PT1809662E - Interferão beta desamidado - Google Patents

Description

ΡΕ1809662 1 DESCRIÇÃO "INTERFERAO BETA DESAMIDADO"

ANTECEDENTES 1. Campo Técnico

Esta invenção encontra-se na área geral da química de proteínas biologicamente activas. Mais especifica-mente está relacionada com os análogos do interferão β mutacional e quimicamente alterados que diferem da proteína nativa nas substituições, delecções ou modificações da cisteína, da asparagina e de outros resíduos. 2. Técnica Anterior O interferão β tem sido útil no tratamento de doenças humanas, em particular na esclerose múltipla. A esclerose múltipla (MS) é uma doença crónica, muitas vezes incapacitante do sistema nervoso central que ocorre quando uma bainha protectora que envolve as fibras nervosas é destruída. Cerca de trinta por cento dos doentes com MS sofrem de um surto - remissão da doença no qual os sintomas desaparecem totalmente ou parcialmente após um pico ao qual se segue um período de estabilidade que pode durar meses ou anos. A administração do interferão beta (interferão β ou 2 ΡΕ1809662 IFN-β) tem demonstrado a redução da frequência dos picos da MS. Como resultado, os fármacos com base no interferão β tornaram-se numa ferramenta valiosa no controlo e tratamento da MS.

As técnicas de recombinação do DNA (rDNA) têm sido desenvolvidas para facilitar a produção em larga escala de fármacos baseados no interferão β. Um problema em particular que necessita de ser resolvido por estas técnicas é o do interferão beta humano, cuja sequência de aminoácidos é apresentada na Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), contém resíduos de cisteína nas posições 17, 31, e 141, Gene (1980) 10: 11-15 e Nature (1980) 285: 542-547), pelo menos alguns deles são não essenciais para a sua actividade mas estão livres para formar ligações intermoleculares ou intramoleculares indesejáveis. No decurso da preparação microbiana do IFN-β por técnicas de rDNA, foi observado que os dímeros e os oligómeros do IFN-β são formados em estratos contendo elevadas concentrações do IFN-β devido a esta ligação intermolecular. Esta formação de multímeros torna a purificação e o isolamento do IFN-β bastante laboriosos e morosos e necessitam de vários passos adicionais nos procedimentos de purificação e de isolamento tal como a redução da proteína durante a purificação e a sua re-oxidação para a restituir à sua conformação original, aumentando assim a possibilidade de formação de ligações dissulfídicas incorrectas. Adicionalmente, esta formação de multímeros tem sido associada com a baixa actividade biológica específica. 3 ΡΕ1809662

Por forma a resolver estes temas, têm sido desenvolvidas técnicas refinadas de rDNA para alterar os análogos da proteína do IFN-β biologicamente activos produzidos microbiologicamente de uma forma que não afecte adversamente a sua actividade, mas que reduza ou elimine a sua capacidade para formar ligações cruzadas intermole-culares ou ligações intramoleculares que permitam à proteína adoptar uma estrutura terciária indesejável (por exemplo, uma conformação que reduza a actividade da proteína) . As técnicas da mutagénese dirigida têm sido utilizadas com sucesso para formar os análogos da proteína biologicamente activos alterados mutacionalmente (um "análogo da proteína" refere-se aqui a uma proteína sintética na qual um ou mais aminoácidos foram genética e/ou quimicamente modificados e que retêm uma actividade biológica da proteína precedente) que retêm uma actividade desejada das suas proteínas precedentes mas sem a capacidade para formar ligações intermoleculares ou ligações dissulfídicas intramoleculares indesejáveis. Tem sido observado que os análogos de proteína sintéticos da proteína do IFN-β biologicamente activa que possuem o resíduo de cisterna na posição 17 delectado ou substituído por outro aminoácido apresentam a actividade e as características desejadas.

Em particular, o interferão β lb (IFN-β lb) , um análogo da proteína recombinante do IFN-β, sintético, é uma proteína biologicamente activa que possui o resíduo de cisterna na posição 17 substituído por um resíduo de serina 4 ΡΕ1809662

como tem sido efectuado. Tal como uma proteína produzida microbianamente, o IFN-β lb não está glicosilada. Possui também uma delecção da metionina N-terminal. O IFN-β lb tem sido formulado num fármaco de sucesso comercializado como Betaseron® que tem demonstrado ser eficaz para o tratamento e controlo da MS. Este análogo da proteína, os materiais e técnicas para a sua produção, a sua formulação como uma terapêutica e a sua utilização para o tratamento da MS estão descritos e reivindicados num número de Patente e aplicações dos EUA incluindo a Aplicação No. 435,154, registada em 19 de Out. , 1982; a Patente No. 4,588,585, registada em 13 de Maio, 1986; a Patente No. 4,737,462, registada em 12 de Abril, 1988; e a Patente No. 4,959,314, registada em 25 de Set. , 1990; cada uma das quais se encontra aqui incorporada por referência devido ás suas descobertas destas características. A produção em larga escala do IFN-β para fármacos é também efectuada a partir de fontes mamíferas, em particular células do ovário de "hamster" chinês (CHO). Este análogo do IFN-β, referido como IFN-β la, não possui a mutação Serl7 do IFN-β lb e está glicosilado. O IFN-β é formulado em produtos terapêuticos comercializados como Avonex® e Rebith®. A WO2004087753 descreve derivados do IFN, em que um ou dois dos resíduos de aminoácidos nas posições 110, 117 ou 137 são mutados para a asparagina, para formar sítios de glicosilação adicionais na molécula. A glico- 5 ΡΕ1809662 silação parece aumentar a actividade dos derivados do IFN, num contexto antiviral e anti-proliferativo; tais derivados possuem também uma biodisponibilidade e uma meia-vida in vivo aumentada.

Tal como na maioria das terapêuticas existe um desejo contínuo de identificar e produzir agentes biologicamente activos mais potentes. No caso dos fármacos baseados no IFN-β, será desejável um análogo do IFN-β com uma actividade biológica aumentada.

Adicionalmente, algumas formulações farmacêuticas do IFN-β, incluindo o Betaseron®, contêm albumina humana (HA ou HSA) , uma proteína estabilizadora comum. A HA é um produto do sangue humano e existe progressivamente em menor quantidade. Por consequência, mais recentemente tem existido uma busca por formulações de fármacos livres da HA, e será desejável uma formulação do IFN-β estável e efectivamente livre da HA.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção resolve estas necessidades fornecendo o interferão β desamidado. 0 IFN-β desamidado é um análogo da proteína do interferão β humano no qual a asparagina na posição 25, numerada de acordo com o interferão β nativo, é desamidada. 0 produto desamidado exibe uma actividade biológica do interferão β humano nativo a um nível aumentado e não requer a HA para a estabilização da proteína. 6 ΡΕ1809662

Numa forma de realização específica, o IFN-β desamidado é um análogo da proteína do IFN-β lb humano sintético no qual a cisteína na posição 17, numerada de acordo com o interferão β nativo, é delectada ou substituída por um aminoácidos neutro, em particular a serina, e a asparagina na posição 25, é desamidada tal que se torna numa imida cíclica, num resíduo de aspartato ou de iso-aspartato. O produto desamidado exibe a actividade biológica desejada do interferão β nativo humano (por exemplo, os efeitos citopáticos celulares ou a actividade anti-proliferativa, tal como a que tem sido apresentada por estar correlacionada com a redução da frequência dos picos da esclerose múltipla) a um nível mais elevado relativamente à sua proteína IFN-β precedente. Adicionalmente a actividade biológica aumentada é observada numa formulação livre da HA do análogo da proteína.

As formulações dos compostos de análogos da proteína activa em composições terapêuticas e métodos para a produzir e utilizar são também fornecidas.

Adicionalmente, é fornecido um mapa técnico do peptídeo da endoproteinase C que produz um perfil de identificação para a proteína do IFN-β utilizando uma digestão enzimática de uma amostra da proteína reduzida a pH relativamente baixo, seguido por resolução cromatográfica de fragmentos de peptídeo, úteis no controlo de qualidade tal como um teste ID para os produtos desamidados. 7 ΡΕ1809662

Estes e outros objectivos e características da invenção irão tornar-se mais evidentes quando a seguinte descrição detalhada da invenção for lida em conjunto com as figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 é um diagrama da sequência de aminoácidos do IFN-β. A Fig. 2 é um diagrama da sequência de aminoácidos do IFN-β lb que indica o sitio a natureza da desamidação de acordo com a presente invenção. A Fig. 3 é um diagrama que ilustra a via de desamidação de Asn com referência à desamidação do IFN-β Asn25 de acordo com a presente invenção.

As Figs. 4-11 apresentam uma representação gráfica da potência versus a quantidade do IFN-β lb desamidado em diversos lotes de produtos e de substâncias farmacológicas estáveis do IFN-β livre da HA de acordo com um aspecto da invenção. A Fig. 12A apresenta mapas do peptideo Glu-C de amostras estáveis do IFN-β livre da HA de acordo com um aspecto da invenção. 8 ΡΕ1809662 A Fig. 12Β apresenta uma vista expandida de uma porção do mapa da Fig. 12A. A Fig. 13 apresenta o perfil RP-HPLC de uma amostra de controlo do IFN-β livre da HA (tempo (min) vs. resposta (mV)). A Fig. 14 apresenta o perfil RP-HPLC da amostra estável do lote de produtos farmacológicos do IFN-β lb livre da HA de acordo com um aspecto da invenção. A Fig. 15 apresenta uma representação gráfica da actividade dos CPE para fracções de RP-HPLC de uma amostra estável do IFN-β livre da HA de acordo com um aspecto da invenção. A Fig. 16A apresenta uma representação gráfica dos resultados de uma actividade anti-proliferativa contra Hs294T para fracções de RP-HPLC de uma amostra estável do IFN-β livre da HA de acordo com um aspecto da invenção. A Fig. 16B apresenta uma representação gráfica dos resultados de uma actividade anti-proliferativa contra Daudi para fracções de RP-HPLC de uma amostra estável do IFN-β livre da HA de acordo com um aspecto da invenção.

DESCRIÇÃO DE FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

Os compostos, composições, materiais e técnicas e utilizações associadas da presente invenção irão agora ser 9 ΡΕ1809662 descritas com referência a diversas formas de realização. As propriedades e caracteristicas importantes das formas de realização descritas estão ilustradas nas estruturas no texto. Embora a invenção irá ser descrita em conjunto com estas formas de realização, deve ser entendido que a invenção não pretende estar limitada a estas formas de realização. Pelo contrário, a invenção está definida pelas reivindicações em apêndice. Na seguinte descrição, são apresentados numerosos detalhes específicos de forma a fornecer uma compreensão completa da presente invenção. A presente invenção pode ser praticada sem alguns ou todos estes detalhes específicos. Noutros exemplos, operações processuais bem conhecidas não foram descritas em detalhe de forma a não obscurecer desnecessariamente a presente invenção.

Introdução A presente invenção fornece o interferão β desamidado. O IFN-β desamidado é um análogo da proteína do interferão β humano no qual a asparagina na posição 25, numerada de acordo com o interferão β nativo, é desamidada. A Asn desamida para Asp ou para iso-Asp via uma imida cíclica intermediária. 0 produto desamidado exibe uma actividade biológica do interferão β nativo humano a um nível aumentado e não requer a HA para a estabilização da proteína. São também fornecidas as formulações dos compostos dos análogos da proteína activa em composições e métodos terapêuticos de produção e utilização. 10 ΡΕ1809662

Um "análogo da proteína" refere-se aqui a uma proteína sintética na qual um ou mais aminoácidos foram genética e/ou quimicamente modificados e que retêm uma actividade biológica da proteína precedente, tal como os efeitos citopáticos celulares ou a actividade anti-proli-ferativa. Tal actividade biológica demonstrou estar correlacionada com outras actividades biológicas específicas, tal como a redução da frequência de picos de esclerose múltipla.

Numa forma de realização específica, o IFN-β desamidado é um análogo sintético da proteína do interferão β lb humano purificado e isolado no qual a cisteína na posição 17, numerada de acordo com o interferão β nativo, é delectada ou substituída por um aminoácido neutro, em particular pela serina e a asparagina na posição 25, é desamidada. Em formas de realização específicas, a Asn25 é desamidada para uma aspartato, iso-aspartato, ou um resíduo de imida cíclica (por exemplo, IFN-β^17,^25, IFN^seri7,iso-asP25 ou i™-$serl7,lmlda-clcllca25, respectivamente) . O produto desamidado exibe uma actividade biológica do interferão β nativo humano a um nível mais elevado relativamente ao IFN-β lb. Adicionalmente, a actividade biológica aumentada é observada numa formulação livre da HA do análogo da proteína, permitindo uma terapêutica com IFN-β lb livre da HA.

No análogo sintético da proteína da invenção, o resíduo de cisteína 17 pode ser substituído por uma serina, uma treonina, uma glicina, uma alanina, uma valina, uma 11 ΡΕ1809662 leucina, uma isoleucina, uma histidina, uma tirosina, uma fenilalanina, um triptofano ou uma metionina. Numa forma de realização especifica, a substituição é efectuada pela serina 17. O resíduo de asparagina 25 foi substituído por um aspartato, um iso-aspartato ou por uma imida cíclica. Com referência à Fig. 2, é ilustrada a estrutura primária (sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) ) e secundária (enrolamento e dobragem, ligações cruzadas) de um análogo da proteína IFN-β lb de acordo com a invenção. Na posição 25, o resíduo Asn nativo é desamidado. A desamidação da asparagina ocorre via uma imida cíclica intermediário. Esta via está ilustrada na Fig. 3. Como descrito em maior detalhe em baixo, os resultados do mapa do peptídeo Glu-C indicam que as formas de desamidação principais são o iso-Asp ( I FN— β 3erl 7 f ±so-asp25) S a imida ClClÍCâ ( I FN— PserI 7r imida- cicllca25) · 0 análogo da proteína pode ser produzido por uma combinação de técnicas de recombinação sintética e de modificação química. Inicialmente, o análogo sintético da proteína do IFN-β lb é normalmente produzido por técnicas de mutagénese dirigida de DNA recombinante, como descrito nas patentes referidas acima na secção dos Antecedentes da aplicação. As técnicas da mutagénese dirigida são bem conhecidas por Lather, R. F. e Lecoq, J. P. em Genetic Engineering Academic Press (1983) pp 31-50. A mutagénese dirigida por oligonucleótideos é especificamente revista por Smith, M. e Gillam, S. em Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press (1981) 3: 1-32. 12 ΡΕ1809662 O análogo da proteína do IFN-β lb é então sujeito a um tratamento químico que desamida o resíduo de asparagina na posição 25. Existe um número de técnicas de desamidação possíveis que podem ser eficazes e adequadas para a adopção em larga escala da produção farmacêutica e pode ser utilizada qualquer técnica que permita a desamidação ao mesmo tempo que retém uma actividade biológica nativa, preferencialmente uma actividade biológica aumentada. Generalizadamente falando, a desamidação das proteínas do IFN-β pode ser conseguida através da incubação a temperaturas moderadas a elevadas (por exemplo, cerca de 25-60°C) e uma variedade de pHs, desde os baixos (por exemplo, cerca de 0-4) moderados (por exemplo, cerca de 4-10) a elevados (por exemplo, cerca de 10-14) com tempos de reacção desde cerca de 1 min a cerca de 90 dias ou mais, dependendo das condições. Por exemplo, a desamidação pode ser conseguida pela incubação do IFN-β (por exemplo, o IFN-β la ou o IFN-β lb) até 60°C; ou entre cerca de 25 a 40°C, por exemplo cerca de 40°C, a cerca de pH 4 desde cerca de 24 horas, por exemplo até 40 dias. O tempo de reacção pode decrescer e/ou a temperatura de reacção decrescer através do aumento do pH, por exemplo desde um pH neutro a básico de cerca de 7 a cerca de 14, por exemplo de cerca de 8 a 12, por exemplo, cerca de 8,5. Num exemplo, a actividade biológica (CPE) de uma amostra do IFN-β lb aumenta quase duas vezes após o tratamento com pH 8,4 a 2-8°C durante 14 dias até cerca de 4,5 IU/mg. Os aumentos substanciais da actividade foram também observados em tratamentos a 13 ΡΕ1809662 temperaturas moderadas (por exemplo, temperatura ambiente) a elevadas (por exemplo, 37-40°C) durante 14-40 dias.

As técnicas para a preparação do análogo da proteína do IFN-β podem produzir um produto que é parcial ou substancialmente puro. Por exemplo, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75% ou substancialmente todo o análogo sintético da proteína no produto pode ser desami-dado na posição 25, numerado de acordo com o interferão β nativo. Onde menos do que substancialmente todo o produto é desamidado, o produto pode no entanto apresentar actividade biológica aumentada e estabilidade livre da HA. Em alguns casos, pode ser desejável purificar e isolar o(s) análogo (s) da proteína desamidada no produto. Esta purificação e isolamento pode ser conseguida por troca catiónica em HPLC utilizando por exemplo as seguintes condições:

Cromatografia de Fase Estacionária: Pharmacia Mono S HR 5/5, ou equivalente;

Tampão de Eluição: Tris-HCl a 20 mM, pH 7,0 com Empigen a 0,5%;

Gradiente: Gradiente linear de NaCl até 200 mM ou mais elevado no tampão de eluição.

Para a produção, esta técnica pode ser conduzida em larga escala. 14 ΡΕ1809662

Numa forma de realização preferencial, quando o análogo sintético da proteína é produzido microbianamente, não é glicosilado. 0 análogo da proteína, possui também uma delecção da metionina N-terminal. Noutras formas de realização, o análogo da proteína pode ser produzido em células de mamíferos e ser assim glicosilado.

Como descrito em maior detalhe a baixo, vários ensaios de actividade demonstram que os análogos da proteína do IFN-β lb desamidado possuem bioactividade aumentada relativamente ás suas proteínas do IFN-β precedentes. E os resultados de estabilidade foram obtidos com amostras livres da HA indicando que os análogos da proteína do IFN-β desamidado da presente invenção são úteis para a formulação livre da HA como uma terapêutica. Para formar uma composição terapêutica o análogo da proteína parcial ou substancialmente puro como descrito abaixo, pode ser misturado com um veículo de transporte farmacologicamente aceitável, tal como os bem conhecidos para este tipo de produto terapêutico .

Tal como é uma propriedade vantajosa das composições da presente invenção que podem exibir estabilidade livre da HA, a desamidação pode também ser conduzida para formulações que contêm HA e estas não se excluem do âmbito da presente invenção. Adicionalmente, enquanto que a invenção é principalmente aqui descrita tendo em conta os análogos da proteína do IFN-β lb, a invenção é também aplicável a outros análogos do IFN-β, incluindo os análogos do IFN-β la. 15 ΡΕ1809662

Os análogos e as composições da proteína do IFN-β da presente invenção exibem actividade biológica que sugere utilidade em terapias num número de aplicações incluindo a regulação do crescimento celular num paciente, o tratamento de um paciente com doenças virais e a estimulação natural da actividade de morte celular num paciente. Uma utilização particular é o tratamento da esclerose múltipla num paciente, em particular no surto - remissão da MS. Neste aspecto, as terapias de acordo com a presente invenção são úteis no tratamento para reduzir a frequência dos picos na esclerose múltipla. O nível elevado da actividade biológica dos análogos da proteína IFN- desamidados indica os efeitos aumentados como terapias, por exemplo no tratamento e controlo da MS.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um mapa técnico do peptídeo da endoproteinase C (Glu-C). O mapa do peptídeo produz um perfil de identificação para proteínas utilizando uma digestão enzimática de uma amostra da proteína reduzida a um pH relativamente baixo, seguido por uma resolução de cromatografia líquida (por exemplo, RP-HPLC) dos fragmentos de digestão. O mapeamento do peptídeo pode ser utilizado no controlo de qualidade tal como um teste ID para o produto do análogo da proteína do IFN-β desamidado de acordo com a invenção. É também uma ferramenta poderosa para monitorizar pequenas modificações da estrutura primária numa proteína a partir de eventos tais como o corte, a mutação e a degradação devida à oxidação ou à desamidação. 16 ΡΕ1809662

Uma variante do IFN-β desamidado é conhecida por conter uma imida cíclica, uma forma intermediária de desamidação. Esta forma de imida cíclica é encontrada em quantidades elevadas em amostras estáveis. Muitas enzimas incluindo a Lis-C, que é utilizada num mapa de peptídeo convencional para o IFN-β, digere optimamente proteínas com pH neutros a elevado. Com pH neutro a elevado, a imida cíclica é instável e a desamidação subsequente é artificialmente induzida. Por isso, a manutenção da amostra a um ambiente de pH baixo durante a redução e a digestão é necessária para monitorizar o nível nativo tanto da imida cíclica como de outras formas de desamidação (Asp, iso-Asp) na amostra. O mapa do peptídeo da endoproteinase C (Glu-C) é acoplado com um agente redutor que é funcional a um pH abaixo de 8, por exemplo, numa gama de cerca de 3-8, por exemplo, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou pHs intermédios a estes. Um agente redutor adequado é o tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP). Outros agentes redutores funcionais a um pH de cerca de 3-8 podem ser utilizados, tais como o ditio-treitol (DTT), 2-mercaptoetanol, cisteína, glutationa reduzida, 2-mercaptoetilamina e ácido tioglicólico. 0 mapa do peptídeo Glu-C tem dois pH' s óptimos, o pH 7,8 e o pH 4, 0 para a sua actividade enzimática. Como observado acima, o TCEP é conhecido por ser funcional a um pH abaixo de 8,0. Noutra forma de realização, o novo mapa do peptídeo Glu-C utiliza a amostra de preparação incluindo tanto a redução 17 ΡΕ1809662 por TCEP como a digestão a baixo pH, 4,0, que se encontra na gama de pH óptima para preservar o nível nativo de formas desamidadas, por exemplo, a imida cíclica, na amostra. Esta nova técnica de mapear pode ser utilizada para carac-terizar o fragmento de digestão que contém formas desamidadas, incluindo a imida cíclica, em amostras do IFN-β.

As amostras do IFN-β podem ser testadas pelo mapa do peptídeo Glu-C para identificar o sítio de desamidação e a sua fórmula (por exemplo, Asp, iso-Asp, imida cíclica). As amostras de proteína em formulações tamponadas (por exemplo, 0,5 ml de amostra de proteínas a uma concentração de 0,1 a 10, por exemplo, 0,5 mg/ml em tampão de formulação de 2 a 500 mM de tampão, ou em alguns casos de 50 a 100 mM, de um sal tal como o aspartato, o bicarbonato (por exemplo, bicarbonato de amónio), o carbonato (por exemplo, carbonato de amónio), o acetato (por exemplo, acetato de amónio), o fosfato (por exemplo, fosfato de sódio), o citrato, o formato, o succinato, o MES, o PIPES, o ACES, o MOPS, o MOPSO, o HEPES, O TES, o TRIS-HC1, o BIS-TRIS propano, O ADA, o BES, o DIPSO, o TAPSO, o HEPPSO, o POPSO, o EPPS, O TEA, etc. cuja selecção e utilização apropriadas serão conhecidas pelos peritos na área através do pH desejado (por exemplo, ácido aspártico a 2 mM a pH 4)) podem ser reduzidas utilizando TCEP, utilizando por exemplo uma taxa molar de 1:2 a 1:30, por exemplo, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10 ou 1:20 de proteína para TCEP, tal como 1:10. A amostra é incubada, por exemplo a cerca de 30-40°C (por exemplo, 18 ΡΕ1809662 37°C) , até que o material da amostra seja reduzido. Os tempos de incubação adequados podem ser desde cerca de 5 minutos a 24 horas dependendo da labilidade da amostra, por exemplo 3 horas. O material reduzido é subsequentemente digerido com Glu-C, por exemplo de 1 a 10, por exemplo, 4 mg/ml, de 1:1 a 20:1 (ou a qualquer taxa intermédia adequada incluindo 2:1, 3:1, 4:1, 10:1, etc.), por exemplo, a taxa de 5:1 da massa de proteína para Glu-C e incubada, por exemplo a cerca de 30-40°C (por exemplo, 37°C), até que o material da amostra seja digerido. Os tempos de digestão adequados podem ir de cerca de 5 minutos a 24 horas dependendo da labilidade da amostra, por exemplo 4 horas. Os fragmentos do peptídeo podem ser determinados por cromatografia líquida, por exemplo, por RP-HPLC.

Uma experiência de um mapa de peptídeos específico e os seus resultados estão descritos na secção de Exemplos a baixo.

Exemplos

Os seguintes exemplos ilustram aspectos da presente invenção, mas não pretendem de qualquer forma limitar a invenção. Em vários destes exemplos é feita uma distinção entre a imida cíclica e outras formas desamidadas (Asp e iso-Asp), as duas espécies principais distinguíveis que apresentam aumento da potência. São todas formas desamidadas, mas onde uma distinção é marcada entre a imida 19 ΡΕ1809662 cíclica e as outras formas desamidadas (Asp e iso-Asp) a primeira é por vezes referida como "imida cíclica" e a outra é por vezes referida como "desamidada" ou "desamidação", particularmente na esquematização das figuras.

Exemplo 1: Potência Aumentada na Amostra Estável do IFN-β lb Livre da HA

Sumário

Foi observada um aumento da potência em amostras estáveis do IFN-β lb livre da HA. O ensaio dos efeitos citopáticos (CPE) apresentou uma potência aumentada nas amostras estáveis do IFN-β a 25°C livre da HA por um periodo de tempo (T = 0-6 meses). 0 produto de desamidação final e o seu intermediário (a imida cíclica) foram também observados por apresentarem um aumento a 25°C das amostras estáveis. 0 mapeamento do peptídeo Glu-C identificou o sítio de desamidação em Asn25 e revelou que as formas principais de desamidação nas amostras estáveis do IFN-β lb livre da HA eram os análogos de iso-Asp e da imida cíclica, enquanto que a forma Asp é ligeiramente aumentada.

Os resultados obtidos a partir do método de RP-HPLC indicaram que as formas desamidadas (imida cíclica, 20 ΡΕ1809662

Asp, e iso-Asp) aumenta significativamente na amostra estáveis do IFN-β livre da HA.

As formas desamidadas na amostra estável do IFN-β livre da HA apresentaram maior actividade biológica do que o IFN-β precedente (amidado) através de ensaios dos CPE e anti-proliferativos.

Com base nestas descobertas, considera-se que a desamidação (formação de análogos de Asp, de iso-Asp e da imida cíclica) aumenta uma actividade biológica do IFN-β livre da HA. Desta forma, uma forma desamidada do IFN-β pode ser preparada de forma a aumentar uma actividade biológica de terapêuticas baseadas no IFN-β, quer livre da HA ou contendo HA. Os análogos desamidados podem ser preparados através da incubação de uma solução do IFN-β (quer livre da HA ou contendo HA) a temperatura moderada a elevada, e/ou a pH baixo, moderado ou elevado. Os produtos de desamidação desta invenção irão reduzir a dose clínica necessária e aumentar a estabilidade das formulações líquidas do IFN-β à temperatura ambiente. Através da redução da dose clínica a proporção de pacientes que sofrem de uma reacção imune adversa (por exemplo, anticorpos neutralizantes), é reduzida.

Os dados que substanciam a invenção obtidos a partir de vários estudos e análise da estabilidade das preparações do IFN-β lb são fornecidas abaixo: 21 ΡΕ1809662

1. Dados da Estabilidade do IFN-β Livre da HA

Como apresentado na Tabela 1 (Substância Farmacológica: em ácido aspártico a 2 mM, pH 4,0) e Tabela 2 (Produto Farmacológico: em ácido aspártico a 2 mM, pH 4,0, Trealose a 9%), o ensaio dos efeitos citopáticos (CPE) apresenta uma potência aumentada em amostras estáveis do IFN-β lb livre da HA a 25°C ao longo do tempo (T = 0-6 meses):

Tabela 1 Dados do Bioensaio de Estabilidade dos CPE para a Substância Farmacológica do Interferão beta lb livre da HA Método Analítico: Bioensaio dos CPE Critério de Aceitação: 1,3-5,1 X 107 IU/mg Lote No.: Teste Dirigido TA2040 TA2085 Teste Dirigido TA2040 TA2085 Descrição: 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml Estudo No.: 1402 1411 1414 1403 1412 1415 Armazenamento: 5°C 5°C 5°C 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH Orientação: Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Meses IU/mg X 107 IU/mg X 107 IU/mg X 107 IU/mg X 107 IU/mg X 107 IU/mg X 107 0 2,8 2,8 2,9 2,8 2,8 2,9 1,5 ND ND ND 4,2 3,5 3,6 3 3,0 2,9 2,8 4,6 4,2 \—1 4,5 ND ND ND 5,7 4,9 5,0 6 3,3 3,1 2,9 6,3 5,4 4,8 ND: Não Efectuado RH: Humidade Relativa 22 ΡΕ1809662

Tabela 2 Dados do Bioensaio de Estabilidade dos CPE para o Produto Farmacológico do Interferão beta lb livre da HA

Lote No.: 14159-49 (Não Clinico) 25FEB03 (Teste Dirigido) TA2158 TA2451 Descrição: 1,2 ml; 0,25 mg/ml 1,2 ml; 1,0 mg/ml 1,2 ml; 1,0 mg/ml 1,2 ml; 1,0 mg/ml Estudo No.: 1335 1438 1442 1444 Armazenamento: 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH Orientação: Invertida Invertida Invertida Invertida Meses IU/mg X 107 IU/mg X 107 IU/mg X 107 IU/mg X 107 0 2,8 2,7 2,7 2,6 1,5 3,2 3,7 3,5 3,6 3 4,3 4,4 4,4 4,2 4,5 4,1 4,8 4,6 4,6 6 4,6 5,3 5,5 5,4

Como apresentado nas Tabelas 3 e 4, em baixo, a troca catiónica (CEX)-HPLC demonstra que os dados de estabilidade para amostras a 25°C de substância farmacológica e de produto farmacológico, respectivamente, apresentaram também um aumento na desamidação (D-IFN-β): 23 ΡΕ1809662

Tabela 3 Dados da Estabilidade de CEX-HPLC para a Substância Farmacológica do Interferão beta lb livre da HA Método Analítico: CEX HPLC Critério de Aceitação: % de Desamidação Apresentada Lote No.: Teste Dirigido TA2040 TA2085 Teste Dirigido TA2040 TA2085 Descrição: 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml Estudo No.: 1402 1411 1414 1403 1412 1415 Armazenamento: 5°C 5°C 5°C 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH Orientação: Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Vertical Meses % de Desa-midação % de Desamidação % de Desamidação % de Desamidação % de Desamidação % de Desamidação 0 6 6 6 6 6 6 1,5 ND ND ND 10 10 9 3 7 6 7 14 14 13 4,5 ND ND ND 20 20 18 6 5 6 6 22 22 20 ND: Não Efectuado

Tabela 4 Dados da Estabilidade de CEX-HPLC para o Produto Farmacológico do Interferão beta lb livre da HA

Lote No.: 14159-49 (Não Clinico) 25FEB03 (Teste Dirigido) TA2158 TA2451 Descrição: 1,2 ml; 0,25 mg/ml 1,2 ml; 1,0 mg/ml 1,2 ml; 1,0 mg/ml 1,2 ml; 1,0 mg/ml Estudo No.: 1335 1438 1442 1444 Armazenamento: 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH Orientação: Invertida Invertida Invertida Invertida ΡΕ1809662 24 (continuação)

Meses % de Desamidação % de Desamidação % de Desamidação % de Desamidação 0 4 7 7 7 1,5 7 11 13 12 3 12 18 18 17 4,5 16 24 24 22 6 18 371 351 401 10 FIM IP IP IP FIM

As Tabelas 5 e 6, em baixo, demonstram que um aumento no Pico D, que representa a forma de desamidação intermediária da imida cíclica, foi também observada ao longo do tempo utilizando uma técnica de (RP)-HPLC de fase reversa em amostras de substâncias farmacológicas e de produtos farmacológicos, respectivamente a 25°C:

Tabela 5 Dados da Estabilidade de RP-HPLC para a Substância Farmacológica do Interferão beta lb livre da HA Método Analítico: RP HPLC Critério de Aceitação: % da Área dos Pioos Apresentados Lote No.: Teste Dirigido TA2040 TA2085 Descrição: 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml 6 ml; 2 mg/ml Estudo No.: 1403 1412 1415 Armazenamento: 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH Orientação: Vertical Vertical Vertical Meses Pk A Meio (EH-B) Pk D Pk B Outro Pk A Meio (EH-B) Pk D Pk B Outro Pk A Meio (DtB) Pk D Pk B Outro 0 2 96 12 85 2 2 96 11 85 2 2 96 11 86 2 1,5 2 95 17 78 3 2 96 17 79 2 2 96 16 80 3 3 1 93 20 73 6 1 92 19 73 7 1 92 19 73 7 4,5 2 91 24 67 7 2 90 24 66 8 1 91 23 68 8 6 2 93 26 67 5 1 93 25 68 5 1 94 25 68 5 25 ΡΕ1809662

Tabela 6 Dados da Estabilidade de RP-HPLC para o Produto Farmacológico do Interferão beta lb livre da HA

Método Analítico: RP HPIC Critério de Aceitação: % da Área dos Picos Apresentados Lote No.: 25EEB03 (Teste Dirigido) TA2158 TA2451 Descrição: 1,2 ml; 1,0 mg/ml 1,2 ml; 1,0 mg/ml 1,2 ml; 1,0 mg/ml Estudo No.: 1438 1442 1444 Armazenamento: 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH 25°C / 60 % RH Orientação: Invertida Invertida Invertida Meses Pk A Meio (D+B) Pk D Pk B Outro Pk A Meio (CH-B) Pk D Pk B Outro Pk A Meio (D+B) Pk D Pk B Outro 0 1 93 12 81 6 1 93 11 82 6 1 93 12 81 6 1,5 1 92 16 76 6 1 92 17 74 7 1 91 17 75 8 3 2 90 22 68 8 2 91 21 69 8 2 91 21 70 7 4,5 2 94 23 71 5 1 94 22 72 5 1 94 22 72 4 6 1 94 24 70 5 1 94 24 71 5 1 95 24 71 4 FIM

As Figs. 4-11 apresentam representações gráficas da potência versus quantidade do IFN-β lb desamidado ("% de D-IFN" ou "% de Pico D") em vários lotes de substâncias e de produtos farmacológicos estáveis do IFN-β livre da HA de acordo com um aspecto da invenção. Estes dados demonstram que existem uma correlação entre a potência aumentada e o nivel de desamidação do IFN-β livre da HA. 26 ΡΕ1809662

2. Caracterização das Amostras Estáveis do IFN-β Livre da HA A sequência principal do IFN-β lb está representada na Fig. 3. A desamidação ocorreu em Asn25. A natureza dessa desamidação e as propriedades dos produtos desamidados foram exploradas nos ensaios descritos abaixo:

2.1. Mapa do Peptídeo Glu-C

Um mapa do peptideo produz um perfil de identificação para proteínas utilizando uma digestão enzimática seguida por RP-HPLC. 0 mapeamento do peptídeo é normalmente utilizado no controlo de qualidade tal como um teste ID. É também uma ferramenta poderosa para monitorizar pequenas modificações da estrutura primária numa proteína a partir de eventos tais como o corte, a mutação e a degradação devida à oxidação ou à desamidação. O IFN-β livre da HA é conhecido por conter imida cíclica, uma forma intermediária de desamidação. Esta imida cíclica é uma variante degradada chave do IFN-β livre da HA e encontra-se em quantidades aumentadas em amostras estáveis. Muitas enzimas incluindo a Lis-C, que é utilizada no mapa do peptídeo comum para o IFN-β livre da HA, digere optimamente proteínas com pH neutros a elevado. Em pH neutro a elevado, a imida cíclica é instável e a desamidação é induzida artificialmente. Por isso, a manutenção da amostra num ambiente de pH baixo durante a redução e a digestão é necessária para monitorizar o nível nativo da imida cíclica e da desamidação na amostra. 27 ΡΕ1809662

Um novo mapa do peptídeo da endoproteinase C (Glu-C) foi desenvolvido acoplado com tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP) como agente redutor para caracterizar o fragmento contendo formas desamidadas, incluindo a imida ciclica, no IFN-β livre da HA. O mapa do peptideo Glu-C é conhecido por possuir dois pH's óptimos, o pH 7,8 e o pH 4,0, para a sua actividade enzimática. O TCEP é conhecido por ser funcional a um pH abaixo de 8,0. O novo mapa do peptideo Glu-C foi desenvolvido utilizando a amostra de preparação incluindo tanto a redução como a digestão a baixo, 4,0, que é uma gama de pH óptima para preservar o nivel nativo de formas desamidadas, por exemplo, a imida ciclica, na amostra. Visto que o mapa do peptídeo aqui desenvolvido emprega uma preparação de amostra de pH baixo, a monitorização precisa do nível nativo das formas desamidadas no IFN-β livre da HA é atingida com sucesso.

As amostras de estabilidade do lote do produto farmacológico do IFN-β lb livre da HA TA2451 (3,6, e 9 meses a 25°C) foram testadas através do mapa do peptídeo da Glu-C para identificar o sítio de desamidação e a sua forma (por exemplo, Asp, iso-Asp, Imida Cíclica). Cada amostra de proteína de 0,5 ml a uma concentração de 0,5 mg/ml, em tampão de formulação de ácidos aspártico a 2 mM, a pH 4,0 foi reduzida utilizando TCEP. Utilizando uma taxa molar de 1:10 de proteína para TCEP, a amostra foi incubada a 37°C durante 3 horas. O material reduzido foi subsequentemente digerido com Glu-C a 4 mg/ml a uma taxa de 5:1 da massa da 28 ΡΕ1809662 proteína para a Glu-C e incubado a 37° C durante 4 horas. Os fragmentos do peptídeo foram determinados por cromato-grafia de RP-HPLC (ThermoHypersil BioBasic C18, 150 x 4,6 mm, 5 pm), utilizando um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% como tampão de eluição, a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min e a uma temperatura da coluna de 38°C. A Fig. 12A apresenta mapas do peptídeo Glu-C de amostras estáveis do IFN-β livre da HA de acordo com um aspecto da invenção. A Fig. 12B apresenta uma vista expandida da porção RT de 22-26 minutos do mapa da Fig. 12A.

Como apresentado nas figuras, o pico do fragmento EI decresce ao longo do tempo, enquanto que os picos que representam a iso-Asp, a imida cíclica e a Asp aumentam. Estes picos são formas desamidadas de Asn na posição 25 no fragmento EI. Esta caracterização do pico foi efectuada por espectrometria de massa e através da sequênciação de Edman de sub-f ragmentos de EI obtidos por digestão da Lisil endopeptidase de fragmentos relacionados com El. O resíduo Asn25 possui uma sequência de aminoácidos seguida pela glicina. Esta sequência Asn-Gli é conhecida por possuir uma taxa de desamidação rápida.

Com base nestes resultados do mapa do peptídeo da Glu-C, as formas principais de desamidação nas amostras estáveis do IFN-β livre da HA foram identificadas por serem 29 ΡΕ1809662 a iso-Asp e a imida cíclica. Houve também um ligeiro aumento no nível da forma de Asp.

2.2. RP-HPLC A RP-HPLC separa compostos com base na sua hidrofobicidade. As amostras do IFN-β lb livre da HA foram testadas pelo método de RP-HPLC para caracterizar as variantes do IFN-β lb (por exemplo, Asp, iso-Asp, imida cíclica). As amostras de teste foram injectadas numa coluna de cromatografia Zorbax 300SB-CN, 150 x 4,6 mm, tamanho da partícula de 3,5 pm e as variantes do IFN-β lb foram separadas utilizando um gradiente de acetonitrilo num tampão de eluição de ácido trifluoroacético a 0,1%. O resultado da amostra de controlo é apresentado na Fig. 13. A identificação do pico apresentado na figura foi efectuada pela análise espectrométrica LC/massa on-line (RP-HPLC/Q-TOF/ESI-MS). 0 fluxo de HPLC foi dividido em 1:20, e cerca de 50 μΐ/min aproximadamente foram dirigidos para a fonte iónica do espectrómetro de massa. O espectró-metro de massa é um instrumento da Q-TOF2 da Micromass, com uma fonte iónica de electrospray. A voltagem iónica foi programada a 3200, com o cone de voltagem programado a 50. Os dados foram recolhidos com o analisador de tempo de voo (TOF) entre 300 e 2500 m/z. Os dados LC/massa on-line revelam que existe mais do que uma variante da proteína a co-eluir sob alguns dos picos de RP-HPLC. 30 ΡΕ1809662 A Fig. 14 apresenta o perfil de RP-HPLC da amostra estável do lote do produto farmacológico do IFN-β lb livre da HA (cerca de 10 meses a 25°C). Como apresentado na figura, o perfil é diferente do da amostra de controlo (Fig. 13) e do da imida cíclica (Pico D) e do da desami-dação (Asp e/ou iso-Asp) (Pico Central) significativamente aumentado no IFN-β lb livre da HA. Foram observadas múltiplas outras variantes desamidadas e da imida cíclica menores. Estas são variantes desamidadas e da imida cíclica com modificações estruturais e químicas adicionais que estão separadas devido ás suas propriedades hidrofóbicas divergente.

2.3. Bioensaio dos CPE O IFN-β induz um estado antiviral em células de mamíferos nas quais alguns tipos de vírus são inibidos na sua replicação e não causam efeitos citopáticos celulares (CPE) . As células do carcinoma do pulmão humano A54 9 e o vírus encefalomiocardite (EMC) de murino foram utilizados para avaliar a actividade biológica das fracções de RP-HPLC obtidas a partir da amostra estável do lote do produto farmacológico do IFN-β lb livre da HA (cerca de 10 meses a 25°C).

As células cresceram em placas de 96 poços e foram preparadas com diluições seriadas do IFN-β lb durante a noite antes da adição do vírus. As culturas foram então incubadas por um período de tempo adequado para permitir a replicação do vírus. As células tratadas com o IFN-β lb 31 ΡΕ1809662 suficiente foram protegidas da infecção com o vírus e permaneceram viáveis. As células não protegidas sofreram alterações citopáticas e morreram. A dose do interferão dependente dos CPE foi quantificada utilizando técnicas de coloração e uma foi preparada uma curva de resposta à dose a partir de uma representação gráfica da viabilidade da célula (medição da Densidade Óptica) vs. a concentração do IFN-β. A actividade do IFN-β foi calculada como a concentração necessária para metade da protecção máxima da célula (concentração de ED50) .

Como apresentado na Fig. 15, a actividade dos CPE na fracção desamidada (Pico Central, Fracção 16) é significativamente mais elevada do que a da fracção do IFN-β lb precedente (Pico B, Fracção 18) . A fracção da imida cíclica (Pico D, Fracção 15) apresenta também actividade dos CPE mais elevada do que a da fracção do IFN-β lb precedente. 2.4. Ensaio Anti-proliferativo 0 IFN-β apresenta actividade anti-proliferativa contra um número de linhas celulares estabelecida a partir de tumores humanos. Duas linhas celulares, a linha celular do melanoma humano Hs294T-a e a linha linfoblástica B humana Daudi-a derivado do linfoma Burkitt, foram utilizadas para avaliar a actividade biológica das fracções de RP-HPLC obtidas a partir da amostra estável do lote do produto farmacológico do IFN-β lb livre da HA (cerca de 10 meses a 25°C). 32 ΡΕ1809662

Foram efectuadas diluições seriadas de amostras de teste do IFN-β em placas de 96 poços. As células replicadoras foram preparadas em meio de cultura de tecidos e adicionadas ás placas de ensaio após 3 dias de incubação, foi utilizado a coloração das células com Alamar Blue ou a contagem com um Contador de Coulter para medir a resposta ao crescimento. O crescimento celular foi inibido em resposta ao IFN-β de uma forma dependente da dose. Foi preparada uma curva de resposta à dose a partir de uma representação gráfica do número de células (medição da Densidade Óptica) vs. a concentração do IFN-β. A actividade do IFN-β foi calculada como a concentração necessária para metade da protecção máxima da célula (concentração de ED50) .

Como apresentado nas Figs. 16A (Hs294T) e na 16B (Daudi), a actividade anti-proliferativa na fracção desamidada (Pico Central, Fracção 16) e na fracção da imida cíclica (Pico D, Fracção 15) é significativamente mais elevada do que na fracção do IFN-β precedente (Pico B, Fracção 18). 3. Conclusões

Com base nos dados de estabilidade e nos resultados obtidos a partir dos estudos descritos acima, a desamidação (Asp, iso-Asp e imida cíclica substituído Asn na posição 25) aumenta uma actividade biológica do IFN-β. Desta forma, uma forma desamidada de um IFN-β, por exemplo, 33 ΡΕ1809662 ο IFN-β lb pode ser intencionalmente preparada de forma a aumentar a actividade biológica do composto. A forma desamidada pode ser preparada através da incubação do IFN-β a temperaturas moderadas a elevadas, ou em ambientes de pH baixo, moderado ou elevado. Os produtos desamidados desta invenção irão reduzir a dose clinica necessária e aumentar a estabilidade das formulações do IFN-β líquidas, incluindo as formulações do IFN-β livres da HA e contendo HA, à temperatura ambiente. Através da redução da dose clínica, a proporção de pacientes que sofrem uma reacção imune adversa (por exemplo, a neutralização de anticorpos), é reduzida.

Exemplo 2: Dados de Produtibilidade

As experiências foram conduzidas para demonstrar várias técnicas de desamidação, como descrito acima. Os dados obtidos a partir do bioensaio dos CPE evidenciam que o IFN-β desamidado é rapidamente preparado através de processos adequados para a produção farmacêutica em larga escala. Em particular, foram observados aumentos significativos da bioactividade em várias amostras efectuadas sob Boas Práticas de Produção (GMP) incubadas a temperaturas de moderada (por exemplo, temperatura ambiente) a elevada (por exemplo, 37-40°C) durante 14-40 dias, e a bioactividade aumentada quase duas vezes foi obtida através da incubação de uma amostra GMP à temperatura ambiente e com pH de 8,8 durante cerca de 1 hora e a 2-8°C com pH de 8,4 durante cerca de 14 dias. 34 ΡΕ1809662

Resultados do Bioensaio dos CPE

Teste 1

Nome da Amostra IU/mg TRO90602 Bulk 2,79 E+07 TRO90602 Stab RT1 20 dias 3,87 E+07 TRO90602 Stab 37C 20 dias 4,11 E+07 Controlo sob Stress Livre da HA 2,95 E+07 pH2 Base sob Stress Livre da HA 4,52 E+07 40C 30 Dias sob Stress Livre da HA 5,06 E+07 Ensaio de Controlo IFN CPE 2,94 E+07

Teste 2

Nome da Amostra IU/mg TRO90602 Bulk 3,62 E+07 TRO90602 Stab RT 40 dias 6,52 E+07 TRO90602 Stab 37C 40 dias 1,56 E+08 GMP#1 Bulk 2,67 E+07 GMP#1 Bulk Stab 37C 40 dias 3,51 E+07 GMP#1 Bulk pH 8,83 4,79 E+07 Controlo sob Stress Livre da HA 2,26 E+07 40C 14 dias sob Stress Livre da HA 3,44 E+07 40C 30 dias sob Stress Livre da HA 4,05 E+07 Ensaio de Controlo IFN CPE 2,93 E+07 1) Temperatura ambiente 2) A amostra foi incubada a pH 8,4 a 2-8 C durante 14 dias. 3) A amostra foi incubada a pH 8,8 à RT durante 1 hr. 35 ΡΕ1809662

Conclusão

Apesar da presente invenção ter sido descrita em algum detalhe com fins de clarividência do entendimento, é evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do âmbito das reivindicações apensas. Deve ser digno de nota que existem bastantes formas alternativas de implementar ambos os processos e composições da presente invenção. Da mesma forma, as formas de realização presentes são consideradas ilustrativas e não restritivas, e a invenção não se limita aos detalhes aqui apresentados, mas pode ser modificada dentro do âmbito das reivindicações apensas.

Lisboa, 18 de Fevereiro de 2009

Claims (27)

1. ΡΕ1809662 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um análogo sintético da proteína do inter-ferão β humano purificado e isolado, em que, a asparagina na posição 25, numerada de acordo com o interferão β nativo, é desamidada, e, o dito análogo da proteína exibe uma actividade biológica do interferão β nativo humano.
2. 2. 0 análogo sintético da proteína da reivindicação 1, em que a cisteína na posição 17, numerada de acordo com o interferão β nativo é delectada ou substituída por aminoácido neutro.
3. 3. O análogo sintético da proteína da reivindicação 2, em que o dito resíduo de cisteína foi substituído por um resíduo de serina.
4. 4. 0 análogo sintético da proteína da reivindicação 3, em que o dito resíduo de asparagina foi substituído por um resíduo seleccionado a partir do grupo constituído pelo aspartato, iso-aspartato, e pela imida cíclica.
5. 5. 0 análogo sintético da proteína da reivin dicação 4, em que o análogo da proteína não está glico-silado.
6. 6. O análogo sintético da proteína da reivin- 2 ΡΕ1809662 dicação 5, em que o análogo da proteína possui uma delecção da metionina N-terminal.
7. 7. 0 análogo sintético da proteína da reivindicação 4, em que o análogo da proteína possui uma activi-dade biológica maior do que a do IFN-pserI7.
8. 8. Uma composição terapêutica contendo a acti-vidade do IFN-β contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo sintético da proteína da reivindicação 4, misturada com um veículo de transporte farmacologicamente aceitável.
9. 9. A composição da reivindicação 8, em que pelo menos 50% do análogo sintético da proteína está desamidado na posição 25, numerada de acordo com o interferão β nativo.
10. 10. A composição da reivindicação 8, em que substancialmente todo o análogo sintético da proteina está desamidado na posição 25, numerada de acordo com o interferão β nativo.
11. 11. A composição da reivindicação 8, em que a composição está livre da HA.
12. 12. Um método de produção do análogo do IFN-β desamidado, que compreende: 3 ΡΕ1809662 a incubação de uma proteína do IFN-β sob condições adequadas a temperatura de moderada a elevada de cerca de 25-60°C, purificando e isolando o análogos da proteína desamidado.
13. 13. O método da reivindicação 12, que compreende : a incubação a uma temperatura de cerca de 40°C durante cerca de 14 dias.
14. 14. O método da reivindicação 13, compreendendo adicionalmente que a incubação seja conduzida a um pH de pelo menos 4.
15. 15. O método da reivindicação 14, compreendendo: a incubação a um pH de 7-14.
16. 16. 0 método da reivindicação 15, em que a incubação decorre a um pH de 8-9 durante cerca de 14 dias.
17. 17. A composição da reivindicação 8 para a utilização em terapia.
18. 18. A composição da reivindicação 17, em que a terapia se destina à regulação do crescimento celular no paciente e a composição é utilizada numa quantidade de regulação do crescimento celular. 4 ΡΕ1809662
19. 19. A composição da reivindicação 17, em que a terapia se destina a uma doença virai do paciente e a composição é utilizada numa quantidade que inibe a doença virai.
20. 20. A composição da reivindicação 17, em que a terapia se destina a estimular a actividade natural da morte celular no paciente e a composição é utilizada numa quantidade que estimula a morte celular natural.
21. 21. A composição da reivindicação 17, em que a terapia se destina à esclerose múltipla no paciente e a composição é utilizada numa quantidade terapeuticamente eficaz.
22. 22. A composição da reivindicação 21, em que a terapia compreende a redução da frequência dos picos de esclerose múltipla.
23. 23. A composição da reivindicação 22, em que a dita esclerose múltipla é do tipo surto - remissão.
24. 24. Um método de mapeamento de peptídeos, que compreende: a incubação uma amostra de proteína numa solução tamponada abaixo de pH 8 contendo um agente de redução; a digestão da amostra incubada com a endoproteinase C; 5 ΡΕ1809662 e a determinação dos fragmentos da digestão do peptideo através de cromatografia liquida. em que a amostra de proteína é um IFN-β desamidado.
25. 25. 0 método da reivindicação 24, em que o agente redutor é o tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP).
26. 26. 0 método da reivindicação 25, em que a incubação é conduzida a um pH de cerca de 4.
27. 27. 0 método da reivindicação 26, em que a cromatografia líquida é a RP-HPLC. Lisboa, 17 de Fevereiro de 2009 1/14 ΡΕ1809662 s 10 IS ' 20’ m$&rXyrmiw ArfSerStrAsu^^ ôl«0y$61 alysuu W . 30’ 35. . 4Ô UatrpOIrieuAsn &1yA?iie«0!aT|j OysLeaLysAspAjg' (mAs#UeAspI1© ProSlisil«neLys 01tàS1ftS1#fc« SlKLysSluMpAU AT«UyTfcfm?yr m 70 * 75 , - -80- 51unetU«81flA») 41ePftt&i«n«Pf!· Arg&líiAspSèfS$r SerT^lyT^Am Si ; m v §1' 100 Slufltrlleiíamia teriUtiUtíAI «A$t» VaiTyrtH sGIϊϊΙΙ e AshHIsUuly sBt e „ m · m·· . us'-'* -ia V«1Ut&1t&!uty| 4euS?«tysSluAsg WNeTiirArfSly^| U«Kôt$«rSèrUe BtsU«lysArgTyr TyrSIyArgll eUa .HIsiyHLealysH* LysTíyTyrSerHís CyíAtaTrpTNrlIe VaTArgValSlyll€ LeiiAgAsT5f%eTyr Shell eAsnArgléa _ „ m m m *' m ThrSIyTyriayârg Μη·*- FIG. 1 ΡΕ1809662 2/14

    ΡΕ1809662 3/14 Via de desamidação de Asn m Hr ft-rf-t L-Asn peptídeo

    FIG. 3 PE1809662 4/14 Cm íillímg xWE+7) cp£ flUíme xlOE+T) ll¥re de HA 1FN TA2040, 25°C, 0-6 meses

    D-ÍFN f%) F/G. 4

    0 5 10 IS 20 26 mm (%) RS. 5 PE1809662 5/14 !FN TA 2158 livre de HA, 25°C. 0-4,5 meses CPE mim X1Q&*7} CP£ py/mg x10E+7?

    FIG. 6

    O S 10 15 20 25 EMPN (%) FIG. 7 PE1809662 6/14 CPE {iWm§ xlÔE+7) OPE {!U/mg χίβΕ+7) iFN TÂ2Q40 livre de HA, 25QC, 0-6 meses

    Fias IFN TA2085 livre de HA, 250C, 0-6 meses

    FIG. 9 PE1809662 7/14 CPU (SU/mg x10E+7) CPi pU/mg x1QE+7) IFN TA2158 íivre de HA, 25°C, 0-6 meses

    F/G. 10 IFN TA2451 livre de HA, 25»C, 0-6 meses

    F/G. íf ΡΕ1809662 8/14 !FN imida cíclica $ΐ israsia cK&ca & 5 5 * * ' t* '$: ·:< «$·' S SÉ- " Sè· > .is: v $< ^ à áfc ‘ & ά ' 25*0, 3 meses

    5Ϊ-* 1 Wf Ιψ ^'S«-S«ÍÍ^WÇ· WfSíj: jii^«i: t·: síf< fsjj: ' « 1 ?S SS 2fc 3S ® ;» I ^Aíf I 2^*0, 6 meses | S>?miisáa: sídtGa iii^t-i c; ^ímJ-sjSçjií ::j $ f ' Φ >3 !·» & W ' á» * -SS s* ' W « ‘ :¾ ' SS ^ 5S ' ά ÇSímida cíd^a\§y , 2bvC, 9 meses sã*'3 s Ί í ^ΐ™ρ·"ΐ;!ΐ ίψ. ψ »jl· η 5,$ !tt| ÍÍÍÍ !S í i * ^ Λ ss tí Ή )»3 xí 'is ks :í< SÁ » sc :¾ m :¾¾. ^ >V-** -W,-.™ fig, 12A ΡΕ1809662 9/14 ΕΊ

    FÍG. 12Β ΡΕ1809662 10/14

    PE1809662 11/14 pça c&túmi

    tempo ípM) [λ/uj] EpodSSJ ΡΕ1809662 12/14

    ΡΕ1809662 1 3/14

    F/α 16Α ΡΕ1809662 14/14

    FIG. 16B 1 ΡΕ1809662 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição - US 435154 A * US 4858314 A US 4588585 A * WO2SC4067753A * US 4737482 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição SRSiTH, M,; G1LLASS, S, Geneac Efigiaesraiç: Frêl·-eiplès arsd p$ksb» Press, 1931, vd. 3,1 -32 * Gene. 1S8C, voí. 10,11-15 « Matute, 1980, vol. 285,542-547 * LATHER, R.F.; LECOQ, i. P„ Qeneãc Engineerirct. Aeademic Press, 1983, 31-50