ES2312192T3 - Uso de oligomeros de acidos nucleicos de poliamida para engendrar una respuesta biologica. - Google Patents
Uso de oligomeros de acidos nucleicos de poliamida para engendrar una respuesta biologica. Download PDFInfo
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Abstract
Un oligómero de ácido nucleico de poliamida sin portador en el que un PNA sin portador es un oligómero de PNA no modificado sin modificaciones adicionales, diseñado para potenciar el paso a través de membranas plasmáticas o de la barrera hematoencefálica para el uso como un medicamento, en el que dicho oligómero de ácido nucleico de poliamida es complementario a una secuencia diana.
Description
Uso de oligómeros de ácidos nucleicos de
poliamida para engendrar una respuesta biológica.
La invención se refiere a oligómeros de ácidos
nucleicos de poliamida sin portador para el uso como un medicamento
para administrar en células vivas, de tal modo que el oligómero de
ácido nucleico de poliamida engendra una respuesta biológica
especifica de secuencia.
Los ácidos nucleicos de poliamida (PNA) son
análogos de ADN que contienen enlaces neutros de amida en su
estructura. A diferencia de los oligómeros de ADN, los oligómeros
de PNA pueden unirse al ADN por desplazamiento de una cadena del
dúplex para formar una estructura de bucle D estable (Peffer y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10648-10652 (1993) y
Møllegaard y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
3892-3895 (1994)). De forma interesante, la unión
de oligómeros de PNA a ADN es independiente de la polaridad de la
cadena de ADN, permitiendo que los oligómeros de PNA se unan de una
forma tanto paralela como antiparalela (Egholm y col., Nature 365:
566-568 (1993) y Peffer y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90: 10648-10652 (1993)). Además, los
oligómeros de PNA son menos susceptibles a la degradación
enzimática (Demidov y col., Biochem. Pharmacol. 48:
1310-1313 (1994)) y se unen a ARN con una mayor
afinidad que los oligómeros de ADN análogos. En su conjunto, estas
propiedades sugieren que los oligómeros de PNA tienen un gran
potencial tanto en estrategias de antigenes como antisentido para
regular la expresión génica.
El éxito de un análogo oligonucleotídico como un
antigén o agente antisentido requiere que el oligonucleótido se
capte por las células en cantidades razonables, de tal modo que el
oligonucleótido alcance su diana en una concentración suficiente.
Sin embargo, los oligómeros de PNA tienen baja permeabilidad de
membranas de fosfolípidos (Wittung y col., FEBS Letters 365:
27-29 (1995)) y se ha descrito que apenas se captan
por células (Hanvey y col., Science 258: 1481-1485
(1992); Nielsen y col., Bioconjugate Chem. 5: 3-7
(1994); Bonham y col., Nucleic Acids Res. 23:
1197-1203 (1995); Gray y col., Biochem. Pharmacol.
48: 1465-1476 (1997)), lo que parecería limitar sus
usos potenciales en estrategias de antigenes y antisentido.
El documento WO95 04748A describe (consúltese el
resumen y el ejemplo 8) el uso médico de oligómeros de PNA para
infecciones víricas.
El documento WO96 35705 describe (consúltense
las reivindicaciones 24-26) la inhibición de la
unión de factor de transcripción por oligómeros de PNA.
Norton J C y col, Bio/Technology, Vol. 14
describe (consúltese el resumen y la Tabla 1) la inhibición de la
telomerasa por oligómeros de PNA en células permeabilizadas.
Knudsen H. y col., Rapid Communications, Oxford,
GB, Vol. 8, páginas 113-118 describe (consúltese el
resumen) la aplicación de oligómeros de PNA en la terapia del
cáncer.
Mardirossian y col., J. Nucl. Med., Vol. 38,
páginas 907-913 describe (consúltese el resumen, la
página 907 columna 2 párrafo 4) la hibridación in vivo de
oligómeros de PNA derivatizados.
Taylor y col., Nature Genetics, Vol. 15, páginas
212-215 describe (consúltese la Figura 4) la
captación de oligómero de PNA marcado con biotina en mioblastos
humanos dando como resultado la inhibición de la replicación de ADN
mitocondrial humano mutante.
Estrategias recientes concebidas para mejorar la
captación celular de oligómeros de PNA implican conjugar otras
moléculas con secuencias de PNA. En concreto, la conjugación de una
pequeña secuencia peptídica que se une al receptor del factor de
crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1R) con un oligómero de PNA
aumenta la captación celular de secuencias de PNA marcadas por
células que expresan IGF1R, mientras que las condiciones que usan
secuencias de PNA sin conjugar o células que carecen de IGF1R
muestran una captación celular insignificante (Basu S. y Wickstrom
E., Bioconjugate Chem. 8: 481-488 (1997)). Estos
resultados sugieren que la conjugación de moléculas de ligandos de
receptores con oligómeros de PNA puede aumentar la captación
celular; sin embargo, todavía se desconoce la capacidad de estos
oligómeros de PNA conjugados con ligandos de receptores para influir
en la actividad biológica una vez en el interior de las células
diana. Además, los oligómeros de PNA conseguirán entrar sólo en las
células que expresen ese receptor dirigido particular. Por lo tanto,
deberá diseñarse y acoplarse con oligómeros de PNA una molécula de
ligando apropiada para cada tipo celular de interés. Además, el
nivel de expresión del receptor puede influir en la permeabilidad de
los oligómeros de PNA conjugados con ligando.
El uso de oligómeros de PNA para manipular la
expresión de proteínas en el cerebro, una estrategia que
contribuiría enormemente al entendimiento de la función cerebral
así como de enfermedades neurológicas, tiene un problema adicional.
La pared endotelial de los capilares tanto del cerebro como de la
médula espinal genera una barrera (barrera hematoencefálica; BHE)
que evita la captación de moléculas en estos órganos. Aunque
sistemas de transporte especializados funcionan en el interior de
la BHE para permitir que la atraviesen determinadas moléculas
circulantes, muchos agentes farmacéuticos no son reconocidos y, por
lo tanto, tienen una escasa permeabilidad de la BHE. Esto parece
ser cierto para moléculas de PNA, puesto que se describe que el
transporte de PNA a través de la BHE es insignificante (Pardridge y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5592-5596
(1995)). Por lo tanto, los oligómeros de PNA que se dirigen a
proteínas cerebrales administrados fuera del sistema nervioso
central necesitan atravesar dos barreras, la BHE y la membrana
plasmática de células individuales en el interior del cerebro,
mientras que los oligómeros de PNA administrados directamente en el
cerebro necesitan atravesar sólo una barrera, la membrana
plasmática de células individuales.
Diversas estrategias de administración de
fármacos pueden salvar el problema de la permeabilidad de la BHE
(Pardridge, Pharmacol. Toxicol. 71: 3-10 (1992);
Pardridge, Trends Biotechnol. 12: 239-245 (1994)).
Por ejemplo, las moléculas de PNA pueden experimentar el transporte
a través de la BHE cuando el extremo amino terminal está
biotinilado y unido a un anticuerpo monoclonal conjugado con
estreptavidina específico para el receptor de la transferrina
(OX26-SA; Pardridge y col., Proc. Natl. Acad Sci.
USA 92: 5592-5596 (1995)). El anticuerpo
OX26-SA suministra las moléculas unidas al cerebro,
presumiblemente mediante endocitosis mediada por receptor, dadas
las elevadas concentraciones del receptor de la transferrina que se
localizan en la BHE. Estos estudios sugieren que las estrategias de
conjugación con anticuerpos proporcionan un mecanismo para que los
oligómeros de PNA atraviesen la BHE. Sin embargo, no existen datos
sobre si los PNA biotinilados unidos a OX26-SA
realmente entran en las células o no. Además, la utilidad de los
procedimientos de administración de PNA que dependen de la
conjugación de otras moléculas con oligómeros de PNA todavía no está
clara, puesto que estas otras moléculas pueden influir en la
funcionalidad deseada de los PNA particulares.
La presente invención se refiere a oligómeros de
PNA que influyen en la actividad biológica de una forma específica
de secuencia. En concreto, esta invención se refiere al
descubrimiento de que oligómeros de PNA sin portador administrados
extracelularmente atraviesan barreras biológicas y provocan una
respuesta biológica específica de secuencia en células vivas. Este
descubrimiento está en oposición directa al actual entendimiento de
las propiedades físicas de los oligómeros de PNA y tiene
implicaciones de gran alcance tanto para los fines de la terapia
génica como de la investigación. Además, administrar
extracelularmente oligómeros de PNA a células vivas evita la
necesidad de microinyectar oligómeros de PNA directamente en
células, así como la necesidad de permeabilizar las células.
Además, esta invención proporciona usos para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de células in vivo, de tal
modo que se observe una respuesta conductual en un organismo. Por
lo tanto, esta invención describe usos y materiales que permiten que
se manipule y estudie cualquier polipéptido en células vivas. Por
ejemplo, la expresión de un polipéptido específico puede anularse en
organismo adultos durante la duración del tratamiento con
oligómeros de PNA. Además de contribuir enormemente al avance de la
investigación científica básica, esta capacidad de manipular la
expresión de polipéptidos de una forma específica de secuencia es
claramente beneficiosa para las estrategias de terapia génica que
implica el tratamiento del cáncer, enfermedades conductuales,
infecciones y enfermedades autoinmunes.
Además, esta invención se refiere a los
siguientes dos descubrimientos: 1) los oligómeros de PNA antisentido
que se van administrar a un animal atraviesan barreras biológicas y
modulan la traducción de una forma específica de secuencia y 2) los
oligómeros de PNA con sentido que se van administrar a un animal
atraviesan barreras biológicas y modulan la transcripción de una
forma específica de secuencia. Por lo tanto, esta invención
proporciona dos usos potentes para manipular la expresión de
polipéptidos de una forma específica de secuencia. Claramente, el
tener la capacidad de modular dos etapas diferentes implicadas en la
síntesis de polipéptidos fomentará el avance de la investigación
científica básica y proporcionará procedimientos útiles para el
tratamiento de enfermedades. La expresión "oligómero de PNA
antisentido" se refiere a cualquier oligómero de PNA que tiene
especificidad de secuencia por una molécula de ARN que se encuentra
en el interior de una célula. La expresión "oligómero de PNA con
sentido" se refiere a cualquier oligómero de PNA que tiene
especificidad de secuencia por una región de ácido nucleico que
puede usarse como la cadena molde durante la transcripción,
incluyendo la transcripción inversa.
Esta invención también se refiere al
descubrimiento de que un oligómero de PNA con emparejamientos
erróneos atraviesa barreras biológicas y engendra una respuesta
biológica en un grado menor que la engendrada por un oligómero de
PNA que se dirige a la misma secuencia pero no que no tiene, por
ejemplo, emparejamiento erróneos de pares de bases. En otras
palabras, esta invención se refiere al descubrimiento de que el
grado en el que se engendra una respuesta biológica puede modularse
cambiando la secuencia de un oligómero de PNA particular para
introducir emparejamientos erróneos de pares de bases con una
secuencia diana. El tener la capacidad de modificar el grado de una
respuesta biológica engendrada proporciona un mecanismo útil para
obtener un efecto deseado particular. La expresión "oligómero de
PNA con emparejamientos erróneos" se refiere a cualquier
oligómero de PNA que tiene una secuencia que contiene al menos un
emparejamiento erróneo de pares de bases con respecto a una
secuencia diana. La expresión "secuencia diana" se refiere a
cualquier secuencia de purina/pirimidina con la que otra secuencia
de purina/pirimidina (por ejemplo, oligómero de PNA, ARN o ADN)
presenta especificidad de secuencia.
Además, se describe el descubrimiento de que
pueden detectarse oligómeros de PNA en una muestra biológica
recogida de un animal. En concreto, puede determinarse la presencia
y cantidad de un oligómero de PNA por adición de una sonda
específica de secuencia a una muestra biológica y examen de esa
muestra para determinar la presencia del complejo sonda/oligómero
de PNA. El complejo sonda/oligómero proporciona un indicio de la
presencia del oligómero de PNA. La detección de oligómeros de PNA en
una muestra biológica tal como sangre proporciona un procedimiento
útil para controlar la presencia y concentración de un oligómero de
PNA particular durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, la
cuantificación de la concentración de un oligómero de PNA
particular en sangre o tejido de un paciente puede permitir a los
médicos ajustar la cantidad de oligómero de PNA administrada al
paciente, de tal modo que se consiga o se mantenga la concentración
y la respuesta biológica deseada.
En general, la invención se refiere a usos para
la fabricación de un medicamento. Los usos implican un oligómero de
PNA sin portador para administrarse extracelularmente en condiciones
tales que el oligómero de PNA engendre una respuesta biológica de
una forma específica de secuencia. La célula viva puede ser una
célula del sistema nervioso o una célula gastrointestinal. El
oligómero de PNA carece de portador y puede administrarse in
vivo a un animal que contiene la célula viva. Cuando se
administra a un animal, la administración puede ser una
administración extracraneal (por ejemplo, intraperitoneal,
intravenosa y oral) o intracraneal. El oligómero de PNA es capaz de
atravesar barreras biológicas tales como la membrana plasmática de
una célula y la barrera hematoencefálica de un organismo vivo.
Típicamente, el oligómero de PNA tiene especificidad de secuencia
por una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido o
regula la expresión de un polipéptido. El polipéptido puede
expresarse intracranealmente o extracranealmente en un organismo
vivo. El polipéptido puede incluir transportadores, así como los
polipéptidos que participan en la señalización celular (por ejemplo,
receptores). Los polipéptidos de señalización celular incluyen
polipéptidos que participan en la señalización opiode. Los
polipéptidos de señalización opiode incluyen receptores opiodes, por
ejemplo, receptores de morfina y neurotensina. Los polipéptidos
transportadores pueden ser transportadores de serotonina. Los
polipéptidos expresados extracranealmente incluyen polipéptidos
expresados fuera del cerebro y del cráneo, por ejemplo, en el
tracto gastrointestinal. Los oligómeros de PNA específicos pueden
incluir oligómeros que tienen secuencias tales como las que se
exponen en las SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 13. El oligómero de PNA puede
tener especificidad de secuencia por una secuencia diana en el
interior de la célula viva, al tiempo que posee al menos un
emparejamiento erróneo de pares de bases con la secuencia diana.
Dicho oligómero de PNA puede tener una secuencia como se expone en
la SEC ID Nº: 12. La respuesta biológica engendrada por la
administración extracelular de un oligómero de PNA puede ser una
modificación, por ejemplo, una reducción de la expresión
polipeptídica. Las respuestas biológicas también pueden
caracterizarse por un cambio fisiológico en un animal.
Además, la respuesta biológica puede ser una
modificación, por ejemplo, una reducción de la transcripción. En
este caso, el oligómero de PNA tiene típicamente especificidad de
secuencia por al menos una porción de una cadena codificante de ADN
en el interior de la célula. Esa porción de una cadena codificante
de ADN puede regular, o puede ser un molde para, la síntesis de una
molécula de ARN (por ejemplo, ARNm). Los oligómeros de PNA
específicos pueden incluir oligómeros que tienen secuencias tales
como las expuestas en las SEC ID Nº: 13 y 14. La modulación de la
transcripción puede reducir la expresión de un polipéptido en el
interior del animal y/o causar un cambio fisiológico en el animal.
Además, los procedimientos pueden implicar administrar un segundo
oligómero de PNA al animal en condiciones tales que el segundo
oligómero de PNA entre en al menos una célula dentro del animal y
module la traducción de una forma específica de secuencia.
Se entenderá que cada una de las características
adicionales de la invención descritas anteriormente pueden
aplicarse a los siguientes aspectos y realizaciones adicionales de
la invención. Por ejemplo, los artículos de fabricación que
combinan material de envasado y un oligómero de PNA y el uso de un
oligómero de PNA en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad animal pueden utilizar un oligómero
de PNA sin portador o un oligómero de PNA que tenga especificidad de
secuencia por una secuencia de ácido nucleico que codifique un
polipéptido o regule la expresión de un polipéptido, y así
sucesivamente.
Se describen procedimientos para identificar un
oligómero de PNA con emparejamientos erróneos que engendre una
respuesta biológica modulada en un sujeto animal que tenga una
secuencia diana. Es una respuesta biológica modulada en comparación
con una respuesta biológica engendrada por un oligómero de PNA de
referencia. Los procedimientos incluyen obtener información de
referencia acerca de la respuesta biológica engendrada por el
oligómero de PNA de referencia administrado a un animal de
referencia que tiene la secuencia diana. Este oligómero de PNA de
referencia tiene especificidad de secuencia por la secuencia diana.
Los procedimientos también incluyen determinar información de
ensayo acerca de la respuesta biológica engendrada por un oligómero
de PNA de ensayo administrado al animal sujeto. Los oligómeros de
PNA de referencia y de ensayo tienen diferentes secuencias y el
oligómero de PNA de ensayo tiene especificidad de secuencia por la
secuencia diana, al tiempo que posee al menos un emparejamiento
erróneo de pares de bases con esa secuencia diana. Además, los
procedimientos incluyen identificar el oligómero de PNA de ensayo
como un PNA con emparejamientos erróneos si el PNA de ensayo
engendra la respuesta
modulada.
modulada.
Se describen kits para tratar a un animal que
contiene una célula que tiene una secuencia diana. Los kits
contienen una pluralidad de oligómeros de PNA, teniendo cada
oligómero de PNA especificidad de secuencia por la secuencia diana,
al tiempo que poseen una secuencia diferente de la secuencia de los
otros oligómeros de PNA. Uno de los oligómeros de PNA puede tener
una secuencia completamente complementaria con la secuencia diana.
Al menos uno de los oligómeros de PNA puede tener una secuencia que
tenga al menos un emparejamiento erróneo de pares de bases con la
secuencia diana. La pluralidad de oligómeros de PNA puede ser una
serie de oligómeros de PNA que tengan grados gradualmente
crecientes de emparejamientos erróneos de pares de bases con la
secuencia diana.
Otro aspecto de la invención presenta el uso de
un oligómero de ácido nucleico de poliamida sin portador para la
fabricación de un medicamento, en el que dicho oligómero de
poliamida es complementario a una secuencia diana. Los
procedimientos pueden incluir seleccionar un primer oligómero de PNA
a partir de un kit. El kit puede contener una pluralidad de
oligómeros de PNA, teniendo cada oligómero de PNA especificidad de
secuencia por la secuencia diana, al tiempo que poseen una
secuencia diferente de la secuencia de los otros oligómeros de PNA.
Los procedimientos también pueden incluir administrar el primer
oligómero de PNA seleccionado al animal en condiciones tales que el
primer oligómero de PNA seleccionado entre en la célula y engendre
una respuesta biológica de una forma específica de secuencia. Los
procedimientos pueden incluir además seleccionar un segundo
oligómero de PNA a partir del kit y administrar ese segundo
oligómero de PNA seleccionado al animal en condiciones tales que el
segundo oligómero de PNA seleccionado entre en una célula en el
animal y engendre la respuesta biológica en un grado modulado en
comparación con la respuesta engendrada por el primer oligómero de
PNA seleccionado.
Se describen procedimientos para detectar un
oligómero de PNA en una muestra biológica recogida de un animal.
Los procedimientos incluyen proporcionar un oligonucleótido a la
muestra. El oligonucleótido tiene especificidad de secuencia por el
oligómero de PNA. Los procedimientos también incluyen examinar la
muestra para determinar la presencia o ausencia de un complejo de
oligonucleótido/oligómero de PNA. El complejo de
oligonucleótido/oligómero proporciona un indicio de la presencia
del oligómero de PNA. La muestra biológica puede ser una muestra de
tejido (por ejemplo, tejido de cerebro, hígado, riñón y corazón) o
una muestra de sangre. El oligonucleótido puede ser un
oligonucleótido marcado (por ejemplo, marcado radiactivamente). La
etapa de examen puede incluir separar el oligonucleótido de
cualquiera de los complejos de oligonucleótido/oligómero de PNA. La
separación puede ser una separación electroforética.
Se describen procedimientos de exploración de
oligómeros de PNA por la capacidad para engendrar una respuesta
biológica específica de secuencia. Los procedimientos implican
administrar extracelularmente oligómeros de PNA a células vivas e
identificar oligómeros de PNA específicos que engendren una
respuesta biológica específica de secuencia en las células.
Se describen procedimientos de identificación de
función polipeptídica. Los procedimientos implican administrar
extracelularmente oligómeros de PNA a células vivas, de tal modo que
los oligómeros de PNA alteren la expresión del polipéptido de una
forma específica de secuencia y examinar esas células para una
actividad que esté influenciada por el oligómero de PNA específico.
Los oligómeros de PNA pueden administrarse in vivo a un
animal, tal como un mamífero murino. La alteración puede ser una
reducción en la expresión del polipéptido.
Se describen procedimientos de medición de la
tasa de renovación relativa de polipéptidos funcionales que tienen
una actividad definida. Los procedimientos implican administrar
extracelularmente oligómeros de PNA a células vivas, de tal modo
que los oligómeros de PNA influyan en la actividad definida y
determinar el tiempo después de la administración del oligómero de
PNA en el que la actividad definida está máximamente influenciada.
Además, puede determinarse el tiempo desde que la actividad definida
está máximamente influenciada hasta que la actividad vuelve a ser
normal.
Se describe un artículo de fabricación que
combina material de envasado y un oligómero de PNA. El material de
envasado incluye una etiqueta o prospecto que indica que el
oligómero de PNA puede administrarse extracelularmente a una célula
viva con el fin de engendrar una respuesta biológica de una forma
específica de secuencia. Por ejemplo, la etiqueta o prospecto puede
indicar que el oligómero de PNA puede usarse en medicina (por
ejemplo, para tratar enfermedades en un animal, incluyendo un ser
humano).
Se describe un artículo de fabricación que
combina material de envasado y un oligonucleótido. El material de
envasado incluye una etiqueta o prospecto que indica que el
oligonucleótido puede detectar un oligómero de PNA en una muestra
biológica recogida de un animal. El oligonucleótido tiene
especificidad de secuencia por el oligómero.
Otro aspecto de la invención presenta un
oligómero de PNA sin portador para el uso en medicina.
Otro aspecto de la invención presenta el uso de
un oligómero de PNA sin portador en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de una enfermedad animal. El oligómero engendra
una respuesta biológica de una forma específica de secuencia tras
la administración del medicamento a un animal.
A menos que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen
el mismo significado que se entienden comúnmente por un
especialista en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque
pueden usarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a
los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la
presente invención, se describen a continuación procedimientos y
materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de
patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente
memoria se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de
conflicto, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las
definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos sólo
son ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Serán evidentes otras características y ventajas
de la invención a partir de la siguiente descripción detallada y de
las reivindicaciones.
La Figura 1 es un gráfico que representa el
efecto máximo posible y la temperatura corporal como porcentaje de
la respuesta basal para ratas tratadas intracranealmente los días
-4, -2 y 0 con oligómeros de NTR1-PNA y expuestas a
neurotensina (NT).
La Figura 2 es un gráfico de barras que
representa el efecto máximo posible y la temperatura corporal como
porcentaje de la respuesta basal para ratas que reciben los
tratamientos de oligómero de PNA indicados intracranealmente los
días -4, -2 y 0 y expuestas a NT o morfina (MOR) los días
indicados.
La Figura 3 es un gráfico que representa el
efecto máximo posible y la temperatura corporal como un porcentaje
de la respuesta basal para ratas tratadas extracranealmente el día 0
con oligómeros de NTR1-PNA y expuestas a NT.
La Figura 4 es un gráfico de barras que
representa el efecto máximo posible y la temperatura corporal como
un porcentaje de la respuesta basal para ratas que reciben un
oligómero de NTR1-PNA o tratamiento con solución
salina extracranealmente el día 0 y expuestas a NT el día 1.
La Figura 5 es un gráfico que representa el
efecto máximo posible como un porcentaje de la respuesta basal para
ratas tratadas intracranealmente los días -4, -2 y 0 con oligómeros
de MU1R-PNA y expuestas a MOR.
La Figura 6 es un gráfico de barras que
representa el efecto máximo posible y la temperatura corporal como
un porcentaje de la respuesta basal para ratas que reciben los
tratamientos con oligómero de PNA indicados intracranealmente los
días -4, -2 y 0 y expuestas a NT o MOR los días indicados.
La Figura 7 es un gráfico que representa el
efecto máximo posible como un porcentaje de la respuesta basal para
ratas tratadas extracranealmente el día 0 con oligómeros de
MU1R-PNA y expuestas a MOR.
La Figura 8 es un gráfico de barras que
representa el efecto máximo posible como un porcentaje de la
respuesta basal para ratas que reciben oligómero de
MU1R-PNA o tratamiento con solución salina
extracranealmente el día 0 y expuestas a MOR el día 1.
La Figura 9 es un gráfico que representa el
efecto máximo posible y la temperatura corporal como un porcentaje
de la respuesta basal para ratas tratadas intracranealmente los días
-4, -2 y 0 con los oligómeros de PNA indicados y expuestas a NT o
MOR.
La Figura 10 es un gráfico que representa la
actividad como un porcentaje de las medidas basales para ratas
tratadas extracranealmente con oligómeros de
SERT-PNA y expuestas a tranilcipromina (TCP) 48
horas después.
La Figura 11 es un gráfico que representa el
efecto máximo posible y la temperatura corporal como un porcentaje
de la respuesta basal para ratas que reciben una sola administración
oral de oligómeros de NTR1-PNA y expuestas a NT en
los tiempos indicados.
La Figura 12 representa las estructuras de
monómeros de PNA con grupos protectores.
La Figura 13 es un diagrama que representa el
recipiente de reacción sinterizado usado para sintetizar manualmente
oligómeros de PNA.
La Figura 14 es un gráfico de barras que
representa el efecto máximo posible como un porcentaje de la
respuesta basal para ratas que reciben solución salina, oligómero
de AS-NTR1-PNA,
NTR1-PNA con sentido,
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos o MU1R-PNA el día 0 y expuestas a NT o MOR
el día 1. La descripción antes de la barra ("/") en la parte
inferior de cada barra indica el tratamiento previo, mientras que el
fármaco enumerado después de la barra indica el fármaco usado para
el ensayo. El * representa P < 0,001 frente a NT sola y t
representa P = 0,002 frente a NT sola.
La Figura 15 es un gráfico de barras que
representa el cambio de la temperatura corporal como un porcentaje
de la respuesta basal para ratas que reciben solución salina,
oligómero de AS-NTR1-PNA,
NTR1-PNA con sentido,
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos o MU1R-PNA el día 0 y expuestas a NT el día
1. La descripción antes de la barra ("/") en la parte inferior
de cada barra indica el tratamiento previo, mientras que el fármaco
enumerado después de la barra indica el fármaco usado para el
ensayo. El * representa P < 0,001 frente a NT sola y \ding{61}
representa P = 0,008 frente a NT sola.
La Figura 16 es un gráfico que representa el
efecto máximo posible como un porcentaje de la respuesta basal para
ratas que reciben solución salina (n = 4),
AS-NTR1-PNA (n = 4) o
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos (n=4) y expuestas a NT en los tiempos indicados.
La Figura 17 es un gráfico que representa el
cambio de la temperatura corporal como un porcentaje de la respuesta
basal para ratas que reciben solución salina (n = 4),
AS-NTR1-PNA (n = 4),
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos (n = 4) y expuestas a NT en los tiempos indicados.
La Figura 18 es un gráfico que representa el
efecto máximo posible (panel superior) y el cambio en la temperatura
corporal (panel inferior) como un porcentaje de la respuesta basal
para ratas que reciben AS-NTR1-PNA
(n \geq 4 en cada dosis) por vía intraperitoneal. Se calcularon
las DE_{50} por determinación de la dosis eficaz (mg/kg) que
proporcionaba el 50% de la respuesta máxima.
La Figura 19 es un gráfico que representa la
proporción de ARNm de NTR1 o MU1R con respecto al ARNm de GAPDH en
animales tratados con los oligómeros de
AS-NTR1-PNA o
NTR1-PNA con sentido. El tiempo 0 representa los
animales que no reciben PNA. El * representa P < 0,005 frente al
control y t representa P < 0,05 frente a
NTR1-PNA con sentido.
La Figura 20 es un gráfico que representa el
porcentaje de inhibición de la transcripción inversa frente a
concentraciones crecientes del oligómero de
AS-NTR1-PNA.
La Figura 21 es una imagen de un gel que
representa un ensayo de cambio de movilidad electroforética en gel
usando extractos de cerebro recogidos de animales tratados o sin
tratar. Carril 1) sonda sola en tampón TE; Carril 2) cerebro de
control + sonda; Carril 3) extracto de cerebro de animal tratado con
AS-NTR1-PNA + sonda. Los carriles
4-8 contenían extracto de cerebro de control con
sonda de 0, 50, 100, 200, 300 pg de patrón de PNA, respectivamente.
La flecha superior indica la posición del complejo de PNA/sonda
oligonucleotídica mientras que la flecha inferior indica la
posición del exceso de sonda oligonucleotídica libre.
La Figura 22 es un gráfico que representa una
curva patrón representativa obtenida a partir de un ensayo de
cambio de movilidad electroforética en gel usando tejido
cerebral.
La invención implica procedimientos y materiales
para administrar extracelularmente oligómeros de PNA a células
vivas. En concreto, la invención proporciona procedimientos de
tratamiento de células vivas con oligómeros de PNA de tal modo que
los oligómeros atraviesen barreras biológicas y engendren una
respuesta biológica de una forma específica de secuencia. Esta
invención también proporciona procedimientos de exploración de
oligómeros de PNA potenciales por la capacidad para engendrar una
respuesta biológica específica de secuencia. Además, esta invención
proporciona procedimientos de identificación de la función de
polipéptidos y de determinación de la tasa de renovación relativa
de polipéptidos funcionales.
Pueden administrarse oligómeros de PNA a células
vivas extracelularmente de tal modo que atraviesen una barrera
biológica y engendren una respuesta biológica específica de
secuencia. El que un oligómero de PNA atraviese una barrera
biológica puede inferirse de la capacidad del oligómero de PNA para
engendrar una respuesta biológica específica de secuencia que
requiera interacciones con secuencias de ácidos nucleicos
específicas contenidas en el interior de una célula viva. Por
ejemplo, si un oligómero de PNA que tiene especificidad de secuencia
por el ácido nucleico que codifica la proteína X se administra
extracelularmente y engendra una respuesta biológica específica de
secuencia por alteración de la expresión de la proteína X, entonces
puede inferirse que ese oligómero de PNA en particular también
atravesó una barrera biológica, la membrana plasmática. En otras
palabras, la naturaleza de las respuestas biológicas específicas de
secuencia engendradas por oligómeros de PNA implica que los
oligómeros de PNA atravesaron una barrera biológica para
interaccionar con secuencias de ácidos nucleicos específicas en el
interior de células vivas. Por lo tanto, una respuesta biológica
específica de secuencia es cualquier respuesta de una célula viva
que se atribuye a la secuencia concreta de un oligómero de PNA, tal
como la alteración de la expresión de la proteína X, como se ha
indicado anteriormente. Además, para analizar la expresión
polipeptídica, pueden determinarse respuestas biológicas específicas
de secuencia mediante el análisis de cualquier actividad biológica
incluyendo, sin limitación, actividades celulares tales como
señalización, adherencia, movimiento, proliferación, diferenciación
y apoptosis, así como actividades fisiológicas tales como
desarrollo, crecimiento, reproducción, inmunidad, dolor,
antinocicepción, percepción, depresión y memoria.
Pueden obtenerse oligómeros de PNA usados para
engendrar una respuesta biológica específica de secuencia en una
célula viva de PerSeptive Biosystems (Framingham, MA, Estados
Unidos) o de proveedores autorizados. Como alternativa, los
oligómeros de PNA pueden sintetizarse manualmente a partir de
monómeros de PNA obtenidos de PerSeptive Biosystems, como se
describe en otro sitio (Norton J. C., Bioorg. Med. Chem. 3:
437-445 (1995) y Cory D. R., Trends in Biotech. 15:
224-229 (1997)). Los oligómeros de PNA pueden tener
cualquier longitud con tal de que contengan al menos dos monómeros
de PNA. Por lo tanto, los oligómeros de PNA pueden variar en tamaño
desde dinucleótidos hasta genes completos o más. Los oligómeros de
PNA también pueden tener cualquier secuencia con tal de que el
oligómero de PNA atraviese una barrera biológica, tal como la BHE de
un organismo o la membrana plasmática de una célula, y engendre una
respuesta biológica específica de secuencia. Por ejemplo, un
oligómero de PNA puede tener especificidad de secuencia por
cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido
o regule la expresión de un polipéptido. Con los avances actuales en
la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes y de secuenciación
de ácido nucleicos, no sólo se conocen innumerables secuencias de
ácidos nucleicos, sino que están fácilmente disponibles de base de
datos de secuencias tales como Genebank®.
\newpage
Además, los oligómeros de PNA pueden estar o no
modificados, con la condición de que atraviesen una barrera
biológica y engendren una respuesta biológica específica de
secuencia. Los tipos posibles de modificaciones pueden incluir,
pero sin limitación, modificaciones con acridina, proteínas, química
de la estructura, ADN, péptidos, bis-PNA, biotina y
fluoresceína. Los oligómeros de PNA no modificados pueden incluir
cualquier oligómero constituido esencialmente por monómeros de PNA,
pero sin modificaciones adicionales diseñadas para potenciar el
paso a través de membranas plasmáticas o de la BHE. Dichos
oligómeros de PNA no modificados se denominan en la presente
memoria "sin portador". Debe entenderse, no obstante, que los
oligómeros de PNA "sin portador" pueden modificarse de otras
formas, por ejemplo, para potenciar su facilidad de detección (por
ejemplo, con diversos marcadores).
El modo de administración de oligómeros de PNA a
células vivas puede ser cualquier modo en el que la administración
sea extracelular y los oligómeros de PNA administrados engendren una
respuesta biológica específica de secuencia. Por ejemplo, pueden
aplicarse oligómeros de PNA directamente al medio de cultivo de
tejido cuando se tratan células in vitro, o pueden
administrarse a un organismo cuando se tratan células in
vivo. Cuando se tratan células in vivo, los oligómeros
de PNA pueden administrarse por diversas vías. Pueden usarse
diversos vehículos farmacéuticamente aceptables para la
administración in vivo a animales incluyendo, por ejemplo,
solución salina fisiológica, líquido cefalorraquídeo artificial u
otros vehículos conocidos apropiados para vías de administración
específicas.
Para los fines de esta invención, se
proporcionan dos vías generales de administración: intracraneal y
extracraneal. Los ejemplos de vías de administración intracraneales
incluyen, pero sin limitación, intracisternal, intranventricular e
intradural. Los ejemplos de vías de administración extracraneales
incluyen, pero sin limitación, oral, intravenosa, intramuscular,
intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, tópica o similar. La
administración oral puede ser por diversos procedimientos
incluyendo, sin limitación, deglución e intubación gástrica. La vía
de administración, ya sea intracraneal o extracraneal, puede
depender de una diversidad de factores tales como el entorno de
tratamiento y los objetivos terapéuticos. Además, los oligómeros de
PNA pueden administrarse de una forma continua o intermitente.
Además, una administración extracelular de oligómeros de PNA puede
contener oligómeros de PNA que tengan una especificidad de
secuencia única o puede contener oligómeros de PNA diferentes que
tengan una pluralidad de especificidades de secuencia.
Las dosificaciones de oligómeros de PNA
dependerán de muchos factores, incluyendo el modo de administración
y de si las células vivas que se tratan están en el interior de un
organismo vivo o dentro de un cultivo. Típicamente, la
concentración de oligómeros de PNA contenidos en el interior de una
dosis individual será una cantidad que engendre eficazmente una
respuesta biológica específica de secuencia sin inducir una
toxicidad significativa.
Pueden explorarse oligómeros de PNA potenciales
por la capacidad para engendrar una respuesta biológica deseada de
una forma específica de secuencia. La respuesta biológica específica
de secuencia deseada puede ser cualquier alteración de una
actividad particular o puede ser un nivel específico de alteración
de una actividad particular. Por ejemplo, una respuesta biológica
específica de secuencia deseada podría ser cualquier reducción en la
expresión de un polipéptido, mientras que otra podría ser la
anulación completa de la expresión del polipéptido. Para explorar
oligómeros de PNA potenciales, se administran extracelularmente
oligómeros de PNA individuales o combinaciones de diferentes
oligómeros de PNA a células vivas, como se describe en la presente
memoria. Después de la administración, las células vivas se
controlan para la respuesta biológica específica de secuencia
deseada. Las combinaciones particulares de oligómeros de PNA que
engendran la respuesta biológica específica de secuencia deseada
pueden dividirse y volver a explorarse de forma secuencial hasta que
se identifique una secuencia oligomérica de PNA individual si es
necesario.
La función de cualquier polipéptido expresado en
una célula viva puede identificarse mediante el siguiente
procedimiento. Pueden administrarse extracelularmente a células
vivas oligómeros de PNA que tengan especificidad de secuencia por
la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido o regula
la expresión de un polipéptido, de tal modo que la expresión de ese
polipéptido particular se altera de una forma específica de
secuencia. Después de la administración, las células pueden
examinarse para determinar una actividad específicamente
influenciada por la expresión alterada del polipéptido causada por
los oligómeros de PNA administrados. Las células vivas pueden
tratarse in vivo o in vitro y examinarse in
vivo o in vitro. Por ejemplo, pueden administrarse
oligómeros de PNA a un organismo y, después de la administración,
extraerse células del organismo para su examen. Además, pueden
administrarse oligómeros de PNA a un organismo y el propio organismo
examinarse después de la administración. Por lo tanto, el examen de
las células vivas puede incluir, sin limitación, el examen de un
organismo. Además, para examinar las propias células vivas después
de la administración, puede examinarse cualquier componente de las
células vivas. Por ejemplo, pueden administrarse oligómeros de PNA
a un organismo y después pueden extraerse y manipularse células, de
tal modo que se examine un componente particular de la célula.
La tasa de renovación relativa de un polipéptido
funcional que tiene una actividad definida puede medirse mediante
el siguiente procedimiento. Pueden administrarse extracelularmente a
células vivas oligómeros de PNA que tienen especificidad de
secuencia por una secuencia de ácido nucleico, que codifica un
polipéptido particular que tiene una actividad definida o que
regula la expresión del polipéptido, de tal modo que la actividad
definida atribuida al polipéptido se vea influenciada de una forma
específica de secuencia. La tasa de renovación para el polipéptido
puede determinarse por medición del tiempo, después de la
administración, necesario para que se influencie máximamente la
actividad atribuida al polipéptido. Además, la tasa de renovación
puede definirse adicionalmente por medición del tiempo necesario
para que la actividad máximamente influenciada vuelva a un nivel
normal después de la eliminación de los oligómeros de PNA del
entorno celular. Un nivel normal es el nivel de actividad medido
antes de cualquier administración de oligómeros de PNA. A partir de
estos datos, puede determinarse la tasa de renovación relativa del
polipéptido por comparación con las tasas de renovación de otros
polipéptidos obtenidos de una forma similar. Estas comparaciones
pueden realizarse entre polipéptidos con actividades biológicas
similares o diferentes.
Como se describe en la presente memoria, un
oligómero de PNA puede tener cualquier secuencia con tal de que el
oligómero de PNA atraviese una barrera biológica, tal como la BHE de
un organismo o la membrana plasmática de una célula, y engendre una
respuesta biológica específica de secuencia. Un oligómero de PNA
particular que tiene estas propiedades puede denominarse oligómero
de PNA "antisentido" o "con sentido", dependiendo de la
secuencia diana del oligómero de PNA. Para los fines de esta
invención, un oligómero de PNA "antisentido" puede ser
cualquier oligómero de PNA que tenga especificidad de secuencia por
una molécula de ARN que se encuentra en el interior de una célula.
Por ejemplo, un oligómero de PNA antisentido puede ser un oligómero
de PNA que tenga especificidad de secuencia por al menos una
porción de una molécula de pre-ARNm, ARNm, ARNm
viral, ARNr o ARNt. Debe entenderse que los oligómeros de PNA
antisentido también tendrán especificidad de secuencia por la
cadena de ácido nucleico no molde y no por la cadena molde a partir
de la que se transcriben dichas moléculas de ARN.
Aunque no se limita a ningún modo de acción en
particular, un oligómero de PNA antisentido puede interaccionar de
una forma específica de secuencia con una molécula de ARNm en el
interior de una célula e impedir la traducción de esa molécula de
ARNm en un polipéptido. La interacción del oligómero de PNA
antisentido y la molécula de ARNm en el interior de una célula da
como resultado, presumiblemente, un complejo de PNA/ARN que impide
la traducción por impedimento estérico. Además, la formación de un
complejo de PNA/ARN usando un oligómero de PNA antisentido no
parece promover la degradación de la molécula de ARN. Por lo tanto,
la respuesta biológica engendrada por un oligómero de PNA
antisentido no parece depender de la participación de polipéptidos
tales como ARNasas.
En resumen, la traducción de un mensaje genético
a partir de un ARNm en un polipéptido implica tres fases: inicio,
elongación y terminación. Durante el inicio, la maquinaria
traduccional se ensambla para formar un complejo de inicio con la
molécula de ARNm cerca de un sitio de inicio de la traducción. Una
vez que se ensambla este complejo de inicio, puede comenzar la
elongación. Durante la elongación, el ribosoma sintetiza una cadena
peptídica de acuerdo con la secuencia proporcionada por la molécula
de ARNm. Una vez que el ribosoma alcanza un codón de terminación,
la traducción se completa mediante un proceso de terminación.
Durante la terminación, el ARNm, ribosoma y el polipéptido recién
sintetizado se disocian.
Un oligómero de PNA antisentido que tiene
especificidad de secuencia por una secuencia próxima a una región
de inicio de la molécula de ARNm puede impedir la traducción,
presumiblemente, por formación de un complejo de PNA/ARN que
interfiere con la formación de un complejo de inicio en ese sitio.
Si una molécula de ARNm particular tiene múltiples sitios de
inicio, entonces puede usarse un oligómero PNA antisentido que tiene
especificidad de secuencia por una secuencia en o próxima a un
sitio de inicio cadena arriba para dirigir el inicio de la
traducción en un sitio cadena abajo. Por lo tanto, pueden usarse
oligómeros de PNA antisentido para impedir el inicio de la
traducción, así como para dirigir el inicio de la traducción en un
sitio cadena abajo.
Un oligómero de PNA antisentido que tiene
especificidad de secuencia por una porción de la secuencia
codificante de una molécula de ARNm puede impedir la traducción,
presumiblemente, por formación de un complejo de PNA/ARN que
interfiere con la elongación. Se señala que un oligómero de PNA
antisentido que tiene especificidad de secuencia por una porción de
la secuencia codificante de una molécula de ARNm puede producir un
polipéptido truncado. Dichos polipéptidos truncados pueden tener
una función modificada con respecto a sus homólogos de longitud
completa. Por ejemplo, un receptor de superficie celular que carece
de una porción de su extremo C-terminal puede tener
una actividad de señalización intracelular modificada. En su
conjunto, pueden usarse oligómeros de PNA antisentido para impedir
la elongación más allá de un punto específico, dando como resultado
una síntesis de polipéptidos reducida o la síntesis de polipéptidos
truncados.
Un oligómero de PNA antisentido que tiene
especificidad de secuencia por una secuencia próxima a un codón de
terminación puede reducir la síntesis de un polipéptido,
presumiblemente, por formación de un complejo de PNA/ARN que
interfiere con el proceso de terminación. La interferencia con el
proceso de terminación puede impedir la disociación del ribosoma,
el complejo polipeptídico, de la molécula de ARNm, dando como
resultado una acumulación de dichos complejos a lo largo de la
molécula de ARNm. En este caso, el polipéptido recién sintetizado
no se liberará del ribosoma y, por lo tanto, será incapaz de
realizar su función biológica. Por lo tanto, pueden usarse
oligómeros de PNA antisentido para reducir la terminación de la
traducción, dando como resultado una síntesis reducida de
polipéptidos funcionales.
Para los fines de esta invención, un oligómero
de PNA "con sentido" puede ser cualquier oligómero de PNA que
tenga especificidad de secuencia por una región de ácido nucleico
que puede usarse como la cadena molde durante la transcripción,
incluyendo la transcripción inversa. Aunque no se limita a ningún
modo de acción en particular, un oligómero de PNA con sentido puede
interaccionar de una forma específica de secuencia con la cadena
molde de una molécula de ácido nucleico e impedir la transcripción
de ese molde. La interacción del oligómero de PNA con sentido y el
molde en el interior de una célula, presumiblemente, da como
resultado un complejo de PNA/ácido nucleico que impide la
transcripción por impedimento estérico. Por ejemplo, un complejo de
PNA/ADN puede reducir la producción de ARN por interferencia con
una ARN polimerasa. Por lo tanto, un oligómero de PNA con sentido
puede impedir la producción de ARNm, dando como resultado un nivel
reducido de síntesis polipeptídica.
El uso de dichos oligómeros de PNA con sentido
para modular la transcripción se denomina, típicamente, una
estrategia de "antigenes", puesto que los oligómeros de PNA con
sentido pueden funcionar a nivel del ADN. Se señala que la cadena
molde del ácido nucleico puede ser una molécula de ADN o ARN. Por
ejemplo, un oligómero de PNA con sentido puede ser un oligómero de
PNA que tenga especificidad de secuencia por la cadena molde de una
molécula de ADN huésped que puede transcribirse en una molécula de
ARNm, o una molécula de ARN viral que puede transcribirse en ADN
mediante una transcriptasa inversa. Además, un oligómero de PNA con
sentido puede ser un oligómero de PNA que tenga especificidad de
secuencia por al menos una porción de una región reguladora, de
intrón o exón de una cadena molde de ácido nucleico. Se señala que
un oligómero de PNA con sentido puede ser un inhibidor de la
actividad biológica más potente que un oligómero de PNA antisentido,
puesto que la cantidad de diana disponible para un oligómero de PNA
antisentido (por ejemplo, muchas copias de ARNm en el interior de
una célula) puede ser mucho mayor que la disponible para un
oligómero de PNA con sentido (por ejemplo, dos copias de ADN en el
interior de una célula).
Pueden proporcionarse oligómeros de PNA con
sentido y antisentido en combinación para engendrar una respuesta
biológica que sea más pronunciada, más duradera o diferente de otro
modo a la respuesta biológica engendrada por el oligómero de PNA
con sentido o antisentido en solitario. Además, pueden usarse
oligómeros de PNA con emparejamientos erróneos en combinación con
otros oligómeros de PNA.
Un oligómero de PNA con emparejamientos erróneos
puede ser cualquier oligómero de PNA, incluyendo un oligómero de
PNA con sentido o antisentido, que tenga una secuencia que contiene
al menos un emparejamiento erróneo de pares de bases con respecto a
una secuencia diana. Por ejemplo, un oligómero de PNA que se dirige
a 5'-GGGGGG-3' y tiene una
secuencia 5'-CCCCCC-3' no sería un
oligómero de PNA con emparejamientos erróneos, pero un oligómero de
PNA que tiene una secuencia
5'-CCCACC-3' sería un oligómero de
PNA con un emparejamiento erróneo con respecto a la secuencia diana
5'-GGGGGG-3'. Además, cualquier
oligómero de PNA con emparejamientos erróneos está dentro del
alcance de esta invención, con tal de que el oligómero de PNA con
emparejamientos erróneos pueda atravesar una barrera biológica, tal
como la BHE de un organismo o la membrana plasmática de una célula,
y engendrar una respuesta biológica específica de secuencia.
Además, la localización de un emparejamiento erróneo de pares de
bases entre un oligómero de PNA con emparejamientos erróneos y una
secuencia diana puede ser en cualquier sitio a lo largo de la
secuencia del oligómero de PNA con emparejamientos erróneos. Por
ejemplo, el emparejamiento erróneo de pares de bases puede ser en
la primera, segunda, tercera, cuarta o hasta la última posición de
pares de bases a lo largo del oligómero de PNA con emparejamientos
erróneos. Además, un oligómero de PNA con emparejamientos erróneos
puede tener uno o múltiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco,
seis, siete y ocho) emparejamientos erróneos de pares de bases con
respecto a una secuencia diana.
Pueden usarse oligómeros de PNA con
emparejamientos erróneos, por ejemplo, para engendrar una respuesta
biológica menor que la producida por oligómeros de PNA que se
dirigen a la misma secuencia pero que tienen menos o que no tienen
emparejamientos erróneos de pares de bases con respecto a esa
secuencia diana. En otras palabras, la secuencia de un oligómero de
PNA puede modificarse, de tal modo que existan emparejamientos
erróneos de pares de bases entre el oligómero de PNA y una
secuencia diana. La introducción de dichos cambios puede modificar
el grado de una respuesta biológica engendrada, que de otro modo se
habría engendrado sin el cambio. Típicamente, los oligómeros de PNA
que tienen un número mayor de emparejamientos erróneos con respecto
a sus secuencias diana engendran una respuesta biológica en un
grado menor que los oligómeros de PNA que tienen un menor número de
emparejamientos erróneos. Por lo tanto, el grado de una respuesta
biológica engendrada por un oligómero de PNA puede modularse
cambiando la secuencia de un oligómero de PNA de tal modo que
existan emparejamientos erróneos de pares de bases entre el
oligómero de PNA y una secuencia diana.
Un kit puede contener una serie de oligómeros de
PNA diferentes. Por ejemplo, un kit puede contener dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más oligómeros de PNA, teniendo
cada uno una secuencia diferente. Un kit puede contener todos los
oligómeros de PNA con sentido, todos los oligómeros de PNA
antisentido o una combinación de oligómeros de PNA con sentido y
antisentido. Además, un kit puede contener oligómeros de PNA con
emparejamientos erróneos. Cada oligómero de PNA diferente dentro de
un kit puede tener especificidad de secuencia por la misma
secuencia diana. En este caso, cada oligómero de la serie puede
contener un grado gradualmente creciente de emparejamientos
erróneos de pares de bases con respecto a la misma secuencia diana.
Por ejemplo, un kit puede contener una serie de cuatro oligómeros
de PNA, en la que uno es completamente complementario a una
secuencia diana y los otros tres tienen cada uno una secuencia que
genera al menos un emparejamiento erróneo de pares de bases con esa
misma secuencia diana.
Además, cada oligómero de PNA dentro de un kit
puede tener especificidad de secuencia por una secuencia diana
diferente. En este caso, las secuencias dianas diferentes pueden
estar todas en la misma cadena contigua de ácido nucleico dentro de
una célula. Por ejemplo, cada oligómero de PNA diferente puede tener
especificidad de secuencia por una secuencia diana diferente que se
encuentre en la misma molécula de ARNm. Así mismo, las secuencias
diana diferentes pueden ser cada una parte de la misma región de ADN
que se usa como molde para la síntesis de un ARNm particular.
La eficacia de un oligómero de PNA particular
puede evaluarse in vivo usando un análisis de respuesta a la
dosis. Por ejemplo, puede administrarse una concentración creciente
de un oligómero de PNA a animales y medirse el grado de respuesta
después de la administración. La evaluación de la eficacia de un
oligómero de PNA particular puede proporcionar información útil
acerca de la potencia de ese oligómero de PNA. Además, pueden
determinarse las concentraciones que no sean eficaces o de
saturación. Por ejemplo, un análisis de respuesta a la dosis puede
proporcionar información acerca de la eficacia de un oligómero de
PNA particular in vivo, así como información acerca de dosis
específicas.
También puede usarse un análisis de respuesta a
la dosis para evaluar lotes individuales o preparaciones
particulares de un oligómero de PNA. Por ejemplo, puede usarse un
análisis de respuesta a la dosis para determinar si un lote
particular de un oligómero de PNA es más o menos eficaz que otro
lote del mismo oligómero de PNA. Esto permitiría que se combinen en
consecuencia lotes eficaces y no eficaces.
Puede detectarse un oligómero de PNA en una
muestra biológica recogida de un animal. En concreto, se recoge una
muestra biológica de un animal y se incuba con una sonda de tal modo
que se puede formar un complejo de sonda/oligómero de PNA. La
presencia del complejo de sonda/oligómero de PNA indica que el
oligómero de PNA está dentro de esa muestra biológica
particular.
Una muestra biológica es cualquier muestra
obtenida de un organismo vivo incluyendo, sin limitación, tejido,
sangre, suero, orina, moco, sudor, saliva y heces. Un animal puede
ser un animal vertebrado o invertebrado. Los animales vertebrados
incluyen mamíferos, tales como animales murinos y humanos.
Puede usarse cualquier forma apropiada para
recoger una muestra biológica de un animal en cualquier momento
antes o después de que el animal se trate con un oligómero de PNA.
Además, un animal puede perfundirse antes de recoger una muestra
biológica para análisis. Una vez que se recoge una muestra
biológica, la muestra puede prepararse de la forma siguiente. Para
muestras de tejido, tales como muestras de tejido de cerebro,
corazón, riñón, hígado y bazo, el tejido puede someterse a
congelación ultrarrápida y homogeneizarse, por ejemplo, en Tris 1
mM (pH 4,0), EDTA 0,1 mM a una concentración de 1,5 ml/g de peso
húmedo de tejido. Esta condición ácida puede protonar bases de
citosina, así como el grupo amino N-terminal del oligómero de
PNA a detectar. Dicha protonación puede aumentar la solubilidad de
un oligómero de PNA y permitir que el oligómero de PNA se separe en
la fase acuosa durante una extracción. Además, una muestra
homogeneizada puede llevarse a ebullición durante un periodo de
tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 5 minutos. La ebullición de
una muestra puede liberar de su secuencia diana a cualquier
oligómero de PNA a detectar unido, que puede estar dentro de la
muestra. Además, la ebullición de una muestra puede inactivar
nucleasas que pueden interferir con la integridad de la sonda si la
sonda es sensible a dichas nucleasas. La muestra puede centrifugarse
para sedimentar el material insoluble. Por ejemplo, una muestra
puede centrifugarse dos o tres veces a 35.600 x g durante 10
minutos cada una. Una vez centrifugada, el sobrenadante puede
recogerse y extraerse para eliminar los glicolípidos que pueden
interferir con la electroforesis en gel. Por ejemplo, el
sobrenadante puede extraerse con 10 volúmenes de CHCl_{3}:MeOH
(2:1 v/v) y centrifugarse brevemente a 1.000 x g para separar las
fases. La fase que contiene el oligómero de PNA a detectar puede
recogerse en un tubo limpio, liofilizarse y resuspenderse en agua
(por ejemplo, de 30 a 40 \mul de H_{2}O).
Para una muestra de sangre, puede recogerse
sangre completa y añadirse una solución tamponada de citrato. Por
ejemplo, pueden añadirse 15 \mul de una solución tamponada de
citrato 0,13 M a un volumen de sangre completa de 150 \mul.
Después, la muestra de sangre puede centrifugarse brevemente y
recogerse el suero en un tubo limpio. El suero puede diluirse o
usarse sin diluir. Por ejemplo, pueden diluirse alícuotas de 1
\mul de suero hasta un volumen final de 30 \mul en tampón TE (pH
8,0).
Puede prepararse una sonda a partir de cualquier
tipo de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico con tal de que
la sonda tenga especificidad de secuencia por el oligómero de PNA a
detectar. Por ejemplo, una sonda puede ser, sin limitación, una
sonda oligonucleotídica de ADN o una sonda oligomérica de PNA.
Típicamente, una sonda tiene una secuencia que es completamente
complementaria al oligómero de PNA para detectar. En otras
palabras, si un oligómero de PNA a detectar tiene una secuencia de
5'-GGGGGG-3', entonces una sonda
típica tendrá una secuencia de
5'-CCCCCC-3'. Además, una sonda
puede marcarse para facilitar la detección del complejo de
sonda/oligómero de PNA. Por ejemplo, una sonda puede marcarse con
biotina, digoxigenina, un radioisótopo (por ejemplo, ^{3}H,
^{12}C, ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S y ^{125}I) o cualquier otra
molécula que permita la detección de la sonda.
Para preparar una sonda oligonucleotídica de ADN
radiomarcada, un oligonucleótido de ADN puede marcarse terminalmente
usando polinucleótido quinasa T4 y
[Gamma-^{32}P]ATP o
[Gamma-^{33}P]ATP. Los nucleótidos no
incorporados pueden eliminarse usando una columna
Chroma-Spin 10 y la sonda purificarse en un gel de
acrilamida al 20%. Una vez separada en un gel, la sonda puede
escindirse y eluirse, por ejemplo, en de 100 a 150 \mul de Tris
10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM.
La muestra y la sonda pueden mezclarse e
incubarse para permitir la formación de un complejo de
sonda/oligómero de PNA. Por ejemplo, pueden añadirse 400 pg de
sonda a de 30 a 40 \mul de muestra preparada como se describe en
la presente memoria. Después de añadir la sonda, la muestra puede
incubarse a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Un complejo de sonda/oligómero de PNA puede
detectarse usando cualquier procedimiento incluyendo, sin
limitación, técnicas de separación y técnicas inmunológicas. Por
ejemplo, pueden usarse técnicas de separación tales como
electroforesis en gel o HPLC y técnicas inmunológicas tales como
ELISA o inmunoprecipitación para detectar los complejos de
sonda/oligómero de PNA. En resumen, pueden usarse técnicas de
separación para detectar la presencia de complejos que contienen
sonda que tengan un peso molecular mayor que el de la sonda sola.
Las técnicas inmunológicas pueden implicar el uso de un anticuerpo
que tenga especificidad de unión por los complejos de
sonda/oligómero de PNA y no por la sonda en solitario (por ejemplo,
anticuerpos anti-PNA/ADN). Cuando el procedimiento
de detección implica una electroforesis en gel, el ensayo se
denomina, típicamente, "ensayo de cambio de movilidad
electroforética en gel".
Los procedimientos de detección de oligómeros de
PNA descritos en la presente memoria también pueden usarse para
cuantificar la concentración de oligómero de PNA dentro de una
muestra biológica particular. Típicamente, la cuantificación
implica añadir cantidades conocidas de un oligómero de PNA a una
muestra de control para generar una curva patrón.
En su conjunto, los resultados que se presentan
en la presente memoria demuestran que los oligómeros de PNA con
sentido, antisentido y con emparejamientos erróneos atraviesan una
barrera biológica (la BHE y la membrana plasmática) y engendran una
respuesta biológica específica de secuencia. Además, estos
resultados demuestran que los oligómeros de PNA con sentido inhiben
la transcripción y que los oligómeros de PNA antisentido inhiben la
traducción. Además, estos resultados demuestran que es necesaria una
cantidad muy pequeña del oligómero de PNA para engendrar una
respuesta biológica específica de secuencia que puede durar durante
al menos 24 horas. Por lo tanto, pueden usarse oligómeros de PNA
para tratar una multitud de enfermedades, incluyendo las
enfermedades del cerebro que anteriormente se pensaba que eran
intratables (por ejemplo, la enfermedad de Huntington y la
enfermedad de Alzheimer).
Además, el tratamiento de animales con un
oligómero de PNA para reducir la síntesis de un polipéptido por
inhibición de su transcripción a traducción puede usarse para
generar un animal que no exprese un polipéptido particular durante
un periodo de tiempo específico. La anulación transitoria de la
expresión de un polipéptido puede proporcionar un procedimiento
para estudiar la función de un polipéptido que es superior a las
estrategias actuales que implican el uso de animales "knock
out" que carecen de un polipéptido particular durante toda
su vida, incluyendo el desarrollo temprano. Por ejemplo, la
anulación de la expresión de un polipéptido durante toda la vida de
un animal puede conducir a mecanismos compensatorios que no reflejan
con precisión el desarrollo normal. La limitación transitoria de la
expresión de un polipéptido usando oligómeros de PNA puede evitar
dichos mecanismos compensatorios, permitiendo que se examine la
función de un polipéptido específico durante cualquier fase del
desarrollo, incluyendo la edad adulta.
La invención se describirá adicionalmente en los
siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención
descrito en las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se sintetizaron oligómeros de PNA con monómeros
de
Fmoc-N-(2-aminoetil)glicil-PNA
en un sintetizador de ácidos nucleicos Expidite 8909 de acuerdo con
la química y con los protocolos desarrollados por el fabricante
(PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA). Las aminas
exocíclicas de las bases de adenina, guanina, timina y citosina de
cada monómero de Fmoc-PNA estaban protegidas con el
grupo bloqueante benzhidriloxicarbonilo (Bhoc). La síntesis de los
oligómeros de PNA (2 x 2 \mumol) era sobre resina de enlazador de
poliamida
(PAL)-polietilenglicol-poliestireno
(PerSeptive Biosystems, Inc.) que produce un grupo carboxamida
(CONH_{2}) en el extremo COOH terminal (3'). Después de la
síntesis, el PNA se desprotegió y se retiró de la resina por
tratamiento con una mezcla de ácido trifluoroacético al 80% (TFA)
que contenía m-Cresol al 20% durante 90 minutos a
22ºC. Después, el oligómero de PNA se precipitó en éter dietílico y
se purificó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de
fase inversa en una columna Vydac C_{18} a 60ºC con un tampón de
TFA acuoso al 0,1% y un gradiente lineal de TFA al 0,5% que
contenía acetonitrilo al 80%/agua al 20%. Se recogió un pico
principal (a A_{300} nm), se liofilizó y se verificó para
determinar su peso en masa correcto mediante espectrometría de masas
de ionización por electropulverización en un espectrómetro de masas
Sciex API 165B (Perkin-Elmer, Foster City, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
La neurotensina (NT) es un tridecapéptido que
produce una respuesta antinociceptiva potente insensible a la
naloxona, así como hipotermia, cuando se inyecta en la región de la
sustancia gris periacueductal (PAG) del tronco cerebral de rata. En
la actualidad se han identificado dos subtipos de receptores de NT
(NTR1 y NTR2), sin embargo, aún no está clara su implicación exacta
en la antinocicepción y la hipotermia mediadas por NT. En un
intento por caracterizar los receptores de NT y posiblemente
identificar subtipos adicionales, se sintetizó un oligómero de PNA
(NTR1-PNA) que tenía especificidad de secuencia por
NTR1, como se ha descrito anteriormente. En concreto, este
NTR1-PNA era un oligómero de 12 unidades que tenía
una secuencia antisentido que comenzaba en +103 pb desde el sitio
de inicio de la región codificante del NTR1 de rata recombinante. Se
seleccionó esta región porque se piensa que es un área que tiene
elevada estructura secundaria en el ARNm. Esto puede no ser
importante para la unión de oligómeros de PNA antisentido, que
tienen mayor afinidad por ácidos nucleicos complementarios (tanto
ARN como ADN) que el ADN. La secuencia de NTR1-PNA
es 5'-CATTGCTCAAAC-3' (SEC ID Nº:
1).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el protocolo aprobado por el
Comité Institucional de Uso y Cuidado de los Animales y en
condiciones estériles se implantaron estereotáxicamente cánulas
guía de acero inoxidable (calibre 26 G -0,405 mm) en la PAG de
ratas macho Sprague-Dawley (180-200
g) bajo anestesia con pentobarbital sódico (50 mg/kg, i. p.), como
se describe en detalle en otro sitio (Jensen T. S. y Yaksh T. L.,
Brain Res. 372: 301-312 (1986) y
Al-Rodhan N. R. F., Brain Res. 557:
227-235 (1991)). Las coordenadas usadas para las
canulaciones en la PAG eran -5,6 mm posterior al bregma, 1,0 mm
lateral al bregma y 5,5 mm hacia abajo desde la duramadre. Se midió
previamente que la cánula guía era de 5,5 mm (Plastics One,
Roanoke, VA) y se encargó una cánula interna que se ajustara por
debajo del soporte con una proyección de 2,0 mm. Después, la cánula
guía se fijó al cráneo usando un tornillo de acero inoxidable (1/8
pulgadas -3,18 mm) y cemento craneoplástico. Después, se colocó un
estilete de acero inoxidable en cada guía para mantenerla a la
vista y libre de residuos. Inmediatamente después de la cirugía, se
dejó que los animales se recuperaran antes de devolverlos a una
jaula de alojamiento individual. Todas las inyecciones comenzaron
5-7 días después de la cirugía. Si se observaba
cualquier problema, tal como una infección, con un animal después
de la canulación, entonces el animal se eutanasiaba inmediatamente
por decapitación.
Se inyectaron oligómeros de
NTR1-PNA en la PAG, usando una jeringa digital de
Hamilton, a través de la cánula interna que se prolongaba 2 mm por
debajo de la punta de la guía. La cánula interna estaba conectada
con una longitud de tubo de polietileno (PE-20)
relleno con solución salina. Se introducía una pequeña burbuja de
aire en el tubo para separar la solución salina de una solución que
contenía 1,3 nmol de oligómeros de NTR1-PNA en
líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF). El volumen de la solución
que contenía los oligómeros de NTR1-PNA era de
aproximadamente 1,0 \mul. La burbuja se usaba para confirmar el
movimiento de esta solución a través del tubo de polietileno.
Se inyectaron oligómeros de
NTR1-PNA en la PAG de cada rata tres veces, los días
-4, -2 y 0. Los controles incluían ratas que no recibían
inyecciones, ratas que recibían inyecciones de ACSF solo y ratas que
recibían oligómeros de PNA que tenían especificidad de secuencia
por un polipéptido no relacionado, el receptor de la morfina 1
murino (MU1R). La secuencia del MU1R-PNA es
5'-CAGCCTCTTCCTCT-3' (SEC ID Nº:
2).
\vskip1.000000\baselineskip
La inyección de NT en la PAG de ratas produce
una potente respuesta antinociceptiva, así como hipotermia. Estas
respuestas están mediadas por receptores de NT específicos y no se
inhiben por naloxona. Se usó un ensayo muy sensible y fiable de
placa caliente para medir los efectos antinociceptivos de la NT
(AI-Rodhan N. R. F., Brain Res. 557:
227-235 (1991)).
Se analizaron ratas tratadas con
NTR1-PNA, MU1R-PNA y ACSF, así como
ratas sin tratar, usando el ensayo de placa caliente para NT. Un
día después del último tratamiento, cada rata se analizó de la forma
siguiente. Quince minutos antes del ensayo, se realizó una medición
de la latencia previa al fármaco por colocación de la rata en una
placa caliente mantenida a una temperatura de 52 \pm 0,15ºC y
registro del tiempo transcurrido antes de que la rata se lamiera
cualquiera de sus patas traseras. Además, se tomó la temperatura de
la rata usando una sonda termistora insertada 3 cm en el recto para
determinar la temperatura corporal previa al fármaco (BT). Después
de realizar esta medición, se administró una dosis apropiada de NT
(18 nmol) a un volumen de aproximadamente 0,5 \mul en la PAG,
como se ha descrito anteriormente. Treinta minutos después de
administrar NT, la rata se colocó de nuevo en una placa caliente
mantenida a una temperatura de 52 \pm 0,15ºC y se midió la
latencia entre el momento en que se colocó a la rata en la
superficie y el tiempo en el que se lamía cualquiera de sus patas
traseras. Una falta de respuesta en treinta segundos daba como
resultado la retirada de la rata para evitar daños tisulares y la
asignación de esa latencia. Los ensayos de placa caliente se
puntuaron como el porcentaje del efecto máximo posible (% MPE) y se
calculó usando la siguiente ecuación: %MPE = [(latencia postfármaco
- latencia prefármaco)/(límite - latencia prefármaco)] x 100; donde
el límite es de 30 segundos. Las ratas de control sin tratar eran
sensibles a NT y presentaban un cambio significativo, dentro del
ensayo de 30 segundos de tiempo, del 75% \pm 9% del MPE de media.
Esta media para ratas de control sin tratar se usó para ajustar el
valor del MPE basal a 100. Inmediatamente después del ensayo de
placa caliente de 30 segundos, se tomó la BT para medir la
hipotermia inducida por NT usando una sonda termistora insertada 3
cm en el recto. De nuevo, las ratas de control sin tratar eran
sensibles a NT y presentaban un cambio de temperatura significativo
de -1,81 \pm 0,26ºC de media, que se usó para ajustar el valor de
la BT basal a 100. Todas las situaciones de ensayo se compararon
con estos valores basales obtenidos de controles sin tratar
sensibles a NT.
El último día de ensayo, se inyectaron 0,5
\mul de azul de metileno en la PAG de cada rata. Después, la rata
se decapitó y se extrajo el cerebro para verificar la colocación de
la cánula. Cada cerebro se colocó en formalina al 10%/sacarosa
durante tres días y se tomaron coronalmente secciones congeladas (30
\mum de grosor) a lo largo de un plano paralelo a la cánula de
inyección. Las secciones se tiñeron con cristal violeta, se
fotografiaron y se compararon con placas estereotáxicas. Los
resultados que se presentan se obtuvieron de ratas que tenían la
localización de cánula correcta.
Se ensayaron los datos para significación
mediante el ensayo t de Student, considerándose significativo p
< 0,05.
La Figura 1 representa las respuestas de MPE y
BT a la exposición a NT como un porcentaje de la respuesta basal
para ratas tratadas con oligómeros de NTR1-PNA, como
se ha descrito anteriormente. Cada rata recibió tres inyecciones de
oligómeros de NTR1-PNA los días -4, -2 y 0. El valor
del 100 por cien el día cero se obtuvo de ratas de control sin
tratar, mientras que las ratas tratadas con NTR1-PNA
se analizaron por primera vez un día después de la última inyección
el día cero. Tanto las respuestas antinociceptivas (MPE) como de
hipotermia (BT) mediadas por NT se redujeron significativamente el
día uno después del tratamiento con NTR1-PNA y
permanecieron significativamente reducidas hasta el día cinco para
la antinocicepción y hasta el día seis para la hipotermia. La
sensibilidad a la exposición a NT volvía gradualmente a la normal
desde el día cinco al nueve. Además, ambas respuestas conductuales
estaban correlacionadas, teniendo niveles casi idénticos de
reducción, recuperación y velocidades de recuperación.
La Figura 2 es un gráfico de barras que
representa los efectos específicos de secuencia del tratamiento con
oligómero de NTR1-PNA. El MPE y la BT para cada tipo
de tratamiento se determinaron como un porcentaje de la respuesta
basal por exposición a NT. Los valores de MPE y BT obtenidos de
ratas a las que sólo se les inyectó ACSF y expuestas a NT eran
equivalentes a las respuestas basales. Estos animales eran
completamente sensibles a la exposición a NT, presentando una
ligera o ninguna reacción al dolor, así como una temperatura
corporal disminuida. Sin embargo, las ratas a las que se inyectaron
oligómeros de NTR1-PNA presentaban una escasa
respuesta a la exposición a NT. De hecho, las respuestas de MPE y
BT a la exposición a NT para ratas tratadas con
NTR1-PNA eran del 10 al 30 por ciento de las
respuestas basales. Como control para indicar la naturaleza
específica de secuencia de la influencia del oligómero de PNA sobre
estas respuestas biológicas, se analizó la sensibilidad a NT de
ratas a las que se inyectaron oligómeros de
MU1R-PNA. Los valores de MPE y BT obtenidos de ratas
a las que se inyectaron oligómeros de MU1R-PNA y
expuestas a NT eran indistinguibles de las respuestas basales,
indicando que los oligómeros de NTR1-PNA engendran
una respuesta biológica de una forma específica de secuencia. Como
otro control, se analizaron ratas a las que se inyectaron oligómeros
de NTR1-PNA para sensibilidad a morfina (MOR)
usando un ensayo de coletazo de la cola (véase el Ejemplo 2 a
continuación). El MPE para ratas tratadas con oligómeros de
NTR1-PNA y expuestas a MOR era similar a los valores
de la respuesta basal, indicando de nuevo la especificidad de los
oligómeros de NTR1-PNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha indicado anteriormente, se han
identificado dos subtipos de receptores de NT y además, en la
actualidad pueden existir subtipos de receptores de NT no
identificados. Además, aún no está clara la implicación exacta de
NTR1 y NTR2 en la antinocicepción e hipotermia mediadas por NT. Por
ejemplo, NTR1 podría mediar principalmente en la antinocicepción y
NTR2 podría mediar principalmente en la hipotermia o viceversa. Los
resultados descritos anteriormente, sin embargo, indican que el
NTR1 participa significativamente tanto en las respuestas de
antinocicepción como en las de hipotermia mediadas por NT (Figuras
1 y 2). De hecho, ambas respuestas biológicas están correlacionadas,
teniendo niveles casi idénticos de reducción, recuperación y
velocidades de recuperación (Figura 1). Esta identificación de la
función de NTR1 se basa en el hecho de que la secuencia específica
de NTR1-PNA no está presente en NTR2 y en la
suposición de que la secuencia de NTR1-PNA es única
sólo para NTR1 y no para cualquier otro subtipo de receptor de NT
no identificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de determinar la influencia de oligómeros
de NTR1-PNA sobre la antinocicepción y la
hipotermia, se determinaron los efectos de estos oligómeros sobre
los sitios de unión a NT usando el siguiente ensayo de unión a
receptores de NT.
Se realizaron ensayos de unión con
homogeneizados de tejido de PAG e hipotálamo de rata, como se
describe en otro sitio (Kanba y col., J. Neurochem. 46:
946-952 (1986) y Al-Rodhan N. R. F.,
Brain Res. 557: 227-235 (1991)). Las
concentraciones de tejido eran de 1 mg de peso húmedo por tubo en un
volumen total de 100 \mul con una concentración de tampón final
de Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4) que contenía los
siguientes compuestos para inhibir la degradación de péptidos:
albúmina sérica bovina al 0,02% (p/v), bacitracina 2,8 mg/ml, EDTA
1,0 mM, o-fenantrolina 0,5 mM, pepstatina 10
\mug/ml, leupeptina 10 \mug/ml, aprotinina 10 \mug/ml,
benzamidina 5 mM, fenilmetilsulfonilfluoruro 2 mM y bestatina 50
\muM. Para cada experimento, se incubaron 80 \mul de una
suspensión de membrana descongelada durante 25 minutos a 20ºC en una
solución que contenía [^{125}I]neurotensina 0,2 nM con un
volumen final de 100 \mul. Después de la incubación, la mezcla se
filtró rápidamente para separar el radioligando unido del no unido.
Después, cada filtro se secó durante 2 minutos, se colocó en una
lámina de escintilación sólida (Wallac Oy, Turku Finland; nº cat.
1205-441) y se midió para determinar la
radiactividad en un contador de escintilación Beta Plate (Wallac Oy;
Beta Plate modelo nº 1205). La unión inespecífica de
[^{125}I]neurotensina, definida como la unión en presencia
de neurotensina 1 \muM (\sim20% de la unión total) se restó de
la unión total para calcular la unión específica.
Se usó el programa LIGAND para analizar todos
los datos de unión (Munson P. J. y Rodbard D., Analyt. Biochem.
107: 220-239 (1980)). En concreto, este programa se
usó para calcular las constantes de disociación de equilibrio y el
número máximo de sitios de unión.
La Tabla I contiene los resultados de varios
ensayos de unión de [^{125}I]neurotensina. El análisis del
tejido de PAG en el experimento 1 fue de la forma siguiente. Se
canularon cuatro ratas y se trataron los días -4, -2 y 0 con ACSF
solo o NTR1-PNA, como se ha descrito anteriormente.
Un día después del tratamiento final, se extirpó la región de PAG
del cerebro de ratas, se homogeneizó y se usó en los ensayos de
unión. Se usaron ratas tratadas con ACSF solo para obtener los
valores de control para el porcentaje de desintegraciones por
minuto (dpm) de control y el porcentaje de receptores de control
(fmol/mg peso húmedo). Por lo tanto, los valores para ratas
tratadas con ACSF solo se ajustaron al 100 por cien. Un día después
del tratamiento final, la región de PAG de las ratas tratadas con
oligómero de NTR1-PNA expresaban un
60-70 por ciento menos sitios de unión a
[^{125}I]neurotensina que las ratas tratadas sólo con
ACSF.
En el experimento 2, se dejaron cinco ratas sin
tratar y se usaron como controles, se trataron dos ratas recuperadas
con ACSF solamente y se trataron cuatro ratas con oligómeros de
NTR1-PNA. Las dos ratas tratadas con ACSF solamente
se designan como recuperadas puesto que ambas ratas habían recibido
anteriormente una sola dosis de oligómeros de PNA por vía
intraperitoneal (una recibió oligómeros de NTR1-PNA
y la otra oligómeros de MU1R-PNA). No obstante,
estas ratas no se usaron hasta cinco días después del tratamiento
con oligómero de PNA intraperitoneal (i. p.). Por lo tanto, en el
momento en el que se realizó el análisis de unión, estas ratas eran
completamente normales, como se determinaba por las respuestas
conductuales mediadas por NT y la respuesta mediada por MOR
descritas anteriormente. De nuevo, un día después del tratamiento
final, la región de PAG de ratas tratadas con oligómero de
NTR1-PNA expresaba menos sitios de unión a
[^{125}I]neurotensina que tanto las ratas recuperadas
tratadas con ACSF solo como las ratas de control sin tratar. En este
experimento, la reducción en sitios de unión era de aproximadamente
el 20-30 por ciento de los expresados por las ratas
sin tratar. Además, las ratas recuperadas previamente tratadas que
recibieron sólo ACSF expresaban significativamente más sitios de
unión a NT que las ratas de control sin tratar, posiblemente
indicando la implicación de un mecanismo compensatorio que funciona
a nivel de densidades de receptor.
También se analizaron los sitios de unión a NT
de la región del hipotálamo del cerebro de rata. En este
experimento, se extirpó la región del hipotálamo del cerebro de
rata de las mismas ratas usadas en el experimento 2 para analizar
la región de PAG (cinco ratas de control sin tratar, dos ratas
recuperadas tratadas con ACSF solo y cuatro ratas tratadas con
oligómero de NTR1-PNA). Las ratas sin tratar se
usaron para obtener los valores de control. Un día después del
tratamiento final, la región del hipotálamo de las ratas tratadas
con oligómero de NTR1-PNA expresaba el
40-50 por ciento menos sitios de unión a
[^{125}I]neurotensina que las ratas de control sin tratar.
Además de indicar que los oligómeros de PNA administrados
extracelularmente influyen en la expresión de un polipéptido
específico, estos resultados demuestran que los oligómeros de PNA
inyectados en la PAG difunden a través del tejido cerebral hasta el
hipotálamo, puesto que los oligómeros de NTR1-PNA
se inyectaron en la PAG y no en el hipotálamo.
Se inyectó una solución que contenía 3 mg/kg de
peso corporal de oligómeros de NTR1-PNA en solución
salina directamente en la cavidad peritoneal de ratas
Sprague-Dawley macho (200-250 g).
Cada rata recibió una sola inyección el día cero y el volumen
inyectado era de aproximadamente 200 \mul. Los controles incluían
ratas que no recibieron inyecciones y que recibieron inyecciones de
solución salina solamente. Cada día después de la inyección, las
ratas se analizaron para respuestas antinociceptivas y de hipotermia
mediadas por NT. La Figura 3 representa el MPE y la BT como un
porcentaje de la respuesta basal para la exposición a NT. Se
midieron las respuestas basales de animales de control que no
recibían inyecciones y se ajustaron a 100. No obstante, las ratas
se canularon quirúrgicamente para permitir la administración de NT.
Un día después del tratamiento con oligómeros de
NTR1-PNA, las ratas eran incapaces de responder a la
exposición a NT. Esta incapacidad para responder a la exposición a
NT era idéntica a la incapacidad observada a partir de las
inyecciones en PAG y se atribuye a una reducción en los receptores
de NT. Además, la Figura 4 representa el MPE y la BT como un
porcentaje de las respuestas basales para ratas tratadas con
NTR1-PNA expuestas a NT, así como ratas tratadas
con solución salina solamente expuestas a NT el día 1. Sólo las
ratas tratadas con oligómeros de NTR1-PNA
presentaban una ausencia de sensibilidad a NT, como se determina por
las respuestas de antinocicepción y de hipotermia mediadas por NT.
Por lo tanto, los oligómeros de NTR1-PNA
administrados por vía extracraneal eran capaces de atravesar la BHE
y la membrana plasmática de las células para influir específicamente
en la expresión y, por lo tanto, en la función de los receptores de
NT en el cerebro.
Además de determinar la influencia de los
oligómeros de NTR1-PNA administrados
extracranealmente sobre la antinocicepción y la hipotermia, se
determinaron los efectos de estos oligómeros sobre los sitios de
unión a NT fuera del sistema nervioso central.
Se realizaron ensayos de unión usando
procedimientos similares a los descritos en otro sitio (Kitabgi P. y
col., Peptides 5: 917-923 (1984) y Ahmad S. y col.,
Biochim et Biophys Acta 896: 224-238 (1987)).
La Tabla II contiene los resultados de un ensayo
de unión a [^{125}I]neurotensina usando preparaciones de
membrana de intestino delgado (yeyuno e íleon) de ratas tratadas con
NTR1-PNA y no tratadas. El tejido de intestino
delgado se extrajo de las ratas 1 día después de recibir una sola
inyección i. p. de oligómeros de NTR1-PNA, como se
ha descrito anteriormente. Se usaron ratas sin tratar para obtener
valores de control para el porcentaje de dpm de control y el
porcentaje de receptores de control (fmol/mg). Por lo tanto, los
valores para ratas sin tratar se ajustaron al 100 por cien. Un día
después del tratamiento, el tejido de intestino delgado de ratas
tratadas con NTR1-PNA expresaba el 98 por ciento
menos de sitios de unión a [^{125}I]neurotensina que las
ratas sin tratar, indicando que los oligómeros de
NTR1-PNA administrados extracranealmente engendran
una respuesta biológica tanto en el cerebro como en la periferia
(células del intestino delgado). Estos resultados indican que la
administración extracraneal de oligómeros de PNA puede engendrar
sistémicamente una respuesta biológica específica de secuencia.
Ejemplo
2
La morfina (MOR) produce una respuesta
antinociceptiva potente sensible a naloxona en animales. Esta
respuesta antinociceptiva está mediada por receptores de MOR. Los
oligómeros de PNA que tienen especificidad de secuencia por el
receptor de mu-1 (MU1R-PNA) se
diseñaron y se sintetizaron como se ha descrito anteriormente. Los
oligómeros de MU1R-PNA constan de 14 unidades, que
tienen una secuencia antisentido que se corresponde con
aproximadamente -50 pb desde el sitio de inicio de la región
codificante del receptor de mu-1 recombinante. Por
lo tanto, el MU1R-PNA no tiene especificidad de
secuencia por la región codificante del gen del receptor de
mu-1, sino que tiene especificidad de secuencia por
una secuencia cadena arriba que se supone está implicada en la
regulación de la expresión de los receptores de
mu-1. Además, no se ha predicho que esta región
tenga un alto grado de estructura secundaria a nivel del ARNm. La
secuencia de MU1R-PNA es
5'-CAGCCTCTTCCTCT-3' (SEC ID Nº: 2).
Se inyectaron oligómeros de MU1R-PNA en la región
de PAG de ratas canuladas, como se ha descrito anteriormente.
La inyección de MOR en ratas produce una potente
respuesta antinociceptiva. Esta respuesta está mediada por
receptores de MOR específicos y se inhibe por la naloxona. Se
concibió y usó un ensayo de coletazo de la cola muy sensible y
fiable para medir los efectos antinociceptivos de MOR (D'Amour F. E.
y Smith D. L, J. Pharm. Exp. Therap. 72: 74-79
(1941)).
Se analizaron ratas tratadas con
MU1R-PNA, NTR1-PNA y ACSF, así como
ratas sin tratar usando el ensayo de coletazo de la cola específico
de MOR. Un día después del último tratamiento, cada rata se analizó
de la forma siguiente. Treinta minutos antes del ensayo, se realizó
una medición de la latencia previa al fármaco por colocación de la
cola de la rata inmovilizada en aceite mantenido a una temperatura
de 60ºC y registro del tiempo transcurrido antes de que la rata dé
un coletazo con su cola. Después de realizar esta medición, se
inyectó una dosis apropiada de MOR (5 mg/kg de peso corporal) a un
volumen de aproximadamente 200 \mul i. p. Treinta minutos después
de la administración de MOR, la cola de la rata inmovilizada se
colocó de nuevo en el aceite mantenido a 60ºC y se midió la
latencia entre el momento en el que se colocaba la cola en el
aceite y el momento en el que la rata daba un coletazo con su cola.
Una falta de respuesta en 12 segundos daba como resultado la
retirada de la cola de la rata para evitar daños tisulares y la
asignación de esa latencia. Los ensayos de coletazo de la cola se
puntuaron como el porcentaje de MPE y se calcularon usando la
siguiente ecuación: %MPE = [(latencia postfármaco - latencia
prefármaco)/(límite - latencia prefármaco)] x 100; donde el límite
era de 12 segundos. Las ratas de control sin tratar eran sensibles a
MOR y presentaban un cambio significativo dentro del ensayo de 12
segundos de tiempo del 86% \pm 5,2% MPE de media. Esta media para
ratas de control sin tratar se usó para ajustar el valor del MPE
basal a 100. Todas las situaciones de ensayo se compararon con este
valor de respuesta basal obtenido de controles sin tratar sensibles
a MOR. Para ensayar la significación, se analizaron los datos
usando el ensayo t de Student, considerándose significativo p <
0,05.
La Figura 5 representa la respuesta de MPE a la
exposición a MOR como un porcentaje de la respuesta basal para
ratas tratadas con oligómeros de MU1R-PNA, como se
ha descrito anteriormente. Cada rata recibió tres inyecciones de
oligómeros de MU1R-PNA los días -4, -2 y 0. El valor
del 100 por cien el día cero se obtuvo de ratas de control sin
tratar, mientras que las ratas tratadas con MU1R-PNA
se analizaron por primera vez un día después de la última inyección
el día cero. La respuesta antinociceptiva mediada por MOR se redujo
significativamente el día uno después del tratamiento con
MU1R-PNA y permaneció significativamente reducida
hasta el día doce. La sensibilidad a la exposición a MOR volvió
gradualmente a la normal después del día doce.
La Figura 6 es un gráfico de barras que
representa el efecto específico de secuencia del tratamiento con
oligómero de MU1R-PNA. La respuesta de MPE a la
exposición a MOR como porcentaje de la respuesta basal se determinó
para cada tipo de tratamiento. Los valores de MPE obtenidos de ratas
a las que se inyectó ACSF solamente y expuestas a MOR eran
equivalentes a las respuestas basales. Estos animales eran
completamente sensibles a la exposición a MOR, no presentando
reacción al dolor. Las ratas a las que se inyectaron oligómeros de
MU1R-PNA, sin embargo, presentaban una escasa
respuesta a la exposición a MOR. De hecho, la respuesta de coletazo
de la cola a la exposición a MOR para ratas tratadas con
MU1R-PNA era del 20 al 40% de la respuesta basal.
Como control para indicar la naturaleza específica de secuencia de
la influencia del oligómero de PNA sobre esta respuesta biológica,
se analizó la sensibilidad a MOR de ratas a las que se inyectaron
oligómeros de NTR1-PNA. Los valores de MPE
obtenidos de ratas a las que se inyectaron oligómeros de
NTR1-PNA y expuestas a MOR eran indistinguibles de
las respuestas basales, indicando que los oligómeros de
MU1R-PNA engendran una respuesta biológica de una
forma específica de secuencia. Como otro control, se analizaron
ratas a las que se inyectaron los oligómeros de
MU1R-PNA para sensibilidad a NT usando el ensayo de
placa caliente descrito anteriormente, así como medición de la
hipotermia. Las respuestas de MPE y BT para ratas tratadas con
oligómeros de MU1R-PNA y expuestas a NT eran
similares a los valores de respuesta basal, indicando de nuevo la
especificidad de los oligómeros de MU1R-PNA.
Se inyectó una solución que contenía 3 mg/kg de
peso corporal de oligómeros de MU1R-PNA en solución
salina directamente en la cavidad peritoneal de ratas
Sprague-Dawley macho (200-250 g).
Cada rata recibió una sola inyección el día cero y el volumen
inyectado era de aproximadamente 200 \mul. Los controles incluían
ratas que no recibieron inyecciones y que recibieron inyecciones de
solución salina solamente. Cada día después de la inyección, las
ratas se analizaron para antinocicepción mediada por MOR. La Figura
7 representa la respuesta de MPE a la exposición a MOR como un
porcentaje de la respuesta basal. Se midieron las respuestas basales
a partir de animales de control que no recibieron inyecciones y se
ajustaron a 100. Un día después del tratamiento con oligómeros de
MU1R-PNA, las ratas eran incapaces de responder a la
exposición a MOR. Esta incapacidad para responder a la exposición a
MOR era idéntica a la incapacidad observada a partir de las
inyecciones en la PAG y se atribuye a una reducción en los
receptores de mu-1. Además, la Figura 8 representa
la respuesta de MPE a la exposición a MOR para ratas tratadas con
MU1R-PNA, así como ratas tratadas con solución
salina solamente el día 1. Sólo las ratas tratadas con oligómeros
de MU1R-PNA presentaban una ausencia de sensibilidad
a MOR, como se determinaba por la respuesta antinociceptiva de
coletazo de la cola a MOR. Por lo tanto, los oligómeros de
MU1R-PNA administrados extracranealmente eran
capaces de atravesar la BHE y la membrana plasmática de células
para influir específicamente en la expresión y, por lo tanto, en la
función de los receptores de mu-1 de una forma
específica de secuencia en el
cerebro.
cerebro.
Para determinar la tasa de renovación relativa
de receptores NTR1 y mu-1 funcionales, se realizó
una comparación entre las respuestas biológicas influenciadas en
ratas por la administración de oligómeros NTR1-PNA y
MU1R-PNA. Las respuestas de MPE (placa caliente) y
BT para ratas tratadas con oligómeros de NTR1-PNA y
expuestas a NT se compararon con la respuesta de MPE (coletazo de
la cola) para ratas tratadas con oligómeros de
MU1R-PNA y expuestas a MOR (Figura 9). Cada rata
recibió tres inyecciones en la PAG de oligómeros de
NTR1-PNA o MU1R-PNA los días -4, -2
y 0. Los valores del 100 por cien el día cero se obtuvieron de ratas
de control sin tratar mientras que las ratas tratadas con
NTR1-PNA y MU1R-PNA se analizaron
por primera vez un día después de la última inyección el día 0.
Puesto que el tiempo necesario para la que sensibilidad a MOR vuelva
a la normal es superior al tiempo necesario para que la
sensibilidad a NT vuelva a la normal, los receptores de
mu-1 parecen tener una tasa de renovación relativa
menor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se diseñaron y sintetizaron oligómeros de PNA
que tienen especificidad de secuencia por el transportador de
serotonina de la membrana plasmática de rata
(SERT-PNA), mediante procedimientos manuales como se
describen en la presente memoria. Los oligómeros de
SERT-PNA constan de 12 unidades que tienen una
secuencia antisentido que se corresponde con aproximadamente 310 pb
cadena abajo del sitio de inicio de la región codificante del
transportador de serotonina de la membrana plasmática recombinante.
Además, se ha predicho que esta región tiene un alto grado de
estructura secundaria a nivel de ARNm. La secuencia de
SERT-PNA es
5'-GCCAGATGTTGC-3' (SEC ID Nº:
3).
La serotonina
(5-hidroxitriptamina; 5-HT) es un
neurotransmisor de monoamina que está empaquetado en compartimentos
vesiculares, de tal modo que puede regularse su liberación en la
sinapsis. Una vez liberada, la serotonina puede unirse a sus
receptores postsinápticos y presinápticos. Después, puede
transportarse de nuevo hacia la neurona presináptica mediante
transportadores de serotonina de la membrana plasmática. Dentro de
la terminación nerviosa, la serotonina puede volver a empaquetarse
para una liberación posterior o degradarse mediante la monoamina
oxidasa (MAO) en su metabolito, el ácido
5-hidroxiindol-3-acético
(5-HIAA). Por lo tanto, la serotonina rara vez se
acumula en la hendidura sináptica y se mantiene la elevada fidelidad
de los mecanismos de señalización química. Sin embargo, puede
producirse un exceso extraneuronal de serotonina por administración
de fármacos que impiden la degradación de la serotonina, tales como
un inhibidor de la MAO, o la recaptación de la serotonina, tales
como fluoxetina. En ratas, la administración de estos fármacos da
como resultado una hiperactividad estereotipada. Otras
características del exceso de serotonina en ratas incluyen abducción
de las extremidades posteriores, balanceo lateral de la cabeza,
temblores, rigidez, cola de Straub, hiperreactividad, piloerección
y salivación. También se han señalado sacudidas del tronco, caminar
compulsivo en círculos y ataxia de las extremidades posteriores. La
combinación de fármacos antidepresivos tales como un inhibidor de la
MAO con un inhibidor del transporte de serotonina de la membrana
plasmática da como resultado un resultado potencialmente mortal
denominado "síndrome serotoninérgico".
Para ensayar la capacidad de oligómeros de
SERT-PNA para engendrar una respuesta biológica, por
ejemplo, una reducción de la expresión del transportador de
serotonina de la membrana plasmática, se administraron oligómeros
de SERT-PNA a ratas con y sin tranilcipromina (TCP),
un inhibidor de la MAO. La combinación sería como combinar un
inhibidor de la recaptación selectiva de serotonina (SSRI), tal como
fluoxetina, con un inhibidor de la MAO, causando un exceso de
serotonina extraneuronal y conduciendo a consecuencias conductuales
fácilmente medibles, tales como la hiperactividad y el síndrome
serotoninérgico. Por lo tanto, cualquier resultado observado para
ratas que reciben oligómeros de SERT-PNA más TCP que
sea similar a los resultados observados para ratas tratadas con
fluoxetina más TCP indicaría que los oligómeros de
SERT-PNA reducen específicamente la recaptación de
serotonina por reducción de la expresión del transportador de
serotonina de la membrana plasmática.
Se inyectó una solución que contenía 5 mg/kg de
oligómeros de SERT-PNA en solución salina
directamente en la cavidad peritoneal de ratas
Sprague-Dawley macho (200-250 g).
Cada rata recibió una sola inyección el día cero y el volumen
inyectado era de aproximadamente 200 \mul. Los controles incluían
ratas que recibieron inyecciones de solución salina solamente e
inyecciones de TCP solamente.
Para controlar la hiperactividad, se usó una
cámara de actividad
Opto-Varimex-Minor (Columbus
Instruments, Columbus, OH). En resumen, esta cámara de actividad
registra el número de veces que un animal interrumpe un haz
infrarrojo mientras está en una cámara de 42 cm por 42 cm. Se
anotaron otros signos de hiperactividad por observación a simple
vista.
Como un control positivo, se inyectaron ratas
previamente sin tratar por vía intraperitoneal con 15 mg/kg de TCP
seguido de, 30 minutos después, 10 mg/kg de fluoxetina (n = 2) y se
controlaron. Típicamente, estas ratas presentaban una
hiperactividad extrema a los 60 minutos del tratamiento con
fluoxetina. Las ratas (n = 3) inyectadas por vía intraperitoneal
con 5 mg/kg de oligómeros de SERT-PNA y a las que
después se inyectaron 15 mg/kg de TCP 48 horas después también
presentaban una hiperactividad extrema a los 10 minutos del
tratamiento con TCP. Además, estas ratas presentaban balanceo de la
cabeza, manoseo con las patas delanteras, temblores corporales,
movimiento en círculos, sacudidas del tronco, hiperreactividad y
ataxia de las extremidades posteriores. Por lo tanto, el
tratamiento de combinación de SERT-PNA más TCP da
como resultado una respuesta biológica equivalente a la respuesta
biológica observada después del tratamiento con fluoxetina más
TCP.
Las ratas de control, ratas tratadas sólo con
TCP 15 mg/kg, no presentaron la hiperactividad extrema observada en
las ratas tratadas con TCP más fluoxetina o con oligómero de
SERT-PNA más TCP. Sin embargo, los animales
tratados sólo con TCP presentaron un breve periodo de
hiperactividad. El nivel de esta hiperactividad inducida sólo por
TCP era sustancialmente y sistemáticamente menor que los niveles de
hiperactividad observados en los controles positivos. La Figura 10
es un gráfico de un experimento representativo que representa el
aumento rápido sobre la actividad basal para animales tratados
previamente con oligómeros de SERT-PNA, a los que
después se les administró TCP. La actividad basal se determinó
mediante el control del animal, después de un periodo de
habituación de 60 minutos, durante 30 minutos antes de la
administración. Los animales tratados con TCP solo inicialmente
presentaban un ligero aumento en la actividad que se disipaba
rápidamente. Además, estos animales solo presentaban balanceo de la
cabeza y salivación aumentada y ninguno de los otros signos
conductuales atribuidos al exceso de serotonina. En su conjunto,
estos resultados indican que la expresión del transportador de
serotonina de la membrana plasmática se redujo por la administración
extracraneal de oligómeros de PNA antisentido para este
polipéptido.
\newpage
Ejemplo
4
A nueve ratas, con cánulas cerebrales
implantadas quirúrgicamente como se describe en el Ejemplo 1, se les
administraron 10 mg/kg de oligómeros de NTR1-PNA
mediante intubación gástrica. En resumen, se colocó una sonda
gástrica en el estomago a través de la boca y se administraron 500
\mul de oligómeros de NTR1-PNA en solución
salina. Doce horas después, cada rata recibió una inyección de NT
directamente en el cerebro y se ensayó para las respuestas
hipotérmica y antinociceptiva a NT, como se describe en el Ejemplo
1. Las respuestas a NT se suprimieron completamente (8/9) o se
suprimieron casi completamente (1/9) en estos animales. La Figura 11
representa las respuestas de MPE y BT a la exposición a NT como un
porcentaje de la respuesta basal para ratas tratadas por vía oral
con oligómeros de NTR1-PNA. Doce horas después de
recibir una sola administración oral de oligómeros de
NTR1-PNA, las ratas no respondieron en absoluto a la
exposición a NT (p < 0,05 para MPE; p < 0,001 BT). Esta
ausencia total de sensibilidad a NT continuó durante al menos 48
horas después del tratamiento oral individual con oligómero de
NTR1-PNA.
Estos animales se sacrificaron y sus cerebros y
tejido intestinal se extirparon para análisis de sitios de unión a
NT.
Además de determinar la influencia de los
oligómeros de NTR1-PNA administrados por vía oral
sobre la antinocicepción y la hipotermia, se determinaron los
efectos de estos oligómeros sobre los sitios de unión a NT usando el
ensayo de unión a receptores de NT descrito en el Ejemplo 1.
La Tabla III contiene los resultados de varios
ensayos de unión a [^{125}I]neurotensina realizados usando
tejido de PAG, hipotálamo e intestino delgado de las mismas ratas
examinadas conductualmente después del tratamiento oral con
oligómeros de NTR1-PNA. La expresión de sitios de
unión a NT en tejido de PAG, hipotálamo e intestino delgado se
redujo espectacularmente 24 horas después de la administración oral
de 10 mg/kg de oligómeros de NTR1-PNA. De hecho, el
50 por ciento de los sitios de unión a NT se redujo en la PAG y el
hipotálamo, mientras que los sitios de unión a NT en el intestino
delgado se suprimieron completamente. Las afinidades de unión a NT
para cada condición de ensayo eran estadísticamente equivalentes,
indicando que el número reducido de sitios de unión a NT no es el
resultado de un artefacto experimental asociado con los ensayos de
unión o con una falta de actividad de los sitios de unión a NT
presentes. Además, la adición de un exceso de oligómeros de
NTR1-PNA a homogeneizados de cerebro usados en
ensayos de unión no cambió estos resultados, indicando que la sola
presencia de oligómeros de PNA no afecta a los ensayos de unión. De
una forma interesante, la administración oral de 10 mg/kg de
oligómeros de NTR1-PNA redujo los sitios de unión a
NT en la PAG y el hipotálamo en un grado mayor que la
administración intraperitoneal de 3 mg/kg del mismo oligómero de PNA
(Véase el Ejemplo 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La síntesis de oligómeros de PNA se realizó por
medio de síntesis en fase sólida. El procedimiento usado es el
siguiente:
En general, la resina de
Fmoc-PAL-PEG-PS
(Fmoc-enlazador de amina
peptídica-polietilenglicol-poliestireno)
se lavó e hinchó. La resina y todos los monómeros de PNA tenían un
grupo Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo; véase la
Figura 12) unido a los extremos amino. Este grupo protector Fmoc se
eliminó inmediatamente antes de la adición de un monómero y al
final de la síntesis. El primer monómero de PNA formaba un enlace
amida con la resina y los monómeros de PNA posteriores formaban el
enlace amida con el grupo amino terminal de la cadena en
crecimiento. A cualquier extremo amino libre que no reaccionara con
un monómero se le añadía una caperuza con un grupo acetilo para
evitar que se formaran secuencias de PNA no deseadas o que se
produjeran otras reacciones. El Ensayo de Kaiser detectaba si
todavía estaba presente cualquier grupo amino. Si el Ensayo de
Kaiser era negativo, entonces se eliminaba el siguiente grupo Fmoc.
Los monómeros de adenina, citosina y guanina tenían grupos Bhoc
(benzhidriloxicarbonilo; Figura 12) protegiendo las aminas primarias
en las bases. Después de que se sintetizaba la secuencia de PNA
deseada, el PNA se escindía de la resina, momento en el que también
se eliminaban los grupos protectores Bhoc restantes. Después, el PNA
se precipitaba y se purificaba pronto después. La síntesis tuvo
lugar en el recipiente de reacción sinterizado, representado en la
Figura 13, de tal modo que la mezcla de reacción se agitó mediante
burbujeo de nitrógeno, así como agitación del recipiente en un
agitador mecánico. El procedimiento explícito para el ciclo de
síntesis de Fmoc-PNA era el siguiente.
Para preparar la resina, se colocaron 300 mg (50
\mumol de los grupos amino disponibles) de la resina de
Fmoc-PAL-PEG-PS en
el recipiente de reacción y se lavaron cuatro veces con 8 ml de
diclorometano (DCM). Después, el recipiente y la resina se secaron
sobre pentóxido de fósforo (P_{2}O_{5}) a alto vacío durante una
hora o una noche. La resina se hinchó en 7 ml de
1-metil-2-pirrolidinona
(NMP) y se burbujeó/agitó durante diez minutos. Después, el
disolvente se desecó al vacío.
El grupo Fmoc se eliminó de la resina de
Fmoc-PAL-PEG-PS por
adición de 4 ml de piperidina al 20%/NMP (Pip/NMP),
burbujeo/agitación durante diez minutos y después desecado del
disolvente al vacío. La resina se lavó dos veces con
N,N-dimetilformamida (DMF), transcurriendo un minuto por
lavado. Se añadieron otros 4 ml de Pip al 20%/NMP, se
burbujeó/agitó durante 10 minutos y se desecó. La resina se lavó
cinco veces con 4 ml de una mezcla 1:1 de DCM y DMF. La resina
estaba ahora lista para la adición del primer monómero de PNA.
Antes de que se añadiera un monómero a la
resina, el grupo carboxilo del monómero se "activaba" usando
hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HATU), diisopropiletilamina (DIPEA) y 2,6-lutidina.
Se descubrió que las cantidades optimizadas de cada uno eran de 200
\mumol (cuatro equivalentes) para los 300 mg de resina, como se
indica en la Tabla IV. Las estructuras de los monómeros de PNA se
representan en la Figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
El monómero de PNA y HATU se colocaron en un
vial Eppendorf y se añadieron 1,4 ml de NMP. La mezcla resultante
se agitó vorticialmente hasta que ambos se disolvieron. Después, se
añadieron DIPEA y 2,6-lutidina y el vial se agitó
de nuevo. La solución se transfirió al recipiente de reacción y se
burbujeó/agitó durante veinticinco minutos. Después, la resina se
lavó cinco veces con 4 ml de DCM/DMF 1:1 cada vez.
Se preparó una solución de adición de caperuzas
por mezcla de 45 ml de DMF, 3 ml de 2,6-lutidina y
2,5 ml de anhídrido acético. Se añadieron seis ml de la solución de
adición de caperuzas a la resina y se burbujeó/agitó durante diez
minutos. Esta solución acetila y bloquea cualquier extremo amino que
pueda no haber reaccionado con el monómero, impidiendo de este modo
adiciones posteriores en los extremos amino. Esta adición de
caperuzas reduce las ocasiones de producir oligómeros de PNA de
longitudes variables y además aumenta la pureza y cantidad del
producto final. Después de la etapa de adición de caperuzas, la
resina se lavó cinco veces con alícuotas de 4 ml de DMF.
Después de cada adición de caperuzas, se realizó
el Ensayo de Kaiser para revisar si existían extremos amino libres.
Se retiraron unas pocas perlas del recipiente de reacción y se
colocaron en un pequeño tubo de vidrio de borosilicato. Se
añadieron dos gotas de fenol/etanol al 76% p/p al tubo. Después de
añadir el fenol/etanol, se añadieron cuatro gotas de cianuro de
potasio 0,0002 M/piridina y dos gotas de nihidrina 0,28 M/etanol.
El tubo se giró para mezclar la solución y después se calentó en un
bloque calentador ajustado a 100ºC durante cinco minutos. El tubo
se retiró y se observó el color de las perlas. Un color amarillo
indica la ausencia de extremos amino libres. Si se observa un color
morado/azul, se preparaba solución de adición de caperuzas fresca y
se repetía la etapa de adición de caperuzas. La experiencia ha
demostrado que con solución de caperuzas recién preparada, no es
necesario que se realice el Ensayo de Kaiser después de cada etapa,
sino que se realiza después de cada tercera adición de
monómeros.
En este punto, había un monómero de PNA unido a
la resina. Para añadir otro monómero, el grupo de Fmoc debe
eliminarse del monómero. Por lo tanto, el ciclo de síntesis de PNA
se repitió con la eliminación de Fmoc, seguida de acoplamiento,
adición de caperuza y de nuevo eliminación de Fmoc.
Después de que se añadiera el último monómero,
el Fmoc se eliminó y la resina se lavó con una mezcla de DCM/DMF
1:1 como anteriormente. Después, la resina se lavó secuencialmente
cinco veces con 4 ml de DCM y cinco veces con 4 ml de metanol. La
resina y el recipiente de reacción se secaron durante una noche en
un liofilizador.
Se preparó una solución de escisión con 1,2 ml
de m-cresol recién destilado y 4,8 ml de ácido
trifluoroacétio (TFA). Se añadieron seis ml de la solución de
escisión al recipiente de reacción seco y se burbujeó/agitó durante
dos horas. La velocidad de flujo de nitrógeno para el burbujeo debe
ser lenta, de tal modo que el TFA no se evapore demasiado
rápidamente (es decir, antes de las dos horas de la etapa de
burbujeo/agitación). Ocasionalmente, se añadía TFA adicional para
mantener el volumen de la solución de escisión. Después de dos
horas, la solución de escisión se desecó en un matraz para filtrado
con brazo lateral de 125 ml. La resina se lavó dos veces con 5 ml
de TFA vaciándose los lavados en el matraz. Se burbujeó nitrógeno en
el matraz a una velocidad rápida para evaporar todo el TFA. Se
colocó un matraz de Dewar pequeño relleno con agua ligeramente por
encima de la temperatura ambiente alrededor del matraz para filtrado
para proporcionar un recipiente caliente para la evaporación del
TFA.
Se añadió al matraz para filtrado éter recién
destilado (45 ml), enfriado a -20ºC, para precipitar el PNA al
tiempo que se agitaba vorticialmente. Si el precipitado no parecía
muy granular, el matraz se colocaba en un congelador a -20ºC
durante treinta minutos. Después, el precipitado se centrifugó a
3000 rpm durante tres minutos. Después de decantar, esta etapa se
repitió dos veces más. El precipitado se secó a alto vacío durante
quince minutos.
Después, el oligómero de PNA se purificó
mediante HPLC de fase inversa en una columna Vydac (2,2 cm x 25 cm)
C_{8} con un gradiente de elusión desde B al 5% hasta B al 100% en
100 minutos (disolvente A = TFA al 0,1%; disolvente B =
acetonitrilo al 80% en TFA acuoso al 0,1%; caudal = 8 ml/min;
\alpha_{máx} = 260 nm).
Se recogieron las fracciones que contenían
oligómeros de PNA por liofilización y se almacenaron en forma seca
a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Para determinar la distribución tisular de
oligómeros de PNA después de la administración, se realizaron los
siguientes experimentos. Se administraron oligómeros de PNA a ratas,
se recuperaron de tejidos seleccionados después de la
administración y se cuantificaron. Las muestras concentradas de
oligómeros de PNA, logradas durante la síntesis, se cuantifican
fácilmente mediante espectrometría UV. No obstante, este
procedimiento puede no ser suficientemente sensible para detectar
concentraciones femtomolares de oligómeros de PNA que pueden
encontrarse en el plasma de animales después de la administración
oral o en el cerebro después de la administración intravenosa. Por
lo tanto, se usan equipos analíticos tales como HPLC acoplada con un
detector de fluorescencia activado por láser que pueden detectar
potencialmente concentraciones sub-attomolares
(10^{-18} mol) con gran sensibilidad, para medir formas no
radiactivas de oligómeros de PNA. Esta es la estrategia más simple
y más directa para medir oligómeros de PNA no modificados
directamente. Los procedimientos alternativos de detección de
oligómeros de PNA incluyen el uso de formas radiactivas o
fluorescentes de oligómeros de PNA. No obstante, la modificación de
un oligómero de PNA para mejorar la facilidad de detección puede
alterar la permeabilidad de la membrana plasmática o de la BHE, así
como la capacidad de un oligómero de PNA para unirse a ácidos
nucleicos complementarios. Por lo tanto, cada oligómero de PNA
modificado se ensaya para determinar su funcionalidad antes de
realizar experimentos de distribución tisular. En resumen, se
administran oligómeros de PNA modificados a una rata y se ensayan
para determinar su capacidad para engendrar una respuesta biológica,
como se describe en la presente memoria.
Se sintetizan oligómeros de PNA no modificados
mediante procedimientos automatizados o manuales. La síntesis
manual proporciona generalmente aproximadamente de 5 a 10 veces
mayores cantidades de oligómeros de PNA que la síntesis
automatizada. Los oligómeros de PNA no modificados se modifican para
producir oligómeros de PNA radiactivos o fluorescentes si es
necesario.
Los oligómeros de PNA se sintetizan con
monómeros de
Fmoc-N-(2-aminoetil)glicil-PNA
en un sintetizador de ácidos nucleicos Expidite 8909, de acuerdo
con la química y los protocolos desarrollados por el fabricante
(PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA). Las aminas
exocíclicas de las bases de adenina, guanina y citosina de cada
monómero de Fmoc-PNA se protegen con el grupo
bloqueante benzhidriloxicarbonilo (Bhoc). La síntesis de los
oligómeros de PNA (2 x 2 \mumol) es en resina de enlazador de
poliamida
(PAL)-polietilenglicol-poliestireno
(PerSeptive Biosystems, Inc.), que produce un grupo carboxamida
(CONH_{2}) en el extremo COOH-terminal (3').
Después de la síntesis, el PNA se desprotege y se retira de la
resina por tratamiento con una mezcla de ácido trifluoroacético al
80% (TFA) que contiene m-cresol al 20% durante 90
minutos a 22ºC. Después, el oligómero de PNA se precipita en éter
dietílico y se purifica mediante cromatografía líquida de alto
rendimiento de fase inversa en una columna Vydac C_{18} a 60ºC
con un tampón de TFA acuoso al 0,1% y un gradiente lineal de TFA al
0,1% que contiene acetonitrilo al 80%/ agua al 20%. Se recoge un
pico principal (a A_{300} nm), se liofiliza y se verifica para su
peso en masa correcto mediante espectrometría de masas de ionización
por electropulverización en un espectrómetro de masas Sciex API
165B (Perkin-Elmer, Foster City, CA).
Se sintetizan oligómeros de PNA en una escala de
50 \mumol en resina de PS-PEG-PAL
(PerSeptive Biosystems) usando 4 equivalentes de cada uno de HATU
(hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio),
diisopropiletilamina y 2,6-lutidina como agentes
activador de carboxilo y 4 equivalentes de los monómeros de PNA
protegidos (PerSeptive Biosystems). Los monómeros usados en la
síntesis son derivados
Fmoc-2-aminoetilglicina de
9N-carboximetil-N6-benzhidriloxiadenina,
9N-carboximetil-N2-benzhidriloxiguanina,
1N-carboximetiltimina y
1N-carboximetil-4N-benzhidriloxicitosina.
El grupo Fmoc se elimina con piperidina al 20% en
N-metilpirrolidinona y el desbloqueo de los grupos Bhoc y la
retirada del oligómero de PNA se llevan a cabo en un recipiente por
tratamiento del PNA unido a la resina con ácido
trifluoroacético/m-cresol (4:1 v/v). Los oligómeros
de PNA brutos se purifican mediante HPLC (columna preparativa de
Vydac, C-8, tamaño de partícula de 10 \mum, 22 x
250 mm) con un gradiente de elución de B al 5% a B al 100% en 100
minutos (disolvente A = TFA al 0,1%; disolvente B = acetonitrilo al
80% en TFA al 0,1%; caudal = 8 ml/minuto; detección UV a 260 nm). Se
verificó el peso en masa correcto como para la síntesis automática
descrita anteriormente.
Para detectar oligómeros de PNA administrados
por vía intravenosa en sangre, se prepararon ratas
Sprague-Dawley (machos de 200 g) por canulación de
la vena yugular con un tubo de silicona bajo anestesia ligera con
éter, de acuerdo con procedimientos bien establecidos. Se
disolvieron oligómeros de PNA no modificados, tales como
NTR1-PNA, MU1R-PNA o
SERT-PNA, en solución de cloruro de sodio isotónica
y la dosis apropiada (por ejemplo, 0,2 mg/kg) se administra en la
vena yugular como una dosis embolada. Se extrajeron muestras de
sangre (aproximadamente 0,3 ml) a través de la cánula a los 10, 20,
30, 40, 60, 90, 120, 150, 180 y 240 minutos después de la
administración en tubos heparinizados y se centrifugaron a 3.000
RPM durante 10 minutos. Después, se recogió el plasma y se preparó
para análisis por HPLC. Se usaron un total de cuatro ratas en cada
nivel de dosis. La concentración frente a los datos de tiempo
generados se someten a un análisis farmacocinético no lineal de
acuerdo con un modelo apropiado (por ejemplo, modelo de uno o de
dos compartimentos) usando WinNonlin^{TM} o el paquete
farmacocinético MPK y se calculan los diversos parámetros
farmacocinéticos (por ejemplo, \alpha, \beta, k_{12},
k_{21,} k_{10}, V_{C,} V_{\beta}, V_{ss}, aclaramiento
total, área bajo la curva (AUC), tiempo de permanencia medio,
etc.).
Se realizaron experimentos similares para
detectar oligómeros de PNA administrados por vía oral en sangre. En
este caso, se administran oligómeros de PNA no modificados por
intubación gástrica (administración oral) y las muestras se recogen
y se analizan como se ha descrito anteriormente. Además, se
determina la velocidad y el grado de absorción de oligómeros de PNA
en el tracto gastrointestinal para oligómeros de PNA administrados
por vía oral. Se calcula la biodisponibilidad absoluta de oligómeros
de PNA a partir de la proporción del logaritmo de la
AUC_{(0-\infty)} de la administración oral con respecto al
logaritmo de la AUC_{(0-\infty)} de la infusión intravenosa. Los
antilogaritmos de esta proporción representan la biodisponibilidad
absoluta.
Además de sangre, se analizan otros tejidos
tales como cerebro e hígado para determinar la presencia de
oligómeros de PNA no modificados. El tiempo de muestreo más
apropiado para examinar tejidos seleccionados es desde que se logra
una C_{máx} (concentración máxima de oligómeros de PNA) en la
sangre hasta aproximadamente cinco veces el t_{1/2} (semivida).
Otros tiempos de muestreo son los tiempos en los que se observan los
efectos conductuales y bioquímicos máximos del oligómero de PNA. En
resumen, rápidamente se extraen por disección regiones íntegras
(por ejemplo corteza frontal, cerebelo), se colocan en hielo y se
trituran. Después, el tejido triturado se prepara para el análisis
por HPLC para detectar la presencia de oligómeros de PNA. El
sistema de elución de HPLC es el mismo que se escribe en la presente
memoria para la síntesis de oligómeros de PNA.
Además, se analiza la entrada de oligómero de
PNA en el cerebro, así cómo la acumulación de serotonina como un
marcador bioquímico para la reducción de la expresión del
transportador de serotonina de la membrana plasmática (véase el
Ejemplo 7), usando mediciones en línea de microdiálisis in
vivo (Kalivas y col., J. Neurochem, 59: 961-967
(1991)). Aunque, potencialmente, la microsonda implantada podría
comprometer la BHE, la cicatrización alrededor de la microsonda
debería evitar la fuga de los oligómeros de PNA administrados
extracranealmente hacia el cerebro. Estas técnicas de microdiálisis
también son útiles para detectar oligómeros de PNA modificados,
tales como las formas radiactivas o fluorescentes de oligómeros de
PNA descritas a continuación.
Se realizan experimentos usando formas
radiomarcadas de oligómeros de PNA para determinar la distribución
tisular por medición de la radiactividad en un espectrómetro de
escintilación líquida. Se preparan oligómeros de PNA tritiados para
que tengan una facilidad de detección aumentada a partir de
oligómeros de PNA no modificados por intercambio de tritio. Este
procedimiento proporciona un compuesto con una actividad específica
de al menos 10 Ci/mmol. Como alternativa, se añade un grupo amino
en el extremo 5' de un oligómero de PNA no modificado. Después,
este grupo amino se metila hasta grados variables con CT_{3}I
(disponible de Amersham a 60-85 Ci/mmol) de la
forma siguiente para proporcionar derivados de oligómeros de PNA
monometilados, dimetilados y trimetilados tritiados que tengan una
actividad específica mínima de aproximadamente 60 Ci/mmol:
R^{1}R^{2}R^{3}N-PNA-CONH_{2}
Radiomarcador 1: R^{1} = CT_{3}; R^{2} =
H; R^{3} = H (menor actividad específica, átomo de N básico)
Radiomarcador 2: R^{1} y R^{2} = CT_{3};
R^{3} = H (actividad específica intermedia, átomo de N básico)
Radiomarcador 3: R^{1}, R^{2} y R^{3} =
CT_{3} (mayor actividad específica, átomo de N cuaternizado)
\vskip1.000000\baselineskip
Esta estrategia es particularmente útil porque
(a) la carga positiva en el átomo de nitrógeno permanece intacta;
(b) el nivel de actividad específica del oligómero de PNA es
ajustable, dependiendo del grado de metilación tritiada; y (c) la
perturbación estructural del oligómero de PNA después de la
metilación es mínima en comparación con el oligómero de PNA
nativo.
Una vez sintetizados y ensayados para determinar
su eficacia, los oligómeros de PNA tritiados se administran en
animales y se examina su distribución tisular. A diversos tiempos de
muestreo después de la administración, se sacrifican animales y se
extirpan rápidamente los tejidos seleccionados. Por ejemplo, se mide
la entrada de oligómeros de PNA en el cerebro por sacrificio de
animales y recogida de tejido cerebral. De nuevo, se extirpan
rápidamente por disección regiones íntegras (por ejemplo, corteza
frontal, cerebelo), se colocan en hielo y se trituran. Se preparan
fracciones de sobrenadante a partir del tejido triturado y se hace
un recuento de la radiactividad. Para verificar que los oligómeros
de PNA radiactivos recuperados tienen el mismo perfil de elución
que el compuesto administrado al animal, las muestras radiactivas
recuperadas se analizan por HPLC.
Otro procedimiento para detectar oligómeros de
PNA tritiados implica el uso de técnicas autorradiográficas ex
vivo. En resumen, se sacrifican ratas
Sprague-Dawley macho adultas por decapitación a
diversos tiempos después de la inyección de [^{3}H]PNA y
sus cerebros se congelan rápidamente en nieve carbónica. Se cortan
secciones coronales (20 micrómetros) en un criostato a -16ºC y se
montan en portaobjetos recubiertos con gelatina (Fisher Plus
Slides). Se procesan las películas radiográficas por yuxtaposición
de la sección radiomarcada a una película de Biomax MS con
pantallas intensificadoras de Biomax MS (Kodak). La exposición es
durante de varias semanas a meses a -80ºC. También se usa un equipo
potenciador, tal como el Cyclone^{TM} Storage Phosphor System
(Packard Instrument Co.), para aumentar la detección de la señal
radiactiva. Se usa un análisis de densidad óptica cuantitativo para
cuantificar la radiactividad usando el programa informático de NIH
Image funcionando en un ordenador Macintosh. A partir de estos
análisis, se determina el curso de tiempo para la entrada de
oligómeros de PNA radiactivos en el cerebro. Además, esta técnica
determina cualquier distribución regional única para oligómeros de
PNA
individuales.
individuales.
Se preparan oligómeros de PNA que tienen una
mayor actividad específica a partir de oligómeros de PNA no
modificados añadiendo químicamente un radiomarcador por iodinación.
En resumen, se añade un resto de tirosina en el extremo amino 5' de
un oligómero de PNA no modificado y se ensaya para determinar si
esta modificación influye en la capacidad del oligómero de PNA para
engendrar una respuesta biológica, tal como reducir la expresión
polipeptídica. Si la tirosina añadida no interfiere con la función
del oligómero de PNA, entonces el oligómero de PNA se modifica
adicionalmente por iodinación del resto de tirosina mediante
técnicas convencionales. Típicamente, este procedimiento de
radioiodinación proporciona un compuesto que tiene una actividad
específica de aproximadamente 2.000 Ci/mmol.
Una vez sintetizados y ensayados para determinar
su eficacia, los oligómeros de PNA iodinados, se administran en
animales y se examina su distribución tisular. Se realizan
experimentos similares a los experimentos descritos anteriormente,
pero en lugar de detectar tritio, los tejidos seleccionados se
ensayan para determinar la presencia de ^{125}I.
Se preparan oligómeros de PNA modificados que
tienen una facilidad de detección aumentada por adición de un
marcador fluorescente a oligómeros de PNA no modificados. En
resumen, se conjuga una fluoresceína o un grupo dansilo en el
extremo amino 5' de un oligómero de PNA no modificado. Después, este
oligómero de PNA modificado se ensaya para determinar su
funcionalidad y se usa para medir la distribución tisular después de
la administración, como se ha descrito anteriormente, entendiendo
que el procedimiento de detección implica detectar la presencia de
un marcador fluorescente, no de radiactividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Para determinar el curso de tiempo para el
comienzo y la recuperación de las respuestas biológicas engendradas
por oligómeros de PNA, se realizan los siguientes experimentos.
Estos experimentos se realizan para diversas vías de
administración, tales como intravenosa, intraperitoneal y oral.
Además, estos tipos de análisis conductuales, bioquímicos y
moleculares se realizan para oligómeros de PNA que se dirigen a
diferentes polipéptidos, así como para cada oligómero de PNA
diferente que se dirige al mismo polipéptido.
Para oligómeros de NTR1-PNA, se
mide la hipotermia y la antinocicepción (ensayo de placa caliente)
después de la exposición intracraneal con NT (18 nmol), como se
describe en el Ejemplo 1. En resumen, ratas a las que se les ha
implantado quirúrgicamente cánulas permanentes reciben una
administración de oligómeros de NTR1-PNA mediante
una vía particular. Estos animales se ensayan para la hipotermia y
la antinocicepción inducidas por NT a las 6, 12, 24 y 48 horas
después de la administración de oligómero de
NTR1-PNA, para determinar el curso de tiempo para
el comienzo de los efectos. También se ensayan periodos de tiempo
más largos y más cortos dependiendo de la respuesta.
Para oligómeros de MU1R-PNA, se
mide la antinocicepción (ensayo de coletazo de la cola) después de
la exposición intraperitoneal a MOR (5 mg/kg), como se describe en
el Ejemplo 2. También se mide la antinocicepción mediada por MOR
usando el ensayo de placa caliente que se describe en el Ejemplo 1.
La razón para el uso del ensayo de placa caliente en este contexto
se proporciona en Matthes y col., Nature 383:
819-823 (1996). En resumen, se ensayan ratas que
reciben oligómeros de MU1R-PNA para sensibilidad a
la exposición a MOR a diversos tiempos después de la administración
de oligómero de MU1R-PNA, para determinar tanto el
curso de tiempo para el comienzo de la pérdida de sensibilidad a
MOR como el curso de tiempo para la recuperación de la sensibilidad
a MOR. Puesto que la desensibilización o tolerancia a la exposición
al fármaco (NT y MOR) puede producirse con inyecciones repetidas,
se usan grupos separados de animales, escalonados con respecto al
tiempo de ensayo, de tal modo que transcurren al menos 12 horas
antes de la siguiente exposición a fármaco en un animal particular.
Después de determinar el curso de tiempo para el comienzo de los
efectos, se determina un curso de tiempo para la recuperación de la
respuesta por ensayo de cada grupo animal durante hasta varios
días.
Para oligómeros de SERT-PNA, se
mide la pérdida de la actividad de transporte de serotonina mediante
la administración por vía intraperitoneal de TCP (15 mg/kg) a ratas
tratadas con oligómero de SERT-PNA y se observan los
comportamientos asociados con la serotonina extraneuronal, como se
describe en el Ejemplo 3. En resumen, se administra una inyección
de TCP a ratas tratadas previamente con oligómeros de
SERT-PNA y se observan para hiperactividad en una
cámara de actividad
Opto-Varimex-Minor (Columbus
Instruments, Columbus, OH). Se miden primero los valores basales
por colocación del animal en la cámara durante un periodo de
habituación de 60 minutos y después registro de la actividad
durante 30 minutos antes de la administración de TCP
intraperitoneal. Después de la administración de TCP, los animales
se observan para determinar la actividad durante hasta 3 horas.
Además, se puntúan los animales por la presencia o ausencia de los
siguientes signos: abducción de las extremidades posteriores,
balanceo lateral de la cabeza, temblores, rigidez, cola de Straub,
hiperreactividad, piloerección, salivación, cromodacriorrea,
sacudidas del tronco, caminar compulsivo en círculos y ataxia de las
extremidades
posteriores.
posteriores.
En experimentos que usan TCP, se usan grupos
separados de animales que nunca se habían expuesto a TCP, puesto
que los resultados anteriores indican que tratamientos repetidos con
TCP en animales no tratados con oligómeros de PNA pueden dar como
resultado hiperactividad. No obstante, esta hiperactividad era
habitualmente de menor magnitud que la observada en animales
tratados con oligómeros de SERT-PNA más un inhibidor
de la MAO. Además, el tratamiento con TCP repetido habitualmente no
se acompaña de otros signos de exceso de serotonina (por ejemplo,
cromodacriorrea o lágrimas teñidas de color sangre, abducción de las
extremidades posteriores y sacudidas del tronco).
Para proporcionar pruebas adicionales de que las
respuestas de comportamiento se atribuyen a una expresión reducida
de polipéptido o de ARN mensajero, las ratas se sacrifican después
del ensayo conductual y se examinan a nivel bioquímico y
molecular.
También se determinan los tiempos de comienzo y
recuperación para la expresión polipeptídica después del tratamiento
con diversos oligómeros de PNA. En general, después de que se
determina el tiempo necesario para un efecto máximo de un oligómero
de PNA particular, el curso de tiempo para la recuperación se mide
cuidadosamente después del tratamiento tanto agudo como crónico.
Por lo tanto, después de determinar el punto de tiempo en el que se
obtiene la inhibición máxima para un tratamiento con un oligómero de
PNA dado, el oligómero de PNA se administra a un grupo de animales
diferente. Estos animales se sacrifican (n = 3 en cada punto de
tiempo) y se analizan a diversos puntos de tiempo después del
tiempo predeterminado cuando el nivel de inhibición es máximo para
determinar la fase de recuperación. Por ejemplo, se sacrifican
grupos separados de animales a las 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36
horas, 2 días, 3 días, 4 días y 5 días después del tiempo respectivo
para el efecto máximo de cada tratamiento con oligómero de PNA. Los
tiempos para la medición de la recuperación después del tratamiento
crónico con oligómeros de PNA son los mismos que con el tratamiento
agudo. Se consiguen tratamientos crónicos mediante el uso de una
minibomba osmótica (Alzat; 2NL4, 2 ml de capacidad, velocidad de
administración de 2,5 \mul/hora) que infunde su contenido en una
cánula yugular o subcutánea durante aproximadamente cuatro semanas.
Las mediciones adicionales para los animales crónicamente tratados
con oligómeros de PNA incluyen mediciones diarias del peso
corporal, observación íntegra del comportamiento y análisis de
muestras de sangre al final del tratamiento crónico para determinar
la química sanguínea, incluyendo estudios de la función
hepática.
Se realizan ensayos de unión a ligando
radiomarcado para NTR1, MU1R, y el transportador de serotonina de la
membrana plasmática para determinar tanto la reducción como la
recuperación de la expresión de un polipéptido específico. En
general, se tratan grupos separados de animales (n = 3 en cada punto
de tiempo) con oligómeros de PNA específicos a una dosificación
determinada como eficaz y se sacrifican a las 6, 12, 24, 36 y 48
horas después del tratamiento. Se recoge tejido de cerebro para
unión a NTR1, MU1R y transportador de serotonina, se recoge tejido
intestinal (íleon y yeyuno) para unión a NTR1 y MU1R y se recoge
sangre para unión al transportador de serotonina. Los ensayos de
unión y bioquímicos se realizan como se describe en los Ejemplos
1-3. Estos tipos de mediciones reflejan tanto la
renovación de polipéptido como los índices de síntesis de
polipéptido.
Se ensayan sitios de unión a NTR1 para animales
tratados con oligómeros de NTR1-PNA por medición de
la unión de NT radiomarcada en tejido cerebral e intestinal (íleon
y yeyuno). Usando ensayos de unión competitiva, se mide la
concentración de sitios de unión (B_{máx}) para NT en
homogeneizados preparados a partir de tejido de PAG, hipotálamo,
yeyuno e íleon recién obtenido de ratas
Sprague-Dawley adultas. Se preparan homogeneizados
de tejido de cerebro y de yeyuno e íleon como se describe en el
Ejemplo 1. Además, se prepara el tejido de yeyuno e íleon a partir
de homogeneizados de tejido intestinal total usando la membrana
nuclear en bruto para ensayos de unión. Se realizan ensayos de
unión competitiva como se describe en otro sitio (Gaudriault y col.,
J. Neurochem. 62: 361-368 (1994)) con las
siguientes modificaciones: el tampón de unión también contiene
glicerol al 0,5%, fenilmetilsulfonilfluoruro 0,01 mM, pepstatina 7
\mul, aprotonina 0,8 \muM, leupeptina 12 \muM, iodoacetamida
0,1 \muM y EDTA 0,25 Mm (todos de Fisher Scientific, Pittsburg,
PA), pero no contiene
N-benciloxicarbonil-prolil-prolinal.
Se incuban los homogeneizados de cerebro (aproximadamente 1 mg de
peso húmedo de polipéptidos) con [^{125}I]NT (0,2 nM; NEN,
Boston, MA) y concentraciones crecientes de [^{126}I]NT no
radiactiva en un volumen total de 100 \muL. Se realizan ensayos
en placas de 96 pocillos con aproximadamente 2,5 mg de peso húmedo
por pocillo para muestras de PAG e hipotálamo y aproximadamente 125
\mug de polipéptido por pocillo para muestras de intestino. Se
analizan los datos de unión a radioligando con el programa
informático LIGAND funcionando en un PC.
Se ensayan sitios de unión a MU1R para animales
tratados con oligómeros de MU1R-PNA por medición de
la unión de morfina radiomarcada en el cerebro. Como con NTR1, se
determina la B_{máx} para sitios de unión a MOR. De nuevo, se
preparan homogeneizados de tejido de PAG y yeyuno e íleon recién
obtenido de ratas adultas y se realizan ensayos de unión
competitiva como se describe en la presente memoria. En resumen, se
realizan ensayos en placas de 96 pocillos con aproximadamente 2,5
mg de peso húmedo por pocillo para muestras de PAG y
aproximadamente 125 \mug de proteína por pocillo para muestras de
intestino. Típicamente, se usa [^{3}H]morfina 2 nM (NEM,
Boston, MA) para cada ensayo de unión.
La expresión del transportador de serotonina de
la membrana plasmática se determina por medición de la unión de
imipramina radiomarcada en el cerebro. La imipramina es un
antidepresivo que se une a los transportadores de serotonina de la
membrana plasmática de forma reversible. En resumen, se homogenizan
aproximadamente 300 mg de corteza cerebral en 10 volúmenes de
tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,7) con un Brinkmann
Polytron (ajuste 7 durante 10 segundos). El homogeneizado se
centrifuga a 20.000 x g durante 15 minutos (4ºC). Los sedimentos se
resuspenden en Tris-HCL 50 mM (pH 7,4) que contiene
CaCl_{2} 4 mM y se incuban durante 15 minutos a 37ºC. Después,
las muestras se centrifugan y se repite el procedimiento de lavado.
Después de la centrifugación final, los sedimentos se resuspenden
en 50 volúmenes de Tris-HCl 50 mM que contiene
CaCl_{2} 4 mM, pargilina 10 \muM y ácido ascórbico al 0,1%. El
ensayo de unión se realiza por incubación de 100 \mul de
diferentes concentraciones de imipramina (0,01
nM-0,1 \muM), 100 \mul de
[^{3}H]imipramina (10 \muM) y 800 \mul de preparación
tisular a 37ºC durante 30 minutos. Para la unión inespecífica se
añaden 100 \mul de imipramina a un conjunto de tubos. La unión se
termina por filtración rápida sobre un filtro de vidrio recubierto
con polietilenimina al 0,5% usando un colector de células Brandell.
Después, los filtros se lavan 3 veces con 2 ml de NaCl al 0,9%. Se
realiza un recuento de la radiactividad y se analizan los datos.
Además, se determinó la expresión del
transportador de serotonina de la membrana plasmática por medición
de la unión de paroxetina radiomarcada en el cerebro. En resumen,
se homogenizan aproximadamente 300 mg de corteza cerebral en 15 ml
de tampón Tris 50 mM helado que contiene NaCl 120 mM y KCl 5 mM a pH
7,4 usando un Brinkmann Polytron (ajuste 4 durante 5 segundos). El
homogenizado se centrifuga a 18.000 x g y 4ºC durante 10 minutos.
Los sedimentos se resuspenden en tampón, se homogenizan, se
centrifugan de nuevo y se resuspenden hasta una concentración final
de 60 \mug de polipéptido/ml en el tampón de ensayo de unión. Los
homogenizados se incuban durante 60 minutos a 22ºC con
[^{3}H]paroxetina 0,1 nM y concentraciones variables (1
pM-10 nM) de paroxetina en un volumen final de 1
ml. Se determina la unión inespecífica en presencia de serotonina
100 \muM. Se detiene la reacción por adición de 6 ml de tampón
helado y filtración a través de filtros Whatman previamente
recubiertos con polietilenimina al 2% usando un colector Brandel.
Después, los filtros se lavan 3 veces con 2 ml de NaCl al 0,9%. Se
mide la radiactividad y los datos se analizan como se ha descrito
anteriormente.
Las plaquetas también expresan transportadores
de serotonina. Para analizar la unión de [^{3}H]imipramina
a plaquetas, se realiza el siguiente procedimiento. Se recoge sangre
completa de un animal por punción cardiaca después de partirse el
esternón. La sangre se aspira durante la sístole y se transfiere a
tubos de plástico que contienen 10 U de heparina sódica porcina/ml
de sangre. El tubo se tapa después y se invierte varias veces. La
sangre se centrifuga con cuidado a 177 x g a 20ºC durante 12
minutos, acelerando hasta la fuerza en g establecida en un espacio
de 8 minutos. El plasma rico en plaquetas resultante (PRP) se retira
y se almacena en un criovial a -80ºC hasta el uso. El ensayo de
unión se realiza mediante una modificación de los procedimientos
descritos anteriormente (O'Shaugnessey y col., Microsurgery 17:
238-242 (1996) y Paul y col., Life Sci. 26:
953-959 (1980)). En resumen, el PRP se centrifuga a
18.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Las membranas de plaquetas se
lavan y se centrifugan dos veces con 50 volúmenes de tampón
(Tris-HCl 0,5 M; NaCl 0,2 M; KCl 0,005 M;
litio-HEPES 0,01 M). Las membranas se rompen con un
Brinkmann Polytron a un ajuste de 6 durante 10 segundos. Las
membranas se lavan de nuevo, se centrifugan y se resuspenden en
tampón hasta una concentración final de polipéptido de 3,5 mg/ml.
Las reacciones de incubación para cada ensayo contienen 25 \mul de
[^{3}H]imipramina (1 nM), 25 \mul de competidor frío y
200 \mul de preparación de membrana. La incubación es durante 1
hora a 4ºC. Después de la incubación, la mezcla de reacción se
diluye con 5 ml de tampón frío y se filtra a través de filtros de
fibra de vidrio Brinkmann GF/F que después se lavan tres veces y se
realiza el recuento en un contador Wallac Betaplate^{TM}. El
análisis de datos es el mismo que se ha descrito anteriormente para
los otros ensayos de unión.
Además, se mide la unión de
[^{3}H]paroxetina a plaquetas de la forma siguiente.
Después de recoger la sangre como se ha descrito anteriormente, la
sangre se centrifuga con cuidado a aproximadamente 180 x g a 20ºC
durante 12 minutos, acelerando hasta la fuerza en g establecida en
un espacio de ocho minutos. El PRP se retira y se almacena en un
criovial a -80ºC hasta el uso. El ensayo de unión se realiza usando
procedimientos descritos en otro sitio con ligeras modificaciones
(Marcusson y col., J. Neurochem. 50: 1783-1790
(1988) y Wall y col., Mol. Pharmacol. 43: 264-270
(1993)). En resumen, el PRP se centrifuga a 18.000 x g durante 10
minutos a 4ºC. Se lavan las membranas de plaquetas y se centrifugan
dos veces con 50 volúmenes de tampón (Tris-HCl 0,5
M; NaCl 0,2 M; KCl 0,005 M; litio-HEPES 0,01 M).
Las membranas se rompen con un Brinkmann Polytron a un ajuste de 6
durante 10 segundos. Las membranas se lavan de nuevo, se centrifugan
y se resuspenden en tampón hasta una concentración final de
polipéptido de 3,5 mg/ml. Las reacciones de incubación contienen 25
\mul de [^{3}H]paroxetina (0,5 nM), 25 \mul de
competidor frío y 200 \mul de preparación de membrana. Las
incubaciones son durante 1 hora a 4ºC. Después de la incubación, la
mezcla de reacción se diluye con 5 ml de tampón frío y se filtra a
través de filtros de fibra de vidrio Whatman GF/F que después se
lavan tres veces y se realiza el recuento en un contador Wallac
Betaplate^{TM}. El análisis de datos es el mismo que se ha
descrito anteriormente para los otros ensayos de unión.
Para ratas tratadas con oligómeros de
SERT-PNA, también se miden los aumentos en los
niveles extracelulares de serotonina por medio de microdiálisis
intracerebral. Cualquier aumento en los niveles de serotonina se
atribuye a una disminución en la actividad de transporte de
serotonina de la membrana plasmática. En resumen, se implanta
estereotáxicamente a las ratas (coordenadas espaciales: 2 mm
anterior al bregma, 3 mm desde la sutura sagital media y 6 mm
ventral a la duramadre) en el cuerpo estriado lateral anterior una
sonda de microdiálisis (CMA/12, 3 mm de longitud, BAS, W.
Lafayette, IN) conectada en línea con un aparato de HPLC para
análisis de los niveles de serotonina. Se permite que estos
animales se muevan libremente después de que se haya insertado la
sonda. La sonda se insertó en el cuerpo estriado lateral mediante
una cánula guía. Se usó una membrana de diálisis de copolímero de
policarbonato/poliéter con un diámetro interno de 400 \mum y un
peso molecular de corte de 20.000. El líquido de perfusión consiste
en KCl 4,0 mM, NaCl 130 mM, CaCl_{2} 2,0 mM, MgCl_{2} 1,2 mM y
solución salina tamponada con fosfato 0,2 mM para dar un pH de 7,4 y
una concentración de sodio final de 137 mM. El caudal es de
aproximadamente 2,0 \mul/min. Se determina la serotonina y
5-HIAA (ácido
5-hidroxi-indol-acético)
usando HPLC con detección electroquímica. La fase móvil (acetato de
sodio 20 mM, ácido cítrico 10 mM, EDTA 3,0 mM, sal sódica del ácido
octanosulfónico monohidrato 800 \muM, dietilamina 1,0 mM y metanol
al 10% (vol/vol), pH 5,0, con N-metil-5HT
2,0 pmol como patrón interno) se filtra a través de filtros de
membrana de nylon de 0,2 \mum y se desgasifica al vacío antes de
bombearla a una velocidad de 1,5 ml/minuto a través de una columna
analítica de fase inversa C_{18} HR-80 de 3,0
\mum (8,0 cm x 4,6 mm i. d.; ESA, Inc., Chelmsford, MA) que está
conectada a una celda analítica de alta sensibilidad modelo 5011
(ESA, Inc.). La detección electroquímica se realiza usando un
detector modelo 5200A Coulochem II EC (ESA, Inc.).
Se realizan intentos, como se ha descrito
anteriormente, para usar este procedimiento para medir también
oligómeros de PNA. En cualquier caso, la colocación de la sonda se
verifica mediante técnicas histológicas similares a las técnicas
usadas para determinar la colocación de cánulas como se ha descrito
en el Ejemplo 1.
En una evaluación más directa de la expresión
polipeptídica, se usan anticuerpos monoclonales o policlonales
contra los diversos polipéptidos para inmunoprecipitar polipéptidos
radiomarcados ex vivo en homogeneizados celulares. Estos
homogeneizados celulares se obtienen de animales tratados con
oligómeros de PNA.
Se preparan preparaciones ribosómicas a partir
del cerebro de animales de control y tratados con oligómero de PNA,
como se describe en otro sitio (Hendrich y Porterfield, Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 213: 273-280 (1996)). En resumen,
se realiza la homogeneización de tejidos en medio (E) compuesto de
Tris 50 mM, KCl 250 mM y MgCl_{2} 10 mM a un pH de 7,6. La mezcla
se centrifuga a 13.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se
filtra a través de lana de vidrio Lubrol-WX (al 10%
en MgCl_{2} 10 mM) y se añade ácido desoxicólico (al 10% en
H_{2}O destilada) para dar una mezcla de Lubrol al 0,5% y ácido
desoxicólico al 1,0%. Esta mezcla se coloca en un homogeneizador de
teflón-vidrio y se mezcla suavemente con tres golpes
de mortero, mientras se deja reposar durante 30 minutos. Cada
muestra se diluye después con tres volúmenes de Medio E y se
centrifuga durante 2 horas a 78.000 g. El sobrenadante se desecha,
el sedimento se aclara con Medio E y se transfiere al tubo de
homogeneización en un volumen total de 2 ml de Medio E. El sedimento
se resuspende después mediante varios golpes suaves de mortero.
Después, los sedimentos resuspendidos se estratifican en 5 ml de
sacarosa 1 M en Medio E y se centrifugan a través de este medio
durante 2,5 horas a 105.000 g. El sobrenadante se desecha y el
sedimento se lava con Medio G (Tris 50 mM, KCl 150 mM y MgCl_{2}
10 mM a un pH de 7,6). El sedimento se suspende en Medio G, se
congela con nitrógeno líquido y se almacena a -80ºC. Se utiliza
inhibidor de ribonucleasa (5 unidades) de placenta y todos los
procedimientos se llevan a cabo en un baño de hielo.
Se sacrifican los animales tratados con
oligómero de PNA cuando se sabe que los oligómeros de PNA engendran
una reducción máxima en la expresión polipeptídica determinada a
partir de los experimentos descritos anteriormente. Después, los
polipéptidos endógenos que se están sintetizando se radiomarcan con
[^{35}S]metionina. Se determina un curso de tiempo para la
producción de radiactividad precipitable con TCA al10% (p/v) con una
alícuota de cada preparación ribosómica para establecer la
viabilidad de la preparación y el tiempo máximo de incorporación de
la metionina radiomarcada. Se usan anticuerpos contra el polipéptido
dirigido por el oligómero de PNA administrado al animal para
inmunoprecipitar los productos mediante técnicas convencionales
(Jagus R, In Methods in Enzymology. Editado por: SL Berger y AR
Kimmel. Vol. 152. Orlando, Academic Press, Inc., 1987, págs.
296-304). El material inmunoprecipitado se analiza
después mediante electroforesis en gel de poliacrilamida para
determinar la presencia o ausencia del polipéptido específicamente
dirigido. Están disponibles en el mercado anticuerpos contra MU1R y
el transportador de serotonina de la membrana plasmática (Chemicon
International, Inc.).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza una PCR con transcripción inversa
cuantitativa (RT-PCR) en animales tratados con
oligómero de PNA y de control usando GAPDH (gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa) como un patrón interno. Se
aísla el ARN total de aproximadamente 20 mg de tejido usando el kit
de aislamiento de ARN total S.N.A.P.^{TM} (Invitrogen, Carlsbad,
CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La primera
cadena de ADNc se sintetiza a partir de 500 ng de ARN total usando
el cDNA CycleKit (Invitrogen, Carlsbad, CA), también de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Se obtiene polinucleótido
quinasa, Taq ADN polimerasa, cebadores y dNTP de Gibco BRL. Se
obtiene [\gamma-^{32}P]ATP de New
England Nuclear (Boston, MA). Los cebadores con sentido se marcan
terminalmente y se purifican a partir de nucleótidos libres usando
columnas Chroma Spin 10 (Clontech, Palo Alto, CA). Los ciclos de
PCR se realizan en un GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer,
Norwalk, CT).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan los siguientes cebadores:
| NTR1, +694S: 5' GCC ACT GTC AAG GTC GTC 3' | (SEC ID Nº: 4) |
| NTR1, +965AS: 5' AGC CAG CAG ACC ACA AAG 3' | (SEC ID Nº: 5) |
(Esto amplifica productos de 271 pb para rata y
259 pb para humano en la región codificante)
\vskip1.000000\baselineskip
| SERT, +1532 5' CCG TGT CTT GGT TCT ATG G 3' | (SEC ID Nº: 6) |
| SERT, +1074AS 5' GGT ATT GGA AAA GCC GTA GC 3' | (SEC ID Nº: 7) |
(Esto amplifica un producto de 173 pb en el
extremo 3' de la región codificante)
\vskip1.000000\baselineskip
| MOR1, +859S: 5' CTG TAT TTA TCG TCT GCT GG 3' | (SEC ID Nº: 8) |
| MOR1,+1091AS: 5' AGT GGA GTT TTG CTG TTC G 3' | (SEC ID Nº: 9) |
(Esto amplifica un producto de 233 pb en el
extremo 3' de la región codificante)
\vskip1.000000\baselineskip
| GAPDH, +6S: 5' TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G 3' | (SEC ID Nº: 10) |
| GAPDH, +11AS: 5' TCC TTG GAG GCC ATG TAG GCC AT 3' | (SEC ID Nº: 11) |
(Esto amplifica productos de 238 pb para el tipo
silvestre y de 175 pb para el mutante de deleción en la región
codificante).
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de PCR del NTR humano y de un
mutante de deleción de GAPDH se usan como patrones exógenos para el
control de la variación entre tubos en las amplificaciones de PCR
apropiadas. Los cebadores de NTR1 + 694S y +965AS amplifican
fragmentos de 271 pb y 259 pb para el NTR de rata y humano,
respectivamente. Los cebadores de GAPDH +6S y +11AS amplifican
fragmentos de 238 pb y 175 pb para GAPDH y su mutante de deleción,
respectivamente. Se generan patrones exógenos para el transportador
de serotonina y el MOR1 usando el PCR Mimic^{TM} Construction Kit
(Clontech).
Las reacciones de PCR contienen Tris 20 mM (pH
8,4), KCl 50 mM, dNTP 200 \muM, 500 \muM de cada cebador,
MgCl_{2} 1,5 mM, 0,5 unidades de Taq ADN polimerasa, DMSO al 10%,
5 x 10^{5} cpm de cebador marcado y 0,2 \mul de ADNc en una
reacción de 25 \mul. Después de una desnaturalización inicial a
94ºC durante 1 minuto, los parámetros del ciclo son 94ºC durante 30
segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos
durante aproximadamente 25 ciclos, seguidos de una extensión de 10
minutos a 72ºC. La PCR se detiene antes de que las reacciones
alcancen la fase de meseta que se determina empíricamente tanto para
la diana como para el control. Los productos se separan en un gel
de secuenciación Long Ranger^{TM} al 5% que contiene urea 7 M y
se detectan usando un Storm860^{TM} Phosphoimager (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA). Los datos se analizan usando el programa
informático Image Quant^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale,
CA).
Además, también se realiza histoquímica de
hibridación in situ cuantitativa para medir los niveles de
ARNm específicos usando procedimientos conocidos por los
especialistas en la técnica.
\newpage
Ejemplo
8
Como se describe en los Ejemplos 1 y 4, el
oligómero de PNA antisentido NTR1-PNA redujo la
sensibilidad a NT después de su administración intracraneal o
extracraneal, como prueba la ausencia de inducción de
antinocicepción e hipotermia por NT. Además, esta sensibilidad a NT
reducida se correlacionaba con una reducción en el polipéptido
NTR1, como probaba una reducción en la unión a [^{125}I]NT
Se señala que el oligómero de PNA antisentido
NTR1-PNA puede denominarse en la presente memoria
NTR1-PNA o
AS-NTR1-PNA para reflejar la
naturaleza antisentido de su secuencia. La Tabla V contiene una
lista de oligómeros de PNA usados para evaluar la capacidad de
oligómeros de PNA para engendrar respuestas biológicas de una forma
específica de secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron cuatro oligómeros de PNA diferentes
para estudiar la sensibilidad a NT (Tabla V). La secuencia del
oligómero de NTR1-PNA con sentido
(5'-GTTTGAGCAATG-3' (SEC ID Nº: 13))
tiene especificidad por NTR1 y es complementaria al oligómero de
AS-NTR1-PNA. Además, la secuencia
del oligómero de AS-NTR1-PNA con
emparejamientos erróneos es similar a la del oligómero de
AS-NTR1-PNA pero contiene un
emparejamiento erróneo cada tercer par de bases (emparejamiento
erróneo indicado en negrita;
5'-TATGGCACAGAC-3' (SEC ID
Nº:12)).
Estos oligómeros de PNA se prepararon en un
sintetizador Expedite 8909 o se sintetizaron manualmente en una
escala de 50 \mumol usando resina de
PS-PEG-PAL (1 equivalente) y
monómeros de bases de ácidos nucleicos protegidos con Fmoc (6
equivalentes; Perseptive Biosystems, Inc., Framingham, MA) en
presencia de diisopropiletilamina y 2,6-lutidina.
Se retiraron los PNA del soporte de resina y se eliminaron los
grupos bloqueantes por escisión (2 horas) a temperatura ambiente en
TFA al 80% que contenía m-cresol al 20% (v/v). Los
PNA se precipitaron en éter dietílico frío y se purificaron
mediante RP-HPLC en una columna Vydac Q8 (25 mm x
250 mm) a 55ºC.
Se inyectaron
AS-NTR1-PNA,
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos y MU1R-PNA por vía intraperitoneal (10
mg/kg) de forma independiente en grupos separados de ratas
Sprague-Dawley macho (Harlan, Prattville, AL). El
oligómero NTR1-PNA con sentido, sin embargo, se
microinyectó directamente en la sustancia gris periacueductal (PAG;
5 \mug), el área principal en el cerebro implicada en la
percepción del dolor (nocicepción). Veinticuatro horas después de
la inyección de un oligómero de PNA, las ratas se ensayaron con NT
(18 nmol), que se microinyectó en la PAG porque la NT se degrada
rápidamente tras la administración sistémica y no atraviesa la
barrera hematoencefálica. Treinta minutos después de recibir NT,
los animales se puntuaron para antinocicepción (placa caliente a
52ºC) e hipotermia (sonda rectal). De nuevo, las puntuaciones de
antinocicepción se calcularon como porcentaje del efecto máximo
posible (% MPE) con la siguiente ecuación: % MPE = [(tiempo de
latencia postfármaco menos tiempo de latencia prefármaco)/(tiempo
límite menos tiempo de latencia prefármaco)] x 100; donde el tiempo
límite (es decir, el tiempo se retiró al animal del dispositivo)
era de 30 segundos para un ensayo de placa caliente y de 12
segundos para una ensayo de coletazo de la cola. Se realizaron
análisis estadísticos usando el ensayo de suma de
rangos.
rangos.
Los animales que reciben el oligómero de
AS-NTR1-PNA (10 mg/kg) por vía
intraperitoneal puntuaban una media de MPE del 25% (P < 0,001
frente a animales sin tratar) en comparación con animales sin
tratamiento previo o tratados con vehículo (sin PNA) que puntuaba
el 77% y el 71% de MPE, respectivamente (Figura 14). Por lo tanto,
los animales que recibieron el oligómero de
AS-NTR1-PNA y después NT, percibían
más fácilmente el dolor y, por lo tanto, pasaban menos tiempo sobre
la placa caliente porque los efectos de la NT estaban bloqueados
por este tratamiento con PNA. Los animales que recibieron el
oligómero de AS-NTR1-PNA con
emparejamientos erróneos (10 mg/kg) por vía intraperitoneal
puntuaban una media de MPE del 60%, que no era estadísticamente
significativa en comparación con animales sin tratar (P = 0,38). Se
señala, sin embargo, que cinco de los siete animales que recibían
el oligómero de AS-NTR1-PNA con
emparejamientos erróneos presentaban un valor de %MPE por debajo
del %MPE medio obtenido a partir de animales sin tratar. Por lo
tanto, el efecto global del oligómero de
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos parece ser una modulación de la respuesta observada en los
animales tratados con oligómero de
AS-NTR1-PNA. Los animales que
recibían oligómero de NTR1-PNA con sentido (PAG; 5
\mug) tenían una puntuación antinociceptiva de MPE del 14% (P =
0,002 frente a animales sin tratar). Además, dos animales que
recibían oligómero de NTR1-PNA con sentido (10
mg/kg) por vía intraperitoneal tenían una puntuación
antinociceptiva de 5,4 \pm 5,4% de MPE. Los animales que recibían
el oligómero de MU1R-PNA (10 mg/kg) por vía
intraperitoneal (que sirven como control para efectos tóxicos o
inespecíficos de PNA) puntuaban al 82% de MPE en la respuesta a NT,
un valor que era casi idéntico al de para los animales que no
recibían tratamiento previo o que recibían vehículo. Como una medida
añadida de especificidad para el sistema de NT, los animales que se
trataron con el oligómero de
AS-NTR1-PNA y que carecían de
antinocicepción cuando se ensayaban con NT se ensayaron con MOR (5
mg/kg; inyección intraperitoneal) y treinta minutos después se
puntuaron para antinocicepción usando el ensayo de coletazo de la
cola descrito en la presente memoria. Estos animales tratados con
oligómero de AS-NTR1-PNA puntuaban
del 95% de MPE, que era esencialmente idéntico al encontrado para
animales a los que no se inyectaba PNA y ensayados con morfina
(puntuaban el 99% de MPE).
Inmediatamente después del ensayo de
antinocicepción de NT de 30 minutos, los animales se examinaron para
cambios en la temperatura corporal en respuesta a NT (Figura 15).
Los animales tratados con el oligómero de
AS-NTR1-PNA (10 mg/kg) por vía
intraperitoneal o con el oligómero de NTR1-PNA con
sentido (PAG; 5 \mug) presentaban un cambio en la temperatura
corporal de -0,5ºC, mientras que los animales sin tratamiento previo
o de control con vehículo presentaban un cambio de temperatura
corporal de -1,8 y -1.7ºC, respectivamente. Estas diferencias eran
muy significativas (P < 0,01). Además, los dos animales tratados
con el oligómero de NTR1-PNA con sentido (10 mg/kg)
por vía intraperitoneal presentaban un cambio de temperatura
corporal de -0,45 \pm 0,15ºC. Los animales tratados con el
oligómero de AS-NTR1-PNA con
emparejamientos erróneos (10 mg/kg) por vía intraperitoneal
presentaban un cambio de temperatura corporal medio de -1,3ºC, que
no era significativamente diferente cuando se comparaba con el de
para animales sin tratar (P = 0,83). Se señala, sin embargo, que
seis de los siete animales que recibían el oligómero de
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos presentaban un cambio de temperatura corporal que era
menor que el cambio de temperatura corporal medio observado en
animales que no recibían un oligómero de PNA. Por lo tanto, el
efecto global del oligómero de
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos parece ser una modulación de la respuesta observada en los
animales tratados con oligómeros de
AS-NTR1-PNA. Los animales que
recibían el oligómero de MU1R-PNA (10 mg/kg) por vía
intraperitoneal presentaban un cambio de temperatura corporal
similar al de los animales sin tratar. Por lo tanto, estos
resultados conductuales indicaban que los oligómeros de PNA actúan
de una forma específica de secuencia y que la sola inyección de un
PNA no altera por sí misma las respuestas animales totales a un
fármaco de ensayo. Además, estos resultados indican que la
introducción de emparejamientos erróneos de pares de bases puede
modular las respuestas biológicas observadas.
El curso de tiempo para la recuperación del
efecto inhibidor de una sola inyección de PNA (10 mg/kg) se
determinó con otro grupo de animales, que se ensayaron cada 24
horas con NT, hasta que las respuestas a NT volvieron al nivel
observado en animales sin tratar (Figuras 16 y 17). Las respuestas a
NT en animales que habían recibido el oligómero de
AS-NTR1-PNA volvieron a los niveles
basales a las 48 horas después de la inyección de PNA y permanecían
normales a las 72 horas. No se incluyeron puntos de tiempo
posteriores en el análisis, puesto que algunos animales (incluyendo
los controles) comenzaban a responder erráticamente a la NT después
de recibir más de tres dosis del péptido, que probablemente se debe
a la desensibilización del receptor. Esta reversibilidad de los
efectos inhibidores del tratamiento con PNA indica además la forma
específica de secuencia en la que actúan los oligómeros de PNA. En
otras palabras, las respuestas observadas después del tratamiento
con oligómeros de PNA no parecen ser el resultado de efectos
inespecíficos o tóxicos sobre las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la potencia del tratamiento de
PNA in vivo, se obtuvieron curvas de respuesta a la dosis
para el oligómero de AS-NTR1-PNA
(Figura 18). El oligómero de
AS-NTR1-PNA producía curvas de
respuesta a la dosis excesivas, que son características de efectos
antisentido, y parecían tener una potencia idéntica en la reducción
de ambas respuestas a NT, con DE_{50} de 2,6 y 3,2 mg/kg para la
antinocicepción y la hipotermia, respectivamente. Los datos de la
respuesta a la dosis son resultados representativos que utilizan un
lote de PNA. Se observó cierta variación en la potencia de
diferentes preparaciones de PNA. Por esta razón, todos los
experimentos se realizaron a 10 mg/kg, una dosis que proporcionaba
resultados uniformes independientemente del lote de PNA.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con oligómero de
AS-NTR1-PNA bloqueaba los efectos
farmacológicos de NT por reducción de la expresión del polipéptido
de NTR1. Los animales que recibían el oligómero de
AS-NTR1-PNA por vía intraperitoneal
se sacrificaron 24 horas después de la inyección para el uso en
ensayos de unión para medir niveles de sitios de unión a
[^{125}I]NT y [^{3}H]morfina. A partir de estos
animales, se extirpó la PAG, el resto del cerebro y porciones del
intestino delgado (yeyuno e íleon). El intestino delgado se
seleccionó porque es un sitio periférico que contiene tantos sitios
de unión a NT como a morfina.
En resumen, se prepararon homogenizados de PAG y
del resto del cerebro recién obtenidos de ratas adultas de acuerdo
con Goedert M, y col., Brain Res. 304, 71-81 (1984)
con las siguientes modificaciones: el tampón de ensayo contenía los
inhibidores de peptidasa 1,10-fenantrolina (1
\muM) y aprotonina (5 mg/ml). Para los ensayos de unión de la PAG
y del resto del cerebro, los tejidos se incubaron con
[^{125}I]NT 0,3 nM (NEN, Boston, MA) o
[^{3}H]morfina 1 nM a temperatura ambiente durante 30 ó 60
minutos, respectivamente. Se midió la unión total e inespecífica
como se ha descrito anteriormente, excepto porque los sitios de
unión se normalizaron para concentraciones de proteína mediante
determinación de proteína por BCA (Pierce Chemical Co., Rockford,
IL).
Se prepararon homogeneizados de membrana
plasmática purificada a partir de yeyuno e ileon recién obtenidos y
se realizaron ensayos de unión a radioligando de acuerdo con Goedert
M, y col., Brain Res. 304, 71-81 (1984) y Makman
MH, y col., Brain Res. 762, 247-250 (1997) con las
siguientes modificaciones: el tampón de unión contenía
1,10-fenantrolina (1 \muM) y aprotonina (5 mg/ml),
y se llevaron a cabo incubaciones a temperatura ambiente durante 30
minutos para NT y 60 minutos para morfina. Para estos ensayos, se
incubaron homogeneizados intestinales (500 \mug de proteína) con
[^{125}I]NT 80 pM (NEN, Boston, MA) o
[^{3}H]morfina 2 nM en un volumen final de 1 ml. Se
determinó la unión inespecífica en ensayos de cerebro e intestino
usando 1 \muM de NT o morfina sin marcar (RBI, Natick, MA). Los
datos se unión se analizaron como dpm de unión específica/\mug de
proteína y se compararon con animales de control (sin PNA) para
porcentaje de cambio.
Los animales tratados con oligómero de
AS-NTR1-PNA tenían una reducción del
35%, 40% y 65% en el número de sitios de unión a NTR1 en la PAG, el
resto del cerebro y el intestino delgado, respectivamente, en
comparación con animales sin tratar (P < 0,05 en todos los
casos) (Tabla VI). En estos animales, no existían diferencias
significativas en el número de sitios de unión a morfina en el resto
del cerebro ni en el intestino delgado en comparación con los
controles. Estos resultados indicaban de nuevo la forma específica
de secuencia en la que los oligómeros de PNA engendran respuestas
biológicas. Además, los resultados indican que los oligómeros de
PNA administrados por vía intraperitoneal no sólo atravesaban la
barrera hematoencefálica, sino que también la membrana plasmática
de las células en el cerebro y en el intestino delgado para anular
la producción de polipéptido NTR1.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La disminución observada en la unión a
[^{125}I]NT en sitios periféricos (intestino delgado) era
mayor que en el cerebro. Este resultado sugiere que aunque el
oligómero de PNA atraviesa claramente la BHE y entra en las células
neuronales, puede entrar en sitos periféricos más fácilmente.
Además, el hecho de que una reducción del 35-40% en
la unión a [^{125}I]NT daba como resultado una pérdida casi
completa en la sensibilidad conductual y fisiológica a NT indica
que la cascada de NT/NTR1 es un fenómeno umbral.
Se midieron los niveles de ARN mensajero (ARNm)
para NTR1, MU1R, y GAPDH en animales de control y tratados con PNA.
En resumen, se aisló el ARN total de aproximadamente 20 mg de tejido
usando el kit de aislamiento de ARN total S.N.A.P. (Invitrogen,
Carlsbad, CA). Se realizó una RT-PCR cuantitativa
sobre animales tratados y de control usando GAPDH como un patrón
interno y fragmentos de PCR del NTR humano y de un mutante de
deleción de GAPDH como patrones exógenos. Se sintetizó la primera
cadena de ADNc a partir de aproximadamente 500 ng de ARN total
usando el cDNA Cycle kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se realizó una
PCR en un GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
usando cebadores marcados terminalmente y TAq ADN polimerasa
(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Los productos se
separaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía urea 7 M y se
detectaron usando un Storm860 Phosphoimager (Molecular Dynamics,
Sunnyvale, CA). Los datos se analizaron usando el programa
informático ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA). Para
controlar cualquier fluctuación del nivel de ARNm diurna que
pudiera aparecer, se controló el momento de inyección de PNA de tal
modo que el tiempo de recogida del tejido era idéntico en cada
grupo animal.
Los animales tratados intracranealmente con el
oligómero de AS-NTR1-PNA (5 \mug)
no presentaban cambios significativos en la proporción de
NTR1/GAPDH o MU1R/GAPDH de ARNm a lo largo del tiempo (Figura 19).
Este resultado indica que los oligómeros de PNA antisentido no
activan los mecanismos de degradación del ARNm tales como los que
implican ARNasa H, pero que los complejos de PNA/ARN bloquean la
traducción de moléculas de ARNm en un polipéptido presumiblemente
por impedimento estérico. Por otro lado, los animales tratados
intracranealmente con el oligómero de NTR1-PNA con
sentido (5 \mug) presentaban una reducción del 50% en la
proporción de NTR1/GAPDH de ARNm a las 8 horas (P < 0,05 frente
al control y frente a animales tratados con
AS-NTR1-PNA a las 8 horas). De
forma importante, no se observaron cambios en la proporción de
MU1R/GAPDH en cualquier momento en los animales tratados con el
oligómero de NTR1-PNA con sentido. En su conjunto,
estos resultados indican que los oligómeros de PNA con sentido son
agentes antigénicos eficaces in vivo.
Se realizó un ensayo de transcripción inversa
in vitro de la forma siguiente. Se aisló el ARN total a
partir de 20 mg de tejido usando el RNeasy Kit (Qiagen, Chatsworth,
CA). Después del aislamiento, se incubó el ARN total (1 \mug) con
los oligómeros de PNA (600 ng) a 40ºC durante 40 minutos. Se
añadieron patrones de ARNc exógenos y se sintetizó ADNc usando el
cDNA Cycle Kit y cebadores específicos de genes para NTR1 y GAPDH
(Invitrogen, Carlsbad, CA). Los patrones de ARNc exógeno se
sintetizaron a partir de moldes de ADNbc usando el
Megashort-Script Kit (Ambion, Austin, TX). Los
moldes de ADNbc para patrones de ARNc exógeno para las reacciones
de ADNc específicas de NTR1 y GAPDH se construyeron usando el PCR
MIMIC Construction Kit (Clontech) y cebadores compuestos. Los
cebadores compuestos contenían el sitio de unión a ARN polimerasa T7
así como secuencias específicas de NTR1 o GAPDH que se corresponden
con las secuencias de los cebadores usados en cada reacción de ADNc
individual. Después del uso del cDNA Cycle Kit, se realizó una PCR
cuantitativa en cada muestra. Los productos se separaron después en
un gel de agarosa al 2% y se tiñeron con Vista Green (Amersham,
Arlington Heights, IL). Los productos se detectaron usando un
Storm860 Phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) y los
datos se analizaron usando el programa informático Image Quant
(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Usando este ensayo de transcripción inversa
in vitro, se incubó 1 \mug de ARN total aislado a partir
del cerebro de ratas sin tratar con 600 ng del oligómero de
AS-NTR1-PNA o
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos y se evaluó la producción de ADNc de NTR1. Las muestras de
ARN total que contenían el oligómero de
AS-NTR1-PNA con emparejamientos
erróneos presentaban un nivel de síntesis de ADNc de NTR1 similar al
observado en muestras que no contenían PNA. Las muestras de ARN
total que contenían el oligómero de
AS-NTR1-PNA, sin embargo,
presentaban una reducción del 65% en la síntesis de ADNc de NTR1,
como probaba la electroforesis en gel. En concreto, las reacciones
que contenían el oligómero de
AS-NTR1-PNA sistemáticamente no
producían producto de ADNc de NTR1 con la misma intensidad que la
producida en reacciones que no contenían el oligómero de
AS-NTR1-PNA. Controles tales como
patrones de ARNc para el gen diana y GAPDH verificaron la eficacia
de la síntesis de ADNc y de la formación de producto de PCR.
Además, los complejos de PNA/ARN inhibían la transcripción inversa
de una forma dependiente de la dosis (Figura 20). En su conjunto,
estos resultados indican que los complejos de PNA/ARN inhiben la
transcripción inversa de una forma específica de secuencia así como
dependiente de la dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Los datos conductuales, fisiológicos y de unión
indican que el oligómero de
AS-NTR1-PNA no sólo actúa de una
forma especifica de secuencia, sino que también atraviesa la barrera
hematoencefálica (BHE) en su forma sin portador después de la
administración intraperitoneal. Para confirmar la presencia y medir
la cantidad de PNA en cerebro después de la administración
extracraneal, se desarrolló un ensayo sensible de cambio de
movilidad electroforética en gel. Este ensayo implica usar un
oligonucleótido marcado radiactivamente que tiene especificidad de
secuencia por un oligómero de PNA como una sonda para detectar ese
oligómero de PNA. En resumen, se prepara una muestra y se incuba
con una sonda. Si la muestra contiene un oligómero de PNA que tiene
especificidad de secuencia por la sonda, entonces la sonda puede
unirse a ese oligómero de PNA. Esta forma unida de la sonda puede
detectarse después y cuantificarse usando electroforesis en gel,
puesto que una sonda unida a un oligómero de PNA migrará de una
forma diferente que una sonda no unida en un gel.
Se prepararon extractos de cerebro de animales
sin tratar o animales tratados por vía intraperitoneal con 10 mg/kg
del oligómero de AS-NTR1-PNA. Para
los animales tratados, se recogió tejido de cerebro 8 después del
tratamiento. Para preparar extractos de cerebro, se homogenizó
tejido de cerebro sometido a congelación ultrarrápida (menos la PAG
y el hipotálamo) en Tris 1 mM (pH 4,0), EDTA 0,1 mM a una
concentración de 1,5 ml/g de peso húmedo de tejido. Esta condición
ácida puede protonar bases de citosina, así como el grupo amino
N-terminal del oligómero de PNA, que presumiblemente aumenta
la solubilidad del oligómero de PNA y permite que el oligómero de
PNA se encuentre en una fase acuosa durante la etapa de extracción
posterior. Las muestras se llevaron a ebullición durante 5 minutos.
Esta etapa de ebullición puede liberar el oligómero de PNA unido de
su secuencia diana e inactivar nucleasas que pueden interferir con
la integridad de la sonda oligonucleotídica de ADN. Después, las
muestras se centrifugaron de dos a tres veces a 35.600 x g durante
10 minutos cada una para sedimentar el material insoluble y se
recogieron los sobrenadantes. Los sobrenadantes se extrajeron con
10 volúmenes de CHCl_{3}:MeOH (2:1 v/v) para retirar los
glicolípidos que pueden interferir con la electroforesis en gel y
se centrifugaron brevemente a 1.000 x g para separar las fases. Para
las curvas patrón que usan cantidades conocidas de un oligómero de
PNA, el oligómero de PNA se añadió al sobrenadante antes de la
extracción con CHCl_{3}:MeOH. Los sobrenadantes se recogieron en
un tubo limpio, se liofilizaron y se resuspendieron en de 30 a 40
\mul de agua.
Una vez preparada, se añadieron aproximadamente
400 pg de sonda a cada muestra de 30 a 40 \mul. Para preparar la
sonda, se marcó terminalmente un oligonucleótido de ADN (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) complementario al oligómero de
AS-NTR1-PNA usando una
polinucleótido quinasa T4 (Gibco BRL) y
[Gamma-^{32}P]ATP o
[Gamma-^{33}P]ATP (New England Nuclear,
Boston, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se
eliminaron los nucleótidos no incorporados usando una columna
Chroma-Spin 10 (Clontech, Palo Alto, CA) y se
purificó en un gel de acrilamida al 20%. La porción del gel que
contenía la sonda se escindió y la sonda se eluyó en de 100 a 150
\mul de Tris 10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM.
Después de añadir la sonda, las muestras se
incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la
incubación, se añadió tampón de carga de Ficoll (10X) a cada muestra
y las muestras se procesaron en un gel de poliacrilamida al 20% de
1,5 mm de grosor en TBE a 150 voltios-hora (por
ejemplo, 180 voltios durante 50 minutos). Los geles se incubaron en
solución de secado de gel (Bio-Rad, Hercules, CA)
durante 30 minutos y se secaron en un secador de geles. Se detectó
la señal usando un Storm860 Phosphoimager (Molecular Dynamics,
Sunnyvale, CA) y los datos se analizaron usando el programa
informático ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale,
CA).
CA).
Se detectó el oligómero de
AS-NTR1-PNA en extractos de cerebro
preparados a partir de animales tratados y no en los extractos
preparados a partir de animales sin tratar. Para controlar la
posibilidad de que los oligómeros de PNA pudieran estar en los
capilares del tejido cerebral después de la inyección
intraperitoneal y no realmente en el propio tejido celular del
cerebro, los animales se perfundieron con solución salina estéril
justo antes de la recogida del tejido cerebral. De nuevo, el
oligómero de AS-NTR1-PNA se detectó
en extractos de cerebro preparados a partir de animales tratados y
de animales sin tratar (Figura 21). Además, los niveles de oligómero
de PNA detectados en extractos de cerebro a partir de animales
tratados perfundidos y sin perfundir eran similares, indicando que
muy poco, si algo, del oligómero de PNA permanece en la sangre
después de 8 horas cuando se administra por vía intraperitoneal a
una concentración de 10 mg/kg. Además, los cambios en la movilidad
electroforética observados en muestras de animales tratados eran
similares a los cambios observados en muestras de control con el
oligómero de AS-NTR1-PNA añadido.
Puesto que la pérdida de incluso una sola base de PNA es fácilmente
distinguible usando este ensayo de cambio de movilidad
electroforética en gel, estos cambios similares en la movilidad
indican que los oligómeros de
AS-NTR1-PNA recuperados del cerebro
no estaban alterados. En su conjunto, estos resultados indican que
los oligómeros de PNA administrados extracranealmente atraviesan la
BHE y permanecen en el tejido del cerebro durante al menos 8 horas
en su forma original.
Usando cantidades conocidas del oligómero de
AS-NTR1-PNA añadidas directamente al
tejido de cerebro recogido de animales sin tratar y corrigiéndolas
por recuperación del oligómero de PNA durante la extracción (60%),
se produjo una curva patrón (y = 31030 x + 375700; R^{2} = 0,97)
(Figura 21 y 22). A partir de esta curva patrón, se calculó la
concentración del oligómero de
AS-NTR1-PNA dentro del cerebro 8
horas después de la administración intraperitoneal como 2,4 \pm
0,3 ng/cerebro completo. Se señala que una cantidad tan pequeña
como de 50 pg del oligómero de
AS-NTR1-PNA se detectaba cuando se
añadía directamente a 160 mg de peso húmedo de tejido cerebral de
un animal sin tratar (500 pg/cerebro completo), como se demostraba
por un cambio en la movilidad electroforética de la sonda marcada
radiactivamente. Por lo tanto, este ensayo de cambio de movilidad
electroforética en gel no sólo detecta la presencia de oligómero de
AS-NTR1-PNA dentro del cerebro, sino
que también proporciona una medida de la cantidad de PNA en el
interior del tejido cerebral.
Este ensayo de cambio de movilidad
electroforética en gel se usó para detectar oligómeros de PNA en
tejidos distintos del cerebro, incluyendo corazón, riñón, hígado,
bazo y sangre. Los animales se inyectaron por vía intraperitoneal
con 10 mg/kg del oligómero de
AS-NTR1-PNA y se perfundieron 2
horas después con solución salina estéril. Se recogieron cerebro,
corazón, riñón, hígado y bazo y se prepararon como se ha descrito
anteriormente.
Para la sangre, el oligómero de
AS-NTR1-PNA (10 mg/kg) se inyectó
por vía intravenosa en animales. Cinco minutos después, se
recogieron 150 \mul de sangre completa y se añadieron 15 \mul de
solución tamponada con citrato 0,13 M. Después, las muestras de
sangre se centrifugaron brevemente y se recogió el suero en un tubo
limpio. El suero se diluyó (alícuotas de 1 \mul de suero se
diluyeron hasta un volumen final de 30 \mul en tampón TE, pH 8,0)
y se añadió la sonda como se ha descrito anteriormente para el
tejido cerebral.
El oligómero de
AS-NTR1-PNA se detectó en cada
tejido, como demostraba la presencia del cambio en la movilidad
electroforética de la sonda radiomarcada. Este cambio es similar al
cambio observado en la Figura 21. Además, se produjo una curva
patrón por adición de cantidades conocidas del oligómero de PNA al
tejido hepático antes de la extracción. Esta curva patrón era
similar a la curva patrón producida usando extracto de cerebro. A
partir de estos resultados, el nivel de detección usando una sonda
marcada con ^{32}P o ^{33}P estaba dentro del intervalo de 30
pg hasta más de 400 pg de PNA por carril. Por lo tanto, este ensayo
de cambio de movilidad electroforética en gel proporciona un ensayo
muy sensible y fiable para detectar oligómeros de PNA dentro de
muestras biológicas recogidas a partir de un animal.
\newpage
Ejemplo
10
Se administran oligómeros de PNA con sentido y
antisentido en combinación para engendrar una respuesta biológica
que es más pronunciada, más duradera o diferente de otro modo de la
respuesta biológica engendrada por el oligómero de PNA con sentido
o antisentido en solitario. Los oligómeros de PNA con sentido y
antisentido administrados en combinación, típicamente no son
complementarios entre sí y, por lo tanto, no presentan especificidad
de secuencia por una secuencia diana idéntica.
Por ejemplo, pueden usarse cuatro grupos de
animales para determinar los efectos de un tratamiento de
combinación de oligómeros de PNA con sentido y antisentido. Cada
grupo puede contener cuatro ratas. El primer grupo de ratas puede
tratarse por vía intraperitoneal con oligómero de PNA antisentido,
tal como el oligómero de AS-NTR1-PNA
(por ejemplo, 10 mg/kg). El segundo grupo de ratas puede tratarse
por vía intraperitoneal con un oligómero de PNA con sentido, tal
como, +376S-NTR1-PNA (por ejemplo,
10 mg/kg). El oligómero de
+376S-NTR1-PNA
(5'-TACAACTTCATCTG-3' (SEC ID Nº:
14)) es un oligómero de 14 unidades que se dirige a una porción de
la cadena codificante del ADN que codifica NTR1. La denominación
+376 indica que el oligómero de
+376S-NTR1-PNA se dirige a una
porción del ácido nucleico que codifica NTR1 que está 376
nucleótidos 3' del sitio de inicio de la traducción de NTR1. El
tercer grupo de ratas puede tratarse por vía intraperitoneal tanto
con oligómero de PNA antisentido como con sentido, tal como el
oligómero de AS-NTR1-PNA (por
ejemplo, 10 mg/kg) y el oligómero de
+376S-NTR1-PNA (por ejemplo, 10
mg/kg). El cuarto grupo de ratas puede tratarse con el vehículo
usado para administrar los oligómeros de PNA, tal como solución
salina.
Después del tratamiento, cada grupo de ratas
puede ensayarse para determinar la sensibilidad a NT. Como se
describe en la presente memoria, puede usarse un ensayo de placa
caliente para evaluar la antinocicepción inducida por NT y la
temperatura rectal puede usarse para evaluar la hipotermia inducida
por NT. Además, el ensayo de unión a [^{125}I]NT descrito
en la presente memoria puede usarse para evaluar el nivel de
reducción en la expresión de polipéptido NTR1.
Se entenderá que, aunque la invención se ha
descrito en conjunción con la descripción detallada de la misma, la
descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la
invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones
adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del
alcance de las siguientes reivindicaciones.
<110> MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL
EDUCATION AND RESEARCH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE OLIGÓMEROS DE ÁCIDO NUCLEICO
DE POLIAMIDA PARA ENGENDRAR UNA RESPUESTA BIOLÓGICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 07039/073WO1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 08/953.269
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-10-1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/016.685
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-01-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> No disponible
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
08-10-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> No disponible
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
08-10-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> No disponible
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
08-10-1990
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Análogo de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Análogo de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Análogo de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Otros
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia con emparejamientos
erróneos derivada de una secuencia de rata
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Análogo de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Análogo de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Análogo de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (43)
1. Un oligómero de ácido nucleico de poliamida
sin portador en el que un PNA sin portador es un oligómero de PNA
no modificado sin modificaciones adicionales, diseñado para
potenciar el paso a través de membranas plasmáticas o de la barrera
hematoencefálica para el uso como un medicamento, en el que dicho
oligómero de ácido nucleico de poliamida es complementario a una
secuencia diana.
2. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento es un
medicamento para administrar por vía intravenosa.
3. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento es un
medicamento para administrar a un mamífero.
4. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 3, en el que dicho medicamento es un
medicamento para administrar fuera del sistema nervioso central de
dicho mamífero.
5. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 4, en el que dicho medicamento es un
medicamento para administrar por vía intraperitoneal.
6. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero atraviesa una
barrera hematoencefálica de un organismo vivo.
7. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero tiene
especificidad de secuencia por una secuencia de ácido nucleico que
regula la expresión de o codifica un polipéptido, expresándose
dicho polipéptido extracranealmente en un organismo vivo.
8. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido se expresa en
el tracto gastrointestinal.
9. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero tiene
especificidad de secuencia por una secuencia de ácido nucleico que
regula la expresión de o codifica un polipéptido, expresándose
dicho polipéptido intracranealmente en un organismo vivo.
10. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 9, en el que dicho polipéptido participa en la
señalización celular.
11. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido participa en
la señalización opiode.
12. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido es un receptor
opiode.
13. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 12, en el que dicho receptor es un receptor de
morfina.
14. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 12, en el que dicho receptor es un receptor de
neurotensina.
15. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 12, en el que dicho oligómero comprende una
secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº: 1 y
2.
16. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero está libre de
acridina.
17. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero está libre de
proteínas.
18. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero está libre de
ADN.
19. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero está libre de
péptidos.
20. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero está libre de
bis-PNA.
\newpage
21. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero está libre de
biotina.
22. El oligómero de ácido nucleico de poliamida
de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero está libre de
fluoresceína.
23. El uso de un oligómero de ácido nucleico de
poliamida sin portador, en el que un PNA sin portador es un
oligómero de PNA no modificado sin modificaciones adicionales
diseñado para potenciar el paso a través de membranas plasmáticas o
de la barrera hematoencefálica, para la fabricación de un
medicamento para administrar por vía extracraneal a un mamífero
para el tratamiento del cáncer, enfermedades de comportamiento,
infecciones y enfermedades autoinmunes, en el que dicho oligómero
de ácido nucleico de poliamida es complementario a una secuencia
diana.
24. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho medicamento es un medicamento para administrar por vía
intravenosa.
25. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero atraviesa una barrera hematoencefálica de dicho
mamífero.
26. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero tiene especificidad de secuencia por una secuencia
de ácido nucleico que regula la expresión de o codifica un
polipéptido, expresándose dicho polipéptido intracranealmente en
dicho mamífero.
27. El uso de la reivindicación 26, en el que
dicho polipéptido participa en la señalización celular.
28. El uso de la reivindicación 27, en el que
dicho polipéptido participa en la señalización opiode.
29. El uso de la reivindicación 27, en el que
dicho polipéptido es un receptor opiode.
30. El uso de la reivindicación 29, en el que
dicho receptor es un receptor de morfina.
31. El uso de la reivindicación 29, en el que
dicho receptor es un receptor de neurotensina.
32. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero tiene especificidad de secuencia por una secuencia
de ácido nucleico que regula la expresión de o codifica un
polipéptido, expresándose dicho polipéptido extracranealmente en
dicho mamífero.
33. El uso de la reivindicación 32, en el que
dicho polipéptido se expresa en el tracto gastrointestinal.
34. El uso de la reivindicación 32, en el que
dicho oligómero comprende una secuencia seleccionada del grupo
constituido por las SEC ID Nº:1 y 2.
35. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero está libre de acridina.
36. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero está libre de proteínas.
37. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero está libre de ADN.
38. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero está libre de péptidos.
39. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero está libre de bis-PNA.
40. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero está libre de biotina.
41. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho oligómero está libre de fluoresceína.
42. El uso de la reivindicación 23, en el que
dicho medicamento es un medicamento para administrar fuera del
sistema nervioso central de dicho mamífero.
43. El uso de la reivindicación 42, en el que
dicho medicamento es un medicamento para administrar por vía
intraperitoneal.
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