amdS) de la Aspergillus nidulans. Este
marcador puede ser usado para seleccionar los transformantes que
tienen el gen seleccionando con acetamida como única fuente de
carbón y/o nitrógeno, mientras la contra selección (un término
reservado de aquí en lo adelante para la selección relacionada con
la ausencia del gen marcador) puede ser hecha con, por ejemplo
fluoroacetamida. Otros marcadores de selección dominantes
bidireccionales que funcionan en las levaduras pueden ser usados de
forma análoga. La recombinación abierta del gen marcador
bidireccional es facilitada por la inserción del gen flanqueado por
repeticiones directas en el plásmido de entrada.
Como es descrito en la solicitud de patente
Europea 0 635 574, el marcador bidireccional es dominante en ambas
direcciones, que significa que las células transformadas de
cualquier antecedente genético pueden ser seleccionadas por la
presencia del marcador (usando la acetamida como única fuente de
carbono y/o nitrógeno). Otros marcadores bidireccionales son el
URA3, el LYS2, y similares, aunque estos últimos tiene
la desventaja que ellos no son "doble dominantes". Para
explicar, la selección por la presencia de estos tipos de marcadores
en las células transformadas requiere de un antecedente genético
auxótrofo; en otras palabras, estos marcadores son recesivos en una
dirección. En principio, esto no es un problema, ya que los medios
usados durante las fermentaciones en una escala industrial son
generalmente permisivos a los auxótrofos del tipo URA3 y
LYS2 (Alani y otros, 1987, Genetics 116,
541-545). La contra selección tiene lugar usando
agentes selectivos que consisten en precursores no tóxicos de
productos que son tóxicos para las células de levadura; en el caso
del URA3 el precursor puede por ejemplo ser el ácido
5-fluoro-orótico. Cuando el marcador
está presente y expresado en la levadura, los precursores
inofensivos son convertidos en el producto tóxico, seleccionado de
manera efectiva de esta forma la perdida del marcador entre las
células transforma-
das.
das.
El uso de células que estén libres de marcadores
es aceptado de manera más fácil por las autoridades regulatorias, y
al mismo tiempo presentan menos carga para el balance de energía de
la levadura bajo las condiciones de la fermentación industrial.
Las células que tienen un número igual de copias
por dominio sustancialmente homólogo son estables en su
productividad de proteínas por al menos 50 generaciones, sin la
necesidad de ninguna forma de presión de selección.
De acuerdo a una realización un método para
producir una proteína o un péptido es proporcionado, que comprende
el paso de cultivar una célula de acuerdo a la invención bajo
condiciones que conducen a la producción de dicha proteína o
péptido. Preferiblemente tales condiciones son las condiciones
industriales de alimentación por lotes en fermentadores a gran
escala, tal como de 100 m^{3}, más preferiblemente de más de 150
m^{3}, usando medios no costosos para el cultivo, tal como las
molasas, o el agua de macerado de maíz. También los medios
definidos químicamente pueden ser usados en fermentaciones a escala
industrial, ya que estos últimos pueden proporcionar ventajas
considerables en términos de control de residuos de herbicidas y
pesticidas, optimización del proceso. La proteína puede ser
producida de manera intracelular o, de manera extracelular, y
recuperada de las células o del medio de cultivo, según pueda ser el
caso. Los medios para la recuperación pueden incluir las técnicas
clásicas de separación bien conocidas en el arte, tal como la
precipitación y/o centrifugación, la cromatografía de columna y
similares. En caso de que el producto sea un metabolito en lugar de
una proteína o un péptido, consideraciones similares son aplicables.
Alternativamente, las células de levadura pueden ser usadas como
tales en un proceso (por ejemplo en la fabricación de cerveza, el
horneado, la fabricación de vinos, la producción de alcohol, el
procesamiento de desechos o similares) o como aditivo para el pienso
o los alimentos, opcionalmente después de la molienda (usando por
ejemplo molinos de bolas para abrir las células) y similares.
Ninguna de las técnicas de recuperación son críticas para la
presente invención.
Las levaduras de acuerdo a la invención pueden
ser propagadas y vendidas con el propósito de la propia levadura,
tal como para hornear, fabricar cerveza, fabricar vinos, para hacer
paredes de células y/o manoproteínas, o extractos de levadura.
Aquí, la levadura de acuerdo a la invención puede tener valor
añadido debido a su contenido de metabolito o proteína, el cual
puede ser incrementado de manera deseada o alterado en la
composición de acuerdo a los deseos del usuario.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ventajas de las cepas son resumidas a
continuación (no limitativas):
1. Integración estable;
2. Fuerte correlación entre la expresión y la
copia del gen;
3. Mayor productividad de la proteína por copia
integrada (económico para la célula);
4. Versátil: pueden ser usada en cualquier
cepa;
5. Pueden ser creadas plataformas de integración
para todo tipo de genes deseados sin la necesidad de tratar con los
efectos adversos de la integración una y otra vez;
6. Las plataformas de integración pueden ser
creadas en dominios del genoma altamente expresados;
7. Los dominios útiles pueden volverse a usar en
aprobaciones regulatorias para las cepas de producción.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes solicitudes de patentes pueden
servir para indicar el nivel general del conocimiento en el estado
del arte y meramente sirven para ilustrar los campos de aplicación
de la invención actual.
EP 0 068 740
(5-01-1983) "Vectores de clonación
de ADN recombinante y los transformantes eucarióticos y
procarióticos de los mismos" que ilustra el uso de marcadores
seleccionables de levadura, tal como la
higromicina-B, el de resistencia G418 y
similares;
EP 0 077 689
(27-04-1983) "Método de
manipulación genética usando una célula eucariótica como
hospedero", que ilustra el uso de una líder 3' para la expresión
de ADN en la célula eucariótica superior, tales como las levaduras
y los hongos;
EP 0 088 632
(14-09-1983) "Expresión,
procesamiento y secreción de proteína heterologa por la
levadura", que ilustra el uso de péptidos de señal homólogos
para la secreción en la especie Saccharomyces;
EP 0 096 910
(28-12-1983) "Levadura del género
Kluyveromyces modificada para la expresión del preprotaumatina o
sus varias formas alélicas o modificadas o sus formas de
maduración", que ilustra la clonación y expresión de genes
foráneos en la levadura Kluyveromyces;
EP 0 123 811
(12-06-1991) "El uso del promotor
de la levadura GAL 1";
EP 0 127 304
(5-12-1984) "Proceso para producir
proteína heterologa en la levadura, vehículo de expresión de la
misma, y la levadura transformada con esto", que ilustra la
secreción en la Saccharomyces usando el péptido señal de la
invertasa;
EP 0 123 544
(31-10-1984) "Proceso para
expresar proteína heterologa en la levadura, vehículos de expresión
y organismos de la levadura para los mismos", que ilustra el uso
del péptido señal/líder del factor alfa en la Saccharomyces
cerevisiae;
EP 0 139 383
(2-05-1985) "Método para expresar
genes foráneos en la Schizosaccharomyces pombe y el uso en
formulaciones terapéuticas de los productos, construcciones de ADN y
cepas transformantes de la Schizosaccharomyces pombe que
pueden usarse en tal método y su preparación";
US 4,745,062 "Vectores de plásmidos para la
clonación y expresión de una proteína en un microorganismo, que
comprenden al menos un promotor para la expresión de
B-Glucosidasa en levaduras; los microorganismos que
contienen estos plásmidos; un proceso de fermentación y las enzimas
obtenidas", que ilustran la sobre expresión de una
\beta-D-glucosidasa en la
Saccharomyces cerevisiae;
EP 0 164 556
(18-12-1985) "Transcripción de
levadura mejorada empleando construcciones de la región del promotor
híbrido", que ilustran el uso de promotores híbridos en la
expresión del gen de la levadura;
EP 0 707 068
(17-04-1996) "Vector de la
levadura", que ilustra un marcador de selección de la levadura,
el marcador de resistencia G418 del Tn903;
EP 0 163 491
(4-12-1985) "Vector de la
levadura", que ilustra la transformación de cepas industriales no
haploides de las levaduras Saccharomyces cerevisiae y
carlsbergensis;
EP 0 183 070
(9-10-1991) "Transformación de
levaduras del género Pichia", que ilustra la clonación y
expresión de genes en la levadura Pichia, usando mutantes
auxótrofos de la histidina;
EP 0 213 593
(10-04-1991) "Promotores de la
levadura reprimibles", que ilustran el uso de algunos promotores
de la levadura reprimibles en la producción de proteínas heterólogas
tal como el promotor híbrido (PH05):: GAPDH de la fosfatasa
ácida;
EP 0 301 669
(1-02-1989) "Construcciones de ADN
que contienen una secuencia leader del factor alfa de la
Kluyveromyces para la secreción directa de derivados
heterólogos" y EP 0 301 670
(1-02-1989) "Kluyveromyces como
una cepa hospedera", que ilustra la secreción de proteínas
foráneas en la Kluyveromyces usando los varios péptidos
señales y líderes, tal como el líder del factor alfa de la
Kluyveromyces;
WO 90 05787
(31-05-1990) "Vectores de
inserción de posición específica y método de usar los mismos",
que ilustra los vectores de integración de la levadura basados en
Ty3 en la Saccharomyces cerevisiae;
EP 0 394 538
(31-10-1990) "Una célula de
levadura del género Schwanniomyces", que ilustra la clonación y
la expresión de genes foráneos en la levadura
Schwanniomyces;
WO 90/14423
(29-11-1990) "Transformación de
microorganismo", que ilustra la transformación de la levadura
por el uso de la integración por un vector lineal que tiene regiones
de homología en las extremidades del vector linealizado;
NL 9001159
(16-12-1991) "Methode om de
efficientie van de secretie van eiwitten door gistcellen te
vergroten", ilustra los mutantes de Kluyveromyces y
Saccharomyces con secreción mejorada debido a que las paredes
de las células son permeables;
EP 0 531 187
(10-03-1993) "PROMOTEUR DE LEVURE
ET SON UTILISATION", describe el promotor ADH4 (alcohol
deshidrogenasa) de la levadura para la expresión de genes foráneos
en la levadura, tal como la Kluyveromyces lactis;
WO 94 01570
(20-01-1994) "Promotor del gen de
la proteína rp28 de la K. lactis y el uso del mismo", WO
94 01569 (20-01-1994) "Gen
promotor de la piruvato decarboxilasa de la K. lactis y el
uso del mismo", WO 94 03618
(17-02-1994) "Promotor del gen de
la transaldolasa de la K. lactis y el uso del mismo" y WO
94 13821 (23-06-1994) "El uso del
promotor del gen del la inulinasa de la Kluyveromyces
marxianus para la producción de proteínas", ilustran el uso
de otros promotores para la expresión de genes foráneos en la
levadura Kluyveromyces lactis;
\newpage
ES 2 059 280
(1-11-1994) "Levadura de vino
CECT1973 recombinante para la endoglucanasa de la T.
longibrachiatum", ilustra mejoras en la cepa de levadura de
vino por clonación y expresión de la endoglucanasa a partir de la
Trichoderma longibrachiatum en la Saccharomyces
cerevisiae bajo el control del promotor de actina;
EP 0 751 997
(28-09-1995) "ADN que codifica
enzimas de la ruta glicolítica para el uso en levaduras que producen
alcohol", que ilustran mejoras en las cepas de levadura por
ingeniería genética de la ruta de
Entner-Doudoroff;
EP 0 748 872
(18-12-1996) "Cepas de levadura de
hornear capaces de expresar y exportar al exterior celular la
enzima A-(1-4)-amilasa de la
Aspergillus oryzae: proceso de producción y aplicación",
que ilustra el mejoramiento de la Saccharomyces cerevisiae
para propósitos de hornear usando técnicas de recADN, tal como la
clonación y la expresión de la alfa amilasa a partir de
Aspergillus oryzae en levadura de hornear;
EP 0 096 430
(19-05-1983) "Sistema de clonación
para la especie Kluyveromyces", ilustra la transformación
del género Kluyveromyces;
EP 0 301 670
(28-07-1988) "Kluyveromyces
como una cepa hospedera", ilustra el uso del género
Kluyveromyces para la secreción de proteínas.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
adicionalmente la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad
\beta-Galactosidasa (lactosa) fue determinada de
acuerdo a Millar (Experimentos en genética molecular - Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1972) pp 352-355) usando
buffer Z y
o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranosida
como sustrato. Las células fueron cultivadas por centrifugación y
resuspendidas en buffer Z. Ellas fueron desintegradas haciéndolas
girar en forma de torbellino durante 3 x 1 minutos con perlas de de
vidrio y enfriamiento inmediato. Las perlas de vidrio y los
desechos de las células fueron removidos mediante 5 min de
centrifugación a 13 000 x g y el sobrenadante, centrifugado 15 min
a 13 000 x g, fue usado para los ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio de cultivo fue acidificado hasta pH 2
por la adición de 1 M de H_{2}SO_{4} e incubado por 2 hrs a
temperatura ambiente. La neutralización hasta pH 6 fue realizada por
la adición de 2 M de Tris base. Un volumen de 50 \mul de una
disolución apropiada fue añadido a 200 \mul de una suspensión al
12% de leche en polvo no grasa en 10 mM de CaCl_{2}, e incubado a
37ºC hasta que se forme un coágulo. Una unidad de actividad
quimosina es definida como la cantidad de quimosina activa requerida
para producir un coagulo en 10 min bajo estas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Las cepas del amdS^{+} fueron
cultivadas en YEPD (10 g/l de extracto de levadura; 20 g/l de
bactopeptona; 2% de glucosa) por 48 horas a 30ºC y 300 rpm.
2. El cultivo de células fue diluido en NaCl al
0.9%. 50-100 células fueron plantadas sobre una
placa YEPD agar.
3. Las placas fueron incubadas por 2 días (si
fuera necesario 3 días a 30ºC y luego plantadas para replicación en
placas de agar acetamida (abajo).
5. Las placas fueron incubadas 48 horas a
30ºC.
6. Las colonias del amdS fueron
re-moteadas sobre placas de YEPD agar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plugs de agarosa de la K. lactis
fueron preparados como fue descrito por Schwartz y Cantor (Célula
37, (1984) p. 67 et seq.). La TAFE fue realizada con Beckman
Geneline II de acuerdo a las Instrucciones de Operación del
Sistema. Condiciones: 1% de agarosa, 1 x
TAFE-buffer, 22 horas, 250 V, Interruptor A 4 seg,
Interruptor B 4 seg.
\vskip1.000000\baselineskip
Un protocolo PCR estándar consiste de 25 ciclos
de 1 min 94ºC, 1 min 55ºC y 1,5 min 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
- con una pipeta automática Wilson P20, parte de
una colonia de levadura fue resuspendida en 30 \mul de
H_{2}O
- Para evitar la evaporación una gota de aceite
mineral fue añadida
- La suspensión de las células fue incubada 15
minutos a 98ºC
- La temperatura fue reducida a 72ºC
- 20 \mul de la siguiente mezcla de reacción
fueron añadidos:
\vskip1.000000\baselineskip
- dNTP mix:
- concentración final en la reacción PCR: 200 \mum de cada nucleótido dATP, dCTP, dGTP, dTTP
- dVB:
- concentración final en la reacción PCR:
- \quad
- 1 mM de Tris-HCL pH8,0
- \quad
- 1 mM de NaCL
- \quad
- 0,1 mM de EDTA
\vskip1.000000\baselineskip
Super TAQ
- Buffer de reacción:
- concentración final en la reacción PCR:
- \quad
- 10 mM de Tris-HCL pH9,0
- \quad
- 1,5 mM MgCl_{2}
- \quad
- 50 mm de KCl
- \quad
- 0,01% (peso/volumen) de gelatina
\vskip1.000000\baselineskip
Super TAQ ADN Polimerasa
0,2 unidades por reacción
- -
- La PCR fue comenzada usando el siguiente programa:
- 45'' a 94ºC
- 45'' a 55ºC
- 2' a 72ºC
- 25 ciclos seguidos por 1 paso: 7' a 72ºC
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Cepa de E. coli GM 48 (dam): ATCC 39099
- -
- Medio
- Para las determinaciones de la lactosa y la quimosina la CBS 685.97 fue cultivada en un medio que contiene 10 g/l de extracto de levadura; 20 g/l de bactopeptona y 2% de galactosa.
- -
- Placas YCB acetamida contenían 1.2% de agar oxoid, 1 x YCB (Agar base carbonado de Difco), 30 mM de buffer K-PO_{4} pH 6.8, 5 mM de acetamida (Sigma)
Procedimientos de Biología Molecular Estándar
fueron llevados a cabo de acuerdo a Sambrook y otros en
Clonación Molecular: un Manual de Laboratorio, 2da Edición (1989;
Cold Spring Harbor Laboratory Press).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN cromosómico fue aislado de la cepa de
K. lactis CBS 685.97 por procedimientos estándares (Struhl
y otros Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 76 (1979)
1035-1039) El ADN fue escindido con XbaI y
clonado en el plásmido pUC18 escindido con XbaI y tratado
con fosfatasa. Un gen de la lactosa que contienen el clon fue
recogido como fue descrito por Dickson y Markin (Célula 15
(1978, 123-130). El clon resultante contenía dos
copias del pUC 18 en tándem (fig. 1).
El plásmido pUCla56 fue escindido con
XbaI y el fragmento que contenía el gen LAC4 fue
clonado en el único sitio XbaI del plásmido
pUCG481-1 (Van den Berg y otros, EP 0301 670)
produciendo el plásmido pGBG418 LAC (Fig. 1).
El pGBLACAmdS fue construido clonando el
fragmento SpeI/SalI P_{lac4}/LAC4/T_{lac4}
del pGBG418LAC en los sitios XbaI/XhoI del vector
pGBamdS-3 (Selten y otros, EP 0 635 574). Por esta
construcción el marcador amdS y las secuencias de
E.coli fueron clonadas entre las repeticiones del terminador
del LAC4. Antes que el pGBamdS-3 pudiera ser digerido
con XbaI el vector fue transformado en E.coli GM48
para remover la metilación del sitio XbaI. Para un
aislamiento más fácil del fragmento SpeI/SalI
P_{lac4}/LAC4/T_{lac4} del pGBG418LAC este vector fue
también digerido con SacI el cual también digirió el pUCG418
en 2 partes. 16 colonias de E.coli JM109 fueron obtenidas. El
ADN plasmídico fue aislado y chequeado por análisis de restricción
y todos los clones tenían la estructura correcta. Uno de estos
clones es llamado pGBLACAmdS (Fig. 2).
\vskip1.000000\baselineskip
El pGBLACAmdS fue digerido con
SacII y transformado en CBS 685.97 por el método de Ito y
otros (J. Bact 153 (1983) 163-168). El
vector aún contiene secuencias de E. coli las cuales serán
integradas en el genoma de la levadura pero que pueden ser
removidas conjuntamente con el marcador amdS con
posterioridad (Selten y otros (op. cit)). Los transformantes fueron
seleccionados en placas YCB/acetamida. Después de 3 días de cultivo
a 30ºC muchos transformantes eran visibles.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis Southern fue realizado en 18
transformantes del pGBLACAmdS y en la CBS 685.97 (ver las
figuras 3 y 4). 15 transformantes mostraron los fragmentos
esperados para la correcta integración del pGBLACAmdS y 3
transformantes mostraron en adición a los fragmentos esperados para
la correcta integración, otro fragmento lo cual significa que la
construcción del pGBLACAmdS está (también) integrada en algún
otro sitio en el genoma (16% de integración aleatoria en el caso de
los transformantes AmdS-8, -9 y -20). También algunas
estimaciones fueron hechas alrededor del número de copias del
pGBLACAmdS de los transformantes (Tabla 1). Fue encontrado
sorprendentemente que la cepa CBS 685.97 contiene dos genes
LAC4 endógenos. Por lo tanto, el número total de copias del
gen LAC4 es fácilmente encontrado sumando el número de copias
del pGBKLACAmdS y estos dos genes LAC4 endógenos
(Tabla 1). El número de transformantes que tiene un número dado de
copias del LAC4 fue calculado como un porcentaje del número
total de transformantes analizados (18) y es también dado en la
Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Con la TAFE el número de copias del LAC4
de 14 transformantes del pGBLACAmdS fue determinado de manera
más precisa (Figura 5). El número de copias del pGBLACAmdS y
el número total de genes LAC4 presentes en los
transformantes es presentado en la Tabla 2. Los transformantes
AmdS-1, -5, -6, -7, -9, -17, -18, -19 y -21 mostraron en
adición a un fragmento de 23 kb muchos otros fragmentos que
representan muchas copias del pGBLACAmdS integradas en uno
de los dos loci del LAC4 endógenos. Sin embargo estas copias
no son estables como es mostrado por el patrón de hibridación en la
Fig. 5.
Los transformantes 2 y 13 fueron almacenados
como LCT 101 y LCT 102, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cepa libre de ADN heterólogo con 3 copias
del gen de la lactosa puede ser obtenida a través de una
recombinación abierta interna en las repeticiones del terminador
del LAC4. Una recombinación abierta interna correcta en las
repeticiones del terminador del LAC4 (figura 4) resulta en la
eliminación de todas las secuencias de ADN heterólogas (pTZ19R y
Klef/amdS).
Esto resulta en una cepa libre de ADN heterólogo
con 1 copia extra del gen de la lactosa. La perdida del gen de la
acetamidasa fue usado para la selección de las cepas libres de ADN
heterólogo.
- -
- Los derivados del AmdS^{-} han sido aislados a través de selección negativa en placas de acetamida. Alrededor del 1% del número total de células había perdido el gen de la acetamidasa.
- -
- Para seleccionar una recombinación abierta que haya mantenido 3 copias del gen de la lactosa los derivados del amdS^{-} fueron tamizados por PCR, con el oligo LACT1 y el oligo LACP1. La posición de estos oligos está indicada en la figura 4c. Solamente las cepas del amdS^{-} con al menos 1 copia extra del gen de la lactosa integrada en forma de tándem en uno de los loci del LAC4 puede dar un fragmento de PCR de alrededor de 600 bp.
- Alrededor de 100 derivados han sido tamizados por PCR de los cuales 25 derivados eran de amdS^{-}. Solamente uno de estos 25 derivados de amdS^{-} dio un fragmento de PCR de 600 bp. A partir de esta cepa la producción de lactosa en un matraz vibrante fue determinada. La producción de lactosa fue comparable a la producción de la LCT101. La nueva cepa fue designada LCT105.
- -
- La LCT105 fue adicionalmente analizada por la técnica Southern-blot. El ADN cromosómico fue digerido con KpnI e hibridado a la sonda del promotor del LAC4: el patrón de hibridación esperado fue encontrado. La Figura 4b y 4c es una representación esquemática de la estructura cromosómica en la LCT101 y la LCT105, la sonda del promotor del LAC4 y la longitud de los fragmentos de hibridación son indicados.
De estos resultados concluimos que la nueva cepa
estaba libre de ADN heterólogo. Esta contiene una copia extra del
gen de la lactosa en uno de los dos loci del LAC4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el aislamiento de una cepa para la
producción de lactosa libre de marcadores de 4 copias, la LCT105 fue
transformada con el PGBLACamdS. 2 transformantes con
diferentes estructuras cromosómicas han sido aislados:
En la cepa LCT106 el pGBLACamdS es
integrado en el locus del LAC4 que contiene solamente el gen
endógeno LAC4. Por lo tanto esta cepa tiene 2 copias del gen
de la lactosa en cada locus del LAC.
La LCT107 tiene la copia del pGBLACamdS
integrada en forma de tándem en el locus del LAC4 que ya
contiene 2 copias del gen de la lactosa.
La LCT108 es un derivado amdS^{-} de 4
copias de la LCT106 y la LCT109 es un derivado amdS^{-} de
4 copias de la LCT107.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- La LCT105 fue transformada con el pGBLACamdS usando el procedimiento de Ito y otros (op cit.). Los transformantes fueron plantados en placas de acetamida y subsiguientemente en placas YEPD agar.
- -
- A partir de 40 transformantes fue determinada la producción de lactosa en el matraz vibrante. 15 a 20% de los transformantes tuvieron una producción de lactosa como lo esperado para una cepa de 4 copias. El resto de los transformantes tuvo una producción de lactosa más baja.
- -
- Los transformantes con una producción de lactosa igual o mayor que la LCT105, han sido analizados por la técnica de Southern-blot.
- Los ADN cromosómicos fueron digeridos con KpnI; las hibridaciones fueron realizadas con la sonda del promotor del LAC4 indicada en el mapa físico de la figura 4c.
- Todos los transformantes mostraron el patrón de hibridación esperado. La intensidad de la banda de 7.5 kb es una medida del numero de copias del pGBLACamdS integradas.
- -
- Para determinar el número exacto de copias y la estructura cromosómica 15 transformantes han sido adicionalmente analizados por TAFE.
- El ADN cromosómico fue digerido con MluI el cual no se corto en pGBLACamdS. Por lo tanto la longitud de los fragmentos de hibridación es una medida del número de copias.
- Dos transformantes han sido almacenados.
- -
- La LCT106 tiene 2 copias del gen de la lactosa en cada locus del LAC4. La LCT107 tiene 3 copias en un locus del LAC4 y 1 copia en el otro locus.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Ambas cepas de 4 copias LCT106 y LCT107 fueron tamizadas por la presencia de derivados de amdS^{-} en placas mínimas de acetamida como se describió anteriormente.
- De la cepa LCT106 fueron tamizadas 10000 colonias. Alrededor de 150 colonias de amdS^{-} fueron encontradas.
- De la cepa LCT107 fueron tamizadas alrededor de 15000 colonias. Alrededor de 300 colonias de amdS^{-} han sido aisladas.
- -
- Para el aislamiento de una cepa libre de marcadores de 4 copias todos los aislados de amdS^{-} han sido analizados en relación con su producción de lactosa. Loa aislados con una producción de lactosa comparable a aquella de las células hospederas, 15 a partir de la LCT106 y 2 a partir de la LCT107 han sido adicionalmente analizados. A partir de estas cepas fue determinada una vez más la producción de lactosa en el matraz vibrante. La mayoría de los aislados tuvo una producción de lactosa comparable a la producción de la LCT106 o LCT107.
- El ADN cromosómico fue analizado con KpnI, todos los aislados mostraron el patrón de hibridación esperado. A partir de los resultados de la técnica de Southern blots de los geles normal (digestión con KpnI) o de TAFE (digestión con MluI) concluimos que todos los aislados de amdS^{-} eran libres de ADN heterólogo y que tenían la estructura cromosómica correcta.
- El aislado 123, un derivado de la cepa LCT106, fue designado LCT108 y el aislado 549, un derivado de LCT107, fue designado LCT109.
Para el aislamiento de una cepa libre de
marcadores de 6 copias la LTC109 fue transformada con el
pGBLACamdS. Un transformante de 1 copia con el vector de
expresión del pGBLACamdS integrado en forma de tándem en el
locus del LAC4 con solamente una copia del gen del
LAC4 fue seleccionado. Un transformante con tal estructura
cromosómica tiene la ventaja que en 1 ronda de selección una cepa
libre de marcadores de 6 copias puede ser aislada a partir de una
cepa de 4 copias mediante la conversión de genes.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- La LCT109 fue transformada con el pGBLACamdS de acuerdo al método de Ito y otros (op cit.). 46 transformante fueron primero re-moteados sobre placas mínimas de acetamida y subsiguientemente sobre placas YEPD.
- -
- Para seleccionar los transformantes con solamente una copia del pGBLACamdS, fue determinada la producción de lactosa de estos transformantes en el matraz vibrante. Todos los 46 transformantes tuvieron una producción de lactosa igual o por encima de la producción de lactosa de la cepa hospedera LCT 109. Para seleccionar una cepa con una estructura cromosómica apropiada, es decir la copia del pGBLACamdS integrada en forma de tándem en el locus del LAC4 con solamente 1 copia del gen del LAC4, el ADN cromosómico fue analizado con MluI. Esta enzima no se cortó en casete de expresión de la lactosa. Por lo tanto la longitud de los fragmentos de hibridación es una medida del número de copias que están integradas en forma de tándem. El ADN digerido fue separado por TAFE, se le aplico la técnica de Southern blot y finalmente hibridado con la sonda del promotor del LAC4. Dos transformantes con la estructura cromosómica correcta fueron almacenados como LCT111a y LCT111b.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Alrededor de 20000 colonias de la cepa LTC111a han sido tamizadas por la presencia de derivados de amdS^{-} por selección en placas positivas y negativas de acetamida.
- -
- Alrededor de 200 derivados de amdS^{-} fueron aislados a partir de la cepa LCT111a.
- -
- Para aislar las cepas libres de marcadores con al menos 5 copias de la lactosa hemos determinado la producción de lactosa para los aislados de amdS^{-} en el matraz vibrante.
- -
- 10 aislados a partir de la LCT111a tuvieron una producción de lactosa comparable o mayor que la LCT111a. Ellos fueron adicionalmente analizados por la técnica de Southern blot y TAFE (digestión con MluI) para determinar sus números de copias y la estructura cromosómica.
- El número exacto de copias de 7 cepas fue determinado por TAFE. Seis de siete cepas (LCT 120 hasta la 125) tuvieron 6 copias del gen de la lactosa con 3 copias integradas en forma de tándem en cada locus. La cepa LCT126 tuvo también 6 copias pero 2 copias en un locus del LAC4 y en 4 copias el otro integradas en forma de tándem. Los resultados: el número de copias y la producción de lactosa de las diferentes cepas están resumidos en la tabla 2.
- Ninguna cepa libre de marcadores de 5 copias pudo ser aislada; en ninguno de los aislados una recombinación abierta correcta había ocurrido. Las cepas LCT120 a la LCT126 se originaron a partir de una conversión de genes. La estructura cromosómica del LTC125 (2 copias en uno y 4 copias en el otro locus integradas en forma de tándem) no puede ser explicada a través de la conversión de genes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los niveles de producción de lactosa de varias
cepas fueron determinados después de la centrifugación de las
células. Los resultados de estas determinaciones están presentados
en la Tabla 3. Está claro que existe una correlación entre el
número de copias del gen LAC4 y el nivel de expresión de la
lactosa hasta 5 copias. A un número de copias más alto la
expresión del gen LAC4 se estabiliza.
Para confirmar que las cepas LCT105, LCT108,
LCT109, LCT121, LCT124 y LCT125 están libres de ADN foráneo se ha
realizado la hibridación con diferentes sondas. Todas las sondas, el
promotor Klef, el pTZ19R y el cADN amdS completo mostraron
el patrón esperado.
El plásmido pGBamdS 6 (Selten y
otros op. cit) fue escindido con SalI y SpeI y el
fragmento de 9kb fue aislado mediante el kit de extracción en gel
de Quiagen. Los oligos 4596 y 4597 fueron cebado con PCR en ADN
cromosómico a partir de la cepa CBS 685.97 aislada por el método de
Das & Hollemberg (1982, Current Genet. 5,
123-128). El fragmento de 2 kb que resultó fue
aislado mediante un kit de extracción en gel de Quiagen. Después de
la digestión con SalI y SepI el fragmento fue ligado
al fragmento de 9kb descrito anteriormente, resultando en el
plásmido pGBamdS 61 (Fig. 6).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pGBAmdS 61 fue escindido con
Hind III y extraído con fenol, seguido por precipitación en
etanol antes de la transformación. El ADN fue disuelto y
transformado en la CBS 685.97 por el método de Ito y otros
(op. cit). Los transformantes fueron analizados mediante PCR en
células de K. lactis intactas con los oligos 4719 y 4720.
Con estos oligos es posible discriminar entre el reemplazo de genes
que remueve uno de los genes LAC4 y el evento que conduce a
la integración del plásmido después de la circularización. Este
último evento origina un fragmento amplificado de 700 bp. Las cepas
que no originaron tal fragmento fueron cultivadas en placas YCB
agar acetamida. Los ADN cromosómicos fueron aislados a partir de los
transformantes, digeridos con BamHI e hibridados con un fragmento
terminador del LAC4 desde EcoRI hasta XbaI
(Breunig y otros Nucleic Acids Res 12 (1984)
2327-2341). La cepa resultante fue designada GBA5 de
la K. lactis.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa GBA5 de la K. lactis fue
transformada (Ito y otros op cit.) con el plásmido pKS105
(Van den Berg y otros EP 0301670) escindido con Sst2. Los
transformantes fueron seleccionados por la presencia de los
marcadores seleccionables amdS y G418. Las cepas las cuales
habían integrado 1, 2 o 3 copias en el locus de la lactosa natural
fueron identificadas por TAFE después de la escisión con
MluI. Las cepas con 1, 2 o 3 copias fueron designadas
GBA-CHY01, 02 y 03, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de partida GBA-CHY01,
02 y 03 fueron seleccionadas por la presencia de un fenotipo
negativo del admS como se describió en el ejemplo IV c. En
cada caso alrededor de 5 colonias negativas de amdS fueron
aisladas de 20.000 colonias plantadas en placas YEPD acetamida y
YEPD normales (ver los métodos). Esto resultó en una colonia para
cada una de CHY 01, 02 y 03, las cuales habían doblado el número de
copias de la quimosina mediante la conversión de genes. Estas
colonias fueron designadas GBA-CHY11, 22 y 33
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las 6 copias integradas del casete de expresión
de la quimosina pKS105 (divididas de igual manera a través de los
dos loci de la lactosa) en la cepa GBA-CHY33 no
fueron completamente estables (ver la Fig. 7). Para aislar una cepa
de 6 copias más estable colonias simples de
GBA-CHY33 fueron aisladas y analizadas por el
número de copias. La cepa GBA-CHY33 fue moteada en
una placa YEPD para aislar una colonia simple (una ronda de
purificación). 10 colonias simples de cada ronda de purificación
fueron analizadas por el número de copias con la ayuda de la
Electroforesis Transversal de Campos Alternos (TAFE). Los plugs de
agarosa que contienen ADN cromosómico fueron digeridos con la
enzima de restricción MluI y fraccionados en partes por TAFE.
Esta enzima no se corta en el casete de expresión de la quimosina.
Por lo tanto la longitud del fragmento de hibridación es una medida
del número de copias que están integradas en forma de tándem.
Después de la transferencia a la nitrocelulosa, la hibridación fue
realizada de acuerdo a los procedimientos estándares. Como sonda un
fragmento del promotor del LAC4 fue usado, indicado en el
mapa físico de la figura 4c. Después de la hibridación esperábamos
solo un fragmento con la longitud de 3 copias de la quimosina (ver
la Fig. 7) En caso de inestabilidad (pérdida de copias de la
quimosina) fragmentos más cortos son detectados lo que representa
los loci con 1 o 0 copias de la quimosina en los loci de la
lactosa. Después de cuatro rondas de purificación una cepa de 6
copias más estable fue encontrada. Esta cepa de 6 copias fue
reaislada nuevamente y 50 SCI fueron analizados por el número de
copias con TAFE. Una cepa de 7 copias fue encontrada entre estas
colonias simples, divididas como 4 y 3 copias del pKS105 a través
de los dos loci de la lactosa (ver la Fig. 7). Esta cepa fue
designada GBA-CHY43. Probablemente una de las
copias de la quimosina fue amplificada.
De la misma forma una cepa de 9 copias fue
encontrada entre los 10 aislados de las colonias simples de la cepa
GBA-CHY43, la cual fue designada
GBA-CHY54. Las 9 copias de la quimosina de la cepa
GBA-CHY54 fueron divididas como 5 y 4 copias del
pKS105 a través de los dos loci de la lactosa (ver la Fig. 7). Entre
los 9 aislados de las colonias simples de la cepa
GBA-CHY54 una cepa de 8 copias fue encontrada, la
cual fue designada GBA-CHY53. Las 8 copias de la
quimosina de la cepa GBA-CHY53 fueron divididas como
5 y 3 copias del pKS105 a través de los dos loci de la lactosa (ver
la Fig. 7).
Un análisis Southern fue realizado para
verificar si una eliminación en el casete de expresión de la
quimosina de la cepa GBA-CHY22,
GBA-CHY33, GBA-CHY43,
GBA-CHY53 y GBA-CHY54 había
ocurrido. Los plugs de agarosa, que contienen ADN cromosómico
fueron digeridos con HinDIII y realizada electroforesis
subsiguiente sobre un gel de agarosa al 0.7%. Después de la
transferencia a la nitrocelulosa, la hibridación fue realizada de
acuerdo a los procedimientos estándares. Como sonda un fragmento
del promotor del LAC4 fue usado, indicado en el mapa físico
de la figura 4c. La Figura 8 es una presentación esquemática del
patrón de hibridación de la GBA-CHY22. Las otras
tres cepas muestran el mismo patrón de hibridación, el fragmento de
hibridación de 3.6 kb es característico para una repetición en
tándem del casete de expresión pKS105. En todas las cepas el patrón
de hibridación esperado fue encontrado (ver la Fig. 9). Cuando 3 o
más copias del casete de expresión de la quimosina pKS105 están
integradas en forma de tándem en el locus del LAC4 la intensidad del
fragmento de hibridación de 3.6 kb es mayor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los niveles de producción de quimosina fueron
determinados como se describió en los materiales y métodos después
de la centrifugación de las células de K. lactis.
Los niveles de producción relativas son
presentados en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
En paréntesis está la distribución del número de
copias a través de dos loci (LAC4) de la lactosa determinada por
TAFE. El nivel de producción de quimosina en el matraz vibrante de
varias cepas de quimosina es expresado como un % de la cepa
GBA-CHY11.
A partir de los resultados está claro que existe
una correlación entre el número de copias del plásmido pKS105 y el
nivel de producción de quimosina hasta 4 copias. El incremento se
estabiliza a un número de copias por encima de 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra de la Kluyveromyces lactis
que tiene dos dominios apropiados para la integración de un gen
deseado (dos loci del LAC4) fue depositada en Abril 11, de
1997 bajo el número CBS 685.97 en el Centraal Bureau voor
Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, Holanda.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Gist-brocades B.V
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Wateringseweb 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Delft
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2611 XT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cepas De Levadura Mejoradas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA COMPUTARIZADA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco floppy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN DE LAS HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: AB5677
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATTGCTGTT TTACTTGAGA TTTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN DE LAS HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: AB5678
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTGGTTTA CCGTACTTCC AGTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN DE LAS HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: LACP1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTATCTGT TCCTTTCCTT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN DE LAS HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: LACT1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTATGTACTT ACAGGTATAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN DE LAS HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 4596
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCTCTTATA GTCGACTCTA ATTCTTCTAA GCTTCTACCC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN DE LAS HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 4597
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCTTTGGT TACTAGTATC GTC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN DE LAS HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 4719
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAATGCAAT CCATGTACTC AAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN DE LAS HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 4720
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATTCTGCA TCGATCCAGT ATG
\hfill23
Claims (37)
1. Una célula de levadura que comprende al menos
dos copias de un gen deseado integradas en su(s)
cromosoma(s), donde dicho(s) cromosoma(s)
comprende(n) al menos dos dominios de ADN apropiados para la
integración de una o más copias de dicho gen deseado, cuyos
dominios comparten una homología sustancial de secuencias y son
dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico, y donde al
menos dos de dichos dominios de ADN que codifican el ARN no
ribosómico sustancialmente homólogos tienen al menos una copia de
dicho gen deseado integrada.
2. La célula de levadura de la reivindicación 1,
donde al menos dos de dichos dominios de ADN que codifican el ARN
no ribosómico sustancialmente homólogos apropiados para la
integración de una o más copias de dicho gen deseado tienen dos o
más copias de dicho gen deseado integradas.
3. La célula de levadura de la reivindicación 1
o 2, donde cada dominio de ADN que codifica el ARN no ribosómico
sustancialmente homólogo apropiado para la integración de una o más
copias de dicho gen deseado tiene un número idéntico de copias de
dicho gen deseado integrado.
4. La célula de levadura de la reivindicación 1,
donde dichos dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico
sustancialmente homólogos apropiados para la integración de una o
más copias de dicho gen deseado son duplicados sustanciales de unos
y otros.
5. La célula de levadura de la reivindicación 4,
donde dichos dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico
sustancialmente homólogos son formas alélicas de unos y otros.
6. La célula de levadura de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, la cual es una célula de levadura
Kluyveromyces.
7. La célula de levadura de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el gen deseado es un gen de la
levadura.
8. La célula de levadura de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el gen deseado no es un gen de
la levadura.
9. La célula de levadura de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde el gen deseado es un gen
recombinante que comprende una región promotora de transcripción, y
opcionalmente de manera adicional una región de terminación de
transcripción, funcional en dicha célula de levadura.
10. La célula de levadura de la reivindicación
1, donde el gen deseado es seleccionado del grupo que consiste de
aquellos que codifican para la lactosa, la quimosina, la
fosfolipasa, la insulina, la HSA, el tPA, el G-CSF,
las interleucinas, los interferones, una hormona peptídica, una
enzima que degrada las paredes de las células de las plantas.
11. La célula de levadura de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde el número de dominios que
codifican el ARN no ribosómico apropiados para la integración de una
o más copias de dicho gen deseado es dos y el número de copias de
dicho gen deseado por dominio es al menos tres.
12. La célula de levadura de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, cuya célula es una célula de levadura
libre de genes marcadores.
13. Un cultivo de las células de levadura, donde
las células de levadura son de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes.
14. El cultivo de las células de levadura de la
reivindicación 13 que es estable en su productividad de proteínas,
péptidos y metabolitos por al menos alrededor de 50 generaciones sin
presión selectiva.
15. La célula de levadura de la reivindicación
6, donde dichos dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico
sustancialmente homólogos son alelos del LAC4.
16. Un método para producir una proteína o un
péptido, que comprende el paso de cultivar una célula de levadura
de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes bajo
condiciones que conducen a la producción de dicha proteína o
péptido.
17. El método de la reivindicación 16, que
adicionalmente comprende el paso de recuperar la proteína de las
células y/o del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Un método de obtener una célula de levadura
capaz de producir un péptido o una proteína deseada que comprende
los pasos de:
(a) transformar una célula de levadura que tiene
un genoma el cual comprende al menos dos dominios de ADN apropiados
para la integración de una o más copias de un gen deseado, cuyos
dominios comparten una homología sustancial de secuencias y son
dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico, con una molécula
de ADN que comprende un gen deseado que codifica para dicho péptido
o proteína, o un precursor de los mismos, y una región de homología
con dicho dominio;
(b) seleccionar o tamizar las células que hayan
obtenido al menos una copia de dicho gen deseado integrada en al
menos uno de dichos dominios de ADN que codifican el ARN no
ribosómico apropiados para la integración de una o más copias de un
gen deseado;
(c) propagar las células obtenidas en (b) y
tamizar o seleccionar las células que hayan obtenido al menos una
copia de dicho gen deseado integrada en al menos dos de dichos
dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico.
\vskip1.000000\baselineskip
19. El método de la reivindicación 18 que
comprende en adición al paso (a), (b) y (c) el paso de:
(d) propagar las células obtenidas en (c) y
tamizar o seleccionar las células que hayan obtenido al menos una
copia de dicho gen deseado integrada en una copia adicional de
dichos dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico.
\vskip1.000000\baselineskip
20. El método de la reivindicación 19 que
comprende en adición al paso (a), (b), (c) y (d) el paso de:
(e) repetir el paso (d) hasta que cada copia de
dichos dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico haya
obtenido al menos una copia integrada de dicho gen deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
21. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 18 - 20 donde, un marcador seleccionable
bidireccional es usado en la transformación de las células de
levadura en el paso (a), y donde la remoción del marcador
seleccionable es efectuada antes del paso (c).
22. El método de la reivindicación 21, donde el
marcado seleccionable bidireccional es un marcador dominante,
preferiblemente un gen de la acetamidasa.
23. El método de la reivindicación 21 o 22,
donde subsiguiente a la remoción del marcador seleccionable
bidireccional, el paso (a) es repetido al menos una vez.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Un método de obtener una célula de levadura
capaz de producir un péptido o una proteína deseada que comprende
los pasos de:
(a) transformar una célula de levadura que tiene
un genoma el cual comprende al menos dos dominios de ADN apropiados
para la integración de una o más copias de un gen deseado, cuyos
dominios comparten una homología sustancial de secuencias y son
dominios de ADN que codifican el ARN no ribosómico, con una molécula
de ADN que comprende un gen deseado que codifica para dicho péptido
o proteína, o un precursor de los mismos, y una región de homología
con dicho dominio;
(b) seleccionar o tamizar las células que hayan
obtenido al menos una copia de dicho gen deseado integrada en al
menos uno de dichos dominios de ADN que codifican el ARN no
ribosómico apropiados para la integración de una o más copias de un
gen deseado;
(c) transformar una célula obtenida en (b) con
una segunda molécula de ADN que comprende un gen marcado
seleccionable, y una región de homología con dicho dominio;
(d) seleccionar o tamizar las células que hayan
obtenido al menos una copia de dicho gen marcador seleccionable
integrada en uno de dichos dominios de ADN que codifican el ARN no
ribosómico sin una o más copias del gen deseado;
(e) propagar las células obtenidas en (d) y
tamizar o seleccionar las células que hayan perdido el gen marcador
seleccionable y hayan obtenido al menos una copia de dicho gen
deseado integrada en al menos dos de dichos dominios de ADN que
codifican el ARN no ribosómico.
\vskip1.000000\baselineskip
25. El método de la reivindicación 24, donde el
gen marcador seleccionable es un gen marcador bidireccional.
26. El método de la reivindicación 24, donde el
gen marcador seleccionable es un gen marcador bidireccional
dominante, preferiblemente un gen de la acetamidasa.
27. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 18-26 donde la célula de levadura
es una célula de la Kluyveromyces.
28. Una célula de levadura del género
Kluyveromyces que no es haploide para al menos un locus, y
cuya célula de levadura tiene en cada alelo de dicho locus no
haploide una o más copias de un gen deseado integradas.
29. La célula de la Kluyveromyces de la
reivindicación 28, la cual tiene el mismo número de copias de dicho
gen deseado integrado en cada alelo.
30. La célula de la Kluyveromyces de la
reivindicación 29, donde el gen deseado en un gen que no es de la
levadura.
31. La célula de levadura de cualquiera de las
reivindicaciones 28 a la 30, cuya célula de levadura es una célula
de levadura libre del gen marcador.
32. Un método para producir una proteína, un
péptido o un metabolito en las células de levadura, cultivando las
células de levadura bajo condiciones que provocan la producción de
dicha proteína, péptido o metabolito, donde la célula de levadura
es una célula de levadura de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 31.
33. Uso de un gen marcador bidireccional para la
selección de convertidores de genes putativos de las células de
levadura no haploide.
34. La célula de la levadura
Kluyveromyces de acuerdo a la reivindicación 28, donde el gen
deseado es un gen que codifica la lactosa o un derivado de la misma
y donde el número de copias de dicho gen en cada alelo del locus no
haploide es dos.
35. La célula de la levadura
Kluyveromyces de acuerdo a la reivindicación 28, donde el gen
deseado es un gen que codifica la quimosina o un precursor o
derivado de la misma y donde el número de copias de dicho gen en
cada alelo del locus no haploide es uno.
36. Un método para producir lactosa,
caracterizado por la propagación de las células de la
reivindicación 34 bajo condiciones que conducen a la producción de
la lactosa, o un derivado de la misma, y opcionalmente recuperar
dicha lactosa, o un derivado de la misma, de las células.
37. Un método para producir quimosina, o un
precursor o derivado de la misma, caracterizado por la
propagación de las células de la reivindicación 35 bajo condiciones
que conducen a la producción de la quimosina, o un precursor o
derivado de la misma, y opcionalmente recuperar la quimosina, o un
precursor o derivado de la misma, de las células y/o el medio de
cultivo.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97201053 | 1997-04-11 | ||
| EP97201053 | 1997-04-11 | ||
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| EP97201637 | 1997-06-03 | ||
| EP98928202A EP0973918B1 (en) | 1997-04-11 | 1998-04-14 | Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal rna encoding domain, particularly with kluyveromyces |
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