ES2320247T3 - Procedimiento para la produccion de l-valina por fermentacion mediando utilizacion de bacterias corineformes con una actividad aumentada de transaminasa. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción por fermentación de L-valina, caracterizado porque en una bacteria corineforme se aumenta la actividad de la transaminasa C.
Description
Procedimiento para la producción de
L-valina por fermentación mediando utilización de
bacterias corineformes con una actividad aumentada de transaminasa
C.
El invento se refiere a un procedimiento para la
producción de L-valina así como a un microorganismo
que es apropiado para esto.
El aminoácido L-valina encuentra
utilización en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en
la industria alimentaria y en la nutrición de animales.
Es conocido que ciertos aminoácidos se producen
por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular
de Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran
importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento
de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los
procedimientos pueden implicar unas medidas técnicas de
fermentación tales como p.ej. agitación y abastecimiento con
oxígeno, o la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej.
la concentración de azúcares durante la fermentación. o el
tratamiento para dar la forma del producto mediante, p.ej., una
cromatografía con intercambio de iones o las propiedades intrínsecas
de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.
Para el mejoramiento de las propiedades de
rendimiento de estos microorganismos, se utilizan unos métodos de
mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se
obtienen unas cepas, que son resistentes contra los antimetabolitos
o son auxótrofas para metabolitos importantes como reguladores y
producen L-aminoácidos. Así, por ejemplo, en el
documento de patente de los EE. UU. US-5.521.074 se
describe una cepa de Corynebacterium, que es resistente frente a
L-valina y es sensible frente a un fluoropiruvato.
Además, en el documento de patente europea EP 0287123 se describe
que unas corinebacterias con resistencia frente a ácidos
micofenólicos se pueden usar ventajosamente para la obtención de
L-valina. También, a partir del documento de
solicitud de patente europea EP 0519113 A1 y del documento US
5.658.766 es conocido que unas mutantes con una
valil-tARN sintetasa mutada, en combinación con
otras mutaciones adicionales, se pueden aprovechar para la formación
de L-valina. Junto a esto, en el documento de
solicitud de patente internacional WO 001996006926 A1 se describe un
procedimiento para la producción de L-valina, en el
que se usa un microorganismo, que necesita la vitamina ácido
lipónico para el crecimiento y posee un defecto en la ATPasa.
La técnica de ADN recombinante se emplea
adicionalmente para el mejoramiento de las propiedades intrínsecas
de cepas de Corynebacterium que producen
L-aminoácidos. Así, en los documentos de patentes
europeas EP 1155139 B1 y EP 0356739 B1 se describe el hecho de que
los refuerzos de la expresión de los genes de biosíntesis ilvBN,
ilvC, ilvD se emplean ventajosamente para la formación de
L-valina. Además, a partir del documento EP 1155139
B1 es conocido que la debilitación o exclusión del gen ilvA de la
treonina deshidratasa y/o de genes de la síntesis de un pantotenato
se pueden aprovechar para la formación de
L-valina.
D. Leyval y colaboradores en el artículo
"Characterisation of the enzyme activities involved in the valine
biosynthetic pathway in a valine-producing strain of
Corynebacterium glutamicum" [Caracterización de las
actividades enzimáticas implicadas en la ruta de biosíntesis de
valina en una cepa productora de valina de Corynebacterium
glutamicum] en el Journal of Biotechnology 104 (2003) 241 - 252
de Elsevier divulgan un estudio cinético acerca de la ruta de
biosíntesis de L-valina en Corynebacterium
glutamicum, en el que se muestra que un cetoisovalerato es
convertido químicamente mediante una transaminasa C en
L-valina.
A partir del documento EP 1.275.729 A1 se
desprende que el aumento de la actividad de la transaminasa puede
conducir a la disminución de la producción de
L-valina.
La misión del invento es poner a punto un
procedimiento, y un microorganismo apropiado para éste, destinados
a la producción por fermentación mejorada de
L-valina.
Partiendo del concepto definitorio de la
reivindicación 1, el problema planteado por esta misión se resuelve
conforme al invento con las características indicadas en la parte
caracterizante de la reivindicación 1.
Se encontró que unas bacterias corineformes,
después de un refuerzo del gen que codifica la transaminasa C,
producen de manera mejorada L-valina. Con el
procedimiento conforme al invento es posible ahora producir
L-valina con un rendimiento que está situado un
35,8% más alto que el de la cepa que no ha sido modificada conforme
al invento.
A continuación se debe de describir el
invento.
Es objeto del invento un procedimiento para la
preparación por fermentación de L-valina mediando
utilización de bacterias corineformes, en las cuales se ha
aumentado la actividad de la transaminasa C.
Unas formas preferidas de realización se
encuentran en las reivindicaciones subordinadas.
\newpage
Conforme al invento la actividad de la
transaminasa C se refuerza en una bacteria corineforme que produce
el aminoácido L-valina.
Las cepas empleadas producen
L-valina de manera preferente ya antes del refuerzo
del gen de la transaminasa C.
Como microorganismo se emplea una bacteria
corineforme.
Se prefieren en este contexto especialmente
Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum,
Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum,
Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum.
Cepas especialmente apropiadas del género
Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium
glutamicum, son por ejemplo las conocidas cepas de tipo
salvaje
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020,
y mutantes o respectivamente cepas que
sobreproducen L-aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias corineformes, que son un objeto
del presente invento, pueden producir L-valina por
ejemplo a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa,
melazas, almidones, celulosas o a partir de glicerol o etanol. Se
trata de representantes de bacterias corineformes, en particular del
género Corynebacterium. En el caso del género Corynebacterium hay
que mencionar especialmente a la especie Corynebacterium
glutamicum, que es conocida en el sector especializado por su
capacidad de producir L-aminoácidos.
Por el concepto de "refuerzo" se entenderá
en el sentido del invento el aumento de la actividad intracelular
de transaminasa C por ejemplo mediante las siguientes medidas
técnicas:
Aumento de la expresión de los genes mediante
por lo menos una medida técnica tomada del conjunto que se compone
de:
- -
- una modificación de las estructuras de señales de la expresión de genes, tal como por ejemplo por modificación de
- los genes represores,
- los genes activadores,
- los operadores,
- los promotores;
- los atenuadores,
- los sitios de fijación a ribosomas,
- el codón inicial,
- los terminadores.
- -
- una introducción de un promotor más fuerte, tal como por ejemplo el promotor tac o un promotor inducible por IPTG.
- -
- un aumento del número de copias de los genes, por ejemplo mediante introducción de vectores, tales como plásmidos,
- aumento del número de copias endógenas de los genes, es decir la incorporación de otros genes adicionales que codifican la transaminasa C, o alelos de los mismos, en el genoma cromosomal.
- Además se puede dar lugar a un refuerzo de la actividad de la transaminasa C mediante las siguientes medidas técnicas:
- -
- un aumento de la estabilidad del ARNm (mensajero) por ejemplo por mutación de las posiciones terminales, que regulan la interrupción de la transcripción.
- Por ejemplo, mediante la estabilidad del ARN m del gen de la transaminasa C se puede conseguir una mejorada formación de productos, influyendo de una manera positiva sobre la estabilidad mediante secuencias adicionales y/o modificadas junto al extremo 5' o al extremo 3' del gen. Ejemplos generales de esto son para genes procedentes de Bacillus subtilis (Microbiology 2001, 147: 1331-41) o de levaduras (Trends Biotechnol. 1994, 12:444-9).
- -
\;
utilización de un gen o alelo, que codifica una correspondiente enzima con una actividad aumentada.
El aumento de la actividad intracelular de una o
varias enzimas (proteínas) en un microorganismo, que son
codificadas mediante el correspondiente ADN, se puede reforzar,
utilizando por ejemplo un promotor fuerte o un gen o
respectivamente alelo, que codifica una correspondiente enzima con
una actividad aumentada o respectivamente sobreexpresa el
correspondiente gen (proteína), y eventualmente se combinan estas
medidas técnicas.
Es preferida la introducción de un promotor más
fuerte, tal como p.ej. el promotor tac (Amann y colaboradores (Gene
1988 69:301-15), o de promotores tomados del
conjunto de los promotores descritos en la cita de Patek y
colaboradores (Microbiology 1996 142:1297). Ejemplos de esto se
encuentran en el documento WO 96/15246 o en la cita de Boyd y
Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), en la cita de
Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), en la
cita de Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), en la cita de Pätek y colaboradores (Microbiology 142: 1297
(1996)), en la cita de Knippers ("Molekulare Genetik"
[Genética molecular], 6ª edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart,
Alemania 1995) o también en la obra de Winnacker ("Gene und
Klone" [enes y clones], sociedad editorial VCH, Weinheim,
Alemania, 1990).
La secuencia natural de nucleótidos del gen de
la transaminasa C es conocido forzosamente por medio de la
construcción de la secuencia completa del genoma de C. glutamicum (Kalinowski y colaboradores, 2003, J
Biotechnol., 104:5-25; Ikeda M, y Nakagawa S. 2003 Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:99-109), pero sin que se conozca la asignación de un marco de lectura abierto a la transaminasa C. También es conocido que la C. glutamicum (Leyval y colaboradores 2003. J. Biotechnol.104:241-52) así como también la E. coli poseen p.ej. una actividad de transaminasa C (Wang y colaboradores, 1987. J. Bacteriol. 169:4228-4234). El marco de lectura abierto descrito e identificado seguidamente en el Ejemplo, que codifica la transaminasa C, lleva el número NCg12510 y se ha depositado en el banco de datos públicamente accesible del "National Institute of Health" [Instituto nacional de la salud] (\underbar{http://www.ncbi.nlm.nih.gov}), el gen idéntico es identificado también como Cg12599 en el "banco de datos de ADN del Japón" públicamente accesible (\underbar{http://gib.genes.nig.ac.jp}).
construcción de la secuencia completa del genoma de C. glutamicum (Kalinowski y colaboradores, 2003, J
Biotechnol., 104:5-25; Ikeda M, y Nakagawa S. 2003 Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:99-109), pero sin que se conozca la asignación de un marco de lectura abierto a la transaminasa C. También es conocido que la C. glutamicum (Leyval y colaboradores 2003. J. Biotechnol.104:241-52) así como también la E. coli poseen p.ej. una actividad de transaminasa C (Wang y colaboradores, 1987. J. Bacteriol. 169:4228-4234). El marco de lectura abierto descrito e identificado seguidamente en el Ejemplo, que codifica la transaminasa C, lleva el número NCg12510 y se ha depositado en el banco de datos públicamente accesible del "National Institute of Health" [Instituto nacional de la salud] (\underbar{http://www.ncbi.nlm.nih.gov}), el gen idéntico es identificado también como Cg12599 en el "banco de datos de ADN del Japón" públicamente accesible (\underbar{http://gib.genes.nig.ac.jp}).
El gen de la transaminasa C, descrito dentro de
estos números, es empleado de manera preferente conforme al
invento. Además, se pueden utilizar alelos del gen de la
transaminasa C, que se establecen por ejemplo a partir de la
degeneración del código genético o mediante mutaciones de sentido
(en inglés sense mutations) neutras en cuanto a la función o
mediante deleción (supresión) o inserción de nucleótidos.
Para conseguir un refuerzo se puede aumentar o
respectivamente reforzar o bien la expresión del gen de la
transaminasa C o las propiedades catalíticas de la proteína
enzimática. Asimismo se puede modificar la propiedad catalítica de
la proteína enzimática en lo que se refiere a su especificidad para
substratos. Eventualmente se pueden combinar ambas medidas
técnicas.
El refuerzo de la expresión de los genes se
puede efectuar mediante una apropiada realización del cultivo o
mediante una modificación genética (mutación) de las estructuras de
señales de la expresión de los genes. Estructuras de señales de la
expresión de los genes son por ejemplo genes represores, genes
activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de
fijación a ribosomas, el codón inicial y terminadores. Datos acerca
de esto los encuentra un experto en la especialidad p.ej. en el
documento WO 96/15246, en la cita de Boyd y Murphy (J. Bacteriol.
1988. 170: 5949),en la cita de Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids
Res. 1998. 26: 3548), en la cita de Jensen y Hammer (Biotechnol.
Bioeng. 1998 58: 191), en la cita de Patek y colaboradores,
(Microbiology 1996. 142: 1297) y en libros de texto conocidos de la
genética y la biología molecular, tales como p.ej. el libro de
texto de Knippers ("Molekulare Genetik" [Genética molecular],
8ª edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 2001) o el
de Winnacker ("Gene und Klone" [Genes y clones], sociedad
editorial VCH, Weinheim, Alemania, 1990).
Unas mutaciones, que conducen a una modificación
de las propiedades catalíticas de proteínas enzimáticas, en
particular a una especificidad modificada para substratos, se
conocen a partir del estado de la técnica. Como ejemplos se han de
mencionar los trabajos de Yano y colaboradores, 1998 Proc Natl Acad
Sci U S A. 95:5511-5, Oue S. y colaboradores J Biol
Chem. 1999, 274:2344-9. y Onuffer y colaboradores,
Protein Sci. 1995 4:1750-7, en los cuales se
divulga la modificación de la especificidad de aspartato -
aminotransferasas. Como mutaciones entran en consideración
transiciones, transversiones, inserciones y deleciones así como
métodos de la evolución dirigida. Unas instrucciones para la
producción de tales mutaciones y proteínas pertenecen al estado de
la técnica y se pueden tomar de libros de texto conocidos (R.
Knippers "Molekulare Genetik", 8ª edición, 2001, editorial
Georg Thieme, Stuttgart, Alemania), o artículos de compendio (N.
Pokala 2001, J. Struct. Biol. 134:269-81; A.
Tramontano 2004, Angew. Chem. Edición internacional en inglés
43:3222-3; N. V. Dokholyan 2004, Proteins.
54:622-8; J. Pei 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.
100:11361-6; H. Lilie 2003, EMBO Rep.
4:346-51; R. Jaenicke Angew. Chem. Edición
internacional en inglés 42:140-2).
La expresión de los genes o de los genes mutados
se efectúa preferiblemente de acuerdo con métodos habituales para
el aumento del número de copias mediante incorporación en apropiados
plásmidos. Como plásmidos son apropiados los que se replican en
bacterias corineformes. Numerosos vectores plasmídicos conocidos,
tales como p.ej. el pZ1 (Menkel y colaboradores, Applied and
Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), el
pEKEx1 (Eikmanns y colaboradores, Gene 102:93-98
(1991)) o el pHS2-1 (Sonnen y colaboradores Gene
107:69-74 (1991)), se basan en los plásmidos
crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores plasmídicos, tales
como p.ej. los que se basan en el pCG4 (documento
US-A 4.489.160), o en el pNG2
(Serwold-Davis y colaboradores, FEMS Microbiology
Letters 66, 119-124 (1990)), o en el pAG1
(documento US-A 5.158.891), se pueden utilizar de
igual manera (O. Kirchner 2003, J. Biotechnol.
104:287-99). Asimismo se pueden usar vectores con
una expresión regulable, tales como por ejemplo el pEKEx2 (B.
Eikmanns, 1991 Gene 102:93-8; O. Kirchner 2003, J.
Biotechnol. 104:287-99). También se puede expresar
el gen mediante integración en el cromosoma en una copia simple (P.
Vasicova 1999, J. Bacteriol. 181:6188-91), o en una
copia múltiple (D. Reinscheid 1994 Appl. Environ Microbiol
60:126-132).
La transformación de la deseada cepa con el
vector destinado al aumento del número de copias se efectúa por
conjugación o electroporación de la deseada cepa de, por ejemplo,
C. glutamicum. El método de la conjugación se describe por
ejemplo en la cita de Schäfer y colaboradores (Applied and
Environmental Microbiology (1994) 60:756-759).
Métodos para la transformación se describen por ejemplo en la cita
de Tauch y colaboradores (FEMS Microbiological Letters
(1994)123:343-347).
De esta manera el gen de la transaminasa C o su
alelo se puede expresar y sobreexpresar en C. glutamicum.
Además, para la producción de
L-valina puede ser ventajoso, adicionalmente al
aumento de la actividad de la transaminasa C, reforzar, en
particular sobreexpresar, a uno o varios de los genes que se
seleccionan entre el conjunto formado por
- \bullet
- los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido - sintasa,
- \bullet
- el gen ilvD que codifica la isómero - reductasa,
- \bullet
- el gen ilvD que codifica la deshidratasa,
o bien reforzar o sobreexpresar alelos de estos
genes, en particular
- \bullet
- los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido - sintasa resistente a una retroacción,
con el fin de aumentar aun más la producción de
L-valina.
Además, para la producción de
L-valina puede ser ventajoso, adicionalmente al
aumento de la actividad de la transaminasa C, desactivar o reducir
en su expresión o mutar a uno o varios de los genes seleccionados
entre el conjunto formado por:
- \bullet
- los genes panBCD que codifican la síntesis de un pantotenato,
- \bullet
- los genes lipAB que codifican la síntesis de ácidos lipónicos,
- \bullet
- los genes aceE-, a-ceF, IpD que codifican la piruvato - deshidrogenasa,
- \bullet
- los genes que codifican la subunidad A de la ATP sintasa, la subunidad B de la ATP sintasa, la subunidad C de la ATP sintasa, la subunidad alfa de ATP sintasa, la subunidad gamma de la ATP sintasa, la subunidad de ATP sintasa, la subunidad épsilon de ATP sintasa, la subunidad delta de ATP sintasa,
con el fin de formar unos productos génicos
debilitados funcionalmente, para aumentar la producción de
L-valina.
Las bacterias corineformes producidas conforme
al invento se pueden cultivar de un modo continuo o discontinuo en
el procedimiento batch (cultivación por tandas) o en el
procedimiento fed batch (procedimiento de afluencia) o en el
procedimiento fed batch repeated (procedimiento de afluencia
repetida) con el fin de efectuar la producción de valina. Una
recopilación acerca de métodos conocidos de cultivación se describe
en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik [Técnica de bioprocesos 1, introducción en
la técnica de los bioprocesos (editorial Gustav Fischer, Stuttgart,
1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen [Biorreactores y disposiciones periféricas]
(editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo que se ha de utilizar, debe
de satisfacer de una manera apropiada las exigencias de los
respectivos microorganismos. Unas descripciones de medios de cultivo
para diferentes microorganismos están contenidas en el manual
"Manual of Methods for General Bacteriology" [Manual de métodos
para la bacteriología general] de la American Society for
Bacteriology (Washington D.C., EE.UU. 1981).
Como fuente de carbono se pueden utilizar
azúcares e hidratos de carbono tales como p.ej. glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidones y celulosas, agentes
y grasas, tales como p.ej. aceite de soja, aceite de girasol,
aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como p.ej.
ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales
como p.ej. glicerol y etanol y ácidos orgánicos tales como p.ej.
ácido acético.
Estas sustancias se pueden utilizar
individualmente o como una mezcla.
Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas,
un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta,
agua de maceración de maíz, harina de soja y urea, o compuestos
inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio,
fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio.
Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar
individualmente o como una mezcla.
Como fuente de fósforo se pueden utilizar el
dihidrógeno - fosfato de potasio, el hidrógeno - fosfato de
dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio.
El medio de cultivo debe de contener además unas
sales de metales, tales como p.ej. sulfato de magnesio o sulfato de
hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, se
pueden emplear fitohormonas esenciales, tales como aminoácidos y
vitaminas, adicionalmente a las sustancias arriba mencionadas.
Las mencionadas sustancias empleadas se pueden
aportar al cultivo en forma de una tanda única o se pueden
alimentar de una manera apropiada durante la cultivación.
Para el control del valor del pH del cultivo se
pueden emplear de un modo apropiado compuestos de carácter básico,
tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco, o
compuestos de carácter ácido, tales como ácido fosfórico o ácido
sulfúrico. Para la represión del desarrollo de espuma se pueden
emplear agentes antiespumantes tales como p.ej. ésteres
poliglicólicos de ácidos grasos. Para la conservación de la
estabilidad de plásmidos se pueden añadir al medio apropiadas
sustancias que actúan de un modo selectivo, p.ej. antibióticos. Con
el fin de mantener unas condiciones aerobias, se introducen en el
cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales
como p.ej. aire. La temperatura del cultivo está situada normalmente
en 20ºC hasta 45ºC y de manera preferida en 25ºC hasta 40ºC. El
cultivo se prosigue durante tanto tiempo hasta que se haya formado
una cantidad máxima de L-valina. Esta meta se
alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas hasta 160
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Con ayuda de la reacción de PCR (reacción en
cadena de la polimerasa) se usó un fragmento de ADN, que contiene
el gen de la transaminasa C. Se usaron los siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores indicados fueron sintetizados por
MWG Biotech, y la reacción de PCR se llevó a cabo de modo
correspondiente a protocolos clásicos (Innis y colaboradores, PCR
Protocols. A guide to Methods and Applications [Protocolos de PCR.
Una guía de métodos y aplicaciones]. 1990. Academic Press). Con los
cebadores se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,1
kb (kilobases), que codifica la transaminasa C. Los cebadores
contienen adicionalmente los sitios de corte con la enzima de
restricción BsaI, que se indican entre paréntesis en las anteriores
secuencias de nucleótidos.
El fragmento de ADN amplificado, de
aproximadamente 1,1 kb, se identificó en un gel de agarosa al 0,8% y
se aisló a partir del gel con métodos existentes (QIAquik Gel
Extraction Kit, Quiagen, Hilden). La ligación del fragmento se
efectuó con el estuche SureCloning Kit (de Amersham, Reino Unido) en
el vector de expresión pASK-IBA-3C
(IBA, Göttingen). Con la tanda de ligación se transformó la E.
coli DH5 (Grant y colaboradores, 1990. Proceedings of the
National of Sciences of the United States of America USA,
87:4645-4649). La selección de cepas que contienen
el plásmido se efectuó por siembra en placas de la tanda de
transformación sobre placas de LB que contenían 25 mg por litro de
cloranfenicol.
Después de un aislamiento de los plásmidos, se
caracterizaron los plásmidos obtenidos mediante una digestión por
restricción y un análisis por electroforesis en gel. El plásmido
obtenido se designó como
pASK-IBA-3Corf2841. Éste se indica
en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La E. coli DH5 con
pASK-IBA-3Corf2841 se cultivó a 30ºC
en 100 ml del medio LB con 25 mg por litro de cloranfenicol hasta
llegar a una densidad óptica de 0,5. Luego se añadieron 0,01 ml de
una solución de anhidro-tetraciclina, que contenía
2 mg de anhidro-tetraciclina por mililitro de
dimetil-formamida. El cultivo se incubó
adicionalmente durante 3 horas a 30ºC. A continuación, las células
se cosecharon por centrifugación durante 12 minutos a 4ºC y 5.000
revoluciones por minuto. Después de esto, el sedimento celular se
volvió a suspender en un tampón de lavado (100 mM de
trihidroximetilaminometano), 1 mM de ácido
etilendiamina-tetraacético, de pH 8) y se
transfirió a un recipiente de reacción de Eppendorf. La disgregación
de las células se efectuó a 0ºC mediante un aparato desintegrador
por ultrasonidos (Branson Sonifier W-250, Branson
Sonic Power Company, Danbury, EE.UU; duración del tratamiento con
ultrasonidos 10 min, longitud de los impulsos 20%, intensidad del
tratamiento con ultrasonidos 2). Después del tratamiento con
ultrasonidos, los desechos celulares se separaron mediante
centrifugación (30 min, 13.000 rpm (revoluciones por minuto), 4ºC) y
el extracto bruto se obtuvo como material sobrenadante.
Para el aislamiento de la proteína, unas
columnas de afinidad StrepTactin del fabricante IBA (IBA, Göttingen,
Alemania) se rellenaron con volumen de lecho de 1 ml de
StrepTactin-Sepharose. Después de un equilibrado de
las columnas con un tampón de lavado del fabricante IBA, se añadió a
la Sepharose 1 ml del extracto bruto. Después del paso del extracto
a su través, la columna de afinidad se lavó cinco veces con 1 ml de
un tampón de lavado. La elución de la proteína transaminasa C se
llevó a cabo con un tampón de elución, que se componía de 100 mM de
Tris, 1 mM de EDTA, 2,5 mM de destiobiotina, de pH 8. Las fracciones
de elución se distribuyeron en partes alícuotas, se congelaron a
-20ºC, y se emplearon directamente en el ensayo enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La tanda de reacción del ensayo enzimático
contenía en un volumen total de 1 ml: 0,2 ml de Tris/HCl 0,25 M, de
pH 8, 0,005 ml de la proteína transaminasa C, y 0,1 ml de fosfato de
piridoxal 2,5 mM, así como 0,1 ml de un
ceto-isocaproato 40 mM y 0,1 ml de
L-alanina 0,5 M, o 0,1 ml de un
ceto-isovalerato 40 mM y 0,1 ml de
L-alanina 0,5 M, o 0,1 ml de un
ceto-valerato de metilo 40 mM y 0,1 ml de
L-alanina 0,5 M, o 0,1 ml de un
ceto-isocaproato 40 mM y 0,1 ml de
L-glutamina 0,5 M, o 0,1 ml de
ceto-isocaproato 40 mM y 0,1 ml de
L-alanina 0,5 M sin la proteína transaminasa C. El
ensayo enzimático se llevó a cabo a 30ºC en un aparato termociclador
Thermocycler 5436 de la entidad Eppendorf (Hamburgo). La reacción
se inició por adición de la proteína. Por adición de 30 \mul de
un reactivo de detención (6,7% (v/v = volumen/volumen) de ácido
perclórico (al 70 %), 40% (v/v) de etanol (al 95%) en agua) en cada
caso a 50 \mul de la tanda de ensayo, se detuvo el ensayo
enzimático. Con el fin de preparar a las muestras para la detección
de los aminoácidos formados a través de una HPLC (cromatografía de
fase líquida de alto rendimiento) de fase inversa, se añadieron 20
\mul de un tampón de neutralización (20 mM de Tris, 2,3 M de
carbonato de dipotasio, de pH 8). El precipitado que se depositaba
mediante la neutralización del ácido perclórico se separó por
centrifugación (a 13.000 rpm, durante 10 min) y el material
sobrenadante se empleó en diferentes diluciones para la
cuantificación mediante una HPLC. Ésta se efectuó después de una
derivatización automática con o-ftaldialdehído tal
como se ha descrito (en la cita de Hara y colaboradores 1985,
Analytica Chimica Acta 172:167-173). Tal como lo
muestra la Tabla 1, la proteína aislada cataliza la aminación,
dependiente de L-alanina, de un
ceto-isovalerato para formar
L-valina.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad específica (actividad spec.) se
indica en micromoles del producto por minuto y miligramo de la
proteína transaminasa C.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con ayuda de la reacción de PCR se amplificó un
fragmento de ADN, que contiene el gen de la transaminasa C. Se
usaron los siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores indicados fueron sintetizados por
MWG Biotech, y la reacción de PCR se llevó a cabo de modo
correspondiente a protocolos clásicos (Innis y colaboradores, PCR
Protocols. A guide to Methods and Applications [Protocolos de PCR.
Una guía de métodos y aplicaciones]. 1990. Academic Press). Con los
cebadores se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,1
kb que codifica la transaminasa C. Los cebadores contienen
adicionalmente los sitios de corte con la enzima de restricción
BamHI.
El fragmento de ADN amplificado, de
aproximadamente 1,1 Kb, se identificó en un gel de agarosa al 0,8% y
se aisló a partir del gel con métodos existentes (QIAquik Gel
Extraction Kit, Quiagen, Hilden). La ligación del fragmento se
efectúo con el estuche SureCloning Kit (Amersham, Reino Unido) en el
vector de expresión pEKEx2 (Eikmanns et al. 1991, Gene
102:93-8). Con la tanda de ligación se transformó la
E. coli DH5 (Grant y colaboradores, 1990. Proceedings of the
National of Sciences of the United States of America USA,
87:4645-4649). La selección de las cepas que
contenían el plásmido se efectuó por siembra en placas de la tanda
de transformación sobre placas de LB que contenían 25 mg por litro
de kanamicina.
Después del aislamiento de los plásmidos, los
plásmidos obtenidos se caracterizaron mediante digestión por
restricción y análisis por electroforesis en gel. El plásmido
obtenido fue designado como pEKEx2ATC.
El plásmido pEKEx2ATC así como el plásmido de
partida pEKEx2 se usaron para la transformación de la cepa
13032DpanBC a una resistencia a kanamicina. La cepa se describe en
el documento EP1155139B1, y la técnica de transformación se
describe en el cita de Kirchner y colaboradores, J Biotechnol. 2003,
104:287-99.
\newpage
Ejemplo
5
La cepa 13032\DeltapanBC pEKEx2ATC, así como
la cepa testigo 13032\DeltapanBC pEKEx2, se cultivaron a 30ºC en
el medio CGIII (Menkel y colaboradores, 1989, Appl. Environ.
Microbiol. 55:684-8). De esta manera el medio CGXII
se inoculó con una densidad óptica de 1. El medio CG12 contiene por
litro: 20 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 5 g de urea, 1 g de
KH_{2}PO_{4}, 1 g de K_{2}HPO_{4}, 0,25 g de
Mg_{2}O_{4}*7 H_{2}O, 42 g de ácido
3-morfolino-propano-sulfónico,
10 mg de CaCl_{2}, 10 mg de FeSO_{4}*7 H_{2}O, 10 mg de
MnSO_{4}*H_{2}O, 1 mg de ZnSO_{4}*7 H_{2}O, 0,2 mg de
CuSO_{4}, 0,02 mg de NiCl_{2}*6 H_{2}O, 0,2 mg de biotina, 40
g de glucosa y 0,03 mg de ácido protocatéquico. El cultivo se incubó
a 30ºC und 170 revoluciones por minuto, y después de 48 horas se
determinó la acumulación de L-valina en el medio
mediante una HPLC. Esta se efectuó con
o-ftaldialdehído tal como se ha descrito (en la cita
de Hara y colaboradores, 1985, Analytica Chimica Acta
172:167-173). Las concentraciones determinadas de
L-valina se muestran en la Tabla 2.
Claims (29)
1. Procedimiento para la producción por
fermentación de L-valina,
caracterizado porque
en una bacteria corineforme se aumenta la
actividad de la transaminasa C.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1,
caracterizado porque
el refuerzo de la actividad de gen de la
transaminasa C se efectúa por aumento de la expresión de genes.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2,
caracterizado porque
el aumento de la expresión de genes se efectúa
mediante introducción de un promotor más fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3,
caracterizado porque
para el aumento de la expresión de un gen se
emplea un promotor tac o un promotor inducible por IPTG.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 4,
caracterizado porque
el refuerzo de la actividad de la transaminasa
se efectúa por aumento del número de copias de los genes que
codifican la transaminasa C y/o de sus alelos.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5,
caracterizado porque
el aumento del número de copias de los genes se
efectúa mediante incorporación de unos vectores, que contienen por
lo menos un gen de la transaminasa C y/o un alelo de éste.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6,
caracterizado porque
como vector se emplea un plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7,
caracterizado porque
como plásmido se emplea por lo menos un
componente del conjunto que se compone de pZ1, pEKEx1,
pHS2-1, pHM1519, pBL1, pGA1, pCG4, pNG2, pAG1 y
pEKEx2.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 5 a 8,
caracterizado porque
el aumento del número de copias de los genes se
efectúa por incorporación de genes que codifican la transaminasa C
y/o sus alelos en el genoma cromosomal.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 9,
caracterizado porque
el refuerzo de la expresión de los genes se
efectúa por modificación de las estructuras de señales.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10,
caracterizado porque
la modificación de las estructuras de señales se
efectúa mediante por lo menos un componente del conjunto de las
siguientes medidas técnicas:
- modificación de los genes represores;
- modificación de los genes activadores;
- modificación de los operadores,
- modificación de los promotores,
- modificación de los atenuadores,
- modificación de los sitios de fijación a
ribosomas,
- modificación del codón inicial,
- modificación de los terminadores.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 11,
caracterizado porque
se aumenta la estabilidad del ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12,
caracterizado porque
la estabilidad del ARNm se establece mediante
modificación del extremo 5' o del extremo 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 13,
caracterizado porque
se emplea un microorganismo, que en su forma
salvaje ya presenta una producción de valina.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 14,
caracterizado porque
como microorganismo se emplea una
Corynebacterium (corinebacteria).
\vskip1.000000\baselineskip
16. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15,
caracterizado porque
se emplea por lo menos un componente del
conjunto formado por Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium
acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium
flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium
divaricatum.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16,
caracterizado porque
se emplea por lo menos un componente del
conjunto de los siguientes microorganismos
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 17,
caracterizado porque
se emplea un microorganismo en el que se
refuerza en su actividad por lo menos un componente de los
siguientes genes
- -
- los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido sintasa,
- -
- el gen ilvC que codifica la isómero reductasa,
- -
- el gen ilvD que codifica la deshidratasa,
- -
- los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido sintasa resistente a la retroacción.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 18,
caracterizado porque se desactivan en su
actividad o se reducen en su expresión
- -
- los genes panBCD que codifican la síntesis de un pantotenato,
- -
- los genes lipAB que codifican la síntesis de ácidos lipónicos,
- -
- los genes aceE, aceF, IpD que codifican la piruvato deshidrogenasa,
- -
- los genes que codifican la subunidad A de ATP sintasa, la subunidad B de ATP sintasa, la subunidad C de ATP sintasa, la subunidad alfa de ATP sintasa, la subunidad gamma de ATP sintasa, la subunidad de ATP sintasa, la subunidad épsilon de ATP sintasa, la subunidad delta de ATP sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Bacteria corineforme productora de
L-valina,
caracterizada porque
se refuerza en su actividad de transaminasa C
con relación a su forma salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 20,
caracterizado porque
se ha aumentado el número de copias de los genes
de la transaminasa C y/o de los alelos de éstos.
\newpage
22. Microorganismo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 20 o 21,
caracterizado porque
posee un promotor lac para la expresión de un
gen de la transaminasa C o de sus alelos.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Microorganismo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 20 a 22,
caracterizado porque
dispone de un número aumentado de copias de los
genes endógenos.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Microorganismo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 20 a 23,
caracterizado porque
ha sido transformado con unos vectores, que
contienen por lo menos un gen de la transaminasa C y/o sus
alelos.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Microorganismo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 20 a 23,
caracterizado porque
se modifica por lo menos un componente del
conjunto de las siguientes estructuras de señales, que son
responsables de la regulación de la expresión de la transaminasa
C;
- genes represores,
- genes activadores,
- operadores,
- promotores,
- atenuadores,
- sitios de fijación a ribosomas,
- codones de partida,
- terminadores.
\vskip1.000000\baselineskip
26. Microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 25,
caracterizado porque
es por lo menos un componente del conjunto que
se compone de:
Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium
acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium
flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium
divaricatum.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 25 o 26,
caracterizado porque
es por lo menos un componente del conjunto que
se compone de:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-_1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
\vskip1.000000\baselineskip
28. Microorganismo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 20 a 28,
caracterizado porque
se refuerza en su actividad por lo menos un
componente del conjunto de los siguientes genes:
- -
- los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido sintasa
- -
- el gen ilvC que codifica la isómero reductasa
- -
- el gen ilvD que codifica la deshidratasa
- -
- los genes ilvBN que codifican la acetohidroxiácido sintasa resistente a la retroacción.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Microorganismo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 20 a 28,
caracterizado porque
se desactiva en su actividad o se reduce en su
expresión por lo menos un componente del conjunto de los siguientes
genes:
- -
- los genes panBCD que codifican la síntesis de un pantotenato
- -
- los genes lipAB que codifican la síntesis de ácidos lipónicos
- -
- los genes aceE, aceF, IpD que codifican la piruvato deshidrogenasa l
- -
- los genes que codifican la subunidad A de ATP sintasa, la subunidad B de ATP sintasa, la subunidad C de ATP sintasa, la subunidad alfa de ATP sintasa, la subunidad gamma de ATP sintasa, la subunidad de ATP sintasa, la subunidad épsilon de ATP sintasa, la subunidad delta de ATP sintasa.
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