ES2399057T3 - Vacuna de ampolla modificada por ingeniería genética - Google Patents

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Wilfred L. J. Dalemans
Philippe Denoel
Guy Dequesne
Christiane Feron
Yves Lobet
Jan Poolman
Georges Thiry
Joelle Thonnard
Pierre Voet
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GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Una preparación de ampolla modificada por ingeniería genética a partir de una cepa bacteriana Gram negativa deNeisseria, Moraxella catharralis o Haemophilus influenzae, caracterizada porque dicha preparación se puedeobtener empleando el siguiente procedimiento: d) un procedimiento de modificación de la parte de lípido A de LPS bacteriano dentro de la preparación deampolla, que comprende las etapas de identificar un gen msbB implicado en hacer la parte del lípido A de LPStóxica, modificar por ingeniería genética una cepa bacteriana para reducir o inactivar la expresión de dicho gen,y fabricar ampollas a partir de dicha cepa.

Description

Vacuna de ampolla modificada por ingenieria genética
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de composiciones de vacuna de bacterias Gram-negativas, a su fabricación y al uso de dichas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere al campo de nuevas vacunas de vesículas de membrana externa (o ampollas), y a procedimientos ventajosos para hacer que estas vacunas sean más eficaces y más seguras.
Antecedentes de la invención
Las bacterias Gram-negativas están separadas del medio externo por dos capas sucesivas de estructuras de membrana. Estas estructuras, denominadas membrana citoplásmica y membrana externa (ME), difieren tanto estructural como funcionalmente. La membrana externa juega un papel importante en la interacción de bacterias patógenas con sus huéspedes respectivos. Por consiguiente, las moléculas bacterianas expuestas en la superficie representan dianas importantes para la respuesta inmune del huésped, haciendo que los componentes de la membrana externa sean candidatos atractivos para proporcionar vacunas, reactivos de diagnóstico y terapéuticos.
Las vacunas bacterianas de células completas (inactivadas o atenuadas) tienen la ventaja de suministrar múltiples antígenos en su microentorno natural. Son inconvenientes asociados con este enfoque los efectos secundarios inducidos por componentes bacterianos tales como fragmentos de endotoxinas y péptidoglicanos. Por otra parte, las vacunas de subunidad acelulares que contienen componentes purificados de la membrana externa pueden suministrar solo una protección limitada y pueden no presentar los antígenos de forma apropiada al sistema inmune del huésped.
Las proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos son los tres constituyentes principales encontrados en la membrana externa de todas las bacterias Gram-negativas. Estas moléculas se distribuyen asimétricamente: fosfolípidos de membrana (principalmente en la capa interna), lipooligosacáridos (exclusivamente en la capa externa) y proteínas (lipoproteínas de la capa interna y externa, proteínas de membrana integrales o politópicas). Para muchos patógenos bacterianos que afectan a la salud humana, se ha demostrado que los lipopolisacáridos y las proteínas de la membrana externa son inmunogénicos y pueden conferir protección contra la enfermedad correspondiente por medio de inmunización.
La ME de las bacterias Gram-negativas es dinámica y, dependiendo de las condiciones ambientales, puede experimentar transformaciones morfológicas drásticas. Entre estas manifestaciones se ha estudiado la formación de vesículas de membrana externa o “ampollas” y se ha documentado en muchas bacterias Gram-negativas (Zhou, L y col. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228). Entre estas, una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos que, según se ha notificado, producen ampollas incluyen: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica. Aunque no se entiende completamente el mecanismo bioquímico responsable de la producción de ampollas de ME, estas vesículas de membrana externa se han estudiado exhaustivamente ya que representan una metodología poderosa para aislar preparaciones de proteínas de membrana externa en su conformación nativa. En este contexto, el uso de preparaciones de membrana externa tiene un interés particular para desarrollar vacunas contra Neisseria, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa y Chlamydia. Además, las ampollas de membrana externa combinan múltiples antígenos proteicos y no proteicos que probablemente conferirán una protección prolongada contra variantes intraespecie.
En comparación con los otros tipos de vacunas bacterianas usados más ampliamente (vacunas bacterianas de células completas y vacunas de subunidad purificadas), los inventores mostrarán que las vacunas de ampollas de membrana externa (si están modificadas de ciertas formas) pueden representar el compromiso ideal.
El uso generalizado de vacunas de subunidad bacterianas se ha debido al intenso estudio de proteínas de la superficie bacteriana que se ha descubierto que son útiles en aplicaciones de vacuna [por ejemplo, pertactina de B. pertussis]. Estas proteínas están asociadas ligeramente con la membrana externa de la bacteria y pueden purificarse a partir del sobrenadante de cultivo o extraerse fácilmente de las células bacterianas. Sin embargo, también se ha mostrado que ciertas proteínas de membrana externa estructurales, integrales, también son antígenos protectores. Son ejemplos PorA en el caso de N. meningitidis serogrupo B; D15 en el caso de H. influenzae; PME CD en el caso de M. catarrhalis; y PME F en el caso de P. aeruginosa. Sin embargo, estas proteínas tienen características estructurales bastante específicas, particularmente múltiples láminas 1 anfipáticas, lo cual complica su uso directo como vacunas de subunidad purificadas (recombinantes).
Además, se ha hecho evidente que se necesitan vacunas de múltiples componentes (en términos de proteínas de la superficie bacteriana y proteínas integrales de membrana) para suministrar un nivel razonable de protección. Por ejemplo, en el caso de vacunas de subunidad de B. pertussis, las vacunas multicomponente son superiores a los productos mono- o bicomponente.
Para incorporar proteínas integrales de la membrana externa en dicho producto de subunidad, en el producto tiene que estar presente el plegamiento conformacional nativo (o casi nativo) de las proteínas para tener un efecto inmunológico útil. El uso de vesículas de membrana externa o ampollas excretadas puede ser una solución elegante al problema de incluir proteínas integrales de la membrana protectoras en una vacuna de subunidad mientras que al mismo tiempo se asegura que se pliegan de manera apropiada.
N. meningitidis serogrupo B (menB) excreta ampollas de membrana externa en suficientes cantidades para permitir su fabricación a escala industrial. Se ha descubierto que dichas vacunas de proteína de membrana externa multicomponente de cepas de menB naturales son eficaces para proteger a los adolescentes de la enfermedad producida por menB y se han registrado en Latinoamérica. Un procedimiento alternativo para preparar vesículas de la membrana externa es a través del procedimiento de extracción con detergente de las células bacterianas (documento EP 11243).
Son ejemplos de especies bacterianas a partir de las cuales pueden prepararse vacunas de ampollas.
Neisseria meningitidis:
Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram-negativa aislada con frecuencia del tracto respiratorio superior humano. Ocasionalmente produce enfermedades bacterianas invasivas tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de la enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas estacionales y anuales (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S 18-S24, 1989). La enfermedad en los países templados principalmente se debe a cepas del serogrupo B y varía en incidencia de 1-10/100.000/año en la población total alcanzando algunas veces valores superiores (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., y col. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990). Las incidencias específicas de edad en los dos grupos de alto riesgo, niños y adolescentes, alcanzan niveles superiores.
Las epidemias dominadas por los meningococos del serogrupo A se producen principalmente en África central, alcanzando algunas veces niveles de hasta 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). Casi todos los casos de enfermedad meningocócica en conjunto se producen por meningococos del serogrupo A, B, C, W-135 e Y. Se dispone de una vacuna tetravalente de polisacáridos capsulares A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335339, 1982).
Las vacunas de polisacáridos actualmente se están mejorando por medio de la conjugación química con proteínas de soporte (Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K., y col. JAMA 275: 1499-1503, 1996). No se dispone de una vacuna del serogrupo B, ya que el polisacárido capsular B no es inmunogénico, muy probablemente debido a que comparte similitud estructural con componentes del huésped (Wyle, F. A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L. y col. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M., Mäkelä, P. M. Lancet ii.: 355-357, 1983).
Durante muchos años, los esfuerzos se han dirigido a desarrollar vacunas basadas en la membrana externa del meningococo (de Moraes, J. C., Perkins, B., Camargo, M.C. y col. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby,
E.A. Gronnesby, J.K. y col. 338: 1093-1096, 1991). Dichas vacunas han demostrado eficacias del 57% al 85% en niños mayores (>4 años) y adolescentes. La mayoría de estos ensayos de eficacia se realizaron con vacunas de VME (vesículas de membrana externa, obtenidas por retirada de LPS de ampollas) derivadas de cepas B de N. meningitidis de tipo silvestre.
Muchos componentes de la membrana externa de las bacterias están presentes en estas vacunas, tales como PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB, y la contribución de estos componentes a la protección observada aún necesita una definición adicional. Se han definido otros componentes de la membrana externa de las bacterias (usando anticuerpos animales o humanos) como potencialmente relevantes para la inducción de inmunidad protectora, tales como TbpB, NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B. R., J. Exp. Med. 185: 1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maître-Wilmotte, C., Dumas, p. y col., Inf. Immun. 63: 884-890, 1995). El mecanismo de inmunidad protectora implicará actividad bactericida mediada por anticuerpos y opsonofagocitosis.
También se han investigado preparaciones en ampollas de Neisseria meningitidis modificadas por ingenieria genética. Partiendo de la cepa H44/76 de Neisseria meningitidis, se construyó un conjunto de cepas portadoras copias cromosómicas múltiples del gen porA para su uso en la producción de una vacuna de vesícula de membrana externa multivalente (Van der Ley, P Van der Biezen , J. and Poolman, J. T., Vaccine 13: 401-407). También se ha comprobado la posibilidad de inactivar la etapa temprana de la síntesis del Lípido A de bacterias Gram negativas de la mucosa sin comprometer la viabilidad celular. En particular, en N.meningitidis se mutó el gen IpxA y se descubrió que los mutantes knockout carecían por completo de lipopolisárido (LPS). (Documento WO 99/10497).
La frecuencia de infecciones por Neisseria meningitidis se ha elevado espectacularmente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a antibióticos, y a la mayor exposición debido a un aumento de las actividades sociales (por ejemplo, piscinas o teatros). Ya no es insólito aislar cepas de Neisseria meningitidis que sean resistentes a algunos o todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y la demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos y ensayos de diagnóstico para este organismo.
Moraxella catarrhalis
Moraxella catarrhalis (también denominada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram-negativa aislada con frecuencia del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo la principal la otitis media en bebés y niños, y la neumonía en ancianos. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y, con menos frecuencia, enfermedades invasivas.
Se han identificado anticuerpos bactericidas en la mayoría de los adultos ensayados (Chapman, AJ y col. (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad de resistir a la actividad bactericida del suero: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que los que simplemente están colonizados (Hol, C y col. (1993) Lancet 341: 1281, Jordan, KL y col. (1990) Am. J. Med. 88 (suppl. 5A):28S). Por lo tanto, la resistencia del suero podría considerarse un factor de virulencia de la bacteria. Se ha observado una actividad de opsonización en el suero de niños que se están recuperando de otitis media.
No se han identificado los antígenos a los que se dirigen estas diferentes respuestas inmunes en seres humanos, con la excepción de PME B1, una proteína de 84 kDa, cuya expresión está regulada por hierro, y que se reconoce por el suero de pacientes con neumonía (Sethi, S, y col. (1995) Infect. Immun. 63: 1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen
D. y col. (1999), Infect. Immun. 67: 1310).
Otras proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis se han caracterizado usando procedimientos bioquímicos por su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (como revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol.Rev. 60: 267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos inducidos contra algunas de ellas (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está muy conservado entre cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que se ha demostrado que es eficaz contra esta bacteria en modelos animales.
M. catarrhalis produce vesículas de membrana externa (Ampollas). Estas Ampollas se han aislado o extraído usando diferentes procedimientos (Murphy T. F., Loeb M. R. 1989. Microb. Pathog. 6: 159-174; Unhanand M., Maciver, I., Ramillo O., Arencibia-Mireles O., Argyle J.C., McCracken G.H. Jr., Hansen E.J. 1992. J. Infect. Dis. 165: 644-650). La capacidad protectora de dichas preparaciones de ampollas se han ensayado en un modelo murino de eliminación pulmonar de M. catarrhalis. Se ha mostrado que la inmunización activa con la vacuna de ampollas o la transferencia pasiva de anticuerpos anti-ampollas inducen una protección significativa en este modelo (Maciver I., Unhanand M., McCracken G.H. Jr., Hansen, E.J. 1993. J. Infect. Dis. 168: 469-472).
Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae es una bacteria Gram-negativa no móvil. El hombre es su único huésped natural. Los aislados de H. influenzae normalmente se clasifican de acuerdo con su cápsula de polisacáridos. Se han identificado seis tipos capsulares diferentes denominados “a” a “f”. Los aislados que no pueden aglutinar con antisueros inducidos contra uno de estos seis serotipos se clasifican como no tipificables y no expresan una cápsula.
H. influenzae tipo b (Hib) es claramente diferente de los otros tipos, ya que es una causa principal de meningitis bacteriana y enfermedades sistémicas. Solo se aíslan ocasionalmente cepas no tipificables de H. influenzae (NTHi) a partir de la sangre de pacientes con enfermedad sistémica. NTHi es una causa común de neumonía, exacerbación de bronquitis crónica, sinusitis y otitis media. Las cepas de NTHi demuestran una gran variabilidad como se identifica por análisis clonal, mientras que las cepas Hib en su conjunto son más homogéneas.
Se ha mostrado que diversas proteínas de H. influenzae están implicadas en la patogénesis o se ha mostrado que confieren protección tras la vacunación en modelos animales.
Se ha notificado adherencia de NTHi a células del epitelio nasofaríngeo humano (Read RC. y col. 1991. J. Infect. Dis. 163: 549). Aparte de las fimbrias y los pili (Brinton CC. y col. 1989. Pediatr. Infect. Dis. J. 8: S54; Kar S. y col. 1990. Infect. Immun. 58: 903; Gildorf JR. y col. 1992. Infect. Immun. 60: 374; St. Geme JW y col. 1991. Infect. Immun. 59: 3366; St. Geme JW y col. 1993. Infect. Immun. 61: 2233), se han identificado muchas adhesinas en NTHi. Entre ellas, se ha mostrado que dos proteínas de alto peso molecular expuestas en la superficie denominadas HMW1 y HMW2 median la adhesión de NTHi a células epiteliales (St. Geme JW. y col. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2875). Se ha identificado otra familia de proteínas de alto peso molecular en cepas de NTHi que carecen de proteínas pertenecientes a la familia HMW1/HMW2. La proteína Hia de 115 kDa de NTHi (Barenkamp SJ., St Geme
S.W. 1996. Mol. Microbiol. En prensa) es muy similar a la adhesina Hsf expresada por las cepas de H. influenzae tipo b (St. Geme JW. y col. 1996. J. Bact. 178: 6281). Otra proteína, la proteína Hap muestra similitud con serina proteasas IgA1 y se ha mostrado que está implicada tanto en la adhesión como en la entrada en la célula (St. Geme JW. y col. 1994. Mol. Microbiol. 14: 217).
Se han identificado cinco proteínas de membrana externa (PME) principales y se han numerado numéricamente. Los estudios originales usando cepas de H. influenzae tipo b mostraron que anticuerpos específicos para PME P1 y P2 protegían a crías de rata de la exposición posterior (Loeb MR. y col. 1987. Infect. Immun. 55: 2612; Musson RS. Jr. y col. 1983. J. Clin. Invest. 72: 677). Se descubrió que P2 podía inducir anticuerpos bactericidas y opsónicos, que se dirigen contra las regiones variables presentes dentro de estructuras de bucle expuestas en la superficie de esta PME integral (Haase EM. y col. 1994 Infect. Immun. 62: 3712; Troelstra A. y col. 1994 Infect. Immun. 62: 779). La lipoproteína P4 también puede inducir anticuerpos bactericidas (Green BA. y col. 1991. Infect. Immun. 59: 3191).
La PME P6 es una lipoproteína asociada a peptidoglicano conservada que constituye hasta un 1-5% de la membrana externa (Nelson MB. y col. 1991. Infect. Immun. 59: 2658). Posteriormente se reconoció una lipoproteína de aproximadamente el mismo peso molecular denominada PCP (proteína de reacción cruzada con P6) (Deich RM. y col. 1990. Infect. Immun. 58: 3388). Una mezcla de las lipoproteínas conservadas P4, P6 y PCP no reveló protección como se mide en un modelo de otitis media de chinchilla (Green BA. y col. 1993. Infect. immun. 61: 1950). P6 sola parece inducir la protección en el modelo de chinchilla (Demaria TF. y col. 1996. Infect. Immun. 64: 5187).
También se ha descrito una proteína de fimbrina (Miyamoto N., Bakaletz, LO. 1996. Microb. Pathog. 21: 343) con homología con PME P5, que por sí misma tiene homología de secuencia con la OmpA integral de Escherichia coli (Miyamoto N., Bakaletz, LO. 1996. Microb. Pathog. 21: 343; Munson RS. Jr. y col. 1993. Infect. Immun. 61: 1017). NTHi parece adherirse al moco por medio de fimbrias.
En línea con las observaciones realizadas con gonococos y meningococos, NTHi expresa un receptor de transferrina humano dual compuesto de TbpA y TbpB cuando se desarrolla con limitación de hierro. El anticuerpo anti-TbpB protegía a crías de rata (Loosmore SM. y col. 1996. Mol. Microbiol. 19: 575). También se ha descrito el receptor de hemoglobina/haptoglobina para NTHi (Maciver I. y col. 1996. Infect. Immun. 64: 3703). También se ha identificado un receptor para Haem:Hemopexina (Cope LD. Y col. 1994. Mol. Microbiol. 13: 868). También está presente un receptor de lactoferrina entre NTHi, pero aún no se ha caracterizado (Schryvers AB. y col. 1989. J. Med. Microbiol.
29: 121). No se ha descrito una proteína similar a la proteína FrpB de Neisseria entre NTHi.
Una PME de 80 kDa, el antígeno de superficie D15, proporciona protección contra NTHi en un modelo de exposición de ratón. (Flack FS. y col. 1995. Gene 156: 97). Una lipoproteína de la membrana externa de 42kDa, LPD, está conservada entre Haemophilus influenzae e induce anticuerpos bactericidas (Akkoyunlu M. y col. 1996. Infect. Immun. 64: 4586). Se observó que una PME de 98 kDa minoritaria (Kimura A. y col. 1985. Infect. Immun. 47: 253) era un antígeno protector, esta PME puede ser muy bien una de las PME inducibles por limitación de Fe o adhesinas de alto peso molecular que se han caracterizado posteriormente. H. influenzae produce actividad IgA1-proteasa (Mulks MH., Shoberg RJ. 1994. Meth. Enzymol. 235: 543). Las IgA1-proteasas de NTHi tienen un alto grado de variabilidad antigénica (Lomholt H., van Alphen L., Kilian, M. 1993. Infect. Immun. 61: 4575).
Se ha mostrado que otra PME de NTHi, OMP26, una proteína de 26 kDa, aumenta la eliminación pulmonar en un modelo de rata (Kyd, J. M., Cripps, A. W. 1998. Infect. Immun. 66: 2272). También se ha mostrado que la proteína HtrA de NTHi es un antígeno protector. De hecho, esta proteína protegía a la chinchilla contra la otitis media y protegía a crías de rata contra la bacteremia inducida por H. influenzae tipo b (Loosmore S. M. y col. 1998. Infect. Immun. 66: 899).
Se han aislado vesículas de membrana externa (o ampollas) a partir de H. influenzae (Loeb M. R., Zachary A. L., Smith D. H. 1981. J. Bacteriol. 145: 569-604; Stull T. L., Mack K., Haas J. E., Smit J., Smith A.L. 1985. Anal. Biochem. 150: 471-480). Las vesículas se han asociado con la inducción de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (Wiwpelwey B., Hansen E. J., Scheld W. M. 1989 Infect. Immun. 57: 2559-2560), la inducción de la inflamación meníngea (Mustafa M. M., Ramilo O., Syrogiannopoulos G. A., Olsen K. D., McCraken G. H. Jr., Hansen,
E. J. 1989. J. Infect. Dis. 159: 917-922) y la captación del ADN (Concino M. F., Goodgal S.H. 1982 J. Bacteriol. 152: 441-450). Estas vesículas pueden unirse y absorberse por el epitelio de la mucosa nasal (Harada T., Shimuzu T., Nishimoto K., Sakakura Y. 1989. Acta Otorhinolarygol. 246: 218-221), mostrando que en las Ampollas podrían estar presentes adhesinas y/o factores de colonización. Se ha observado una respuesta inmune a proteínas presentes en las vesículas de la membrana externa en pacientes con diversas enfermedades producidas por H. influenzae (Sakakura Y., Harada T., Hamaguchi Y., Jin C. S. 1988. Acta Otorhinolarygol. Suppl. (Stockh.) 454: 222-226; Harada T., Sakakura Y., Miyoshi Y. 1986. Rhinology 24: 61-66).
Pseudomonas aeruginosa:
El género Pseudomonas consiste en bastones Gram-negativos, flagelados polarmente, rectos y ligeramente curvos que crecen aeróbicamente y no forman esporas. Debido a sus requisitos metabólicos limitados, Pseudomonas spp. es ubicua y se distribuye ampliamente en el suelo, el aire, aguas residuales y en plantas. Se ha mostrado que numerosas especies de Pseudomonas, tales como P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei, P. maltophilia y P. cepacia son patógenas para seres humanos. Entre esta lista, P. aeruginosa se considera un patógeno humano importante ya que está asociado con infecciones oportunistas de huéspedes inmunocomprometidos y es responsable de la alta morbilidad observada en pacientes hospitalizados. La infección nosocomial con P. aeruginosa afecta principalmente a pacientes sometidos a un tratamiento prolongado y que reciben agentes inmunosupresores, corticosteroides, antibióticos antimetabolitos o radiación.
Las Pseudomonas, y particularmente P. aeruginosa, produce una diversidad de toxinas (tales como hemolisinas, fibrinolisinas, esterasas, coagulasas, fosfolipasas, endo- y exotoxinas) que contribuyen a la patogenicidad de estas bacterias. Además, estos organismos tienen alta resistencia intrínseca a antibióticos debido a la presencia de múltiples bombas de salida de fármaco. Esta última característica con frecuencia complica las consecuencias de la enfermedad.
Debido al uso incontrolado de agentes quimioterapéuticos antibacterianos, la frecuencia de infección nosocomial producida por P. aeruginosa ha aumentado considerablemente durante los últimos 30 años. En los Estados Unidos, por ejemplo, se estima una carga económica de infección nosocomial por P. aeruginosa de 4,5 billones de dólares estadounidenses anualmente. Por lo tanto, se necesita activamente el desarrollo de una vacuna para inmunización activa o pasiva contra P. aeruginosa (como revisión, véase Stanislavsky y col. 1997. FEMS Microbiol. Lett. 21: 243277).
Diversos antígenos asociados con las células y secretados de P. aeruginosa han sido el objeto del desarrollo de vacunas. Entre los antígenos de Pseudomonas, se observó que la sustancia mucoide, que es una baba extracelular que consiste predominantemente en alginato, era heterogénea en términos de tamaño e inmunogenicidad. Los componentes de alginato de alta masa molecular (30-300 kDa) parecen contener epítopos conservados, mientras que los componentes de alginato de menor masa molecular (10-30 kDa) poseen epítopos conservados además de epítopos únicos. Entre las proteínas asociadas a la superficie, PcrV, que forma parte del aparato de secrecióntranslocación de tipo III, también ha mostrado ser una diana interesante para la vacunación (Sawa y col. 1999. Nature Medicine 5:392-398).
Se han usado antígenos expuestos en la superficie, incluyendo antígenos O (polisacárido O-específico de LPS) o antígenos H (antígenos flagelares) para la serotipificación debido a su naturaleza altamente inmunogénica. Se han esclarecido estructuras químicas de unidades repetidas de polisacáridos O-específicos y estos datos permitieron la identificación de 31 quimiotipos de P. aeruginosa. Los epítopos conservados entre todos los serotipos de P. aeruginosa están localizados en el oligosacárido nuclear y la región de lípido A de LPS y los inmunógenos que contienen estos epítopos inducen inmunidad de protección cruzada en ratones contra diferentes inmunotipos de P. aeruginosa. Se dedujo que el núcleo externo de LPS era un ligando para la unión de P. aeruginosa a las vías respiratorias y células del epitelio ocular de animales. Sin embargo, existe heterogeneidad en esta región nuclear externa entre los diferentes serotipos. Los epítopos en el núcleo interno están muy conservados y se ha demostrado que son accesibles a la superficie, y no están enmascarados por el polisacárido O-específico.
Para examinar las propiedades protectoras de proteínas ME, se ha usado una vacuna que contiene proteínas ME de
P. aeruginosa con masas moleculares que varían de 20 a 100 kDa en ensayos preclínicos y clínicos. Esta vacuna era eficaz en modelos animales contra la exposición a P. aeruginosa e inducía altos niveles de anticuerpos específicos en voluntarios humanos. El plasma de voluntarios humanos que contenía anticuerpos anti-P. aeruginosa proporcionaba protección pasiva y ayudaba a la recuperación del 87% de los pacientes con formas severas de infección por P. aeruginosa. Más recientemente, se mostró que una proteína híbrida que contenía partes de las proteínas de la membrana externa OprF (aminoácidos 190-342) y OprI (aminoácidos 21-83) de Pseudomonas aeruginosa fusionada a glutatión-S-transferasa protegía a los ratones contra una dosis 975 veces la dosis letal del 50% de P. aeruginosa (Knapp y col. 1999. Vaccine. 17: 1663-1669).
Los presentes inventores se han dado cuenta de varios inconvenientes asociados con las vacunas de ampollas de tipo silvestre anteriores (naturales o fabricadas químicamente).
Son ejemplos de dichos problemas los siguientes:
-
la presencia de proteínas imunodominantes pero variables en la ampolla (PorA; TbpB, Opa [N. meningitidis B];
P2, P5 [H. influenzae no tipificable]) - siendo dichas ampollas eficaces solo contra una selección restringida de
especies bacterianas. La especificidad de tipo de la respuesta de anticuerpo bactericida puede impedir el uso de
dichas vacunas en la infancia -la presencia de antígenos no protectores (no relevantes) (Rmp, H8, ...) en las ampollas - antígenos que son
reclamos para el sistema inmune -la ausencia de moléculas importantes que se producen condicionalmente (por ejemplo, proteínas de membrana
externa reguladas por hierro, IROMP, mecanismos de expresión regulados in vivo) - dichas condiciones son
difíciles de controlar en la producción de ampollas para optimizar la cantidad de antígeno en la superficie -el bajo nivel de expresión de antígenos protectores (particularmente conservados) (NspA, P6) -la toxicidad del LPS que queda en la superficie de la ampolla -la posible inducción de una respuesta autoinmune debido a estructuras idénticas del huésped (por ejemplo, el
polisacárido capsular en Neisseria meningitidis serogrupo B, la lacto-N-neotretaosa en LPS de Neisseria, la
estructura de sacárido dentro de LPS de ntHi, y estructuras de sacárido dentro de Pili).
Estos problemas pueden impedir el uso de vacunas de ampollas como reactivos de vacunas humanas. Esto es particularmente cierto para uso pediátrico (<4 años) en el que la reactogenicidad contra las vacunas de ampollas es particularmente importante, y en el que las vacunas de ampollas (por ejemplo, la vacuna de ampollas MenB comercializada mencionada previamente) han mostrado ser ineficaces en la inmunoprotección. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona procedimientos para aliviar los problemas anteriores usando cepas bacterianas modificadas por ingeniería genética, que tienen como resultado vacunas de ampollas mejoradas. Dichos procedimientos serán especialmente útiles en la generación de nuevas vacunas contra patógenos bacterianos tales como Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa y otras.
Las vacunas de ampollas de la invención están diseñadas para centrar la respuesta inmune en unos pocos antígenos protectores (preferentemente conservados) o epítopos - formulados en una vacuna de múltiples componentes. Cuando dichos antígenos son PME integrales, las vesículas de la membrana externa de las vacunas de ampollas asegurarán su plegamiento apropiado. La presente invención proporciona procedimientos para optimizar la composición de PME y LPS de las vacunas de VME (ampolla) mediante la deleción de la variable inmunodominante así como PME no protectoras, creando PME conservadas por deleción de regiones variables, mediante la regulación positiva de la expresión de PME protectoras y mediante la eliminación de mecanismos de control para la expresión (tales como restricción con hierro) de PME protectoras. Además, la invención proporciona una reducción en la toxicidad del lípido A modificando la parte lipídica o cambiando la composición de fosforilo mientras que conserva su actividad adyuvante o enmascarándola. Cada uno de estos nuevos procedimientos de mejora perfecciona individualmente la vacuna de ampolla, sin embargo, una combinación de uno o más de estos procedimientos actúa conjuntamente para producir una vacuna de ampolla modificada por ingeniería genética optimizada que es inmunoprotectora y no tóxica, particularmente adecuada para uso pediátrico.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una preparación de ampolla modificada genéticamente de una cepa bacteriana Gram negativa Neisserial, Moraxella catharralis o Haemophilus influenzae caracterizada porque dicha preparación se puede obtener empleando los siguientes procedimientos:
d) un procedimiento de modificación de la parte de lípido A de LPS bacteriano dentro de la preparación de ampolla, que comprende las etapas de identificar un gen msbB implicado en hacer la parte del lípido A de LPS tóxica, modificar por ingeniería genética una cepa bacteriana para reducir o inactivar la expresión de dicho gen, y fabricar ampollas a partir de dicha cepa.
Otros aspectos de la invención incluyen, procedimientos preferentes para obtener la preparación de ampolla anterior, incluyendo la colocación óptima de promotores fuertes para la regulación positiva de la expresión de antígenos dentro de ampollas, antígenos preferentes para la regulación positiva y la regulación negativa para diversas cepas bacterianas para obtener preparaciones de ampollas particularmente adecuadas para uso en vacunas. También se proporcionan formulaciones preferentes que comprenden las ampollas de la invención que son particularmente adecuadas para vacunas globales contra determinadas patologías. Los vectores para producir las ampollas de la invención y las cepas bacterianas modificadas a partir de las cuales se producen las ampollas de la invención son aspectos adicionales de la invención.
La presente invención proporciona por primera vez una vacuna de ampolla que es inmunoprotectora y no tóxica cuando se usa con niños de menos de 4 años de edad.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Reactividad del Acm (anticuerpo monoclonal) 735 en diferentes colonias.
Figura 2: Reactividades de anticuerpos monoclonales específicos por Elisa de células completas.
Figura 3: Representación esquemática de vectores pCMK usados para suministrar genes, operones y/o casetes de expresión en el genoma de Neisseria meningitidis.
Figura 4: Análisis de la expresión de PorA en extractos de proteína total de N. meningitidis recombinante serogrupo B (derivados de H44/76). Se recuperaron proteínas totales de cepas de N. meningitidis serogrupo B recombinantes cps- (calles 3 y 4), cps- porA::pCMK+ (calles 2 y 5) y cps-porA::nspA (calles 1 y 6) y se analizaron en condiciones de SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 12%. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie (calles 1 a 3) o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se tiñeron inmunológicamente con un anticuerpo monoclonal anti-PorA.
Figura 5: Análisis de la expresión de NspA en extractos de proteína de cepas de N. meningitidis serogrupo B recombinantes (derivados de H44/76). Se extrajeron proteínas de bacterias completas (calles 1 a 3) o preparaciones de ampollas de membrana externa (calles 4 a 6) separadas por SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 12% y se analizaron por inmunotransferencia usando un suero policlonal anti-NspA. Se analizaron muestras correspondientes a cps-(calles 1 y 6), cps- pora::pCMK+ (calles 3 y 4) y cps- porA::nspA (calles 2 y 5). Se detectaron dos formas de NspA: una forma madura (18 kDa) que co-migraba con la NspA purificada recombinante, y una forma más corta (15 kDa).
Figura 6: Análisis de la expresión de D15/omp85 en extractos de proteína de cepas de N. meningitidis serogrupo B recombinantes (derivados de H44/76). Se extrajeron proteínas de preparaciones de ampollas de membrana externa y se separaron por SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 12% y se analizaron por inmunotransferencia usando un suero policlonal anti-omp85. Se analizaron muestras correspondientes a cepas de N. meningitidis serogrupo B recombinantes cps- (calle 2) y cps-, PorA+, pCMK+Omp85/D15 (calle 1).
Figura 7: Estrategia general para modular la expresión génica por suministro de promotor (RS representa el sitio de restricción).
Figura 8: Análisis de ampollas de membrana externa producidas por cepas cps-de N. meningitidis serogrupo B recombinantes (derivados de H44/76). Se extrajeron proteínas de preparaciones de ampollas de membrana externa y se separaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras en un gel de poliacrilamida en gradiente del 4 al 20%. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R250. Las calles 2, 4 y 6 correspondían a 5 !g de proteínas totales, mientras que las calles 3, 5 y 7 se cargaron con 10 !g de proteínas.
Figura 9: Construcción de un plásmido de reemplazo de promotor usado para regular positivamente la expresión/producción de Omp85/D15 en Neisseria meningitidis H44/76.
Figura 10: Análisis de la expresión de OMP85 en extractos de proteína total de NmB recombinante (derivados de H44/76). Se tiñeron geles con azul de Coomassie (A) o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se tiñeron inmunológicamente con anticuerpo monoclonal anti-OMP85 de conejo (N. gono) (B).
Figura 11: Análisis de la expresión de OMP85 en preparaciones de VME de NmB recombinante (derivados de H44/76). Se tiñeron geles con azul de Coomassie (A) o se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se tiñeron inmunológicamente con anticuerpo policlonal anti-OMP85 de conejo (B).
Figura 12: Representación esquemática de estrategia de PCR recombinante usada para delecionar el lacO en el promotor quimérico de porA/lacO.
Figura 13: Análisis de la expresión de Hsf en extractos de proteína totales de N. meningitidis serogrupo B recombinante (derivados de H44/76). Se recuperaron proteínas totales de cepas de N. meningitidis serogrupo B recombinantes Cps-PorA+ (calle 1) y Cps-PorA+/Hsf (calle 2) y se analizaron en condiciones de SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 12%. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie.
Figura 14: Análisis de la expresión de GFP en extractos de proteína total de N. meningitidis recombinante (derivado de H44/76). La proteína total se recuperó a partir de cepas recombinantes Cps-, PorA+ (calle 1), Cps-, PorA- GFP+ (calles 2 y 3). Las proteínas se separaron por PAGE-SDS en un gel de poliacrilamida al 12% y después se tiñeron con azul de Coomassie.
Figura 15: Ilustración del patrón de proteínas principales en la superficie de diversas preparaciones de ampollas recombinantes como se analiza por SDS-PAGE (tinción con Coomassie).
Figura 16: Respuesta anti-Hsf específica para diversas preparaciones de ampollas y ampollas recombinantes usando proteína Hsf recombinante purificada.
Figura 17: Análisis de la expresión de NspA en extractos de proteína total de NmB recombinante (derivados del serogrupo B). Los geles se tiñeron con azul de Coomassie (A) o se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se tiñeron inmunológicamente con anticuerpo monoclonal anti-PorA de ratón (B) o anticuerpo policlonal anti-NspA de ratón (C).
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a una serie general de herramientas y procedimientos que pueden usarse para fabricar ampollas modificadas por ingeniería genética, mejoradas, a partir de cepas de bacterias Gram-negativas. La invención incluye procedimientos usados para fabricar ampollas recombinantes más inmunogénicas, menos tóxicas y más seguras para su uso en una vacuna humana y/o animal. Además, la presente invención también describe procedimientos específicos necesarios para construir, producir, obtener y usar ampollas modificadas por ingeniería genética, recombinantes, a partir de diversas bacterias Gram-negativas, para fines de vacuna, terapéuticos y/o de diagnóstico. Mediante los procedimientos de la divulgación, la composición bioquímica de ampollas bacterianas puede manipularse por actuación sobre/alteración de la expresión de genes bacterianos que codifican productos presentes o asociados con ampollas de la membrana externa bacteriana (proteínas de la membrana externa u PME). También se incluye en el alcance de la presente invención la producción de ampollas usando un procedimiento de modificación genética para aumentar, reducir o hacer condicional la expresión de uno o más genes que codifican componentes de la membrana externa.
Por claridad, la expresión “casete de expresión” se referirá en el presente documento a todos los elementos genéticos necesarios para expresar un gen o un operón y para producir y dirigir la proteína o proteínas correspondientes de interés a ampollas de la membrana externa, derivadas de un huésped bacteriano dado. Una lista no exhaustiva de estas características incluye elementos de control (transcripción y/o traducción), regiones codificantes de proteínas y señales de dirección, con una separación apropiada entre ellos. La referencia a la inserción de las secuencias promotoras significa, para los fines de la presente invención, la inserción de una secuencia con al menos una función promotora, y preferentemente uno o más elementos reguladores genéticos distintos comprendidos dentro de un casete de expresión. Además, la expresión “casete integrativo” se referirá en el presente documento a todos los elementos genéticos necesarios para integrar un segmento de ADN en un huésped bacteriano dado. Una lista no exhaustiva de estas características incluye un vehículo de liberación (o vector), con regiones recombinogénicas, y marcadores de selección y de selección opuesta.
De nuevo para proporcionar claridad, la expresión “modificación por ingeniería genética de una cepa bacteriana para producir menos de dicho antígeno” se refiere a cualquier medio para reducir la expresión de un antígeno de interés, con respecto a la de la ampolla no modificada (es decir natural), de tal forma que la expresión sea al menos un 10% inferior que la de la ampolla no modificada. Preferentemente, es al menos un 50% inferior. “Secuencia promotora más fuerte” se refiere a un elemento de control regulador que aumenta la transcripción para un gen que codifica un antígeno de interés. “Regulación positiva de la expresión” se refiere a cualquier medio para aumentar la expresión de un antígeno de interés, con respecto a la ampolla no modificada (es decir, natural). Se entiende que la cantidad de “regulación positiva” variará dependiendo del antígeno particular de interés, pero no superará una cantidad que altere la integridad de la membrana de la ampolla. La regulación positiva de un antígeno se refiere a una expresión que es al menos un 10% superior que la de la ampolla no modificada. Preferentemente, es al menos un 50% superior. Más preferentemente, es al menos un 100% (2 veces) superior.
Los aspectos de la invención se refieren a procedimientos individuales para fabricar ampollas modificadas por ingeniería genética mejoradas, a una combinación de dichos procedimientos y a las composiciones de ampollas obtenidas como resultado de estos procedimientos. Otro aspecto de la invención se refiere a las herramientas genéticas usadas para modificar genéticamente una cepa bacteriana elegida para extraer ampollas modificadas por ingeniería genética mejoradas a partir de dicha cepa.
Las etapas de modificación por ingeniería genética de los procedimientos de la invención pueden realizarse en una diversidad de formas conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, pueden insertarse secuencias (por ejemplo, promotores o fases de lectura abierta) y pueden alterarse promotores/genes por la técnica de inserción de transposones. Por ejemplo, para la regulación positiva de la expresión de un gen, podría insertarse un promotor fuerte a través de un transposón hasta 2 kb cadena arriba del codón de iniciación del gen (más preferentemente 200-600 pb cadena arriba y aún más preferentemente aproximadamente 400 pb cadena arriba). También puede usarse mutación puntual o deleción (particularmente para la regulación negativa de la expresión de un gen).
Dichos procedimientos, sin embargo, pueden ser bastante inestables o inciertos y, por lo tanto, se prefiere que la etapa de ingeniería genética [particularmente para los procedimientos a), b), c), d), e), h) e i) como se describe más adelante] se realice mediante un acontecimiento de recombinación homóloga. Preferentemente, el acontecimiento tiene lugar entre una secuencia (una región recombinogénica) de al menos 30 nucleótidos en el cromosoma bacteriano, y una secuencia (una segunda región recombinogénica) de al menos 30 nucleótidos en un vector transformado dentro de la cepa. Preferentemente, las regiones tienen 40-1000 nucleótidos, más preferentemente 100-800 nucleótidos, y aún más preferentemente 500 nucleótidos). Estas regiones recombinogénicas deben ser suficientemente similares para que sean capaces de hibridar entre sí en condiciones muy rigurosas (como se define más adelante).
Los acontecimientos de recombinación pueden tener lugar usando una sola región recombinogénica en el cromosoma y vector, o a través de un acontecimiento de entrecruzamiento doble (con 2 regiones en el cromosoma y vector). Para realizar un solo acontecimiento de recombinación, el vector debe ser una molécula de ADN circular. Para realizar un acontecimiento de recombinación doble, el vector podría ser una molécula de ADN circular o lineal (véase la Figura 7). Es preferible emplear un acontecimiento de recombinación doble y que el vector usado sea lineal, ya que la bacteria modificada producida de esta manera será más estable en términos de acontecimientos de reversión. Preferentemente, las dos regiones recombinogénicas en el cromosoma (y en el vector) son de longitud similar (más preferentemente iguales) para promover entrecruzamientos dobles. El entrecruzamiento doble funciona de tal forma que las dos regiones recombinogénicas en el cromosoma (separadas por la secuencia de nucleótidos "X") y las dos regiones recombinogénicas en el vector (separadas por la secuencia de nucleótidos "Y") se recombinan para dejar un cromosoma sin alteración con la excepción de que X e Y se hayan intercambiado. La posición de las regiones recombinogénicas puede ser cadena arriba o cadena abajo de, o pueden flanquear, una fase de lectura abierta de interés. Estas regiones pueden consistir en una secuencia codificante, no codificante o una mezcla de secuencias codificantes y no codificantes. La identidad de X e Y dependerá del efecto deseado. X puede ser todo o parte de una fase de lectura abierta e Y ningún nucleótido en absoluto, lo cual daría como resultado una secuencia X que se deleciona del cromosoma. Como alternativa, Y puede ser una región promotora fuerte para la inserción cadena arriba de una fase de lectura abierta, y por lo tanto X puede carecer de cualquier nucleótido.
Los vectores adecuados variarán en composición dependiendo del tipo de acontecimiento de recombinación que se vaya a realizar, y de cual sea el fin último del acontecimiento de recombinación. Los vectores de integración usados para liberar la región Y pueden ser condicionalmente replicativos o plásmidos suicidas, bacteriófagos, transposones o fragmentos de ADN lineales obtenidos por hidrólisis de restricción o amplificación por PCR. La selección del acontecimiento de recombinación se selecciona por medio de un marcador genético de selección, tal como genes que confieren resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, eritromicina, cloranfenicol o gentamicina), genes que confieren resistencia a metales pesados y/o compuestos tóxicos o genes que complementan mutaciones auxotróficas
(por ejemplo, pur, leu, met, aro).
Procedimiento a) y f) - Regulación negativa/Retirada de antígenos inmunodominantes Variables y no protectores
Muchos antígenos de superficie son variables entre cepas bacterianas y, como consecuencia, son protectores sólo contra una serie limitada de cepas muy relacionadas. Un aspecto de esta divulgación cubre la reducción en expresión o, preferentemente, la deleción del gen o los genes que codifican una o más proteínas de superficie variables, que da como resultado una cepa bacteriana que produce ampollas que, cuando se administran en una vacuna, tienen un mayor potencial de reactividad cruzada contra diversas cepas debido a la mayor influencia ejercida por proteínas conservadas (retenidas en las membranas externas) en el sistema inmune del individuo vacunado. Los ejemplos de dichos antígenos variables incluyen: para Neisseria - pili (PilC) que experimenta variaciones antigénicas, PorA, Opa, TbpB, FrpB; para H. influenzae - P2, P5, pilina, IgA1-proteasa; y para Moraxella - CopB, OMP106.
Otros tipos de genes que podrían regularse negativamente o inactivarse son genes que la bacteria puede activar (expresar) o inactivar in vivo. Como en la bacteria no siempre están presentes proteínas de membrana externa codificadas por dichos genes, la presencia de dichas proteínas en las preparaciones de ampollas también puede ser perjudicial para la eficacia de la vacuna por las razones indicadas anteriormente. Un ejemplo preferido para regular negativamente o delecionar es la proteína Opc de Neisseria. La inmunidad anti-Opc inducida por una vacuna de ampolla que contiene Opc solo tendría una capacidad protectora limitada, ya que el organismo infeccioso podría volverse fácilmente Opc-. HgpA y HgpB de H. influenzae son otros ejemplos de dichas proteínas.
En el procedimiento a) de la divulgación, estos genes variables o no protectores se regulan negativamente en expresión,
o se inactivan terminalmente. Esto tiene la ventaja sorprendente mencionada anteriormente de concentrar el sistema inmune en mejores antígenos que están presentes en bajas cantidades en la superficie externa de las ampollas.
La cepa puede modificarse por ingeniería genética de esta manera por varias estrategias que incluyen la inserción de transposones para romper la región codificante o la región promotora del gen, o mutaciones puntuales o deleciones para conseguir un resultado similar. También puede usarse recombinación homóloga para delecionar un gen de un cromosoma (en el que la secuencia X comprende parte de (preferentemente toda) la secuencia codificante del gen de interés). Además, puede usarse para cambiar su promotor fuerte por un promotor más débil (o ningún promotor) (en el que la secuencia de nucleótidos X comprende parte de (preferentemente toda) la región promotora del gen, y la secuencia de nucleótidos Y comprende una región promotora más débil [dando como resultado una menor expresión del gen o genes/operón u operones de interés] o ninguna región promotora). En este caso, es preferible que el acontecimiento de recombinación se produzca dentro de la región del cromosoma 1000 pb cadena arriba del gen de interés.
Como alternativa, Y puede conferir una actividad transcripcional condicional, dando como resultado una expresión condicional del gen o genes/operón u operones de interés (regulación negativa). Esto es útil en la expresión de moléculas que son tóxicas o no se soportan bien por el huésped bacteriano.
La mayoría de las proteínas ejemplificadas anteriormente son PME integrales y su variabilidad puede limitarse solo a uno
o unos pocos de sus bucles expuestos en la superficie. Otro aspecto de esta divulgación [procedimiento g)] cubre la deleción de regiones de ADN que codifican estos bucles expuestos en la superficie, lo que conduce a la expresión de una PME integral que contiene bucles expuestos en la superficie conservados. Los bucles expuestos en la superficie de P2 y P5 de H. influenzae son ejemplos preferidos de proteínas que podrían transformarse en antígenos con reacción cruzada mediante el uso de dicho procedimiento. De nuevo, la recombinación homóloga es un procedimiento preferido para realizar este procedimiento de ingeniería genética.
Procedimiento b) - Liberación y modulación de promotor:
Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a la modificación de la composición de ampollas alterando in situ la región reguladora que controla la expresión del gen o genes y/u operón u operones de interés. Esta alteración puede incluir el reemplazo parcial o total del promotor endógeno que controla la expresión de un gen de interés, por uno que confiere una actividad transcripcional distinta. Esta actividad transcripcional distinta puede conferirse por variantes (mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones) de las regiones de control endógenas, mediante promotores heterólogos naturales o modificados o mediante una combinación de ambas cosas. Dichas alteraciones preferentemente conferirán una actividad transcripcional más fuerte que la endógena (introducción de un promotor fuerte), dando como resultado una mayor expresión del gen o genes/operón u operones de interés (regulación positiva). Dicho procedimiento es particularmente útil para mejorar la producción de componentes de ampollas inmunológicamente relevantes tales como proteínas y lipoproteínas de la membrana externa (preferentemente PME conservadas, normalmente presentes en ampollas a bajas concentraciones).
Los promotores fuertes típicos que pueden integrarse en Neisseria son porA [SEC ID Nº: 24] o porB [SEC ID Nº: 26], lgtF, Opa, p110, lst y hpuAB. PorA y PorB se prefieren como promotores fuertes constitutivos. Se ha establecido (Ejemplo 9) que la actividad promotora de PorB está contenida en un fragmento que corresponde a los nucleótidos -1 a 250 cadena arriba del codón de iniciación de porB. En Moraxella, se prefiere usar los promotores de ompH, ompG, ompE, OmpB1, ompB2, ompA, OMPCD y Omp106, y en H. influenzae, se prefiere integrar los promotores de P2, P4, P1, P5 y P6.
Usando la tecnología de recombinación homóloga de doble entrecruzamiento preferida para introducir el promotor en la región cadena arriba de 1000 pb, los promotores pueden ponerse en cualquier sitio desde 30-970 pb cadena arriba del codón de iniciación del gen que se desea regular positivamente. Aunque convencionalmente se cree que la región promotora debe estar relativamente próxima a la fase de lectura abierta para obtener una expresión óptima del gen, los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente, la colocación del promotor lejos del codón de iniciación tiene como resultado grandes aumentos en los niveles de expresión. De esta manera, se prefiere que el promotor se inserte a 200-600 pb desde el codón de iniciación del gen, más preferentemente a 300-500 pb, y aún más preferentemente a aproximadamente 400 pb desde el ATG de iniciación.
Procedimiento c) - Componentes de ampolla productos condicionalmente
La expresión de algunos genes que codifican ciertos componentes de ampolla está regulada cuidadosamente. La producción de los componentes está modulada condicionalmente y depende de diversas señales metabólicas y/o ambientales. Estas señales incluyen, por ejemplo, limitación con hierro, modulación del potencial redox, variaciones del pH y temperatura y cambios nutricionales. Algunos ejemplos de componentes de ampolla que se sabe que se producen condicionalmente incluyen proteínas de la membrana externa reguladas por hierro de Neisseria y Moraxella (por ejemplo, TbpB, LbpB), y porinas de la membrana externa inducibles por sustrato. La presente divulgación incluye el uso de los procedimientos genéticos descritos previamente (procedimiento a) o b)) para hacer constitutiva la expresión de dichas moléculas. De esta manera, la influencia de una señal ambiental sobre la expresión del gen o genes de interés puede solucionarse modificando/reemplazando la región de control correspondiente del gen o genes de forma que se vuelva constitutivamente activa (por ejemplo, delecionando parte [preferentemente toda] o la secuencia de control de represión - por ejemplo, la región del operador), o insertando un promotor constitutivo fuerte. Para genes regulados por hierro, puede retirarse el operador de fur. Como alternativa, el procedimiento i) puede usarse para liberar una copia adicional del gen/operón de interés en el cromosoma que se pone artificialmente bajo el control de un promotor constitutivo.
Procedimientos d) y e) - Destoxificación de LPS
La toxicidad de las vacunas de ampollas presenta uno de los mayores problemas en el uso de ampollas en las vacunas. Un aspecto adicional de la invención se refiere a procedimientos para destoxificar genéticamente el LPS presente en las ampollas. El lípido A es el componente principal de LPS responsable de la activación celular. Muchas mutaciones en genes implicados en esta ruta conducen a fenotipos esenciales. Sin embargo, mutaciones en los genes responsables de las etapas de las modificaciones terminales conducen a fenotipos sensibles a la temperatura (htrB) o permisivos (msbB). Las mutaciones que tienen como resultado una expresión reducida (o nula) de estos genes producen una actividad tóxica alterada del lípido A. De hecho, el lípido A no lauroilado (mutante de htrB) o no miristoilado (mutante de msbB) es menos tóxico que el lípido A de tipo silvestre. Las mutaciones en el gen que codifica la 4'-quinasa del lípido A (lpxK) también reducen la actividad tóxica del lípido A.
El procedimiento d) de esta forma implica la deleción de parte de (o preferentemente de toda) la fase de lectura abierta o promotor anterior msbB. Como alternativa, el promotor podría reemplazarse por un promotore más débil. Preferentemente, para realizar el procedimiento, se usan las técnicas de recombinación homóloga descritas anteriormente.
Para este fin también se proporcionan las secuencias de los genes de htrB y msbB de Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis y Haemophilus influenzae.
La actividad tóxica de LPS también podría alterarse introduciendo mutaciones en genes/loci implicados en la resistencia a polimixina B (dicha resistencia se ha correlacionado con la adición de aminoarabinosa en el 4' fosfato del lípido A). Estos genes/loci podrían ser pmrE que codifica una UDP-glucosa deshidrogenasa, o una región de genes de resistencia a péptidos antimicrobianos comunes a muchas enterobacterias que podrían estar implicados en la síntesis y transferencia de aminoarabinosa. El gen pmrF que está presente en esta región codifica una dolicol-fosfato manosil transferasa (Gunn J.S., Kheng, B.L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S.I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 11711182).
Las mutaciones en el sistema regulador PhoP-PhoQ, que es un sistema regulador de dos componentes de transferencia de fosfato (f.i. fenotipo constitutivo de PhoP, PhoPc), o condiciones ambientales o de cultivo de bajo Mg++ (que activan el sistema el regulador PhoP-PhoQ) conducen a la adición de aminoarabinosa en el 4'-fosfato y el reemplazo de miristato por 2-hidroximiristato (hidroxilación de miristato). Este lípido A modificado presenta una menor capacidad de estimular la expresión de la E selectina por células endoteliales humanas y la secreción de TNF-a a partir de monocitos humanos.
El procedimiento e) implica la regulación positiva de estos genes usando una estrategia como se ha descrito anteriormente (incorporándose promotores fuertes, preferentemente usando técnicas de recombinación homóloga para realizar el procedimiento).
Como alternativa, en lugar de realizar ninguna mutación, podría usarse una cepa resistente a polimixina B como cepa de producción de vacuna (junto con uno o más de los otros procedimientos de la invención), ya que los ampollas de dicha cepa también tienen toxicidad de LPS reducida (por ejemplo, como se muestra para meningococos - van der Ley, P, Hamstra, HJ, Kramer, M, Steeghs, L, Petrov, A y Poolman, JT. 1994. En: Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, Inglaterra).
Como alternativa adicional (y aspecto adicional de la divulgación), los inventores proporcionan un procedimiento para destoxificar una cepa bacteriana Gram-negativa que comprende la etapa de cultivar la cepa en un medio de crecimiento que contiene 0,1 mg-100 g de aminoarabinosa por litro de medio.
Como otra alternativa adicional, pueden añadirse péptidos sintéticos que imitan la actividad de unión de polimixina B (descritos más adelante) a la preparación de ampollas para reducir la actividad tóxica de LPS (Rustici, A, Velucchi, M, Faggioni, R, Sironi, M, Ghezzi, P, Quataert, S, Green, B y Porro M 1993. Science 259: 361-365; Velucchi, M, Rustici, A, Meazza, C, Villa, P, Ghezzi, P y Porro, M. 1997. J. Endotox. Res. 4:).
Procedimiento f) - Anclaje de proteínas homólogas o heterólogas a ampollas de membrana externa mientras se reduce la toxicidad de LPS
Otro aspecto de esta divulgación cubre el uso de secuencias genéticas que codifican péptidos de polimixina B (o análogos de los mismos) como medio para dirigir proteínas de fusión a la membrana externa. La polimixina B es un péptido cíclico compuesto de aminoácidos no codificados por ARNt (producidos por organismos actinomicetales Grampositivos) que se une muy fuertemente a la parte del Lípido A del PLS presente en la membrana externa. Esta unión reduce la toxicidad intrínseca del LPS (actividad de endotoxina). Se han desarrollado péptidos que imitan la estructura de la polimixina B y compuestos de aminoácidos canónicos (codificados por ARNt) y también se unen al lípido A con fuerte afinidad. Estos péptidos se han usado para destoxificar el LPS. Se mostró que uno de estos péptidos conocido como SAEP-2 (extremo N-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys-extremo C) era muy prometedor a este respecto (Molecular Mapping and detoxifying of the Lipid A binding site by synthetic peptides (1993). Rustici, A., Velucchi, M., Faggioni, R., Sironi, M., Ghezzi, P., Quataert, S., Green, B. y M. Porro. Science 259, 361-365).
El presente procedimiento f) de la divulgación proporciona una mejora de este uso. Se ha descubierto que el uso de secuencias de ADN que codifican el péptido SEAP-2 (o derivados del mismo), fusionadas genéticamente a un gen de interés (que codifica, por ejemplo, un antígeno de linfocitos T o un antígeno protector que normalmente se secreta tal como una toxina, o una proteína citosólica o periplásmica) es un medio para dirigir la proteína recombinante correspondiente a la membrana externa de un huésped bacteriano preferido (mientras que al mismo tiempo reduce la toxicidad del LPS).
Este sistema es adecuado para proteínas lábiles que no se expondrían directamente al exterior de la ampolla. La ampolla, por lo tanto, actuaría como un vehículo de liberación que expondría la proteína al sistema inmune una vez que las ampollas se han englobado por los linfocitos T. Como alternativa, la fusión genética también comprendería un péptido señal o dominio transmembrana de tal forma que la proteína recombinante pueda atravesar la membrana externa para la exposición al sistema inmune del huésped.
Esta estrategia de dirección podría ser de interés particular en el caso de genes que codifican proteínas que normalmente no son objetivos en la membrana externa. Esta metodología también permite el aislamiento de ampollas recombinantes enriquecidas en la proteína de interés. Preferentemente, dicha señal de dirección a péptidos permite el enriquecimiento de ampollas de la membrana externa en una o varias proteínas de interés, que no se encuentran naturalmente en esa localización subcelular dada. Una lista no exhaustiva de bacterias que pueden usarse como huésped receptor para dicha producción de ampollas recombinantes incluye Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae.
Aunque para la construcción se prefiere que el gen se introduzca en el cromosoma de la bacteria por ingeniería genética [usando el procedimiento i)], una realización preferida alternativa de la divulgación es para fabricar independientemente proteínas recombinantes marcadas con SAEP-2, y unirlas en una fase posterior a una preparación de ampollas.
Una realización adicional de la divulgación es el uso de dichas construcciones en un procedimiento de purificación de proteínas. El sistema podría usarse como parte de un sistema de expresión para producir proteínas recombinantes en general. El marcador de péptido SAEP-2 puede usarse para la purificación por afinidad de la proteína a la que se une usando una columna que contiene moléculas de lípido A inmovilizadas.
Procedimiento h) - Polisacáridos de reacción cruzada
El aislamiento de ampollas de membrana externa bacteriana a partir de bacterias Gram-negativas encapsuladas con frecuencia da como resultado la co-purificación de polisacárido capsular. En algunos casos, este material “contaminante” puede resultar útil ya que el polisacárido puede aumentar la respuesta inmune conferida por otros componentes de la ampolla. Sin embargo, en otros casos, la presencia de material de polisacárido contaminante en preparaciones de ampollas bacterianas puede resultar perjudicial para el uso de las ampollas en una vacuna. Por ejemplo, se ha demostrado, al menos en el caso de N. meningitidis, que el polisacárido capsular del serogrupo B no confiere inmunidad protectora y es susceptible de inducir una respuesta auto-inmune adversa en seres humanos. Por consiguiente, el procedimiento h) de la invención es la modificación por ingeniería genética de la cepa bacteriana para la producción de ampollas de tal forma que carezca de polisacárido capsular. Las ampollas entonces serán adecuadas para uso en seres humanos. Un ejemplo particularmente preferido de dicha preparación de ampolla es una de N. meningitidis serogrupo B que carece de polisacárido capsular.
Esto puede conseguirse usando cepas de producción de ampollas modificadas en las que los genes necesarios para la biosíntesis y/o exportación capsular se han alterado. La inactivación del gen que codifica la biosíntesis o exportación del polisacárido capsular puede conseguirse por mutación (mutación puntual, deleción o inserción) de la región de control, la región codificante o ambas (preferentemente usando las técnicas de recombinación homólogas descritas anteriormente). Además, la inactivación de genes de biosíntesis capsular también puede conseguirse por sobreexpresión antisentido o mutagénesis de transposón. Un procedimiento preferido es la deleción de algunos o todos los genes cps de Neisseria meningitidis necesarios para la biosíntesis y exportación de polisacáridos. Para este fin, puede usarse el plásmido de reemplazo pMF121 (descrito en Frosh y col. 1990, Mol. Microbiol. 4: 1215-1218) para producir una mutación que deleciona el agrupamiento génico cpsCAD (+ galE). Como alternativa, podría delecionarse el gen siaD, o regularse negativamente su expresión (el gen siaD meningocócico codifica la alfa-2,3-sialiltransferasa, una enzima necesaria para la síntesis del polisacárido capsular y de LOS). Dichas mutaciones también pueden retirar estructuras similares en el huésped en la porción de sacárido del LPS de la bacteria.
Procedimiento i) - Liberación de una o más copias adicionales de un gen y/u operón en un cromosoma huésped, o liberación de un gen y/u operón heterólogo en un cromosoma huésped
Una estrategia eficaz para modular la composición de una preparación de ampollas es liberar una o más copias de un segmento de ADN que contiene un casete de expresión en el genoma de una bacteria Gram-negativa. Una lista no exhaustiva de especies bacterianas preferidas que podrían usarse como receptor para dicho casete incluye
Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae. El gen o genes contenidos en el casete de expresión puede ser homólogo (o endógeno) (es decir, existir de forma natural en el genoma de la bacteria manipulada) o heterólogo (es decir, no existe naturalmente en el genoma de la bacteria manipulada). El casete de expresión reintroducido puede consistir en secuencias promotor/gen/operón “naturales” no modificadas o casetes de expresión modificados por ingeniería genética en los que la región promotora y/o la región codificante o ambas se han alterado. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos que podrían usarse para la expresión incluye los promotores porA, porB, lbpB, tbpB, p110, Ist, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorrhoeae, los promotores p2, p5, p4, ompF, p1, ompH, p6, hin47 de H. influenzae, los promotores ompH, ompG, ompCD, ompE, ompB1, ompB2, ompA de M. catarrhalis, el promotor ApL, lac, tac, araB de Escherichia coli o promotores reconocidos específicamente por la ARN polimerasa de bacteriófagos tales como el bacteriófago T7 de E. coli. Una lista de no exhaustiva de genes preferidos que podrían expresarse en dicho sistema incluye NspA, Omp85, PilQ, complejo TbpA/B Hsf, PldA y HasR de Neisseria; PPME y HMWP de Chlamydia; OMP106, HasR, PilQ, OMP85 y PldA de Moraxella; FHA, PRN y PT de Bordetella pertussis.
En una realización preferida de la divulgación, el casete de expresión se libera e integra en el cromosoma bacteriano por medio de recombinación homóloga y/o con especificidad de sitio. Los vectores de integración usados para liberar dichos genes y/u operones pueden ser plásmidos condicionalmente replicativos o plásmidos suicidas, bacteriófagos, transposones o fragmentos de ADN lineal obtenidos por hidrólisis de restricción o amplificación por PCR. La integración preferentemente se dirige a regiones cromosómicas dispensables para el crecimiento in vitro. Una lista no exhaustiva de loci preferidos que pueden usarse para dirigir la integración del ADN incluye los genes porA, porB, opa, opc, rmp, omp26, lecA, cps e lgtB de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae, los genes P1, P5, hmw1/2, IgA-proteasa y fimE de NTHi; los genes lecA1, lecA2, omp106, uspa1 y uspA2 de Moraxella catarrhalis. Como alternativa, el casete de expresión usado para modular la expresión de uno o más componentes de ampolla puede liberarse en una bacteria de elección por medio de vectores episomales, tales como plásmidos de replicación circulares/lineales, cósmicos, fásmidos, bacteriófagos lisogénicos o cromosomas bacterianos artificiales. La selección del acontecimiento de recombinación puede seleccionarse por medio de marcadores genéticos de selección tales como genes que confieren resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, eritromicina, cloranfenicol o gentamicina), genes que confieren resistencia a metales pesados y/o compuestos tóxicos o genes complementan mutaciones auxotróficas (por ejemplo, pur, leu, met, aro).
Genes Heterólogos - Expresión de proteínas extrañas en ampollas de membrana externa
Las ampollas bacterianas de membrana externa representan un sistema muy atractivo para producir, aislar y liberar proteínas recombinantes para su uso en vacunas, terapéutico y/o de diagnóstico. Un aspecto adicional de esta divulgación se refiere a la expresión, producción y dirección de proteínas heterólogas extrañas a la membrana externa, y al uso de las bacterias para producir ampollas recombinantes.
Un procedimiento preferido para conseguir esto es mediante un procedimiento que comprende las etapas de: introducir un gen heterólogo, opcionalmente controlado por una secuencia promotora fuerte, en el cromosoma de una cepa Gram-negativa por recombinación homóloga. Las ampollas pueden obtenerse a partir de la cepa modificada resultante.
Una lista no exhaustiva de bacterias que pueden usarse como huésped receptor para la producción de ampollas recombinantes incluye Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae. El gen expresado en dicho sistema puede ser de origen viral, bacteriano, fúngico, parasitario o eucariota superior.
Una aplicación preferida de la divulgación incluye un procedimiento para la expresión de proteínas de la membrana externa de Moraxella, Haemophilus y/o Pseudomonas (integrales, politópicas y/o lipoproteínas) en ampollas recombinantes de Neisseria meningitidis. Los loci de integración preferibles se han indicado anteriormente, y los genes que se introducen preferentemente son los que proporcionan protección contra la bacteria a partir de la cual se aislaron. Los genes protectores preferidos para cada bacteria se describen a continuación.
Son aplicaciones preferidas adicionales de la divulgación: ampollas producidas a partir de una cepa de Haemophilus influenzae modificada en la que el gen heterólogo es una PME protectora de Moraxella catarrhalis; y ampollas producidas a partir de una cepa de Moraxella catarrhalis modificada en la que el gen heterólogo es una PME protectora de Haemophilus influenzae (los loci preferidos para la inserción de genes se han proporcionado anteriormente, y los antígenos protectores preferidos se describen más adelante).
Una aplicación particularmente preferida de esta divulgación se refiere al campo de la profilaxis o tratamiento de enfermedades de transmisión sexual (ETS). Con frecuencia, es difícil para los médicos determinar si la causa principal de una ETS se debe a una infección por gonococos o por Chlamydia trachomatis. Estos dos organismos son las causas principales de salpingitis - una enfermedad que puede producir esterilidad en el huésped. Por lo tanto, sería útil si pudiera vacunarse contra una ETS o tratarse con una vacuna combinada eficaz contra la enfermedad producida por los dos organismos. Se ha mostrado que la proteína principal de la membrana externa (PPME) de C. trachomatis es la diana de anticuerpos protectores. Sin embargo, la integridad estructural de esta proteína de membrana integral es importante para inducir dichos anticuerpos. Además, los epítopos reconocidos por estos anticuerpos son variables y definen más de 10 serovariedades. El aspecto descrito previamente de esta divulgación permite el plegamiento apropiado de una o más proteínas de membrana dentro de una preparación de membrana externa de ampolla. La modificación por ingeniería genética de una cepa de gonococo que expresa múltiples serovariedades de PPME de C. trachomatis en la membrana externa, y la producción de ampollas a partir de la misma, produce una solución sencilla a los múltiples problemas de proteínas de membrana plegadas correctamente, la presentación de suficientes serovariedades de PPME para proteger contra un amplio espectro de serovariedades, y la profilaxis/tratamiento simultáneo de la infección por gonococos (y por consiguiente, la ausencia de necesidad de que los médicos decidan inicialmente qué organismo está produciendo los síntomas clínicos particulares - puede vacunarse contra los dos organismos simultáneamente permitiendo de esta forma el tratamiento de la ETS en una fase muy temprana). Los loci preferidos para la inserción de genes en el cromosoma del gonococo se han proporcionado anteriormente. Otros genes de C. trachomatis protectores preferidos que podrían incorporarse son HMWP, PmpG y las PME desveladas en el documento WO 99/28475.
Dirección de proteínas heterólogas a ampollas de la membrana externa:
La expresión de algunas proteínas heterólogas en ampollas bacterianas puede requerir la adición de una o más señales de dirección a la membrana externa. El procedimiento preferido para solucionar este problema es mediante la creación de una fusión genética entre un gen heterólogo y un gen que codifica una PME residente como un enfoque específico para dirigir proteínas recombinantes a ampollas. Más preferentemente, el gen heterólogo se fusiona a las secuencias de péptidos señal de dicha PME.
Preparaciones de ampollas de Neisseria
Para la regulación positiva a través de los procedimientos b) y/o i) de la divulgación, cuando se realizan en una cepa Neisserial, incluyendo gonococo y meningococo (particularmente N. meningitidis B) se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores): NspA (documento WO 96/29412), tipo Hsf (documento WO 99/31132), Hap (documento PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (documento WO 00/23595), PilQ (documento PCT/EP99/03603), PldA (documento PCT/EP99/06718), FrpB (documento WO 96/31618), TbpA (documento US 5.912.336), TbpB, FrpA/FrpC (documento WO 92/01460), LbpA/LbpB (documento PCT/EP98/05117), FhaB (documento WO 98/02547), HasR (documento PCT/EP99/05989), lipo02 (documento PCT/EP99/08315), Tbp2 (documento WO 99/57280), MltA (documento WO 99/57280) y ctrA (documento PCT/EP00/00135). También se prefieren como genes que pueden introducirse de forma heteróloga en otras bacterias Gram-negativas.
Para la regulación negativa a través del procedimiento a) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes: PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa y Opc.
Los siguientes genes se regulan negativamente a través del procedimiento d): msbB y opcionalmente htrB
Para la regulación positiva a través del procedimiento e) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF.
Para el procedimiento c) de la divulgación son secuencias de control represoras preferidas: la región del operador fur (particularmente para uno o los dos genes TbpB o LbpB); y la región del operador DtxR.
Para la regulación negativa a través del procedimiento h) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC y ctrD.
Preparaciones de ampollas de Pseudomonas aeruginosa
Para la regulación positiva a través de los procesos b) y/o i) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores): PcrV, OprF, OprI. También se prefieren como genes que pueden introducirse de forma heteróloga en otras bacterias Gram-negativas.
Preparaciones de ampollas de Moraxella catarrhalis
Para regulación positiva a través de los procesos b) y/o i) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores): OMP106 (documentos WO 97/41731 y WO 96/34960), HasR (documento PCT/EP99/03824), PilQ (documento PCT/EP99/03823), OMP85 (documento PCT/EP00/01468), lipo06 (documento GB 9917977.2), lipo10 (documento GB 9918208.1), lipo11 (documento GB 9918302.2), lipo18 (documento GB 9918038.2), P6 (documento PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, y col (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010), D15 (documento PCT/EP99/03822), OmplA1 (documento PCT/EP99/06781), Hly3 (documento PCT/EP99/03257), LbpA y LbpB (documento WO 98/55606), TbpA y TbpB (documentos WO 97/13785 y WO 97/32980), OmpE, UspA1 y UspA2 (documento WO 93/03761) y Omp21. También se prefieren como genes con los que introducirse de forma heteróloga en otras bacterias Gram-negativas.
Para la regulación negativa a través del proceso a) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes: CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA y LbpB.
Los siguientes genes se segulan negativamente a través del proceso d): msbB y opcionalmente htrB
Para la regulación positiva a través del proceso e) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF.
Preparaciones de ampollas de Haemophilus influenzae
Para la regulación positiva a través de los procesos b) y/o i) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores): D15 (documento WO 94/12641), P6 (documento EP 281673), TbpA, TbpB, P2, P5 (documento WO 94/26304), OMP26 (documento WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 y Hif (en este operón todos los genes deben regularse positivamente para regular positivamente la pilina). También se prefieren como genes que pueden introducirse de forma heteróloga en otras bacterias Gram-negativas.
Para la regulación positiva a través del proceso a) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes: P2, P5, Hif, IgA1-proteasa, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA y TbpB.
Los siguientes genes se regulan negativamente a través del procedimiento d): msbB y opcionalmente htrB.
Para la regulación positiva a través del proceso e) de la divulgación se prefieren uno o más de los siguientes genes: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF.
Formulaciones de Vacuna
Una realización preferida de la invención es la formulación de las preparaciones de ampollas de la invención en una vacuna que también puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La fabricación de preparaciones de ampollas a partir de cualquiera de las cepas modificadas mencionadas anteriormente se puede conseguir por cualquiera de los procedimientos bien conocidos por un experto en la materia. Preferentemente se usan los procedimientos desvelados en los documentos EP 301992, US 5.597.572, EP 11243 o US 4.271.147. Más preferentemente, se usa el procedimiento descrito en el Ejemplo 8.
La preparación de vacunas se describe, en general, en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. y Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York).
A las preparaciones de ampollas de la presente invención se les puede añadir un adyuvante en la formulación de vacuna de la invención. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio (particularmente carbonato cálcico), hierro o cinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos modificados catiónica o aniónicamente, o polifosfacenos.
Los sistemas adyuvantes de Th1 adecuados que pueden usarse incluyen Monofosforil lípido A, particularmente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, y una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Un sistema mejorado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se desvela en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se inactiva con colesterol como se desvela en el documento WO96/33739. En el documento WO95/17210 se describe una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua y es una formulación preferida.
La vacuna puede comprender una saponina, más preferentemente QS21. También puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol. También son inductores preferentes de una respuesta TH1 oligonucleótidos que contienen CpG no metilados (documento WO 96/02555) y son adecuados para uso en la presente invención.
La preparación de vacuna de la presente invención puede usarse para proteger o tratar a un mamífero susceptible de infección, por medio de la administración de dicha vacuna por vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir la inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por administración en la mucosa en los tractos oral/alimentario, respiratorio y genitourinario. De esta manera, un aspecto de la presente invención es un procedimiento para inmunizar a un huésped humano contra una enfermedad producida por la infección de una bacteria gram-negativa, comprendiendo dicho procedimiento administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la preparación de ampollas de la presente invención.
La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos secundarios adversos significativos observados en las vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo del inmunógeno específico que se emplee y de cómo se presenta. En general, es de esperar que cada dosis comprenda 1-100 !g de antígeno proteico, preferentemente 5-50 !g y más típicamente en el intervalo de 5 a 25 pg.
Una cantidad óptima para una vacuna particular puede averiguarse por estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas adecuadamente.
Vacunas de Células Fantasma o Células Completas Inactivadas
Los inventores prevén que las mejoras anteriores de las preparaciones y vacunas de ampollas pueden extenderse fácilmente a preparaciones y vacunas de células fantasmas o de células completas inactivadas (con ventajas idénticas). Las cepas Gram negativas modificadas de la invención a partir de las cuales se fabrican las preparaciones de ampollas también pueden usarse para fabricar preparaciones de células fantasmas y de células completas inactivadas. Los procedimientos para fabricar preparaciones fantasmas (células vacías con envueltas intactas) a partir de cepas Gram-negativas son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 92/01791). También son bien conocidos procedimientos para inactivar células completas para fabricar preparaciones de células inactivadas para uso en vacunas. Las expresiones "preparaciones de ampollas" y "vacunas de ampollas" así como los procedimientos descritos a lo largo de este documento, por lo tanto, son aplicables a las expresiones "preparación fantasma" y "vacuna fantasma" y "preparación de células completas inactivadas" y "vacuna de células completas inactivadas", respectivamente, para los fines de la presente invención.
Combinaciones de procedimientos a) - i)
Puede apreciarse que uno o más de los procedimientos anteriores pueden usarse para producir una cepa modificada a partir de la cual fabricar preparaciones de ampollas mejoradas. Preferentemente se usa uno de dichos procedimientos, más preferentemente dos o más (2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 9) de los procedimientos para fabricar la vacuna de ampollas. Como cada procedimiento adicional se usa en la fabricación de la vacuna de ampollas, cada mejora actúa junto con los otros procedimientos usados para fabricar una preparación de ampollas modificada por ingeniería genética optimizada.
Una preparación de ampollas meningocócicas (particularmente N. meningitidis B) de la divulgación comprende el uso de los procedimientos a), b), d) y/o e) y h). Dichas preparaciones de ampollas son seguras (sin estructuras similares a las estructuras del huésped), no tóxicas y están estructuradas de tal forma que la respuesta inmune del huésped se centrará en altos niveles de antígenos protectores (y preferentemente conservados). Todos los elementos anteriores actúan juntos para proporcionar una vacuna de ampollas optimizada.
De manera similar para M. catarrhalis y H. influenciae no-tipificable, las preparaciones de ampollas preferidas comprenden el uso de los procedimientos a), b) y d) y/o e).
Por tanto, otro aspecto de la invención es una vacuna de ampolla Gram-negativa, no tóxica e inmunoprotectora de la invención adecuada para su uso pediátrico.
Por uso pediátrico se entiende el uso en niños de menos de 4 años.
Por inmunoprotector se entiende que al menos el 40% (y preferentemente el 40, 50, 70, 80, 90 y 100%) de los niños muestran seroconversión (aumento de 4 veces en la actividad bactericida [la dilución de antisuero a la que mueren el 50% de las bacterias - véase, por ejemplo, el documento PCT/EP98/05117] contra una serie de cepas heterólogas que se seleccionan entre los grupos clonales principales conocidos. Para el meningococo B, estas cepas deben tener un tipo PorA diferente de la cepa de producción de ampollas, y preferentemente deben ser 2, 3, 4 ó, más preferentemente, las 5 cepas H44/76, M97/252078, BZ10, NGP165 y CU385. Para H.influenciae no-tipificable, las cepas deben ser preferentemente 2,3,4 o, más preferentemente, las 5 cepas 3224A, 3219C,3241 A, 640645 y A840177. Para M. catarrhalis las cepas deben ser preferentemente 2, 3 4, o más preferentemente, las 5 cepas de la ATCC 43617, 14, 358, 216 Y 2962
Por no tóxico se entiende que hay una reducción significativa (2-4 veces, preferentemente 10 veces) de actividad de endotoxina como se mide por los ensayos bien conocidos LAL y de pirogenicidad.
Combinaciones de Vacunas
Un aspecto adicional de la invención son combinaciones de vacunas que comprenden las preparaciones de ampollas de la invención con otros antígenos que se usan ventajosamente contra determinadas patologías. Se ha descubierto que las ampollas son particularmente adecuadas para la formulación con otros antígenos, ya que ventajosamente tienen un efecto adyuvante sobre los antígenos con los que se mezclan.
En una combinación preferida, las preparaciones de ampollas de meningococo B de la invención se formulan con 1, 2, 3 ó preferentemente los 4 polisacáridos capsulares de meningococo siguientes, que pueden estar solos o conjugados con una proteína de soporte: A, C, Y o W. Dicha vacuna puede usarse ventajosamente como vacuna de meningococo global. En lugar de usar las preparaciones de ampollas de meningococo B de la invención, también se prevé que la formulación pueda contener, como alternativa, preparaciones de ampollas de meningococo B de tipo silvestre de 2 o más (preferentemente varias) cepas que pertenecen a varios subtipos/serotipos (por ejemplo, elegidos entre P1.15, P1.7,16, P1.4 y P1.2).
En otra realización preferida, las preparaciones de ampollas de meningococo B de la invención, preferentemente formuladas con 1, 2, 3 o los 4 polisacáridos capsulares de meningococo solos o conjugados A, C, Y o W, se formulan con un polisacárido capsular de H. influenzae b conjugado, y uno o más polisacáridos capsulares de neumococo solos o conjugados. Opcionalmente, la vacuna también puede comprender uno o más antígenos proteicos que pueden proteger a un huésped contra la infección por Streptococcus pneumoniae. Dicha vacuna puede usarse ventajosamente como vacuna global contra la meningitis.
Los antígenos del polisacárido capsular de neumococo preferentemente se seleccionan entre los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (más preferentemente de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F).
Son antígenos proteicos de neumococo preferidos las proteínas de neumococo que se exponen en la superficie externa del neumococo (que pueden reconocerse por el sistema inmune del huésped durante al menos parte del ciclo de vida del neumococo) o son proteínas que se secretan o liberan por el neumococo. Más preferentemente, la proteína es una toxina, adhesina, transductor de señal de 2 componentes o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o fragmentos de los mismos. Las proteínas particularmente preferidas incluyen, pero sin limitación: neumolisina (preferentemente destoxificada por tratamiento químico o mutación) [Mitchell y col. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 “Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2”, Mitchell y col. Biochim Biophys Acta, 23 de enero de 1989; 1007 (1): 67-72 “Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties”, documentos WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO90/06951 (Paton y col), WO99/03884 (NAVA)]; PspA y variantes de deleción transmembrana de la misma (documento US 5804193 - Briles y col.); PspC y variantes de deleción transmembrana de la misma (documento WO 97/09994 - Briles y col); PsaA y variantes de deleción transmembrana de la misma (Berry y Paton, Infect Immun, diciembre 1996; 64(12): 5255-62 “Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae”); proteínas de unión a colina de neumococo y variantes de deleción transmembrana de las mismas; CbpA y variantes de deleción transmembrana de la misma (documentos WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (Infect. Immun. 1996 64: 3544); HSP70 (documento WO 96/40928); PcpA (Sánchez-Beato y col. FEMS Microbiol Lett 1998, 164: 207-14); proteína de tipo M, Solicitud de Patente SB Nº EP 0837130; y adhesina 18627, Solicitud de Patente SB Nº EP 0834568. Otros antígenos proteicos de neumococo preferidos son los desvelados en el documento WO 98/18931, particularmente los seleccionados en los documentos WO 98/18930 y PCT/US99/30390.
En una realización preferida adicional, las preparaciones de ampolla de Moraxella catarrhalis de la invención se formulan con uno o más polisacáridos capsulares neumocócicos sencillos o conjugados y uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra infección por H. influenzae no tipificable. Opcionalmente, la vacuna también puede comprender uno o más antígenos proteicos que pueden proteger un huésped contra infección por Streptococcus pneumoniae. Opcionalmente, la vacuna también puede comprender uno o más antígenos que pueden protegen a un huésped contra el RSV y/o uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra el virus de la gripe. Ventajosamente, dicha vacuna puede usarse como una vacuna de eficacia global contra la otitis media.
Los antígenos proteicos de H. influenzae no tipificables preferidos incluyen la proteína Fimbrina (documento US 5766608) y fusiones que comprenden péptidos de los mismos (por ejemplo la Fusión LB1) (documento US 5843464
-
Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap y D15.
Los antígenos del virus de la gripe preferidos incluyen virus completos, vivos o inactivados, el virus gripal dividido, células que crecen en ovocitos o MDCK, células Vero o virosomas gripales completos (como describe R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) o proteínas purificadas o recombinantes de los mismos, tales como proteínas HA, NP, NA o M o combinaciones de las mismas.
Los antígenos del RSV (Virus Sincitial Respiratorio) preferidos incluyen la glicoproteína F, la glicoproteína G, la proteína HN o sus derivados.
En una realización aún más preferida, las preparaciones de ampolla de H. influenzae no tipificable de la invención se formulan con uno o más polisacáridos capsulares neumocócicos sencillos o conjugados, y uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra infección por M. catarrhalis. Opcionalmente, la vacuna también puede comprender uno o más antígenos proteicos que pueden proteger a un huésped contra infección por Streptococcus pneumoniae. Opcionalmente, la vacuna también puede comprender uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra el SRV y/o uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra el virus de la gripe. Ventajosamente, dicha vacuna puede usarse como una vacuna de eficacia global contra la otitis media.
Secuencias de nucleótidos de la invención
Otro aspecto de la divulgación se refiere a la provisión de nuevas secuencias de nucleótidos que pueden usarse en los procedimientos de la invención. La divulgación proporciona regiones cadena arriba específicas para diversos genes de diversas cepas que pueden usarse, por ejemplo, en los procedimientos a), b), d) y h). Además, se proporcionan regiones codificantes para realizar el procedimiento d).
Procedimiento general para el análisis de la región flanqueante no codificante de un gen bacteriano, y su explotación para la expresión modulada del gen en ampollas
Las regiones flanqueantes no codificantes de un gen específico contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional como traduccional. La secuencia de estas regiones, cadena arriba o cadena abajo de la fase de lectura abierta del gen, puede obtenerse por secuenciación del ADN. Esta información de secuencia permite la determinación de motivos reguladores potenciales tales como los diferentes elementos promotores, secuencias terminadoras, elementos de secuencia inducible, represores, elementos responsables de variación de fase, la secuencia Shine-Dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial implicada en la regulación, así como otros tipos de motivos o secuencias reguladoras.
Esta información de secuencia permite la modulación de la expresión natural del gen en cuestión. La regulación positiva de la expresión del gen puede realizarse alterando el promotor, la secuencia Shine-Dalgarno, el posible represor o elementos operadores, o cualquier otro elemento implicado. De forma similar, la regulación negativa de la expresión puede conseguirse por tipos de modificaciones similares. Como alternativa, cambiando secuencias de variación de fase, la expresión del gen puede ponerse bajo control de variación de fase, o puede desacoplarse de esta regulación. En otro enfoque, la expresión del gen puede ponerse bajo el control de uno o más elementos inducibles que permiten la expresión regulada. Los ejemplos de dicha regulación incluyen, pero sin limitación, inducción por cambio de temperatura, adición de sustratos inductores tales como carbohidratos seleccionados o sus derivados, oligoelementos, vitaminas, cofactores, iones metálicos, etc.
Dichas modificaciones como se ha descrito anteriormente pueden introducirse por varios medios diferentes. La modificación de secuencias implicadas en la expresión génica puede realizarse in vivo por mutagénesis aleatoria seguida de la selección del fenotipo deseado. Otro enfoque consiste en aislar la región de interés y modificarla por mutagénesis aleatoria, o reemplazo dirigido, mutagénesis de inserción o deleción. La región modificada después puede reintroducirse en el genoma bacteriano por recombinación homóloga, y puede evaluarse el efecto sobre la expresión del gen. En otro enfoque, el conocimiento de la secuencia de la región de interés puede usarse para reemplazar o delecionar todo o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora fijada como objetivo se aísla y modifica para contener los elementos reguladores de otro gen, una combinación de elementos reguladores de diferentes genes, una región reguladora sintética o cualquier otra región reguladora, o para delecionar partes seleccionadas de la secuencia reguladora de tipo silvestre. Estas secuencias modificadas después pueden reintroducirse en la bacteria por recombinación homóloga en el genoma.
En el procedimiento b) de la divulgación, por ejemplo, la expresión de un gen puede modularse cambiando su promotor por un promotor más fuerte (aislamiento de la secuencia cadena arriba del gen, modificación in vitro de esta secuencia y reintroducción en el genoma por recombinación homóloga). La expresión regulada positivamente puede obtenerse tanto en la bacteria como en las vesículas de la membrana externa desprendidas (o fabricadas) a partir de la bacteria.
En otros ejemplos preferidos, los enfoques descritos pueden usarse para generar cepas bacterianas recombinantes con características mejoradas para aplicaciones de vacuna, como se ha descrito anteriormente. Éstas pueden ser, pero sin limitación, cepas atenuadas, cepas con mayor expresión de antígenos seleccionados, cepas con inactivaciones (knock-out) (o expresión reducida) de genes que interfieren con la respuesta inmune, y cepas con la expresión modulada de proteínas inmunodominantes.
Las SEC ID Nº: 2-23, 25, 27-38 son, todas ellas, secuencias cadena arriba de Neisseria (cadena arriba del codón de iniciación de diversos genes preferidos) que comprenden aproximadamente 1000 pb cada una. Las SEC ID Nº: 3962 son, todas ellas, secuencias cadena arriba de M. catarrhalis (cadena arriba del codón de iniciación de diversos genes preferidos) que comprenden aproximadamente 1000 pb cada una. Las SEC ID Nº: 63-75 son, todas ellas, secuencias cadena arriba de H. influenzae (cadena arriba del codón de iniciación de diversos genes preferidos) que comprenden aproximadamente 1000 pb cada una. Todas éstas pueden usarse en procedimientos genéticos (particularmente recombinación homóloga) para la regulación positiva o regulación negativa de las fases de lectura abierta con las que están asociadas (como se ha descrito anteriormente). Las SEC ID Nº: 76-81 son las regiones codificantes para los genes HtrB y MsbB de Neisseria, M. catarrhalis y Haemophilus influenzae. Pueden usarse en procedimientos genéticos (particularmente recombinación homóloga) para regular negativamente (en particular delecionar) parte de (preferentemente todos) esos genes [procedimiento d)].
Otro aspecto de la divulgación, por lo tanto, es una secuencia polinucleotídica aislada que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una parte de al menos 30 nucleótidos de los nucleótidos de las SEC ID Nº: 2-23, 25, 27-81
o una cadena complementaria de las mismas. Preferentemente, la secuencia aislada debe tener una longitud suficiente para realizar una recombinación homóloga con la secuencia del cromosoma si forma parte de un vector adecuado - particularmente al menos 30 nucleótidos (preferentemente al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ó 500 nucleótidos). Más preferentemente, el polinucleótido aislado debe comprender al menos 30 nucleótidos (preferentemente al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ó 500 nucleótidos) de las SEC ID Nº: 2-23, 25, 27-81 o una cadena complementaria de las mismas.
Como se usa en el presente documento, las condiciones de hibridación altamente rigurosas incluyen, por ejemplo, SSC 6X, Denhardt 5X, SDS al 0,5% y 100 !g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado hibridado durante una noche a 65ºC y lavado en SSC 2X, SDS al 0,1% una vez a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos seguido de una vez a 65ºC durante aproximadamente 15 minutos, seguido de al menos un lavado en SCC 0,2X y SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante al menos 3-5 minutos.
Otro aspecto de la divulgación es el uso de las secuencias polinucleotídicas aisladas de la invención para realizar un acontecimiento de ingeniería genética (tal como una inserción de transposón, o mutación específica de sitio o deleción, pero preferentemente un acontecimiento de recombinación homóloga) dentro de 1000 pb cadena arriba de un gen cromosómico de una bacteria Gram-negativa para aumentar o reducir la expresión del gen. Preferentemente, la cepa en la que se realiza el acontecimiento de recombinación es igual que la cepa a partir de la cual se obtuvieron las secuencias cadena arriba de la invención. Sin embargo, los meningococos A, B, C, Y y W y los genomas de gonococos son suficientemente similares como para que la secuencia cadena arriba de cualquiera de estas cepas pueda ser adecuada para diseñar vectores para realizar dichos acontecimientos en las otras cepas. Esto también puede ocurrir en el caso de Haemophilus influenzae y Haemophilus influenzae no tipificable.
Ejemplos
Los ejemplos proporcionados a continuación se realizan usando técnicas convencionales, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la materia, excepto cuando se describe otra cosa con detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.
Ejemplo 1: Construcción de una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B que carece de polisacáridos capsulares
El plásmido pMF121 (Frosch y col., 1990) se ha usado para construir una cepa de Neisseria meningitidis B que carece del polisacárido capsular. Este plásmido contiene las regiones flanqueantes de un locus génico que codifica la ruta de biosíntesis del polisacárido del grupo B (PS B), y el gen de resistencia a eritromicina. La deleción del PS B dio como resultado una pérdida de expresión del polisacárido capsular del grupo B así como una deleción en la copia activa de galE que condujo a la síntesis de LPS deficiente en galactosa.
Transformación de la cepa:
Se seleccionó Neisseria meningitidis B cepa H44/76 (B:15:P1.7, 16; Los 3,7,9) para la transformación. Después de una incubación durante una noche con CO2 en una placa MH (sin eritromicina), las células se recogieron en MH líquido que contenía MgCl2 10 mM (se usaron 2 ml por placa MH) y se diluyeron hasta una DO de 0,1 (550 nm). A estos 2 ml de solución, se añadieron 4 !l de la solución madre de plásmido pMF121 (0,5 !g/ml) durante un periodo de incubación de 6 horas a 37ºC (con agitación). Se realizó un grupo de control con la misma cantidad de bacterias Neisseria meningitidis B, pero sin la adición del plásmido. Después del periodo de incubación, se pusieron 100 !l de cultivo, como tal, a diluciones de 1/10, 1/100 y 1/1000, en placas MH que contenían 5, 10, 20, 40 u 80 !g de eritromicina/ml antes de la incubación durante 48 horas a 37ºC.
Transferencia de colonias:
Después de la incubación de las placas, se cultivaron 20 colonias y se seleccionaron a partir de las placas MH de 10 y 20 !g de eritromicina/ml, mientras que no había crecimiento de colonias en el grupo de control sin transformación con plásmido. La cepa H44/76 de tipo silvestre no podía crecer en las placas con eritromicina seleccionadas (de 10 a 80 !g de eritromicina/ml). El día después, todas las colonias visibles se pusieron en nuevas placas MH sin eritromicina para dejarlas crecer. Posteriormente, se transfirieron a láminas de nitrocelulosa (transferencia de colonias) para determinar la presencia de polisacárido B. En resumen, las colonias se transfirieron a una lámina de nitrocelulosa y se aclararon directamente en PBS-Tween 20 a 0,05% antes de la inactivación celular durante 1 hora a 56ºC en PBS-Tween 20 al 0,05% (tampón diluyente). Posteriormente, la membrana superpuso durante una hora en el tapón diluyente a temperatura ambiente (TA). Después, las láminas se lavaron de nuevo durante 5 minutos tres veces en el tampón diluyente antes de la incubación con el Acm 735 anti-PS B (Boerhinger) diluido a 1/3000 en el tampón diluyente durante 2 horas a TA. Después de una nueva etapa de lavado (3 veces, 5 minutos), el anticuerpo monoclonal se detectó con una Ig anti-ratón biotinilada de Amersham (RPN 1001) diluida 500 veces en el tampón diluyente (una hora a TA) antes de la siguiente etapa de lavado (como se ha descrito anteriormente). Posteriormente, las láminas se incubaron durante una hora a TA con una solución de complejo de estreptavidina-peroxidasa diluido 1/1000 en el tampón diluyente. Después de las últimas tres etapas de lavado usando el mismo procedimiento, las láminas de nitrocelulosa se incubaron durante 15 min en la oscuridad usando la solución de revelación (30 mg de solución de 4-cloro-1-naftol en 10 ml de metanol más 40 ml de PBS y 30 mcl de H2O2 al 37% de Merck). La reacción se detuvo con una etapa de lavado con agua destilada.
Ensayos Elisa de célula completa:
También se realizaron ensayos Elisasde células completas usando las dos colonias transformadas (“D” y “R”) y la cepa de tipo silvestre H44/76) como bacterias revestidas (20 !g proteína/ml) y se usó una serie de anticuerpos monoclonales diferentes para caracterizar las cepas de Neisseria meningitidis. Se ensayaron los siguientes Acm: anti-PS B (735 de Dr Frosch), y los otros Acm de NIBSC: anti-PS B (Ref 95/750) anti-P1.7 (A-PorA, Ref 4025), anti-P1.16 (A-PorA, Ref 95/720), anti-Los 3,7,9 (ALPS, Ref 4047), anti-Los 8 (A-LPS, Ref 4048), y anti-P1.2 (A-PorA Ref 95/696).
Se revistieron placas de microtitulación (Maxisorp, Nunc) con 100 !l de la solución de linfocitos B de meningococo recombinante durante una noche (ON) a 37ºC a aproximadamente 20 !g/ml en PBS. Posteriormente, las placas se lavaron tres veces con 300 !l de NaCl 150 mM - Tween 20 al 0,05% y se revistieron con 100 !l de PBS-caseína al 0,3% y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron de nuevo usando el mismo procedimiento antes de la incubación con anticuerpos. Se usaron anticuerpos monoclonales (100 !l) a diferentes diluciones (como se muestra en la Figura 2) en PBS-Caseína al 0,3% y Tween 20 al 0,05% y se pusieron en las microplacas antes de la incubación a temperatura ambiente durante 30 min con agitación, antes de la siguiente etapa de lavado idéntica. Se añadieron 100 !l de la Ig anti-ratón (de conejo, Dakopatts E0413) conjugada con biotina y diluida a 1/2000 en PBS-Caseína al 0,3%-Tween 20 al 0,05% a los pocillos para detectar anticuerpos monoclonales unidos. Después de la etapa de lavado (como se ha indicado anteriormente), las placas se incubaron con una solución de complejo de estreptavidina-peroxidasa (100 !l del Amersham RPN 1051) diluido al 1/4000 en la misma solución de trabajo durante 30 min a temperatura ambiente en condiciones de agitación. Después de esta incubación y de la última etapa de lavado, las placas se incuban con 100 !l de la solución de cromógeno (4 mg de ortofenilendiamina (OPD) en 10 ml de tampón citrato 0,1 M pH 4,5 con 5 !l de H2O2) durante 15 min en la oscuridad. Después, las placas se leen a 490/620 nm usando un espectrofotómetro.
Resultados:
La Figura 1 muestra que a partir de las 20 colonias aisladas, que podían crecer en el medio seleccionado con eritromicina, solo dos (la “D” y la “R”) resultaron ser negativas con respecto a la presencia de polisacárido B. Entre las otras, 16 fueron claramente positivas para PS B y aún resistentes a eritromicina. Esto indicaba que integraban el plásmido en su genoma, pero en la orientación incorrecta, y manteniendo intacto el gen de PS B y de LPS (sin entrecruzamiento doble). También se ensayaron controles positivos y negativos en las placas y mostraron que la cepa NmB de tipo silvestre H44/76 era claramente positiva para el polisacárido B, mientras que las cepas de meningococo A (A1) y meningococo C (C11) eran claramente negativas con este Acm anti-PS B 735. Estos resultados indican que aproximadamente el 10% de las colonias seleccionadas integraban correctamente el plásmido en su genoma realizando un entrecruzamiento doble, mientras que las otras cepas/colonias se obtuvieron después de un entrecruzamiento sencillo, manteniendo los genes de PS B y LPS intactos y expresados.
Usando el ensayo Elisa de células completas, los resultados (Figura 2 y la Tabla proporcionada a continuación) indican claramente que los dos transformantes “D” y “R” (procedentes de colonias D y R) ya no pueden reconocerse por los Acm anti-PS B (735 y 95/750), ni por los Acm anti-Los 3,7,9 y anti-Los 8. Sin embargo, cuando se usan Acm anti-PorA específicos, hay una clara reacción con los Acm anti-P1.7 y anti-P1.16 en las células, como también se observa en la cepa de tipo silvestre. No se observó reacción con un Acm anti-PorA no específico (Acm anti-P1.2). Estos resultados confirman que la proteína PorA, y específicamente los epítopos P1.7 y P1.16 aún están presentes después de la transformación, mientras que el polisacárido B y los epítopos Los 3.7,9 y Los 8 (LPS) no.
Tabla: Especificidades de los anticuerpos monoclonales ensayados
Acm Ensayados
Dirigido contra Resultado
Anti-PS B 735
Polisacárido B ++ en la cepa de tipo silvestre (-) en los mutantes “D” y “R”
Anti-PS B 95/750 de NIBSC
PS B ++ en la cepa de tipo silvestre (-) en los mutantes “D” y “R”
Anti-P1.7 (NIBSC)
Bucle 1 de Porina A ++ en todas las cepas de tipo silvestre y mutantes
Anti-P1.16 (NIBSC)
Bucle 4 de Porina A ++ en todas las cepas de tipo silvestre y mutantes
Anti-Los 3,7,9
LPS ++ en la cepa de tipo silvestre (-) en los mutantes “D” y “R”
Anti-Los 8 (NIBSC)
LPS +/- en la cepa de tipo silvestre (-) en los mutantes “D” y “R”
Anti-P1.2 (NIBSC)
Anti-Porina A Sero-subtipo 1.2 (-) en todas las cepas de tipo silvestre y mutantes
Ejemplo 2: Construcción de vectores de liberación génica versátiles (la serie pCMK) que dirige la integración en 5 el locus porA de Neisseria meningitidis
Se construyó un plásmido que permitía la recombinación homóloga y la integración estable de ADN extraño en el locus porA de Neisseria meningitidis. Este vector de liberación (genes, operones y/o casetes de expresión) es útil para construir las cepas de Neisseria meningitidis que producen ampollas recombinantes mejoradas. Típicamente, dicho vector contiene al menos: (1) un esqueleto plasmídico replicativo en E. coli pero no en Neisseria meningitidis (un 10 plásmido suicida), (2) al menos uno, pero preferentemente dos regiones de homología para dirigir la integración en un locus cromosómico tal como porA, (3) señales de la transcripción eficaces (promotor, región reguladora y terminador) y de la traducción (sitio de unión a ribosomas optimizado y codón de iniciación) funcionales en Neisseria meningitidis (4), un sitio de clonación múltiple y (5) uno o más genes de selección que permiten el mantenimiento del plásmido en E. coli y la selección de integrantes en Neisseria meningitidis. Otros elementos incluyen, por ejemplo, secuencias de captación
15 para facilitar la entrada del ADN extraño en Neisseria meningitidis y marcadores contraseleccionables tales como sacB, rpsL, gltS para aumentar la frecuencia de acontecimientos de entrecruzamiento doble.
En la Figura 3 se representa un dibujo esquemático del vector construido en este ejemplo y denominado pCMK. Su secuencia de nucleótidos completa correspondiente se muestra en la SEC ID Nº: 1. pCMK procede de un esqueleto de pSL1180 (PharmaciaBiotech, Suecia), un plásmido de alto número de copias replicativo en E. coli, que lleva el gen bla (y 20 por lo tanto confiere resistencia a ampicilina). Además de esto, pCMK contiene funcionalmente dos regiones flanqueantes de porA (porA5’ y porA3’ que contiene un terminador de la transcripción) necesarias para la recombinación homóloga, un marcador de selección que confiere resistencia a kanamicina, dos secuencias de captación, un promotor quimérico porA/lacO reprimido en el huésped E. coli que expresa laclq pero transcripcionalmente activo en Neisseria meningitidis, y un sitio de clonación de múltiple (5 sitios presentes: NdeI, KpnI, NheI, PinA1 y SphI) necesario para la
25 inserción del ADN extraño en pCMK.
pCMK se construyó como se indica a continuación. Las regiones recombinogénicas porA5’ y porA3’ y el promotor porA/lacO se amplificaron por PCR usando los oligonucleótidos indicados en la tabla mostrada a continuación, se clonaron en pTOPO y se secuenciaron. Estos fragmentos de ADN se escindieron sucesivamente de pTOPO y se volvieron a clonar en pSL1180. El casete de resistencia a kanamicina se escindió de pUC4K (PharmaciaBiotech, Suecia)
30 y se introdujo entre la región flanqueante porA5’ y la región promotora porA/lacO.
Tabla: Oligonucleótidos usados en este trabajo
Oligonucleótidos
Secuencia Observación(s)
PorA5’Directo
Sitio de clonación HindIII Secuencia de captación (_)
PorA5’Inverso
Sitio de clonación NruI
PorA3’Directo
Sitio de clonación Bgl II Codones de terminación (_)
PorA3’Inverso
Sitio de clonación EcoRI Secuencia de captación (_)
PoLa Inverso1
PoLa Inverso1
Sitio de clonación NdeI
PorAlacO Directo
Sitio de clonación PstI
PorAlacO Inverso
5’-CTTAAGGCATATGGGCTT CCT TTT GTA A-3’ Sitio de clonación NdeI
PPA1
5’- GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C-3’
PPA2
5’-GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3’
N-full-01:
Sitio de clonación NdeI
Nde-NspA-3:
Sitio de clonación NdeI
PNS1
Sitio de clonación EcoRI
PNS1
5’-CGTCTAGACGTAGCGGTATCCGGCTGC-3’ Sitio de clonación XbaI
PromD15-51X
Sitios de clonación EcoRI y NotI
PromD15-S2
Sitio de clonación XbaI
(continuación)
PNS4
Sitios de clonación SwaI y PacI
PNS5
Sitio de clonación PmeI
D15-S4
Sitios de clonación Swal y PacI
D15-S5
Sitio de clonación PmeI
Ejemplo 3: Construcción de una cepa de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece tanto de polisacáridos capsulares como del antígeno inmunodominante principal PorA
5 La modulación del contenido antigénico de las ampollas de membrana externa puede ser ventajosa para mejorar su seguridad y eficacia en su uso en vacunas, o en usos de diagnóstico o terapéuticos. Componentes tales como los polisacáridos capsulares de Neisseiria meningitidis serogrupo B deberían eliminarse para excluir el riesgo de inducir autoinmunidad (véase el Ejemplo 1). De forma similar, es beneficioso suprimir la inmunodominancia de los antígenos de membrana externa principales tales como PorA, que inducen anticuerpos bactericidas específicos de cepa pero no
10 confieren protección cruzada. Para ilustrar dicha estrategia, los inventores usaron el vector pCMK(+) para construir una cepa de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece tanto de polisacáridos capsulares como del antígeno de proteína de membrana externa PorA inmunodominante. Con este fin, se introdujo una deleción del gen porA en la cepa H44/76 cps-, descrita en el Ejemplo 1, por medio de recombinación homóloga.
La cepa H44/76 cps- se hizo competente y se transformó con 2 !g de ADN plasmídico de pCMK(+) superenrollado como
15 se ha descrito anteriormente. Se sembraron fracciones de alícuotas de la mezcla de transformación (100 !l) en placas Mueller-Hinton complementadas con kanamicina (200 !g/ml) y se incubaron a 37ºC durante 24 a 48 horas. Se seleccionaron las colonias resistentes a kanamicina, se volvieron a sembrar en estrías en MH-Kn y se cultivaron durante 24 horas adicionales a 37ºC. En esa fase se usó la mitad del cultivo bacteriano para preparar soluciones madre en glicerol (15% vol/vol) y se mantuvo congelado a -70ºC. Otra fracción (que se estimó que era de 108 bacterias) se
20 resuspendió en 15 !l de agua destilada, se llevó a ebullición diez minutos y se usó como molde para exploración por PCR. Se sintetizaron dos cebadores internos de porA denominados PPA1 y PPA2 y se usaron para realizar amplificación por PCR en lisados bacterianos llevados a ebullición en las condiciones descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). El termociclado usado era el siguiente: 25 veces (94ºC 1 min, 52ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10 min, 4ºC hasta su recuperación). Puesto que un sobrecruzamiento doble entre ADN de pCMK y el locus
25 cromosómico de porA deleciona la región necesaria para la hibridación Nº 1 y Nº 2, los clones que carecen de un fragmento de amplificación de PCR de 1170 pb se seleccionaron como mutantes de deleción de porA. Estos resultados de PCR se confirmaron adicionalmente analizando en paralelo la presencia de PorA en los extractos de proteína bacteriana correspondientes. Con este fin, se resuspendió otra alícuota de bacterias (que se estimó era de 5.108 bacterias) en 50 !l de tampón de PAGE-SDS (SDS al 5%, glicerol al 30%, beta-mercaptoetanol al 15%, azul de
30 bromofenol 0,3 mg/ml, Tris-HCl 250 mM pH 6,8), se llevó a ebullición (100ºC), se congeló (-20ºC)/se llevó a ebullición (100ºC) tres veces y se separó mediante electroforesis de PAGE-SDS en un gel al 12,5%. Después los geles se tiñeron mediante azul brillante de Coomassie R250 o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con un anticuerpo monoclonal anti-PorA como se describe en Maniatis y col. Como se representa en la Figura 4, tanto la tinción con Coomassie como de inmunotransferencia confirmó que los clones negativos por PCR
35 para porA no producen niveles detectables de PorA. Este resultado confirma que el vector pCMK es funcional y puede usarse con éxito para dirigir la inserción de ADN en el gen porA, suprimiendo al mismo tiempo la producción del antígeno proteico de membrana externa de PorA.
Ejemplo 4: Regulación positiva de la producción de proteína de membrana externa NspA en ampollas derivadas de una cepa recombinante de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de genes porA y cps
40 funcionales.
El enriquecimiento de vesículas de ampollas con antígenos protectores es ventajoso para mejorar la eficacia y la cobertura de vacunas basadas en proteínas de membrana externa. En ese contexto, se obtuvieron por ingeniería genética cepas de Neisseiria meningitidis recombinantes que carecen de genes cps y porA funcionales para regular positivamente los niveles de expresión de la proteína de membrana externa NspA. Con este fin, el gen que codifica para NspA se amplificó por PCR usando los cebadores oligonucleotídicos N01-full-Ndel y Ndel-3’ (véase la tabla del Ejemplo 2). Las condiciones usadas para la amplificación por PCR eran las descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). El termociclado realizado era el siguiente: 25 veces (94ºC 1 min, 52ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10 min, 4ºC hasta la recuperación). El amplicón correspondiente se digirió con NdeI y se insertó en el sitio de restricción de NdeI del vector de suministro pCMK(+). La orientación del inserto se comprobó y se purificaron plásmidos recombinantes, denominados pCMK(+)-NspA, a gran escala usando el kit de maxipreparaciones de QIAGEN y se usaron 2 !g de este material para transformar una cepa de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de genes cps funcionales (cepa descrita en el Ejemplo 1). La integración resultante de un sobrecruzamiento doble entre el vector pCMK(+)-NspA y el locus cromosómico de porA se seleccionó usando una combinación de procedimientos de exploración de PCR y transferencia de Western presentada en el Ejemplo 3.
Se resuspendieron bacterias (correspondientes a aproximadamente 5.108 bacterias) en 50 !l de tampón de PAGE-SDS, se congelaron (-20ºC)/se llevaron a ebullición (100ºC) tres veces y después se separaron mediante electroforesis de PAGE-SDS en un gel al 12,5%. Los geles se tiñeron después mediante azul brillante de Coomassie R250 o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con un suero policlonal anti-NspA. Tanto la tinción con Coomassie (no se muestran los datos) como la inmunotransferencia (véase la Figura 4) confirmaron que los clones negativos por PCR para porA no producen niveles detectables de PorA. La expresión de NspA se examinó en lisados bacterianos de células completas (LBCC) o preparaciones de ampollas de membrana externa derivadas de NmB [cps-, porA-] o NmB [cps-, porA-, Nspa+]. Aunque no eran observables diferencias por tinción con Coomassie, la inmunotransferencia con el suero policlonal anti-NspA detectó un aumento de 3-5 veces en la expresión de NspA (con respecto al nivel de NspA endógeno), tanto en LBCC como en preparaciones de ampollas de membrana externa (véase la Figura 5). Este resultado confirma que el vector pCMK(+)-NspA es funcional y puede usarse con éxito para regular positivamente la expresión de proteínas de membrana externa tales como NspA, suprimiendo al mismo tiempo la producción del antígeno proteico de membrana externa PorA.
Ejemplo 5: Regulación positiva del antígeno proteico de membrana externa D15/Omp85 en ampollas derivadas de una cepa recombinante de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de genes cps funcionales pero que expresa PorA
Ciertas poblaciones humanas aisladas geográficamente (tales como de Cuba) están infectadas mediante un número limitado de aislados de Neisseiria meningitidis que pertenecían en su mayor parte a uno o pocos serotipos de proteínas de membrana externa. Puesto que PorA es un antígeno proteico de membrana externa principal, que induce anticuerpos bactericidas específicos de cepa y protectores, entonces es posible conferir protección vacunal usando un número limitado de serotipos de porA en una vacuna. En tal contexto, la presencia de PorA en vesículas de membrana externa puede ser ventajosa, reforzando la eficacia de la vacuna de dichas ampollas recombinantes mejoradas. Dichas vacunas que contienen PorA, sin embargo, puede mejorarse aún más aumentando el nivel de otras PME con reactividad cruzada tales como omp85/D15.
En el ejemplo siguiente, el vector pCMK(+) se usó para regular positivamente la expresión del antígeno proteico de membrana externa Omp85/D 15 en una cepa que carece de genes cps funcionales pero que expresa porA. Con este fin, el gen que codifica Omp85/D15 se amplificó por PCR usando los cebadores oligonucleotídicos D15-NdeI y D15-NotI. Las condiciones usadas para la amplificación por PCR eran las descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). El termociclado realizado fue el siguiente: 25 veces (94ºC 1 min, 52ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10 min, 4ºC hasta su recuperación). El amplicón correspondiente se insertó en el vector de clonación pTOPO de acuerdo con las especificaciones del fabricante y se realizó una secuenciación de confirmación. Este fragmento de ADN de Omp85/D15 se escindió a partir de pTOPO por hidrólisis de restricción usando NdeI/NsiI y posteriormente se clonó en los sitios de restricción correspondientes del vector de suministro pCMK(+). Los plásmidos recombinantes, denominados pCMK(+)-D15, se purificaron a gran escala usando el kit de maxipreparaciones de QIAGEN y se usaron 2 !g de este material para transformar una cepa de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de genes cps funcionales (cepa descrita en el Ejemplo 1). Para preservar la expresión de porA, la integración resultante de un solo sobrecruzamiento (en Omp85/D15 o en porA) se seleccionó mediante una combinación de procedimientos de exploración por PCR y transferencia de Western. Los clones resistentes a kanamicina que dieron en ensayo positivo mediante PCR específica de porA y transferencia de Western se almacenaron a -70ºC como soluciones madre en glicerol y se usaron para estudios adicionales.
Las bacterias (correspondientes a aproximadamente 5.108 bacterias) se resupendieron en 50 !l de tampón de PAGE-SDS, se congelaron (-20ºC)/se llevaron a ebullición (100ºC) tres veces y después se separaron mediante electroforesis de PAGE-SDS en un gel al 12,5%. Después los geles se tiñeron mediante azul brillante de Coomassie R250 o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con un anticuerpo monoclonal anti-porA. Como se representa en la Figura 6, tanto la tinción con Coomassie como de inmunotransferencia confirmó que los clones positivos por PCR para porA producen PorA.
La expresión de D15 se examinó usando preparaciones de ampollas de membrana externa derivadas de NmB [cps-, porA-] o NmB [cps-, porA+, D15+]. El Coomassie detectó un aumento significativo en la expresión de D15 (con respecto al nivel de D15 endógeno), en las preparaciones (véase la Figura 6). Este resultado confirmó que el vector pCMK(+)-D15 es funcional y puede usarse con éxito para regular positivamente la expresión de proteínas de membrana externa tales como D15, sin suprimir la producción del antígeno proteico de membrana externa PorA principal.
Ejemplo 6: Construcción de vectores de suministro de promotores versátiles
Fundamento: El fundamento de esta estrategia se representa en la Figura 7 y puede resumirse en 7 etapas 5 esenciales. Algunas de esas etapas se ilustran a continuación con la construcción de un vector para regular positivamente la expresión de NspA y D15/Omp85.
Vector para regular positivamente la expresión del gen de NspA.
Etapa 1. Se descubrió una región de ADN (997 pb) localizada cadena arriba del gen codificante de NspA (SEC ID Nº: 2) en la base de datos privada Incyte PathoSeq que contenía secuencias de ADN genómico sin terminar de la 10 cepa ATCC 13090 de Neisseiria meningitidis. Se diseñaron dos cebadores oligonucleotídicos denominados PNS1 y PNS2 (véase la tabla 2 del Ejemplo 2) usando esta secuencia y se sintetizaron. Estos cebadores se usaron para la amplificación por PCR usando ADN genómico extraído de la cepa H44/76. Etapa 2. Los amplicones correspondientes se limpiaron usando el kit de PCR Wizard (Promega, Estados Unidos) y se sometieron a digestión con las enzimas de restricción EcoRI/XbaI durante 24 horas usando las condiciones descritas por el proveedor (Boehringer Mannheim, 15 Alemania). Los fragmentos de ADN correspondientes se purificaron en gel y se insertaron en los sitios correspondientes del vector de clonación pUC18. Etapa 3. Los plásmidos recombinantes se prepararon a gran escala y se usó una fracción de alícuota como molde para la amplificación por PCR inversa. La PCR inversa se realizó usando los oligonucleótidos PNS4 y PNS5 usando las condiciones de termociclado siguientes: 25 veces (94ºC 1 min, 50ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10 min, 4ºC hasta su recuperación). Se obtuvieron vectores pUC18 linealizados que
20 albergaban una deleción en el inserto de la región cadena arriba de NspA.
Vector para regular positivamente la expresión del gen de D15/omp85
Etapa 1. Se describió una región de ADN (1000 pb) localizada cadena arriba del gen codificante de D15/omp85 (SEC ID Nº: 3) en la base de datos privada Incyte PathoSeq que contenía secuencias de ADN genómico sin terminar de la cepa ATCC 13090 de Neisseiria meningitidis. Se diseñaron dos cebadores oligonucleotídicos denominados PromD1525 51X y PromD15-S2 (véase la tabla 2 del Ejemplo 2) usando esta secuencia y se sintetizaron. Estos cebadores se usaron para la amplificación por PCR usando ADN genómico extraído de la cepa H44/76. Etapa 2. Los amplicones correspondientes se limpiaron usando el kit de PCR Wizard (Promega, Estados Unidos) y se sometieron a digestión con las enzimas de restricción EcoRI/XbaI durante 24 horas en las condiciones descritas por el proveedor (Boehringer Mannheim, Alemania). Los fragmentos de ADN correspondientes se purificaron en gel y se insertaron en los sitios
30 correspondientes del vector de clonación pUC18. Etapa 3. Se prepararon plásmidos recombinantes a gran escala y se usó una fracción de alícuota como molde para la amplificación por PCR inversa. Se realizó PCR inversa usando los oligonucleótidos D15-S4 y D15-S5 usando las condiciones de termociclado siguientes: 25 veces (94ºC 1 min, 50ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10 min, 4ºC hasta su recuperación). Se obtuvieron vectores pUC18 linealizados que albergaban una deleción en el inserto de la región cadena arriba de D15/omp85.
35 Ejemplo 7: Procedimientos de fermentación para producir ampollas recombinantes
Los ejemplos enumerados a continuación describen procedimientos para producir ampollas recombinantes que carecen de polisacáridos capsulares o de polisacáridos capsulares y PorA. Dicho procedimiento puede usarse para una amplia variedad de cepas recombinantes de Neisseiria meningitidis y puede adaptarse a una amplia variedad de escalas.
40 Medios de cultivo: Se propagaron cepas de Neisseiria meningitidis serogrupo B en medios de cultivo sólidos (FNE 004 AA, FNE 010 AA) o líquidos (FNE 008 AA). Estos nuevos medios para cultivo de meningococos están ventajosamente libres de productos animales y se consideran un aspecto adicional de la divulgación.
Componentes
FNE 004AA FNE 008 AA FNE 010AA
Agar
18 g/l - 18 g/l
NaCl
6 g/l 6 g/l 6 g/l
Na-Glutamato
- 1,52 g/l -
NaH2PO4.2H2O
2,2 g/l 2,2 g/l 2,2 g/l
KCl
0,09 g/l 0,09 g/l 0,09 g/l
40 (continuación)
Componentes
FNE 004AA FNE 008 AA FNE 010AA
NH4Cl
1,25 g/l 1,25 g/l 1,25 g/l
Glucosa
5 g/l 20 g/l 5 g/l
Extracto de Levadura UF
- 2,5 g/l -
Peptona de Soja
5 g/l 30 g/l 5 g/l
CaCl2.2H2O
0,015 g/l - 0,015 g/l
MgSO4.7H2O
0,6 g/l 0,6 g/l 0,6 g/l
Eritromicina:
0,015 g/l - -
Kanamicina
- - 0,2 g/l
Cultivo en matraz de ampollas recombinantes de Neisseiria meningitidis serogrupo B cps-: Esto se realizó en dos etapas que comprenden el precultivo en medio sólido seguido de cultivo líquido. Precultivo sólido. Se retiró un vial de siembra del congelador (-80ºC), se descongeló a temperatura ambiente y se sembraron en estrías 0,1 ml en una placa de Petri que contenía 15 ml de FNE004AA (véase anteriormente). La placa de Petri se incubó a 37ºC durante 18 ± 2 horas. El cultivo en superficie se resuspendió en 8 ml de FNE008AA (véase anteriormente) complementado con 15 mg/l de eritromicina. Cultivo en matraz. Se añadieron 2 ml de precultivo sólido resuspendido a un matraz de 2 litros que contenía 400 ml de FNE008AA complementado con 15 mg/l de eritromicina. El matraz se puso en una mesa con agitación (200 rpm) y se incubó a 37ºC durante 16 ± 2 horas. Las células se separaron del caldo de cultivo por centrifugación a 5000 g a 4ºC durante 15 minutos.
Cultivo en modo discontinuo de ampollas recombinantes de Neisseiria meningitidis serogrupo B cps-: Esto se realizó en tres etapas que comprenden el precultivo en medio sólido, el cultivo líquido y cultivo en modo discontinuo. Precultivo sólido. Se retiró un vial de siembra del congelador (-80ºC), se descongeló a temperatura ambiente y se sembraron en estrías 0,1 ml en una placa de Petri que contenía 15 ml de FNE004AA (véase anteriormente). La placa de Petri se incubó a 37ºC durante 18 ± 2 horas. El cultivo en superficie se resuspendió en 8 ml de FNE008AA (véase anteriormente) complementado con 15 mg/l de eritromicina. Precultivo líquido. Se añadieron 2 ml de precultivo sólido resuspendido a un matraz de 2 litros que contenía 400 ml de FNE008AA complementado con 15 mg/l de eritromicina. El matraz se puso en una mesa con agitación (200 rpm) y se incubó a 37ºC durante 16 ± 2 horas. El contenido del matraz se usó para inocular el fermentador de 20 litros. Cultivo en modo discontinuo en fermentador. El inóculo (400 ml) se añadió a un fermentador de 20 litros (volumen total) preesterilizado que contenía 10 l de FNE008AA complementado con 15 mg/l de eritromicina. El pH se ajustó a y se mantuvo a 7,0 mediante la adición automática de NaOH (25% p/v) y H3PO4 (25% v/v). La temperatura se reguló a 37ºC. La tasa de aireación se mantuvo a 20 litros de aire/min y la concentración de oxígeno disuelto se mantuvo al 20% de saturación mediante el control de la velocidad de agitación. La sobrepresión en el fermentador se mantuvo a 300 g/cm2. Después de 9 ± 1 horas, el cultivo estaba en fase estacionaria. Las células se separaron del caldo de cultivo por centrifugación a 5000 g a 4ºC durante 15 minutos.
Cultivo en matraz de ampollas recombinantes de Neisseiria meningitidis serogrupo B cps-, PorA-: Esto se realizó en dos etapas que comprenden el precultivo en medio sólido seguido de cultivo líquido. Precultivo sólido. Se retiró un vial de siembra del congelador (-80ºC), se descongeló a temperatura ambiente y se sembraron en estrías 0,1 ml en una placa de Petri que contenía 15 ml de FNE010AA (véase anteriormente). La placa de Petri se incubó a 37ºC durante 18 ± 2 horas. El cultivo en superficie se resuspendió en 8 ml de FNE008AA (véase anteriormente) complementado con 200 mg/l de kanamicina. Cultivo en matraz. Se añadieron 2 ml de precultivo sólido resuspendido a un matraz de 2 litros que contenía 400 ml de FNE008AA complementado con 200 mg/l de kanamicina. El matraz se puso en una mesa con agitación (200 rpm) y se incubó a 37ºC durante 16 ± 2 horas. Las células se separaron del caldo de cultivo por centrifugación a 5000 g a 4ºC durante 15 minutos.
Ejemplo 8: Aislamiento y purificación de ampollas de meningococos desprovistas de polisacárido capsular
Se purificaron ampollas recombinantes como se describe a continuación. La pasta celular (42 g) se suspendió en 211 ml de tampón Tris-Cl 0,1 M pH 8,6 que contenía EDTA 10 mM y desoxicolato sódico (DOC) al 0,5%. La proporción de tampón respecto a biomasa era de 5/1 (V/P). La biomasa se extrajo por agitación magnética durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, el extracto total se centrifugó a 20.000 g durante 30 minutos a 4ºC (13.000 rpm en un rotor JA-20, centrífuga Beckman J2-HS). El sedimento se desechó. El sobrenadante se ultracentrifugó a 125.000 g durante 2 horas a 4ºC (40.000 rpm en un rotor 50.2Ti, ultracentrífuga Beckman L8-70M) para concentrar vesículas. El sobrenadante se desechó. El sedimento se suspendió suavemente en 25 ml de tampón Tris-Cl 50 mM pH 8,6 que contenía EDTA 2 mM, DOC al 1,2% y sacarosa al 20%. Después de una segunda etapa de ultracentrifugación a 125.000 g durante 2 horas a 4ºC, las vesículas se suspendieron suavemente en 44 ml de sacarosa al 3% y se almacenaron a 4ºC. Todas las soluciones usadas para la extracción y purificación de ampollas contenían tiomersalato al 0,01%. Como se ilustra en la Figura 8, este procedimiento produce preparaciones de proteína altamente enriquecidas en proteínas de membrana externa tales como PorA y PorB.
Ejemplo 9: Identificación de promotores bacterianos adecuados para la regulación positiva de genes codificantes de antígenos
El uso de elementos promotores bacterianos fuertes es esencial para obtener la regulación positiva de genes que codifican proteínas de membrana externa. En ese contexto, se ha mostrado previamente que la regulación positiva de genes nspA, hsf y omp85 de Neisseiria meningitidis usando el promotor de porA ha permitido a los inventores aislar ampollas recombinantes enriquecidas en las proteínas NspA, Hsf y Omp85 correspondientes. Las alternativas al promotor de porA pueden ser útiles para obtener diferentes niveles de regulación positiva para superar la variación de fase potencial de porA y/o para conseguir una expresión génica condicional (promotores regulados por hierro). En el presente documento los inventores describen un procedimiento que permite la identificación de un sitio de inicio de la transcripción preciso de elementos promotores fuertes que probablemente confieren un alto nivel de expresión en bacterias. Puesto que los elementos reguladores promotores se incluyen clásicamente dentro de 200 pb cadena arriba y 50 pb cadena abajo del sitio +1 (Collado-Vides J, Magasanik B, Gralla JD, 1991, Microbiol Rev 55(3):371-94), el resultado de dicho experimento permite a los inventores identificar fragmentos de ADN de aproximadamente 250 pb que lleven actividades promotoras fuertes. Las proteínas de membrana externa principales tales como PorA, PorB y Rmp de Neisseiria meningitidis, P1, P2, P5 y P6 de Haemophilus influenzae, OmpCD, OmpE de Moraxella catarrhalis, así como algunas proteínas citoplásmicas y/o reguladas por hierro de estas bacterias poseen elementos promotores fuertes. Como validación de esta metodología general, se mapeó el sitio de inicio de la transcripción de los promotores fuertes de porA y porB de Neisseiria meningitidis usando una amplificación rápida de elementos de ADNc (RACE 5’).
Los principios de la RACE 5’ son los siguientes: 1) Extracción de ARN total usando el kit “RNeasy” de QIAGEN. Eliminación del ADN genómico por tratamiento con ADNasa seguido de purificación por QIAGEN; 2) Transcripción inversa del ARNm con un cebador 3’ terminal específico de porA (denominado porA3). Tamaño esperado del ADNc: 307 nt. Eliminación del ARN por hidrólisis alcalina; 3) Ligación de un anclaje oligonucleotídico de ADN monocatenario (denominado DT88) con el extremo 3’ del ADNc usando ARN ligasa T4. Tamaño de producto esperado: 335 nt. Amplificación del ADNc ligado a anclaje usando una combinación de PCR semianidada; 4) Amplificación por PCR del ADNc ligado a anclaje usando un cebador de anclaje de secuencia complementaria como el cebador 5’ terminal (denominado DT89) y un cebador 3’ terminal (denominado p1-2) que es interno al cebador de RT 3’ terminal de porA3. Tamaño de producto esperado 292 pb; 5) Amplificación por PCR de productos de PCR previos usando DT89 como cebador 5’ terminal y p1-1 como cebador 3’ terminal (interno a p1-2). Tamaño de producto esperado: 211 pb; y 6) Secuenciación con cebador p1-1 (el tamaño de los productos esperados puede calcularse porque se conoce el sitio de inicio de la transcripción de porA: 59 nt antes del sitio de inicio de la traducción “ATG”).
Procedimiento experimental
Se extrajo el ARN total a partir de aproximadamente 109 células de una cepa de Neisseiria meningitidis serogrupo B cpsporA+. La extracción de 1 ml de cultivo líquido a la densidad óptica apropiada (DO600 = 1) se realizó mediante el kit “RNAeasy” de QIAGEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se eliminó el ADN cromosómico por adición de 10 U de ADNasa sin ARNasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) a los 30 !l de ARN eluido y se incubó a 37ºC durante 15 min. El ARN sin ADN se purificó con el mismo kit de QIAGEN de acuerdo con las instrucciones.
Se realizaron reacciones de transcripción inversa usando el cebador de porA3 y 200 U de transcriptasa inversa SUPERSCRIPT II (Life Technologies). Las reacciones de RT se realizaron en un volumen de 50 !l que contenía: 5!l de dNTP 2 mM, 20 pmol de cebador de porA3, 5!l de tampón SUPERSCRIPT II 10X, 9!l de MgCl2 25 mM, 4!l de DTT 0,1 M, 40 U de inhibidor de ribonucleasa recombinante y 1 !g de ARN total. El cebador de porA3 se hibridó por etapas (70ºC durante 2 min, 65ºC durante 1 min, 60ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, 50ºC durante 1 min y 45ºC durante 1 min) antes de que se añadiera la SUPERSCRIPT II. La reacción de RT se realizó a 42ºC durante 30 min, seguida de 5 ciclos (50ºC durante 1 min, 53ºC durante 1 min y 56ºC durante 1 min) para desestabilizar la estructura secundaria del ARN. Se realizaron dos reacciones en paralelo, omitiéndose la transcriptasa inversa de una reacción como control negativo.
El ARN se eliminó por escisión mediante hidrólisis alcalina con adición de 1 !l de EDTA 0,5 M seguido de 12,5 !l de NaOH 0,2 M antes de la incubación a 68ºC durante 5 min. Las reacciones se neutralizaron por adición de 12,5 !l de Tris-HCl 1 M (pH 7,4) y se precipitaron mediante la adición de 20 !g de glucógeno (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania), 5 !l de acetato sódico 3 M y 60 !l de isopropanol. Ambas muestras se resuspendieron en 20 !l de TE 10:1 (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM, pH 8).
Se usó ARN ligasa T4 para anclar un oligonucleótido de anclaje bloqueado con ddCTP 3’ terminal 5’-fosforilado DT88 (véase la tabla a continuación). Se realizaron dos ligaciones en paralelo durante una noche a temperatura ambiente conteniendo cada una: 1,3 !l de tampón de ARN ligasa 10X (Roche Molecular Biochemicals), DT88 0,4 !M, 10 !l de ADNc o muestra de control de RT y 3 U de ARN ligasa T4. Como controles negativos, se realizó un segundo conjunto de reacciones de ligación omitiendo la ARN ligasa T4. Las mezclas de reacción de ligación resultantes se usaron directamente sin purificación en la PCR posterior.
El ADNc ligado a anclaje se amplificó usando una combinación de estrategias de PCR semianidada y de inicio en caliente para aumentar la especificidad y el rendimiento de producto. Se realizaron cuatro primeras rondas de PCR 5 separadas sobre la reacción de RT/ligasa y controles en un volumen de 30 !l, conteniendo cada una: 3 !l de tampón de Taq Platinium 10X, 3 !l de MgCl2 25 mM, 1 !l de dNTP 10 mM, 10 pmol de cada cebador y 1 !l de la reacción de ligación de ARN correspondiente. La PCR se inició en caliente mediante el uso de ADN polimerasa Taq Platinium (Life Technologies) (añadidas 2 U). La primera PCR anclada por ligación (LA-PCR) se realizó usando 10 pmol tanto del cebador específico de anclaje DT89 como del cebador específico de transcrito p1-2 (véase la tabla a 10 continuación) que es interno al cebador de RT 3’ terminal de porA3. La PCR se realizó usando una etapa inicial de 95ºC durante 5 min (para la activación de la ADN polimerasa) seguida de 10 ciclos a 95ºC durante 10 s y 70ºC durante 1 min (reduciendo un grado por ciclo), 15 ciclos a 95ºC durante 10 s y 60ºC durante 1 min. La segunda LA-PCR semianidada se realizó en las mismas condiciones usando el cebador DT89 y el cebador interno p1-2, junto con 10 pmol de p1-1 (véase la tabla a continuación) y 1 !l de PCR de primera ronda. Los productos de amplificación
15 se purificaron usando el kit de “purificación de PCR QIAquick” de QIAGEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de enviarlos a secuenciación.
El kit de secuenciación cíclica con terminadores marcados con colorante CEQTM, (Beckman Francia) se usó para secuenciar los productos de RACE PCR usando 10 pmol de cebador p1-1. Se realizaron reacciones de secuenciación de acuerdo con las instrucciones proporcionadas y los productos de secuenciación se analizaron
20 mediante el Sistema de Análisis de ADN Ceq2000 (Beckman-Coultier).
DT88
5’ GAAGAGAAGGTGGAAATGGCGTTTTGGC 3’
DT89
5’ CCAAAACGCCATTTCCACCTTCTCTTC 3’
porA3
5’ CCAAATCCTCGCTCCCCTTAAAGCC 3’
p1-2
5’ CGCTGATTTTCGTCCTGATGCGGC 3’
p1-1
5’ GGTCAATTGCGCCTGGATGTTCCTG 3’
Resultados para el promotor de porA en Neisseiria meningitidis
El inicio de la transcripción para ARNm de porA de Neisseiria meningitidis serogrupo B (cepa H44/76) se mapeó 59 pb
25 cadena arriba del codón de inicio ATG usando el procedimiento de RACE 5’ descrito. Este resultado confirma el mapeo realizado por extensión de cebadores y publicado por van der Ende y col (1995). Este resultado confirma que un fragmento de ADN que contiene 2 nucleótidos de -9 a -259 con respecto al ATG de porA es adecuado para dirigir la expresión génica fuerte en Neisseiria meningitidis y posiblemente en otras especies bacterianas tales como Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
30 Resultados para el promotor de porB de Neisseiria meningitidis
La misma estrategia experimental se ha aplicado para mapear el sitio de inicio de la transcripción de porB de Neisseiria meningitidis serogrupo B (cepa H44/76). Los cebadores enumerados en la tabla a continuación corresponden al cebador de RT 3’ terminal (porB3), cebador específico de transcrito que es interno al porB3 (porB2) e interno al porB2 (porB1). PorB3, porB2 y porB1 se localizan respectivamente 265 pb, 195 pb y 150 pb cadena abajo del codón de inicio ATG.
porB1
5’ GGTAGCGGTTGTAACTTCAGTAACTT 3’
porB2
5’ GTCTTCTTGGCCTTTGAAGCCGATT 3’
porB3
5’ GGAGTCAGTACCGGCGATAGATGCT 3’
Usando los cebadores porB1 y DT89 se obtuvo un amplicón de PCR de -200 pb por realización de mapeo por RACE 5’. Puesto que porB1 se localiza a 150 pb del codón de inicio ATG de porB, este resultado confirma que el sitio de inicio de la transcripción de porB se localiza aproximadamente 50 pb (+/- 30 pb) cadena arriba del ATG de porB.
40 El nucleótido exacto correspondiente al inicio de la transcripción se está determinando en la actualidad mediante secuenciación de ADN. El resultado PCR anterior confirma que un fragmento de ADN que contiene los nucleótidos -1 a 250 con respecto al codón de inicio ATG de porB es adecuado para dirigir la expresión génica fuerte en Neisseiria meningitidis y posiblemente en otras especies bacterianas tales como Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
Ejemplo 10: Regulación positiva del gen Omp85 de N. meningitidis serogrupo B por sustitución del promotor
El objetivo del experimento era sustituir la región promotora endógena del gen de D15/Omp85 por el promotor fuerte de porA para regular positivamente la producción del antígeno D15/Omp85. Con este fin, se construyó un plásmido de sustitución de promotor usando metodologías de clonación en E. coli. Se descubrió una región de ADN (1000 pb) localizada cadena arriba del gen codificante D15/omp85 (SEC ID Nº: 3) en la base de datos privada Incyte PathoSeq que contiene secuencias de ADN genómico sin terminar de la cepa ATCC 13090 de Neisseiria meningitidis. Las etapas principales de este procedimiento están representadas en la Figura 9. En resumen, un fragmento de ADN (1000 pb) que abarca los nucleótidos -48 a -983 con respecto al codón de inicio del gen D15/Omp85 (ATG) se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos ProD15-51X (5’-GGG CGA ATT CGC GGC CGC CGT CAA CGG CAC ACC GTT G-3’) y ProD15-52 (5’-GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3’) que contienen los sitios de restricción EcoRI y XbaI (subrayados) respectivamente. Este fragmento se sometió a restricción y se insertó en el plásmido pUC18 digerido por restricción con las mismas enzimas. La construcción obtenida se sometió a mutagénesis in vitro usando el sistema Genome Priming (usando el plásmido donador pGPS2) comercializado por New England Biolabs (MA, Estados Unidos). Los clones que tienen un minitransposón insertado (derivado de Tn7 y que albergan un gen de resistencia a cloranfenicol) se seleccionaron. Un clon que contiene una inserción de minitransposón localizada en la región flanqueante 5’ de D15/Omp85, 401 pb cadena abajo del sitio EcoRI se aisló y se usó para estudios adicionales. Este plásmido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528-534) para (i) delecionar una secuencia de ADN repetida (Tn7R) generada por el procedimiento de transposición,
(ii) insertar secuencias de captación meningocócicas necesarias para la transformación y (iii) insertar sitios de restricción adecuados que permiten la clonación de material de ADN extraño tal como promotores. La PCR circular se realizó usando los oligonucleótidos TnRD15-KpnI/XbaI + US (5’-CGC CGG TAC CTC TAG AGC CGT CTG AAC CAC TCG TGG ACA ACC C-3’) y TnR03Cam(KpnI) (5’-CGC CGG TAC CGC CGC TAA CTA TAA CGG TC-3’) que contienen secuencias de captación y sitios de restricción adecuados (KpnI y XbaI) subrayados. El fragmento de PCR resultante se purificó en gel, se digirió con Asp718 (isoesquizómero de KpnI) y se ligó con un fragmento de ADN de 184 pb que contiene el promotor de porA y generado por PCR usando los oligonucleótidos PorA-01 (5’-CGC CGG TAC CGA GGT CTG CGC TTG AAT TGT G-3’) y PorA02 (5’-CGC CGG TAC CTC TAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’) que contienen sitios de restricción de KpnI. Los clones recombinantes que llevan un promotor de porA insertado en la orientación correcta (la transcripción se desarrolla en la dirección de EcoRI a XbaI) se seleccionaron y se usaron para transformar una cepa de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de polisacárido capsular (cps-) y una de las proteínas de membrana externa principales —PorA (porA-). Los clones recombinantes de Neisseiria meningitidis que se obtienen como resultado de un acontecimiento de sobrecruzamiento doble (exploración por PCR usando los oligonucleótidos Cam-05 (5’- GTA CTG CGA TGA GTG GCA GG-3’) y proD15-52) se seleccionaron en medio GC que contenía cloranfenicol 5 !g/ml y se analizaron para la expresión de D15/Omp85. Como se representa en la Figura 10, la producción de D15/Omp85 se aumentó significativamente en los extractos de proteína total de cepas de Nm resultantes de la sustitución del promotor en comparación con la cepa parental (cps-). Este resultado también se observó cuando se analizaron ampollas de membrana externa preparadas a partir de las mismas cepas (véase la Figura 17). Estos resultados son atribuibles a la sustitución del promotor de D15 endógeno por el promotor fuerte de porA. Además, se descubrió sorprendentemente que la expresión, cuando se introdujo el promotor de porA aproximadamente 400 pb cadena arriba del codón de inicio, era aproximadamente 50 veces superior que cuando el promotor se situaba aproximadamente 100 pb cadena arriba. En su conjunto estos experimentos confirman que la estrategia de sustitución del promotor funciona y permite la regulación positiva de la síntesis de proteínas de membrana externa integrales en ampollas de membrana externa.
Ciertas poblaciones humanas aisladas geográficamente (tales como de Cuba) están infectadas por un número limitado de aislados de Neisseiria meningitidis que pertenecen en su mayor parte a uno o pocos serotipos de proteínas de membrana externa. Puesto que PorA es un antígeno proteico de membrana externa principal que puede inducir anticuerpos bactericidas protectores y específicos de cepa, puede ser posible conferir protección vacunal en dicha población usando un número limitado de serotipos de porA. Además, PorA puede interaccionar con o estabilizar algunas otras proteínas de membrana externa. En este contexto, la presencia de PorA en vesículas de membrana externa puede ser ventajosa, reforzando la eficacia vacunal de dichas ampollas recombinantes mejoradas.
Por dicha razón, puede ser deseable regular positivamente la expresión de proteína de membrana externa D15/Omp85 en una cepa de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de genes cps funcionales pero que expresa PorA. Se extrajo ADN genómico a partir de la cepa recombinante de Neisseiria meningitidis serogrupo B cps-, porA-, D15/Omp85+ usando el kit QIAGEN Genomic Tips 100-G. Se linealizaron 10 !g de este material y se usaron para transformar Neisseiria meningitidis serogrupo B cps- después de un protocolo de transformación clásico. Se obtuvieron Neisseiria recombinantes en placas de agar GC que contenían cloranfenicol 5 !g/ml.
Las integraciones resultantes de un sobrecruzamiento doble cadena arriba del gen D15 se exploraron mediante PCR como se ha descrito anteriormente. Como pueden aparecer recombinaciones homólogas en cualquier parte del cromosoma, se realizó una segunda exploración por PCR para controlar la integridad del locus de porA en la cepa recombinante. Con este fin, se usaron los cebadores de porA internos PPA1 (5- GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C -3’) y PpA2 (5- GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC -3’) en un experimento de exploración por PCR.
La amplificación de un fragmento de 1170 pb confirma la presencia del gen porA en las bacterias recombinantes.
Las bacterias recombinantes (correspondientes a aproximadamente de 5.108 bacterias) pueden resuspenderse en 50 !l de tampón de PAGE-SDS, congelarse (-20ºC)/llevarse a ebullición (100ºC) tres veces y después separarse mediante electroforesis de PAGE-SDS en un gel al 12,5%. Los geles pueden teñirse después mediante azul brillante
5 de Coomassie R250 o transferirse a una membrana de nitrocelulosa y sondarse con un anticuerpo monoclonal antiporA o con un anticuerpo policlonal de conejo anti- D15/Omp85. También puede realizarse un análisis de ampollas de membrana externa preparadas a partir de las mismas cepas.
Ejemplo 11: Regulación positiva del antígeno proteico Hsf en una cepa recombinante de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de genes cps funcionales pero que expresa PorA
10 Como se ha descrito anteriormente, en ciertos países, la presencia de PorA en vesículas de membrana externa puede ser ventajosa y puede reforzar la eficacia vacunal de ampollas recombinantes mejoradas. En el ejemplo siguiente, se ha usado un vector pCMK(+) modificado para regular positivamente la expresión del antígeno proteico Hsf en una cepa que carece de genes cps funcionales pero que expresa PorA. El vector pCMK(+) original contiene un promotor quimérico porA/lacO reprimido en huésped E. coli que expresa laclq pero transcripcionalmente activo en
15 Neisseria meningitidis. En el pCMK(+) modificado, el promotor de porA nativo se usó para dirigir la transcripción del gen hsf. El gen que codifica Hsf se amplificó por PCR usando los cebadores oligonucleotídicos HSF01-NdeI y HSF02-NheI, presentados en la tabla a continuación. Debido a la secuencia del cebador HSF01-NdeI la proteína Hsf expresada contendrá dos restos de metionina en el extremo 5’. Las condiciones usadas para la amplificación por PCR eran las descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). El termociclado era
20 el siguiente: 25 veces (94ºC 1 min, 48ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10 min, 4ºC hasta su recuperación). El amplicón correspondiente se clonó posteriormente en los sitios de restricción correspondientes del vector de suministro pCMK(+). En este plásmido recombinante, denominado pCMK(+)-Hsf, los inventores delecionaron el lacO presente en el promotor quimérico porA/lacO mediante una estrategia de PCR recombinante (véase la Figura 12). El plásmido pCMK(+)-Hsf se usó como molde para amplificar por PCR 2 fragmentos de ADN separados:
25 - el fragmento 1 contiene la región recombinogénica 5’ de porA, el gen de resistencia a kanamicina y el promotor de porA. Los cebadores oligonucleotídicos usados, RP1 (SacII) y RP2, se presentan en la tabla a continuación. El cebador RP1 es homólogo a la secuencia justo cadena arriba del operador lac.
-
el fragmento 2 contiene la secuencia de Shine-Dalgarno del gen porA, el gen hsf y la región recombinogénica 3’ de porA. Los cebadores oligonucleotídicos usados, RP3 y RP4 (ApaI), se presentan en la tabla a continuación. El 30 cebador RP3 es homólogo a la secuencia justo cadena abajo del operador lac. El extremo 3’ del fragmento 1 y el extremo 5’ del fragmento 2 tienen 48 bases solapantes. Se usaron 500 ng de cada PCR (1 y 2) para una reacción de PCR final usando los cebadores RP1 y RP4. El amplicón final obtenido se subclonó en el vector pSL 1180 digerido por restricción con SacII y ApaI. El plásmido modificado pCMK(+)-Hsf se purificó a gran escala usando el kit de maxipreparaciones de QIAGEN y se usaron 2 !g de este material para transformar una cepa de 35 Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de genes cps funcionales (la cepa descrita en el Ejemplo 1). Para preservar la expresión de parA, se seleccionó la integración resultante de un solo sobrecruzamiento mediante una combinación de procedimientos de exploración de PCR y transferencia de Western. Los clones resistentes a kanamicina que dieron positivo en el ensayo mediante transferencia de Western y PCR específica de porA se almacenaron a -70ºC como soluciones madre en glicerol y se usaron para estudios adicionales. Las bacterias 40 (correspondientes a aproximadamente 5.108 bacterias) se resuspendieron en 50 !l de tampón de PAGE-SDS, se congelaron (-20ºC)/se llevaron a ebullición (100ºC) tres veces y después se separaron mediante electroforesis en PAGE-SDS en un gel al 12,5%. La expresión de Hsf se examinó en lisados bacterianos de células completas (LBCC) derivados de NmB [Cps-, PorA+] o NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. La tinción con Coomassie detectó un aumento significativo en la expresión de Hsf (con respecto al nivel de Hsf endógeno) (véase la Figura 13). Este
45 resultado confirma que el vector pCMK (+)-Hsf modificado es funcional y puede usarse con éxito para regular positivamente la expresión de proteínas de membrana externa, sin suprimir la producción del antígeno proteico de membrana externa PorA principal.
Oligonucleótidos usados en el presente trabajo
Oligonucleótidos
Secuencia Observación (s)
HsF 01-Nde
Sitio de clonación NdeI
HsF 02-Nhe
Sitio de clonación NheI
(continuación)
Oligonucleótidos
Secuencia Observación (s)
GFP-mut-Asn
Sitio de clonación AsnI Compatible con Ndel
GFP-Spe
Sitio de clonación SpeI Compatible con Ndel
RP1 (SacII)
Sitio de clonación Sacll
RP2
RP3
RP4 (Apal)
Sitio de clonación Apal

Ejemplo 12: Expresión de la proteína verde fluorescente en una cepa recombinante de Neisseria meningitidis 5 serogrupo B que carece de genes cps funcionales pero que expresa PorA
En el ejemplo siguiente, el vector pCMK se usó para ensayar la expresión de una proteína citoplasmática heteróloga en Neisseria meningitidis. La proteína verde fluorescente se amplificó a partir del plásmido pKen-Gfpmut2 con los cebadores GFP-Asn-mut2 y GFP-Spe (véase la tabla del Ejemplo 11). AsnI proporciona extremos cohesivos compatibles con NdeI, SpeI proporciona extremos cohesivos compatibles con NheI . Las condiciones usadas para la 10 amplificación por PCR eran las descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). El termociclado era el siguiente: 25 veces (94ºC 1 min, 48ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10min, 4ºC hasta su recuperación). El amplicón correspondiente se clonó posteriormente en el vector de suministro pCMK(+) digerido con las enzimas de restricción NdeI y NheI. En este plásmido recombinante, denominado pCMK(+)-GFP, se delecionó el lacO presente en el promotor quimérico porA/lacO mediante una estrategia de PCR recombinante. El plásmido
15 pCMK(+)-GFP se usó como molde para amplificar por PCR 2 fragmentos de ADN separados:
-
el fragmento 1 contenía la región recombinogénica 5’ de porA, el gen de resistencia a kanamicina y el promotor de porA. Los cebadores oligonucleotídicos usados, RP1 (SacII) y RP2 (véase la tabla del Ejemplo 11). El cebador RP1 es homólogo a la secuencia justo cadena arriba del operador lac.
-
el fragmento 2 contiene la secuencia de Shine-Dalgarno de PorA, el gen gfp y la región recombinogénica 3’ de
20 porA. Los cebadores oligonucleotídicos usados, RP3 y RP4 (ApaI) se presentan en la tabla del Ejemplo 11. El cebador RP3 es homólogo a la secuencia justo cadena abajo del operador lac.
El extremo 3’ del fragmento 1 y el extremo 5’ del fragmento 2 tienen 48 bases solapantes. Se usaron 500 ng de cada PCR (1 y 2) para una reacción de PCR final usando los cebadores RP1 y RP4. Se usaron veinte !g de este fragmento de PCR para transformar una cepa de Neisseiria meningitidis serogrupo B que carece de genes cps
25 funcionales.
La transformación con ADN lineal es menos eficaz que con ADN plasmídico circular pero todos los recombinantes obtenidos realizaron un sobrecruzamiento doble (confirmado por una combinación de procedimientos de exploración de PCR y transferencia de Western). Los clones resistentes a kanamicina se almacenaron a -70ºC como soluciones madre en glicerol y se usaron para estudios adicionales. Se resuspendieron bacterias (correspondientes a
30 aproximadamente 5.108 bacterias) en 50 !l de tampón de PAGE-SDS, se congelaron (-20ºC)/se llevaron a ebullición (100ºC) tres veces y después se separaron mediante electroforesis de PAGE-SDS en un gel al 12,5%.
La expresión de GFP se examinó en lisados bacterianos de células completas (LBCC) derivados de NmB [Cps-, PorA +] o NmB [Cps-, PorA-, GFP+]. La tinción con Coomassie detectó la ausencia de expresión de GFP en la cepa receptora de Neisseria meningitidis (véase la Figura 14).
Ejemplo 13: Regulación positiva del gen NspA de N. meningitidis serogrupo B mediante sustitución del promotor
El objetivo del experimento era sustituir la región promotora endógena del gen NspA por la región promotora fuerte de porA, para regular positivamente la producción del antígeno NspA. Con este fin, se construyó un plásmido de sustitución de promotor usando metodologías de clonación de E. coli. Se descubrió una región de ADN (924 pb) localizada cadena arriba del gen codificante NspA (SEC ID Nº: 7) en la base de datos privada Incyte PathoSeq que contenía secuencias de ADN genómicas sin terminar de la cepa ATCC 13090 de Neisseria meningitidis. Un fragmento de ADN (675 pb) que abarcaba los nucleótidos -115 a -790 con respecto al codón de inicio del gen NspA (ATG) se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos PNS1' (5'-CCG CGA ATT CGA CGA AGC CGC CCT CGA C-3’) y PNS2 (5’-CGT CTA GAC GTA GCG GTA TCC GGC TGC-3’) que contienen sitios de restricción EcoRI y XbaI (subrayados), respectivamente. El fragmento de PCR se sometió a restricción con EcoRI y XbaI y se insertó en pUC
18. Este plásmido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528534) para insertar secuencias de captación meningocócicas necesarias para la transformación y sitios de restricción adecuados que permiten la clonación de un casete de promotor CmR/PorA. La PCR circular se realizó usando los oligonucleótidos BAD01-2 (5’-GGC GCC CGG GCT CGA GCT TAT CGA TGG AAA ACG CAG C-3’) y BAD02-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTT CAG ACG GCG CGC TTA TAT ACT GGA TTA AC-3’) que contienen secuencias de captación y sitios de restricción adecuados (XmaI y XhoI) subrayados. El fragmento de PCR resultante se purificó en gel y se digirió con XhoI. El casete de promotor CmR/PorA se amplificó a partir del plásmido pUC D15/Omp85 descrito anteriormente, usando los oligonucleotídicos cebadores BAD 15-2 (5’-GGC GCC CGG GCT CGA GTC TAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’) y BAD 03-2 (5’-GGC GCC CGG GCT CGA GCA CTA GTA TTA CCC TGT TAT CCC-3’) que contienen sitios de restricción adecuados (XmaI, XbaI, SpeI y XhoI) subrayados. El fragmento de PCR obtenido se sometió a digestión y se insertó en el plásmido de PCR circular digerido por restricción con las enzimas correspondientes. Se linealizaron 10 !g del plásmido recombinante y se usaron para transformar una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B que carece de polisacárido capsular (cps-) y una de las proteínas de membrana externa principales —PorA (porA-). Se seleccionaron los clones recombinantes de Neisseria meningitidis resultantes de una exploración por OPCR de acontecimientos de sobrecruzamiento doble usando los oligonucleótidos BAD 25 (5'-GAG CGA AGC CGT CGA ACG C-3’) y BAD08 (5’-CTT AAG CGT CGG ACA TTT CC-3’) en placas de agar GC que contenían cloranfenicol 5 !g/ml y se analizaron para determinar la expresión de NspA. Se resuspendieron bacterias recombinantes (correspondientes a aproximadamente 5.108 bacterias) en 50 !l de tampón de PAGE-SDS, se congelaron (-20ºC)/se llevaron a ebullición (100ºC) tres veces y después se separaron mediante electroforesis de PAGE-SDS en un gel al 12,5%. Después los geles se tiñeron mediante azul brillante de Coomassie R250 o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con el anticuerpo monoclonal anti-PorA o con un anticuerpo policlonal anti-NspA (Figura 17). Como para Omp85, existen indicios sorprendentes de que la inserción del promotor aproximadamente 400 pb cadena arriba del codón de inicio de NspA expresa más proteína que si se sitúa aproximadamente 100 pb cadena arriba.
El mismo plásmido recombinante pUC puede usarse para regular positivamente la expresión de NspA en una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B que carece de gen cps funcional pero que todavía expresa PorA.
Ejemplo 14: Regulación positiva del gen pldA (omplA) de N. meningitidis serogrupo B por sustitución del promotor
El objetivo del experimento era sustituir la región promotora endógena del gen pldA (omplA) por el promotor fuerte de porA para regular positivamente la producción del antígeno PldA (Omp1A1). Con este fin, se construyó un plásmido de sustitución de promotor usando metodologías de clonación en E. coli. Se descubrió una región de ADN (373 pb) localizada cadena arriba de la secuencia codificante de pldA (SEC ID Nº: 18) en la base de datos privada Incyte PathoSeq de la cepa ATCC 13090 de Neisseria meningitidis. Este ADN contiene la secuencia que codifica un supuesto gen rpsT. El codón de terminación de rpsT se localiza 169 pb cadena arriba del ATG de pldA. Para evitar la alteración de este gen potencialmente importante, los inventores decidieron insertar el casete de promotor CmR/PorA justo cadena arriba del ATG de pldA. Con este fin, se amplificó por PCR un fragmento de ADN de 992 pb correspondiente al gen rpsT, la secuencia intergénica de 169 pb y los primeros 499 nucleótidos del gen pldA a partir de ADN genómico de Neisseria meningitidis serogrupo B usando los oligonucleótidos PLA1 Amo5 (5'-GCC GTC TGA ATT TAA AAT TGC GCG TTT ACA G-3’) y PLA1 Amo3 (5’-GTA GTC TAG ATT CAG ACG GCG CAA TTT GGT TTC CGC AC-3’) que contienen secuencias de captación (subrayadas). El PLA1 Amo3 también contiene un sitio de restricción XbaI. Este fragmento de PCR se limpió con un Kit High Pure (Roche, Mannheim, Alemania) y se clonó directamente en un vector pGemT (Promega, Estados Unidos). Este plásmido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer (1992)) para insertar sitios de restricción adecuados que permitan la clonación de un casete de promotor CmR/PorA. La PCR circular se realizó usando los oligonucleótidos CIRC1-Bgl (5’CCT AGA TCT CTC CGC CCC CCA TTG TCG-3’) y CIRC1-XH-RBS/2 (5’-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA ATA TAC GGA ATA TGC G-3’) o CIRC2-XHO/2 (5’-CCG CTC GAG ATG AAT ATA CGG AAT-3’) que contienen sitios de restricción adecuados (BglII y XhoI) subrayados. El casete de promotor CmR/PorA se amplificó a partir del plásmido pUC D15/Omp85 descrito anteriormente usando los cebadores BAD20 (5’-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’) y CM-PORA-3 (5'-CCG CTC GAG ATA AAA CAC TAA AAA CAT CGG GC-3’) que contienen sitios de restricción adecuados (BglII y XhoI) subrayados. Este fragmento de PCR se clonó en el plásmido de PCR circular obtenido con los cebadores CIRC1-Bgl y CIRC1-XH-RBS/2. Este plásmido puede usarse para transformar cepas de Neisseria meningitidis serogrupo B [cps-] y [cps- por A-]. La integración por sobrecruzamiento doble en la región cadena arriba de pldA dirigirá la inserción del promotor de porA directamente cadena arriba del ATG de pldA. Se amplificó otro casete a partir del ADN genómico de la Neisseria meningitidis serogrupo B recombinante [cps-, porA-, D15/Omp85+] que sobreexpresa D15/Omp85 por sustitución del promotor. Este casete contiene el gen cmR, el promotor de porA y 400 pb correspondientes a la secuencia flanqueante 5’ del gen D15/Omp85. Esta secuencia ha demostrado ser eficaz para la regulación positiva de la expresión de D15/Omp85 en Neisseria y se ensayará para la regulación positiva de la expresión de otros antígenos de Neisseria. Los cebadores usados para la amplificación eran BAD20 y CM-PORA-D15/3 (5’-CGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3’) que contienen sitios de restricción XhoI (subrayados). Este fragmento de PCR se clonó en el plásmido de PCR circular obtenido con los cebadores CIRC1-Bgl y CIRC2-XHO/2. Este plásmido se usará para transformar cepas de Neisseria meningitidis serogrupo B [cps-] y[cps-, porA-]. La integración por sobrecruzamiento doble en la región cadena arriba de pldA dirigirá la inserción del promotor de porA 400 pb cadena arriba del ATG de pldA.
Ejemplo 15: Regulación positiva del gen tbpA de N. meningitidis serogrupo B por sustitución de promotor
El objetivo del experimento era sustituir la región promotora endógena del gen tbpA por el promotor fuerte de porA para regular positivamente la producción del antígeno TbpA. Con este fin, se construyó un plásmido de sustitución de promotor usando metodologías de clonación en E. coli. Se descubrió una región de ADN (731 pb) localizada cadena arriba de la secuencia codificante de tbpA (SEC ID Nº: 17) en la base de datos privada Incyte PathoSeq de la cepa ATCC 13090 de Neisseria meningitidis. Este ADN contiene la secuencia que codifica el antígeno TbpB. Los genes están organizados en un operón. El gen tbpB se delecionará y se sustituirá por el casete de promotor CmR/porA. Con este fin, un fragmento de ADN de 3218 pb correspondiente a la región flanqueante 5’ de 509 pb del gen tbpB, la secuencia codificante de tbpB de 2139 pb, la secuencia intergénica de 87 pb y los 483 primeros nucleótidos de la secuencia codificante de tbpA se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico de Neisseria meningitidis serogrupo B usando los oligonucleótidos BAD16 (5'-GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3’) y BAD17 (5’-GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG ACT TTG AGC CTT TGC-3’) que contienen secuencias de captación y sitios de restricción NheI y HindIII (subrayados). Este fragmento de PCR se limpió con un kit High Pure (Boerhinger Mannheim, Alemania) y se clonó directamente en un vector pGemT (Promega, Estados Unidos). Este plásmido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer (1992)) para (i) insertar sitios de restricción adecuados que permitan la clonación de un casete de promotor CmR/PorA y (ii) delecionar 209 pb de la secuencia flanqueante 5’ de tbpB y la secuencia codificante de tbpB. La PCR circular se realizó usando los oligonucleótidos BAD 18 (5’-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3’) y BAD 19 (5’-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3’) que contienen sitios de restricción adecuados XmaI, BglII y XhoI (subrayados). El casete de promotor CmR/PorA se amplificó a partir del plásmido pUC D15/Omp85 descrito anteriormente usando los cebadores BAD21 (5’-GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’) y BAD20 (5’-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’) que contienen sitios de restricción adecuados XmaI, SpeI, BglII y XhoI (subrayados). Este fragmento de PCR se clonó en el plásmido de PCR circular. Este plásmido se usará para transformar cepas de Neisseria meningitidis serogrupo B [cps-] y [cps- porA-]. La integración por sobrecruzamiento doble en la región cadena arriba de tbpA dirigirá la inserción del promotor de porA directamente cadena arriba del ATG de tbpA.
Ejemplo 16: Regulación positiva del gen pilQ de N. meningitidis serogrupo B por sustitución del promotor
El objetivo del experimento era sustituir la región promotora endógena del gen pilQ por el promotor fuerte de porA para regular positivamente la producción del antígeno PilQ. Con este fin, se construyó un plásmido de sustitución de promotor usando metodologías de clonación en E. coli. Se descubrió una región de ADN (772 pb) localizada cadena arriba del gen codificante pilQ (SEC ID Nº: 12) en la base de datos privada Incyte PathoSeq de la cepa ATCC 13090 de Neisseria meningitidis. Este ADN contiene la secuencia codificante del antígeno PilP. El gen pilQ es parte de un operón que los inventores no quieren alterar, siendo las pilinas elementos esenciales de las bacterias. El casete de promotor CmR/porA se introdujo cadena arriba del gen pilQ siguiendo la misma estrategia descrita para la regulación positiva de la expresión del gen pldA. Con este fin, un fragmento de ADN de 866 pb correspondiente a la parte 3’ de la secuencia codificante de pilP, la secuencia intergénica de 18 pb y los 392 primeros nucleótidos del gen pilQ se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico de Neisseria serogrupo B usando los oligonucleótidos PQ-rec5-Nhe (5’-CTA GCT AGC GCC GTC TGA ACG ACG CGA AGC CAA AGC-3’) y PQ-rec3-Hin (GCC AAG CTT TTC AGA CGG CAC GGT ATC GTC CGA TTC G-3’) que contienen secuencias de captación y sitios de restricción NheI y HindIII (subrayados). Este fragmento de PCR se clonó directamente en un vector pGemT (Promega, Estados Unidos). Este plásmido se sometió a mutagénesis por PCR circular (Jones y Winistofer (1992)) para insertar sitios de restricción adecuados que permitan la clonación de un casete de promotor CmR/PorA. La PCR circular se realizó usando los oligonucleótidos CIRC1-PQ-Bgl (5’-GGA AGA TCT AAT GGA GTA ATC CTC TTC TTA-3’) y CIR1-PQ-XHO (5’-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA TTA CCA AAC TGA CAA AAA TC-3’) o CIRC2-PQ-X (5'-CCG CTC GAG ATG AAT ACC AAA CTG ACA AAA ATC-3’) que contienen sitios de restricción adecuados BglII y XhoI (subrayados). El casete de promotor CmR/PorA se amplificó a partir del plásmido pUC D15/Omp85 descrito anteriormente usando los cebadores BAD20 (5’-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC3’) y CM-PORA-3 (5’-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GCA AAC ACC C-3’) que contienen sitios de restricción adecuados BglII y XhoI (subrayados). Este fragmento de PCR se clonó en el plásmido de PCR circular obtenido con los cebadores CIRC1-PQ-Bgl y CIRC1-PQ-XHO. Este plásmido puede usarse para transformar cepas de Neisseria meningitidis serogrupo B [cps-] y [cps-, porA-]. La integración por sobrecruzamiento doble en la región cadena arriba de pilQ dirigirá la inserción del promotor de porA directamente cadena arriba del ATG de pilQ.
Se amplificó otro casete a partir del ADN genómico de la Neisseria meningitidis recombinante serogrupo B [cps-, porA-, D15/Omp85+] que sobreexpresa D15/Omp85 por sustitución del promotor. Este casete contiene el gen cmR, el promotor porA y 400 pb correspondientes a la secuencia flanqueante 5’ del gen D15/Omp85. Esta secuencia ha demostrado ser eficaz para la regulación positiva de la expresión de D15/Omp85 en Neisseria meningitidis y se ensayará para la regulación positiva de la expresión de otros antígenos de Neisseria. Los cebadores usados para la amplificación eran BAD 20 y CM-PORA-D153 (5’-GGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3’) que contienen sitios de restricción XhoI (subrayados). Este fragmento de PCR se clonó en el plásmido de PCR circular obtenido con los cebadores CIRC1-PQ-Bgl y CIRC2-PQ-X. Este plásmido puede usarse para transformar cepas de Neisseria meningitidis serogrupo B [cps-] y [cps-, porA-]. La integración por sobrecruzamiento doble en la región cadena arriba de pilQ dirigirá la inserción del promotor de porA 400 pb cadena arriba del ATG de pilQ.
Ejemplo 17: Construcción de un casete de kanR/sacB para la introducción de mutaciones sin marcar “limpias” en el cromosoma de N. meningitidis
El objetivo del experimento era construir una casete de ADN versátil que contiene un marcador de selección para la exploración positiva de recombinaciones en el cromosoma de Neisseria meningitidis (es decir: gen kanR) yun marcador de contraselección para delecionar el casete del cromosoma después de la recombinación (es decir: gen sacB). Mediante este procedimiento, cualquier ADN heterólogo introducido durante la recombinación homóloga se eliminará del cromosoma de Neisseria.
Un fragmento de ADN que contiene el gen neoR y el gen sacB expresado bajo el control de su propio promotor se obtuvo por digestión de restricción del plásmido pIB 279 (Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI (1991), Mol Microbiol 5:1447-57) con la enzima de restricción BamHI. El vector receptor se obtuvo del plásmido pCMK descrito anteriormente. El gen kanR del pCMK se delecionó por digestión de restricción con las enzimas NruI y EcoRV. Este plásmido se denominó pCMKs. El casete neoR/sacB se insertó en el pCMKs en un sitio de restricción BglII compatible con extremos BamHI.
La E. coli que alberga el plásmido es incapaz de crecer en presencia de sacarosa al 2% en el medio de cultivo, confirmando la funcionalidad del promotor de sacB. Este plásmido contiene secuencias recombinogénicas que permiten la inserción del casete en el locus de porA en el cromosoma de Neisseria meningitidis serogrupo B. Se obtuvieron Neisseria recombinantes en placas de agar GC que contenían 200 pg/ml de kanamicina. Desgraciadamente el promotor de sacB no era funcional en Neisseria meningitidis: no se observaron diferencias de crecimiento en placas de agar GC que contenían sacarosa al 2%.
Se construyó un nuevo casete que contiene el gen sacB bajo el control del promotor kanR. Se realizó una PCR circular usando el plásmido pUC4K ((Amersham Pharmacia Biotech, Estados Unidos)) como molde con los oligonucleótidos CIRC-Kan-Nco (5’-CAT GCC ATG GTT AGA AAA ACT CAT CGA GCA TC-3’) y CIRC-Kan-Xba (5’-CTA GTC TAG ATC AGA ATT GGT TAA TTG GTT G-3’) que contienen sitios de restricción NcoI y XbaI (subrayados). El fragmento de PCR resultante se purificó en gel, se digirió con NcoI y se ligó con el gen sacB generado por PCR a partir del plásmido pIB279 con el oligonucleótido SAC/NCO/NEWS (5’-CAT GCC ATG GGA GGA TGA ACG ATG AAC ATC AAA AAG TTT GCA A-3’) que contiene un sitio de restricción NcoI (subrayado) y un oligonucleótido RBS (negrita) y SAC/NCO/NEW3 (5’-GAT CCC ATG GTT ATT TGT TAA CTG TTA ATT GTC-3’) que contiene un sitio de restricción Ncol (subrayado). Los clones de E. coli recombinantes pueden ensayarse para determinar su sensibilidad en placas de agar que contienen sacarosa al 2%. El nuevo casete kanR/sacB puede subclonarse en el pCMKs y usarse para transformar una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B cps-. La sensibilidad a sacarosa adquirida se confirmará en Neisseria. El plásmido pCMKs se usará para transformar la Neisseria de kanP/SacB recombinante para delecionar el casete completo insertado en el cromosoma del locus porA. Se obtendrá Neisseria recombinante limpia en placas de agar GC que contienen sacarosa al 2%.
Ejemplo 18: Uso de secuencias recombinogénicas pequeñas (43 pb) para permitir la recombinación homóloga en el cromosoma de Neisseria meningitidis
El objetivo del experimento es usar secuencias recombinogénicas pequeñas (43 pb) para dirigir inserciones, modificaciones o deleciones en el cromosoma de Neisseria. La consecución de este experimento facilitará enormemente trabajos futuros, en términos de evitar etapas de subclonación de secuencias homólogas en E. coli (pueden añadirse fácilmente secuencias recombinogénicas de 43 pb en el cebador de amplificación de PCR). El gen kanR se amplificó por PCR a partir del plásmido pUC4K con los oligonucleótidos Kan-PorA-5 (5’-GCC GTC TGA ACC CGT CAT TCC CGC GCA GGC GGG AAT CCA GTC CGT TCA GTT TCG GGA AAG CCA CGT TGT GTC-3’) que contiene 43 pb homólogas a la secuencia flanqueante 5’ del gen porA de NmB (negrita) y una secuencia de captación (subrayada) y Kan-PorA-3 (5’-TTC AGA CGG CGC AGC AGG AAT TTA TCG GAA ATA ACT GAA ACC GAA CAG ACT AGG CTG AGG TCT GCC TCG-3’) que contiene 43 pb homólogas a la secuencia flanqueante 3’ del gen porA de NmB (negrita) y una secuencia de captación (subrayada). El fragmento de ADN 1300 pb obtenido se clonó en vector pGemT (Promega, Estados Unidos). Este plásmido puede usarse para transformar una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B cps-. Se obtendrá Neisseria recombinante en placas GC que contienen
5 kanamicina 200 !g/ml. Las integraciones resultantes de un sobrecruzamiento doble en el locus de porA se explorarán mediante PCR con los cebadores PPA1 y PPA2 como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 19: Protección activa de ratones inmunizados con ampollas de Neisseria meningitidis recombinante y de tipo silvestre (WT)
Los animales se inmunizaron tres veces (vía IP) con 5 !g de las diferentes VME adsorbidas en Al(Om3 los días 0, 14
10 y 28. Se extrajo sangre los días 28 (día 14 Post II) y 35 (día 7 post III) y se expusieron el día 35 (vía IP). La dosis de exposición era de 20 x DL50 (~107 UFC/ratón). La tasa de mortalidad se controló durante 7 días después de la exposición.
Las VME inyectadas eran:
Grupo 1: ampollas Cps-, PorA +
15 Grupo2: ampollas Cps-, PorA-Grupo3: ampollas Cps-, PorA-, NspA+ Grupo4: ampollas Cps-, PorA-, Omp85+ Group5: ampollas Cps-, PorA-, Hsf+
La Figura 15 ilustra el patrón de estas VME mediante análisis de SDS-PAGE (tinción con Coomassie).
20 24 horas después de la exposición, había una mortalidad del 100% (8/8) en el grupo de control negativo (inmunizado con Al(OH)3 solamente) mientras que los ratones inmunizados con las 5 preparaciones de VME diferentes seguían vivos todavía (sobrevivieron de 7 a 8/8 ratones). La enfermedad se controló también durante los 7 días y los ratones inmunizados con las ampollas que sobreexpresaban NSPA parecían estar menos enfermos que los de otros grupos. La PorA presente en ampollas PorA+ es probable que confiera una amplia protección frente a la infección por la
25 cepa homóloga. Sin embargo, la protección inducida por ampollas reguladas positivamente PorA- se debe probablemente al menos en cierta medida a la presencia de una cantidad aumentada de NspA, Omp85 o Hsf.
Ejemplo 20: Inmunogenicidad de ampollas recombinantes medidas por procedimientos de ELISA específicos y de células completas
Para medir la capacidad de los anticuerpos para reconocer los antígenos presentes en la superficie celular de MenB,
30 los sueros de ratones combinados (del Ejemplo 19) se ensayaron mediante ELISA de células completas (usando células inactivadas con tetraciclina) y los títulos se expresaron como títulos a punto medio. Todos los tipos de anticuerpos de ampollas inducían un alto título de Ac de células completas mientras que el grupo de control negativo era claramente negativo.
Ampolla
Titulación a punto medio WCE (H44/76) 14P2 14P3
CPS(-) PorA(+)
23849 65539
CPS(-) PorA(-)
20130 40150
CPS(-) PorA(-) NSPA(+)
8435 23846
CPS(-) PorA(-) OMP85(+)
4747 16116
(continuación)
Ampolla
Titulación a punto medio WCE (H44/76) 14P2 14P3
CPS(-) PorA(-) HSF(+)
6964 22504
(-)
51 82
Se verificó la respuesta de Ac específicos contra proteína HSF recombinante disponible. Las microplacas se revistieron con molécula HSF de longitud completa 1 !g/ml.
Los resultados ilustrados en la Figura 16 muestran que había una buena respuesta específica de HSF cuando se usaban VME que sobreexpresaban HSF para inmunizar ratones (usando HSF recombinante purificada en las placas). Las ampollas que sobreexpresaban HSF inducían un buen nivel de anticuerpos específicos.
SEC ID Nº: 1 Secuencia de nucleótidos del vector pcMK(+)
SEC ID Nº: 2
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (997 pb) cadena arriba del gen de NspA en la cepa Z2491 de Neisseria meningitidis serogrupo A
SEC ID Nº: 3
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de D15/Omp85 en la cepa ATCC13090 de Neisseria meningitidis serogrupo B
SEC ID Nº: 4
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de tipo Hsf-de Neisseria meningitidis
SEC ID Nº: 5
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (772 pb) cadena arriba del gen de PilQ de Neisseria meningitidis
SEC ID Nº: 6
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Hap de Neisseria meningitidis
SEC ID Nº: 7
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (924 pb) cadena arriba del gen de NspA de Neisseria meningitidis (serogrupo B) (ATCC13090)
SEC ID Nº: 8
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de FrpB de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 9
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de FrpA de Neisseria 15 meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 10
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de FrpC en Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 11
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Omp85 de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
10 SEC ID Nº: 12 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (772 pb) cadena arriba del gen de PilQ de Neisseria meningitidis (serogrupo B) (ATCC 13090)
SEC ID Nº: 13
15 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de tipo Hsf de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 14
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Hap de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 15
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de LbpA de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 16
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de LbpB de Neisseria meningitidis (serogrupo A)
SEC ID Nº: 17
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (731 pb) cadena arriba del gen de TbpA de Neisseria 15 meningitidis (serogrupo B) (ATCC13090)
SEC ID Nº: 18
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (373 pb) cadena arriba del gen de OmpIA de Neisseria meningitidis (serogrupo B) (ATCC13090)
SEC ID Nº: 19
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Pla1 de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 20
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de FhaB de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 21
15 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Lipo02 de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 22
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Tbp2 de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 23
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de PorA de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
10 SEC ID Nº: 24 Región promotora de PorA de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 25
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de PorB de Neisseria 15 meningitidis (serogrupo A)
SEC ID Nº: 26
Región Promotora de PorB de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 27
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de siaABC de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 28
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Igt de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 29
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de TbpB de Neisseria meningitidis (cepa MC58)
SEC ID Nº: 30
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de opc de Neisseria 15 meningitidis (serogrupo A)
SEC ID Nº: 31
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (100 pb) cadena arriba del gen de siaD de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 32
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de ctrA de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 33
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de IgtF de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 34
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de IgtB de Neisseria 15 meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 35
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del 1er gen de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 36
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de msbB de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 37
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de htrB de Neisseria meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 38
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de MItA de Neisseria 15 meningitidis (serogrupo B)
SEC ID Nº: 39
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de ompCD de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 40
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de copB de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 41
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de D15 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 42
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de ompIA de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 43
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de hly3 de Moraxella catarrhalis
10 SEC ID Nº: 44 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de IbpA de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 45
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de IbpB de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 46
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de tbpB de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 47
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (731 pb) cadena arriba del gen de tbpA de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 48
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de OmpE de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 49
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de uspa1 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 50
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de uspa2 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 51
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de omp21 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 52
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de omp106 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 53
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de HtrB de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 54
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de MsbB de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 55
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de PilQ de Moraxella catarrhalis
10 SEC ID Nº: 56 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de lipo18 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 57
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de lipo11 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 58
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de lipo10 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 59
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de lipo2 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 60
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de lipo7 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 61
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de lipo6 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 62 10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de P6 de Moraxella catarrhalis
SEC ID Nº: 63
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de MsbB de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 64
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de HtrB de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 65
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba de la proteína D de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 66
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Hin47 de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 67
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de P5 de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 68
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de D15 de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 69
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de Omp26 de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 70
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de P6 de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 71
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de TbpA de Haemophilus influenzae (no tipificable)
SEC ID Nº: 72
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de TbpB de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 73
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de HifA (pilina) de Haemophilus influenzae (genoma de LKP serotipo 1)
SEC ID Nº: 73
10 Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de HifE (pilina de la punta) de Haemophilus influenzae (genoma LKP serotipo 1)
SEC ID Nº: 75
Secuencia de nucleótidos de la región de ADN (1000 pb) cadena arriba del gen de P2 de Haemophilus influenzae (HiRd)
SEC ID Nº: 76
Secuencia de nucleótidos de la región codificante de ADN (parcial) del gen de HtrB de Moraxella Catarrhalis
Sec. de proteína: identidad del 25% y similitud del 35% con HtrB de E. coli 10 SEC ID Nº: 77 Secuencia de nucleótidos de la región codificante de ADN del gen de HtrB de Neisseria (meningococo B) Secuencia proteica: identidad del 30% y similitud del 38% con Htrb de E. coli
SEC ID Nº: 78
Secuencia de nucleótidos de la región codificante de ADN del gen de HtrB de Haemophilus influenzae (no tipificable)
Secuencia proteica - identidad del 57% y similitud del 66% con HtrB de E. coli
SEC ID Nº: 79
10 Secuencia de nucleótidos de la región codificante de ADN del gen de MsbB de Haemophilus influenzae (no tipificable)
Secuencia proteica - identidad del 45% y similitud del 56% con MsbB de E. coli
SEC ID Nº: 80
Secuencia de nucleótidos de la región codificante de ADN del gen de MsbB de Moraxella catarrhalis
Secuencia proteica - identidad del 28% y similitud del 37% con MsbB de E. coli
SEC ID Nº: 81
Secuencia de nucleótidos de la región codificante de ADN del gen de MsbB de Neisseria (meningococo B)
Secuencia proteica - identidad del 25% e identidad del 36% con MsbB de E. coli
LISTA DE SECUENCIAS
<110> SmithKline Beecham Biologicals s.a.
<120> Composición de Vacuna
<130> B45189 5 <160> 156
<170> FastSEQ de Windows Versión 3.0
<210> 1
<211> 5893
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> vector pCMK(+)
<400> 1
<210> 2
<211> 997
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 2
<210> 3
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 3
<210> 4 10 <211> 1036
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 4
<210> 5
<211> 772
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 5
<210> 6
<211>
1057 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 6
<210> 7
<211> 924
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 7
<210> 8
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 8
<210> 9
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 9
<210> 10
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 10
<210> 11
<211> 1000
<212>
ADN
<212>
Neisseria meningitidis
<400> 11
<210> 12
<211>
772 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 12
<210> 13
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 13
<210> 14
<211> 1000
<212> ADN 10 <213> Neisseria meningitidis
<400> 14
<210>
<211>
1000 15 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 15
<210> 16
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 16
<210> 17
<211>
731 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 17
<210> 18
<211> 373
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 18
<210> 19
<211> 1000
<212> ADN 10 <213> Neisseria meningitidis
<400> 19
<210> 20
<211>
1000 15 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 20
<210> 21
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 21
<210> 22
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 22
<210> 23
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 23
<210> 24
<211>
228 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 24
<210> 25 15 <211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 25
<210> 26
<211> 537
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 26
<210> 27
<211> 1000 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 27
<210>
28 15 <211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 28
<210> 29
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 29
<210>
30 10 <211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 30
<210> 31
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 31
<210> 32
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 32
<210> 33
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 33
<210> 34
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 34
<210> 35
<211> 806
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 35
<210> 36
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 36
<210> 37
<211> 1000
<212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 37
<210> 38
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<400> 38
<210> 39
<211> 1000
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 39
<210> 40
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 40
<210> 41
<211> 1000
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 41
<210> 42
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 42
<210> 43
<211> 1000
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 43
<210> 44
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 44
15 <210> 45
<211> 1000
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 45
<210> 46
<211> 1000
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 46
<210> 47
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 47
<210> 48
<211> 1000
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 48
<210> 49
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 49
<210> 50
<211> 1000
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 50
<210> 51
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 51
<210> 52
<211> 1000
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 52
<210> 53
<211>
1001 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 53
<210> 54
<211> 1001
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 54
<210> 55
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 55
<210> 56
<211> 1001
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 56
<210> 57
<211>
1001 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 57
<210> 58
<211> 1001
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 58
<210> 59
<211>
1001 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 59
<210> 60
<211> 1001
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 60
<210> 61
<211>
1001 10 <212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 61
<210> 62
<211> 1001
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 62
<210> 63 10 <211> 1001
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 63
<210> 64
<211> 1001
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 64
<210> 65
<211>
1000 10 <212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 65
<210> 66
<211> 1001
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 66
<210> 67
<211>
1001 10 <212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 67
<210> 68
<211> 1001
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 68
<210> 69
<211>
1001 10 <212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 69
<210> 70
<211> 1001
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 70
<210> 71
<211>
1001 10 <212> ADN
<212> Haemophilus influenzae
<400> 71
<210> 72
<211> 1001
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 72
<210> 73 10 <211> 1001
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 73
<210> 74
<211> 1001
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 74
<210> 75
<211>
1001 10 <212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<400> 75
<210> 76
<211> 924
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(924)
<400> 76
<210> 77
<211>
894 5 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(894)
10 <400> 77
<210> 78
<211> 936
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(936)
<400> 78
<210> 79
<211> 957
<212> ADN
<213> Haemophilus influenzae
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(957)
<400> 79
<210> 80
<211> 1046
<212> ADN
<213> Moraxella catarrhalis
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1044)
<400> 80
<210> 81
<211> 876
<212>
ADN
<212>
Neisseria meningitidis
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(876)
<400> 81
<210> 82
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo PorA5'
<400> 82
<210> 83
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso PorA5'
<400> 83
<210> 84
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo PorA3'
<400> 84
<210> 85
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso PorA3'
<400> 85 <210> 86
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo 1 PoLa
<400> 86
<210> 87
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso 2 PoLa
<400> 87
<210> 88
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo PorAlacO
<400> 88
<210> 89
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador inverso PorAlacO
<400> 89
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador PPA1
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador PPA2
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> cebador N-full-01
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<223> cebador porB2
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<211> 25
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<212> ADN
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<223> cebador GFP-Spe
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<212> ADN
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<212> ADN
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<223> cebador PNS1'
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador BAD01-2
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador BAD02-2
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> cebador BAD 15-2
<400> 127
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> cebador BAD 03-2
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<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador BAD 25
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador BAD08
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<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador PLA1 Amo5
<400> 131
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<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador PLA1 Amo3
<400> 132
<210> 133
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CIRCI-Bgl
<400> 133
<210> 134
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CIRC1-XH-RBS/2
<400> 134
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CIRC2-XHO/2
<400> 135
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador BAD20
<400> 136
<210> 137
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CM-PORA-3
<400> 137
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<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CM-PORA-D15/3
<400> 138
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<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador BAD16
<400> 139
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<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador BAD17
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<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador BAD18
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<211> 64
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador BAD19
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
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<223> cebador BAD21
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador PQ-rec5-Nhe
<400> 144
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<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador PQ-rec3-Hin
<400> 145
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<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CIRC1-PQ-Bgl
<400> 146
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<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CIRC1-PQ-XHO
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<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CIRC2-PQ-X
<400> 148
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<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CM-PORA-3
<400> 149
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<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CM-PORA-D153
<400> 150
<210> 151
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CIRC-Kan-Nco
<400> 151
<210> 152
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CIRC-Kan-Xba
<400> 152
<210> 153
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador SAC/NCO/NEW5
<400> 153 <210> 154
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador SAC/NCO/NEW3
<400> 154
<210> 155
<211> 72
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador Kan-PorA-5
<400> 155
<210> 156
<211> 69
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador Kan-PorA-3
<400> 156

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una preparación de ampolla modificada por ingeniería genética a partir de una cepa bacteriana Gram negativa de Neisseria, Moraxella catharralis o Haemophilus influenzae, caracterizada porque dicha preparación se puede obtener empleando el siguiente procedimiento:
    d) un procedimiento de modificación de la parte de lípido A de LPS bacteriano dentro de la preparación de ampolla, que comprende las etapas de identificar un gen msbB implicado en hacer la parte del lípido A de LPS tóxica, modificar por ingeniería genética una cepa bacteriana para reducir o inactivar la expresión de dicho gen, y fabricar ampollas a partir de dicha cepa.
  2. 2.
    La preparación de ampolla modificada por ingeniería genética de la reivindicación 1, en la que la cepa de Neisseria es una cepa menigocócica, gonocócica o de N. meningitidis del serogrupo B
  3. 3.
    La preparación de ampolla modificada por ingeniería genética de la reivindicación 1 o 2, en la que el gen msbB tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 79, 80 u 81.
  4. 4.
    La preparación de ampolla modificada por ingeniería genética de las reivindicaciones 1-3, en la que el gen msbB está regulado negativamente por mutación puntual o deleción.
  5. 5.
    La preparación de ampolla modificada por ingeniería genética de las reivindicaciones 1-3, en la que una parte o toda la fase de lectura abierta de msbB o de un promotor está delecionada
    6 Una vacuna que comprende la preparación de ampolla modificada por ingeniería genética de las reivindicaciones 1-5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable
  6. 7.
    La vacuna de las reivindicación 6, que adicionalmente comprende un adyuvante.
  7. 8.
    La vacuna de la reivindicación 7, en la que el adyuvante es: una sal de aluminio, gel de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, una sal de calcio, carbonato cálcico, una sal de hierro, una sal de zinc, una suspensión insoluble de tirosina acilada o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente, o polifosfacenos, un sistema adyuvante de Th1, monofosforil lípido A (MPL), monofosforil lípido A 3-des-I-acilado (3D-MPL), una combinación de MPL junto con una sal de aluminio, una combinación de 3D-MPL junto con una sal de aluminio, una combinación de un MPL y un derivado de saponina, una combinación de QS21 y 3D-MPL, una combinación de QS21 y 3D-MPL en la que el QS21 está inactivado con colesterol, QS21 y 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua, una saponina, QS21, una emulsión de aceite en agua y tocoferol, u oligonucleótidos que contienen CpG no metilados.
  8. 9.
    La preparación de ampolla modificada por ingeniería genética de las reivindicaciones 1-5 o la vacuna de las reivindicaciones 6-8 para su uso como un adyuvante en una vacuna de combinación que comprende otro antígeno.
  9. 10.
    La preparación de ampolla modificada por ingeniería genética de las reivindicaciones 1-5 para su uso en la inmunización a un huésped humano contra una enfermedad causada por una infección de: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeaea, Haemophilus influenzae o Moraxella catarrhalis.
    Figura 9
    Figura 11
    Figura 12
    Representación esquemática de la estrategia de PCR recombinante usada para delecionar el lacO en el promotor quimérico porA/lacO
    Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17
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