ES2316583T3 - El monoxido de carbono mejora los resultados de trasplantes de tejidos y organos y suprime la adoptosis. - Google Patents

Abstract

Uso de monóxido de carbono para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del rechazo crónico en un paciente que está experimentando o está a punto de experimentar un rechazo crónico a un órgano o tejido trasplantado.

Description

El monóxido de carbono mejora los resultados de trasplantes de tejidos y órganos y suprime la apoptosis.

Declaración en relación con la investigación patrocinada federalmente

Esta invención se realizó con financiación gubernamental con los números de subvención de los Institutos Nacionales de la Salud HL 58688. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Campo técnico

Esta invención se refiere al campo del aumento de la supervivencia celular.

Antecedentes

El gas monóxido de carbono (CO) es venenoso a altas concentraciones. Sin embargo, ahora se reconoce como una molécula de señalización importante (Verma et al., Science 259:381-384, 1993). Se ha sugerido que el monóxido de carbono actúa como una molécula mensajera neuronal en el cerebro (Id.) y como un modulador neuroendocrino en el hipotálamo (Pozzoli et al., Endocrinology 735:2314-2317, 1994). Al igual que el óxido nítrico (NO), el monóxido de carbono es un relajante del músculo liso (Utz et al., Biochem Pharmacol. 47:195-201, 1991; Christodoulides et al., Circulation 97:230.6-9, 1995) e inhibe la agregación plaquetaria (Mansouri et al., Thromb Haemost. 48:286-8, 1982). Se ha demostrado que la inhalación de bajos niveles de CO tiene efectos antiinflamatorios en algunos modelos.

El trasplante de células de islotes es un tratamiento viable para la mejora de la diabetes de tipo I (Lacy et al., Annu. Rev. Immunol., 2:183-98, 1984; Weir et al., J. Am. Optom. Assoc. 69:727-32, 2000; Berney et al., Langenbechs Arch. Surg. 385: 378-8, 2000; Shapiro et al., N Engl. J. Med., 343:230-8, 2000). Sin embargo, los procesos de trasplante clínico de islotes se han visto dificultados por varios factores. Un factor es el fallo primario (PNF) del injerto. Otro es la necesidad de grandes números de islotes del donante para conseguir una inversión satisfactoria de la diabetes (Shapiro et al., N Engl. J. Med., 343:230-8, 2000). Estas dos situaciones reflejan la misma patofisiología: la pérdida sustancial de células en el injerto en las primeras semanas posteriores al trasplante. Después del trasplante, los islotes experimentan una diversidad de factores de estrés tales como hipoxia antes de la vascularización secundaria (Carlsson et al., Diabetes 47:1027-32, 1998) y la exposición a citoquinas pro-inflamatorias y radicales libres liberados de macrófagos en el microentorno del trasplante (Rabinovitch et al., Diabetes 48:1223-9, 1999; Kaufman et al., J Exp Med. 772:291-302, 1990; Corbett et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:1731-5, 1993) y de macrófagos de islotes residentes (Mandrup-Poulsen et al., J. Immunol. 739:4077-82, 1987; Amush et al., J. Clin Invest. 702:516-26, 1998). Los efectos tóxicos de los fármacos inmunosupresores, así como el rechazo (Weir et al., Diabetes 46:1247-56, 1997) también contribuyen a la pérdida de células de los islotes. La existencia de PNF después de un trasplante de islotes singénico experimental (Nagata et al., Transplant Proc. 22:855-6, 1990; Arita et al., Transplantation 65:1429-33, 1998) indica que la inflamación no específica juega un papel importante en este escenario.

Se cree que la supervivencia de un órgano trasplantado está relacionada principalmente con el éxito de la inmunosupresión, en términos del bloqueo de la respuesta inmune que conduce al rechazo del injerto. Sin embargo, previamente se ha demostrado que los órganos trasplantados pueden protegerse por sí mismos de las lesiones vasculares que conducen a un rechazo por medio de la expresión de "genes protectores" (véase, por ejemplo, Bach et al., Nature Med. 3:196-202 (1997); y Soares et al., Nature Med. 4:1073-1077, 1998). Uno de estos genes, la hemooxigenasa-1 (HO-1), cataboliza el grupo hemo hasta biliverdina, hierro libre y CO (Tenhunen et al., Proc Natl Acad Sci USA 61:748-755, 1968). Dos publicaciones de Sato K et al (véase Journal of Immunology 166:4185-4194, 2001 and Acta Haematologica 103, Suppl. 1:87, 2000) se refieren a estudios animales en los que la administración de gas monóxido de carbono a receptores de injertos cardiacos (ratas) mejora significativamente la función y la supervivencia de dicho injerto en los receptores.

Resumen

La presente invención se basa, en parte, en las observaciones de que el CO promueve la supervivencia y/o la función de trasplantes de órganos, tejidos y células individuales. La presente invención se refiere al uso de CO como se define en las reivindicaciones adjuntas.

El órgano o tejido puede ser cualquier órgano o tejido que puede trasplantarse, por ejemplo, un hígado, un riñón, un corazón, un páncreas, un pulmón, intestino delgado y/o piel, y el donante puede ser de una especie diferente de la del receptor, o el donante y el receptor pueden ser de la misma especie. El donante y el receptor pueden ser animales no humanos o seres humanos. Como alternativa, el donante puede ser un animal no humano tal como un cerdo, y el receptor puede ser un ser humano.

El trasplante de órganos o tejidos incluye las etapas de proporcionar un órgano, tejido o células de un donante, trasplantar el órgano, el tejido o las células en un receptor y antes y/o durante y/o después de la etapa de trasplantar el órgano, el tejido o las células en el receptor, administrar al receptor una cantidad de una composición farmacéutica que contiene suficiente monóxido de carbono para mejorar la supervivencia y/o la función del órgano, tejido o células trasplantadas en el receptor.

En una realización, la composición farmacéutica puede administrarse al receptor en un periodo de 0 a 20 días, por ejemplo, dentro de un periodo de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 ó 20 días, desde que se trasplantó el órgano en el receptor. En otra realización, la composición farmacéutica se administra al receptor al menos una vez, por ejemplo, múltiples veces o de forma continua, desde el momento que empieza 21 días después de la etapa de trasplantar el órgano o el tejido en el receptor y durante tanto tiempo como sea necesario para asegurar la supervivencia del injerto. La composición farmacéutica se administrará al receptor tras la determinación de que el órgano o tejido trasplantado está experimentando o está a punto de experimentar un rechazo crónico.

El efecto de supervivencia del CO puede mejorarse induciendo la enzima hemooxigenasa-1 (HO-1) en un donante o receptor, por ejemplo, con hemo, metales pesados, citoquinas, hormonas, óxido nítrico, endotoxinas, irradiación UV, o agentes reductores de los niveles de glutatión; o por medio de choque térmico. En el donante, esta inducción puede realizarse antes o durante la extracción del órgano, el tejido o las células. En el receptor, esta inducción puede realizarse antes, durante o después del trasplante. Como alternativa, la enzima puede inducirse en el órgano, tejido o las células ex vivo, antes del trasplante en el receptor.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención pueden usarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, más adelante se describen métodos y materiales adecuados.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1A es un gráfico de barras que ilustra el efecto del tratamiento de células \betaTC3 con concentraciones crecientes de TNF-\alpha.

La Fig. 1B es una representación gráfica que ilustra un análisis FACScan^{TM} de la fragmentación de ADN en células \betaTC3 después del tratamiento con TNF-\alpha.

La Fig. 1C es un gráfico de barras que ilustra el efecto de cotransfectar \betaTC3 con un vector que expresa \beta-gal (pcDNA3/\beta-gal) más un control (pcDNA3), y el tratamiento con el inhibidor de caspasa-3 Z-DEVD-FMK (C3-i) o el inhibidor de caspasa-8 IETD-CHO (C8-i). Los histogramas grises representan las células \beta no tratadas y los histogramas negros representan células \beta tratadas con TNF-\alpha durante 24 horas. Los resultados mostrados son la media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres.

La Fig. 2A es un gráfico de barras que demuestra que el monóxido de carbono exógeno puede sustituir a la HO-1 (hemooxigenasa-1) cuando se bloquea la actividad de la HO-1. Los histogramas grises representan las células \beta no tratadas y los histogramas negros representan las células \beta tratadas con TNF-\alpha o etopósido o sometidas a privación de suero. Los resultados mostrados son la media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres.

La Fig. 2B es una representación gráfica de un análisis FACScan^{TM} de fragmentación de ADN en células \betaTC3 después de un tratamiento de 24 horas con monóxido de carbono después del tratamiento con TNF-\alpha.

La Fig. 2C es un gráfico de barras que ilustra que el monóxido de carbono exógeno protege a las células \beta de la apoptosis en ausencia de HO-1. Se transfectaron células \betaTC3 con vectores que expresaban \beta-gal y se expusieron a monóxido de carbono exógeno. Los histogramas grises representan las células \beta no tratadas y los histogramas negros representan las células \beta tratadas con TNF-\alpha o etopósido o sometidas a privación de suero según se indique. Los resultados mostrados son media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres.

La Fig. 3 es un análisis de fragmentación de ADN por FACScan^{TM} que indica que el monóxido de carbono exógeno protege a los islotes de Langerhans murinos de la apoptosis. CHX = cicloheximida.

La Fig. 4A es un gráfico de barras que ilustra que el efecto anti-apoptótico del monóxido de carbono exógeno está mediado por la activación de la guanilato ciclasa. ODQ = inhibidor de guanilil ciclasa ODQ.

La Fig. 4B es un gráfico de barras que ilustra que el análogo de GMPc puede sustituir al monóxido de carbono en la protección de las células frente a la apoptosis. 8-Br-GMPc = análogo de GMPc 8-Br-GMPc.

La Fig. 4C es un gráfico de barras que ilustra que las proteína quinasas dependientes de GMPc (cGK) median el efecto anti-apoptótico del monóxido de carbono. Se cotransfectaron células \betaTC3 con vector que expresaba \beta-gal. Para las Fig. 4A-C, los histogramas grises representan las células \beta no tratadas y los histogramas negros representan las células \beta tratadas con TNF-\alpha. Los resultados mostrados son media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres. KT = inhibidor de proteína quinasa G KT5823.

La Fig. 5A es un gráfico de barras que demuestra que una hora de exposición a monóxido de carbono es suficiente para prevenir la apoptosis.

La Fig. 5B es un gráfico de barras que demuestra que el monóxido de carbono protege a las células \beta después de la inducción de la apoptosis.

La Fig. 5C es un gráfico de barras que demuestra que la preincubación con monóxido de carbono previene la apoptosis de las células \beta. Para las Fig. 5A-C, los histogramas grises representan células \beta no tratadas y los histogramas negros representan células \beta tratadas con TNF-\alpha. Los resultados mostrados son media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres.

La Fig. 6A es un gráfico lineal que indica que la exposición de islotes murinos a monóxido de carbono mejora la supervivencia y la función después del trasplante.

La Fig. 6B es un gráfico lineal que indica la probabilidad de recuperación (nivel de glucosa sanguínea por debajo de 200 mg/dl) para animales que reciben islotes expuestos previamente a monóxido de carbono o islotes de control. *P = 0,001 frente al control.

La Fig. 7 es un gráfico de barras que ilustra la expresión de HO-1 en corazones de ratón trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA. Se trasplantaron corazones de ratón en ratas tratadas en el momento del trasplante con factor de veneno de cobra (CVF) más tratamientos diarios después del trasplante con ciclosporina A (CsA). La expresión de ARNm de HO-1 y \beta-actina se detectó por RT-PCR. El símbolo -/- indica ARN de corazones de ratón HO-1 -/- usados como control negativo. Los histogramas representan el nivel relativo de expresión de ARNm de HO-1 normalizado para la expresión de ARNm de \beta-actina.

La Fig. 8 es un conjunto de gráficos de barras que ilustran que SnPPIX inhibe la actividad enzimática de HO-1 in vivo. Se trasplantaron corazones de ratón en ratas no tratadas (II) o en ratas tratadas con CVF y CsA (III) más FePPIX (IV) o SnPPIX (V). La actividad total de la HO en corazones del donante y del receptor se midió 2 días después del trasplante y se comparó con la actividad basal de la HO en corazones de ratones y ratas normales, respectivamente (I). Los resultados mostrados son media \pm desviación típica (SD) de tres animales analizados para cada tratamiento. Los análisis estadísticos se realizaron usando un ensayo t de Welsh de datos independientes.

La Fig. 9 es una serie de gráficos lineales que ilustran que SnPPIX y FePPIX no interfieren con la generación de anticuerpos anti-injerto (Ab). Se trasplantaron corazones de ratón en ratas tratadas con CVF más CsA, como se ha descrito anteriormente. El nivel sérico de Ab IgM anti-injerto se evaluó por un ELISA celular. La unión del componente C3 del complemento de rata a células endoteliales de ratón se evaluó por medio de un ELISA celular. La actividad hemolítica del complemento (CH50) se evaluó por un ensayo hemolítico convencional. Los resultados mostrados son la media \pm SD (n = 3).

La Fig. 10A es una serie de gráficos de barras que ilustran que el CO exógeno no afecta a la capacidad de SnPPIX de reprimir la actividad enzimática de la HO-1. Se trasplantaron corazones de ratón en ratas tratadas con CVF más CsA más SnPPLX (II) o SNPPIX y CO (III). La actividad total de la HO se midió en corazones de donantes y de receptores así como en hígados de receptores 2 días después del trasplante. La actividad de la HO en diferentes muestras se comparó con la actividad basal de la HO en corazones de ratón (I), corazones de rata (I) o hígados (I) normales, de acuerdo con la muestra analizada. Los resultados mostrados son la medida \pm SD de tres animales analizados para cada tratamiento. Los análisis estadísticos se realizaron usando un ensayo t de Welsh de datos independientes.

La Fig. 10B es un gráfico de barras que ilustra que el CO exógeno no afecta a la capacidad de SnPPIX de reprimir la actividad de la HO-1. Los animales usados para generar los datos de la Fig. 10A se analizaron con respecto al contenido de carboxihemoglobina 2 días después del trasplante. Los resultados mostrados son la media \pm SD
(n = 3).

La Fig. 11 es un gráfico lineal que ilustra que la regulación positiva de la HO-1 en células endoteliales inhibe la activación de las plaquetas. Se dejaron sin tratar (NT) células endoteliales 2F-2B de ratón o se trataron con CoPPIX (50 \muM, 16 h) para regular positivamente la actividad de la HO-1, con SnPPIX para reprimir la actividad de la HO-1 (50 \muM, 16 h) o con CoPPIX (50 \muM, 12 h) más SnPPIX (50 \muM, 4 h) para controlar la especificidad de CoPPIX en la regulación positiva de la actividad de la HO-1. Se aislaron plaquetas de rata, se superpusieron en las células endoteliales de ratón durante 5 minutos y se ensayaron con respecto a la agregación después de la estimulación con una concentración 2 \muM de adenosina difosfato (ADP).

La Fig. 12 es un gráfico de barras que ilustra que el monóxido de carbono reprime la apoptosis de las células endoteliales. Los histogramas grises representan células tratadas con Act.D solo y los histogramas negros representan células tratadas con Act.D más TNF-\alpha. Cuando se indica, las células endoteliales se trataron con SnPPIX (50 \muM) y se expusieron a CO exógeno (10.000 partes por millón (ppm)).

Descripción detallada

La expresión "monóxido de carbono" (o "CO"), como se usa en el presente documento, describe monóxido de carbono molecular en su estado gaseoso, comprimido en forma líquida o disuelto en solución acuosa. Las expresiones "composición de monóxido de carbono" y "composición farmacéutica que comprende monóxido de carbono" se usan a lo largo de la memoria descriptiva para describir una composición gaseosa, líquida, sólida o semisólida que contiene monóxido de carbono. El experto en la materia reconocerá la forma de la composición farmacéutica, por ejemplo, gaseosa, líquida o tanto gaseosa como líquida que se prefiere para una aplicación dada.

Las expresiones "cantidad eficaz" y "eficaz para tratar", como se usan en el presente documento, se refieren a una cantidad o concentración de monóxido de carbono utilizada durante un periodo de tiempo (incluyendo la administración aguda o crónica y la administración periódica o continua) que es eficaz dentro del contexto de su administración para producir un efecto o resultado fisiológico deseado. Las cantidades eficaces de monóxido de carbono para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, cantidades que son eficaces para mejorar la supervivencia y/o mejorar la función de órganos o células in vivo. Dentro del contexto del trasplante de órganos y tejidos, una cantidad eficaz de monóxido de carbono es la cantidad administrada al receptor del trasplante suficiente para mejorar la supervivencia del órgano, tejido o células de interés, por ejemplo, para reducir la pérdida de células de las que está compuesto el órgano o tejido, y/o para mejorar el comportamiento funcional de un órgano.

Trasplante, una cantidad eficaz de monóxido de carbono es una cantidad suficiente para mejorar la supervivencia y/o función del órgano o los tejidos. Como se usa en este documento, el término "inhibir" incluye el retraso del inicio, la reducción, la prevención o el alivio de un proceso biológico, por ejemplo, la apoptosis. En el caso de los gases, las cantidades eficaces de monóxido de carbono generalmente están dentro del intervalo de aproximadamente un 0,0000001% a aproximadamente un 0,3% en peso, por ejemplo de un 0,0001% a aproximadamente un 0,25% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente un 0,001%, por ejemplo al menos un 0,005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% ó 0,24% en peso de monóxido de
carbono.

Los intervalos preferidos de monóxido de carbono incluyen de aproximadamente un 0,001% a aproximadamente un 0,24%, de aproximadamente un 0,005% a aproximadamente un 0,22%, de aproximadamente 0,01% a aproximadamente un 0,20%, y de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 0,1% en peso. Otros intervalos preferidos incluyen de aproximadamente un 0,005% a aproximadamente un 0,24%, de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 0,22%, de aproximadamente un 0,015% a aproximadamente un 0,20% y de aproximadamente un 0,025% a aproximadamente un 0,1% en peso. Para soluciones líquidas de CO, las cantidades eficaces generalmente están dentro del intervalo de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,0044 g de CO/100 g de líquido, por ejemplo, al menos 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040 ó 0,0042 g de CO/100 g de solución acuosa. Los intervalos preferidos incluyen, por ejemplo, de aproximadamente 0,0010 a aproximadamente 0,0030 g de CO/100 g de líquido, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,0026 g de CO/100 g de líquido, o de aproximadamente de 0,0018 a aproximadamente 0,0024 g de CO/100 g de líquido. Un especialista en la técnica apreciará que pueden usarse cantidades fuera de estos intervalos, dependiendo de la aplicación.

El término "paciente" se usa a lo largo de la memoria descriptiva para describir un animal, humano o no humano, al que se le proporciona el tratamiento de acuerdo con los métodos de la presente invención. En la presente invención se prevén claramente aplicaciones veterinarias. El término incluye, pero sin limitación, aves, reptiles, anfibios y mamíferos, por ejemplo seres humanos, otros primates, cerdos, roedores tales como ratones y ratas, conejos, cobayas, hámsteres, vacas, caballos, gatos, perros, ovejas y cabras. El término "donante" o "paciente donante", como se usa en este documento, se refiere a un animal (humano o no humano) del que puede obtenerse un órgano, tejido o células individuales para el almacenamiento y/o trasplante a un paciente receptor. El término "receptor" o "paciente receptor" se refiere a un animal (humano o no humano) al que se le puede transferir un órgano, tejido, una masa de células o células individuales.

El término "diabetes" es un término general para describir los trastornos diabéticos como se reconocen en la técnica, por ejemplo, Diabetes Mellitus. La Diabetes Mellitus se caracteriza por una incapacidad de regular los niveles sanguíneos de glucosa. Los dos tipos más prevalentes de diabetes se conocen como diabetes de Tipo I y de Tipo II. En la diabetes de Tipo I, o dependiente de insulina (IDDM), el páncreas fabrica poca o nada de insulina porque las células beta productoras de insulina se han destruido. En la diabetes de Tipo II o no dependiente de insulina (NIDDM), el páncreas fabrica algo de insulina pero esta insulina no es eficaz. El término también incluye la miríada de trastornos secundarios producidos por la diabetes, tanto agudos como crónicos, por ejemplo, complicaciones diabéticas, por ejemplo, hipoglucemia e hiperglucemia, retinopatía, angiopatía, neuropatía y nefropatía.

La expresión "célula(s)" o "célula(s) animal(es)" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier tipo de célula animal, incluyendo células animales adecuadas para el trasplante. Las células típicamente son células primarias obtenidas a partir de un animal donante, pero pueden ser células secundarias o incluso células de una línea celular establecida. Opcionalmente se transfectan ex vivo con un vector de expresión que de alguna manera altera su función. Las células incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, células de islotes, por ejemplo, células que son parte de un islote pancreático, y células hepáticas, fibroblastos, células de médula ósea, miocitos y células madre, y células (por ejemplo, neuronas) del sistema nervioso central, incluyendo la médula espinal. La expresión "célula(s) de islotes" se usa a lo largo de la memoria descriptiva como una expresión general para describir los grupos de células dentro del páncreas conocidas como islotes, por ejemplo, los islotes de Langerhans. Los islotes de Langerhans contienen varios tipos celulares que incluyen, por ejemplo, células \beta (que fabrican insulina), células \alpha (que producen glucagones), células \gamma (que fabrican somatostatina), células F (que producen polipéptido pancreático), células enterocromafines (que producen serotonina), células PP y células D1. La expresión "célula madre" es una expresión reconocida en la técnica que se refiere a células que tienen la capacidad de dividirse durante periodos indefinidos en cultivo y que dan lugar a células especializadas. Dentro de esta expresión se incluyen, por ejemplo, células madre totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes, por ejemplo, células madre neuronales, hepáticas, musculares y hematopoyéticas.

Por "célula aislada" se entiende que la célula se retira del tejido u órgano en el que se produce de forma natural (o su predecesor). Una célula puede purificarse parcialmente de su medio natural y considerarse "aislada". Por ejemplo, un islote de Langerhans intacto se considera constituido por células "aisladas" una vez que el islote se ha retirado de un páncreas y puede separarse físicamente de otros islotes. Las células de un órgano intacto tal como un riñón o corazón o un órgano parcial tal como una pieza de un vaso sanguíneo no se consideran "células aisladas" mientras que aún formen parte del órgano.

El término "órgano(s)" se usa a lo largo de la memoria descriptiva como un término general para describir cualquier parte anatómica o miembro que tiene una función específica en el animal. Dentro del significado de este término también se incluyen partes sustanciales de órganos, por ejemplo, tejidos cohesivos obtenidos a partir de un órgano. Estos órganos incluyen, pero sin limitación, riñón, hígado, corazón, intestino, por ejemplo, intestino delgado o grueso, páncreas y pulmones. En esta definición también se incluyen huesos y vasos sanguíneos, por ejemplo trasplantes aórticos.

El término "trasplante" se usa a lo largo de la memoria descriptiva como término general para describir el proceso de implantar un órgano, tejido, masa de células o células individuales en un paciente. El término "trasplante" se define en la técnica como la transferencia de tejidos o células vivas desde un donante a un receptor, con la intención de mantener la integridad funcional del tejido o células trasplantadas en el receptor (véase, por ejemplo, The Merck Manual, Berkow, Fletcher, and Beers, Eds., Merck Research Laboratories, Rahway, N. J., 1992). La expresión "trasplante de células" se usa a lo largo de la memoria descriptiva como expresión general para describir el proceso de transferir a un paciente al menos una célula, por ejemplo una o más células de islotes. Por ejemplo, este trasplante puede realizarse extrayendo las células \beta (o islotes intactos) del páncreas de un donante y transfiriéndolas a un paciente receptor cuyo páncreas no puede producir suficiente insulina. Las expresiones incluyen todas las categorías de trasplantes conocidas en la técnica, excepto transfusiones sanguíneas. Los trasplantes se clasifican por el sitio y por la relación genética entre el donante y el receptor. La expresión incluye, por ejemplo, autotrasplante (extracción y transferencia de células o tejidos desde una localización de un paciente a la misma u otra localización del mismo paciente), alotrasplante (trasplante entre miembros de la misma especie) y xenotrasplante (trasplantes entre miembros de diferentes especies).

Las expresiones "rechazo de órgano", "rechazo de trasplante" o "rechazo" se reconocen en la técnica y se usan a lo largo de la memoria descriptiva como una expresión general para describir el proceso de rechazo de un órgano, tejidos o células en un receptor. Dentro de la definición se incluyen, por ejemplo, tres patrones principales de rechazo normalmente identificados en la práctica clínica: rechazo hiperagudo, rechazo agudo y rechazo crónico (véase, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994).

Las expresiones "donante(s) marginal(es)" y "órgano marginal" se usan en este documento como términos generales para describir a un donante u órgano que presenta problemas que hacen que su uso en un procedimiento de trasplante no sea óptimo. Por ejemplo, un donante marginal puede incluir un donante que tiene más de 50 años, o que padece una enfermedad crónica que puede afectar a la función del injerto, por ejemplo, diabetes, HTA y alcoholismo. Un órgano marginal es, por ejemplo, (1) un órgano procedente de dicho donante, o (2) un órgano que ha experimentado tiempos prolongados de isquemia caliente o fría, o (3) un órgano que presenta anomalías anatómicas (por ejemplo, vasos pequeños y múltiples, por ejemplo en el riñón) que pueden dificultar la anastomosis vascular, o con indicios de placas ateroscleróticas en vasos del injerto.

Preparación de Composiciones Gaseosas

La composición de monóxido de carbono puede ser una composición de monóxido de carbono gaseosa. El gas comprimido o presurizado útil en los métodos de la invención puede obtenerse en cualquier fuente comercial, y en cualquier tipo de recipiente apropiado para almacenar gas comprimido. Por ejemplo, pueden obtenerse gases comprimidos o presurizados a partir de cualquier fuente que suministre gases comprimidos, tales como oxígeno, para uso médico. El gas presurizado que incluye monóxido de carbono usado en los métodos de la presente invención puede proporcionarse de tal forma que todos los gases de la composición final deseada (por ejemplo CO y O_{2}, y opcionalmente N_{2}, He y/o CO_{2}) se mezclen conjuntamente en el mismo recipiente. Si se desea, los métodos de la presente invención pueden realizarse usando múltiples recipientes que contienen gases individuales. Por ejemplo, puede proporcionarse un solo recipiente que contenga monóxido de carbono, con o sin otros gases, cuyo contenido puede mezclarse opcionalmente con aire ambiental o con el contenido de otros recipientes, por ejemplo, recipientes que contienen oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, aire comprimido o cualquier otro gas adecuado o mezclas de los mismos.

Las composiciones gaseosas administradas a un paciente de acuerdo con la presente invención típicamente contienen del 0% a aproximadamente el 79% en peso de nitrógeno, de aproximadamente el 21% a aproximadamente el 100% en peso de oxígeno y de aproximadamente el 0,0000001% a aproximadamente el 0,3% en peso (correspondiente a una cantidad de aproximadamente 0,001 ppm (es decir, 1 ppb) a aproximadamente 3.000 ppm) de monóxido de carbono. Preferiblemente, la cantidad de nitrógeno en la composición gaseosa es de aproximadamente el 79% en peso, la cantidad de oxígeno es de aproximadamente el 21% en peso y la cantidad de monóxido de carbono es de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 0,25% en peso. La cantidad de monóxido de carbono es preferiblemente al menos aproximadamente un 0,001%, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% ó 0,24% en peso. Los intervalos preferidos de monóxido de carbono incluyen de aproximadamente un 0,001% a aproximadamente un 0,24%, de aproximadamente un 0,005% a aproximadamente un 0,22%, de aproximadamente un 0,010% a aproximadamente un 0,20% y de aproximadamente un 0,015% a aproximadamente un 0,1% en peso. Debe indicarse que pueden usarse composiciones de monóxido de carbono gaseoso que tengan concentraciones de monóxido de carbono mayores del 0,3% (tal como un 1% o más) durante períodos cortos (por ejemplo, una o unas pocas respiraciones), dependiendo de la aplicación. Son particularmente útiles para aplicaciones ex vivo en las que no supone un riesgo el envenenamiento con monóxido de carbono. Cuando el gas se usa para formar una atmósfera para el cultivo de células in vitro, el gas también puede contener dióxido de carbono para ayudar a mantener el pH del medio. El dióxido de carbono puede estar presente, por ejemplo, en una cantidad del 1% al 10%, comúnmente del 5% en peso.

Puede usarse una composición de monóxido de carbono gaseoso para crear una atmósfera que comprenda monóxido de carbono gaseoso. Puede crearse una atmósfera que incluye niveles apropiados de monóxido de carbono gaseoso, por ejemplo, proporcionando un recipiente que contiene un gas presurizado que comprende monóxido de carbono gaseoso, y liberando el gas presurizado desde el recipiente al interior de una cámara o espacio para formar una atmósfera que incluya el monóxido de carbono gaseoso dentro de la cámara o espacio. Como alternativa, los gases pueden liberarse en un aparato que termina en una máscara de respiración o tubo de respiración, creando de esta manera una atmósfera que comprende monóxido de carbono gaseoso en la máscara de respiración o tubo de respiración y asegurándose de que el paciente es la única persona en la sala expuesta a niveles significativos de monóxido de carbono.

Los niveles de monóxido de carbono en una atmósfera o un circuito de ventilación pueden medirse o controlarse usando cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos incluyen detección electroquímica, cromatografía de gases, recuento de radioisótopos, absorción infrarroja, colorimetría y métodos electroquímicos basados en membranas selectivas (véase, por ejemplo, Sunderman et al., Clin. Chem. 28: 2026-2032, 1982; Ingi et al., Neuron 16: 835-842, 1996). Pueden detectarse niveles de monóxido de carbono por debajo de las partes por millón, por ejemplo, mediante cromatografía de gases y recuento de radioisótopos. Además, se sabe en la técnica que en un tejido biológico pueden medirse niveles de monóxido de carbono en el intervalo por debajo de las ppm mediante un sensor de gas de infrarrojo medio (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol 280:H482-H488, 2001). En muchas fuentes comerciales están disponibles ampliamente sensores de monóxido de carbono y dispositivos de detección de gases.

Preparación de Composiciones Líquidas

Una composición de monóxido de carbono también puede ser una composición líquida de monóxido de carbono. Un líquido puede convertirse en una composición de monóxido de carbono mediante cualquier método conocido en la técnica para disolver gases en líquidos. Por ejemplo, el líquido puede ponerse en un denominado "incubador de CO_{2}" y exponerse a un flujo continuo de monóxido de carbono hasta alcanzar la concentración deseada de monóxido de carbono en el líquido. Como otro ejemplo, puede "burbujearse" directamente gas monóxido de carbono en el líquido hasta alcanzar la concentración deseada de monóxido de carbono en el líquido. La cantidad de monóxido de carbono que puede disolverse en una solución acuosa dada aumenta al disminuir la temperatura. Como otro ejemplo, puede pasarse un líquido apropiado a través de un tubo que permite la difusión de gas, donde el tubo pasa a través de una atmósfera que comprende monóxido de carbono (por ejemplo, utilizando un dispositivo tal como un oxigenador de membrana extracorpóreo). El monóxido de carbono se difunde en el líquido creando una composición líquida de monóxido de carbono.

El líquido puede ser cualquier líquido considerado por los especialistas en la técnica adecuado para la administración a pacientes (véase, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994) o para mantener órganos, tejidos o células ex vivo. En general, el líquido será una solución acuosa. Los ejemplos de soluciones incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución Celsior^{TM}, solución Perfadex^{TM}, solución de Collins, solución de citrato y solución de la Universidad de Wisconsin (UW) (Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994). Las composiciones líquidas pueden incluir monóxido de carbono a concentraciones en el intervalo de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,0044 g de CO/100 g de líquido, por ejemplo, al menos 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040 ó 0,0042 g de CO/100 g de solución acuosa. Los intervalos preferidos incluyen, por ejemplo, de aproximadamente 0,0010 a aproximadamente 0,0030 g de CO/100 g de líquido, de aproximadamente 0,0015 a aproximadamente 0,0026 g de CO/100 g de líquido o de aproximadamente 0,0018 a aproximadamente 0,0024 g de CO/100 g de líquido. En el caso del agua a 0ºC, el punto de saturación es de aproximadamente 0,0044 g de CO/100 g de medio.

Cualquier líquido adecuado puede saturarse hasta una concentración establecida de monóxido de carbono a través de difusores de gas. Como alternativa, pueden usarse soluciones prefabricadas que se han sometido a controles de calidad para contener niveles establecidos de monóxido de carbono. Puede conseguirse un control preciso de la dosificación por mediciones con una membrana permeable a gases e impermeable a líquidos conectada a un analizador de monóxido de carbono. Las soluciones pueden saturarse hasta las concentraciones eficaces deseadas y mantenerse a estos niveles. En las composiciones tanto líquidas como gaseosas, la inclusión del gas inerte helio puede mejorar la administración de monóxido de carbono a los tejidos de un órgano.

Tratamiento de Pacientes con Composiciones de Monóxido de Carbono

La presente invención contempla composiciones de monóxido de carbono para tratar a los receptores, órganos o tejidos en cualquier etapa del proceso de recogida, almacenamiento y trasplante. Un órgano o un tejido puede recogerse de un donante, tratarse con una composición de monóxido de carbono ex vivo de acuerdo con la presente invención, y trasplantarse en un receptor. Como alternativa o además, el órgano o tejido puede tratarse in situ, mientras que aún está en el donante. Opcionalmente, puede administrarse una composición de monóxido de carbono al receptor antes, durante y/o después de la cirugía: por ejemplo, después de someter un órgano a reperfusión con la sangre del receptor.

Pueden recogerse órganos y tejidos de un donante y trasplantarse por cualquier método conocido por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). El especialista en la técnica reconocerá que los métodos de recogida y trasplante pueden variar dependiendo de muchas circunstancias tales como el tipo de órgano o de tejido y el tipo de donante.

Puede tratarse a un paciente con una composición de monóxido de carbono mediante cualquier método conocido en la técnica para administrar gases y/o líquidos a pacientes. La presente invención contempla la administración sistémica de composiciones de monóxido de carbono líquidas o gaseosas a pacientes (por ejemplo, por inhalación y/o ingestión), y la administración tópica de las composiciones a los órganos o tejidos de los pacientes in situ (por ejemplo, por ingestión, insuflación y/o introducción en la cavidad abdominal).

Administración Sistémica de Monóxido de Carbono

Las composiciones de monóxido de carbono gaseosas pueden administrarse sistémicamente a un paciente, por ejemplo, a un paciente sometido o que necesita un trasplante. Las composiciones de monóxido de carbono gaseosas típicamente se administran por inhalación a través de la boca o los conductos nasales hasta los pulmones, donde el monóxido de carbono se absorbe fácilmente hacia la corriente sanguínea del paciente. La concentración de compuesto activo (CO) utilizada en la composición gaseosa terapéutica dependerá de los índices de absorción, distribución, inactivación y excreción (generalmente por medio de la respiración) del monóxido de carbono así como otros factores conocidos por los especialistas en la técnica. Debe entenderse que para cualquier objeto particular, los regímenes de dosificación específicos se ajustarán a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración indicados en este documento son sólo ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la invención reivindicada. La presente invención contempla la administración aguda, subaguda y crónica de monóxido de carbono, dependiendo, por ejemplo, de la gravedad o persistencia del trastorno en el paciente. El monóxido de carbono puede administrase al paciente durante un periodo de tiempo (incluyendo indefinidamente) suficiente para tratar la afección y ejercer el efecto farmacológico o biológico deseado.

A continuación se proporcionan ejemplos de algunos métodos y dispositivos que pueden utilizarse para administrar composiciones de monóxido de carbono gaseosas a pacientes.

Ventiladores

El monóxido de carbono (las concentraciones pueden variar) puede adquirirse mezclado con aire u otro gas que contenga oxígeno en un depósito convencional de gas comprimido (por ejemplo, 21% de O_{2}, 79% de N_{2}). No es reactivo, y las concentraciones que se necesitan para los métodos de la presente invención están bien por debajo del intervalo combustible (un 10% en aire). En un hospital, el gas supuestamente se administrará a pie de cama, donde se mezclará con oxígeno o aire ambiente en un mezclador hasta la concentración deseada. El paciente inhalará la mezcla de gas mediante un ventilador, que se ajustará a un caudal en base a la comodidad y necesidades del paciente. Esto se determina mediante gráficos pulmonares (es decir, ritmo respiratorio, volúmenes tidales, etc.). En el sistema de suministro pueden diseñarse mecanismos de seguridad frente a fallos para evitar que el paciente reciba innecesariamente cantidades mayores que las deseadas de monóxido de carbono. El nivel de monóxido de carbono del paciente puede controlarse estudiando (1) la carboxihemoglobina (COHb), que puede medirse en la sangre venosa, y (2) el monóxido de carbono exhalado recogido en orificio lateral del ventilador. La exposición al monóxido de carbono puede ajustarse en base al estado de salud del paciente y en base a los marcadores. Si es necesario, puede eliminarse del paciente el monóxido de carbono cambiando a una inhalación de O_{2} al 100%. El monóxido de carbono no se metaboliza; de esta manera, cualquier cantidad que se inhale finalmente se exhalará con la excepción de un porcentaje muy pequeño que se convierte en CO_{2}. El monóxido de carbono también puede mezclarse con cualquier nivel de O_{2} para proporcionar la administración terapéutica de monóxido de carbono sin que como consecuencia de ello se produzcan condiciones hipóxicas.

Máscara y Tienda Facial

Se prepara una mezcla de gas que contiene monóxido de carbono como se ha indicado anteriormente para permitir la inhalación por el paciente usando una máscara o tienda facial. La concentración inhalada puede cambiarse y puede eliminarse simplemente cambiando a O_{2} al 100%. El control de los niveles de monóxido de carbono se realizaría en o cerca de la máscara o tienda con un mecanismo de seguridad frente a fallos que impediría la inhalación de una concentración demasiado elevada de monóxido de carbono.

Inhalador Portátil

El monóxido de carbono comprimido puede envasarse en un dispositivo inhalador portátil e inhalarse en una dosis medida, por ejemplo, para permitir el tratamiento intermitente de un receptor que no está hospitalizado. En los recipientes podrían envasarse diferentes concentraciones de monóxido de carbono. El dispositivo podría ser tan sencillo como un depósito pequeño (por ejemplo, de menos de 5 kg) de CO diluido de manera apropiada con una válvula de activación-desactivación y un tubo desde el cual el paciente toma una bocanada de CO de acuerdo con un régimen convencional o cuando sea necesario.

Pulmón Artificial Intravenoso

Para administrar el monóxido de carbono puede usarse un pulmón artificial (un dispositivo de catéter para el intercambio de gases en la sangre) diseñado para administrar O_{2} y extraer CO_{2}. El catéter, cuando se implanta, reside en una de las venas grandes y podría administrar monóxido de carbono a concentraciones dadas para administración sistémica o en un sitio local. La administración puede ser una administración local de una alta concentración de monóxido de carbono durante un corto periodo de tiempo en un sitio específico (esta alta concentración rápidamente se diluiría en la corriente sanguínea), o una exposición sistémica relativamente más prolongada a una menor concentración de monóxido de carbono (véase, por ejemplo, Hattler et al., Artif. Organs 18 (11): 806-812, 1994; y Golob et al., ASAIO J. 47 (5): 432-437, 2001).

Cámara Normobárica

En ciertos casos, sería deseable exponer al paciente entero a monóxido de carbono. El paciente estaría dentro de una cámara hermética al aire que se inundaría con monóxido de carbono (a un nivel que no ponga en peligro al paciente, o a un nivel que suponga un riesgo aceptable sin riesgo para los espectadores). Después de finalizar la exposición, la cámara podría limpiarse con aire (por ejemplo, 21% de O_{2}, 79% de N_{2}) y podrían analizarse muestras por analizadores de monóxido de carbono para asegurar que no queda monóxido de carbono antes de permitir que el paciente salga del sistema de exposición.

Soluciones Acuosas

La presente invención contempla además que pueden crearse soluciones acuosas que comprenden monóxido de carbono para la administración sistémica a un paciente, por ejemplo, para administración oral y/o por inyección en el cuerpo, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal y/o subcutánea.

Los tampones de conservación y medios de cultivo pueden saturarse hasta una concentración establecida de monóxido de carbono a través de difusores de gas o soluciones madre preparadas previamente que se han sometido a controles de calidad para contener niveles establecidos de monóxido de carbono. El control preciso de la dosis puede conseguirse por medición con una membrana permeable a gases e impermeable a líquidos conectada a un analizador de monóxido de carbono. Los tampones y soluciones pueden saturarse a concentraciones eficaces deseadas y mantenerse a esos niveles. Para procedimientos que requieren la perfusión de una preparación dada de órgano, tejido o células, puede disponerse de soluciones saturadas prefabricadas para mantener los niveles de monóxido de carbono. Si los niveles de monóxido de carbono se reducen, pueden añadirse soluciones nuevas para sustituir a aquéllas en las que se han reducido las concentraciones de monóxido de carbono. Una vez que se ha realizado la preparación del órgano, tejido o célula, puede mantenerse en la solución en un recipiente hermético al aire para el trasporte. La presencia del gas inerte helio hace que sea más eficaz la captación de monóxido de carbono.

Tratamiento Tópico de Órganos, Tejidos y Células Aisladas con Monóxido de Carbono in situ y ex vivo

El trasplante de órganos y tejidos puede incluir una etapa de exponer los órganos y tejidos a una composición de monóxido de carbono antes del trasplante. Estas exposiciones pueden realizarse in situ y/o ex vivo. Los órganos y tejidos pueden exponerse a una atmósfera que comprende gas monóxido de carbono, a una composición líquida de monóxido de carbono, por ejemplo, un perfundido líquido, una solución de almacenamiento o una solución de lavado que tiene monóxido de carbono disuelto en su interior, o ambas cosas.

La exposición de un órgano o tejido a composiciones líquidas de monóxido de carbono pueden realizarse ex vivo y/o in situ por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la exposición puede realizarse ex vivo en cualquier cámara o espacio que tenga suficiente volumen para sumergir el órgano o tejido, completa o parcialmente, en la composición de monóxido de carbono. Como otro ejemplo, el órgano puede exponerse a una composición de monóxido de carbono poniendo el órgano en cualquier recipiente adecuado y haciendo que la composición de monóxido de carbono "inunde" al órgano, de tal forma que el órgano se exponga a un flujo continuo de la composición de monóxido de carbono.

Como alternativa, el órgano puede perfundirse con una composición de monóxido de carbono. El término "perfusión" es un término reconocido en la técnica y se refiere al paso de un líquido, por ejemplo, una composición de monóxido de carbono, a través de los vasos sanguíneos de un órgano o tejido. Los métodos de perfusión de órganos ex vivo e in situ son bien conocidos en la técnica. Un órgano puede perfundirse con una composición de monóxido de carbono ex vivo, por ejemplo, mediante una máquina de perfusión hipotérmica continua (véase Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994). Opcionalmente, en las perfusiones in situ o ex vivo, el órgano puede perfundirse con una solución de lavado, por ejemplo una solución UW sin monóxido de carbono, antes de la perfusión con la composición de monóxido de carbono, para retirar la sangre del donante del órgano. Este proceso podría realizarse para evitar la competición del monóxido de carbono por la hemoglobina del donante. Como otra opción, la solución de lavado puede ser una composición de monóxido de carbono. Un líquido apropiado puede pasarse a través del tubo para permitir la difusión de gas; este tubo pasa a través de una atmósfera que comprende monóxido de carbono (por ejemplo, a través de una cámara, tal como con oxigenación de membrana extracorpórea), para crear una composición líquida de monóxido de carbono, que después puede pasarse al interior de un órgano (por ejemplo, perfundirse al interior del órgano conectando el tubo al órgano).

El órgano o tejido puede ponerse, por ejemplo, sumergirse, en un medio o solución que no incluye monóxido de carbono, y ponerse en una cámara que expone el medio o solución a una atmósfera que contiene monóxido de carbono. Como alternativa o además, el monóxido de carbono puede "burbujearse" en el medio o solución. Las exposiciones in situ pueden realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por perfusión o lavado abundante in situ del órgano con una composición líquida de monóxido de carbono (véase, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press, 1994).

En un procedimiento de trasplante dado puede usarse cualquiera o todos los métodos anteriores para exponer un órgano o tejido a una composición líquida de monóxido de carbono, por ejemplo, lavado, inmersión o perfusión.

La presente invención también contempla que puede crearse una composición de monóxido de carbono sólida o semisólida. Por ejemplo, un líquido que es una composición de monóxido de carbono, como se ha descrito anteriormente, puede convertirse en una composición sólida o semisólida en la que puede superponerse o incrustarse un órgano o tejido. Como alternativa, puede infundirse en el órgano una composición de monóxido de carbono semisólida. Las composiciones sólidas o semisólidas pueden obtenerse, por ejemplo, añadiendo al líquido un agente de solidificación tal como un agente gelificante (por ejemplo, colágeno o alginato).

Uso de Hemooxigenasa-1, Compuestos Asociados con Hemooxigenasa-1, y Otros Compuestos y Tratamientos

La presente invención también contempla la inducción o expresión de hemooxigenasa-1 (HO-1) junto con la administración de monóxido de carbono. La HO-1 puede proporcionarse a un paciente mediante inducción o expresión de HO-1 en el paciente, o administrando HO-1 exógena directamente al paciente. Como se usa en este documento, el término "inducir" significa aumentar la producción de una proteína, por ejemplo, HO-1, en células aisladas o en las células de un tejido, órgano o animal usando el propio gen endógeno de las células (por ejemplo, no recombinante) que codifica la proteína.

La HO-1 puede inducirse en un paciente, por ejemplo, un donante y/o receptor, por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la producción de HO-1 puede inducirse por hemina, por protoporfirina de hierro o por protoporfirina de cobalto. Una diversidad de agentes no hemo incluyendo metales pesados, citoquinas, hormonas, óxido nítrico, COCl_{2}, endotoxina y choque térmico también son fuertes inductores de la expresión de HO-1 (Otterbein et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1029-L1037, 2000; Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15: 9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37: 517-554, 1997; y Tenhunen et al., J. Lab. Clin. Med. 75: 410-421, 1970). La HO-1 también se induce fuertemente por una diversidad de agentes y situaciones que crean estrés oxidativo, incluyendo el peróxido de hidrógeno, reductores de los niveles de glutatión, irradiación UV e hiperoxia (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37: 517-554, 1997; y Keyse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 99-103, 1989). Una "composición farmacéutica que comprende un inductor de HO-1" significa una composición farmacéutica que contiene cualquier agente capaz de inducir la HO-1 en un paciente, por ejemplo, cualquiera de los agentes descritos anteriormente, por ejemplo, hemina, protoporfirina de hierro y/o protoporfirina de cobalto.

La expresión de HO-1 en una célula también puede aumentarse por transferencia génica. Como se usa en este documento, el término "expresar" significa aumentar la producción de una proteína, por ejemplo, HO-1 o ferritina, en células aisladas o en las células de un tejido, órgano o animal, usando un gen administrado exógenamente (por ejemplo, un gen recombinante). La HO-1 o ferritina preferiblemente es de la misma especie (por ejemplo ser humano, ratón, rata, etc.) que el receptor del trasplante para minimizar cualquier reacción inmune. La expresión podría dirigirse por un promotor constitutivo (por ejemplo, promotores de citomegalovirus) o un promotor con especificidad de tejido (por ejemplo, promotor de suero de leche para células de mamífero o promotor de albúmina para células hepáticas). Un vector de terapia génica apropiado (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), poxvirus (por ejemplo, vaccinia), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus diminuto del ratón, el virus de la hepatitis B, el virus de la gripe, el virus del herpes simple-1 y lentivirus) que codifica HO-1 o ferritina se administraría al paciente por vía oral, por inhalación o por inyección en una localización apropiada para al tratamiento del rechazo del trasplante. Se prefiere particularmente la administración local directamente en el órgano, tejido o células a trasplantar del donante o en el sitio del trasplante en el receptor. De forma similar, pueden administrarse vectores plasmídicos que codifican HO-1 o apoferritina, por ejemplo como ADN desnudo, en liposomas o en micropartículas.

Además, puede administrarse directamente proteína HO-1 exógena a un paciente por cualquier método conocido en la técnica. La HO-1 exógena puede administrarse directamente además de o como alternativa a la inducción o expresión de HO-1 en el paciente como se ha descrito anteriormente. La proteína HO-1 puede administrase a un paciente, por ejemplo, en liposomas, y/o como una proteína de fusión, por ejemplo, como una proteína de fusión con TAT (véase, por ejemplo, Becker-Hapak et al., Methods 24: 247-256, 2001).

Como alternativa o además, cualquiera de los productos del metabolismo por HO-1, por ejemplo, bilirrubina, biliverdina, hierro y/o ferritina pueden administrase al paciente junto con o en lugar de monóxido de carbono para prevenir o tratar el trastorno. Además, la presente invención contempla que pueden administrarse al paciente moléculas de unión al hierro distintas de ferritina, por ejemplo, desferoxamina (DFO), hierro dextrano y/o apoferritina. Cualquiera de los compuestos anteriores pueden administrase al paciente tópica y/o sistémicamente.

También se contempla por la presente invención la administración de óxido nítrico (NO) a un paciente, órgano, tejido y/o células aisladas junto con la administración de monóxido de carbono, HO-1 y/o compuestos asociados a HO-1. Esta técnica incluye proporcionar NO al donante, al receptor o al órgano, tejido o célula ex vivo, junto con la administración de HO-1 y/o cualquiera o todos los productos de la degradación del grupo hemo, por ejemplo, CO, biliverdina, bilirrubina, hierro y ferritina.

La expresión "óxido nítrico" (o "NO"), como se usa en este documento, describe óxido nítrico molecular en su estado gaseoso o disuelto en solución acuosa. Las composiciones gaseosas que comprenden NO típicamente se administran por inhalación a través de la boca o los conductos nasales hasta los pulmones, donde el NO puede ejercer su efecto directamente o puede absorberse fácilmente en la corriente sanguínea del paciente. El gas comprimido o presurizado, por ejemplo, NO (y/o CO, como se describe con más detalle anteriormente), útil en los métodos de la invención puede obtenerse a partir de cualquier fuente comercial, y en cualquier tipo de recipiente apropiado para almacenar gas comprimido. Si se desea, los métodos de la presente invención pueden realizarse usando múltiples recipientes que contienen gases individuales. Como alternativa, el CO y NO pueden combinarse en un solo recipiente, diluidos si se desea en un gas inerte.

El NO para inhalación está disponible en el mercado (por ejemplo, INOmax^{TM}, INO Therapeutics, Inc., Clinton, NJ). El gas puede obtenerse a partir de un proveedor comercial típicamente como una mezcla de 200-800 ppm de NO en gas N_{2} puro. La fuente de NO puede ser esencialmente NO al 100%, o diluido con N_{2} o cualquier otro gas inerte (por ejemplo, helio) a cualquier concentración deseada. Es vital que el NO se obtenga y se almacene como una mezcla sin O_{2} contaminante u óxidos de nitrógeno superiores, porque estos óxidos de nitrógeno superiores (que pueden formarse por reacción de O_{2} con NO) son potencialmente nocivos para los tejidos pulmonares. Si se desea, puede demostrase la pureza del NO con un análisis de quimioluminiscencia, usando métodos conocidos, antes de la administración al paciente. Están disponibles en el mercado analizadores de NO-NOX de quimioluminiscencia (por ejemplo, Model 14A, Thermo Environmental Instruments, Franklin, MA). La mezcla de NO-N_{2} puede mezclarse con un gas que contiene O_{2} (por ejemplo, O_{2} al 100% o aire) justo antes de la inhalación por el paciente, usando, por ejemplo, un rotámetro calibrado que previamente se ha validado con un espirómetro. La concentración final de NO en la mezcla de respiración puede verificarse con una técnica química o de quimioluminiscencia bien conocida por los especialistas en este campo (por ejemplo, Fontijin et al., Anal Chem 42: 575, 1970). Como alternativa, las concentraciones de NO y NO_{2} pueden controlarse mediante un analizador electroquímico. Cualquier impureza tal como NO_{2} puede depurarse por exposición a soluciones de NaOH, baralyme o sodalime. Como control adicional, también puede evaluarse el FiO_{2} de la mezcla de gas final.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden NO pueden administrarse usando cualquier método en la técnica para administrar gases a pacientes. Se describen métodos seguros y eficaces para administrar NO por inhalación, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.570.683; en la Patente de Estados Unidos Nº 5.904.938; y Frostella et al., Circulation 83: 2038-2047, 1991. Algunos métodos ilustrativos para administrar gases (tal como CO) a pacientes se han descrito con detalle anteriormente, y pueden usarse para administrar NO. Los ejemplos de métodos y dispositivos que pueden utilizarse para administrar composiciones farmacéuticas gaseosas que comprenden NO a pacientes incluyen ventiladores, máscaras y tiendas faciales, inhaladores portátiles, pulmones artificiales intravenosos (véase, por ejemplo, Hattler et al., Artif. Organs 18(11):806-812; y Golob et al., ASAIO J., 47(5):432-437, 2001) y cámaras normobáricas. Sin embargo, las propiedades del NO pueden permitir/necesitar alguna modificación de estos métodos. En una situación de campo de hospital o urgencias, la administración del gas NO puede realizarse, por ejemplo, acoplando un depósito de gas NO comprimido en N_{2}, y un segundo depósito de oxígeno o una mezcla de oxígeno/N_{2} (tal como aire), a un inhalador diseñado para mezclar el gas de dos fuentes. Controlando el flujo de gas de cada fuente, la concentración de NO inhalada por el paciente puede mantenerse a un nivel óptimo. El NO también puede mezclarse con aire ambiente, usando un mezclador de bajo flujo convencional (por ejemplo, Bird Blender, Palm Springs, CA). El NO puede generarse a partir de N_{2} y O_{2} (por ejemplo, aire) usando un generador de NO eléctrico. Se describe un generador de NO adecuado en la Patente de Estados Unidos Nº 5.396.882. Además, el NO puede proporcionarse intermitentemente a partir de un inhalador equipado con una fuente de NO tal como NO comprimido o un generador eléctrico de NO. El uso de un inhalador puede ser particularmente ventajoso si se administra un segundo compuesto (por ejemplo, un inhibidor de fosfodiesterasa como se describe con más detalle más adelante), por vía oral o por inhalación, junto con el NO.

Preferiblemente, en una composición farmacéutica que comprende gas NO, la concentración de NO en el momento de la inhalación es de aproximadamente 0,1 ppm a aproximadamente 300 ppm, por ejemplo, de 0,5 ppm a 290 ppm, de 1,0 ppm a 280 ppm, de 5 ppm a 250 ppm, de 10 ppm a 200 ppm ó de 10 ppm a 100 ppm, en aire, oxígeno puro u otro gas o mezcla de gases adecuada. Una dosificación de partida adecuada para el NO administrado por inhalación puede ser de 20 ppm (véase, por ejemplo, el prospecto de INOmax^{TM}), y la dosificación puede variar, por ejemplo, de 0,1 ppm a 100 ppm, dependiendo de la edad y estado del paciente, la enfermedad o trastorno a tratar, y otros factores que el médico a cargo del caso puede considerar relevantes. La presente invención contempla la administración aguda, subaguda y crónica de NO. El NO pude administrase al paciente durante un periodo de tiempo suficiente (incluido indefinidamente) para tratar la afección y ejercer el efecto farmacológico o biológico deseado. La concentración puede aumentarse temporalmente durante cortos periodos de tiempo, por ejemplo, 5 minutos a 200 ppm de NO. Esto puede hacerse cuando se desea un efecto inmediato. Los periodos de tiempo preferidos para la exposición de un paciente a NO incluyen al menos una hora, por ejemplo, al menos seis horas; al menos un día; al menos una semana, dos semanas, cuatro semanas, seis semanas, ocho semanas, diez semanas o doce semanas; al menos un año; al menos dos años; y al menos cinco años. El paciente puede exponerse a la atmósfera de forma continua o intermitente durante dichos periodos. La administración de composiciones farmacéuticas que comprenden NO (y/o CO) puede realizarse por ventilación espontánea o mecánica.

Cuando se administra NO inhalado, es deseable controlar los efectos de la inhalación del NO. Este control puede usarse, en un individuo particular, para verificar los efectos deseables e identificar los efectos secundarios indeseables que podrían producirse. Este control también es útil para ajustar el nivel de dosificación, la duración y frecuencia de la administración del NO inhalado en un individuo determinado.

El NO gaseoso puede disolverse en solución acuosa y utilizarse en esa forma. Por ejemplo, dicha solución podría usarse para bañar un órgano, tejido o células ex vivo, o usarse para perfundir un órgano o tejido in situ. La solución puede contener otros agentes activos tales como CO, HO-1, hemo, biliverdina y/o bilirrubina.

Puede ser deseable prolongar los efectos beneficiosos del NO inhalado dentro del paciente. Para determinar cómo prolongar los efectos beneficiosos del NO inhalado, es útil considerar que uno de los efectos in vivo del NO es la activación de la guanilato ciclasa soluble, que estimula la producción de GMPc. Al menos algunos de los efectos beneficiosos del NO pueden deberse a su estimulación de la biosíntesis de GMPc. Por consiguiente, puede administrarse un inhibidor de fosfodiesterasa junto con la inhalación de NO para inhibir la degradación de GMPc por fosfodiesterasas endógenas.

El inhibidor de fosfodiesterasa puede introducirse en un paciente por cualquier método adecuado, incluyendo la vía oral, transmucosa, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal. Como alternativa, el paciente puede inhalar el inhibidor. Para la inhalación, el inhibidor de fosfodiesterasa ventajosamente se formula como un polvo seco o una solución aerosolizada o nebulizada que tiene un tamaño de partícula o de gotita menor de 10 \mum para la deposición óptima en los alvéolos, y opcionalmente puede inhalarse en un gas que contiene NO.

Puede ser deseable prolongar los efectos beneficiosos del NO inhalado dentro del paciente. Para determinar cómo prolongar los efectos beneficiosos del NO inhalado, es útil considerar que uno de los efectos in vivo del NO es la activación de la guanilato ciclasa soluble, que estimula la producción de GMPc. Al menos algunos de los efectos beneficiosos del NO pueden deberse a su estimulación de la biosíntesis de GMPc. Por consiguiente, puede administrarse un inhibidor de fosfodiesterasa junto con la inhalación de NO para inhibir la degradación de GMPc por fosfodiesterasas endógenas.

El inhibidor de fosfodiesterasa puede introducirse en un paciente por cualquier método adecuado, incluyendo la vía oral, transmucosa, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal. Como alternativa, el paciente puede inhalar el inhibidor. Para la inhalación, el inhibidor de fosfodiesterasa ventajosamente se formula como un polvo seco o una solución aerosolizada o nebulizada que tiene un tamaño de partícula o de gotita menor de 10 \mum para la deposición óptima en los alvéolos, y opcionalmente puede inhalarse en un gas que contiene NO.

Un inhibidor de fosfodiesterasa adecuado es el Zaprinast\check{O} (M&B 22948; 2-o-propoxifenil-8-azapurina-6-ona; Rhone-Poulenc Rorer, Dagenham Essex, UK). El Zaprinast\check{O} inhibe selectivamente la hidrólisis de GMPc con efectos mínimos sobre la degradación de la adenosina monofosfato cíclico en células del músculo liso vascular (Trapani et al., J Pharmacol Exp Ther 258: 269, 1991; Harris et al., Pharmacol Exp Ther 249: 394, 1989; Lugnier et al., Biochem Pharmacol 35: 1743, 1986; Souness et al., Br J Pharmacol 98: 725, 1989). Cuando se usa Zaprinast\check{O} de acuerdo con esta invención, las vías de administración preferidas son la vía intravenosa u oral. El intervalo de dosificación adecuado puede determinarse por un especialista habitual en la técnica. Puede prepararse una solución madre de Zaprinast\check{O} en NaOH 0,05 N. La solución madre después puede diluirse con solución de lactado de Ringer hasta la concentración de Zaprinast\check{O} final deseada, inmediatamente antes del uso.

Esta invención puede ponerse en práctica con otros inhibidores de fosfodiesterasa. Se conocen diversos inhibidores de fosfodiesterasa en la técnica, incluyendo Viagra® (citrato de sildenafil), dipiridamol y teofilina. Un especialista habitual en la técnica puede determinar una vía de administración adecuada y un intervalo de dosificación
adecuado.

La administración de NO con inhibidores de fosfodiesterasa puede realizarse como se indica a continuación. El NO se administra a 20 ppm en aire durante 45 min. Al inicio del periodo de 45 minutos, se administra 1,0 mg de Zaprinast\check{O} por kg de peso corporal por infusión intravenosa durante 4 minutos, seguido de una infusión continua de 0,004 mg/kg/min durante el resto del periodo de 45 minutos. Como alternativa, al inicio del periodo de 45 minutos se administran 0,15 mg de dipiridamol por kg de peso corporal durante 4 minutos, seguido de una infusión continua de 0,004 mg/kg/min durante el resto del periodo de 45 minutos. El Zaprinast\check{O} o dipiridamol se administran en una solución salina.

En el contexto del trasplante pueden usarse otros procedimientos conocidos en la técnica para mejorar la supervivencia/función de los injertos junto con los métodos descritos en este documento. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, terapias inmunosupresoras y transfusiones con especificidad de donante (DST). Por ejemplo, puede administrarse una DST a un receptor antes, durante y/o después de la administración de CO, HO-1, otros productos asociados a hemo, y/o NO a un receptor. Dicha administración, por ejemplo la administración de DST(s) junto con un tratamiento descrito en este documento, puede realizarse antes, durante y/o después del trasplante.

Ejemplo I El Monóxido de Carbono Protege a las Células Beta Pancreáticas de la Apoptosis y Mejora la Función/Supervivencia de los Islotes Después del Trasplante (no forma parte de la invención) Cultivos de células

Se cultivó la línea celular de insulinoma murino \betaTC3 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) suplementado con L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina G, 100 U/ml de estreptomicina y suero bovino fetal (FCS) al 10% (Life Technologies) y se incubó en 5% de CO_{2}/95% de aire humidificado a 37ºC. Se sabe que esta línea de células \beta murinas, procedente de ratones transgénicos que llevan un antígeno tumoral del virus del simio 40 promotor de la insulina híbrida, conserva las características de las células \beta diferenciadas durante aproximadamente 50 pases en cultivo. Las células producen insulina madura a partir de proinsulina I y II de una manera comparable a las células \beta in vivo y son inducibles hasta 30 veces por glucosa (Efrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9037-41, 1988). En comparación con otras líneas de células \beta transformadas usadas frecuentemente tales como RIN-m5f y HIT, los niveles de insulina secretada están más próximos a los de las células \beta normales en la línea celular \betaTC3. De esta manera, estas células son útiles para estudiar la regulación de las células \beta y la expresión génica (D'Ambra et al., Endocrinology 726: 2815-22, 1990).

Los islotes pancreáticos de Langerhans de ratones C57BL/6 se suministraron por la instalación central de aislamiento de islotes del Joslin Diabetes Center.

Tinción vital con violeta de cristal

Se sembraron células \betaTC3 a 2 x 10^{5} células (Nunc, Marsh Products, Rochester, NY, USA). Las células se lavaron una vez con 500 \mul de PBS y se tiñeron con 200 \mul de violeta de cristal al 0,05% en etanol al 20% durante 10 minutos a TA. Se aclaró el violeta de cristal. Para eluir el tinte de las células, se añadieron 100 \mul de ácido acético al 50% a cada pocillo. Se transfirieron 50 \mul a una placa de microtitulación de 96 pocillos y se leyeron con un lector de placas de microtitulación (lector biocinético EL 340, Bio-Tek Instruments) a una absorbancia de 562 nm.

Plásmidos de expresión

El vector de expresión de \beta-galactosidasa (Clontech Laboratories, Palo Alto, California) se clonó en el vector pcDNA3 (Sato et al., J. Immunol. 166: 4185-4194, 2001). (Invitrogen, Carlsbad, California). Se cortó un fragmento XhoI-HindIII de 1,0 kpb que codificaba el ADNc de HO-1 de rata de longitud completa a partir del vector prHO-1. (Shibahara et al., J. Biochem. 113: 214-218, 1993) y se subclonó en el vector pcDNA3.

Transfecciones transitorias

Se sembraron células \betaTC3 a 3 x 10^{5} células en pocillos de 16 mm y se transfectaron durante 15 a 20 horas después usando reactivos Lipofectamine plus^{TM} (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN total se mantuvo constante usando vector pcDNA3 vacío. Se evaluó el porcentaje de células viables normalizando el porcentaje de células viables de cada preparación de ADN para el número de células transfectadas de control sin el estímulo apoptótico (viabilidad del 100%) (Soares et al., Nature Med. 4: 1073-1077, 1998; Sato et al., J. Immunol. 166: 4185-4194, 2001).

Citometría de flujo

Se incubaron cultivos de \betaTC3 con TNF-\alpha recombinante (500 ó 1000 U/ml) (R&D Systems) durante 24 horas y los cultivos de islotes se estimularon con TNF-É (5000 U/ml) (R&D Systems) y ciclohexamida (CHX) (50 \mug/ml) durante 48 horas. Las células \betaTC3 o los islotes se recogieron, se dispersaron, se fijaron en etanol al 70% y se suspendieron en tampón de tinción de ADN (PBS, pH 7,4 que contenía Tritón X-100 al 0,1%, EDTA 0,1 mM, 50 \mug/ml de yoduro de propidio, 50 mg/ml de Rnasa A). El contenido de ADN se analizó en un analizador FACScan^{TM} equipado con un software Cell Qest\check{O} (Becton Dickinson, Palo Alto, CA). Las células con un contenido de ADN normal (2 N) se consideraron viables, mientras que las células con un contenido de ADN hipoploide (<2 N, denominadas A^{0}) se consideraron apoptóticas. Para excluir los deshechos celulares y los fragmentos sin células apoptóticas, se excluyeron del análisis todos los casos con un perfil de área FL-2 inferior al de los núcleos de eritrocitos de pollo.

Tratamiento de células y reactivos

Se disolvió TNF-\alpha recombinante murino (R&D Systems) en PBS con albúmina de suero bovino al 1% y se añadió al medio de cultivo (17,5 ng/ml = 500 U) 24 horas después de la transfección. El inhibidor de caspasa-3 Z-DEVD-FMK y el inhibidor de caspasa-8 IETD-CHO (Calbiochem, San Diego, California) se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma) y se añadieron al medio de cultivo (10 \muM y 1 \muM respectivamente) dos horas antes del tratamiento con TNF-\alpha. Se disolvió (10 mM) protoporfirina de estaño (SnPPIX) (Porphyrin Products, Logan, Utah) en NaOH 100 mM y se añadió 6 horas después de la transfección al medio de cultivo (50 \muM). Se disolvió el inhibidor de guanilil ciclasa 1H[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1 (ODQ; Calbiochem) en DMSO y se añadió al medio de cultivo (100 \muM) 6 horas antes de la transfección. El análogo de GMPc 8-bromoguanosina-3',5'-monofosfato-cíclico (8-Br-GMPc) (Sigma) se disolvió en agua y se añadió al medio de cultivo (10 \muM) 30 minutos antes de la inducción de la apoptosis. El inhibidor de proteína quinasa G KT5823 (Calbiochem) se disolvió en DMSO y se añadió al medio de cultivo (1,6 \muM) 6 horas después de la transfección.

Exposición a CO

Las células y los islotes se expusieron a monóxido de carbono al 1% en aire comprimido equilibrado con 5% de CO_{2}, como de describe en otras partes (véase, por ejemplo, Otterbein et al., Nature Med. 6:422-428, 2000). Los islotes se incubaron en medio RPMI presaturado con monóxido de carbono (4ºC durante una noche, 1% de CO, 5% de CO_{2}) durante dos horas a 37ºC mientras se continuaba el tratamiento con 1% de CO y 5% de CO_{2}.

Ratones e inducción de diabetes

Se adquirieron ratones C57BL/6 macho en Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts) y se alojaron de acuerdo con las directrices de los NIH. Los experimentos se aprobaron por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Los ratones receptores (de 8 semanas de edad) se hicieron diabéticos por una sola inyección intraperitoneal (220 mg/kg) de Streptozotocin\check{O} (Sigma) disuelto en tampón citrato. Los ratones recibían trasplantes si se
obtenían 2 niveles de glucosa sanguínea posprandiales mayores de 350 mg/dl a partir de una muestra de sangre entera.

Aislamiento de islotes

Los islotes pancreáticos de Langerhans (ratón C57BL/6) se proporcionaron por el Islet Core Laboratory of the JDRF Center for Islet Transplantation at Harvard Medical School y se aislaron como se ha descrito previamente (Gotoh et al., Transplantation 40:437-438, 1985).

Trasplantes singénicos de islotes de masa marginal

Se recogieron manualmente 250 islotes de 150-250 \mum de diámetro usando un microscopio de disección. Los islotes se trasplantaron debajo de la cápsula renal como se ha descrito previamente (Kaufman et al., J. Exp. Med. 172: 291-302, 1990). A partir de cada preparación de islote se trasplantaron los mismos números de animales de control y tratamiento.

Análisis de resultados funcionales del injerto

La función del injerto de definió como el punto en el que se alcanzaba el primero de tres días consecutivos de niveles de glucosa sanguínea posprandial < 200 mg/dl. El criterio de valoración primario del experimento se definió como el tiempo transcurrido hasta la normoglucemia.

Análisis estadísticos

Los datos de glucosa sanguínea se resumieron como media \pm desviación típica de ratones que recibían islotes tratados o no tratados. El tiempo hasta la recuperación de la función de los islotes se calculó usando tablas de vida de Kaplan-Meier y las diferencias entre grupos se ensayaron usando un ensayo long-rank, tratándose las tres preparaciones de islotes como estratos separados en el análisis, y presentándose el tiempo medio hasta la recuperación, con un intervalo de confianza del 95%.

El TNF-\alpha induce la apoptosis en células \betaTC3

Se investigó el efecto del TNF-\alpha sobre las células \betaTC3. Se utilizaron los siguientes procedimientos para generar los datos ilustrados en las Fig. 1A-C. Fig. 1A: las células \betaTC3 se trataron con concentraciones crecientes de TNF-\alpha. Las células viables se tiñeron 24 horas después de la activación con violeta de cristal. La extinción se midió a 562 nm y se normalizó para las células no tratadas. Fig. 1B: las células \betaTC3 se trataron con TNF-\alpha, se tiñeron con yoduro de propidio 24 horas después y se analizaron por fragmentación de ADN (FACScan^{TM}). Fig. 1C: las células \betaTC3 se cotransfectaron con un vector de expresión de \beta-gal (pcDNA3/\beta-gal) más control (pcDNA3). Cuando se indica, las células se trataron con el inhibidor de caspasa-3 Z-DEVD-FMK (C3-i) o con el inhibidor de caspasa-8 IETD-CHO (C8-i). Los histogramas grises representan las células \beta no tratadas y los histogramas negros representan las células \beta tratadas con TNF-\alpha durante 24 horas. Los resultados mostrados son la media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres.

El TNF-\alpha inducía altos niveles de muerte celular en la línea de células de insulinoma \betaTC3, de una manera dependiente de la dosis (Stephens et al., Endocrinology 140:3219-3227, 1999) (Fig. 1A). La fragmentación de ADN se demostró por tinción con yoduro de propidio (PI) (Fig.1B), lo que sugiere que el TNF-\alpha induce la muerte de las células \beta por medio de la apoptosis. La apoptosis mediada por TNF-\alpha era estrictamente dependiente de la activación de la caspasa-8 y parcialmente dependiente de la de la caspasa-3, como se ilustra por el descubrimiento de que el bloqueo de la caspasa-8 con un inhibidor específico de caspasa-8 (IETD-CHO) impedía la apoptosis (inhibición del 96%) mientras que el bloqueo de la caspasa-3 con un inhibidor específico de caspasa-3 (Z-DEVD-FMK) impedía la apoptosis sólo parcialmente (inhibición del 53%) (Fig. 1C).

El monóxido de carbono protege a las células \betaTC3

Se investigó si el monóxido de carbono exógeno podía proteger a las células \beta de la apoptosis (Figs. 2A-C). Se utilizaron los siguientes procedimientos para crear los datos ilustrados en las Figs. 2A-C. Fig. 2A: el CO exógeno puede sustituir a la HO-1 cuando se bloquea la actividad de la HO-1. Se cotransfectaron células \betaTC3 con un vector de expresión de \beta-gal más control o vector de expresión de HO-1 (Brouard et al., J. Exp. Med. 192:1015-1026, 2000). Cuando se indica, la actividad enzimática de la HO-1 se inhibió por protoporfirina de estaño (SnPP). Cuando se indica, las células \beta se expusieron a monóxido de carbono exógeno (al 1%) como se ha descrito anteriormente (Otterbein et al., Nature Med 6:422-428, 2000). Los histogramas grises representan las células \beta no tratadas y los histogramas negros representan las células \beta tratadas con TNF-\alpha. Los resultados mostrados son la media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres. Fig. 2B: el monóxido de carbono exógeno protege a las células \beta de la apoptosis en el análisis de fragmentación de ADN. Se trataron células \betaTC3 con TNF-\alpha. Directamente después de la estimulación, las células \betaTC3 se expusieron a monóxido de carbono exógeno durante 24 horas. Las células \betaTC3 de control se trataron de la misma manera pero no se expusieron a monóxido de carbono. Después de 24 horas, las células se tiñeron por yoduro de propidio y se analizaron con respecto a la fragmentación de ADN en un FACScan^{TM}. Fig. 2C: el monóxido de carbono exógeno protege a las células \beta de la apoptosis en ausencia de HO-1. Se transfectaron células \betaTC3 con vectores que expresaban \beta-gal y se expusieron a monóxido de carbono exógeno (Stephens et al., Endocrinology 740: 3219-27, 1999). Los histogramas grises representan las células \beta no tratadas y los histogramas negros representan las células \beta tratadas con TNF-\alpha o etopósido o sometidas a privación de suero cuando se indica. Los resultados mostrados son la media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres.

Para evaluar si la expresión de HO-1 protegería a las células \beta de la apoptosis mediada por TNF-\alpha, las células \betaTC3 se transfectaron de forma transitoria con un vector de expresión de HO-1 y se ensayaron con respecto a su capacidad para sobrevivir cuando se exponían a TNF-\alpha. La sobreexpresión de HO-1 protegió a las células \betaTC3 de la apoptosis mediada por TNF-\alpha (Pileggi et al., Diabetes 50: 1983-1991, 2001) (supervivencia del 87% frente al 33% en el control) (Fig. 2A). Cuando la actividad de la HO-1 se bloqueaba por la protoporfirina de estaño (SnPPIX) (Kappas et al., Hepatology 4:336-341, 1994), se suprimió el efecto anti-apoptótico (Fig. 2A), lo que sugiere que se requiere la generación de al menos uno de los productos finales del catabolismo del grupo hemo por HO-1, es decir, hierro, bilirrubina y/o CO, para su función anti-apoptótica.

Basándose en la hipótesis de que el efecto anti-apoptótico de la HO-1 podía estar mediado por monóxido de carbono, se ensayó si la exposición a monóxido de carbono exógeno sustituiría a la HO-1 en la protección de las células \beta de la apoptosis. Cuando la acción de la HO-1 se suprimió por SnPPIX, la exposición del monóxido de carbono suprimió la apoptosis mediada por TNF-\alpha en una medida similar a la HO-1 (Fig. 2A). La exposición a monóxido de carbono exógeno solo era protectora (el 11,7% de células apoptóticas frente al 20,3% en controles no expuestos a CO), como se demuestra por análisis de fragmentación del ADN (Fig. 2B). De forma similar, la apoptosis de células \beta inducida por etopósido o privación de suero se suprimió por exposición a monóxido de carbono
(Fig. 2C).

La inducción de HO-1 en donantes y receptores conduce a una supervivencia prolongada de injertos de islotes

Se investigó si la inducción de HO-1 en donantes y receptores protegería a los injertos de células de islotes. Se utilizaron los siguientes procedimientos para generar los datos ilustrados en la Tabla 1 presentada a continuación. Para los experimentos se utilizó un modelo de ratón. Los donantes de células de islotes se trataron con protoporfirina de cobalto (CoPP) (20 mg/kg) una vez al día antes del aislamiento de las células de los islotes. Los receptores de los injertos de las células de los islotes se trataron con CoPP (20 mg/kg) una vez al día los días 1, 3, 5 y 7 o con CoPP (10 mg/kg) una vez al día los días 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17. El tratamiento con CoPP induce la expresión de la hemo oxigenasa-1 (HO-1).

TABLA I

1

Debajo del encabezamiento "día de rechazo" están los días que sobrevivieron los islotes. Por ejemplo, ">51x2", significa que los islotes de dos receptores aún sobrevivían después de 51 días. La fecha media de rechazo se muestra en la cuarta columna. Estos datos demuestran que la inducción de HO-1 produce una mayor supervivencia de los islotes después del trasplante.

El monóxido de carbono exógeno protege a las células de los islotes murinos de la apoptosis

También se investigó si el monóxido de carbono exógeno protege a las células de los islotes murinos de la apoptosis (Fig. 3). Se utilizaron los siguientes procedimientos para generar los datos ilustrados en la Fig. 3. Se indujo apoptosis en islotes murinos aislados recientemente (C57BL/6) por estimulación con TNF-\alpha y cicloheximida (CHX). Directamente después de la simulación, los islotes se expusieron a monóxido de carbono exógeno durante 24 horas. Los islotes de control se trataron de la misma manera pero no se expusieron a monóxido de carbono. Después de 48 horas, las células se analizaron en un FACScan^{TM} para la fragmentación del ADN. Este experimento se realizó dos veces con resultados indistinguibles.

La exposición a monóxido de carbono durante 24 horas protegió a los islotes de Langerhans murinos aislados (C57/BL6) de la apoptosis mediada por TNF-\alpha más cicloheximida (CHX) (el 11,7% de células apoptóticas frente al 20,3% en controles no expuestos a CO) como se ensaya por análisis de fragmentación de ADN (Fig. 3).

El efecto anti-apoptótico del monóxido de carbono exógeno está mediado por la activación de la guanilato ciclasa y proporciona señales a través de proteína quinasas dependientes de GMPc (cGK)

Se investigó si el efecto antiapoptótico del monóxido de carbono actuaba a través de la activación de la guanilato ciclasa soluble (GCs) y la generación de GMPc (Figs. 4A-C). Se utilizaron los siguientes procedimientos para generar los datos ilustrados en las Figs. 4A-C. Fig. 4A: el efecto anti-apoptótico del monóxido de carbono exógeno está mediado por la activación de la guanilato ciclasa. Se transfectaron células \betaTC3 con vectores que expresaban \beta-gal y se expusieron a monóxido de carbono exógeno (1%). Cuando se indica, la células \betaTC3 se trataron con el inhibidor de guanilil ciclasa ODQ. Fig. 4B: un análogo de GMPc puede sustituir al monóxido de carbono en la protección de la apoptosis. Las células \betaTC3 se transfectaron con vectores que expresaban \beta-gal. Cuando se indica, las células \betaTC3 se expusieron a monóxido de carbono exógeno. Cuando se indica, las células \betaTC3 se trataron con el análogo de GMPc 8-Br-GMPc pero no se expusieron a monóxido de carbono. Fig 4C: las proteína quinasas dependientes de GMPc (cGK) median el efecto anti-apoptótico del monóxido de carbono. Se cotransfectaron células \betaTC3 con vector de expresión de \beta-gal. Cuando se indica, las células \betaTC3 se expusieron a monóxido de carbono exógeno. Cuando se indica, las células se trataron con el inhibidor de proteína quinasa G KT5823 (KT). Los histogramas grises representan las células \beta no tratadas y los histogramas negros representan las células \beta tratadas con TNF-\alpha. Los resultados mostrados son la media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados a partir de un experimento representativo de tres.

Se investigó si el efecto anti-apoptótico del monóxido de carbono actuaba a través de la activación de la guanilato ciclasa soluble y la generación de GMPc (como se describe en fibroblastos) (Petrache et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278: L312-319, 2000). La inhibición de la actividad GCs por la oxadiazoloquinoxalina (ODQ) suprimía el efecto anti-apoptótico del CO, sugiriendo que una guanilato ciclasa soluble es un mediador importante para el monóxido de carbono en este sistema experimental (Fig. 4A). El activador de cGK/análogo de GMPc, 8-Br-GMPc, suprimía la apoptosis de \betaTC3 en un grado similar al observado con el monóxido de carbono (Fig. 4B). Además, la inhibición de proteína quinasas dependientes de GMPc por el inhibidor específico KT5823 suprimía el efecto anti-apoptótico del monóxido de carbono exógeno (Fig. 4C), lo que sugiere que el efecto anti-apoptótico del monóxido de carbono está mediado por la activación de una o varias proteína quinasas dependientes de GMPc.

El monóxido de carbono exógeno proporcionó protección anti-apoptótica en diversos protocolos

Se investigó la capacidad del monóxido de carbono para proteger células \beta después de inducir la apoptosis (Figs. 5A-C). Para generar los datos ilustrados en las Figs. 5A-C se utilizaron los siguientes procedimientos. Fig. 5A: una hora de exposición al monóxido de carbono es suficiente para prevenir la apoptosis. Se transfectaron células \betaTC3 con vectores que expresaban \beta-gal. Se indujo la apoptosis de células \beta por TNF-\alpha. Inmediatamente después de la activación de TNF-\alpha, las células se expusieron a monóxido de carbono al 1% durante periodos variables (0-24 horas). Las células \betaTC3 de control se trataron de la misma manera pero no se expusieron a monóxido de carbono. La supervivencia celular se determinó 24 horas después de la aplicación de TNF-\alpha. Fig. 5B: el monóxido de carbono protege a las células \beta después de la inducción de la apoptosis. Se transfectaron células \betaTC3 con vectores que expresaban \beta-gal. La apoptosis se indujo por TNF-\alpha. Después de periodos variables (0,5-12 horas, cuando se indica), las células \betaTC3 se expusieron a monóxido de carbono al 1% (Otterbein et al., Nat. Med, 6:422-428, 2000). Las células \betaTC3 de control se trataron de la misma manera pero no se expusieron a monóxido de carbono. La supervivencia celular se determinó 24 después de la aplicación de TNF-\alpha. Fig. 5C: la preincubación con monóxido de carbono previene la apoptosis de las células \beta. Se transfectaron células \betaTC3 con vectores de expresión de \beta-gal y se indujo la apoptosis por TNF-\alpha. Las células \betaTC3 se pre-expusieron a monóxido de carbono al 1% durante una hora. Las células \betaTC3 de control se trataron de la misma manera pero no se expusieron a monóxido de carbono. 1-6 horas después de terminar el periodo de pre-exposición, se indujo la apoptosis por TNF-\alpha. Los histogramas grises representan células \beta no tratadas y los histogramas negros representan células \beta tratadas con TNF-\alpha. Los resultados mostrados son media \pm desviación típica de pocillos duplicados tomados de un experimento representativo de
tres.

Las células \betaTC3 se expusieron a monóxido de carbono durante periodos de tiempo diferentes (1-24 horas) inmediatamente después de la adición de TNF-\alpha y se ensayaron con respecto a la apoptosis 24 horas después. Una hora de exposición a monóxido de carbono fue suficiente para impedir la apoptosis de las células \beta (Fig. 5A).

Para investigar si la exposición a monóxido de carbono puede bloquear la apoptosis en curso, las células \beta se expusieron durante una hora a CO, de 0,5 a 12 horas después de la inducción de la apoptosis por TNF-\alpha. Incluso cuando se expusieron dos horas después de la estimulación de TNF-\alpha, el monóxido de carbono podía suprimir la apoptosis de las células \beta (Fig. 5B).

Para investigar si la preincubación con monóxido de carbono protegería a las células \beta de la apoptosis, las células \betaTC3 se expusieron a monóxido de carbono durante 0,5 a 3 horas antes de la inducción de la apoptosis. Una hora de preincubación en presencia de monóxido de carbono fue suficiente para impedir la apoptosis de las células \beta (datos no mostrados). Para evaluar durante cuanto tiempo duraría este efecto cuando se prolongara el tiempo transcurrido entre la preincubación y el estímulo apoptótico, las células \beta se pre-expusieron durante una hora a CO, de una a seis horas antes de la inducción de la apoptosis con TNF-\alpha (Fig. 5C). Una hora de preincubación con monóxido de carbono prevenía la apoptosis de las células \beta en células estimuladas con TNF-\alpha incluso de dos a tres horas después de terminar el tratamiento de una hora con monóxido de carbono. Estos datos indican que un tratamiento relativamente breve con monóxido de carbono puede actuar de una manera anti-apoptótica y que este efecto anti-apoptótico durará un periodo de tiempo prolongado.

La exposición de islotes murinos a monóxido de carbono mejora la supervivencia/función de los islotes después del trasplante

Para determinar si el monóxido de carbono también podía mejorar la función de los injertos de islotes in vivo, se transplantó una masa de islotes marginal de 250 islotes recogidos de forma manual en un sistema singénico, un modelo de fallo primario (Berney et al., Transplantation 71:125-32, 2001); Kaufman et al., Diabetes 43:778-83, 1994). El trasplante de un número de islotes marginales (por ejemplo, subóptimos) (una "masa marginal") en un receptor singénico diabético produce un retraso en el retorno a la normoglucemia sin los efectos de rechazo o recurrencia de enfermedades autoinmunes. Para determinar lo que sería una masa de islotes marginales en el sistema singénico C57/BL6, se observó que el trasplante de 500 islotes recogidos de forma manual debajo de la cápsula renal del receptor conducía a un retorno rápido de la normoglucemia (1,5 \pm 0,5 días (n = 4)) mientras que el trasplante de 250 islotes produjo un retraso significativo (14,2 \pm 2,94 días (n = 9)). De esta manera, se definió que la masa marginal era de 250 islotes. El uso de una masa marginal de esta manera no implica el rechazo o recurrencia de enfermedades autoinmunes. (Berney et al., Transplantation 71: 125-132, 2000).

Se investigó si la preincubación con monóxido de carbono de injertos de islotes antes del trasplante produce un mejor comportamiento funcional in vivo (Figs. 6A-B). Para generar los datos ilustrados en las Figs. 6A-B se utilizaron los siguientes procedimientos. Fig. 6A: se incubaron doscientos cincuenta islotes aislados recientemente y recogidos de forma manual a partir de ratones C57BL/6 en un medio pre-saturado con monóxido de carbono al 1% durante dos horas a 37ºC. Los islotes de control de trataron de la misma manera pero no se expusieron a monóxido de carbono. Los islotes se transplantaron debajo de la cápsula renal de los receptores singénicos diabéticos como se ha descrito previamente. Después del trasplante, se determinaron los niveles de glucosa en sangre en una base diaria. Un total de 16 animales (8 con islotes pre-expuestos; 8 de control) recibieron los trasplantes. Un animal que recibió islotes pre-expuestos murió el día 3 por razones técnicas no relacionadas con la exposición y se incluyó en el análisis estadístico como un animal censurado. El criterio de valoración primario de estos experimentos fue el primer día de normoglucemia. Los datos se muestran como media \pm desviaciones típicas. Fig. 6B: indica la probabilidad de recuperación (nivel de glucosa en sangre por debajo de 200 mg/dl) para animales que reciben islotes pre-expuestos a monóxido de carbono o islotes de control. *P = 0,001 frente al control.

Basándose en la observación de que los efectos del tratamiento con monóxido de carbono duran un periodo de tiempo prolongado (Figs. 5A y 5B) y que un pretratamiento relativamente breve con monóxido de carbono (antes de aplicar el estímulo apoptótico) es anti-apoptótico (Fig. 5C), se evaluó si la pre-exposición de islotes a monóxido de carbono puede mejorar la supervivencia y/o función de los islotes después del trasplante. Se transplantó una masa de islotes marginales debajo de la cápsula renal de receptores singénicos diabéticos. El tiempo necesario para alcanzar la normoglucemia se redujo de una manera muy significativa (P = 0,0011) cuando los islotes se preincubaron durante dos horas en un medio presaturado con monóxido de carbono (7 días, intervalo de confianza del 95%: 6-8 días) en comparación con islotes de control no pre-expuestos a monóxido de carbono (14 días, intervalo de confianza del 95%, 12-18 días) (Fig. 6). En total, se usaron tres preparaciones de islotes diferentes para estos experimentos. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa en el tiempo transcurrido hasta la normoglucemia para los islotes entre estas tres preparaciones (P > 0,25).

Exposiciones a monóxido de carbono

Para los experimentos de cultivo de células estaba presente un 5% de CO_{2} para los requisitos de tamponamiento. Se mezcló CO a una concentración del 1% (10.000 ppm) en aire comprimido con o sin CO_{2} en un cilindro de mezcla de acero inoxidable entes de la administración a la cámara de exposición. El flujo en la cámara animal de plexiglás de 3,70 pies^{2} (0,34 m^{2}) se mantuvo a 12 l/min y en la cámara de cultivo de células de 1,2 pies^{2} (0,11 m^{2}) a un flujo de 2 l/min. La cámara de cultivo de células se humidificó y se mantuvo a 37ºC. Se usó un analizador de CO (Interscan, Chatsworth, CA) para medir los niveles de CO continuamente en las cámaras. Se tomaron muestras de gas por el analizador a través de un orificio en la parte superior de las cámaras a una velocidad de 1 l/min y se analizaron por detección electroquímica, con una sensibilidad de 10-600 ppm. Los niveles de concentración se midieron cada hora. No hubo fluctuaciones en las concentraciones de CO una vez que la cámara se equilibró (aproximadamente 5 minutos).

Los animales se expusieron a mezclas de >98% de O_{2} o 98% de O_{2} + CO a un caudal de 12 litros/min en una cámara de exposición de vidrio de 3,70 pies cúbicos (0,10 m^{3}). Los animales recibieron alimento y agua durante las exposiciones. Se mezcló CO a una concentración del 1% (10.000 ppm) en aire comprimido con > 98% de O_{2} en un cilindro de mezcla de acero inoxidable antes de entrar en la cámara de exposición. Variando los caudales de CO en el cilindro de mezcla, se controlaron las concentraciones suministradas a la cámara de exposición. Como el caudal se determinaba principalmente por el flujo de O_{2}, sólo se cambió el flujo de CO para generar las diferentes concentraciones suministradas a la cámara de exposición. Las concentraciones de O_{2} en la cámara se determinaron usando un espectrómetro de gases.

Procedimiento de aislamiento de células

El siguiente ejemplo ilustra un protocolo usado para aislar células de islotes a partir de ratas o ratones. Se disolvió un frasco de Rat Liberase\check{O} (de Boehringer Manheim/Roche, Nº de cat. 1 815 032) en 4 ml de HBSS estéril, se enfrió en hielo durante 30 minutos, se repartió en alícuotas de 0,5 ml y se almacenó a -20ºC. A cada alícuota de 0,5 ml se le añadieron 33 ml de medio, por ejemplo, M199, HBSS o RPMI 1640 sin suero bovino.

A las ratas se les administró una sobredosis de anestesia (0,1 ml más 0,1 ml/100 g de peso corporal de Nembutol I.P.). En el caso de los ratones, se prepararon jeringuillas de 3 ml con 2 ml de solución Liberase con una aguja de calibre 27 doblada formando un ángulo de 90 grados. Para la cirugía, se usaron dos pares de tijeras; un par grande para el corte abdominal y un par pequeño para cortar el conducto biliar. Se usaron dos pares de pinzas para la escisión del páncreas. Se usó un hemostato para estrangular el conducto biliar.

El abdomen se abrió y se expuso el páncreas en la medida de lo posible realizando un corte en v desde la parte abdominal inferior. El conducto pancreático se estranguló (con un hemostato en ratas o una pinza de bulldog pequeña en ratones) en su inserción duodenal, teniendo cuidado de no dañar el tejido pancreático circundante. El conducto biliar se aisló en el extremo proximal. Se retiró la grasa antes de insertar la cánula, asegurándose de que no se pinchaba la vena porta. El conducto se cortó con las tijeras finas un tercio de la sección transversal y se insertó la cánula en el conducto. La cánula se mantuvo en el conducto sujetando el conducto ligeramente con pinzas. Rápidamente se inyecto solución Liberase\check{O}. El páncreas parecía distendido y completamente dilatado después de 6 ml de inyección de fluido. En los ratones, la aguja se insertó en el conducto tan cerca del hígado como fue posible y se inyecto la solución Liberase\check{O}. Después la rata o el ratón se sacrificó cortando el diafragma y el corazón o la aorta.

Después de la infiltración de Liberase\check{O}, se extrajo el páncreas, empezando por la extracción de los intestinos, después el estómago y después el bazo. Cuando el páncreas estaba unido únicamente por el conducto biliar, éste se cortó de la rata. Se puso el páncreas en un tubo cónico de 50 ml y se puso en un baño de agua a 37ºC durante 30 minutos.

Después de la incubación, se añadieron 20 ml de medio + NCS a cada tubo. El resto del aislamiento se completó en hielo. Los tubos se agitaron manualmente de forma vigorosa durante 5-10 segundos para romper el tejido. Los islotes se lavaron varias veces para retirar la solución Liberase\check{O} en una centrifugadora clínica a 800 rpm (aprox. 180 xg) durante 120 seg o 1200 rpm (aprox. 200 xg) durante 90 seg. Se vertió el sobrenadante y se añadieron 25-35 ml de medio y se agitó con vórtice suavemente (aproximadamente 1/2 máx.). La etapa de centrifugación se repitió, seguida de lavado 2-3 veces. El tejido se resuspendió en 20 ml de medio, y la suspensión se filtró a través de una malla de alambre de 400 im de diámetro (malla científica Thomas 35 Nº cat. 8321-M22) para retirar el tejido no digerido restante, la grasa y la linfa. Se añadieron 5-10 ml más al tubo para lavar cualquier islote restante y filtrarlo a través de la malla.

Las células se sedimentaron por centrifugación a 1200 rpm durante 90 seg. El sobrenadante se retiró, dejando la menor cantidad posible de medio.

Para preparar el gradiente, el sedimento se resuspendió en 10-15 ml de Histopaque 1077\check{O} (Sigma Nº cat. 1077) y se agitó con vórtice hasta que la suspensión fue homogénea (igual que en el caso de los lavados). Se superpusieron 10 ml de medio, sin NCS, con cuidado de mantener la superficie de contacto nítida entre el Histopaque\check{O} y el medio. Se añadió el medio lentamente con una pipeta dejándolo caer por las paredes del tubo. El gradiente se centrifugó durante 20 minutos a 2400 rpm (900 g) a 10ºC con una aceleración muy lenta y sin frenado.

Después de la centrifugación, la capa de islotes se recogió de la superficie de contacto con una pipeta serológica desechable de 10 cc (Falcon), y se puso en tubos cónicos de 50 cc. Los islotes se lavaron varias veces para retirar el Histopaque\check{O} añadiendo 25-35 ml del medio + NCS. La centrifugación inicial se realizó a 1200 rpm durante 2 min., pero las centrifugaciones posteriores se realizaron durante 90 seg. Después de tres lavados, los islotes se resuspendieron por movimiento vertical con la ayuda de una pipeta. Se pusieron 7-10 ml de cada uno en placas de cultivo estériles de 60 mm para la selección manual.

La selección manual de las células de los islotes se realizó usando una punta de pipeta estéril de 100 il, al microscopio. Cada islote se recogió individualmente, teniendo cuidado de evitar cualquier otro tejido. Sólo se recogieron los islotes con un diámetro comprendido entre 50 y 225 im que presentaban una forma lisa y redonda u ovalada.

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Ejemplo II El monóxido de carbono suprime el rechazo de trasplantes cardiacos de ratón a rata

Como órganos donantes se usaron corazones de ratones BALB/c para transplantar en ratas Lewis macho adultas endogámicas (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN). Los animales se alojaron de acuerdo con las directrices de la American Association for Laboratory Animal Care, y los protocolos de investigación se aprobaron por el Institutional Animal Care and Use Committees of the Beth Israel Deaconess Medical Center.

Modelo quirúrgico

Los animales se anestesiaron con una combinación de inhalación de metoxiflurano (Pitman-Moore, Mundelain, IL) y pentoarbital (Abbott, North Chicago, IL) a una dosis de 30-50 mg/kg i.p. durante todos los procedimientos. Los trasplantes cardiacos heterotópicos se realizaron como se ha descrito previamente (Berk et al., Physiol Rev. 8: 999-1030, 2001; Petkova et al., J Biol. Chem. 276:7932-7936, 2001). La supervivencia de los injertos se evaluó diariamente por palpación. El rechazo se diagnosticó por el cese de contracciones ventriculares y se confirmó por examen histológico.

Reactivos experimentales

Se administró factor de veneno de cobra (CVF; que bloquea la activación del complemento) (Quidel, San Diego, CA) i.p. el día -1 (60 U/kg) y el día 0 (20 U/kg) con respecto al día del trasplante (día 0). La ciclosporina A (CsA; Novartis, Basilea, Suiza) que bloquea la activación de las células T, se administró i.m. (15 mg/kg) empezando el día 0 y posteriormente cada día hasta el final de cada experimento. Se diluyeron protoporfirina de estaño (SnPPIX); protoporfirina de cobalto (CoP-PIX) y protoporfirina de hierro (FePPIX; Porphyrin Products, Logan, UT) en NaOH 100 mM hasta una solución madre de 50 mM y se mantuvieron a -70ºC hasta que se usaron. La exposición a la luz se limitó en la medida de lo posible. Tanto SnPPIX como FePPIX se administraron i.p. (30 \muM/kg) en PBS. FePPIX y SnPPIX se administraron al donante en los días -2 y -1 (30 \muM/kg) y al receptor en el momento del trasplante (día 0) y diariamente desde entonces (30 \muM/kg).

Exposición a CO

En resumen, se mezcló CO a una concentración de 1% (10.000 partes por millón; ppm) en aire comprimido con aire equilibrado (21% de oxígeno) en un cilindro de mezcla de acero inoxidable antes de la entrada en la cámara de exposición. Las concentraciones de CO se controlaron variando los caudales de CO en un cilindro de mezcla antes del suministro a la cámara. Como el caudal se determina principalmente por el flujo de O_{2}, sólo se cambió el flujo de CO para suministrar la concentración final a la cámara de exposición. Se usó un analizador de CO (Interscan Corporation, Chatsworth, CA) para medir los niveles de CO de forma continua en la cámara. Los donantes del injerto se pusieron en la cámara de exposición a CO dos días antes del trasplante. Los receptores del injerto se pusieron en la cámara de exposición inmediatamente después del trasplante y se mantuvieron en la cámara de exposición durante 14 (n = 3) o 16 (n = 3) días. La concentración de CO se mantuvo entre 250 y 400 ppm en todo momento. Los animales se retiraron diariamente de la cámara para evaluar la supervivencia del injerto y para administrar CsA, SnPPIX o FePPIX como se ha descrito anteriormente.

Actividad enzimática de HO

La actividad enzimática de HO se midió por generación de bilirrubina en corazón y en microsomas hepáticos. Los animales se sacrificaron y los hígados y corazones se lavaron abundantemente con PBS enfriado con hielo y se congelaron a -70ºC hasta el uso. Los órganos se homogeneizaron en cuatro volúmenes de tampón de sacarosa (250 mM) Tris-HCl (10 mM/l) (pH 7,4) en hielo y se centrifugaron (28.000 RPM 3X, 20 min, 4ºC). El sobrenadante se centrifugó (150.000 RPM 3X, 60 min, 4ºC) y el sedimento microsomal se resuspendió en tampón de MgCl_{2} (2 mM)-fosfato potásico (100 mM) (pH 7,4) y se sonicó en hielo. Las muestras (1 mg de proteína) se añadieron a la mezcla de reacción (400 îl) que contenía citosol de hígado de rata (2 mg de proteína), hemina (50 iM), glucosa-6-fosfato (2 mM), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (0,25 U) y NADPH (0,8 mM) durante 60 min a 37ºC en la oscuridad. La bilirrubina formada se extrajo con cloroformo y la DO se midió a 464-530 nm (coeficiente de extinción, 40 mM/cm en el caso de la bilirrubina). La actividad enzimática se expresa como picomoles de bilirrubina formados por miligramo de proteína por 60 min (pmol/mg/h). La concentración de proteína se determinó por ensayo de proteína de ácido bicinconínico (Pierce, Georgetown). El efecto de fondo fue de \sim5 pmol/mg/h. Todos los reactivos usados en este ensayo se adquirieron en Sigma (St. Louis, MO) a menos que se indique otra cosa. La carboxihemoglobina se midió dos días después del trasplante usando un analizador de gas sanguíneo Comino 865 (Clinical Chemistry, Massachussets General Hospital, Boston, MA).

Análisis histomorfométrico

Los injertos se recogieron 3 días después del trasplante, se incluyeron en parafina, se fijaron en formalina y se seccionaron en serie (5 im) en conjunto desde el ápice hasta la base. Se pusieron diez secciones por portaobjetos en un total de aproximadamente 20-25 portaobjetos. Uno de cada cinco portaobjetos se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) para el análisis histomorfométrico. Se capturaron dos imágenes por portaobjetos usando un microscopio Nikon Eclipse E600\breve{O} (Nikon, Melville, NY) conectado a una cámara de color Hitachi 3-CCD (modelo HV-C20; Hitachi, Tokio, Japón) y a un ordenador Power Macintosh\breve{O} 7300/200 (Apple Computer, Cupertino, CA) equipado con un software de imágenes digitales IPLab Spectrum (Signal Analytics Corporation, Viena, VA). Se capturaron aproximadamente 50 imágenes a partir de cada corazón trasplantado de dos o tres animales por grupo. Las imágenes se analizaron por segmentación manual, localizando las áreas infartadas y no infartadas de los ventrículos derecho e izquierdo en cada sección. Las áreas correspondientes al tejido infartado y no infartado se calcularon con un software de formación de imágenes digitales como números de píxeles correspondientes a esas áreas. Las áreas infartadas y no infartadas después se calcularon como el porcentaje de área total. Los datos reunidos para cada grupo, expresados como área en píxeles o como porcentaje de infarto, se analizaron usando un ANOVA. Los resultados obtenidos de esta manera fueron similares tanto si se usaban píxeles como si se usaba el porcentaje de infarto y sólo se muestran los resultados obtenidos usando el porcentaje de infarto (véase la Tabla II). Los resultados se expresan como media = SD.

Inmunohistología

Los injertos se recogieron 3 días después del trasplante, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Las secciones de criostato se fijaron y se tiñeron como se ha descrito previamente (Soares et al, Nature Med. 4: 1073, 1998). Se analizaron poblaciones de leucocitos de rata usando mAb anti-Ag común de leucocito de rata (LCA, CD45; OX-1), Éé TCR (cadenas TCRÉé; R73), células B (CD45RB; OX-33), células NK (NKR-P1; 3.2.3), y M\Phi (CD68; ED-1) (Serotec, Harlan Bioproducts for Science, Indianapolis, IN). La detección de fibrina/fibrinógeno se realizó usando un Ab policlonal de conejo anti-fibrina/fibrinógeno humano (Dako, Carpinteria, CA). La activación del complemento intrainjerto se detectó usando un mAb anti-Clq de rata (The Binding Site, Birmigham, U.K.), C3 (ED11; Serotec) o C5b-9 (Dako). La IgM de rata se detectó usando el mAb anti-IgM de rata MARM-4 (donado amablemente por el Dr. H. Bazin, University of Louvain, Bruselas, Bélgica). En cada experimento se incluyeron mAb de isotipo correspondiente o Ig purificadas, así como un control para la actividad peroxidasa endógena residual. La detección de la apoptosis se realizó usando el kit de detección de apoptosis in situ ApopTag\breve{O} (Oncor, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo hemolítico del complemento (CH50)

Las unidades de CH50 se definieron como la dilución de suero de rata necesaria para producir un 50% de la lisis máxima de eritrocitos de oveja sensibilizados con Ab. En resumen, se incubaron eritrocitos de oveja sensibilizados con Ab (1 x 10^{8} células/ml; Sigma) (30 min, 37ºC) con suero de rata en tampón Veronal de gelatina (GVB^{++}; Sigma). Las células se centrifugaron y se midió la liberación de hemoglobina (1î = 550 nm). El nivel de fondo se midió en ausencia de eritrocitos de oveja o en ausencia de suero y se restó de todas las muestras.

ELISA celular

Se midieron los niveles séricos de Ab de rata anti-ratón por un ELISA indirecto basado en células. Como diana antigénica se usó la línea de células endoteliales de ratón 2F-2B (CRL-2168; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA). En resumen, se cultivaron células 2F-2B en DMEM (Life Technologies, Rockville, MD), FCS al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 îg/ml de estreptomicina (Life Technologies). Las células 2F-2B fijadas con glutaraldehído se incubaron (1 h, 37ºC) en presencia de suero de rata diluido en serie en PBS con Tween 20 al 0,05% (Sigma) y los Ab de rata anti-ratón se detectaron usando IgM de ratón anti-rata (MARM-4), IgG1 (MARG 1-2), IgG2a (Marg2a-1), IgG2b (MARGb-8) o IgG2c (MARG2c-5) (donados amablemente por el Prof. H. Bazin, University of Louvain, Bruselas, Bélgica). Los Ab de ratón anti-rata se detectaron usando Fab' de cabra anti-ratón marcado con HRP en el que se había reducido la reactividad cruzada con Ig anti-rata (0,1 îg/ml, 1 h, temperatura ambiente; Pierce, Rockford, IL). La HRP se reveló usando orto-fenildiamina (Sigma) y H_{2}O_{2} (al 0,03%) en tampón citrato (pH 4,9). La absorbancia se midió a î = 490 nm. La cantidad relativa de Ab anti-injerto circulantes en el suero se expresó como DO (î = 490) tomada a partir de una dilución seriada en el intervalo lineal del ensayo (1: 32 -1: 1024).

La unión de C3 de rata a células endoteliales de ratón se midió por un ELlSA celular modificado con células endoteliales 2F-2B de ratón como dianas antigénicas (Miyatake et al, J. Immunol. 160: 4114, 1998). En resumen, se incubaron células endoteliales 2F-2B no fijadas en presencia de suero de rata diluido en serie en tampón GVB^{++} (1 h, 37ºC). Las células se fijaron en PBS, glutaraldehído al 0,05% y la deposición de C3 de rata se detectó usando un mAb de ratón anti-C3 de rata (Serotec).

Ensayo de agregación plaquetaria

Se cultivaron células endoteliales 2F-2B de ratón en placas de seis pocillos recubiertas con gelatina al 0,2% (Sigma) en DMEM al 88% (Life Technologies), FCS al 10% (FCS), 100 U/ml de penicilina y 100 îg/ml de estreptomicina (Life Technologies). Las células endoteliales confluentes se dejaron sin tratar o se trataron con el agente inductor de HO CoPPIX (50 iM; 18 h), el inhibidor de HO SnPPIX (50 îM, 18 h) o tanto con CoPPIX (50 îM, 15 h) como con SnPPIX (50 iM, 3 h). El plasma rico en plaquetas se obtuvo por centrifugación (290 - g, 12 min, 19ºC) de plasma de rata normal en citrato sódico al 3,8%. Las plaquetas de rata (3 - 10^{8} células/ml) se resuspendieron en tampón HT (NaHCO_{3} 8,9 mM, KH_{2}PO 0,8 mM, dextrosa 5,6 mM, solución de KCl 2,8 mM, MgCl_{2} 0,8 mM, NaCl 129 mM, HEPES 10 mM). Las plaquetas se superpusieron (5 min; 37ºC) en células endoteliales de ratón y los ensayos de agregación plaquetaria se realizaron como se ha descrito anteriormente (Kaczmarek et al, J. Biol. Chem. 271: 33116, 1996) usando un agregómetro (Chrono-Log, Harestown, PA) y ADP (0,5-4 \muM) como agonista.

Extractos celulares y análisis de transferencia de Western

Se lavaron células endoteliales en PBS (pH 7,2), se recogieron raspando y se lisaron en tampón de Laemmli. Se realizó una electroforesis en condiciones desnaturalizantes con geles de poliacrilamida al 10%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de polivinildifluoridina (Immobilon P; Millipore, Bedford, MA) por electrotransferencia y se detectaron con Ab policlonales de conejo dirigidos contra HO-1 o HO-2 humanas (StressGen, Victoria, Canadá) o é-tubulina (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Las proteínas se visualizaron usando IgG de burro anti-conejo conjugada con HRP o IgG de cabra anti-ratón (Pierce) y el ensayo ECL (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Transfecciones transitorias y ensayo de apoptosis

La línea de células endoteliales murinas 2F-2B (ATCC) se transfectó de forma transitoria como se describe en otras partes (Soares et al., Nature Med. 4: 1073, 1998; Brouard et al., J. Exp. Med. 192: 1015, 2000). Todos los experimentos se realizaron 24-48 horas después de la transfección. Las células transfectadas con é-galactosidasa se detectaron como se describe en otras partes (Soares et al., Nature Med. 4: 1073, 1998; Brouard et al., J. Exp. Med. 192: 1015, 2000). El porcentaje de células viables se evaluó evaluando el número de células que expresaban é-galactosidasa que retenían la morfología normal como se describe en otras partes (Soares et al., Nature Med. 4: 1073, 1998; Brouard et al., J. Exp. Med. 192: 1015, 2000). Se determinó que el número de campos aleatorios contados tenía un mínimo de 200 células transfectadas viables por pocillo de control. El porcentaje de células viables se normalizó para cada preparación de ADN al número de células transfectadas contadas en ausencia del agente inductor de la apoptosis (viabilidad del 100%). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces por duplicado. Se disolvió actinomicina D (Act. D; Sigma) en PBS y se añadió al medio de cultivo (10 îg/ml) 24 h después de la transfección. Se disolvió SnPPIX (Porphyrin Products) (10 iM) en NaOH 100 mM y se conservó a -20ºC hasta que se usó. Se añadió SnPPIX al medio de cultivo (50 îM) 6 h después de la transfección. Se disolvió TNF-\alpha humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) en PBS y BSA al 1% y se añadió al medio de cultivo (10 -100 ng/ml) 24 h después de la transfección.

Exposición de células endoteliales cultivadas a CO

Las células se expusieron a aire comprimido o a una concentración variable de CO (250 y 10.000 ppm), como se describe en otras partes (Otterbein et al., Nature Med. 6: 422, 2000; y Brouard et al., J. Exp. Med. 192: 1015, 2000).

Modelo de trasplante aórtico

El trasplante aórtico se realizó como se describe en otras partes (Plissonnier et al., Transplantation 60: 414-424, 1995). En resumen, la aorta y la vena cava inferior se cortaron para producir una hemorragia después de una heparinización. Después de una toracotomía izquierda adicional, se ligaron tres o cuatro pares de las arterias intercostales usando una sutura de nylon 7-0 (Keisei Medical lndustrial Co., L TD, Tokio, Japón) y se recogieron 2 cm de la aorta descendente. El injerto se insertó entre las arterias renales y la bifurcación aórtica por una técnica de microcirugía convencional usando suturas de nylon 9-0 (Ethilon^{TM}, Ethicon, Inc, Somerville, New Jersey). La aorta abdominal nativa se dejó después de ligar los dos bordes.

Se mezcló CO a una concentración del 1% (10.000 partes por millón; ppm) en aire comprimido con aire equilibrado (21% de oxígeno) como se ha descrito previamente (Otterbein et al., Am J Physiol 276(4 Pt 1): L688-L694, 1999). Para el modelo de trasplante, los donantes de los injertos se pusieron en la cámara de CO dos días antes del trasplante. Los receptores se pusieron en la cámara inmediatamente después del trasplante y se dejaron allí 56 días. La concentración de CO se mantuvo a 250 ppm en todo momento.

Como donantes de injerto aórtico se usaron ratas Brown Norway (RT1) macho adultas (250-350 g) y como receptores se usaron ratas Lewis (RT1) macho adultas (250-350 g) (Charles River Lab. Wilmington, MA). Se adquirieron ratones null C57BL/6, p21^{-/-} y p53^{-/-} macho en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los ratones null MKK3^{(-/-)} se generaron como se ha descrito previamente (Lu et al., EMBO. J. 18: 1845-1857, 1999). Los ratones se dejaron aclimatar durante una semana con pienso de roedores y agua ad libitum.

RT-PCR

Se realizó RT-PCR después del aislamiento del ARN a partir de los corazones trasplantados usando un kit de extracción de ARN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Chatsworth, CA). Los cebadores usados para la \beta-actina de ratón fueron: con sentido (5'-3'), CCTGACCGAGCGTGGCTACAGC (SEC ID Nº: 1); antisentido (3'-5'), AGCCTCCAGGGCATCGGAC (SEC ID Nº: 2); y para la HO-1 de ratón: con sentido (5'-3'), TCCCAGACACCGCTCCTCCAG (SEC ID Nº: 3); antisentido (3'-5'), GATTTGGGGCTGCTGGTTTC (SEC ID Nº: 4).

La actividad enzimática es crítica para reprimir el rechazo vascular agudo

Los corazones de ratón trasplantados en ratas no tratadas experimentaron un rechazo vascular agudo 2-3 días después del trasplante, una observación coherente con los informes previos (Soares et al., Nature Med. 4: 1073, 1998; y Koyamada et al., Transplantation 65: 1210, 1998). Bajo tratamiento con factor de veneno de cobra (CVF) mas ciclosporina A (CsA), los injertos cardiacos de ratón sobrevivieron a largo plazo (véase la Tabla II presentada a continuación), un hallazgo también coherente con los informes previos. Con tratamiento de CVF más CsA, la supervivencia del injerto se asoció con una regulación positiva de la expresión de HO-1 por células endoteliales del injerto y células del músculo liso así como por miocitos cardiacos (Fig. 7). La expresión del ARNm de HO-1 se detectó por RT-PCR 12-24 h después del trasplante y la proteína HO-1 se detectó 24-72 h después del trasplante (Fig. 7). No se produjo supervivencia del injerto a largo plazo cuando se administró el inhibidor de HO SnPPIX al donante y después al receptor, a pesar del tratamiento con CVF más CsA. En estas condiciones, todos los injertos se rechazaron en 3-7 días (Tabla II). El tratamiento de control con FePPIX, una protoporfirina que no inhibe la actividad de la HO, no condujo a un rechazo de los injertos (Tabla II).

TABLA II

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Para generar los datos de la Tabla II, se trasplantaron corazones de ratón en ratas tratadas con CVF más CsA. Los receptores de los injertos se trataron con FePPIX o SnPPIX. El tratamiento con SnPPIX indujo el rechazo del injerto 3-7 días después del trasplante (p < 0,0001 en comparación con las ratas tratadas con CVF más CsA solo o con CVF más CsA más FePPIX). Los análisis estadísticos se realizaron usando el ensayo exacto de Fisher.

Para demostrar que SnPPIX, pero no FePPIX, bloqueaba la función de la HO-1 in vivo, se cuantificó la actividad enzimática de HO total en corazones trasplantados y del receptor 2 días después del trasplante (Fig. 8). Los corazones de ratón vírgenes produjeron 35,5 \pm 4 picomoles de bilirrubina por miligramo de proteína total por hora (pmol/mg/h; Fig. 8). La actividad de la HO aumentó significativamente en corazones de ratón trasplantados en ratas no tratadas (98 \pm 7,21 pmol/mg/h; p = 0,001), tratadas con CVF más CsA (98,3 \pm 7,23 pmol/mg/h) o tratadas con CVF más CsA más FePPIX (77,3 \pm 5,51 pmol/mg/h; p = 0,0009), en comparación con corazones vírgenes (Fig. 8). La actividad de la HO se inhibió a los niveles basales, como los presentes en los corazones vírgenes, en corazones de ratón trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA más SnPPIX (32,37 \pm 7,23 pmol/mg/h). Esto representó una inhibición muy significativa en comparación con los corazones de ratón trasplantados en ratas no tratadas (p = 0,0009), tratadas con CVF más CsA (p = 0,0009) o tratadas con CVF más CsA más FePPIX (p = 0,0018; Fig. 8). La actividad de la HO en los hígados de los receptores también se reguló positivamente después del trasplante de una manera que imitaba a la de los corazones trasplantados (datos no mostrados). Sin embargo, esto no ocurría en el corazón de los propios receptores, en los que la actividad de la HO no estaba regulada positivamente después del trasplante (Fig. 8). En injertos trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX, hubo un infarto de miocardio progresivo, que fue evidente ya a los dos días después del trasplante (datos no mostrados). Esto no se observó en injertos trasplantados en ratas de control tratadas con FePPIX (datos no mostrados).

Previamente se ha demostrado que las ratas que reciben un injerto cardiaco de ratón con tratamiento con CVF más CsA generan Ab anti-ratón que son exclusivamente del isotipo IgM (Koyamada et al., Transplantation 65: 1210, 1998). El tratamiento adicional con SnPPIX o FePPIX no influyó sobre esta respuesta de Ab (Fig. 9). La generación de Ab anti-injerto se correlacionó con la activación del complemento, como se demuestra por la deposición de C3 en células endoteliales de ratón (Fig. 9). Ni el tratamiento con SnPPIX ni el tratamiento con FePPIX influyó sobre la deposición de C3 en células endoteliales de ratón (Fig. 9).

El CO exógeno sustituye completamente la actividad enzimática de la HO-1 para reprimir el rechazo vascular agudo

Todos los corazones de ratón trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX y expuestas a CO (400 ppm; 0,04%) sobrevivieron a largo plazo (véase la Tabla III mostrada a continuación). La dosis de CO usada (400-500 ppm) corresponde a aproximadamente una vigésima parte de la dosis letal (datos no mostrados). Las ratas y ratones expuestos a CO no presentaron reacciones indeseadas. La exposición a CO se interrumpió 14 (n = 3) o 16 (n = 3) días después del trasplante sin influir sobre la supervivencia del injerto, es decir, los injertos continuaron funcionando durante >50 días (Tabla III).

TABLA III

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Para generar los datos de la Tabla III, se trasplantaron corazones de ratón en ratas tratadas con CVF más CsA. Cuando se indica, los receptores de los injertos se trataron con SnPPIX con o sin exposición a CO. El rechazo del injerto observado en ratas tratadas con SnPPIX se reprimió con exposición a CO exógeno (p < 0,0001 en comparación con los receptores tratados con CVF más CsA más SnPPIX). Los análisis estadísticos se realizaron usando un ensayo exacto de Fisher.

Para determinar si el CO exógeno interfería con la inhibición de la actividad enzimática de la HO-1 por SnPPIX, que podía explicar la capacidad del CO de reprimir el rechazo del injerto, se investigó si el CO afectaba a la actividad enzimática de la HO en corazones trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX. Como se muestra en la Fig. 10, éste no fue el caso. La actividad enzimática total de la HO en corazones trasplantados con tratamiento con SnPPIX (32,37 \pm 7,23 pmol/mg/h) no fue significativamente diferente de la de corazones trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX y expuestas a CO (43,6 \pm 7,57 pmol/mg/h; p = 0,1095; Fig. 10). Se obtuvieron resultados similares en los hígados y corazones de los receptores (Fig. 10).

El CO exógeno puede sustituir a la actividad de la HO-1 en la prevención del rechazo de injertos. Esto podría funcionar por un mecanismo que implica la "carga" de CO exógeno por inhalación en los RBC (glóbulos rojos) y después su administración a través de la circulación en el injerto a una concentración adecuada. De acuerdo con esta teoría, cuando la actividad de la HO-1 endógena se está inhibiendo por SnPPIX, el CO exógeno imitaría el efecto del CO endógeno que se produce cuando no se ve afectada la actividad enzimática de la HO-1. La exposición del receptor del trasplante a 400 ppm de CO exógeno aumentó la carboxil hemoglobina del 0,5 \pm 1,5% al 32,1 \pm 6,9% (Fig. 10). El hecho de que los corazones trasplantados sobrevivieran en animales expuestos a CO, incluso bajo estos efectos supresores de SnPPIX, puede indicar que este nivel de CO era suficiente para "cargar" de forma adecuada los RBC, suministrar CO al interior del injerto y reprimir el rechazo del injerto (Fig. 10). Como alternativa, puede suministrarse monóxido de carbono al injerto y a todos los tejidos del cuerpo, disuelto en plasma.

Se investigó si el CO exógeno reprimía el desarrollo del infarto de miocardio que caracteriza al rechazo de injertos en ratas tratadas con SnPPIX. Los injertos se recogieron 3 días después del trasplante y se cuantificaron con respecto al porcentaje de área infartada. Los corazones trasplantados en ratas no tratadas mostraron un infarto transmural casi completo del ventrículo derecho (87,1 \pm 4,9% del área del ventrículo derecho) con un infarto endomiocárdico y transmural extensivo del ventrículo izquierdo (32,0 \pm 6,7% del área del ventrículo izquierdo; datos no mostrados). Los infartos mostraron un miocardio eosinofílico no viable que carecía de núcleos con hemorragia intersticial, edema y neutrófilos. Los infartos del ventrículo izquierdo siempre eran endomiocárdicos con extensión transmural dependiendo del grado del infarto, y los del ventrículo derecho eran de un origen más difuso. El porcentaje de área infartada en los dos ventrículos generalmente aumentó desde el ápice a la base del corazón. Los corazones trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA mostraron únicamente áreas no transmurales pequeñas difusas de infarto en el ventrículo derecho (4,5 \pm 4,9%) pero no en el izquierdo (0,7 \pm 2,1%) (véase la Tabla IV mostrada más adelante). Los corazones trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA más FePPIX mostraron pequeñas áreas difusas de infarto en el ventrículo derecho (12,2 \pm 9,5%) pero no en el izquierdo (0,7 \pm 1,3%) (Tabla IV). Estos corazones fueron indistinguibles de los trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA sin tratamiento con FePPIX (datos no mostrados). Los corazones trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA más SnPPIX mostraron infartos del ventrículo derecho transmurales significativos (26,1 \pm 12,7%) con infartos del ventrículo izquierdo endomiocárdicos y transmurales extensivos (37,6 \pm 15,5%) (Tabla IV) en un patrón que era indistinguible del de los corazones trasplantados en ratas no tratadas (datos no mostrados). Estas lesiones fueron específicas para el corazón trasplantado. Los corazones nativos de los receptores no desarrollaron ningún infarto. El porcentaje de área infartada en los corazones trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX fue significativamente mayor (p < 0,001) en comparación con el de corazones trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA con o sin tratamiento con FePPIX (Tabla IV). Los corazones trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX que recibieron CO exógeno mostraron muy poco infarto del ventrículo derecho (8,4 \pm 5,3%) e izquierdo (1,8 \pm 3,4%) (Tabla IV), con patrones que fueron similares a los de los corazones trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA con o sin tratamiento con FePPIX (datos no mostrados). El porcentaje de área infartada en corazones trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX que recibieron CO exógeno no fue significativamente diferente del de los corazones trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA con o sin el tratamiento con FePPIX. Sin embargo, el porcentaje de área infartada en estos corazones fue significativamente diferente (p < 0,001) del de los corazones trasplantados con el mismo tratamiento pero que no recibieron CO exógeno.

TABLA IV

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Para generar los datos de la Tabla IV, se trasplantaron corazones de ratón en ratas tratadas con CVF más CsA (n = 3 por grupo). Cuando se indica, los receptores del injerto se trataron con FePPIX o SnPPIX y se expusieron a CO. Los resultados se muestran como porcentaje de área infartada. Los análisis estadísticos se realizaron usando un ensayo ANOVA. Un asterisco indica una diferencia significativa en comparación con todos los demás tratamientos.

El CO exógeno reprime la trombosis vascular y la infiltración de monocitos/macrófagos que caracteriza al rechazo vascular agudo

Se trasplantaron corazones de ratón en ratas tratadas con CVF más CsA. Se administró SnPPIX o FePPIX y los receptores del injerto se expusieron a CO (250-400 ppm). Se recogieron injertos 3 días después del trasplante (n = 3 por grupo) y se tiñeron para IgM de rata, Clq del complemento de rata y de ratón, P-selectina de rata y de ratón, fibrina/fibrinógeno de rata y de ratón y leucocitos que expresaban CD45 de rata. Los corazones de ratón trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA con o sin tratamiento con FePPIX mostraron una deposición intravascular extensiva de IgM y Clq de rata (datos no mostrados), pero no mostraron IgG, C3 o C5b-9 detectable (datos no mostrados). Se detectaron HO-2, HO-1 y ferritina en células del músculo liso y endoteliales del injerto así como en miocitos cardiacos (datos no mostrados). Sólo hubo una trombosis vascular mínima o infiltración de leucocitos del hospedador normalmente asociada con áreas focales de infarto (datos no mostrados). Hubo una expresión de P-selectina baja pero detectable en el endotelio vascular (datos no mostrados). Los corazones trasplantados en ratas tratadas con CVF más CsA, con la inhibición de la actividad de la HO-1 por SnPPIX, mostraron niveles similares de deposición intravascular de IgM y Clq en comparación con las ratas tratadas con FePPIX de control y sin niveles detectables de IgG, C3 o C5b-9 (datos no mostrados). Hubo una trombosis vascular extendida de grandes vasos coronarios asociada con agregados plaquetarios que expresaban P-selectina y fibrina intravascular. Se observaron consistentemente trombos en grandes vasos coronarios en la base del corazón. No hubo agregados plaquetarios que expresaran P-selectina detectables en la microvasculatura (datos no mostrados). Hubo una infiltración extensiva en el injerto de neutrófilos del hospedador así como de leucocitos CD45^{++} que expresaban el marcador de monocitos/M\Phi CD68/ED-1 y los Ag del MHC de clase II (datos no mostrados). Los monocitos/M\Phi infiltrantes se encontraron cerca de las arteriolas y dispersos a lo largo de todo el miocardio, asociado con áreas de infarto.

Los corazones trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX que se expusieron a CO fueron esencialmente indistinguibles de los transplantados en ratas tratadas con CVF más CsA con o sin FePPIX (datos no mostrados). Estos corazones mostraron un nivel similar de deposición vascular de IgM y Clq en comparación con los corazones trasplantados en receptores tratados con SnPPIX pero no expuestos a CO (datos no mostrados). Bajo exposición a CO, no hubo signos de trombosis vascular como se reveló por la ausencia de agregados plaquetarios que expresaran niveles detectables de P-selectina o fibrina intravascular. Se detectó P-selectina en el endotelio vascular del injerto. Hubo algún nivel de infiltración de monocitos/M\Phi asociado con pequeñas áreas focales de infarto (datos no
mostrados).

La regulación positiva de HO-1 en células endoteliales inhibe la agregación plaquetaria

Dada la ausencia de agregación plaquetaria en injertos trasplantados en ratas expuestas a CO, se investigó si la expresión de HO-1 en células endoteliales inhibiría la agregación plaquetaria in vitro. Se expusieron células endoteliales de ratón a CoPPIX o SnPPIX para inducir o reprimir la actividad de la HO en estas células, respectivamente. Se superpusieron plaquetas sobre las células endoteliales y se ensayaron con respecto a su capacidad de formar agregados tras la estimulación por ADP (2 \muM). Las plaquetas superpuestas sobre las células endoteliales no tratadas tuvieron una agregación normal cuando se estimularon con ADP (Fig. 11). Cuando las plaquetas se expusieron a células endoteliales pretratadas con SnPPIX, la agregación plaquetaria aumentó en comparación con las plaquetas expuestas a las células endoteliales no tratadas (Fig. 11). Esta observación indica que las células endoteliales no tratadas tienen un nivel basal de actividad de HO supuestamente atribuible a la expresión constitutiva de la HO-2 en estas células (Fig. 11). Cuando las plaquetas se expusieron a células endoteliales pretratadas con CoPPIX, la agregación plaquetaria se inhibió significativamente en comparación con plaquetas expuestas a células endoteliales no tratadas o tratadas con SnPPIX (Fig. 11). Este efecto inhibidor se suprimió cuando las plaquetas se expusieron a células endoteliales tratadas con CoPPIX y SnPPIX (Fig. 11). Tanto CoPPIX como SnPPIX regularon positivamente la expresión de HO-1 en células endoteliales cultivadas (datos no mostrados). Los efectos diferenciales de estas protoporfirinas deberían atribuirse a la capacidad de SnPPIX de actuar como un potente inhibidor de la actividad enzimática de la HO-1.

La HO-1 genera CO que reprime la apoptosis de las células endoteliales

Una de las características principales que caracteriza al rechazo de corazones de ratón trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX es la apoptosis generalizada de las células endoteliales y los miocitos cardiacos (Fig. 12). No se produjo apoptosis en corazones de ratón trasplantados en ratas tratadas con FePPIX (Fig. 12). Dada la capacidad de la HO-1 de reprimir la apoptosis de las células endoteliales in vitro (Soares et al., Nature Med. 4, 1073-1077, 1998; y Brouard et al., J. Exp. Med. 192: 1015, 2000), se investigó si este efecto citoprotector estaba mediado por la generación de CO. No se producía apoptosis en corazones de ratón trasplantados en ratas tratadas con SnPPIX y expuestas a CO, lo que sugería que éste era el caso (Fig. 12). Se investigó in vitro si bajo la inhibición de la actividad de la HO-1 por SnPPIX, el CO exógeno impediría que las células endoteliales experimentaran la apoptosis mediada por TNF-É. Los datos ilustrados en la Fig. 6 sugieren que éste es el caso. La sobreexpresión de HO-1 reprimía la apoptosis de células endoteliales mediada por TNF-\alpha, tal como ocurre en presencia de actinomicina D (Fig. 12). El efecto antiapoptótico de la HO-1 está mediado por su actividad enzimática porque la exposición de las células endoteliales a SnPPIX bloqueaba el efecto antiapoptótico de la HO-1 (Fig. 12). Bajo la inhibición de la actividad de la HO-1 por SnPPIX, el CO exógeno (10.000 ppm) reprimía la apoptosis mediada por TNF-É, lo que sugiere que la HO-1 reprime la apoptosis de las células endoteliales por medio de la generación de CO (Fig. 12).

El monóxido de carbono reprime el desarrollo de la arteriosclerosis asociada con trasplantes

Se trasplantaron aortas Brown Norway en ratas Brown Norway (trasplante singénico), ratas Lewis no tratadas (trasplante alogénico) o ratas Lewis expuestas a monóxido de carbono (250 ppm; alogénico con monóxido de carbono). Se recogieron muestras 56 días después del trasplante y se tiñeron por una técnica de tejido elástico-tricromo de Masson modificada, o por eosina-hematoxilina. Los segmentos aórticos Brown Norway trasplantados en ratas Lewis desarrollaron lesiones arterioscleróticas que son coherentes con las asociadas con un rechazo de injerto crónico (datos no mostrados). Estas lesiones se hicieron evidentes 20-30 días después del trasplante y fueron significativamente más pronunciadas a los 50-60 días (datos no mostrados). Por esta razón, todos los análisis se realizaron 56 días después del trasplante. Estas lesiones se caracterizaron por una hiperplasia de la intima, pérdida de células del músculo liso (SMC) de la media y acumulación de leucocitos en la adventicia, y no se observaron en aortas del receptor del trasplante (datos no mostrados). No se observó ningún signo de estas lesiones cuando se trasplantaron segmentos aórticos de rata en receptores singénicos. Para ensayar si el CO reprimía el desarrollo de estas lesiones, se trasplantaron injertos aórticos en receptores alogénicos que después se expusieron a CO (250 ppm) inmediatamente después del trasplante y durante los 56 días posteriores. La hiperplasia de la íntima se inhibió en injertos aórticos trasplantados en receptores expuestos a CO, en comparación con los trasplantados en receptores expuestos a aire, así como la acumulación de leucocitos en la adventicia (datos no mostrados). El CO no tuvo ningún efecto significativo sobre la pérdida de SMC de la media en comparación con injertos trasplantados en receptores no tratados (datos no mostrados).

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Ejemplo III Protocolos para el Tratamiento de Órganos y Tejidos, un Donante y un Receptor Durante Procedimientos de Trasplante

El siguiente ejemplo ilustra protocolos para usar en el tratamiento de un donante, un órgano y un receptor con monóxido de carbono durante un procedimiento de trasplante. En un procedimiento de trasplante dado puede usarse uno cualquiera o más de los siguientes procedimientos.

Tratamiento de un donante

Antes de recoger un órgano o un tejido, el donante puede tratarse con monóxido de carbono inhalado (250 ppm) durante una hora. El tratamiento puede administrarse a dosis que varían de 10 ppm a 1000 ppm durante periodos de tiempo que varían de una hora a seis horas, o durante el periodo entero desde el momento en el que es posible tratar a un donante por muerte cerebral (cadáver) hasta el momento en el que se extrae el órgano. El tratamiento debe iniciarse tan pronto como sea posible después de la declaración de muerte cerebral. En algunas aplicaciones, puede ser deseable empezar el tratamiento antes de la muerte cerebral.

En el caso de animales no humanos (por ejemplo, cerdos) que se van a usar como donantes de xenotrasplantes, el animal vivo puede tratarse con niveles relativamente elevados de monóxido de carbono inhalado, cuando se desee, siempre que la carboxihemoglobina producida de esta manera no comprometa la viabilidad y función del órgano a trasplantar. Por ejemplo, se podrían usar niveles mayores de 500 ppm (por ejemplo, 1000 ppm o superiores y hasta 10.000 ppm, particularmente durante breves periodos de tiempo).

Tratamiento del órgano in situ

Antes de recoger un órgano de un donante, puede lavarse abundantemente con una solución, por ejemplo un tampón o un medio, sin glóbulos rojos mientas que aún está en el donante. La intención es lavar abundantemente el órgano con una solución saturada con monóxido de carbono y mantenerlo en una atmósfera de monóxido de carbono de forma que el contenido de monóxido de carbono se mantenga en saturación. El lavado abundante puede tener lugar durante un periodo de tiempo de al menos 10 minutos, por ejemplo 1 hora, varias horas o más. La solución idealmente debería proporcionar la máxima concentración de monóxido de carbono posible a las células del órgano.

Tratamiento de un órgano o tejido

El órgano o tejido puede conservarse en un medio que incluye monóxido de carbono desde el momento en el que se extrae del donante hasta el momento en el que se trasplanta en el receptor. Esto puede hacerse manteniendo el órgano o el tejido en el medio que comprende CO, o perfundiéndolo con dicho medio. Como esto ocurre ex vivo en lugar de en un animal, pueden usarse concentraciones muy elevadas de gas CO (por ejemplo, 10.000 ppm para mantener el medio saturado con CO).

Tratamiento de un receptor

El receptor puede tratarse con monóxido de carbono. El tratamiento puede empezar el día del trasplante al menos 30 minutos antes de que empiece la cirugía. Como alternativa, podría empezar al menos 30 minutos antes de la reperfusión del órgano en el receptor. Puede continuarse durante al menos 30 minutos, por ejemplo 1 hora. Pueden administrarse dosis de monóxido de carbono entre 10 ppm y 3000 ppm durante tiempos variables, por ejemplo minutos u horas, y pueden administrarse el día y los días siguientes al trasplante. Por ejemplo, un receptor puede inhalar una concentración de monóxido de carbono, por ejemplo 3000 ppm, durante tres respiraciones consecutivas de 10 segundos. Como alternativa, el receptor puede inhalar, por ejemplo, 200 ppm durante un periodo prolongado, tal como 20 días. Las concentraciones de carboxihemoglobina pueden utilizarse como guía para una administración apropiada de monóxido de carbono a un paciente. Normalmente, los tratamientos de receptores no deben elevar los niveles de carboxihemoglobina por encima de los que se considera que proporcionan un riesgo aceptable para un paciente que necesita un trasplante.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción

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Claims (6)

1. Uso de monóxido de carbono para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del rechazo crónico en un paciente que está experimentando o está a punto de experimentar un rechazo crónico a un órgano o tejido trasplantado.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la composición farmacéutica está en forma gaseosa.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, donde el monóxido de carbono está presente en la composición gaseosa en una cantidad de 0,001 ppm a 3000 ppm.

4. Monóxido de carbono para usar en el tratamiento del rechazo crónico en un paciente que está experimentando o está a punto de experimentar un rechazo crónico a un órgano o tejido trasplantado.

5. Monóxido de carbono para usar de acuerdo con la reivindicación 4, donde el monóxido de carbono se usa en forma de una composición gaseosa.

6. Monóxido de carbono para uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde el monóxido de carbono está presente en la composición gaseosa en una cantidad de 0,001 ppm a 3000 ppm.