ES2317711T3

ES2317711T3 - Presentacion molecular de alergenos, metodos de preparacion y uso.

Info

Publication number: ES2317711T3
Application number: ES99972928T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang A. Renner; Frank Hennecke; Lars Nieba; Martin Bachmann
Original assignee: Cytos Biotechnology AG
Current assignee: Cytos Biotechnology AG
Priority date: 1998-11-30
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2019-11-30
Also published as: RU2245163C2; WO2000032227A2; CN100534529C; CN1679932A; DE69939836D1; AU768807B2; CN1193791C; JP2010510960A; IL143441A; CN1333693A; WO2000032227A3; BR9915771A; EP1135162B1; ATE412434T1; PL348452A1; IL143441A0; CA2354183A1; DK1135162T3; US20040136962A1; US7229624B2

Abstract

Una composición, caracterizada porque comprende: a) un andamio molecular que no se origina naturalmente que comprende: (i) una partícula central seleccionada del grupo que consiste en: (1) una partícula central de origen no natural; y (2) una partícula de origen natural; caracterizada porque dicha partícula central comprende una partícula similar a un virus; y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de unión, en donde dicho organizador se conecta a dicha partícula central por al menos un enlace covalente; y b) un determinante antígeno o antigénico con al menos un segundo sitio de unión, dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste en: (i) un sitio de unión que no se origina naturalmente con dicho determinante antígeno o antigénico; y (ii) un sitio de unión de origen natural con dicho determinante antígeno o antigénico, en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no peptídico para dicho primer sitio de unión; y en donde dicho determinante antígeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación para formar un arreglo de antígeno ordenado y repetitivo.

Description

Presentación molecular ordenada de alérgenos, métodos de preparación y uso.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular, virología, inmunología y medicina. La invención proporciona una composición que comprende un arreglo determinante antigénico o antígeno repetitivo y ordenado. La invención también proporciona un proceso para producir un determinante antigénico o antígeno en un arreglo repetitivo y ordenado. El determinante antigénico o antígeno repetitivo y ordenado es empleado en la producción de vacunas para el tratamiento de alergias.

Técnica relacionada

El desarrollo de vacunas para la prevención de afecciones infecciosas ha tenido un impacto más grande en la salud humana que cualquier invención médica. Se estima que son prevenidas alrededor del mundo, tres millones de muertes por la vacunación (Hillemann, Nature Medicine 4:507 (1998)). La estrategia de vacunación más común, el uso de patógenos atenuados (es decir, menos virulentos) u organismos estrechamente relacionados, fue demostrada primero por Edward Jenner en 1796, quien vacunó contra la viruela mediante la administración de un virus de vacuna menos peligroso. Aunque un número de virus atenuados vivos (por ejemplo, sarampión, paperas, rubéola, varicela, adenovirus, polio, gripe) y bacterias (por ejemplo, bacilo Calmette-Guerin (BCG) contra la tuberculosis), son exitosamente administrados por vacunación, existe un riesgo del desarrollo de complicaciones serias relacionadas con la reversión a la virulencia y la infección por el organismo de "vacuna", en particular, en individuos inmunocomprometidos.

El diseño específico de virus atenuados es ahora posible por la tecnología de ADN recombinante (es decir, ingeniería genética) a través de la generación de variantes de supresión o mutación. Por ejemplo, la administración de un Virus de Inmunodeficiencia de Simio diseñado genéticamente (SIV) con una supresión dentro del gen nef, demostró proteger macacos de la infección subsiguiente con una cepa SIV patogénica (Daniel y cols., Science 258:1938-1941 (1992)). Sin embargo, la progresión de síntomas similares como el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) en animales, se refiere a la seguridad alcanzada por el SIV atenuado administrado (Baba y cols., Science 267:1820-1825 (1995)).

Como un enfoque alternativo, los virus o bacterias atenuados pueden ser usados como vehículos para los genes que codifican al antígeno de un patógeno que es considerado también inseguro para ser administrado en una forma atenuada (por ejemplo, Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH). Después de la liberación del gen que codifica al antígeno en el anfitrión, el antígeno es sintetizado in situ. La vaccinia y virus avipox relacionados, se han usado como tales vehículos para varios genes en los estudios clínicos y pre-clínicos para una variedad de afecciones (por ejemplo, Shen y cols., Science 252:440 (1991)). Una desventaja de esta estrategia de vacunación es que no imita a la superficie del virion, debido a que la proteína recombinante se expresa en la superficie de la célula anfitriona. Adicionalmente, las complicaciones pueden desarrollarse en individuos inmunocomprometidos, como se evidencia por las infecciones de vaccinia diseminadas que amenazan la vida Redfield, N. Eng. J. Med. 316:673 (1998)).

Un cuarto enfoque de vacunación involucra el uso de componentes aislados de un patógeno, ya sea purificado a partir del crecimiento del patógeno in vitro (por ejemplo, neuraminidasa o hemaglutinina de la influenza) o después de la expresión heteróloga de una proteína viral única (por ejemplo, antígeno de la superficie de la hepatitis B). Por ejemplo, toxinas mutadas, recombinantes (destoxificadas) usadas para la vacunación contra la difteria, tétanos, cólera y toxinas pertusis (Levine y cols., New generation vaccines, 2nd. Edn., Marcel Dekker, Inc., New York 1997), y proteínas recombinantes de VIH (120 gp y longitud completa de 160 gp), se evaluaron como un medio para inducir los anticuerpos neutralizantes contra el VIH con resultados frustantes (Connor y cols., J. Virol. 72:1552 (1998)).

Recientemente, se obtuvieron resultados prometedores con 160 gp oligomérico soluble, que puede inducir respuestas CTL y estimular anticuerpos los cuales neutralizan la actividad contra VIH-1 asilados (Van Cortt y cols., J. Virol. 71:4319 (1997)). Además, pueden ser usadas las vacunas peptídicas, en las cuales los epítopes de las células T o B conocidos de un antígeno, se acoplan a una molécula portadora diseñada para incrementar la inmunogenecidad del epítope mediante la estimulación de la ayuda de las células T. Sin embargo, un problema significativo con este procedimiento es que se proporciona una respuesta inmune limitada a la proteína como un todo. Sin embargo, las vacunas han sido individualmente diseñadas para haplotipos MHC diferentes. El más serio referente para este tipo de vacuna es que los complejos reconocen anticuerpos antivirales protectivos, estructuras tridimensionales que no pueden ser mimetizadas por los péptidos.

Una estrategia de vacunación más nueva, es el uso de vacunas de ADN (Donnelly y cols., Ann. Rev. Immunol. 15:617 (1997)), la cual puede generar respuestas CTL restringidas a la clase I de MHC (sin el uso de un vector vivo). Este puede proporcionar protección más amplia contra las diferentes cepas de un virus por los epítopes objetivos a partir de las proteínas internas conservadas pertinentes a muchas cepas del mismo virus. Puesto que se produce el antígeno con modificación post-traduccional de mamífero, la conformación y oligomerización es más parecida por ser similar o idéntica a la proteína de tipo nativa producida por la infección viral que a las proteínas químicamente modificadas o recombinantes. Sin embargo, esta distinción puede cambiar por ser una desventaja para la aplicación de antígenos bacterianos, puestos que una modificación post-traduccional no nativa puede resultar en la inmunogenicidad reducida. Además, las proteínas de superficie viral no están altamente organizadas en la ausencia de las proteínas de matriz.

Además de las aplicaciones para la prevención de las afecciones infecciosas, la tecnología de vacunas está ahora siendo utilizada para dirigir problemas inmunes asociados con las alergias. En individuos alérgicos, los anticuerpos del isotipo IgE se producen en una respuesta inmune humoral inapropiada hacia los antígenos particulares (alérgenos). El tratamiento de alergias por la inmunoterapia de alergia, requiere administración semanal de dosis que sucesivamente se incrementan del alérgeno particular durante un periodo de hasta 3-5 años. Presumiblemente, los anticuerpos IgG "de bloqueo", generados, interceptan alérgenos en las secreciones nasales o respiratorias o en membranas antes de que reaccionen con los anticuerpos IgE en las mastocito. Sin embargo, no existe relación constante entre los tituladores de IgG y el alivio de los síntomas. Actualmente, este es un proceso extremadamente costoso y que requiere tiempo, por ser considerado solamente para pacientes con síntomas severos durante un periodo prolongado cada año.

Está bien establecido que la administración de las proteínas purificadas solas, no es usualmente suficiente para estimular una respuesta inmune fuerte; el antígeno aislado generalmente podrá ser dado junto con substancias auxiliadoras llamadas adyuvantes. Dentro de estos adyuvantes, el antígeno administrado es protegido contra la rápida degradación, y el adyuvante proporciona una liberación prolongada a un nivel inferior del antígeno.

Los virus, proteínas aisladas diferentes, inducen respuestas inmunes eficientes y prontas en la ausencia de cualquiera de los adyuvantes, tanto con y sin la ayuda de células T. (Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). A pesar de que los virus que a menudo consisten en unas cuantas proteínas, son capaces de provocar respuestas inmunes mucho más fuertes que sus componentes aislados. Para las respuestas de las células B, se sabe que un factor crucial para la inmunogenicidad de los virus es la repetitividad y orden de los epítopes de la superficie. Muchos virus exhiben una superficie casi cristalina que presentan un arreglo regular de epítopes, los cuales eficientemente reticulan las inmunoglobulinas específicas del epítope en las células B (Bachmann & Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996). Esta reticulación de inmunoglobulinas de la superficie en las células B, es una señal de activación fuerte que directamente induce la progresión del ciclo celular y la producción de los anticuerpos IgM. Además, tales células B provocadas, son capaces de activar a las células auxiliadoras T, las cuales en cambio, inducen una interrupción de la producción del anticuerpo IgM a IgG en las células B y la generación de la memoria de las células B de larga vida - la meta de cualquier vacunación (Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). La estructura viral está aún, ligada a la generación de anticuerpos en afecciones autoinmunes y como una parte de la respuesta natural a los patógenos (véase, Fehr, T., y cols., J. Exp. Med. 185:1785-1792 (1997)). Así, los antígenos en las partículas virales que están organizadas en un arreglo ordenado y repetitivo, son altamente inmunogénicos, puesto que pueden directamente, activar a las células B.

Además de las respuestas de las célula B fuertes, las partículas son también capaces de inducir la generación de una respuesta a las células T citotóxicas, otra arma crucial del sistema inmune. Estas células T citotóxicas son particularmente importantes para la eliminación de virus no citopáticos tales como los virus de la hepatitis B o VIH, y para la erradicación de tumores. Las células T citotóxicas, no reconocen antígenos nativos pero preferentemente reconocen sus productos de degradación en asociación con las moléculas de clase I de MHC (Townsend & Bodmer, Ann. Rev. Immunol. 7:601-624 (1989)). Los macrófagos y las células dendríticas son capaces de tomar y procesar partículas virales exógenas (pero no sus componentes aislados, solubles), y presentan el producto de degradación generado a las células T citotóxicas, conduciendo a su activación y proliferación (Kovacsovics-Bankowski y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4992-4946 (1993); Bachmann y cols., Eur. J. Immunol. 26:2595-2600 (1996)).

Partículas virales como antígenos, presentan dos ventajas sobre sus componentes aislados: (1) Debido a su estructura de superficie altamente repetitiva, son capaces de activar directamente a las células B, conduciendo a tituladores de anticuerpos altos y a memoria de las células B de larga duración; y (2) Partículas virales pero no proteínas solubles, son capaces de inducir una respuesta a la célula T citotóxica, aún, si los virus no son infecciosos y adyuvantes, están ausentes.

Varias nuevas estrategias de vacunas explotan la inmunogenicidad inherente de los virus. Algunos de estos enfoques se centran en la naturaleza particulada de la partícula del virus; por ejemplo, véase Harding, C. V. y Song R., (J. Immunology 153:4925 (1994)), la cual describe una vacuna que consiste en perlillas de látex y antígenos; Kovacsovics-Bankowski, M., y cols., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4942-4946 (1993)), el cual describe una vacuna que consiste en perlillas de óxido de hierro y antígeno; Patente Estadounidense No.:5,334,394 por Kossovsky, N. Y cols., el cual describe partículas centrales revestidas con antígeno; Patente Estadounidense No. 5,871,747, el cual describe partículas de polímeros sintéticas que llevan en la superficie una o más proteínas covalentemente enlazadas a estas; y una partícula central con un revestimiento covalentemente no enlazado, el cual al menos, parcialmente cubre la superficie de dicha partícula central, y al menos, un agente biológicamente activo en contacto con dicha partícula central revestida (véase, por ejemplo, el documento WO/94/15585).

Sin embargo, una desventaja de estos sistemas de mimetismo, es que no son capaces de recrear la presentación ordenada del antígeno encontrado en la superficie viral. Los antígenos acoplados a una superficie en una orientación aleatoria, se encuentran induciendo una respuesta CTL y no solamente respuestas de la célula B débiles. Para una vacuna eficiente, ambas armas del sistema inmune han sido fuertemente activadas, como se describe anteriormente y en Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235 (1997).

En otro ejemplo, los virus recombinantes son utilizados para el suministro de antígeno. Se ha encontrado que los virus del fago filamentosos que contienen un antígeno fusionado a una proteína cápsida son altamente inmunogénicos (véase, Perham R.N., y cols., FEMS Microbiol. Rev. 17:25-31 (1995); Willis y cols., Gene 128:85-88 (1993); Minenkova y cols., Gene 128:85-88 (1993)). Sin embargo, este sistema está limitado a muy pocos péptidos (5 o 6 residuos de aminoácidos), cuando la proteína de fusión se expresa a un nivel alto (Iannolo y cols., J. Mol. Biol. 248:835-844 (1995)) o se limita al nivel de expresión bajo de las proteínas más largas (de la Cruz y cols., J. Biol. Chem. 263:4318-4322 (1988)). Para péptidos pequeños, todavía se observa solamente la respuesta CTL y no, o solamente una respuesta a las células B débil.

En aún otro sistema, los alfavirus recombinantes son propuestos como un medio de suministro del antígeno (véanse, las patentes estadounidenses nº^{s}. 5,766,602; 5,792,462; 5,739,026; 5,789,245 y 5,814,482). Los problemas con los sistemas de virus recombinantes descritos todavía incluyen una expresión de baja densidad de la proteína heteróloga en la superficie viral y/o la dificultad de exitosamente y repetidamente, crear un nuevo y diferente virus recombinante para diferentes aplicaciones.

En un desarrollo adicional, partículas similares a virus (VLPs) están siendo explotadas en el área de la producción de la vacuna, debido tanto a sus propiedades estructurales como su naturaleza no infecciosa. Las VLPs son estructuras supermoleculares construidas de una manera simétrica a partir de muchas moléculas de proteínas de uno o más tipos. Carecen del genoma viral y, por lo tanto, no son infecciosos. Los VLPs pueden a menudo, ser producidos en grandes cantidades por la expresión heteróloga y pueden ser fácilmente purificados.

Los ejemplos de VLPs incluyen, las proteínas capsidas del virus de la Hepatitis B (Ulrich, y cols., Virus Res. 50:141-182 (1998)), virus del sarampión (Warnes, y cols., Gene 160:173-178 (1995)), virus Sibdis, rotavirus (Patentes Estadounidenses Nos. 5,071,651 y 5,374,426), virus de afecciones de boca y pie (Twomey, y cols., Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), virus Norwalk (Jiang, X., y cols., Science 250:1580-1583 (1990); Matsui, S. M., y cols., J. Clin. Invest. 87:1456-1461 (1991)), la proteína GAG retroviral (Solicitud de Patente PCT No. WO 96/30523), la proteína Ty retrotransposon p1, la proteína de la superficie del virus de la Hepatitis B (WO 92/11291) y el virus del papiloma humano (WO 98/15631). En algunos ejemplos, se puede utilizar la tecnología de ADN recombinante para fusionar una proteína heteróloga a una proteína VLP (Kratz, P.A., y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:19151920 (1990)).

Así, existe una necesidad en la técnica para el desarrollo de vacunas nuevas y mejoradas que promuevan una respuesta inmune a las células B y CTL fuerte, tan eficientemente como los patógenos naturales.

El documento US 5.698.424 describe una proteína quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos de proteína de recubrimiento de MS-2 fago, modificada por la retirada de los residuos de cisteína presentes externamente a la horquilla \beta protuberante final del recubrimiento de proteína y la inserción del residuo de cisterna dentro de la horquilla \beta.

El documento WO 00/23955 describe composiciones y métodos para estimular una respuesta inmune in vitro y tratar o evitar dolencias tales como la infección viral crónica, dolencia inflamatoriua crónica y neoplasia.

El documento US 5.143.726 describe una proteína inmunogénica de fusión que tiene una inmunogenicidad mejorada, en la cual un inmunogen polipétido está unido a las partículas del centro de proteína a través de una cadena lateral de residuo de aminoácido.

El documento EP0385610 describe partículas del centro del antígeno de la hepatitis B que transporta un polipéptido que presenta un epítopo antiogénico. La unión del polipéptido y las partículas Hbc Ag es a través de un residuo Lys en una extensión N- terminal del Hbc Ag.

El documento 99/40934 describe una Hbc Ag estratégicamente modificada unida a un hapteno para formar un conjugado de nucleocápside modificado.

Sumario de la invención

La invención proporciona una nueva tecnología versátil que permite la producción de partículas revestidas con un antígeno deseado. La tecnología permite la creación de vacunas eficientemente altas para el tratamiento de alergias y cánceres.

En una primera realización, la invención proporciona una composición según se define en la reivindicación 1 de la presente memoria descriptiva. Más en detalle, la composición comprende: (A) un andamio molecular no natural y (B) un determinante antigénico o antígeno, el cual es seleccionado de proteínas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra los alérgenos.

El andamio molecular no natural comprende (i) una partícula central seleccionada del grupo que consiste en (1) una partícula central de origen no natural y (2) una partícula central de origen natural; y (ii) un organizador que comprende al menos, un primer sitio de unión, en donde dicho organizador está conectado a dicha partícula central por al menos, un enlace covalente.

El determinante antigénico o antígeno tiene al menos un segundo sitio de unión, el cual se selecciona del grupo que consiste en (i) un sitio de unión que no se origina naturalmente, con dicho determinante antigénico o antígeno; y (ii) un sitio de unión que se origina naturalmente con dicho determinante antigénico o antígeno.

La invención proporciona un arreglo de antígeno repetitivo y ordenado a través de una asociación del segundo sitio de unión al primer sitio de unión por medio de al menos, un enlace peptídico. Así, el determinante antigénico o antígeno y el andamio molecular no natural, son llevados juntos a través de esta asociación del primer y segundo sitio de unión para formar un arreglo de antígeno repetitivo y ordenado.

En otra realización, la partícula central de la composición mencionada anteriormente comprende un virus, una partícula parecida al virus, un bacteriófago, una partícula capsida viral o una forma recombinante de la misma. Alternativamente, la partícula central puede ser un polímero sintético o un metal.

En una realización particular, el organizador puede comprender al menos, un primer sitio de unión. El primer y segundo sitio de unión son particularmente elementos importantes de la composición de la invención. En varias realizaciónes de la invención, el primer y/o segundo sitio de unión, puede ser un antígeno y un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de este; biotina y avidina; estrepavidina y biotina; un receptor y su ligando; una proteína de enlace al ligando y su ligando; interacción de polipéptidos de cierre de leucina; un grupo amino y un grupo químico reactivo de este; un grupo carboxilo y un grupo químico reactivo de este; un grupo sulfihidrilo y un grupo químico reactivo a este; o una combinación del mismo.

En una realización preferida, la invención proporciona el acoplamiento de casi cualquier antígeno de selección a la superficie de un virus, bacteriófago, partícula parecida al virus, o partícula capsida viral. Mediante la introducción de un antígeno en una estructura "similar al virus" casi cristalina, la invención explica la reacción inmune antiviral fuerte de un anfitrión para la producción de una respuesta inmune altamente eficiente, es decir, una vacunación contra el antígeno mostrado.

En una realización preferida, la partícula central puede seleccionarse del grupo que consiste en: proteínas recombinantes de Rotavirus, proteínas recombinantes de virus Norwalk, proteínas recombinantes de Alfavirus, proteínas recombinantes de virus de Afecciones de la Boca y Pie, proteínas recombinantes de Retrovirus, proteínas recombinantes del virus de la Hepatitis B, proteínas recombinantes del virus del mosaico del Tabaco, proteínas recombinantes del virus Flock House, y proteínas recombinantes de Papilomavirus humano.

En una realización particularmente preferida de la invención, el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión, comprenden un polipéptido de cierre de leucina de interacción. En más realizaciónes preferidas, el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión, se seleccionan del grupo que comprende: (1) el dominio de la proteína de cierre leucina JUN; y (2) el dominio de la proteína de cierre leucina FOS.

En otra realización preferida, el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión, se seleccionan del grupo que comprende: (1) un residuo de lisina diseñado genéticamente y (2) un residuo de cisteína diseñado genéticamente, dos residuos que pueden ser químicamente ligados juntos.

Otras realizaciónes de la invención incluyen procesos para la producción de las composiciones de la invención y aplicaciones terapeúticas de dichas composiciones.

Se entenderá que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada, son solamente ejemplarizantes y explicatorias y están propuestas para proporcionar explicación adicional de la invención como se reivindica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Manchado Western que demuestra la producción de partículas virales que contienen la proteína de fusión E2-JUN, usando el vector de expresión pCYTts::E2JUN.

Figura 2. Manchado Western que demuestra la producción de partículas virales que contienen la proteína de fusión E2-JUN, usando el vector de expresión pTE5'2J::E2JUN.

Figura 3. Manchado de punto Western que demuestra la expresión bacteriana y eucariótica del antígeno FOS-hgh.

Figura 4. Expresión de HBcAg-JUN en células de E. coli.

Figura 5. Manchado Western que demuestra que el HBcAg-JUN es soluble en lisados de E. coli.

Figura 6. Análisis SDS-PAGE del enriquecimiento de las partículas capsidas HBc-Ag-JUN en un gradiente de densidad de sacarosa.

Figura 7. Análisis SDS-PAGE sin reducción del acoplamiento de partículas hGH-FOS y HBcAg-JUN.

Descripción detallada de las realizaciónes preferidas 1. Definiciones

Se proporcionan las siguientes definiciones para clarificar el tema sujeto el cual los inventores consideran como la presente invención.

Alfavirus: Como se usa aquí, el término "alfavirus" se refiere a cualquiera de los virus de ARN incluidos dentro del género Alfavirus. Las descripciones de los elementos de este género están contenidas en Strauss y Strauss, Microbiol. Rev., 58:491-562 (1994). Los ejemplos de los alfavirus incluyen virus Aura, virus Bebaru, virus Cabassou, virus Chikungunya, virus de encefalomielitis equina Easte, virus Fort morgan, virus Getah, virus Kyzylagach, virus Mayoaro, virus Middleburg, virus Mucambo, virus Ndumi, virus Pixuna, virus Tonate, virus Triniti, virus Una, virus de encefalomielitis equina Western, virus Whataroa, virus Sindbis (SIN), virus Semliki forest (SFV), virus de encefalomielitis equina Venezolana (VEE), y virus Ross River.

Antígeno: Como se usa aquí, el término "antígeno" es una molécula capaz de ser enlazada por un anticuerpo. Un antígeno es adicionalmente capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuestas inmune celulares que conducen a la producción de linfocitos T y/o B. Un antígeno puede tener uno o más epítopes (epítopes B y T). La reacción específica referida anteriormente, se sugiere para indicar que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos los cuales pueden evocarse por otros antígenos.

Determinante antigénica: Como se usa aquí, el término "determinante antigénica" se sugiere para referirse a tal porción de un antígeno que está específicamente reconocida por ya sea los linfocitos B o T. Los linfocitos B responden a las determinantes antigénicas ajenas o extrañas vía la producción de anticuerpos, mientras los linfocitos T son el mediador de la inmunidad celular. Así, las determinantes antigénicas o epítopes, son aquellas partes de un antígeno que son reconocidas por los anticuerpos, o en el contexto de un MHC, por los receptores de las células T.

Asociación: Como se usa aquí, el término "asociación" como se aplica al primero y segundo sitios de unión, se usa para referirse al menos a un enlace no peptídico. La naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrofóbica, polar o cualquier combinación de la mismas.

Primer sitio de unión: Como se usa aquí, la frase "primer sitio de unión" se refiere a un elemento del "organizador", mismo enlace a la partícula central en una forma no aleatoria, en la cual el segundo sitio de unión localizado en el antígeno o determinante, puede asociarse. El primer sitio de unión puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un compuesto o metabolito secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iónes metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una combinación del mismo, o un grupo del mismo químicamente reactivo. El primer sitio de unión múltiple, está presente en la superficie del andamio molecular no natural en una configuración repetitiva.

Segundo sitio de unión: Como se usa aquí, la frase "segundo sitio de unión" se refiere a un elemento asociado con el determinante antigénico o antígeno al cual el primer sitio de unión del "organizador" localizado en la superficie de andamio molecular no natural, puede asociarse. El segundo sitio de unión del determinante antigénico o antígeno puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero sintético o natural, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo del mismo. Al menos un segundo sitio de unión está presente en el determinante antigénico o antígeno.

Partícula central: Como se usa aquí, el término "partícula central" se refiere a una estructura rígida con una organización repetitiva inherente que proporciona una fundación para la unión de un "organizador". Una partícula central como se usa aquí, puede ser el producto de un proceso sintético o el producto de un proceso biológico.

Cis-actuante: Como se usa aquí, la frase secuencia "cis-actuante" se refiere a las secuencias de ácido nucléico a la cual una replicasa se enlaza para catalizar la replicación dependiente del ARN de las moléculas de ARN. Este evento de replicación resulta en la replicación de las moléculas de ARN parcial y de longitud completa, y así, el promotor subgenómico alfavirus es también una secuencia "cis-actuante". Las secuencias "cis-actuantes" pueden localizarse a o cerca del extremo 5' y 3', o en ambos extremos de una molécula de ácido nucléico así como también internamente.

Fusión: Como se usa aquí, el término "fusión" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácidos de orígenes diferentes en una cadena de polipéptido por una combinación en estructura de sus secuencias de nucleótidos codificantes. El término "fusión", explícitamente abarca fusiones internas, es decir, inserción de las secuencias de diferente origen dentro de una cadena de polipéptido, además de la fusión a uno de sus términos.

Secuencia heteróloga: Como se usa aquí, el término "secuencia heteróloga" se refiere a una segunda secuencia de nucleótido presente en un vector de la invención. El término "secuencia heteróloga" también se refiere a cualquier aminoácido o secuencia de ARN codificada por una secuencia de ADN heteróloga contenida en un vector de la invención. Las secuencias de nucleótidos heterólogas pueden codificar proteínas o moléculas de ARN, normalmente expresadas en el tipo celular en el cual están presentes o las moléculas no se expresan normalmente ahí (por ejemplo, proteínas estructurales Sinbdis).

Aislado: Como se usa aquí, el término "aislado" se usa en referencia a una molécula, el término significa que las moléculas se han removido de su ambiente natural. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un animal viviente, no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural es "aislado". Además, las moléculas de ADN recombinantes contenidas en un vector, son consideradas aisladas para los propósitos de la presente invención. Las moléculas de ARN aisladas incluyen productos de replicación de ARN in vivo o in vitro, de las moléculas de ADN y ARN. Las moléculas de ácido nucléico aislado, además incluyen moléculas sintéticamente producidas. Adicionalmente, las moléculas de vectores contenidos en las células anfitrionas recombinantes también son aisladas. Así, no todas las moléculas "aisladas" necesitan ser "purificadas".

Inmunoterapéutico: Como se usa aquí, el término "inmunoterapéutico" es una composición para el tratamiento de afecciones o desórdenes. Más específicamente, el término es usado para referirse a un método de tratamiento para alergias o un método de tratamiento para el cáncer.

Individuo: Como se usa aquí, el término "individuo" se refiere a organismos multicelulares e incluye tanto plantas como animales. Los organismos multicelulares preferidos son animales, más preferidos son vertebrados, aún más preferidos son mamíferos, y más preferidos son humanos.

Inferior o no detectable: Como se usa aquí, la frase "inferior o no detectable", cuando se usa en referencia al nivel de expresión del gen, se refiere a un nivel de expresión el cual es ya sea, significantemente inferior que aquel observado cuando el gen está máximamente inducido (por ejemplo, al menos cinco partes inferiores), o no es fácilmente detectable por los métodos usados en la siguiente sección de ejemplos.

Lectina: Como se usa aquí, las proteínas se obtienen particularmente a partir de las semillas de plantas de leguminosas, pero también de muchas otras fuentes de plantas y animales, que tienen sitios de enlaces para mono y oligosacáridos específicos. Los ejemplos incluyen concanavalina A y aglutinina de germen de trigo, los cuales son ampliamente usados como agentes analíticos y preparativos en el estudio de las glicoproteínas.

Origen natural: Como se usa aquí, el término "origen natural" significa que el total o las partes del mismo no son sintéticas y existen o se producen en la naturaleza.

No natural: Como se usa aquí, el término significa de manera general, no natural, más específicamente, el término significa de la mano del hombre.

Origen no natural: Como se usa aquí, el término "origen no natural", significa de manera general, sintético o no natural; más específicamente, el término significa de la mano del hombre.

Andamio molecular no natural: Como se usa aquí, la frase "andamio molecular no natural" se refiere a cualquier producto elaborado por la mano del hombre que puede servir para proporcionar un arreglo rígido y repetitivo del primer sitio de unión. Idealmente, pero no necesariamente, estos primeros sitios de unión están en un orden geométrico. El andamio molecular no natural puede ser orgánico o no orgánico y pueden ser sintetizados químicamente o a través de un proceso biológico, en parte o totalmente. El andamio molecular no natural está comprendido de: (a) una partícula central, ya sea de origen natural o no natural; y (b) un organizador, el cual el mismo comprende la menos, un primer sitio de unión y está conectado a una partícula central por al menos, un enlace covalente. En una realización particular, el andamio molecular natural puede ser un virus, una partícula parecida al virus, una partícula capsida de virus, un fago, una forma recombinante de la misma, o una partícula sintética.

Arreglo de determinante antigénico o antígeno repetitivo y ordenado: Como se usa aquí, el término "arreglo de determinante antigénico o antígeno repetitivo y ordenado", se refiere de manera general a un patrón de repetición de un determinante antigénico o antígeno, caracterizado por una disposición espacial uniforme de los determinantes antigénicos o antígenos con respecto al andamio. En una realización de la invención, el patrón de repetición, puede ser un patrón geométrico. Un arreglo determinante antigénico o antígeno repetitivo y ordenado poseerá un orden paracristalino estrictamente repetitivo del determinante antigénico o antígeno con una separación de 5 a 15
nanómetros.

Organizador: Como se usa aquí, el término "organizador" se usa para referirse a un elemento enlazado a una partícula central en una forma no aleatoria que proporciona un sitio de nucleación para crear un arreglo antígeno repetitivo y ordenado. Un organizador es cualquier elemento que comprende al menos un primer sitio de unión que está enlazado a una partícula central por al menos, un enlace covalente. Un organizador puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un aminoácido (es decir, un residuo de una proteína un polipéptido o un péptido), un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un compuesto o metabolito secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iónes metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una combinación del mismo, o un grupo del mismo químicamente reactivo.

Temperatura permisiva: Como se usa aquí, la frase "temperatura permisiva" se refiere a temperaturas a las cuales una enzima tiene niveles relativamente altos de actividad catalítica.

Purificada: Como se usa aquí, cuando el término "purificada" se usa con referencia a una molécula, significa que la concentración de la molécula a ser purificada, se ha incrementado con relación a las moléculas asociadas dentro de su ambiente natural. Las moléculas naturalmente asociadas incluyen proteínas, ácidos nucléicos, lípidos y azúcares, pero de manera general no incluyen agua, amortiguadores y reactivos agregados para mantener la integridad o facilitar la purificación de la molécula a ser purificada. Por ejemplo, aún si el ARNm es diluido con un solvente acuoso durante la cromatografía en columna de dT oligo, las moléculas de ARN son purificadas por esta cromatografía si los ácidos nucléicos naturalmente asociados y otras moléculas biológicas no se enlazan a la columna y se separan de las moléculas de ARNm sujeto.

Receptor: Como se usa aquí, el término "receptor" se refiere a proteínas o glicoproteínas o fragmentos del mismo capaces de interactuar con otra molécula, llamada el ligando. El ligando puede portar cualquier clase de compuestos químicos o bioquímicos. El receptor no necesariamente necesita ser una proteína ligada a la membrana.

La proteína soluble, como por ejemplo la proteína de enlace a la maltosa o proteína de enlace al retinol, son así también receptores.

Residuo: Como se usa aquí, el término "residuo" se sugiere para significar un aminoácido específico en una estructura de polipéptido o de cadena lateral.

Sensible a la temperatura: Como se usa aquí, la frase "sensible a la temperatura" se refiere a cualquier enzima la cual fácilmente cataliza una reacción a una temperatura pero cataliza la misma reacción lentamente o no a todas las otras temperaturas. Un ejemplo de una enzima sensible a la temperatura es la proteína replicasa codificada por el vector pCYTts, la cual tiene actividad de replicasa fácilmente detectable a temperaturas por debajo de 34ºC y tienen actividad baja o indetectable a 37ºC.

Transcripción: Como se usa aquí, el término "transcripción" se refiere a la producción de moléculas de ARN a partir de los modelos de ADN catalizados por las polimerasas de ARN.

Célula anfitriona recombinante: Como se usa aquí, el término "célula anfitriona recombinante" se refiere a una célula anfitriona en la cual se han introducido una o más moléculas de ácido nucléico de la invención.

Virus recombinante: Como se usa aquí, la frase "virus recombinante" se refiere a un virus que es genéticamente modificado por la mano del hombre. La frase cubre cualquier virus conocido en la técnica. Más específicamente, la frase se refiere a un alfavirus genéticamente modificado por la mano del hombre, y más específicamente, la frase se refiere a un virus Sinbis genéticamente modificado por la mano del hombre.

Temperatura restrictiva: Como se usa aquí, la frase "temperatura restrictiva" se refiere a temperaturas a las cuales una enzima tiene niveles bajo o indetectables de actividad catalítica. Tanto los mutantes sensitivos al "frío" o "calor", se conocen y así, una temperatura restrictiva puede ser superior o inferior que una temperatura permisiva.

Evento de replicación de ARN dependiente del ARN: Como se usa aquí la frase "evento de replicación del ARN dependiente del ARN", se refiere a procesos los cuales resultan en la formación de una molécula de ARN usando una molécula de ARN como un modelo.

Polimerasa de ARN dependiente del ARN: Como se usa aquí, la frase "polimerasa de ARN dependiente del ARN", se refiere a una polimerasa, la cual cataliza la producción de una molécula de ARN a partir de otra molécula de ARN. Este término es usado aquí sinónimamente con el término "replicasa".

ARN no traducido: Como se usa aquí, la frase "ARN no traducido" se refiere a una secuencia o molécula de ARN la cual no codifica a una estructura lectora abierta o codifica a una estructura lectora abierta, o porción de la misma, pero en un formato en el cual una secuencia de aminoácido no se producirá (por ejemplo, no está presente el codon de iniciación). Los ejemplos de tales moléculas son las moléculas de ARNt, moléculas de ARNr, y ribozimas.

Vector: Como se usa aquí, el término "vector" se refiere a un agente (por ejemplo, un plasmido o virus), usado para transmitir el material genético a una célula anfitriona. Un vector puede estar compuesto de ya sea ADN o ARN.

Uno, una o un: Cuando los término "uno", "un" o "una" se usan en esta descripción, significan "al menos uno" o "uno o más" a menos que se indique de otro modo.

2. Composiciones de Arreglos de Determinantes Antigénicos o Antígenos Repetitivos y Ordenados y Métodos para Hacer los mismos

La invención descrita proporciona composiciones que comprenden un determinante antigénico o antígeno repetitivo y ordenado. Además, la invención convenientemente permite al facultativo construir arreglos de determinantes antigénicos o antígenos repetitivos y ordenados para el tratamiento de alergias.

Las composiciones de la invención esencialmente comprenden dos elementos: (1) un andamio molecular no natural; y (2) un determinante antigénico o antígeno con al menos, un segundo sitio de unión capaz de asociación a través de al menos, un enlace no peptídico a dicho primer sitio de unión.

El andamio molécular no natural que comprende (a) una partícula central seleccionada del grupo que consiste en (1) una partícula central de un origen no natural y (2) una partícula central de origen natural; y (b) un organizador que comprende al menos, un primer sitio de unión, en donde dicho organizador está conectado a dicha partícula central por al menos, un enlace covalente.

El determinante antigénico o antígeno tiene al menos, un segundo sitio de unión, el cual se selecciona del grupo que consiste en (a) un sitio de unión que no se origina naturalmente con dicho determinante antigénico o antígeno; y (b) un sitio de unión el cual se origina naturalmente con dicho determinante antigénico o antígeno.

La invención proporciona un arreglo antígeno repetitivo y ordenado a través de una asociación del segundo sitio de unión al primer sitio de unión por medio de al menos, un enlace peptídico. Así, el antígeno o determinante antigénico y el andamio molecular no natural, son introducidos juntos a través de esta asociación del primer y segundo sitio de unión para formar un arreglo de antígeno repetitivo y ordenado.

El facultativo puede diseñar específicamente el determinante antigénico o antígeno y el segundo sitio de unión, de manera que el arreglo de todos los determinantes antigénicos o antígenos enlazados al andamio molecular no natural serán uniformes. Por ejemplo, uno puede colocar un segundo sitio de unión único en el determinante antigénico o antígeno al término carboxilo o amino, con ello, se asegura a través del diseño, que todas las moléculas determinantes antigénicas o antígeno que están unidas al andamio molecular no natural, están colocadas de una manera uniforme. Así, la invención proporciona un medio conveniente de colocación de cualquier determinante antigénica o antígeno en un andamio molecular no natural en una repetición y orden definidos.

Como será claro para un experto en la técnica, ciertas realizaciónes de la invención, involucran el uso de tecnologías de ácido nucléico recombinantes tales como clonación, reacción en cadena de la polimerasa, la purificación de ADN y ARN, la expresión de las proteínas recombinantes en las células procarióticas y eucarióticas, etc. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y pueden convenientemente, encontrarse en manuales de métodos de laboratorio publicados (por ejemplo, Sambrook., J. Y cols., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. y cols., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H, Wiley & Sons, Inc. (1997)). Fundamental laboratory techniques for working with tissue culture cell lines (Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2da. Edición, (1998)) and antibody-based techonologies (Hatlow, E. and Lane, D.,"Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Deutscher, M.P., "Guide to Protein Purification", "Meth. Enzymol". 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R. K., "Protein Purification Principles and Practice", 3ra. Ed., Springer-Verlag, New York (1994)) están también adecuadamente descritos en la bibliografía, de los cuales todos están incorporados aquí por referencia.

A. Construcción de un Andamio Molecular No Natural

Un elemento en la composición de la invención es un andamio molecular no natural, que comprende una partícula central y un organizador. Como se usa aquí, la frase "andamio molecular no natural", se refiere a cualquier producto hecho por la mano del hombre, que puede servir para proporcionar un arreglo repetitivo y rígido de los primeros sitios de unión. Más específicamente, el andamio molecular no natural comprende (a) una partícula central seleccionada del grupo que consiste en (1) una partícula central de origen no natural y (2) una partícula central de origen natural; y (b) un organizador que comprende al menos, un sitio de unión, en donde dicho organizador está conectado a dicha partícula central por al menos, un enlace covalentes.

Como será fácilmente aparente para aquellos expertos en la técnica, la partícula central del andamio molecular no natural de la invención, no está limitada a cualquier forma específica. La partícula central puede ser orgánica o no orgánica y puede ser sintetizada químicamente o a través de un proceso biológico.

En una realización, la partícula central no natural puede ser un polímero sintético, un micelio lípido o un metal. Tales partículas centrales se conocen en la técnica, proporcionando una base a partir de la cual se construye el nuevo andamio molecular no natural de la invención. A modo de ejemplo, el polímero sintético o las partículas centrales de metal, se describen en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 5,770,380, la cual describe el uso de un andamio orgánico calixareno al cual está unido una pluralidad de lazos peptídicos en la creación de un "anticuerpo mímico", y la Patente Estadounidense No. 5,334,394 describe partículas no cristalinas usadas como un señuelo viral que está compuesto de una variedad amplia de materiales inorgánicos, incluyendo metales o cerámicas. Los metales preferidos en esta realización, incluyen cromio, rubidio, hierro, zinc, selenio, níquel, oro, plata, platino. Los materiales de cerámica preferidos en esta realización, incluyen dióxido de silicio, dióxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de rutenio y óxido de estaño. Las partículas centrales de esta realización se pueden hacer de materiales inorgánicos, incluyendo carbono (diamante). Los polímeros preferidos incluyen poliestireno, nylon y nitrocelulosa. Para este tipo de partícula nanocristalina, las partículas hechas de óxido de estaño, dióxido de titanio o carbono (diamante), son particularmente preferidas. Un micelio lípido puede prepararse por medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, los micelios pueden prepararse de conformidad con el enfoque de Baiselle y Millar (Baiselle, C.J. y Millar, D, B., Biophys, Chem. 4:355-361 81975)) o Corti y cols., (Corti, M., Degriorgio, V., Sonnino S., Ghidoni R., Masserini, M. Y Tettamanti, G., Chem. Phys. Lipids 38:197-214 (1981)) o Lopez y cols., (Lopez, O. de la Maza, A., Coderch., L., Lopez-Iglesias, C., Wehrli, E. y Parra, J. L., FEBS Lett. 426: 314-318 (1998)) o Topcieva y Karaezin (Topchieva, I. y Karaezin, K., J. Colloid Interface Sci. 213: 29-35 (1999)) o Morein y cols., (Morein, B., Sundquist, B., Hoglund, S., Dalsgaard K. y Osterhaus, A., Nature 308:457-60 (1984)), las cuales están todas incorporadas aquí por referencia.

Las partículas centrales pueden también producirse a través de un proceso biológico, el cual puede ser natural o no natural. Por medio del ejemplo, este tipo de realización puede incluir una partícula central que comprende un virus, una partícula similar al virus, un fago, una partícula de cápsido viral o una forma recombinante del mismo. En una realización más específica, la partícula central puede comprender proteínas recombinantes de Rotavirus, proteínas recombinantes de Norwalkvirus, proteínas recombinantes de Alfavirus, proteínas recombinantes del virus de afecciones de la Boca y el Pie, proteínas recombinantes de Retrovirus, proteínas recombinantes del virus de la Hepatitis B, proteínas recombinantes del virus del mosaico del tabaco, proteínas recombinantes del virus Flock House, y proteínas recombinantes del Papilomavirus humano.

Sean naturales o no naturales, las partículas centrales de la invención se caracterizan por comprender un organizador que está unido a la partícula central natural por al menos, un enlace covalente. El organizador es un elemento enlazado a una partícula central en un modo no aleatorio que proporciona un sitio de nucleación para crear un arreglo de antígeno repetitivo y ordenado. Idealmente, pero no necesariamente, el organizador está asociado con la partícula central en un orden geométrico. Mínimamente, el organizador comprende un primer sitio de unión.

Como se declaró previamente, el organizador puede ser cualquier elemento que comprende al menos, un primer sitio de unión que está enlazado a una partícula central por al menos, un enlace covalente. Un organizador puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un aminoácido (es decir, un residuo de una proteína, un polipéptido o péptido), un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito secundario o compuesto (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una combinación del mismo, o un grupo del mismo químicamente reactivo. En una realización más específica, el organizador puede comprender un primer sitio de unión que comprende un antígeno, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, biotina, avidina, estreptavidina, un receptor, un ligando receptor, un ligando, una proteína enlazante al ligando, un polipéptido de cierre leucina interactuante, un grupo amino, un grupo químico reactivo a un grupo amino; un grupo carboxilo, un grupo químico reactivo al grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo químico reactivo a un grupo sulfhidrilo, o una combinación de los mismos.

En una realización preferida, la partícula central del andamio molecular no natural, comprende un virus, un bacteriófago, una partícula similar al virus, una partícula cápsida viral o una forma recombinante de la misma. Cualquier virus conocido en la técnica que tiene una estructura de proteína central y/o revestida repetitiva y ordenada, puede seleccionarse como un andamio molecular no natural de la invención; ejemplos de virus adecuados incluyen: sibdis y otros alfavirus; virus somatitis vesicular; rabdo, (por ejemplo, virus de somatitis vesicular), picorna, toga, ortomixo, polioma, parvovirus, rotavirus, norwalkvirus, virus de padecimiento de la boca y pie, un retrovirus, virus de la hepatitis B, virus del mosaico del tabaco, virus flock house, papilomavirus humano (por ejemplo, véase Tabla 1 en Bachman, M.F y Zinkernagel, R.M., Immunol. Today 17:553-558 (1996).

En una realización, la invención utiliza ingeniería genética de un virus, para crear una fusión entre una proteína de cubierta viral repetitiva y ordenada, y un organizador, que comprende una proteína heteróloga, péptido, determinante antigénico o un residuo de aminoácido reactivo de selección. Otras manipulaciones genéticas conocidas por aquellos en la técnica, pueden incluirse en la construcción del andamio molecular no natural; por ejemplo, puede ser deseable restringir la capacidad de replicación del virus recombinante a través de la mutación genética. La proteína viral seleccionada por fusión a la proteína organizadora (es decir, el primer sitio de unión), deberá tener una estructura repetitiva y organizada, más preferiblemente una organización paracristalina óptimamente con una separación de 5-15 nm en la superficie del virus. La creación de este tipo de proteína de fusión resultará en organizadores repetitivos y ordenados, múltiples en la superficie del virus. Así, la organización repetitiva y ordenada del primer sitio de unión, resultante de este, reflejará la organización normal de la proteína viral nativa.

Como se discutirá en más detalle aquí, en una realización preferida de la invención, el andamio es un alfavirus recombinante, y más específicamente, un virus Sinbis recombinante. Los alfavirus son virus de ARN de hebras positivas que replican su ARN genómico completamente en el citoplasma de la célula infectada y sin un intermediario de ADN (Strauss, J., y Strauss, E., Microbiol. Rev. 58:491-562 (1994)). Varios miembros de la familia del alfavirus, Sinbdis (Xiolng, C. et. al., Science 243:1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993)), Semliki Forest Virus (SFV) (Liljeström, P. & Garoff. H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991)) y otros (Davis, N. L. y cols., Virology 171:189-204 (1989)), han recibido atención considerable para usarse como vectores de expresión a base de virus, para una variedad de proteínas diferentes (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997); Liljeström, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5:495-500 (1994) y como candidatos para el desarrollo de vacunas. Recientemente, un número de patentes se han publicado dirigidas al uso de alfavirus para la expresión de proteínas heterólogas y el desarrollo de vacunas (véase Patentes Estadounidenses nos. 5,766,602; 5,792,462; 5,739,026; 5,789,245 y 5,814,482). La construcción del andamio alfaviral de la invención puede hacerse por medio conocidos de manera general en la técnica de la tecnología de ADN recombinante, como se describe por los artículos mencionados anteriormente, los cuales están incorporados aquí por referencia.

Pueden ser utilizadas una variedad de células anfitrionas recombinantes diferentes, para producir una partícula central a base de virales para la unión determinante antigénica o antígeno. Por ejemplo, los alfavirus se conocen por tener un amplio rango de anfitrión; el virus Sibdis infecta las células de mamífero, reptil, y anfibio cultivadas, así como también algunas células de insecto (Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51:645 (1973); Leake, C., J. Gen. Virol. 33:335 (1997); Stollar, V. en THE TOGAVIRUSES, R. W. Schlesinger, Ed., Academic Press, (1980), pp. 583-621). Así, en la práctica de la invención, se pueden usar numerosas células anfitrionas recombinantes. Las células BHK, COS, Vero, HeLa y CHO, son particularmente adecuadas para la producción de las proteínas heterólogas debido a que tienen el potencial a las proteínas heterólogas glicosiladas de una manera similar a las células humanas (Watson E. y cols., Glycobiology 4:227 (1994)) y pueden seleccionarse (Zang, M. Y cols., Bio/Technology 13:89 (1995)) o diseñarse genéticamente (Renner W. y cols., Biotech. Bioeng. 4:476 (1995); Lee K. y cols. Biotech. Bioeng 50:336 (1996)) para crecer en un medio libre de suero, así como también en suspensión.

La introducción de los vectores polinucleótidos en las células anfitrionas, puede ser realizada por métodos descritos en los manuales de laboratorio estándares (véase, por ejemplo, Sambrook, J. y cols., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL. 2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col Spring Harbor, N.Y. (1989), Capítulo 9; Ausuble, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), Capítulo 16), incluyendo métodos tales como electroporación, transfección mediada por dextrano-DEAE, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, transducción, carga de hebras, introducción balística, e infección. Los métodos para la introducción de secuencias de ADN exógenas en las células anfitrionas se discuten en Felgner, P. et. al., Patente Estadounidense No. 5,580,859.

Las secuencias de ARN empaquetadas, pueden también ser usadas para infectar células anfitrionas. Estas secuencias de ARN empaquetadas se pueden introducir en las células anfitrionas por la adición de estas al medio de cultivo. Por ejemplo, la preparación de partículas alfavirales no infectivas, se describe en un número de fuentes, incluyendo "Sistema de Expresión de Sinbdis", Versión C, (Invitrogen Catálogo No. K750-1).

Cuando las células de mamífero se usan como células anfitrionas recombinantes para la producción de partículas centrales a base de virales, estas células de manera general, se hacen crecer en un cultivo de tejidos. Los métodos para el crecimiento de las células en cultivos, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic press, 2da. Edición, (1998); Sambrook, J. y cols., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel, F. y cols., eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGI, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Freshney, R., CULTURE OF ANIMAL CELLS, Alan R. Liss, Inc. (1983)).

Como se entenderá por aquellos en la técnica, el primer sitio de unión puede estar o ser una parte de cualquier proteína, polipéptido, azúcar, polinucleótido, peptido (aminoácido), polímero natural o sintético, un metabolito secundario o combinación de los mismos adecuados, que puede servir para unir específicamente el determinante antigénico o antígeno de selección al andamio. En una realización, el sitio de unión es una proteína o péptido que puede seleccionarse de aquellos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el primer sitio de unión puede seleccionarse del siguiente grupo: un ligando, un receptor, una lectina, avidina, estreptavidina, biotina, un epítope tal como extremo, HA o T7, Myc, Max, dominios de inmunoglobulina y cualquier otra secuencia de aminoácido conocida en la técnica que podría ser usada como un primer sitio de unión.

Deberá además, entenderse por aquellos en la técnica, que con otra realización de la invención, se puede crear el primer sitio de unión secundariamente al organizador (es decir, la proteína o polipéptido), utilizado para construir la fusión en estructura a la proteína cápsida. Por ejemplo, puede utilizarse una proteína para la fusión a la proteína cubierta con una secuencia de aminoácido conocida por ser glicosilada en una forma específica, y la porción azúcar agregada como un resultado, puede entonces servir al primer sitio de unión del andamio viral por medio del enlace a la lectina, sirviendo como el sitio de unión secundario de un antígeno. Alternativamente, la secuencia organizadora puede ser biotinilada in vivo y la porción biotina puede servir como el primer sitio de unión de la invención, o la secuencia organizadora puede someterse a la modificación química de los residuos de aminoácidos distintos in vitro, la modificación sirve como el primer sitio de unión.

Una realización específica de la invención utiliza el virus Sinbis. El genoma del ARN del virus sinbis es empaquetado en una proteína capsida que está circundada por una bicapa lípida que contiene a las tres proteínas llamadas E1, E2 y E3. Estas así llamadas proteínas cubiertas son glicoproteínas, y las porciones glicosiladas se localizan en el exterior de la bicapa lípida, en donde los complejos de estas proteínas forman las "espigas" que pueden observarse en los micrógrafos de electrones para proyectarse hacia fuera de la superficie del virus. En una realización preferida de la invención, el primer sitio de unión se selecciona por ser el dominio de la proteína de cierre leucina JUN o FOS, que está fusionada en estructura a la proteína cubierta E2. Sin embargo, será claro para todos los individuos en la técnica, que otras proteínas cubiertas pueden utilizarse en la construcción de la proteína de fusión para localizar el primer sitio de unión en el andamio de la invención.

En una realización más preferida de la invención, el primer sitio de unión se selecciona por ser el dominio de la proteína de cierre de leucina JUN-FOS, que está fusionado en la estructura a la proteína cápsida (central) de la Hepatitis B. Sin embargo, será claro para todos los individuos en la técnica, que otras proteínas capsidas virales pueden ser utilizadas en la construcción de la proteína de fusión para localizar el primer sitio de unión en el andamio de la invención.

En otra realización preferida de la invención, el primer sitio de unión se selecciona por ser un residuo de lisina o cisteína que se fusiona en estructura a la proteína central (capsida) de la Hepatitis. Sin embargo, será claro para todos los individuos en la técnica, que pueden ser utilizadas otras partículas como las virales o cápsidas virales, en la construcción de la proteína de fusión para localizar el primer sitio en el andamio de la invención.

Se proporciona el Ejemplo 1 para demostrar la construcción de una proteína de fusión en estructura entre la proteína cubierta E2 del virus Sinbis y el dominio de la proteína de cierre de leucina JUN, usando el vector pTE5'2J de Hahn y cols. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2679-2683)). La secuencia de aminoácido JUN utilizada para el primer sitio de unión es la siguiente:

1

En este ejemplo, el segundo sitio de unión anticipado en el antígeno, podría ser el dominio de la proteína de cierre leucina FOS y la secuencia de aminoácido podría ser la siguiente:

2

Estas secuencias se derivan de los factores de transcripción JUN y FOS flanqueado, cada uno, con una secuencia corta que contiene un residuo de cisteína en ambos lados. Estas secuencias se conocen por interactuar con cada una de las otras. La estructura hipotética original propuesta para el dímero JUN-FOS, asume que las cadenas laterales hidrofóbicas de un monómero se entrelazan con las cadenas laterales respectivas del otro monómero de una manera similar al cierre (Landschulz et al., Science 240:1759-1764 (1988). Sin embargo, esta hipótesis comprobada como impropia, y estas proteínas se conocen por formar un espiral enroscado \alpha-helicoidal (O'Shea y cols., Science 243:538-542 (1989); O'Shea y cols. Cell 68:699-708 (1992); Cohen & Parry, Trends Biochem. Sci. 11:245-248 (1986)). Así, el término "cierre leucina" es usado frecuentemente para referirse a estos dominios de proteínas para más razones históricas que estructurales. En toda esta patente, el término "leucina de cierre" es usado para referirse a las secuencias demostradas anteriormente o secuencias esencialmente similares a una demostradas anteriormente. Los términos JUN y FOS son usados para los dominios de cierre de leucina respectivos, en lugar de las proteínas JUN y FOS
completas.

En una realización, la invención proporciona la producción de un andamio E2-JUN del virus Sinbis, usando el sistema de expresión pCYTts (Documento. WO 99/50432). El sistema de expresión pCYTts proporciona nuevos vectores de expresión los cuales permiten la estrecha regulación de la expresión del gen en células eucarióticas. Los vectores de ADN de este sistema se transcriben para formar moléculas de ARN las cuales entonces se replican por una replicasa sensible a la temperatura para formar moléculas de ARN adicionales. Las moléculas de ARN producidas por replicación contienen una secuencia de nucleótido la cual puede ser traducida para producir una proteína de interés o la cual codifica a una o más moléculas de ANR no traducidas. Así, el sistema de expresión permite la producción de partículas del virus Sinbis recombinante.

El Ejemplo 2 proporciona detalles en la producción del andamio molecular no natural de Sinbis E2-JUN, de la invención. Proporcionado de manera adicional en el Ejemplo 3, está otro método para la producción del andamio del virus Sinbis E2-JUN recombinante, usando el vector pTE5'2JE2:JUN producido en el Ejemplo 1. Así, la invención proporciona dos medios, el sistema de expresión pCYTts (Ejemplo 2) y el sistema de vector pTE5'2J (Ejemplo 3), por el cual se puede producir el andamio molecular, no natural E2-JUN del virus Sinbis recombinante. En la Figura 1 y Figura 2 se proporciona un análisis de las partículas virales producidas en cada sistema.

Como se declaró previamente, la invención incluye partículas centrales a base de virales, los cuales comprenden un virus, una partícula similar al virus, un fago, una partícula cápsida viral o una forma recombinante de la misma. Los artesanos expertos, tienen el conocimiento para producir tales partículas centrales y organizadores unidos a estos. Por medio de proporcionar otros ejemplos, la invención se proporciona aquí para la producción de partículas similares al virus de la Hepatitis B y partículas cápsidas virales del sarampión (Ejemplos 17 a 22). En tal realización, el dominio de la proteína de cierre de leucina JUN, o el dominio de la proteína de cierre leucina FOS, pueden ser usados como un organizador, y por lo tanto, como un primer sitio de unión, para el andamio molecular no natural de la invención.

Los Ejemplos 23-29 proporcionan detalles de la producción de las partículas centrales de la Hepatitis B que llevan un péptido fusionado en estructura con un residuo de lisina reactivo y antígeno que llevan un residuo de cisteína genéticamente fusionado, como un primer y segundo sitio de unión, respectivamente.

B. Construcción de un Determinante Antigénico o Antígeno con un Segundo Sitio de Unión

El segundo elemento en la composición de la invención es un determinante antigénico o antígeno que posee al menos, un segundo sitio de unión capaz de asociación a través de al menos, un enlace no peptídico al primer sitio de unión del andamio molecular no natural. La invención proporciona composiciones que varían de conformidad con el determinante antigénico o antígeno seleccionado en consideración del efecto terapéutico deseado. Otras composiciones se proporcionan mediante la variación de la molécula seleccionada para el segundo sitio de unión.

Se seleccionan los antígenos de la invención a partir del grupo que consiste en proteínas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra alérgenos.

En una realización específica, las composiciones de la invención son inmunoterapéuticas que pueden ser usadas para el tratamiento de alergias.

La selección de determinantes antigénicos o antígenos para la composición y método de tratamiento para alergias, podrá conocerse por aquellos expertos en la técnica médica tratando tales alteraciones; los ejemplos representativos de este tipo de determinante antigénica o antígeno incluyen los siguientes: fosfolipasa de veneno de abeja A_{2}, Bet v I (alérgeno del polen de abedul), 5 Dol m V (alérgeno de veneno de avispón de cara blanca), Der pI (alérgeno de ácaro del polvo de casa).

En una realización particular de la invención, el determinante antigénico o antígeno se selecciona del grupo que consiste en: (p) una proteína recombinante de la alergia a la picadura de abeja, (q) proteínas recombinantes de alergia a la nuez yr) proteínas recombinantes de alergias a los alimentos.

Una vez que se selecciona el determinante antigénico o antígeno de la composición, al menos un segundo sitio de unión puede agregarse a la molécula en la preparación para construir el arreglo repetitivo y organizado asociado con el andamio molecular no natural de la invención. El conocimiento de que constituirá un segundo sitio de unión apropiado, será conocido por aquellos expertos en la técnica. Los ejemplos representativos del segundo sitio de unión incluyen, pero no están limitados a los siguientes: un antígeno, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, biotina, avidina, estrepavidina, un receptor, un ligando receptor, un ligando, una proteína enlazante al ligando, un polipéptido de cierre interactuante, un grupo amino, un grupo químico reactivo a un grupo amino; un grupo carboxilo, un grupo químico reactivo a un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo químico reactivo a un grupo sulfhidrilo, o una combinación de los mismos.

La asociación entre el primer y segundo sitios de unión, se determinará por las características de las moléculas respectivas seleccionadas, pero comprenderá al menos, un enlace no peptídico. Dependiendo de la combinación de los primeros y segundos sitios de unión, la naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrófoba, polar, o una combinación de los mismos.

En una realización de la invención, el segundo sitio de unión puede ser el dominio de la proteína de cierre de leucina FOS o el dominio de la proteína de cierre leucina JUN.

En una realización más específica de la invención, el segundo sitio de unión seleccionado es el dominio de la proteína de cierre leucina FOS, el cual se asocia específicamente con el dominio de la proteína de cierre leucina JUN del andamio molecular no natural de la invención. La asociación de los dominios de la proteína de cierre leucina JUN y FOS, proporcionan una base para la formación de un arreglo de determinante antigénico o antígeno repetitivo, en la superficie del andamio. El dominio de la proteína de cierre leucina FOS puede ser fusionado en estructura al determinante antigénico o antígeno de selección a ya sea el termino amino, término carboxilo o internamente localizado en la proteína, si se desea.

Se proporcionan varios constructos de fusión FOS para propósitos ejemplares. La hormona de crecimiento humana (Ejemplo 4), fosfolipasa de veneno de abeja A2 (PLA) (Ejemplo 9), ovalbúmina (Ejemplo 10) y HIV gp 140 (Ejemplo 12).

Para simplificar la generación de constructos de fusión FOS, se describen varios vectores que proporcionan opciones para el diseño y construcción de determinantes antigénicos o antígeno (véase Ejemplo 6). Los vectores pAV1-4 se diseñaron para la expresión de la fusión FOS en E. coli; los vectores pAV5 y pAV6 se diseñaron para la expresión de las proteínas de fusión FOS en células eucarióticas. Las propiedades de estos vectores se describen brevemente:

1. pAV1: Este vector se diseñó para la secreción de las proteínas de fusión con FOS al C-término en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.o.i) se puede ligar en los sitios StuI/NotI del vector.

2. pAV2: Este vector se diseñó para la secreción de las proteínas de fusión con FOS al N-término en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.o.i) se ligó en los sitios NotI/EcoRV (o NotI/Hindi) del vector.

3. pAV3: Este vector se diseñó para la producción citoplásmica de las proteínas de fusión con FOS la C-término en E. coli. El gen de interés (g.o.i) puede estar ligado en los sitios EcoRV/NotI del vector.

4. pAV4: Este vector se diseñó para la producción citoplásmica de las proteínas de fusión con FOS al N-término en E. coli. El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios NotI/EcoRV (o NotI/Hindi) del vector. El residuo de metionina N-términal es proteolíticamente removido después de la síntesis de proteínas. (Hirel y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8247-8251 (1989)).

5. pAV5: Este vector se diseñó para la producción eucariótica de las proteínas de fusión con FOS al C-término. El gen de interés (g.d.i) puede insertarse entre las secuencias codificantes para la secuencia de señal hGH y el dominio FOS por ligación en los sitios Eco47III/NotI del vector. Alternativamente, un gen que contiene su propia secuencia de señal puede fusionarse a la región codificante FOS por ligación en los sitios Suti/NotI.

6. pAV6: Este vector se diseñó para la producción eucariótica de las proteínas de fusión con FOS al N-término. El gen de interés (g.d.i) puede ligarse en los sitios NotI/StuI (o NotI/Hindi) del vector.

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Como se entenderá por aquellos en la técnica, la construcción de una proteína de fusión determinante antigénica o antígeno FOS, puede incluir la adición de ciertos elementos genéticos para facilitar la producción de la proteína recombinante. El Ejemplo 4 proporciona guía para la adición de ciertos elementos regulatorios E. coli, para traducción y el Ejemplo 7 proporciona guía para la adición de una secuencia de señal eucariótica. Se pueden seleccionar otros elementos genéticos, dependiendo de las necesidades específicas del facultativo.

La invención está también considerada por incluir la producción de la proteína de fusión de determinante antigénico FOS o antígeno FOS, ya sea en las células bacterianas (Ejemplo 5) o eucarióticas (Ejemplo 8). La selección de cual tipo de célula en la cual se expresa la proteína de fusión está dentro del conocimiento del artesano experto, dependiendo de los factores tal como si las modificaciones post-traduccionales son en consideración importante en el diseño de la composición.

Como se notó previamente, la invención describe varios métodos para la construcción de una proteína de fusión de determinante antigénico FOS o antígeno FOS, a través del uso de los vectores pAV. Además de permitir la expresión procariótica y eucariótica, estos vectores permiten al facultativo, seleccionar entre -la adición al C-terminal al antígeno del dominio de la proteína de cierre leucina FOS. Se proporcionan aquí ejemplos específicos - y las fusiones Fos C-terminales se elaboran para PLA (Ejemplo 9) y ovlabúmina (Ejemplo 10). El ejemplo 11 demuestra la purificación de las proteínas de fusión FOS PLA y ovalbúmina.

En una realización más específica, la invención se dirige a un determinante antigénico o antígeno codificado por el genoma del VIH. Más específicamente, el antígeno VIH es gp 140. Como está provisto para los Ejemplos 11-15, el VIH gp140 puede crearse con un dominio de la proteína de cierre de leucina FOS, y la proteína de fusión sintetizada y purificada para unirse al andamio molecular no natural de la invención. Como un experto en la técnica podrá saber, se pueden usar otros determinantes antigénicos o antígenos en la creación de una composición de la invención.

En una realización más específica de la invención, el segundo sitio de unión seleccionado es un residuo de cisteína, el cual se asocia específicamente con un residuo de lisina del andamio molecular no natural de la invención. El enlace químico del residuo de lisina (Lys) y residuo de cisteína (Cys) proporciona una base para la formación de un arreglo determinante antigénica o antígeno repetitivo y organizado en la superficie del andamio. El residuo de cisteína puede diseñarse en la estructura al determinante antigénico o antígeno de selección a ya sea el término amino, término carboxilo o internamente localizado en la proteína si se desea. Por medio del ejemplo, PLA y VIH gp140 se proporciona con un residuo de cisteína para el enlace a un primer sitio de unión del residuo de lisina.

C. Preparación de las Partículas Alfavaccinas

La invención proporciona nuevas composiciones y métodos para la construcción de arreglos de antígenos ordenados y repetitivos. Como un experto en la técnica podrá saber, las condiciones para el ensamble del arreglo de antígeno ordenado y repetitivo dependen de una gran extensión en la selección específica del primer sitio de unión del andamio no natural y la selección específica del segundo sitio de unión del determinante antigénico o antígeno. Así, la selección del facultativo en el diseño de la composición (es decir, la selección de los primeros y segundos sitios de unión, andamio de antígeno y no natural), determinará las condiciones específicas para el ensamble de la partícula Alfavaccina (el arreglo de antígeno repetitivo y ordenado y el andamio molecular natural combinado). Información con relación al ensamble de la partícula alfa vaccina está también dentro del conocimiento de trabajo del facultativo, y existen numerosas referencias para auxiliar al facultativo (por ejemplo, Sambrook, J. y cols., eds. MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. y cols., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2^{nd}. Edición (1998), de las cuales todas están incorporadas aquí por referencia.

En una realización específica de la invención, los dominios de la proteína de cierre de leucina JUN y FOS, se utilizan para los primeros y segundos sitios de unión de la invención, respectivamente. En la preparación de las partículas alfavaccina, el antígeno podrá producirse y purificarse bajo condiciones para promover el ensamble del arreglo de antígeno ordenado y repetitivo en el andamio no natural. En la realización del dominio de la proteína de cierre de la leucina JUN/FOS particular, el determinante FOS-antigénico o FOS-antígeno, deberá tratarse con un agente de reducción (por ejemplo, Ditiotreitol (DTT), para reducir o eliminar la incidencia de la formación del enlace disulfuro (Ejemplo 15).

Para la preparación del andamio no natural (es decir, el virus Sinbis recombinante) de la realización del dominio de la proteína de cierre de leucina JUN/FOS, las partículas virales E2-JUN recombinantes, deberán concentrarse, neutralizarse y tratarse con el agente de reducción (véase Ejemplo 16).

El ensamble del arreglo de antígeno ordenado y repetitivo en la realización JUNE/FOS se hace en la presencia de un desorden redox. Las partículas virales E2-JUN se combinan con un exceso molar de 240 partes de determinante FOS-antígeno o FOS-antigénico por 10 horas a 4ºC. Seguidamente, la partícula AlfaVaccina se concentra y purifica por cromatografía (Ejemplo 16).

En otra realización de la invención, el acoplamiento del andamio molecular no natural al determinante antigénico o antígeno, se puede acompañar por la reticulación química. En una realización más preferida, el agente químico es un agente de reticulaión hetero-bifuncional tal como el éster N-hidroxisuccinimida del ácido \varepsilon-maleimidopróico (Tanimori y cols., J. Pharm. Dyn 4:812 (1981); Fujiwara y cols., J. Immunol. Meth 45:195 (1981), el cual contiene (1) un grupo reactivo de succinimida con grupos amino y (2) un grupo reactivo maleimida con grupos SH. Una proteína heteróloga o polipéptido del primer sitio de unión puede ser diseñada genéticamente por contener uno o más residuos de lisina que servirán como una porción reactiva para la porción de succinimida del agente de reticulación hetero-bifuncional. Una vez acoplado químicamente a los primeros sitios de unión del andamio molecular no natural, en grupo maleimida del agente de reticulación hetero-bifuncional, estará disponible para reaccionar con el grupo SH de un residuo de cisteína en el determinante antigénico o antígeno. La preparación del determinante antigénico o antígeno en este ejemplo, puede requerir el diseño por ingeniería genética, de un residuo de cisteína en la proteína o polipéptido seleccionado como el segundo sitio de unión, de manera que pueda hacerse reaccionar a la función maleimida libre en el agente de reticulación enlazado al primer sitio de unión del andamio molecular no natural.

3. Composiciones, Vacunas y la Administración de las Mismas, Métodos de Tratamiento

En una realización de la invención, las composiciones de la invención se pueden usar en el diseño de las vacunas para el tratamiento de alergias. Los anticuerpos del isotipo IgE son componentes importantes en las reacciones alérgicas. Los mastocitos se enlazan a los anticuerpos IgE en su superficie y liberan histaminas y otros mediadores de respuesta alérgica después del enlace del antígeno específico a las moléculas IgE enlazadas en la superficie de los mastocitos. La inhibición de la producción de los anticuerpos IgE, por lo tanto, es un objetivo prometedor para proteger contra las alergias. Esto deberá ser posible alcanzando una respuesta a las células auxiliadoras T deseadas. Las respuestas a las células auxiliadoras T se pueden dividir en respuestas a las células auxiliadoras T tipo 1 (T_{H}1) y tipo 2 (T_{H}2) (Romagnani, Immunol. Today 18:263-266 (1997)). Las células T_{H}1 secretan interferona-gama y otras citocinas las cuales provocan que las células B produzcan anticuerpos IgG1-3. En contraste, una citosina crítica producida por las células T_{H}2 es IL-4, las cuales accionan a las células B para producir IgG4 e IgE. En muchos sistemas experimentales, el desarrollo de las respuestas T_{H}1 y T_{H}2 es mutuamente exclusiva puesto que las células T_{H}1 suprimen la inducción de las células T_{H}2 y viceversa. Así, los antígenos que disparan una respuesta T_{H}1 fuerte simultáneamente suprimen el desarrollo de las respuestas T_{H}2 y por lo tanto, la producción de los anticuerpos IgE. De manera interesante, virtualmente todos los virus inducen una respuesta T_{H}1 en el anfitrión y fallan al disparar la producción de los anticuerpos IgE (Coutelier y cols., J. Exp. Med. 165:64-69 (1987)). Este modelo de isotipo no está restringido a virus vivos, pero también se han observado por partículas virales recombinantes o inactivadas (Lo-Man y cols., Eur. J. Immunol 28:1401-1407 (1998)). Así, mediante el uso de los procesos de la invención (por ejemplo, Tecnología AlfaVaccina), las partículas virales se pueden decorar con varios alérgenos y usarse para inmunización. Debido a la "estructura viral" resultante del alérgeno, se estimulará una respuesta TH1, los anticuerpos IgG1-3 "protectivos" se producirán, y la producción de los anticuerpos IgE los cuales causan reacciones alérgicas se prevendrán. Puesto que tal alérgeno está presentado por las partículas virales las cuales son reconocidas por una serie diferente de células T auxiliadoras que el alérgeno mismo, es probable que los anticuerpos IgG1-3 se inducirán aún en individuos alérgicos albergados PRE-existente en las células TH2 específicas para el alérgeno. La presencia de altas concentraciones de anticuerpos IgG puede prevenir el enlace de los alérgenos a los mastocitos enlazados IgE, con ello, se inhibe la liberación de histamina. Así, la presencia de anticuerpos IgG puede proteger de reacciones alérgicas mediadas por IgE. Las substancias típicas que causan alergias incluyen: pasto, ambrosía, polen de cedro de montaña o abedul, polvo de casa, ácaros, caspa animal, tierra vegetal, veneno de insecto o fármacos (por ejemplo, penicilina). Así, la inmunización de individuos con partículas virales decoradas con alérgenos deberá ser benéfica no solamente antes sino también después del comienzo de las alergias.

Como podrá entenderse por un ordinario experto en la técnica, cuando las composiciones de la invención se administran a individuos, puede estar en una composición la cual contiene sales, amortiguadores, adyuvantes u otras substancias las cuales son deseables para el mejoramiento de la eficacia de la composición. Se proporcionan los Ejemplos de materiales adecuados para usarse en la preparación de composiciones farmacéuticas en numerosas fuentes incluyendo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A. Ed., Mack Publishing Co., (1980)).

Las composiciones de la invención se dice son "farmacéuticamente aceptables" si su administración puede ser tolerada por un recipiente individual. Además, las composiciones de la invención se administrarán en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (es decir, una cantidad que produce un efecto fisiológico deseado).

Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas por varios métodos conocidos en la técnica, pero normalmente de administrarán por inyección, infusión, inhalación, administración oral, u otros métodos físicos adecuados. Las composiciones pueden alternativamente, ser administradas intramuscularmente, intravenosamente o subcutánea. Los componentes de las composiciones para administración incluyen soluciones acuosas o no acuosas (por ejemplo, salina fisiológica) estériles y suspensiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tal como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículoso rellenos oclusivos se pueden usar para incrementar la permeabilidad de la piel e incrementar la absorción del antígeno.

Además de las tecnologías de vacunas, otras realizaciónes de la invención se dirigen a métodos de tratamiento médico de cáncer y alergias.

Todas las patentes y publicaciones referidas aquí, están expresamente incorporadas por referencia.

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Ejemplos

Las enzimas y reactivos usados en los experimentos siguientes incluyen: ligasa de ADN T4 obtenida de New England Biolabs; Polimerasa de ADN Taq, Equipo QIAprep Spin Plasmid, QUIAGEN Plasmid Midi Kit, Equipo de extracción en Gel QuiaExII, Euipo de Purificación por PCR QIAquick obtenido de QUIAGEN; Equipo de Purificación de ARNm Micro QuickPrep obtenido de Pharmacia; SuperScript One-Step RT PRC Kit, suero de ternero fetal (FCS), extracto de levadura y bacto-triptona obtenidos de Gibco BRL; Oligonucleótidos obtenidos de Microsynth (Suiza); endonucleasas de restricción obtenidas de Boehringer Mannheim, New England Biolabs o Fermentos MBO; polimerasa Pwo y dNTPs obtenidas de Boehringer Mannheim. El medio HP-1 se obtuvo de las tecnologías de cultivos Celulares (Glattbrugg, Suiza). Se obtuvieron todos los estándares químicos a partir de Fluka-Sigma-Aldrich, y todos los materiales de cultivos celulares se obtuvieron de TPP.

Se llevaron a cabo las manipulaciones de ADN usando técnicas estándar. El ADN se preparó de conformidad con la instrucción del fabricante ya sea de un cultivo bacteriano de 2 ml usando el Equipo de Plasmido giratorio QUIAprep o de un cultivo de 50 ml usando el Equipo Midi de Plasmido QUIAGEN. Para la digestión de la enzima de restricción, el ADN se incubó al menos, 2 horas con la enzima de restricción apropiada a una concentración de 5-10 unidades (U) de enzima por mg de ADN bajo las condiciones recomendadas por el fabricante (amortiguador y temperatura). Se realizaron simultáneamente las digestiones con más de una enzima, si las condiciones de reacción fueron apropiadas para todas las enzimas, o de otro modo, consecutivamente. Los fragmentos de ADN aislados para manipulaciones adicionales se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 0.7 a 1.5%, escindido del gel y purificado con el Equipo de Extracción de Gel QuiaExII de conformidad con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Para la ligación de los fragmentos de ADN, 100 a 200 pg del vector de ADN purificado se incubaron durante la noche con un exceso molar de tres partes del fragmento insertado a 16ºC en la presencia de ligasa de ADN T4 U en el amortiguador proporcionado por el fabricante (volumen total: 10-20 \mul). Una alícuota (0.1 a 0.5 \mul) de la reacción de ligación se usó para la transformación de E. coli XLI-Blue (Stratagene). La transformación se hizo por electroporación usando un Pulsador de Gen (BioRAD) y 0.1 cm de Probetas del Pulsador de Gen (BioRAD) a 200 \Omega, 25 \muF, 1.7 kV. Después de la electroporación, las células se incubaron con sacudimiento por 1 hora en 1 ml de medio S.O.B (Miller, 1972) antes del blindaje en agar S.O.B selectivo.

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Ejemplo 1 Inserción del dominio de hélice anfifática JUN con E2

En el vector pTE5'2J (Hahn y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2679-2683, (1992)), los sitios de enzima de restricción MluI y BstEII, se introdujeron entre los codones 71 (Gln) y 74 (THr) de la secuencia codificante E2 de la proteína estructural, que resulta en el vector pTE5'2JBM. La introducción de estos sitios de enzima de restricción se hizo por PCR usando los siguientes oligonucleótidos:

3

Para la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo se usó con 5 ng del ADN modelo en una mezcla de reacción de 100 \mul, que contienen 4 unidades de polimerasa Pwo o Taq, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO_{4}. Todas las concentraciones se determinaron fotométricamente usando el aparato GeneQuant (Pharmacia). La polimerasa se agregó directamente antes del comienzo de la reacción de PCR (punto de inicio fue 95ºC). El funcionamiento cíclico de la temperatura se hizo de la siguiente manera y orden. 95ºC por 2 minutos; 5 ciclos de 95ºC (45 segundos), 53ºC (60 segundos), 72ºC (80 segundos); y 25 ciclos de 95ºC (45 segundos), 57ºC (60 segundos), 72ºC (80 segundos).

Los dos fragmentos de PCR se analizaron y purificaron por electroforesis en gel de agarosa. El ensamble de PCR en los dos fragmentos usando oligo 3 y oligo 4 para amplificación, se llevó a cabo para obtener el constructo final.

Para el ensamble de la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo se usó con 2 ng de los fragmentos de PCR purificados en una mezcla de reacción de 100 \mul que contiene 4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM MgSO_{4}. Todas las concentraciones de ADN se determinaron fotométricamente usando el aparato GeneQuant (Pharmacia). La polimerasa se agregó directamente antes del inicio de la reacción de PCR (el punto inicial fue de 95ºC). El funcionamiento de la temperatura cíclica se hizo de la siguiente manera y orden: 95ºC por 2 minutos; 5 ciclos de 95ºC (45 segundos), 57ºC (60 segundos), 72ºC (80 segundos); y 25 ciclos de 95ºC (45 segundos), 59ºC (60 segundos), 72ºC (90 segundos).

El producto de PCR final se purificó usando columnas de PCR giratorias Quia (Quiagen) y se digirió en un amortiguador apropiado usando 10 unidades cada uno de ssHII y endonucleasas de restricción StuI por 12 horas a 37ºC. Los fragmentos de ADN se purificaron en gel y se ligaron en BssHII/SuI digerido y el vector pTE5'2J purificado en gel (Hahn y cols., Proc. NATL. Acad. Sci. USA 89:2679-2683). La inserción correcta del producto de PCR se analizó primero por el análisis de restricción BstEII y MluI y después el secuenciamiento de ADN del fragmento de PCR.

La secuencia de ADN codificante para el dominio de hélice anfifática JUN, se amplificó por PCR a partir del vector pJuFo (Crameri y Suter, Gene 137:69 (1993)) usando los siguientes oligonucleótidos:

4

Para la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo se usaron con 5 ng del ADN patrón en una mezcla de reacción de 100 \mul que contiene 4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO_{4}. Todas las concentraciones de ADN se determinaron fotométricamente usando el aparato GeneQuant (Pharmacia). La polimerasa se agregó directamente antes del comienzo de la reacción de PCR (el punto inicial fue de 95ºC). El funcionamiento cíclico se hizo en el siguiente orden y manera: 95ºC por 2 minutos; 5 ciclos de 95ºC (45 segundos), 60ºC (30 segundos), 72ºC (25 segundos); y 25 ciclos de 95ºC (45 segundos), 68ºC (30 segundos), 72ºC (20 segundos).

El producto de PCR final se purificó en gel y se ligó en pBluescript II (KS-) purificado en gel y se digirió en EcoRV. A partir del vector resultante, la secuencia JUN se aisló por la escisión con MluI/BstEII purificado con QiaExII y se ligó en el vector pTE5'2BJM (cortado previamente con las mismas enzimas de restricción) para obtener el vector pTE5'2J:E2JUN.

Ejemplo 2 Producción de partículas virales que contienen E2-JUN usando el sistema pCYTts

Las proteínas estructurales se amplificaron por PCR usando el pTE5'2J:E2JUN como patrón y los XbalStruct de oligonucleótidos.

(ctatcaTCTAGAATGAATAGAGGATTCTTTAAC) (SEC ID NO: 12) y StructBsp 1201 (tcgaatGGGCCCTCATC
TTCGTGTGCTAGTCAG) (SEC ID NO:87). Para el PCR, 100 pmol de cada oligo se usó y 5 ng del ADN de patrón se usó en la mezcla de reacción de 100 \mul, que contiene 4 unidades de polimerasa Tac o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO_{4}. Todas las concentraciones de ADN se determinaron fotométricamente usando el aparato GeneQuant (Pharmacia). La polimerasa se agregó directamente antes del inicio de la reacción de PCR (el punto inicial fue de 95ºC). Los ciclos de temperatura fueron como sigue. 95ºC por 3 minutos, seguidos por 5 ciclos de 92ºC (30 segundos), 54ºC (35 segundos), 72ºC (270 segundos); y seguida por 25 ciclos de 95ºC (30 segundos), 63ºC (35 segundos), 72ºC (270 segundos). El producto de PCR se purificó en gel y se digirió con las enzimas de restricción XbaI/Bsp1201 y se ligó en el vector pCYTts previamente escindido con las mismas enzimas (Solicitud de Patente Estadounidense Sol. No. 60/079,562; Presentada el 27 Marzo de 1998).

Veinte \mug de pCYTtsE2:JUN se incubaron con 30 U de ScaI en un amortiguador apropiado por al menos, 4 horas a 37ºC. La reacción se detuvo por la extracción de fenil/cloroformo, seguida por la precipitación de isopropalon del ADN linearizado. La reacción de restricción se verificó por electroforesis en gel de agarosa. Para la transfección, 5.4 \mug de pCYTtsE2:JUN linearizado se mezclaron con 0.6 \mug de pSV2Neo linearizado en 30 \mul de H_{2}O y se agregó una solución de 30 \mul de CaCl_{2} 1 M. Después de la adición de 60 \mul de amortiguador de fosfato (50 mM de HEPES, 280 Mn de NaCl, 1.5 mM de Na_{2}, HPO_{4}, pH 7.05), la solución se sometió a vórtices por 5 segundos, seguida por una incubación a temperatura ambiente por 25 segundos. La solución se agregó inmediatamente a 2 ml de medio HP-1 que contiene FCS al 2% (medio FCS al 2%). El medio de un cultivo de células BHK21 al 80% de confluencia en una placa de 6 pozos entonces se reemplazo con el ADN que contiene el medio. Después de una incubación por 5 horas a 37ºC en un incubador con CO2, el ADN que contiene el medio se removió y se reemplazó por 2 ml de glicerol al 15% en medio FCS al 2%. El medio que contiene el glicerol se removió después de una fase de incubación de 30 segundos, y las células se lavaron por el enjuague con 5 ml de un medio de HP-1 que contiene FCS al 10%. Finalmente se agregaron 2 ml del medio de HP-1 fresco que contiene FCS al 10%.

Las células establemente transfectadas se seleccionaron y se hicieron crecer en un medio de selección (medio HP-1, suplementado con G418) a 37ºC en un incubador con CO_{2}. Cuando la población mezclada se hizo crecer a confluencia, el cultivo se dividió en dos discos, seguido por un periodo de 12 horas de crecimiento a 37ºC. Un disco de las células se cambió a 30ºC para inducir la expresión de las partículas virales; el otro disco se mantuvo a 37ºC.

La expresión de las partículas virales se determinó por el manchado Western (Figura 1). El medio de cultivo (0.5 ml) fue metanol/cloroformo precipitado, y la pelotilla se resuspendió en un amortiguador de muestra SDS-PAGE. Las muestras se calentaron por 5 minutos a 95ºC antes de ser aplicadas a gel de acrilamida al 15%. Después del SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de Protano (Schleicher & Schuell, Alemania) como se describe por Bass y Yang, en Creighton, T. E., ed., Protein Function: A Practical Approach, 2da. Edición., IRL Press, Oxford (1997), pp-29-55. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (10 x TBS por litro: 87.7 g NaCl, 66.1 g de clorhidrato de Trizma (Sigma) y 9.7 g de base Trizma (Sigma), pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por una incubación con un anticuerpo anti-E1/E2 (suero policlonal) por 1 hora. El manchado se lavó tres veces por 10 minutos con TBS-T (TBS con Tween 20 al 0.05%), y se incubó por 1 hora con un conjugado IgG anti-conejo de fosfatasa alcalina (0.1 \mug/ml, Amersham Life Science, Inglaterra). Después de lavar 2 veces por 10 minutos con TBS-T y 2 veces por 10 minutos con TBS, el desarrollo de la reacción se llevó a cabo usando reactivos de detección de fosfatasa alcalina (10 ml de amortiguador AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) con 50 \mul de una solución de NBT (Tetrazolio Nitro Blue al 7.7% (Sigma) en dimetilformamida al 70%), y 37 \mul de una solución de X-fosfato (5% de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo en dimetilformamida).

La producción de las partículas virales se muestra en la Figura 1. El patrón del manchado Western mostró que E2-JUN (línea 1) migró a un peso molecular superior en SDS-PAGE, comparado con el tipo silvestre E2 (línea 2) y la línea de células anfitrionas BHK21 no mostró ningún antecedente.

Ejemplo 3 Producción de partículas virales que contienen E2-JUN usando el vector pTE5'2JE2:JUN

El vector libre RNase (1.0 \mug) se linearizó por digestión PvuI. Seguidamente, se llevó a cabo la transcripción in vitro usando un equipo de transcripción in vitro SP6 (InvitroscripCAP por InvitroGen, Invitrogen BV, NV Leek, Holanda). El ARNm 5'-coronado resultante, se analizó en una reducción en gel de agarosa.

El ARNm transcrito in vitro (5 \mug) se electroporó en células BHK21 (ATCC:CCL10) de conformidad con el manual de Invitrogen (Sistema de Expresión Sindbis, Invitrogen BV, Holanda). Después de 10 horas de incubación a 37ºC, el medio que contiene FCS se intercambió por el medio HP-1 sin FCS, seguido por una incubación adicional a 37ºC por 10 horas. El sobrenadante se cultivó y analizó por el análisis de manchado Western para la producción de partículas virales exactamente como se describe en el Ejemplo 2.

El resultado obtenido fue idéntico a uno obtenido con pCYTtsE2:JUN como se muestra en la Figura 2.

Ejemplo 4 Fusión de la hormona de crecimiento humana (hGH) al dominio de cierre de leucina FOS (secuencia de señal OmpA)

El gen hGH sin la secuencia líder humana se amplificó a partir del plasmido original (ATCC 31389) por PCR. El oligo 7 con un sitio XbaI interno, se diseñó por ablandamiento al extremo 5' del gen hGH, y oligo 9 con un sitio EcoRI interno cebado al extremo 3' del gen Hgh. Para La reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo y 5 ng del patrón de ADN se usaron en 75 \mul de la mezcla de reacción (4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO4).

El funcionamiento cíclico de la PCR se realizó de la siguiente manera: 30 ciclos con una temperatura de annealing de 60ºC y un tiempo de elongación de 1 minuto a 72ºC.

El producto de PCR aislado y purificado en gel, se usó como un patrón para una segunda reacción de PCR para introducir la secuencia de señal ompA y la secuencia Shine-Dalgarno. Para la reacción de PCR, 100 pmol del oligo 8 y oligo 9 y 1 ng del fragmento del PCR patrón, se usaron en 75 \mul de la mezcla de reacción (4 unidades de polimerasa Taq o Pow, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO_{4}). La temperatura de ablandamiento para los primeros cinco ciclos fue a 55ºC con un tiempo de elongación de 60 segundos a 72ºC; otros 25 ciclos se realizaron con una temperatura de ablandamiento de 65ºC y un tiempo de elongación de 60 segundos a 72ºC.

5

El gen hGH recombinante resultante se subclonó en pBluescript vía XbaI/EcoRI. La secuencia correcta de ambas hebras se confirmó por el secuenciamiento de AND.

La secuencia de ADN codificante para el dominio de hélice anfifática FOS se amplificó con PCR a partir del vector pJuFo (Crameri & Suter Gen 137:69 (1993)) usando los oligonucleótidos.

Omp-FOS:

6

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fos-HGH:

7

Para la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo y 5 ng del patrón de ADN se usaron en 75 \mul de la mezcla de reacción (4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO_{4}). Los ciclos de temperatura fueron como sigue:

95ºC por 2 minutos, seguidos por 5 ciclos de 95ºC (45 segundos), 60ºC (30 segundos), 72ºC (25 segundos) y seguido por 25 ciclos de 95ºC (45 segundos), 68ºC (30 segundos), 72ºC (20 segundos).

El producto de PCR se purificó, aisló y clonó en el pBluescript-ompA-hGH digerido con StuI. El gen híbrido entonces se clonó en el plasmido pKK223-3 (Pharmacia).

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Ejemplo 5 Expresión Bacteriana de FOS-hGH

El ompA-FOS-hGH en pkk223-3 se expresó bajo el control del promotor dependiente de IPTG inducible usando JM101 como la cepa anfitriona E. coli. La expresión se realizó en matraces sacudidores. Las células se indujeron con 1 mM de IPTG (concentración final) a un OD600 de 0.5. La expresión se continuó por 10 horas a 37ºC. Las células se cultivaron por centrifugación a 3600 a 10ºC por 15 minutos. La pelotilla celular se congeló (-20ºC) o N_{2} liq.) y se almacenó por 16 horas. La pelotilla entonces se cebó a 4ºC y se resuspendió en 10 ml de 10 mM de Tris-HCl, pH 7.4 que contiene 600 mM de sacarosa. Después de la agitación por 15 minutos a 4ºC, las proteínas periplásmicas se liberaron por un enfoque de golpe osmótico. Se agregó H_{2}O desionizada fría (4ºC), y la suspensión se agitó por 30 minutos a 4ºC. El lodo se diluyó, resuspendió y se agregó la lisozima para degradar la pared celular de la bacteria. Las células y los esferoplastos de la fracción periplásmica se separaron por centrifugación por 20 minutos a 11000 g a 4ºC. El sobrenadante que contiene FOS-hGH se analizó por reducción y el SDS-Page sin reducción y manchado Dot. El manchado Dot se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 8, usando un anticuerpo anti-hGH (Sigma) como el primer anticuerpo y un conjugado anticuerpo anti-ratón (AP) de fosfatasa alcalina al segundo
anticuerpo.

El FOS-hGH correctamente procesado, de longitud completa, podrá detectarse bajo condiciones de reducción y no reducción. Parte del FOS-hGH se enlazó a otras proteínas no identificadas debido a las cisteínas libres presentes en la hélice anfifática FOS. Sin embargo, más del 50% del FOS-hGH expresado, se dio en su conformación monomérica nativa (Figura 3).

El FOS-hGH purificado, se usará para realizar los primeros experimentos de dopaje con partículas virales que contiene JUN.

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Ejemplo 6 Construcción de la serie de vectores pAV para la expresión de las proteínas de fusión FOS

Se construyó un sistema de vector versátil que permitió ya sea la producción o secreción citoplásmica de - las proteínas de fusión FOS C-terminal en E. coli o producción de- proteínas de fusión FOS C-terminal en células eucarióticas. Los vectores pAV1 - pAV4 los cuales se diseñaron para la producción de las proteínas de fusión FOS en E. coli, abarcan los casetes de ADN listados abajo, los cuales contienen los siguientes elementos genéticos colocados en diferentes órdenes: (a) un sitio de enlace al ribosoma fuerte y una región no traducida 5' derivada del gen ompA de E. coli (aggaggtaaaaaacg) (SEC ID NO:13); (b) una secuencia que codifica al péptido de señal OmpA de la proteína de membrana exterior de E. coli (MKKTAIAIAVALAGFATVAQA) (SEC ID NO:14); (c) una secuencia codificante para el dominio de dimerización FOS flanqueado en ambos aldos por dos residuos de lisina y un residuo de
cisteína.

(CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC) (SEC ID NO:15); y (d) una región que codifica un enlazador peptídico corto (AAASGG (SEC ID NO:16) O GGSAAA (SEC ID NO:17)), que conecta a la proteína de interés con el dominio de dimerización FOS. Las regiones codificantes relevantes están dadas en letras en casillas superiores. El arreglo de los sitios de escisión de restricción, permite la fácil construcción de los genes de fusión FOS con o sin una secuencia de señal. Los casetes son clonados en los sitios de restricción EcoRI/Hindi del vector de expresión pKK223-3 (Pharmacia) para la expresión de los genes de fusión bajo el control del promotor tac fuerte.

pVA1

Este vector se diseñó para la secreción de las proteínas de fusión con FOS al C-término en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios StuI/NotI del vector.

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8

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pVA2

Este vector se diseñó para la secreción de las proteínas de fusión con FOS al N-término en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios NotI/EcoRV (o NotI/Hindi) del vector.

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10

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pVA3

Este vector se diseñó para la producción citoplásmica de proteínas de fusión con FOS al C-término en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios EcoRV/NotI del vector.

11

pVA4

Este vector se diseñó para la producción citoplásmica de las proteínas de fusión con FOS al N-término en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios NotI/EcoRV del vector. El residuo de metionina N-terminal se remueve proteolíticamente después de la síntesis de proteínas (Hirel y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8247-8251 (1989)).

12

Los vectores pAV5 y pAV6, los cuales se diseñaron para la producción eucariótica de las proteínas de fusión FOS, abarcan los siguientes elementos genéticos colocados en diferentes órdenes: (a) una región codificante para el péptido líder de la hormona de crecimiento humana (MATGRSTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA) (SEC ID NO:26); (b) una secuencia codificante para el dominio de dimerización FOS flanqueado en ambos lados por dos residuos de glicina y un residuo de cisteína.

13

(c) una región que codifica a un enlazador peptídico corto (AAASGG (SEC ID NO:16) O GGSAAA (SEC ID NO:17)) que conecta a la proteína de interés con el dominio de dimerización FOS. Las regiones codificantes relevantes están dadas en letras mayúsculas. El arreglo de los sitios de escisión de restricción permiten la fácil construcción de los genes de fusión FOS. Los casetes se clonan en los sitios de restricción EcoRI/HindIII del vector de expresión pMPSVEH (Artelt y cols., Gene 68:213-219 (1988)).

pVA5

Este vector se diseñó para la producción eucariótica de las proteínas de fusión con FOS al C-término. El gen de interés (g.d.i) puede insertarse entre las secuencias codificantes para la secuencia de señal hGH y el dominio FOS por la ligación en los sitios Eco47III/NotI del vector. Alternativamente, un gen que contiene su propia secuencia de señal se puede fusionar a la región codificante FOS por la ligación en los sitios StuI/NotI.

14

15

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pVA6

Este vector se diseñó para la producción eucariótica de las proteínas de fusión con FOS al N-término. El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios NotI/StuI (o NotI/HindIII) del vector.

16

: (SEC ID NO:29)

: (SEC ID NO:30)

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Construcción de los vectores de expresión pAV1-pAV6

Se han sintetizaron los siguientes oligonucleótidos para la construcción de los vectores de expresión pAV1-pAV6:

17

Para La construcción del vector pAV2, las regiones codificantes para la secuencia de señal OmpA y el dominio FOS se amplificaron a partir del gen de fusión ompA-FOS-hGH en el vector pKK223-3 (véase Ejemplo 5), usando el par cebador OmpA-FOR1/FOS-REV2. El producto PCR se digirió con EcoRI/Hindi y se ligó en los mismos sitios del vector pKK223-(Pharmacia).

Para la construcción del vector pAV1, la región codificante FOS se amplificó a partir del gen de fusión ompA-FOS-hGH en el vector pKK223-3 (véase Ejemplo 5), usando el par cebador FOS-FOR1/FOS-REV1. El producto de PCR se digirió con HindIII y se ligó en pAV2 del vector digerido con StuI/HindIII.

Para la construcción del vector pAV3, la región codificante para el dominio FOS se amplificó del vector pAV1 usando el par cebador FOS-FOR2/FOS-REV1. El producto PCR se digirió con EcoRI/HindIII y se ligó en los mismos sitios del vector pKK223-3 (Pharmacia).

Para la construcción del vector pAV4, la región codificante para el dominio FOS se amplificó a partir del gen de fusión ompA-FOS-hGH en el vector pKK223-3 (véase Ejemplo 5), usando el par cebador FOS-FOR3/FOS-REV2. El producto de PCR se digirió con EcoRI/HindIII y se ligó en los mismos sitios del vector pKK223-3 (Pharmacia).

Para la construcción del vector pAV5, la región codificante para la secuencia de señal hGH se amplificó a partir del gen de fusión hGH-FOS-hGH en el vector pSINrep5 (véase Ejemplo 7), usando el par cebador hGH-FOR1/hGHREV1. El producto de PCR se digirió con EcoRI/NotI y se ligó en los mismos sitios del vector pAV1. El casete resultante que codifica a la secuencia de señal hGH y el dominio FOS entonces se aisló por digestión EcoRI/HindIII y se clonó en el vector pMPSVEH (Artelt y cols., Gene 68:213-219 (1988)) se digirió con las mismas enzimas.

Para la construcción del vector pAV6, la región codificante FOS se amplificó a partir del vector pAV2 usando el par cebador FOS-FOR4/FOSREV3. El producto de PCR se digirió con HindIII y se clonó en el vector pAV5 escindido Eco47III/HindIII. El casete completo que codifica a la secuencia de señal hGH y el dominio FOS entonces se reamplificaron a partir del vector resultante usando el par cebador hGH-FOR2/FOSREV3, escindido con EcoRI/HindIII y ligado en el vector pMPSVEH (Artelt y cols., Gene 68:213-219 (1988) escindido con las mismas enzimas.

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Ejemplo 7 Construcción del FOS-hGH con la secuencia de señal (hGH) humana

Para la expresión eucariótica de la proteína de fusión FOS-hGH. El gen de fusión OmpA-FOS-hGH se aisló a partir de pBluescript::OmpA-FOS-hGH (véase Ejemplo 4), por digestión con XbaI/Bps120I y se clonó en el vector pSINrep5 (Invitrogen) escindido con las mismas enzimas. La secuencia de señal hGH se sintetizó por PCR (mezcla de reacción: 50 pmol de cad acebador, dATP, dGTP, dTTP, dCTP, (200 \muM de cada uno), 2.5 U de polimerasa de ADN Taq (Quiagen), 50 \mul del volumen total en el amortiguador suministrado por el fabricante; amplificación: 92ºC por 30 segundos, 55ºC por 30 segundos, 72ºC por 30 segundos, 30 ciclos) usando los oligonucleótidos traslapantes Sig-hGH-FOR.

18

El producto de PCR se purificó usando el equipo QuiExII, se digirió con StuI/XbaI y se ligó en el vector pSINrep5::OmpA-FAS-hGH escindido con las mismas enzimas.

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Ejemplo 8 Expresión Eucariótica de FOS-hGH

El vector libre de RNase (1.0 \mug) (pSINrep::5OmpA-FOS-hGH) y 1.0 \mug de DHEB (Bredenbeek y cols., J. Vriol 67:6439-6446 (1993)), se linearizaron por la digestión de restricción ScaI. Seguidamente, la transcripción in vitro se llevó a cabo usando un equipo de transcripción in vitro SP6 (InvitroscripCAP por InvitroGen, Invitrogen BV. NV Leek, Holanda). El ARNm 5'-coronado resultante se analizó en reducción por gel de agarosa.

5 \mug del ARNm transcrito, in vitro, se electroporaron en células BHK 21 (ATCC:CCL10) de conformidad con el manual de Invitrogen (Sistema de Expresión Sindbis, Invitrogen BV, Holanda). Después De 10 horas de incubación a 37ºC, el medio que contiene FCS se intercambió por el medio HP-1 sin FCS, seguido por una incubación adicional a 37ºC por 10 horas. El sobrenadante se cultivó y analizó por el análisis del manchado dot para la producción de FOS-hgh.

El medio de cultivo (2.5 \mul) se manchó en una membrana de nitrocelulosa y se secó por 10 minutos a temperatura ambiente. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (10xTBS por litro: 87.7 g de NaCl, 66.1 g de clorhidrato de Trizma (Sigma) y 9.7 de base Trizma (Sigma), pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, seguida por una incubación con anticuerpo hGH anti-humano de conejo 2 \mug (Sigma) en 10 ml de TBS-T (TBS con Tween20 al 0.05%) por 1 hora. El manchado se lavó 3 veces por 10 minutos con TBS-T y se incubó por 1 hora con IgG anti-conejo de conjugado de fosfatasa alcalina (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.), diluido 1:5000 en TBS-T. Después de lavar 2 veces por 10 minutos con TBS-T y 2 veces por 10 minutos con TBS, el manchado se desarrolló por el teñido AP como se describe en el Ejemplo 2. los resultados se muestran en la
Figura 3.

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Ejemplo 9 Construcción de FOS-PLA (N y C- términal)

El siguiente gen se construyó por la síntesis de gen química que codifica para una variante catalíticamente inactiva (Föster y cols., J. Allergy Clin. Immunol. 95:1229-1235 (1995)) de fosfolipasa A_{2} de veneno de abeja (PLA).

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Para la fusión de PLA al N-término del dominio de dimerización FOS, la región se amplifica usando los oligonucleótidos PLA-FOR1

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El producto de PCR se escindió con NotI y se ligó en el vector pAV1 previamente escindido con las enzimas de restricción StuI/NotI. Para la fusión de PLA al C-término del dominio de dimerización FOS, la región se amplificó usando los oligonucleótidos PLA-FOR2.

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El producto de PCR se escindió con NotI y se ligó en el vector pAV2 previamente escindido con las enzimas de restricción NotI/EcoRV.

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Ejemplo 10 Construcción del gen de fusión FOS-Ovalbúmina (N- y C-terminal)

Para la clonación de la secuencia codificante de ovalbúmina, el ARNm del tejido de oviducto de pollo se preparó usando el Equipo de Purificación de ARNm Micro QuikPrep® (Pharmacia), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Usando el Equipo de PCR RT de una etapa SuperScript® (Gibco BRL), un ADNc que codifica a la parte madura de la ovalbúmina (correspondiente a los nucleótidos 68-1222 del ARNm (McReynolds y cols, Nature 272:723-728 (1978)), es sintetizada usando los cebadores Ova-FOR1

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El producto PCR se digirió con NotI y se clonó en el vector pAV1 digerido StuI/NotI para la expresión de la proteína de fusión con el dominio de dimerización FOS al C-término. Para la producción de una proteína de fusión con el dominio de dimerización FOS al N-término, la región codificante de Ovalbúmina se amplificó a partir del vector construido (pAV1::Ova) usando los cebadores Ova-FOR2

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El producto de PCR se digiró con NotI y se clonó en el vector pAV2 digerido con NotI/EcoRV. Los fragmentos clonados se verificaron por el análisis de secuencia de AND.

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Ejemplo 11 Producción y purificación de Proteínas de Fusión de ovalbúmina de FOS y FOS-PLA

Para la producción citoplásmica de las proteínas de fusión FOS, una cepa E. coli apropiada se transformó con los vectores pAV3::PLA, pAV4::PLA, Pav3::Ova u pAV4::OVa. El cultivo se incubó en un medio rico en la presencia de ampicilina a 37ºC con sacudimientos. A una densidad óptica (550 nm) de 1, 1 mM de IPTG se agregó y la incubación continuó por otras 5 horas. Las células se cultivaron por centrifugación, se resuspendieron en un amortiguador apropiado (por ejemplo, HCl-tris, pH 7.2, 150 nM NaCl) que contiene DNase, RNase y lisozima y se disolvieron por el paso a través de una célula de presión french. Después de la centrifugación (Sorvall RC-5C, rotor SS34, 15000 rpm, 10 minutos, 4ºC), la pelotilla se resuspendió en 25 ml de amortiguador lavando el cuerpo de inclusión (20 mM de tris-HCl, 23% sacarosa, 0.5% Triton X-100, 1 mM de EDTA, pH 8) a 4ºC se centrífugo como se describe anteriormente. Este procedimiento se repitió hasta que el sobrenadante después de la centrifugación fue esencialmente claro. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en 20 ml de amortiguador de solubilización (5.5 M de clorhidrato de guanidinio, 25 mM de tris-HCl, pH 7.5) a temperatura ambiente y el material insoluble se removió por centrifugación y el subsecuente paso del sobrenadante a través de un filtro estéril (0.45 \mum). La solución de la proteína se mantuvo a 4ºC por al menos, 10 horas en la presencia de 10 mM de EDTA y 100 mM de DTT y después se dializó tres veces contra 10 volúmenes de 5.5 M de clorhidrato de guanidinio. 25 mM de tris-HCl, 10 mM de EDTA, pH 6. La solución se dializó dos veces contra 5 litros de 2 M de urea, 4 mM de EDTA, 0.1 M de NH4Cl, 20 Mm de borato de sodio (pH 8.3) en la presencia de un arrastre redox (glutationa oxidada/glutationa reducida; cisteína/cisteína). La proteína replegada se aplicó entonces a una cromatografía de intercambio iónico. La proteína se almacenó en un amortiguador apropiado con un pH arriba de 7 en la presencia de 2-10 mM de DTT para mantener los residuos de cisteína que flanquean al dominio FOS en una forma reducida. Previo al acoplamiento de la proteína con las partículas alfavirus, el DTT se removió por el paso de la solución de la proteína a través de una columna de filtración en gel
Sephadex G-25.

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Ejemplo 12 Construcción de gp140-FOS

El gen gp140 (Swiss-Prot:P03375) sin el sitio de escisión de la proteasa interna, se amplificó por PCR a partir del plasmido original pAbT4574 (ATCC 40829) que contiene el gen de longitud completa gp160, usando los siguientes oligonucleótidos:

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Para PCR I, 100 pmol de oligo VIH-1 y VIH-Cleav2 y 5 ng del patrón de ADN, se usaron en 75 \mul de la mezcla de reacción (4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO4). El funcionamiento cíclico de PCR se hizo de la siguiente manera: 30 ciclos con una temperatura de annealin de 60ºC y un tiempo de elongación de 2 minutos a 72ºC.

Para PCR II, 100 pmol del oligo VIH-extremo y VIH-Celav y 5 ng del patrón de ADN, se usaron en 75 \mul de la mezcla de reacción, (4 unidades de la polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO4). El funcionamiento cíclico del PCR se hizo de la siguiente manera: 30 ciclos con una temperatura de ablandamiento de 60ºC y un tiempo de elongación de 50 segundos a 72ºC.

Ambos fragmentos de PCR se purificaron, aislaron y se usaron en una reacción de PCR de ensamble. Para la reacción de PCR de ensamble, 100 pmol de oligo VIH-1 y VIH-final y 2 ng de cada fragmento de PCR (PCR1 y PCRII) se usaron en los 75 \mul (4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO4). El funcionamiento cíclico se hizo de la siguiente manera: 30 ciclos con una temperatura ablandamiento de 60ºC y un tiempo de elongación de 2.5 minutos a 72ºC. El producto de PCR de ensamble se digirió con XbaI y NheI. La hélice anfifática FOS se fusionó en estructura al extremo C-terminal de gp-140.

La secuencia de ADN codificante para el dominio de hélice anfifática FOS, se amplificó por PCR a partir del vector pJuFo (Crameri & Suter Gene 137:69 (1993)) usando los oligonucleótidos:

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Para la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo y 5 ng del patrón de ADN, se usaron en 75 \mul de la mezcla de reacción (4 unidades de la polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgSO4). El funcionamiento cíclico de la temperatura se hizo como sigue: 95ºC por 2 minutos, seguido por 5 ciclos de 95ºC (45 segundos), 60ºC (30 segundos), 72ºC (25 segundos) y seguido por 25 ciclos de 95ºC (45 segundos), 68ºC (30 segundos), 72ºC (20 segundos). El fragmento de PCR obtenido se digirió con NheI y Bsp120L.

El vector de expresión final para GP140-FOS se obtuvo en una ligación del fragmento 3 de ambos fragmentos de PCR en pSinRep5. El vector resultante pSinRep5-GP140-FOS se evaluó por el análisis de restricción y el secuenciamiento de ADN.

El GP140-FOS también se clonó en el pCYTts vía XbaI y Bsp120L para obtener una línea celular que expresa GP140-FOS inducible, estable.

Ejemplo 13 Expresión de GP140FOS usando pSinRep5-GP140FOS

El vector libre de Rnase (1.0 \mug) (pSinRep5-GP140FOS) y 1.0 \mug de DHEB (Bredenbeek y cols., J. Vriol 67:6439-6446 (1993)), se linearizaron por la digestión de restricción. Seguidamente, la transcripción in vitro se llevó a cabo usando un equipo de transcripción in vitro SP6 (InvitroscripCAP por InvitroGen, Invitrogen BV. NV Leek, Holanda). El ARNm 5'-coronado resultante se analizó en reducción por gel de agarosa.

El ARNm transcrito in vitro (5 \mug), se electroporó en células BHK 21 (ATCC:CCL10) de conformidad con el manual de Invitrogen (Sistema de Expresión Sindbis, Invitrogen BV, Holanda). Después De 10 horas de incubación a 37ºC, el medio que contiene FCS se intercambió por el medio HP-1 sin FCS, seguido por una incubación adicional a 37ºC por 10 horas. El sobrenadante se cultivó y analizó por el análisis del manchado Western para la producción de GP140-FOS soluble, exactamente como se describe en el Ejemplo 2.

Ejemplo 14 Expresión de GP140FOS usando pCYTs-GP140FOS

20 \mug de pCYT-GP140-FOS, se linearizaron por la digestión de restricción. La reacción se detuvo por la extracción de fenol/cloroformo, seguida por una precipitación isopropanilo del ADN linearizado. La digestión de restricción se evaluó por la electroforesis en gel de agarosa. Para la transfección, 5.4 \mug del pCYTtsGP140-FOS linearizado, se mezclaron con 0.6 \mug de pSV2Neo linearizado en 30 \mul de H2O y se agregaron 30 \mul de una solución de 1 M de CaCl2. Después de la adición de 60 \mul de amortiguador de fosfato (50 mM de HEPES, 280 mM de NaCl, 1.5 mM de Na2 HPO4, pH 7.05), la solución se sometió a vórtices por 5 segundos, seguida por una incubación a temperatura ambiente por 25 segundos. La solución inmediatamente se agregó a 2 ml del medio HP-1 que contiene FCS al 2% (placa de 6 pozos), entonces se reemplazó por el medio que contiene el ADN Después de una incubación por 5 horas a 37ºC en un incubador de CO2, el medio que contiene el ADN se removió y se reemplazó pro 2 ml de glicerol a 15% en un medio FCS al 2%. El medio que contiene el glicerol se removió después de una fase de incubación de 30 segundos y las células se lavaron por el enjuague con 5 ml de un medio de HP-1 que contiene FCS al 10%. Finalmente, se agregaron 2 ml del medio HP-1 que contiene FCS al 10%.

Las células establemente transfectadas se seleccionaron y se hicieron crecer en un medio de selección (medio HP-1 suplementado con G418) a 37ºC en un incubador de CO2. Cuando la población mezclada se hizo crecer a confluencia, el cultivo se dividió en dos discos, seguidos por un periodo de 12 horas de crecimiento a 37ºC. Un disco de las células se cambio a 30ºC para inducir la expresión de GP140-FOS soluble. El otro disco se mantuvo a 37ºC.

La expresión del GP140-FOS se determinó por el análisis del manchado Western. El medio de cultivo (0.5 ml) fue metanol/cloroformo precipitado, y la pelotilla se resuspendió en un amortiguador de muestra SDS-PAGE. Las muestras se calentaron por 5 minutos a 95ºC antes de ser aplicadas a gel de acrilamida al 15%. Después del SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de Protano (Schleicher & Schuell, Alemania) como se describe por Bass y Yang, en Creighton, T. E., ed., Protein Function: A Practical Approach, 2da. Edición., IRL Press, Oxford (1997), pp- 29-55. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (10 x TBS por litro: 87.7 g NaCl, 66.1 g de clorhidrato de Trizma (Sigma) y 9.7 g de base Trizma (Sigma), pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por una incubación con un anticuerpo GP-160 o anti-GP140 por 1 hora. El manchado se lavó tres veces por 10 minutos con TBS-T (TBS con Tween 20 al 0.05%), y se incubó por 1 hora con un conjugado IgG anti-ratón/conejo/mono/humano de fosfatasa alcalina. Después de lavar 2 veces por 10 minutos con TBS-T y 2 veces por 10 minutos con TBS, el desarrollo de la reacción se llevó a cabo usando reactivos de detección de fosfatasa alcalina (10 ml de amortiguador AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) con 50 \mul de una solución de NBT (Tetrazolio Nitro Blue al 7.7% (Sigma) en dimetilformamida al 70%), y 37 \mul de una solución de X-fosfato (5% de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo en dimetilformamida).

Ejemplo 15 Producción y Purificación de GP140FOS

Un anticuerpo anti-gp 120 se acopló covalentemente a un NHS/EDC activado por dextrano y empaquetado en una columna de cromatografía. El sobrenadante que contiene GP140FOS se cargó en la columna y después se lavó suficiente, el GP140FOS se eluyó con 0.1 M de HCl. El eluato se neutralizó directamente durante la colección usando 1M de Tris a pH 7.2 en los tubos de colección.

La formación del enlace disulfuro podría darse durante la purificación, por lo tanto, la muestra colectada es tratada con 10 mM de DTT, en 10 mM de Tris a pH 7.5 por 2 horas a 25ºC.

El DTT se removió por la diálisis subsecuente contra 10 Mm de Ms: 80 mM de NaCl pH 6.0. Finalmente, el GP140FOS se mezcló con partículas alfavirus que contienen el cierre de leucina JUN en E2 como se describe en el Ejemplo 16.

Ejemplo 16 Preparación de las Partículas de AlfaVaccina

Las partículas virales (véase Ejemplos 2 y 3), se concentraron usando Dispositivos de Filtros Centrífugos Ultralibres Miliporo con un peso molecular crítico de 100 kD de conformidad con el protocolo suministrado por el fabricante. Alternativamente, las partículas virales se concentraron por centrifugación de gradiente sacarosa como se describe en el manual de instrucción del Sistema de Expresión Sinbdis (Invitrogen, San Diego, California). El pH de la suspensión del virus se ajustó a 7.5 y las partículas virales se incubaron en la presencia de 22-10 mM de DTT por varias horas. Las partículas virales se purificaron a partir de la proteína contaminante en una columna Sephacryl S-300 (Pharmacia) (partículas virales eluidas con el volumen vacío) en un amortiguador apropiado.

Las partículas del virus purificadas se incubaron con al menos 240 partes de exceso molar de la proteína de fusión del antígeno FOS, en un amortiguador apropiado (pH 7.5-8.5) en la presencia de un arrastre de reducción (glutationa oxidada/glutationa reducida; cisteína/cisteína) por al menos, 10 horas a 4ºC. Después de la concentración de las partículas usando un Dispositivo de Filtro Centrífugo Ultralibre Milipro, ocn un peso molecular crítico de 100 kD, la mezcla se pasó a través de una columna de filtración de gel Sephacryl S-300 (Pharmacia). Las partículas virales se eluyeron con el volumen vacío.

Ejemplo 17 Fusión del hélice anfifático JUN al término amino de HBcAg (1-144)

La hélice JUN se fusionó al término amino de la secuencia de aminoácidos HBcAg 1 a 144 (constructo JUN-HBcAg). Para la construcción de la secuencia de ADN JUN-HBcAg, las secuencias que codifican a la hélice JUN y HBcAg (1-144) se amplificaron separadamente por PCR. La secuencia JUN se amplificó a partir del plasmido pJuFo usando cebadores EcoRI-JUN(s) y JUN-SacII(as). El cebador EcoRI-JUN(s) introduce un sitio EcoRI por un codón ATG de inicio. El cebador JUN-SacII(as) introduce un enlazador que codifica a la secuencia de aminoácido GAAGS. La secuencia HBcAg (1-144) se amplificó a partir del plasmido pEco63 (obtenido de ATCC No. 31518), usando cebadores JUN-HBcAg(s) y HBcAg (1-144) Hind(as). El JUN-HBcAg(s) contiene una secuencia correspondiente al extremo 3' de la secuencia codificante a la hélice JUN seguida por una secuencia que codifica al enlazador GAAGS, y al extremo 5' de la secuencia HBcAg. El HBcAg(1-144)Hind(as), introduce un codón de detención y un sitio HindIII después del codón 14 del gen HBcAg. Para las reacciones de PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón ADNs, se usaron en las mezclas de reacción 50 \mul con 2 unidades de polimerasas Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 Mm de MgSO4. Para ambas reacciones, el funcionamiento cíclico de la temperatura se llevó a cabo como sigue: 94ºC por 2 minutos; y 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos).

Secuencias cebadoras:

26

La fusión de los dos fragmentos de PCR se realizó por PCR usando cebadores EcoRI-JUN(s) y HBcAg(1-144)Hind(as). 100 pmol de cada oligo se usó con 100 ng de los fragmentos de PCR purificados en una mezcla de reacción de 50 \mul que contiene 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. Las condiciones del funcionamiento cíclico de PCR fueron: 94ºC por 2 minutos, y 35 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos). El producto de PCR final se analizó por electroforesis en gel de agarosa, se purificó y se digirió por 16 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN digerido se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII, para generar el vector de expresión pKK-JUN-HBcAg. La inserción del producto de PCR se analizó por el análisis de restricción de EcoRI/HindIII y por el secuenciamiento de ADN del inserto.

Ejemplo 18 Fusión de la hélice anfifática JUN al término carboxi de HBcAg(1-144)

La hélice JUN se fusionó al término carboxi de la secuencia de aminoácido HBcAG 1 a 144 (constructo HbcA-JUN). Para la construcción de la secuencia de ADN de HBcAG-JUN, las secuencias que codifican la hélice JUN y HBcAG (1-1449 se amplificaron separadamente por PCR. La secuencia JUN se amplificó a partir del plasmido pJuFo con los cebadores SacII-JUN(s) y JUN-HindIII(as9. El SacII-JUN(c) introduce un enlazador que codifica a los aminoácidos LAAG. Esta secuencia también contiene un sitio SacII. El JUN-HindIII(as) introduce un codón de detención (TAA) seguido por un sitio HindIII. La secuencia de ADN HBcAg(1-144) se amplificó a partir del plasmido pEco63 usando cebadores EcoRI-HBcAg(s) y HBcAg(1-144)-JUN(as). El EcoRI-HBcAg(s) introduce un sitio EcoRI antes del inicio del ATG de la secuencia codificante HBcAg. El HBcAg(1-144)-JUN(as) introduce una secuencia codificante al enlazador péptido (LAAG), el cual también contiene un sitio SacII. Para las reacciones de PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de ADN, se usaron en 50 \mul de las mezclas de reacción con 2 unidades de la polimerasa Pwo, 0.1 de mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. El funcionamiento cíclico se llevó a cabo como sigue: 94ºC por 2 minutos, y 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos).

Secuencias cebadoras:

27

La fusión de los dos fragmentos de PCR se realizó por PCR usando cebadores EcoRI/HBcAg(s) y JUN-HindIII(as). Para la fusión de PCR, 100 pmol de cada oligo se usó con 100 ng de los fragmentos de PCR purificados en 50 \mul de una mezcla de reacción que contiene 2 unidades polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. Las condiciones del funcionamiento cíclico de PCR fueron: 94ºC por 2 minutos; y 35 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos). El producto de PCR final se analizó por electroforesis en gel de agarosa y se digirió por 16 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN se purificó en gel y se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII para generar el vector de expresión pKK-HBcAg-JUN. La inserción del producto PCR se analizó por el análisis de restricción EcoRI/HindIII y por el secuenciamiento de ADN del inserto.

Ejemplo 19 Inserción de la hélice anfifática JUN en el epítope c/e1 de HBcAg(1-144)

El epítope c/e1 (residuos 72 a 88) de HBcAg se sabe, está localizado en la región delantera de la superficie del cápsido del virus de la Hepatitis B. Una parte de esta región (residuos 76 a 82) de la proteína se reemplazó genéticamente por el hélice HUN para proporcionar un sitio de unión para los antígenos (constructo HBcAg-JUNIns). La secuencia de ADN de HBcAg-JUNIns se generó por PCRs: la secuencia de hélice JUN y las dos secuencias que codifican a los fragmentos HBcAG (residuos de aminoácidos 1 a 75 y 83 a 144) se amplificaron separadamente por PCR. La secuencia JUN se amplificó a partir del plasmido pJuFo con cebadores BamHI-JUN(s) y JUN-SacII(as). El BamHI-JUN(s) introduce una secuencia enlazadora que codifica a la secuencia peptídica GSGGG que también contiene un sitio BamHI. El JUN-SacII(as) introduce una secuencia que codifica al enlazador peptídico GAAGS seguida por una secuencia complementaria al extremo 3' de la secuencia codificante JUN. La secuencia de ADN de HBcAg(1-75) se amplificó a partir del plasmido pEco63 usando cebadores EcoRIHBcAg(s) y HBcAg75-JUN(as). El EcoRIHBcAg(s)
introduce un sitio EcoRI seguido por una secuencia correspondiente al extremo 5' de la secuencia HBcAg. El HBcAg75-JUN(as) introduce un enlazador que codifica al péptido GGSGGG después del aminoácido 75 del HBcAg, seguido por una secuencia complementaria al extremo 5' de la secuencia que codifica al hélice JUN. El fragmento HBcAg(83-155),m se amplificó usando cebadores JUN-HBcAg83(s) y HBcAg(1-144)Hind(as). El JUN-HBcAg83(s) contiene una secuencia correspondiente al extremo 3' de la secuencia codificante JUN seguida por un enlazador que codifica al péptido, GAAGS y una secuencia correspondiente al extremo 5' de la secuencia que codifica a HBcAg(83-144). El HBcAg(1-144)Hind(as) introduce un codon de detención y un sitio HindIII después del codon 144 del gen HBcAg. Para las reacciones de PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 nt del patrón de ADNs se usaron en 50 \mul de las mezclas de reacción (2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4). El funcionamiento cíclico de la temperatura se realizó como sigue: 94ºC por 2 minutos, y 35 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos).

Secuencias Cebadoras:

28

y

29

La fusión de tres fragmentos de PCR se realizó como sigue. Primero, el fragmento que codifica al HBcAg 1-75 se fusionó con la secuencia codificante JUN por PCR usando cebadores EcoRIHBcAg(s) y JUN-SacII(as). Segundo, el producto obtenido se fusionó con el fragmento HBcAg(83-144) por PCR usando cebadores EcORI HBcAg(s) y HBcAg HindIII(as). Para las fusiones de PCR, 100 pmol de cada oligo se usó con 100 ng de los fragmentos de PCR purificados en 50 \mul de mezcla de reacción que contiene 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 Mm de MgSO4. Los mismos ciclos de PCR s usaron para la generación de los fragmentos individuales. El producto PCR final se digirió por 16 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII, proporcionando el vector pKK-HBcAg-JUNIs. La inserción del producto por PCR se analizó por el análisis de restricción EcoRI/HindIII y por el secuenciamiento de AND del inserto.

Ejemplo 20 Fusión de la hélice anfifática JUN al término carboxi de la proteína nucleocápsida (N) del virus del sarampión

La hélice JUN se fusionó al término carboxi del fragmento de la proteína N del virus del sarampión truncado que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 473 (constructo N473-JUN). Para la construcción de la secuencia de ADN que codifica al N473-JUN, la secuencia que codifica a la hélice JUN y la secuencia que codifica al N473-JUN, se amplificó separadamente por PCR. La secuencia JUN se amplificó a partir del plasmido pJuFo con cebadores
SacII-JUN(s) y JUN-HindIII(as). El SacII-JUN(s) introduce una secuencia que codifica al enlazador peptídico LAAG. Esta secuencia también contiene un sitio SacII. El cebador anti-sentido JUN-HindIII(as) introduce un codon de detención (TAA) seguido por un sitio HindIII. La secuencia N (1-473) se amplificó a partir del plasmido pSC-N que contiene la proteína N del virus del sarampión completo codificando la secuencia (obtenida de M. Billeter, Zurcí), usando cebadores EcoRI-Nmea(s) y Nmea-JUN(as). EcoRI-N(mea)(s) introduce un sitio EcoRI antes del inicio de ATG de la secuencia codificante N. El N(mea)-Jun(as) fue complementario al extremo 3' de la secuencia codificante N(1-473) seguida por una secuencia complementaria a la secuencia codificante para el enlazador peptídico (LAAG). Para las reacciones de PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de ADNs se usaron en 50 \mul de las mezclas de reacción con 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. El funcionamiento cíclico de la temperatura se realizó como sigue: 94ºC por 2 minutos; y 35 ciclos por 94ºC (1 minuto), 55ºC (1 minuto), 72ºC
(2 minutos).

Secuencias cebadoras:

30

La fusión de los dos fragmentos de PCR se realizó en un PCR adicional, usando cebadores EcoRI-Nmea(s) Nmea-JUN(as). Para la fusión de PCR, 100 pmol de cada oligo se usaron con 100 ng de los fragmentos de PCR purificados en 50 \mul de una mezcla de reacción que contiene 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. El funcionamiento cíclico de la temperatura se realizó como sigue: 94ºC por 2 minutos; y 35 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos). El producto de PCR se digirió por 16 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN se purificó en gel y se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII, proporcionando el plasmido pKK-N473-JUN. La inserción del producto de PCR se analizó por en análisis de restricción EcoRI/HindIII y por el secuenciamiento de ADN del inserto.

Ejemplo 21 Expresión y Purificación parcial de HBCaG-JUN

Cepa XL-1 blue de E. coli, se transformó con pKK-HBcAg-JUN, 1 ml de un cultivo de bacteria durante la noche se usó para inocular 100 ml de medio LB que contiene 100 \mug de ampicilina. Este cultivo se hizo crecer por 4 horas a 37ºC, hasta que se alcanzó un OD a 600 nm de aproximadamente 0.8. La inducción de la síntesis de HBcAg-JUN se realizó por la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de la inducción, la bacteria además se agitó a 37ºC por 16 horas. La bacteria se cultivó por centrifugación a 5000 x g por 15 minutos. La pelotilla se congeló a -20ºC. La pelotilla se cebó y resuspendió en al amortiguador de lisis de bacteria (10 mM de Na2HPO4, pH 7.0, 30 mM de NaCl, 0.25% de Tween20, 10 mM de EDTA, 10 mM de DTT), suplementado con 200 \mug/ml de lisosima y 10 \mul de Benzonase (Merck). Las células se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente y se disolvieron usando una célula de presión French. Se agregó Triton X-100 al lisado a una concentración final de 0.2%, y el lisado se incubó por 30 minutos en hielo y se agitó ocasionalmente. La Figura 4 muestra la expresión de la proteína HBcAg en E. coli, después de la inducción con IPTG. Las células E. coli que albergan el plasmido de expresión pKK-HBcAg-JUN o un plasmido de control, se usaron para la inducción de la expresión HBcAg-JUN con IPTG. Antes de la adición de IPTG, se removió una muestra a partir del cultivo de bacteria que lleva el plasmido pKK-HBcAg-JUN (línea 3) y de un cultivo que lleva el plasmido de control (línea 1). Siete horas después de la adición de IPTG, las muestras nuevamente se removieron del cultivo que contiene pKK-HBcAg-JUN (línea 4) y del cultivo de control (línea 2). La expresión de la proteína se monitoreo por SDS-PAGE seguida por el teñido Coomassie.

El lisado se centrífugo por 30 minutos a 12,000 x g para remover los desechos celulares insolubles. El sobrenadante y la pelotilla se analizaron por el manchado Western usando un anticuerpo monoclonal contra HBcAg (YVS1841, adquirido de Achúrate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY USA), que indica que una cantidad significativa de HBcAg-JUN fue insoluble (Fig. 5). Brevemente, los lisados de las células E. coli que expresan HBcAg-JUN y de las células de control, se centrifugaron a 14,000 x g por 30 minutos. El sobrenadantes (=fracción soluble) y pelotilla (= fracción insoluble), se separaron y diluyeron con el amortiguador de muestra SDS a volúmenes iguales. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE seguido por el manchado Western con anticuerpo monoclonal anti-HBcAg YVS 1841. Línea 1: células de control de la fracción soluble; línea 2:células de control de la fracción insoluble; línea 3: fracción soluble, células que expresan HBcAg-JUN; línea 4: celas de la fracción insoluble que expresan HBcAG-JUN.

El lisado celular aclarado se usó para la etapa de centrifugación de gradiente usando un gradiente de etapa de sacarosa que consiste en una solución de sacarosa al 65% sobrecargada con una solución de sacarosa al 15%, seguida por 4 ml de lisado bacteriano. La muestra se centrífugo por 3 horas con 100,000 x g a 4ºC. Después de la centrifugación, fracciones de 1 ml de la parte superior de gradiente, se colectaron y analizaron por SDS-PAGE, seguidas por el manchado Cooomassie (Figura 6). Línea 1: lisado de E. coli total antes de la centrifugación. Línea 1 y 2: fracciones de 1 y 2 a partir de la parte superior del gradiente. Línea 4 a 7: fracciones 5 a 8 (sacarosa al 15%). La proteína HBcAg-JUN se detectó por el teñido Coomassie.

La proteína HBcAG se enriqueció a la interface entre 15 y 65% de sacarosa, indicando que se ha formado una partícula cápsida. La mayoría de las proteínas bacterianas permanecían en la capa superior libre de sacarosa del gradiente, por lo tanto, la etapa de centrifugación del gradiente de las partículas HBcAg-JUN, condujo a tanto el enriquecimiento como a una purificación parcial de las partículas.

Ejemplo 22 Acoplamiento Covalente de hGH-FOS a HBcAG-JUN

Para demostrar el enlace de una proteína a las partículas HBcAg-JUN, seleccionamos una hormona de crecimiento humana (hGH) fusionada con su término carboxi a la hélice FOS como una proteína modelo (hGH-FOS). Las partículas HBcAG-JUN se mezclaron con hGH-FOS parcialmente purificado y se incubaron por 4 horas a 4ºC, para permitir el enlace de las proteínas. La mezcla entonces se dializó durante la noche contra un volumen de 3000 partes de amortiguador diálisis (150 mM de NaCl, 10 mMm de solución de Tris-HCl, pH 8.0), para remover el DTT presente en tanto la solución de HBcAg-JUN como la solución hGH-FOS y con ello, permitir el acoplamiento covalente de las proteínas a través del establecimiento de los enlaces disulfuro. Como controles, las soluciones de HBcAg-JUN y hGH-Fos, se dializaron entonces también contra el amortiguador de diálisis. Las muestras de tres soluciones de proteínas dializadas, se analizaron por SDS-PAGE bajo condiciones no de reducción. El acoplamiento de hGH-FOS a HBcAg-JUN se detectó en un inmunomanchado anti-hGH (Fig. 7). El enlace de hGH-FOS enlazado a HBcAG-JUN deberá migrar con una masa molecular aparente de aproximadamente 53 kDa, mientras el hGH-FOS no enlazado migran con una masa molecular aparente de 31 kDa. El dializado se analizó por SDS-PAGE en la ausencia de un agente de reducción (línea 3) y e la presencia de agente de reducción (línea 2) y detectado por el teñido Coomassie. Como un control, el hGH-FOS que no se ha mezclado con las partículas cápsidas también se cargó en el gen en la presencia de un agente de reducción (línea 1).

Un cambio del hGH-FOS a una masa molecular de aproximadamente 53 kDa se observó en la presencia de una proteína capsida HBcAg-JUN, sugirió que la eficiencia del enlace de hGH-FOS a HBcAg-JUN ha tomado lugar.

Ejemplo 23 Inserción de un péptido que contiene un residuo de Lisina en el epítope c/e1 de HBcAg(1-149)

El epítope c/e1 (residuos 72 a 88) del HBcAG se localiza en la región superior de la superficie del cápsido del virus de la hepatitis B (HBcAG). Una parte de esta región (Prolina 79 y Alanina 80) se reemplazó genéticamente por el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (constructo HBcAg-Lys). El residuo de lisina introducido contiene un grupo amino reactivo en la cadena lateral que puede ser usada para al reticulación química intermolecular de partículas HBcAg con cualquier antígeno que contiene un grupo de Cisteína libre.

La secuencia de ADN de HBcAg-Lys se generó por PCRs: Los dos fragmentos que codifican a los fragmentos HBcAg (residuos de aminoácidos 1 a 78 y 81 a 149) se amplificaron separadamente por PCR. Los cebadores usados para estos PCRs también introducen una secuencia de AND que codifica al péptido Gly-Gly-Lys-GLy-GLy. EL fragmento de HBcAG (1 a 78) se amplificó a partir de Eco63 usando cebadores EcoRIHbcAg(s) y Lys-HBcAg(as). El fragmentos de HBcAg (81 a 149) se amplificó a partir de pEco63 usando cebadores Lys-HBcAg(s) y HBcAg(1-149)Hind(as). Los cebadores Lys-HBcAg(as) y Lys-HBcAg(s) introducen secuencias de ADN complementarias a los extremos de los dos productos de PCR permitiendo la fusión de los dos productos de PCR en un PCR de ensamble subsiguiente. Los fragmentos ensamblados se amplificaron por PCR usando cebadores EcoRIHBcAg(s) y HbcAg(1-149)Hind(as).

Para el PCRs, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de ADNs se usaron en 50 \mul de mezclas de reacción con 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. Para ambas reacciones, el funcionamiento cíclico de la temperatura se llevó a cabo como sigue: 94ºC por 2 minutos; 30 ciclos ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos).

\newpage

Secuencias cebadoras:

31

Para la fusión de los dos fragmentos de PCR por PCR, 100 pmol de los cebadores EcoRIHBcAg(s) y HBcAg(1-149)Hind(as), se usaron con 100 ng de los dos fragmentos de PCR purificados en 50 \mul una mezcla de reacción que contiene dos unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. Las condiciones de funcionamiento cíclico de PCR fueron: 94ºC por 2 minutos; 30 ciclos por 94ºC (1 minuto), 50ºC 81 minutos), 72ºC (2 minutos). El producto PCR ensamblado se analizó por electroforesis en gel de agarosa, se purificó y digirió por 19 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN digerido se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII para generar el vector de expresión pKK-HBcAg-Lys. La inserción del producto PCR en el vector se analizó por el análisis de restricción EcoRI/HindIII y el secuenciamiento de ADN del inserto.

Ejemplo 24 Expresión y purificación parcial de HBcAG-Lys

Cepas XL-1 blue de E. coli, se transformaron con pKK-HBcAg-Lys. 1 ml de un cultivo de bacteria durante la noche se usó para inocular 100 ml de medio LB que contiene 100 \mug de ampicilina. Este cultivo se hizo crecer por 4 horas a 37ºC, hasta que se alcanzó un OD a 600 nm de aproximadamente 0.8. La inducción de la síntesis de HBcAg-Lys se realizó por la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de la inducción, la bacteria además se agitó a 37ºC por 16 horas. La bacteria se cultivó por centrifugación a 5000 x g por 15 minutos. La pelotilla se congeló a -20ºC. La pelotilla se cebó y resuspendió en al amortiguador de lisis de bacteria (10 mM de Na2HPO4, pH 7.0, 30 mM de NaCl, 0.25% de Tween20, 10 mM de EDTA, 10 mM de DTT), suplementado con 200 \mug/ml de lisosima y 10 \mul de Benzonase (Merck). Las células se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente y se disolvieron usando una célula de presión French. Se agregó Triton X-100 al lisado a una concentración final de 0.2%, y el lisado se incubó por 30 minutos en hielo y se agitó ocasionalmente. Las células E. coli que albergan el plasmido de expresión pKK-HBcAg-Lys o un plasmido de control, se usaron para la inducción de la expresión HBcAg-Lys con IPTG. Antes de la adición de IPTG, se removió una muestra a partir del cultivo de bacteria que lleva el plasmido pKK-HBcAg-Lys y de un cultivo que lleva el plasmido de control. Siete horas después de la adición de IPTG, las muestras nuevamente se removieron del cultivo que contiene pKK-HBcAg-Lys y del cultivo de control. La expresión de la proteína se monitoreo por SDS-PAGE seguida por el teñido Coomassie.

El lisado se centrífugo por 30 minutos a 12,000 x g para remover los desechos celulares insolubles. El sobrenadante y la pelotilla se analizaron por el manchado Western usando un anticuerpo monoclonal contra HBcAg (YVS1841, adquirido de Achúrate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY USA), que indica que una cantidad significativa de HBcAg-Lys fue insoluble. Brevemente, los lisados de las células E. coli que expresan HBcAg-Lys y de las células de control, se centrifugaron a 14,000 x g por 30 minutos. El sobrenadantes (=fracción soluble) y pelotilla (= fracción insoluble), se separaron y diluyeron con el amortiguador de muestra SDS a volúmenes iguales. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE seguidas por el manchado Western con anticuerpo monoclonal anti-HBcAg YVS 1841.

El lisado celular aclarado se usó para la etapa de centrifugación de gradiente usando un gradiente de etapa de sacarosa que consiste en 4 ml de una solución de sacarosa al 65% sobrecargada con una solución de sacarosa al 15%, seguida por 4 ml de lisado bacteriano. La muestra se centrífugo por 3 horas con 100,000 x g a 4ºC. Después de la centrifugación, fracciones de 1 ml de la parte superior de gradiente, se colectaron y analizaron por SDS-PAGE, seguidas por el manchado Cooomassie. La proteína HBcAg-Lys se detectó por el teñido Coomassie.

La proteína HBcAg-Lys se enriqueció a la interface entre 15 y 65% de sacarosa, indicando que se ha formado una partícula cápsida. La mayoría de las proteína bacterianas permanecían en la capa superior libre de sacarosa del gradiente, por lo tanto, la etapa de centrifugación del gradiente de las partículas HBcAg-Lys, condujo a tanto el enriquecimiento como a una purificación parcial de las partículas.

Ejemplo 25 Acoplamiento Químico del péptido FLAG a HBcAg-Lys usando el reticulador heterobifuncional SPDP

El péptido FLAG sintético con un residuo de cisteína a su término amino (secuencia de aminoácido CGGDYKDD
DDK) se acopló químicamente a partículas HBcAg-Lys purificadas para provocar una respuesta inmune contra el péptido FLAG. 600 \mul de una solución 95% pura de partículas HBcAg-Lys (2 mg/ml) se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente con el reticulador heterobifuncional de 3-(2-piridiltio)propionado de N-succinimidilo (SPDP) (0.5 mM). Después de la terminación de la reacción, la mezcla se dializó durante la noche contra 1 litro de amortiguador de fosfato 50 mM (pH 7.2) con 150 mM de Nal para remover el SPDP libre. Después 500 \mul del cápsido HBcAg-Lys derivatizado (2 mg/ml) se mezclaron con 0.1 mM del péptido FLAG (que contienen una cisteína amino-terminal) en la presencia de 10 mM de EDTA para prevenir la oxidación de sulfhidrilo catalizada por el metal. La reacción se monitoreo a través del incremento de la densidad óptica de la solución a 343 nm debido a la liberación de piridin-2-tiona a partir de SPDP después de la reacción con la cisteína libre del péptido. La reacción de los residuos Lys derivatizados con el péptido se completó después de aproximadamente 30 minutos.

Las partículas decoradas FLAG se inyectaron en ratones.

Ejemplo 26 Construcción de pMPSV-gp140cys

El gen gp140 se amplificó por PCR a partir de pCytTSgp140FOS usando oligos gp140CysEcoRI y SalIgp140. Para el PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de ADN se usaron en 50 \mul de las mezclas de reacción con 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. Para ambas reacciones, el funcionamiento cíclico de la temperatura se llevó a cabo como sigue: 94ºC por 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (0.5 minutos); 55ºC (0.5 minutos), 72ºC (2 minutos).

El producto de PCR se purificó usando un equipo QuiaEXII, digerido con SalI/EcoRI y se ligó en el vector pMPSVHE escindido con las mismas enzimas.

Secuencias Oligo:

32

Ejemplo 27 Expresión de pMPSVgp140Cys

PMPSVgp140Cys (20 \mug) se linearizó por digestión de restricción. La reacción se detuvo por la extracción de fenol/cloroformo, seguida por una precipitación de isopropanol del ADN linearizado. La digestión de restricción se evaluó por electroforesis en gel de agarosa. Para la transfección, 5.4 \mug del pMPSVgp140-Cys linearizado, se mezclaron con 0.6 \mug de pSV2Neo linearizado en 30 \mul de H2O y se agregaron 30 \mul de una solución CCl2 1 m. Después de la adición de 60 \mul del amortiguador de fosfato (50 mM de HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mMm de Na2HPO4, pH 7.05), la solución se sometió a vórtices por 5 segundos, seguida por una incubación a temperatura ambiente por 25 segundos. La solución se agregó inmediatamente a 2 ml de medio de HP-1 que contiene FCS al 2% (medio de FCS al 2%). El medio de un cultivo celular de BHK21 a 80% de confluencia (placas de 6 pozos), entonces se reemplazó por el medio que contiene ADN. Después de una incubación por 5 hora a 37ºC en un incubador de CO2, el medio que contiene el ADN se removió y se reemplazó por 2 ml de glicerol al 15% en un medio de FCS al 2%. El medio que contiene glicerol se removió después de una fase de incubación de 30 segundos, y las células se lavaron por el enjuague con 5 ml de un medio de HP-1 que contiene FCS al 10%. Finalmente, se agregaron 2 ml del medio HP-1 fresco que contiene FCS al 10%.

Las células establemente transfectadas se seleccionaron y se hicieron crecer en un medio de selección (medio HP-1, suplementado con G418) a 37ºC en un incubador con CO_{2}. Cuando la población mezclada se hizo crecer a confluencia, el cultivo se dividió en dos discos, seguido por un periodo de 12 horas de crecimiento a 37ºC. Un disco de las células se cambió a 30ºC para inducir la expresión de las GP140-FOS soluble. El otro disco se mantuvo
a 37ºC.

La expresión de GP140-FOS se determinó por el análisis del manchado Western. El medio de cultivo (0.5 ml) fue metanol/cloroformo precipitado, y la pelotilla se resuspendió en un amortiguador de muestra SDS-PAGE. Las muestras se calentaron por 5 minutos a 95ºC antes de ser aplicadas a gel de acrilamida al 15%. Después del SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de Protano (Schleicher & Schuell, Alemania) como se describe por Bass y Yang, en Creighton, T. E., ed., Protein Function: A Practical Approach, 2da. Edición., IRL Press, Oxford (1997), pp- 29-55. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (10 x TBS por litro: 87.7 g NaCl, 66.1 g de clorhidrato de Trizma (Sigma) y 9.7 g de base Trizma (Sigma), pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por una incubación con un anticuerpo anti-GP140 o GP-160 por 1 hora. El manchado se lavó tres veces por 10 minutos con TBS-T (TBS con Tween 20 al 0.05%), y se incubó por 1 hora con un conjugado IgG anti-ratón/conejo/mono/humano de fosfatasa alcalina. Después de lavar 2 veces por 10 minutos con TBS-T y 2 veces por 10 minutos con TBS, el desarrollo de la reacción se llevó a cabo usando reactivos de detección de fosfatasa alcalina (10 ml de amortiguador AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) con 50 \mul de una solución de NBT (Tetrazolio Nitro Blue al 7.7% (Sigma) en dimetilformamida al 70%), y 37 \mul de una solución de X-fosfato (5% de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo en dimetilformamida).

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Ejemplo 28 Purificación de gp140Cys

Un anticuerpo anti-gp 120 se acopló covalentemente a un NHS/EDC activado por dextrano y empaquetado en una columna de cromatografía. El sobrenadante que contiene GP140Cys se cargó en la columna y después se lavó suficiente, el GP140Cys se eluyó con 0.1 M de HCl. El eluato se neutralizó directamente durante la colección usando 1 M de Tris a pH 7.2 en los tubos de colección.

El DTT se removió por la diálisis subsiguiente contra 10 Mm de Ms: 80 mM de NaCl pH 6.0. Finalmente, el GP140Cys se mezcló con partículas alfavirus que contienen el cierre de leucina JUN en E2 como se describe en el Ejemplo 16.

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Ejemplo 29 Construcción de PLA2-Cys

El gen PLA2 se amplificó por PCR a partir de pAV3PLAfos usando oligos EcoRIPLA y PLA-Cys-hind. Para el CPRs, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de ADNs se usó en 50 \mul de las mezclas de reacción con 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. Para ambas reacciones, el funcionamiento cíclico de la temperatura se llevó a cabo como sigue: 94ºC por 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (0.5 minutos9, 55ºC (0.5 minutos), 72ºC (2 minutos).

33

Ejemplo 30 Expresión y Purificación de PLA-cys

Para la producción citoplásmica de las proteínas marcadas Cys, una cepa XL-1 Blue de E. coli se transformó con los vectores pAV3::PLA, y Ppla-Cys. El cultivo se incubó en un medio rico en la presencia de ampicilina a 37ºC con sacudimientos. A una densidad óptica (550 nm) de 1, 1 mM de IPTG se agregó y la incubación continuó por otras 5 horas. Las células se cultivaron por centrifugación, se resuspendieron en un amortiguador apropiado (por ejemplo, HCl-tris, pH 7.2, 150 nM NaCl) que contiene DNase, RNase y lisozima y se disolvieron por el paso a través de una célula de presión french. Después de la centrifugación (Sorvall RC-5C, rotor SS34, 15000 rpm, 10 minutos, 4ºC), la pelotilla se resuspendió en 25 ml de amortiguador lavando el cuerpo de inclusión (20 mM de tris-HCl, 23% sacarosa, 0.5% Triton X-100, 1 mM de EDTA, pH 8) a 4ºC se centrífugo como se describe anteriormente. Este procedimiento se repitió hasta que el sobrenadante después de la centrifugación fue esencialmente claro. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en 20 ml de amortiguador de solubilización (5.5 M de clorhidrato de guanidinio, 25 mM de tris-HCl, pH 7.5) a temperatura ambiente y el material insoluble se removió por centrifugación y el subsiguiente paso del sobrenadante a través de un filtro estéril (0.45 \mum). La solución de la proteína se mantuvo a 4ºC por al menos, 10 horas en la presencia de 10 mM de EDTA y 100 mM de DTT y después se dializó tres veces contra 10 volúmenes de 5.5 M de clorhidrato de guanidinio. 25 mM de tris-HCl, 10 mM de EDTA, pH 6. La solución se dializó dos veces contra 5 litros de 2 M de urea, 4 mM de EDTA, 0.1 M de NH4Cl, 20 Mm de borato de sodio (pH 8.3) en la presencia de un arrastre redox apropiado (glutationa oxidada/glutationa reducida; cisteína/cisteína). La proteína replegada se aplicó entonces a una cromatografía de intercambio iónico. La proteína se almacenó en un amortiguador apropiado con un pH arriba de 7 en la presencia de 2-10 mM de DTT para mantener los residuos de cisteína en una forma reducida. Previo al acoplamiento de la proteína con las partículas alfavirus, el DTT se removió por el paso de la solución de la proteína a través de una columna de filtración en gel Sephadex G-25.

Claims

1. Una composición, caracterizada porque comprende:

a) un andamio molecular que no se origina naturalmente que comprende:

(i): una partícula central seleccionada del grupo que consiste en:

1): una partícula central de origen no natural; y

2): una partícula de origen natural; caracterizada porque dicha partícula central comprende una partícula similar a un virus; y

(ii): un organizador que comprende al menos un primer sitio de unión,

en donde dicho organizador se conecta a dicha partícula central por al menos un enlace covalente; y

b) un determinante antígeno o antigénico con al menos un segundo sitio de unión, dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste en:

(i): un sitio de unión que no se origina naturalmente con dicho determinante antígeno o antigénico; y

(ii): un sitio de unión de origen natural con dicho determinante antígeno o antigénico,

en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no peptídico para dicho primer sitio de unión; y

en donde dicho determinante antígeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación para formar un arreglo de antígeno ordenado y repetitivo.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque:

a) dicha partícula central es una partícula similar a un virus o una forma recombinante del mismo; y

b) dicho organizador es un polipéptido o residuo del mismo; y

c) dicho segundo sitio de unión es un polipéptido o residuo del mismo.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque dicho primer y/o segundo sitio de unión comprende:

a) un antígeno;

b) y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo,

c) biotina

d) Avidina;

e) estrepavidina

f) un receptor

g) un ligando de receptor;

h) una proteína ligando enlazante

i) un ligando;

j) una leucina interactúante de polipéptidos de cierre;

k) un grupo amino;

l) un grupo químico reactivo con un grupo amino;

m) un grupo carboxilo;

n) un grupo químico reactivo con un grupo carboxilo;

o) un grupo sulfídrilo;

p) Un grupo químico reactivo con un grupo sulfidrilo; o

q) una combinación de los mismos.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada porque dicho segundo sitio de unión con dicho determinante antígeno o antigénico no se da naturalmente.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque dicha partícula central es un alfavirus recombinante.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque dicho alfavirus recombinante es el virus Sindbis y dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión comprenden, cada uno, una leucina interactúante de polipéptido de cierre.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión son las leucinas JUN y/o FOS de polipéptidos de cierre.

8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque primer sitio de unión es un grupo amino y dicho segundo sitio de unión es un grupo sulfidrilo.

9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque dicha partícula similar a un virus es es una proteína capsida del virus de hepatitis B.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo grupo de unión comprenden, cada uno, una leucina interactúante de polipéptido de cierre.

11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque dicho primer sitio de unión es el polipéptido JUN y dicho segundo sitio de unión es el polipéptido FOS.

12. Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 9, caracterizada porque dicho primer sitio de unión es una lisina residual y dicho segundo sitio de unión es una cisteina residual.

13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho antígeno o determinante antígeno tiene un segundo sitio de unión individual en su término carboxilo o amino.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque dicha partícula unida al virus es una proteína capsida de virus del sarampión.

15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión comprenden, cada uno, una leucina interactúante de polipéptido de cierre.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión son leucina JUN y/o FOS de polipéptidos de cierre.

17. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque dicha partícula central se selecciona del grupo que consiste en:

a) proteínas recombinantes de Rotavirus,

b) proteínas recombinantes del virus Norwalk,

c) proteínas recombinantes de Alfavirus,

d) proteínas recombinantes del virus de afecciones de boca y pie,

e) proteínas recombinantes de Retrovirus,

f) proteínas recombinantes del virus de la hepatitis B,

g) proteínas recombinantes del virus del mosaico del Tabaco,

h) proteínas recombinantes del virus de Flock House, y

i) proteínas recombinantes del Papilomavirus humano.

18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque el primer sitio de unión y el segundo sitio de unión comprenden, cada uno, una leucina interactúante del polipéptido de cierre.

19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicho primer sitio de unión es un grupo amino y dicho segundo sitio de unión es un grupo sulfhidrilo.

20. Una composición de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizada porque dicha partícula central es

a) una proteína recombinante de alergia a la picadura de abeja.

b) una proteína recombinante de alergia a la nuez,

c) una proteína recombinante de alergias alimentarias, o

d) una proteína recombinante de asma.

21. Una composición de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión comprenden, cada uno, una leucina interactú ante del polipéptido de cierre.

22. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho segundo sitio de unión es capaz de asociarse a través de al menos un enlace covalente no péptido a dicha primera unión.

23. Un proceso para producir un arreglo de antígeno ordenado y repetitivo no naturalmente, caracterizado porque comprende:

a) proporcionar un andamio molecular que no se da naturalmente, que comprende:

(i): una partícula central seleccionada del grupo que consiste en:

(ii): una partícula central de origen no natural; y

1): una partícula central de origen natural;

2): en la cual la partícula central comprende una partícula similar a un virus; y

(ii): un organizador que comprende al menos un primer sitio de unión,

b) proporcionar un determinante antígeno o antigénico con al menos un segundo sitio de unión, dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste en:

(i): un sitio de unión de origen no natural con dicho determinante antígeno o antigénico; y

en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no péptídico para dicho primer sitio de unión; y

c) combinación de dicho andamio molecular de origen no natural y dicho determinante antígeno o antigénico,

en donde dicho determinante antígeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación para formar un arreglo antígeno ordenado y repetitivo; en el cual dicho antígeno se selecciona a partir de proteínas adecuadas para una respuesta inmune contra los alérgenos.

24. Un procesos de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizados porque

b) dicho organizador es un polipéptido o residuo del mismo; y

c) dicho segundo sitio de unión es un polipéptido o residuo del mismo.

25. Un proceso de la reivindicación 24, caracterizado porque dichos primero y/o segundo sitios de unión que comprenden:

a) un antígeno;

b) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo;

c) biotina;

d) avidina;

e) estrepavidina;

f) un receptor y su ligando;

g) un ligando de receptor;

h) una proteína de unión a ligando;

i) un ligando;

j) un polipéptido interactuante de cierre, de leucina;

k) un grupo amino;

l) un grupo químico reactivo con un grupo amino;

m) un grupo carboxílico;

n) un grupo químico reactivo con un grupo carboxílico;

o) un grupo sulfhidrilo;

p) un grupo químico reactivo con un grupo sulfhidrilo; o

q) una combinación del mismo.

26. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho segundo sitio de unión no es de origen natural con dicho determinante antígeno o antigénico.

27. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-22 para el uso en el tratamiento médico.

28. Una composición farmaceútica que comprende:

a) La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-22; y

b) un vehículo farmaceúticamente aceptable.

29. Un método de inmunización, caracterizado porque comprende la administración a un sujeto de una composición que comprende:

a) un andamio molecular de origen no natural que comprende:

(i): una partícula central seleccionada del grupo que consiste en:

1): una partícula central de origen no natural; y

2): una partícula central de origen natural; y

(ii): un organizador que comprende al menos un primer sitio de unión,

en donde al menos dicho organizador se conecta a dicha partícula central por al menos un enlace covalente; y

b) un determinante antígeno o antigénico con al menos un segundo sitio de unió, dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste en:

caracterizado porque dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no peptídico para dicho primer sitio de unión; y porque dicho determinante antígeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación formando un arreglo antígeno ordenado y repetitivo; y porque dicho antígeno se selecciona a partir de proteínas adecudas para inducir una respuesta inmune contra alérgenos, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir alergias mediante la inmunización.

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30. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta inmune.

31. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta inmune humoral.

32. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta inmune celular.

33. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta inmune humoral y una respuesta inmune celular.

34. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta protectora.

35. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque:

a) dicha partícula central se selecciona del grupo que consiste en:

(i): un virus;

(ii): una partícula similar a un virus;

(iii): un bacteriófago;

(iv): una partícula de cápside viral;

(v): una forma recombinante de (i), (ii), (iii), o (iV); y

b) dicho organizador es un polipéptidoo un residuo del mismo; y

c) dicho segundo sitio de unión es un polipéptido o residuo del mismo.

36. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque dicha composición está definida como en cualquiera de las reivindicaciones 2-22.

37. Uso de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque dicha partícula central es de origen no natural, y porque dicha partícula central se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polímero sintético;

b) una micela lípida;

c) un metal.

38. Una composición de vacuna, que comprende una composición que comprende:

a) un andamio molecular de origen no natural que comprende:

(i): una partícula central seleccionada del grupo que consiste en:

1): una partícula central de origen no natural; y

2): una partícula central de origen natural; y

(ii): un organizador que comprende al menos un primer sitio de unión,

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en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no peptídico para dicho primer sitio de unión; y en donde dicho determinante antígeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación formando un arreglo antígeno ordenado y repetitivo; caracterizada porque dicho antígeno se selecciona de proteínas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra alérgenos.

39. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 38, caracterizada porque, además comprende un adyuvante.

40. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 38, caracterizada porque:

a) dicha partícula central se selecciona del grupo que consiste en:

(i): un virus

(ii): una partícula ligada al virus;

(iii): un bacteriofago;

(iv): una partícula cápsida viral; y

(v): una forma recombinante de (i), (ii), (iii) o (iv) y

b) dicho organizador es un polipéptido o residuo del mismo; y

c) dicho segundo sitio de unión es un polipéptido o residuo del mismo.

41. Una composición de vacuna de la reivindicación 38, caracterizada porque dicha composición se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2-22.

42. Una composición de vacuna de la reivindicación 38, caracterizada porque dicha partícula central es de origen no natural, y en la cual dicha partícula se selcciona del grupo que consiste en:

a) un polímero sintético;

b) una micela lípida; y

c) un metal.

43. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 38 o 39, caracterizada porque dicha partícula central comprende una partícula similar a un virus, preferiblemente una partícula similar a un virus seleccionanda del grupo que consiste en una partícula similar al virus de la hepatitis B y una partícula similar al virus del sarampión.

44. Una composición de vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 38 o 39, caracterizada porque dicha partícula central comprende un virus, preferiblemente el virus Sindbis.