ES2325475T3 - Adyuvantes proteinicos. - Google Patents
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Abstract
Preparación inmunogénica que comprende los componentes siguientes para la administración simultánea, separada o secuencial: (i) por lo menos un antígeno asociado al cáncer; y (ii) una holotoxina pertussis genéticamente destoxificada en la que por lo menos uno de entre Arg 9 , Arg 13 , Trp 26 , Arg 58 y Glu 129 de la subunidad S1 de la holotoxina ha sido eliminado o sustituido, para proporcionar una respuesta inmunológica con adyuvante contra dicho antígeno o antígenos asociados a cáncer coadministrado con dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada por la misma vía, permitiendo dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada la adición de adyuvante en ausencia de un adyuvante extrínseco, para la provisión de dicha respuesta inmunológica con adyuvante.
Description
Adyuvantes proteínicos.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunología y se refiere particularmente a adyuvantes proteínicos,
es decir, materiales que modulan las respuestas inmunológicas frente
a un antígeno.
Se han utilizado vacunas durante muchos años
para proteger a seres humanos y a animales frente a una amplia
diversidad de enfermedades infecciosas. Estas vacunas convencionales
están constituidos por patógenos atenuados (por ejemplo el virus de
la polio), patógenos muertos (por ejemplo Bordetella
pertussis) o componentes inmunogénicos del patógeno (por
ejemplo el toxoide diftérico). Algunos antígenos son altamente
inmunogénicos y pueden por sí solos de inducir respuestas
inmunológicas. Otros antígenos, sin embargo, no consiguen inducir,
por ejemplo, una respuesta inmunológica protectora o inducen
únicamente una respuesta inmunológica débil.
Puede mejorarse significativamente la
inmunogenicidad si los antígenos se coadministran con adyuvantes.
Los adyuvantes incrementan la inmunogenicidad de un antígeno aunque
ellos mismos no son necesariamente inmunogénicos.
Se han utilizado agentes inmunoestimuladores o
adyuvantes extrínsecos durante muchos años para mejorar las
respuestas inmunológicas del huésped frente a composiciones
inmunogénicas, incluyendo vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son
inmunomoduladores que típicamente se encuentran unidos no
covalentemente a antígenos y se formulan para incrementar las
respuestas inmunológicas del huésped. De esta manera, se han
identificado adyuvantes que incrementan la respuesta inmunológica
frente a antígenos administrados parenteralmente. Sin embargo,
algunos de estos adyuvantes son tóxicos y pueden causar efectos
secundarios no deseables, provocando que resulten inadecuados para
la utilización en seres humanos y en muchos animales. En efecto,
únicamente el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio
(comúnmente denominados, colectivamente, alumbre) se utilizan
rutinariamente como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias.
La eficacia del alumbre como potenciador de las respuestas de
anticuerpos frente a los toxoides diftéricos y tetánicos ha sido
bien establecida y, más recientemente, se ha utilizado alumbre como
adyuvante de una vacuna HbsAg. Aunque la utilidad del alumbre se
encuentra bien establecida para algunas aplicaciones, presenta
limitaciones. Por ejemplo, resulta ineficaz en la vacunación de la
gripe e induce una respuesta inmunológica mediada por células de
manera inconsistente. Los anticuerpos que resultan inducidos por
antígenos con adyuvante alumbre en el ratón principalmente son del
isotipo IgG1, que puede no resultar óptimo para la protección por
parte de algunos agentes de vacuna.
Además, algunos estudios en ratas han demostrado
que el alumbre actúa como adyuvante de IgE (ref. 1, a lo largo de
la presente solicitud, se hace referencia a diversas referencias en
paréntesis para describir con mayor detalle el estado de la técnica
a la que se refiere la invención. Se proporciona información
bibliográfica completa para cada cita al final de la
especificación, inmediatamente antes de las reivindicaciones. Se
incorporan referencias adicionales como referencia en la presente
invención. Algunos estudios de vacunas de toxoides tetánico y
diftérico también indican que la adsorción con alumbre de vacunas
induce los anticuerpos IgE en seres humanos (refs. 2, 3, 4). Por lo
tanto, aunque la inclusión de una sal de aluminio en una formulación
de vacuna puede mejorar su inmunogenicidad y su potencia, el hecho
de que pueda inducir granulomas locales y anticuerpos IgE que
podrían contribuir a producir reacciones de hipersensibilidad,
merece un examen cuidadoso de la práctica de la adsorción con
alumbre de vacunas para la utilización humana y animal.
Entre algunas características de los adyuvantes
deseables se incluyen:
- (1)
- falta de toxicidad,
- (2)
- capacidad de estimular una respuesta inmunológica de larga duración,
- (3)
- simplicidad de fabricación y estabilidad de almacenamiento de largo plazo,
- (4)
- capacidad para inducir respuestas inmunológicas tanto celulares como humorales frente a antígenos administrados por diversas vías, en caso necesario,
- (5)
- sinergia con otros adyuvantes,
- (6)
- capacidad de interaccionar selectivamente con poblaciones de células presentadoras de antígeno (APC),
- (7)
- capacidad para inducir respuestas inmunológicas T_{H}1 o T_{H}2 apropiadas específicas de células,
- (8)
- capacidad para incrementar selectivamente los niveles del isotipo de anticuerpo apropiado (por ejemplo IgA) contra antígenos, y
- (9)
- no contribuyen a que se produzcan reacciones de hipersensibilidad.
Resulta relacionada con la presente invención
una exposición del desarrollo de las vacunas pertussis presentada a
continuación.
De esta manera, la enfermedad pertussis o tos
ferina es una enfermedad respiratoria grave causada por la infección
del tracto respiratorio por el organismo
Gram-negativo Bordetella pertussis. La tos
ferina es una causa importante de morbilidad infantil y se
encuentra implicada en 360.000 muertes anualmente (ref. 5). El
procedimiento más efectivo de control de la expansión de la
enfermedad ha demostrado ser la utilización de programas de
inmunización generalizada. La vacuna de pertussis de células
completas, que demostró su eficacia clínica en los años 50, ha
resultado efectiva en el control de la epidemia de tos ferina (refs.
6, 7, 8). El valor de la vacuna se puso de manifiesto cuando Japón,
Suecia y el Reino Unido abandonaron la inmunización rutinaria
infantil de la tos ferina. Poco después estos países experimentaron
grandes epidemias de tos ferina (refs. 9, 10, 11, 12).
Aunque la vacuna pertussis de células completas
resulta efectiva en la prevención de la incidencia y la expansión
de la enfermedad, la aceptación e incorporación de la vacuna ha sido
limitada debido a informes sobre los efectos adversos asociados a
la misma. Por lo tanto, se generó un impulso para la creación de una
vacuna pertussis componente acelular no reactogénica, efectiva y
bien definida. Una de las características clave de la vacuna
acelular es el componente toxina pertussis químicamente
destoxificada (PT). La presencia de toxina pertussis nativa en la
vacuna de células completas ha sido una fuente de preocupación,
debido a que algunos estudios en modelos animales han demostrado
que puede inducir linfocitosis, sensibilización a las histaminas,
potenciación de la anafilaxis y anticuerpos IgE, incremento de la
secreción de insulina y muchos otros efectos sistémicos (ref. 13).
Las vacunas pertussis acelulares difieren con respecto a las
combinaciones y cantidades de antígenos de Bordetella
pertussis incluidos en las vacunas, aunque los antígenos clave
incluyen los aglutinógenos, pertactina, hemaglutinina filamentosa
(FHA) y toxina pertussis (PT). Aunque la vacuna acelular ha
demostrado ser inmunogénica y de eficacia comparable a la vacuna de
células completas, no ha resultado tan efectiva en la prevención de
la colonización bacteriana (ref. 14). Además, los resultados de un
trabajo de campo sueco que ha comparado las vacunas pertussis
acelulares y las vacunas de células completas indican que la toxina
pertussis inactivada con formaldehído presente en las vacunas
celulares muestra evidencia de reversión a la toxicidad (ref. 15).
Por lo tanto, resultaron necesarios otros procedimientos para
inactivar la molécula de toxina pertussis.
Para superar las desventajas de la
destoxificación química, varios grupos han desarrollado moléculas de
holotoxina mutante pertussis genéticamente destoxificada (refs. 16,
17, 18, 19, 20, 21). Un candidato prometedor es el mutante K9G129.
No sólo conserva la inmunogenicidad de la molécula, sino que reduce
mucho la toxicidad de dicha toxina recombinante (refs. 18, 19, 21).
Además, la inmunización con el mutante K9G129 estimula respuestas
específicas de antígeno pertussis tanto humorales como celulares
(ref. 22). Aunque muchos ensayos clínicos basan la evaluación de la
inmunogenicidad de una vacuna únicamente en la respuesta de
anticuerpos tras la inmunización, algunos estudios indican que la
inmunidad celular presenta un papel importante en la protección
frente a esta enfermedad. Se ha demostrado en modelos animales que
la respuesta inmunológica celular resulta importante para la
respuesta protectora frente a la tos ferina debido a que la
transferencia adoptiva de células procedentes de animales
convalecientes a animales irradiados subletalmente proporcionó
protección frente al reto con organismos de Bordetella
pertussis, mientras que la transferencia pasiva de suero
inmunológico no proporcionó protección (refs. 23, 24). Un estudio
retrospectivo en seres humanos indica que la inmunidad mediada por
células frente a Bordetella pertussis se correlaciona con un
historial positivo de tos ferina (ref. 25). Tras la infección
natural por tos ferina en seres humanos, se observan respuestas
inmunológicas tanto de anticuerpos como celulares (ref. 26). Sin
embargo, la inmunización con vacunas de células completas o de
componente acelular resulta en respuestas inmunológicas celulares
variables específicas de antígeno pertussis (refs. 27, 28).
Aparentemente la destoxificación química del componente toxina
pertussis destruye la inmunogenicidad de células T del mismo,
mientras que las respuestas de anticuerpos no resultan afectadas
(ref. 26). Por lo tanto, únicamente podía utilizarse la molécula de
toxina pertussis genéticamente destoxificada para estimular una
respuesta inmunológica tanto celular como humoral.
La utilización del mutante PT recombinante
K9G129 como componente de vacuna pertussis ha sido bien descrita.
Se han sugerido varias formas diferentes de vacuna. Se han evaluado
dos formulaciones en seres humanos. La primera formulación está
constituida por 15 \mug de PT mutante adsorbido con alumbre, con
un total de 0,5 mg de alumbre por dosis (refs. 22, 29), mientras
que la otra formulación contiene 7,5 \mug de mutante K9G129, así
como 10 \mug de FHA y 10 \mug de pertactina y también se
encontraba adsorbida a alumbre (ref. 30). Estos estudios indican
que el candidato de vacuna pertussis genéticamente destoxificada no
sólo resultaba segura, inmunogénica y podía inducir una respuesta
mediada por células, sino que, en combinación con los antígenos FHA
y pertactina, también proporcionaba una mejor protección en el
ensayo de reto intracerebral que una vacuna pertussis de componente
químicamente destoxificada (ref. 30). Entre otras formulaciones
propuestas se incluyen un componente K9G129 tratado con
formaldehído (ref. 31) y una vacuna celular derivada de una cepa de
Bordetella pertussis que produce una molécula de toxina
pertussis K9G129 genéticamente inactivada (ref. 32). El tratamiento
de formaldehído de la molécula K9G129 alteró la inmunogenicidad de
la molécula, induciendo menores cantidades de anticuerpos
específicos. También se redujo la capacidad protectora de la
molécula, al resultar menos efectiva en el ensayo de reto
intracerebral (ref. 32). Sin embargo, la vacuna celular recombinante
derivada de la cepa productora de K9G129 demostró ser tan efectiva
como la vacuna pertussis de células completas (ref. 32).
\newpage
Aunque las formulaciones anteriormente indicadas
demuestran las ventajas de mejores seguridad y eficacia asociadas a
la utilización de una molécula de toxina pertussis genéticamente
destoxificada, no mejoran los efectos adversos de la vacunación DPT
(difteria, pertussis y tétanos) no asociados al componente molécula
de pertussis (refs. 33, 46). La totalidad de las formulaciones
indicadas utilizaron 0,3 mg de fosfato de aluminio (ref. 32) ó 0,5
mg de hidróxido de aluminio (refs. 29, 30). Se introdujeron sales de
aluminio en las formulaciones de vacuna DT y DPT a modo de
adyuvante que potenciarían respuestas fuertes de anticuerpos en el
momento en que se redujeran los niveles de los toxoides o el número
de organismos de Bordetella pertussis con el fin de evitar
reacciones adversas (refs. 34, 35), y en la actualidad se utiliza
alumbre rutinariamente como adyuvante en estas vacunas. Sin
embargo, varios años de trabajo de campo con estas vacunas pertussis
adsorbidas y algunos estudios (refs. 36, 37) han demostrado que,
aunque contienen menos de los componentes de vacuna reactogénicos
identificados, de todas maneras precipitan reacciones locales (refs.
38, 39, 40, 41, 42). El examen histopatológico de los abscesos
locales producidos tras la vacunación ha revelado inclusiones de
hidróxido de aluminio en células gigantes (ref. 38). La
investigación de la frecuencia de estos granulomas indica que se
encuentran asociados al contenido de aluminio en la vacuna, debido a
que los grupos inmunizados con placebo que únicamente habían
recibido la fracción aluminio de la vacuna mostraron formación de
abscesos a una tasa de reacción similar (ref. 43). Se han obtenido
datos adicionales que apoyan el papel del aluminio en estas
reacciones locales a partir de estudios comparativos de adyuvante
aluminio adsorbido y vacunas solas de cólera y de tétanos (refs.
44, 45). La inoculación profunda de la vacuna en el músculo reduce
la incidencia de estos abscesos pero, aunque las técnicas mejoradas
pueden evitar la formación de abscesos (ref. 39), la potenciación
de las respuestas de IgE por parte de las sales de aluminio no
resulta afectada.
Resultaría ventajoso proporcionar composiciones
inmunogénicas que presentasen respuestas inmunológicas moduladas
frente a antígenos constituyentes sin las desventajas de toxicidad
local y sin contribuir a la hipersensibilidad frente a adyuvantes
extrínsecos de la técnica anterior.
La presente invención se refiere a evitar los
problemas asociados a la utilización del alumbre como adyuvante en
composiciones inmunogénicas mediante la utilización de una
holotoxina pertussis genéticamente destoxificada, que puede ser
inmunogénica ella misma, para producir la modulación de una
respuesta inmunológica frente a un antígeno asociado al cáncer.
Aunque la eliminación del alumbre de las
formulaciones de vacuna podría haber sido un enfoque para resolver
los problemas asociados a las mismas, tal como se ha indicado
anteriormente, se incluyó alumbre en las formulaciones de vacuna
para proporcionar una respuesta inmunológica incrementada frente a
los antígenos en la formulación. Por lo tanto, se esperaría que la
eliminación del alumbre conduciría a una formulación menos efectiva
y que probablemente no ha sido propuesta.
Sin embargo, la holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada proporciona inesperadamente una
modulación de la respuesta inmunológica de un antígeno asociado al
cáncer que permite proporcionar formulaciones de vacuna y otras
composiciones inmunogénicas que muestran respuestas inmunológicas
por lo menos equivalentes a aquéllas conseguidas con un adyuvante
alumbre.
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un
aspecto de la presente invención se proporciona una preparación
inmunogénica que comprende los componentes siguientes para la
administración simultánea, separada o secuencial:
- (i)
- por lo menos un antígeno asociado al cáncer, y
- (ii)
- una holotoxina pertussis genéticamente destoxificada en la que se ha eliminado o sustituido por lo menos uno de entre Arg^{9}, Arg^{13}, Trp^{26}, Arg^{58} y Glu^{129} de la subunidad S1 de la holotoxina, con el fin de proporcionar una respuesta inmunológica con adyuvante frente a dicho antígeno o antígenos asociados al cáncer, coadministrada con dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada mediante la misma vía, resultando posible la utilización de adyuvante de dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada, en ausencia de un adyuvante extrínseco, para proporcionar dicha respuesta inmunológica con adyuvante. La holotoxina pertussis genéticamente destoxificada se encuentra presente en una cantidad suficiente para modular una respuesta inmunológica frente a dicho otro antígeno en ausencia de un adyuvante extrínseco.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una composición que comprende:
- (i)
- por lo menos un antígeno asociado al cáncer, y
- (ii)
- una holotoxina pertussis genéticamente destoxificada en la que por lo menos uno de entre Arg^{9}, Arg^{13}, Trp^{26}, Arg^{58} y Glu^{129} de la subunidad S1 de la holotoxina ha sido eliminado o sustituido, para la utilización como vacuna para proporciona una respuesta inmunológica con adyuvante frente a dicho antígeno o antígenos asociados a cáncer, resultando posible la utilización de adyuvante de dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada en ausencia de un adyuvante extrínseco, para proporcionar dicha respuesta inmunológica con adyuvante.
\vskip1.000000\baselineskip
La respuesta inmunológica que se encuentra
modulada por la presencia de la holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada pude ser una respuesta inmunológica humoral y/o
celular. En particular, la respuesta inmunológica modulada puede
ser una respuesta de IgG y/o celular incrementada frente al antígeno
asociado al cáncer.
Según un aspecto de la presente invención, puede
seleccionarse por lo menos un antígeno asociado a cáncer de entre
antígenos de melanoma, cáncer de vejiga, pulmón, cervical y
prostático.
El antígeno o antígenos asociados a cáncer puede
comprender células tumorales inactivadas o fracciones membranales
de las mismas. Las células tumorales pueden eliminarse de un huésped
cancerosos y después inactivarse de cualquier manera conveniente,
por ejemplo mediante irradiación o inactivación química. Las células
inactivadas y/o fracción membranal de las mismas se mezclan a
continuación con la holotoxina genéticamente destoxificada,
proporcionando una composición inmunogénica según la invención. A
continuación, esta composición puede administrarse en un huésped no
expuesto (es decir, sin carga cancerosa) con el fin de proporcionar
protección profiláctica frente al desarrollo tumoral. Además, esta
composición puede administrarse a un huésped con carga cancerosa,
estimulando una respuesta antitumoral en el huésped.
La holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada puede ser ella misma inmunoprotectora, aunque el
efecto inmunomodulador de la misma puede obtenerse en ausencia de
una respuesta inmunológica contra la holotoxina. La provisión de
holotoxinas pertussis genéticamente destoxificadas se describe en
las patentes US nº 5.085.862 y nº 5.221.618, asignadas al
cesionario de la presente invención.
La expresión "genéticamente destoxificado"
tal como se utiliza en la presente memoria presenta el mismo
significado que en las patentes mencionadas anteriormente US nº
5.085.862 y nº 5.221.618, es decir una holotoxina pertussis mutante
que muestra una toxicidad residual de aproximadamente 1% o inferior,
preferentemente inferior a aproximadamente 0,5% de la de la toxina
nativa. La toxicidad residual se determina mediante ensayo de
aglutinación de células CHO y actividad de
ADP-ribosil-transferasa.
Puede formarse dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada mediante mutagénesis de una secuencia
de nucleótidos codificante de la holotoxina, tal como se describe en
las patentes anteriormente indicadas, de manera que se elimina o se
sustituye por lo menos un aminoácido. Pueden eliminarse o
sustituirse múltiples aminoácidos. El aminoácido o aminoácidos que
se eliminen o sustituyan se encuentran presentes en la subunidad S1
y son, específicamente, ARG^{9}, ARG^{13}, TRP^{26},
ARG^{58} y GLU^{129}. En el caso de que se eliminen o
sustituyan múltiples aminoácidos, resulta preferente eliminar o
sustituir (S1)ARG^{9}GLU^{129}. En el caso de que se
lleve a cabo dicha mutación, resulta preferente sustituir ARG^{9}
por CYS^{2}, y GLU^{129} por GLY^{129} (este mutante
específico en ocasiones se ilustra en la presente memoria como
K9G129).
Posteriormente se encuentran las Tablas 1a y 2,
que contienen detalles de varias mutaciones de la holotoxina
pertussis que pueden utilizarse como la holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada en las composiciones inmunogénicas
proporcionadas en la presente memoria (las Tablas aparecen al final
del texto descriptivo). La Tabla 1b contiene detalles de la
caracterización in vitro de las mutaciones en la Tabla
1a.
Las composiciones inmunogénicas de la invención
pueden contener por lo menos un antígeno de Bordetella
adicional, incluyendo aglutinógenos, FHA y pertactina.
Las composiciones inmunogénicas proporcionadas
en la presente memoria pueden formularse en ausencia sustancial de
un adyuvante extrínseco como vacuna para la administración humana o
animal. Este tipo de composición de vacuna puede mostrar una
respuesta de IgE reducida.
Las composiciones y preparaciones inmunogénicas
de la presente invención resultan útiles para obtener una respuesta
inmunológica modulada frente a un antígeno asociado a cáncer en un
huésped, incluyendo un ser humano. Para dicho fin, el antígeno
asociado a cáncer se administra en el huésped y se coadministra una
holotoxina pertussis genéticamente destoxificada en el huésped en
una cantidad suficiente para modular una respuesta inmunológica
frente al antígeno asociado a cáncer en ausencia de un adyuvante
extrínseco.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
respuesta inmunológica puede ser una respuesta inmunológica humoral
y/o celular y la respuesta inmunológica modulada puede ser una
respuesta inmunológica de IgG y/o celular. La administración de la
holotoxina pertussis y el antígeno asociado a cáncer puede llevarse
a cabo mediante la administración en el huésped de una composición
tal como se ha indicado anteriormente y proporcionada según la
invención.
En una forma de realización particular de la
presente invención, se coadministran antígenos y adyuvantes. En la
presente solicitud, el término "coadministración" se refiere a
administraciones simultáneas o administraciones comprendidas dentro
de un periodo de tiempo corto, tal como entre varios minutos u horas
y hasta 3 días. Las coadministraciones pueden realizarse en el
mismo sitio o en sitios diferentes y por la misma vía o por vías
diferentes.
La presente invención se pondrá más claramente
de manifiesto a partir de la descripción siguiente, haciendo
referencia a las figuras. Se hace referencia a las figuras 1 a 6
conjuntamente con los Ejemplos 1 a 9 y 11, que, tal como se indica
posteriormente en la presente memoria, no se encuentran comprendidos
dentro de la invención según se reivindica en la presente
memoria.
La figura 1 representa el incremento de la
producción de anticuerpos IgE séricos murinos por parte de
composiciones inmunogénicas,
la figura 2 representa la producción de
anticuerpos IgG por parte de composiciones inmunogénicas,
la figura 3 representa la producción de
anticuerpos IgG por parte de vacunas multivalentes, y
la figura 4 representa la inducción de
respuestas inmunológicas celulares por parte de vacunas
multivalentes,
la figura 5 representa los fenotipos T_{h}1 y
T_{h}2 de respuesta inmunológica, según se determina a partir del
perfil de citoquinas en ratones inmunizados con ovoalbúmina con
adyuvante PPD y toxina pertussis, PT, genéticamente destoxificada
(K9G129),
la figura 6 representa los fenotipos T_{h}1 y
T_{h}2 de respuesta inmunológica según se determina a partir de
los perfiles específicos de las inmunoglobulinas IgG2a y IgGE de
ovoalbúmina en ratones inmunizados con PPD y con toxina pertussis,
PT, genéticamente destoxificada (K9GK9),
la figura 7 representa el número de ratones
libres de tumor en experimentos de inmunoterapia llevados a cabo en
la presente memoria. Se inmunizaron seis grupos de ratones con cinco
ratones por grupo, con medio de cultivo celular como control y
10^{4} células vivas de melanoma. El gráfico muestra el número de
ratones que no presentaban tumor treinta días después del reto,
la figura 8 representa los volúmenes tumorales
el día 30 de dos de los seis grupos de ratones representados frente
al número de días posteriores al reto de 10^{5} células vivas de
melanoma. Las cajas abiertas con las líneas discontinuas
representan los cinco ratones que fueron inmunizados con 10^{4}
células irradiadas solas (grupo 2) y los círculos negros conectados
por líneas continuas representan los cinco ratones inmunizados con
células irradiadas más 1 \mug de K9G129 (grupo 3), y
la figura 9 representa los volúmenes tumorales
el día 22. Se inmunizaron ratones con medio de cultivo celular como
control y 10^{4} células de melanoma irradiado solas o
conjuntamente con CFA o con concentraciones crecientes de K9G129.
Los volúmenes tumorales de cada uno de los cinco ratones en los seis
grupos se muestran 22 días después del reto con 10^{5} células
vivas de melanoma. Para los tres últimos grupos (ratones que
recibieron K9G129), los números junto a las flechas muestran el
número de ratones libres de tumores.
Haciendo referencia a la figura 1, se ilustra el
incremento de los niveles séricos de IgE en ratones inmunizados con
una vacuna DTP acelular con adyuvante alumbre químicamente
inactivada y una vacuna rDTP acelular con adyuvante no alumbre, que
comprendía el análogo K9G129 de PT genéticamente destoxificado. Los
resultados indican que los niveles séricos de IgE en ratones
inmunizados con la vacuna rDTP acelular se redujeron
significativamente (p<0,05) respecto a los de la vacuna DTP
acelular que contenía la molécula de toxina pertussis químicamente
destoxificada.
Haciendo referencia a las figuras 2 y 3 y la
Tabla 3, se ilustra una comparación entre los niveles de anticuerpos
específicos de antígeno producidos tras la inmunización de ratones
con una vacuna DTP de células completas con adyuvante alumbre, una
preparación de vacuna DTP acelular con adyuvante alumbre y una
vacuna DTP que contenía el análogo K9G129 de PT genéticamente
destoxificado sin adyuvante alumbre. Los resultados representados en
la Tabla 3 indican que la respuesta de IgG antiPT y los títulos de
neutralización de CHO producidos por la vacuna DTP acelular con
adyuvante alumbre y la vacuna DTP acelular recombinante sin
adyuvante alumbre eran equivalentes. De esta manera, aunque la
formulación recombinante libre de alumbre demostró una actividad
potenciadora de IgE reducida, sin embargo conservaba su efectividad
como vacuna pertussis, tal como indicaban estos títulos de IgG
antitoxina pertussis. Se obtuvieron datos adicionales de la
conservación de inmunogenicidad específica de PT a partir de
ensayos de neutralización de células CHO. Resulta significativo que
se detectasen niveles más altos de anticuerpos IgG antiaglutinógeno
2+3 y anti69 kD (pertactina) en las muestra de suero procedentes de
ratones inmunizados con formulación recombinante libre de alumbre
(p<0,05). Las respuestas de IgG antitoxoide FHA eran
equivalentes en sueros obtenidos de ratones inmunizados con
cualquiera de las vacunas.
La figura 3 representa los niveles de anticuerpo
IgG antitoxoide tetánico y antitoxoide diftérico en sueros de
ratones inmunizados con la vacuna pertussis de células completas, la
vacuna DTP acelular de componente definido que contiene la molécula
pertussis destoxificada con glutaraldehído o la vacuna DTP acelular
recombinante libre de alumbre. Los componentes toxoides diftérico y
tetánico en esta última vacuna también carecían de alumbre. Los
resultados indican que las formulaciones acelulares inducen niveles
de anticuerpos IgG antitoxoide tetánico y antitoxoide diftérico
significativamente más elevados según mediciones con este ensayo.
Además, la formulación recombinante libre de alumbre indujo
respuestas de IgG antitoxoide tetánico y diftérico
significativamente más elevadas que la vacuna DTP de componente
acelular.
Se evaluó in vitro la capacidad de las
formulaciones de vacuna DTP de inducir respuestas inmunológicas
celulares específicas de antígeno y se muestran los resultados en la
figura 4. Se cultivaron esplenocitos derivados de ratones
inmunizados con las vacunas de células completas, acelular o DTP
acelular recombinante libre de alumbre, en presencia de los
antígenos de vacuna específicos. La vacuna DTP de células completas
indujo una respuesta celular antitoxoide diftérico significativa,
aunque no en el mismo grado que la generada por la vacuna
componente DTP acelular. La vacuna componente acelular indujo una
respuesta proliferativa específica de antígeno pertussis
relativamente baja, con la excepción de las respuestas anti69 kD y
antitoxoide diftérico. Sin embargo, resultó significativo el
marcado incremento del índice proliferativo específico de antígeno
inducido por la formulación acelular recombinante libre de alumbre
en respuesta a todos los antígenos sometidos a ensayo. La
formulación recombinante indujo claramente los niveles más altos de
respuestas proliferativas específicas de antígeno de entre todas
las vacunas sometidas a ensayo.
De acuerdo con una forma de realización de la
invención descrita y reivindicada en la solicitud parental (EP
19950924122), se proporciona (a título de ejemplo de una composición
inmunogénica que comprende una holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada y por lo menos otro antígeno no de Bordetella
en el que se encuentra presente dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada en una cantidad suficiente para modular
una respuesta inmunológica contra dicho otro antígeno en ausencia
de un adyuvante extrínseco) una vacuna DTP acelular libre de
alumbre que contiene el análogo K9G129 de PT genéticamente
destoxificado. De esta manera, aunque la formulación libre de
alumbre no contiene un adyuvante extrínseco (por ejemplo un
mineral), contiene un adyuvante, debido a que el mutante K9G129
actúa no sólo como antígeno sino también como un adyuvante (es
decir, un adyuvante proteínico). Esta propiedad resulta aparente en
las respuestas específicas de antígeno pertussis medidas mediante
inmunoensayo enzimático (fig. 2). Resultaron evidentes respuestas de
IgG antiaglutinógeno 2+3 y anti69 kD (pertactina)
significativamente más altas en las muestras de suero derivadas de
ratones inmunizados con la formulación de vacuna pertussis acelular
recombinante libre de alumbre, mientras que las respuestas
específicas de toxoide FHA. Por lo tanto, la nueva formulación
indujo respuestas de anticuerpos específicas de antígenos de vacuna
pertussis a niveles que eran comparables o superiores a los niveles
inducidos por la vacuna pertussis acelular adsorbida en
alumbre.
También se evaluó la actividad adyuvante
intrínseca general del mutante K9G129 para otros antígenos de vacuna
(tales como aquellos antígenos presentes en vacunas humanas, tales
como las vacunas pediátricas de combinación). Se compararon las
respuestas de IgG específicas de los toxoides tetánico y diftérico
en suero obtenido de ratones inmunizados con la vacuna pertussis de
células completas adsorbida en alumbre o la vacuna pertussis
acelular o la vacuna recombinante libre de alumbre (fig. 3). Los
títulos de IgG específico de tétanos y de difteria en el suero de
ratones inmunizados con la vacuna de células completas eran
significativamente inferiores a los observados en cualquiera de los
grupos inmunizados con DTP acelular. Aunque la vacuna DTP adsorbida
en alumbre indujo respuestas específicas de toxoide
significativamente más altas que el grupo inmunizado con vacuna de
células completas, de entre todas las formulaciones de vacuna
sometidas a ensayo, la formulación libre de alumbre indujo los
títulos más altos de IgG específica de toxoide. Por lo tanto, la
actividad adyuvante del mutante K9G129 no se limita únicamente a
antígenos de Bordetella.
La presente invención en una forma de
realización proporciona composiciones inmunogénicas, adecuadas para
ser utilizadas como, por ejemplo, vacunas. La composición
inmunogénica induce una respuesta inmunológica en el huésped en el
que se administra, incluyendo la producción de anticuerpos por parte
del huésped. Las composiciones inmunogénicas incluyen por lo menos
un antígeno asociado a cáncer.
Entre los antígenos específicos de cáncer se
incluyen antígenos de melanoma, de cáncer pulmonar, cervical,
prostático y de vejiga. Alternativamente pueden prepararse antígenos
o haptenos por medio de procedimientos sintéticos orgánicos o, en
el caso de, por ejemplo, polipéptidos y proteínas por medio de
procedimientos de ADN recombinante.
Las composiciones inmunogénicas pueden
prepararse en forma de inyectables, soluciones líquidas o
emulsiones. Los antígenos y composiciones inmunogénicas pueden
mezclarse con portadores fisiológicamente aceptables que resulten
compatibles con las mismas. Entre éstas pueden incluirse agua,
solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de los
mismos. La vacuna además puede contener sustancias auxiliares, tales
como agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponadores de
pH, para incrementar adicionalmente la efectividad de los mismos.
Las vacunas pueden administrarse mediante inyección subcutánea o
intramuscularmente.
Alternativamente, las composiciones
inmunogénicas proporcionadas por la presente invención pueden
administrarse de manera que induzcan una respuesta inmunológica en
las superficies mucosales. De esta manera, la composición
inmunogénica puede administrarse en superficies mucosales por las
vías, por ejemplo, nasal, anal, vaginal u oral (intragástrica).
Alternativamente, pueden resultar deseables otros modos de
administración, incluyendo supositorios. Para los supositorios,
entre los ligantes y portadores pueden incluirse, por ejemplo,
polialquilenglicoles y triglicéridos. Las formulaciones orales
pueden incluir incipientes utilizados normalmente, tales como grados
farmacéuticos de sacarina, celulosa y carbonato de magnesio.
Dichas composiciones pueden adoptar la forma de
soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas,
formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contener entre 1%
y 95% de las composiciones inmunogénicas de la presente
invención.
Las composiciones inmunogénicas se administran
de una manera compatible con la formulación de dosis, y en una
cantidad que resulte terapéuticamente efectiva, protectora e
inmunogénica. La cantidad que debe administrarse depende del sujeto
que debe inmunizarse, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del
sistema inmunológico del sujeto de sintetizar anticuerpos y, en
caso necesario, producir una respuesta inmunológica mediada por
células. Las cantidades precisas de antígeno y composición
inmunogénica que deben administrarse dependen del criterio del
médico responsable. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados
resultan fácilmente determinables por el experto en la materia y
pueden encontrarse en el orden de microgramos a miligramos. Los
regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de
refuerzo también son variables, aunque pueden incluir una
administración inicial seguido de administraciones posteriores. La
dosis de la vacuna también puede depender de la vía de
administración y variará según el tamaño del huésped.
La concentración de antígenos en una composición
inmunogénica según la invención en general se encuentra comprendida
entre 1% y 95%.
La composición inmunogénica de la presente
invención resulta útil para generar anticuerpos específicos de
antígeno asociado a cáncer que resultan ellos mismos útiles para la
identificación específica de antígeno asociado a cáncer en un
inmunoensayo. Entre estos inmunoensayos se incluyen ensayos de
inmunosorción ligada a enzima (ELISA), RIA y otros ensayos de unión
de anticuerpo no ligado a enzima o procedimientos conocidos en la
técnica. En los ensayos ELISA, los anticuerpos específicos de
antígeno se inmovilizan sobre una superficie seleccionada, por
ejemplo los pocillos de una placa de microtitulación de
poliestireno. Tras lavado para eliminar los anticuerpos
incompletamente adsorbidos, puede unirse a la superficie
seleccionada una proteína no específica, tal como una solución de
albúmina sérica bovina (BSA) o caseína, que es conocido que es
antigénicamente neutra con respecto a la muestra de ensayo. Lo
anterior permite bloquear los sitios de adsorción no específica
sobre la superficie inmovilizadora y de esta manera reducir la
señal de fondo causada por las uniones no específicas de antígenos
a la superficie. A continuación, la superficie inmovilizadora se
pone en contacto con una muestra, tal como materiales clínicos o
biológicos, que deben someterse a ensayo de una manera que permita
la formación de complejo inmunológico (antígeno/anticuerpo). Lo
expuesto anteriormete puede incluir diluir la muestra con
diluyentes, tales como BSA, globulina gamma bovina (BGG) y/o
solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween. A continuación,
la muestra se deja incubar durante aproximadamente 2 a 4 horas, a
temperaturas tales como del orden de aproximadamente 25ºC a 37ºC.
Tras la incubación, la superficie en contacto con la muestra se
lava para eliminar el material no acomplejado inmunológicamente. El
procedimiento de lavado puede incluir el lavado con una solución,
tal como PBS/Tween, o un tampón borato.
Tras la formación de inmunocomplejos específicos
entre el antígeno asociado a cáncer en la muestra de ensayo y los
anticuerpos específicos de antígeno unidos, y el posterior lavado,
puede determinarse la presencia, e incluso la magnitud de la
formación de complejo inmunológico sometiendo a éste a un segundo
anticuerpo que presente especificidad para el antígeno asociado a
cáncer. Para proporcionar un medio de detección, el segundo
anticuerpo puede presentar una actividad asociada, tal como una
actividad enzimática, que generará, por ejemplo, un desarrollo de
color tras la incubación con un sustrato cromogénico apropiado.
Puede conseguirse a continuación la cuantificación midiendo el
grado de generación de color, utilizando, por ejemplo, un
espectrofotómetro de espectro visible.
La exposición anterior describe de manera
general la presente invención. Puede ponerse más claramente de
manifiesto haciendo referencia a los Ejemplos específicos
siguientes. Estos ejemplos se describen a título únicamente
ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención. Se
encuentran comprendidos cambios de forma y sustitución de
equivalentes según sugieran o hagan conveniente las circunstancias.
Aunque en la presente invención se han utilizado términos
específicos, estos términos pretenden utilizarse en un sentido
descriptivo y no limitativo. Las composiciones inmunogénicas
descritas en los Ejemplos 1 a 9 y 11 no se encuentran comprendidas
dentro del alcance de la invención según se reivindica en la
presente memoria.
El presente Ejemplo describe la formulación de
vacunas.
La vacuna DPT de células completas y una vacuna
acelular componente experimental fueron producidas por Connaught
Laboratories Ltd. La vacuna pertussis acelular componente se
encontraba adsorbida con alumbre (1,5 mg/dosis) y consistía de 10
\mug de nitrógeno proteico de toxina pertussis convertida en
toxoide con glutaraldehído, 5 \mug de nitrógeno proteico de cada
FHA y cada uno de los aglutinógenos 2 y 3, y 3 \mug de pertactina
conjuntamente con 5 Lf de toxoide tetánico y 25 Lf de toxoide
diftérico por dosis. La vacuna recombinante componente también
contenía 5 \mug de nitrógeno proteico de cada FHA y de cada uno de
los aglutinógenos 2 y 3, y 3 \mug de nitrógeno proteico de la
pertactina, además de 5 Lf de toxoide tetánico y 25 Lf de toxoide
diftérico por dosis. Sin embargo, era diferente de la otra vacuna
acelular en el aspecto de que contenía 20 \mug de nitrógeno
proteico de la holotoxina PT mutante recombinante, K9G129, y no se
encontraba adsorbida con alumbre. La molécula de toxina pertussis
K9G129, así como los componentes FHA purificada, agg. 2+3 y
pertactina, se obtuvieron individualmente de Connaught Laboratories
Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo describe la inmunización de
los animales.
Se obtuvieron ratones BALB/c hembra de 15 a 18
gramos de Charles River Canada (St. Constant, Québéc). Los ratones
se alojaron en microaisladores y se utilizaron de acuerdo con las
directrices fijadas por el Canadian Council on Animal Care (CCAC).
Los animales eran libres de patógenos específicos y se realizó el
seguimiento de los cubículos en que se alojaron para brotes de
virus de hepatitis murina mediante la utilización de ratones
centinela. Se les proporcionó agua ad libitum y la dieta se
encontraba libre de ovoalbúmina. Los ratones se inmunizaron el día
0 con las formulaciones de vacuna en grupos de seis. Se administró
una dosis de refuerzo de vacuna el día 21. El día 28 se sangraron
los animales mediante laceración de la vena yugular y se sometieron
a esplenectomía. Las muestras de suero se almacenaron a -20ºC hasta
la realización del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo describe inmunoensayos
específicos de antígeno.
Se determinaron mediante EIA indirecta las
respuestas de IgG específicas de antígeno de la vacuna. Los
antígenos de interés eran la toxina pertussis, la pertactina, la
hemaglutinina filamentosa, aglutinógenos, así como los toxoides
diftérico y tetánico. Se recubrieron microplacas de elevada
capacidad de unión (Nunc) con 4 \mug/ml de cada uno de los
antígenos anteriormente indicados en un volumen de 50 \mul/pocillo
de tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras la incubación durante la
noche, las placas se lavaron y se bloquearon sucesivamente con una
solución al 0,1% de albúmina de suero bovino (Sigma) durante una
hora a temperatura ambiente. Se eliminó el bloqueante en exceso y
se lavaron las microplacas. A continuación, se diluyeron
seriadamente muestras de suero murino en PBS-Tween
20 (al 0,05%) y se sembraron en una placa en un volumen de 100
\mul. Las muestras se incubaron durante la noche a 4ºC. La
fracción de anticuerpos IgG específicos de antígeno se detectaron
con un conjugado de IgG de oveja antirratón conjugado con peroxidasa
(Jackson Laboratories). Las placas se revelaron con el sustrato TMB
tal como se ha indicado anteriormente y se leyeron a doble longitud
de onda, 450 nm y 540 nm, en el lector de microplacas Multiskan MCC
340 Mkll. Se definió el título reactivo como la dilución a la que
la absorbancia de la muestra de ensayo es equivalente a la media más
tres desviaciones estándar de los valores de absorbancia del
control negativo. Se calcularon las medias geométricas e intervalos
de confianza al 95% y se compararon los grupos utilizando la prueba
t de Student.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo describe la determinación de
los perfiles de la subclase IgG específica de ovoalbúmina.
Los títulos de IgG, IgG1 e IgG2a específicos de
ovoalbúmina se midieron mediante EIA indirecta. En el ensayo de
IgG2a, se recubrieron microplacas de 96 pocillos Nunc Maxisorp
(Gibco/BRL) con una fracción de IgG anticuerpo policlonal de conejo
antiovoalbúmina (Cappell Laboratories) diluida en tampón carbonato
50 mM, pH 9,6, y se incubaron durante la noche a temperatura
ambiente. Se midieron las respuestas de IgG e IgG1 específicas de
ovoalbúmina en microplacas recubiertas directamente con ovoalbúmina
(Sigma) diluida hasta una concentración de 10 \mug/ml en tampón
carbonato 50 mM. Al día siguiente las microplacas se lavaron en
PBS-T y se bloquearon durante una hora a
temperatura ambiente con una solución de leche desnatada al 0,1% en
polvo diluida en PBS-T. Tras una etapa de lavado
adicional, se añadió una solución 10 \mug/ml de ovoalbúmina
(Sigma) diluida en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, al ensayo
específico de IgG2a. Este recubrimiento de antígeno se incubó
durante una hora a temperatura ambiente, seguido de una etapa de
lavado.
La etapa siguiente en el ensayo requirió la
adición de las muestras de suero murino. En el ensayo de IgG2a, las
muestras de suero se diluyeron seriadamente tres veces partiendo de
una dilución inicial de 1:40 y finalizando en una dilución de
1:87.480. Los ensayos de IgG e IgG1 se llevaron a cabo con muestras
de suero diluidas tres veces partiendo de una dilución inicial de
1:360 y finalizando en una dilución final de 1:787.320. Las muestras
de suero se diluyeron en PBS-T y se añadieron a los
pocillos de las microplacas en volúmenes de 100 \mul. Las placas
se incubaron durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, las placas se
lavaron y se detectaron las subclases de IgG específicas de
ovoalbúmina con conjugados de IgG de rata antirratón biotinilada
específicos para cada subclase de anticuerpo IgG (conjugado de
IgG2a derivado del clon R19-15 y obtenido de
Pharmingen, conjugado de IgG1 derivado del clon
LO-MGI-2 y obtenido de Serotec),
mientras que las respuestas de IgG se detectaron con una dilución
1:50.000 de una IgG de oveja antirratón marcada con peroxidasa
(específica de Fc\gamma, Jackson Laboratories). Los anticuerpos
monoclonales conjugados se diluyeron hasta una concentración de 2
\mug/ml y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente.
Tras el lavado, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa a
cada pocillo de las placas que contenían un conjugado biotinilado a
una concentración de 500 ng/ml. Las placas se incubaron durante una
hora a temperatura ambiente. Las IgG específicas de antígeno y
anticuerpos de subclase de IgG unidos se detectaron mediante la
adición del sustrato peroxidasa, TMB al 10% (ADI Diagnostics)
diluida al 0,005% en peróxido de hidrógeno (Fisher Scientific). Se
dejó que las reacciones continuasen durante un periodo de diez
minutos, momento en que se terminaron mediante la adición de ácido
sulfúrico 1 M (Fisher Scientific) a cada pocillo. Las microplacas se
leyeron en un lector de microplacas (Multiskan MCC 340 MkII, Flow
Laboratories) a doble longitud de onda, 450 nm y 540 nm. Se definió
el título reactivo como la última dilución a la que la absorbancia
de la muestra de ensayo era equivalente a la media más tres
desviaciones estándar de los valores de absorbancia del control
negativo. Se calcularon las medias geométricas en datos
transformados logarítmicamente y se expresaron con intervalos de
confianza al 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo describe los inmunoensayos
de IgE total.
Se evaluaron los niveles séricos de IgE total
mediante ETA indirecta. Se recubrieron placas inmunológicas Nunc
(Gibco/BRL) a temperatura ambiente durante la noche con un antisuero
policlonal IgE de oveja antirratón (Serotec) diluido en tampón
carbonato 50 mM, pH 9,6. Al día siguiente las placas se lavaron en
PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (J.T. Baker) y después se
bloquearon con aminoácidos de caseína al 0,1% (Difco) durante una
hora a temperatura ambiente. Tras lavar de las placas el exceso de
solución de bloqueo, las muestras de suero murino se diluyeron
seriadamente tres veces en el diluyente de ensayo y se sembraron en
las microplacas en volúmenes de 100 \mul por pocillo. Las
muestras se incubaron durante la noche a 4ºC. Para detectar los
anticuerpos IgE unidos, se añadió un anticuerpo monoclonal IgE de
rata antirratón biotinilado (Serotec) a cada pocillo a una
concentración de 2 \mug/ml y se incubó durante una hora a
temperatura ambiente. Tras el lavado, se añadió a cada pocillo
estreptavidina conjugada con peroxidasa (Dimension Laboratories). Se
evaluó la cantidad de IgE unida a los pocillos mediante la adición
del sustrato enzimático, tetrametilbenzidina (TMB) al 10% (ADI
Diagnostics) en agua con peróxido de hidrógeno al 0,005% (Fisher
Scientific). La reacción se detuvo tras diez minutos con ácido
sulfúrico 1 M (Fisher Scientific). Se midió la absorbancia de los
pocillos a 450 nm con una corrección de fondo a 540 nm en un lector
de microplacas Multiskan MCC 340 Mkll (Flow Laboratories). Se
cuantificaron los niveles séricos de IgE mediante calibración de las
absorbancias de la muestra frente a una curva estándar generada
mediante dilución seriada de proteína IgE de mieloma murino corrida
en cada placa. Se calcularon las medias geométricas e intervalos de
confianza al 95% para cada grupo de tratamiento y los grupos se
compararon utilizando la prueba t de Student y p<0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo describe la determinación de
inmunoglobulinas IgGF específicas de ovoalbúmina.
Se determinaron los títulos de IgE específicos
de ovoalbúmina en los sueros de ratones inmunizados, mediante la
utilización de una EIA indirecta de captura de antígenos.
Brevemente, se recubrieron microplacas Nunc Maxisorp (Gibco/BRL)
con una fracción de IgG de conejo antiovoalbúmina (Cappel
Laboratories). Las placas se incubaron durante la noche a
temperatura ambiente. Al día siguiente, tras el lavado en
PBS-T, las placas se bloquearon con una solución de
leche desnatada en polvo al 0,1% diluida en PBS-T
durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió
una solución de ovoalbúmina diluida hasta 10 \mug/ml en tampón
carbonato 50 mM, pH 9,6, en volúmenes de 100 \mul. Tras una
incubación de una hora a temperatura ambiente, la solución de
ovoalbúmina se lavó de las placas. A continuación, las muestras de
suero murino se diluyeron seriadamente tres veces en
PBS-T a una dilución inicial de 1:40 y una dilución
final de 1:87.480. Se añadieron muestras de 100 ml por pocillo y se
incubaron durante la noche a 4ºC. Tras el lavado al día siguiente,
se detectaron los anticuerpos IgE específicos de ovoalbúmina unidos
a las placas utilizando un anticuerpo monoclonal IgE de rata
antirratón biotinilado (Clon
LO-ME-2, Serotec) diluido hasta 2
\mug/ml en PBS-T. Tras una incubación adicional
de una hora a temperatura ambiente, dicho anticuerpo se desprendió
mediante lavado y se añadió a cada pocillo estreptavidina conjugada
con peroxidasa (Vector Laboratories) a una concentración de 500
ng/ml. Se detectó la cantidad de IgE específica de ovoalbúmina en
las muestras de suero murino mediante la adición del sustrato
peroxidasa, tetrametilbenzidina (TMB) al 10% (ADI Diagnostics) en
peróxido de hidrógeno al 0,005%. Se permitió que se desarrollase el
color en los pocillos durante quince minutos y se detuvieron las
reacciones mediante la adición de 100 \mul de ácido sulfúrico 1 M
(Fisher Scientific). Se midió la absorbancia de los pocillos en un
lector de microplacas (Multiskan MCC 340 MkII, Flow Laboratories) a
450 nm con una lectura a 540 nm para la corrección de fondo. Se
definieron los títulos reactivos como la última dilución a la que
el valor de absorbancia de la muestra de ensayo era equivalente a la
media de los valores de absorbancia de un control sérico negativo
más tres desviaciones estándar (134,139). Se calcularon las medias
geométricas en datos transformados logarítmicamente y se expresaron
con intervalos de confianza al 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo describe la determinación de
perfiles de citoquinas murinas.
Se determinaron los niveles de
IL-4 y de IFN-\gamma en una EIA en
sándwich. Brevemente, se recubrieron microplacas Nunc Maxisorp de
96 pocillos (Gibco/BRL) durante la noche a temperatura ambiente con
anticuerpos monoclonales de rata monoespecíficos de citoquina.
Estos anticuerpos se obtuvieron de Pharmingen y se derivaron de los
clones respectivos siguientes: IL-4, clon 11B11,
IL-5, IFN-\gamma, clon
R4-6A2. Los anticuerpos monoclonales se diluyeron
hasta una concentración de 2 \mug/ml en tampón carbonato 50 mM, pH
9,6. Al día siguiente las placas se lavaron en
PBS-Tween 20 al 0,05% (PBS-T) y se
bloquearon los sitios de unión no específica mediante la adición de
una solución de albúmina sérica bovina al 1% (Sigma) diluida en
PBS-T. Tras la incubación durante una hora a
temperatura ambiente, se lavó el bloqueo en exceso de las palcas y
se añadieron sobrenadantes de cultivo no diluidos a los pocillos
por duplicado. Se diluyeron los estándares recombinantes apropiados
para cada citoquina (IL-4 recombinante obtenido de
Pharmingen, IFN-\gamma recombinante adquirido de
Genzyme) hasta las concentraciones apropiadas (concentración
inicial: 100 ng/ml o 1.000 ng/ml para la EIA de
IL-10) y se diluyeron seriadamente tres veces en
RPM 1640 (Sigma) que contenía suero fetal bovino (FBS) al 10%. Los
estándares se sembraron en placas en volúmenes de 100 \mul/pocillo
y las microplacas se incubaron durante la noche a 4ºC. Tras un
lavado vigoroso en PBS-T, las citoquinas unidas se
detectaron utilizando un anticuerpo monoclonal biotinilado
específico para cada citoquina y diluido hasta una concentración de
2 \mug/ml en PBS-T. Los anticuerpos se obtuvieron
de Pharmingen y se derivaron a partir de los clones siguientes:
IL-4 clon BVD6-24G2,
IFN-\gamma, clon XMG1.2. Tras una etapa de
incubación de una hora a temperatura ambiente, se añadió una
preparación de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Vector
Laboratories) diluida hasta una concentración de 500 ng/ml. Se
llevó a cabo un lavado final seguido de una incubación de una hora a
temperatura ambiente de la preparación de estreptavidina. Las
placas se revelaron mediante la adición del sustrato, TMB al 10% en
peróxido de hidrógeno al 0,05% en agua (Fischer Scientific). Se dejó
que continuasen las reacciones hasta alcanzar una intensidad de
color adecuada y se detuvieron mediante la adición de 100
\mul/pocillo de una solución de ácido sulfúrico 1 M (Fisher
Scientific). Se leyeron las absorbancias de los pocillos de
reacción a doble longitud de onda (450 nm y 540 nm) en un lector de
microplacas Multiskan MCC 340 MkII (Flow Laboratories).
Se cuantificaron las concentraciones de
citoquinas en los sobrenadantes mediante calibración de las
absorbancias de las muestras frente a las absorbancias de los
estándares de concentraciones conocidas utilizando el algoritmo de
ajuste de curva logística con un coeficiente de correlación mínima
de 99,9%. Se utilizó ELISA+paquete de software (Meddata) para
cuantificar las cantidades de citoquinas presentes en los
sobrenadantes basándose en las curvas estándares generadas en cada
placa.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo describe las respuestas
inmunológicas celulares específicas de antígeno.
Se obtuvieron esplenocitos murinos el día 28 a
partir ratones BALB/c inmunizados con vacuna. Se disociaron los
bazos en una suspensión unicelular y se lavaron tres veces en un
medio RPMI 1640 (Sigma). Se llevó a cabo un recuento celular
utilizando el procedimiento de exclusión de azul tripán y las
células se ajustaron a una concentración de 2x10^{6} células/ml.
Los antígenos (toxoide pertussis, pertactina, FHA, aglutinógenos y
toxoides diftérico y tetánico no adsorbido con alumbre se diluyeron
hasta una concentración de 5 \mug/ml en medio RPMI 1640 que
contenía suero de feto bovino al 10%. A continuación, los antígenos
se diluyeron seriadamente dos veces hasta una concentración de 78
ng/ml. Se añadieron a continuación las células a cada pocillo hasta
una concentración final de 1x10^{5} células/pocillo. Los cultivos
se dejaron incubando a 37ºC en un incubador de 5% de CO_{2}
durante 72 horas. Al final de este periodo, se añadió a las células
un pulso de 0,5 \muCi/pocillo de timidina tritiada (Amersham)
diluidas en PBS estéril (Sigma). Tras una incubación adicional de 18
horas, las células se recolectaron sobre papel de filtro de fibra
de vidrio utilizando un recolector de 96 pocillos (Canberra
Packard) y se leyeron los pulsos radioactivos en un contador beta
Matrix 96 (Canberra Packard). Los resultado se expresaron como
índices de estimulación que se calcularon mediante división de las
medias de los recuentos de ensayo por las medias de los recuentos
de fondo en la placa. Se sometió a ensayo cada muestra por
triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo describe la capacidad de los
anticuerpos de neutralizar la toxina pertussis en el ensayo de
neutralización de células CHO.
La capacidad de los anticuerpos inducida por las
vacunas de pertussis de neutralizar la toxina pertussis se evaluó
en el ensayo de células CHO tal como describen Granstrom et
al. (ref. 47). Se definió el título de neutralización como la
última dilución de anticuerpo a la que no podían observarse efectos
morfológicos significativos. Los resultados se expresaron como
títulos de neutralización recíprocos.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo ilustra la utilización de
holotoxina pertussis genéticamente destoxificada para proporcionar
protección profiláctica frente al desarrollo de tumores.
De esta manera, se utilizó el modelo de melanoma
de ratón B16 (ref. 54) para evaluar la efectividad de K9G129 como
adyuvante en la inmunoterapia del cáncer. Se inyectaron
subcutáneamente células de melanoma B16 de cepa
B16-F1 singénica en ratones C57B1/6, aparecieron
tumores tras aproximadamente diez días y crecieron progresivamente
de manera exponencial. La aparición de tumores era directamente
proporcional a la dosis de células inyectada, por ejemplo los
tumores se formaron con mayor antelación al inyectar en los ratones
10^{6} células que al inyectar 10^{4} células. Se pudo retrasar
la formación de tumores mediante la inmunización de los ratones con
células de melanoma B16 que habían sido previamente irradiadas con
10.000 rads. Este retraso también era dependiente de la dosis. La
inmunización con 10^{6} células irradiadas causó un mayor retraso
de la aparición de tumores que la inmunización con 10^{5} células
irradiadas, al retar posteriormente los ratones con 10^{5}
células vivas. La inmunización con 10^{4} células irradiadas no
causó ningún retraso significativo del crecimiento tumoral.
La efectividad de K9G129 como adyuvante se
sometió a ensayo mediante la medición de la capacidad de retrasar
el crecimiento tumoral al combinarlo con 10^{4} células irradiadas
en un experimento de inmunización. Se inmunizaron seis grupos de
ratones con cinco ratones por grupo con:
- 1)
- medio de cultivo celular (control)
- 2)
- 10^{4} células irradiadas
- 3)
- 10^{4} células irradiadas + 1 \mug de K9G129
- 4)
- 10^{4} células irradiadas + 5 \mug de K9G129
- 5)
- 10^{4} células irradiadas + 10 \mug de K9G129
- 6)
- 10^{4} células irradiadas + CFA (adyuvante completo de Freund).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones recibieron un refuerzo de la misma
manera dos semanas después y posteriormente, dos semanas después
del refuerzo, se retaron con 10^{5} células de melanoma B16 vivas.
Se realizó un seguimiento de la aparición de tumores y se midió el
tamaño de los tumores en crecimiento con un calibrador, registrando
tanto la longitud como la anchura. Se calculó el volumen de los
tumores mediante la aplicación de estas mediciones a la fórmula de
un elipsoide.
K9G129 resultó efectivo de una manera
dependiente de la dosis en el retraso de la aparición de crecimiento
tumoral. Treinta días después del reto con 10^{5} células de
melanoma vivas, no había ratones sin tumores en los grupos que no
habían recibido inmunización (grupo 1), que habían recibido
únicamente células irradiadas (grupo 2) o que habían recibido
células irradiadas con CFA (grupo 6). Tampoco había ratones libres
de tumores en el grupo que había recibido células irradiadas con 1
\mug de K9G129 (grupo 3). Sin embargo, había dos y cuatro
ratones, respectivamente, que no presentaban tumores, de los grupos
que habían recibido células irradiadas con 5 \mug y 10 \mug de
K9G129 (grupos 4 y 5) (fig. 7). Estos resultados demuestran que se
produce un gran retraso en la aparición de tumores mediada por las
dos concentraciones más altas de K9G129.
Incluso la concentración más baja de K9G129
utilizada causó un retraso de la aparición de tumores. En cuatro de
cinco ratones del grupo 3 (células irradiadas + 1 \mug de K9G129)
se inició la aparición de tumores después de que se iniciase el
crecimiento de tumores en los ratones que habían sido inmunizados
únicamente con células irradiadas (grupo 2) (fig. 8). La
efectividad de K9G129 en el retraso del crecimiento tumoral resulta
demostrada adicionalmente por la comparación de los volúmenes
tumorales de ratones individuales entre los diversos grupos, 22
días después del reto con células de melanoma vivas. Los tumores
eran no existentes o sus tamaños eran generalmente menores en los
ratones que habían sido inmunizados con células irradiadas y K9G129
que en ratones inmunizados con células irradiadas únicamente o
conjuntamente con CFA (fig. 9).
Estos resultados indican que K9G129 puede actuar
como adyuvante en la inmunoterapia del cáncer, incrementando la
respuesta inmunológica contra las células tumorales.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente Ejemplo describe la generación de
una respuesta de Th1 frente a un inmunógeno con adición como
adyuvante de análogo de S1 de toxina pertussis (K9G129).
Uno de los factores clave implicados en la
potenciación de las diferentes subclases de inmunoglobulina,
incluyendo IgE, es la presencia de mediadores solubles conocidos
como citoquinas. El control de la producción de IgE se encuentra
regulado por una diversidad de citoquinas que no sólo presentan
funciones efectoras directas, tales como la inducción de cambios de
isotipo de inmunoglobulina, sino que también actúan regulando
cruzadamente la producción de las demás citoquinas. En el ratón,
IL-4 actúa no sólo induciendo cambios de isotipo de
IgE y de IgG1, sino que también actúa inhibiendo la secreción de
IgM, IgG3, IgG2b e IgG2a (ref. 48). Por otra parte,
IFN-\gamma actúa estimulando la producción de
IgG2a e IgG3, inhibiendo simultáneamente la síntesis de IgG1, IgG2b
e IgE (ref. 48).
En un esfuerzo por organizar y racionalizar los
múltiples efectos de regulación cruzada de las citoquinas, se ha
descrito un sistema para describir los diversos patrones de
secreción de citoquinas (ref. 49). Mossmann y Coffman (ref. 49) han
definido dos subgrupos diferentes de células T CD4^{+} murinos
basándose en sus patrones diferenciales de secreción de citoquinas.
Utilizando clones de células T de largo plazo, pudieron mostrar que
un grupo de células, definido como Th2, secretaba
IL-4, IL-5 e IL-10,
mientras que otro grupo de células, definido como Th1, secretaba
IL-1, IFN-\gamma y
TNF-\beta. Estos dos perfiles de citoquinas
diferentes también se correlacionaron con la producción de
inmunoglobulinas en el aspecto de que los clones de Th1
proporcionan asistencia a los linfocitos B en la producción de
IgG2a, mientras que los clones Th2 estimulan la secreción de IgG1 e
IgE por parte de las células B (48, 50, 51). Un trabajo posterior
por Romagnani y colaboradores demostró la existencia de estos
subgrupos de células T en seres humanos también (ref. 52).
Aunque la diferenciación inicial de los perfiles
de citoquinas Th1/Th2 se definió basándose en los patrones de
citoquinas in vitro de los clones individuales de células T,
las definiciones se han extendido para describir los fenotipos
resultantes de la inmunización o la infección (refs. 48, 53). Estos
fenotipos no son tan francamente polares como los observados en el
análisis clonal original y se encuentran definidos por una
diversidad de citoquinas diferentes. De esta manera, una respuesta
fenotípica Th1 se caracteriza por un incremento significativo de
las citoquinas de tipo Th1 (proporciones
IFN-\gamma:IL-4 más altas)
respecto a los fenotipos de respuesta inmunológica Th2. Esta
clasificación también se extiende a los perfiles de subclases de
inmunoglobulina específicos de antígeno en los que los fenotipos
Th1 presentan proporciones IgG2a:IgE más altas que las respuestas
de tipo Th2.
La figura 5 muestra el perfil de citoquinas en
ratones inmunizados con ovoalbúmina y con adyuvante PPD y PT
(K9G129). PPD es un adyuvante que produce una respuesta inmunológica
Th1.
Se obtuvieron esplenocitos de ratones
inmunizados con ovoalbúmina conjuntamente con S1 de rPT (K9G129) o
PPD como adyuvantes. Las células de bazo de cuatro ratones en cada
grupo de tratamiento se agruparon y se estimularon nuevamente in
vitro con ovoalbúmina sola (sin adyuvante). A continuación, se
recolectaron los sobrenadantes de estos cultivos y se determinaron
mediante EIA los niveles de IFN-\gamma e
IL-4. Se obtuvieron proporciones
IFN-\gamma:IL-4 similares a partir
de cultivos derivados de ratones inmunizados con S1(K9G129) o
PPD como adyuvante. Tal como se ha indicado anteriormente, una
proporción de citoquinas
IFN-\gamma:IL-4 más alta es
característica de una respuesta inmunológica Th1.
La figura 6 muestra las respuestas de IgG2a e
IgE específicas de ovoalbúmina de ratones BALB/c inmunizados con
ovoalbúmina y análogo de S1(K9G129) de PT o PPD como
adyuvantes. El gráfico de columnas indica que la inmunización con
el análogo de S1(K9G129) de PT resultó en proporciones
IgG2a:IgE específicas de ovoalbúmina similares a las obtenidas tras
la inmunización con PPD. Tal como se ha indicado anteriormente, una
proporción IgG2a:IgE elevada es característica de una respuesta
inmunológica Th1. Los resultados en las figuras 5 y 6 indican, de
esta manera, que la adición de adyuvante PT(K9G129) produce
una respuesta inmunológica Th1 en ratones.
Como sumario de la presente exposición, la
presente invención proporciona nuevas composiciones y preparaciones
inmunogénicas en las que se utiliza una holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada que también puede ser inmunogénica,
como adyuvante proteínico en lugar de adyuvantes extrínsecos
convencionales, particularmente alumbre, para conseguir una
respuesta inmunológica modulada frente a un antígeno asociado al
cáncer sin los efectos secundarios adversos del alumbre.
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Claims (30)
1. Preparación inmunogénica que comprende los
componentes siguientes para la administración simultánea, separada
o secuencial:
- (i)
- por lo menos un antígeno asociado al cáncer; y
- (ii)
- una holotoxina pertussis genéticamente destoxificada en la que por lo menos uno de entre Arg^{9}, Arg^{13}, Trp^{26}, Arg^{58} y Glu^{129} de la subunidad S1 de la holotoxina ha sido eliminado o sustituido, para proporcionar una respuesta inmunológica con adyuvante contra dicho antígeno o antígenos asociados a cáncer coadministrado con dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada por la misma vía, permitiendo dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada la adición de adyuvante en ausencia de un adyuvante extrínseco, para la provisión de dicha respuesta inmunológica con adyuvante.
2. Preparación inmunogénica según la
reivindicación 1, en la que dicho antígeno asociado al cáncer es un
antígeno asociado a melanoma, cáncer de vejiga, pulmón, cervical o
prostático.
3. Preparación inmunogénica según la
reivindicación 1 ó 2, en la que las células tumorales inactivadas o
la fracción membranal de las mismas proporcionan dicho antígeno
asociado al cáncer.
4. Preparación inmunogénica según la
reivindicación 3, en la que dichas células tumorales se inactivan
mediante irradiación.
5. Preparación inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en la que dicha holotoxina
pertussis genéticamente destoxificada es inmunoprotectora.
6. Preparación inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en la que se eliminan y sustituyen
múltiples aminoácidos en dicha holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada.
7. Preparación inmunogénica según la
reivindicación 6, en la que dichos múltiples aminoácidos son (S1)
ARG^{9}, GLU^{129}.
8. Preparación inmunogénica según la
reivindicación 7, en la que dichos múltiples aminoácidos son (S1)
ARG^{9} sustituido por LYS^{9} y GLU^{129} por
GLY^{129}.
9. Preparación inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en la que dicha respuesta
inmunológica se selecciona de entre una respuesta humoral, una
respuesta celular y una respuesta tanto humoral como celular.
10. Preparación inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en la que dicha respuesta
inmunológica modulada se selecciona de entre una respuesta de IgG
aumenta, una respuesta celular y tanto una respuesta de IgG
aumentada como celular.
11. Composición que comprende:
- (i)
- por lo menos un antígeno asociado al cáncer; y, para la administración por la misma vía,
- (ii)
- una holotoxina pertussis genéticamente destoxificada en la que por lo menos uno de entre Arg^{9}, Arg^{13}, Trp^{26}, Arg^{58} y Glu^{129} de la subunidad S1 de la holotoxina ha sido eliminado o sustituido, para la utilización como un producto farmacéutico para proporcionar una respuesta inmunológica con adyuvante a dicho por lo menos un antígeno asociado al cáncer, presentando dicha holotoxina pertussis genéticamente destoxificada capacidad de adyuvante en ausencia de un adyuvante extrínseco, para proporcionar dicha respuesta inmunológica con adyuvante.
12. Composición según la reivindicación 11, en
la que dicho antígeno asociado al cáncer es un antígeno asociado a
melanoma, cáncer de vejiga, pulmón, cervical o prostático.
13. Composición según la reivindicación 11 ó 12,
en la que las células tumorales inactivadas o una fracción
membranal de las mismas proporcionan dicho antígeno asociado al
cáncer.
14. Composición según la reivindicación 13, en
la que dichas células tumorales se inactivan mediante
irradiación.
15. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en la que dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada es inmunoprotectora.
16. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, en la que se eliminan o sustituyen
múltiples aminoácidos en dicha holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada.
17. Composición según la reivindicación 16, en
la que dichos múltiples aminoácidos son (S1) ARG^{9},
GLU^{129}.
18. Composición según la reivindicación 17, en
la que dichos múltiples aminoácidos son (S1)ARG^{9}
sustituido por LYS^{9} y GLU^{129} por GLY^{129}.
19. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 18, en la que dicha respuesta inmunológica se
selecciona de entre una respuesta humoral, una respuesta celular y
una respuesta tanto humoral como celular.
20. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 19, en la que dicha respuesta inmunológica
modulada se selecciona de entre una respuesta de IgG aumentada, una
respuesta celular y una respuesta tanto de IgG aumentada como
celular.
21. Utilización de una holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada en la que se ha eliminado o sustituido
por lo menos uno de entre Arg^{9}, Arg^{13}, Trp^{26},
Arg^{58} y Glu^{129} de la subunidad S1 de la holotoxina, para
la preparación de un medicamento que comprende dicha holotoxina
pertussis genéticamente destoxificada, para proporcionar una
respuesta inmunológica con adyuvante a por lo menos un antígeno
asociado al cáncer coadministrado con dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada por la misma vía, presentando dicha
holotoxina pertussis genéticamente destoxificada capacidad adyuvante
para proporcionar dicha respuesta inmunológica con adyuvante, en
ausencia de un adyuvante extrínseco.
22. Utilización según la reivindicación 21, en
la que dicho antígeno asociado al cáncer es un antígeno asociado a
melanoma, cáncer de vejiga, pulmón, cervical o prostático.
23. Utilización según la reivindicación 21 ó 22,
en la que células tumorales inactivadas o la fracción membranal de
las mismas proporcionan dicho antígeno asociado al cáncer.
24. Utilización según la reivindicación 23, en
la que dichas células tumorales se inactivan mediante
irradiación.
25. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 24, en la que dicha holotoxina pertussis
genéticamente destoxificada es inmunoprotectora.
26. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, en la que se eliminan y sustituyen
múltiples aminoácidos en dicha holotoxina pertussis genéticamente
destoxificada.
27. Utilización según la reivindicación 26, en
la que dichos múltiples aminoácidos son (S1)ARG^{9},
GLU^{129}.
28. Utilización según la reivindicación 27, en
la que dichos múltiples aminoácidos son (S1)ARG^{9}
sustituido por LYS^{9} y GLU^{129} por GLY^{129}.
29. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 28, en la que dicha respuesta inmunológica se
selecciona de entre una respuesta humoral, una respuesta celular y
una respuesta tanto humoral como celular.
30. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 29, en la que dicha respuesta inmunológica
modulada se selecciona de entre una respuesta de IgG aumentada, una
respuesta celular y una respuesta tanto de IgG aumentada como
celular.
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