ES2315595T3 - Composiciones para tratar cancer con uso de virus. - Google Patents

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Abstract

Uso de un virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero que tiene un tumor, en el que el medicamento se administra intravenosamente en dosis múltiples a dicho mamífero en una cantidad suficiente para causar la regresión del tumor.

Description

Composiciones para tratar cáncer con uso de virus.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al uso de ciertos virus en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en mamíferos.
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Antecedentes de la invención 1. Tratamiento del cáncer
A pesar de los recientes avances en quimioterapia y radiación, el cáncer sigue siendo la segunda enfermedad más mortal en Estados Unidos. En 1993 habrá cerca de dos millones de nuevos casos de cáncer diagnosticados y se espera que mueran de cáncer más de 525.000 personas. La supervivencia global de cinco años se aproxima al cincuenta por ciento para todos los pacientes y el pronóstico continúa siendo particularmente malo para aquellos con tumores sólidos avanzados.
2. Efecto de los virus sobre el cáncer
La asociación entre la exposición a diversos virus y la regresión del tumor ha sido el objeto de varios trabajos de casos previos. La mayoría de los virus descritos en esos trabajos son patógenos en humanos, e incluyen las paperas y el sarampión. Se ha descrito también el efecto de otros virus específicos sobre tipos particulares de células cancerosas: Smith et al, (1956) Cancer, 9, 1211 (efecto de los virus APC sobre el carcinoma de cérvix); Holzaepfel et al, (1957) Cancer, 10, 577 (efecto del virus APC3 sobre el tumor epitelial); Taylor et al, (1970) J. Natl. Cancer Inst., 44, 515 (efecto del enterovirus-1 bovino sobre el sarcoma-1); Shingu et al, (1991) J. General Virology, 72, 2031 (efecto del enterovirus bovino, MZ-468 sobre células de leucemia F-647a); Suskind et al, (1957) PSEBM, 94, 309 (efecto del virus Coxsackie B3 sobre células tumorales HeLa); Rukavishnikova et al, (1976) Acta Virol., 20, 387 (efecto de la cepa de la gripe A sobre tumores de ascites).
Las referencias más tempranas describían la regresión tumoral parcial en pacientes tratados con vacuna viral atenuada viva con el fin de vacunarlos contra la viruela o la rabia. Véanse DePace, N.G. (1912) Ginecologia, 9, 82-88; Salmon, P. & Baix (1922) Compt. Rend. Soc. Biol., 86, 819-820. Se ha apreciado también una regresión parcial de tumores y una regresión de leucemias durante infecciones de sarampión aparecidas de forma natural. Véanse Pasquinucci, G. (1971) Lancet, 1, 136; Gross, S. (1971) Lancet, 1, 397-398; Bluming, A.Z. y Ziegler, J.L. (1971) Lancet, 2, 105-106. En un estudio de 90 pacientes de cáncer infectados intencionadamente con virus de paperas vivos, se apreció una regresión del tumor en 79 casos. Véase Asada (1974) Cancer, 34, 1907-1928. Sin embargo existe una gran preocupación acerca de las graves secuelas de la infección con estos patógenos humanos. Además, el mecanismo del efecto anticancerígeno nunca se exploró totalmente por los investigadores. Todos los efectos apreciados tras la exposición a esos virus eran asimismo temporales.
3. Efecto del NDV sobre el cáncer
El virus de la enfermedad de Newcastle ("NDV") es un miembro de la familia Paramixovirus. Los hospedadores naturales para el NDV son pollos y otras aves. El NDV se une típicamente a ciertas moléculas sobre la superficie de células hospedadoras animales, se fusiona con la superficie celular e inyecta su material genético en el hospedador. Una vez dentro, los genes virales dirigen la célula hospedadora para hacer copias del virus. Estas copias de NDV se liberan luego para infectar otras células, que a su vez destruyen la célula hospedadora. A diferencia de algunos virus, no es conocido que produzca ninguna enfermedad humana grave. A diferencia de muchos otros tipos de virus (p.ej. herpes, hepatitis, VIH), los paramixovirus no interfieren con los genes de la célula hospedadora, y no es conocido que sean carcinogénicos.
La regresión temporal de tumores se ha descrito en un pequeño número de pacientes expuestos a NDV, los cuales sucumbieron eventualmente todos a sus cánceres. Véase, Csatary, L.K. (1971) Lancet, 2, 825. Csatary apreció la regresión de un cáncer gastrointestinal en un granjero de pollos durante una epidemia de la enfermedad de Newcastle en sus pollos. En un trabajo anecdótico similar, Cassel, W. A. y Garrett, R. E. (1965) Cancer, 18, 863-868, apreciaron la regresión de un cáncer cervical primario, que se había extendido a los ganglios linfáticos, en un paciente tras la inyección de NDV en el tumor cervical. Debido a que el mecanismo de la actividad tumoricida observada se pensó que era inmunológico, no se realizó ningún trabajo para averiguar la citotoxicidad tumoral directa del virus. En lugar de esto, los esfuerzos se centraron en los efectos inmunomoduladores del NDV. Véanse, por ejemplo, Murray, D. R., Cassel, W. A., Torbin, A. H, Olkowski, Z. L., & Moore, M. E. (1977) Cancer, 40, 680; Cassel, W. A., Murray, D. R., & Phillips, H. S. (1983) Cancer, 52, 856; Bohle, W., Schlag, P. Liebrich, W. Hohenberger, P. Manasterski, M. Möller, P., y Schirrmacher, V. (1990) Cancer, 66, 1517-1523.
Derwent Abstract AN 1976-60708x describe el uso de NDV vivos para tratar cáncer.
CARPLUS Abstract AN 1992:104333 describe la inyección intramuscular de NDV atenuado para producir interferones.
J. Surgical Research, Vol 52 (1992), 448-453 describe la administración subcutánea de células tumorales a ratones atímicos, seguido de la inyección intralesional de NDV vivos o inactivados por calor.
Surg. Forum, Vol. 43, 1992, 603-606 describe el uso del oncogen N-myc para potenciar la sensibilidad de neuroblastoma a la inactivación por NDV.
La presente invención proporciona el uso del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un mamífero que tiene un tumor, donde el medicamento se administra intravenosamente en múltiples dosis a dicho mamífero en una cantidad suficiente para causar la regresión del tumor.
La invención proporciona así un uso de NDV en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de virus en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona el Paramyxovirus en combinación con otro agente, administrándose ambos en cantidades suficientes de modo que la combinación sea efectiva frente al cáncer.
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Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra la regresión de xenotrasplantes de neuroblastoma humano IMR-32 en ratones atímicos, tras la inyección intratumoral con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 2 muestra la regresión de xenotrasplantes de fibrosarcoma humano HT-1080 en ratones atímicos, tras la inyección intratumoral con NDV vivos (cepa 73-T)
La Figura 3 muestra la regresión de xenotrasplantes de carcinoma de pulmón humano de células grandes NCI-H460 en ratones atímicos, tras la inyección intratumoral con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 4 muestra la regresión de xenotrasplantes de neuroblastoma humano IMR-32 tras inyecciones sistémicas (intraperitoneales) de NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 5 ilustra la efectividad de una cepa (M, Mass MK107) de NDV de virulencia relativamente moderada con la de una cepa de virulencia relativamente alta (73-T) en la producción de regresión de tumores.
La Figura 6 muestra la regresión de xenotrasplantes de glioblastoma humano U87MG en ratones atímicos tras inyecciones intratumorales con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 7 muestra la inhibición del crecimiento de xenotrasplantes de carcinoma cervical humano KB8-5-11 en ratones atímicos tras inyecciones intratumorales con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 8 muestra la regresión de carcinoma de próstata humano PC-3 en ratones atímicos, tras inyecciones intratumorales en ratones atímicos con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 9 muestra la inhibición del crecimiento de carcinoma de colon humano HT29 en ratones atímicos, tras inyecciones intratumorales con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 10 muestra la inhibición del crecimiento de carcinoma de mama humano SK-BR-3 en ratones atímicos, tras inyecciones intratumorales con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 11 muestra la inhibición del crecimiento de carcinoma de colon humano SW620 en ratones atímicos, tras inyecciones intratumorales con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 12 muestra la inhibición del crecimiento de carcinoma de colon humano MM17387 en ratones atímicos, tras inyecciones intratumorales con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 13 muestra la regresión de un sarcoma sinovial humano TH15145 en ratones atímicos, tras inyecciones intratumorales con NDV vivos (cepa 73-T).
La Figura 14 muestra la regresión de un xenotrasplante de melanoma humano MEL330 en ratones atímicos, tras inyecciones intratumorales con NDV vivos (cepa 73-T).
Nota: solamente la figura 4 es ilustrativa de la presente invención, todas las demás figuras se proporcionan solamente de manera informativa.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas actualmente
La presente invención proporciona el uso de ciertos virus en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer. El virus es un Paramixovirus, preferiblemente virus citolíticos. En la invención, el Paramyxovirus es un virus de la enfermedad de Newcastle ("NDV"). Según se usan en la presente solicitud, los términos "virus", "Paramixovirus" y "virus de la enfermedad de Newcastle" se emplean en sentido amplio y se refieren tanto a virus intactos como a fragmentos virales, así como a virus y fragmentos virales genética, física o químicamente modificados.
Los Paramixovirus, incluyendo varias cepas de NDV, tanto citolíticas como no citolíticas, están disponibles para el público y se pueden obtener de vendedores, como la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD.
El virus empleado en la invención se puede preparar mediante diversos métodos. Por ejemplo, el NDV se puede preparar en huevos de pollo fertilizados de 8 a 10 días de edad (obtenidos de SPAFAS, Inc., Roanoke, IL). Los métodos de aislamiento del virus son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Weiss, S. R. & Bratt, M. A. (1974) J. Virol., 13, 1220-1230. Este método se describe además en el Ejemplo nº 1, más adelante. Usando este método de aislamiento, se puede obtener NDV que es aproximadamente 90-95% puro.
Alternativamente, el virus se puede preparar en un cultivo celular in vitro. Preferiblemente, el cultivo celular comprende células de mamífero, y más preferiblemente, células cancerosas de mamífero. Una ventaja de utilizar este método de preparación del virus es que evita problemas asociados con proteínas extrañas residuales en la preparación viral. Las células consideradas por estos métodos incluyen, pero no están limitadas a, fibroblastos fetales humanos y líneas celulares establecidas, como fibrosarcoma humano HT1080 (disponible para el público de ATCC) o las propias células cancerosas del paciente. Las células pueden ser dependientes de anclaje o independientes de anclaje.
Las técnicas de cultivo celular que se pueden emplear en la preparación del virus se conocen en la técnica y pueden incluir el uso de matraces de cultivo estacionarios con áreas superficiales grandes, o matraces de tipo cilindro. Preferiblemente, el tipo de sistema de cultivo seleccionado puede soportar números de células relativamente grandes.
Los medios de cultivo celulares que se pueden emplear en la producción del virus se conocen por los expertos en la técnica. El medio incluye típicamente una fuente de nutrientes, uno o varios antibióticos y albúmina o una fuente de suero que contiene uno o varios factores de crecimiento. La selección de medios particulares y de constituyentes del medio adecuados para las células empleadas en el cultivo está comprendida en la experiencia en la técnica.
En la Tabla 1, más adelante, se muestra un ejemplo de un medio de cultivo adecuado para cultivar NDV en un cultivo celular in vitro:
1
Las condiciones de cultivo incluyen típicamente incubación a temperatura deseada (como 37ºC), así como concentraciones seleccionadas de oxígeno y dióxido de carbono. Las condiciones de cultivo particulares seleccionadas se pueden determinar de acuerdo con las células empleadas en el cultivo, y la determinación de dichas condiciones está comprendida en la experiencia en la técnica.
Las células se colocan en el recipiente de cultivo y se dejan incubar y crecer bajo las condiciones de cultivo seleccionadas. Preferiblemente, las células dependientes de anclaje se dejan crecer hasta la confluencia o pico de crecimiento. El tiempo requerido para el crecimiento variará dependiendo del tamaño del inóculo celular inicial añadido al recipiente de cultivo y del tiempo de multiplicación por dos de la línea celular que se está empleando. Preferiblemente, se siembran en placa de aproximadamente 3 x 10^{3} a aproximadamente 3 x 10^{5} células por cm^{2} y se cultivan durante uno a cinco días. Para la inoculación con virus del cultivo celular, el medio se elimina de las células (para células adherentes, mediante aspiración del medio de cultivo; para células cultivadas en suspensión, mediante centrifugación de la suspensión celular y aspiración del sobrenadante celular) y se añade el virus (tras reconstitución) a las células, en un volumen mínimo de medio o solución salina (como solución salina equilibrada de Hank, Gibco) para evitar la deshidratación. Preferiblemente, este volumen varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 2500 microlitros por cm^{2} de área superficial del recipiente de cultivo o por 10^{5} células. La dilución preferida del inóculo de virus varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 unidades infecciosas por célula, dependiendo la relación óptica del virus particular y de la línea celular. El virus se cultiva a continuación de aproximadamente 1 a 7 días, determinándose primariamente el espacio de tiempo mediante la supervivencia residual de la línea celular. Para el NDV, el tiempo óptimo de recogida es de 1 a 5 días tras la inoculación del virus.
El virus se puede recoger a continuación, bien eliminando el sobrenadante y reemplazándolo por medio nuevo o por medio nuevo con células nuevas a intervalos de 12 a 48 horas, o congelando y descongelando las células para liberar el virus en el sobrenadante. El sobrenadante se puede centrifugar y ultracentrifugar a continuación para recuperar el virus en forma relativamente pura. La pureza de la preparación viral se puede ensayar mediante determinación de proteínas y/o mediante electroforesis. El virus se puede añadir a continuación a un vehículo farmacéuticamente aceptable, descrito con más detalle a continuación.
De acuerdo con la invención, se administra una cantidad eficaz de virus al mamífero. El término "cáncer" en la presente invención se usa en un sentido amplio, y se refiere al estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento celular no regulado. Se considera que tales virus se pueden usar para tratar distintos cánceres, incluyendo pero no limitados a carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de próstata, adenocarcinoma de colon, carcinoma cervical, carcinoma endometrial, carcinoma ovárico, carcinoma de vejiga, tumor de Wilm, fibrosarcoma, osteosarcoma, melanoma, sarcoma sinovial, neuroblastoma y glioblastoma. El virus se puede administrar al mamífero en cualquier momento durante el curso de la enfermedad maligna cuando se detecta el cáncer para reducir la carga del tumor primario, así como la extensión metastática. Alternativamente, el virus se puede administrar como medida profiláctica, previamente a la aparición o detección del cáncer en el mamífero. También se considera que los virus se puedan administrar a un mamífero ya tratado contra el cáncer, si ese cáncer no responde completamente o se reproduce. Preferiblemente, si un tumor es operable, el virus se administra después de que se haya eliminado quirúrgicamente la mayor parte del tumor.
Se cree que el NDV tiene una actividad citolítica directa sobre las células cancerosas, aunque no se comprende completamente. También se cree que el NDV es capaz de diferenciar específicamente las células cancerosas de las células normales, sanas. Los resultados (no mostrados) han indicado que varios oncogenes (H-ras, N-ras y N-myc), que se sabe que confieren un comportamiento maligno a las células cancerosas, incrementan la susceptibilidad de las células a morir por NDV. Véanse, Lorence, R. M., Reichard, K. W., Cascino, C. J. et al (1992) Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 33, 398; Reichard, K. W., Lorence, R. M., Cascino, C. J. et al (1992) Surg. Forum, 43, 603-606. Además, se ha observado que el tratamiento de células con ácido retinoico (vitamina A), también incrementa la lisis de células cancerosas por NDV. Reichard, K. W., Lorence, R. M., Katubig, B. B., et al (1993) J. Pediatr. Surg., 28, 1221.
Se cree que la actividad citolítica del NDV es el resultado de la unión directa del virus a la célula cancerosa. Se ha identificado un componente de la molécula o moléculas de la superficie celular que permite al NDV unirse a las células de pollo. Véase Paulson, J. C., Sadler, J. E. & Hill, R. C. (1979) J. Biol. Chem., 254, 2120-2124. La molécula parece ser una o varias moléculas de glicoproteína y/o glicolípidos relativamente complejas sobre las cuales se disponen los componentes de ácido siálico en una configuración particular. La opinión actual del solicitante es que las variaciones en glicoproteínas y/o glicolípidos que contienen ácido siálico situadas sobre la superficie de las células cancerosas, pueden mediar la especificidad y actividad del NDV. Por ejemplo, se ha demostrado que la sensibilidad de las células cancerosas al NDV disminuye mediante pretratamiento con neuraminidasa, que elimina por escisión los residuos de ácido siálico. Véase, Reichard, K. W., Lorence, R. M., Katubig, B. B. et al (1993) J. Pediatr. Surg., 28, 1221.
El virus se puede administrar al mamífero en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, vehículos adecuados para administrar el virus pueden incluir fluidos como agua, solución salina, tampón y medio de cultivo celular. Más preferiblemente, se usa una solución salina como vehículo. Será obvio para las personas expertas en la técnica, que ciertos vehículos pueden ser más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración del virus que se va a administrar.
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El virus se administra al mamífero mediante inyección (p.ej. intravenosa, intraperitoneal). El virus se administra sistémicamente. Las dosis y calendarios efectivos para administrar el virus se pueden determinar empíricamente, y la realización de dichas determinaciones está comprendida en los conocimientos de la técnica. Los solicitantes han descubierto que son particularmente efectivas para tratar tumores, dosis de tratamiento local en el intervalo de aproximadamente 4 x 10^{8} a aproximadamente 4 x 10^{10} UFP (unidades formadoras de placas) de NDV por kilogramo de peso corporal del mamífero. Para el tratamiento sistémico, los solicitantes creen que puede ser preferible para el tratamiento del cáncer un intervalo de aproximadamente 4 x 10^{10} a aproximadamente 4 x 10^{12} UFP por kilogramo. Los expertos en la técnica creen que la dosis de virus que se debe administrar, variará dependiendo, por ejemplo, del mamífero que recibirá el virus, del tipo de cáncer, la extensión del crecimiento de las células cancerosas o la metástasis, el sitio biológico o compartimiento corporal del tumor o tumores, la cepa de virus, la vía de administración y la identidad de cualquier otro fármaco o tratamiento que se esté administrando al mamífero, como radiación, quimioterapia o tratamiento quirúrgico. El intervalo óptimo entre dosis múltiples del virus se puede determinar empíricamente y está comprendido en los conocimientos de la técnica. La administración del virus debe de continuar hasta que se ha restablecido la salud del mamífero.
Una cantidad efectiva de virus se puede administrar al mamífero en combinación con otro agente. El virus se puede administrar al mamífero como se describe anteriormente. El otro agente administrado en combinación con el virus puede ser una sustancia existente en la naturaleza o sintética, y preferiblemente tiene actividad anticancerígena, actividad potenciadora inmunitaria o actividad potenciadora del virus.
En una realización, el agente es un agente citotóxico o citostático. El agente citotóxico o citostático puede ser un compuesto quimioterapéutico conocido en la técnica. Los compuestos quimioterapéuticos considerados por la presente invención incluyen, pero no están limitados a Tiotepa, Busulfan, Ciclofosfamida, Metotrexato, Citarabina, Bleomicina, Cisplatino, Doxorubicina, Melfalan, Mercaptopurina, Vinblastina, 5-Fluorouracilo, Taxol y Ácido Retinoico. Típicamente, los agentes citotóxicos o citostáticos funcionan destruyendo las células y/o inhibiendo su multiplicación y son, por tanto, útiles para el tratamiento del cáncer.
En otra realización, el agente es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo existente en la naturaleza o un anticuerpo modificado biológica, química, física o genéticamente, usando métodos que están comprendidos en los conocimientos de la técnica. Tales anticuerpos pueden potenciar la actividad anticancerígena del virus, uniéndose a la célula tumoral o al virus, una vez que éste está unido a la célula tumoral.
En otra realización, el agente es un agente potenciador del sistema inmunitario, como un inmunoadyuvante o citoquina. Los inmunoadyuvantes o citoquinas, también denominados "modificadores de la respuesta biológica", se conocen en la técnica. Generalmente, tales moléculas son útiles para estimular o potenciar los mecanismos de defensa del hospedador y son útiles, por tanto, en la terapia anticancerígena. Ejemplos de inmunoadyuvantes o citoquinas que se pueden administrar incluyen, pero no están limitados a, interferón o interferones, factor de crecimiento de colonias (CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), factores de crecimiento e interleuquinas, como IL-1, IL-2 e IL-6.
En otra realización, el agente es un agente inmunosupresor. Preferiblemente, el agente inmunosupresor es un compuesto farmacéutico conocido en la técnica. Los agentes inmunosupresores considerados por la presente invención incluyen, pero no están limitados a Ciclosporina A, Azatiaprina y Leflunomida y varias preparaciones de corticoesteroides. Los agentes inmunosupresores se cree que funcionan bloqueando la respuesta inmunitaria (mediada por células, mediada por anticuerpos y mediada por citoquinas) frente a virus, lo cual puede potenciar la actividad anticancerígena del virus.
El agente se administra preferiblemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como agua, solución salina o tampón. Las formas de administración del agente al mamífero incluyen, pero no están limitadas a, administración oral o inyección (p.ej. intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular). Está comprendido en los conocimientos de la técnica el hecho de determinar vehículos aceptables y medios adecuados para la administración del agente. El Paramyxovirus y el agente se pueden administrar mediante los mismos medios o mediante medios diferentes. Por ejemplo, el virus se puede administrar al mamífero mediante inyección intravenosa, mientras que el otro agente se administra al mamífero por vía oral.
El virus y el agente se pueden encapsular también en un liposoma u otra estructura de tipo bolsa farmacéuticamente aceptable. Alternativamente, el virus y el agente se pueden acoplar mediante conjugación o técnicas de enlace conocidas en la técnica.
Más adelante se describen dosis y calendarios efectivos para la administración del virus. Las dosis y calendarios efectivos para la administración del otro agente en combinación con el virus se pueden determinar empíricamente, y la realización de tales determinaciones está comprendida en los conocimientos de la técnica. Previamente a la administración del virus y del otro agente, es preferible determinar los niveles de toxicidad de todos los componentes, para evitar efectos deletéreos. Dependiendo del agente administrado, el virus y el agente pueden tener actividad aditiva o sinérgica. Por ejemplo, la administración del virus puede reducir la dosis eficaz requerida del otro agente. Los expertos en la técnica sabrán que la dosis del otro agente administrado variará dependiendo, por ejemplo, del mamífero que se esté tratando, del tipo de cáncer, la localización sistémica del cáncer y de la cantidad de virus que se esté administrando al mamífero. Es posible que se deban administrar dosis múltiples del otro agente en combinación con el virus. El agente se puede administrar a intervalos de tiempo diferentes de la administración del virus. Los intervalos de administración se pueden determinar empíricamente, y tal determinación está comprendida en los conocimientos de la técnica. La administración del virus y del agente debería continuar hasta que se haya restablecido la salud del mamífero.
Ejemplos Ejemplo nº 1 Tratamiento de tumores humanos en ratones atímicos con NDV intralesional (ejemplo informativo solamente)
Se obtuvieron ratones atímicos hembra Balb-c de Life Sciences, Incorporated, St. Petersburg, FL y Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Se alojaron en una habitación aislada, en jaulas esterilizadas, filtradas y se les proporcionó comida y agua esterilizadas en autoclave a voluntad. El cuidado de estos animales y los protocolos experimentales se realizaron según las directrices establecidas por los Institutional Animal Care Committees, Cook County Hospital y Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center, Chicago, IL. Los ratones se obtuvieron a aproximadamente cuatro semanas de edad, y se dejó que se aclimataran a su nuevo medio durante una semana.
Se obtuvieron líneas celulares tumorales congeladas de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, y se derivaban de tumores humanos. Las líneas celulares se mantuvieron en Opti-MEM (Gibco-BRL, Grand Island, NY) que contenía 2,4 g/l de bicarbonato sódico, suero bovino fetal al 10%, inactivado por calor y diluciones 1/100 de las siguientes soluciones 100X: aminoácidos no esenciales MEM (Gibco BRL, nº de catálogo 320-1140AG); L-glutamina (Gibco BRL, nº de catálogo 320-5030AG); y antibiótico-antifúngico (Gibco BRL, nº de catálogo 600-5240AG). Las células se colocaron en matraces de cultivo de 225 mm^{2} y se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% para permitir el crecimiento celular adecuado. Las células se recogieron a continuación mediante tratamiento breve con tripsina al 0,25% (Gibco BRL, Grand Island, NY), se lavaron en medio exento de suero y se contaron. Luego se colocaron las células en medio exento de suero a una concentración de 1x10^{7} células/0,1 mililitros en una preparación para inyección en los animales.
Bajo condiciones limpias, las células tumorales se implantaron en el espacio subcutáneo sobre el flanco de animales experimentales, inyectando 0,1 ml de solución que contenía 1x10^{7} células, con una aguja de calibre 25. Los animales se colocaron a continuación de nuevo en sus jaulas y se dejó que las células tumorales creciesen en los animales.
Tras aproximadamente 10 días, se obtuvieron tumores de 6,5 mm de diámetro o mayores en más del 90% de los animales. Los animales que presentaban tumores de al menos 6,5 mm de diámetro mayor se dividieron aleatoriamente en tres grupos, se marcaron y las dimensiones del tumor se registraron cuidadosamente por un observador independiente.
La cepa 73-T de NDV se obtuvo de William A. Cassel, Atlanta, Georgia y se preparó como sigue. Se inyectaron aproximadamente 100 unidades formadoras de placas (UFP) de partículas virales vivas, en embriones de pollo de 10 días de edad (SPAFAS, Inc., Roanoke, IL). Los huevos se incubaron durante 48 horas, tiempo durante el cual el virus se replicó rápidamente, matando la mayoría de los huevos. A continuación, se recogió el fluido alantoideo de los embriones. Los glóbulos rojos, los desechos de membranas embrionarias y de cáscara de huevo contaminantes se eliminaron del fluido alantoideo mediante dos centrifugaciones a baja velocidad a 7.520 x g durante 15 minutos cada una. El virus que contenía sobrenadante se ultracentrifugó a continuación a 50.000 x g durante 18 horas. El glóbulo de virus resultante se volvió a poner en suspensión a continuación en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (Gibco BRL, Grand Island, NY). Se preparó un gradiente de sacarosa discontinuo a concentraciones de 20% y 50%, y la suspensión del virus se colocó sobre el gradiente y se centrifugó durante 1 hora a 75.000 x g. La cepa de NDV purificada se recogió de la superficie de contacto 20%-55% y se almacenó a -80ºC.
La dosis de virus se expresa normalmente en unidades formadoras de placas (UFP), o número de partículas de virus infecciosas que son capaces de replicarse en las células y disgregarlas. Las UFPs se midieron en un ensayo de placas. Se formaron monocapas de células de fibrosarcoma humano HT 1080 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) o de células de embrión de pollo (SPAFAS, Inc., Roanoke, IL), sobre placas de cultivo de tejido de plástico de 50 mm en medio de cultivo celular Opti-MEM, enriquecido con aminoácidos no esenciales, glutamina, antibiótico-antimicótico y suero bovino fetal al 10% inactivado por calor. Se añadieron soluciones en serie del virus en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a las monocapas, y las partículas virales se dejaron adsorber durante 45 minutos a temperatura ambiente. Si se usaban células de embrión de pollo, las monocapas se cerraban a continuación herméticamente con una mezcla de Bacto-Agar al 0,9% (Difco, Detroit, MI) en medio de cultivo. Si se usaban células HT 1080, sólo se requería medio celular. Las monocapas se incubaron a continuación a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 18 horas (para células HT 1080) o durante 2 días (para células de embrión de pollo). Todo el agar se eliminaba y las células se fijaron con metanol al 100% y se tiñeron con cristal violeta al 0,2%.
Las áreas claras sobre la monocapa, denominadas placas, representan el efecto lítico de una partícula de virus infecciosa tras la replicación en la monocapa celular. El número de placas se contó, y se calculó el UFP/ml basándose en el factor de dilución para cada placa.
La cepa de NDV purificada se diluyó en una solución salina (p.ej. solución salina de tampón fosfato, PBS) a una concentración de 1 x 10^{7} UFP/0,1 ml. La solución se dividió en dos grupos, y uno se trató mediante exposición a luz ultravioleta para inactivar el genoma viral. Se preparó también una tercera alícuota de solución salina sola. El grupo del virus muerto por UV y de la solución salina pura sirvieron como testigos.
Los tres grupos de animales se trataron cada uno con una de las tres soluciones descritas anteriormente, como sigue. El animal portador del tumor se limpiaba cuidadosamente con alcohol, y se inyectaba uniformemente la solución de tratamiento en el tumor, usando una aguja de calibre 25 y una jeringa de tuberculina. Los animales se colocaron a continuación de nuevo en sus jaulas respectivas y se observaron. Cada tres días, los animales se examinaron por un observador independiente cegado, que registró el tamaño de cada animal en cada grupo y calculó el volumen tumoral {(\pi x L x H x W)/6)}.
Los resultados de estos experimentos se resumen en Figs. 1-3. Los animales tratados con NDV vivos experimentaron una regresión tumoral completa en un plazo de 30 días de tratamiento, mientras que los animales tratados con virus inactivado por UV o suero salino solo presentaban un crecimiento tumoral no reducido de sus tumores.
En el caso del neuroblastoma (IMR-32) (Fig. 1) se observó regresión tumoral completa en 18 de cada 20 ratones tratados una vez con NDV vivos. Los tumores en los otros dos ratones, se redujeron, pero no completamente, y requirieron un segundo tratamiento 10 días más tarde para la regresión completa. En el día 23, un tumor que había desaparecido completamente empezó a volver a crecer, pero un segundo tratamiento con virus en el día 23 condujo a una regresión completa de larga duración. No se observó regresión tumoral en ninguno de los 8 ratones tratados con NDV muertos por UV o en ninguno de los 19 ratones tratados con solución salina [P < 0,001 (mediante el ensayo exacto de Fisher) comparados con el grupo tratado con NDV vivos].
La Fig. 2 muestra la terapia intralesional de xenotrasplantes de fibrosarcoma humano HT 1080 establecidos (\geq 0,6 cm) en ratones atímicos, usando NDV (N = 10, 10^{7} UFP) o testigo de solución salina (PBS, N = 9). Tras un tratamiento único con NDV vivos, 8 de cada 10 tumores se redujeron completamente (los tamaños medios de estos 8 tumores se representan gráficamente por separado). Los otros dos tumores mantuvieron sus tamaños entre los días 2 y 24 (y sus tamaños medios se representan gráficamente por separado). En los nueve ratones tratados con placebo se observó un crecimiento tumoral no reducido [P < 0,005 (mediante el ensayo exacto de Fisher) para la regresión tumoral, comparado con el grupo que recibió NDV].
La Fig. 3 muestra la terapia intralesional de xenotrasplantes de carcinoma pulmonar humano de células grandes NCI-H460 establecido en ratones atímicos, usando NDV vivos (N = 3, 10^{7} UFP) o testigo de solución salina (N = 1). Se representaron gráficamente por separado los volúmenes tumorales en una escala logarítmica para cada uno de estos cuatro ratones, en función del tumor tras el tratamiento. La regresión tumoral completa se produjo en 2 de cada 3 ratones tratados con NDV vivos. El tumor en el ratón tratado con solución salina continuó creciendo sin reducirse.
En resumen, estos ejemplos muestran que una dosis de NDV, proporcionada intralesionalmente a ratones atímicos, producía la erradicación completa y permanente de una amplia variedad de tumores humanos, que crecían sin reducción en los animales testigo. El tratamiento de NDV con una corta exposición a radiación UV, que dañaba el material genético de forma que el virus no se podía replicar pero todavía se podía unir, no era más efectivo que el tratamiento con solución salina sola, en cuanto a producir regresión del tumor. De los animales tratados con NDV vivos se realizó un seguimiento hasta el final para el resto de su vida natural, y se observaron muy pocas reapariciones en cualquiera de los animales. Los tumores que se reproducían, sin embargo, se reducían completamente tras un segundo tratamiento local de NDV. Además, no se apreció ningún efecto adverso del tratamiento viral en ninguno de los animales.
Ejemplo nº 2 Tratamiento de tumores humanos en ratones atímicos usando terapia sistémica de NDV
Se inyectaron ratones atímicos con xenotrasplantes de tumores humanos como se describe en el Ejemplo nº 1. Cuando se lograban tumores superiores a 6 mm de diámetro, los animales se dividían en tres grupos. El NDV se preparaba (véase Ejemplo nº 1) en concentraciones de 1 x 10^{8} UFP/0,3 ml o 1 x 10^{9} UFP/0,3 ml de solución salina. La solución testigo era un volumen igual de solución salina sola.
Los abdómenes de los animales se lavaron cuidadosamente con alcohol y el NDV se inyectó intraperitonealmente, usando una aguja de calibre 25. Un grupo de ratones experimentales (N = 3) recibió una única inyección de NDV a la dosis más elevada (10^{9} UFP), mientras que el otro grupo de 4 ratones recibió inyecciones de 10^{8} UFP tres veces por semana. Los animales testigo recibieron inyecciones de solución salina. A continuación, los animales se observaron y se siguieron los tamaños de los tumores como se describió para el Ejemplo nº 1.
Los resultados se resumen en la Fig. 4. Seis de cada siete animales tratados con NDV vivos intraperitonealmente, experimentaron una regresión completa de sus tumores alrededor del día 52, mientras que los animales tratados con solución salina sola, experimentaron un crecimiento no reducido del tumor. Se observó una regresión tumoral completa en todos los ratones tratados sólo una vez con 10^{9} UFP de NDV (- -\bullet- -) y en 3 de cada 4 ratones tratados múltiples veces con 10^{8} UFP de NDV vivos (- -\sqbullet- -). Los volúmenes tumorales para el ratón tratado múltiples veces con 10^{8} UFP de NDV que no experimentaban una regresión tumoral completa, se representan gráficamente por separado (- -\ding{117}- -). Todos los tumores tratados con PBS (- -\circ- -) solo, mostraban una progresión tumoral marcada (P < 0,0025, ensayo exacto de Fisher).
Los resultados demuestran que el NDV es efectivo en el tratamiento del cáncer cuando se administra sistémicamente. No se apreció ningún efecto adverso en los animales desde el tratamiento con NDV vivos.
Ejemplo nº 3 Tratamiento de tumores humanos en ratones atímicos usando cepas atenuadas de NDV (ejemplo informativo solamente)
La cepa 73-T de NDV se obtuvo y preparó como se describe en el Ejemplo nº 1. La cepa M de NDV (Mass - MK107) es una cepa menos virulenta que 73-T y se obtuvo del Dr. Mark Peeples, Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center, Chicago, IL. La cepa M se replicó de forma similar a la descrita en el Ejemplo nº 1 para la cepa 73-T de NDV.
Se inyectaron células tumorales HT1080 humanas a animales atímicos como se describió anteriormente. Se dejó que desarrollaran tumores de al menos 6,5 mm de diámetro, momento en el que se dividieron aleatoriamente en tres grupos, y se registraron sus tamaños tumorales.
Se inyectaron intralesionalmente 1,0 x 10^{8} UFP de la cepa 73-T de NDV en 0,1 ml de solución salina a los animales de un grupo, como se describió en el Ejemplo nº 1. Se inyectaron intralesionalmente 1,0 x 10^{8} UFP de la cepa M de NDV en 0,1 ml de solución salina al segundo grupo. Se inyectaron 0,1 ml de solución salina sola al último grupo. A continuación, se observaron los animales y se registraron los tamaños de sus tumores independientemente cada tres días, como se describe en el Ejemplo nº 1 anteriormente.
Los resultados se muestran en la Fig. 5. Como en el Ejemplo nº 1, los tumores tratados intralesionalmente con la cepa 73-T de NDV desaparecieron completamente. Dos de los tres tumores tratados intralesionalmente con la cepa M desaparecieron de forma similar en menos de tres semanas. No se produjo ninguna regresión en los ratones testigo tratados con solución salina.
Ejemplo nº 4 Ensayos in vitro que prueban el efecto del NDV sobre células cancerosas humanas
Se ensayó el NDV (cepa 73-T, preparada como se describe en el Ejemplo nº 1) con las líneas celulares cancerosas humanas enumeradas más adelante, para determinar la sensibilidad de cada uno de los tipos celulares al NDV.
KB-8-5-11 Carcinoma cervical
SW626 Carcinoma ovárico
SK-OV-3 Carcinoma ovárico
A172 Glioblastoma (cáncer cerebral)
HT1080 Sarcoma (fibrosarcoma)
KHOS Sarcoma (osteosarcoma)
IMR-32 Neuroblastoma
SW620 Carcinoma de colon
HT29 Carcinoma de colon
NCI-460 Carcinoma pulmonar (células grandes)
NCI-H510A Carcinoma pulmonar (células pequeñas)
SK-MEL-3 Melanoma
SK-MEL-28 Melanoma
SCC25 Carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello
MDMA468 Carcinoma de mama
MDMBA157 Carcinoma de mama
SKBR3 Carcinoma de mama
PC3 Carcinoma de próstata
G104 Tumor de Wilm
Con la excepción de las líneas celulares de carcinoma cervical KB-8-5-11 y de sarcoma KHOS (osteosarcoma), todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC, Rockville, Maryland. La línea celular de carcinoma cervical KB-8-5-11 se obtuvo del Dr. John Coon, Rush University, Chicago, Illinois, y la línea celular de sarcoma KHOS (osteosarcoma) se obtuvo del Dr. Warren Knudson, Rush University, Chicago, Illilois. Las células y el NDV se ensayaron según el ensayo de placas descrito en el Ejemplo nº 1, excepto porque se usaron mayores multiplicidades de infección (que variaban de 0,01 a 10). Todos los ensayos se realizaron en paralelo con cultivos testigo tratados con medio solo.
Los resultados de los ensayos de placas mostraron que todos los tipos celulares de cáncer eran susceptibles a la muerte celular por NDV. La citolisis se observó de 1 a 3 días después de la inoculación del virus y, en todos los casos, se observó mediante microscopía de contraste de fases, que consistía en desintegración de la membrana y disgregación celular.
Ejemplo nº 5 Tratamiento de tumores celulares cancerosos humanos en ratones atímicos usando terapia intralesional de NDV (ejemplo informativo solamente)
Los experimentos in vivo se realizaron según los métodos y procedimientos descritos en el Ejemplo nº 1, con las siguientes excepciones: (1) se usaron ratones macho atímicos Balb-C, obtenidos de Life Sciences, como hospedadores para las células de carcinoma de próstata PC3; se usaron ratones hembra como hospedadores para todas las demás células cancerosas ensayadas; (2) los tejidos tumorales identificados como carcinoma de colon MM17387, sarcoma sinovial TH14145, y melanoma MEL330, se obtuvieron de muestras de patología quirúrgica de pacientes de cáncer en el Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center y se hicieron pasar por explantes tumorales en ratones atímicos (véase Sharkey et al, (1978) The Nude Mouse in Experimental and Clinical Research, Editores: J. Fogh & B. P. Giovanella), Academic Press, New York, Volumen 1, págs. 187-214) y se trataron con NDV o con solución salina en el primer o el segundo pase. Las células de carcinoma cervical KB-8-5-11 se obtuvieron del Dr. John Coon, Rush University, Chicago, Illinois. Todas las demás líneas celulares tumorales descritas más adelante y en Figs. 6-14 se obtuvieron de ATCC, Rocville, Maryland.
Los animales tratados con NDV vivos experimentaron regresión tumoral o estabilización en un plazo de 30 días de tratamiento, mientras que los animales tratados con virus inactivado con UV o con solución salina sola, presentaban un crecimiento no reducido de sus tumores. Los resultados in vivo mostraban que una única dosis de NDV proporcionada intralesionalmente a ratones atímicos, producía la regresión o la inhibición del crecimiento de una gran variedad de tumores de células cancerosas y que los tumores de células cancerosas crecían sin control en animales testigo. No se observó ningún efecto adverso en ninguno de los animales. Los resultados de los experimentos in vivo se resumen en las Figuras 6-14.
En el caso del glioblastoma (U87MG) (Fig. 6), se observó una regresión completa del tumor en 4 de cada 4 ratones tratados una vez con NDV vivos. No se observó ninguna regresión tumoral en el ratón tratado con PBS.
La Fig. 7 muestra la terapia intralesional de los xenotrasplantes establecidos de carcinoma cervical KB8-5-11, usando NDV vivos (N = 12, 10^{7} UFP), NDV muertos por UV (N = 12), o testigo de solución salina (PBS, N = 12). Tras una única inyección de NDV vivos, se observó una inhibición pronunciada del crecimiento en los 12 ratones. Se observó un crecimiento no reducido del tumor en los 12 ratones tratados con solución salina. Se observó una ligera inhibición del crecimiento en los ratones tratados con virus muertos por UV.
La Fig. 8 muestra la regresión de cuatro xenotrasplantes de próstata humanos NPC-3, tras la inyección intratumoral con NDV vivos. Los tumores en los ratones tratados con PBS continuaron creciendo sin reducción.
Las Figs. 9, 10 y 11 muestran la inhibición del crecimiento de xenotrasplantes de carcinoma de colon HT29, carcinoma de mama SK-BR-3 y carcinoma de colon SW620 tras la inyección con NDV vivos, comparada con el testigo de solución salina.
La Fig. 12 muestra la inhibición del crecimiento de tres xenotrasplantes de carcinoma de colon MM17387 (en el segundo pase del paciente), tras la inyección con NDV vivos, comparada con el testigo de solución salina. Tres ratones tratados intratumoralmente con NDV muertos por UV mostraron un grado inferior de inhibición del crecimiento.
La Fig. 13 muestra la terapia intralesional de xenotrasplantes establecidos de sarcoma sinovial TH14145 humano de bajo pase (pase nº 1 o 2) en ratones atímicos. Se observó una regresión tumoral superior a 90% en seis de cada nueve ratones tratados con NDV vivos. No se observó regresión tumoral en ninguno de los cuatro ratones tratados con solución salina.
La Fig. 14 muestra la regresión de un único xenotrasplante de melanoma humano MEL330 en un ratón atímico, tras la inyección intratumoral con NDV. La progresión tumoral se observó en el ratón tratado con solución salina.

Claims (18)

1. Uso de un virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero que tiene un tumor, en el que el medicamento se administra intravenosamente en dosis múltiples a dicho mamífero en una cantidad suficiente para causar la regresión del tumor.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho tumor se selecciona de los grupos que consisten en: carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de próstata, adenocarcinoma de colon, carcinoma cervical, carcinoma endometrial, carcinoma ovárico, carcinoma de vejiga, tumor de Wilm, fibrosarcoma, osteosarcoma, melanoma, sarcoma sinovial, neuroblastoma y glioblastoma.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho tumor es un adenocarcinoma de colon.
4. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho tumor es un melanoma.
5. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho tumor es un neuroblastoma.
6. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho tumor es un glioblastoma.
7. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho tumor es un carcinoma cervical.
8. Uso según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicho tumor tiene un diámetro mayor que 6 milímetros.
9. Uso según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicho tumor es metastático.
10. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho virus de la enfermedad de Newcastle es la cepa Mass MK107.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho virus de la enfermedad de Newcastle es la cepa 73-T.
12. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que la cantidad de virus de la enfermedad de Newcastle administrado sistémicamente es aproximadamente 4 x 10^{10} a 4 x 10^{12} PFU/kg.
13. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se aísla de fluido alantoico.
14. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se aísla de un medio de cultivo.
15. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho medicamento se administra en combinación con un agente quimioterapéutico.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que dicho medicamento se administra en combinación con una citoquina.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que dicho medicamento se administra en combinación con un agente inmunosupresor.
18. Uso según cualquier reivindicación anterior, en la que dicho NDV está en forma purificada.
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