ES2317698T3 - Metodo para produccion de plantas tolerantes al estres. - Google Patents

Abstract

Un método para producir una planta tolerante al estrés, comprendiendo dicho método introducir un gen quimérico en células de dicha planta para obtener células de plantas transgénicas, en donde dicho gen quimérico comprende las regiones de DNA siguientes enlazadas operativamente: (a) un promotor expresable en plantas; (b) una región de DNA, que cuando se transcribe produce una molécula de RNA, siendo dicha molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, en donde dicha molécula de RNA comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos que tiene 75 a 100% de identidad de secuencia con una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa o el complemento del mismo; y (c) una región de DNA implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación; y regenerar una planta a partir de dichas células de plantas transgénicas.

Description

Método para producción de plantas tolerantes al estrés.

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de proteínas poli(ADP-ribosa)-polimerasa (PARP), particularmente proteínas PARP mutantes o partes de las mismas, y genes que codifican las mismas, para producir células de plantas y plantas, con muerte celular programada modificada. Se proporcionan células de plantas y plantas en las cuales la PCD de las células o de al menos parte de las células en un organismo está inhibida, por modulación del nivel o actividad de las proteínas PARP en dichas células. La invención se refiere también a células de plantas y plantas que expresan tales genes.

Descripción de la técnica afín

La muerte celular programada (PCD) es un proceso fisiológico de muerte celular implicado en la eliminación de células seleccionadas tanto en animales como en plantas durante procesos del desarrollo o en respuesta a indicaciones ambientales (para una revisión véase Ellis et al. 1991; Pennell y Lamb, 1997). El desensamblaje de las células que sufren PCD está acompañado morfológicamente por condensación, contracción y fragmentación del citoplasma y el núcleo, a menudo en paquetes pequeños sellados (Cohen 1993, Wang et al. 1996). Bioquímicamente, la PCD se caracteriza por fragmentación del DNA nuclear en fragmentos que tienen por regla general aproximadamente 50 kb, que representan oligonucleosomas, así como la inducción de cisteína-proteinasas y endonucleasas. La fragmentación del DNA puede detectarse por marcación del extremo de la muesca dUTP mediada por desoxinucleotidil-transferasa (TUNEL) de grupos 3'-OH del DNA en secciones de células. (Gavrieli et al. 1992). La muerte celular por PCD es claramente distinta de la muerte celular por necrosis, implicando la última hinchamiento de la célula, lisis y fuga del contenido celular.

En los animales, la PCD está implicada en la eliminación o muerte de células indeseables tales como las células de la cola del renacuajo en la metamorfosis, las células entre los dedos en desarrollo en los vertebrados, neuronas de vertebrados producidas en exceso, células durante la especialización celular tales como queratocitos, etc. Las células deterioradas, que ya no son capaces de funcionar adecuadamente, pueden ser eliminadas también por PCD, impidiendo que las mismas se multipliquen y/o se propaguen. La PCD, o la falta de la misma, ha sido implicada también en cierto número de condiciones patológicas en humanos (AIDS, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Lou Gehring, cánceres).

En las plantas, se ha demostrado o se cree que la PCD está implicada en cierto número de procesos del desarrollo tales como p.ej., la eliminación de las células suspensoras durante el desarrollo de un embrión, la eliminación de células de aleurona después de la germinación de las semillas de monocotiledóneas; la eliminación de las células de la cofia de la raíz después de la germinación de la semilla y el crecimiento de la plántula; la muerte celular durante la especialización de las células como se observa en el desarrollo del elemento traqueal de xilema o tricomas, o el aborto de órganos florales en las flores unisexuales. Asimismo, la formación de aeroquima en las raíces en condiciones hipóxicas y la formación de lóbulos o perforaciones de hojas en algunas plantas parecen implicar PCD. La muerte celular en gran escala en las plantas ocurre durante la senescencia de las hojas u otros órganos. La respuesta hipersensible en las plantas, o dicho de otro modo la muerte celular rápida que ocurre en el sitio de entrada de un patógeno avirulento que conduce a una lesión restringida, es otro ejemplo de PCD en respuesta a un estímulo ambiental.

Células de animales o plantas moribundas en cultivos de suspensión, particularmente en cultivos de suspensión con baja densidad de células, demuestran también las características de la PCD.

Una enzima que ha sido implicada por su intervención en la PCD o la apoptosis es la poli(ADP-ribosa)-polimerasa. La poli(ADP-ribosa)-polimerasa (PARP), conocida también como poli(ADP-ribosa)-transferasa (ADPRT) (EC 2.4.2.30), es una enzima nuclear encontrada en la mayoría de los eucariotas, con inclusión de vertebrados, artrópodos, moluscos, mohos del fango, dinoflagelados, hongos y otros eucariotas inferiores, con la excepción de las levaduras. La actividad enzimática se ha demostrado también en cierto número de plantas (Payne et al., 1976; Willmitzer y Wagner, 1982, Chen et al., 1994; O'Farrell, 1995).

PARP cataliza la transferencia de un resto de ADP-ribosa derivado de NAD^{+}, principalmente al grupo carboxilo de un resto de ácido glutámico en la proteína diana, y polimerización subsiguiente de la ADP-ribosa. La proteína diana principal es PARP propiamente dicha, pero se ha demostrado que están sujetas también a esta modificación histonas, proteínas cromosómicas del grupo de movilidad alta, una topoisomerasa, endonucleasas y DNA-polimerasas.

La proteína PARP de los animales es una proteína nuclear de 113-120 kDa, abundante en la mayoría de los tipos de células, que está constituida por tres dominios funcionales principales: un dominio de fijación de DNA amino-terminal que contiene dos dominios de dedos de Zn, un dominio catalítico carboxi-terminal, y un dominio interno que está automodificado (De Murcia y Ménissier, 1994; Kameshita et al., 1984; Lindahl et al., 1995). La actividad enzimática in vitro se incrementa notablemente después de fijación a rupturas de una sola cadena en el DNA. La actividad in vivo se induce por condiciones que dan eventualmente como resultado rupturas del DNA (Álvarez-González y Althaus, 1989; Ikejima et al., 1990). La automodificación del dominio central sirve aparentemente como regulación negativa de la alimentación de PARP.

La actividad de PARP en las células de las plantas se demostró por primera vez examinando la incorporación de ^{3}H a partir de NAD^{+} marcada en los núcleos de las células del ápice de la raíz (Payne et al., 1976; Willmitzer y Wagner, 1982). La actividad enzimática se purificó también parcialmente a partir de plántulas de maíz y se encontró que está asociada con una proteína de una masa molecular aparente de 113 kDa, lo que sugiere que la PARP de la planta podría ser similar a la enzima de los animales (Chen et al., 1994; O'Farrell, 1995).

cDNAs correspondientes a proteínas PARP han sido aislados de varias especies que incluyen mamíferos, pollos, Xenopus, insectos y Caenorhabditis elegans.

Chen et al. (1994) han consignado actividad de PARP en núcleos de maíz y han asociado esta actividad enzimática con la presencia de una proteína de aproximadamente 114 kDa presente en un extracto de núcleos de maíz. O'Farrell (1995) consignó que la amplificación por RT-PCR de RNA aislado de maíz (utilizando iniciadores degenerados basados en las secuencias más altamente conservadas) daba como resultado un fragmento de 300 pb que exhibía 60% de identidad al nivel de aminoácidos con la proteína PARP humana. Lepiniec et al. (1995) han aislado y clonado un cDNA de longitud total de Arabidopsis thaliana que codifica una proteína de 72 kDa que tiene alta semejanza con el dominio catalítico de la PARP de los vertebrados. El dominio N-terminal de la proteína no revela semejanza alguna de secuencia con el dominio correspondiente de la PARP de los vertebrados, pero se compone de 4 tramos de aminoácidos (designados A1, A2, B y C) que muestran semejanza con el término N de cierto número de proteínas nucleares y de fijación del DNA. La estructura secundaria predicha de A1 y A2 era una estructura hélice-bucle-
hélice.

La base de datos Genbank contiene las secuencias de dos cDNAs de Zea mays para las cuales la secuencia de aminoácidos de los productos de traducción tiene homología o bien con las proteínas PARP convencionales (AJ222589) o con las proteínas PARP no convencionales, como se identifica en Arabidopsis (AJ222588).

La o las funciones de PARP y la ribosilación poli-ADP en células eucariotas no está(n) totalmente claras. PARP está implicada o se cree que está implicada directa o indirectamente en cierto número de procesos celulares tales como reparación, replicación y recombinación del DNA, en la división celular y la diferenciación de las células o en los caminos de señalización que detectan alteraciones en La integridad del genoma. Dado que la actividad de PARP puede reducir significativamente la agrupación celular de NAD^{+}, se ha sugerido también que la enzima puede jugar un papel crítico en la muerte celular programada (Heller et al., 1995; Zhang et al., 1994). Adicionalmente, se ha sugerido que la nicotinamida resultante de la hidrólisis de NAD^{+} o los productos del cambio de poli-ADP-ribosa por poli-ADP-ribosa-glicohidrolasa pueden ser señales de respuesta al estrés en los eucariotas.

La información disponible actualmente sobre la función biológica de la PARP en las plantas se ha obtenido por experimentos que implican inhibidores de PARP que sugieren un papel in vivo en la prevención de la recombinación homóloga en sitios de deterioro del DNA como las tasas de recombinación intracromosómica homóloga en el tabaco y está aumentando después de la aplicación de 3-aminobenzamida (3ABA) (Puchta, et al., 1995). Adicionalmente, se ha demostrado que la aplicación de inhibidores de PARP, tales como 3ABA, nicotinamida, y 6(5H)-fenastridinona, a las células de Zinnia o de Helianthus tuberosum en diferenciación impide el desarrollo de elementos traqueales (Hawkins y Phillips, 1983; Phillips y Hawking, 1985; Shoji et al., 1997; Sugiyama et al., 1995), lo que se considera es un ejemplo de muerte celular programada en las plantas.

La solicitud PCT WO97/06267 describe el uso de inhibidores de la PARP que mejoran la transformación (cualitativa o cuantitativamente) de células eucariotas, particularmente células de plantas.

Lazebnik et al. (1994) identificaron una proteasa con propiedades similares a la enzima convertidora de la interleuquina 1-B capaz de escindir PARP, lo cual es un suceso inicial en la apoptosis de las células animales.

Kuepper et al. (1990) y Molinette et al. (1993) han descrito la superproducción del dominio de fijación de DNA de la PARP humana de 46 kDa y diversas formas mutantes del mismo, en células de mono CV-1 transfectadas o fibroblastos humanos y han demostrado la inhibición trans-dominante de la actividad de PARP residente y el bloqueo consiguiente de la reparación del DNA con escisión de bases en estas células.

Ding et al. (1992), y Smulson et al. (1995) han descrito el empobrecimiento de PARP por expresión de RNA antisentido en células de mamífero y han observado un retardo en la reunión de las rupturas de cadena del DNA, así como la inhibición de la diferenciación de los preadipocitos 3T3-L1.

Ménissier de Murcia et al., (1997) y Wang et al. (1995, 1997) han generado ratones transgénicos "silenciados" mutados en el gen PARP, lo que indica que PARP no es una proteína esencial. Las células de los ratones deficientes en PARP son, sin embargo, más sensibles al deterioro del DNA y difieren de las células normales de los animales en algunos aspectos de muerte celular inducida (Heller et al., 1995).

Amor et al. (1998), FEBS Letters 550:1-7) describe la implicación de la poli(ADP-ribosa)-polimerasa en la respuesta al estrés por oxidación en las plantas.

Sumario y objetos de la invención

La invención proporciona un método para producir una planta tolerante al estrés, preferiblemente una planta tolerante al estrés por frío, estrés por sequía o estrés por calor, que comprende los pasos de introducir un gen quimérico en células de dicha planta para obtener células de plantas transgénicas y regenerar una planta a partir de las células de plantas transgénicas, en donde el gen quimérico comprende las regiones del DNA siguientes enlazadas operativamente:

(a)

un promotor expresable en plantas;

(b)

una región de DNA, que cuando se transcribe produce una molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos que tiene 75 a 100% de identidad de secuencia con una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa o el complemento del mismo; y

(c)

una región de DNA implicada en la terminación de la transcripción y poliadenilación.

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La región de DNA del gen quimérico que, cuando se transcribe, produce una molécula de DNA capaz de reducir la expresión de los genes endógenos codificantes de poli-(ADP-ribosa)-polimerasa puede proporcionar una molécula de RNA que comprende

i)

una secuencia de nucleótidos de sentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa de dicha planta; y

ii)

una secuencia de nucleótidos antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de dicho gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa de dicha planta;

en donde la secuencia de nucleótidos de sentido y la secuencia de nucleótidos antisentido son capaces de combinarse en una región de RNA bicatenario.

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La invención proporciona también plantas transgénicas, tales como maíz, colza oleaginosa, lino, trigo, césped, alfalfa, leguminosas, hortalizas de coles, tomate, lechuga, algodón, arroz, cebada, patata, tabaco, remolacha azucarera, girasol, clavellina, rosa, crisantemo o tulipán que exhiben tolerancia incrementada al estrés cuando se comparan con una planta de control, donde la planta transgénica comprende en sus células un gen quimérico que comprende las regiones de DNA siguientes, enlazadas operativamente:

a)

un promotor expresable en plantas;

b)

una región de DNA que, cuando se transcribe, produce una molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa en los cuales la molécula de RNA comprende

i)

una secuencia de nucleótidos de sentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa; y

ii)

una secuencia de nucleótidos antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, en donde la secuencia de nucleótidos de sentido y antisentido son capaces de combinarse en una región de RNA bicatenario; y

c)

una región de DNA implicada en la terminación de la transcripción y poliadenilación.

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La invención se refiere adicionalmente al uso de una secuencia de nucleótidos de un gen vegetal codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa o el complemento del mismo para producir una planta tolerante al estrés, por introducción de dicha secuencia de nucleótidos en células de dicha planta, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos o su complemento comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos que tiene 75% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos de un gen PARP endógeno de dicha planta y es capaz de reducir la expresión de los genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Las secuencias de aminoácidos N-terminales deducidas de poli(ADP-ribosa)-polimerasa de plantas.

Alineación de las secuencias aguas arriba del dominio de fijación de NAD^{+} encontrado en Arabidopsis thaliana APP (A. Th. APP; número de acceso a EMBL Z48243; SEQ ID No 6) y el homólogo de maíz NAP (Z. m. NAP; número de acceso a EMBL AJ221588; SEQ ID No 4). La división de dominios que se muestra es como se ha propuesto previamente (Lepiniec et al., 1995). La señal de localización nuclear (NLS) localizada en el dominio B se indica por el corchete. La secuencia del dominio B no está muy bien conservada entre las plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. El dominio C es probablemente comparable en función al dominio de automodificación de la PARP de los animales. Las repeticiones imperfectas, A1 y A2 están presentes también en NAP de maíz. Para ilustrar la simetría doble e imperfecta internamente dentro de la secuencia de repetición, las propiedades de los residuos de aminoácidos se resaltan bajo las secuencias como sigue: círculos llenos, residuo hidrófobo; círculo vacío, glicina; (+), residuo cargado positivamente; (-), residuo cargado negativamente; o línea ondulada, cualquier residuo. El eje de simetría está indicado por la punta de flecha vertical y las líneas con punta de flecha marcan las regiones con la repetición invertida de las propiedades de las cadenas laterales de aminoácidos.

(B) Alineación de los dominios de fijación de DNA y autocatalíticos de PARP de ratón y ZAP de maíz. Los dedos de Zn que contienen ZAP1 y ZAP2 de maíz (cDNA parcial encontrado por el análisis PCR 5'RACE) se indican como Z.m. ZAP (número de acceso a EMBL AJ222589; SEQ ID No 2) y Z.m. ZAP (variedad) (SEQ ID No 11 desde el aminoácido de la posición 1 al aminoácido de la posición 98), respectivamente, y la PARP de ratón, M.m. ADPRT (número de acceso a Swissprot P11103). Los dedos de Zn y la NLS bipartita de la enzima de ratón se indican por corchetes, el sitio de escisión de la caspasa 3 por el asterisco, y la NLS supuesta en la proteína ZAP por el corchete en negrilla bajo la secuencia de maíz. Los residuos de aminoácidos que están conservados en todas las secuencias están recuadrados; los residuos de aminoácidos con propiedades físico-químicas similares están sombreados con la secuencia superior como referencia.

Figura 2. Comparación del dominio de fijación NAD+ de las proteínas PARP de ratón y PARP de plantas. El intervalo de la "firma PARP" se indica sobre las secuencias. Los nombres y la alineación de las secuencias son como en la Figura 1.

Figura 3. Estimación del número de copias del gen y tamaño del transcrito para los genes nap y zap .

(A) y (B) DNA genómico de maíz de la variedad LG2080 digerido con las endonucleasas de restricción indicadas, resuelto por electroforesis en gel de agarosa, transferido e hibridado con sondas de DNA marcadas radiactivamente preparadas a partir de los dominios 5' del cDNA de nap y zap, que no codifican el dominio de fijación de NAD^{+}. El patrón de hibridación obtenido con la sonda nap (A) es simple e indica un solo gen nap en el genoma del maíz. Como puede verse por el patrón de hibridación (B), deberían existir al menos dos genes zap. Para determinar el tamaño de los transcritos codificados por los genes zap y nap, se resolvió aproximadamente 1 \mug de RNA poli(A)^{+} extraído de raíces (pista 1) y brotes (pista 2) de plantas de semillero de 6 días de edad, en un gel de agarosa después de desnaturalización con glioxal, se transfirió, y se hibridó con cDNA de NAP(C) y ZAP(D) marcado con ^{32}P. Se utilizaron fragmentos de \lambdaDNA BstEII marcados en el extremo 5' con ^{33}P como marcadores de peso molecular en ambos experimentos de transferencia en gel de DNA y RNA; sus posiciones se indican en kb a la izquierda de cada
panel.

Figura 4. Análisis de la expresión de APP en levadura.

(A) Vista esquemática de la casete de expresión en pV8SPA. La expresión del cDNA de app viene dada por un promotor de levadura quimérico, que está constituido por la región promotora mínima que contiene el recuadro TATA del gen cyc1 (CYC1) y una región promotora de activación aguas arriba del gen gal10 (GAL10), proporcionando el último activación del promotor por galactosa. Las secuencias reguladoras aguas abajo se derivan del gen que codifica la fosfoglicerol-quinasa (3PGK) (Kuge y Jones, 1994). La región codificante de app se representa con una división en dominios supuestos como se ha propuesto anteriormente (Lepiniec et al., 1995): A1 y A2 corresponden a repeticiones imperfectas de 27 amino-ácidos, entre los cuales existe una secuencia (dominio B) rica en aminoácidos cargados positivamente y que se asemeja a los dominios de fijación de DNA de cierto número de proteínas de fijación de DNA La secuencia de fijación de aminoácidos del dominio B se muestra bajo el mapa, y el tramo de residuos arginina y lisina, que pueden funcionar como una NLS, se representa en negrita. Los residuos metionina (M^{1}, M^{72}), que pueden funcionar como codones de iniciación de la traducción, se indican sobre el mapa. El dominio C es rico en residuos de ácido glutámico, asemejándose en su composición, pero no en su secuencia, al dominio de automodificación de PARP de los animales.

(B) Análisis por inmunotransferencia (transferencia Western) y por transferencia Northern de las variedades DY(pYeDP1/8-2) y DY(pV8SPA), indicadas como (vector) y (app), respectivamente. Las cepas se dejaron crecer en medio SDC suplementado con glucosa (GLU), galactosa (GAL), galactosa y 3 mM de 3ABA (GAL+3ABA), o galactosa y nicotinamida 5 mM (GAL+NIC). El RNA total o la proteína total se extrajeron de los mismos cultivos. Se fraccionaron 10 microgramos de proteína total por electroforesis en SDS-PAGE al 10%, se sometieron a electrotransferencia, y se sondaron con antisueros anti-APP. Se resolvieron 5 microgramos de RNA total por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%, se transfirieron a membranas de nailon, y se hibridaron con fragmentos de DNA marcados con ^{32}P derivados del cDNA de app. Las posiciones de las bandas marcadoras de peso molecular se indican a la izquierda en kilobases (kb) y kilodaltons (kDa).

Figura 5. Actividad de poli(ADP-ribosa)-polimerasa de la proteína APP.

(A) Los extractos de proteínas totales se prepararon a partir de DY(pYeDP1/8-2) cultivado en SDC con 2% de galactosa (vector GAL) y DY(pV8SPA) cultivado en SDC con 2% de glucosa (app GLU), en SDC con 2% de galactosa (app GAL), o en SDC con 2% de galactosa y 3ABA 3 mM (app GAL+3ABA). Para detectar la síntesis de la poli(ADP-ribosa) en estos extractos, se incubaron muestras con ^{32}P-NAD^{+} durante 40 min a la temperatura ambiente. Se efectuaron dos reacciones de control: se incubaron 100 ng de la PARP humana purificada en un tampón de reacción solo (PARP) (pista 5), o con extracto de proteína producido a partir de cultivo DI(pYeDP1/8-2) desarrollado en glucosa (vector GLU+PARP) (pista 6). Se muestra la autorradiografía obtenida después de la exposición del gel seco a película Kodak X-Omat. ORi corresponde al comienzo del gel de secuenciación.

(B) Estimulación de la síntesis de poli(ADP-ribosa) por DNA en extractos de proteínas de DI(pV8SPA). Se indican las cantidades de DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos añadidas a los extractos de levadura empobrecidos en ácido nucleico en \mug/ml^{-1}. La síntesis de la poli(ADP-ribosa) está bloqueada por 3ABA, que se añadió en una de las reacciones a una concentración de 3 mM (pista 5). Para asegurar la recuperación máxima de la poli(ADP-ribosa), se incluyeron 20 \mug de glucógeno como vehículo durante los pasos de precipitación; esto, como puede verse, dio como resultado sin embargo un arrastre importante del marcador no incorporado.

Figura 6. Representación esquemática de los vectores T-DNA que comprenden los genes quiméricos moduladores de la PCD de la invención. P35S: promotor CaMV35S; L: conductor cab22; ZAP: región codificante de un gen PARP de la clase ZAP; 5'ZAP: parte N-terminal de la región codificante de un gen PARP de la clase ZAP en orientación invertida; 3' 35S: señal de terminación de la transcripción del extremo 3' de CaMV35S y señal de poliadenilación; pACT2: región promotora del gen actina; pNOS: promotor del gen nopalina-sintasa; gal: gentamicina-acetil-transferasa; bar: fosfinotricina-acetil-transferasa; 3'NOS: señal de terminación de la transcripción del extremo 3' y señal de poliadenilación del gen de nopalina-sintasa; APP: región codificante de un gen PARP de la clase NAP; 5'APP: parte N-terminal de la región codificante de un gen PARP de la clase NAP en orientación invertida; LB: borde izquierdo del T-DNA; RB: borde derecho del T-DNA; pTA29: promotor específico de tapete; pNTP303: promotor específico de polen.

Descripción detallada

Para el propósito de la invención, el término "promotor expresable en plantas" significa un promotor que es capaz de dirigir la transcripción en una célula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero también cualquier promotor de origen no vegetal que sea capaz de dirigir la transcripción en una célula vegetal, v.g., ciertos promotores de origen viral o bacteriano tales como los promotores CAMV35S o los promotores del gen T-DNA.

El término "expresión de un gen" hace referencia al proceso en el cual una región de DNA bajo control de regiones reguladoras, particularmente el promotor, se transcribe en un RNA que es biológicamente activo, es decir, que o bien es capaz de interacción con otro ácido nucleico o proteína o que es capaz de ser traducido en un polipéptido o proteína biológicamente activo. Se dice que un gen codifica un RNA cuando el producto final de la expresión del gen es RNA biológicamente activo, tal como v.g. un RNA antisentido o una ribozima. Se dice que un gen codifica una proteína cuando el producto final de la expresión del gen es una proteína o polipéptido biológicamente activo.

El término "gen" significa cualquier fragmento de DNA que comprende una región de DNA (la "región de DNA transcrita") que se transcribe en una molécula de RNA (v.g., un mRNA) en una célula bajo control de regiones reguladoras adecuadas, v.g., un promotor expresable en plantas. Un gen puede comprender por tanto varios fragmentos de DNA enlazados operativamente tales como un promotor, una secuencia conductora 5', una región codificante, y una región 3' que comprende un sitio de poliadenilación. Un gen vegetal endógeno es un gen que se encuentra naturalmente en una especie vegetal. Un gen quimérico es cualquier gen que no se encuentra normalmente en una especie de planta o, alternativamente, cualquier gen en el cual el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o la totalidad de la región de DNA transcrita o con al menos otra región reguladora del gen.

Como se utiliza en esta memoria, "que comprende" debe interpretarse como especificación de la presencia de las características, entidades completas, pasos o componentes a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, entidades completas, pasos o componentes, o grupos de los mismos. Así pues, v.g., un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los citados realmente, es decir, puede estar incluido en un ácido nucleico o proteína mayor. Un gen quimérico que comprende una región de DNA que se define funcional o estructuralmente, puede comprender regiones de DNA adicionales, etc.

Los autores de la invención encontraron que células eucariotas, particularmente células vegetales, muy particularmente células de Zea mays contienen simultáneamente al menos dos isoformas (clases) funcionales de proteínas PARP principales que difieren en tamaño y secuencia de aminoácidos, pero que son capaces ambas de fijar DNA, particularmente DNA con roturas de una sola cadena, y tienen ambas actividad de ribosilación de poli-ADP. Los autores de la invención han comprobado también que la muerte celular programada en eucariotas, particularmente en plantas, puede modularse por alteración del nivel de expresión de los genes PARP o por alteración de la actividad de las proteínas codificadas genéticamente, y que con objeto de alcanzar este objetivo, la expresión de ambos genes precisa estar alterada o, como alternativa, ambas clases de proteínas precisan estar alteradas en su actividad.

Está claro que el fallo de la técnica en demostrar que las células eucariotas, particularmente células vegetales, comprenden dos isoformas funcionales de proteínas PARP, codificadas por clases de genes diferentes, ha impedido la modulación eficiente de la actividad de PARP en dichas células por métodos de DNA recombinante. Diversas realizaciones de los métodos y medios se representan por la descripción, los Ejemplos y las reivindicaciones.

Se describen métodos para la inhibición de la muerte celular programada o apoptosis en células vegetales, por alteración del nivel de expresión de genes PARP, o por alteración de la actividad o actividad aparente de proteínas PARP en dicha célula vegetal. Convenientemente, el nivel de expresión de los genes PARP o la actividad de las proteínas PARP está controlado genéticamente por introducción de genes quiméricos moduladores de la PCD que alteran la expresión de los genes PARP y/o por introducción de genes quiméricos moduladores de la PCD que alteran la actividad aparente de las proteínas PARP y/o por alteración de los genes codificantes de PARP endógenos.

"PCD inhibida" con relación a células específicas debe entenderse como el proceso por el cual una fracción mayor de dichas células o grupos de células, que podrían sufrir normalmente muerte celular programada (sin intervención de los métodos de esta invención) en condiciones particulares, se mantienen vivas en estas condiciones.

La expresión de los genes quiméricos moduladores de la PCD introducidos o de los genes endógenos modificados influirá por tanto en el nivel funcional de la proteína PARP, e interferirá indirectamente con la muerte celular programada. Una disminución moderada en el nivel funcional de las proteínas PARP conduce a una inhibición de la muerte celular programada, particularmente para la prevención de la muerte celular programada, mientras que una disminución severa en el nivel funcional de las proteínas PARP conduce a la inducción de la muerte celular programada.

Con objeto de inhibir o prevenir la muerte celular programada en una célula eucariota, particularmente en una célula vegetal, el nivel combinado de ambas proteínas PARP y/o su actividad o actividad aparente se reduce significativamente, evitando sin embargo que la reparación del DNA (dirigida directa o indirectamente por PARP) se inhiba de tal manera que las células en las cuales la función de las proteínas PARP se inhibe no puedan recuperarse del deterioro del DNA, o no puedan mantener su integridad genómica. Preferiblemente, el nivel y/o la actividad de las proteínas PARP en las células diana, deberían reducirse al menos 75%, con preferencia aproximadamente 80%, y en particular aproximadamente 90% del nivel y/o actividad normales en las células diana de tal modo que aproximadamente 25%, con preferencia aproximadamente 20%, en particular aproximadamente 10% del nivel y/o actividad normales de PARP se retenga en las células diana. Adicionalmente, se cree que la disminución en el nivel y/o actividad de las proteínas PARP no debería exceder del 95%, no debiendo exceder con preferencia del 90% de la actividad y/o nivel normales en las células diana. Los métodos para determinar el contenido de una proteína específica tal como las proteínas PARP son bien conocidos por las personas expertas en la técnica e incluyen, pero sin carácter limitante, cuantificación (histoquímica) de tales proteínas utilizando anticuerpos específicos. Los métodos para cuantificar la actividad de PARP están disponibles también en la técnica e incluyen el ensayo TUNEL citado anteriormente (in vivo) o el ensayo in vitro descrito por Collinge y Althaus (1994) para la síntesis de poli(ADP-ribosa) (véanse los Ejemplos).

Con objeto de desencadenar la muerte celular programada en una célula eucariota, particularmente en una célula vegetal, el nivel combinado de ambas proteínas PARP y/o su actividad o actividad aparente se reduce sustancialmente, reduciéndose preferiblemente casi por completo de tal modo que la reparación del DNA y el mantenimiento de la integridad genómica no sean ya posibles. Preferiblemente, el nivel y/o actividad combinados de las proteínas PARP en las células diana, debería reducirse al menos aproximadamente en un 90%, con preferencia aproximadamente un 95%, de un modo más preferiblemente aproximadamente 99% del nivel y/o actividad normales en las células diana; en particular la actividad de PARP debería inhibirse completamente. Particularmente, se prefiere que los niveles funcionales de ambas clases de proteínas PARP por separado se reduzcan a los niveles mencionados.

Para el propósito de la invención, las proteínas PARP se definen como proteínas que tienen actividad de poli(ADP-ribosa)polimerasa, comprendiendo preferiblemente la denominada "firma PARP". La firma PARP es una secuencia de aminoácidos que está altamente conservada entre las proteínas PARP, definidas por de Murcia y Menussier de Murcia (1994) por la extensión desde el aminoácido de la posición 858 al aminoácido de la posición 906 de la proteína PARP de Mus musculus. Este dominio corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 817 a 865 de la proteína PARP convencional de Zea mays (ZAP1; SEQ ID No 2) o a la secuencia de aminoácidos desde la posición 827 a 875 de la proteína PARP convencional de Zea mays (ZAP2; SEQ ID No: 11) o a la secuencia de aminoácidos desde la posición 500 a la 547 de la proteína PARP no convencional de Zea mays (SEQ ID No 4) o a la secuencia de aminoácidos desde la posición 485 a la 532 de la proteína PARP no convencional de Arabidopsis thaliana (SEQ ID No 6). Esta secuencia de aminoácidos está altamente conservada entre las diferentes proteínas PARP (teniendo aproximadamente 90% a 100% de identidad de secuencia). Está particularmente conservada la lisina en la posición 891 (que corresponde a la posición 850 de SEQ ID No 2, la posición 861 de SEQ ID No 11, la posición 532 de SEQ ID No 4 y la posición 517 de SEQ ID No 6) de la proteína PARP de Mus musculus, que se considera está implicada en la actividad catalítica de las proteínas PARP. Particularmente, los aminoácidos de las posiciones 865, 866, 893, 898 y 899 de la proteína PARP de Mus musculus o de las posiciones correspondientes para las otras secuencias son variables. Las proteínas PARP pueden comprender adicionalmente un dominio de fijación de DNA N-terminal y/o una señal de localización nuclear (NLS).

Actualmente, se han descrito dos clases de proteínas PARP. La primera clase, como se define en esta memoria, comprende las denominadas proteínas PARP clásicas que contienen dedos de Zn (ZAP). Estas proteínas tienen tamaños comprendidos entre 113 y 120 kDA y se caracterizan adicionalmente por la presencia de al menos uno, preferiblemente dos dominios de dedos de Zn localizados en el dominio N-terminal de la proteína, localizados en particular dentro de los aproximadamente 355 a aproximadamente 375 primeros aminoácidos de la proteína. Los dedos de Zn se definen como secuencias peptídicas que tienen la secuencia CxxCx_{n}HxxC (donde n puede variar desde 16 a 30) capaz de complejar un átomo de Zn. Ejemplos de secuencias de aminoácidos para proteínas PARP de la clase ZAP incluyen las secuencias que pueden encontrarse en la base de datos de proteínas PIR con número de acceso P18493 (Bos taurus), P26466 (Gallus gallus), P35875 (Drosophila melanogaster), P09874 (Homo sapiens), P11103 (Mus musculus), Q08824 (Oncorynchus masou), P27008 (Rattus norvegicus), Q11208 (Sarcophaga peregrina), P31669 (Xenopus laevis), y las secuencias actualmente identificadas de la proteína ZAP1 y ZAP2 de Zea mays (SEQ ID No 2/SEQ ID No 11).

La secuencia de nucleótidos de los cDNAs correspondientes puede encontrarse en la base de datos EMBL bajo los números de acceso D90073 (Bos taurus), X52690 (Gallus gallus), D13806 (Drosophila melanogaster), M32721 (Homo sapiens), X14406 (Mus musculus), D13809 (Oncorynchus masou), X65496 (Rattus norvegicus), D16482 (Sarcophaga peregrina), D14667 (Xenopus laevis), y en SEQ ID No 1 y 10 (Zea mays).

La segunda clase que se define en esta memoria, comprende las denominadas proteínas PARP no clásicas (NAP). Estas proteínas son más pequeñas (72-73 kDa) y se caracterizan adicionalmente por la ausencia de un dominio de dedo de cinc en el término N de la proteína, y por la presencia de un dominio N-terminal que comprende tramos de aminoácidos que tienen semejanza con proteínas de fijación de DNA. Preferiblemente, las proteínas PARP de esta clase comprenden al menos una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 30 a 32 aminoácidos que comprenden la secuencia RGxxxxGxKxxxxxRL (los aminoácidos se representan por el código estándar de una sola letra, donde x representa cualquier aminoácido; SEQ ID No 7). Aún más preferiblemente, estas proteínas PARP comprenden al menos una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 32 aminoácidos que tienen la secuencia xLxVxxxRxxLxxR
GLxxxGVKxxLVxRLxxAI (SEQ ID No 8) (el denominado dominio A1) o al menos una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 32 aminoácidos que tiene la secuencia GMxxxELxxxAxxRGxxxxGxKKDxxRLxx (SEQ ID No 9) (el denominado dominio A2), o ambas. Particularmente, los dominios A1 y A2 son capaces de formar una estructura hélice-bucle-hélice. Estas proteínas PARP pueden comprender adicionalmente un dominio básico "B" (secuencia de aminoácidos rica en K/R, de aproximadamente 35 a aproximadamente 56 aminoácidos, implicada en el direccionamiento de la proteína al núcleo) y/o un dominio ácido "C" (secuencia de aminoácidos rica en D/E de aproximadamente 36 aminoácidos). Ejemplos de secuencias de proteínas de la clase NAP incluyen la proteína APP de Arabidopsis thaliana (accesible de la base de datos de proteínas PIR bajo el número de acceso Q11207; SEQ ID No 6) y la proteína NAP de Zea mays (SEQ ID No 4). La secuencia de los cDNAs correspondientes puede encontrarse en la base de datos EMBL bajo el número de acceso Z48243 (SEQ ID No 5) y en SEQ ID No 3. El hecho de que la segunda clase de proteínas PARP son realmente proteínas PARP funcionales, es decir, son capaces de catalizar la polimerización de poli(ADP-ribosa) dependiente de DNA ha sido demostrado por los autores de la invención (véase el Ejemplo 2).

Los autores de la invención han demostrado adicionalmente que las células eucariotas, particularmente células vegetales, expresan simultáneamente genes que codifican proteínas PARP de ambas clases.

Está claro que otros genes o cDNAs que codifican proteínas PARP de ambas clases como se han definido, o partes de las mismas, pueden aislarse a partir de otras especies o variedades eucariotas, particularmente de otras especies o variedades de plantas. Estos genes de PARP o cDNAs, pueden aislarse v.g. por hibridación Southern (sea hibridación de baja severidad o de alta severidad, dependiendo de la relación entre las especies a partir de las cuales se intenta aislar el gen PARP y la especie de la cual se derivó últimamente la sonda) utilizando como sondas fragmentos de DNA con la secuencia de nucleótidos de los genes PARP o cDNAs arriba mencionados, o partes de los mismos, con preferencia partes que están conservadas tales como un fragmento de gen que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la firma PARP arriba mencionada. Las secuencias de nucleótidos que corresponden a la firma PARP de las proteínas PARP codificadas por genes de plantas son la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1 desde el nucleótido 2558 al 2704 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3 desde el nucleótido 1595 al 1747, o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el nucleótido 1575 al 1724. Si debe hacerse una discriminación entre las clases de genes PARP, deberían utilizarse preferiblemente partes de los genes PARP que son específicas para la clase, tales como los dominios N-terminales que preceden al dominio catalítico o partes de los mismos.

Alternativamente, los genes o cDNAs que codifican proteínas PARP o partes de las mismas, pueden aislarse también por amplificación mediante PCR utilizando iniciadores apropiados tales como los iniciadores degenerados con la secuencia de nucleótidos que corresponde a las secuencias indicadas en SEQ ID No 13, SEPA ID No 14 (sic), o iniciadores con la secuencia de nucleótidos que corresponde a las secuencias indicadas en SEQ ID No 15 a 20. No obstante, está claro que las personas expertas en la técnica pueden diseñar oligonucleótidos alternativos para uso en PCR o pueden utilizar oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 20, con preferencia al menos aproximadamente 30, y de modo particular al menos aproximadamente 50, nucleótidos consecutivos de cualquiera de los genes PARP para aislar los genes o parte de los mismos por amplificación PCR.

Está claro que una combinación de estas técnicas, u otras técnicas (con inclusión, v.g., de RACE-PCR) disponibles para el operario experto con objeto de aislar genes o cDNAs sobre la base de fragmentos parciales y su secuencia de nucleótidos, v.g., obtenida por amplificación PCR, pueden utilizarse para aislar genes PARP, o parte de los mismos.

Además, los genes PARP, que codifican proteínas PARP en las cuales algunos de los aminoácidos han sido intercambiados por otros aminoácidos, químicamente similares (denominadas sustituciones conservadoras), o genes PARP sintéticos (que codifican proteínas similares a los genes PARP naturales pero con una secuencia de nucleótidos diferente, basada en la degeneración del código genético) y partes de los mismos son también adecuados para los métodos de la invención.

La PCD en células eucariotas, particularmente en células vegetales, puede inhibirse por una disminución moderada en el nivel funcional de PARP en dichas células eucariotas.

El nivel funcional de PARP en las células eucariotas, particularmente en células vegetales, puede reducirse por introducción de al menos un gen quimérico en dichas células, que comprende un promotor capaz de dirigir la transcripción en estas células, preferiblemente un promotor expresable en plantas, y una región funcional 3' de terminación de la transcripción y poliadenilación, enlazada operativamente a una región de DNA que, cuando se transcribe, produce una molécula de RNA biológicamente activa que es capaz de reducir el nivel funcional de la actividad endógena de PARP codificada por ambas clases de genes PARP.

Al menos dos de tales genes quiméricos moduladores de la PCD pueden introducirse en las células, con lo cual el RNA biológicamente activo codificado por el primer gen quimérico modulador de la PCD reduce el nivel funcional de la actividad endógena de PARP codificada por los genes de la clase NAP, y con lo cual el RNA biológicamente activo codificado por el segundo gen quimérico modulador de la PCD reduce el nivel funcional de la actividad endógena de PARP codificada por los genes de la clase ZAP, de tal modo que la actividad combinada de PARP se reduce moderadamente.

En una realización particularmente preferida, los genes quiméricos moduladores de la PCD reducen el nivel funcional de la actividad endógena de PARP por reducción del nivel de expresión de los genes endógenos PARP. A este fin, la región de DNA transcrita codifica un RNA biológicamente activo que reduce los mRNAs que codifican las proteínas PARP de las clases NAP y ZAP, que está disponible para la traducción. Esto puede conseguirse por técnicas tales como RNA antisentido, co-supresión o acción de ribozimas.

Como se utiliza en esta memoria, "cosupresión" hace referencia al proceso de supresión transcripcional y/o post-transcripcional de acumulación de RNA de una manera específica de la secuencia, dando como resultado la supresión de la expresión de genes homólogos endógenos o transgenes.

La supresión de la expresión de los genes endógenos PARP puede realizarse por tanto por introducción de un transgén que comprende un promotor fuerte enlazado operativamente a una región de DNA con lo cual el RNA resultante transcrito es un RNA de sentido o un RNA antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75%, con preferencia al menos 80%, particularmente al menos 85%, más particularmente al menos 90%, y especialmente al menos 95% de identidad de secuencia con o es idéntico a la secuencia codificante o transcrita de DNA (sentido) o al complemento (antisentido) de parte del gen PARP cuya expresión debe suprimirse. Preferiblemente, la región de DNA transcrita no codifica una proteína funcional. Particularmente, la región transcrita no codifica una proteína. Adicionalmente, la secuencia de nucleótidos de la región de sentido o antisentido debería tener con preferencia al menos una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos, con más preferencia al menos aproximadamente 250 nucleótidos, en particular al menos aproximadamente 500 nucleótidos, pero puede extenderse hasta la longitud total de la región codificante del gen cuya expresión debe reducirse.

Para el propósito de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias afines de nucleótidos o aminoácidos, expresada como porcentaje, hace referencia al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen residuos idénticos (x100) dividido por el número de posiciones comparadas. Una laguna, es decir una posición en una alineación en la cual está presente un residuo en una secuencia pero no en la otra, se considera como una posición con residuos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se realiza por el algoritmo de Wilbur y Upmann (Wilbur y Lipmann, 1983) utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos o aminoácidos, una longitud de palabra de 2 aminoácidos, y una penalidad por laguna de 4. El análisis asistido por ordenador y la interpretación de los datos de secuencias, con inclusión de la alineación de secuencias como se ha descrito arriba, pueden realizarse convenientemente utilizando paquetes de software disponibles comercialmente, tales como los programas de la Serie Intelligenetics^{TM} (Intelligenetics Inc., CA).

Estará claro para un técnico experto que uno o más genes quiméricos de sentido o antisentido moduladores de la PCD pueden utilizarse para conseguir las metas de la invención. Cuando se utiliza un gen quimérico de sentido o antisentido modulador de la PCD, este gen debe ser capaz de reducir simultáneamente la expresión de genes PARP de ambas clases. Esto puede conseguirse p.ej. por elección de la región transcrita del gen quimérico de tal manera que la expresión de ambas clases de genes puede regularse por un solo RNA de sentido o antisentido, es decir por elección de las regiones diana correspondientes a la región de DNA de homología máxima de los genes PARP de ambas clases e incorporación de una región de sentido o antisentido del DNA transcrita correspondiente a ambas regiones diana, de acuerdo con las condiciones descritas arriba para el RNA de sentido y antisentido. Alternativamente, regiones diferentes de RNA de sentido o antisentido, específica cada una para regulación de la expresión de una sola clase de genes PARP, pueden combinarse en una sola molécula de RNA, codificada por una región transcrita de un solo gen quimérico modulador de la PCD. Obviamente, las diferentes regiones de RNA de sentido o antisentido específicas para regulación de la expresión de una sola clase de genes PARP, pueden introducirse como genes quiméricos moduladores de la PCD separados.

Las regiones transcritas codificantes de sentido y antisentido preferidas comprenden una secuencia de nucleótidos que corresponde (con limitaciones de identidad de secuencia como se ha indicado arriba) a una secuencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos seleccionados de los dominios N-terminales de los genes PARP, que corresponden preferiblemente a una secuencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de SEQ ID No 1 desde la posición del nucleótido 113 a 1189, la secuencia de SEQ ID No 3 desde la posición del nucleótido 107 al 583, la secuencia de SEQ ID No 5 desde la posición del nucleótido 131 al 542, o la secuencia de SEQ ID No 10 desde la posición del nucleótido 81 al 1180. Sin embargo, está claro que pueden utilizarse regiones transcritas codificantes de sentido o antisentido, que comprenden una secuencia correspondiente a la secuencia completa del dominio N-terminal de los genes PARP, o incluso a la secuencia completa de los genes PARP, en particular la región codificante de proteínas de los mismos. Se prefieren adicionalmente regiones transcritas codificantes de sentido y antisentido que comprenden una secuencia de nucleótidos correspondiente (con limitaciones de identidad de secuencia como se ha indicado arriba) a una secuencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos seleccionados de los dominios catalíticos C-terminales de los genes PARP, preferiblemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos que abarca las secuencias de nucleótidos codificantes de la firma PARP, particularmente las secuencias de nucleótidos codificantes de la firma de PARP arriba indicadas. Una vez más, está claro que pueden utilizarse las regiones transcritas codificantes de sentido o antisentido, que comprenden una secuencia correspondiente a la secuencia completa del dominio C-terminal de los genes
PARP.

Los genes quiméricos moduladores de la PCD pueden reducir el nivel funcional de la actividad endógena de PARP por reducción del nivel de actividad aparente de las PARPs endógenas de ambas clases. A este fin, la región de DNA transcrita codifica un RNA biológicamente activo que se traduce en una proteína o péptido que inhibe las proteínas PARP de las clases NAP o ZAP o ambas, tales como anticuerpos desactivadores o mutantes PARP negativos dominantes.

Los "anticuerpos desactivadores de las proteínas PARP" son anticuerpos o partes de los mismos que se fijan específicamente al menos a algunos epítopes de las proteínas PARP, tales como el epítope que abarca parte del dedo de Zn If desde la posición 111 a la 118 en ZAP1 o un péptido correspondiente en ZAP2, y que inhiben la actividad de la proteína diana.

"Mutantes PARP dominantes negativos" como se utiliza en esta memoria, son proteínas o péptidos que comprenden al menos parte de una proteína PARP (o una variante de la misma), preferiblemente una proteína PARP endógena para la célula hospedadora diana eucariota, que no tienen actividad alguna de PARP, y que tienen un efecto inhibidor sobre la actividad de las proteínas endógenas PARP cuando se expresan en la célula hospedadora. Mutantes PARP dominantes negativos preferidos son proteínas que comprenden o están constituidas por un dominio de fijación de DNA funcional (o una variante del mismo) sin un dominio catalítico (tal como el dominio N-terminal que contiene dedo de Zn de aproximadamente 355 a aproximadamente 375 aminoácidos de una PARP de la clase ZAP, en particular un dominio de proteína de fijación de DNA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 2 desde el amino-ácido 1 al 370 o un dominio de proteínas de fijación de DNA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 11 desde el aminoácido 1 al 98, o un dominio de proteínas de fijación de DNA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 2 desde el aminoácido 1 al 370 en donde la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 1 al 88 está reemplazada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 11, desde el aminoácido de la posición 1 al aminoácido de la posición 98, o tal como el dominio de proteínas de fijación de DNA N-terminal de aproximadamente 135 a 160 aminoácidos de una PARP de la clase NAP, particularmente un dominio de proteínas de fijación de DNA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 4 desde el aminoácido 1 al 159 o un dominio de proteínas de fijación de DNA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 6 desde el aminoácido 1 al 138) o sin un dominio catalítico funcional (tal como mutantes PARP inactivos, mutados en la denominada firma PARP, mutados particularmente en la lisina conservada de la posición 850 de SEQ ID No 2, la posición 532 de SEQ ID No 4, la posición 517 de SEQ ID No 6). Preferiblemente, los mutantes PARP dominantes negativos deberían retener su actividad de fijación de DNA. Los mutantes PARP dominantes negativos pueden fusionarse a una proteína portadora, tal como una \beta-glucuronidasa (SEQ ID No 12).

Una vez más, pueden utilizarse uno o más genes moduladores de la PCD codificantes de uno o más mutantes PARP dominantes negativos. Cuando se utiliza un gen quimérico modulador de la PCD, el gen tiene que ser capaz de reducir simultáneamente la expresión de genes PARP de ambas clases.

El nivel funcional de PARP en las células eucariotas, particularmente en células vegetales, puede reducirse por modificación de la secuencia de nucleótidos de los genes PARP endógenos en dichas células de tal manera que las proteínas PARP mutantes codificadas retengan aproximadamente 10% de su actividad. Los métodos para conseguir una modificación de este tipo de genes endógenos PARP incluyen recombinación homóloga para intercambiar los genes PARP endógenos por genes PARP mutantes v.g. por los métodos descritos en la Patente U.S. 5.527.695. En una realización preferida, dicha modificación orientada de la secuencia de nucleótidos de los genes PARP endógenos se consigue por introducción de oligonucleótidos DNA/RNA quiméricos como se describe en WO 96/22364 o en la patente US 5.565.350.

En el caso de las células vegetales, se ha encontrado sin embargo que la introducción de un solo gen quimérico modulador de la PCD, que codifique preferiblemente RNA con actividad biológica en la reducción de la expresión de una sola clase de los genes PARP, particularmente de genes PARP de la clase ZAP, puede ser suficiente para la reducción de la actividad total de PARP en dichas células vegetales de acuerdo con la invención, es decir para inhibir o prevenir la muerte celular programada en dichas células vegetales.

En esta realización de la invención, el gen quimérico modulador de la PCD comprende preferiblemente una región transcrita que codifica un RNA biológicamente activo que comprende al menos una región de RNA, con preferencia de al menos 100 nucleótidos de longitud, clasificada de acuerdo con los criterios mencionados en esta memoria como un RNA de sentido para uno de los genes endógenos PARP, y que comprende al menos en otra región de RNA, preferiblemente de al menos 100 nucleótidos de longitud, que se clasifica de acuerdo con los criterios mencionados en esta memoria como un RNA antisentido para uno de los genes endógenos PARP, donde la región de RNA antisentido y la de sentido son capaces de combinarse en una región bicatenaria, con preferencia a lo largo de una distancia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos.

Se espera que la introducción de un solo gen quimérico modulador de la PCD, que puede reducir el nivel funcional o aparente de una sola clase de proteínas PARP, particularmente una proteína PARP de la clase ZAP, como se describe en esta memoria, puede ser análogamente suficiente para la reducción de la actividad total de PARP en las células vegetales de acuerdo con la invención. La muerte celular programada reducida o inhibida en células vegetales que comprenden al menos un solo gen quimérico modulador de la PCD de acuerdo con la invención puede dar como resultado una resistencia mejorada a condiciones adversas, tal como resistencia al estrés impuesto por tratamiento con productos químicos, resistencia al estrés por frío, resistencia al estrés impuesto por patógenos y plagas, resistencia a la sequía, resistencia al estrés por calor, etc.

Si la introducción de genes quiméricos moduladores de la PCD en células eucariotas dará finalmente como resultado un nivel funcional moderada o severamente reducido de PARP combinada en dichas células - es decir, PCD inhibida o PCD incrementada - estará determinado usualmente por el nivel de expresión (sea al nivel de la transcripción o al nivel combinado transcripción/traducción) de dichos genes moduladores de la PCD. Un factor principal contribuyente al nivel de expresión del gen modulador de la PCD es la elección de la región promotora, aunque otros factores (tales como, pero sin carácter limitante, la elección del extremo 3', la presencia de intrones, el uso de codones de la región transcrita, la estabilidad del mRNA, la presencia de secuencias de consenso alrededor del sitio de iniciación de la traducción, la elección de regiones de RNA 5' y 3' no traducidas, la presencia de secuencias PEST, la influencia de la estructura de la cromatina que rodea el sitio de inserción de un gen modulador de la PCD estable integrado, el número de copias de los genes moduladores de la PCD introducidos, etc.) o combinaciones de los mismos contribuirán también al nivel de expresión último del gen modulador de la PCD. En general, puede suponerse que la reducción moderada de los niveles funcionales de PARP combinada puede conseguirse por genes moduladores de la PCD que comprenden un promotor relativamente débil, mientras que la reducción severa de los niveles funcionales de PARP combinada puede conseguirse por genes moduladores de la PCD que comprenden un promotor relativamente fuerte. No obstante, el nivel de expresión de un gen modulador de la PCD que comprende un promotor específico y eventualmente su efecto en la PCD, pueden variar en función de los otros factores contribuyentes, como se han mencionado anteriormente.

Para el propósito de realizaciones particulares de la invención, los genes quiméricos moduladores de la PCD pueden comprender un promotor constitutivo, o un promotor que se expresa en la totalidad o la mayoría de los tipos de células del organismo, particularmente en toda la planta, tales como las regiones promotoras derivadas de los genes T-DNA, en particular los genes de opina-sintasa de los plásmidos Ti o Ri de Agrobacterium (v.g., los promotores nos, ocs), o las regiones promotoras de genes virales (tales como los promotores CaMV35S, o variantes de los mismos).

Adicionalmente, puede ser ventajoso controlar la expresión del gen modulador de la PCD a voluntad o en respuesta a estímulos ambientales, v.g. por inclusión de un promotor inducible que puede ser activado por un estímulo externo, tal como, pero sin carácter limitante, la aplicación de compuestos químicos (v.g. fitoprotectores, herbicidas, glucocorticoides), condiciones de luz, exposición a estrés abiótico (v.g. lesiones, metales pesados, temperaturas extremas, salinidad o sequía) o estrés biótico (v.g. infección por patógenos o plagas con inclusión de infección por hongos, virus, bacterias, insectos, nematodos, micoplasmas y organismos semejantes a micoplasmas, etc.). Ejemplos de promotores inducibles expresables en plantas adecuados para la invención son: promotores inducibles por nematodos (tal como se describen en el documento WO 92/21757), promotores inducibles por hongos (WO 93/19188, WO 96/28561), promotores inducibles después de aplicación de glucocorticoides tales como dexametasona ( ), o promotores reprimidos o activados después de la aplicación de tetraciclina (Gatz et al. 1998; Weimann et al., 1994).

Puede ser conveniente o necesario restringir el efecto sobre la muerte celular programada a un subconjunto particular de las células del organismo, particularmente de la planta, por lo que los genes moduladores de la PCD pueden incluir promotores específicos de tejido o específicos del tipo de célula. Ejemplos de promotores adecuados expresables en plantas, expresados selectivamente en tejidos particulares o tipos de células particulares son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin carácter limitante, promotores específicos de semillas (v.g. WO 89/03887), promotores específicos de primordios de órganos (An et al., 1996), promotores específicos del tallo (Keister et al., 1988), promotores específicos de las hojas (Hudspeth et al., 1989), promotores específicos de mesófilos (tales como los promotores fotoinducibles Rubisco), promotores específicos de la raíz (Keller et al., 1989), promotores específicos de tubérculos (Keil et al., 1989), promotores específicos de tejido vascular (Peleman et al., 1989), promotores específicos de meristemos (tales como el promotor del gen SHOOTMERISTEMLESS (STM, Long et al., 1996), promotores específicos de primordios (tales como el promotor del gen Antirrhinum Cyc D3A, Doonan et al., 1998), promotores específicos de las anteras (WO 89/10396, WO 9213956, WO 9213957), promotores específicos de los estigmas (WO 91/02068), promoto-
res específicos de la zona de dehiscencia (WO 97/13865), promotores específicos de semillas (WO 89/03887), etc.

Preferiblemente, los genes quiméricos moduladores de la PCD están acompañados por un gen marcador, preferiblemente un gen marcador quimérico que comprende un DNA marcador que está enlazado operativamente en su extremo 5' para un promotor expresable en plantas, con preferencia un promotor constitutivo, tal como el promotor 35S de CaMV, o un promotor fotoinducible tal como el promotor del gen que codifica la subunidad pequeña de Rubisco; y enlazado operativamente en su extremo 3' a señales adecuadas de formación del extremo 3' de la transcripción en plantas y poliadenilación. Es de esperar que la elección del DNA marcador no sea crítica, pudiendo utilizarse cualquier DNA marcador adecuado. Por ejemplo, un DNA marcador puede codificar la proteína que proporciona un "color" distinguible a la célula vegetal transformada, tal como el gen A1 (Meyer et al., 1987) o la Proteína Fluorescente Verde (Sheen et al., 1995), puede proporcionar resistencia a los herbicidas a la célula vegetal transformada, tal como el gen bar, que codifica resistencia a la fosfinotricina (EP 0.242.246), o puede proporcionar resistencia a los antibióticos a las células transformadas, tales como el gen aac (6'), que codifica resistencia a la gentamicina (WO 94/01560).

Métodos para introducir genes quiméricos moduladores de la PCD en células eucariotas, particularmente métodos para transformar células vegetales son bien conocidos en la técnica, y se cree que no son críticos para los métodos de la invención. La transformación da como resultado células transformadas transitoriamente o de manera estable (por lo cual los genes quiméricos moduladores de la PCD se insertan de manera estable en el genoma de la célula, particularmente en el genoma nuclear de la célula).

Está claro que los métodos y medios descritos en esta memoria para alterar la muerte celular programada en células de plantas y en plantas, tienen varias posibilidades de aplicación importantes. La inhibición de la PCD por los métodos y medios descritos en esta memoria, puede utilizarse para aliviar el estrés impuesto sobre las células, en particular las células vegetales, durante la transformación y por tanto aumentar la eficiencia de transformación, como se describe en WO 97/06267. La inhibición de la PCD puede utilizarse también para mejorar cultivos celulares de células eucariotas, particularmente de células vegetales.

De modo inesperado, se ha encontrado que después de la introducción de un gen quimérico modulador de la PCD que modula la expresión de un gen PARP, preferiblemente un gen quimérico que modula la expresión de un gen PARP de la clase ZAP, particularmente un gen quimérico modulador de la expresión de un gen PARP de la clase ZAP en el cual la región transcrita codifica un RNA biológicamente activo que comprende simultáneamente un RNA de sentido y antisentido como se describe en esta memoria, las células vegetales transformadas, callos de plantas y plantas exhibían un crecimiento incrementado.

Aunque no se pretende limitar la invención a un modo de acción particular, se cree que el crecimiento incrementado es una consecuencia del número reducido de células que sufren muerte celular programada, probablemente por aumento del umbral para una señal que inhibe la división celular, conduciendo así a plantas de crecimiento más vigoroso. Estas plantas son también más resistentes al estrés como se explica en otro lugar de esta solicitud.

Por consiguiente, la invención se refiere también a un método para incrementar el crecimiento, preferiblemente el crecimiento vegetativo, de células vegetales, tejidos de plantas y plantas que comprenden al menos un gen quimérico modulador de la PCD de acuerdo con el primer aspecto de la invención, preferiblemente un gen quimérico modulador de la expresión de un gen PARP de la clase ZAP, en particular un gen quimérico modulador de la expresión de un gen PARP de la clase ZAP en el cual la región transcrita codifica un RNA biológicamente activo que comprende simultáneamente un RNA de sentido y antisentido.

Aunque está claro que los métodos descritos en esta memoria pueden aplicarse esencialmente a todas las especies y variedades de plantas, la invención será especialmente adecuada para la muerte celular programada en plantas con valor comercial. Plantas particularmente preferidas a las cuales puede aplicarse la invención son maíz, colza oleaginosa, lino, trigo, céspedes, alfalfa, leguminosas, una verdura crucífera, tomate, lechuga, algodón, arroz, cebada, patata, tabaco, remolacha azucarera, girasol, y plantas ornamentales tales como clavellina, cristantemo, rosas, tulipanes y análogas.

La planta transformada obtenida puede utilizarse en un esquema de reproducción convencional para producir más plantas transformadas con las mismas características o para introducir el gen quimérico controlador de la división celular de la invención en otras variedades de la misma especie o especies de plantas afines. Las semillas obtenidas a partir de las plantas transformadas contienen el gen modulador de la PCD de la invención como una inserción genómica estable.

Los ejemplos que siguen describen la construcción de genes quiméricos controladores de la apoptosis y el uso de dichos genes para la modulación de la muerte celular programada en células y organismos eucariotas. A no ser que se indique otra cosa en los ejemplos, todas las técnicas de DNA recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU. Materiales y métodos estándar para trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Cloy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd. (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.

A lo largo de la descripción y los ejemplos, se hace regencia a las secuencias siguientes:

SEQ ID No 1:

Secuencia de DNA del gen ZAP de Zea mays (zap1)

SEQ ID No 2:

Secuencia de proteína de la proteína ZAP de Zea mays (ZAP1)

SEQ ID No 3:

Secuencia de DNA del gen NAP de Zea mays (nap)

SEQ ID No 4:

Secuencia de proteína de la proteína NAP de Zea mays (NAP)

SEQ ID No 5:

Secuencia de DNA de Arabidopsis thaliana (app)

SEQ ID No 6:

Secuencia de proteína de la proteína NAP de Arabidopsis thaliana (APP)

SEQ ID No 7:

Secuencia de consenso para el dominio A de proteínas PARP no-convencionales

SEQ ID No 8:

Secuencia de consenso para el dominio A1 de proteínas PARP no-convencionales

SEQ ID No 9:

Secuencia de consenso para el dominio A2 de proteínas PARP no-convencionales

SEQ ID No 10:

Secuencia de DNA del segundo gen ZAP de Zea mays (Zap2)

SEQ ID No 11:

Secuencia de proteína de la proteína ZAP de Zea mays (ZAP2)

SEQ ID No 12:

Secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión entre el dominio de fijación de DNA de APP y la proteína GUS

SEQ ID No 13:

Iniciador PCR degenerado

SEQ ID No 14:

Iniciador PCR degenerado

SEQ ID No 15:

Iniciador PCR

SEQ ID No 16:

Iniciador PCR

SEQ ID No 17:

Iniciador PCR

SEQ ID No 18:

Iniciador PCR

SEQ ID No 19:

Iniciador PCR

SEQ ID No 20:

Iniciador PCR

SEQ ID No 21:

Fusión de traducción promotor app-gus

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Texto libre del listado de secuencias

El texto libre siguiente se ha utilizado en la parte del Listado de Secuencias de esta Solicitud

<223>

Descripción de la Secuencia Artificial: Dominio A de proteínas PARP no-convencionales

<223>

Descripción de la Secuencia Artificial: Dominio A1 de proteína PARP no-convencional

<223>

Descripción de la Secuencia Artificial: Dominio A2 de proteína PARP no-convencional

<223>

Descripción de la Secuencia Artificial: Proteína de fusión entre el dominio N-terminal de APP y la proteína GUS

<223>

Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR degenerado

<223>

Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para uso como iniciador PCR

<223>

Descripción de la Secuencia Artificial: Fusión del promotor APP con el gen de beta-glucuronidasa

<223>

Codón de iniciación de la traducción

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Ejemplos Procedimientos experimentales Cepas de levadura y bacterianas

Se utilizó la cepa de Saccharomyces cerevisiae DY(MATa his3 can1-10 ade2 leu2 trp1 ura3::(3xSV40 AP1-lacZ) (Kuge y Jones, 1994) para la expresión de la proteína APP. La transformación con levadura se realizó de acuerdo con Dohmen et al. (1991). Las cepas se cultivaron en un medio SDC mínimo (base nitrogenada de levadura 0,67%, casamino-ácidos 0,37%, glucosa 2%, 50 mg l^{-1} de adenina y 40 mg l^{-1} de triptófano). Para la inducción de la expresión de APP, se sustituyó la glucosa en SDC con galactosa al 2%.

Se utilizó la cepa XL-1 de Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA) para las manipulaciones de plásmidos y cribados de genotecas, que se llevaron a cabo de acuerdo con procedimientos estándar (Ausubel et al., 1987; Sambrook et al., 1989). Se utilizó E. coli BL21 (Studier y Moffat, 1986) para la expresión de la proteína APP y Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif^{r} (pGV2260) (Deblaere et al., 1985) para la transformación estable de las
plantas.

Ensayo de actividad de poli(ADP-ribosa)polimerasa

Se ensayó la actividad enzimática de la APP en extractos de proteínas totales de cepas de levadura preparadas como sigue. Se cultivaron DY(pV8SPA) o DY(pYeDP1/8-2) en 50 ml de medio SDC durante una noche a 30ºC en una máquina de sacudidas giratoria a 150 rpm. Se cosecharon las células de levadura por centrifugación a 1000 x g, se lavaron tres veces con 150 ml de tampón de fosfato de potasio 0,1M (pH 6,5), y se suspendieron de nuevo en 5 ml de tampón de sorbitol (sorbitol 1,2M, K_{2}HPO_{4} 0,12M, ácido cítrico 0,033M, pH 5,9). Se añadió Lyticase (Boehringer Mannheim, Alemania) a la suspensión de células a una concentración final de 30 U ml^{-1} y las células se incubaron a 30ºC durante 1 hora. Se lavaron luego los esferoplastos de levadura tres veces con tampón de sorbitol y se resuspendieron en 2 ml de tampón de lisis enfriado en hielo (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, NaCl 400 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10%, DTT 1 mM). Después de tratamiento por ultrasonidos, el lisado se centrifugó a 20.000 x g durante 20 min a 4ºC y el sobrenadante se desaló en una columna EconoPack^{TM} 10 DG (Bio-Rad, Richmond, CA) equilibrada con tampón de reacción (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM). Para reducir la degradación proteolítica de las proteínas, los tampones de lisis y de reacción se suplementaron con un cóctel inhibidor de proteasas (Boehringer), una tableta por cada 50 ml. Se separaron los ácidos nucleicos de los extractos totales por adición de NaCl y sulfato de protamina a una concentración final de 600 mM y 10 mg ml^{-1}, respectivamente. Después de incubación a la temperatura ambiente durante 10 min, se separó el precipitado por centrifugación a 20.000 x g durante 15 min a 4ºC. El tampón del sobrenadante se intercambió en lugar del tampón de reacción por filtración con gel en una columna Econo-Pack^{TM} 10 DG.

El ensayo para la síntesis de poli(ADP-ribosa) se adaptó de Collinge y Althaus (1994). Se incubaron aproximadamente 500 \mug de proteína de levadura total en un tampón de reacción suplementado con 30 \muCi de ^{32}P-NAD^{+} (500 Ci mmol^{-1}), NAD^{+} sin marcar a una concentración final de 60 \muM, y 10 \mug ml^{-1} de DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos. Después de incubación durante 40 min a la temperatura ambiente, se añadieron 500 \mul del tampón de parada (Tris-HCl 200 mM, pH 7,6, NaCl 0,1M, EDTA 5 mM, 1% de Na^{+}-N-lauroil-sarcosina, y 20 \mug ml^{-1} de proteínasa K) y las reacciones se incubaron a 37ºC durante una noche. Después de extracciones con fenol y fenol/cloroformo, se precipitaron los polímeros con 2,5 volúmenes de etanol que contenía NaAc 0,1M (pH 5,2). El sedimento se lavó con etanol al 70%, se secó, y se disolvió en formamida al 70%, EDTA 10 mM, azul de bromofenol al 0,01%, y xileno-cianol al 0,01%. Las muestras se calentaron a 80ºC durante 10 min y se cargaron luego en un gel de secuenciación de poliacrilamida al 12%/urea 6M. Los geles se secaron sobre papel 3 MM (Whatman International, Maidstone, Reino Unido) y se expusieron a película Kodak X-Omat de rayos X (Eastman, Richmond, NY) o se escanearon utilizando un Phosphorimager^{TM} 445SI (Molecular Dynamics, Sunnivale, CA).

Técnicas inmunológicas

Se expresó un cDNA truncado app que codificaba un polipéptido APP desde los aminoácidos Met^{310} a His^{637} como una fusión de traducción con seis residuos histidina en el término N después de inducción de un cultivo de 500 ml del E. coli BL21 (pET\DeltaNdeSPA) con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido 1 mM. El polipéptido APP se purificó hasta cuasi-homogeneidad por cromatografía de afinidad en condiciones desnaturalizantes (en presencia de hidrocloruro de guanidinio 6M) en una columna Ni^{2+}-NTA-agarosa, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Qiagen, Chatsworth, CA). Después de diálisis contra PBS, se utilizó una mezcla de los polipéptidos APP solubles e insolubles para inmunizar dos conejos blancos de Nueva Zelanda siguiendo un protocolo de inmunización estándar (Harlow y Lane, 1988). Para el análisis por transferencia Western, las proteínas se resolvieron por SDS-PAGE desnaturalizante (Sambrook et al., 1989; Harlow y Lane, 1988) y se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa (Hybond-C; Amersham), utilizando un Semi-Dry Blotter II (Kem-En-Tec, Copenhague, Dinamarca).

La localización in situ del antígeno en células de levadura se llevó a cabo como se ha descrito (Harlow y Lane, 1988). Para la localización de la proteína APP en esferoplastos de levadura, se diluyó suero anti-APP en relación 1:3000 hasta 1:5000 en tampón solución salina-BSA tamponado con Tris. Se utilizó el anticuerpo monoclonal 10H, que reconoce específicamente el polímero poli(ADP-ribosa) (Ikajima et al., 1990) en una dilución 1:100 en tampón de PBS. El anticuerpo de ratón se detectó con el fragmento de IgG F(ab')_{2} anti-ratón de oveja conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma), a una dilución de 1:200. Se detectó la IgG de conejo con el fragmento F(ab')_{2} de oveja anti-IgG de conejo conjugado con CY-3 (Sigma), a una dilución de 1:200. Para la visualización del DNA, se incubaron portaobjetos durante 1 min en PBS con 10 \mug ml^{-1} de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma). La obtención de imágenes de fluorescencia se realizó en un microscopio de epifluorescencia Axioskop (Zeiss, Jena, Alemania). Para la observación de los fluorocromos FITC y CY-3 se utilizaron cubos de 23 y 15 filtros, respectivamente. Las células se fotografiaron con película Fuji Color-100 super plus.

Material vegetal y análisis histoquímico

Se utilizó Nicotiana tabacum SR1 (Maliga et al., 1975) para la generación de transformantes estables siguiendo el procedimiento de cocultivo en discos de hojas (De Block et al., 1987) con A. tumefaciens C58C1 RifR(pGV2260; pGCNSPAGUS). Se utilizó como control la línea SR1 de N. tabacum transformada con GUS auténtico bajo el control del CaMV 35S. Se utilizó Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia, para la transformación de la fusión app-promotor-GUS siguiendo el procedimiento de infiltración in situ.

Para la tinción histoquímica in situ de la actividad de GUS, se fijaron muestras de plantas en acetona al 90% enfriada en hielo durante 30 min, se lavaron en K_{2}HPO_{4} 0,1M (pH 7,8), y se incubaron luego en tampón de tinción (K_{2}HPO_{4} 0,1M, pH 7,8, X-Gluc 2 mM, Fe^{3+}-EDTA 20 mM) a 37ºC. Los tejidos de plantas teñidos se guardaron en etanol al 70% a 4ºC. En caso necesario, se redujo el pardeo de los tejidos debido a la oxidación fenólica por incubación con lactofenol (Beeckman y Engler, 1994). Se examinó la tinción de GUS bajo un microscopio óptico Jenalumar (Zeiss). Los tejidos vegetales se fotografiaron con película Fuji Color-00 super plus.

Métodos diversos

Los pasos de construcción de plásmidos se verificaron rutinariamente por secuenciación del DNA realizada de acuerdo con los protocolos proporcionados por USB Biochemicals (Cleveland, OH). Las sondas de DNA marcadas con ^{32}P para hibridación de los ácidos nucleicos se sintetizaron por medio del estuche de marcación Ready-Prime DNA (Amersham). Para los experimentos de hibridación de DNA y RNA, se utilizó el sistema tampón de Church y Gilbert (1984) (fosfato de sodio 0,25M, pH 7,2, SDS al 7%, BSA al 1%, EDTA 1 mM). Para el análisis por transferencia Western, las proteínas totales de levadura se extrajeron con fenol esencialmente como se ha descrito para tejidos vegetales (Hurkman y Tanaka, 1986). Para el análisis por transferencia Northern, se extrajo el RNA total de levadura con fenol caliente como ha sido descrito (Ausubel et al., 1987). El RNA se resolvió sobre geles de agarosa al 1,5% después de desnaturalización con glioxal (Sambrook et al., 1989). Para la transferencia de los ácidos nucleicos se utilizaron filtros Hybond-N-nailon (Amersham).

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Ejemplo 1

Aislamiento de genes que codifican homólogos de PARP de Zea mays

El ejemplo siguiente se da únicamente para propósitos de referencia.

Con el propósito de aislar cDNA de maíz codificante de homólogo(s) de PARP se siguieron dos métodos. En primer lugar, se cribó una genoteca de cDNA de maíz en condiciones de hibridación DNA-DNA de severidad baja, utilizando una sonda de DNA preparada a partir del cDNA de app de Arabidopsis En segundo lugar, se realizó una amplificación por PCR de parte de la PARP de maíz, utilizando el cDNA de la primera cadena como molde y dos iniciadores degenerados, designados sobre la base de la secuencia de la "firma PARP", la secuencia de aminoácidos más conservada entre todas las proteínas PARP conocidas.

Una genoteca de cDNA \lambdaZAP (Stratagene) de hojas de maíz (Zea mays L.), línea endogámica B734. Se cribaron calvas (500.000) de acuerdo con procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989). Después de cribado con la sonda app de Arabidopsis, se purificó un cDNA de longitud no total de 1,4 kpb. Después del cribado de la genoteca de cDNA inicial con la sonda app y una amplificación rápida 5' subsiguiente de los extremos del cDNA por análisis PCR (RACE), se identificó el gen nap, un homólogo de maíz del app de Arabidopsis. Para la PCR 5'RACE, el molde se preparó con el kit Marathon (Clontech, Palo Alto, CA) y 0,5 \mug de RNA poli(A)+ de maíz aislado de la vaina interna, la vaina externa, y las hojas de plantas de semillero de maíz de una semana de edad. Los iniciadores anidados específicos de genes para la amplificación por PCR eran 5'-GGGACCATGTAGTTTATCTTGACCT-3'(SEQ ID No 15) y 5'-GACCTCGTACCCCAACTCTTCCCCAT-3' (SEQ ID No 16) para los iniciadores nap. Los productos PCR amplificados se subclonaron y secuenciaron. Un fragmento de 800 pb se amplificó con iniciadores específicos nap, lo que permitió reconstruir la secuencia de 2295 pb de longitud del cDNA nap (SEQ ID No 3).

La proteína NAP tenía una longitud de 653 aminoácidos (peso molecular -73 kDa (sic); SEQ ID No 4) y era muy similar (61% de identidad de secuencia y 69% de semejanza) a la APP. Y, lo que es más importante, NAP tenía una organización del término N congruente con APP (Figura 1A), lo que sugería una presión de selección estricta en cuanto a la estructura de las proteínas semejantes a APP en las plantas. El gen nap era exclusivo del genoma del maíz (Figura 2A) y codificaba un transcrito de 2,4 kb (Figura 2C).

Utilizando iniciadores degenerados basados en regiones muy conservadas en la "firma PARP" y el cDNA de la primera cadena de Zea mays como molde, se amplificó un fragmento de 310 pares de bases. Para la PCR con iniciadores degenerados 5'-CCGAATTCGGNTAYATGTTYGGNAA-3' (SEQ ID No 13) y 5'-CCGAATTCACNATRTAYTCRT
TRTA-3' (SEQ ID No 14) con Y=C/T; R=A/G; N=A/G/C/T), se utilizó el cDNA de la primera cadena como molde y se sintetizó utilizando 5 \mug de RNA poli(A)^{+} a partir de hojas jóvenes de maíz y la transcriptasa inversa MuMLV. Se realizaron amplificaciones PCR con DNA-polimerasa Taq en un volumen de 100 \mul utilizando las condiciones siguientes: 1 min a 95ºC, 2 min a 45ºC, 3 min a 72ºC, seguido por 38 ciclos de 1 min a 95ºC, 2 min a 45ºC, 3 min a 72ºC, con una incubación final durante 10 min a 72ºC.

La secuencia del fragmento de 310 pb demostró 55% de identidad de secuencia y 64% de semejanza de secuencia con PARP humana en la misma región, pero era, sin embargo, diferente de la secuencia del cDNA nap. Se identificaron tres cDNAs zap después de cribado con el fragmento de 310 pb, que se obtuvo por PCR con iniciadores degenerados. Estos tres cDNAs purificados se dedujeron todos del mismo transcrito debido a que tenían regiones 3' no codificantes idénticas; el clon de mayor longitud (#9) se secuenció en ambas cadenas (SEQ ID No 1). Este cDNA codificaba un polipéptido PARP-homólogo de 689 aminoácidos (SEQ ID No 2; peso molecular 109 kDa), que fue designado por los inventores como ZAP1 (Figura 1B). El primer dedo de Zn de ZAP1 era probablemente no funcional debido a que tenía la secuencia CKSCxxxHASV, que no incluía un tercer residuo de cisteína.

El análisis 5'RACE PCR de los transcritos zap de la línea de maíz LG2080 (la genoteca de cDNA cribada se produjo a partir de la línea endogámica B734) se realizó como se ha descrito arriba utilizando los iniciadores específicos de zap siguientes 5'-AAGTCGACGCGGCCGCCACACCTAGTGCCAGGTCAG-3' (SEQ ID No 17) y 5'-ATCTCAATTGTACATTTCTCAGGA-3' (SEQ ID No 18). Se obtuvo un producto PCR de 450 pb después de PCR con iniciadores específicos de zap. Se secuenciaron 8 fragmentos 5'RACE PCR independientes, debido a sus ligeras diferencias en longitudes en los extremos 5', con iniciadores específicos de zap. En la totalidad de los transcritos de las plantas de maíz LG2080, había una inserción de secuencia adicional en la región codificante, que hacía la proteína ZAP 11 aminoácidos más larga (980 aminoácidos, peso molecular -110,4 kDa (sic)). El dedo de Zn I de ZAP2 era estándar y su lectura era CKSCxxxHARC (Figura 1B; SEQ ID No 11). La diferencia de secuencias puede ser debida a diferencias entre variedades de maíz, a la expresión de dos genes homólogos, o a remodelación alternativa. De hecho, el maíz puede tener al menos dos genes zap (Figura 2B), que codifican un transcrito de 3,4-3,5 kb (Figura 2D). El experimento de transferencia en gel de DNA con una sonda preparada a partir del cDNA zap demostró que estaban presentes los genes homólogos en Arabidopsis.

Estructuralmente, ZAP era muy similar a PARP de los animales. El mismo tenía un dominio de fijación de DNA bien conservado, compuesto de dos dedos de Zn (36% de identidad y 45% de semejanza con el dominio de fijación de DNA de PARP de ratón). Se demostró una homología aún mayor por comparación exclusiva de las secuencias de los dedos de Zn, Ala^{1}-Phe^{162} en la enzima de ratón (44% de identidad y 54% de semejanza), o un subdominio aguas abajo de la señal de localización nuclear (NLS), Leu^{237}-Ser^{360} en la PARP de ratón (identidad 40% y semejanza 50%). Mientras que la señal de localización nuclear bipartita característica de PARP de mamífero no podía identificarse en ZAP, la secuencia KRKK proporcionaba una NLS monopartita (Figura 1B). El dominio de automodificación supuesto estaba deficientemente conservado y era más corto en ZAP que en PARP de ratón. La compilación de la homología de los dominios catalíticos entre zap, NAP, APP y PARP de ratón se muestra en la Figura 2. Debe indicarse que el dominio de fijación de NAD^{+} de ZAP era más similar a la enzima de un mamífero (identidad 48%) que a la de APP y NAP (40% y 42% de identidad de secuencia, respectivamente), en tanto que APP y NAP eran idénticas en un 68% y semejantes en un 76% a su dominio catalítico.

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Ejemplo 2

Demostración de que la proteína PARP no convencional tiene actividad de poli(ADP-ribosa)-polimerasa dependiente de DNA

El ejemplo siguiente se da únicamente para propósitos de referencia.

APP es una poli(ADP-ribosa)-polimerasa dependiente de DNA

Se realizó un estudio más detallado de la proteína APP (expresada en levadura) para entender la actividad de las proteínas de la clase NAP semejantes a PARP. La elección de levadura como el organismo para la expresión y el análisis enzimático de la proteína APP de Arabidopsis se realizó por varías razones. Como eucariota, Saccharomyces cerevisiae es más adecuado para la expresión de proteínas nativas que otros organismos eucariotas, y al contrario que la mayoría de las restantes células eucariotas, no posee actividad endógena de PARP (Lindahl et al.,
1995).

Se puso cDNA de app de longitud total en pYeDP1/8-2 bajo el control de un promotor de levadura inducible por galactosa de la manera siguiente: se escindió el cDNA de app de longitud total de pC3 (Lepiniec et al., 1995) como un fragmento XhoI-EcoRI. Los extremos se rellenaron con el fragmento Klenow de DNA-polimerasa I, y el fragmento se subclonó en el sitio SmaI del vector de expresión de levadura pYeDP1/8-2 (Cullin y Pompon, 1988). El vector de expresión resultante pV8SPA (Figura 4A) se transformó en la cepa DY de S. cerevisiae.

Para la expresión de APP en E. coli, la región codificante completa del cDNA de app se amplificó por PCR con DNA-polimerasa de Pfu (Stratagene), utilizando los iniciadores 5'-AGGATCCCATGGCGAACAAGCTCAAAGT
GAC-3' (SEQ ID No 19) y 5'-AGGATCCTTAGTGCTTGTAGTTGAAT-3' (SEQ ID No 20), y se subclonó como un fragmento BamHI en pET19b (Novagene, Madison, WI), dando como resultado pETSPA. La expresión de la APP de longitud total en E. coli BL21 de pETSPA era muy pobre. Para obtener una expresión mejor, se digirió pETSPA con NcoI y NdeI o con SmaI, se rellenaron los extremos con el fragmento Klenow de DNA-polimerasa I, y se autoligaron luego los plásmidos. De los plásmidos pET\DeltaNdeSPA y pET\DeltaSmaSPA resultantes, únicamente pETANdeSPA proporcionaba una expresión satisfactoria del polipéptido APP truncado (Met^{310} hasta His^{637}) en E. coli
BL21.

La expresión de la APP en levadura se verificó por análisis mediante transferencias Northern y Western. (Fig. 4). Dado que el promotor en pV8SPA es inactivo cuando las células se cultivan en glucosa y se desreprimen en medios que contienen galactosa, se esperaba que la expresión estuviera estrictamente regulada por la fuente de carbono. Sin embargo, el análisis por transferencia Northern del RNA y el análisis por inmunotransferencia de proteínas en DY(pV8SPA) en comparación con la cepa de control DY que contenía el vector vacío, demostró que el mRNA app y la proteína APP se expresaban en levadura aun cuando se cultivaban en medios que contenían glucosa (Figura 4B, pista 2). La peculiaridad de la expresión observada en medio que contenía glucosa era que tanto mRNA app como la proteína APP eran más cortos que los detectados después de inducción con galactosa (compárense las pistas 2 y 4 en la Figura 4B). El polipéptido APP con el peso molecular mayor (aparentemente una proteína de longitud total) se detectaba únicamente en medio que contenía galactosa, aunque tales células expresaban también el mRNA y la proteína truncados. La explicación más probable para este hallazgo es que cuando la cepa DY(pV8SPA) se cultiva en glucosa, existe una expresión que se fuga de la casete de expresión, comenzando la transcripción 200-300 pares de bases aguas abajo del inicio de la transcripción observado después de inducción en galactosa. Este mRNA más corto no codifica probablemente la primera metionina (Met^{1}) de APP y, por tanto, la traducción se inicia en Met^{72}. Esto podría explicar la diferencia observada de -5 kDa (siendo la diferencia calculada 7,5 kDa) en las masas moleculares de los polipéptidos APP de las cepas cultivadas en glucosa o en galactosa. La posibilidad de que las diferencias en pesos moleculares puedan atribuirse a automodificación por poli(ADP-ribos)ilación se excluyó por cultivo de cepas en presencia de inhibidores de PARP tales como 3-ABA y nicotinamida (Figura 4B, compárense las pistas 6 y 8 con la pista 4).

Para detectar la síntesis de poli(ADP-ribosa), se extrajeron las proteínas totales de cepas de levadura cultivadas en diferentes condiciones y se incubaron en presencia de NAD^{+} marcada radiactivamente. Para prevenir la síntesis de poli(ADP-ribosa) y la posible automodificación de la APP in vivo, se cultivaron también cepas en presencia de 3ABA, un inhibidor reversible de PARP, que se separó subsiguientemente de los extractos de proteínas durante el desalado. La Figura 5 muestra que poli(ADP-ribosa) es sintetizada por extractos de proteínas de DY(pV8SPA) cultivados en galactosa (Figura 5A, pistas 1 y 2), pero no por una cepa que contiene el vector vacío (Figura 5A, pista 4). Puede verse también que APP de Arabidopsis podría sintetizar polímeros de hasta 40 residuos de longitud (Figura 5A, pista 1) incorporándose la mayor parte de la radiactividad en el 10-15-mero. Esta observación es consistente con los tamaños de los polímeros detectados por otros autores (Chen et al., 1994). Se incorporaba más radiactividad en el polímero cuando la cepa de levadura se cultivaba con 3ABA que sin ella (Figura 5A, pista 1 comparada con la pista 2); la razón podía ser que o bien la APP extraída de cultivos inhibidos se automodificaba menos (se cree que la automodificación inhibe la actividad de PARP) o que la NAD^{+} marcada era utilizada por la enzima del cultivo no inhibido para la extensión del polímero existente, dando como resultado una menor actividad específica global. En las mismas condiciones de reacción, la poli(ADP-ribosa) sintetizada por PARP humana, sea en tampón de reacción solo o en presencia de un extracto de proteínas de levadura total de DY(pYeDP1/8-2) (Figura 5A, pistas 5 y 6, respectivamente), exhibía cadenas mucho más largas, posiblemente hasta un 400-mero (de Murcia y Ménissier de Murcia, 1994).

La estimulación de la actividad enzimática por DNA mellado es una propiedad bien conocida de la PARP de los animales (Álvarez-González y Althaus, 1989). Por esta razón, los inventores testaron si la actividad de la proteína APP era dependiente de DNA. Después de la eliminación de los ácidos nucleicos de la levadura (DNA, RNA) y algunas proteínas básicas del extracto de proteínas DY(pV8SPA) cultivado en galactosa, se analizó la síntesis de poli(ADP-ribosa) en presencia de concentraciones crecientes de DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos. Como puede verse en la figura 5B, había una correlación directa entre la cantidad de DNA presente en la reacción y la incorporación de ^{32}P-NAD^{+}. El escaneo de las imágenes fosforescentes indicó que se incorporaba seis veces más radiactividad en la poli(ADP-ribosa) en la mezcla de reacción que contenía 40 \mug ml^{-1} de DNA que en la que contenía 2 \mug ml^{-1} de DNA (Figura 5B, pistas 4 y 2, respectivamente). La síntesis del polímero era sensible a 3ABA en la mezcla de reacción (Figura 5B, pista 5).

APP es una proteína nuclear

En las células animales, la actividad de PARP está localizada en el núcleo (Schreiber et al., 1992). La localización intracelular, en el caso de ser nuclear, de APP podría proporcionar un estímulo adicional importante de que APP es una PARP vegetal auténtica. A este fin, la localización de los polipéptidos APP en células de levadura se analizó utilizando antisueros anti-APP. El polipéptido APP sintetizado en levadura cultivada sobre galactosa se encontraba principalmente en el núcleo. Esta localización no se veía afectada por la presencia en el medio de los inhibidores de PARP.

Adicionalmente, se testó si la APP era constitutivamente activa en células de levadura, como ha sido consignado para la PARP humana (Collinge y Althaus, 1994). En este caso, se incubaron esferoplastos de levadura fijos con el anticuerpo monoclonal 10H, que reconoce específicamente los polímeros de poli(ADP-ribosa) (Kawamitsu et al., 1984). Se localizó una señal de fluorescencia amarillenta-verde positiva con el anticuerpo 10H en el núcleo y se observó únicamente en células DY(pV8SPA) cultivadas en galactosa. La tinción positiva se reducía notablemente en las células cultivadas en presencia de los inhibidores de PARP, 3ABA y nicotinamida.

Para identificar la localización intracelular de APP en células vegetales, se utilizó un método ampliamente adoptado en estudios de plantas, a saber, el examen de la localización subcelular de una proteína de fusión formada entre la proteína en cuestión y un gen informador, una vez que se produjo la fusión proteínica en plantas transgénicas o células transfectadas (Citovsky et al., 1994; Sakamoto y Nagatani, 1996; Terzaghi et al., 1997; von Arnim y Deng, 1994). Se realizó una fusión traduccional en el terminal N de GUS con la parte del polipéptido APP que se extendía desde Met^{1} a Pro^{407}. La fusión traduccional de APP con GUS bacteriano se construyó como sigue. Se cortó el plásmido pETSPA con SmaI, se trató con fosfatasa alcalina, y se ligó a un fragmento romo NcoI-XbaI de pGUS1 (Plant Genetic Systems N.V., Gante, Bélgica). La mezcla de ligación se transformó en E. coli XL-1 y las células se extendieron en placas sobre medio LB suplementado con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido 0,1 mM, 40 \mug ml^{-1} de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónido, y 100 \mug ml^{-1} de ampicilina. De este modo, se seleccionó pETSPAGUS como colonias azules. La expresión en E. coli de la proteína de fusión de \sim110 kDa se confirmó por medio de geles de actividad GUS in situ (Lee et al., 1995). La fusión APP-GUS se puso bajo el control del promotor 35S del CaMV (el fragmento BamHI hecho romo con Klenow de pETSPAGUS se subclonó en pJD330 digerido con SmaI; Gallie y Walbot, 1992) y la casete de expresión resultante se subclonó como un fragmento XbaI en el sitio XbaI del vector binario pCGN1547 (McBride y Summerfelt, 1990) para dar pGCNSPAGUS. El pGCNSPAGUS se introdujo finalmente en A. tumefaciens C58C1Rif® (pGV2260) por el procedimiento de transformación congelación-descongelación.

La expresión de la proteína de fusión se verificó en E. coli. El cDNA quimérico bajo el control del promotor 35S CaMV se integró de manera estable en el genoma del tabaco. La progenie de 4 plantas transgénicas independientes de tabaco se analizó respecto a la distribución subcelular de la actividad de GUS después de tinción histoquímica in situ (Jefferson et al., 1987). En plantas de semillero de dos días de edad pudo detectarse la actividad de GUS en los cotiledones y en las raíces, pero no en los hipocótilos o los ápices de la raíz. Debido a la transparencia de los tejidos de la raíz, la tinción de GUS se localizaba claramente en los núcleos de los pelos radiculares y las células epidérmicas. Adicionalmente, se observó cierta tinción difusa, no localizada de otras células de las raíces, en particular a lo largo de los cilindros vasculares. Esta tinción no nuclear de GUS era más pronunciada en los tejidos de las hojas. Mientras que las hojas jóvenes verdaderas o cotiledones exhibían una tinción azul intensa de los núcleos, se apreciaba también cierta tinción difusa del citoplasma. En las hojas completamente expandidas, sin embargo, la tinción de GUS se hacía homogénea y similar a la tinción de plantas de control transformadas con GUS bajo el control del promotor 35S de CaMV, en el cual se expresaba GUS en el citoplasma. Eventualmente, las hojas más viejas o los cotiledones no exhibían prácticamente actividad alguna de GUS detectable histoquímicamente, con la excepción de los haces vasculares, donde la tinción de GUS no podía confinarse a ningún compartimiento particular de las células.

La deficiencia en DNA-ligasa I induce la expresión del gen app

La PARP en las células animales es una de las proteínas nucleares más abundantes y su actividad está regulada por cambios alostéricos en la proteína después de fijación al DNA deteriorado. Los inventores encontraron que el gen app en Arabidopsis tenía un nivel de expresión más bien bajo, lo que sugería que la activación transcripcional de este gen podría ser esencial para la función de APP in vivo. Para testar esta hipótesis, se estudió la expresión del gen app durante la desestabilización del genoma in vivo causada por una deficiencia en DNA-ligasa I. Se aisló previamente una mutación por inserción de T-DNA, línea SK1B2, en el gen de DNA-ligasa I de Arabidopsis (Babiychuk et al., 1997). La mutación es letal en el estado homocigótico, pero el alelo mutante exhibe una transmisión normal en los gametos. Por esta razón, los inventores esperaban que las células homocigóticas para la mutación murieran debido a una síntesis incompleta del DNA durante la fase S del ciclo celular, poco después de la fertilización del saco embrionario mutante con polen mutante. Se construyó una fusión de traducción promotor app-GUS, en la cual la región codificante de GUS estaba fusionada en marco con los cinco primeros aminoácidos de APP y 2 kb de secuencias flanqueantes app 5' (SEQ ID No 21). El gen codificante de la proteína de fusión se transformó en Arabidopsis. Después de dos retrocruzamientos a un tipo salvaje, las plantas heterocigóticas transformadas con el promotor app-GUS se cruzaron con la línea SK1 B2 de Arabidopsis. Las inflorescencias de las plantas de control y las plantas heterocigóticas para la mutación de ligasa se teñían por la actividad de GUS. El patrón de tinción GUS detectado principalmente en los tejidos de envejecimiento refleja probablemente la expresión del gen app, aunque no se tiene evidencia firme alguna de que la totalidad de las secuencias reguladoras estuvieran presentes en los constructos utilizados. Este patrón era el mismo tanto en las inflorescencias de las plantas de control, que no llevaban el gen mutante de ligasa como en las plantas heterocigóticas para una mutación. Aproximadamente la cuarta parte de los óvulos en las plantas mutantes con la proteína de fusión son GUS-positivos. El examen microscópico más próximo demostró que en los óvulos GUS-positivos únicamente se teñía el gametofito. La única diferencia entre las plantas de control y la planta mutante era una mutación en el gen de DNA-ligasa. Por esta razón, los inventores han llegado a la conclusión de que el gen app es inducido, debido o bien a la acumulación de roturas del DNA, o a la muerte de los sacos embrionarios mutantes fertilizados con polen mutante. Se encontró que la tinción GUS de los sacos embrionarios aparece dentro de las 24 horas después de la polinización, o por consiguiente muy pronto después de la fertilización.

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Ejemplo 3

Construcción de genes quiméricos moduladores de la PCD e introducción de los vectores T-DNA que comprenden tales genes moduladores de la PCD en una cepa de Agrobacterium 3.1. Construcción de los genes p35S:(dsRNA-APP) y p35S:(dsRNA-ZAP)

Utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, se enlazan operativamente las regiones de DNA siguientes, como se reseña esquemáticamente en la Figura 6 (constructos 1 y 5): Para el gen quimérico p35S:(dsRNA-ZAP)

\bullet

una región promotora de CaMV 35S (Odell et al., 1985)

\bullet

una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de ZAP (aproximadamente completa) (el homólogo de Arabidopsis thaliana a SEQ ID No 10, aislado por hibridación)

\bullet

aproximadamente 500 pb del extremo 5' de la región de DNA codificante de ZAP2 en orientación inversa

\bullet

una región extrema 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990)

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Para el gen quimérico p35S:(dsRNA-APP)

\bullet

una región promotora de CaMV 35S (Odell et al., 1985)

\bullet

una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de APP (aproximadamente completa) (SEQ ID No 5)

\bullet

aproximadamente 500 pb del extremo 5' de la región de DNA codificante de APP en orientación inversa

\bullet

una región extrema 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990)

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3.2. Construcción de los genes pNOS:(dsRNA-APP) y pNOS:(dsRNA-ZAP)

Utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, se enlazan operativamente las regiones de DNA siguientes, como se reseña esquemáticamente en la Figura 6 (constructos 2 y 6): Para el gen quimérico pNOS:(dsRNA-ZAP)

\bullet

una región promotora NOS (Herrera-Estrella et al., 1983)

\bullet

una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de ZAP (aproximadamente completa) (el homólogo de Arabidopsis thaliana a SEQ ID No 10, aislado por hibridación)

\bullet

aproximadamente 500 pb del extremo 5' de la región de DNA codificante de ZAP2 en orientación inversa

\bullet

una región extrema 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990)

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Para el gen quimérico pNOS:(dsRNA-APP)

\bullet

una región promotora NOS (Herrera-Estrella et al., 1983)

\bullet

una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de APP (aproximadamente completa) (SEQ ID No 5)

\bullet

aproximadamente 500 pb del extremo 5' de la región de DNA codificante de APP en orientación inversa

\bullet

una región extrema 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990)

\newpage

3.3. Construcción de los genes pTA29:(dsRNA-APP) y pTA29:(dsRNA-ZAP)

Utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, se enlazan operativamente las regiones de DNA siguientes, como se reseña esquemáticamente en la Figura 6 (constructos 3 y 7):

Para el gen quimérico pTA29:(dsRNA-ZAP)

\bullet

una región promotora TA29 (WO 89/10396)

\bullet

una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de ZAP (aproximadamente completa) (el homólogo de Arabidopsis thaliana a SEQ ID No 10, aislado por hibridación)

\bullet

aproximadamente 500 pb del extremo 5' de la región de DNA codificante de ZAP2 en orientación inversa

\bullet

una región extrema 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990)

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Para el gen quimérico pTA29:(dsRNA-APP)

\bullet

una región promotora TA29 (WO 89/10396)

\bullet

una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de APP (aproximadamente completa) (SEQ ID No 5)

\bullet

aproximadamente 500 pb del extremo 5' de la región de DNA codificante de APP en orientación inversa

\bullet

una región extrema 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990)

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3.4. Construcción de los genes pNTP303:(dsRNA-APP) y pNTP303:(dsRNA-ZAP)

Utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, se enlazan operativamente las regiones de DNA siguientes, como se reseña esquemáticamente en la Figura 6 (constructos 4 y 8):

Para el gen quimérico pNTP303:(dsRNA-ZAP)

\bullet

una región promotora NTP303 (Wetering 1994)

\bullet

una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de ZAP (aproximadamente completa) (el homólogo de Arabidopsis thaliana a SEQ ID No 10, aislado por hibridación)

\bullet

aproximadamente 500 pb del extremo 5' de la región de DNA codificante de ZAP2 en orientación inversa

\bullet

una región extrema 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990)

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Para el gen quimérico pNTP303:(dsRNA-APP)

\bullet

una región promotora NTP303(Wetering 1994)

\bullet

una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de APP (aproximadamente completa) (SEQ ID No 5)

\bullet

aproximadamente 500 pb del extremo 5' de la región de DNA codificante de APP en orientación inversa

\bullet

una región extrema 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990)

\newpage

3.5. Construcción de los genes marcadores quiméricos

Utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, se enlazan operativamente las regiones de DNA siguientes, como se reseña esquemáticamente en la Figura 6:

Para el gen marcador gat

\bullet

una región promotora Act2 (An et al., 1996)

\bullet

un DNA codificante de aminoglicosido-6'-acetil-transferasa (WO 94/26913)

\bullet

una región del extremo 3' de un gen de nopalina-sintasa (Depicker et al., 1982)

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Para el gen marcador BAR

\bullet

una región promotora Act2 (An et al., 1996)

\bullet

un DNA codificante de fosfinotricin-acetil-transferasa (US 5.646.024)

\bullet

una región del extremo 3' de un gen de nopalina-sintasa (Depicker et al., 1982)

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3.6. Construcción de los vectores T-DNA que comprenden los genes quiméricos moduladores de la PCD

Utilizando enzimas de restricción apropiadas, se cortan los genes moduladores quiméricos PCD descritos en 3.1 a 3.5 y se introducen en el polienlazador entre los bordes de T-DNA de un vector de T-DNA derivado de pGSV5 (WO 97/13865) junto con el gen marcador gat o el gen marcador bar. Los vectores T-DNA resultantes se representan esquemáticamente en la Figura 6.

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3.7. Introducción de los vectores T-DNA en Agrobacterium

Los vectores T-DNA se introducen en Agrobacterium tumefaciens C58C1 Rif(pGV4000) por electroporación como ha sido descrito por Walkerpeach y Velten (1995) y se seleccionan los transformantes utilizando espectinomicina y estreptomicina.

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Ejemplo 4

Transformación de Arabidopsis thaliana mediada por Agrobacterium con los vectores T-DNA del Ejemplo 3

Se utilizan las cepas de Agrobacterium para transformar Arabidopsis thaliana var.C24 aplicando el método de transformación de las raíces como ha sido descrito por Valvekens et al. (1992). Los explantes se coinfectan con las cepas de Agrobacteria que contienen respectivamente los constructos dsRNA-APP o dsRNA-ZAP. Los constructos dsRNA-APP se utilizan en combinación con el gen pact:bar. Los constructos dsRNA-ZAP se utilizan en combinación con el gen pact-gat. Se seleccionan transformantes respecto a resistencia a la fosfinotricina. Las líneas transgénicas regeneradas y enraizadas se testan respecto a la presencia del otro T-DNA por cribado respecto a resistencia a la kanamicina. Las líneas transgénicas que contienen ambos T-DNA's se transfieren al invernadero. Se registra el fenotipo de las líneas transgénicas T0 y las generaciones T1 se estudian ulteriormente con mayor detalle.

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Ejemplo 5

Transformación de Brassica napus mediada por Agrobacterium con los vectores T-DNA del Ejemplo 3

Se utilizan las cepas de Agrobacterium para transformar la variedad N90-740 de Brassica napus aplicando el método de transformación del hipocótilo esencialmente como ha sido descrito por De Block et al. (1989), excepto en lo que respecta a las modificaciones siguientes:

-

\vtcortauna Se precultivan explantes de hipocótilo durante un día en medio A2 [MS, 0,5 g/l de Mes (pH 5,7), 1,2% de glucosa, 0,5% de agarosa, 1 mg/l de 2,4-D, 0,25 mg/l de ácido naftalenoacético (NAA) y 1 mg/l de 6-bencilaminopurina (BAP)].

-

\vtcortauna El medio de infección A3 es MS, 0,5 g/l de Mes (pH 5,7), 1,2% de glucosa, 0,1 mg/l de NAA, 0,75 mg/l de BAP y 0,01 mg/l de ácido gibberélico (GA3).

\newpage

-

\vtcortauna El medio de selección A5G es MS, 0,5 g/l de Mes (pH 5,7), 1,2% de glucosa, 40 mg/l de adenina.SO_{4}, 0,5 g/l de polivinilpirrolidona (PVP), 0,5% de agarosa, 0,1 mg/l de NAA, 0,75 mg/l de BAP, 0,01 mg/l de GA3, 250 mg/l de carbenicilina, 350 mg/l de triacilina, 5 mg/l de AgNO_{3} durante 3 semanas. Después de este periodo, se continúa la selección en medio A5J (similar a A5G pero con 3% de sacarosa)

-

\vtcortauna El medio de regeneración A6 es MS, 0,5 g/l de Mes (pH 5,7), 2% de sacarosa, 40 mg/l de adenina.SO_{4}, 0,5 g/l de PVP, 0,5% agarosa, 0,0025 mg/l de BAP y 250 mg/l de triacilina.

-

\vtcortauna Se transfieren brotes sanos a un medio de enraizado que era A9: MS semiconcentrado, 1,5% de sacarosa (pH 5,8), 100 mg/l de triacilina, 0,6% de agar en recipientes de 1 litro. MS significa medio de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962).

Para la introducción de ambos constructos dsRNA-APP y dsRNA-ZAP de T-DNA en una misma célula vegetal, se aplica el método de co-transformación, especialmente como ha sido descrito por De Block y Debrouwer (1991). Se seleccionan líneas de plantas transformadas en un medio que contiene fosfinotricina, después de lo cual se escruta la presencia del segundo T-DNA por testado de los brotes enraizados regenerados respecto a resistencia a la kanamicina. En los experimentos de co-transformación, se utilizan los constructos dsRNA-APP en combinación con el gen pact:bar. Los constructos dsRNA-ZAP se utilizan en combinación con el gen pact-gat. Las líneas transgénicas que contienen ambos T-DNA's se transfieren al invernadero. Se registra El fenotipo de las líneas transgénicas T0 y las generaciones T1 se estudian ulteriormente con mayor detalle.

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Ejemplo 6

Ensayo in vitro para testar el vigor de las líneas de plantas 6.1. Ensayo de aptitud para Brassica napus Medios y tampones de reacción

Medio de siembra:

Sales de Murashige y Skoog semiconcentradas

2% de sacarosa

pH 5,8

0,6% de agar

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Medio de inducción de callo: A2S

Medio MS, 0,5 g/l de Mes (pH 5,8), 3% de sacarosa, 40 mg/l de adenina-SO_{4}, 0,5% de agarosa, 1 mg/l de 2,4-O, 0,25 mg/l de NAA, 1 mg/l de BAP

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Medio de incubación:

Tampón de fosfato K 25 mM, pH 5,8

Sacarosa al 2%

1 gota de Tween 20 para 25 ml de medio

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Tampón de reacción:

Tampón de fosfato K 50 mM, pH 7,4

Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio 10 mM (TTC) (= 3,35 mg/ml)

1 gota de Tween 20 para 25 ml de tampón

\newpage

Esterilización de las semillas y crecimiento de las plantas jóvenes

Se empapan las semillas en etanol al 70% durante 2 min, se esterilizan luego superficialmente durante 15 min en una solución de hipoclorito de sodio (con aproximadamente 6% de cloro activo) que contiene 0,1% de Tween 20. Finalmente, se lavan las semillas con 1 l de agua destilada estéril. Se ponen 7 semillas/recipiente de 1 l (Weck) que contiene aproximadamente 75 ml de medio de siembra. Se dejan germinar las semillas a 23ºC y 30 \muEinstein/s^{-1}m^{-2} con un periodo de luz de 16 h.

La línea N90-740 se incluye siempre para estandarización entre los experimentos.

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Precultivo de los explantes de hipocótilo

-

\vtcortauna 12-14 días después de la siembra, se cortan los hipocótilos en segmentos de aproximadamente 7 mm. 25 hipocótilos por cápsula Petri Optilux (Falcon S1005)

-

\vtcortauna Los explantes de hipocótilos se cultivan durante 4 días en medio A2S a 23-25ºC (a 30 \muEinstein/s^{-1}m^{-2}).

\quad

\Box P.S.: son necesarios aproximadamente 150-300 explantes de hipocótilo/línea para la realización del ensayo

-

\vtcortauna Se transfieren los explantes de hipocótilos a cápsulas Petri Optilux (Falcon S1005) que contienen 30 ml de medio de incubación.

-

\vtcortauna Se incuba durante aproximadamente 20 horas a 24ºC en la oscuridad.

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Ensayo TTC

-

\vtcortauna Se transfieren 150 explantes de hipocótilo a un tubo Falcon de 50 ml.

-

\vtcortauna Se lava con tampón de reacción (sin TTC).

-

\vtcortauna Se añaden 25 ml-30 ml de tampón de reacción/tubo.

\quad

\Box no se añadió cantidad alguna de TTC al tubo 1.

\quad

\text{*} para la medida de la absorción de fondo

\quad

\text{*} es suficiente una línea/experimento

\quad

Tubo 2 \Box + TTC 10 mM

\quad

(los explantes tienen que estar sumergidos, pero no se infiltran a vacío!)

-

\vtcortauna Se invierten los tubos

-

\vtcortauna Se incuba durante aproximadamente 1 hora en la oscuridad a 26ºC (la reacción no termina!)

-

\vtcortauna Se lavan los hipocótilos con agua desionizada

-

\vtcortauna Se elimina el agua

-

\vtcortauna Se congela a -70ºC durante 30 min

-

\vtcortauna Se descongela a la temperatura ambiente (en la oscuridad)

-

\vtcortauna Se añaden 50 ml de etanol (industrial)

-

\vtcortauna Se extrae el TTC-H reducido por agitación mediante sacudidas durante 1 hora

-

\vtcortauna Se miden las absorciones de los extractos a 485 nm

\quad

P.S.: el TTC-H reducido no es estable \Box se mantiene en la oscuridad y se mide D.O._{485} lo antes posible

O.D._{485 \ (TTC-H)} = (O.D._{485} + TTC) – (O.D._{485} -TTC)

-

\vtcortauna La comparación de las capacidades de reducción de TTC entre muestras de experimentos independientes diferentes puede hacerse por ajuste de la capacidad de reducción de TTC de N90-740 en los diferentes experimentos hasta 100%.

-

\vtcortauna Las líneas con una capacidad reductora de TTC alta son vigorosas, mientras que las líneas con una capacidad reductora de TTC baja son débiles.

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6.2. Ensayo de aptitud de Arabidopsis Medios y tampones de reacción

Medio de plantas: sales de Murashige y Skoog semiconcentradas

Sacarosa al 1,5%

pH 5,8

Agar al 0,6%

\rightarrow Autoclave 15 min.

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Se añade 100 mg/l de mio-inositol esterilizado por filtración

-

0,5 mg/l de piridoxina

-

0,5 mg/l de ácido nicotínico

-

1 mg/l de tiamina

\vskip1.000000\baselineskip

Medio de incubación:

Tampón de fosfato K 10 mM, pH 5,8

Sacarosa al 2%

1 gota de Tween 20 para 25 ml de medio

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón de reacción:

Tampón de fosfato K 50 mM, pH 7,4

Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio 10 mM (TTC) (= 3,35 mg/ml)

1 gota de Tween 20 por 25 ml de tampón

\vskip1.000000\baselineskip

Plantas de Arabidopsis

-

\vtcortauna Esterilización de las semillas de Arabidopsis

\quad

2 min en etanol al 70%

\quad

10 min de lejía (6% de cloro activo) + 1 gota de Tween 20 para 20 ml de solución, lavado 5 veces con agua estéril

\quad

P.S.: la esterilización se realiza en tubos Eppendorf de 2 ml, con las semillas de Arabidopsis sumergidas en el fondo del tubo, permitiendo la eliminación de los líquidos por medio de una pipeta de 1 ml

-

\vtcortauna Cultivo de las plantas de Arabidopsis

\quad

Las semillas se siembran en "discos de Cultivo de Tejidos Intergrid de Falcon" (nº 3025) que contienen \pm100 ml de medio vegetal (una semilla/cuadrícula).

\newpage

\quad

Las plantas se cultivan a 23ºC

\quad

40 \muEinstein s^{-1}m^{-2}

\quad

16 horas luz-8 horas oscuridad

\quad

durante aproximadamente 3 semanas (las plantas comienzan a formar capullos)

\quad

\rightarrow P.S.: * se necesitan aproximadamente 90-110 plantas/línea para llevar a cabo el ensayo

\quad

\text{*} Se incluye una línea de control (C24; Columbia; ...) para calibración.

\vskip1.000000\baselineskip

Preincubación

-

\vtcortauna Se cosechan los brotes de Arabidopsis por corte de las raíces (mediante tijeras). Se pone cada brote inmediatamente en medio de incubación (los brotes tienen que estar sumergidos, pero sin infiltración a vacío)

\quad

Medio de incubación: \pm150 ml en "discos de Cultivo de Tejidos Intergrid de Falcon" (nº 3025)

a)

Medio de incubación: para cuantificación de la absorción del sustrato (véase el ensayo TTC)

b)

Medio de incubación

c)

Medio de incubación + niacinamida 2 mM

\quad

30-35 brotes/cápsula Petri (pero la misma cantidad de brotes para todas las líneas y para cada condición)

-

\vtcortauna Se incuba a 24ºC en la oscuridad durante \pm20 horas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayo TTC

-

\vtcortauna Se transfieren los brotes a tubos Falcon de 50 ml

-

\vtcortauna Se lava con tampón de reacción (sin TTC)

-

\vtcortauna Se añaden 30-35 ml de tampón de reacción/tubo

a)

sin TTC añadida (para medida de la absorción de fondo)

b y c) +TTC 10 mM

\quad

(los brotes tienen que estar sumergidos, pero sin infiltración a vacío!)

-

\vtcortauna Se incuban durante aproximadamente 2 horas en la oscuridad a 26ºC (sin terminar la reacción!)

-

\vtcortauna Se lavan los brotes con agua desionizada

-

\vtcortauna Se elimina el agua

-

\vtcortauna Se congela a -70ºC durante 30 min

-

\vtcortauna Se descongela a la temperatura ambiente (en la oscuridad)

-

\vtcortauna Se añaden 50 ml de etanol (industrial)

-

\vtcortauna Se extrae el TTC-H reducido por agitación mediante sacudidas durante 1 hora

-

\vtcortauna Se miden las absorciones de los extractos a 485 nm

\quad

P.S.: el TTC-H reducido no es estable \rightarrow mantener en la oscuridad y medir D.O._{485} lo antes posible

-

\vtcortauna Se comparan los perfiles de reducción de las líneas testadas frente a la línea de control (para población de 30 a 35 plantas)

O.D._{485 \ (TTC-H)} = (O.D._{485} + TTC) – (O.D._{485} -TTC)

-

\vtcortauna La comparación de las capacidades de reducción de TTC entre muestras de experimentos independientes diferentes puede hacerse por ajuste de la capacidad reductora de TTC de la línea de control (C24; Columbia; ...) en los diferentes experimentos a 100%.

-

\vtcortauna Las líneas con una capacidad de reducción de TTC alta son vigorosas, mientras que las líneas con una capacidad de reducción de TTC baja son débiles.

-

\vtcortauna Si la adición de niacinamida al medio de incubación da como resultado una mayor capacidad de reducción de TTC, ello indica una aptitud menor (como se muestra para C24 y Columbia)

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Ejemplo 7

Análisis fenotípicos de las líneas transgénicas que contienen a la vez los constructos dsRNA-APP y dsRNA-ZAP

Se registraron el fenotipo de la flor y la viabilidad del polen (tinción de Alexander (Alexander, 1969) y ensayo de germinación) de las líneas T0 que contenían dsRNA-APP y dsRNA-ZAP bajo el control de promotores específicos de tapete o de polen. Para Arabidopsis, la generación T1 se obtiene por autopolinización o, si las plantas son estériles masculinas, por retrocruzamiento utilizando polen de plantas de tipo salvaje no transformadas. Para Brassica napus, la generación T1 se obtiene siempre por retrocruzamiento utilizando polen de plantas no transfor-
madas.

La semilla T1 se deja germinar sobre medio que contiene kanamicina, después de lo cual las plantas resistentes se registran por medio del ensayo de multipocillos de amonio para resistencia a la fosfinotricina (De Block et al., 1995). Una mitad de las plantas que contiene ambos T-DNA's se transfiere al invernadero para registrar la fertilidad masculina de las plantas, mientras que la otra mitad se utiliza para cuantificar el vigor de las plantas por medio del ensayo de aptitud.

Para las plantas que comprenden combinaciones (APP/ZAP) de genes moduladores de la PCD bajo control del promotor 35S o NOS, se observa un vigor elevado en varias de las líneas transgénicas.

Para las plantas que comprenden combinaciones (APP/ZAP) de los genes moduladores de la PCD bajo control de TA29, se observa esterilidad masculina en varias de las líneas transgénicas.

Para las plantas que comprenden combinaciones (APP/ZAP) de los genes moduladores de la PCD bajo control de NTP303, se observa polen estéril en varias de las líneas transgénicas.

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Ejemplo 8

Análisis fenotípico de plantas que comprenden un gen quimérico modulador de la PCD

Se construyó otro ejemplo de un gen quimérico p35S::(dsRNA-ZAP) utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, enlazando operativamente las regiones de DNA siguientes:

\bullet

una región promotora CaMV35S2 (Odell et al., 1985)

\bullet

un DNA codificante de una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de ZAP2 de Zea mays desde el sitio HincII al sitio SnaBI que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 10 desde el nucleótido de la posición 279 al nucleótido de la posición 1728

\bullet

el extremo 5' de la región codificante de ZAP2 desde el sitio HincII al sitio EcoRV en orientación inversa (que tiene el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 10 desde el nucleótido de la posición 279 al nucleótido de la posición 792)

\bullet

una región del extremo 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990).

Este gen quimérico se introdujo en el polienlazador entre los bordes de T-DNA de un vector de T-DNA derivado de pGSV5 (descrito en WO 97/13865) junto con el gen marcador bar, y produce el vector de T-DNA pTYG33, que se introdujo en Agrobacterium C58C1 Rif (pGV4000) por electroporación como se ha descrito.

Se construyó otro ejemplo de un gen quimérico pNos::(dsRNA-ZAP) utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, por enlace operativo de las regiones de DNA siguientes:

\bullet

una región promotora de nopalina-sintasa (Herrera-Estrella et al., 1985)

\bullet

un DNA codificante de una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\newpage

\bullet

una región de DNA codificante de ZAP2 de Zea mays desde el sitio HincII al sitio SnaBI que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 10 desde el nucleótido de la posición 279 al nucleótido de la posición 1728

\bullet

el extremo 5' de la región codificante de ZAP2 desde el sitio HincII al sitio EcoRV en orientación inversa (que tiene el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 10 desde el nucleótido de la posición 279 al nucleótido de la posición 792)

\bullet

una región del extremo 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990).

Este gen quimérico se introdujo en el polienlazador entre los bordes de T-DNA de un vector de T-DNA derivado de pGSV5 (descrito en WO 97/13865) junto con el gen marcador bar, y produce el vector de T-DNA pTYG34, que se introdujo en Agrobacterium C58C1 Rif (pGV4000) por electroporación como se ha descrito.

Se construyó otro ejemplo de un gen quimérico p35S::(dsRNA-APP) utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, por enlace operativo de las regiones de DNA siguientes:

\bullet

una región promotora CaMV35S2 (Odell et al., 1985)

\bullet

un DNA codificante de una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de APP de Arabidopsis thaliana desde el sitio ScaI al sitio SmaI que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el nucleótido de la posición 189 al nucleótido de la posición 1349

\bullet

el extremo 5' de la región codificante de ZAP2 desde el sitio ScaI al sitio HaeIII en orientación inversa (que tiene el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el nucleótido de la posición 189 al nucleótido de la posición 784)

\bullet

una región del extremo 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990).

Este gen quimérico se introdujo en el polienlazador entre los bordes de T-DNA de un vector de T-DNA derivado de pGSV5 (descrito en WO 97/13865) junto con el gen marcador bar, y produce el vector de T-DNA pTYG29, que se introdujo en Agrobacterium C58C1 Rif (pGV4000) por electroporación como se ha descrito.

Se construyó otro ejemplo de un gen quimérico pNos::(dsRNA-APP) utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante, por enlace operativo de las regiones de DNA siguientes:

\bullet

una región promotora de nopalina-sintasa (Herrera-Estrella et al., 1985)

\bullet

un DNA codificante de una región conductora Cab 22 (Harpster et al., 1988)

\bullet

una región de DNA codificante de APP de Arabidopsis thaliana desde el sitio ScaI al sitio SmaBI que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el nucleótido de la posición 189 al nucleótido de la posición 1349

\bullet

el extremo 5' de la región codificante de ZAP2 desde el sitio ScaI al sitio HaeIII en orientación inversa (que tiene el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el nucleótido de la posición 189 al nucleótido de la posición 784)

\bullet

una región del extremo 3' de CaMV35S (Mogen et al., 1990).

Este gen quimérico se introdujo en el polienlazador entre los bordes de T-DNA de un vector de T-DNA derivado de pGSV5 (descrito en WO 97/13865) junto con el gen marcador bar, y produce el vector de T-DNA pTYG30, que se introdujo en Agrobacterium C58C1 Rif (pGV4000) por electroporación como se ha descrito.

Las cepas de Agrobacterium resultantes se utilizaron para introducir los diferentes genes moduladores de la PCD por separado en Brassica napus y Arabidopsis thaliana (Columbia y C24) como se describe en los Ejemplos 4 y 5.

Las plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana obtenidas por autopolinización de la generación T0 (generación T1) se dejaron germinar en medio que contenía fosfinotricina. Las plantas transgénicas resistentes se cultivaron ulteriormente.

El crecimiento de las plantas transgénicas T1 (derivadas tanto de Columbia como de C24) que comprendían un constructo pNOS::(dsRNA-ZAP) como en pTYG33 o un constructo p35S::(dsRNA-ZAP) como en pTYG34, era significativamente más rápido que el de las plantas transgénicas de control transformadas por el T-DNA o el vector de T-DNA sin gen quimérico modulador de la PCD (véase la Tabla 1).

La tolerancia al estrés de las plantas transgénicas de Arabidopsis T1 (derivadas de Columbia) se evaluó dejando en flotación pequeñas plantas sobre una solución de ácido salicílico de 10 ó 50 mg/l o, para control, simplemente sobre agua. Las plantas sensibles al estrés desarrollaban hojas blanqueadas y retorcidas al cabo de 1 a 2 días de incubación, mientras que las plantas tolerantes al estrés se mantenían intactas durante al menos 5 días. Nuevamente, las plantas transgénicas que comprendían un constructo pNOS::(dsRNA-ZAP) como en pTYG33 o un constructo p35S::(dsRNA-ZAP) como en pTYG34, eran significativamente más tolerantes al estrés que las plantas transgénicas de control (véase Tabla 1).

El callo transgénico resistente a PPT obtenido a partir de Brassica napus transformada por los constructos dsRNA-ZAP o dsRNA-APP de pTYG29, pTYG30, pTYG33 o pTYG34, se incubó en un medio que contenía 50 mg/l de aspirina durante 2 días. Después de 2 días, se determinó el peso de los callos y se transfirieron los callos a un medio sin aspirina y se incubaron luego durante 5 días más. Al final del periodo de 5 días, se determinó el peso de los callos, y el aumento de peso se expresó como porcentaje del peso después del periodo de incubación de dos días. Como control, se tomó un callo transgénico transformado por un T-DNA sin un gen quimérico modulador de la PCD por el mismo procedimiento, con la excepción de que no se añadió aspirina durante la incubación de dos días. Los resultados se resumen en la Tabla II e indican que las células de Brassica napus transgénicas que comprenden un gen quimérico modulador de la PCD son más resistentes al estrés que las células de control.

TABLA 1 Evaluación de plantas transgénicas de Arabidopsis (generación T1)

1

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TABLA 2 Recrecimiento de los callos de Brassica transgénica después de incubación en aspirina

2

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<140>

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<210> 1

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<211> 3211

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<212> DNA

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (113)..(3022)

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<400> 1

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4

5

6

7

8

9

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<210> 2

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<211> 969

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 2

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10

11

12

13

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<210> 3

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<211> 2295

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<212> DNA

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (107)..(2068)

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<400> 3

14

15

16

17

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<210> 4

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<211> 653

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 4

18

19

20

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<210> 5

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<211> 2147

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<212> DNA

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CDS

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<222> (129)..(2042)

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<400> 5

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21

22

23

24

25

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<210> 6

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<211> 637

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Dominio A de proteínas PARP no-convencionales

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Dominio A1 de proteína PARP no-convencional

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Dominio A2 de proteína PARP no-convencional

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (81)..(3020)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

32

33

34

35

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 980

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1010

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Proteína de fusión entre el dominio APP N-terminal y la proteína GUS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR degenerado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR degenerado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para uso como Iniciador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para uso en PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para uso en PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para uso en PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para uso en PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para uso en PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4947

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fusión del promotor APP con el gen de beta-glucoronidasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1961)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1962)..(1964)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codón de iniciación de la traducción

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

59

Claims (15)

1. Un método para producir una planta tolerante al estrés, comprendiendo dicho método introducir un gen quimérico en células de dicha planta para obtener células de plantas transgénicas, en donde dicho gen quimérico comprende las regiones de DNA siguientes enlazadas operativamente:

(a)

un promotor expresable en plantas;

(b)

una región de DNA, que cuando se transcribe produce una molécula de RNA, siendo dicha molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, en donde dicha molécula de RNA comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos que tiene 75 a 100% de identidad de secuencia con una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa o el complemento del mismo; y

(c)

una región de DNA implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación; y regenerar una planta a partir de dichas células de plantas transgénicas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho estrés se selecciona de estrés por frío, estrés por sequía o estrés por calor.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho gen quimérico comprende las regiones de DNA siguientes enlazadas operativamente:

a)

un promotor expresable en plantas;

b)

una región de DNA, que cuando se transcribe produce una molécula de RNA, siendo dicha molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa en donde dicha molécula de RNA comprende

i)

una secuencia de nucleótidos de sentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa de dicha planta; y

ii)

una secuencia de nucleótidos antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto al complemento de una secuencia de nucleótidos de dicho gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa de dicha planta;

\quad

siendo dicha secuencia nucleotídica de sentido y dicha secuencia nucleotídica antisentido capaces de combinarse en una región de RNA bicatenario, y

c)

una región de DNA implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho gen quimérico comprende las regiones de DNA siguientes enlazadas operativamente:

a)

un promotor expresable en plantas;

b)

una región de DNA, que cuando se transcribe produce una molécula de RNA, siendo dicha molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa en donde dicha molécula de RNA comprende

i)

una secuencia de nucleótidos de sentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo constituido por una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 4, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 6 y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 11; y

ii)

una secuencia de nucleótidos antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto al complemento de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 4, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 6 y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 11,

\quad

siendo dicha secuencia de nucleótidos de sentido y dicha secuencia de nucleótidos antisentido capaces de combinarse en una región de RNA bicatenario; y

c)

una región de DNA implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.

5. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa comprende

i)

una secuencia de nucleótidos de sentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 3; la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 5 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 10; y

ii)

una secuencia de nucleótidos antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto al complemento de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 3; la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 5 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 10, siendo dicha secuencia de nucleótidos de sentido y dicha secuencia de nucleótidos antisentido capaces de combinarse en una región de RNA bicatenario.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho promotor expresable en plantas es un promotor constitutivo.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionalmente el paso de producir más plantas que comprenden dicho gen quimérico por un esquema de reproducción convencional.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha planta se selecciona del grupo constituido por maíz, colza oleaginosa, lino, trigo, césped, alfalfa, leguminosas, verduras crucíferas, tomate, lechuga, algodón, arroz, cebada, patata, tabaco, remolacha azucarera, girasol, clavellina, rosa, crisantemo y tulipán.

9. Una planta transgénica que exhibe tolerancia incrementada al estrés cuando se compara con una planta de control, comprendiendo dicha planta transgénica en sus células un gen quimérico que comprende las regiones de DNA siguientes enlazadas operativamente:

a)

un promotor expresable en plantas;

b)

una región de DNA, que cuando se transcribe produce una molécula de RNA, siendo dicha molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa en donde dicha molécula de RNA comprende

i)

una secuencia de nucleótidos de sentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa de dicha planta; y

ii)

una secuencia de nucleótidos antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto al complemento de una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, siendo dicha secuencia nucleotídica y dicha secuencia de nucleótidos antisentido capaces de combinarse en una región de RNA bicatenario; y

c)

una región de DNA implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.

10. La planta transgénica de la reivindicación 9, en donde dicho gen quimérico comprende las regiones de DNA siguientes, enlazadas operativamente:

a)

un promotor expresable en plantas;

b)

una región de DNA, que cuando se transcribe produce una molécula de RNA, siendo dicha molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa en donde dicha molécula de RNA comprende

iii)

una secuencia de nucleótidos de sentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 4, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 6 y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 11; y

iv)

una secuencia de nucleótidos antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto al complemento de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 4, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 6 y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 11, siendo dicha secuencia de nucleótidos de sentido y dicha secuencia de nucleótidos antisentido capaces de combinarse en una región de RNA bicatenario; y

c)

una región de DNA implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación.

11. La planta transgénica de la reivindicación 10, en donde dicha molécula de RNA capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa comprende

i)

una secuencia de nucleótidos de sentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 3; la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 5 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 10; y

ii)

una secuencia de nucleótidos antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos con 75% a 100% de identidad de secuencia respecto al complemento de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 1, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 3; la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 5 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No: 10,

\quad

siendo dicha secuencia de nucleótidos de sentido y dicha secuencia de nucleótidos antisentido capaces de combinarse en una región de RNA bicatenario.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicho promotor expresable en plantas es un promotor constitutivo.

13. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde dicha planta se selecciona del grupo constituido por maíz, colza oleaginosa, lino, trigo, césped, alfalfa, leguminosas, verdura crucífera, tomate, lechuga, algodón, arroz, cebada, patata, tabaco, remolacha azucarera, girasol, clavellina, rosa, crisantemo, y tulipán.

14. Una semilla de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende dicho gen quimérico.

15. Uso de una secuencia de nucleótidos de un gen vegetal codificante de poli(ADP-ribosa)-polimerasa o el complemento del mismo para producir una planta tolerante al estrés, por introducción de dicha secuencia de nucleótidos en células de dicha planta, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos o su complemento comprende una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos que tiene 75% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia nucleotídica de 100 nucleótidos de un gen PARP endógeno de dicha planta y es capaz de reducir la expresión de genes endógenos codificantes de poli(ADP-ribosa)-polimerasa.