ES2327496T3 - Cepas bacterianas formadoras de hipervesiculas y su uso para la produccion de vacunas. - Google Patents

Abstract

Una bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas que se ha modificado genéticamente por reducción de la expresión de uno o más genes Tol.

Description

Cepas bacterianas formadoras de hipervesículas y su uso para la producción de vacunas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las composiciones de vacunas de bacterias Gram negativas, a su fabricación y al uso de dichas composiciones en medicina. Más en particular, se refiere al campo de nuevas cepas bacterianas Gram negativas diseñadas que tienen mejores propiedades de liberación de vesículas de la membrana externa, y a composiciones de vacunas que comprenden estas vesículas.

Antecedentes de la invención

Las bacterias Gram negativas están separadas del medio exterior por dos capas sucesivas de estructuras de membrana. Estas estructuras, denominadas la membrana citoplasmática y la membrana externa (OM), difieren tanto estructural como funcionalmente. La membrana externa tiene una función importante en la interacción de las bacterias patógenas con sus respectivos huéspedes. Por consiguiente, las moléculas bacterianas expuestas en la superficie representan objetivos importantes para la respuesta inmunitaria del huésped, haciendo que los componentes de la membrana externa sean candidatos atractivos para proporcionar vacunas, reactivos de diagnóstico y terapéuticos.

Las vacunas bacterianas de células enteras (muertas o atenuadas) tienen la ventaja de suministrar múltiples antígenos en su microentorno natural. Las desventajas de este procedimiento son los efectos secundarios inducidos por componentes bacterianos tales como endotoxinas y fragmentos de péptidoglucanos. Por otra parte, las vacunas de subunidades acelulares que contienen componentes purificados de la membrana externa pueden proporcionar una protección solo limitada y no pueden presentar los antígenos de forma adecuada al sistema inmunitario del
huésped.

Proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos son los 3 constituyentes principales que se encuentran en la membrana externa de todas las bacterias Gram negativas. Estas moléculas están distribuidas de forma asimétrica: fosfolípidos de la membrana (principalmente en la parte interna), lipooligosacáridos (exclusivamente en la parte externa) y proteínas (lipoproteínas en la parte interna y externa, proteínas de membrana integrales o politópicas). Para muchos patógenos bacterianos que afectan a la salud humana, se ha mostrado que los lipopolisacáridos y las proteínas de la membrana externa son inmunógenas y factibles para conferir protección contra la correspondiente enfermedad mediante inmunización.

Sturgis y col. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3:113) describen el contexto genómico y la distribución filogenética del grupo de genes tol-pal, y sugieren que tiene una función importante en el mantenimiento de la envuelta celular.

Bernadac y col. (1998, Journal of Bacteriology vol 180(18):4872) describen que cepas de E. coli con mutaciones en cada uno de los genes tol-pal, forman vesículas en la membrana externa.

La OM de las bacterias Gram negativas es dinámica, y dependiendo de las condiciones del entorno puede sufrir drásticas transformaciones morfológicas. Entre estas manifestaciones, se ha estudiado la formación de vesículas o "vesículas" en la membrana externa y se ha estudiado y documentado en muchas bacterias Gram negativas (Zhou, L y col. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228). Entre estas, una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos que se ha publicado que producen vesículas incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosaand Yersinia enterocolitica. Aunque el mecanismo bioquímico responsable de la producción de las vesículas de la OM no se entiende completamente, estas vesículas de la membrana externa se han estudiado ampliamente ya que representan una metodología poderosa con el fin de aislar preparaciones de proteínas de la membrana externa en su conformación nativa. En este contexto, el uso de preparaciones de la membrana externa tiene un interés particular para desarrollar vacunas contra Neisseria, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa y Chlamydia. Además, las vesículas de la membrana externa combinan múltiples antígenos proteínicos y no proteínicos que es probable que confieren una protección extendida contra variantes entre especies.

Los ejemplos de especies bacterianas con las que se pueden hacer vacunas de vesículas son las siguientes:

Neisseria meningitidis

Neisseria meningitidis (meningococos) es una bacteria Gram negativa aislada con frecuencia del tracto respiratorio superior humano. A veces produce enfermedades bacterianas invasivas tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de la enfermedad meningocócica muestra diferencias estacionales y anuales geográficas (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). La mayoría de las enfermedades en países templados se deben a cepas del serogrupo B y varían en incidencia de 1-10/100.000/población total al año, alcanzando a veces valores mayores (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz. C, Pavez, G., Aguilar, E., y col. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990). Las incidencias específicas de la edad en los dos grupos de riesgo mayor, los niños y adolescentes, alcanzan niveles mayores.

La epidemia dominada por el serogrupo A de meningococos ocurre principalmente en África central, alcanzando a veces niveles de hasta 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V., Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). En conjunto, casi todos los casos de enfermedades meningocócicas son causadas por los serogrupos de meningococos A, B, C, W-135 e Y. Se encuentra disponible una vacuna de polisacárido capsular tetravalente de A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C, J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982).

Actualmente, las vacunas de polisacáridos se están mejorando mediante la conjugación química de estos con proteínas vehículo (Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K., y col. JAMA 275: 1499-1503, 1996). No hay disponible una vacuna del serogrupo B, puesto que el polisacárido capsular B no es inmunogénico, lo más probable porque comparte similitud estructural con los componentes del huésped (Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L. y col., J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M., Makela, P.M. Lancet ii.: 355-357, 1983).

Durante muchos años, los esfuerzos se han centrado en desarrollar vacunas basadas en la membrana externa meningocócica (de Moraes, J.C., Perkins, B., Camargo, M.C. y col. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E.A. Gronnesby, J.K. y col. 338: 1093-1096, 1991). Dichas vacunas han demostrado eficacias de 57%-85% en niños más mayores (>4 años) y adolescentes. La mayoría de estos ensayos de eficacia se llevaron a cabo con vacunas de OMV (vesículas de la membrana externa, obtenidas por reducción drástica de las vesículas) obtenidas de cepas salvajes de N. meningitidis B.

El serogrupo B de N. meningitidis (menB) excreta vesículas de la membrana externa en cantidades que permiten su preparación a una escala industrial. Se ha encontrado que dichas vacunas de proteínas de la membrana externa multicomponentes de cepas de menB naturales, son eficaces para proteger a los adolescentes frente a la enfermedad por menB, y se han registrado en Latinoamérica. Un procedimiento alternativo para preparar vesículas de la membrana externa es por el procedimiento de extracción con detergente de las células bacterianas (documento EP 11243).

En estas vacunas, hay presentes muchos componentes de la membrana externa bacteriana, tales como PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB y la contribución de estos componentes a la protección observada todavía necesita una definición adicional. Se han definido otros componentes de la membrana externa bacteriana (usando anticuerpos animales o humanos) como que son potencialmente importantes para la inducción de la inmunidad protectora, tales como TbpB, NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B.R., J. Exp. Med. 185: 1173-1183, 1997; Lissolo, L, Maître-Wilmotte, C, Dumas, p. y col., Inf. Immun. 63: 884-890, 1995). El mecanismo de inmunidad protectora implicará la actividad bactericida mediada por anticuerpo y opsonofagocitosis.

Moraxella catarrhalis

Moraxella catarrhalis (también llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram negativa aislada con frecuencia del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo las principales la otitis media en bebés y niños, y la neumonía en ancianos. También es responsable de la sinusitis, infecciones nosocomiales, y con menos frecuencia, de enfermedades invasivas.

Se han identificado anticuerpos bactericidas en la mayoría de los adultos ensayados (Chapman, A.J. y col. (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad de resistir la actividad bactericida del suero: (Hol, C. y col. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, K.L. y col. (1990), Am. J. Med. 88 (suppl. 5A):28S). Por lo tanto, la resistencia del suero podría considerarse como un factor virulento de las bacterias. Se ha observado una actividad de opsonización en los sueros de niños que se recuperan de la otitis media.

No se han identificado los antígenos dirigidos por estas diferentes respuestas inmunitarias en seres humanos, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa, cuya expresión es regulada por el hierro, y que es reconocida por los sueros de los pacientes con neumonía (Sethi, S, y col. (1995) Infect. Immun. 63:1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col. (1999), Infect. Immun. 67:1310).

Se han caracterizado algunas proteínas de membrana más en la superficie de M. catarrhalis usando procedimientos bioquímicos por su potencial implicación en la inducción de una inmunidad protectora (para una revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos contra algunos de ellos (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está muy conservado entre las cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que se ha demostrado que es eficaz contra esta bacteria en modelos animales.

M. catarrhalis produce vesículas en la membrana exterior (vesículas). Estas vesículas se han aislado o extraído usando diferentes procedimientos. Entre estos procedimientos, se conocen bien la extracción con detergente (Bartos L.C. y Murphy T.M. 1988. J. Infect. Dis. 158: 761-765; Murphy T.M. y Loeb M.R. 1989 Microbial Pathog. 6:159-174; Unhanand M., Maciver I., Ramilo O., Arencibia-Mireles O., Argyle J.C, McCrackenG.H., Hansen E.J. 1992. J. Infect. Dis. 165:644-650; Maciverl., Unhanand M., McCracken G.H. y Hansen E.J. 1993. J. Infect. Dis. 168: 469-472) o la producción de células fantasma (Lubitz W., y col. 1999. J. Biotechnol. 73:261-273; Eko F.O., y col. 1999. Vaccine 17: 1643-1649). La capacidad protectora de dichas preparaciones de vesículas se ha ensayado en un modelo murino de eliminación pulmonar de M. catarrhalis. Se ha mostrado que la inmunización activa con vacuna de vesículas o transferencia pasiva de anticuerpos anti-vesículas, induce una protección significativa en este modelo (Maciver I., Unhanand M., McCracken G.H. Jr., Hansen, E.J. 1993. J. Infect. Dis. 168: 469-472).

Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae es una bacteria Gram negativa inmóvil. Su único huésped natural es el hombre. Los aislados de H. influenzae normalmente se clasifican según su cápsula de polisacáridos. Se han identificado 6 tipos capsulares diferentes denominados de "a" a "f". Los aislados que no pueden aglutinarse con antisuero contra uno de estos 6 serotipos se clasifican como no tipificables, y no expresan una cápsula.

H. influenzae de tipo b (Hib) es claramente diferente de los otros tipos en cuanto que es una causa principal de meningitis bacteriana y enfermedades sistémicas. Las cepas no tipificables de H. influenzae (NTHi) se aíslan solo a veces de sangre de pacientes con enfermedad sistémica. Las NTHi son una causa común de neumonía, exacerbación de la bronquitis crónica, sinusitis y otitis media. Las cepas de NTHi demuestran una gran variabilidad cuando se identifican por análisis clonal, mientras que las cepas Hib en conjunto son más homogéneas.

Se ha demostrado que diferentes proteínas de H. influenzae están implicadas en la patogénesis o se ha demostrado que confieren protección tras la vacunación en modelos animales.

Se ha descrito la adherencia de NTHi a células epiteliales nasofaríngeas humanas (Read RC. y col. 1991. J. Infect. Dis. 163:549). A parte de fimbrias y pilis (Brinton CC. y col. 1989. Pediatr. Infect. Dis. J. 8:S54; Kar S. y col. 1990. Infect. Immun. 58:903; Gildorf JR. y col. 1992. Infect. Immun. 60:374; St. Geme JW y col. 1991. Infect. Immun. 59:3366; St. Geme JW y col. 1993. Infect. Immun. 61: 2233), se han identificado muchas adhesinas en las NTHi. Entre ellas, se ha mostrado que dos proteínas de alto peso molecular expuestas en la superficie, denominadas HMW1 y HMW2, median la adhesión de NTHi a las células epiteliales (St. Geme JW. y col. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2875). Se ha identificado otra familia de proteínas de alto peso molecular en las cepas de NTHi que carecen de proteínas que pertenecen a la familia HMW1/HMW2. La proteína Hia de 115 kDa de NTHi (Barenkamp SJ., St Geme S.W. 1996. Mol. Microbiol. Pendiente de publicación) es muy similar a la adhesina Hsf expresada por las cepas de tipo b de H. influenzae (St. Geme JW. y coll. 1996. J. Bact. 178:6281). Otra proteína, la proteína Hap presenta similitudes con las serina proteasas IgA1 y se ha mostrado que está implicada tanto en la adhesión como en la entrada celular (St. Geme JW. y col. 1994. Mol. Microbiol. 14:217).

Se han identificado 5 proteínas de membrana exterior (OMP) principales y se han nombrado numéricamente. Los estudios originales usando cepas de tipo b de H. influenzae mostraron que los anticuerpos específicos para las OMP P1 y P2 protegían ratas bebés de la posterior estimulación (Loeb MR. y col. 1987. Infect. Immun. 55:2612; Musson RS. Jr. y col. 1983. J. Clin. Invest. 72:677). Se encontró que P2 podía inducir anticuerpos bactericidas y opsónicos, que se dirigen contra las regiones variables presentes en estructuras de bucle expuestas en la superficie de esta OMP integral (Haase EM. y col. 1994 Infect. Immun. 62:3712; Troelstra A. y col. 1994 Infect. Immun. 62:779). La lipoproteína P4 también puede inducir anticuerpos bacterianos (Green BA. y col. 1991. Infect. Immun. 59:3191).

La OMP P6 es una lipoproteína conservada asociada a péptidoglucano que compone hasta 1-5% de la membrana externa (Nelson MB. y col. 1991. Infect. Immun. 59:2658). Más tarde, se reconoció una lipoproteína de aproximadamente el mismo peso molecular llamada PCP (proteína de reactividad cruzada P6) (Deich RM. y col. 1990. Infect. Immun. 58:3388). Una mezcla de las lipoproteínas conservadas P4, P6 y PCP no puso de manifiesto protección cuando se midió en un modelo de otitis media de chinchilla (Green BA. y col. 1993. Infect. immun. 61:1950). Parece que P6 sola induce protección en el modelo de chinchilla (Demaria TF. y col. 1996. Infect. Immun. 64:5187).

También se ha descrito una proteína fimbrina (Miyamoto N., Bakaletz, LO. 1996. Microb. Pathog. 21:343) con homología con OMP P5, la cual tiene homología de secuencia con OmpA integral de Escherichia coli (Miyamoto N., Bakaletz, LO. 1996. Microb. Pathog. 21:343; Munson RS. Jr. y col. 1993. Infect. Immun. 61:1017). Parece que NTHi se adhiere al moco mediante las fimbrias.

En línea con las observaciones hechas con gonococos y meningococos, NTHi expresa un receptor de transferrina humana doble compuesto de TbpA y TbpB, cuando se hace crecer con limitación de hierro. El anticuerpo anti-TbpB protegía a las ratas bebés (Loos-more SM. y col. 1996. Mol. Microbiol. 19:575). También se ha descrito un receptor de hemoglobina/haptoglobina para NTHi (Maciver I. y col. 1996. Infect. Immun. 64:3703). También se ha identificado un receptor de Hemo:Hemopexina (Cope LD. y col. 1994. Mol. Microbiol. 13:868). También hay un receptor de lactoferrina presente entre las NTHi, pero todavía no se ha caracterizado (Schry-vers AB. y col. 1989. J. Med. Microbiol. 29:121). No se ha descrito una proteína similar a la proteína FrpB de Neisseira entre las NTHi.

Una OMP de 80 kDa, el antígeno de superficie D 15, proporciona protección contra la NTHi en un modelo de estimulación de ratón (Flack FS. y col. 1995. Gene 156:97). Una lipoproteína de membrana externa de 42 kDa, LPD se conserva entre Haemophilus influenzae e induce anticuerpos bacterianos (Akkoyunlu M. y col. 1996. Infect. Immun. 64:4586). Se encontró que una OMP minoritaria de 98 kDa (Kimura A. y col. 1985. Infect. Immun. 47:253), era un antígeno protector, esta OMP puede ser bien una de las OMP inducible con limitación de Fe o adhesinas de peso molecular alto que se han caracterizado después. H. Influenzae produce actividad de proteasa lgA1 (Mulks MH., Shoberg RJ. 1994. Meth. Enzymol. 235:543). La proteasa IgA1 de NTHi tiene un grado alto de variabilidad antígena (Lomholt H., van Alphen L, Kilian, M. 1993. Infect. Immun. 61:4575).

Se ha mostrado que otra OMP de NTHi, OMP26, una proteína de 26 kDa potencia la depuración pulmonar en un modelo de rata (Kyd, J.M., Cripps, A.W. 1998. Infect. Immun. 66:2272). También se ha mostrado que la proteína HtrA de NTHi es un antígeno protector. Realmente, esta proteína protegía a la chinchilla frente a la otitis media y protegía a los bebés de rata frente a la bacteriemia de tipo b de H. influenzae (Loosmore S.M. y col. 1998. Infect. Immun.
66:899).

Se han aislado vesículas (o vesículas) de la membrana externa de H. influenzae (Loeb M.R., Zachary A.L., Smith D.H. 1981. J. Bacteriol. 145:569-604; Stull T.L., Mack K., Haas J.E., Smit J., Smith A.L. 1985. Anal. Biochem. 150: 471-480), que tenían la producción de células fantasma (Lubitz W., y col. 1999. J. Biotechnol. 73: 261-273; Eko F.O., y col. 1999. Vaccine 17:1643-1649). Las vesículas se han asociado con la inducción de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (Wi-wpelwey B., Hansen E.J., Scheld W.M. 1989 Infect. Immun. 57: 2559-2560), la inducción de inflamación meníngea (Mustafa M.M., Ramilo O., Syrogiannopoulos G.A., Olsen K.D., McCraken G.H. Jr., Hansen, E.J. 1989. J. Infect. Dis. 159: 917-922) y la absorción de ADN (Concino M.F., Goodgal S.H. 1982 J. Bacteriol. 152: 441-450). Estas vesículas pueden unirse y ser absorbidas por el epitelio de la mucosa nasal (HaradaT., ShimuzuT., Nishimoto K., Sakakura Y. 1989. Acta Otorhinolarygol. 246:218-221) mostrando que las adhesinas y/o los factores de colonización podían estar presentes en las vesículas. Se ha observado la respuesta inmunitaria a proteínas en vesículas de la membrana exterior en pacientes con diferentes enfermedades por H. influenzae (Sakakura Y., Harada T., Hamaguchi Y., Jin C.S. 1988. Acta Otorhinolarygol. Suppl. (Stockh.) 454: 222-226; Harada T., Sakakura Y., Miyoshi Y. 1986. Rhinology 24: 61-66).

Pseudomonas aeruginosa

El género Pseudomonas consta de bacilos Gram negativos rectos y ligeramente curvados, con flagelos polares, que crecen aeróbicamente y no forman esporas. Debido a sus requisitos metabólicos limitados, la especie Pseudomonas es ubicua y está ampliamente distribuida en el suelo, el aire, aguas residuales y en las plantas. Numerosas especies de Pseudomonas tales como P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei, P. maltophilia y P. cepacia también han demostrado ser patógenos para los seres humanos. Entre esta lista, P. aeruginosa se considera un patógeno humano importante puesto que está asociado con la infección oportunista del huésped inmunocomprometido y es responsable de una alta morbosidad en pacientes hospitalizados. Las infecciones nosocomiales con P. aeruginosa afectan principalmente a pacientes sometidos a tratamientos prolongados y que reciben agentes inmunosupresores, corticoesteroides, antibióticos antimetabolitos o radiación.

Las Pseudomonas y en particular P. aeruginosa, producen una variedad de toxinas (tales como hemolisinas, fibrinolisinas, esterasas, coagulasas, fosfolipasas, endo y exotoxinas) que contribuyen a la patogenicidad de estas bacterias. Además, estos organismos tienen una alta resistencia intrínseca a los antibióticos debido a la presencia de bombas de eflujo de múltiples fármacos. Esta última característica complica a menudo el resultado de la enfermedad.

Debido al uso incontrolado de los productos quimioterapéuticos antibacterianos, ha aumentado considerablemente la frecuencia de la infección nosocomial por P. aeruginosa a lo largo de los últimos 30 años. En EE.UU., por ejemplo, la carga económica de la infección nosocomial por P. aeruginosa se calcula que es 4,5 mil millones de dólares anuales. Por lo tanto, es muy necesario el desarrollo de una vacuna para la inmunización activa o pasiva contra P. aeruginosa (para una revisión véase Stanislavsky y col. 1997. FEMS Microbiol. Lett. 21:243-277).

Diferentes antígenos secretados y asociados a células de P. aeruginosa han sido objeto del desarrollo de vacunas. Entre los antígenos de Pseudomonas, se encontró que la sustancia mucoide, que es un limo extracelular que consiste predominantemente en alginato, era heterogénea en términos de tamaño e inmunogenicidad. Los componentes del alginato de masa molecular alta (30-300 kDa) parece que contienen epítopos conservados mientras que los componentes del alginato de masa molecular menor (10-30 kDa) tienen epítopos conservados además de epítopos únicos. También se ha mostrado que entre las proteínas asociadas a la superficie, PrcV, que es parte del aparato de secreción-translocación de tipo III, también es un objetivo interesante para la vacunación (Sawa y col. 1999. Nature Medicine 5:392-398).

Los antígenos expuestos en la superficie, incluyendo los antígenos O (polisacárido O-específico de LPS) o antígenos H (antígenos flagelares) se han usado para el serotipo debido a su naturaleza inmunógena. Se han elucidado las estructuras químicas de las unidades que se repiten de polisacáridos O-específicos y estos datos han permitido la identificación de 31 quimiotipos de P. aeruginosa. Los epítopos conservados entre todos los serotipos de P. aeruginosa se encuentran en el núcleo de oligosacárido y la región de lípido A de los LPS e inmunógenos que contienen estos epítopos inducen inmunidad protectora cruzada en ratones contra diferentes inmunotipos de P. aeruginosa. El núcleo exterior de los LPS se implicó como un ligando para la unión de P. aeruginosa a células epiteliales de la vía aérea y ocular de animales. Sin embargo, existe heterogenicidad en esta región del núcleo exterior entre los diferentes serotipos. Los epítopos en el núcleo interior son muy conservados y se ha demostrado que son accesibles a la superficie y no están enmascarados por el polisacárido O-específico.

Para examinar las propiedades protectoras de las proteínas OM, se ha usado una vacuna que contiene proteínas OM de P. aeruginosa de masas moleculares en el intervalo de 20 a 100 kDa, en ensayos preclínicos y clínicos. Esta vacuna era eficaz en modelos animales contra la estimulación por P. aeruginosa e inducía niveles altos de anticuerpos específicos en voluntarios humanos. Los plasmas de voluntarios humanos que contenían anticuerpos anti- P. aeruginosa proporcionaron protección pasiva y ayudaron a la recuperación de 87% de los pacientes con formas graves de infección por P. aeruginosa. Más recientemente, se demostró que una proteína híbrida que contenía partes de las proteínas de la membrana externa OprF (aminoácidos 190-342) y Oprl (aminoácidos 21-83) de Pseudomonas aeruginosa fusionada con la glutatión-S-transferasa, protegía a ratones contra una dosis 975 veces la dosis letal de 50% de P. aeruginosa (Knapp y col. 1999. Vaccine. 17:1663-1669).

Sin embargo, la purificación de vesículas es técnicamente difícil; la producción de vesículas en la mayoría de las cepas Gram negativas da rendimientos bajos del producto para la producción industrial de vacunas, y a menudo un producto muy heterogéneo. La presente invención resuelve este problema proporcionando cepas "formadoras de hipervesículas" especialmente modificadas, a partir de las cuales se pueden hacer vesículas más fácilmente con mayor rendimiento y pueden ser de naturaleza más homogénea. Dichas vesículas también pueden esterilizarse por filtración más fácilmente.

Además, si la bacteria hace más vesículas de forma natural, hay considerables ventajas en el procedimiento asociadas con la purificación de vesículas en cuanto que las vesículas se pueden hacer y recoger sin usar detergentes tales como desoxicolato (para la extracción de cantidades mayores de vesículas). Esto significaría que se podrían obviar etapas del procedimiento habituales para eliminar el detergente, tales como la purificación por cromatografía y la ultracentrifugación.

Breve descripción de los dibujos

la fig. 1 es un alineamiento múltiple de proteínas asociadas a péptidoglucanos. EC es E. coli, HI es Haemophilus influenzae, NG es Neisseria gonorrhoeae. \uparrow indica la posición del resto F conservado de homólogos de OmpA que deberían estar conservados en truncados C-terminales. _____ indica la extensión totalmente conservada del sitio de asociación de péptidoglucanos;

la fig. 2 es un alineamiento múltiple de proteínas asociadas a péptidoglucanos. EC es E. coli, MC es Moraxella catarrhalis, NG es Neisseria gonorrhoeae. \uparrow indica la posición del resto F conservado de homólogos de OmpA que deberían estar conservados en truncados C-terminales. _____ indica la extensión totalmente conservada del sitio de asociación de péptidoglucanos;

la fig. 3 muestra una estructura esquemática hipotética de ompCD de M. catarrhalis. Se muestra la posición del resto F de homólogos de OmpA que deberían estar conservado en truncados C-terminales, ya que es el sitio de asociación de péptidoglucanos;

la fig. 4 muestra el cribado por PCR de Neisseria recombinante resultante de un cruzamiento doble en el sitio rmp como se describe en el ejemplo 1;

la fig. 5 es una representación esquemática de la estrategia usada para construir los plásmidos mutadores para la deleción de genes tol en Moraxella catarrhalis y NTHi;

la fig. 6 es una representación esquemática de Moraxella catarrhalis tolQR recombinante doble esperada. B: análisis por PCR de clones recombinantes de Moraxella catarrhalis tol QR usando los cebadores E, F, G y H

la fig. 7 es la construcción de plásmidos mutadores usados para introducir un codón de parada en la secuencia ompCD y la secuencia P5 de Moraxella catarrhalis y NTHI respectivamente.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas que se ha modificado genéticamente por uno o ambos procedimientos seleccionados de un grupo que consiste en: reducción de la expresión de uno o más genes tol; y mutación de uno o más genes que codifican una proteína que comprende un sitio asociado a péptidoglucanos, para atenuar la actividad de unión a péptidoglucanos de la o las proteínas.

Por "formadora de hipervesículas" se entiende que la bacteria de forma natural libera 2 o más veces (más preferiblemente 3, 4, 5 o 10 o más veces) la cantidad de vesículas de la bacteria no modificada.

Por "reducción de la expresión" y "que reduce la expresión" se entiende que se reduce la expresión del gen en cuestión (en al menos 2 veces, preferiblemente 5 veces o más) o se para completamente. Esto se puede hacer fácilmente mediante procedimientos tales como la deleción del gen del genoma, introducción de un codón de parada en la secuencia codificante del gen, deleción de la secuencia promotora del gen, o sustitución de la secuencia promotora del gen por un promotor más débil. Cuando el gen es un operón (como lo son muchos de los genes tol) se debe tener cuidado de asegurar que la reducción de la expresión del gen objetivo no afecte a la expresión de los otros genes en el operón de los que no se pretende reducir la expresión.

Los genes tol específicos se pueden identificar en diferentes bacterias Gram negativas por homología (preferiblemente más de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% de identidad o más) con los genes tol descritos en el presente documento (por ejemplo tolA, B, Q o R), o los de E. coli. Preferiblemente, se reduce la expresión de 1, 2, 3, 4 ó 5 genes tol en la bacteria de la invención. Lo más preferiblemente, se reduce la expresión de parejas de genes tol: tolQ y tolR, o tolR y tolA (preferiblemente por deleción o introducción de un codón de alteración) en una bacteria.

Por "mutación" de uno o más genes que codifican una proteína que comprende un sitio asociado a péptidoglucanos para atenuar la actividad de unión a péptidoglucanos de la o las proteínas, se entiende que se "reduce la expresión" de dichos genes como se ha descrito antes. Alternativamente, debido a que dichos genes pueden codificar antígenos protectores, se puede introducir un codón de parada en o 5' respecto de la parte del gen que codifica el sitio de asociación a péptidoglucanos (un péptido de aproximadamente 16-22 aminoácidos que está conservado y se puede identificar entre las cepas bacterianas Gram negativas, como se muestra en las figuras 1 y 2, o secuencias de aminoácidos 40, 50, 60, 70, 80, 90% o más, idénticas a dichas secuencias).

Con frecuencia dichos genes son proteínas de membrana integrales, y por lo tanto es preferible que el codón de parada esté en 3' respecto de la parte del gen que codifica la parte asociada a la membrana externa de la proteína, y 5' respecto del sitio de asociación de péptidoglucanos. Se ha visto que para proteínas homólogas a OmpA, dicho codón de parada estaría situado 3' respecto de un codón que codifica un resto F conservado (como se indica en las fig. 1 y 2, y esquemáticamente en la fig. 3). Este resto conservado F debería estar retenido con el fin de asegurar el plegamiento adecuado de la proteína truncada en la membrana externa. Los truncados C-terminales de los homólogos de OmpA (y genes que los codifican) que retienen este resto F conservado (cuya identidad se puede determinar fácilmente por comparación de un homólogo OmpA con la secuencia de emparejamiento de las figuras 1 y 2) son un aspecto adicional de esta invención.

Cuando la región del gen 3' de la región que codifica el sitio de asociación de péptidoglucanos se va a retener (por ejemplo, si codifica un epítopo protector [por ejemplo en el caso de P5 de H. influenzae]), el sitio de asociación de péptidoglucanos se puede diseñar mediante 1, 2, 3, 4, 5 ó más mutaciones puntuales, o por deleción de aminoácidos (preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 ó 15 aminoácidos o el conjunto del sitio de asociación de péptidoglucanos) del sitio de asociación de péptidoglucanos, de modo que se atenúa la actividad de asociación a péptidoglucanos de la proteína (se reduce al menos 2 veces, preferiblemente se elimina totalmente) hasta el nivel deseado.

Para el propósito de esta invención el "sitio de asociación de péptidoglucanos" significa la región de una proteína que se asocia a péoptidoglucanos que se puede alinear con los sitios de asociación de péptidoglucanos marcados en las figuras 1 y 2 (regiones encuadradas o subrayadas).

Los sucesos de reducción de la expresión y mutación anteriores en el genoma bacteriano, los pueden llevar a cabo expertos en la materia usando recombinación homóloga (como se describe en los ejemplos y en el documento WO 01/09350). Para esta técnica, deben conocerse al menos 50-100 nucleótidos (preferiblemente aproximadamente 500) de cada lado del área de cambio.

Esta invención no pretende cubrir las bacterias que albergan mutaciones (p. ej., noqueados) del sitio minB, salvo que la bacteria se haya modificado también por uno o ambos de los procedimientos anteriores de la invención.

Neisseria

En una realización la bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas se modificó genéticamente por reducción de la expresión de uno o ambos de los siguientes genes: exbB (homólogo de tolQ) [SEQ ID NO: 1] y exbD (homólogo de tolR) [SEQ ID NO: 3]. La región secuencia arriba de exbB y exbD se proporciona en los SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente, y es útil para designar vectores de recombinación homólogos para la reducción de la expresión del gen (por ejemplo por deleción del promotor o sustitución del mismo por una más débil, o un promotor controlado por metabolito [p. ej., el promotor phoE de E. coli]).

En una realización adicional la cepa de Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas se ha modificado genéticamente (de forma aislada o combinada con los sucesos de reducción de la expresión anteriores) por mutación de rmpM [SEQ ID NO: 7 ó 9] para atenuar la actividad de unión a péptidoglucanos de la proteína codificada. El sitio de asociación de péptidoglucanos para la proteína se puede ver en la figura 1 (y tiene la secuencia de aminoácidos NQALSERRAYVVANNLVSN - véase también el SEQ ID NO: 8). La región secuencia arriba del gen se proporciona en el SEQ ID NO: 10 que es útil para la reducción de la expresión del gen. Preferiblemente, el gen se muta de la forma descrita en el ejemplo 1. Si se hace un truncado, se prefiere introducir el codón de parada secuencia abajo del codón que codifica el resto F conservado indicado en las figuras 1 y 2.

Las vesículas preparadas a partir de dichas cepas modificadas pueden tener una o más de las siguientes mejoras: menor tamaño de partículas (que permite la esterilización por filtración a través de poros de 0,22 \mum), una mayor homogeneidad del lote y rendimiento superior. Este tipo de alteraciones de la morfología de las vesículas se obtiene por manipulación de genes en la unión de la membrana externa a la capa de péptidoglucanos y/o a la membrana citoplasmática como se ha descrito antes. La liberación natural de vesículas mejorada tiene la ventaja de que las vesículas se pueden aislar en cantidades industriales sin el uso de detergentes tales como desoxicolato.

Mejoras adicionales en las bacterias y vesículas de la invención

La bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas se puede diseñar además genéticamente mediante uno o más procedimientos seleccionados del siguiente grupo: (a) un procedimiento de reducción de la expresión de antígenos inmunodominantes variables o no protectores, (b) un procedimiento de aumento de la expresión de antígenos OMP protectores, (c) un procedimiento de reducción de la expresión de un gen implicado en hacer tóxica la parte de lípido A del LPS, (d) un procedimiento de aumento de la expresión de un gen implicado en hacer menos tóxica la parte de lípido A del LPS, y (e) un procedimiento de reducción de la síntesis de un antígeno que comparte similitud estructural con una estructura humana y puede inducir una respuesta autoinmune en seres humanos.

Dichas vacunas de vesículas de la invención se diseñan para centrarse en la respuesta inmunitaria de unos pocos antígenos o epítopos protectores (preferiblemente conservados), formulados en una vacuna de múltiples componentes. Cuando dichos antígenos son OMP integrales, las vesículas de la membrana externa de las vacunas de vesículas asegurarán su plegamiento adecuado. Esta invención proporciona procedimientos para optimizar la composición en OMP y LPS de vacunas UMV (vesículas) por deleción de la variable inmunodominante así como de OMP no protectoras, creando OMP conservadas por deleción de regiones variables, por aumento de la expresión de OMP protectoras, y por eliminación de mecanismos de control para la expresión (tales como restricción de hierro) de OMP protectoras. Además, la invención proporciona la reducción de toxicidad del lípido A por modificación de la parte lipídica o cambiando la composición de fosforilos, mientras que retiene la actividad adyuvante, o por enmascaramiento. Cada uno de estos procedimientos nuevos de mejora, mejoran individualmente la vacuna de vesículas, sin embargo una combinación de uno o más de estos procedimientos trabajan juntos para producir una vacuna de vesículas optimizada por ingeniería que es inmunoprotectora y no tóxica, en particular adecuada para uso pediátrico.

(a) Un procedimiento de reducción de la expresión de antígenos inmunodominantes variables o no protectores

Muchos antígenos de superficie son variables entre las cepas bacterianas y como consecuencia son protectores solo contra un grupo limitado de cepas estrechamente relacionadas. Un aspecto de esta invención cubre la reducción de la expresión, o preferiblemente la deleción del gen o genes que codifican proteínas de superficie variables, que da como resultado una cepa bacteriana que produce vesículas que, cuando se administran en una vacuna, tienen un potencial mayor de reactividad cruzada contra diferentes cepas debido a una mayor influencia ejercida por las proteínas conservadas (retenidas en la membranas externas) en el sistema inmunitario de los vacunados. Los ejemplos de dichos antígenos variables incluyen: para Neisseria - pili(PilC) que sufre variaciones antigénicas, PorA, Opa, TbpB, FrpB.

Otros tipos de genes de los que se podría reducir o parar la expresión son genes que, in vivo, la bacteria puede expresar o no. Puesto que las proteínas de la membrana externa codificadas por dichos genes no siempre están presentes en la bacteria, la presencia de dichas proteínas en las preparaciones de vesículas también puede ser perjudicial para la eficacia de la vacuna por las razones expuestas antes. Un ejemplo preferido de reducción de la expresión o deleción, es la proteína Opc de Neisseria. La inmunidad anti-Opc inducida por una vacuna de vesículas que contienen Opc solo tendría una capacidad protectora limitada ya que el organismo infeccioso podría convertirse fácilmente en Opc''. HgpA y HgpB de H. influenzae son otros ejemplos de dichas proteínas.

En el procedimiento a), se reduce la expresión de estos genes variables o no protectores, o se para definitivamente. Esto tiene la sorprendente ventaja de concentrar en el sistema inmunitario antígenos mejores que están presentes en pequeñas cantidades en la superficie exterior de las vesículas.

La cepa se puede diseñar de esta forma mediante una serie de estrategias que incluyen la inserción de transposón para alterar la región codificante o región promotora del gen, o mutaciones puntuales o deleciones para lograr un resultado similar. También se puede usar la recombinación homóloga para suprimir un gen de un cromosoma (cuando la secuencia X comprende parte (preferiblemente toda) la secuencia codificante del gen de interés). Además se puede usar para cambiar su promotor fuerte por un promotor más débil (o sin promotor). Todas estas técnicas se describen en el documento WO 01/09350 (publicado por WIPO el 8/2/01).

(b) Un procedimiento de aumento de la expresión de antígenos OMP protectores

Esto se puede hacer insertando una copia de dicha OMP protectora en el genoma (preferiblemente por recombinación homóloga) o aumentando la expresión del gen nativo y sustituyendo el promotor nativo por un promotor más fuerte, o insertando un promotor fuerte secuencia arriba del gen en cuestión (también por recombinación homóloga). Dichos procedimientos se pueden llevar a cabo usando las técnicas descritas en el documento WO 01/09350 (publicado por WIPO el 8/2/01).

Dichos procedimientos son particularmente útiles para potenciar la producción de componentes de las vesículas inmunológicamente relevantes tales como proteínas de la membrana externa y lipoproteínas (preferiblemente OMP conservadas, normalmente presentes en vesículas en concentraciones bajas).

(c) Un procedimiento de reducción de la expresión de un gen implicado en hacer tóxica la parte de lípido A del LOPS

La toxicidad de las vacunas de vesículas es uno de los mayores problemas en el uso de las vacunas de vesículas. Un aspecto adicional de la invención se refiere a procedimientos de detoxificación genética de LPS presentes en las vesículas. El lípido A es el componente principal de los LPS responsable de la activación celular. Muchas mutaciones en genes implicados en esta ruta conducen a fenotipos esenciales. Sin embargo, las mutaciones en los genes responsables de las etapas de modificaciones terminales conducen a fenotipos sensibles a la temperatura (htrB) o permisivos (msbB). Las mutaciones que dan como resultado una disminución (o no) de la expresión de estos genes dan como resultado la actividad tóxica del lípido A alterada. Realmente, el lípido A no lauroilado (mutante htrB) [también definido por los LPS resultantes que carecen de ambas cadenas de acilo secundarias] o no miristoilado (mutante msbB) [también definido por los LPS resultantes que carecen solo de una sola cadena de acilo secundario] son menos tóxicos que el lípido A salvaje. Las mutaciones en la lípido A 4'-quinasa que codifica el gen (lpxK) también disminuye la actividad tóxica del lípido A.

Por lo tanto, el procedimiento c) implica la deleción de parte (o preferiblemente todos) de uno o más de los marcos de lectura abiertos o promotores anteriores. Alternativamente, los promotores se podrían sustituir por promotores más débiles. Preferiblemente, se usan técnicas de recombinación homóloga para llevar a cabo el procedimiento. Preferiblemente los procedimientos se describen en el documento WO 01/09350 (publicado por WIPO el 8/2/01). Las secuencias de los genes htrB y msbB de Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis, y Haemophilus influenzae se proporcionan en el documento WO 01/09350 para este propósito.

(d) Un procedimiento de aumento de la expresión de un gen implicado en hacer menos tóxica la parte de lípido A del LPS

La actividad tóxica de los LPS también se podría alterar introduciendo mutaciones en genes/sitios implicados en la resistencia a la polimixina B (dicha resistencia se ha correlacionado con la adición de aminoarabinosa en el fosfato 4' del lípido A). Estos genes/sitios podrían ser pmrE que codifica una UDP-glucosa deshidrogenasa, o una región de genes de resistencia a péptidos antimicrobianos común a muchas enterobacterias, que podría estar implicada en la síntesis y transferencia de aminoarabinosa. El gen pmrF que está presente en esta región codifica una dolicol-fosfato manosil transferasa (Gunn J.S., Kheng, B.L., Krueger J., Kim K., GuoL, HackettM., Miller S.I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182).

Las mutaciones en el sistema regulador de PhoPhoQ, que es un sistema regulador de dos componentes de fosfotransmisión (fenotipo constitutivo Pho, PhoP^{c}), o condiciones de cultivo o del entorno de Mg^{++} bajo (que activan el sistema regulador PhoP-PhoQ) conducen a la adición de la aminoarabinosa en el fosfato 4' y al 2-hidroximiristato que sustituye al miristato (hidroxilación de miristato). Este lípido A modificado reduce la capacidad para estimular la expresión de E-selectina por las células endoteliales humanas y la secreción de TNF-\alpha de monocitos
humanos.

El procedimiento d) implica el aumento de la expresión de esos genes usando una estrategia descrita en el documento WO 01/09350 (publicado por WIPO el 8/2/01).

(e) Un procedimiento de reducción de la síntesis de un antígeno que comparte una similitud estructural con una estructura humana y puede ser capaz de inducir una respuesta autoinmunitaria en seres humanos

El aislamiento de vesículas de la membrana externa bacteriana de bacterias Gram negativas encapsuladas, a menudo da como resultado la copurificación del polisacárido capsular. En algunos casos, este material "contaminante" puede ser útil, puesto que el polisacárido puede potenciar la respuesta inmunitaria conferida por otros componentes de la vesícula. Sin embargo, en otros casos, la presencia del material polisacárido contaminante en las preparaciones de vesículas bacterianas puede ser perjudicial para el uso de las vesículas en una vacuna. Por ejemplo, se ha mostrado que al menos en el caso de N. meningitidis el polisacárido capsular del serogrupo B no confiere inmunidad protectora y es susceptible de inducir una respuesta autoinmunitaria adversa en seres humanos. Por consiguiente, el procedimiento e) de la invención es el diseño de la cepa bacteriana para la producción de vesículas desprovistas de polisacáridos capsulares. Las vesículas serán entonces adecuadas para usar en seres humanos. Un ejemplo particularmente preferido de dicha preparación de vesículas es una de N. meningitidis del serogrupo B desprovista de polisacárido
capsular.

Esto se puede lograr usando cepas de producción de vesículas modificadas, en las que los genes necesarios para la biosíntesis y/o exportación capsular se han alterado como se describe en el documento WO 01/09350 (publicado por WIPO el 8/2/01, e incorporado en el presente documento por referencia). Un procedimiento preferido es la deleción de algunos o todos los genes cps de Neisseria meningitidis necesarios para la biosíntesis y exportación del polisacárido. Para este propósito, se puede usar la sustitución del plásmido pMF121 (descrito en Frosh y col.1990, Mol. Microbiol. 4:1215-1218) para dar una mutación que suprime el grupo de genes cpsCAD (+ galE). Alternativamente, podría suprimirse o reducir la expresión del gen siaD (el gen siaD meningocócico codifica la alfa-2,3-sialiltransfereasa, una enzima necesaria para el polisacárido capsular y la síntesis de LOS). Dichas mutaciones también pueden eliminar estructuras similares del huésped en la parte de sacárido del LPS de la bacteria.

Combinaciones de los procedimientos a) - e)

Se pude observar que se puede usar uno o más de los procedimientos anteriores para producir una cepa modificada a partir de la cual hacer preparaciones de vesículas mejoradas de la invención. Preferiblemente, se usa uno de dichos procedimientos, más preferiblemente se usan dos o más (2, 3, 4 ó 5) de los procedimientos con el fin de fabricar vacunas de vesículas. Cuando se usan procedimientos adicionales en la fabricación de la vacuna de vesículas, cada mejora trabaja conjuntamente con los otros procedimientos usados con el fin de hacer una preparación de vesículas diseñada optimizada.

Una preparación de vesículas menigocócicas (en particular N. meningitidis B) preferida comprende el uso de los procedimientos b), c) y e) (opcionalmente combinados con el procedimiento a)). Dichas preparaciones de vesículas son seguras (no hay estructuras similares a las estructuras del huésped), no tóxicas y estructuradas de forma que la respuesta inmunitaria del huésped estará centrada en los altos niveles de antígenos protectores (y preferiblemente conservados). Todos los elementos anteriores trabajan juntos con el fin de proporcionar una vacuna de vesículas optimizada.

Igualmente, para M. catarrhalis, H. influenzae no tipificable, y cepas meningocócicas no de serotipo B (p. ej., serotipo A, C, Y o W), las preparaciones de vesículas preferidas comprenden el uso de los procedimientos b) y c), opcionalmente combinados con el procedimiento a).

Preparaciones preferidas de vesículas de Neisseria

Se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) para el aumento de la expresión mediante el procedimiento b) cuando se lleva a cabo en una cepa de Neisseria, incluyendo genococos y meningococos (en particular, N. meningitidis B): NspA (WO 96/29412), Hsf-like (WO 99/31132), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO 96/31618), TbpA (US 5.912.336), TbpB, FrpA/FrpC (WO 92/01460), LbpA/LbpB (PCT/EP98/05117), FhaB (WO 98/02547), HasR (PCT/EP99105989), lipo02 (PCT/EP99/08315), Tbp2 (WO 99/57280), MltA (WO 99/57280), y ctrA (PCT/EP00/
00135). También se prefieren genes que se pueden introducir de forma heteróloga en otras bacterias Gram negativas.

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para la reducción de la expresión por el procedimiento a): PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa, y Ope (lo más preferiblemente PorA).

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para la reducción de la expresión por el procedimiento c): htrB, msbB y lpxK (lo más preferiblemente msbB que elimina una sola cadena de acilo secundaria de la molécula de LPS).

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para el aumento de la expresión por el procedimiento d): pmrA, pmrB, pmrE, y pmrF.

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para la reducción de la expresión por el procedimiento e): galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC, y ctrD (los genes se describen en el documento WO 01/09350 - publicado por WIPO el 8/2/01).

Preparaciones preferidas de vesículas de Pseudomonas aeruginosa

Se prefiere uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) para el aumento de la expresión por el procedimiento b): PcrV, OprF, OprI. También se prefieren genes que se pueden introducir de forma heteróloga en otras bacterias Gram negativas.

Preparaciones de vesículas de Moraxella catarrhalis preferidas

Se prefiere uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) para el aumento de la expresión por el procedimiento b): OMP106 (documentos WO 97/41731 y WO 96/34960), HasR (PCT/EP99/03824), PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85 (PCT/EP00/01468), lipo06 (GB 9917977.2), lipo10 (GB 9918208.1), lipo11 (GB 9918302.2), lipo18 (GB 9918038.2), P6 (PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, y col. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010), D15 (PCT/EP99/03822), OmplA1 (PCT/EP99/06781), Hly3 (PCT/EP99/03257), LbpA y LbpB (WO 98/55606), TbpA y TbpB (WO 97/13785 y WO 97/32980), OmpE, UspA1 y UspA2 (WO 93/03761), FhaB (WO 99/58685) y Omp21. También se prefieren genes que se pueden introducir de forma heteróloga en otras bacterias Gram negativas.

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para la reducción de la expresión por el procedimiento a): CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA, y LbpB.

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para la reducción de la expresión por el procedimiento c): htrB, msbB y 1 pxK (lo más preferiblemente msbB).

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para el aumento de la expresión por el procedimiento d): pmrA, pmrB, pmrE, y pmrF.

Preparaciones preferidas de vesículas de Haemophilus influenzae

Se prefiere uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) para el aumento de la expresión por el procedimiento b): D15 (WO 94/12641), P6 (EP 281673), TbpA, TbpB, P2, P5 (WO 94/26304), OMP26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, Iomp1457 (GB 0025493.8), YtfN (GB 0025488.8), VirG (GB 0026002.6), Iomp1681 (GB 0025998.6), OstA (GB 0025486.2) y Hif (debe aumentarse la expresión de todos los genes en este operón con el fin de aumentar la expresión de la pilina). También se prefieren genes que se pueden introducir de forma heteróloga en otras bacterias Gram negativas.

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para la reducción de la expresión por el procedimiento a): P2, P5, Hif, lgA1-proteasa, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA, y TbpB.

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para la reducción de la expresión por el procedimiento c): htrB, msbB y lpxK (lo más preferiblemente msbB).

Se prefiere uno o más de los siguientes genes para el aumento de la expresión por el procedimiento d): pmrA, pmrB, pmrE y pmrF.

Preparaciones de vesículas de membrana (vesículas) de la invención

La fabricación de preparaciones de vesículas de cualquiera de las cepas modificadas mencionadas, se puede lograr recogiendo las vesículas liberadas de forma natural por las bacterias, o por cualquiera de los procedimientos conocidos para el experto en la materia (p. ej., como se describe en los documentos EP 301992, US 5.597.572, EP 11243 o US 4.271.147).

Una preparación de vesículas de membrana obtenida de la bacteria de la invención, es un aspecto adicional de esta invención. Preferiblemente, la preparación de las vesículas de membrana se puede filtrar a través de una membrana de 0,22 \mum.

También está prevista una preparación estéril (preparada homogéneamente) de vesículas de membrana que se puede obtener haciendo pasar las vesículas de membrana de la bacteria de la invención a través de una membrana de 0,22 \mum.

Formulaciones de vacuna

Un aspecto adicional de la invención es una vacuna que comprende una bacteria de la invención o una preparación de vesículas de la invención junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas vacunas se usan de forma ventajosa en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal.

La preparación de vacuna se describe en general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York).

Las preparaciones de vacunas de la presente invención pueden llevar adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una al de calcio (en particular carbonato de calcio), hierro o cinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente, o polifosfazenos.

Los sistemas adyuvantes Th1 adecuados que se pueden usar incluyen monofosforil-lípido A, en particular monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado, y una combinación de monofosforil-lípido A, preferiblemente monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, en particular, la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se atenúa con colesterol como se describe en el documento WO96/33739. Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua, se describe en el documento WO95/17210 y es una formulación preferida.

La vacuna puede comprender una saponina, preferiblemente QS21, También puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Los oligonucleótidos que contienen CpG no metilada (documento WO 96/02555) también son inductores preferidos de una respuesta TH1 y son adecuados para usar en la presente invención.

La preparación de vacuna de la presente invención se puede usar para proteger o tratar un mamífero susceptible de infección, mediante la administración de dicha vacuna por vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir la inyección vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o administración por vía mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un procedimiento de protección de un individuo frente a una infección bacteriana, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz (capaz de inmunoproteger a un individuo frente a la bacteria fuente) de una bacteria de la invención o una preparación de vesículas de la invención.

La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona de una cantidad de induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos secundarios adversos significativos, de las vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo del inmunógeno específico que se use y de cómo se presenta. En general, se espera que cada dosis comprenda 1-100 \mug de antígeno proteína, preferiblemente 5-50 \mug y los más habitualmente en el intervalo de 5-25 \mug.

Una cantidad óptima para una vacuna particular se puede calcular mediante estudios estándar que implican la observación de las respuestas inmunitarias adecuadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas de forma adecuada.

También se contempla un procedimiento de preparación de una composición de vacuna que comprende una preparación de vesículas de membrana de la invención, cuyo procedimiento comprende: (a) inocular un recipiente de cultivo que contiene un medio nutriente adecuado para el crecimiento de la bacteria de la invención; (b) cultivar dicha bacteria; (c) recuperar las vesículas de membrana del medio; y (d) mezclar dichas vesículas de membrana con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las vesículas se pueden recuperar por extracción con detergente (p. ej., desoxicolato), pero preferiblemente se recuperan sin dicha etapa (y las etapas de cromatografía y ultracentrifugación necesarias que van con la misma).

Preferiblemente después de la etapa (c) o etapa (d), la preparación se esteriliza por filtración (a través de una membrana de 0,22 \mum).

También se proporciona un procedimiento para producir una bacteria formadora de hipervesículas de la invención, cuyo procedimiento comprenden modificar genéticamente una cepa bacteriana Gram negativa por uno o ambos de los siguientes procedimientos: (a) diseño de la cepa para reducir la expresión de uno o más genes Tol; y (b) mutación de uno o más genes que codifican una proteína que comprende un sitio asociado a péptidoglucanos para atenuar la actividad de unión a péptidoglucanos de la o las proteínas.

Secuencias de nucleótidos de la invención

Un aspecto adicional de la invención se refiere a proporcionar las secuencias de nucleótidos (véase las listas se secuencias adjuntas) que se pueden usar en los procedimientos (reducción de expresión/mutación) de la invención.

Otro aspecto de la invención es una secuencia de polinucleótido aislada que hibrida en condiciones de restricción alta con al menos una parte de 30 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos de la invención (p. ej., SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 ó 44) o una cadena complementaria de la misma. Preferiblemente, la secuencia aislada será suficientemente larga para realizar la recombinación homóloga con la secuencia cromosómica si es parte de un vector adecuado, en particular al menos 30 nucleótidos (preferiblemente, al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ó 500 nucleótidos). Más preferiblemente, el polinucleótido aislado debe comprender al menos 30 nucleótidos (preferiblemente al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ó 500 nucleótidos) de las secuencias reales proporcionadas o una cadena complementaria de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, las condiciones de hibridación de restricción alta incluyen, por ejemplo, 6X SSC, 5X disolución de Denhardt, SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, hibridado durante una noche a 65ºC y lavado en 2X SSC, SDS al 0,1% una vez a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos, seguido de una vez a 65ºC durante aproximadamente 15 minutos, seguido de al menos un lavado en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante al menos 3-5 minutos.

Un aspecto adicional es el uso de secuencias de polinucleótidos aisladas de la invención para llevar a cabo un suceso de ingeniería genética (tal como inserción de transposón, o mutación o deleción específica de sitio, pero preferiblemente un suceso de recombinación homóloga) en un gen de cromosoma de bacteria Gram negativa con el fin de reducir la expresión o mutarla como se ha descrito antes. Preferiblemente, la cepa en la que tiene lugar el suceso de recombinación, es la misma que la cepa de la que se obtienen las secuencias de la invención. Sin embargo, los genomas de meningococos A, B, C, Y y W y genococos son suficientemente similares, de modo que la secuencia de cualquiera de estas cepas puede ser adecuada para diseñar vectores para realizar dichos sucesos en las otras cepas. Es probable que este sea el caso también para Haemophilus influenzae y Haemophilus influenzae no tipificable.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se llevan a cabo usando técnicas estándar que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la materia, salvo cuando se describen en detalle. Los ejemplos son ilustrativos y no limitan la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Construcción de una cepa de Neisseria meningitidis que carece del gen RmpM funcional

El objetivo del experimento era construir una cepa de Neisseria meningitidis de serogrupo B que expresara una proteína Rmp truncada. Rmp de Neisseria meningitidis es homóloga a OmpA de E. coli y OprF de P. aeruginosa. Esta proteína contiene un dominio N-terminal anclado en la membrana externa y un dominio C-terminal que contiene un sitio asociado a péptidoglucanos. El dominio C-terminal de Rmp se eliminó por recombinación homóloga en una cepa cps- de Neisseria meningitidis de serogrupo B. La parte N-terminal de la proteína expresada todavía tendrá su función en la estabilidad de la membrana externa, mientras que la ausencia del sitio asociado a péptidoglucanos relajará la membrana alrededor de la bacteria. Se analizaron las vesículas de la membrana externa de esta Neisseria modificada: cantidad de producción, tamaño, homogeneidad. Se descubrió una región de ADN (729 pb) correspondiente al gen rmp (SEQ ID Nº 9) en la base de datos Sanger que contenía secuencias de ADN genómico de la cepa de Neisseria meningitidis serogrupo A Z2491. Hay una secuencia similar presente en la cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B MC58 (SEQID Nº 7); presenta 99,3% de identidad con la secuencia de de menA. Se amplificó por PCR un fragmento de ADN que cubría la secuencia completa del gen del ADN genómico de Neisseria meningitidis serogrupo B, usando los oligonucleótidos RMP-H-5 (5'- GCC CAC AAG CTT ATG ACC AAA CAG CTG AAA TT-3') y RMP-E-3 (5'- CCG GAA TTCTTAGTGTTGGTG ATG ATTGT-3') que contienen los sitios de restricción HindIII y EcoRI (subrayados). Este fragmento de la PCR se limpió con el kit High Pure (Roche, Mannheim, Alemania) y se clonó directamente en un vector pGemT (Promega, EE.UU.). Este plásmido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528-534) con el fin de introducir una deleción de 33 pb y un codón de parada después del resto de fenilalanina interior. La PCR circular se llevó a cabo usando los oligonucleótidos PW-CIRC-3-B (5'-GGC GGA TCC TTA GAA CAG GGT TTT GGC AG-3') y RMP CIRC-5-B (5'-CGG GGA TCC CAA GAC AAC CTG AAA GTA TT-3') que contienen sitios de restricción BamHI (subrayados). El gen cmR se amplificó en el plásmido pGPS2, con los oligonucleótidos CM/BAM/5/2 (5'-CGC GGA TCC GCC GTC TGA AAC CTG TGA CGG AAG ATC AC-3') y CM/BAM/3/2 (5'-CGC GGA TCC TTC AGA CGG CCC AGG CGT TTA AGG GCA C-3') que contienen secuencias de absorción y sitios de restricción BamHI (subrayados). Este fragmento se insertó en el plásmido circular de la PCR tratado con la enzima de restricción BamHI. El plásmido recombinante se usó para transformar la cepa cps- de Neisseria meningitidis serogrupo B. La Neisseria meningitidis recombinante resultante de un suceso de sobrecruzamiento doble se seleccionó por cribado por PCR con los cebadores RMP SCR 5 (5'- CAT GAT AGA CTA TCA GGA AAC-3') y RMP SCR 3 (5'-CAG TAC CTG GTACAAAATCC-3'). Estos cebadores amplifican un fragmento de 970 bp a partir de la cepa de control (WT para rmp) y uno de 1800 pb de una Neisseria recombinante. La figura 4 muestra las amplificaciones por PCR obtenidas de 10 colonias recombinantes analizadas en un gel de agarosa al 1% en presencia de bromuro de etidio. Los recombinantes se hicieron crecer en medio GC que contenía cloranfenicol 5 \mug/ml y se analizó la expresión de Rmp y la producción de OMV.

Caracterización de OMV de menB producidas de un mutante rmpM

Se analizó el efecto de la mutación rmpM en el rendimiento de OMV, tamaño y polidispersión, comparando las OMV extraídas (usando desoxicolato) de H44/76 Cps- (polisacárido no capsular) y las correspondientes OMV extraídas del derivado mutante RmpM. Los resultados son los siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

Como se muestra a continuación, la deleción de rmpM aumenta significativamente (al menos en un factor 2) el rendimiento de las OMV preparadas a partir de dicha cepa. El tamaño de las OMV aisladas de cepas derivadas de N. meningitidis H44/46 mutantes rmpM y salvajes, se calculó por espectroscopía de correlación de fotones (PCS) usando el analizador Malvem Zetasizer 4000 recomendado por el proveedor (Malvern Instruments GmbH, Herrenberg Germany: www.malvern.co.uk). Los resultados se resumen a continuación:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

Estos datos apoyan que el tamaño de CPS (-) 07/2000 es menor que el tamaño de CPS (-) 09/2000 y también que el tamaño de las muestras de CPS (-) es menor que el tamaño de las vesículas de CPS (-)rmpM(-). Estos datos juntos apoyan que la deleción de un dominio que codifica el dominio asociado a péptidoglucanos de RmpM conduce a una formación potenciada de vesículas y morfología y distribución de tamaño de las OMV alteradas. Estas características se podían usar ventajosamente para producir vacunas como se publica en el documento WO 01/09350 (publicado por WIPO el 8/2/01 e incorporado en el presente documento por referencia).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Deleción de los genes tolQR en Moraxella catarrhalis

El objetivo del experimento era eliminar los genes tolQR de Moraxella catarrhalis con el fin de obtener una cepa de Moraxella formadora de hiperburbujas.

Para este propósito, se construyó un plásmido mutador usando tecnologías de clonación de E. coli. Las etapas principales se muestran en la figura 5. Brevemente, se extrajo el ADN genómico de la cepa de Moraxella catarrhalis ATCC 43617 utilizando el kit de extracción de ADN genómico de QIAGEN (Qiagen Gmbh). Este material se usó para amplificar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de ADN de 2151 nucleótidos que cubría 501 nucleótidos secuencia arriba del codón de inicio del gen tolQ (ATG) hasta 500 nucleótidos secuencia abajo del codón de parada tolR (TAA) usando los cebadores A (5' - GCTCTAGAGCTTCAGCAGTCACG-GGCAAATCATGATTA - 3') y B (5' - CGGAGCTCTGCTCAAGGTCTGAGACATGATTAGAATAT - 3'). Este producto de la PCR se introdujo en el vector de clonación pGEM-T (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido obtenido después se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer, (1992), Biotechniques 12: 528-534) con el fin de suprimir los genes tol QR (que consiste en la amplificación del vector entero sin la región comprendida entre los dos cebadores). La PCR circular se llevó a cabo usando los cebadores C (5' - CGGGATCCCAGCGAGATT-AGGCTAATGGATTCGTTCA - 3') y D (5'- CGGGATCCAATGTTGGTATCACCCAAGTGAGTTTGCTT - 3') que hibridan con 31 nucleótidos secuencia abajo del codón de inicio (ATG) de tolQ y 48 pb secuencia arriba del codón de parada (TAA) de tolR, respectivamente (véase la Figura 5). Ambos cebadores contienen un sitio de restricción BamHI (subrayado). El fragmento de la PCR obtenido después se purificó usando el kit PCR Clean Up (Boehringer), se hizo digerir con BamHI y se ligó, dando como resultado un plásmido que llevaba una secuencia 5'-flanqueadora de 532 nucleótidos y una secuencia 3'-flanqueadora de 548 nucleótidos separadas por un sitio de restricción BamHI. Después se introdujeron casetes de resistencia a la kanamicina en el sitio BamHI con el fin de poder seleccionar recombinantes en las bacterias huésped. Se subclonaron dos casetes diferentes dando dos plásmidos diferentes; uno era el gen de resistencia a la kanamicina Tn903 (KanR) subclonado en el plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech) y el otro era un casete sacB-neo que procede de pIB279 que llevaba el gen de resistencia a la kanamicina de Tn5 y el gen sacB gene (Blomfield y col., (1991), Molecular Microbiology, 5: 1447-1457). sacB es un marcador de contraselección perjudicial para bacterias en presencia de sacarosa y permite sacar más el casete. Ambos casetes se subclonaron usando los sitios de restricción BamHI disponibles. Las secuencias de los clones obtenidos se han confirmado usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 373A/PRISM. Alternativamente, se puede usar el vector suicida pKNG101 para introducir la mutación después de subclonar las regiones flanqueadoras en el sitio de multiclonación del vector (Kaniga y col., (1991), Gene 109:137-
141).

Se usó el plásmido que lleva el marcador de resistencia de la kanamicina de Tn903 para transformar la cepa de Moraxella catarrhalis 14 aislada de nasofaringe humana en Oslo, Noruega. La técnica de transformación se basa en la competencia de absorción de ADN natural de la cepa. Se mezclaron \sim10 colonias de bacterias con 25 \mug de ADN (en 20 \mul de PBS) y se incubaron durante 3 horas a 36ºC. Se seleccionaron los clones recombinantes de Moraxella catarrhalis en placas Muller-Hinton que contenían kanamicina 20 \mug/ml y se cribaron por PCR los mutantes resultantes de un suceso recombinante doble, usando los cebadores E (5'-ATCGGCGTGGCTGTGTGTGGC - 3'), F (5'-ACCGAATTGGATTGAGGTCAC - 3'), G (5'- GCGATTCAGGCCTGGTATGAG - 3') y H (5'- TTGTGCAATG
TAACATCAGAG - 3'). Después de amplificación térmica, se analizó una parte alícuota de \sim10 \mul de la reacción por electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 1% en un tampón de Tris-borato-EDTA (TBE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron por iluminación UV después de electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se realizó la electroforesis de un patrón de tamaño molecular de ADN (Smartladder, Eurogentec) en paralelo con las muestras de ensayo y se usó para calcular el tamaño de los productos de la PCR. Como se muestra en la figura 6, varios transformantes produjeron el producto de la PCR del tamaño esperado y se identificaron como cepas mutantes de Moraxella catarrhalis tolQR. La secuenciación confirmó la integración correcta del casete. Se ensayó en estos clones la producción de vesículas de la membrana externa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Mutación de ompCD de Moraxella catarrhalis

El objetivo del experimento era mutar el gen ompCD de Moraxella catarrhalis en un gen truncado sin la región codificante 3' asociada a péptidoglucanos, con el fin de obtener una cepa de Moraxella formadora de hipervesículas. En este experimento se introdujo un codón de parada después de la fenilalanina al final del dominio de transmembrana de la proteína.

Para este propósito, se construyó un plásmido mutador usando las tecnologías de clonación de E. coli. Las etapas principales se muestran en la figura 7. Brevemente, el ADN genómico se extrajo de la cepa de Moraxella catarrhalis ATCC 43617 usando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen Gmbh). Este material se usó para amplificar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de ADN de 1000 nucleótidos que cubría 500 nucleótidos secuencia arriba y secuencia abajo del resto de fenilalanina crítico, usando los cebadores 1 (5' - CCTCTAGACGCTTATTATAACATAAATCAGTCTAACTG - 3') y 2 (5' – AAGGTACCAG-CA
GAAGTAGGCAATGGGCAAAACATTGC - 3'). Este producto de la PCR se introdujo en el vector de clonación pGEM-T (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después el plásmido obtenido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer, (1992), Biotechniques 12: 528-534) con el fin de introducir un codón de parada y un sitio de restricción BamHI. La PCR circular se llevó a cabo usando los cebadores (5' - CCGGATCC TTAACGGTATTGTGGTTTGATGATTGATTT - 3') y 4 (5' - AAGGATCCGCGCAAATGCGTGAATT
CCCAAATGCAACT - 3') que hibridaban con 62 nucleótidos secuencia arriba y 39 nucleótidos secuencia abajo del codón TTC que codifica la fenilalanina (Figura 7). Ambos cebadores contienen un sitio de restricción BamHI (subrayado) y el cebador 3 también contiene el codón de parada (negrilla). Después el fragmento de la PCR obtenido se purificó usando el kit PCR Clean Up (Boehringer), se hizo digerir con BamHI y se ligó, dando como resultado un plásmido que llevaba una secuencia 5'-flanqueadora de 438 nucleótidos y una secuencia 3'-flanqueadora de 540 nucleótidos separadas por un sitio de restricción BamHI. Después se introdujeron casetes de resistencia a la kanamicina en el sitio BamHI con el fin de poder seleccionar recombinantes en las bacterias huésped. Se subclonaron dos casetes diferentes dando dos plásmidos diferentes, uno era el gen de resistencia a la kanamicina de TN903 (KanR) subclonado en el plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech) y el otro era un casete SacB-neo que procede de pIB179 que lleva el gen de resistencia a la kanamicina de Tn5 y el gen sacB (Blomfield y col., (1991), Molecular Microbiology, 5:1447-1457). sacB es un marcador de contraselección perjudicial para las bacterias en presencia de sacarosa y permite sacar más el casete. Ambos casetes se subclonaron usando los sitios de restricción BamHI disponibles. Las secuencias de los clones obtenidos se confirmaron usando el kit de secuenciación Big Dye (Perkin Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 373A/PRISM. Alternativamente, se puede usar el vector suicida pKNG101 para introducir la mutación después de subclonar las regiones flanqueadoras en el sitio de multiclonación del vector (Kaniga y col., (1991), Gene 109: 137-141).

El plásmido que lleva el marcador de resistencia a la kanamicina de Tn903 se puede usar para transformar Moraxella catarrhalis. Los clones recombinantes de Moraxella catarrhalis se pueden seleccionar en placas Muller-Hinton que contienen kanamicina 20 \mug/ml y se pueden seleccionar los mutantes que resultan de un suceso recombinante doble por PCR. Después se puede ensayar en estos clones la producción de vesículas de la membrana
externa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Deleción de los genes tolQR en Haemophilus influenzae no tipificable

El objetivo del experimento era eliminar los genes tolQR Haemophilus influenzae no tipificable (NTHI) con el fin de obtener una cepa formadora de hiperburbujas.

Para este propósito, se construyó un plásmido mutador usando tecnologías de clonación de E. coli. Las etapas principales se muestran en la figura 5. Brevemente, se extrajo el ADN genómico de la cepa de Haemophilus influenzae no tipificable 3224A utilizando el kit de extracción de ADN genómico de QIAGEN (Qiagen Gmbh). Este material se usó para amplificar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de ADN de 1746 nucleótidos que cubría 206 nucleótidos secuencia arriba del codón del gen tolQ hasta 364 nucleótidos secuencia abajo del codón de parada tolR usando los cebadores ZR1-EcoRI (5' - CCGGAATTCAAAGTGCGGTAGATTTAGTCG
TAGTAATTGATTTACTTATG - 3') y ZR2-XbaI (5' - CTAGTCTAGAACGTTGCTGTTCTTGCTG - 3'). Este producto de la PCR se introdujo en el vector de clonación pGEM-T (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido obtenido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer, (1992), Biotechniques 12: 528-534) con el fin de suprimir los genes tol QR (que consiste en una amplificación del vector entero sin la región comprendida entre los dos cebadores). La PCR circular se llevó a cabo usando los cebadores ZR1-BamHI (5' - CGCGGATCCCGCTTCAGGTGCATCTGG - 3') y ZR2-BamHI (5' - CGCGGATCCAGACAGGAATTTGATAAGG - 3') que hibridan con 312 nucleótidos secuencia abajo del codón de inicio de tolQ y 144 pb secuencia arriba del codón de parada de tolR, respectivamente (Figura 5). Ambos cebadores contienen un sitio de restricción BamHI (subrayado). El fragmento de la PCR obtenido después se purificó usando el kit PCR Clean Up (Boehringer), se hizo digerir con BamHI y se ligó, dando como resultado un plásmido que llevaba una secuencia 5'-flanqueadora de 517 nucleótidos y una secuencia 3'-flanqueadora de 507 nucleótidos separadas por un sitio de restricción BamHI. Después se introdujeron casetes de resistencia a la kanamicina en el sitio BamHI con el fin de poder seleccionar recombinantes en las bacterias huésped. Se subclonaron dos casetes diferentes dando dos plásmidos diferentes, uno era el gen de resistencia a la kanamicina Tn903 (KanR) subclonado en el plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech) y el otro era un casete sacB-neo procedente de pIB279 que llevaba el gen de resistencia a la kanamicina de Tn5 y el gen sacB (Blomfield y col., (1991), Molecular Microbiology, 5: 1447-1457). sacB es un marcador de contraselección perjudicial para bacterias en presencia de sacarosa y permite sacar más el casete. Ambos casetes se subclonaron usando los sitios de restricción BamHI disponibles. Las secuencias de los clones obtenidos se han confirmado usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 373A/PRISM. Alternativamente, se puede usar el vector suicida pKNG101 para introducir la mutación después de subclonar las regiones flanqueadoras en el sitio de multiclonación del vector (Kaniga y col., (1991), Gene 109:137-
141).

Se usó el plásmido que lleva el marcador de resistencia a la kanamicina de Tn903 para transformar la cepa de Haemophilus influenzae no tipificable 3224A. La transformación se realizó usando células NTHI competentes obtenidas por un tratamiento con cloruro de calcio de acuerdo con "Methods in Enzymology, Bacterial genetic systems", ed. J. H. Miller, Academic Press Inc., vol. 204, p. 334. Los clones de Haemophilus influenzae no tipificable se seleccionaron en placas GC que contenían kanamicina 15 \mug/ml y los mutantes resultantes de un suceso recombinante doble se cribaron por PCR usando los cebadores NTHI-Fo-ZRI (5' - CCTTACTAGAGGAACAACAACTC - 3'), NTHI-RE-ZR2 (5' - GCCTCTTCAGCTTGCTTCTG - 3'), ZR1-EcoRI (5' - CCGGAATTCAAAGTGCGGTAGATTTAGTCG
TAGTAATTGATTTACTTATG - 3') y ZR2-XbaI (5' -CTAGTCTAGAACGTTGCTGTTCTTGCTG - 3'). Después de amplificación térmica, se analizó una parte alícuota de \sim10 \mul de la reacción por electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 1% en un tampón de Tris-borato-EDTA (TBE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron por iluminación UV después de electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se realizó la electroforesis de un patrón de tamaño molecular de ADN (Smartladder, Eurogentec) en paralelo con las muestras de ensayo y se usó para calcular el tamaño de los productos de la PCR. Varios transformantes produjeron el producto de la PCR del tamaño esperado y se identificaron como cepas mutantes de Haemophilus influenzae no tipificable que llevan el casete de resistencia al antibiótico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Deleción de los genes tolRA en Haemophilus influenzae no tipificable

El objetivo del experimento era eliminar los genes tolRA Haemophilus influenzae no tipificable (NTHI) con el fin de obtener una cepa formadora de hiperburbujas.

Para este propósito, se construyó un plásmido mutador usando tecnologías de clonación de E. coli. Las etapas principales se muestran en la figura 5. Brevemente, se extrajo el ADN genómico de la cepa de Haemophilus influenzae no tipificable 3224A utilizando el kit de extracción de ADN genómico de QIAGEN (Qiagen Gmbh). Este material se usó para amplificar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de ADN de 1797 nucleótidos que cubría 244 nucleótidos secuencia arriba del codón del gen tolR hasta el codón de parada de tolA usando los cebadores ZR5-EcoRI (5'-CCGGAATTCAAAGTGCGGTAGATTTAGTCGTAATTCGCTGAGGCC - 3') y ZR6-XbaI (5' - CTAGTCTAGATTATCGAATATCAAAGTCAATAATG - 3'). Este producto de la PCR se introdujo en el vector de clonación pGEM-T (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido obtenido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer, (1992), Biotechniques 12: 528-534) con el fin de suprimir los genes tolRA (que consiste en una amplificación del vector entero sin la región comprendida entre los dos cebadores). La PCR circular se llevó a cabo usando los cebadores ZR5-BamHI (5' - CGCGGATCCTTCTTCTGTTTAAACCTTCTTG - 3') y ZR6-BamHI (5' - CGCGGATCCAAGCAAAGGCTGAAGCGG - 3') que hibridan con 527 nucleótidos secuencia abajo del codón de inicio de tolR y 500 nucleótidos secuencia arriba del codón de parada de tolA, respectivamente (Figura 5). Ambos cebadores contienen un sitio de restricción BamHI (subrayado). El fragmento de la PCR obtenido después se purificó usando el kit PCR Clean Up (Boehringer), se hizo digerir con BamHI y se ligó, dando como resultado un plásmido que llevaba una secuencia 5'-flanqueadora de 502 nucleótidos y una secuencia 3'-flanqueadora de 500 nucleótidos separadas por un sitio de restricción BamHI. Después se introdujeron casetes de resistencia a la kanamicina en el sitio BamHI con el fin de poder seleccionar recombinantes en las bacterias huésped. Se subclonaron dos casetes diferentes dando dos plásmidos diferentes, uno era el gen de resistencia a la kanamicina de Tn903 (KanR) subclonado en el plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech) y el otro era un casete sacB-neo procedente de pIB279 que llevaba el gen de resistencia a la kanamicina de Tn5 y el gen sacB (Blomfield y col., (1991), Molecular Microbiology, 5: 1447-1457). sacB es un marcador de contraselección perjudicial para bacterias en presencia de sacarosa y permite sacar más el casete. Ambos casetes se subclonaron usando los sitios de restricción BamHI disponibles. Las secuencias de los clones obtenidos se han confirmado usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 373A/PRISM. Alternativamente, se puede usar el vector suicida pKNG101 para introducir la mutación después de subclonar las regiones flanqueadoras en el sitio de multiclonación del vector (Kaniga y col., (1991), Gene 109:137-141).

Se usó el plásmido que lleva el marcador de resistencia a la kanamicina de Tn903 para transformar la cepa de Haemophilus influenzae no tipificable 3224. La transformación se realizó usando células NTHI competentes obtenidas por un tratamiento con cloruro de calcio de acuerdo con "Methods in Enzymology, Bacterial genetic systems", ed. J. H. Miller, Academic Press Inc., vol. 204, p. 334. Los clones recombinantes de Haemophilus influenzae no tipificable se seleccionaron en placas GC que contenían kanamicina 15 \mug/ml y los mutantes resultantes de un suceso recombinante doble se cribaron por PCR usando los cebadores NTHI-FO-ZR5 (5' - CGCTGAGGCCTTGATTGC - 3'), NTHI-RE-ZR6 (5'- GTACAATCGCGAATACGCTCAC - 3'), ZR5-EcoRI (5' -CCGGAATTCAAAGTGCGGTAGATTTAGTCGTA
ATTCGCTGAGGCC - 3') y ZR6-XbaI (5' - CTAGTCTAGATTATC-GAATATCAAAGTCAATAATG - 3'). Después de amplificación térmica, se analizó una parte alícuota de \sim10 \mul de la reacción por electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 1% en un tampón de Tris-borato-EDTA (TBE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron por iluminación UV después de electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se realizó la electroforesis de un patrón de tamaño molecular de ADN (Smartladder, Eurogentec) en paralelo con las muestras de ensayo y se usó para calcular el tamaño de los productos de la PCR. Varios transformantes produjeron el producto de la PCR del tamaño esperado y se identificaron como cepas mutantes de Haemophilus influenzae no tipificable que llevan el casete de resistencia al antibiótico.

\newpage

Ejemplo 6

Mutación del gen P5 en Haemophilus influenzae no tipificable

El objetivo del experimento era mutar el gen P5 de Haemophilus influenzae (NTHI) en un gen truncado sin la región codificante 3' asociada a péptidoglucanos, con el fin de obtener una cepa de NTHI formadora de hipervesículas. En este experimento se introdujo un codón de parada después de la fenilalanina al final del dominio de transmembrana de la proteína.

Para este propósito, se construyó un plásmido mutador usando las tecnologías de clonación de E. coli. Las etapas principales se muestran en la figura 7. Brevemente, el ADN genómico se extrajo de la cepa de Haemophilus influenzae no tipificable 3224A usando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen Gmbh). Este material se usó para amplificar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de ADN de 1047 nucleótidos secuencia arriba y secuencia abajo del codón TTT que codifica el resto de fenilalanina crítico, usando los cebadores P5-01 bis (5'-GATGAATTCAAAGTGCGGTAGATTTAGTCGTAGTAAT-TAATAACTTA - 3') y P5-02 (5' - CTAGTCTAGAAGGTTTCCATAATGTTTCCTA - 3'). Este producto de la PCR se introdujo en el vector de clonación pGEM-T (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después el plásmido obtenido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer, (1992), Biotechniques 12: 528-534) con el fin de introducir un codón de parada y un sitio de restricción BamHI. La PCR circular se llevó a cabo usando los cebadores (5' - CGCG-GATCC CTAAAAAGTTACATCAGAATTTAAGC- 3') y P5-04 (5' - CGCGGATCCGCATTTGGTAAAGCAAACTT - 3') que hibridan exactamente con el codón TTT que codifica la fenilalanina (Figura 7). Ambos cebadores contienen un sitio de restricción BamHI (subrayado) y el cebador 3 también contiene también el codón de parada (negrilla). Después el fragmento de la PCR obtenido se purificó usando el kit PCR Clean Up (Boehringer), se hizo digerir con BamHI y se ligó, dando como resultado un plásmido que llevaba una secuencia 5'-flanqueadora de 518 nucleótidos y una secuencia 3'-flanqueadora de 538 nucleótidos separadas por un sitio de restricción BamHI. Después se introdujeron casetes de resistencia a la kanamicina en el sitio BamHI con el fin de poder seleccionar recombinantes en las bacterias huésped. Se subclonaron dos casetes diferentes dando dos plásmidos diferentes, uno era el gen de resistencia a la kanamicina de TN903 (KanR) subclonado en el plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech) y el otro era un casete SacB-neo procedente de pIB179 que lleva el gen de resistencia a la kanamicina de Tn5 y el gen sacB (Blomfield y col., (1991), Molecular Microbiology, 5:1447-1457). sacB es un marcador de contraselección perjudicial para las bacterias en presencia de sacarosa y permite sacar más el casete. Ambos casetes se subclonaron usando los sitios de restricción BamHI disponibles. Las secuencias de los clones obtenidos se confirmaron usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 373A/PRISM. Alternativamente, se puede usar el vector suicida pKNG101 para introducir la mutación después de subclonar las regiones flanqueadoras en el sitio de multiclonación del vector (Kaniga y col., (1991), Gene 109: 137-141).

Se usó el plásmido que lleva el marcador de resistencia a la kanamicina de Tn903 para transformar la cepa de Haemophilus influenzae no tipificable 3224. La transformación se realizó usando células NTHI competentes obtenidas por un tratamiento con cloruro de calcio de acuerdo con "Methods in Enzymology, Bacterial genetic systems", ed. J. H. Miller, Academic Press Inc., vol. 204, p. 334. Los clones recombinantes de Haemophilus influenzae no tipificable se seleccionaron en placas GC que contenían kanamicina 15 \mug/ml y los mutantes resultantes de un suceso recombinante doble se cribaron por PCR usando los cebadores P5-01 bis (5'-GATGAATTCAAAGTGCGGTAGATTTAGTCGTAGTAATTAATAACTTA - 3') y P5-02 (5' - CTAGTCTAGAAGGTT-TCCATAATGTTTCCTA - 3'). Después de amplificación térmica, se analizó una parte alícuota de \sim10 \mul de la reacción por electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 1% en un tampón de Tris-borato-EDTA (TBE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron por iluminación UV después de electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se realizó la electroforesis de un patrón de tamaño molecular de ADN (Smartladder, Eurogentec) en paralelo con las muestras de ensayo y se usó para calcular el tamaño de los productos de la PCR. Varios transformantes produjeron el producto de la PCR del tamaño esperado y se identificaron como cepas mutantes de Haemophilus influenzae no tipificable que llevan el casete de resistencia al antibiótico.

SEQ. ID NO: 1

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de exbB de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

Nº de acceso y secuencias (ADN y proteína) de la cepa de NmB ExbB

3

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 2

Secuencia de aminoácidos de ExbB de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 3

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de exbD de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

Nº de acceso y secuencias (ADN y proteína) de la cepa NmB de ExbD

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 4

Secuencia de aminoácidos de ExbD de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 5

Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) secuencia arriba del gen exbB de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

Secuencia de ADN de 1 kb secuencia arriba de ExbB de la cepa MC58 de NmB

7

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 6

Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) secuencia arriba del gen exbD de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

Secuencia de ADN de 1 kb secuencia arriba de ExbB de la cepa MC58 de NmB

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 7

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de rmpM de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

Nº de acceso de RmpM (también llamado OMP4 en N. menigitidis)

Cepa Nm MC58 (serogrupo B): (secuencias de ADN y proteína)

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 8

Secuencia de aminoácidos de RmpM de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

10

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 9

Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (729 pb) correspondiente al gen rmpM de Neisseria meningitidis serogrupo A, cepa Z2491

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 10

Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) secuencia arriba del gen rmpM de Neisseria meningitidis (serogrupo B) - cepa MC58

Secuencia de ADN de 1 kb secuencia arriba de RmpM de la cepa MC58 de NmB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de nucleótidos:

Tol Q: complemento (5168..5854) debajo de SEQ ID NO: 11 - cepa H. influenzae HiRD

Tol R: complemento (4677..5096) debajo de SEQ ID NO: 13 - cepa H. influenzae HiRD

Tol A: complemento (3543..4661) debajo de SEQ ID NO: 15 - cepa H. influenzae HiRD

Tol B: complemento (2218..3501) debajo de SEQ ID NO: 17 - cepa H. influenzae HiRD

13

\newpage

SEQ ID NO: 12 - secuencia de aminoácidos de TolQ - cepa H. influenzae HiRD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 14 - secuencia de aminoácidos de TolR - cepa H. influenzae HiRD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 16 - secuencia de aminoácidos de TolA - cepa H. influenzae HiRD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 18 - secuencia de aminoácidos de TolB - cepa H. influenzae HiRD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

17

\newpage

SEQ. ID NO: 19

Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) secuencia arriba del operón TolQRAB de H. influenzae - cepa HiRD

Secuencia promotora (1000 nt) secuencia arriba: secuencia complementaria (atg en negrilla)

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 20

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de P5 de H. influenzae no tipificable

19

\newpage

SEQ. ID NO: 21

Secuencia de aminoácidos de P5 de H. influenzae no tipificable

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 22

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de P6 de H. influenzae cepa HiRD

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 23

Secuencia de aminoácidos de P6 de H. influenzae cepa HiRD

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 24

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de P6 de H. influenzae no tipificable

\vskip1.000000\baselineskip

23

\newpage

SEQ. ID NO: 25

Secuencia de aminoácidos de P6 de H. influenzae no tipificable

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 26

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de pcp de H. influenzae cepa HiRD

PCP de HiRD

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 27

Secuencia de aminoácidos de pcp de H. influenzae cepa HiRD

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TolQ 22100-22789 debajo de SEQ ID NO: 28 - Moraxella catarrhalis

TolR 22185-23250 debajo de SEQ ID NO: 30 - Moraxella catarrhalis

TolB 24097-25359 debajo de SEQ ID NO: 34 - Moraxella catarrhalis

TolX 23253-24080 debajo de SEQ ID NO: 32 - Moraxella catarrhalis

La secuencia 21051-25650 también es una secuencia de nucleótidos adicional de la invención, en particular la región de 1000 pb secuencia arriba del codón de inicio del gen TolQ.

MCA1C0024 Longitud: 33248 Tipo: N Comprobar: 1253..

27

28

29

\newpage

SEQ ID NO: 29 - secuencia de aminoácidos de TolQ de M. catarrhalis

!!AA_SECUENCIA 1.0

Traducción de: contig24.txt comprobar: 1253 de: 22100 a: 22786

símbolos generados 1 a: 229.

MCA1c0024

tolQ-Mcat.pep Longitud: 229, 22 de diciembre, 1999 09:12 Tipo: P Comprobar: 2526..

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 31 - secuencia de aminoácidos de TolR de M. catarrhalis

!!AA_ SECUENCIA 1.0

Traducción de: contig24.txt comprobar: 1253 de: 22815 a: 23246

símbolos generados 1 a: 144.

MCA1c0024

tolR-Mcat.pep Longitud: 144, 22 de diciembre, 1999 09:13 Tipo: P Comprobar: 507..

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 33 - secuencia de aminoácidos de TolX de M. catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 35 - secuencia de aminoácidos de TolB de M. catarrhalis

!!AA_ SECUENCIA 1.0

Traducción de: contig24.txt comprobar: 1253 de: 24097 a: 25356

símbolos generados 1 a: 420.

MCA1c0024

tolB-Mcat.pep Longitud: 420, 22 de diciembre, 1999 09:08 Tipo: P Comprobar: 3135..

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

SEQ ID NO: 36

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de tolA de M. catarrhalis

Nucleótidos de TolA 27473-28852 en la siguiente secuencia

La secuencia 26451-28900 también es una secuencia de nucleótidos adicional de la invención, en particular la región de 1000 pb secuencia arriba del codón de inicio del gen TolA

! !NA_ SECUENCIA 1.0

MCA1C0028 Longitud: 49617, Tipo: N Comprobar: 3684..

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\newpage

SEQ ID NO: 37 - secuencia de aminoácidos de TolA de Moraxella catarrhalis

! !AA_ SECUENCIA 1.0

Traducción de: contig28.txt comprobar: 3684 de: 27473 a: 28849

símbolos generados 1 a: 459.

MCA1c0028

tolB-Mcat.pep Longitud: 459, 22 de diciembre, 1999 09:05 Tipo: P Comprobar: 8307..

36

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 38

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de OmpCD de Moraxella catarrhalis

ADN de Omp CD Mcat

Acceso L10755

37

370

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 39

Secuencia de aminoácidos de OmpCD de Moraxella catarrhalis

Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

SEQ ID NO: 40

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de xOmpA de Moraxella catarrhalis

xompa

! !NA_SECUENCUA 1.0

MCA1C0035

mca1c0035.seq Longitud: 2461, 2 de diciembre, 1999 11:22 Tipo: N Comprobar: 9214..

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 41

Secuencia de aminoácidos de xOmpA de Moraxella catarrhalis, y también mostrada en la figura 2

xompa

! !AA_ SECUENCIA 1.0

Traducción de: omp854.seq comprobar: 9214 de: 1 a: 2461

símbolos generados 1 a: 820.

MCA1C0035

omp854.pep Longitud: 553, 2 de diciembre, 1999 11:35 Tipo: P Comprobar: 5451..

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

42

\newpage

SEQ. ID NO: 42

Secuencia de nucleótidos de la región codificante de tipo P6 (o PAL-1) de Moraxella catarrhalis

ADN (tipo P6) Pal mcat

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID NO: 43

Secuencia de aminoácidos de tipo P6 (o PAL-1) de Moraxella catarrhalis

Péptido (tipo P6) Pal Mcat

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

SEQ. ID NO: 44

Secuencia de nucleótidos de la región codificante PAL-2 de Moraxella catarrhalis

! !NA_SECUENCIA 1.0

Definición: MCat Lipo4 2ª lipoproteína tipo Pal BASB113 SBBMCA012

Acceso: BASB113

Lipo4_MCat.seq Longitud: 675 28 de abril, 1999 09:31 Tipo: N Comprobar:

LIPO04_MCAT Longitud: 675 7 de febrero, 2001 17:42 Tipo: N Comprobar: 4424..

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

SEQ. ID NO: 45

Secuencia de aminoácidos de PAL-2 de Moraxella catarrhalis. Véase la figura 2.

Pal2

! !AA_SECUENCIA 1.0

Definición: MCat Lipo4 2ª lipoproteína tipo Pal BASB113 SBBMCA012

Acceso: BASB113

Lipo4_MCat.pep Longitud: 224 28 de abril, 1999 09:21 Tipo: P Comprobar:

LIPO04_MCAT Longitud: 224 20 de diciembre, 1999 12:28 Tipo: P Comprobar: 4279..

\vskip1.000000\baselineskip

46

Claims (12)

1. Una bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas que se ha modificado genéticamente por reducción de la expresión de uno o más genes Tol.

2. La bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas de la reivindicación 1, en la que la bacteria se ha modificado genéticamente atenuando la actividad de unión a péptidoglucanos por mutación de uno o más genes que codifican una proteína que comprende un sitio asociado a péptidoglucanos.

3. La bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas de la reivindicación 1 ó 2, que se ha modificado genéticamente por reducción de la expresión de uno o los dos genes seleccionados de un grupo que consiste en exbB (tolQ) y exbD (tolR).

4. La bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas de las reivindicaciones 1-3, que se ha modificado genéticamente por mutación de rmpM para atenuar la actividad de unión a péptidoglucanos de la proteína codificada.

5. La bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas de las reivindicaciones 1-4, que se ha diseñado además genéticamente mediante uno o más procedimientos seleccionados del siguiente grupo: (a) un procedimiento de reducción de la expresión de antígenos inmunodominantes variables o no protectores, (b) un procedimiento de aumento de la expresión de antígenos OMP protectores, (c) un procedimiento de reducción de la expresión de un gen implicado en hacer tóxica la parte de lípido A del LPS, (d) un procedimiento de aumento de la expresión de un gen implicado en hacer menos tóxica la parte de lípido A del LPS, y (e) un procedimiento de diseño de la cepa bacteriana para la producción de vesículas de modo que esté desprovista de polisacárido capsular.

6. Una vacuna que comprende la bacteria definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, para usar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal.

8. Un uso de una cantidad eficaz de la bacteria definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la fabricación de un medicamento para proteger a un individuo frente a una infección bacteriana.

9. Un procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende una preparación de vesículas de membrana, cuyo procedimiento comprende: (a) inocular un recipiente de cultivo que contiene la bacteria de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un medio nutriente adecuado para hacer crecer dicha bacteria; (b) cultivar dicha bacteria; (c) recuperar las vesículas de membrana del medio; y (d) mezclar dichas vesículas de membrana con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, que además comprende una etapa después de la etapa (c) o etapa (d), cuya etapa comprende esterilizar por filtración la preparación de las vesículas de membrana.

11. Un procedimiento para producir una bacteria Neisseria meningitidis formadora de hipervesículas de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, cuyo procedimiento comprende modificar genéticamente la cepa bacteriana diseñando la cepa para reducir la expresión de uno o más genes Tol.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, que además comprende la etapa de atenuar la actividad de unión a péptidoglucanos por mutación de uno o más genes que codifican una proteína que comprende un sitio asociado a péptidoglucanos.