ES2323364T3

ES2323364T3 - Preparacion de complejos m(co)3 con tecnicas de fase solida mediante corte metalico desde el soporte solido.

Info

Publication number: ES2323364T3
Application number: ES03749396T
Authority: ES
Inventors: Roger Alberto; Stefan Mundwiler
Original assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Current assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Priority date: 2002-09-03
Filing date: 2003-09-02
Publication date: 2009-07-14
Anticipated expiration: 2023-09-02
Also published as: CN1703249A; WO2004022105A3; AU2003268431B2; AU2003268431A1; CA2497548A1; WO2004022105A2; NO20051573L; EP1536844A2; ATE424222T1; US20060165594A1; CN100366297C; PL375530A1; JP2006514612A; KR20050086412A; DE60326465D1; EP1536844B1

Abstract

Procedimiento para generar un agente acomplejado metálico, que comprende: poner en contacto un conjugado orgánico unido a fase sólida, representado por la fórmula (I) con [M(H2O)3 (CO)3] n+ , **(Ver fórmula)** en la que: la esfera es un soporte de fase sólida, C es un grupo metileno R4 y R5 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consta de H, sustituyentes alifáticos, sustituyentes aromáticos, RO, RS y (R)2N, en los que R es un grupo alifático o arílico, L es un línker o un enlace sencillo, y cada uno de R1 y R2 es independientemente un grupo coordinante metálico, un grupo orgánico no coordinante, un grupo coordinante metálico derivatizado con una molécula biológicamente activa, o un grupo orgánico no coordinante derivatizado con una molécula biológicamente activa. en la que M se selecciona de entre el grupo que consta de tecnecio (Tc), renio (Re), rodio (Rh), platino (Pt), iridio (Ir), rutenio (Ru) y cobre (Cu), y n es 1, 2 ó 3.

Description

Preparación de complejos M(CO)_{3} con técnicas de fase sólida mediante corte metálico desde el soporte sólido.

La invención se refiere al campo de los radiofarmacéuticos. En particular la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un agente acomplejado metálico mediante corte metálico de un soporte sólido.

En un aspecto adicional la invención se refiere a nuevos conjugados de un ligando y una biomolécula unidos a una fase sólida.

En todavía un aspecto adicional la invención se refiere a nuevos conjugados de ligando-biomolécula acomplejados con metal, a composiciones que comprenden estos nuevos complejos y a la utilización de los mismos.

En todavía un aspecto adicional la invención se refiere a un kit para la preparación de una composición farmacéutica diagnóstica o terapéutica.

Para la aplicación de moléculas bioactivas marcadas radioactivamente, tales como péptidos en el diagnóstico o la terapia clínicas rutinarias, resulta altamente deseable que únicamente se inyecten compuestos marcados para evitar la saturación de los receptores correspondientes in vivo o los efectos secundarios tóxicos de compuestos no marcados, "fríos". Además, la unión de grandes cantidades de biomoléculas no marcadas a los receptores elimina la posibilidad de obtener imágenes claras (escintigramas) y, de esta manera, con frecuencia imposibilita un diagnóstico claro.

Según el estado de la técnica, sólo puede conseguirse una elevada actividad específica en un procedimiento de marcaje homogéneo normal mediante la utilización de la cantidad (concentración) mínima posible de biomoléculas derivatizadas (o de ligando para ^{99m}Tc acoplado a la biomolécula) que todavía resulte en el marcaje cuantitativo. Dependiendo del ligando y del precursor del complejo, estas cantidades con frecuencia deben ser relativamente elevadas debido a que, a concentraciones bajas, la tasa de acomplejamiento está gobernada por una cinética de segundo orden y, de esta manera, el marcaje resulta excesivamente lento y se ve acompañado por la descomposición del ligando o del precursor ^{99m}Tc. El límite inferior de concentración con frecuencia no resulta conveniente para la utilización rutinaria, debido a que ligeras modificaciones de las condiciones (temperatura, tiempo) a esta concentración no acaban con un rendimiento de marcaje cuantitativo. En consecuencia, los productos secundarios y de descomposición, así como los materiales de partida, todavía se encuentran presentes en la solución final.

Un modo conveniente de separar físicamente compuesto "frío" de "caliente" es mediante la unión del conjugado de ligando-biomolécula a un material de fase sólida y la separación mediante corte del mismo concomitantemente a la formación de complejo. Los ejemplos de dicha separación de fases sólidas mediante corte metálico son raros.

La patente estadounidense nº US 5.789.555 (Pollack et al) describe un procedimiento para marcar péptidos con tecnecio-99m, renio-186 o renio-188. El procedimiento que comprende las etapas de acoplamiento covalente de los péptidos a un soporte sólido mediante un enlace tioéter con un línker maleimida. Mediante la introducción de pertecnetato al soporte, se forma un complejo ^{99m}Tc^{V}(=O)-péptido. Tras la formación de complejo, ^{99m}Tc^{V}(=O) cataliza el corte del péptido del soporte mediante la rotura del enlace C-S, liberando de esta manera el complejo ^{99m}TcV(=O)-péptido del soporte.

Es conocido de la literatura que los tioles protegidos liberan el grupo protector mediante coordinación con un centro de Tc=O. Basándose en estos resultados, Pollak et al (J. Am. Chem. Soc. 121:11593-11594, 1999) unieron un quelante tetradentado mediante un enlace tioéter a una superficie de oro. Tras la coordinación de Tc(V) a este ligando, se liberó selectivamente el complejo ^{99m}Tc en la solución mediante la rotura del enlace S-Au a medida que el azufre se coordinaba con el Tc.

Más recientemente, Dunn-Dufault et al (Nucl. Med. Biol. 27:803-807, 2000) han descrito una variante de dicho procedimiento mediante la unión covalente del quelante a un soporte polimérico orgánico.

Los procedimientos anteriormente indicados para producir complejos orgánicos marcados con Tc y Re dependen todos del corte de un enlace C-S o Au-S. Este enlace C-S y Au-S, con el que el ligando se une covalentemente al soporte sólido, es sensible a la oxidación. Por lo tanto, resulta necesario almacenar soportes sólidos que comprendan ligandos unidos covalentemente mediante un enlace C-S bajo condiciones reductoras. Esto resulta especialmente cierto para el almacenamiento de largo plazo. La necesidad de almacenamiento bajo condiciones reductoras requiere medidas adicionales que deben adoptarse durante el almacenamiento. Además, si los soportes deben utilizarse para la generación de compuestos adecuados para aplicaciones farmacéuticas, la presencia de agentes reductores resulta altamente no deseable desde el punto de vista de la seguridad farmacéutica. Por lo tanto, existirán determinadas restricciones a la utilización de los ligandos unidos a sólido conocidos en dicha aplicación.

Además, la utilización de estas especies de óxido metálico se ve acompañada por restricciones a los ligandos que se encuentran disponibles para la utilización con los mismos, es decir, los tetradentados. Por lo tanto, únicamente se da a conocer en la técnica anterior ligandos peptídicos para la utilización con un centro ^{99m}Tc^{V}(=O).

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Schibli et al (Bioconjugate Chem. 11:3445, 2000) describen la síntesis en solución de varios complejos multidentados utilizando [^{99m}Tc(OH_{2})_{3}(CO_{3})]^{+}. Schibli et al (Bioconjugate Chem. 13:750, 2002) describen la síntesis en fase solución de complejos multidentados utilizando [^{188}Re(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+}. Seifert et al (Inorg. Chim. Acta 322:79, 2001) dan a conocer la síntesis en fase solución de complejos carbonilo de Tc(I) tioéter y la reacción de intercambio de ligando en fase solución de los mismos con histidina. La Bella et al (Bioconjugate Chem. 13:599, 2002) describen la preparación de un análogo bombesina que se marca, en solución, utilizando [^{99m}Tc(OH_{2})_{3}(CO)_{3}]^{+}. Jang et al (J. Korean Nucl. Soc. 34:146, 2002) describen el marcaje radioactivo de varias biomoléculas, en solución, utilizando [^{99m}Tc(OH_{2})_{3}
(CO)_{3}]^{+}. Langer et al (Bioconjugate Chem. 12:1028, 2001) han dado a conocer un enfoque similar en la preparación, en solución, de derivados marcados radioactivamente de neuropéptido Y. La síntesis de complejos tricarbonilo de renio en solución utilizando el precursor (NEt_{4})_{2}[ReBr_{3}(CO)_{3}] ha sido descrita por Correia et al (Inorg. Chem. 40:5147, 2001). Los derivados sacáridos marcados preparados en solución utilizando [M(H_{2}O)_{3(}CO)_{3}]^{+} (M=Tc,Re) han sido descritos por Petrig et al (Chem. Eur. J. 7:1868, 2001). La preparación de complejos de renio con ligandos tridentados que contienen fósforo utilizando Re(CO)_{5}Br en solución ha sido descrita por Faller et al (J. Organometallic Chem. 626:181, 2001). La reacción en fase solución de [^{99m}Tc(OH_{2})_{3}(CO)_{3}]^{+} con un ligando tridentado bifuncional también ha sido dada a conocer por Alberto et al (J. Am. Chem. Soc. 120:7987, 1998). Las síntesis en fase solución de una serie de complejos que contienen Re(CO)_{3} diimina han sido descrita por Stor et al (Organometallics 14:1115, 1995). Las síntesis en fase solución de complejos que contienen Tc(CO)_{3} también han sido dadas a conocer por Alberto et al (Radiochimica Acta 63:153, 1993). La preparación en fase solución de complejos utilizando un precursor basado en Ru(CO)_{3} ha sido dada a conocer por van Wijnkoop et al (Organometallics 11:3607, 1992).

La patente WO nº 01/00637 da a conocer las síntesis en fase solución de varios complejos de metal de transición del grupo (VII) utilizando el precursor [M(CO)_{3}(OH)_{2}]_{3}]^{+}, conjuntamente con un kit para llevar a cabo las síntesis. Se da a conocer una materia similar en la patente WO nº 01/89586. Los complejos de Tc(CO)_{3} y de Re(CO)_{3}, preparados a partir de solución, también se dan a conocer en la patente EP nº 1013642.

La derivatización en fase sólida de una biomolécula ha sido descrita en Kheyong et al (Tetrahedron Lett. 38:973, 1997). Sin embargo, el corte de la biomolécula para separarla del soporte sólido no implica un metal y es una etapa no específica que meramente requiere la presencia de ácido.

De esta manera, existe una necesidad de nuevos procedimientos para preparar complejos marcados metálicos mediante técnicas en fase sólida por medio de corte metálico para la separación respecto al soporte sólido, que utilicen conjugados de biomolécula-ligando unidos a la fase sólida, que resulten más estables bajo condiciones farmacéuticamente aceptables que los conjugados de la técnica anterior.

Además, la disponibilidad de más ligandos que puedan utilizarse en la formación de conjugados de ligando-biomolécula acomplejados con un metal por medio de técnicas de fase sólida por medio de corte metálico resultará ventajoso debido a que proporcionará un uso más flexible de esta técnica. El objetivo de la presente invención es proporcionar técnicas mejoradas para la preparación de compuestos diagnósticos y terapéuticos marcados.

En la investigación que ha conducido a la presente invención, se encontró que algunas moléculas orgánicas (ligandos) que son capaces de coordinarse con un metal y se encuentran unidos a un soporte sólido mediante un grupo amino terciario, en presencia de [Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} se cortan y separan del soporte sólido al formarse complejos [Tc(CO)_{3}-Ligando]. El corte hidrolítico selectivo del enlace C-N se encuentra claramente mediado por el centro carbonilo [Tc(H_{2}O)(CO)_{3}]^{+} de valencia baja, formado durante la formación del complejo, y no se produce bajo las mismas condiciones de reacción en ausencia de [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+}. Tras liberarse del soporte sólido, la amina terciaria anterior se encuentra presente en forma de amina secundaria coordinada.

El mecanismo para este complejo [Tc(CO)_{3}-Ligando] se propone que es el siguiente. A medida que el grupo amino terciario del quelante unido a la fase sólida (el denominado "ligando") se coordina con el centro metálico catiónico de [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+}, se vuelve parcialmente positivo y el átomo de carbono contiguo resulta, por lo tanto, activado para el ataque nucleofílico. Un grupo hidroxi remanente ataca el grupo metileno del quelante e induce el corte del enlace C-N (figura 2).El tercer sitio donante del quelante se coordina con el centro metálico, y el complejo producto se libera en la solución. El quelante no acomplejado y el complejo no cortado siguen unidos a la fase sólida.

Se ha descubierto que los compuestos marcados obtenidos mediante corte hidrolítico del ligando respecto del soporte sólido con [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} tal como se ha descrito anteriormente presentaban una actividad específica muy elevada, es decir, había muy poco ligando no acomplejado en solución. La cantidad de ligando no acomplejado en solución era del orden de 10^{-7} M. Por lo tanto, resulta atractiva la explotación de esta reacción de corte específico para la preparación de complejos denominados "sin adición de portador" (s.a.p.) de tecnecio y de otros metales que presenten una reactividad química similar.

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De esta manera, la invención se refiere a un nuevo procedimiento para generar un agente acomplejado con metal, que comprende poner en contacto (I) un conjugado orgánico unido a fase sólida, representado por la fórmula siguiente:

1

en la que:

\quad: la esfera es la fase sólida,

\quad: C es un grupo metileno; R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente de entre el grupo que consta de H, sustituyentes alifáticos o aromáticos, RO, RS y R_{2}N, en los que R es un grupo alifático o arílico;

\quad: L es un línker o un enlace simple, acoplándose el línker, en caso de hallarse presente, al soporte sólido, y presentando actividades de activación del ataque nucleofílico del grupo C; y

\quad: R_{1} y R_{2} son iguales o diferentes y son un grupo coordinante de metal o un grupo orgánico no coordinante,

\quad: un grupo coordinante de metal derivatizado con una molécula biológicamente activa, o un grupo orgánico no coordinante derivatizado con una molécula biológicamente activa,

\quad: con (II) [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+},

en la que M se selecciona de entre el grupo que consta de tecnecio (Tc), renio (Re), rodio (Rh), rutenio (Ru), platino (Pt), iridio (Ir) y cobre (Cu y n es 1, 2 ó 3, dependiendo del metal; bajo condiciones adecuadas para causar la formación de un enlace coordinado entre [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+} y el átomo de nitrógeno de amina terciaria del soporte sólido unido a conjugado orgánico, liberando de esta manera el agente acomplejado metálico formado de esta manera a partir del soporte.

El línker puede encontrarse presente o no. Puede encontrarse ya presente en el soporte sólido disponible o puede introducirse después. En el caso de que ya se encuentre presente, preferentemente es un grupo activador bueno para el ataque nucleofílico en C y se selecciona de entre el grupo que consta de fenilo, vinilo, arilo y otros grupos no alifáticos o alifáticos. El grupo fenilo, vinilo, arilo, otro grupo no alifático o alifático puede encontrarse sustituido, y en caso de encontrarse sustituido, preferentemente se encuentra sustituido con un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre OR, R, NR_{2}, en los que R es un grupo alifático o arílico.

En una realización preferente, el línker es tal como se muestra en la fórmula II:

2

en la que X_{1} es O y cada X_{2} es H o un sustituyente aceptor de electrones, con la condición de que por lo menos un grupo X_{2} sea un sustituyente aceptor de electrones, y preferentemente un grupo -OCH_{3}.

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En el caso de que R_{1} y R_{2}, o uno de entre R_{1} y R_{2}, sean grupos orgánicos no coordinantes, pueden seleccionarse de entre alquilo, fenilo o bencilo o derivados de los mismos.

Preferentemente R_{1} y/o R_{2} se seleccionan de entre el grupo que consta de:

3

en los que R_{3} es una cadena alifática que contiene entre 1 y 3 carbonos.

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El metal M se selecciona de entre el grupo que consta de Tc, Re, Ru, Rh, Ir, Cu y Pt. El metal más preferentemente esTc, ^{186}Re o ^{188}Re.

Preferentemente el metal resulta adecuado para la utilización como agente de obtención de imágenes, por ejemplo mediante transmisión de partículas de alta energía o características paramagnéticas, o como radionucleido.

Puede generarse [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+} mediante cualquier medio adecuado conocido de la técnica. Los medios adecuados para generar [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+} proceden, por ejemplo, de la forma permetalato, tal como se da a conocer en Alberto et al (J. Am. Chem. Soc. 123:3135-3136, 2001) o en la patente WO nº 98/48848 (Alberto et al).

La molécula según la fórmula I sin el soporte sólido se denomina en la presente invención "ligando". El ligando puede ser, en particular, un ligando tridentado si R_{1} y R_{2} se selecciona de entre el grupo que consta de:

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aunque también un quelante bidentado si R_{1} y R_{2}, o uno de ellos, son un grupo no coordinante alifático o aromático.

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Los ligandos utilizados según la invención en combinación con [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+} pueden ser una diversidad de ligandos tridentados, siendo el requisito principal la presencia de un grupo amina terciario como parte central del ligando, que forma el enlace C-N que se acopla con el soporte sólido y se corta al formarse el complejo. Preferentemente los ligandos utilizados son aquellos basados en aminas alifáticas o aromáticas o carboxilatos y combinaciones de los mismos como donantes. El ligando también puede ser un quelante bidentado si R_{1} y R_{2}, pero no ambos, son un grupo no coordinante alifático o aromático. Ello se muestra en el Ejemplo 10.

En particular, puede utilizarse dietilentriamina, ácido picolilamina-N-acético, N-(2-aminoetil)-glicina o ácido imino-diacético como ligandos en la invención.

El ligando puede unirse covalentemente al soporte sólido en primer lugar formando una resina halogenada, por ejemplo mediante los procedimientos descritos por Ngu y Patel (Tet. Lett. 38:973-976, 1997). Esta resina halogenada posteriormente puede hacerse reaccionar con un ligando protegido. Tras la desprotección, se obtiene la resina unida al ligando. Si el ligando se une a la fase sólida mediante este procedimiento, el enlace covalente que lo une al soporte sólido será un enlace C-N. El ligando también puede sintetizarse sobre el soporte sólido partiendo de una resina amino, por ejemplo mediante aminación y/o alquilación reductora con haluros de alquilo, tal como se describe en los Ejemplos 5, 6, 8 y 9. La preparación de una resina cargada se comenta en más detalle en los Ejemplos 1 a 9.

En la presente memoria, el término "ligando" se refiere a un compuesto que comprende por lo menos un átomo coordinante de metal capaz de formar un enlace coordinante con un metal para formar un complejo metal-ligando estable. Un ligando que comprende más de un átomo coordinante de metal puede denominarse quelante o ligando multidentado. Los ligandos bidentados son ligandos con dos átomos coordinantes de metal, los ligandos tridentados son ligandos con tres átomos coordinantes de metal y los ligandos tetradentados son ligandos con cuatro átomos coordinantes de metal.

La molécula biológicamente activa (también denominada en la presente memoria "biomolécula") que puede acoplarse al ligando puede ser cualquier molécula que resulte activa en el diagnóstico o la terapia. La molécula puede acoplarse en cualquier posición excepto en el nitrógeno unido al soporte sólido. Puede ser una molécula de referencia para dirigir el producto radioactivo al sitio que necesita ser diagnosticado o tratado, o puede presentar una actividad terapéutica que es independiente del marcaje radioactivo. La molécula biológicamente activa puede seleccionarse de entre el grupo que consta de aminoácidos, esteroides, proteínas, en particular proteínas estructurales, enzimas o anticuerpos, carbohidratos, polisacáridos y oligosacáridos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos y polinucleótidos, lípidos, péptidos y moléculas pequeñas farmacéuticamente activas, tales como los compuestos ligantes de receptor del sistema nervioso central.

La biomolécula puede unirse al ligando por cualquier medio adecuado conocido de la técnica, por ejemplo mediante aminación reductora de un aldehído a grupo de amina primaria del ligando, o mediante la introducción de un sitio de unión en el sistema arílico. La biomolécula puede unirse al ligando antes o después de la unión del ligando al soporte sólido.

Se ha encontrado que la elección del soporte sólido podría mejorar adicionalmente la eficiencia del procedimiento de la invención. El soporte sólido debe ser capaz de hincharse en agua, debe ser estable bajo las condiciones de reacción y no debe contener unidades coordinantes de metal. Éste es el caso en particular de que el soporte sólido sea una resina de polietilenglicol, o un híbrido de polietilenglicol y poliestireno, por ejemplo una resina de poliestireno con espaciadores de polietilenglicol con un grupo de anclaje de alcohol bencílico.

El procedimiento de la invención puede comprender además la etapa de recoger el agente acomplejado con metal (es decir, el radiofarmacéutico) para la utilización posterior.

Tras la preparación del radiofarmacéutico de ^{99m}Tc s.a.p., el polímero de fase sólida puede recogerse, lavarse y reutilizarse.

Preferentemente el procedimiento se lleva a cabo a un pH que se encuentra comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 6,0 y 11,0, preferentemente en el intervalo de entre 7,5 y 9,5.

Las temperaturas adecuadas para llevar a cabo la reacción se encuentran comprendidas dentro del intervalo de entre aproximadamente 40ºC y 100ºC. Preferentemente la reacción se lleva a cabo en el intervalo de entre aproximadamente 70ºC y 82ºC.

Según un aspecto adicional de la misma, la invención se refiere al conjugado orgánico unido a la fase sólida de fórmula I, y composiciones que comprenden dicho compuesto. Preferentemente estas composiciones se encuentran en una forma que puede almacenarse durante periodos de tiempo prolongados bajo condiciones farmacéuticamente aceptables.

Con el procedimiento según la invención, pueden obtenerse conjugados de ligando-biomolécula acomplejados con metal, con una elevada actividad específica mediante filtración sin purificación adicional posterior al marcaje.

Habitualmente los conjugados obtenibles con el procedimiento según la invención están comprendidos en una composición que es el resultado del procedimiento de la invención, y que se caracteriza porque se encuentra esencialmente libre de conjugado de ligando-biomolécula no acomplejado, por ejemplo el nivel de conjugado de ligando-biomolécula no acomplejado en la composición que contiene el conjugado es del orden de 10^{-7} M.

Debido a la corta vida media de algunos isótopos utilizados en los radiofarmacéuticos, por ejemplo ^{99m}Tc, el marcaje de los conjugados de ligando-biomolécula inmediatamente antes de la utilización de los mismos puede resultar importante para la actividad específica del conjugado acomplejado. La cantidad de complejo descompuesto en una composición recién marcada será inferior en comparación con la situación en la que el conjugado se había conjugado un intervalo de tiempo sustancialmente anterior a la utilización del mismo.

Por lo tanto, en todavía un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit para la preparación de una composición farmacéutica diagnóstica o terapéutica, que comprende un recipiente con la molécula de fórmula (I), en la que tiene lugar la reacción con una solución de [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+}. El recipiente puede ser un vaso o columna. La solución de [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+} se introduce en el vaso o columna para iniciar la reacción. La solución puede ser parte del kit o proporcionarse por otros medios. En una realización alternativa, los reactivos para la preparación del carbonilo metálico [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+} se encuentran comprendidos en el kit. Además, el kit puede comprender un dispositivo para la filtración.

La utilización de un kit además proporciona flexibilidad al complejo metálico que puede formarse, debido a que puede realizarse una selección de un metal adecuado inmediatamente antes de la reacción de acomplejamiento.

El principio de la preparación de compuestos acomplejados metálicos sin adición de portador (s.a.p.) según la invención se explica en la Figura 1. Se une un ligando tridentado, por ejemplo dietilentriamina, mediante un línker, en la presente invención un derivado bencilo, a una fase sólida mediante una amina terciaria. Se une al quelante (ligando) una biomolécula, formando de esta manera un conjugado de ligando-biomolécula. Tras la introducción de [Tc(H_{2}O)_{3}
(CO)_{3}]^{+}, se produce la formación del complejo y el ligando tridentado sustituye dos ligandos de agua. El ligando hidroxi restante en [Tc(H_{2}O)_{2}(OH)(CO)_{3}]^{+} ahora puede atacar el grupo metileno activado, induciendo el corte del enlace C-N. La activación del grupo metileno se produce mediante acomplejamiento del grupo amino terciario con el centro de tecnecio, que retira densidad electrónica del quelante y lo expone al ataque nucleofílico.

La especie principal con reactividad hacia el átomo de amina terciaria del conjugado de biomolécula-ligando unido a fase sólida es [M(OH)(H_{2}O)_{2}(CO)_{3}]. En solución, [M(OH)(H_{2}O)_{2}(CO)_{3}] se encuentra en equilibrio con el conjugado en la forma de [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+} y formas más disociadas, dependiendo del pH de la solución. Se entenderá que, dependiendo del pH, [M(OH)(H_{2}O)_{2}(CO)_{3}] es por lo menos parcialmente intercambiable con estas especies en virtud del equilibrio.

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La invención se explica adicionalmente a partir de los ejemplos no restrictivos siguientes. En los Ejemplos, se hace referencia a las figuras siguientes:

Figura 1: el principio de preparación de compuestos acomplejados metálicos sin adición de por- tador (s.a.p.) según la invención.

Figura 2: mecanismo de formación de complejo.

Figura 3: dependencia del pH de la reacción de corte.

Figura 4: dependencia de la temperatura del rendimiento de corte.

Figura 5: esquemas de reacción de los Ejemplos 1, 2, 3, 4 y 10.

Figura 6: esquemas de reacción de los Ejemplos 5, 6, 7, 8 y 9.

Figura 7: esquemas de reacción de los Ejemplos 11, 12 y 13.

Figura 8: fórmulas estructurales de los compuestos del Ejemplo 14 y de la Tabla 1.

Figura 9: fórmulas estructurales de los compuestos con moléculas biológicamente activas.

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Ejemplos Ejemplo 1

Se unió covalentemente un ligando modelo a una resina de fase sólida apropiada. La resina de fase sólida debe hincharse en agua para permitir la difusión de la especie Tc, y el grupo de anclaje al que se acopla el ligando debe ser un grupo activador para el ataque nucleofílico. La resina de poliestireno/polietilenglicol TentaGel S AC (Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Alemania) satisface dichos requisitos. Su sitio activo, un derivado de alcohol bencílico, se convirtió en el bromuro 1 correspondiente (Ngu y Patel, Tet. Lett. 38:973-976, 1997).

Se disolvió N,N'-bis(1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilidén)etil)dietilentriamina (2) (101,8 mg, 235,9 \mumoles) en DMF (5 ml), se añadió resina 1 (196,6 mg, 47,2 moles), y la mezcla se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 22 horas. Se filtró la mezcla de reacción y se lavó la resina con DMF (3 veces), DMF y metanol (3 veces, alternando) y DMF (5 veces). Se eliminaron los grupos protectores mediante lavado de la resina 10 veces con una solución de hidrato de hidrazina, 2% en DMF (1 ml) durante 5 minutos. Se filtró la mezcla de reacción y la resina se lavó con DMF (3 veces), DMF y metanol (5 veces, alternando), DMF (3 veces) y éter dietílico (3 veces). La resina se secó bajo alto vacío, proporcionando el producto 3 con un rendimiento de 192,3 mg (97,8%; capacidad: 0,236 mmoles/g, eficiencia de acoplamiento: 100%).

Se visualizaron los grupos amino libres en las resinas de fase sólida mediante ensayos de color: solución azul de bromofenol en agua para las resinas alcalinas y ácido trinitrotoluenosulfónico (TNBS) en DMF/diisopropiletilamina 10:1 exclusivamente para las aminas primarias. La resina 3 fue positiva en ambos ensayos, mientras que el intermediario protegido fue negativo en la tinción TNBS. La capacidad de las resinas (en mmoles de quelante ligado por gramo) y la eficiencia de acoplamiento de los quelantes a los soportes sólidos se calculó a partir del contenido de N de las resinas según determinación mediante análisis elementales.

Se verificó la capacidad quelante de la resina 3 mediante agitación de la misma en una solución 1 mM de [^{99}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} (7 equivalentes) a temperatura ambiente. El análisis de la solución filtrada mediante recuento \beta de centelleo líquido mostró una reducción de actividad de 14%, que es consistente con la formación cuantitativa de complejo sobre la resina. Los análisis de HPLC mostraron únicamente picos del material de partida, indicando que no se había producido corte de la fase sólida bajo estas condiciones suaves. El complejo de ^{99}Tc ya formado resultó ser estable bajo las condiciones utilizadas para el marcaje. Incluso el calentamiento prolongado a 80ºC durante 5 horas en tampón fosfato, pH 7,5, rindió únicamente 3% de actividad beta en la solución, por lo menos un orden de magnitud inferior al esperado.

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Ejemplo 2

Otro ligando tridentado, que rinde complejos no cargados, se unió a la misma resina que en el Ejemplo 1. Se disolvió etil éster de ácido N-picolilamina acético (54 mg, 280 \mumoles) en DMF (3 ml) y se añadió resina 1 (280 mg, 67 \mumoles). La mezcla se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 15 horas, la mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con DMF (3 veces), DMF y metanol (3 veces, alternando) y éter dietílico (3 veces). El intermediario protegido fue positivo en azul de bromofenol y negativo en tinción de TNBS. Se eliminaron los grupos protectores mediante agitación suave de la resina en una mezcla de agua (5 ml) e hidróxido sódico 1 M (0,30 ml) durante 28 horas. La filtración de la resina, el lavado con DMF (3 veces), DMF y metanol (3 veces, alternando), DMF (3 veces) y éter dietílico (3 veces) y el secado en alto vacío proporcionó el producto 4, con un rendimiento de 268 mg (96%; capacidad: 0,209 mmoles/g, eficiencia de acoplamiento: 87,1%). La resina 4 era negativa en todas las reacciones de tinción.

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Ejemplo 3

Otro ligando tridentado, que rinde complejos cargados negativamente, se unió a la misma resina que en el Ejemplo 1. Se disolvieron hidrocloruro de dimetilimino diacetato (6,4 mg, 33 \mumoles) y diisopropiletilamina (11,2 \mul, 66 \mumoles) en DMF (0,5 ml) y se añadió resina 1 (280 mg, 67 \mumoles). La mezcla se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 24 horas, la mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con DMF (3 veces), DMF y metanol (3 veces, alternando), metanol y agua (3 veces, alternando). El intermediario protegido fue positivo en azul de bromofenol y negativo en tinción de TNBS. Se eliminaron los grupos protectores mediante enjuague de la resina con NaOH acuoso (0,1 M durante 3 horas, después 0,01 M durante 12 horas). La filtración de la resina, el lavado con NaOH 0,1 M (2 veces), agua (5 veces), agua y metanol (3 veces, alternando), metanol (3 veces) y éter dietílico (3 veces) y secado en alto vacío proporcionó el producto 5, con un rendimiento de 35 mg (100%; capacidad: 4 mmoles/g, eficiencia de acoplamiento: 18%). La resina 5 era negativa en todas las reacciones de tinción.

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Ejemplo 4

Se unió otro ligando tridentado, que rendía complejos no cargados, a la misma resina que en el Ejemplo 1.

Se disolvió etil éster de ácido N5-tert-butiloxicarbonil)-5-amino-3-azapentano (74 mg, 280 \mumoles) en DMF (3 ml) y se añadió resina 1 (300 mg, 72 \mumoles). La mezcla se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 15 horas, se filtró la mezcla de reacción y la resina se lavó con DMF (3 veces), DMF y metanol (3 veces, alternando) y éter dietílico (3 veces). El intermediario protegido era positivo en azul de bromofenol y negativo en tinción TNBS. Se eliminó el grupo éster etílico mediante agitación suave de la resina en una mezcla de agua (5 ml) e hidróxido sódico 1 M (1,40 ml) durante 28 horas. La filtración de la resina, el lavado con DMF (3 veces), DMF y metanol (3 veces, alternando), DMF (3 veces) y éter dietílico (3 veces) y secado bajo alto vacío proporcionó el ácido protegido por Boc. Se eliminó el grupo Boc mediante agitación de la resina en una mezcla de TFA y DCM (1:1) durante 5 minutos, filtración y agitación de la resina en una mezcla de TFA y DCM (1:1) nuevamente, ahora durante 10 minutos. El lavado tal como se ha descrito anteriormente proporcionó el producto 6, con un rendimiento de 72 mg (96%, capacidad: 22 mmoles/g, eficiencia de acoplamiento: 94%). La resina 6 era positiva en la tinción TNBS.

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Ejemplo 5

La resina NovaSyn TG presenta un grupo de anclaje amino alifático. En el presente ejemplo, se describe la síntesis del quelante ácido picolilaminoacético sobre el soporte sólido.

Se agitaron resina NovaSyn TG (100 mg, 30 \mumoles) y piridina-2-carbaldehído (14,3 \mul, 150 \mumoles) en metanol (3 ml) a temperatura ambiente durante 20 horas. La mezcla de reacción se agitó y la resina se lavó con DMF (3 veces), y DMF y metanol (3 veces, alternando). Se añadió a la resina triacetoxi-borohidruro sódico (31,8 mg, 150 \mumoles) en DMF (2 ml). Tras agitar a temperatura ambiente durante 5 horas, la mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con DMF (4 veces) y metanol (3 veces). Se añadió NaHCO_{3} (al 10% en agua) a la resina. Tras 3 horas, se lavó la resina con DMF (3 veces), agua (3 veces), etanol (3 veces) y éter dietílico (3 veces) y se secó, proporcionando el intermediario aminopiridina, que era positivo en azul de bromofenol y ligeramente positivo en tinción TNBS.

Se añadió a la resina una mezcla de etil éster de ácido bromoacético (16,6 \mul, 150 \mumoles) y diisopropil etilamina (5,1 \mul, 30 \mumoles) en etanol (2,5 ml). Tras agitar a temperatura ambiente durante 24 horas, la mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con etanol (5 veces) y se secó. Se añadió NaOH (1 M) a la resina para eliminar el grupo protector etil éster. Tras un día de agitación a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con agua (5 veces), etanol (3 veces) y éter dietílico (2 veces) y se secó, proporcionando 8, con un rendimiento de 86,4 mg (83,7%; capacidad: 0,10 mmoles/g; eficiencia de acoplamiento: 43%).

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Ejemplo 6

Se hicieron reaccionar resina NovaSyn TG (100 mg, 30 \mumoles), bromoacetato de etilo (33,2 \mul, 300 \mumoles) y diisopropiletilamina (12,9 \mul, 75 \mumoles) tal como se describe en la segunda parte del Ejemplo 5, proporcionando 9, con un rendimiento de 96,2 mg (93%).

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Ejemplo 7

La resina NovaSyn TGT presenta un grupo de anclaje hidroxitritilo. El grupo hidroxi se convirtió en el cloruro tal como ha sido descrito (J.M.J. Frechert et al, Tetrahedron Lett. 1975, 3055).

Se disolvieron hidrocloruro de dimetiliminodiacetato (16,2 mg, 82 \mumoles) y diisopropiletilamina (21 \mul, 123 \mumoles) en DMF (2 ml). Se añadió resina Novasyn TGT clorada (41 \mumoles). La reacción de acoplamiento, así como las hidrólisis de ésteres, se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 3, con la excepción de que se añadió diisopropiletilamina (14 \mul, 82 \mumoles) tras un tiempo de reacción de 3 horas. Se obtuvo el producto 10, con un rendimiento de 132 mg (81%; capacidad: 0,015 mmoles/g; eficiencia de acoplamiento: 6%).

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Ejemplo 8

La resina NovaSyn TGR presenta un grupo de anclaje aminometilo con dos sustituyentes arilo en el grupo metileno. Se preparó la resina 11 análogamente a la síntesis de 8 descrita en el Ejemplo 5.

La resina NovaSyn TGR (166 mg, 30 \mumoles) se hizo reaccionar con la misma cantidad de reactivos que en el Ejemplo 5, proporcionando 11, con un rendimiento de 153 mg (90%, capacidad: 0,08 mmoles/g, eficiencia de acoplamiento: 44%).

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Ejemplo 9

Se preparó resina 12 análogamente a la síntesis de 9 descrita en el Ejemplo 6.

Se hizo reaccionar la resina NovaSyn TGR (166 mg, 30 \mumoles) con la misma cantidad de reactivos que en el Ejemplo 6, proporcionando 12, con un rendimiento de 142,2 mg (84%).

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Ejemplo 10

En el presente ejemplo, se unió un quelante bidentado a bromuro de Tentagel S AC 1.

Se disolvió N,N'-dimetiletilendiamina (110 \mul, 1.040 \mumoles) en DMF (1 ml), se añadió resina 1 (108,6 mg, 26 \mumoles), y la mezcla se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con DMF (3 veces), DMF y metanol (3 veces, alternando), agua (3 veces), DMF e isopropanol (3 veces, alternando), agua (3 veces), isopropanol (3 veces) y éter dietílico (3 veces). La resina se secó bajo alto vacío, proporcionando el producto 13, con un rendimiento de 101,6 mg (98,1%; capacidad: 0,24 mmoles/g; eficiencia de acoplamiento: 100%). La resina 13 era positiva en azul de bromofenol y negativa en tinción TNBS.

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Ejemplo 11

En el presente ejemplo, se describe la síntesis de un conjugado que rinde un complejo bioactivo, que se intercala en ADN de doble cadena. La unidad bioactiva, un derivado pireno, se unió a la unidad quelante sobre el soporte sólido.

Se acopló dietilén triamina protegida por N-Boc-N''-Dde a 1 tal como se describe en la preparación de 3. El intermediario bis-protegido era positivo en azul de bromofenol y negativo en tinción TNBS. Se eliminó el grupo protector Dde mediante agitación de la resina en hidrato de hidrazina (1,5 ml, al 2% en DMF) cinco veces durante 10 minutos, seguido de filtración. La tinción positiva con TNBS confirmó la eliminación del grupo protector Dde. Se introdujo el grupo pireno mediante aminación reductiva. Se añadieron 1-pirenaldehído (28,5 mg, 120 \mumoles) y metanol (4 ml) a la resina mono-desprotegida (103 mg, 24 \mumoles) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Tras la filtración y el lavado con DMF, se añadió triacetoxiborohidruro sódico (25 mg, 120 \mumoles) en DMF (5 ml), y la mezcla se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. El lavado con DMF y metanol (tal como anteriormente) proporcionó derivado dietilentriamina de pireno unido a resina protegida con Boc que era positivo en azul de bromofenol y negativo en tinción de TNBS. Finalmente, se eliminó el grupo protector Boc mediante agitación de la resina en ácido trifluoroacético (al 50% en CH_{2}Cl_{2}) durante 5 minutos, seguido de filtración y otro tratamiento con ácido trifluoroacético (al 50% en CH_{2}Cl_{2}) durante 10 minutos. El lavado (tal como se ha descrito anteriormente) proporcionó el producto 7 (capacidad: 0,18 mmoles/g, eficiencia de acoplamiento: 82%). La resina 7 era positiva en azul de bromofenol y en tinción TNBS.

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Ejemplo 12

En el presente ejemplo, se unión biotina (vitamina H) a la unidad quelante. En contraste con el Ejemplo 11, el conjugado de quelante-biomolécula se sintetizó antes de la unión al soporte sólido.

Se disolvió trietilentetramina (0,150 ml, 1,00 mmol) en THF (30 ml) y la solución se enfrió a -78ºC. Se añadió una solución de trifluoroacetato de etilo (0,109 ml, 1,00 mol) en THF (5 ml) antes de cumplirse los 30 minutos a -78ºC, y la solución se agitó a dicha temperatura durante 4 horas. A continuación se calentó hasta 0ºC.

\newpage

Entretanto, se calentó (+)-biotina (244 mg, 1,00 mmol) a 80ºC, proporcionando una solución incolora. Se añadieron N,N'-diciclohexilcarbodiimida (216 mg, 1,05 mmoles) y N-hidroxisuccinimida (121 mg, 1,05 mmoles) a la solución caliente. Se dejó que la mezcla se enfriase lentamente hasta la temperatura ambiente. Precipitaron unos polvos blancos. Se continuó la agitación durante 4 horas.

Las dos mezclas se mezclaron a 0ºC y se agitaron durante 30 minutos, proporcionando un gel blanco. Se evaporó el THF, proporcionando una suspensión blanca. Tras agitar a temperatura ambiente durante 18 horas, se eliminó el solvente in vacuo y se añadió agua al residuo. Se ajustó el pH a un valor de entre 3 y 4. Se filtró la mezcla, el eluido se neutralizó y se eliminó el agua in vacuo. Se purificó el producto crudo mediante cromatografía de columna (sílice, diclorometano/metanol/trietilamina 5:1:0,1), proporcionando N-biotinil-N'''-trifluoroacetil-trietiltetramina con un rendimiento de 60,5 mg (0,129 mmoles, 12,9%). La estructura se confirmó mediante espectrometría de masas y RMN.

Se hicieron reaccionar N-biotinil-N'''-trifluoroacetil-trietiltetramina (40,3 mg, 86 \mumoles), trietilamina (1,8 \mul, 17 \mumoles) y resina 1 (71,7 mg, 17 \mumoles) tal como se describe en el Ejemplo 1. Se secó TFA-resina bajo alto vacío, proporcionando el producto 14 con un rendimiento de 67 mg (85%, capacidad: 3 mmoles/g, eficiencia de acoplamiento: 13%). La resina 14 era positiva en azul de bromofenol y negativa en tinción TNBS. Los intentos de eliminar el grupo protector TFA con carbonato sódico (al 10% en agua) fracasaron, según los resultados negativos tras la tinción TNBS.

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Ejemplo 13

En el presente ejemplo, se describe un procedimiento para la preparación de derivados péptidos marcados. Se acopló un dipéptido protegido con un grupo terminal carboxílico libre a una poliamina parcialmente protegida. Se eliminó la totalidad de los grupos protectores y se introdujo protección Dde para bloquear selectivamente los grupos amino primarios en el péptido y en el quelante. Ello permitió unir selectivamente el conjugado a un soporte sólido mediante la formación de un grupo amino terciario procedente de uno de los grupos de amino secundario no protegidos del quelante.

Se disolvieron N,N',N''-tri(tert-butiloxicarbonil)trietilentetramina (103,3 mg, 234,5 \mumoles), Boc-Phe-Gly-OH (75,6 mg, 234,5 \mumoles), PyBOP (183 mg, 352 \mumoles) y diisopropiletilamina (20 \mul, 117 \mumoles) en diclorometano (2,5 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Periódicamente se añadió diisopropiletilamina (20 \mul, 117 \mumoles) para mantener el pH >7. Se eliminó el solvente in vacuo, el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó en solución hipersalina (3 veces), HCl frío 0,5 M (3 veces), NaHCO_{3} al 10% (2 veces) y solución hipersalina (3 veces). Se secó la fase orgánica sobre MgSO_{4} y se eliminó el solvente in vacuo, proporcionando N-(tert-butiloxicarbonil-fenilalanil-glicil)-N'-N''-N'''-tri(tert-butiloxicarbonil)-trietilentetramina, con un rendimiento de 175,2 mg (231,6 \mumoles, 98,8%). Se confirmó la estructura mediante espectrometría de masas y RMN.

Se eliminaron los grupos protectores Boc mediante agitación del producto (162,2 mg, 0,169 mmoles) en HCl en acetato de etilo (aproximadamente 1 M, 3 ml). Tras agitar a temperatura ambiente durante 9 horas, se eliminó el solvente in vacuo. El residuo se disolvió en agua y se agitó durante 1 hora (el pH era de 2 a 3), después se añadió NaOH (1 M, 313 mmoles) para neutralizar la solución y se evaporó el solvente in vacuo, proporcionando H-Phe-Gly-NH-C_{2}H_{4}-NH-C_{2}H_{4}-NH_{2}, en rendimiento cuantitativo. Se confirmó la estructura mediante espectrometría de masas y RMN.

Se disolvieron H-Phe-Gly-NH-C_{2}H_{4}-NH-C_{2}H_{4}-NH-C_{2}H_{4}-NH_{2} (113 mg, 0,152 mmoles) y 2-acetildimedona (Dde-OH) (70,0 mg, 0,335 mmoles) en etanol (4 ml). Tras agitar a temperatura ambiente durante 20 horas, el análisis mediante TLC mostró la conversión completa de la amina en un único producto. Se eliminó el solvente, proporcionando Dde-Phe-Gly-NH-C_{2}H_{4}-NH-C_{2}H_{4}-NH-C_{2}H_{4}-NH-Dde. Se confirmó la estructura mediante espectrometría de masas. Se utilizó el producto crudo sin separación del exceso de 2-acetildimedona.

Se hicieron reaccionar Dde-Phe-Gly-NH-C_{2}H_{4}-NH-C_{2}H_{4}-NH-C_{2}H_{4}-NH-Dde (76 \mumoles) y resina (79,2 mg, 19 \mumoles) tal como se describe en el Ejemplo 1. El intermediario protegido era positivo en azul de bromofenol y negativo en tinción TNBS. También se eliminaron los grupos protectores Dde, tal como se describe en el Ejemplo 1, proporcionando el producto 15. La resina 15 era positiva en azul de bromofenol y en tinción TNBS.

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Ejemplo 14

Condiciones de marcaje: se preparó [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} a partir de [^{99}TcO_{4}]^{-} utilizando un kit de borocarbonato (Alberto et al, J. Am. Chem. Soc. 123:3135-3136, 2001). Se añadió 1 mg de los quelantes unidos a fase sólida (0,2 mmoles) a la solución de [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} (1 ml), las mezclas se sonicaron brevemente y después se calentaron a 82ºC durante 30 minutos. Las soluciones se separaron de la resina de fase sólida mediante filtración y se analizaron mediante HPLC con detección gamma.

Se observó formación de complejos solubles con todos los quelantes unidos a fase sólida. El rendimiento variaba, según el tipo de quelante y las condiciones de reacción, de 5% a 50% (Tabla 1).

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Ejemplo 15

También se marcaron las resinas 3 y 4 en un procedimiento de un bote, combinando la formación de [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} y la reacción de corte. Se añadió 1 mg de quelantes unidos a fase sólida (0,2 mmoles) a un kit de borocarbonato (Mallinckrodt Medical, Petten, Países Bajos; Alberto et al, J. Am. Chem. Soc. 123:3135-3136, 2001). Se añadió al vial NaTcO_{4} tal como eluyó de un generador, y la mezcla se mantuvo a una temperatura de entre 78ºC y 82ºC durante 20 a 60 minutos. El pH era 11. El rendimiento de corte se encontraba comprendido entre 8% y 32%; la conversión de pertecnetato, entre 40% y 54%.

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Ejemplo 16

Para las reacciones de marcaje en la resina 4, se variaron las condiciones de reacción, tales como el valor de pH y la temperatura de reacción, para encontrar las condiciones de reacción óptimas. Para la utilización como trazador radioactivo, resulta necesaria la conversión completa del material de partida [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} y la formación de un único producto. Las etapas de purificación tras el procedimiento de marcaje deben evitarse debido a la radioactividad de las muestras y su rápida descomposición (t_{1/2}=6,2 horas). Los rendimientos de corte elevados resultan deseables para obtener soluciones de elevada radioactividad.

Se muestra la dependencia del pH de la reacción de corte en la figura 3. El rendimiento del corte se incrementa a partir de pH 6, con un máximo a pH 8,5. Esto es consistente con la desprotonación de [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} para formar [^{99m}Tc(OH)(H_{2}O)(CO)_{3}] (pK_{s} del análogo del renio: 7,5; Egli et al, Organometallics 16:1833-1840, 1997) y, por lo tanto, con la teoría de que un ion hidroxi coordinado con Tc es el nucleófilo que ataca al grupo CH_{2}, cortando el enlace C-N. El incremento del pH a 11 reduce el rendimiento de corte nuevamente. Esto podría deberse a la formación de la especie cargada negativamente [^{99m}Tc(OH)_{2}(H_{2}O)(CO)_{3}]^{-}, que reduce la electrofilicidad de un grupo amino coordinado.

Se estudió la dependencia de la temperatura de la reacción de la resina 4 con [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+} mediante el análisis de los productos de reacción tras la conversión completa de [^{99m}Tc(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{+}. A temperatura ambiente únicamente se produjo formación de complejo en la resina, la solución tras la filtración de la fase sólida no mostró radioactividad. A 43ºC, el rendimiento del corte era observable aunque reducido. A continuación se incrementó a medida que se incrementaba la temperatura (figura 4). Esto demuestra claramente que se produce competición entre la formación de complejo en la resina y la reacción de corte, presentando la reacción de corte la barrera de energía de activación más elevada. Sin embargo, las temperaturas muy elevadas podrían ser una desventaja, en vista de la estabilidad de la resina de fase sólida y de las biomoléculas unidas. Para la resina 4 resulta preferente una temperatura de reacción de entre 70ºC y 82ºC.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

5

6

Claims

1. Procedimiento para generar un agente acomplejado metálico, que comprende:

\quad: poner en contacto un conjugado orgánico unido a fase sólida, representado por la fórmula (I) con [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+},

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7

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en la que:

\quad: la esfera es un soporte de fase sólida,

\quad: C es un grupo metileno

\quad: R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente de entre el grupo que consta de H, sustituyentes alifáticos, sustituyentes aromáticos, RO, RS y (R)_{2}N, en los que R es un grupo alifático o arílico,

\quad: L es un línker o un enlace sencillo, y

\quad: cada uno de R_{1} y R_{2} es independientemente un grupo coordinante metálico, un grupo orgánico no coordinante, un grupo coordinante metálico derivatizado con una molécula biológicamente activa, o un grupo orgánico no coordinante derivatizado con una molécula biológicamente activa.

en la que M se selecciona de entre el grupo que consta de tecnecio (Tc), renio (Re), rodio (Rh), platino (Pt), iridio (Ir), rutenio (Ru) y cobre (Cu), y

n es 1, 2 ó 3.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que L es un línker seleccionado de entre el grupo que consta de fenileno, vinilo, alquileno, alileno, arileno y otros grupos no alifáticos y alifáticos.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que L se sustituye con un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre OR, R y (R)_{2}N, en los que R es un grupo alifático o arílico.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

en el que L es:

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8

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en el que X_{1} es O, y cada X_{2} es H o un sustituyente aceptor de electrones, con la condición de que por lo menos un grupo X_{2} sea un sustituyente aceptor de electrones.

\newpage

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

en el que por lo menos uno de entre R_{1} y R_{2} se selecciona de entre el grupo que consta de:

9

en los que R_{3} es una cadena alifática que contiene 1, 2 ó 3 carbonos.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que por lo menos uno de entre R_{1} y R_{2} es un sustituyente alifático o aromático.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un enlace coordinado entre [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+} y un átomo de nitrógeno de amina terciaria del conjugado orgánico unido a la fase sólida, y que libera un agente acomplejado metálico formado de esta manera.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

en el que M se selecciona de entre el grupo que consta de ^{99m}Tc, ^{186}Re y ^{188}Re.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

en el que la molécula biológicamente activa se selecciona de entre el grupo que consta de aminoácidos, esteroides, péptidos, proteínas, carbohidratos, polisacáridos, oligosacáridos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, lípidos y moléculas pequeñas farmacéuticamente activas.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,

en el que el soporte de fase sólida es una resina de polietilenglicol o un híbrido de polietilenglicol y poliestireno.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,

en el que el procedimiento se lleva a cabo a un pH que se encuentra comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 6,0 y 11,0.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,

en el que el procedimiento se lleva a cabo a una temperatura comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 40ºC y 100ºC.

13. Conjugado orgánico unido a fase sólida representado por la fórmula (I):

10

en la que la esfera es un soporte de fase sólida,

C es un grupo metileno,

R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente de entre el grupo que consta de H, sustituyentes alifáticos, sustituyentes aromáticos, RO, RS y (R)_{2}N, en los que R es un grupo alifático o arílico,

L es un línker o un enlace sencillo, y

cada uno de R_{1} y R_{2} es independientemente un grupo coordinante metálico, un grupo orgánico no coordinante, un grupo coordinante metálico derivatizado con una molécula biológicamente activa, o un grupo orgánico no coordinante derivatizado con una molécula biológicamente activa.

14. Conjugado orgánico unido a fase sólida según la reivindicación 13, en el que la molécula biológicamente activa se selecciona de entre el grupo que consta de aminoácidos, esteroides, péptidos, proteínas, carbohidratos, polisacáridos, oligosacáridos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, lípidos y moléculas pequeñas farmacéuticamente activas.

15. Conjugado orgánico unido a fase sólida según al reivindicación 13 ó 14, en el que el soporte de fase sólida es una resina de polietilenglicol o un híbrido de polietilenglicol y poliestireno.

16. Kit para la preparación de una composición farmacéutica diagnóstica o terapéutica, comprendiendo el kit:

un recipiente, y

una molécula de fórmula (I),

11

en la que la esfera es una fase sólida,

C es un grupo metileno,

L es un línker o un enlace sencillo, y

cada uno de R_{1} y R_{2} es independientemente un grupo coordinante metálico, un grupo orgánico no coordinante, un grupo coordinante metálico derivatizado con una molécula biológicamente activa, o un grupo orgánico no coordinante derivatizado con una molécula biológicamente activa,

en la que puede tener lugar la reacción con una solución de [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+}.

17. Kit según la reivindicación 16, en el que el recipiente es un vaso o columna.

18. Kit según la reivindicación 16 ó 17, que además comprende una solución de [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+}, en la que M es un metal, y n es 1, 2 ó 3.

19. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que además comprende reactivos para la preparación de [M(H_{2}O)_{3}(CO)_{3}]^{n+}, en la que M es un metal, y n es 1, 2 ó 3.

20. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, que además comprende un dispositivo para la filtración.