ES2310204T3 - Genes de delta-4-desaturasa y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad Delta4-desaturasa, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55.

Description

Genes de \Delta-4-desaturasa y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención Campo técnico

La presente invención se refiere a la identificación y aislamiento de genes que codifican enzimas (por ejemplo, \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum, \Delta4-desaturasa de Schizochytrium aggregatum y \Delta4-desaturasa de Isochrysis galbana) implicadas en la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados y a los usos de los mismos. En particular, la \Delta4-desaturasa cataliza la conversión de, por ejemplo, ácido adrénico (22:4n-6) en ácido \omega6-docosapentaenoico (22:5n-6) y la conversión del ácido \omega3-docosapentaenoico (22:5n-3) en ácido docosahexaenoico (22:6n-3). Después, los productos convertidos pueden utilizarse como sustratos en la producción de otros ácidos grasos poliinsaturados (AGP). El producto u otros ácidos grasos poliinsaturados pueden añadirse a composiciones farmacéuticas, composiciones nutricionales, piensos animales, así como a otros productos tales como cosméticos.

Información antecedente

Las desaturasas son críticas en la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga que tienen muchas funciones importantes. Por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados (AGP) son componentes importantes de la membrana plasmática de una célula, donde se encuentran en forma de fosfolípidos. También sirven como precursores para prostaciclinas, eicosanoides, leucotrienos y prostaglandinas de mamíferos.

Además, los AGP son necesarios para el desarrollo apropiado del cerebro del lactante en desarrollo, así como para la formación y reparación de tejidos. En vista de la importancia biológica de los AGP, se han realizado intentos de producirlos, así como intermedios que conducen a su producción de una forma eficaz.

El documento WO 98/46764 describe la producción de AGP de cadena larga, tales como DHA, usando células vegetales recombinantes que expresan desaturasas de ácidos grasos, por ejemplo, \Delta5-, \Delta6- y \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina. Dicho documento describe aceites vegetales producidos por las células recombinantes y composiciones que comprenden el aceite o una fracción del mismo, por ejemplo, fórmulas para lactantes, complementos dietéticos y sustitutos dietéticos. La Patente de Estados Unidos Nº 5.340.742 describe la producción de lípidos con elevadas concentraciones de ácido \omega3-docosapentaenoico y DHA mediante el cultivo de Thraustochytrium y Schizochytrium y el uso de estos lípidos como aditivos alimentarios o en productos farmacéuticos.

Varias enzimas, más particularmente desaturasas y elongasas, están implicadas en la biosíntesis de AGP (véase la Figura 1). Por ejemplo, la elongasa (elo) cataliza la conversión del ácido \gamma-linolénico (GLA) en ácido dihomo-\gamma-linolénico (DGLA) y del ácido estearidónico (18:4n-3) en ácido (n-3)-eicosatetraenoico (20:4n-3). El ácido linoleico (LA, 18:2n-9,12 ó 18:2n-6) se produce a partir del ácido oleico (18:1-\Delta9) por una \Delta12-desaturasa. El GLA (18:3n-6,9,12) se produce a partir del ácido linoleico por una \Delta6-desaturasa.

Debe señalarse que los animales no pueden desaturar más allá de la posición \Delta9 y, por lo tanto, no pueden convertir el ácido oleico en ácido linoleico. Asimismo, el ácido \gamma-linolénico (ALA, 18:3n-9,12,15) no puede sintetizarse por mamíferos. Sin embargo, el ácido \gamma-linolénico puede convertirse en ácido estearidónico (STA, 18:4n-6,9,12,15) por una \Delta6-desaturasa (véase la publicación PCT WO 96/13591 y The FASEB Journal, Resúmenes, Parte 1, Resumen 3093, página A532 (Experimental Biology 98, San Francisco, CA, 18-22 de abril de 1998); véase también la Patente de Estados Unidos Nº 5.552.306), seguido de su elongación en ácido (n-3)-eicosatetraenoico (20:4n-8,11,14,17) en mamíferos y algas. Después, este ácido graso poliinsaturado (es decir, 20:4n-8,11,14,17) puede convertirse en ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-5,8,11,14,17) por una \Delta5-desaturasa. Después, el EPA puede convertirse a su vez en ácido \omega3-docosapentaenoico (22:5n-3) por una elongasa. Nunca se ha descrito el aislamiento de una enzima, o de su gen codificante, responsable de la conversión del ácido \omega3-docosapentaenoico en ácido docosahexaenoico (22:6n-3). Se han propuesto dos rutas para esta conversión (véase la Figura 1 y Sprecher, H., Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, Vol. 2, págs. 135-138, 1999). Una de ellas implica a una sola enzima, una \Delta4-desaturasa tal como la de la presente invención. En la ruta de n-6, el ácido linoleico de la dieta puede convertirse en ácido adrénico a través de una serie de etapas de desaturación y elongación en mamíferos (véase la Figura 1). Se postula que la producción del ácido \omega6-docosapentaenoico a partir del ácido adrénico está mediada por la \Delta6-desaturasa que se ha analizado anteriormente.

En el documento WO 98/46764 y Sprecher H. et al., J. Lipid Research, vol. 36, nº 12, diciembre de 1995, págs. 2471-2477, se ha propuesto, pero no se ha demostrado, la existencia de una \Delta4-desaturasa que cataliza la conversión del ácido \omega3-docosapentaenoico en DHA y/o del ácido adrénico en \omega6-docosapentaenoico. Sprecher H. et al. concluyen que la biosíntesis de DHA en animales implica la elongación del ácido adrénico y/o docosapentaenoico en el ácido de 24 carbonos correspondiente, la desaturación por una \Delta6-desaturasa y la \beta-oxidación, en lugar de la desaturación directa por una \Delta4-desaturasa.

Otros eucariotas, incluyendo hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en el carbono 12 (véase la publicación PCT WO 94/11516 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.443.974) y en el carbono 15 (véase la publicación PCT WO 93/11245). Por lo tanto, los ácidos grasos poliinsaturados fundamentales de animales proceden de la dieta y/o de la desaturación y elongación del ácido linoleico o del ácido \gamma-linolénico. En vista de estas dificultades, es de un interés significativo aislar genes implicados en la síntesis de AGP a partir de especies que producen de forma natural estos ácidos grasos y expresar estos genes en un sistema microbiano, vegetal o animal que puede alterarse para proporcionar la producción de cantidades comerciales de uno o más AGP.

En vista de la discusión anterior, existe una clara necesidad para la enzima \Delta4-desaturasa, los genes respectivos que codifican esta enzima, así como para los métodos recombinantes de producción de esta enzima. Además, existe la necesidad de aceites que contengan niveles de AGP por encima de los presentes de forma natural, así como los enriquecidos en nuevos AGP. Dichos aceites pueden prepararse solamente por aislamiento y expresión del gen o genes de la \Delta4-desaturasa.

Sumario de la invención

La presente invención incluye una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta4-desaturasa. La secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55. Además, en particular, la presente invención incluye una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta4-desaturasa, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 55.

Además, la presente invención incluye una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 54. En particular, la presente invención incluye una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 54.

Cada una de las secuencias descritas anteriormente codifica una \Delta4-desaturasa funcionalmente activa que utiliza un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado como sustrato. Las secuencias de nucleótidos pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de un hongo o un alga. En particular, cuando la secuencia de nucleótidos comprende la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17 o SEC ID Nº: 45, puede obtenerse, por ejemplo, del hongo Thraustochytrium aureum. La secuencia que comprende la SEC ID Nº: 36 puede obtenerse, por ejemplo, del hongo Schizochytrium aggregatum. La secuencia que comprende la SEC ID Nº: 54 puede obtenerse, por ejemplo, del alga Isochrysis galbana. La presente invención también incluye una proteína purificada codificada por las secuencias de nucleótidos mencionadas anteriormente.

En particular, la presente invención también incluye un polipéptido purificado que desatura ácidos grasos poliinsaturados en el carbono 4 y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55. En particular, la presente invención también incluye un polipéptido purificado que desatura ácidos grasos poliinsaturados en el carbono 4 y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 55.

Además, la presente invención incluye un Método de producción de una \Delta4-desaturasa que comprende las etapas de: aislar una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55 (o una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 55) o que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 54 (o que tiene, en particular, una identidad de secuencia de al menos el 70% con la SEC ID Nº: 54); construir un vector que comprende: i) la secuencia de nucleótidos aislada unida operativamente a ii) un promotor; e introducir dicho vector en una célula hospedadora durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de la desaturasa. La célula hospedadora puede ser, por ejemplo, una célula eucariota o una célula procariota. En particular, la célula procariota puede ser, por ejemplo, de E. coli, cianobacterias o B. subtilis. La célula eucariota puede ser, por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de hongo (por ejemplo, una célula de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida spp., Lipomyces starkey, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Trichoderma spp. o Pichia spp.).

Además, la presente invención también incluye un vector que comprende: una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55 (o, en particular, una identidad de aminoácidos de al menos el 70% con la SEC ID Nº: 55) o que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 54 (o, en particular, una identidad de al menos el 70% con la SEC ID Nº: 54), unida operativamente a un promotor. La invención también incluye una célula hospedadora que comprende este vector. La célula hospedadora puede ser, por ejemplo, una célula eucariota o una célula procariota. Las células eucariotas y células procariotas adecuadas son como se han definido anteriormente.

Además, la presente invención también incluye una célula vegetal, planta o tejido vegetal que comprende el vector anterior, en la que la expresión de la secuencia de nucleótidos del vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado por la célula vegetal, planta o tejido vegetal. El ácido graso poliinsaturado puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo constituido por ácido \omega6-docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico.

Además, la presente invención también incluye una planta transgénica que comprende el vector anterior, en la que la expresión de la secuencia de nucleótidos del vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado en las semillas de la planta transgénica.

La presente invención también incluye un método ("primer método") para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de: aislar una secuencia de nucleótidos que comprende o que es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55 (y, en particular, una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% con la SEC ID Nº: 55) o que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 54 (y, en particular, de al menos el 70% con respecto a la SEC ID Nº: 54); construir un vector que comprende la secuencia de nucleótidos aislada; introducir el vector en el interior de una célula hospedadora durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de la \Delta4-desaturasa; y exponer la \Delta4-desaturasa expresada a un ácido graso poliinsaturado sustrato para convertir el sustrato en un ácido graso poliinsaturado producto. El ácido graso poliinsaturado sustrato puede ser, por ejemplo, ácido adrénico o ácido \omega3-docosapentaenoico y el ácido graso poliinsaturado producto puede ser, por ejemplo, ácido \omega6-docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico, respectivamente. Este método puede comprender además la etapa de exponer el ácido graso poliinsaturado producto a otra enzima (por ejemplo, una \Delta4-desaturasa, una elongasa u otra desaturasa) para convertir el ácido graso poliinsaturado producto en otro ácido graso poliinsaturado (es decir, "segundo" método). En este método que contiene la etapa adicional (es decir, "segundo" método), el ácido graso poliinsaturado producto puede ser, por ejemplo, ácido \omega6-docosapentaenoico y el "otro" ácido graso poliinsaturado puede ser ácido docosahexaenoico.

Además, la presente invención incluye un método de producción de un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de: exponer un ácido graso poliinsaturado sustrato a una o más enzimas seleccionadas del grupo constituido por una desaturasa y una elongasa para convertir el sustrato en un ácido graso poliinsaturado producto; y exponer el ácido graso poliinsaturado producto a una \Delta4-desaturasa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55, para convertir el ácido graso poliinsaturado producto en un ácido graso poliinsaturado producto final.

Por ejemplo, un ácido graso poliinsaturado sustrato (por ejemplo, ácido eicosapentaenoico) puede exponerse a una elongasa o desaturasa (por ejemplo, MEL04 u otras elongasas o desaturasas de importancia en la ruta biosintética) para convertir el sustrato en un ácido graso poliinsaturado producto (por ejemplo, ácido \omega3-docosapentaenoico). Después, el ácido graso poliinsaturado producto puede convertirse en un ácido graso poliinsaturado producto "final" (por ejemplo, ácido docosahexaenoico) por exposición a la \Delta4-desaturasa de la presente invención (véase la Figura 1). Por lo tanto, la \Delta4-desaturasa se utiliza en la última etapa del método para generar el producto deseado "final". Como otro ejemplo, se puede exponer ácido linoleico a una \Delta6-desaturasa para generar ácido \gamma-linolénico (GLA) y, después, exponer el GLA a una elongasa y después a una \Delta5-desaturasa para generar el ácido araquidónico (AA). Después, el AA puede exponerse a una elongasa para convertirlo en ácido adrénico. Por último, el ácido adrénico puede exponerse a una \Delta4-desaturasa para convertirlo en ácido \omega6-docosapentaenoico (véase la Figura 1). Por lo tanto, el método implica la utilización de un sustrato de ácido linoleico y una serie de enzimas desaturasa y elongasa, además de la \Delta4-desaturasa, para lograr el producto final. Mediante el uso de un método similar, también se puede convertir el AGP sustrato, ácido \gamma-linolénico, en ácido docosahexaenoico. De nuevo, se usan diversas desaturasas y elongasas para lograr, en última instancia, el ácido \omega3-docosapentaenoico que después se expone a una o más \Delta4-desaturasas de la presente invención para convertirlo en ácido docosahexaenoico. (Los sustratos posibles incluyen los que se muestran en la Figura 1, por ejemplo, ácido linoleico, ácido \gamma-linolénico, ácido estearidónico, ácido araquidónico, ácido dihomo-\gamma-linolénico, ácido adrénico, ácido eicosapentaenoico y ácido eicosatetraenoico).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la ruta biosintética de ácidos grasos y el papel de la \Delta4-desaturasa en esta ruta.

La Figura 2 ilustra una comparación de aminoácidos de \Delta4-desaturasas producidas por cuatro plásmidos diferentes (SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20 y SEC ID Nº: 21).

La Figura 3 ilustra la secuencia de nucleótidos que codifica la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) del plásmido pRTA5 (SEC ID Nº: 14).

La Figura 4 ilustra la secuencia de nucleótidos que codifica la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) del plásmido pRTA6 (SEC ID Nº: 15).

La Figura 5 ilustra la secuencia de nucleótidos que codifica la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) del plásmido pRTA7 (SEC ID Nº: 16).

La Figura 6 ilustra la secuencia de nucleótidos que codifica la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) del plásmido pRTA8 (SEC ID Nº: 17).

La Figura 7 ilustra la secuencia de aminoácidos de la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) del plásmido pRTA5 (SEC ID Nº: 18).

La Figura 8 ilustra la secuencia de aminoácidos de la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) del plásmido pRTA6 (SEC ID Nº: 19).

La Figura 9 ilustra la secuencia de aminoácidos de la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) del plásmido pRTA7 (SEC ID Nº: 20).

La Figura 10 ilustra la secuencia de aminoácidos de la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) del plásmido pRTA8 (SEC ID Nº: 21).

La Figura 11 ilustra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas en la presente memoria.

La Figura 12 ilustra la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la elongasa MEL04 de un ratón.

La Figura 13 ilustra la secuencia de ADN de la supuesta \Delta4-desaturasa de ssa.con (SEC ID Nº: 24) generada a partir de los clones saa9 y saa5 de S. aggregatum (ATCC 28209) (véase el Ejemplo VI).

La Figura 14 ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 25) de la supuesta \Delta4-desaturasa codificada por la secuencia de ADN de ssa.con de S. aggregatum (ATCC 28209) (véase el Ejemplo VI).

La Figura 15 ilustra el alineamiento de los aminoácidos procedentes de la traducción de las fases de lectura abierta del ADN de ssa.con de S. aggregatum (ATCC 28209) (SEC ID Nº: 25) y pRTA7 (SEC ID Nº: 68) (véase el Ejemplo VI).

La Figura 16 ilustra la secuencia de ADN de la \Delta4-desaturasa de pRSA 1 (SEC ID Nº: 36) de S. aggregatum (ATCC 28209) (véase el Ejemplo VII).

La Figura 17 ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 37) de la \Delta4-desaturasa codificada por la secuencia de ADN de pRSA1 de S. aggregatum (ATCC 28209) (véase Ejemplo VII).

La Figura 18 ilustra la secuencia de ADN de la \Delta4-desaturasa de pRTA11 (SEC ID Nº: 45) de T. aureum (BICC 7091) (véase el Ejemplo VII).

La Figura 19 ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 46) de la supuesta \Delta4-desaturasa codificada por la secuencia de ADN de pRTA11 de T. aureum (BICC 7091) (véase el Ejemplo VII).

La Figura 20 ilustra la secuencia de ADN de la \Delta4-desaturasa de Isochrysis galbana (CCMP1323) (SEC ID Nº: 54) presente en el clon pRIG6 (véase el Ejemplo IX).

La Figura 21 ilustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 55) de la \Delta4-desaturasa codificada por la secuencia de ADN de pRIG6 de Isochrysis galbana (CCMP1323) (véase el Ejemplo IX).

La Figura 22 ilustra el porcentaje de identidad entre la nueva \Delta4-desaturasa de I. galbana (CCMP 1323) (SEC ID Nº: 69) y la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) (SEC ID Nº: 70).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos traducidas del gen de la \Delta4-desaturasa procedente del hongo Thraustochytrium aureum (BICC 7091), del hongo Schizochytrium aggregatum y del alga Isochrysis galbana. Además, la presente invención también incluye usos de estos genes y de las enzimas codificadas por estos genes. Por ejemplo, los genes y las enzimas correspondientes pueden usarse en la producción de ácidos grasos poliinsaturados tales como, por ejemplo, ácido \omega6-docosapentaenoico y/o ácido docosahexaenoico, que pueden añadirse a composiciones farmacéuticas, composiciones nutricionales y otros productos valiosos.

Los genes de \Delta4-desaturasa y las enzimas codificadas por los mismos

Como se ha indicado anteriormente, las enzimas codificadas por los genes de \Delta4-desaturasa de la presente invención son esenciales en la producción de ácidos grasos poliinsaturados altamente insaturados que tienen una longitud superior a 22 carbonos. Las secuencias de nucleótidos de los genes de \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum aislados, que se diferenciaban en base al plásmido generado (véase el Ejemplo III), se muestran en las Figuras 3-6, y las secuencias de aminoácidos de las proteínas purificadas correspondientes se muestran en la Figura 7-10. Se muestra una secuencia de nucleótidos de T. aureum aislada adicional en la Figura 18 (véase el Ejemplo VII), y la secuencia de aminoácidos codificada se muestra en la Figura 19. Las secuencias de nucleótidos de las secuencias de \Delta4-desaturasa de Schizochytrium aggregatum aisladas se muestran en las Figuras 13 y 16, y las secuencias de aminoácidos codificadas se muestran en las Figuras 14 y 17, respectivamente. Además, las secuencias de nucleótidos de la secuencia de la \Delta4-desaturasa de Isochrysis galbana aislada se muestran en la Figura 20, y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos se muestra en la Figura 21.

Como un ejemplo de la importancia de los genes de la presente invención, los genes de \Delta4-desaturasa aislados convierten el ácido adrénico en ácido \omega6-docosapentaenoico o convierten el ácido \omega3-docosapentaenoico en ácido docosahexaenoico.

Debe señalarse que la presente invención también incluye secuencias de nucleótidos aisladas (y las correspondientes proteínas codificadas) que tienen secuencias que comprenden, se corresponden con, son idénticas a o complementarias a, con una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente de al menos aproximadamente el 80% y, más preferiblemente, de al menos aproximadamente el 90%, la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16 o SEC ID Nº: 17 (es decir, las secuencias de nucleótidos del gen de la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304), la SEC ID Nº: 36 (es decir, la secuencia de nucleótidos del gen de la \Delta4-desaturasa de Schizochytrium aggregatum (ATCC 28209) o la SEC ID Nº: 45 (es decir, la secuencia de nucleótidos del gen de la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (BICC 7091)) o la SEC ID Nº: 54 (es decir, la secuencia de nucleótidos del gen de la \Delta4-desaturasa de Isochrysis galbana), todas descritas en la presente memoria. Con respecto a la secuencia de I. galbana, en particular, la presente invención también incluye secuencias de nucleótidos (y las proteínas codificadas correspondientes) que tienen secuencias que comprenden, se corresponden con, son idénticas a o complementarias a al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80% y, más preferiblemente, al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 54. (Todos los números enteros entre el 70% y el 100% también se considera que están dentro del alcance de la presente invención con respecto al porcentaje de identidad). Dichas secuencias pueden obtenerse de cualquier fuente, aislarse a partir de una fuente natural o producirse mediante un ruta semisintética o sintetizarse de novo. En particular, dichas secuencias pueden aislarse u obtenerse a partir de otras fuentes distintas de las descritas en los ejemplos (por ejemplo, bacterias, hongos, algas, C. elegans, ratones o seres humanos).

Además, la presente invención también describe fragmentos y derivados de las secuencias de nucleótidos de la presente invención (es decir, la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 45 o SEC ID Nº: 54), así como de las secuencias obtenidas a partir de otras fuentes, y que tienen la complementariedad, identidad o correspondencia descritas anteriormente y que tienen actividad \Delta4-desaturasa.

Para los fines de la presente invención, un "fragmento" de una secuencia de nucleótidos se define como una secuencia contigua de aproximadamente al menos 6, preferiblemente de al menos aproximadamente 8, más preferiblemente de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y, aun más preferiblemente, de al menos aproximadamente 15 nucleótidos que se corresponden con una región de la secuencia de nucleótidos especificada.

La invención también incluye un polipéptido purificado que desatura ácidos grasos poliinsaturados en la posición del carbono 4 y tiene una similitud o identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70%, preferiblemente una similitud de identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80% y, más preferiblemente, una similitud o identidad de aminoácidos de al menos el 90% con las secuencias de aminoácidos (es decir, SEC ID Nº: 18 (que se muestra en la Figura7), SEC ID Nº: 19 (que se muestra en la Figura 8), SEC ID Nº: 20 (que se muestra en la Figura 9), SEC ID Nº: 21 (que se muestra en la Figura 10), SEC ID Nº: 37 (que se muestra en la Figura 17), SEC ID Nº: 46 (que se muestra en la Figura 19) y SEC ID Nº: 55 (que se muestra en la Figura 21) de las proteínas señaladas anteriormente que, a su vez, están codificadas por las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente. En particular, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la \Delta4-desaturasa de I. galbana, la presente invención incluye un polipéptido purificado que desatura ácidos grasos poliinsaturados en la posición del carbono 4 y tiene una similitud o identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70% y, preferiblemente, una similitud o identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente el 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 55 (es decir, la secuencia de aminoácidos de la \Delta4-desaturasa de I. galbana que se muestra en la Figura 21). (Todos los números enteros entre el 70% y el 100% de similitud o identidad también se incluyen dentro del alcance de la presente invención).

El término "identidad" se refiere a la relación entre dos secuencias en base a nucleótido por nucleótido a lo largo de una ventana o segmento de comparación en particular. Por lo tanto, la identidad se define como el grado de igualdad, correspondencia o equivalencia entre las mismas cadenas (con sentido o antisentido) de dos segmentos de ADN (o dos secuencias de aminoácidos). El "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula por comparación de dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una región particular, determinación del número de posiciones en las que aparecen bases o aminoácidos idénticos en ambas secuencias para dar el número de posiciones emparejadas, división del número de dichas posiciones por el número total de posiciones en el segmento que se esté comparando y multiplicación del resultado por 100. El alineamiento óptimo de secuencias puede realizarse mediante el algoritmo de Smith y Waterman, Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988) y mediante programas informáticos que aplican los algoritmos pertinentes (por ejemplo, Clustal Macaw Pileup (http://cmgm.stanford.edu/biochem218/11Multiple.pdf; Higgins et al., CABIOS. 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical lnformation; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25: 3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) o GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI). (Véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.912.120).

Para los fines de la presente invención, la "complementariedad" se define como el grado de relación entre dos segmentos de ADN. Se determina por medición de la capacidad de la cadena con sentido de un segmento de ADN para hibridar con la cadena antisentido del otro segmento de ADN en condiciones apropiadas para formar una doble hélice. Un "complementario" se define como una secuencia que se empareja con una secuencia dada en base a las reglas canónicas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, una secuencia A-G-T en una cadena de nucleótidos es "complementaria" a T-C-A en la otra cadena.

En la doble hélice, si aparece adenina en una cadena, aparece timina en la otra cadena. De forma similar, allí donde se encuentra guanina en una cadena, se encuentra citosina en la otra. Cuanto mayor sea la relación entre las secuencias de nucleótidos de dos segmentos de ADN, mayor será la capacidad de formar dúplex híbridos entre las cadenas de los dos segmentos de ADN.

La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se define como la presencia de una serie de restos aminoacídicos idénticos, así como conservados, en ambas secuencias. Cuando mayor sea el grado de similitud entre dos secuencias de aminoácidos, mayor será la correspondencia, igualdad o equivalencia de las dos secuencias. (La "identidad" entre dos secuencias de aminoácidos se define como la presencia de una serie de restos aminoacídicos exactamente iguales o invariables en ambas secuencias). Las definiciones de "complementariedad", "identidad" y "similitud" son bien conocidas por los especialistas en la técnica.

La expresión "codificado por" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica, en la que la secuencia polipeptídica o una porción de la misma contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 8 aminoácidos y, aún más preferiblemente, de al menos 15 aminoácidos de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico.

La presente invención también describe una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una actividad desaturasa de AGP y que es hibridable en condiciones moderadamente rigurosas con un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o que es complementaria a las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente. Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" con otra molécula de ácido nucleico cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridar con la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica (véase Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. La "hibridación" requiere que dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias. Sin embargo, dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, pueden aparecer emparejamientos erróneos entre bases. La rigurosidad apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementariedad. Dichas variables se conocen bien en la técnica. Más específicamente, cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de la Tm para híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han obtenido ecuaciones para el cálculo de la Tm (véase Sambrook et al., anteriormente). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, la posición de los emparejamientos erróneos se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., anteriormente).

Como se usa en la presente memoria, un "fragmento o secuencia de ácido nucleico aislado" es un polímero de ARN o ADN que es monocatenario o bicatenario, que opcionalmente contiene bases de nucleótidos sintéticos, no naturales o modificados. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar compuesto por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético. (Un "fragmento" de un polinucleótido determinado se refiere a una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia contigua de aproximadamente al menos aproximadamente 6 nucleótidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 8 nucleótidos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y, aún más preferiblemente, de al menos aproximadamente 15 nucleótidos y, más preferiblemente, de al menos aproximadamente 25 nucleótidos idénticos o complementarios a una región de la secuencia de nucleótidos determinada.) Se hace referencia a los nucleótidos (que habitualmente se encuentran en su forma 5'-monofosfato) por su denominación de una sola letra de la forma siguiente: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para ARN o ADN, respectivamente), "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A o G), "Y" para pirimidinas (C o T), "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido.

Las expresiones "fragmento o subfragmento que es funcionalmente equivalente" y "fragmento o subfragmento funcionalmente equivalente" se usan indistintamente en la presente memoria. Estas expresiones se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en el que se conserva la capacidad de modificar la expresión génica o producir un fenotipo determinado independientemente de que el fragmento o subfragmento codifique una enzima activa. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento puede usarse en el diseño de construcciones quiméricas para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Pueden diseñarse construcciones quiméricas para el uso en la cosupresión o terapia antisentido por unión a un fragmento de ácido nucleico o subfragmento del mismo, independientemente de que codifique o no una enzima activa, en la orientación apropiada con respecto a una secuencia promotora vegetal.

Los términos "homología", "homólogo", "sustancialmente similar" y "que se corresponde sustancialmente" se usan indistintamente en la presente memoria. Se refieren a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en uno o más bases nucleotídicas no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la expresión génica o producir un fenotipo determinado. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico descritos en la presente invención, tales como deleción o inserción de uno o más nucleótidos, que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con respecto a fragmento inicial no modificado. Por lo tanto se entiende, como apreciarán los especialistas en la técnica, que la invención describe más que las secuencias ejemplares específicas.

El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo las secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificantes) y que siguen (secuencias 3' no codificantes) a la secuencia codificante.

La expresión "gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza, con sus propias secuencias reguladoras. Por el contrario, la expresión "construcción quimérica" se refiere a una combinación de fragmentos de ácidos nucleicos que normalmente no se encuentran juntos en la naturaleza. Por consiguiente, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que proceden de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que proceden de la misma fuente, pero organizadas de una forma diferente a la que se encuentra normalmente en la naturaleza. (El término "aislada" significa que la secuencia se retira de su entorno natural).

Un gen "extraño" se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo hospedador, pero que se introduce en el organismo hospedador por transferencia génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o construcciones quiméricas. Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

La "secuencia codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Las "secuencias reguladoras" se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas cadena arriba (secuencias 5' no codificantes), en el interior o cadena abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o en la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero sin limitación, promotores, secuencias líder de la traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o de ARN funcional. La secuencia promotora consiste en los elementos cadena arriba proximales y más distales, los últimos elementos denominados con frecuencia potenciadores. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel o la especificidad de tejido de un promotor. También pueden localizarse secuencias promotoras en el interior de las porciones transcritas de genes y/o cadena abajo de las secuencias transcritas. Los promotores pueden proceder en su totalidad de un gen nativo o estar compuestos por diferentes elementos procedentes de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Se entiende por los especialistas en la técnica que promotores diferentes pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en fases del desarrollo diferentes, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos celulares hospedadores casi todo el tiempo se denominan comúnmente como "promotores constitutivos". Constantemente se están descubriendo nuevos promotores de diversos tipos útiles en células vegetales; pueden encontrarse numerosos ejemplos en la recopilación de Okamuro y Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15: 1-82. Se reconoce además que, puesto que la mayoría de los casos no se han definido completamente los límites exactos de las secuencias reguladoras, fragmentos de ADN con alguna variación pueden tener una actividad promotora idéntica.

Un "intrón" es una secuencia intermedia en un gen que no codifica una porción de la secuencia proteica. Por lo tanto, dichas secuencias se transcriben en un ARN pero después se escinden y no se traducen. El término también se usa para las secuencias de ARN escindidas. Un "exón" es una porción de la secuencia génica que se transcribe y que se encuentra en el ARN mensajero maduro procedente del gen, pero que no es necesariamente una parte de la secuencia que codifica el producto génico final.

La "secuencia líder de traducción" se refiere a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de traducción está presente en el ARNm completamente procesado cadena arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar al procesamiento del transcrito primario en ARNm, a la estabilidad del ARNm o a la eficacia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias líder de traducción (Tuner, R. y Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3: 225).

Las "secuencias 3' no codificantes" se refieren a secuencias de ADN localizadas cadena debajo de una secuencia codificante e incluyen sitios de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar al procesamiento del ARNm o a la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza habitualmente por que afecta a la adición de extensiones de ácido poliadenílico en el extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias 3' no codificantes se ejemplifica por Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1: 671-680.

La expresión "transcrito de ARN" se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se denomina como transcrito primario, o puede ser una secuencia de ARN procedente del procesamiento postranscripcional del transcrito primario y se denomina como ARN maduro. La expresión "ARN mensajero (ARNm)" se refiere al ARN que carece de intrones y que puede traducirse en una proteína por la célula. El "ADNc" se refiere a un ADN que es complementario a y se sintetiza a partir de un molde de ARNm usando la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o convertirse en la forma bicatenaria usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. El ARN "con sentido" se refiere al transcrito de ARN que incluye el ARNm y que puede traducirse en una proteína en el interior de una célula o in vitro. El "ARN antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a todo o a una parte de un transcrito primario diana o ARNm y que bloquea la expresión de un gen diana (Patente de Estados Unidos Nº 5.107.065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito génico específico, es decir, en la secuencia 5' no codificante, secuencia 3' no codificante, intrones o en la secuencia codificante. La expresión "ARN funcional" se refiere a ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que puede no traducirse pero que aún así tiene un efecto sobre los procesos celulares. Las expresiones "complementario" y "complementario inverso" se usan indistintamente en la presente memoria con respecto a los transcritos de ARNm y pretenden definir al ARN antisentido del mensaje.

La expresión "ARN endógeno" se refiere a cualquier ARN que está codificado por cualquier secuencia de ácido nucleico presente en el genoma del hospedador antes de la transformación con la construcción recombinante de la presente invención, ya sea de origen natural o no natural, es decir, introducido por medios recombinantes, mutagénesis, etc.

La expresión "de origen no natural" significa artificial, que no concuerda con el que se encuentra normalmente en la naturaleza.

La expresión "unido operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico, de tal modo que la función de uno esté regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de regular la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar unidas operativamente a secuencias reguladoras en una orientación con sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementarias de la invención pueden estar unidas operativamente, directamente o indirectamente, al 5' de la ARNm diana o al 3' del ARNm diana, o en el interior del ARNm diana, o una primera región complementaria es 5' y su complementario es 3' al ARNm diana.

El término "expresión", como se usa en la presente memoria, se refiere a la producción de un producto final funcional. La expresión de un gen implica la transcripción del gen y la traducción del ARNm en una proteína precursora o madura. La "inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana. La "cosupresión" se refiere a la producción de transcritos de ARN con sentido capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (Patente de Estados Unidos Nº 5.231.020).

La proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado postraduccionalmente; es decir, uno del que se ha eliminado cualquier prepéptido o propéptido presente en el producto de traducción primario. La proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción de ARNm; es decir, con prepéptidos y propéptidos todavía presentes. Los prepéptidos y propéptidos pueden ser, pero sin limitación, señales de localización intracelular.

La expresión "transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al interior de un genoma de un organismo hospedador que da como resultado una herencia genéticamente estable. Por el contrario, la expresión "transformación transitoria" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al interior del núcleo o de un orgánulo que contiene ADN de un organismo hospedador que da como resultado la expresión génica sin integración o herencia estable. Los organismos hospedadores que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan como organismos "transgénicos". El método preferido de transformación de células de arroz, maíz y otras monocotiledóneas es el uso de la tecnología de transformación de partículas aceleradas o "pistola génica" (Klein et al., (1987) Nature (Londres) 327: 70-73; Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050) o un método mediado por Agrobacterium usando un plásmido Ti apropiado que contiene el transgén (Ishida Y. et al., 1996, Nature Biotech. 14: 745-750). El término "transformación", como se usa en la presente memoria, se refiere tanto a la transformación estable como a la transformación transitoria.

Las técnicas de ADN recombinante y de clonación molecular convencionales usadas en la presente memoria son bien conocidas en la técnica y se describen más completamente en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (en lo sucesivo, "Sambrook").

El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos de ácidos nucleicos aislados por técnicas de ingeniería genética.

La "PCR" o "reacción en cadena de la polimerasa" es una técnica para la síntesis de grandes cantidades de segmentos de ADN específicos que consiste en una serie de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Típicamente, el ADN bicatenario se desnaturaliza por calor, los dos cebadores complementarios a los límites 3' del segmento de diana se hibridan a baja temperatura y después se extienden a una temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas consecutivas se denomina como ciclo.

La reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") es una técnica potente usada para amplificar ADN millones de veces mediante la replicación repetida de un molde en un corto periodo de tiempo. (Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich et al, Solicitud de Patente Europea 50.424; Solicitud de Patente Europea 84.796; Solicitud de Patente Europea 258.017, Solicitud de Patente Europea 237.362, Mullis, Solicitud de Patente Europea 201.184; Mullis et al, Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202; Erlich, Patente de Estados Unidos Nº 4.582.788; y Saiki et al, Patente de Estados Unidos Nº 4.683.194). El proceso utiliza conjuntos de oligonucleótidos sintetizados in vitro específicos para cebar la síntesis de ADN. El diseño de los cebadores depende de las secuencias de ADN que se desea analizar. La técnica se lleva a cabo mediante muchos ciclos (habitualmente 20-50) de fusión del molde a una temperatura elevada, permitiendo que los cebadores hibriden con las secuencias complementarias dentro del molde y, después, replicación del molde con ADN polimerasa.

Los productos de las reacciones de PCR se analizan por separación en geles de agarosa seguida de tinción con bromuro de etidio y visualización con transiluminación UV. Como alternativa, pueden añadirse dNTP radiactivos a la PCR para incorporar un marcador en los productos. En este caso, los productos de PCR se visualizan por exposición del gel a una película de rayos x. La ventaja añadida del radiomarcaje de productos de PCR es que pueden cuantificarse los niveles de productos de amplificación individuales.

Las expresiones "construcción recombinante", "construcción de expresión" y "construcción de expresión recombinante" se usan indistintamente en la presente memoria. Estas expresiones se refieren a una unidad funcional de material genético que puede insertarse en el genoma de una célula usando una metodología convencional bien conocida por un especialista en la técnica. Dicha construcción puede usarse en solitario o junto con un vector. Si se usa un vector, entonces la elección del vector depende del método que se usará para transformar plantas hospedadoras, como bien saben los especialistas en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un vector plasmídico. El especialista es bien consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar con éxito células hospedadoras que comprendan cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención. El especialista también reconocerá que diferentes acontecimientos de transformación independientes darán como resultado niveles y patrones de expresión diferentes (Jones et al., (1985) EMBO J. 4: 2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78-86) y, por lo tanto, que deben explorarse múltiples acontecimientos para obtener líneas que presenten el nivel y el patrón de expresión deseado. Dicha exploración puede llevarse a cabo mediante análisis de Southern de ADN, análisis de Northern de la expresión de ARNm, análisis de Western de la expresión proteica o análisis fenotípico.

Producción de la enzima \Delta4-desaturasa

Una vez que se ha aislado el gen que codifica la enzima \Delta4-desaturasa, puede introducirse después en una célula hospedadora procariota o eucariota mediante el uso de un vector o construcción. El vector, por ejemplo, un bacteriófago, cósmido o plásmido, puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima \Delta4-desaturasa, así como cualquier secuencia reguladora (por ejemplo, promotora) que sea funcional en la célula hospedadora y que sea capaz de provocar la expresión de la desaturasa codificada por la secuencia de nucleótidos. La secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor) está en una asociación operativa con o unida operativamente a la secuencia de nucleótidos. (Se dice que un promotor está "unido operativamente" con una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante). Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los de genes que codifican la alcohol deshidrogenasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglucoisomerasa, fosfoglicerato quinasa, fosfatasa ácida, T7, TPI, lactasa, metalotioneína, promotor inmediato temprano de citomegalovirus, proteína ácida del suero, glucoamilasa y promotores activados en presencia de galactosa, por ejemplo, GAL1 y GAL10. Además, también pueden incluirse dentro del vector secuencias de nucleótidos que codifican otras proteínas, oligosacáridos, lípidos, etc., así como otras secuencias reguladoras tales como una señal de poliadenilación (por ejemplo, la señal de poli A del antígeno SV-40T, ovoalbúmina u hormona del crecimiento bovino). La selección de las secuencias presentes en la construcción depende de los productos de expresión deseados, así como de la naturaleza de la célula hospedadora.

Como se ha señalado anteriormente, una vez que se ha construido el vector, entonces puede introducirse en la célula hospedadora de elección por métodos conocidos por los especialistas en la técnica que incluyen, por ejemplo, transfección, transformación y electroporación (véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Después, la célula hospedadora se cultiva en condiciones adecuadas que permitan la expresión de los genes que conducen a la producción del AGP deseado, que después se recupera y se purifica.

Los ejemplos de células hospedadoras procariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, bacterias tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, así como Cyanobacteria, tal como Spirulina spp. (es decir, algas verdeazuladas). Los ejemplos de células hospedadoras eucariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, células de mamífero, células vegetales, células de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Lipomyces starkey, Candida spp., tales como Yarrowia (Candida) lipolytica, Kluyveromyces spp., Pichia spp., Trichoderma spp o Hansenula spp., o células de hongos tales como células de hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus, Neurospora y Penicilium. Preferiblemente, se utilizan células de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería).

La expresión en una célula hospedadora puede lograrse de una forma transitoria o estable. La expresión transitoria puede producirse a partir de construcciones introducidas que contengan señales de expresión funcionales en la célula hospedadora, pero de construcciones que no se repliquen y que rara vez se integren en la célula hospedadora, o cuando la célula hospedadora no esté proliferando. La expresión transitoria también puede lograrse por inducción de la actividad de un promotor regulable unido operativamente al gen de interés, aunque tales sistemas inducibles presentan frecuentemente un bajo nivel de expresión basal. La expresión estable puede lograrse por introducción de una construcción que puede integrarse en el genoma hospedador o que se replique de forma autónoma en la célula hospedadora. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse mediante el uso de un marcador de selección localizado en o transfectado con la construcción de expresión, seguido de la selección para las células que expresen el marcador. Cuando la expresión estable es el resultado de la integración, el lugar de la integración de la construcción puede suceder de forma aleatoria dentro del genoma hospedador o puede estar dirigido por el uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma hospedador suficientes para dirigir la recombinación con el locus hospedador. Cuando las construcciones se dirigen a un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripción y traducción pueden proporcionarse por el locus endógeno.

También puede usarse un mamífero transgénico para expresar la enzima de interés (es decir, la \Delta4-desaturasa) y, en última instancia, el o los AGP de interés. Más específicamente, una vez que se genera la construcción descrita anteriormente, puede insertarse en el pronúcleo de un embrión. Después, el embrión puede implantarse en una hembra receptora. Como alternativa, también podría utilizarse un método de transferencia nuclear (Schnieke et al., Science 278: 2130-2133 (1997)). Después se permite la gestación y el nacimiento (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.750.176 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.700.671). Después, la leche, el tejido u otras muestras de fluido de la descendencia deberían contener niveles alterados de AGP en comparación con los niveles que normalmente se encuentran en el animal no transgénico. Pueden controlarse las generaciones posteriores para determinar la producción de los niveles alterados o aumentados de AGP y, por lo tanto, la incorporación del gen que codifica la enzima desaturasa deseada en sus genomas. El mamífero utilizado como el hospedador puede seleccionarse del grupo constituido por, un ratón, una rata, un conejo, un cerdo, una cabra, una oveja, un caballo y una vaca. Sin embargo, puede usarse cualquier mamífero con tal de que tenga la capacidad de incorporar el ADN que codifica la enzima de interés en su genoma.

Para la expresión de un polipéptido de desaturasa, las regiones funcionales de inicio y terminación de la transcripción y de la traducción están unidas operativamente al ADN que codifica el polipéptido de desaturasa. Las regiones de inicio y terminación de la transcripción y de la traducción proceden de una diversidad de fuentes no excluyentes, que incluyen el ADN que se va a expresar, genes que se sabe o se sospecha que son capaces de la expresión en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química o de un locus endógeno en una célula hospedadora. La expresión en un tejido vegetal y/o parte de una planta presenta unos rendimientos determinados, particularmente cuando el tejido o parte es uno que se recoge de forma temprana, tal como semillas, hojas, frutos, flores, raíces, etc. La expresión puede dirigirse a esa localización dentro de la planta mediante la utilización de una secuencia reguladora específica tal como las de las Patentes de Estados Unidos Nº 5.463.174, 4.943.674, 5.106.739, 5.175.095, 5.420.034, 5.188.958 y 5.589.379. Como alternativa, la proteína expresada puede ser una enzima que produzca un producto que puede incorporarse, directamente o después de modificaciones adicionales, en una fracción fluida de la planta hospedadora. La expresión de un gen de desaturasa o de transcritos de desaturasa antisentido puede alterar los niveles de AGP específicos o de derivados de los mismos que se encuentran en partes de plantas y/o en tejidos vegetales. La región codificante del polipéptido de desaturasa puede expresarse en solitario o con otros genes para producir tejidos y/o partes de plantas que contienen mayores proporciones de los AGP deseados, o en los que la composición de AGP se asemeja más a la de la leche materna humana (Prieto et al., publicación PCT WO 95/24494). La región de terminación puede proceder de la región 3' del gen del que se obtuvo la región de inicio o de un gen diferente. Se sabe y se ha descubierto que un gran número de regiones determinación son satisfactorias en una diversidad de hospedadores del mismo y de diferente género y especie. Habitualmente, la región de terminación se selecciona como una cuestión de conveniencia en lugar de por cualquier propiedad particular.

Como se ha indicado anteriormente, también puede utilizarse una planta (por ejemplo, Glycine max (soja) o Brassica napus (colza)) o tejido vegetal como un hospedador o célula hospedadora, respectivamente, para la expresión de la enzima desaturasa que, a su vez, puede utilizarse en la producción de ácidos grasos poliinsaturados. Más específicamente, los AGP deseados pueden expresarse en las semillas. Se conocen en la técnica métodos de aislamiento de aceites de semillas. Por lo tanto, además de proporcionar una fuente de AGP, los componentes de aceites de semillas pueden manipularse mediante la expresión del gen de la desaturasa, así como de quizás otros genes de desaturasa y genes de elongasa, para proporcionar aceites de semillas que pueden añadirse a composiciones nutricionales, composiciones farmacéuticas, piensos animales y cosméticos. De nuevo, un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica la desaturasa unida operativamente a un promotor se introducirá en el tejido vegetal o planta durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión del gen de la desaturasa. El vector también puede comprender uno o más genes que codifican otras enzimas, por ejemplo, \Delta5-desaturasa, elongasa, \Delta12-desaturasa, \Delta15-desaturasa, \Delta17-desaturasa y/o \Delta19-desaturasa. El tejido vegetal o planta puede producir el sustrato pertinente (por ejemplo, ácido adrénico o ácido \omega3-docosapentaenoico) sobre el que actúa la enzima, o un vector que codifica enzimas que producen dichos sustratos puede introducirse en el tejido vegetal, célula vegetal o planta. Además, el sustrato puede pulverizarse sobre tejidos vegetales que expresen las enzimas apropiadas. Usando estas diversas técnicas, se pueden producir AGP (por ejemplo, ácidos grasos n-6 insaturados tales como ácido \omega6-docosapentaenoico, o ácidos grasos n-3 tales como ácido docosahexaenoico) mediante el uso de una célula vegetal, tejido vegetal o planta. Debería señalarse que la invención también incluye una planta transgénica que comprende el vector descrito anteriormente, en el que la expresión de la secuencia de nucleótidos del vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado, por ejemplo, en las semillas de la planta transgénica.

Se conoce bien en la técnica la regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos vegetales individuales o de diversos explantes transformados (Weissbach y Weissbach, en: Methods for Plant Molecular Biology (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1988)). Este proceso de regeneración y crecimiento típicamente incluye las etapas de selección de células transformadas, cultivo de las células individualizadas a través de las fases habituales de desarrollo embrionario hasta la fase de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicos se regeneran de forma similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan después en un medio de crecimiento de plantas apropiado, tal como suelo.

Se conoce bien en la técnica el desarrollo o la regeneración de plantas que contienen el gen exógeno extraño que codifica una proteína de interés. Preferiblemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. De otra forma, el polen obtenido a partir de las plantas regeneradas se cruza con plantas cultivadas a partir de semillas de líneas agrícolamente importantes. Por el contrario, el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar las plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por un especialista en la técnica.

Existe una diversidad de métodos para regeneración de plantas a partir de tejido vegetal. El método particular de regeneración dependerá del tejido vegetal de partida y de la especie vegetal particular que se vaya a regenerar.

Se han publicado métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens, y obtener plantas transgénicas para algodón (Patentes de Estados Unidos Nº 5.004.863, Patente de Estados Unidos Nº 5.159.135, Patente de Estados Unidos Nº 5.518.908); soja (Patente de Estados Unidos Nº 5.569.834, Patente de Estados Unidos Nº 5.416.011, McCabe et. al., Biol Technology 6: 923 (1988), Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988)); crucíferas (Patente de Estados Unidos Nº 5.463.174); cacahuete (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15: 653-657 (1996), McKently et al., Plant Cell Rep. 14: 699-703 (1995)); papaya; y guisante (Grant et al., Plant Cell Rep. 15: 254-258, (1995)).

También se ha descrito la transformación de monocotiledóneas usando electroporación, bombardeo de partículas y Agrobacterium. Se ha conseguido la transformación y la regeneración de plantas en espárragos (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 5354, (1987)); cebada (Wan y Lemaux, Plant Physiol 104: 37 (1994)); Zea mays (Rhodes et al., Science 240: 204 (1988), Gordon-Kamm et al., Plant CeIl 2: 603-618 (1990), Fromm et al., Biol Technology 8: 833 (1990), Koziel et al., Biol Technology 11: 194, (1993), Armstrong et al., Crop Science 35: 550-557 (1995)); avena (Somers et al., Biol Technology 10: 1589 (1992)); dáctilo (Horn et al., Plant Cell Rep. 7: 469 (1988)); arroz (Toriyama et al., Theor Appl. Genet. 205: 34 (1986); Part et al., Plant Mol. Biol. 32: 1135-1148, (1996); Abedinia et al., Aust. J. Plant Physiol. 24: 133-141 (1997); Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835 (1988); Zhang et al. Plant Cell Rep. 7: 379, (1988); Battraw y Hall, Plant Sci. 86: 191-202 (1992); Christou et al., Bio/Technology 9: 957 (1991)); centeno (De la Pena et al., Nature 325: 274 (1987)); caña de azúcar (Bower y Birch, Plant J. 2: 409 (1992)); festuca alta (Wang et al., Biol Technology 10: 691 (1992)) y trigo (Vasil et al., Biol Technology 10: 667 (1992); Patente de Estados Unidos Nº 5.631.152).

Se han desarrollado ensayos para la expresión génica basados en la expresión transitoria de construcciones de ácidos nucleicos clonados mediante la introducción de las moléculas de ácido nucleico en las células vegetales por tratamiento con polietilenglicol, electroporación o bombardeo de partículas (Marcotte et al., Nature 335: 454-457 (1988); Marcotte et al., Plant CeIl 1: 523-532 (1989); McCarty et al., Cell 66: 895-905 (1991); Hattori et al., Genes Dev. 6: 609-618 (1992); Goff et al., EMBO J. 9: 2517-2522 (1990)).

Pueden usarse sistemas de expresión transitoria para diseccionar funcionalmente construcciones génicas (véase, en general, Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Se entiende que cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención puede introducirse en una célula vegetal de una forma permanente transitoria en combinación con otros elementos genéticos tales como vectores, promotores, potenciadores, etc.

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Además de los procedimientos analizados anteriormente, los facultativos están familiarizados con los materiales de recurso convencionales que describen condiciones y procedimientos específicas para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmidos, etc.), la generación de organismos recombinantes y la detección y aislamiento de clones (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, Nueva York (1998), Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nueva York (1997)).

Los sustratos que pueden producirse por la célula hospedadora de forma natural o transgénicamente, así como las enzimas que pueden codificarse por secuencias de ADN presentes en el vector que se introduce posteriormente en la célula hospedadora, se muestran en la Figura 1.

Usos del gen de la \Delta4-desaturasa y de la enzima codificada por el mismo

Como se ha indicado anteriormente, los genes de desaturasa aislados y las enzimas desaturasa codificadas por los mismos tienen muchos usos. Por ejemplo, el gen y la enzima correspondiente pueden usarse indirectamente o directamente en la producción de ácidos grasos poliinsaturados, por ejemplo, la \Delta4-desaturasa puede usarse en la producción de ácido \omega6-docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico. El término "directamente" pretende incluir la situación en la que la enzima convierte directamente el ácido en otro ácido, utilizándose este último en una composición (por ejemplo, la conversión de ácido adrénico en ácido \omega6-docosapentaenoico). La expresión "indirectamente" pretende incluir la situación en la que un ácido se convierte en otro ácido (es decir, una ruta intermedia) mediante la desaturasa (por ejemplo, ácido adrénico en ácido \omega6-docosapentaenoico) y después este último ácido se convierte en otro ácido mediante el uso de una desaturasa o enzima no desaturasa (por ejemplo, ácido \omega6-docosapentaenoico en ácido docosahexaenoico mediante una \Delta19-desaturasa). Además, la presente invención incluye situaciones "indirectas", en las que el AGP se convierte primero en otro ácido graso poliinsaturado mediante una enzima que no es \Delta4-desaturasa (por ejemplo, una elongasa u otra desaturasa) y después se convierte en un producto final mediante una \Delta4-desaturasa. Por ejemplo, el ácido eicosapentaenoico puede convertirse en ácido \omega3-docosapentaenoico mediante una elongasa y después convertirse en ácido docosahexaenoico mediante una \Delta4-desaturasa. Estos ácidos grasos poliinsaturados (es decir, los producidos directa o indirectamente mediante la actividad de la enzima desaturasa) pueden añadirse a, por ejemplo, composiciones nutricionales, composiciones farmacéuticas, cosméticos y piensos animales, incluyéndose todos en la presente invención. Estos usos se describen con detalle a continuación.

Composiciones nutricionales

La presente invención incluye métodos para producir un ácido graso poliinsaturado que puede usarse en composiciones nutricionales. Dichas composiciones incluyen cualquier alimento o preparación para consumo humano, incluyendo para consumo enteral o parenteral, que cuando se suministra al cuerpo (a) sirve para nutrir o construir tejidos o suministrar energía y/o (b) conservar, restaurar o mantener un estado nutricional o una función metabólica adecuados.

La composición nutricional comprende al menos un aceite o ácido producido directa o indirectamente mediante el uso del gen de la desaturasa, de acuerdo con la presente invención, y puede estar en una forma sólida o líquida. Además, la composición puede incluir macronutrientes, vitaminas y minerales comestibles en cantidades deseadas para un uso particular. La cantidad de dichos ingredientes variará dependiendo de si la composición se desea para uso con lactantes o niños sanos normales o adultos que tienen necesidades especiales, tales como las que acompañan a determinadas afecciones metabólicas (por ejemplo trastornos metabólicos).

Los ejemplos de macronutrientes que pueden añadirse a la composición incluyen, pero sin limitación, grasas, hidratos de carbono y proteínas comestibles. Los ejemplos de dichas grasas comestibles incluyen, pero sin limitación, aceite de coco, aceite de borraja, aceite de hongos, aceite negro corriente, aceite de soja y monoglicéridos y diglicéridos. Los ejemplos de dichos hidratos de carbono incluyen, pero sin limitación, glucosa, lactosa comestible y almidón hidrolizado. Además, los ejemplos de proteínas que pueden utilizarse en la composición nutricional incluyen, pero sin limitación, proteínas de soja, suero electrodializado, leche desnatada electrodializada, suero de la leche o los hidrolisados de estas proteínas.

Con respecto a las vitaminas y minerales, pueden añadirse los siguientes a las composiciones nutricionales:

calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, selenio, yodo y vitaminas A, E, D, C y el complejo B. También pueden añadirse otras vitaminas y minerales de este tipo. Los componentes utilizados en las composiciones nutricionales serán de origen semipurificado o purificado. Por semipurificado o purificados se entiende un material que se ha preparado por purificación de un material natural o por síntesis. Los ejemplos de composiciones nutricionales incluyen, pero sin limitación, fórmulas para lactantes, complementos dietéticos (por ejemplo, productos nutricionales para adultos y aceite), sustitutos dietéticos y composiciones de rehidratación. Las composiciones nutricionales de particular interés incluyen, pero sin limitación, las utilizadas para la suplementación enteral y parenteral en lactantes, fórmulas para lactantes especiales, suplementos para personas mayores y suplementos para los que tienen dificultades gastrointestinales y/o malabsorción.

La composición nutricional también puede añadirse al alimento aún cuando no sea necesaria la suplementación de la dieta. Por ejemplo, la composición puede añadirse a un alimento de cualquier tipo incluyendo, pero sin limitación, margarinas, mantequillas modificadas, quesos, leche, yogur, chocolate, caramelos, aperitivos, aceites para ensalada, aceites de cocina, grasas de cocina, carnes, pescado y bebidas.

En una realización preferida, la composición nutricional es un producto nutricional enteral, más preferiblemente, un producto nutricional enteral para adultos o pediátrico. Esta composición puede administrarse a adultos o niños que padezcan estrés o que tengan unas necesidades especiales debido a patologías crónicas o agudas. La composición puede comprender, además de ácidos grasos poliinsaturados producidos de acuerdo con la presente invención, macronutrientes, vitaminas y minerales, como se han descrito anteriormente. Los macronutrientes pueden estar presentes en cantidades equivalentes a las presentes en la leche humana o en una base energética, es decir, en base a calorías.

Se conocen bien en la técnica métodos para formular fórmulas nutricionales enterales y parenterales líquidas o sólidas (véanse también los Ejemplos a continuación).

La fórmula enteral, por ejemplo, puede esterilizarse y posteriormente utilizarse en una forma lista para usar (RTF) o conservarse en un líquido o polvo concentrado. El polvo puede prepararse mediante secado por pulverización de la fórmula preparada como se ha indicado anteriormente y reconstitución de la misma por rehidratación del concentrado. Se conocen bien en la técnica fórmulas nutricionales pediátricas y para adultos y están disponibles en el mercado (por ejemplo, Similac®, Ensure®, Jevity® y Alimentum® de Ross Products Division, Abbott Laboratories, Columbus, Ohio). Puede añadirse a cualquiera de estas fórmulas un aceite o ácido producido de acuerdo con la presente invención.

La densidad energética de las composiciones nutricionales, cuando están en forma líquida, puede variar de aproximadamente 0,6 Kcal a aproximadamente 3 Kcal por ml. Cuando están en forma sólida o en polvo, los complementos nutricionales pueden contener de aproximadamente 1,2 a más de 9 Kcal por gramo, preferiblemente de aproximadamente 3 a 7 Kcal por g. En general, la osmolaridad de un producto líquido debería ser inferior a 700 mOsm y, más preferiblemente, inferior a 660 mOsm.

La fórmula nutricional puede incluir macronutrientes, vitaminas y minerales, como se ha indicado anteriormente, además de los AGP producidos de acuerdo con la presente invención. La presencia de estos componentes adicionales ayuda al individuo a ingerir los requerimientos mínimos diarios de estos elementos. Además de suministrar AGP, también puede ser deseable añadir cinc, cobre, ácido fólico y antioxidantes a la composición. Se piensa que estas sustancias refuerzan un sistema inmune estresado y, por lo tanto, proporcionarán beneficios adicionales al individuo que recibe la composición. También puede suplementarse una composición farmacéutica con estos elementos.

En una realización más preferida, la composición nutricional comprende, además de los antioxidantes y de al menos un AGP, una fuente de hidratos de carbono en la que al menos el 5 por ciento en peso de los hidratos de carbono sean un oligosacárido no digestible. En una realización más preferida, la composición nutricional comprende además una proteína, taurina y carnitina.

Como se ha indicado anteriormente, los AGP producidos de acuerdo con la presente invención, o derivados de los mismos, pueden añadirse a un sustituto o complemento dietético, particularmente una fórmula para lactantes, para pacientes que están bajo alimentación intravenosa o para prevenir o tratar una malnutrición u otras afecciones o patologías. Como antecedentes, debería señalarse que la leche materna humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende de aproximadamente el 0,15% a aproximadamente el 0,36% como DHA, de aproximadamente el 0,03% a aproximadamente el 0,13% como EPA, de aproximadamente el 0,30% a aproximadamente el 0,88% como AA, de aproximadamente el 0,22% a aproximadamente el 0,67% como DGLA y de aproximadamente el 0,27% a aproximadamente el 1,04% como GLA. Por lo tanto, pueden usarse ácidos grasos tales como AA, EPA y/o ácido docosahexaenoico (DHA), producidos de acuerdo con la presente invención, para modificar, por ejemplo la composición de fórmulas para lactantes para reproducir mejor el contenido de AGP de la leche materna humana o para modificar la presencia de los AGP que normalmente se encuentran en una leche de mamíferos no humanos. En particular, una composición para usar en un complemento farmacéutico o alimenticio, particularmente un sustituto o suplemento de la leche materna, comprenderá preferiblemente uno o más de AA. DGLA y GLA. Mas preferiblemente, el aceite comprenderá de aproximadamente el 0,3 al 30% de AA, de aproximadamente el 0,2 al 30% de DGLA y/o de aproximadamente el 0,2 a aproximadamente el 30% de GLA.

Se contemplan composiciones nutricionales parenterales que comprenden de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 30 por ciento en peso de ácidos grasos calculados como triglicéridos. La composición preferida tiene de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 25 por ciento en peso de la composición de AGP total como GLA (Patente de Estados Unidos Nº 5.196.198). Pueden incluirse opcionalmente otras vitaminas, particularmente vitaminas liposolubles tales como vitamina A, D, E y L-carnitina. Cuando se desee, puede añadirse un conservante tal como alfa-tocoferol en una cantidad de aproximadamente el 0,1% en peso.

Además, las proporciones de AA, DGLA y GLA pueden adaptarse para un uso final dado particular. Cuando se formula como un suplemento o sustituto de la leche materna, una composición que comprende uno o más de AA, DGLA y GLA se proporcionará en una proporción de aproximadamente 1:19:30 a aproximadamente 6:1:0,2, respectivamente. Por ejemplo, la leche materna de animales puede variar en proporciones de AA:DGLA:GLA que varían de 1:19:30 a 6:1:0,2 que incluye proporciones intermedias que son preferiblemente de aproximadamente 1:1:1, 1:2:1 y 1:1:4. Cuando se producen juntos en una célula hospedadora, puede usarse el ajuste del índice y del porcentaje de conversión de un sustrato precursor tal como GLA y DGLA en AA para controlar con precisión las proporciones de AGP. Por ejemplo, puede usarse un índice de conversión del 5% al 10% de DGLA en AA para producir una proporción de AA con respecto a DGLA de aproximadamente 1:19, mientras que puede usarse un índice de conversión de aproximadamente el 75% al 80% para producir una proporción de AA con respecto a DGLA de aproximadamente 6:1. Por lo tanto, ya sea en un sistema de cultivo celular o en un animal hospedador, la regulación del momento, grado y especificidad de la expresión de la desaturasa, así como de la expresión de otras desaturasas y elongasas, puede usarse para modular los niveles y proporciones de AGP. Después, los AGP producidos de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, AA y EPA) pueden combinarse con otros AGP/ácidos (por ejemplo, GLA) en las concentraciones y proporciones deseadas.

Además, los AGP producidos de acuerdo con la presente invención o las células hospedadoras que los contienen también pueden usarse como complementos alimenticios animales para modificar la composición de ácidos grasos en el tejido o la leche de un animal por una más deseable para consumo humano o animal.

Composiciones farmacéuticas

También se contempla una composición farmacéutica que comprende uno o más de los ácidos y/o aceites resultantes producidos usando los genes de desaturasa, de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria. Más específicamente, una composición farmacéutica de este tipo puede comprender uno o más de los ácidos y/o aceites, así como un vehículo, adyuvante o excipiente convencional bien conocido no tóxico y farmacéuticamente aceptable tal como, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente humectante o una emulsión, tal como una emulsión de agua en aceite. La composición puede estar en una forma líquida o sólida. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un comprimido, cápsula, líquido o polvo ingerible, inyectable o pomada o crema tópica. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro sódico y similares. A parte de dichos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y agentes perfumantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden comprender agentes de suspensión tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, sorbitol de polioxietileno y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto o mezclas de estas sustancias.

Pueden prepararse formas de dosificación sólidas, tales como comprimidos y cápsulas, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los AGP producidos de acuerdo con la presente invención pueden conformarse en comprimidos con bases para comprimidos convencionales tales como lactosa, sacarosa y almidón de maíz, en combinación con aglutinantes tales como goma arábiga, almidón de maíz o gelatina, agentes disgregantes tales como almidón de patata o ácido algínico y un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio. Pueden prepararse cápsulas por incorporación de estos excipientes en una cápsula de gelatina junto con antioxidantes y el o los AGP pertinentes. El antioxidante y los componentes de AGP deberían ajustarse las directrices presentadas anteriormente.

Para la administración por vía intravenosa los AGP producidos de acuerdo con la presente invención o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales, tales como Intralipids^{TM}. El perfil típico de ácidos grasos en plasma de un adulto normal comprende del 6,64 al 9,46% de AA, del 1,45 al 3,11% de DGLA y del 0,02 al 0,08% de GLA. Estos AGP o sus precursores metabólicos pueden administrarse solos o en combinación con otros AGP para conseguir un perfil de ácidos grasos normal en un paciente. Cuando se desee, los componentes individuales de las formulaciones pueden proporcionarse de forma individual, en forma de kit, para un solo uso o usos múltiples. Una dosificación típica de un ácido graso en particular es de 0,1 mg a 20 g (hasta 100 g) diariamente y es preferiblemente de 10 mg a 1, 2, 5 ó 10 g diarios.

Las posibles vías de administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo, vías enterales (por ejemplo, oral y rectal) y parenterales. Por ejemplo, una preparación líquida puede administrarse, por ejemplo, por vía oral o rectal. Además, una mezcla homogénea puede dispersarse completamente en agua, mezclarse en condiciones estériles con diluyentes, conservantes, tampones o propulsores fisiológicamente aceptables para formar una pulverización o un inhalador. Por supuesto, la vía de administración dependerá del efecto deseado. Por ejemplo, si la composición se está utilizando para tratar la piel áspera, seca o el envejecimiento, para tratar piel lesionada o quemada o para tratar piel o pelo afectados por una enfermedad o afección, quizá pueda aplicarse por vía tópica.

La dosificación de la composición que se va administrar al paciente puede determinarse por un especialista en la técnica y depende de diversos factores tales como el peso del paciente, la edad del paciente, el estado inmune del paciente, etc.

Con respecto a la forma, la composición puede ser, por ejemplo, una solución, una dispersión, una suspensión, una emulsión o un polvo estéril que después se reconstituye.

También se contempla el tratamiento de diversos trastornos mediante el uso de las composiciones farmacéuticas y/o nutricionales descritas en la presente memoria. En particular, las composiciones pueden usarse para tratar la reestenosis después de una angioplastia. Además, también pueden tratarse con las composiciones síntomas de inflamación, artritis reumatoide, asma y psoriasis. Las pruebas también indican que los AGP pueden estar implicados en el metabolismo del calcio; por lo tanto, las composiciones de la presente invención pueden utilizarse, quizá, en el tratamiento o la prevención de la osteoporosis y de piedras en el riñón o en el tractor urinario.

Además, las composiciones también pueden usarse en el tratamiento del cáncer. Se ha demostrado que las células malignas tienen composiciones de ácidos grasos alteradas. Se ha demostrado que la adición de ácidos grasos ralentiza su crecimiento, provoca muerte celular y aumenta su susceptibilidad a agentes quimioterápicos. Además, las composiciones también pueden ser útiles para el tratamiento de la caquexia asociada con el cáncer.

Las composiciones también pueden usarse para tratar la diabetes (véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.826.877 y Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Supl.) 732S-737S). Se ha demostrado un metabolismo y una composición de ácidos grasos alterada en animales diabéticos.

Además, las composiciones que comprenden AGP producidos directa o indirectamente mediante el uso de las enzimas desaturasas, también pueden usarse en el tratamiento de eccemas, en la reducción de la presión sanguínea y en la mejora de las puntuaciones en los exámenes de matemáticas. Además, las composiciones pueden usarse en la inhibición de la agregación plaquetaria, la inducción de la vasodilatación, la reducción de los niveles de colesterol, la inhibición de la proliferación de tejido fibroso y muscular liso de las pareces de los vasos (Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, págs. 85-101, 1976), la reducción o la prevención del sangrado gastrointestinal y otros efectos secundarios de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.666.701), la prevención o el tratamiento de la endometriosis y del síndrome premenstrual (véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.758.592) y el tratamiento de la encefalomielitis miálgica y de la fatiga crónica después de infecciones virales (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.116.871).

Los usos adicionales de las composiciones incluyen el uso en el tratamiento del SIDA, la esclerosis múltiple y los trastornos cutáneos inflamatorios, así como para el mantenimiento de la salud en general.

Además, la composición puede utilizarse con fines cosméticos. Puede añadirse a composiciones cosméticas preexistentes de tal modo que se forme una mezcla o puede usarse como una composición única.

Aplicaciones veterinarias

Debe señalarse que las composiciones farmacéuticas y nutricionales descritas anteriormente pueden utilizarse en relación con animales (es decir, domésticos o no domésticos) así como en seres humanos, puesto que los animales experimentan muchas de las mismas necesidades y afecciones que los seres humanos. Por ejemplo, el aceite o los ácidos producidos por los métodos de la presente invención pueden utilizarse en suplementos de piensos animales, sustitutos de piensos animales, vitaminas para animales o en pomadas tópicas para animales.

Ejemplo I Diseño de oligonucleótidos degenerados para el aislamiento de desaturasas de Thraustochytrium aureum y construcción de una genoteca de ADNc

El análisis de la composición de ácidos grasos del hongo marino Thraustochytrium aureum (T. aureum) (ATCC 34304) se investigó para determinar los tipos y cantidades de ácidos grasos poliinsaturados (AGP). Este hongo tenía cantidades importantes de AGP de cadena larga, tales como ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6) y ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-3). Sin embargo, el T. aureum también producía AGP tales como ácido adrénico (ADA, 22:4n-6), ácido \omega6-docosapentaenoico (\omega6-DPA, 22:5n-6), \omega3-docosapentaenoico (\omega3-DPA, 22:5n-3), siendo la mayor cantidad de ácido graso el ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3) (véase la Figura 1). Por lo tanto, además de la \Delta6, \Delta5 y \Delta17-desaturasa, el T. aureum probablemente contiene una \Delta19-desaturasa que convierte el ADA en \omega3-DPA o el \omega6-DPA en DHA y/o una \Delta4-desaturasa que desatura el ADA en \omega6-DPA o el \omega3-DPA en DHA. Por lo tanto, el objetivo era intentar aislar los genes de desaturasa predichos de T. aureum y verificar la funcionalidad de las enzimas por expresión en un hospedador alternativo.

Para aislar genes que codifican enzimas desaturasas funcionales, se construye una genoteca de ADNc. Se cultivaron células de T. aureum (ATCC 34304) en medios BY+ (Nº 790, Difco, Detroit, MI) a temperatura ambiente durante 4 días en presencia de luz y con agitación constante (250 rpm) para obtener la máxima biomasa. Estas células se recogieron por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos y se aclararon en agua helada sin ARNasa. Estas células se lisaron después en una prensa francesa a 10.000 psi y las células lisadas se recogieron directamente en fenol tamponado con TE. Se retiraron las proteínas del lisado celular mediante extracción repetida con fenol:cloroformo (1:1 v/v) seguida de una extracción con cloroformo. Los ácidos nucleicos de la fase acuosa se precipitaron a -70ºC durante 30 minutos usando acetato de sodio 0,3 M (concentración final) (pH 5,6) y un volumen de isopropanol. Los ácidos nucleicos precipitados se recogieron por centrifugación a 15.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC, se secaron al vacío durante 5 minutos y después se trataron con ADNasa I (sin ARNasa) en tampón de ADNasa 1X (Tris-Cl 20 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 5 mM) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió con EDTA 5 mM (pH 8,0) y el ARN se purificó adicionalmente usando el Qiagen RNeasy Maxi kit (Qiagen, Valencia, CA) según el protocolo de fabricante.

Se aisló el ARN mensajero a partir del ARN total usando resina de oligo dT celulosa y se usó el kit de construcción de genotecas pBluescript II XR (Stratagene, La Jolla, CA) para sintetizar ADNc bicatenario que después se clonó direccionalmente (5' EcoRI/3' XhoI) en el vector pBluescript II SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). La genoteca de T. aureum contenía aproximadamente 2,5 x 10^{6} clones, cada uno con un tamaño de inserto medio de aproximadamente 700 pb. Se aisló el ADN genómico de cultivos de T. aureum que producían AGP por trituración del cultivo en nitrógeno líquido y se purificó usando el Qiagen Genomic DNA Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).

La estrategia que se adoptó consistía en diseñar oligonucleótidos (cebadores) degenerados que representan motivos aminoacídicos que están conservados en desaturasas conocidas. Estos cebadores podían usarse después en una reacción de PCR para identificar un fragmento que contenía las regiones conservadas en los genes de desaturasa predichos de hongos. Puesto que las únicas desaturasas fúngicas que se habían identificado eran los genes de la \Delta5 y \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina (números de acceso de Genbank AF067650, AB020032, respectivamente), se tuvieron en cuenta las secuencias de desaturasas de plantas así como de animales durante el diseño de estos cebadores degenerados. En particular, se usaron secuencias de \Delta5 y \Delta6-desaturasas conocidas de los siguientes organismos para el diseño de estos cebadores degenerados: Mortierella alpina, Borago officinalis, Helianthus annuus, Brassica napus, Dictyostelium discoideum, Rattus norvegicus, Mus musculus, Homo sapiens, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana y Ricinus communis. Los cebadores degenerados usados fueron los siguientes, usando el programa CODE-HOP Blockmaker (http://blocas.fhcrc.org/codehop.html):

a. Motivo proteico 1: NH_{3}-VYDVTEWVKRHPGG-COOH (SEC ID Nº: 56)

Cebador RO 834 (SEC ID Nº: 1):

5'GTBTAYGAYGTBACCGARTGGGTBAAGCGYCAYCCBGGHGGH-3'

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B. Motivo proteico 2: NH_{3}-GASANWWKHQHNVHH-COOH (SEC ID Nº: 57)

Cebador RO835 (Directo) (SEC ID Nº: 2):

5'-GGHGCYTCCGCYAACTGGTGGAAGCAYCAGCAYAACGTBCAYCAY-3'

Cebador RO836 (Inverso) (SEC ID Nº: 3):

5'-RTGRTGVACGTTRTGCTGRTGCTTCCACCAGTTRGCGGARGCDCC-3'

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C. Motivo proteico 3: NH_{3}-NYQIEHHLFPTM-COOH (SEC ID Nº: 58)

Cebador RO838 (Inverso) (SEC ID Nº: 4)

5'-TTGATRGTCTARCTYGTRGTRGASAARGGVTGGTAC-3'

Además, se diseñaron dos cebadores más en base a la 2ª y 3ª "cajas de histidina" conservadas que se encuentran en las \Delta6-desaturasas conocidas. Estos eran:

Cebador RO753 (SEC ID Nº: 5) 5'-CATCATCATXGGRAAXARRTGRTG-3'

Cebador RO754 (SEC ID Nº: 6) 5'-CTACTACTACTACAYCAYACXTAY ACXAAY-3'.

El código de degeneración para las secuencias oligonucleotídicas era: B = C, G, T; H = A, C, T; S = C, G; R = A, G; V = A, C, G; Y = C, T; D = A, T, C; X = A, C, G, T

Ejemplo II Uso de oligonucleótidos degenerados para el aislamiento de una desaturasa de un hongo

Para aislar supuestos genes de desaturasa, se aisló el ARN total usando el método de cloruro de litio (Hoge et al., (1982) Exp. Mycol. 6: 225-232). Se realizó una transcripción inversa de aproximadamente 5 \mug usando el sistema Superscript Preamplification (Life Technologies, Rockville, MD) para producir la primera cadena de ADNc. Se usaron las siguientes combinaciones de cebadores: RO834/836, RO834/838, RO835/836, RO835/838 y RO753/754 en varias reacciones de PCR con diferentes parámetros de termociclado y Taq polimerasa a temperaturas de hibridación inferiores a 60ºC, pero no se produjeron bandas.

En intentos adicionales para aislar fragmentos de desaturasas, se usaron los cebadores degenerados RO834/838 (diseñados con el programa Blockmaker) y RO753/754 en una reacción de 50 \mul. Se combinaron los siguientes componentes: 2 \mul del molde de la primera cadena de ADNc, Tris-HCl 20 mM a pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada desoxirribonucleótido trifosfato, 0,2 pmoles de concentración final de cada cebador y ADNc polimerasa (Clonetech, Palo Alto, CA). El termociclado se llevó a cabo de la forma siguiente: una desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos seguida de 35 ciclos de; desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 60ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 1 minuto. Esto se siguió de una extensión final a 72ºC durante 7 minutos. Se detectaron dos bandas débiles de aproximadamente 1000 pb para los cebadores RO834/838, mientras que se descubrió una banda ligeramente más pequeña pero más intensa de 800-900 pb con la pareja de cebadores RO753/754. Las reacciones se separaron en un gel de agarosa al 1%, se escindieron y se purificaron con el QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Los extremos escalonados de estos fragmentos se "rellenaron" usando una ADN polimerasa T4 (Life Technologies, Rockville, MD), según las especificaciones del fabricante, y estos fragmentos de ADN se clonaron en el vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los plásmidos recombinantes se usaron para transformar células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los clones se secuenciaron parcialmente.

Posteriormente, se descubrió que las secuencias del clon 30-3 (reacción con RO834/838) y del clon 17-1 (reacción con RO753/754) se solapaban para generar un fragmento de 1313 pb. El fragmento se tradujo y se usó Tfasta para hacer una búsqueda en la base de datos de GenBank. Las mayores coincidencias eran la \Delta5-desaturasa de Mortierella alpina (Nº de Acceso de GenBank AF067654) (homología del 27% en 202 aminoácidos), \Delta6-desaturasa de Spirulina platensis (número de acceso de GenBank X87094) (homología del 30% en 121 aminoácidos), \Delta5-desaturasa de Dictyostelium discoideum (número de acceso de GenBank AB02931) (homología del 26% en 131 aminoácidos) y \Delta6-desaturasa de M. alpina (número de acceso AF110510) (homología del 30% en 86 aminoácidos). Puesto que existía un grado razonable de homología de aminoácidos con desaturasas conocidas, se buscó un gen de longitud completa que codificara una desaturasa potencial para determinar su actividad cuando se expresaba en levaduras.

Ejemplo III Aislamiento de la secuencia génica de longitud completa de T. aureum (ATCC 34304)

Para encontrar el gen de longitud completa se llevaron a cabo dos reacciones de PCR separadas, en un intento por determinar los dos extremos de una supuesta desaturasa de la genoteca de ADNc. Para el extremo 3' del gen, se usó RO898 (SEC ID Nº: 7) (5'-CCCAGTCAC-GACGTTGTAAAACGACGGCCAG-3') (diseñado en base a la secuencia del vector pBluescript SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA)) en una reacción de amplificación por PCR junto con un cebador específico de gen RO930 (SEC ID Nº: 8) (5'-GACGATTAACAAGGTGATTTCCCAGGATGTC). En este caso, se usó el kit Advantage-GC cDNA PCR (Clonetech, Palo Alto, CA) para superar los problemas de la amplificación por PCR que aparecían con secuencias ricas en GC (61% para el fragmento de 1313 pb). Las condiciones de termociclado de la PCR fueron las siguientes: el molde se desnaturalizó inicialmente a 94ºC durante 3 minutos, seguido de 30 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto] y, por último, un ciclo de extensión a 72ºC durante 7 minutos con 20 pmoles de cada cebador. Los productos de PCR obtenidos de este modo se resolvieron en un gen de agarosa al 1%, se escindieron y se purificaron en gel usando el Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Los extremos escalonados en el fragmento se "rellenaron" usando una ADN polimerasa T4 (Life Technologies, Rockville, MD) según las especificaciones del fabricante y se clonaron en el vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA), como se describe en el Ejemplo II. La secuencia del clon 93-3 se solapaba con el fragmento de 1313 pb original y se descubrió que contenía una fase de lectura abierta, un codón de terminación y una cola poli A que indicaba que éste era el extremo 3' del gen. Se diseñaron dos cebadores en base a la secuencia del clon 93-3 cerca de codón de terminación con un sitio generado para XhoI (subrayado), de la forma siguiente: RO973 (SEC ID Nº: 9) (5'-GACTAACTCGAGTCACGT-GGACCAGGCCGTGAGGTCCT-3') y RO974 (SEC ID Nº: 10 (5'-GACTAACTCGAGTTGACGAGGTTTGTAT GTTCGGCGGTTTGCTTG-3'). Se seleccionaron de forma deliberada dos cebadores porque RO973, que contenía el codón de terminación, era rico en GC (60%) y podía no amplificar bien. Por otro lado, RO974, cadena abajo del codón de terminación, tenía un contenido mucho menor de GC (48%).

Siguiendo el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente para aislar el extremo 5' del gen, se usaron RO899 (SEC ID Nº: 11) (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC-3') (diseñado en base a la secuencia del vector pBluescript SK(+)) y el oligonucleótido específico de gen RO1004 (SEC ID Nº: 12) (5'-TGGCTACCGTCGTGCTG
GATGCAAGTTCCG-3') para la amplificación de la genoteca de ADNc. La amplificación se llevó a cabo usando 10 pmoles de cada cebador y el kit de ADNc polimerasa (Clonetech, Palo Alto, CA). Las condiciones de reacción incluían una desnaturalización inicial a 94ºC durante 1 minuto, seguida de 30 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 3 minutos] y, por último, un ciclo de extensión a 68ºC durante 5 minutos. Los productos de PCR obtenidos de este modo se clonaron en el vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente. Los plásmidos recombinantes se usaron para transformar células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se secuenciaron los clones. El clon 1004-5 contenía una fase de lectura abierta, varios codones de inicio y se solapaba con la secuencia de 1313 pb original indicando que éste era el extremo 5' del gen.

Para aislar el gen de longitud completa, se diseñó un cebador para el extremo 5' de la supuesta desaturasa con un sitio EcoRI generado (subrayado), de la forma siguiente: RO1046 (SEC ID Nº: 13) (5'-CGCATGGAATTCATGACGGT
CGGGTTTGACGAAACGGTG-3').

Para aislar un clon de longitud completa, se usaron tanto RO1046/973 como RO1046/974 con ADNc aislado a partir de la genoteca y del ADN genómico como diana. Se usaron tanto una ADNc polimerasa (Clonetech, Palo Alto, CA) como una -GC Advantage Polymerase (Clonetech, Palo Alto, CA) para amplificar sus respectivas dianas con 10 pmol de cebador, con las siguientes condiciones de reacción: una desnaturalización inicial a 94ºC durante 1 minuto, seguida de 30 ciclos de [94ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 3 minutos] y, por último, un ciclo de extensión a 68ºC durante 5 minutos. Las reacciones se purificaron en gel, se cortaron con EcoRI/XhoI y se clonaron en un vector de expresión de levaduras pYX242 preparado con EcoRI/XhoI (Invitrogen, Carlsbad, CA) que se había tratado con fosfatasa alcalina de camarón (Roche, Indianápolis, IN) para evitar la recircularización. El análisis inicial de las secuencias de longitud completa demostró varios cambios de bases. Los clones 112-3 y 112-5 (denominados pRTA7 y 8, respectivamente) se obtuvieron de la amplificación con ADN genómico y polimerasa -GC Advantage usando los cebadores RO1046/974. El clon 110-3 (denominado pRTA5) se obtuvo a partir de una reacción con RO1046/973, diana de ADN genómico y ADNc polimerasa. El clon 111-1 (denominado pRTA6) se aisló a partir de la reacción que usaba RO1046/974, diana de ADNc y kit de polimerasa -GC Advantage. La secuencia de estos cuatro plásmidos, pRTA5 (SEC ID Nº: 14), pRTA6 (SEC ID Nº: 15), pRTA7 (SEC ID Nº: 16) y pRTA8 (SEC ID Nº: 17) se muestra en las Figuras 3-6, respectivamente. (Los plásmidos pRTA7 y pRTA8 se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110 el 19 de abril de 2001 y se acordaron los números de acceso PTA-3301 y PTA-3300, respectivamente). Esta supuesta desaturasa de 1548 pb y 515 aminoácidos (véanse las Figuras 7-10 y las SEC ID Nº: 18, 19, 20 y 21, respectivamente) tenía muchas de las características de las desaturasas descritas. Los aminoácidos que se corresponden con el extremo 5' de la enzima son homólogos al citocromo b5. También existen varias cajas de histidina en los siguientes aminoácidos: 178-183-(Q)HDGSH (SEC ID Nº: 59); 213-219-(Q)HVLGHH (SEC ID Nº: 60); 262-265-HPWH (SEC ID Nº: 61), 271-275-HKFQH (SEC ID Nº: 62); y 452-475(H)QIEHH (SEC ID Nº: 63). Al menos una H o una Q precede a tres de estas cajas de histidina, algo que es poco habitual. El Dictyostelium discoideum (número de acceso de GenBank AB029311) tiene dos cajas similares [(Q)HVIGHH (SEC ID Nº: 64) y (H)QVVHH] (SEC ID Nº: 65), mientras que M. alpina (número de acceso de GenBank AF067654) tiene (Q)HMLGHH (SEC ID Nº: 66) y Synechocystis sp. sólo tiene una (H)QVTHH (SEC ID Nº: 67). Las secuencias de las diversas supuestas desaturasas diferían entre sí. Varios de estos cambios de bases dieron como resultado un cambio de aminoácido, como se muestra en la Tabla 1. Estas diferencias podían ser variantes de origen natural, introducirse por un emparejamiento erróneo en la PCR durante la amplificación final o un error en la PCR cuando se producía el ADNc inicial. Hay siete cambios aminoacídicos individuales entre los cuatro plásmidos, ninguno de ellos compartido (véase la Figura 2A y B, aminoácidos subrayados y en negrita). Estas diferencias podían alterar la actividad de la enzima codificada.

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TABLA 1

1

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Ejemplo IV Expresión de plásmidos que contienen supuestas desaturasas en levaduras

Los cuatro plásmidos se usaron para transformar Saccharomyces cerevisiae de cepa 334 competentes. La transformación de levaduras se llevó a cabo usando el Alkali-Cation Yeast Transformation Kit (BIO 101, Vista, CA), de acuerdo con las condiciones especificadas por el fabricante. Se seleccionaron transformantes por auxotrofia para leucina en medios que carecían de leucina (DOB [-Leu]). Para detectar la actividad desaturasa específica de estos clones, los transformantes se cultivaron en presencia de 50 \muM de sustratos de ácidos grasos específicos, como se enumeran a continuación:

a. Ácido linoleico (18:2n-6) (la conversión en ácido alfa-linolénico indicaría actividad \Delta15-desaturasa y la conversión en ácido gamma-linolénico indicaría actividad \Delta6-desaturasa).

b. Ácido alfa-linolénico (18:3n-3) (la conversión en ácido estearidónico indicaría actividad \Delta6-desaturasa).

c. Ácido araquidónico (20:4n-6) (la conversión en ácido eicosapentaenoico indicaría actividad \Delta17-desaturasa).

d. Ácido adrénico (22:4n-6) (la conversión en ácido \omega3-docosapentaenoico indicaría actividad \Delta19 o la conversión en ácido \omega6-docosapentaenoico indicaría actividad \Delta4-desaturasa).

e. Ácido \omega3-docosapentaenoico (22:5:n-3) (la conversión en docosahexaenoico indicaría actividad \Delta4-desaturasa).

La cepa de control negativo era S. cerevisiae 334 que contenía el vector pYX242 no modificado, y éstas se cultivaron simultáneamente.

Los cultivos se agitaron vigorosamente (250 rpm) y se cultivaron durante 48 horas a 24ºC en presencia de 50 \muM (concentración final) de los diversos sustratos en 50 ml de medios que carecían de leucina, después de la inoculación con cultivo de una noche de colonias individuales en caldo de extracto de levadura peptona dextrosa (YPD) a 30ºC. Las células se sedimentaron y los sedimentos se agitaron vorticialmente en metanol; se añadió cloroformo junto con tritidecanoína (como un patrón interno). Estas mezclas se incubaron durante al menos una hora a temperatura ambiente o a 4ºC durante una noche. La fase de cloroformo se extrajo y se filtró a través de un filtro Whatman con 1 g de sulfato de sodio anhidro para eliminar particulados y agua residual. Los disolventes orgánicos se evaporaron a 40ºC bajo una corriente de nitrógeno. Después, los lípidos extraídos se derivatizaron a ésteres metílicos de ácidos grasos (EMAG) para el análisis mediante cromatografía de gases (GC) por adición de 2 ml de hidróxido de potasio 0,5 N en metanol a un tubo cerrado. Las muestras se calentaron a 95ºC-100ºC durante 30 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadieron aproximadamente 2 ml de trifluoruro de boro al 14% en metanol y se repitió el calentamiento. Después de enfriarse la mezcla de lípidos extraída, se añadieron 2 ml de agua y 1 ml de hexano para extraer los ésteres metílicos de ácidos grasos (EMAG) para el análisis por GC. Se calculó el porcentaje de conversión dividiendo el producto producido por la suma de (el producto producido + el sustrato añadido) y, después, multiplicando por 100.

Los resultados demostraron una conversión de \omega-3DPA en DHA y de ADA en \omega6-DPA. Esto indicaría actividad \Delta4-desaturasa (véase la Tabla 2).

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TABLA 2

3

En particular, ésta es la primera demostración de un gen de \Delta4-desaturasa con datos de expresión in vivo. La conversión para los cuatro clones variaba del 3,91% al 10,97% para la producción de \omega6-DPA a partir de ADA y del 10% al 36,34% para la producción de DHA a partir de \omega-3DPA. La enzima parecía ser mucho más activa en la producción de DHA que en la de \omega6-DPA como indicaba el porcentaje de conversión reducido, del 36,34% frente al 10,97%, respectivamente, para 25 \muM de sustrato para el clon pRTA7. A una concentración de 100 \muM de cualquier sustrato, el porcentaje de conversión (véase la Tabla 2), así como la cantidad de producto producido (no se muestran los datos) disminuían, indicando que puede existir una inhibición por retroalimentación de la etapa de desaturación por el sustrato. La cantidad de \omega3-DPA (22:5n-3) incorporado (como un porcentaje del lípido total) es similar para los cuatro plásmidos (véase la Tabla 3, a continuación). Sin embargo, la cantidad producida como un porcentaje del total varía desde el 2,74 (PRTA5) hasta el 8,11% (PRTA7). La diferencia en los índices de conversión y en le porcentaje producido podían deberse a la diferencia en la secuencia, por lo tanto, a la variación de aminoácidos de la enzima codificada en los cuatro plásmidos.

TABLA 3

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4

No se muestran los datos para 25 \muM de sustrato.

Clave:

22:4(n-6) =

Ácido adrénico

22:5(n-3) =

Ácido \omega3-docosapentaenoico

22:5(n-6) =

Ácido \omega6-docosapentaenoico

22:6(n-3) =

Ácido docosahexaenoico

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Estos datos muestran de forma inequívoca que estos plásmidos codifican de hecho una \Delta4-desaturasa, que tiene una actividad preferida en la conversión de \omega3-DPA en DHA por encima de la conversión de ADA en \omega6-DPA.

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Ejemplo V Expresión de \Delta4-desaturasa con la elongasa de ratón en levadura

Los plásmidos pRTA7 y pRTA8 (que tenían los dos porcentajes de conversión más elevados) pueden cotransformarse de forma individual con pRMEL04, un clon que contiene un gen de elongasa de ratón de pRAE-84 (véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos de Nº de Serie 09/624.670, incorporada en la presente memoria en su totalidad como referencia). La elongasa de ratón de 879 pares de bases (véase la Figura 11 (SEC ID Nº: 22) y la Figura 12 (SEC ID Nº: 23)) puede clonarse como un fragmento de EcoRI/SalI en el vector de expresión de levaduras pYES2 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en los sitios EcoRI/XhoI. Esta elongasa de 292 aminoácidos cataliza varias de las etapas de elongación en la ruta de AGP, en concreto, de AA a ADA y de EPA a \omega3-DPA. El ADA y el \omega3-DPA son sustratos para la \Delta4-desaturasa. Pueden seleccionarse transformantes de levaduras sobre medios mínimos que carecen de leucina y uracilo (DOB [-Leu-Ura]) para la selección de \Delta4-desaturasa (pRTA7 o pRTA8) y pRMEL04 (elongasa de ratón). El cultivo y la expresión del cultivo de levaduras que contiene pRMEL04 y pRTA7 o pRTA8 en medios mínimos que carecen de uracilo y leucina y con galactosa al 2% puede dar como resultado la elongación del AA añadido exógenamente a ADA y la \Delta4-desaturación en \omega6-DPA. Además, la suplementación de EPA en el medio mínimo de levaduras puede dar como resultado la elongación en \omega3-DPA por la elongasa que, después, puede desaturarse por la \Delta4-desaturasa para producir DHA, como se muestra en la Figura 1. Esto se ha demostrado anteriormente con elongasas y otras desaturasa para producir AA y EPA (véase la solicitud PCT WO 00/12720) y proporciona datos experimentales paralelos para demostrar que la elongación de un sustrato y la posterior desaturación pueden tener lugar in vivo en un organismo tal como una levadura y, potencialmente, en otros organismos. Además, los presentes datos demuestran la capacidad de la \Delta4-desaturasa para trabajar con otra enzima en la ruta biosintética de los AGP para producir \omega6-DPA o DHA a partir de los precursores AA y EPA, respectivamente.

Ejemplo VI Homólogo de \Delta4-desaturasa de Schizochytrium aggregatum (ATCC 28209)

En paralelo al Ejemplo II, se aisló ARN mediante el método de fenol ácido de Schizochytrium aggregatum (S. aggregatum) ATCC 28209. En resumen, se lavaron sedimentos de S. aggregatum con agua desionizada fría y se volvieron a sedimentar durante 5 minutos a 3000 rpm. Se usaron aproximadamente 10 ml de solución de TES (Tris-Cl 10 mM a pH 7,5, EDTA 10 mM y SDS al 0,5%) para resuspender el sedimento. Después, se añadieron 10 ml de fenol ácido y se siguió con la incubación durante una hora a 65ºC. El sedimento se colocó en hielo durante 5 minutos, se centrifugó durante 5 minutos a 1000 x g a 4ºC y la fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo. Se añadieron 10 ml adicionales de fenol ácido a la fase acuosa, la mezcla se agitó vorticialmente y se separó como anteriormente. La fase acuosa que contenía los ácidos nucleicos se transfirió a un nuevo tubo. Se añadió aproximadamente 1 ml de acetato de sodio a pH 5,3 y 25 ml de etanol helado para una precipitación durante una noche a -70ºC. Al día siguiente, los tubos se centrifugaron durante 15 minutos a 14.000 rpm a 4ºC y el sobrenadante se decantó. El sedimento se lavó con 10 ml de etanol al 70% y se centrifugó como en la etapa anterior. El sedimento se secó y se resuspendió en 500 \mul de agua desionizada sin ARNasa. El ARN se purificó adicionalmente usando el Qiagen RNeasy Maxikit (Qiagen, Valencia, CA), según el protocolo del fabricante.

Se generó el ADNc usando oligo dT con el sistema SuperScript Preamplification (Life Technologies, Rockville, MD) con 5 \mug de ARN de S. aggregatum. Puesto que el S. aggregatum produce grandes cantidades de DHA, se requeriría una \Delta4-desaturasa para la producción de DHA. En un experimento idéntico, se usaron los cebadores RO753 (SEC ID Nº: 5) y RO754 (SEC ID Nº: 6) en la misma reacción que en el Ejemplo II para producir una banda de aproximadamente 800 pares de bases. Como anteriormente, el ADN generado a partir de la reacción de PCR se separó en un gel al 1%, se escindió, se purificó y se clonó en el vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). La secuencia de ADN generada a partir de los clones saa9 y saa5 se solapaba para generar la secuencia saa.con (SEC ID Nº: 24 y Figura 13). La traducción de la fase de lectura abierta de la secuencia de ADN de saa.con en una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 25 y Figura 14) alineada con pRTA7 se muestra en la Figura 15. La secuencia de aminoácidos de la \Delta4-desaturasa del clon pRTA7 tenía una identidad del 79,1% con la secuencia traducida de saa.con a lo largo de 249 aminoácidos. Esta secuencia, debido a su elevada identidad con una \Delta4-desaturasa conocida, es muy probablemente un fragmento de una \Delta4-desaturasa de S. aggregatum. Este ejemplo proporciona pruebas de que este procedimiento puede usarse para aislar \Delta4-desaturasas de otros organismos.

Ejemplo VII Aislamiento de secuencias de nucleótidos de la \Delta4-desaturasa de Schizochytrium aggregatum (ATCC 28209) y Thraustochytrium aureum (BICC 7091)

Para aislar los extremos 5' y 3' se diseñaron nuevos cebadores basados en la secuencia interna del fragmento de S. agreggatum aislado que se muestra en el Ejemplo VI. Para el extremo 5 prima del gen, se usó RO1240 (SEC ID Nº: 26) (5'-CCC TCG ATG ATG TGG TTG ACG ATG AAC-3') y posteriormente el cebador anidado 5 prima RO1239 (SEC ID Nº: 27) (5'-CGG AGC ATG GGG TAG GTG CTG AAG AC-3'). Para el extremo 3 prima, se usó RO1236 (SEC ID Nº: 28) (5'-CCA ACT GCC GTT ACG CCA GCA AGT-3') seguido del cebador anidado 3 prima RO1237 (SEC ID Nº: 29) (5'-CAA GCT CTT CTT CAT CGC CCA CTT TTC G-3'), para una segunda reacción para aislar el otro extremo del gen. Se usó ADNc listo para RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) como una diana para las reacciones. Para preparar este material, se usaron aproximadamente 5 \mug del ARN total, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con el kit GeneRacer^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la enzima Superscript II^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la transcripción inversa para producir ADNc diana. Para la amplificación inicial de los extremos, se usó el siguiente protocolo de termociclado en un Perkin Elmer 9600: fusión inicial a 94ºC durante 2 minutos seguida de 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos, 10 ciclos de 94ºC 30 segundos, 70ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos y 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos, seguidos de una extensión de 72ºC durante 10 minutos. La primera reacción de PCR se realizó con 10 pmol de RO1240 y 30 pmol de cebador 5 prima de GeneRacer^{TM} (SEC ID Nº: 30) (5'-CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA-3') o RO1236 y cebador 3 prima de GeneRacer^{TM} (SEC ID Nº: 31) (5'-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G-3'). La reacción contenía 1 \mul de ADNc en un volumen final de 50 \mul con Platimun Taq^{TM} PCRx (Clonetech, Palo Alto, CA) usando MgSO_{4} de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó una reacción anidada con 1 \mul de la reacción inicial, 10 pmol de cebador anidado RO1239 y 30 pmol del cebador 5 prima anidado de GeneRacer^{TM} (SEC ID Nº: 32) (5'-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3') o cebador 3 prima anidado de GeneRacer^{TM} (SEC ID Nº: 33) (5'-CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG-3') y cebador anidado RO1237, usando las mismas condiciones que en la primera reacción. El análisis en gel de agarosa de los productos de PCR mostraba una banda de aproximadamente 800 pares de bases para la reacción 5 prima y de aproximadamente 600 pares de bases para la reacción 3 prima. La posterior clonación en pCR Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA), la transformación en células competentes Top10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la secuenciación reveló una fase de lectura abierta con tanto un codón de inicio como de terminación. Se usaron los cebadores RO1241 (SEC ID Nº: 34) (5'-GAT ATC GAA TTC ATG ACG GTG GGC GGC GAT GAG G-3') y RO1242 (SEC ID Nº: 35) (5'-GTA CTT AAG CTT TCA CTT GGA CTT GGG GTG GTC C-3') con sitios de restricción añadidos para la clonación (véanse los sitios EcoRI y HindIII subrayados, respectivamente) para aislar un gen de longitud completa. Como se ha mostrado anteriormente, se usaron 10 pmol de los cebadores RO1241 y 1242 con Platimum Taq^{TM} PCRx (Clonetech, Palo Alto, CA) usando MgSO_{4}, de acuerdo con el protocolo del fabricante, con 2 \mul del ADNc como diana. Los parámetros de termociclado fueron los siguientes: fusión inicial a 94ºC durante 2 minutos seguida de 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos, 5 ciclos de 94ºC 30 segundos, 70ºC durante 2 minutos y 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 2 minutos, seguidos de una extensión de 68ºC durante 10 minutos. El gran producto de la reacción se purificó en gel usando el kit de purificación en gel de QiaQuick (Qiagen, Valencia, CA), se cortó con EcoRI y HindIII y se ligó con ADN linealizado con EcoRI/HindIII de pYX242 con el kit de ligación Rapid (Roche, Indianápolis, IN), y se denominó pRSA-1. El clon pRSA-1 contenía un gen de longitud completa de 1530 pb (SEC ID Nº: 36, Figura 16) y una fase de lectura abierta de 509 aminoácidos (SEC ID Nº: 37, Figura 17). (El plásmido pRSA-1 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110 el 27 de marzo de 2002, y se acordó el número de acceso PTA-4186).

La segunda \Delta4-desaturasa se identificó mediante una secuencia parcial aislada usando la combinación de cebadores de RO1201 (SEC ID Nº: 38) (5'-CGT GTT CGC TGC CTT TGT CGG AAC TTG CAT CC-3') y RO1202 (SEC ID Nº: 39) (5'-TTG ACA ATA AAC ATG GAG GCG AGG ACC TCT CCG-3') basados en la secuencia de pRTA7 (SEC ID Nº: 16), como se describe en el Ejemplo III. El ADN genómico (ADNg) se preparó como se describe en el Ejemplo I, a partir de Thraustochytrium aureum (BICC 7091) (Biocon India Ltd., Bangalore, India). Se llevó a cabo una amplificación por PCR en un volumen de 100 \mul que contenía: 5 \mul de ADNg de T7091 aislado, 1,0 U de ADNc polimerasa (Clonetech, Palo Alto, CA) y 10 pmol de cebadores de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las condiciones de termociclado en Perkin Elmer 9600 fueron las siguientes: 94ºC durante 3 min, después 35 ciclos de 94ºC durante 30 s, 60ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min. La PCR se siguió de una extensión adicional a 72ºC durante 7 minutos. Se purificó en gel un fragmento de 600 pb, se rellenaron los extremos usando una ADN polimerasa T4 (Life Technologies, Rockville, MD), se clonó en el vector pCR-Blunt (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA) y los plásmidos recombinantes se usaron para transformar células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La secuenciación de los clones reveló una elevada homología con pRTA7 (del 82,1% en 196 aminoácidos).

Para el aislamiento de un gen de longitud completa se generó una genoteca de ADNc con ARNm aislado a partir de ARN total usando una resina de oligo dT celulosa. Después se usó el kit de construcción de genotecas pBluescript II XR (Stratagene, La Jolla, CA) para sintetizar ADNc bicatenario que después se clonó direccionalmente (5'NotI/3'EcoRI) en el vector pBluescript II KS(+). La genoteca de T. aureum (BICC 7091) contenía aproximadamente 1,89 x 10^{8} clones, cada uno con un tamaño de inserto medio de aproximadamente 1300 pb.

Se diseñaron los cebadores RO1210 (SEC ID Nº: 40) (5'-GCT GGT TGG ACT TTG GAC ATG ATT GGA TCC-3') y RO1211 (SEC ID Nº: 41) (5'-TAC ATT GGC AGG CCA ACC ATG TAG AGA ACG-3') para amplificar las secuencias 5' y 3', respectivamente. Se prepararon RO1210/RO899 (SEC ID Nº: 11) y RO1211/RO898 (SEC ID Nº: 7) con ADNc polimerasa (Clonetech, Palo Alto, CA), 5 \mul de ADNc de la genoteca en las mismas condiciones que se han descrito anteriormente en este ejemplo para el aislamiento del fragmento original. Después de la clonación y de la secuenciación de los fragmentos, se usó un cebador interno adicional RO1214 (SEC ID Nº: 42) (5'-GGA TTC AAT CAT GTC CAA AGT CCA ACC AGC-3') con RO898 a partir del vector para identificar el extremo 5' del gen. En una reacción de 50 \mul, se usaron 10 pmoles de cada cebador con 5 \mul de ADN de genoteca como diana con Platinum Taq^{TM} PCRx (Clonetech, Palo Alto, CA) con MgSO_{4}, de acuerdo con el protocolo del fabricante. El protocolo de ciclado fue el siguiente: una fusión inicial de 94ºC durante 5 minutos seguida de 35 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 2 minutos y un ciclo de extensión de 72ºC durante 7 minutos.

Se aisló la \Delta4-desaturasa de longitud completa de T. aureum (BICC 7091) con el cebador 5' RO1223 (SEC ID Nº: 43) (5'-TCT GAT GAA TTC ATG ACG GCC GGA TTT GAA GAA G-3') y el cebador 3' RO 1224 (SEC ID Nº: 44) (5'-GTC TAG CTC GAG TTA GTT CTT GTC CCA GGC AGG CA-3') con sitios de restricción añadidos para EcoRI y XhoI (subrayados), respectivamente, añadidos con el fin de la clonación. En una reacción de 50 \mul, se usaron 10 pmoles de cada cebador, con 5 \mul de ADN de genoteca como diana con Platinum Taq^{TM} PCRx (Clonetech, Palo Alto, CA) con MgSO_{4}, de acuerdo con el protocolo del fabricante. El protocolo de ciclado fue el siguiente: una fusión inicial de 94ºC durante 5 minutos seguida de 35 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 2 minutos y un ciclo de extensión de 72ºC durante 7 minutos. La banda sencilla se separó en un gel de agarosa, se purificó, se cortó con EcoRI y XhoI y se ligó en pYX242 linealizado con las mismas enzimas. El análisis de secuencia del clon de longitud completa denominado pRTA11 (véase la Figura 18) (SEC ID Nº: 45) reveló una fase de lectura abierta de 1542 pares de bases que codificaba una proteína de 513 aminoácidos (véase la Figura 19) (SEC ID Nº: 46). (El plásmido pRTA11 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110 el 27 de marzo de 2002, y se acordó el número de acceso PTA-4187).

Ejemplo VIII Expresión de supuestas \Delta4-desaturasas de pRSA1 y pRTA11 en levaduras

Ambos plásmidos se transformaron en la cepa 334 de Saccharomyces cerevisiae competente y se cultivaron como se ha descrito en el Ejemplo IV con 50 \muM de ADA o de \omega3-DPA. Como se muestra en la Tabla 4, se produjo tanto \omega6-DPA como DHA cuando la cepa 334 (pSAR1) o (pRTAII) se cultivó con ADA o \omega3-DPA, que son los productos de una \Delta4-desaturación.

TABLA 4

5

Clave:

22:4(n-6) =

Ácido adrénico

22:5(n-3) =

Ácido \omega3-docosapentaenoico

22:5(n-6) =

Ácido \omega6-docosapentaenoico

22:6(n-3) =

Ácido docosahexaenoico

Cuando el porcentaje de conversión del sustrato en producto se calculó como se describe en la Tabla 5, el sustrato preferido, en virtud del mayor porcentaje de conversión, era el \omega3-DPA para producir DHA. Estos datos muestran claramente que estos plásmidos también codifican \Delta4-desaturasas.

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TABLA 5

6

Ejemplo IX Demostración de la coexpresión de una \Delta4-desaturasa con una elongasa de ratón en levaduras

Como se ha descrito en el Ejemplo V, la \Delta4-desaturasa de T. aureum (ATCC 34304) se cotransformó con la elongasa de ratón pRMELO4 (reclonada a partir del plásmido pRAE84 en pYES2).

La Tabla 6 muestra que cuando se añadieron 10 \muM del sustrato EPA (20:5n-3), la elongasa era capaz de añadir dos carbonos al EPA para producir \omega3-DPA, y la desaturasa convertía el \omega3-DPA en DHA. No se produjo DHA por la transformación de control de 334(pYX242/pYES2). Se observó una pequeña cantidad de \omega3-DPA en el control, pero era un contaminante del sustrato EPA añadido. Por lo tanto, la \Delta4-desaturasa de T. aureum era capaz de producir un producto en un sistema de expresión heterólogo que era el producto de otra enzima heteróloga (la elongasa de ratón) de la ruta biosintética de los AGP para producir el AGP esperado. Esto demuestra que la \Delta4-desaturasa puede trabajar de hecho con otras enzimas heterólogas en la ruta de los AGP, en un sistema de expresión heterólogo tal como una levadura.

TABLA 6

7

Ejemplo IX Aislamiento de un nuevo gen de desaturasa a partir del alga Isochrysis galbana (CCMP1323)

La composición de ácidos grasos del alga Isochyrisis galbana (I. galbana) (CCMP 1323) se investigó para determinar los ácidos grasos poliinsaturados (AGP) producidos por este organismo. Este alga demostraba una cantidad importante de AGP de cadena larga que incluían ácido omega-3-docosapentaenoico (omega-3-DPA, 22:5n-3) y ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3). De hecho, el DHA está presente en la mayor cantidad que representaba el 19% del lípido total. Por lo tanto, se predijo que I. galbana poseía una \Delta4-desaturasa capaz de convertir el omega-3-DPA en DHA. Por lo tanto, el objetivo era aislar el gen de la \Delta4-desaturasa predicha de I. galbana y verificar la funcionalidad de la enzima por expresión en un hospedador alternativo.

Se obtuvieron sedimentos congelados de I. galbana del Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (CCMP, West Boothbay Harbor, ME). Estos sedimentos se trituraron en nitrógeno líquido y se extrajo el ARN total de I. galbana usando el Qiagen RNeasy Maxi Kit (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. A partir de este ARN total, se aisló el ARNm usando resina de oligo dT celulosa que después se usó para la construcción de una genoteca de ADNc usando el kit de construcción de genotecas pBluescript II XR (Stratagene, La Jolla, CA). El ADNc producido de este modo se clonó direccionalmente (5' NotI/3' EcoRI) en el vector pBluescript II KS(+). La genoteca de I. galbana contenía aproximadamente 9,4 x 10^{4} clones por \mul, cada uno con un tamaño de inserto medio de aproximadamente 1300 pb. Se secuenciaron doscientos clones primarios de esta genoteca a partir del extremo 5' usando el cebador directo M13 (SEC ID Nº: 47) (5'-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG-3'). La secuenciación se llevó a cabo usando el kit de secuenciación ABI BigDye (Applied Biosystems, CA) y el secuenciador de ADN MegaBase Capillary (Amersham biosciences, Piscataway, NJ).

Se obtuvo un clon de 647 pb que contenía el extremo 3' de esta nueva \Delta4-desaturasa denominada "iso25-A09" a partir de la secuenciación de los 2000 clones de la genoteca. Este fragmento compartía una identidad de secuencia de aminoácidos de \sim30% con otras delta-5 y delta-6-desaturasas conocidas. Puesto que este fragmento no contenía el codón de terminación del gen, se obtuvieron clones adicionales que contenían el extremo 3' de este gen mediante amplificación por PCR de la genoteca de ADNc (molde) usando el cebador del vector del extremo 3' RO899 (SEC ID Nº: 11) y RO127 (SEC ID Nº: 48) (5'-CAC CTG GCT CGA GTC GAC GAT GAT GG -3'). Se llevó a cabo una amplificación por PCR usando la ADN polimerasa Platinum Taq (HF) (Invitrogen, Carlsbad, CA). La amplificación se llevó a cabo en un volumen total de 50 \mul que contenía: 1 \mul de la mezcla de ligación de la genoteca de ADNc, tampón de PCR que contenía Tris-CI 20 mM a pH 8,4, KCI 50 mM (concentración final), 200 \muM de cada desoxirribonucleótido trisfosfato, 10 pmoles de cada cebador, MgSO_{4} 1,5 mM y 0,5 \mul de ADN polimerasa Platinum Taq (HF). La amplificación se llevó a cabo de la forma siguiente, usando la máquina Perkin Elmer 9600: fusión inicial a 94ºC durante 2 minutos seguida de 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos, 10 ciclos de 94ºC 30 segundos, 70ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos y 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos, seguido de una extensión de 72ºC durante 10 minutos. A partir de esta amplificación no fueron visibles bandas, lo que podía deberse a las bajas cantidades de este gen en la genoteca. Por lo tanto, se usaron 2 \mul de esta reacción de PCR como molde para una segunda reacción de PCR que implicaba una ADNc polimerasa Platinum Taq (HF) bajo los mismos componentes de PCR que se han descrito anteriormente. Sin embargo, esta vez la amplificación se llevó a cabo de la forma siguiente: una desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos, seguida de 30 ciclos de lo siguiente: 94ºC durante 45 s, 55ºC durante 30 s, 68ºC durante 2 min. La reacción se terminó a 4ºC. Se obtuvo de este modo una banda de PCR de 670 pb que se purificó en gel y se clonó en un vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los plásmidos recombinantes se usaron para transformar células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los clones se secuenciaron y se analizaron. Se obtuvieron de este modo los clones "iso25-A09-6" e "iso25-A09-1", que contenían el extremo 3' del gen junto con el codón de terminación "TAA" y la cola poli A. Este clon se solapaba con el fragmento "iso25-A09" original.

Para aislar el extremo 5' de este gen, se usó ADNc listo para RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) como una diana para las reacciones. Para preparar este material, se usaron aproximadamente 5 \mug del ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el kit GeneRacer^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la enzima Superscript II^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la transcripción inversa, para producir ADNc diana. Después, este ADNc se usó como molde para una reacción de PCR que implicaba 30 pmoles de cebador 5' de GeneRacer^{TM} (SEC ID Nº: 30) (5'-CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA-3') en combinación con 10 pmoles de uno cualquiera de los siguientes cebadores específicos de gen:

RO1286 (SEC ID Nº: 49)

5'-CGT ACC CGG TGC AAT AGA AGG TGA G-3'

RO1287 (SEC ID Nº: 50)

5'-CCA TCA TCG TCG ACT CGA GCC AGG TG-3'

RO1288 (SEC ID Nº: 51)

5'-TGT GGA GCC ATG TGG TGC TCG ATC TG-3'

Se llevó a cabo una amplificación por PCR usando la ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un volumen total de 50 \mul que contenía: 1 \mul del ADNc de RACE, tampón de PCR que contenía Tris-Cl 20 mM a pH 8,4, KCI 50 mM (concentración final), 200 \muM de cada desoxirribonucleótido trifosfato, MgSO_{4} 1,5 mM y 0,5 \mul de ADN polimerasa Platinum Taq. La amplificación se llevó a cabo de la forma siguiente, usando la máquina Perkin Elmer 9600: fusión inicial a 94ºC durante 2 minutos seguida de 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos, 10 ciclos de 94ºC 30 segundos, 70ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos y 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos, seguidos de una extensión de 72ºC durante 10 minutos. Todas estas combinaciones de cebadores dieron como resultado bandas que se purificaron en gel, se rellenaron con ADN polimerasa T4, se clonaron en un vector PCR-blunt y se usaron para transformar células supercompetentes TOP10. La secuenciación de estos clones como "iso25-A09-33-5", "iso25-A09-31-3", "iso25-A09-30-1" e "iso25-A09-32-3" reveló que el extremo 5' de este gen contenía el sitio de inicio "ATG", el dominio del citocromo b5 y dos cajas de histidina. Estos clones se solapaban entre sí y también se solapaban con el fragmento "iso25-A09" original, que contenía la tercera caja de histidina.

Para aislar la longitud completa de este gen se usó tanto ADN genómico como el ADNc obtenido (de RACE), como moldes en reacciones de PCR con los siguientes cebadores:

RO 1400 (SEC ID Nº: 52)

5'-TCA ACA GAA TTC ATG TGC AAC GCG GCG CAG GTC GAG ACG CAG-3'

(Este cebador directo contenía un sitio EcoRI (subrayado) junto con el sitio de inicio "ATG" (en negrita) adecuado para la clonación en el vector de expresión de levaduras pYX242).

RO 1401 (SEC ID Nº: 53)

5'-AAA AGA AAG CTT TTA GTC CGC CTT GAC CGT GTC GAC CAA AGC-3'

(Este cebador inverso contenía un sitio HindIII (subrayado) junto con el sitio de terminación "TAA" (en negrita) para la clonación en pYX242). Se llevó a cabo una amplificación por PCR usando ADNc polimerasa Advantage-GC (Clonetech, Palo Alto, CA) en un volumen total de 50 \mul que contenía: 1 \mul del ADNc de RACE o 2 \mul de ADN genómico, tampón de PCR que contenía [Tricina-KOH 40 mM a pH 9,2, KOAc 15 mM (concentración final), Mg(OAc)_{2} 3,5 mM, DMSO al 5%, BSA 3,75 \mug/ml, 200 \muM de cada desoxirribonucleótido trifosfato, GC-melt 1 M y 1 \mul de ADNc polimerasa Advantage-GC. El protocolo de termociclado incluía una desnaturalización inicial a 94ºC durante 1 min, seguida de 30 ciclos de lo siguiente [desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos e hibridación a 68ºC durante 3 minutos], una extensión final a 68ºC durante 5 minutos, seguida de una terminación a 4ºC.

Se obtenía una banda de \sim1,35 kb que se purificó en gel, se digirió con las enzimas de restricción EcoRI/HindIII durante 2 horas, se limpió mediante el kit de purificación de PCR QiaQuick (Qiagen, Valencia, CA) y se clonó en el vector de expresión de levaduras pYX242 (Novagen, Madison, WI) previamente digerido con EcoRI/HindIII. Esta construcción se marcó como pRIG6 y consistía en el gen de longitud completa "iso25-A09" aislado a partir de ADNc obtenido de RACE y el vector pYX242. Esto se transformó en levaduras SC334 para estudios de expresión.

El gen de longitud completa de "iso25-A09" presente en pRIG6 era de 1302 pb de longitud (SEC ID Nº: 54) (Figura 20) y codificaba una proteína de 433 aminoácidos (SEC ID Nº: 55) (Figura 21). Una búsqueda de tFastA de la secuencia proteica deducida de este gen mostraba que la proteína tenía una identidad del 30,6% con la \Delta5-desaturasa de I. galbana (Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/054.534, incorporada en su totalidad como referencia). Además, la proteína predicha de este gen tenía una identidad del 30,8% con la \Delta4-desaturasa de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) (Figura 22). (Además, se descubrió que la secuencia de ADN del gen presentaba una identidad de secuencia del 42,37% con la secuencia de nucleótidos que codifica la \Delta4-desaturasa de T. aureum (ATCC 34304), una identidad del 43% con la secuencia de nucleótidos que codifica la \Delta4-desaturasa de S. aggregatum (ATCC 28209) y una identidad del 39,7% con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la \Delta4-desaturasa de T. aureum (BICC7091). Como todos los genes de enzimas desaturantes iniciales como la \Delta5 y la \Delta6-desaturasa, este gen contiene un dominio de citocromo b5 dentro del extremo 5' de su secuencia. Se piensa que este citocromo b5 funciona como el donador de electrones inmediato para las desaturasas y funciona en varias reacciones de oxidación-reducción que implican una desaturación dependiente de NADH. Este gen también poseía los tres motivos ricos en histidina que están presentes en todas las desaturasas unidas a membrana. Estos están presentes en las posiciones 153 a 158 (HMGGH) (SEC ID Nº: 71), 188 a 193 (HNKHH) (SEC ID Nº: 72) y 347 a 352 (QIEHH) (SEC ID Nº: 73). Se piensa que estas cajas ricas en histidina coordinan la estructura dihierro-oxo en el sitio activo de la enzima y son necesarias para la actividad enzimática. Estas características son coherentes con que este producto génico sea un miembro de la familia de desaturasas unidas a membrana/hidroxilasas de las proteínas dihierro-oxo (3) y sea también una enzima desaturante inicial. El contenido de G+C de este gen es del 64,2%.

Ejemplo X Expresión de pRIG6, una nueva desaturasa de Isochrysis galbana (CCMP 1323), en levaduras

Para determinar la especificidad de sustrato y la clase de reacción catalizada por una nueva desaturasa de I. galbana, se expresó de forma heteróloga la construcción pRIG6 en un Saccharomyces cerevisiae (SC334), como se describe a continuación. Puesto que S. cerevisiae no puede sintetizar ácidos grasos más allá del ácido oleico (OA, 18:1 n-9), es un sistema ideal para usar para determinar la actividad enzimática en sustratos más largos que el OA puesto que no se detectará actividad enzimática de fondo. En este punto, pueden suministrarse exógenamente sustratos al hospedador, captarse por la célula y afectarse por la proteína expresada del gen transformado.

El clon pRIG6, que consistía en la desaturasa "iso25-A09" de longitud completa de I. galbana clonada en pYX242 se usó para transformar Saccharomyces cerevisiae (SC334) usando el kit Alkali-Cation Yeast Transformation (BIO 101, Vista, CA). (El plásmido pRIG6 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, el 5 de abril de 2002 y se acordó el número de acceso PTA-4209.) Los transformantes se seleccionaron por auxotrofia para leucina en medios que carecían de leucina (DOB [-Leu]). Para detectar la actividad desaturasa específica de estos clones, los transformantes se cultivaron en presencia de 50 \muM los sustratos de ácidos grasos específicos, como se enumeran a continuación:

a. Ácido linoleico (LA, 18:2n-6) -la conversión en ácido \alpha-linolénico (ALA, 18:3n-3) indica actividad \Delta15-desaturasa; la conversión en ácido gamma-linolénico indica actividad \Delta6-desaturasa.

b. Ácido dihomo-gamma-linolénico (20:3n-6) -la conversión en ácido eicosatetraenoico (ETA, 20:4n-3) indica actividad \Delta17-desaturasa; la conversión en ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6) indica actividad \Delta5-desaturasa.

c. Ácido omega-6-eicosadienoico (20:2n-6) -la conversión en ácido dihomo-gamma-linolénico (20:3n-6) indica actividad \Delta8-desaturasa.

d. Ácido adrénico (22:4n-6) -la conversión en ácido \omega6-docosapentaenoico (22:5n-6) indica actividad \Delta4-desaturasa.

e. Ácido omega-3-docosapentaenoico (22:5n-3) -la conversión en ácido docosahexaenoico (22:6n-3) indica actividad \Delta4-desaturasa.

La cepa de control negativo consistía en S. cerevisiae transformadas con el vector pYX242, y estos cultivos se cultivaron simultáneamente y se analizaron.

Los cultivos se agitaron vigorosamente (250 rpm) y se cultivaron durante 48 horas a 24ºC en presencia de 50 \muM (concentración final) de diversos sustratos (Tabla 7). Las células se centrifugaron, se lavaron una vez en agua destilada y los sedimentos se agitaron vorticialmente en metanol; se añadió cloroformo junto con tridecanoína (como un patrón interno). Estas mezclas se incubaron durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o a 4ºC durante una noche. La fase de cloroformo se extrajo y se filtró a través de un filtro Whatman con 1 g de sulfato de sodio anhidro para eliminar particulados y agua residual. Los disolventes orgánicos se evaporaron a 40ºC bajo una corriente de nitrógeno. Después, los lípidos extraídos se derivatizaron a ésteres metílicos de ácidos grasos (EMAG) para el análisis mediante cromatografía de gases (GC) por adición de 2 ml de hidróxido de potasio 0,5 N en metanol en un tubo cerrado. Las muestras se calentaron a 95ºC-100ºC durante 30 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente. Se añadieron aproximadamente 2 ml de trifluoruro de boro al 14% en metanol y se repitió el calentamiento. Después de enfriarse la mezcla de lípidos extraída, se añadieron 2 ml de agua y 1 ml de hexano al extracto de EMAG para el análisis por GC. El porcentaje de conversión se calculó usando la fórmula:

300

La Tabla 7 muestra la especificidad de sustrato de la nueva desaturasa expresada en levadura. En este punto, el clon de pRIG6 expresado era capaz de convertir el 15,3% del ácido \omega3-docosapentaenoico (22:5n-3) en ácido docosahexaenoico (22:5n-3), indicando que el gen era una \Delta4-desaturasa. Además, esta enzima era capaz de convertir el 11% del ácido adrénico (22:4n-6) en ácido \omega6-docosapentaenoico (22:5n-6), que también indicaba actividad \Delta4-desaturasa.

Los ácidos grasos de interés se representan como porcentaje de los lípidos totales extraídos de levaduras. Se empleó GC/MS para identificar los productos. En estas condiciones, los clones no presentaban otras actividades desaturasas. Esto confirmaba que el gen aislado era un nuevo gen de \Delta4-desaturasa. No se detectó conversión de sustrato de fondo con el uso de sólo el vector en solitario. Estos datos indican que esta nueva \Delta4-desaturasa puede expresarse en un sistema heterólogo y, por lo tanto, sería útil en la producción de aceite transgénico que contenga DHA.

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TABLA 7

8

Clave:

\quad

LA = Ácido linolénico (18:2n-6)

\quad

GLA = Ácido gamma-linolénico (18:3n-6)

\quad

DGLA = Ácido dihomo-gamma-linolénico (20:3n-6)

\quad

M = Ácido araquidónico (20:4n-6)

\quad

\omega6-EDA = Ácido omega-6-eicosadienoico (20:2n-6)

\quad

ADA = Ácido adrénico (22:4n-6)

\quad

\omega3-DPA = Ácido omega-3-docosapentaenoico (22:5n-6)

\quad

\omega6-DPA= Ácido omega-6-docosapentaenoico (22:5n-3)

\quad

DHA= Ácido docosahexaenoico (22:6n-3)

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Composiciones nutricionales

Los AGP descritos en la Descripción detallada pueden utilizarse en diversos complementos nutricionales, formulaciones para lactantes, sustitutos nutricionales y otras soluciones nutricionales.

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I. Formulaciones para lactantes A. Fórmula de soja con hierro Isomil®

Uso: Como una bebida para lactantes, niños y adultos con una alergia o sensibilidad a la leche de vaca. Un alimento para pacientes con trastornos para los que debe evitarse la lactosa: deficiencia de lactasa, intolerancia a la lactosa y galactosemia.

Características:

- Proteína de soja aislada para evitar los síntomas de la alergia o la sensibilidad a proteínas de la leche de vaca.

- Formulación sin lactosa para evitar la diarrea asociada a la lactosa.

- Baja osmolaridad (240 mOs/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.

- Hidratos de carbono dobles (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para mejorar la absorción de hidratos de carbono y reducir el riesgo de sobrepasar la capacidad absorbente del intestino dañado.

- 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro.

- Niveles recomendados de vitaminas y minerales.

- Aceites vegetales para proporcionar niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.

- Color blanco lechoso, consistencia similar a la leche y aroma agradable. Ingredientes: (Pareve) agua al 85%, jarabe de maíz al 4,9%, azúcar (sacarosa) al 2,6%, aceite de soja al 2,1%, aislado de proteína de soja al 1,9%, aceite de coco al 1,4%, citrato de calcio al 0,15%, fosfato de calcio tribásico al 0,11%, citrato de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, monoglicéridos y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro de magnesio, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenito de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

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B. Fórmula de soja para diarrea Isomil® DF

Uso: Como una alimentación a corto plazo para el tratamiento dietético de la diarrea en lactantes y niños pequeños.

Características:

- Primera fórmula para lactantes que contiene fibra dietética añadida a partir de fibra de soja específicamente para el tratamiento de la diarrea.

- Se ha demostrado clínicamente que reduce la duración de las heces líquidas y sueltas durante la diarrea de leve a grave en lactantes.

- Nutricionalmente completa para satisfacer las necesidades nutricionales de los lactantes.

- Aislado de proteína de soja con L-metionina añadida satisface o supera los requerimientos de lactantes de todos los aminoácidos esenciales.

- Formulación sin lactosa para evitar la diarrea asociada a la lactosa.

- Baja osmolaridad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.

- Hidratos de carbono dobles (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para mejorar la absorción de hidratos de carbono y reducir el riesgo de sobrepasar la capacidad absorbente del intestino dañado.

- Satisface o excede los niveles recomendados de vitaminas y minerales por el Committee on Nutrition of the American Academy of Pediatrics y requeridos por el Infant Formula Act.

- 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro.

- Aceites vegetales para proporcionar niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.

Ingredientes: (Pareve) agua al 86%, jarabe de maíz al 4,8%, azúcar (sacarosa) al 2,5%, aceite de soja al 2,1%, aislado de proteína de soja al 2,0%, aceite de coco al 1,4%, fibra de soja al 0,77%, citrato de calcio al 0,12%, fosfato de calcio tribásico al 0,11%, citrato de potasio al 0,10%, cloruro de potasio, fosfato de potasio monobásico, monoglicéridos y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, cloruro de magnesio, ácido ascórbico, L-metionina, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenito de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

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C. Fórmula de soja sin sacarosa con hierro Isomil® SF

Uso: Como una bebida para lactantes, niños y adultos con una alergia o sensibilidad a proteínas de la leche de vaca o una intolerancia a la sacarosa. Una alimentación para pacientes con trastornos para los que deba evitarse la lactosa y la sacarosa.

Características:

- Aislado de proteína de soja para evitar los síntomas de la alergia o la sensibilidad a proteínas de la leche de vaca.

- Formulación sin lactosa para evitar la diarrea asociada a la lactosa (la fuente de hidratos de carbono son polímeros de glucosa Polycose®).

- Sin sacarosa para los pacientes que no pueden tolerar la sacarosa.

- Baja osmolaridad (180 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.

- 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por 100 calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro.

- Niveles recomendados de vitaminas y minerales.

- Aceites vegetales para proporcionar niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.

- Color blanco lechoso, consistencia similar a la leche y aroma agradable.

Ingredientes: (Pareve) agua al 75%, almidón de maíz hidrolizado al 11,8%, aceite de soja al 4,1%, aislado de proteína de soja al 4,1%, aceite de coco al 2,8%, almidón de maíz modificado al 1,0%, fosfato de calcio tribásico al 0,38%, citrato de potasio al 0,17%, cloruro de potasio al 0,13%, monoglicéridos y diglicéridos, lecitina de soja, cloruro de magnesio, ácido ascórbico, L-metionina, carbonato de calcio, cloruro de sodio, cloruro de colina, carragenina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenito de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

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D. Fórmula de soja con hierro lista para usar Isomil® 20, 20 cal/onza líquida (28,41 ml)

Uso: Cuando se desea un alimento de soja.

Ingredientes: (Pareve) agua al 85%, jarabe de maíz al 4,9%, azúcar (sacarosa) al 2,6%, aceite de soja al 2,1%, aislado de proteína de soja al 1,9%, aceite de coco al 1,4%, citrato de calcio al 0,15%, fosfato de calcio tribásico al 0,11%, citrato de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, monoglicéridos y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro de magnesio, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenito de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

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E. Fórmula para lactantes Similac®

Uso: Cuando se necesite una fórmula para lactantes: si la decisión se toma para interrumpir la lactancia materna antes del primer año de edad, si es necesario un suplemento para la lactación materna o como una alimentación de rutina si no se adopta la lactación materna.

Características:

- Proteína de una calidad y cantidad apropiadas para un buen crecimiento; desnaturalizada por calor, que reduce el riesgo de pérdidas sanguíneas entéricas asociadas con la leche.

- Grasa de una mezcla de aceites vegetales (doblemente homogeneizados) que proporciona ácido linoleico esencial, que se absorbe fácilmente.

- Hidratos de carbono como lactosa en una proporción similar a la de la leche humana.

- Baja carga de solutos renales para minimizar las agresiones sobre los órganos en desarrollo.

- Formas en polvo, líquido concentrado y lista para usar. Ingredientes: (-D) Agua, leche desnatada, lactosa, aceite de soja, aceite de coco, monoglicéridos y diglicéridos, lecitina de soja, ácido ascórbico, carragenina, cloruro de colina, taurina, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, niacinamida, sulfato ferroso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenito de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

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F. Fórmula para lactantes prematuros con hierro Similac® NeoCare

Uso: Para las necesidades nutricionales especiales de los lactantes prematuros después de salir del hospital. Similac NeoCare es una fórmula nutricionalmente completa desarrollada para proporcionar a los lactantes prematuros calorías, proteínas, vitaminas y minerales extra necesarios para promover que alcancen el crecimiento normal y contribuir al desarrollo.

Características:

- Reduce la necesidad de suplementación calórica y vitamínica. Más calorías (22 cal/onza líquida (28,41 ml)) que las fórmulas convencionales para este periodo (20 cal/onza líquida (28,41 ml)).

- Mezcla de grasas de alta absorción con triglicéridos de cadena media (MCToil) para ayudar a satisfacer las necesidades digestivas especiales de los lactantes prematuros.

- Mayores niveles de proteína, vitaminas y minerales por 100 calorías para prolongar el soporte nutricional iniciado en el hospital.

- Más calcio y fósforo para mejorar la mineralización de los huesos.

Ingredientes: -D Sólidos de jarabe de maíz, leche desnatada, lactosa, concentrado de proteína del suero, aceite de soja, aceite de cártamo rico en oleico, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), aceite de coco, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, carbonato de calcio, ácido ascórbico, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, cloruro de colina, palmitato de ascorbilo, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, niacinamida, tocoferoles mixtos, citrato de sodio, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, betacaroteno, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenito de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

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G. Fortificante de leche materna bajo en hierro listo para usar Similac Natural Care, 24 cal/onza líquida (28,41 ml)

Uso: Diseñado para mezclar con leche materna o para alimentar de forma alternativa con leche materna para lactantes con bajo peso al nacimiento.

Ingredientes: -D Agua, leche desnatada, almidón de maíz hidrolizado, lactosa, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), concentrado de proteína del suero, aceite de soja, aceite de coco, fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, cloruro de magnesio, citrato de sodio, ácido ascórbico, carbonato de calcio, monoglicéridos y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, cloruro de colina, m-inositol, taurina, niacinamida, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, cloruro de potasio, pantotenato de calcio, sulfato ferroso, sulfato cúprico, riboflavina, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, biotina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, vitamina D3, selenito de sodio y cianocobalamina.

Diversos AGP de esta invención pueden sustituirse y/o añadirse a las fórmulas para lactantes descritas anteriormente y a otras fórmulas para lactantes conocidas por los especialistas en la técnica.

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II. Formulaciones nutricionales A. ENSURE®

Uso: ENSURE es un alimento líquido bajo en residuos diseñado principalmente como un complemento nutricional oral para usar con o entre las comidas o en cantidades apropiadas como un sustituto de las comidas. ENSURE no contiene lactosa ni gluten y es adecuado para usar en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol. Aunque principalmente es un complemento oral, puede suministrarse mediante sonda.

Condiciones del paciente:

- Para pacientes con dietas modificadas.

- Para pacientes ancianos con riesgos nutricionales.

- Para pacientes con una pérdida de peso involuntaria.

- Para pacientes que se estén recuperando de una enfermedad o cirugía.

- Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos.

Ingredientes: -D Agua, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y sodio, aceite de cártamo rico en oleico, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de colza, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, citrato de sodio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio dibásico, aromas artificiales, cloruro sódico, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de cinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, goma gelano, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato de sodio, cloruro de cromo, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio.

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B. ENSURE® BARRAS

Uso: Las BARRAS ENSURE son complementos nutricionales completos y equilibrados para usar entre o con las comidas. Proporcionan una alternativa deliciosa rica en nutrientes a otros aperitivos. Las BARRAS ENSURE contienen menor <1 g de lactosa/barra y el sabor Chocolate Fudge Brownie no contiene gluten (el sabor Honey Graham Crunch contiene gluten).

Condiciones del paciente:

- Para pacientes que necesiten calorías, proteína, vitaminas y minerales extra.

- Especialmente útiles para personas que no ingieren suficientes calorías y nutrientes.

- Para personas que tienen la capacidad de masticar y tragar.

- No deben usarse por nadie con alergia al cacahuete o cualquier tipo de alergia a frutos secos.

Ingredientes: Honey Graham Crunch - Jarabe de maíz rico en fructosa, aislado de proteína de soja, azúcar moreno, miel, maltodextrina (maíz), arroz inflado (arroz molido, azúcar [sacarosa], sal [cloruro de sodio] y malta), salvado de avena, aceites de semilla de algodón y de soja parcialmente hidrogenados, polisacárido de soja, glicerina, concentrado de proteína del suero, polidextrosa, fructosa, caseinato de calcio, polvo de coco, aromas artificiales, aceite de colza, aceite de cártamo rico en oleico, leche en polvo desnatada, polvo de suero, lecitina de soja y aceite de maíz. Fabricado en una instalación que procese frutos secos.

Vitaminas y minerales: fosfato de calcio tribásico, fosfato de potasio dibásico, óxido de magnesio, sal (cloruro de sodio), cloruro de potasio, ácido ascórbico, ortofosfato férrico, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, óxido de cinc, pantotenato de calcio, gluconato de cobre, sulfato manganeso, riboflavina, betacaroteno, clorhidrato de piridoxina, mononitrato de tiamina, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, yoduro de potasio, selenato de sodio, molibdato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.

Proteína: Honey Graham Crunch - La fuente de proteína es una mezcla de aislado de proteína de soja y proteínas de la leche.

Aislado de proteína de soja

74%

Proteínas de la leche

26%

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Grasa: Honey Graham Crunch - La fuente de grasa es una mezcla de aceites de semilla de algodón y de soja, de colza, de cártamo rico en oleico parcialmente hidrogenados y lecitina de soja.

Aceite de semilla de algodón y de soja parcialmente hidrogenado 76%.

Aceite de colza

8%

Aceite de cártamo rico en oleico

8%

Aceite de maíz

4%

Lecitina de soja

4%

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Hidratos de carbono: Honey Graham Crunch - La fuente de hidratos de carbono es una combinación de jarabe de maíz rico en fructosa, azúcar moreno, maltodextrina, miel, arroz inflado, glicerina, polisacárido de soja y salvado de avena.

Jarabe de maíz rico en fructosa

24%

Azúcar moreno

21%

Maltodextrina

12%

Miel

11%

Arroz inflado

9%

Glicerina

9%

Polisacárido de soja

7%

Salvado de avena

7%

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C. ENSURE® HIGH PROTEIN

Uso: ENSURE HIGH PROTEIN es un alimento líquido concentrado rico en proteínas diseñado para personas que requieren calorías, proteína, vitaminas y minerales adicionales en sus dietas. Puede usarse como un complemento nutricional oral con o entre las comidas o, en cantidades apropiadas, como un sustituto de las comidas. ENSURE HIGH PROTEIN no contiene lactosa ni gluten y es adecuado para usar por personas que se estén recuperando de una cirugía general o de fracturas de cadera y en pacientes en riesgo de padecer úlceras por presión.

Condiciones del paciente:

- Para pacientes que requieren calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales, tales como pacientes que se estén recuperando de una cirugía general o de fracturas de cadera, pacientes en riesgo de padecer úlceras por presión y pacientes con dietas bajas en colesterol.

Características:

- Bajo en grasa saturada.

- Contiene 6 g de grasa total y < 5 mg de colesterol por porción.

- Sabor rico y cremoso.

- Excelente fuente de proteína, calcio y otras vitaminas y minerales esenciales.

- Para dietas bajas en colesterol.

- Sin lactosa y fácil de digerir.

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Ingredientes:

Vanilla Supreme: -D Agua, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y sodio, aceite de cártamo rico en oleico, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de colza, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, citrato de sodio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio dibásico, aromas artificiales, cloruro sódico, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de cinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, goma gelano, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato de sodio, cloruro de cromo, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.

\vskip1.000000\baselineskip

Proteína:

La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.

Caseinatos de sodio y calcio

85%

Aislado de proteína de soja

15%

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Grasa:

La fuente de grasa es una mezcla de tres aceites: de cártamo rico en oleico, de colza y de soja.

Aceite de cártamo rico en oleico

40%

Aceite de colza

30%

Aceite de soja

30%

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El nivel de grasa en ENSURE HIGH PROTEIN cumple las directrices de la Asociación Americana del Corazón (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE HIGH PROTEIN representan el 24% de las calorías totales, siendo el 2,6% de la grasa de ácidos grasos saturados y el 7,9% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de las directrices de la AHA de <30% de calorías totales de la grasa, <10% de las calorías de ácidos grasos saturados y <10% de las calorías totales de ácidos grasos poliinsaturados.

\vskip1.000000\baselineskip

Hidratos de Carbono:

ENSURE HIGH PROTEIN contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El dulzor moderado y la variedad de sabores (vanilla supreme, chocolate royal, wild berry y banana) más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en pacana, cereza, fresa, limón y naranja ayudan a evitar que el paciente se canse del sabor y contribuye a su conformidad. Vainilla y otros sabores distintos de chocolate:

Sacarosa

60%

Maltodextrina

40%

\vskip1.000000\baselineskip

Chocolate:

Sacarosa

70%

Maltodextrina

30%

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D. ENSURE® LIGHT

Uso: ENSURE LIGHT es un alimento líquido bajo en grasa diseñado para usar como un complemento nutricional oral con o entre las comidas. ENSURE LIGHT no contiene lactosa ni gluten y es adecuado para usar en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.

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Condiciones del paciente:

- Para pacientes de peso normal o con sobrepeso que necesitan una nutrición extra en un suplemento que contenga un 50% menos de grasa y un 20% menos de calorías que ENSURE.

- Para adultos sanos que no comen bien y necesitan una nutrición extra.

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Características:

- Bajo en grasas y grasas saturadas.

- Contiene 3 g de grasa total por porción y <5 mg de colesterol.

- Sabor rico y cremoso.

- Excelente fuente de calcio y otras vitaminas y minerales esenciales.

- Para dietas bajas en colesterol.

- Sin lactosa y fácil de digerir.

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Ingredientes:

French Vanilla: -D agua, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinato de calcio, aceite de cártamo rico en oleico, aceite de colza, cloruro de magnesio, citrato de sodio, citrato de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de magnesio dibásico, aromas naturales y artificiales, fosfato de calcio tribásico, gel de celulosa, cloruro de colina, lecitina de soja, carragenina, sal (cloruro de sodio), ácido ascórbico, goma de celulosa, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato de sodio, biotina, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.

Proteína:

La fuente de proteína es caseinato de calcio.

Caseinato de calcio

100%

\vskip1.000000\baselineskip

Grasa:

La fuente de grasa es una mezcla de dos aceites: de cártamo rico en oleico y de colza.

Aceite de cártamo rico en oleico

70%

Aceite de colza

30%

\vskip1.000000\baselineskip

El nivel de grasa en ENSURE LIGHT cumple las directrices de la Asociación Americana del Corazón (AHA). Los 3 gramos de grasa en ENSURE LIGHT representan el 13,5% de las calorías totales, siendo el 1,4% de la grasa de ácidos grasos saturados y el 2,6% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de las directrices de la AHA de <30% de calorías totales de la grasa, <10% de las calorías de ácidos grasos saturados y <10% de las calorías totales de ácidos grasos poliinsaturados.

\vskip1.000000\baselineskip

Hidratos de carbono:

ENSURE LIGHT contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El sabor de chocolate contiene también jarabe de maíz. El dulzor moderado y la variedad de sabores (French vanilla, chocolate supreme, strawberry swirl) más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en pacana, cereza, fresa, limón y naranja ayudan a evitar que el paciente se canse del sabor y contribuyen a su conformidad.

\vskip1.000000\baselineskip

Sabor vainilla y otros distintos de chocolate:

Sacarosa

50%

Maltodextrina

49%

\global\parskip1.000000\baselineskip

Chocolate:

Sacarosa

47,0%

Jarabe de maíz

26,5%

Maltodextrina

26,5%

\vskip1.000000\baselineskip

Vitaminas y minerales:

Una porción de 8 onzas líquidas (236,588 ml) de ENSURE LIGHT proporciona al menos el 25% de la CDR para 24 vitaminas y minerales clave.

Cafeína:

El sabor de chocolate contiene 2,1 mg de cafeína/8 onzas líquidas (236,588 ml).

\vskip1.000000\baselineskip

E. ENSURE PLUS®

Uso: ENSURE PLUS es un alimento líquido bajo en residuos y rico en calorías para usar cuando se requieren calorías y nutrientes extra pero una concentración normal de proteína. Esta diseñado principalmente como un complemento nutricional oral para usar con o entre comidas o, en cantidades apropiadas, como un sustituto de las comidas. ENSURE PLUS no contiene lactosa ni gluten. Aunque principalmente es un complemento nutricional oral, puede suministrarse mediante sonda.

Condiciones del paciente:

- Para pacientes que requieren calorías y nutrientes extras pero una concentración normal de proteína en un volumen limitado.

- Para pacientes que necesitan ganar peso o mantener un peso saludable.

\vskip1.000000\baselineskip

Características:

- Sabor rico y cremoso.

- Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales.

\vskip1.000000\baselineskip

Ingredientes:

Vainilla: -D agua, jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), aceite de maíz, caseinato de sodio y calcio, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro de magnesio, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, lecitina de soja, aromas naturales y artificiales, citrato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenina, sulfato de cinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenito de sodio, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D3.

\vskip1.000000\baselineskip

Proteína:

La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.

Caseinato de sodio y calcio

84%

Aislado de proteína de soja

16%

\vskip1.000000\baselineskip

Grasa:

La fuente de grasa es aceite de maíz.

Aceite de maíz

100%

\vskip1.000000\baselineskip

Hidratos de carbono:

ENSURE PLUS contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El dulzor moderado y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, fresa, café, mantequilla de pacana y yema) más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en pacana, cereza, fresa, limón y naranja ayudan a evitar que el paciente se canse del sabor y contribuyen a su conformidad.

\vskip1.000000\baselineskip

Los sabores de vainilla, fresa, mantequilla de pacana y café:

Jarabe de maíz

39%

Maltodextrina

38%

Sacarosa

23%

\vskip1.000000\baselineskip

Los sabores de chocolate y yema:

Jarabe de maíz

36%

Maltodextrina

34%

Sacarosa

30%

\vskip1.000000\baselineskip

Vitaminas y minerales:

Una porción de 8 onzas líquidas (236,588 ml) de ENSURE PLUS proporciona al menos el 15% de las CDR para 25 vitaminas y minerales clave.

\vskip1.000000\baselineskip

Cafeína:

El sabor de chocolate contiene 3,1 mg de cafeína/8 onzas líquidas (236,588 ml). El sabor de café contiene cantidades traza de cafeína.

\vskip1.000000\baselineskip

F. ENSURE PLUS® HN

Uso: ENSURE PLUS HN es un alimento líquido nutricionalmente completo rico en calorías y rico en nitrógeno diseñado para personas con necesidades calóricas y proteicas mayores o una tolerancia de volumen limitada. Puede usarse para una suplementación oral o para soporte nutricional total mediante sonda. ENSURE PLUS HN no contiene lactosa ni gluten.

Condiciones del paciente:

- Para pacientes con necesidades calóricas y proteicas aumentadas, tal como después de una cirugía o lesión.

- Para pacientes con una tolerancia de volumen limitada y que se llenan rápido.

\vskip1.000000\baselineskip

Características:

- Para una nutrición complementaria o total.

- Para alimentación oral o mediante sonda.

- 1,5 cal/ml.

- Rico en nitrógeno.

- Calóricamente denso.

\vskip1.000000\baselineskip

Ingredientes:

Vainilla: -D agua, maltodextrina (maíz), caseinatos de sodio y calcio, aceite de maíz, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro de magnesio, citrato de potasio, fosfato de calcio tribásico, lecitina de soja, aromas naturales y artificiales, citrato de sodio, cloruro de colina, ácido ascórbico, taurina, L-carnitina, sulfato de cinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, carragenina, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenito de sodio, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D3.

\vskip1.000000\baselineskip

G. ENSURE® EN POLVO

Uso: ENSURE EN POLVO (reconstituido con agua) es un alimento líquido bajo en residuos diseñado principalmente como un complemento nutricional oral para usar con o entre las comidas. ENSURE EN POLVO no contienen lactosa ni gluten y es adecuado para el uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.

Condiciones del paciente:

- Para pacientes con dietas modificadas.

- Para pacientes ancianos en riesgo nutricional.

- Para pacientes que se estén recuperando de una enfermedad o cirugía.

- Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos.

\vskip1.000000\baselineskip

Características:

- Práctico, fácil de mezclar.

- Bajo en grasas saturadas.

- Contiene 9 g de grasa total y <5 mg de colesterol por porción.

- Rico en vitaminas y minerales.

- Para dietas bajas en colesterol.

- Sin lactosa y fácil de digerir.

\vskip1.000000\baselineskip

Ingredientes: -D Jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), aceite de maíz, caseinatos de sodio y calcio, aislado de proteína de soja, aromas artificiales, citrato de potasio, cloruro de magnesio, citrato de sodio, fosfato de calcio tribásico, cloruro de potasio, lecitina de soja, ácido ascórbico, cloruro de colina, sulfato de cinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, clorhidrato de cloruro de tiamina, sulfato cúprico, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, molibdato de sodio, cloruro de cromo, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.

Proteína:

La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soja.

Caseinatos de sodio y calcio

84%

Aislado de proteína de soja

16%

\vskip1.000000\baselineskip

Grasa:

La fuente de grasa es aceite de maíz.

Aceite de maíz

100%

\vskip1.000000\baselineskip

Hidratos de carbono:

ENSURE EN POLVO contiene una combinación de jarabe de maíz, maltodextrina y sacarosa. El dulzor moderado de ENSURE EN POLVO, más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a evitar que el paciente se canse del sabor y contribuyen a su conformidad.

Vainilla:

Jarabe de maíz

35%

Maltodextrina

35%

Sacarosa

30%

\vskip1.000000\baselineskip

H. ENSURE® PUDDING

Uso: ENSURE PUDDING es un complemento denso en nutrientes que proporciona una nutrición equilibrada en una forma no líquida para usar con o entre las comidas. Es apropiado para dietas de consistencia modificada (por ejemplo, blandas, en puré o completamente líquidas) o para personas con problemas de deglución. ENSURE PUDDING no contiene gluten.

Condiciones del paciente:

- Para pacientes con dietas de consistencia modificada (por ejemplo, blanda, en puré o completamente líquida).

- Para pacientes con problemas de deglución.

\vskip1.000000\baselineskip

Características:

- Rico y cremoso, buen sabor.

- Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales.

- Práctico, no necesita refrigeración.

- Sin gluten.

\vskip1.000000\baselineskip

Perfil de nutrientes por 5 onzas (142 gramos): calorías 250, proteína 10,9%, grasa total 34,9%, hidratos de carbono 54,2%.

Ingredientes:

Vainilla: -D leche desnatada, agua, azúcar (sacarosa), aceite soja parcialmente hidrogenado, almidón alimentario modificado, sulfato de magnesio, estearoil lactilato de sodio, fosfato de sodio dibásico, aromas artificiales, ácido ascórbico, sulfato de cinc, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, cloruro de colina, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, FD&C Yellow #5, citrato de potasio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, FD&C Yellow #6, ácido fólico, biotina, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.

Proteína:

La fuente de proteína es leche desnatada.

Leche desnatada

100%

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Grasa:

La fuente de grasa es aceite de soja hidrogenado.

Aceite de soja hidrogenado

100%

\vskip1.000000\baselineskip

Hidratos de carbono:

ENSURE PUDDING contiene una combinación de sacarosa y almidón alimentario modificado. El dulzor moderado y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, dulce de azúcar y tapioca) ayudan a evitar el cansancio del sabor. El producto contiene 9,2 g de lactosa por porción.

\newpage

Vainilla y otros sabores distintos de chocolate:

Sacarosa

56%

Lactosa

27%

Almidón alimentario modificado

17%

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Chocolate:

Sacarosa

58%

Lactosa

26%

Almidón alimentario modificado

16%

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I. ENSURE® CON FIBRA

Uso: ENSURE CON FIBRA es un alimento líquido nutricionalmente completo que contiene fibra diseñado para personas que pueden beneficiarse de un aumento dietético de fibra y nutrientes. ENSURE CON FIBRA es adecuado para personas que no requieren una dieta baja en residuos. Puede suministrarse por vía oral o mediante sonda y puede usarse como un complemento nutricional en una dieta normal o, en cantidades apropiadas, como un sustituto de las comidas. ENSURE CON FIBRA no contiene lactosa ni gluten y es adecuado para usar en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.

Condiciones del paciente:

- Para pacientes que pueden beneficiarse de un aumento dietético de fibra y nutrientes.

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Características:

- Nueva fórmula avanzada baja en grasa saturada con mayor cantidad de vitaminas y minerales.

- Contiene 6 g de grasa total y <5 mg de colesterol por porción.

- Sabor rico y cremoso.

- Buena fuente de fibra.

- Excelente fuente de vitaminas y minerales esenciales.

- Para dietas bajas en colesterol.

- Sin lactosa ni gluten.

\vskip1.000000\baselineskip

Ingredientes:

Vainilla: -D agua; maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinatos de sodio y calcio, fibra de avena, aceite de cártamo rico en oleico, aceite de colza, aislado de proteína de soja, aceite de maíz, fibra de soja, fosfato de calcio tribásico, cloruro de magnesio, citrato de potasio, gel de celulosa, lecitina de soja, fosfato de potasio dibásico, citrato de sodio, aromas naturales y artificiales, cloruro de colina, fosfato de magnesio, ácido ascórbico, goma de celulosa, cloruro de potasio, carragenina, sulfato ferroso, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de cinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, cloruro de cromo, biotina, molibdato de sodio, yoduro de potasio, selenato de sodio, filoquinona, vitamina D3 y cianocobalamina.

Proteína:

La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico -caseína y soja.

Caseinatos de sodio y calcio

80%

Aislado de proteína de soja

20%

\vskip1.000000\baselineskip

Grasa:

La fuente de grasa es una mezcla de tres aceites: de cártamo rico en oleico, colza y maíz.

Aceite de cártamo rico en oleico

40%

Aceite de colza

40%

Aceite de maíz

20%

El nivel de grasa en ENSURE CON FIBRA cumple las directrices de la Asociación Americana del Corazón (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE CON FIBRA representan el 22% de las calorías totales, siendo el 2,01% de la grasa de ácidos grasos saturados y el 6,7% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de las directrices de la AHA de \leq30% de calorías totales de la grasa, <10% de las calorías de ácidos grasos saturados
y \leq10% de las calorías totales de ácidos grasos poliinsaturados.

Hidratos de carbono:

ENSURE CON FIBRA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El dulzor moderado y la variedad de sabores (vainilla, chocolate y mantequilla de pacana) más VARI-FLAVORS® Flavor Pacs en pacana, cereza, fresa, limón y naranja ayudan a evitar el cansancio del sabor y contribuyen a la conformidad del paciente.

Vainilla y otros sabores distintos de chocolate:

Maltodextrina

66%

Sacarosa

25%

Fibra de avena

7%

Fibra de soja

2%

\vskip1.000000\baselineskip

Chocolate:

Maltodextrina 5

5%

Sacarosa

36%

Fibra de avena

7%

Fibra de soja

2%

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Fibra:

La mezcla de fibra usada en ENSURE con fibra consiste en fibra de avena y polisacárido de soja. Esta mezcla da como resultado aproximadamente 4 gramos de fibra dietética total por lata de 8 onzas líquidas (236,588 ml). La proporción de fibra insoluble con respecto a soluble es de 95:5.

Los diversos complementos nutricionales descritos anteriormente y los conocidos por otros especialistas en la técnica pueden sustituirse y/o complementarse con los AGP producidos de acuerdo con la presente invención.

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J. Producto nutricional Oxepa^{TM}

Oxepa es un producto nutricional enteral calóricamente denso y bajo en hidratos de carbono diseñado para el tratamiento dietético de pacientes con o en riesgo de ARDS. Tiene una combinación única de ingredientes que incluye una mezcla de aceites patentada que contiene ácido eicosapentaenoico (EPA de aceite de pescado), ácido \gamma-linolénico (GLA de aceite de borraja) y niveles de antioxidantes elevados.

Distribución calórica:

La densidad calórica es elevada a 1,5 cal/ml (355 cal/8 onzas líquidas (236,588 ml)) para minimizar el volumen necesario para satisfacer las necesidades energéticas. La distribución de calorías en Oxepa se muestra en la Tabla A.

TABLA A Distribución calórica de Oxepa

10

Grasa:

- Oxepa contiene 22,2 g de grasa por porción de 8 onzas líquidas (93,7 g/l).

- La fuente de grasa es una mezcla de aceite de colza al 31,8%, triglicéridos de cadena media (TCM) al 25%, aceite de borraja al 20%, aceite de pescado al 20% y lecitina de soja al 3,2%. El perfil de ácidos grasos típico de Oxepa se muestra en la Tabla B.

- Oxepa proporciona una cantidad equilibrada de ácidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados y saturados, como se muestra en la Tabla VI.

- Los triglicéridos de cadena media (TCM) -25% de la mezcla de grasa- ayudan al vaciamiento gástrico porque se absorben por el tracto intestinal sin emulsión por los ácidos biliares.

Los diversos componentes de ácidos grasos del producto nutricional Oxepa^{TM} pueden sustituirse y/o complementarse con los AGP producidos de acuerdo con esta invención.

TABLA B Perfil típico de ácidos grasos

11

Los ácidos grasos equivalen a aproximadamente el 95% de la grasa total

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TABLA C Perfil graso de Oxepa

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12

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Hidratos de carbono:

- El contenido de hidratos de carbono es de 25,0 g por porción de 8 onzas líquidas (105,5 g/l).

- Las fuentes de hidratos de carbono son maltodextrina (un hidrato de carbono complejo) al 45% y sacarosa (un azúcar sencillo) al 55%, digiriéndose y absorbiéndose ambas fácilmente.

- El contenido rico en grasa y bajo en hidratos de carbono de Oxepa está diseñado para minimizar la producción de dióxido de carbono (CO_{2}). Niveles elevados de CO_{2} pueden complicar el destete en pacientes dependientes de ventilación. El bajo nivel de hidratos de carbono también puede ser útil para los pacientes que han desarrollado hiperglucemia inducida por estrés.

- Oxepa no contiene lactosa.

Los hidratos de carbono dietéticos, los aminoácidos de proteínas y los restos de glicerol de grasas pueden convertirse en glucosa dentro del cuerpo. Mediante este proceso, se satisfacen las necesidades de hidratos de carbono de tejidos dependientes de glucosa (tales como el sistema nervioso central y los glóbulos rojos). Sin embargo, una dieta sin hidratos de carbono puede conducir cetosis, un catabolismo excesivo de proteína tisular y pérdida de líquido y electrolitos. Estos efectos pueden evitarse mediante la ingesta diaria de 50 a 100 g de hidratos de carbono digestibles si la ingesta calórica es adecuada. El nivel de hidratos de carbono en Oxepa también suficiente para minimizar la gluconeogénesis si se cumplen las necesidades energéticas.

Proteína:

- Oxepa contiene 14,8 g de proteína por porción de 8 onzas líquidas (62,5 g/l).

- La proporción de calorías totales/nitrógeno (150:1) satisface las necesidades de pacientes estresados.

- Oxepa proporciona suficiente proteína para promover el anabolismo y el mantenimiento de la masa corporal magra sin provocar problemas respiratorios. Ingestas proteicas elevadas suponen un problema en pacientes con una insuficiencia respiratoria. Aunque la proteína tiene un efecto escaso sobre la producción de CO_{2}, una dieta rica en proteínas aumentará el funcionamiento de la ventilación.

- Las fuentes de proteína de Oxepa son caseinato de sodio al 86,8% y caseinato de calcio al 13,2%.

- El perfil de aminoácidos del sistema de proteínas en Oxepa satisface o supera el patrón para proteína de alta calidad establecido por el National Academy of Sciences.

* Oxepa no contiene gluten.

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<110> Abbott Laboratories

\hskip1cm Mukerji, Pradip

\hskip1cm Thurmond, Jennifer M.

\hskip1cm Huang, Yung-Sheng

\hskip1cm Das, Tapas

\hskip1cm Leonard, Amanda E.

\hskip1cm Pereira, Suzette L.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> GENES DE DELTA-4-DESATURASA Y USOS DE LOS MISMOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 6804.US.P1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> No asignado todavía

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 11-04-2002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 09/849.199

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 04-05-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 73

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R0834

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> b = g o c o t/u en posición 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> y = t/u o c en posición 6

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (9)...(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> y = t/u o c en posición 9

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<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)...(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> b = g o c o t/u en posición 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(18)

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<223> r = g o a en posición 18

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<221> misc_feature

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<222> (24)...(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> b = g o c o t/u en posición 24

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<221> misc_feature

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<222> (30)...(30)

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<223> y = t/u o c en posición 30

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<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)...(33)

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<223> y = t/u o c en posición 33

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<221> misc_feature

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<222> (36)...(36)

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<223> b = g o c o t/u en posición 36

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (39)...(39)

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<223> h = a o c o t/u en posición 39

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<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42)...(42)

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<223> h = a o c o t/u en posición 42

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<400> 1

\hskip1cm13

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<210> 2

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo R0835

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<221> misc_feature

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<222> (3)...(3)

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<223> h = a o c o t/u en posición 3

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<221> misc_feature

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<222> (6)...(6)

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<223> y = t/u o c en posición 6

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<221> misc_feature

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<222> (12)...(12)

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<223> y = t/u o c en posición 12

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<221> misc_feature

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<222> (27)...(27)

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<223> y = t/u o c en posición 27

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<221> misc_feature

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<222> (33)...(33)

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<223> y = t/u o c en posición 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (39)...(39)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> b = g o c o t/u en posición 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (42)...(42)

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<223> y = t/u o c en posición 42

\vskip1.000000\baselineskip

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<221> misc_feature

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<222> (45)...(45)

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<223> y = t/u o c en posición 45

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<400> 2

\hskip1cm14

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<210> 3

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador inverso R0836

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<221> misc_feature

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<222> (1)...(1)

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<223> r = g o a en posición 1

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<221> misc_feature

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<222> (4)...(4)

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<223> r = g o a en posición 4

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<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)...(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> v = a o g o c en posición 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)...(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)...(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34)...(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)...(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43)...(43)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> d = a o g o t/u en posición 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso R0838

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)...(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)...(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> y = t/u o c en posición 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_difference

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)...(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> s = g o c en posición 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)...(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)...(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> v = a o g o c en posición 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R0753

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)...(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a o g o c o t/u, desconocido u otro en posición 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)...(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)...(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a o g o c o t/u, desconocido u otro en posición 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posiciones 18-19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)...(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g o a en posición 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R0754

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)...(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> y = t/u o c en posición 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> y = t/u o c en posición 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a o g o c o t/u, desconocido u otro en posición 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)...(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> y = t/u o c en posición 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)...(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a o g o c o t/u, desconocido u otro en posición 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)...(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> y = t/u o c en posición 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R0898

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R0930

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R0973

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R0974

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R0899

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R01004

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1046

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1548

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1548

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1548

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1548

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 515

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 515

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 515

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 515

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

38

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 879

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 754

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Schizochytrium aggregatum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Schizochytrium aggregatum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador anidado 5' RO1239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador anidado 3' RO1237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1240 y cebador 5' de GeneRacer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1236 y cebador 3' de GeneRacer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador anidado RO1239 y cebador 5' anidado de GeneRacer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador anidado RO1237 y cebador 3' anidado de GeneRacer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1530

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Schizochytrium aggregatum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 509

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Schizochytrium aggregatum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R01201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador R01211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador interno RO1214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 5' R01223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 3' RO1224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1542

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 513

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo M13

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1287

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador RO1288

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador directo RO1400

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador inverso RO1401

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Isochrysis galbana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Isochrysis galbana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

76

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Motivo proteico nº 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Motivo proteico nº 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Motivo proteico nº 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dictyostelium discoideum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Dictyostelium discoideum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mortierella alpina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Synechocystis (especie desconocida)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Schizochytrium aggregatum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (335)...(335)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Desconocido u otro en posición 335

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Isochrysis galbana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 515

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thraustochytrium aureum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

92

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Motivo rico en histidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Motivo rico en histidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Motivo rico en histidina

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<400> 73

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Claims (23)

1. Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta4-desaturasa, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55.

2. Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una actividad \Delta4-desaturasa y que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 54.

3. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha secuencia codifica una \Delta4-desaturasa funcionalmente activa que utiliza un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado como sustrato.

4. La secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha secuencia procede de un organismo seleccionado del grupo constituido por un hongo y un alga.

5. La secuencia de nucleótidos de la reivindicación 4, en la que dicha secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17 y SEC ID Nº: 45 procede del hongo Thraustochytrium aureum, comprendiendo dicha secuencia la SEC ID Nº: 36 que procede del hongo Schizochytrium aggregatum y comprendiendo dicha secuencia la SEC ID Nº: 54 que procede del alga Isochrysis galbana.

6. Un polipéptido purificado que tiene actividad \Delta4-desaturasa codificado por dicha secuencia de nucleótidos de las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Un polipéptido purificado que desatura ácidos grasos poliinsaturados en el carbono 4 y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un identidad de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55.

8. Un método de producción de una \Delta4-desaturasa que comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos:

i)

que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55 o

ii)

que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36 SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 54.

b) construir un vector que comprende: i) dicha secuencia de nucleótidos aislada unida operativamente a ii) un promotor;

c) introducir dicho vector en una célula hospedadora durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de dicha \Delta4-desaturasa.

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9. Un vector que comprende:

a) una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos:

i)

que codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta4-desaturasa, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55 o

ii)

que codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta4-desaturasa que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 54, unida operativamente a

b) un promotor.

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10. Una célula hospedadora que comprende dicho vector de la reivindicación 9.

11. Una célula vegetal, planta o tejido vegetal que comprende dicho vector de la reivindicación 9, en la que la expresión de dicha secuencia de nucleótidos de dicho vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado por dicha célula vegetal, planta o tejido vegetal.

12. La célula vegetal, planta o tejido vegetal de la reivindicación 11, en la que dicho ácido graso poliinsaturado se selecciona del grupo constituido por ácido \omega6-docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.

13. Una planta transgénica que comprende dicho vector de la reivindicación 9, en la que la expresión de dicha secuencia de nucleótidos de dicho vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado en semillas de dicha planta transgénica.

14. Un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos:

i)

que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55 o

ii)

que tiene una identidad de al menos el 70% con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 54;

b) construir un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos aislada;

c) introducir dicho vector en una célula hospedadora durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de dicha \Delta4-desaturasa; y

d) exponer dicha \Delta4-desaturasa expresada a un ácido graso poliinsaturado sustrato para convertir dicho sustrato en un ácido graso poliinsaturado producto.

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15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho ácido graso poliinsaturado sustrato es ácido adrénico o ácido \omega3-docosapentaenoico y dicho ácido graso poliinsaturado producto es ácido \omega6-docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico, respectivamente.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además la etapa de exponer dicho ácido graso poliinsaturado producto a una desaturasa para convertir dicho ácido graso poliinsaturado producto en otro ácido graso poliinsaturado.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho ácido graso poliinsaturado producto es ácido \omega6-docosapentaenoico y dicho otro ácido graso poliinsaturado es ácido docosahexaenoico.

18. Un método de producción de un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de:

a) exponer un ácido graso poliinsaturado sustrato a una o más enzimas seleccionadas del grupo constituido por una desaturasa y una elongasa para convertir dicho sustrato en un ácido graso poliinsaturado producto;

b) exponer dicho ácido grado poliinsaturado producto de la etapa (a) a una \Delta4-desaturasa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 55, para convertir dicho ácido graso poliinsaturado producto en un ácido graso poliinsaturado producto final.

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19. El método de la reivindicación 18, en el que dicho ácido graso poliinsaturado sustrato se selecciona del grupo constituido por ácido linoleico, ácido \gamma-linolénico, ácido estearidónico, ácido araquidónico, ácido dihomo-\gamma-linolénico, ácido eicosatetraenoico, ácido adrénico y ácido eicosapentaenoico.

20. El método de la reivindicación 18, en el que dicho ácido graso poliinsaturado producto final se selecciona del grupo constituido por ácido \omega6-docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.

21. Una secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta4-desaturasa, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 55.

22. Una secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 2, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta4-desaturasa y que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 54.

23. Un polipéptido purificado de la reivindicación 7, que desatura ácidos grasos poliinsaturados en el carbono 4 y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 55.