ES2331533T3 - Biosensor. - Google Patents
Biosensor. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2331533T3 ES2331533T3 ES06730046T ES06730046T ES2331533T3 ES 2331533 T3 ES2331533 T3 ES 2331533T3 ES 06730046 T ES06730046 T ES 06730046T ES 06730046 T ES06730046 T ES 06730046T ES 2331533 T3 ES2331533 T3 ES 2331533T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- biosensor
- reaction layer
- electrode
- layer
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/096—Polyesters; Polyamides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
- G01N27/3272—Test elements therefor, i.e. disposable laminated substrates with electrodes, reagent and channels
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Biosensor para medir la concentración de grasas neutras en base al valor de la corriente que fluye en un sistema de electrodos, que comprende: un sustrato aislante; un sistema de electrodos que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, formado sobre dicho sustrato aislante, y una capa de reacción que tiene una lipoproteína lipasa, una glicerol deshidrogenasa del tipo dependiente de coenzima y un mediador de electrones, formada en la parte superior o en la proximidad de dicho sistema de electrones; caracterizado porque dicha coenzima es pirrolo-quinolina quinona o flavín adenín dinucleótido.
Description
Biosensor.
La presente invención se refiere a un biosensor
que es capaz de determinar, rápidamente y con precisión elevada, la
cantidad de grasas neutras contenida en una muestra biológica o
similar.
En general, como método de medición para grasas
neutras, existen (1) un método que utiliza ácido cromotrópico, (2)
un método con acetilacetona, (3) un método enzimático, y (4) un
método que utiliza un nefelómetro, no obstante, cualquiera de estos
métodos requiere operaciones de análisis complicadas y un tiempo de
análisis largo. Por lo tanto, se ha desarrollado un biosensor como
método para determinar, de manera sencilla y rápida, una cantidad
de sustancias objetivo sin proceder a la dilución o agitación de una
mezcla líquida en la medición de componentes específicos contenidos
en la muestra.
Como biosensor del tipo dicho para la medición
de grasas neutras, existe un sensor de triglicéridos caracterizado
porque se inmoviliza una glicerol éster hidrolasa sobre una membrana
polimérica porosa o una membrana polimérica uniforme hidrofílica
recubiertas por una película aislante de la puerta de un transistor
de efecto campo eléctrico selectivo de iones y sensible al pH
(JP-A-59-210356).
Además, también se conoce un sensor de grasas
neutras que utiliza una lipoproteína lipasa y una glicerol oxidasa
(JP-A-59-228158).
Este sensor es un sensor que tiene un primer electrodo y un segundo
electrodo y está dotado de una enzima inmovilizada en la proximidad
de un electrodo, con el fin de medir las grasas neutras contenidas
en una solución a medir, basado en el flujo de corriente entre los
electrodos de membrana, y se utilizan una lipoproteína lipasa y una
glicerol oxidasa como enzimas inmovilizadas. Sin embargo, este
aparato es complicado, ya que está compuesto de un tubo interior de
vidrio y un tubo exterior de vidrio, y está dispuesto con un primer
electrodo en la base del tubo interior; el líquido interior es
cargado entre el tubo interior y el tubo exterior; y un segundo
electrodo está dispuesto en este líquido interior, cuyos electrodos
están sumergidos en un tanque de agua mantenida a 30ºC, y se carga
una muestra a medir en este tanque de agua.
Como aparato más simple y más conveniente, se ha
propuesto un sensor para medir la concentración de sustrato de una
muestra líquida, mediante la detección electroquímica de un cambio
en la concentración de sustancia en una reacción entre una enzima,
un mediador de electrones y una muestra líquida por medio de un
sistema de electrodos, que tiene, como mínimo, un electrodo de
medición y un contraelectrodo formado sobre un sustrato aislante
(JP-A-2001-343349).
Este sensor es un sensor para la medición de grasas neutras, que
tiene una primera capa formada sobre un electrodo de medición,
mediante el mantenimiento una lipoproteína lipasa, una glicerol
quinasa, una glicerofosfato oxidasa y un tensoactivo, y mediante el
montaje de un portador a través del cual puede pasar la muestra
líquida; y tiene una segunda capa formada sobre un contraelectrodo,
mediante el mantenimiento de un tensoactivo y mediante el montaje
de un portador a través de cual puede pasar la muestra líquida.
Analytical Chemistry ("Química analítica"),
1982, 54, pág. 1987-1990 da a conocer un sistema
amperométrico de tres electrodos para la determinación de
triglicéridos en suero, que utiliza glicerol deshidrogenasa y
diaforasa dependientes de NAD^{+} e inmovilizadas sobre una
membrana de colágeno.
Sin embargo, un sensor de triglicéridos descrito
en el documento anterior
JP-A-59-210356, mide
los ácidos grasos liberados por una glicerol éster hidrolasa
utilizando un transistor de efecto campo eléctrico selectivo de
iones y sensible al pH y, dado que el valor de la respuesta es
proporcional al logaritmo de la concentración de la muestra, la
precisión de la medición es insuficiente. Este sensor también tiene
el problema de que el aparato resulta complicado.
Además, un sensor de grasas neutras descrito en
el documento anterior
JP-A-59-228158
requiere un aparato de calentamiento para mantener la temperatura
constante para una medición precisa. Dado que el sensor requiere el
suministro de una muestra para su medición desde su exterior,
requiere una gran cantidad de muestras, haciendo así que la
medición sea difícil utilizando una cantidad pequeña de una
muestra.
Además, un sensor descrito en el documento
anterior
JP-A-2001-343349
está configurado por diferentes capas para una enzima y un mediador
de electrones, lo que hace el aparato extremadamente complicado, y
requiere el uso de dos tipos de enzimas caros, una glicerol quinasa
y una glicerofosfato oxidasa, así como una lipoproteína lipasa.
Recientemente, el número de pacientes de
hiperlipemia, que es una enfermedad relacionada con el estilo de
vida, ha crecido de manera constante y, por tanto, es una cuestión
actual que se desea firmemente el desarrollo de un sensor que es
capaz de medir, rápidamente y con una precisión elevada, la
concentración de grasas neutras contenidas en una muestra, tal como
sangre o similar.
En estas circunstancias, un objetivo de la
presente invención es dar a conocer un sensor que es capaz de medir,
rápidamente y con una precisión elevada, la concentración de grasas
neutras de una muestra, tal como una muestra biológica o similar,
sin realizar el pretratamiento de la muestra.
Los presentes inventores han observado que, en
un biosensor para medir la concentración de grasas neutras basado
en el valor del flujo de corriente en el sistema de electrodos, que
tiene: un sustrato aislante; un sistema de electrodos que tiene un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo, formado sobre el sustrato
aislante; y una capa de reacción formada en la parte superior o en
la proximidad del sistema de electrodos; mediante la inclusión de
una lipoproteína lipasa, una glicerol deshidrogenasa dependiente de
PQQ o FAD y un mediador de electrones en la capa de reacción, se
puede medir la concentración de glicerol en una muestra de manera
rápida y con una precisión elevada, y habiendo conseguido así la
presente invención.
Concretamente, un aspecto de la presente
invención se refiere a un biosensor para medir de la concentración
de las grasas neutras, basado en el valor del flujo de corriente en
el sistema de electrodos, que tiene: un sustrato aislante; un
sistema de electrodos que tiene un electrodo de trabajo y un
contraelectrodo, formado sobre el sustrato aislante; y una capa de
reacción que tiene una lipoproteína lipasa, una glicerol
deshidrogenasa dependiente de PQQ o FAD y un mediador de
electrones, formada en la parte superior o en la proximidad del
sistema de electrodos.
Adicionalmente, otros objetivos, detalles y
características de la presente invención quedarán claros en
referencia a las realizaciones preferentes que se indicarán como
ejemplos en la explicación siguiente y los dibujos que se
acompañan.
La figura 1 es una vista en planta que muestra
la formación de cada uno de los elementos de la configuración de un
biosensor de la presente invención; (a) es una vista en planta que
muestra un patrón de formación de una parte de conducción y una
parte de conexión sobre un sustrato aislante; (b) es una vista en
planta que muestra un patrón de formación de un electrodo de
referencia que configura un sistema de electrodos; (c) es una vista
en planta que muestra un patrón de formación de un electrodo de
trabajo y un contraelectrodo que configuran un sistema de
electrodos; (d) es una vista en planta que muestra un patrón de
formación de una capa aislante; y (e) es una vista en planta que
muestra un patrón de formación de un separador y una capa de
reacción.
La figura 2 es una vista en perspectiva que
muestra el orden de laminación de cada uno de los elementos de la
configuración mostrada en cada uno de los dibujos de la figura
1.
La figura 3 es una vista en planta que muestra
un biosensor formado por cada uno de los elementos de la
configuración mostrada en cada uno de los dibujos de las figuras 1
y 2.
La figura 4 es un gráfico que muestra el
resultado del ejemplo 1-1.
La figura 5 es un gráfico que muestra el
resultado del ejemplo 1-2.
La figura 6 es un gráfico que muestra el
resultado de los ejemplos 2-1 a
2-3.
A continuación, se proporcionará una explicación
sobre una realización preferente para llevar a cabo la presente
invención, aunque, el alcance técnico de la presente invención no
debe ser limitado sólo a la siguiente realización:
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un biosensor para medir la concentración de grasas neutras, basado
en el valor del flujo de corriente en el sistema de electrodos, que
tiene: un sustrato aislante; un sistema de electrodos que tiene un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo, formado sobre el sustrato
aislante; y una capa de reacción que tiene una lipoproteína lipasa,
una glicerol deshidrogenasa dependiente de PQQ o FAD y un mediador
de electrones, formada en la parte superior o en la proximidad del
sistema de electrodos.
La figura 1 es una vista en planta que muestra
un patrón de formación de cada uno de los elementos de la
configuración del biosensor (10) de la presente invención. En cada
uno de los dibujos de la figura 1, se muestra una línea virtual que
muestra la forma externa del sustrato aislante (20) adicionalmente a
los elementos de la configuración para la explicación por cada uno
de los dibujos. La figura 1(a) es una vista en planta que
muestra un patrón de formación de la parte de conducción (30) y la
parte de conexión (32) sobre el sustrato aislante (20); la figura
1(b) es una vista en planta que muestra un patrón de
formación del electrodo de referencia (42) que configura el sistema
de electrodos; la figura 1(c) es una vista en planta que
muestra un patrón de formación del electrodo de trabajo (44) y el
contraelectrodo (46) que configuran el sistema de electrodos; la
figura 1(d) es una vista en planta que muestra una patrón de
formación de la capa aislante; y la figura 1(e) es una vista
en planta que muestra un patrón de formación del separador (60) y la
capa de reacción (70). Debería indicarse que, en cada uno de los
dibujos de la figura 1, se muestran los elementos de la
configuración para la explicación por cada uno de los dibujos, y el
sustrato aislante (20). La figura 3 es una vista en planta que
muestra el biosensor (10) formado por cada uno de los elementos de
la configuración mostrada en cada uno de los dibujos de la figura
1. En el biosensor (10) mostrado en la figura 2, la parte de
conducción integrada (30) y la parte de conexión (32), el sistema de
electrodos, la capa aislante (50), el separador (60) y la capa de
reacción (70) están laminados sobre el sustrato aislante (20), desde
la parte del sustrato aislante (20), en este orden. Debería
indicarse que el biosensor (10) se puede utilizar y almacenar en un
estado en el que se cubre adicionalmente con una cubierta, aunque,
en la figura 1 y la figura 2, el dibujo de dicha cubierta se ha
omitido. Además, para comodidad de explicación, se ha aumentado la
proporción de las dimensiones en los dibujos y la realización
mostrada puede ser diferente de la escala práctica.
El biosensor (10) es un aparato para medir la
concentración de grasas neutras en una muestra, tal como un fluido
corporal o similar. A continuación, se proporcionará una explicación
en detalle de cada una de las partes que configuran el biosensor
(10).
El biosensor (10) está dotado del sustrato
aislante (20), como sustrato del mismo. El sustrato aislante (20)
puede estar configurado por un material aislante conocido
habitualmente, tal como una resina, por ejemplo, tereftalato de
polietileno (PET), polietileno o similar; vidrio, cerámicas, papel;
o similar. La forma o tamaño del sustrato aislante (20) no están
especialmente limitados.
Sobre el sustrato aislante (20), tal como se
muestra en la figura 1 y la figura 2, se forman las partes de
conducción (-30a-, -30b- y -30c-) y las partes de conexión (-32a-,
-32b- y -32c-). Las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-)
actúan como medios para la conexión eléctrica del sistema de
electrodos, a describir posteriormente, y el exterior del biosensor
(10), y están conectadas eléctricamente con el sistema de electrodos
a través de las partes de conducción
(-30a-, -30b- y -30c-). Las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-) se extienden, tal como se muestran en la figura 2, desde las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) hasta la posición del sistema de electrodos, de este modo configuran una capa base de cada uno de los electrodos (-42-, -44- y -46-) del sistema de electrodos. El material que configura las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-) y las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) no está especialmente limitado y se puede utilizar, según sea apropiado, un material utilizado de forma práctica en la formación de la parte de conducción y la parte de conexión del biosensor. Sin embargo, en vista de la mayor sensibilidad de respuesta del biosensor (10), las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-) y las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) están preferentemente configuradas por un material con un valor menor de la resistividad de la superficie. Específicamente, es preferente que estén configuradas por un material que tiene un valor de resistividad de la superficie igual o inferior a 50 m\Omega/\Box, más preferentemente, igual o inferior a 40 m\Omega/\Box, en un grosor de 10 \mum. La configuración de la parte de conducción y la parte de conexión, que utilizan un material con un valor de resistividad de la superficie mayor que el intervalo anterior, reduce la linealidad entre la concentración de sustrato y el valor de respuesta, lo cual podría proporcionar un efecto de mejora insuficiente de la sensibilidad de la medición por la presente invención. Por otro lado, el límite inferior del valor de resistividad de la superficie de este material no está especialmente limitado, aunque, al considerar la adición de un aglutinante para asegurar la adhesión de la parte de conducción (30) y la parte de conexión (32) con un sustrato, se prevé que el valor de resistividad de la superficie de la parte de conducción (30) y la parte de conexión (32) es aproximadamente de 0,1 m\Omega/\Box o superior, en un grosor de 10 \mum. Sin embargo, la parte de conducción (30) y la parte de conexión (32) pueden estar configuradas de forma natural por un material que tiene un valor de resistividad de la superficie fuera de este intervalo. Como material que tiene el valor de resistividad de la superficie preferente, tal como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, se incluye uno fabricado de metales, tales como plata, oro, platino, paladio y similares, como componente principal. El material que configura cada una de las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-) y cada una de las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) puede ser el mismo o puede ser diferente. Sin embargo, en vista del bajo coste, es preferente que tanto la parte de conducción como la parte de conexión estén configuradas por plata. El método para la formación de la parte de conducción y la parte de conexión no está especialmente limitado, y pueden formarse mediante un método conocido habitualmente, tal como un método de impresión por pantallas, un método de "sputtering" (bombardeo iónico) o similar. En este caso, el material que configura la parte de conducción y la parte de conexión se puede suministrar en forma de una pasta que contiene un aglutinante de una resina, tal como poliéster o similar. Después de la formación de una película recubierta mediante el método anterior, es preferible someterla a un proceso de calentamiento a una temperatura de aproximadamente 50 a 200ºC para endurecer la película recubierta.
(-30a-, -30b- y -30c-). Las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-) se extienden, tal como se muestran en la figura 2, desde las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) hasta la posición del sistema de electrodos, de este modo configuran una capa base de cada uno de los electrodos (-42-, -44- y -46-) del sistema de electrodos. El material que configura las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-) y las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) no está especialmente limitado y se puede utilizar, según sea apropiado, un material utilizado de forma práctica en la formación de la parte de conducción y la parte de conexión del biosensor. Sin embargo, en vista de la mayor sensibilidad de respuesta del biosensor (10), las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-) y las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) están preferentemente configuradas por un material con un valor menor de la resistividad de la superficie. Específicamente, es preferente que estén configuradas por un material que tiene un valor de resistividad de la superficie igual o inferior a 50 m\Omega/\Box, más preferentemente, igual o inferior a 40 m\Omega/\Box, en un grosor de 10 \mum. La configuración de la parte de conducción y la parte de conexión, que utilizan un material con un valor de resistividad de la superficie mayor que el intervalo anterior, reduce la linealidad entre la concentración de sustrato y el valor de respuesta, lo cual podría proporcionar un efecto de mejora insuficiente de la sensibilidad de la medición por la presente invención. Por otro lado, el límite inferior del valor de resistividad de la superficie de este material no está especialmente limitado, aunque, al considerar la adición de un aglutinante para asegurar la adhesión de la parte de conducción (30) y la parte de conexión (32) con un sustrato, se prevé que el valor de resistividad de la superficie de la parte de conducción (30) y la parte de conexión (32) es aproximadamente de 0,1 m\Omega/\Box o superior, en un grosor de 10 \mum. Sin embargo, la parte de conducción (30) y la parte de conexión (32) pueden estar configuradas de forma natural por un material que tiene un valor de resistividad de la superficie fuera de este intervalo. Como material que tiene el valor de resistividad de la superficie preferente, tal como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, se incluye uno fabricado de metales, tales como plata, oro, platino, paladio y similares, como componente principal. El material que configura cada una de las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-) y cada una de las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) puede ser el mismo o puede ser diferente. Sin embargo, en vista del bajo coste, es preferente que tanto la parte de conducción como la parte de conexión estén configuradas por plata. El método para la formación de la parte de conducción y la parte de conexión no está especialmente limitado, y pueden formarse mediante un método conocido habitualmente, tal como un método de impresión por pantallas, un método de "sputtering" (bombardeo iónico) o similar. En este caso, el material que configura la parte de conducción y la parte de conexión se puede suministrar en forma de una pasta que contiene un aglutinante de una resina, tal como poliéster o similar. Después de la formación de una película recubierta mediante el método anterior, es preferible someterla a un proceso de calentamiento a una temperatura de aproximadamente 50 a 200ºC para endurecer la película recubierta.
Tal como se muestra en la figura 1 y la figura
2, sobre la capa superior de la capa base, hasta la cual se
extienden las partes de conducción (-30a-, -30b- y -30c-), se forma
el sistema de electrodos. Este sistema de electrodos actúa, al
utilizar el biosensor (10), como un medio de aplicación de voltaje
para aplicar voltaje en una muestra en la capa de reacción (70), a
describir posteriormente, y un medio de detección de corriente para
detectar el flujo de corriente en una muestra.
En la realización mostrada por el dibujo, el
sistema de electrodos está configurado por tres electrodos: el
electrodo de referencia (42), el electrodo de trabajo (44) y el
contraelectrodo (46). Concretamente, el biosensor (10) de la
realización mostrada es un sensor con un sistema de tres electrodos.
Sin embargo, el biosensor de la presente invención no está limitado
a un sensor con un sistema de tres electrodos y se puede incluir un
sensor con un sistema de dos electrodos dispuesto con un sistema de
electrodos que no contiene un electrodo de referencia. Debería
indicarse que, en vista del control del voltaje en el sistema de
electrodos con una sensibilidad mayor, se utiliza un sistema de
tres electrodos, más preferentemente, que un sistema de dos
electrodos.
El electrodo de trabajo (44) y el
contraelectrodo (46) actúan como medio de medición de corriente,
como pareja, para medir la corriente de oxidación (corriente de
respuesta) que fluye al aplicar un voltaje en una muestra en la
capa de reacción (70), a describir posteriormente. Al utilizar el
biosensor (10), se aplica el voltaje predeterminado entre el
electrodo de referencia (42) y el electrodo de trabajo (44). El
material que configura cada uno de los electrodos no está
especialmente limitado y se puede utilizar, según sea apropiado, un
material utilizado habitualmente en la formación del sistema de
electrodos del biosensor. Sin embargo, en vista de la mayor
sensibilidad a la respuesta del biosensor (10), el sistema de
electrodos está configurado preferiblemente por un material con un
valor de resistividad de la superficie igual o inferior a 100
\Omega/\Box, más preferentemente, igual o inferior a 80
\Omega/\Box, en un grosor de 10 \mum. La configuración del
sistema de electrodos, utilizando un material con un valor de
resistividad de la superficie superior al intervalo anterior, reduce
la linealidad entre la concentración de sustrato y el valor de
respuesta, lo cual podría proporcionar un efecto de mejora
insuficiente de la sensibilidad de la medición por la presente
invención. Por otro lado, el límite inferior del valor de
resistividad de la superficie de este material no está especialmente
limitado. El material que configura cada uno de los electrodos
(-42-, -44- y -46-) puede ser el mismo o diferente. Sin embargo, en
vista de la resistencia a la corrosión y el coste, es preferible
que cada uno de los electrodos (-42-, -44- y -46-) esté
configurado por carbono como componente principal. Sin embargo, en
algunos casos, el sistema de electrodos puede estar configurado por
un material diferente al carbono, tal como varios metales o
similares. El método para la formación del sistema de electrodos no
está especialmente limitado y puede formarse mediante un método
conocido habitualmente, tal como un método de impresión por
pantallas, un método de "sputtering" (bombardeo iónico) o
similar. En este caso, el material que configura el sistema de
electrodos se puede suministrar en forma de una pasta que contiene
un aglutinante de una resina, tal como poliéster o similar. Después
de la formación de una película recubierta mediante el método
anterior, es preferible someterla a un proceso de calentamiento
para endurecer la película recubierta.
En el biosensor (10) de la presente realización,
cada uno de los electrodos (-42-, -44- y -46-) que configuran el
sistema de electrodos se expone, tal como se muestra en la figura 3,
desde una parte de abertura de forma casi rectangular que tiene la
capa aislante (50) formada sobre la capa superior del sistema de
electrodos. En la presente, el valor de la proporción del área
expuesta del electrodo de trabajo (44) y el contraelectrodo (46) de
la parte de abertura está preferentemente controlado en un intervalo
predeterminado. Específicamente, el área expuesta de la parte de
abertura del contraelectrodo (46) es de 1,2 a 3,0 veces más grande
que el área expuesta desde la parte de abertura del electrodo de
trabajo (44). El área expuesta del contraelectrodo (46), menos de
1,2 veces más grande que el área expuesta del electrodo de trabajo
(44), proporciona un control insuficiente de la saturación de una
reacción redox en el contraelectrodo (46) en la medición del valor
de la corriente de oxidación, lo cual podría proporcionar un efecto
insuficiente de la presente invención en el aumento de la
sensibilidad de la medición del biosensor (10). Por otro lado, el
área expuesta del contraelectrodo (46), más de 3,0 veces más grande
que el área expuesta del electrodo de trabajo (44), podría
dificultar el dimensionado compacto del biosensor (10).
Sobre las partes de conducción (-30a-, -30b- y
-30c-) y las partes de conexión (-32a-, -32b- y -32c-) formadas
sobre el sustrato aislante (20), además de sobre la capa superior
del sistema de electrodos, tal como se muestra en la figura 1 y la
figura 2, se forma la capa aislante (50) de manera que se expone el
sistema de electrodos. La capa aislante (50) actúa como un medio de
aislamiento para evitar un cortocircuito entre cada uno de los
electrodos que configura el sistema de electrodos. El material que
configura la capa aislante (50) no está especialmente limitado y,
por ejemplo, puede estar configurado por una tinta resistente; una
resina, tal como PET, polietileno, o similar; vidrio, cerámica,
papel, o similar. El método para la formación de la capa aislante
(50) no está especialmente limitado y puede formarse mediante un
método conocido habitualmente, tal como un método de impresión por
pantallas, un método de adhesión o similar.
Sobre la capa superior del sistema de electrodos
y la capa aislante (50), tal como se muestra en la figura 1 y 2, se
forman el separador (60) y la capa de reacción (70). Al utilizar el
biosensor (10), se produce una reacción enzimática, a describir
posteriormente, en la capa de reacción (70). Además, el montaje del
separador (60) evita pérdidas de la capa de reacción (70) y la
solución de muestra al utilizar el biosensor (10). En la
realización mostrada por el dibujo, el separador (60) presenta una
parte de abertura rectangular en la posición correspondiente al
sistema de electrodos y la capa de reacción (70) se dispone sobre
esta parte de abertura. Sin embargo, la forma de la parte de
abertura, que presenta el separador (60), no está limitada al
rectángulo y se puede utilizar una forma arbitraria. El material que
configura el separador (60) no está especialmente limitado; por
ejemplo, puede estar configurado por una resina, tal como PET,
polietileno, o similar, vidrio, cerámica, papel, o similar. El
método para la formación del separador (60) y la capa de reacción
(70) no está especialmente limitado y, por ejemplo, se puede
utilizar un método para el montaje del separador (60) que presenta
una parte de abertura en una posición predeterminada, seguido del
goteo de una solución para formar la capa de reacción (70) en esta
parte de abertura y el secado.
En el biosensor de la presente realización, la
capa de reacción (70) presenta una lipoproteína lipasa, una
glicerol deshidrogenasa y un mediador de electrones.
Habitualmente, ha existido un biosensor formado
por un sistema de electrodos que tiene un electrodo de trabajo y un
contraelectrodo, sobre el sustrato aislante; y una capa de reacción
formada en la parte superior o en la proximidad del sistema de
electrodos y también se conocía un sensor por combinación de una
lipoproteína lipasa con otras enzimas en la capa de reacción. Sin
embargo, en la presente invención, la formulación de una glicerol
deshidrogenasa junto con una lipoproteína lipasa es capaz de medir
las grasas neutras de manera práctica y económica. Además, debido a
que la capa de reacción contiene además un mediador de electrones,
no es necesario montar por separado la capa de reacción que contiene
una enzima y una capa que contiene el mediador de electrones, lo
cual permite que la estructura sea sencilla. La adición de una
muestra que contiene lipoproteínas al biosensor de la presente
realización libera glicerol y ácidos grasos mediante la
descomposición de las grasas neutras en lipoproteínas por una
lipoproteína lipasa contenida en la capa de reacción. Además, la
presencia de una glicerol deshidrogenasa y un mediador de electrones
en la capa de reacción oxida el glicerol y, al mismo tiempo, reduce
el mediador de electrones. Por lo tanto, se puede determinar de
manera precisa la concentración de un sustrato mediante el valor de
la corriente de oxidación del mediador de electrones resultante. A
continuación, se proporcionará una explicación en detalle de la
configuración característica de la presente invención.
La lipoproteína lipasa utilizada en el biosensor
de la presente realización no está especialmente limitada siempre y
cuando sea capaz de liberar glicerol mediante la descomposición de
lipoproteína y se puede utilizar preferentemente cualquier
lipoproteína lipasa habitual o alguna con una mayor estabilidad o
reactividad por modificación adicional de la misma. El contenido de
dicha lipoproteína lipasa en la capa de reacción se puede
seleccionar, según sea apropiado, por el tipo de muestra biológica a
utilizar o por la cantidad de adición de la misma. En general, la
cantidad de lipoproteína lipasa contenida en la capa de reacción es
de 0,001 a 1000 unidades de actividad, más preferentemente de 0,1 a
500 unidades de actividad, y particularmente preferentemente de 0,1
a 300 unidades de actividad. Debería indicarse que la definición y
el método para medir la unidad de actividad de la lipoproteína
lipasa son los siguientes:
En 1 ml de solución de tampón fosfato 20 mM (pH
7), se añadieron 2 ml de una emulsión de aceite de soja y se agitó
suficientemente; posteriormente, se añadió 1 ml de una solución que
contenía una lipoproteína lipasa y se agitó a 37ºC durante 20
minutos. Después de la agitación, se añadieron 10 ml de la solución
de terminación de la reacción y además se añadieron 6 ml de
n-heptano y 4 ml de agua pasada por un
intercambiador de iones y se agitó suficientemente. Debería
indicarse que la "emulsión de aceite de soja" es aquella
preparada mediante la adición de 24 ml de aceite de soja a 16 ml de
una solución de albúmina de suero bovino al 10% preparada en una
solución de tampón fosfato 20 mM (pH 7) y una agitación suficiente.
Además, "una solución de terminación de la reacción" es una
mezcla líquida de
n-heptano/2-propanol/ácido sulfúrico
2N (10/40/1, p/p/p).
A continuación, se tomaron 6 ml de la capa
superior (capa de n-heptano), se vertieron 2 gotas
del indicador rojo cresol y se valoró mediante una solución de
etanol de hidróxido de potasio 0,01 M para determinar la cantidad
de ácidos grasos liberados tomando como punto final el momento en
que el líquido se vuelve violeta. Como prueba de blancos, se
realizó una operación similar utilizando 1 ml de una solución de
tampón fosfato 20 mM, en lugar de una solución que contenía la
lipoproteína lipasa, para determinar los ácidos grasos
liberados.
En las condiciones anteriores, la cantidad de
lipoproteína lipasa que libera 1 \mumol de ácidos grasos en 1
minuto se define como 1 unidad de actividad.
La glicerol deshidrogenasa es del tipo
dependiente de coenzima, caracterizada porque dicha coenzima es
pirrolo-quinolina quinona (PQQ) o flavín adenín
dinucleótido (FAD). En la presente, por ejemplo, al contener la capa
de reacción la glicerol oxidasa, como enzima, se dificulta la
medición correcta de las grasas neutras, ya que la reacción se
realiza utilizando oxígeno disuelto en una solución. Por otro lado,
utilizando el biosensor de la realización descrita anteriormente,
no existe el efecto del oxígeno disuelto, ya que la glicerol
deshidrogenasa del tipo dependiente de coenzima sólo utiliza un
mediador de electrones en una solución para la reacción. Por lo
tanto, la medición de la corriente de oxidación obtenida mediante
la oxidación de un mediador de electrones reducido es capaz de
proporcionar de manera precisa la concentración de glicerol. El
contenido de glicerol deshidrogenasa en la capa de reacción se
puede seleccionar, según sea apropiado, por el tipo de muestra
biológica a utilizar, o por la cantidad de adición de la misma. En
general, la cantidad de glicerol deshidrogenasa contenida en la
capa de reacción es de 0,001 a 200 unidades de actividad, más
preferentemente de 0,05 a 100 unidades de actividad y
particularmente preferentemente de 0,1 a 80 unidades de actividad.
Debería indicarse que se puede hacer referencia a la definición y a
un método para medir la unidad de actividad de la glicerol
deshidrogenasa en la descripción de los ejemplos a describir
posteriormente.
La glicerol deshidrogenasa utilizada en la
presente realización se puede utilizar como producto adquirido en
el mercado o se puede preparar per se. Un método para
preparar la enzima per se incluye, por ejemplo, un método
para utilizar bacterias que producen la enzima. Entre las bacterias
que producen la enzima se incluyen, por ejemplo, aquellas que
pertenecen a varios géneros, tales como Gluconobacter, Pseudomonas,
y similares. En la presente realización, en particular, se puede
utilizar preferentemente una glicerol deshidrogenasa dependiente de
PQQ presente en una fracción de membranas de bacterias que
pertenecen a Gluconobacter. Además, en vista de la fácil
disponibilidad, se pueden utilizar las Gluconobacter,
particularmente, Gluconobacter oxydans NBRC 3171, 3253, 3258, 3285,
3289, 3290, 3291; Gluconobacter frateurii NBRC 3251, 3260, 3264,
3265, 3268, 3286; Gluconobacter Cerinus NBRC 3262; o similares. Una
cepa representativa de dichos microorganismos incluye Gluconobacter
oxydans NBRC 3291.
El método para obtener la glicerol
deshidrogenasa dependiente de PQQ a partir de estas bacterias no
está especialmente limitado y se puede hacer referencia, según sea
apropiado, a los conocimientos habitualmente conocidos.
En el caso en el que la glicerol deshidrogenasa
en el biosensor de la presente realización es dependiente de PQQ,
es preferible que la glicerol deshidrogenasa se modifique mediante
modificación química con un reactivo de reticulación bivalente bajo
la presencia de un tensoactivo. En dicha glicerol deshidrogenasa
modificada, la enzima hidrofóbica presenta una estructura firme al
ser introducida con una estructura de reticulación sin agregación,
y es, por tanto, capaz de aumentar la estabilidad térmica. Por lo
tanto, al utilizar el biosensor de la realización descrita
anteriormente, es posible medir con una precisión elevada las grasas
neutras en una muestra.
El agente de reticulación bivalente no está
especialmente limitado, siempre y cuando sea capaz de introducir
una estructura reticulada mediante la reacción con un grupo amino o
similar contenido en la glicerol deshidrogenada dependiente de PQQ;
y se pueden utilizar preferentemente un compuesto dialdehído, un
compuesto ácido dicarboxílico, un compuesto de base diisocianato,
un compuesto imidato o similar, que se pueden utilizar como agente
de reticulación en el campo de enzimas inmovilizadas. El compuesto
dialdehído incluye aldehído glutárico, dialdehído succínico,
aldehído adípico o similar; el compuesto ácido dicarboxílico incluye
ácido adípico, ácido dimetiladípico o similar; el compuesto de base
diisocianato incluye hexametilen diisocianato, toluen diisocianato o
similar; y el compuesto imidato incluye dimetil suberimidato,
dimetil pimelimidato o similar. En la presente invención, entre los
agentes de reticulación bivalentes anteriores, el aldehído glutámico
es particularmente
preferente.
preferente.
Por otro lado, el tensoactivo no está
especialmente limitado, siempre y cuando sea un tensoactivo
utilizado para la solubilización de la proteína de membrana y se
puede hacer referencia, según sea apropiado, a los conocimientos
habituales. Por ejemplo, se incluyen Triton X-100,
glucósido de octilo, colato sódico o similar.
La temperatura de reacción en una reacción de
reticulación se puede seleccionar, según sea apropiado, teniendo en
cuenta al agente de reticulación bivalente a utilizar y,
generalmente, la reacción se realiza preferentemente de
aproximadamente 0 a 40ºC; y el tiempo de reacción es de 1 minuto a 4
horas, preferentemente de aproximadamente 5 minutos a 2 horas,
particularmente preferentemente de 5 minutos a 1 hora. El tiempo de
reacción por debajo de 1 minuto proporciona una reticulación
insuficiente y aumenta la cantidad de enzima no reticulada, mientras
que un tiempo de reacción por encima de 4 horas aumenta
excesivamente la velocidad de reticulación y se puede perder la
actividad enzimática.
La reacción de reticulación se puede terminar
mediante la adición de un agente de terminación, tal como una
solución de glicina o una solución de tampón
tris-clorhidrato. Después de procesar el agente de
reticulación anterior, se pueden extraer la glicina no reaccionada,
el agente de reticulación bivalente,
2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol
y un producto de reacción entre un agente de terminación y un
reactivo de reticulación bivalente, mediante la realización de un
método de diálisis, un método de cromatografía, un método de
ultrafiltración, o similar. En la presente invención, la
realización de un método de diálisis es particularmente preferible,
ya que la operación de la misma es sencilla y práctica y requiere
un menor coste.
Al utilizar el biosensor (10), el mediador de
electrones recibe electrones generados por la acción de una enzima
redox, es decir, se reduce. Por tanto, después de completar la
reacción enzimática, el mediador de electrones reducido es oxidado
electroquímicamente por el flujo de corriente en el sistema de
electrodos. La concentración de un componente deseado en una
solución de muestra se puede calcular a partir del valor del flujo
de corriente (referido como corriente de oxidación) en esta
reacción.
El mediador de electrones utilizado en el
biosensor de la presente realización no está especialmente limitado,
siempre y cuando se reduzca conjuntamente con la oxidación del
glicerol por la glicerol deshidrogenasa y se oxide mediante la
aplicación de un voltaje en el sistema de electrodos.
Específicamente, por ejemplo, se ilustran un ion ferricianuro,
p-benzoquinona, un derivado de
p-benzoquinona, metosulfato de fenacina, un derivado
de metosulfato de fenacina, azul de metileno, tionina, carmín de
índigo, galocianina, safranina, ferroceno y un derivado del mismo,
\alpha-naftoquinona y un derivado de
\alpha-naftoquinona. En la presente, se incluye
un derivado de p-benzoquinona, un derivado de
metosulfato de fenacina o un derivado de
\alpha-naftoquinona que incluyen
p-benzoquinona, metosulfato de fenacina o
\alpha-naftoquinona unidos con un grupo alquilo
que tiene 1 ó 2 átomos de carbono, un átomo de halógeno, tal como
un átomo de flúor, un átomo de cloro, un átomo de bromo o similar.
Debería indicarse que en el caso en el que la glicerol
deshidrogenasa del tipo dependiente de PQQ descrita anteriormente
esté contenida en una capa de reacción como glicerol deshidrogenasa,
se adoptan preferentemente como mediador de electrones metosulfato
de fenacina; metilsulfato de
1-metoxi-5-metilfenacinio
como derivado de metosulfato de fenacina;
p-benzoquinona;
2-metil-1,4-benzoquinona
como derivado de p-benzoquinona; y
\alpha-naftoquinona.
Además, estos mediadores de electrones se pueden
utilizar solos o se pueden utilizar dos o más tipos mediante la
combinación con metilsulfato de
1-metoxi-5-metilfenacinio
y un ion ferricianuro, o similar.
La concentración de un mediador de electrones en
la capa de reacción se puede seleccionar, según sea apropiado, en
respuesta al tipo de enzima redox a utilizar, o una muestra diana, o
la cantidad de adición del mismo, o similar, aunque, en general, en
el caso en el que se añaden de 0,5 a 10 \mul de muestra, es
preferentemente de 0,01 a 1000 \mug, más preferentemente de 0,1 a
100 \mug y particularmente preferentemente de 1 a 50 \mug por
sensor.
Es preferible que la capa de reacción contenga
además un tensoactivo y un agente tamponador del pH. La razón de
esto es la siguiente: el biosensor de la presente realización se
utiliza con el objetivo de medir la concentración de grasas neutras
contenidas en una muestra; por lo tanto, la muestra a verter sobre
el sensor contiene grasas neutras, que son una sustancia soluble
oleosa; en la presente, según una realización de la presente
invención en la que la capa de reacción contiene además un
tensoactivo y un agente tamponador del pH, se puede eliminar la
disminución de la sensibilidad de la medición provocada por la
solubilidad oleosa de las grasas neutras en una muestra. A
continuación, se proporcionará una explicación en detalle de la
realización descrita anteriormente.
\newpage
En el biosensor de la presente realización, la
capa de reacción (70) contiene un tensoactivo. Al contener la capa
de reacción (70) el tensoactivo, se acelera la disolución en la capa
de reacción (70) de las grasas neutras contenidas en una muestra.
Como resultado, se puede disponer de un biosensor excelente en la
sensibilidad de la medición.
El tipo de tensoactivo contenido en la capa de
reacción (70) no está especialmente limitado y se puede utilizar un
tensoactivo conocido habitualmente. En la presente, el tensoactivo
se clasifica de manera amplia en tensoactivo catiónico, tensoactivo
aniónico, tensoactivo anfótero y tensoactivo no iónico y se puede
utilizar cualquiera de éstos. En la presente, como tensoactivo
catiónico se incluyen una sal de cetil trimetil amonio, una sal de
dodecil trimetil amonio o similar; como tensoactivo aniónico se
incluyen alquilsulfato sódico, una sal del ácido alquilbenceno
sulfónico, una sal del ácido cólico o similar; como tensoactivo
anfotérico, se incluyen lecitina, fosfatidil etanolamina,
lisolecitina o similar; y como tensoactivo no iónico se incluyen
acilsorbitano, glucósido de alquilo, un tensoactivo de base Tween,
un tensoactivo de base Triton, un tensoactivo de base Brij o
similar. Es evidente que se pueden utilizar tensoactivos distintos a
los indicados. Entre éstos, se utilizan preferentemente un
tensoactivo no iónico, más preferentemente un tensoactivo de base
Tween o un tensoactivo de base Triton.
El contenido del tensoactivo en la capa de
reacción (70) no está especialmente limitado y se puede ajustar,
según sea apropiado, en respuesta a la cantidad o similar de una
sustancia soluble oleosa en una solución de muestra. Como ejemplo,
en la capa de reacción (70) del biosensor (10) utilizado mediante la
adición de 0,5 a 10 \mul de una solución de muestra, normalmente
están contenidos de 0,1 a 500 \mug, preferentemente de 1 a 100
\mug, y más preferentemente de 1 a 50 \mug del tensoactivo.
Además, en el biosensor (10) de la presente
realización, la capa de reacción (70) contiene el agente tamponador
del pH. Al contener la capa de reacción (70) el agente tamponador
del pH, se aumenta adicionalmente la sensibilidad del biosensor
(10). La razón para esto se estima de la siguiente manera.
Concretamente, al disolver la capa de reacción (70) mediante la
adición de una solución de muestra, el pH de la capa de reacción
(70) puede variar dependiendo de la composición de la solución de
muestra. Como ejemplo de la variación de pH, en la capa de reacción
(70), se incluye la reducción del pH que acompaña a la liberación de
ácidos grasos provocada por la descomposición de grasas neutras en
una muestra. En la presente, debido a que el mecanismo del biosensor
(10) es una determinación indirecta de la cantidad de sustrato
oxidado por una enzima redox, la variación del pH en la capa de
reacción (70) da lugar a una diferencia ente el pH de la capa de
reacción (70) y el pH óptimo de la enzima que depende del tipo de
enzima, que puede conducir a disminuir la sensibilidad de la
medición de un sensor. Por otro lado, al contener la capa de
reacción (70) el agente tamponador del pH, se elimina dicha
variación de pH y se evita la disminución de la sensibilidad de
medición del sensor acompañado por una variación del pH.
El tipo de agente tamponador del pH contenido en
la capa de reacción (70) no está especialmente limitado y se puede
seleccionar, según sea apropiado, en respuesta al pH óptimo de una
enzima a utilizar y, como ejemplo, se incluyen
glicina-HCl, glicina-NaOH, ácido
cítrico-citrato sódico, MES-NaOH,
MOPS-NaOH, ácido fosfórico,
Tris-HCl, ácido acético o similar. Debería indicarse
que el pH del agente tamponador del pH es preferentemente de 6 a 9.
Además, estos agentes tamponadores del pH pueden estar contenidos
solos en la capa de reacción (70) o pueden estar contenidos dos o
más tipos combinados en la capa de reacción (70). Es natural que
pueda estar contenido en la capa de reacción (70) un agente
tamponador del pH diferente de éstos.
La capa de reacción puede contener además otros
componentes. Como otros componentes, por ejemplo, se incluyen un
polímero hidrofílico o un estabilizante de enzima o similar.
Al contener la capa de reacción el polímero
hidrofílico, es capaz de evitar la separación de la capa de reacción
de la superficie del sistema de electrodos. Además, el polímero
hidrofílico presenta el efecto de evitar la rotura de la superficie
de la capa de reacción y es eficaz en el aumento de la fiabilidad
del biosensor. Además, también es capaz de eliminar la adsorción de
un componente adsorbente, tal como una proteína o similar sobre el
sistema de electrodos. Dicho polímero hidrofílico no está
especialmente limitado y, por ejemplo, se incluyen celulosa, goma
guar, carboximetil celulosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropil
celulosa, metil celulosa, etil celulosa, carboximetil etil
celulosa, polivinilpirrolidona, polivinilalcohol, poliaminoácido,
tal como polilisina, ácido poliestireno sulfónico, gelatina, ácido
acrílico y una sal del mismo, ácido metacrílico y una sal del
mismo, almidón, anhídrido maleico y una sal del mismo, gel de
agarosa, ácido tánnico, pectina, caseína, carragenano,
furcellarano, pululano, colágeno, quitina, quitosano, condroitín
sulfato sódico, ácido lignin sulfónico, polivinil alcohol,
polivinilpirrolidona, poliacrilamida, polietilenglicol, y derivados
de los mismos. Al contener la capa de reacción (70) el ácido
tánnico, pectina, caseína, carragenano, furcellarano, pululano,
colágeno, quitina, quitosano, condroitín sulfato sódico, ácido
lignin sulfónico y un derivado de los mismos, entre éstos, se
elimina además la adsorción de un componente adsorbente sobre un
electrodo; se pueden utilizar preferentemente ácido tánnico,
pectina, caseína y derivados de los mismos. Debería indicarse que
estos polímeros hidrofílicos pueden estar contenidos solos en la
capa de reacción (70), o pueden estar contenidos dos o más tipos
combinados en la capa de reacción (70). Debería indicarse que la
cantidad de formulación de dicho polímero hidrofílico es, en
general, preferentemente de 0,1 a 1000 \mug, más preferentemente
de 1 a 500 \mug y, particularmente preferentemente de 5 a 100
\mug, por sensor.
La capa de reacción (70) puede ser una capa
configurada por una única capa o puede ser una capa configurada por
dos o más capas. Como ejemplo de la realización en la que la capa de
reacción (70) está configurada por dos capas se incluye, por
ejemplo, una realización, en la que la capa de reacción (70) está
configurada por una primera capa de reacción que tiene el mediador
de electrones y el polímero hidrofílico, pero que sustancialmente
no tiene la glicerol deshidrogenasa; y una segunda capa de reacción
formada sobre la capa superior de la primera capa de reacción, y
que tiene la glicerol deshidrogenasa y el polímero hidrofílico, pero
que sustancialmente no tiene el mediador de electrones. Además,
como ejemplo de la realización en la que la capa de reacción (70)
está configurada por tres capas se incluye, por ejemplo, una
realización, en la que la capa de reacción (70) está configurada
por una primera capa de reacción que tiene el mediador de electrones
y el polímero hidrofílico, pero que sustancialmente no tiene la
glicerol deshidrogenasa; una segunda capa de reacción formada sobre
la capa superior de la primera capa de reacción y que tiene el
polímero hidrofílico, pero que sustancialmente no tiene la glicerol
deshidrogenasa y el mediador de electrones; y una tercera capa de
reacción formada sobre la capa superior de la segunda capa de
reacción y que tiene la glicerol deshidrogenasa y el polímero
hidrofílico, pero que sustancialmente no tiene el mediador de
electrones.
Además, la capa de reacción (70) se forma sobre
la capa superior del sistema de electrodos en la realización
mostrada en el dibujo, aunque, en algunos casos, a diferencia de la
realización mostrada en el dibujo, la capa de reacción (70) se
puede formar, en la proximidad del sistema de electrodos, como la
realización en la que el sistema de electrodos y la capa de
reacción (70) no están en contacto directamente entre sí. Debería
indicarse que, como la realización en la que la capa de reacción
(70) se forma en "la proximidad" del sistema de electrodos, se
da como ejemplo una realización en la que se encuentra un espacio o
un filtro entre el sistema de electrodos y la capa de reacción
(70), o una realización en la que la capa de reacción (70) se forma
entre un puerto de suministro de muestra y el sistema de
electrodos.
Anteriormente, se ha dado la explicación en
detalle de la configuración del biosensor (10) de la presente
invención, aunque, la configuración no está limitada a la
realización anterior, y se pueden realizar varias mejoras en
referencia a los conocimientos habituales, según sea apropiado. Como
conocimiento habitualmente conocido se incluye, por ejemplo,
JP-A-2-062952,
JP-A-5-87768,
JP-A-11-201932 o
similar.
A continuación, se dará una explicación sobre la
acción del biosensor (10) de la presente invención.
En primer lugar, se suministra a la capa de
reacción (70) del biosensor (10) una cantidad predeterminada de una
muestra que contiene un componente cuya concentración se desea
medir. La realización específica de la muestra no está
especialmente limitada y se puede utilizar, según sea apropiado, una
solución que contiene grasas neutras como sustrato de la glicerol
deshidrogenasa utilizado para el biosensor (10). Como muestra, por
ejemplo, se utiliza una muestra biológica, tal como sangre, orina,
saliva o similar; alimentos, tales como frutas, vegetales, materias
primas de alimentos procesados y similar; o similar. Sin embargo,
como muestras también se pueden utilizar otras soluciones. Además,
la utilización de una solución de muestra, en particular, con un
contenido elevado de grasas neutras es capaz de provocar además un
efecto de la presente invención. Debería indicarse que, como
muestra, se puede utilizar una solución de almacenamiento sin
dilución, o también se puede utilizar una solución diluida con un
disolvente adecuado, con el objetivo de ajustar la viscosidad o
similar. La realización para suministrar la muestra a la capa de
reacción (70) no está especialmente limitada y se puede suministrar
una cantidad predeterminada de la muestra mediante el goteo vertical
y directo a la capa de reacción (70), o se puede suministrar la
muestra desde una dirección horizontal a la capa de reacción (70)
mediante un medio de suministro de muestra proporcionado por
separado.
Cuando se suministra una muestra a la capa de
reacción (70), las grasas neutras, que es un sustrato en la
muestra, se descompone en glicerol y ácidos grasos mediante la
acción de la lipoproteína lipasa contenida en la capa de reacción
(70). A continuación, el glicerol liberado se oxida mediante la
acción de la glicerol deshidrogenasa y emite electrones a la vez
que la propia oxidación. Los electrones emitidos desde el sustrato
son capturados mediante un mediador de electrones y el propio
mediador de electrones cambia de un tipo oxidado a un tipo
reducido, que acompaña al mismo. Después de la adición de la
muestra, mientras se deja el biosensor (10) tal como está, durante
un tiempo predeterminado, las grasas neutras en la muestra se oxidan
completamente, mediante la acción de la lipoproteína lipasa y la
glicerol deshidrogenasa, y una cierta cantidad de los mediadores de
electrones se convierten de un tipo oxidado a un tipo reducido. El
tiempo para dejar que se complete la reacción entre las grasas
neutras en la muestra y una enzima no está especialmente limitado,
aunque, el biosensor (10) se puede dejar normalmente durante 0 a 5
minutos, preferentemente durante 0 a 3 minutos después de la
adición de la muestra.
Posteriormente, con el objetivo de oxidar el
mediador de electrones del tipo reducido, se aplica un voltaje
predeterminado ente el electrodo de trabajo (44) y el
contraelectrodo (46) a través del sistema de electrones. Esta
aplicación de voltaje hace que la corriente (a continuación también
referida como "corriente de oxidación") fluya en la capa de
reacción (70) y por esta corriente, el mediador de electrones de
tipo reducido a su vez se oxida electroquímicamente y se convierte
en el tipo oxidado. La cantidad de mediador de electrones de tipo
reducido antes de la aplicación del voltaje se puede calcular a
partir del valor de la corriente de oxidación medida aquí, y se
puede determinar la cantidad adicional de glicerol reaccionado con
la glicerol deshidrogenasa; y finalmente, se puede calcular la
concentración de grasas neutras en la muestra. El valor del voltaje
aplicado en la corriente de oxidación que fluye no está
especialmente limitado y se puede ajustar, según sea apropiado, con
referencia al conocimiento conocido habitualmente; como ejemplo, se
puede aplicar un voltaje de aproximadamente -200 a 700 mV,
preferentemente de 0 a 600 mV entre el electrodo de referencia (42)
y el electrodo de trabajo (44). El medio de aplicación del voltaje
para la aplicación del voltaje no está especialmente limitado y se
puede utilizar, según sea apropiado, un medio de aplicación de
voltaje habitualmente conocido.
Según otra realización de la presente invención,
se da a conocer un método para medir la concentración de grasas
neutras en una muestra que utiliza el biosensor (10) descrito
anteriormente.
Como método para medir el valor de la corriente
de oxidación y para convertir el valor de la corriente en la
concentración de sustrato, se puede utilizar un método de
cronoamperometría para medir el valor de corriente después de un
cierto tiempo desde la aplicación de un voltaje predeterminado, o un
método de cronocoulometría para medir la cantidad de carga obtenida
mediante la integración de la respuesta de corriente medida mediante
el método de cronoamperometría con el tiempo. En vista de la
capacidad de medición por un sistema de aparatos sencillos, se
puede utilizar preferentemente el método de cronoamperometría.
Anteriormente, se proporcionó una explicación de
ejemplos de realizaciones para el cálculo de la concentración de
grasas neutras mediante la medición de la corriente en la oxidación
del mediador de electrones de tipo reductor (corriente de
oxidación), aunque, también se pueden adoptar realizaciones para el
cálculo de la concentración de grasas neutras mediante la medición
de la corriente en la reducción del mediador de electrones de tipo
oxidante que no se ha reducido (corriente de reducción).
A continuación, se proporcionará una explicación
específica de la presente invención, aunque, estos ejemplos no
deberían limitar la presente invención.
En una solución de tampón fosfato 10 mM (pH 7)
que contenía 0,2% de Triton X-100, que contenía DCIP
50 \muM, PMS 0,2 mM y glicerol 400 mM, se disolvió la glicerol
deshidrogenasa de tipo dependiente de PQQ para preparar una
solución de la glicerol deshidrogenasa de tipo dependiente de PQQ.
Se siguió una reacción entre una enzima y un sustrato contenido en
la solución mediante el cambio de absorbancia de DCIP a 600 nm y la
velocidad de reducción de la absorbancia se definió como la
velocidad de reacción de la enzima, y la actividad de la enzima que
redujo 1 \mumol de DCIP en 1 minuto se definió como 1 unidad (U).
Debería indicarse que la absorbancia molar de DCIP a un pH de 7,0
fue 16,3 mM^{-1}.
Ejemplo de referencia
1
En un matraz Sakaguchi de 500 ml, se
transfirieron 400 ml de medio de cultivo compuesto de sorbitol (2%
en peso), extracto de levadura (0,3% en peso), extracto de carne
(0,3% en peso), licor de maíz fermentado (0,3% en peso), polipeptona
(1% en peso), urea (0,1% en peso), KH_{2}PO_{4} (0,1% en peso),
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,02% en peso), CaCl_{2} (0,1% en
peso), con un pH de 7,0, en 100 ml por matraz, y se puso en un
autoclave a 121ºC durante 20 minutos.
Como inóculo, se inoculó una cepa de
Gluconobacter Oxydans NBRC 3291 mediante un asa de platino y se
cultivó a 30ºC durante 24 horas para realizar un medio de cultivo
de base.
A continuación, se transfirieron 6,6 l del medio
de cultivo preparado con la misma composición anterior a un
fermentador en jarra de 10 l y se puso en un autoclave a 121ºC
durante 20 minutos, seguido de un enfriamiento gradual y la
posterior transferencia de 400 ml del medio de cultivo de base, que
se cultivó bajo 750 rpm y una cantidad de aire de 7 l/minuto, a
30ºC durante 24 horas.
El medio de cultivo se sometió a una separación
centrífuga para recoger las células bacterianas, las cuales se
suspendieron con agua destilada, y posteriormente, las células
bacterianas se destruyeron con una prensa francesa. La solución que
contenía las células bacterianas destruidas se sometieron a una
separación centrífuga y el sobrenadante resultante se sometió a una
separación ultracentrífuga para obtener una fracción de membrana
como precipitado. Esta fracción de membrana se suspendió en una
solución tampón de Tris-clorhidrato 10 mM (pH
8,0), se añadió con Triton X-100 para que la
concentración final fuera del 1% y, a continuación, se agitó a 4ºC
durante 2 horas. El sobrenadante obtenido mediante separación
ultracentrífuga se dializó durante toda la noche con una solución
de tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía un 0,2% en peso de
Triton X-100 y ésta se utilizó como fracción de
membrana solubilizada. Esta fracción de membranas solubilizada se
separó mediante FPLC, utilizando ResourceQ (6 ml), y la fracción
activada resultante se dializó durante toda la noche con una
solución de tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía un 0,2% en
peso de Triton X-100, y posteriormente, se sometió
a liofilización para producir una preparación de proteínas auténtica
en enzimas con una actividad específica de 3 U/mg. A esta glicerol
deshidrogenasa derivada de Gluconobacter Oxydans se le puede hacer
referencia a continuación simplemente como "GlyDH".
Como sustrato del sensor formado con un sistema
de electrodos, se preparó un electrodo sensor comercial (fabricado
por BVT Co., Ltd; AC1.W5.R1). En este sustrato del sensor, el
sistema de electrodos tiene un diámetro de aproximadamente 6 mm y
forma casi circular. Además, en la parte superior del sistema de
electrodos preparado anteriormente, se adhirió una lámina PET, con
un grosor de 0,2 mm y que tenía un agujero con un diámetro de 6 mm,
para formar un separador. En el interior del agujero del separador
en el sistema de electrodos, se dejaron caer 10 \mul de solución
salina tamponada con fosfato mezclada con GlyDH (20 U/ml) obtenida
en el Ejemplo de referencia 1 anterior, la lipoproteína lipasa
(fabricada por Amano Enzyme Inc., 10.000 U/ml) y metilsulfato de
1-metoxi-5-metilfenazinio
(fabricado por DOJINDO Laboratories, 10 mmol/l; a continuación
referido como "m-PMS") como el mediador de
electrones, y se secó a temperatura ambiente para formar la capa de
reacción.
Sobre esta capa de reacción, se dejaron caer 10
\mul de una muestra líquida que contenía 50 mg/dl de trioleína.
La trioleína contenida en la muestra se hidrolizó a ácido graso y el
glicerol por la lipoproteína lipasa, y este glicerol fue oxidado
por GlyDH, y simultáneamente se redujo el mediador de electrones en
la capa de reacción.
Después de 5 minutos de dejar caer la muestra,
se aplicó un voltaje de +150 mV en el electrodo de trabajo en
relación con el electrodo de referencia, para medir el valor de la
corriente de oxidación del mediador de electrones. En esta
medición, se utilizó un sistema de medición electroquímico
HZ-5000 (fabricado por Hokuto Denko Corp., HAG 1512
m/BP). Este valor de corriente (corriente de respuesta) es
proporcional a la concentración de un reductor del mediador de
electrones, concretamente la concentración de trioleína en la
muestra. Mediante la medición de este valor de corriente, se evaluó
la concentración de trioleína en la muestra.
Debería indicarse que la muestra se obtuvo
mediante la disolución de trioleína (fabricada por Tokio Chemical
Industry Co., Ltd.) en solución salina tamponada con fosfato que
contenía un 10% en peso de Triton X-100.
A continuación, se midió la corriente de
respuesta de manera similar a anteriormente, a excepción de que la
cantidad de trioleína contenida en la muestra varió a 0 mg/dl, 100
mg/dl, 150 mg/dl y 200 mg/dl. En la figura 4 se muestra el
resultado de la representación del valor de corriente un segundo
después de la aplicación del voltaje en muestras que contenían cada
concentración de trioleína.
Tal como se muestra en la figura 4, se observó
una buena linealidad entre el valor de la corriente de respuesta y
la concentración de trioleína.
Después de dejar caer una solución acuosa del
0,5% (p/v) de carboximetil celulosa sódica (fabricada por Wako Pure
Chemical Industries Ltd; a continuación se puede hacer referencia
como "CMC") sobre el sistema de electrodos utilizado en el
ejemplo 1-1, y secarse, se dejaron caer una solución
de CMC al 0,5% que contenía GlyDH (20 U/ml) obtenida en el ejemplo
de referencia 1, la lipoproteína lipasa (10.000 U/ml) y
m-PMS (10 mmol/l), y se secó para formar la capa de
reacción.
La correlación entre el valor de la corriente de
respuesta y la concentración de trioleína se estudió de manera
similar al ejemplo 1-1, mediante la utilización del
biosensor. El resultado se muestra en la figura 5.
Tal como se muestra en la figura 5, aunque el
valor de la corriente de respuesta resultante se redujo un poco
debido al efecto de CMC, se observó una correlatividad superior
entre el valor de la corriente de respuesta y la concentración de
grasas neutras en comparación con el ejemplo
1-1.
Como sustrato del sensor formado con el sistema
de electrodos, se preparó un electrodo sensor comercial (fabricado
por BVT Co., Ltd; AC1.W5.R1). En este sustrato del sensor, el
sistema de electrodos tiene un diámetro de aproximadamente 6 mm y
forma casi circular. Además, en la parte superior del sistema de
electrodos preparado anteriormente, se adhirió una lámina PET, con
un grosor de 0,2 mm y que tenía un agujero con un diámetro de 6 mm,
para formar un separador.
Por otro lado, se añadieron a la solución de
tampón fosfato (PBS) con un pH de 7,0, GlyDH (30 U/ml), como enzima
redox obtenida en el ejemplo de referencia anterior, la lipoproteína
lipasa (Amano Enzyme Inc., 10.000 U/ml) y metilsulfato de
1-metoxi-5-metilfenazinio
(a continuación referido como "m-PMS"), como
mediador de electrones, (fabricado por DOJINDO Laboratories, 10
mM), carboximetil celulosa (CMC) (0,5% en peso) y Triton
X-100 (2% en peso), como tensoactivo, para preparar
una composición para formar la capa de reacción.
En el interior del agujero del separador, se
dejaron caer 10 \mul de la composición para formar la capa de
reacción preparada anteriormente y se secó a temperatura ambiente
para formar la capa de reacción.
Además, para preparar la solución de muestra, se
disolvió trioleína (fabricada por Tokio Chemical Industry Co.,
Ltd.) en la solución salina tamponada con fosfato con un pH 7,0
(PBS) que contenía un 10% en peso de Triton X-100,
para que la concentración fuera de 100 mg/dl.
Sobre la capa de reacción anterior, se dejaron
caer 10 \mul de una solución de muestra preparada. La trioleína
en la solución de muestra fue hidrolizada en ácidos grasos (ácido
oleico) y glicerol por la lipoproteína lipasa y este glicerol fue
oxidado por GlyDH y simultáneamente se reduce el mediador de
electrones (m-PMS) en la capa de reacción.
Después de 30 segundos a partir de la caída de
la muestra, se aplicó un voltaje de +150 mV en el electrodo de
trabajo en relación con el electrodo de referencia, para medir el
valor de la corriente de oxidación del mediador de electrones. En
esta medición, se utilizó un sistema de medición electroquímico
HZ-5000 (fabricado por Hokuto Denko Corp., HAG 1512
m/BP). Este valor de corriente (corriente de respuesta) es
proporcional a la concentración del mediador de electrones de tipo
reducido, concretamente la concentración de trioleína en la
muestra.
A continuación, se midió el valor de la
corriente de oxidación mediante un método similar al anterior, a
excepción de que la concentración de trioleína en la solución de
muestra se cambió a 300 mg/dl y 500 mg/dl. Además, como muestra de
control, se preparó una solución de muestra que no contenía
trioleína y se midió de forma similar el valor de la corriente de
oxidación. El valor de corriente de oxidación medido se representó
en un gráfico. Este gráfico se muestra en la figura 6. En el
gráfico mostrado en la figura 6, una mayor inclinación significa
una mayor sensibilidad de medición del sensor. En el presente
ejemplo, se puede obtener un gráfico que muestra una inclinación
relativamente grande, tal como se muestra en la figura 6. Por lo
tanto, se observa que, según el presente ejemplo, se dispone de un
sensor excelente en la sensibilidad de medición.
Se formaron un separador y una capa de reacción
sobre un sustrato del sensor mediante un método similar al del
ejemplo 2-1 anterior, a excepción de que no se
añadió el Triton X-100 como tensoactivo en la
preparación de la composición para formar la capa de reacción, para
medir la corriente de oxidación (corriente de respuesta) después de
la adición de la solución de muestra. En la figura 6 se muestra un
gráfico en el que se representaron los resultados obtenidos. En el
presente ejemplo, tal como se muestra en la figura 6, se observa
cierto grado de linealidad, aunque la inclinación del gráfico
resultante es pequeña.
Se formaron un separador y una capa de reacción
sobre un sustrato del sensor mediante un método similar al del
ejemplo 2-1 anterior, a excepción de que se utilizó
agua destilada en lugar de la solución salina tamponada con fosfato
en la preparación de la composición para formar una capa de
reacción, para medir la corriente de oxidación (corriente de
respuesta) después de la adición de la solución de muestra. En la
figura 6 se muestra un gráfico en el que se representaron los
resultados obtenidos. En el presente ejemplo, tal como se muestra
en la figura 6, se observa cierto grado de linealidad, aunque la
inclinación del gráfico resultante es pequeña.
Claims (15)
1. Biosensor para medir la concentración de
grasas neutras en base al valor de la corriente que fluye en un
sistema de electrodos, que comprende:
un sustrato aislante;
un sistema de electrodos que tiene un electrodo
de trabajo y un contraelectrodo, formado sobre dicho sustrato
aislante, y
una capa de reacción que tiene una lipoproteína
lipasa, una glicerol deshidrogenasa del tipo dependiente de
coenzima y un mediador de electrones, formada en la parte superior o
en la proximidad de dicho sistema de electrones;
caracterizado porque dicha coenzima es
pirrolo-quinolina quinona o flavín adenín
dinucleótido.
2. Biosensor, según la reivindicación 1, en el
que dicho sistema de electrodos comprende además un electrodo de
referencia.
3. Biosensor, según la reivindicación 1 ó 2, en
el que dicho mediador de electrones es de un tipo o de dos o más
tipos seleccionados del grupo que consiste en un ion ferricianuro,
p-benzoquinona y un derivado de
p-benzoquinona, metosulfato de fenacina y un
derivado de metosulfato de fenacina, azul de metileno, tionina,
carmín de índigo, galocianina, safranina, ferroceno y un derivado
del mismo, \alpha-naftoquinona y un derivado de
\alpha-naftoquinona.
4. Biosensor, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha capa de reacción
comprende además un tensoactivo y un agente de tamponador del
pH.
5. Biosensor, según la reivindicación 4, en el
que dicho tensoactivo es un tensoactivo no iónico.
6. Biosensor, según la reivindicación 4 ó 5, en
el que el pH de dicho agente tamponador del pH es de 6 a 9.
7. Biosensor, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha capa de reacción
comprende además un polímero hidrofílico.
8. Biosensor, según la reivindicación 7, en el
que dicho polímero hidrofílico es de un tipo o de dos o más tipos
seleccionados del grupo que consiste en ácido tánnico, pectina,
caseína, carragenano, furcellarano, pululano, colágeno, quitina,
quitosano, condroitín sulfato sódico, ácido lignin sulfónico y
derivados de los mismos.
9. Biosensor, según la reivindicación 7 u 8, en
el que dicha capa de reacción comprende:
una primera capa de reacción que tiene dicho
mediador de electrones y dicho polímero hidrofílico, pero que
sustancialmente no tiene dicha glicerol deshidrogenasa; y
una segunda capa de reacción formada sobre la
capa superior de dicha primera capa de reacción, y que tiene dicha
glicerol deshidrogenasa y dicho polímero hidrofílico, pero que
sustancialmente no tiene dicho mediador de electrones.
10. Biosensor, según la reivindicación 9, en el
que se forma una tercera capa de reacción que consiste esencialmente
en dicho polímero hidrofílico, entre dicha primera capa de reacción
y dicha segunda capa de reacción.
11. Biosensor, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se forma una capa aislante
que tiene una parte de abertura de forma casi rectangular en la
capa superior de dicho sistema de electrodos, caracterizado
porque el área expuesta de dicha parte de abertura de dicho
contraelectrodo es de 1,2 a 3,0 veces el área expuesta desde dicha
parte de abertura de dicho electrodo de trabajo.
12. Biosensor, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además una parte de
conducción y una parte de conexión para fabricar dicho sistema de
electrodos conducido eléctricamente al exterior del biosensor, en
el que el material que configura dicho sistema de electrodos es un
material de carbono, como componente principal, con un valor de
resistividad de la superficie igual o inferior a 100
\Omega/\Box, en un grosor de 10 \mum, y el material que
configura dicha parte de conducción y dicha parte de conexión es un
material de metal, como componente principal, con un valor de
resistividad de la superficie igual o inferior a 50
\Omega/\Box, en un grosor de 10 \mum.
13. Biosensor, según la reivindicación 12, en el
que dicho metal es de un tipo o dos o más tipos de metales
seleccionados del grupo que consiste en plata, oro, platino y
paladio.
14. Biosensor, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha glicerol deshidrogenasa
es una glicerol deshidrogenasa modificada químicamente modificada
con un reactivo de reticulación bivalente, en presencia de un
tensoactivo.
15. Biosensor, según la reivindicación 14, en el
que dicha glicerol deshidrogenasa deriva de bacterias que
pertenecen a Gluconobacter.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005-96427 | 2005-03-29 | ||
| JP2005095169 | 2005-03-29 | ||
| JP2005096427 | 2005-03-29 | ||
| JP2005-95169 | 2005-03-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2331533T3 true ES2331533T3 (es) | 2010-01-07 |
Family
ID=37053335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06730046T Expired - Lifetime ES2331533T3 (es) | 2005-03-29 | 2006-03-27 | Biosensor. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20090236222A1 (es) |
| EP (1) | EP1873516B1 (es) |
| JP (1) | JP4700687B2 (es) |
| KR (1) | KR101226264B1 (es) |
| CN (1) | CN101151526B (es) |
| CA (1) | CA2603123C (es) |
| DE (1) | DE602006010048D1 (es) |
| ES (1) | ES2331533T3 (es) |
| WO (1) | WO2006104077A1 (es) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0526051D0 (en) | 2005-12-21 | 2006-02-01 | Oxford Biosensors Ltd | Cholesterol sensor |
| KR101069310B1 (ko) | 2007-11-02 | 2011-10-05 | 건국대학교 산학협력단 | 도파민, 아스코빅산 및 요산의 동시 검출이 가능한 전도성고분자 전극을 이용한 바이오센서 및 그 제조방법 |
| EP3187866B1 (en) * | 2007-12-10 | 2019-04-17 | Ascensia Diabetes Care Holdings AG | Electrochemical test sensor |
| EP2329255A4 (en) * | 2008-08-27 | 2014-04-09 | Edwards Lifesciences Corp | analyte |
| US8721870B2 (en) * | 2009-03-19 | 2014-05-13 | Edwards Lifesciences Corporation | Membrane system with sufficient buffering capacity |
| JP5627858B2 (ja) * | 2009-03-31 | 2014-11-19 | シーシーアイ株式会社 | バイオセンサ |
| CN102959392B (zh) | 2010-03-31 | 2015-02-18 | Cci株式会社 | 生物传感器 |
| US20120122197A1 (en) * | 2010-11-12 | 2012-05-17 | Abner David Jospeh | Inkjet reagent deposition for biosensor manufacturing |
| JP2012211810A (ja) * | 2011-03-31 | 2012-11-01 | Cci Corp | 測定精度を向上させたバイオセンサ |
| JP5684767B2 (ja) * | 2011-09-26 | 2015-03-18 | アークレイ株式会社 | 乳酸センサ |
| JP5979937B2 (ja) * | 2012-03-29 | 2016-08-31 | シーシーアイ株式会社 | トリスホウ酸を含むバイオセンサ |
| JP2014089096A (ja) * | 2012-10-30 | 2014-05-15 | Murata Mfg Co Ltd | バイオセンサ |
| WO2015066819A1 (en) * | 2013-11-08 | 2015-05-14 | Carlos Filipe | Method of stabilizing molecules without refrigeration using water soluble polymers and applications thereof in performing chemical reactions |
| WO2015147594A1 (ko) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 이중 전극쌍을 이용한 전기화학 바이오 센서 |
| JP6300353B2 (ja) * | 2014-03-31 | 2018-03-28 | シーシーアイ株式会社 | 保存安定性を向上させたバイオセンサ |
| KR101535750B1 (ko) * | 2014-08-11 | 2015-07-09 | 경북대학교 산학협력단 | 화학 센서 |
| EP3156788B1 (en) * | 2015-10-15 | 2018-12-26 | ARKRAY, Inc. | Biosensor |
| EP3156789B1 (en) * | 2015-10-15 | 2024-01-03 | ARKRAY, Inc. | Biosensor |
| WO2017123205A1 (en) | 2016-01-12 | 2017-07-20 | Honeywell International Inc. | Electrochemical sensor |
| KR101894183B1 (ko) | 2017-03-17 | 2018-08-31 | 가천대학교 산학협력단 | 광 도파로 센서 및 이를 이용한 농도 측정 시스템 |
| KR102464005B1 (ko) * | 2017-04-25 | 2022-11-07 | 한국전자기술연구원 | 바이오마커 검출용 전기화학센서 및 이를 이용한 바이오마커의 검출방법 |
| CN107064261A (zh) * | 2017-05-01 | 2017-08-18 | 台州亿联健医疗科技有限公司 | 一种基于葡萄糖脱氢酶的生物传感器及检测方法 |
| US20180319283A1 (en) * | 2017-05-08 | 2018-11-08 | Bell Helicopter Textron Inc. | Aircraft Power System |
| FR3069323B1 (fr) * | 2017-07-20 | 2023-10-20 | Lsee | Bandelettes electrochimiques permettant le suivi de la degradation des graisses de l'organisme et leur procede de preparation |
| US20190056345A1 (en) * | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Tyson Bioresearch Inc. | Method of operation of a meter |
| US10365242B2 (en) * | 2017-10-04 | 2019-07-30 | King Fahd University Of Petroleum And Minerals | Electrochemical cell for detecting hydroquinone |
| KR102097421B1 (ko) | 2018-06-14 | 2020-04-06 | 가천대학교 산학협력단 | 광 도파로 센서 및 이를 이용한 측정 물질 검출 시스템 |
| CN113008951B (zh) * | 2019-12-20 | 2024-04-19 | 利多(香港)有限公司 | 一种生物传感器及其在检测血液样品凝血指标中的应用 |
| CN113564943A (zh) * | 2021-07-09 | 2021-10-29 | 天津工业大学 | 一种电子介体强化的靛蓝全细胞还原染色方法 |
| KR102589481B1 (ko) * | 2021-09-23 | 2023-10-16 | 주식회사 위즈맥 | 조립형 세포 측정 기구 |
| GB2615805B (en) | 2022-02-21 | 2026-03-18 | Univ Of The West Of England Bristol | Biosensor for triglycerides |
| CN115266865B (zh) * | 2022-07-29 | 2024-04-16 | 北京大学 | 一种提高电化学传感器稳定性的方法 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5548392A (en) * | 1978-02-17 | 1980-04-07 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel immobilizing material combined with biologically active substance, its preparation, device comprising it, method, and preparation of support |
| JPS5816693B2 (ja) * | 1978-04-21 | 1983-04-01 | 松下電器産業株式会社 | 電極 |
| DE3311027A1 (de) * | 1983-03-25 | 1984-09-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Nad(p)-unabhaengige glycerindehydrogenase, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung von glycerin und triglyceriden |
| JPS59210356A (ja) | 1983-05-13 | 1984-11-29 | Kuraray Co Ltd | トリグリセライドセンサ |
| JPS59228158A (ja) | 1983-06-09 | 1984-12-21 | Jeol Ltd | 中性脂質センサ− |
| JPS62177443A (ja) | 1986-01-31 | 1987-08-04 | Seitai Kinou Riyou Kagakuhin Shinseizou Gijutsu Kenkyu Kumiai | 脂質センサ |
| JPH03229144A (ja) * | 1989-05-31 | 1991-10-11 | Nakano Vinegar Co Ltd | 酵素センサー |
| JP2508276B2 (ja) * | 1989-07-03 | 1996-06-19 | 富士ゼロックス株式会社 | 熱転写記録フィルム |
| JP3041840B2 (ja) * | 1992-02-24 | 2000-05-15 | 東洋紡績株式会社 | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 |
| JPH0690754A (ja) * | 1992-09-10 | 1994-04-05 | Masao Karube | スペーサーを介してメディエータで修飾した酵素及びそれを用いたセンサー |
| JP2636637B2 (ja) * | 1992-06-18 | 1997-07-30 | 住友金属工業株式会社 | 酵素電極の製造方法 |
| US5651869A (en) * | 1995-02-28 | 1997-07-29 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Biosensor |
| JP3654956B2 (ja) * | 1995-05-29 | 2005-06-02 | バイオトレース リミテッド | 残留物の検出方法及び残留物検出キット |
| DE69810194T2 (de) * | 1997-06-03 | 2003-11-20 | Matsushita Electric Industrial Co. Ltd., Osaka | Cholesterinsensor |
| JP3487409B2 (ja) * | 1997-06-03 | 2004-01-19 | 松下電器産業株式会社 | コレステロールセンサ |
| JP4364331B2 (ja) * | 1998-12-24 | 2009-11-18 | 旭化成株式会社 | 酵素を用いる分析方法 |
| AU758153B2 (en) * | 1999-03-19 | 2003-03-13 | Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory | Method of quantifying substrate and biosensor |
| JP2001021526A (ja) * | 1999-07-02 | 2001-01-26 | Akebono Brake Res & Dev Center Ltd | バイオセンサーを用いた試料溶液の測定方法 |
| CA2356364C (en) * | 1999-11-22 | 2003-12-09 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Cholesterol sensor and method for determining cholesterol |
| JP4603655B2 (ja) | 2000-05-31 | 2010-12-22 | 株式会社テクノメデイカ | 中性脂肪測定用センサ |
| JP2002100684A (ja) * | 2000-09-25 | 2002-04-05 | Ricoh Co Ltd | 半導体装置 |
| US6447657B1 (en) * | 2000-12-04 | 2002-09-10 | Roche Diagnostics Corporation | Biosensor |
| US7132642B2 (en) * | 2001-07-09 | 2006-11-07 | Nartron Corporation | Anti-entrapment systems for preventing objects from being entrapped by translating devices |
| US7074519B2 (en) * | 2001-10-26 | 2006-07-11 | The Regents Of The University Of California | Molehole embedded 3-D crossbar architecture used in electrochemical molecular memory device |
| GB0204232D0 (en) * | 2002-02-22 | 2002-04-10 | Isis Innovation | Assay |
| EP1482307B1 (en) * | 2002-03-01 | 2007-10-03 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Biosensor |
| JP4180933B2 (ja) * | 2003-01-31 | 2008-11-12 | 旭化成株式会社 | Ｎａｄまたは還元型ｎａｄ濃度測定用電極系と測定方法 |
| JP2004271746A (ja) * | 2003-03-06 | 2004-09-30 | Fuji Xerox Co Ltd | 画像形成装置 |
| EP1811666A1 (en) * | 2006-01-19 | 2007-07-25 | 3M Innovative Properties Company | Proximity sensor and method for manufacturing the same |
| KR101368597B1 (ko) * | 2009-03-31 | 2014-02-27 | 코오롱인더스트리 주식회사 | 투명전극, 전도성 적층체 및 전도성 수지막 |
-
2006
- 2006-03-27 DE DE602006010048T patent/DE602006010048D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2006-03-27 JP JP2007510476A patent/JP4700687B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2006-03-27 WO PCT/JP2006/306098 patent/WO2006104077A1/ja not_active Ceased
- 2006-03-27 KR KR1020077021705A patent/KR101226264B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2006-03-27 CN CN2006800104998A patent/CN101151526B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-27 CA CA2603123A patent/CA2603123C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-27 EP EP06730046A patent/EP1873516B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2006-03-27 US US11/910,382 patent/US20090236222A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-27 ES ES06730046T patent/ES2331533T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-12-21 US US15/387,054 patent/US9957542B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101226264B1 (ko) | 2013-01-25 |
| CN101151526B (zh) | 2012-05-30 |
| DE602006010048D1 (en) | 2009-12-10 |
| CA2603123A1 (en) | 2006-10-05 |
| CN101151526A (zh) | 2008-03-26 |
| CA2603123C (en) | 2014-01-28 |
| JP4700687B2 (ja) | 2011-06-15 |
| EP1873516B1 (en) | 2009-10-28 |
| WO2006104077A1 (ja) | 2006-10-05 |
| US20090236222A1 (en) | 2009-09-24 |
| EP1873516A1 (en) | 2008-01-02 |
| US20170101661A1 (en) | 2017-04-13 |
| US9957542B2 (en) | 2018-05-01 |
| EP1873516A4 (en) | 2008-05-07 |
| JPWO2006104077A1 (ja) | 2008-09-04 |
| KR20070116608A (ko) | 2007-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9957542B2 (en) | Biosensor | |
| US6656702B1 (en) | Biosensor containing glucose dehydrogenase | |
| JP3621084B2 (ja) | バイオセンサ | |
| US6214612B1 (en) | Cholesterol sensor containing electrodes, cholesterol dehydrogenase, nicotinamide adenine dinucleotide and oxidized electron mediator | |
| JPH1144667A (ja) | バイオセンサ | |
| JP3027306B2 (ja) | バイオセンサおよびその製造方法 | |
| JP2009244013A (ja) | 中性脂肪測定用バイオセンサ | |
| Reddy et al. | Selective membranes for the construction and optimization of an amperometric oxalate enzyme electrode | |
| JP3529081B2 (ja) | コレステロールセンサおよびその製造方法 | |
| JPH09297121A (ja) | コレステロールセンサ | |
| JP2009247289A (ja) | グルコースの定量方法ならびに定量組成物 | |
| JP3770757B2 (ja) | バイオセンサ | |
| JP5419779B2 (ja) | バイオセンサ | |
| JP5627858B2 (ja) | バイオセンサ | |
| JP3070818B2 (ja) | バイオセンサおよびその製造方法 | |
| JP2009236829A (ja) | バイオセンサ | |
| JPH10239273A (ja) | グルコースセンサ | |
| JP3297623B2 (ja) | バイオセンサ | |
| JP2010237145A (ja) | バイオセンサ | |
| JP2002333420A (ja) | バイオセンサおよび基質の定量方法 | |
| JP4691378B2 (ja) | バイオセンサを用いた基質の測定方法 | |
| JP5562098B2 (ja) | バイオセンサ | |
| JP2012211810A (ja) | 測定精度を向上させたバイオセンサ | |
| JP2009244012A (ja) | バイオセンサ |