ES2337986T3 - Dominios de union de antigenos de peces. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la producción de dominio de unión a antígeno específico de antígeno utilizando un huésped transformado que contenga una secuencia DNA expresable que codifique el dominio de unión a antígeno específico de antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno específico de antígeno se derive de una región variable del isotipo NAR encontrado en especies de la subclase de los elasmobranquios en donde la especificidad del dominio de unión a antígeno específico de antígeno viene determinada por un antígeno que se introduce en un miembro de la subclase de los elasmobranquios.
Description
Dominios de unión de antígenos de peces.
La presente invención se refiere a la producción
de dominios de unión a antígenos específicos de antígenos
(anticuerpos de dominio individual) de los peces, donde el término
pez abarca tanto los cartilaginosos (subclase elasmobranquios) como
los peces óseos (clase osteictios). Por dominios de unión a
antígenos específicos de antígenos entendemos la región variable de
un Receptor de Antígeno Nuevo (NAR).
Los anticuerpos, especialmente los anticuerpos
monoclonales, son útiles, entre otros, para los diagnósticos
moleculares y terapéuticos debido a su alta unión, afinidad y
especificidad. Sin embargo, aunque ahora resulta relativamente
simple producir anticuerpos monoclonales utilizando modelos
animales, sigue resultando difícil la producción de anticuerpos
monoclonales humanos. Como se apreciará, cuando se introducen en
humanos los anticuerpos monoclonales de modelos no humanos, el
cuerpo prepara una respuesta autoinmune porque el anticuerpo
monoclonal es extraño al sistema humano.
Recientemente, se ha apreciado que la actividad
del anticuerpo monoclonal puede retenerse al tiempo que se reduce
su rechazo en humanos al producir anticuerpos de unión individual
(sda) de la cadena variable del anticuerpo correspondiente. La
solicitud de patente europea número 89311731.7 presenta dichos
anticuerpos de dominio individual y métodos para su producción en
ratones.
Los anticuerpos de dominio individual también
son importantes ya que pueden penetrar en los tejidos llevándose
con ellos cualquier compuesto vinculado. Además, pueden unirse
dentro de cavidades en la superficie de las proteínas, por ejemplo,
dentro de centros de unión de enzimas interrumpiendo, por tanto, la
función.
Los anticuerpos de dominio individual producidos
de camélidos han demostrado reconocer las cavidades de las
proteínas y, como tales, tienen la capacidad de inhibir enzimas
(Lauwereys et al. EMBO 17 pp3512-3520
1998).
Aunque el tamaño pequeño de los anticuerpos de
dominio individual producidos por camélidos ha permitido el
reconocimiento de cavidades de proteínas y la inhibición de
actividades de enzimas, el rango de posibles objetivos puede seguir
siendo relativamente pequeño, dado que muchas cavidades de proteínas
pueden seguir siendo demasiado pequeñas para ser penetrables por
anticuerpos de dominio individual derivados de los camélidos.
WO94/25591 y la solicitud de patente europea
número 99200439.0 hacen referencia a la producción de anticuerpos
de dominio individual de anticuerpos de cadena pesada de camélidos.
Los anticuerpos de dominio individual producidos por anticuerpos de
cadena pesada de camélidos son más estables que los anticuerpos de
cadena individual del ratón y pueden producirse en cantidades más
grandes. Sin embargo, como se apreciará, incluso los miembros más
pequeños de la familia de los camélidos, por ejemplo, la llama, si
se mantienen en condiciones humanas, exigen zonas importantes de
terreno donde poder vivir.
Diaz M et al., PNAS 24 NOV 1998, vol. 95,
núm, 24, páginas 14343-14348, presenta mutaciones en
las secuencias de la transmembrana NAR y las formas secretoras y
sugiere que la hipermutación de NAR no genera el repertorio, sino
que se implica en respuestas inmunes basadas en antígenos.
Dooley H et al., DEVELOPMENTAL &
COMPARATIVE IMMUNOLOGY, vol. 24, número de Suplemento 1, 2000,
páginas S37-S38 presenta NAR aislada de un tiburón
nodriza sin haber sido sometido a tratamiento anteriormente y el
uso de phage display para estudiar el repertorio activo
funcionalmente y determinar el modo de la unión a antígenos por
clones NAR individuales.
Diaz M et al., INTERNATIONAL
IMMUNOLOGY, vol. 11, núm. 5, 1999, páginas
825-833 analizaron 1023 mutaciones en NAR y no
encontraron reconocimiento del mecanismo para ningún nucleótido
concreto, pero sí obtuvieron sólidas muestras para un desvío de
transición y para la polaridad de filamentos.
Krishnan U et al., THE GENOME
CONFERENCE 2001 - 22ª Conferencia Anual sobre la Organización y
la Expresión del Genoma, 11-15 de febrero, 2001,
POSTER 1-67, Victoria, Australia, anuncia que el NAR
aislado de los tiburones Wobbegong tiene características
estructurales similares a las encontradas en los tiburones
nodriza.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un proceso para la producción de dominios de unión a
antígeno específicos de antígenos el cual busca aliviar los
problemas anteriores.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar una composición que incluya dominios de unión a
antígeno específicos de antígenos para la inhibición de la actividad
de proteínas que busquen aliviar los problemas anteriores.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un proceso para la producción de un dominio de unión a
antígeno específico de antígenos utilizado un huésped transformado
que contenga una secuencia de DNA que pueda expresarse codificando
el dominio de unión a antígeno específico de antígeno, en donde
dicho dominio se derive de una región variable del isotipo de
inmunogloblina NAR encontrado en una especie de la subclase de
elasmobronquios en donde la especifidad del dominio de unión a
antígeno específico de antígeno viene determinada por un antígeno
que se introduce en un miembro de la subclase de
elasmobronquios.
Se ha hallado que los dominios de unión a
antígenos específicos de antígenos producidos de la región variable
de NAR encontrado en peces son tan estables como los anticuerpos de
dominio sencillos producidos por miembros de la familia de los
camélidos.
Pueden mantenerse muchos otros peces por unidad
de área que los miembros de la familia de los camélidos.
El isotipo de inmunogloblina conocido ahora como
NAR (Receptor de Antígeno Nuevo), se descubrió en el suero del
tiburón nodriza (Ginglymostoma cirratum) como un complejo de
cadena pesada homodimérico, el cual carecía de cadenas ligeras de
forma natural (Greenberg et al., Nature 374, páginas
l68-173, 1995). Sin embargo, antes del trabajo
actual de los inventores la identificación de NAR como dominio de
unión de antígenos no se apreció completamente ni tampoco su
capacidad para ser criado contra un antígeno específico.
Sólo los mamíferos (humanos, ratones, conejos,
ovejas, camellos, llamas, etc.) y algunas aves (los pollos) eran
considerados capaces de algo que se acercara a una segunda respuesta
inmune como la maduración de afinidad, intercambio de clase de
anticuerpos, etc. como respuesta a la presencia de un antígeno
externo. Por ejemplo, los teleósteos (óseos), que están muchos más
avanzados y evolucionados que los tiburones, parecen depender
únicamente de la producción de respuesta de tipo IgM no específica
de afinidad baja (Watts et al., Aust Vet J 79 pp
570-574 2001). Una característica definidora del
teléosteo IgM es su baja afinidad y capacidad a los antígenos
múltiples que se unen de manera no específica. La neutralización de
IgM es a través de una unión múltiple no específica, que resulta
principalmente en la aglutinación, etc.. La neutralización sin
complemento se asocia normalmente con una unión específica de
afinidad alta y que hasta esta invención no se había visto en
especies de peces. Los dominios de unión a antígenos específicos de
antígenos de la presente invención han demostrado neutralizar la
actividad de una enzima inmunógena directamente sin pedir otros
componentes del sistema inmulógico.
La región variable (v) NAR cumple con el modelo
de dominios de típicas superfamilias Ig con el enlace disulfuro
intradominio, canónico, predecido. Sin embargo, mientras las
regiones VHH de los camélidos tiene una identidad de secuencia de
hasta el 75% con otras regiones VH de los mamíferos, la identidad
entre los dominios NAR V y VH convencionales es tan baja como del
25% (Roux et al. Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 95, páginas 11804-11809,
1998).
Debido a esta baja identidad y a la falta de
secuencias NAR en la base de datos de Kabat, los aminoácidos de las
regiones NAR V han sido previamente numerados secuencialmente (Roux
et al. Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 95 páginas 11804-11809, 1998).
Para permitir una sencilla comparación de residuos en las
diferentes moléculas NAR V o secuencias en las regiones NAR V con
las de otras especies durante este trabajo, se derivó un sistema de
numeración para la región NAR V basándose en las de Kabat et
al., (1991) (Sequences of Proteins of immunological
Interest, 5th Edition National Institutes of Health, Betheseda,
USA).
(Nota: Este sistema de numeración se emplea en
las Figuras adjuntas).
Inmediatamente aparentes de la alineación está
la supresión de una gran porción de CDR2 (residuos
54-65) dando a la región NAR V su característico
tamaño pequeño (ver, por ejemplo, la Figura 2A).
El análisis de la secuencia inicial permitió la
clasificación de los dominios NAR V en dos clases íntimamente
relacionadas (tipo I o II), ambos construidos de un segmento de V,
tres de D y uno de J. Las regiones de Tipo I tienen residuos de
cisteína no canónicos en Fr2 (C35) y Fr4 (C103), que probablemente
forman un enlace disulfuro estabilizador del dominio. En los bucles
CDR3 de NAR más largos se han observado pares de residuos de
cisteína adicional y casi seguramente forman puentes de disulfuro
dentro de CDR, con se encontró en algún dominio VH de ganado con un
CDR3 de largo inusual.
Las regiones de tipo II son muy similares en la
estructura global al tipo I, pero en su lugar tiene residuos de
cisteína no canónica localizados en Fr1 (C29) y CDR3, cuyo propósito
es formar un enlace de disulfuro limitador como el observado en los
dominios VHH de los camélidos. La presencia de cisteínas dentro de
cada tipo NAR se muestra de manera esquemática en la Figura 1.
Recientemente, un tipo NAR adicional ha sido
identificado como la forma predominante expresada en las crías de
tiburones nodriza (Tipo III) pero debido a su estado unido de línea
germinal no muestra diversidad de uniones.
En el NAR tipo I y II, el DNA que codifica la
región V se genera por la unión física de los segmentos de DNA que
se separan espacialmente en el genoma. Este proceso de unión se
produce en células B y ayuda a generar la diversidad de la
secuencia vista para estos tipos de NAR. Para el tipo III estos
segmentos de DNA ya están unidos físicamente en el DNA de todas las
células y por ellos se unió el término línea germinal.
NAR posee la organización genómica de tipo
agregado que se observa normalmente para los receptores Ig en los
peces cartilagionosos, pero se considera que existen menos de cinco
loci NAR, solo con dos o tres capaces de una reorganización
y expresión funcional. La diversidad observada en el repertorio
primario se genera a través de mecanismos de recombinación y,
aunque es extensivo (debido a la presencia de tres segmentos D), se
localiza en CDR3. En el encuentro con antígenos este repertorio se
expande rápidamente por la mutación extensiva. El patrón de la
mutación en NAR es distinta a la observada en el IgM del tiburón,
que muestra bajos niveles de mutación y una pobre agregación a los
CDRs, pero tiene los distintivos de la mutación somática similar a
la del mamífero.
Recientemente se ha averiguado que NAR V es
similar a VH, VL y TCR V, pero diferente de los tres, de ahí su
"arquitectura de dominio única". El nombre de VH se ha
utilizado en el pasado debido a la porción constante de que NAR es
una cadena pesada, pero la región V es realmente más similar a
VL/TCR V que VH (es decir, grupos más cercanos a un árbol
filogenético). NAR V no es como los dominios VHH del camello, que se
derivan de regiones V de cadenas pesadas de buena fe. El dominio de
unión a antígeno de NAR es más cercano al dominio VL que carece
naturalmente de VH en lugar de al revés.
La secuencia de alineación de NAR V y el camello
VHH muestra claramente la enorme diferencia en la secuencia. Si NAR
V y camello VHH tiene la misma estructura física (la cual ha sido
tácita pero no demostrada) consiguen esto utilizando secuencias
completamente diferentes de aminoácidos y uno no podría ampliar una
biblioteca de región NAR utilizando las imprimaciones de la
biblioteca del camello VHH. Además, las formas en que los
repertorios de genes de NAR V y el camello VHH se crearon durante la
unión de VDJ son diferentes debido a la organización de genes de
inmunoglobina (Schluter et al Immunol Today 18,
páginas 543-549 1997).
Preferentemente, el huésped transformado es una
procariota o eucariota inferior.
Existen muchas procariotas establecidad y
huéspedes de eucariotas inferiores. Estos huéspedes son conocidos
para expresar correctamente las proteínas externas.
Convenientemente, el huésped de la procariota es
la Escherichia coli.
En realizaciones preferentes la secuencia de DNA
que puede expresarse es en la forma de vector fagémido.
La expresión de fagémido tiene ventajas sobre la
expresión del genoma fago en que resulta en una estabilidad
genética mayor y la eficiencia de la transformación bacteriana es
superior y, por tanto, permite la construcción de bibliotecas más
diversas y potencialmente más grandes.
Para mostrar los fragmentos de los anticuerpos
en el fago, el gen que codifica la región variable del anticuerpo
puede fusionarse a esa parte de una proteína de la superficie del
fago, normalmente el gen III o VIII. La fusión del Gen III es
favorecidad debido a su número de copias limitadas
(3-5 copias) en la punta de cada fago, minimizando
los posibles efectos de avidez que no son deseables cuando se
intenta aislar a los aglutinantes de una alta afinidad. Los genes
del fragmento anticuerpo pueden clonarse directamente en un genoma
de fago o fusionarse a segmentos de genes presentes dentro de los
plásmidos fagémidos.
Preferentemente, el pez es un miembro de la
subclase de los elasmobranquios, por ejemplo, un tiburón o un
cazón.
Un número mayor de miembros más pequeños de la
subclase de Elasmobranquios pueden guardarse en tanques que sean
más pequeños en unidad de superficie que la zona de pastoreo exigida
para el mismo número de miembros de la familia de los camélidos. Al
igual que miembros de la subclase de los elasmobranquios, se
conservan en tanques donde puedan cogerse fácilmente para
extraerles la sangre.
Convenientemente, el tiburón es un tiburón
nodriza, Ginglymostoma cirratum.
Preferentemente, el dominio de unión a antígeno
específico de antígenos puede tener ser el objetivo para un
antígeno específico.
Convenientemente, el dominio de unión a antígeno
específico de antígenos se eleva a un antígeno individual.
Según un aspecto individual de la presente
invención se proporciona un proceso para la producción de un dominio
de unión a antígeno específico de antígenos que incluye los pasos
de:
a) Inmunizar un pez con un antígeno;
b) Aislar los linfocitos del pez;
c) Aislar el RNA para un dominio de unión a
antígeno específico de antígenos de los linfocitos;
d) Ampliar las secuencias de DNA que codifican
los dominios de unión a antígenos específicas de antígenos por
PCR;
e) Clonar el DNA ampliado a un vector de
visualización;
f) Transformar un huésped para producir una
biblioteca;
g) Seleccionar los clones deseados de la
biblioteca;
h) Aislar y purificar el dominio de unión a
antígeno específico de antígenos de estos clones;
i) Clonar las secuencias de DNA que codifican el
dominio de unión a antígenos específico de antígenos a un vector de
expresión;
j) transformar un huésped para permitir la
expresión del vector de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de las bibliotecas mostradas para
los centros de unión específicos implica ciclos repetidos de
selección con el antígeno deseado en el proceso de ciclos de
selección. Generalmente, durante la selección, la biblioteca de
fagos que mostraba dominios de unión de antígenos se incuba con el
antígeno inmovilizado, el fago no enlazado se enjuaga y el fago
enlazado se elúa. Esta población seleccionada se expande mediante
una infección bacteriana y se pone a través de otras vueltas de
selección. Como cada fago encapsula el DNA codificando la región V
que muestra, existe una conexión funcional del genotipo y fenotipo,
reminiscente de la inmunoglubina vinculada a la membrana de la
superficie de las células B. Dicha selección cíclica ha demostrado
ser capaz de enriquecer a los clones para tener una afinidad
superior, similar a la selección de anticuerpos in vivo.
Preferentemente antes del paso d), se genera el
cDNA de los dominios de unión a antígenos.
Convenientemente, las enzimas de restricción se
utilizan para digerir las secuencias ampliadas de DNA codificando
el dominio de unión a antígenos específico de antígenos. Las enzimas
de restricciones pueden elegirse según, por ejemplo, la
manipulación de las imprimaciones utilizadas en los procesos
anteriores.
En realizaciones preferentes las enzimas de
restricción son NcoI y NotI.
Convenientemente, el vector de visualización es
un vector fagémido, por ejemplo pHEN2.
Preferentemente, el vector de expresión es un
vector de expresión soluble como pIMS100.
Los vectores anteriores son meramente ejemplos
de vectores que pueden utilizarse. Es de conocimiento general común
para los familiarizados en la técnica en la cual pueden utilizarse
los vectores.
Se describe un dominio de unión a antígeno
específico de antígenos producido por el proceso tal y como se
define anteriormente.
También se describe una composición para la
inhibición de la actividad de la proteína que incluye dominios de
unión a antígenos específicos de antígenos derivados de una región
variable de la inmuglobulina isotipo NAR encontrada en peces.
A pesar del hecho de que la región NAR V es 12
kDa que es un 20% más pequeña que cualquier anticuerpo de dominio
individual 15 kDa derivado de los camélidos, siguió siendo posible
alterar la actividad de la proteína ahí. El tamaño es un factor
significativo en las aplicaciones terapéuticas de los dominios de
unión a antígenos específicos de antígenos y otros anticuerpos de
dominio individual, con los beneficios terapéuticos de la
penetración incrementada en tejidos, un mejor acceso a las
hendiduras de las proteínas para la neutralización a través del
impedimento estérico y una inmunogenecidad reducida, resultante del
uso de los dominios de unión a antígenos específicos de
antígenos.
Los dominios de unión a antígenos específicos
del antígeno derivados de NAR, por tanto, tienen una población
objetivo más amplia que los anticuerpos de dominio individual
derivado de los camélidos en virtud de su tamaño más pequeño. El
potencial para la inmunogenecidad también se reduce dado que, en
general, cuanto menor sea el tamaño de una proteína menor será la
inmunogenecidad.
Además, aunque las secuencias NAR, en un trabajo
anterior al de los inventores, han sido identificadas a nivel de
DNA, no ha habido pistas de la evidencia de DNA de que un repertorio
somáticamente madurable, capaz de seleccionar una alta afinidad,
los aglutinantes específicos pudieran ser una característica de la
respuesta NAR. Por esa razón, no se espera que sea capaz de generar
una biblioteca NAR de dominios de unión a antígenos derivados de
tiburones y la selección de estos dominios de unión a antígenos
específicos del antígeno funcional y específico y sus
correspondientes genes receptores. La secuenciación de estos genes
confirma que se produce una respuesta atípica (para los peces y
organismos de esta línea evolucionaria) somáticamente madurable
(mostrando la mutación desde el repertorio de la línea de
germinación) dentro del repertorio NAR, conducido por el proceso de
inmunización. Esto ha resultado en la selección de dominios de unión
a antígenos con alta afinidad, altamente específicos, capaces de
una neutralización a antígenos en el aislamiento y no la esperada
respuesta con afinidad baja similar a IgM que se encuentra
normalmente en los peces y en los tiburones.
Es más, los inventores han sido capaces de
aislar los dominios de unión a antígenos específicos del antígeno y
demostrar por primera vez que NAR V es capaz de doblarse y funcionar
en aislamiento del resto de la molécula (y en un entorno que no sea
de tiburones), que el dominio de unión a antígenos específico de
antígenos madure desde los genes de la línea germinal hasta
convertirse en específico para el antígeno (sólo posible con una
biblioteca derivada de mRNA y no DNA) y que el dominio de unión a
antígeno especifico del antígeno sea capaz de unirse
específicamente al antígeno inmunizador. En resumen, como se
describe más abajo, los inventores han podido inmunizar un tiburón
y derivar de esta inmunización un dominio de unión a antígeno
específico del antígeno somáticamente madurado que sea de alta
afinidad y específica para el inmunógeno. Además, el dominio de
unión a antígenos específico de antígenos es capaz de neutralizar la
actividad del inmunógeno directamente, sin pedir otros componentes
del sistema inmunitario. Según los conocimientos anteriores, esto no
debe ser posible para las especies primitivas como los
tiburones.
La inhibición de la actividad de la pro tenia es
de una manera dependiente de la concentración.
La composición puede incluir además un portador
farmacéutico o un diluyente.
Dichos portadores farmacéuticos son muy
conocidos en la materia.
También se describe un dominio de unión a
antígeno específico del antígeno producido de una región variable
de NAR.
La invención se describirá a partir de ahora
únicamente mediante ilustración, con referencia a los siguientes
ejemplos y las figuras acompañantes.
La Figura 1 muestra la presencia de los residuos
de aminoácidos de cisteína dentro de cada tipo NAR y regiones
variables de humanos, ganado y camellos para su comparación. Las
cisteínas canónicas también se muestran por \circoncentricos y
las cisteínas no canónicas de muestran mediante \medbullet.
Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran las
translaciones de aminoácidos de las secuencias obtenidas en los
Ejemplos (Identificador de secuencia 1 a 51). Las secuencias están
alineadas contra una secuencia de clones típicas tipo I y tipo II
(parte superior de cada Figura con el CDR marcado en negrita) las
líneas indican la identidad al clon del tipo I y * indica un codón
de terminación en el marco.
La Figura 3 muestra la alineación de la
secuencia de aminoácidos de la región variable de tipo I y II NAR
(secuencia 1 y 2). La secuencia de la línea germinal se da para el
tipo I, mientras que la dada para el tipo II es típica para las
observadas de algunas secuencias de cDNA somáticamente mutadas (Roux
et al., Proceedings of the National Academy of
Sciences. USA 95 páginas,11804-11809, 1998). La
identidad de la secuencia viene marcada por la una línea y los CDRs
de las dos secuencias están en negrita. La numeración encima de las
secuencias fue generada por comparación de los residuos conservados
(subrayados) con los de otras especies y se emplea para permitir la
comparación de las secuencias de la región NAR V.
La Figura 4 muestra una unidad experimental de
variabilidad para las 29 secuencias de biblioteca inmune
identificadas en el Ejemplo (preselección y funcional). La
variabilidad en cada posición se calculó según el método de Wu
& Kabat (1970) (Journal of Experimental Medicine 132,
páginas 211-250). Los residuos de cisteína canónica,
C22 y 92 están marcados por un asterisco.
Las Figuras 5A y B muestran los resultados ELISA
del fago policlonal y monoclonal para la selección en la lisozima
de la clara de huevo de gallina (en los sucesivo HEL) (Figura 5A) y
la ovoalbúmina del pollo (en lo sucesivo Ova) (Figura 5B). El
número de fagos fue normalizado para cada pan anterior al
análisis policlonal.
La información presentada es un medio de
triplicar pozos y es representativo de los tres últimos ensayos.
Los resultados monoclonales son los porcentajes obtenidos por 96
clones para cada pan.
La Figura 6 muestra el DNA (Identificador de
secuencia 53 y 54) y una secuencia codificada de aminoácidos
(Identificador de secuencia 52) del clon
5A7\alpha-HEL. Los CDRs se marcan en negrita.
La Figura 7 muestra el DNA (Identificador de
secuencia 56 y 57) y una secuencia codificada de aminoácidos
(Identificador de secuencia 55) del clon 4F11
\alpha-HEL. Los CDRs se marcan en negrita.
La Figura 8 muestra la alineación del amino
ácido de los dos clones \alpha-HEL, 5A7
(Identificador de secuencia 52) y 4F11 (Identificador de secuencia
55) con un clon típico de tipo I (Identificador de secuencia 1). Las
secuencias se numeran según la Figura 3 para facilitar la
comparación, las diferencias entre los clones seleccionados se
marcan subrayándose y las CDRs se destacan en negrita, * residuos
conservados en todas las secuencias: sustituciones conservadas,
sustituciones semiconservadas.
La Figura 9 muestra el DNA (Identificador de
secuencia 59 y 60) y una secuencia codificada de aminoácidos
(Identificador de secuencia 58) del clon
4H11\alpha-Ova. Los CDRs se marcan en negrita.
La Figura 10 muestra el DNA (Identificador de
secuencia 62 y 63) y una secuencia codificada de aminoácidos
(Identificador de secuencia 61) del clon 3E4
\alpha-Ova. Los CDRs se marcan en negrita.
\newpage
La Figura 11 muestra la alineación del amino
ácido de los dos clones \alpha-Ova, 4H11
(Identificador de secuencia 58) y 3E4 (Identificador de secuencia
61) con un clon típico de tipo I (Identificador de secuencia 1).
Las secuencias se numeran según la Figura 3 para facilitar la
comparación. Las diferencias entre las diferencias entre los clones
seleccionados se marcan y los CDRs se marcan en negrita.
* residuos conservados en todas las secuencias,
: sustituciones conservadas, .
sustituciones semiconservadas.
La Figura 12 muestra el análisis de unión del
clon 5A7 \alpha-HEL. Las diluciones seriales de la
solución de liberación periplásmica cruda se aplicaron a una placa
ELISA revestida con cada una de las proteínas del ensayo a 10
\mug/ml y bloqueada con Marvel. La información presentada es un
medio de triplicar pozos y es representativa de al menos tres
ensayos repetidos.
La Figura 13 muestra el análisis de unión del
clon 4F11 \alpha-HEL. Las diluciones seriales de
la solución de liberación periplásmica cruda se aplicaron a una
placa ELISA revestida con cada una de las proteínas del ensayo a 10
\mug/ml y bloqueadas con Marvel. La información presentada es un
medio de triplicar pozos y es representativa de al menos tres
ensayos repetidos.
La Figura 14 muestra el análisis de unión del
clon 4H11 a-Ova. Las diluciones seriales de la
solución de liberación periplásmica cruda se aplicaron a una placa
ELISA revestida con cada una de las proteínas del ensayo a 10
\mug/ml y bloqueadas con Marvel. La información presentada es un
medio de triplicar pozos y es representativa de al menos tres
ensayos repetidos.
La Figura 15 muestra una comparación de la
estabilidad de los clones 5A7 anti-HEL y 4F11 para
la desnaturalización térmica irreversible. La información
presentada es un medio de triplicar pozos y es representativa de al
menos tres ensayos repetidos.
La figura 16 muestra un ensayo de inhibición
enzimático de lisozima. La proteína de la región NAR V
HEL-5A7 purificada a una concentración final de
2500 nN (círculo relleno), 250 nM (triángulo abierto) o 25 nM
(cuadrado relleno) se preincubaron con HEL antes de la introducción
de la bacteria M. lysodeikticus. Los pozos de control
(diamante abierto) contenían tampones en el lugar de la proteína
HE-5A7. La información presentada está en una media
de 3 repeticiones y una información típica establecida de los tres
experimentos repetidos.
Ejemplo
La cepa de
electroporación-competente E. coli
XLl-Blue {recAl endAl endA96
thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac
[F' proAB lacIª Z\DeltaM15 Tn10 (Tet^{r})]}
(Stratagene Ltd.) se utilizó para preparar y lavar las bibliotecas
de visualización de fago de la región NAR V.
Todos los oligonucleótidos tradicionales
empleados en todo este trabajo fueron pedidos a
Sigma-Genosys Ltd., y fuero desalinizados y/o
purificados con HPLC. Las secuencias de imprimación de la biblioteca
fueron las siguientes (todas de 5' a 3'):
Todas las reacciones de PCR se realizaron en un
boque de sprint PCR de Hybaid en un Hybaid con onmitubos con
un espesor de pared de 0.2 ml.
Para permitir la producción la biblioteca
inmune, se inmunizaron tres tiburones nodriza cinco veces con la
lisozima de la clara de huevo de la gallina (HEL) (en un periodo de
aproximadamente 8 meses). Las muestras de sangre se tomaron de cada
tiburón después de la inmunización, se aislaron los linfocitos de
sangre periféricos y el RNA total se preparó para cada sangrado. El
RNA de los sangrados 4 y 5 para cada uno de los tres tiburones se
juntó y se almacenó a 80ºC hasta que se requirió para la síntesis
del cDNA.
Para la síntesis de cDNA, los cantos listos para
llevar RT-PCR (200 \muM cada dNTP, 10 mM
Tris-HCl tope, 60 mM KCl, 1.5 mM MgCl_{2},
M-MuLV transcriptasa inversa, RNAguard7, RNase/DNase
libre BSA y 2 U Taq DNA polimerasa) (APB Ltd.) se
reconstituyeron en 45 \mul de DEPC tratado H_{2}O incubando en
hielo durante 5 min o hasta que los cantos se disolvieron
completamente. A cada tubo se añadió 2 \mul de tiburones nodriza
tRNA a 2 \mug/\mul y 2 \mul de imprimación NAR F4 For o
imprimación F4 For2 a 25 pM/\mul. Las dos imprimaciones son
específicas para la región 4 del marco NAR y tiene un sitio
NotI incorporado en el mango para permitir una clonación
posterior en el vector fagémido. Los tubos se giran suavemente para
mezclar los contenidos y se incuban en un bloque de PCR previamente
calentado a 46ºC durante 30 min. Después de la síntesis de cDNA, los
tubos se incubaron a 95ºC durante 7 min. para inactivar la
transcriptasa inversa y desnaturalizar la plantilla.
En cada tubo 2 \mul de la imprimación común se
añadió NAR F1 Rev a 25 pM/\mul, que contenga un centro de
NcoI en su mango, los tubos se precalentaron a 95ºC y 1
\mul de la polimerasa Taq DNA a 1 U/\mul se añadió a
cada uno antes de variar la temperatura por ciclos 32 veces a 95ºC
durante 2 min., 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 min. y 30
segundos.
Después de la amplificación de PCR del tipo I y
tipo II, los productos fueron purificados con PAGE en un gel del
1.5% y una sólida banda se visualizó a aproximadamente 400 bp para
ambas imprimaciones indicando la amplificación exitosa de la región
NAR V.
El producto PCR purificado con PAGE fue
asimilado con las enzimas de restricción NcoI y NotI
en los sitios incorporados por las imprimaciones manipuladas
utilizadas para la amplificación, para permitir la clonación en el
vector fagémido pHEN2. El DNA restringido se purificó en un gel de
agarosa al 1.5% y el AND se eliminó y se limpió.
El DNA plásmido, recolectado de un cultivo
nocturno de E. coli XLl-Azul y fenol: tratado
con cloroformo, se cortó de manera similar con las enzimas de
restricción NcoI y NotI. El vector de corte doble se
purificó en un gel de agarosa del 0.7% y se extrajo el DNA. Para la
construcción de la biblioteca el vector digerido no se trató con
fosfatasa alcalina de ternero.
Para permitir la cuantificación, 2 \mul del
producto de PCR digerido idóneamente y el vector pHEN2 fueron
sometidos a un gel de agarosa al 1% frente a 2 \mul de marcador VI
de DNA (Boehringer Ltd.) y las intensidades de bandas evaluadas a
ojo para juzgar las cantidades relativas de DNA presente. Las
ligaduras se realizaron con cantidades iguales del vector y se
insertó DNA en presencia de 2.5 \mul de 10 x tope de ligasa y 1
\mul de T4 de ligasa. El volumen final se hizo hasta 25 \mul con
H_{2}O e incubado durante la noche a 15ºC. Para la construcción
de la biblioteca se realizaron tales 30-40
ligaduras.
Después de la incubación nocturna, se extrajeron
productos de la ligadura: fenol: cloroformo limpiado y el pelet de
DNA resultante reconstituido en aproximadamente 100 \mul de una
1:10 dilución de 10 mM Tris-HCl, ph 8.5, el DNA
estaba ya listo para transformarse en células competentes para la
electroporación.
El DNA ligado fue alicuotado en cubetas de
electroporación congeladas y a cada 40 \mul de de electroporación
recién descongelada se añadieron células XL1-Azul
competentes. Las células se electroporaron y resuspendieron en 100
\mul de hielo frío de 2xTY media con 1% de glucosa (w/v) añadido.
Las diluciones a 10^{-2}, 10^{-4} y 10^{-6} se realizaron
para cada transformación y se recubrieron en un agar de TYE que
contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 1-2% de
glucosa (w/v). La suspensión bacteriana pendiente se recubrió en
cajas de Petri de 140 mm que contenían TYE con ampicilina y glucosa
(como anteriormente). Todas placas se incrementaron por la noche a
37ºC.
Después de la incubación nocturna, las colonias
de las placas de dilución se contaron para dar una estimación del
tamaño final de la biblioteca, aproximadamente 5 x 10^{6}
miembros. Aproximadamente el 100 de las colonias individuales
fueron analizadas con PCR utilizando 1 \mul cada una de las
imprimaciones LMB 3 (5' CAGGAAACAGCTATGAC 3') (Identificador de
secuencia 69) y secuencia pHEN (5' CTATGCGGCCCCATTCA 3')
(Identificador de secuencia 70) a 25 pM/\mul, 1 fxl de dNTPs a 25
pM cada uno, 2 jul de 50 mM MgCl2, 5 \mul de 10 x Taq
tapón de polimerasa, 1 \mul Taq de polimerasa (a 1 U/\mul) y 39
\mul de Steripak H_{2}0. PCR se trató de la siguiente manera; 1
ciclo a 95ºC durante 3 minutos (para lisar la bacteria) y 20 ciclos
de 95ºC durante 1 min., a 55ºC durante 1 min y a 72ºC durante 1 min.
El producto PCR fue sometido a un gel de agarosa del 1.5% que
contenía EtBr contra el marcador VI del peso molecular (Boehringer
Ltd.) para evaluar el porcentaje de la biblioteca que portaba la
región NAR V insertada. Utilizando este método, se observó que el
75% de la biblioteca transportada una inserción aproximándose a lo
esperado para la región NAR V, dando un tamaño funcional de la
biblioteca de 3. 75 x 10^{6} miembros. Cincuenta clones,
establecidos de esta forma para transportar correctamente las
inserciones, fueron secuenciados para evaluar la diversidad de la
biblioteca.
Las traslaciones codificadas de los aminoácidos
de las secuencias obtenidas se muestran en las Figuras 2A, B y
C.
De los 50 clones secuenciados, se halló que 6
albergan uno o más codones de parada por medio de un codón TGA en
el marco dentro de CDR3. En el caso de los clones 13 y 14 el codón
de parada es probablemente una consecuencia de los segmentos D3 y
D2 (respectivamente) utilizados en un marco de lectura no preferente
(Roux et al., Proceedings of the National Academy of
Sciences). USA 95 páginas, 11804-11809, 1998).
La razón de los codones de parada en otros 5 clones es menos
diferente pero es probable que se deba a la hipermutación somática
dentro de esta región.
Otros 15 clones transportaron mutaciones que
desplazan el marco de lectura del código genético a la producción
de proteínas truncadas o sin sentido. Para la mayoría de estos
clones, el desplazamiento del marco de lectura del código genético
dentro de CDR3, ocurrió posiblemente como consecuencia del añadido o
la extracción de nucleótido durante el proceso de recombinación.
Para los clones 14 y 41 la mutación que desplaza el marco de
lectura del código genético aumentó dentro de Fr2 (posición 41 según
la Figura 3) y Fr3 (posición 67) respectivamente y debido más
posiblemente a los errores de polimerasa durante la construcción de
la biblioteca (el desplazamiento del marco de lectura del código
genético en el clon 14 se produce inmediatamente después de un
tracto largo poli-A en la secuencia de DNA).
La alienación de la secuencia y la parcela de
variabilidad de los 28 clones que codifican inserciones funcionales
codificadoras (Figuras 2 y 4) muestran buena diversidad, teniendo
cada clon una secuencia única de aminoácido. La variabilidad se ve
para centrarse en todo el CDR 3 que, como clones de una biblioteca
nunca sometida a ensayo, varió ampliamente tanto en secuencia como
en longitud. La naturaleza inmune de la biblioteca es importante ya
que las regiones NAR V, unidas a antígeno, no podían aislarse de la
biblioteca nunca sometida a ensayo (es decir, sin inmunización
previa).
Los dos tipos de NAR se representaron con
aproximadamente el 80% siendo el tipo I y el 20% el tipo II. Sin
embargo, un número de clones demostraron que resultaba difícil
asignar un tipo NAR. Por ejemplo, el clon 33 tiene un tipo II Fr1
pero el tipo I CDR3 y Fr4, mientras que los clones 06, 40 y 46
tienen un tipo I Fr1 y CDR 3, pero un tipo Fr2 y Fr4. Este hallazgo
sugiere la posibilidad de que la conversión de genes puede
producirse entre los genes NAR.
Un número de otros clones también han demostrado
algunas características atípicas que no se observaron con los
clones de preselección de la biblioteca naive. Los clones 24 y 36
son los dos asignados como tipo I basándose en otra característica
de secuencia, pero no portan el par de residuos de cisteína que
normalmente se observan en el tipo I CDR3. Los clones 06, 40, 46 y
48 codifican un número impar de residuos de cisteína. Como se
mencionó anteriormente en el caso de 06, esto puede deberse a la
conversión de genes. Muy pocos clones que portan un número de
cisteínas se han observado previamente y, por eso, se piensa que la
región V debe estar bajo una presión considerable para mantener un
número par de residuos de cisteína, permitiendo la formación de
enlaces disulfuro. La consecuencia de las cisteínas impares dentro
de la región NAR V es, aún, desconocida, pero puede ser perjudicial
para el doblado del dominio. Si, de hecho, este es el caso, entonces
dichos clones se eliminarán probablemente de la biblioteca durante
los pans iniciales debido a su toxicidad para expresar la
bacteria.
El clon 02 codifica 4 residuos de cisteína en
sus CDR3, dando a esta región V un total de 8 residuos de cisteína
y el potencial para formar 4 enlaces disulfuro. Dichos dominios de
tipo I transportan 4, u ocasionalmente 6 o más, residuos de
cisteína que ya se han encontrado previamente. La capacidad para
formar estos enlaces disulfuros adicionales, combinados con el
tamaño pequeño de la región NAR V, puede proporcionar una fuente
adicional para los fragmentos anticuerpos altamente estables.
Las colonias, que no están secuenciadas, fueron
raspadas de las placas de la biblioteca con una espátula estéril en
un volumen final de 10 ml de 2xTY medio que contenía 100 \mug/ml
de ampicilina y 2% de glucosa. Las células se combinaron con
glicerol estéril al 20% (v/v) y después a través de mezclar
alicuotadas como 500 disparos de \mul y congeladas antes del
almacenaje a -80ºC.
Una alícuota individual del stock de la
biblioteca se añadió a 200 ml de 2xTY medio precalentado que
contenía ampicilina a 100 \mug/ml y 1-2% de
glucosa (w/v) y aumentada a 37º C/250 rpm hasta que se alcance la
fase de log (OD_{600} de 0.4-0.8). A una muestra
de 50 ml extraída del cultivo aproximadamente se le añadieron
10^{15} del fago auxiliar M13K07 y el cultivo incubado a 37ºC sin
agitar para permitir la infección. Después de la incubación, el
cultivo fue girado a 3.5K rpm/4ºC durante 10 min y el pelet volvió a
suspenderse en 100 ml de 2xTY conteniendo 100 \mug/ml de
ampicilina, 50 \mug/ml de kanamicina y 0.1-0.25%
de glucosa y se incubó por la noche a 30ºC/250 rpm para permitir la
expresión de la biblioteca y su rescate.
El cultivo nocturno fue removido a 12K rpm/4ºC
durante 20 min, 80 ml de sobrenadante se eliminó y se añadió a 20
ml de PEG/NaCl, bien mezclado e incubado en hielo para al menos 1 h.
El fago precipitado fue sometido a pelet a 12K rpm/4ºC y nuevamente
suspendido en 2 ml de PBS. La suspensión del fago fue girada a 13K
rpm durante 10 minutos para eliminar cualquier resto bacteriano y
el fago sobrenadante se almacenó a 4ºC. El stock de fago fue
titulado al realizar diluciones en serie en PBS y el añadido de 900
\mul de un cultivo de fase de log a 100 \mul de cada dilución.
Después de la incubación a 37ºC durante 30 minutos, 100 \mul de
cada dilución se recubrieron en placas TYE que contenían ampicilina
a 100 \mug/ml y 1% de glucosa e incubados por la noche a 37ºC. El
título de fago podría estimarse al contar las colonias
resultantes.
Los tubos de ensayo Nunc Maxisorp Immuno (Gibco
BRL, Life technologies Ltd.) fueron revestidos o bien con HEL o OVA
en 4 ml de PBS por la noche a 4ºC. El tubo se lavó 3 veces con PBS
antes de bloquearlo con un 2% de MARVEL en PBS (MPBS) durante 2 h a
temperatura ambiente, después del cual se lavó otras 3 veces con
PBS. La selección se condujo incubando el inmunotubo revestido
durante 1 h a temperatura ambiente con 1 ml de stock de fago
en 3 ml de 2% de MPBS en vaso doble. Se dejó otra hora de incubación
estacionaria antes de que el sobrenadante que contenía el fago no
unido se desechara y el fago unido eluado como se describe más
abajo.
Los individuos de unión de la biblioteca del
dominio de unión a antígeno específica del antígeno se mostraron en
la cepa de fago M13K07 fueron eluados utilizando la trietilamina
alcalina.
Después de la incubación en el fago, el
inmunotubo se lavó 20 veces con PBST, el líquido sobrante se drenó
y 1 ml de 100 mM de trietilamina se añadió. El tubo se giró entonces
durante un máximo de 10 min. a temperatura ambiente para eluar el
fago unido. Después de la incubación la solución de fago se
neutralizó mezclando con 500 \mul de 1 M
Tris-HCl. En este estado, la solución de fago se
almacenó a 4º C para un uso posterior (o a largo plazo a -20ºC de
glicerol añadido a 15% v/v).
A los 750 \mul del fago eluado de trietilamina
se añadieron 10 ml de cultivo bacteriano de fase de log y el
cultivo se incubó a 37ºC sin agitar durante 30 min. Las diluciones
en serie del cultivo se prepararon en 2xTY y se recubrieron en
placas TYE que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y el 2% de
glucosa para permitir que se estimara el número de fago rescatado.
El cultivo infectado remanente se giró durante 10 min a 13K rpm, se
volvió a suspender en 100 \mul de 2xTY y se recubrieron en un
plato de Petri de 140 mm que contenían TYE como anteriormente. Las
placas se incrementaron por la noche a 37ºC.
Después del crecimiento nocturno, las colonias
fueron raspadas de los grandes platos de Petri en 2 ml de 2xTY
medio con una espátula estéril y la suspensión se mezcló en toda la
zona. Después de la inoculación de 50 ml 2xTY que contenían 100
\mug/ml de ampicilina y 1-2% de glucosa con 50
\mul de esta suspensión, 1 ml de la bacteria remanente se mezcló
con el 15% de glicerol (v/v) y se almacenó a -80ºC como stock. El
cultivo de 50 ml se incubó a 37ºC/250 rpm hasta que OD_{600}
alcanzó 0.4, donde 15 ml se eliminó, se añadió a aproximadamente
10^{10} fago auxiliar y se incubó durante 30 min. a 37ºC. Después
de la incubación el cultivo se removió a 3.5K rpm durante 10 min y
el pelet celular resultante se volvió a suspender en 2x TY
conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina, 50 \mug/ml de kanamicina
y 0,1-0.25% de glucosa y se incubó por la noche a
30ºC/250 rpm.
El cultivo nocturno se removió a 12K rpm durante
10 min y 40 ml del sobrenadante se añadió a 10 ml de PEG/NaCl y se
mezcló bien antes de la incubación en hielo durante al menos 1 hora.
El pelet del fago volvió a suspenderse en 2 ml de PBS y se removió
durante 10 min. a 13 K rpm para eliminar cualquier resto bacteriano
remanente y el fago se almacenó a 4ºC a corto plazo.
Volvieron a desarrollarse nuevas vueltas de
selección con el fago rescatado de la anterior vuelta de selección,
como anteriormente, sobre inmunotubos revestidos de antígenos.
La biblioteca inmunológica estuvo sometida a
cinco rondas de panning frente a los antígenos de proteína
de la lisozima de la clara de huevo de la gallina (HEL) y la
ovoalbumina* del Pollo (Ova), independientemente, utilizando el
fago auxiliar M13K07 y la elusión de trietilamina. En la Tabla 1 se
ofrece un resumen de los resultados de panning.
En un intento por minimizar la pérdida de la
diversidad de clones en las rondas iniciales de la selección, la
densidad de revestimiento de antícuenos se mantuvo constante a 100
\mug/ml para los pans 1 y 2. Después de la primera vuelta
de panning, aproximadamente 10^{6} de fago se eluaron de
los inmunotubos revestidos HEL y Ova, aumentando en 10 veces el
siguiente pan 2. Para los pans 3 y 4, la densidad de
revestimiento de antígeno se redujo para cada pan en un intento por
seleccionar unos aglutinantes con una afinidad superior. Al tiempo
que el número de fagos eluados después de la selección HEL
permanecieron constantes a \siml0^{6} para los dos pans, el de
la selección Ova cayó a 10^{3} en el pan 3, volviendo a aumentar a
10^{6} después del pan 4. Para el pan 5, la concentración de
revestimiento de antígeno volvió a reducirse y la selección estuvo
acompañada por una caída significativa en el número de fagos
eluados. Debido a esta reducción en el número de fagos eluados, el
fago monoclonal y policlonal ELISAs se condujeron para determinar si
el enriquecimiento de los aglutinantes HEL u Ova se estaba
produciendo (Figura 5).
La unión del fago policlonal seleccionado de HEL
mostró un pequeño incremento en OD_{450} sobre los pans 1
y 2, con un aumento significativo después del pan 3. Otro
pequeño aumento en la señal siguió al pan 4, pero después de
que el pan se cayera al nivel observado para los panes anteriores.
Un patrón similar se observó para el fago policlonal seleccionado
de Ova con el enlace más alto obtenido para el fago rescatado
después del pan 4. Sin embargo, en este caso, los valores
OD_{450} permanecieron bajos (por debajo de 0.25) para todos los
pans.
El fago monoclonal ELISAs muestra un aumento en
el número de fago positivo para ambos juegos de selección sobre los
pans 1 a 4. En el caso de la selección HEL este aumento fue
menos del 1% a aproximadamente el 80% después del pan 4. Para los
clones seleccionados Ova los números de positivos fue ligeramente
inferior pero sin tener en cuenta los aumentados desde menos del 1%
a aproximadamente el 66% después del cuarto pan. Después del pan 5,
el número de clones positivos de HEL-10 permaneció
constante al 80% pero el número de monoclonales
Ova-positivo cayó a los niveles observados en los
pans anteriores (\siml0%).
La caída en el número de clones capaz de unir
Ova después del pan 5 indica que para este pan la
concentración de revestimiento de proteína se ha reducido de tal
forma que la selección es demasiado rigurosa y la mayoría de los
clones ya no pueden unirse. Ninguna caída de ese tipo se observa
para el ensayo monoclonal HEL-seleccionado,
indicando que la afinidad de estos clones para su antígeno es
probablemente superior. Esto muestra que los dominios de unión a
antígenos específicos de antígenos producidos por los tiburones son
muy específicos ya que los tiburones se inmunizaron con HEL y sólo
los aglutinadores HEL pudieron aislarse, la información de Ova no
muestra aglutinadores. Por esta razón, una selección de los
pans 3 y 4 se pusieron en secuencia para Ova, pero de los
pans 4 y 5 para HEL.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una placa ELISA Immulon 4 de 96 pozos (Dynatech
Laboratories Ltd.) se revistió con 100 \mul de antígenos a 10
\mug/ml durante 1 h a 37ºC.
Después de los tres lavados con PBST los pozos
se bloquearon con 300 \mul del 2% de MPBS (PBS con 2% w/v de
marvel añadido) durante otra hora a temperatura ambiente nocturna a
4ºC. Los pozos se lavaron 3 veces con PBST y a los pozos
individuales 10 \mul de fago de precipitado PEG de cada pan, en
100 \mul del 2% de MPBS, se añadió a la placa incubada durante 1
hora a temperatura ambiente. La solución de fago se desechó y la
placa se lavó con PBST 3 veces. Para cada pozo 100 \mul de
conjugado de HRP monoclonal anti-M13 (APB Ltd.),
diluido 1 en 5000 en PBS se añadió y se incubó a temperatura
ambiente durante 1 hora. La placa se lavó 5 veces con PBST y se
desarrolló con 100 \mul por pozo de substrato de TMB, la reacción
paró con 50 \mul por pozo de 1 M H_{2}SO_{4} y la placa se
leyó a 450 nm.
Las colonias individuales que crecieron en
placas TYE se recogieron en 100 \mul 2xTY medios que contenían
100 \mug/ml de ampicilina y 1-2% de glucosa en una
placa estéril ELISA de 96 pozos para cada uno de los pans, y
crecieron por la noche a 37ºC/250 rpm. Después del crecimiento, un
dispositivo de transferencia de pozo-96 se utilizó
para inocular un placo del pozo 96 fresco que contenía 200 \mul
por pozo de 2xTY con 100 \mug/ml de ampicilina y
1-2% de glucosa. Las bacterias crecieron durante 2
horas a 37ºC/250 rpm. A la placa nocturna original se le añadió
glicerol para dar una concentración final del 15% y las placas se
almacenaron a -80ºC como stock bacteriano.
Después de una incubación de dos horas, se
añadieron a cada pozo 25 \mul de 2xTY que contenían 100 \mu/ml
de ampicilina, 1-2% de glucosa y 10^{10} de fago
auxiliar. La placa se incubó entonces durante otra hora a 37ºC/250
rpm antes de girarse a 2K rpm durante 10 minutos para someter a
pelet la bacteria. El sobrenadante se aspiró de la placa y el pelet
resultante volvió a suspenderse en 200 \mul 2xTY conteniendo 100
\mug/ml de ampicilina, 50 \mug/ml de kanamicina y glucosa a
0.25% (w/v). La placa se incubó por la noche a 30ºC/250 rpm.
La placa nocturna se giró a 2K rpm durante 10
minutos para dar un sobrenandante que contenía el sobrenadante de
fago monoclonal. Para las placas colocadas y bloqueadas
correctamente, 50 \mul de este sobrenadante de fago en 50 \mul
de MPBS se añadió por pozo y la placa incubada a temperatura
ambiente durante 1 hora. Después de la incubación la placa se
incubó con anticuerpo conjugado anti-M13 HRP y se
desarrolló como normal.
Después de la determinación de clones
individuales que daban una señal positiva para la unión a antígenos,
5 ml de 2xTY que contenían el 2% de glucosa y 100 \mug/ml de
ampicilina se inoculó desde la fuente de clon adecuada. Teniendo en
cuenta los resultados del fago monoclonal ELISAs, quince clones
HEL-positivos se recogieron al azar desde los pans
4 y 5, mientras que los Ova se recogieron de los pans 3 y 4. Después
de la incubación nocturna de los cultivos a 37ºC/250 rpm plásmido
se preparó tal y como se establece anteriormente. Una muestra de 20
\mul de plásmido se digirió con las enzimas de restricción
Ncol y Notl y el fragmento \sim 400 bp
correspondiente a los fragmentos recuperados y purificados con PAGE
de la región NAR V, fragmento PAGE purificado y recuperado. Los
fragmentos de la región V purificados se ligaron posteriormente en
un corte similar, se trataron con fosfatasa alcalina y se limpiaron
con el vector de expresión pIMSlOO. Después de la incubación
nocturna a 15ºC, el vector resultante, albergando la inserción NAR V
fusionaron con el dominio HuCK y la cola 6His se transformaron en
células E. coli XLl-Azul competentes de la
electroporación. Las colonias se recogieron y crecieron como
cultivos nocturnos en 5 ml TB (que contenían el 2% de glucosa
(v/v), 100 \mug/ml de ampicilina, 25 \mug/ml de tetraciclina) y
stock de glicerol y plásmido preparado.
Las inserciones fueron puestas en secuencia
desde el plásmido utilizando el M13 inverso (5' TTCACACAG
GAAACAG 3') (Identificador de secuencia 67) y la imprimación de reverso HuCk (5' GAAGATGAAGACAGATGG
TGC 3') (identificador de secuencia 68). Cuando los datos de secuencia se han generado, al clon se le dio un nombre único para permitir la identificación.
GAAACAG 3') (Identificador de secuencia 67) y la imprimación de reverso HuCk (5' GAAGATGAAGACAGATGG
TGC 3') (identificador de secuencia 68). Cuando los datos de secuencia se han generado, al clon se le dio un nombre único para permitir la identificación.
En la translación sólo se obtuvieron secuencias
diferentes de los 15 clones HEL-seleccionados y dos
de los 15 clones Ova-seleccionados.
Los clones 5A7 y 4F11 se eligieron para
representar las dos secuencias diferentes de aminoácidos encontrados
dentro de los clones positivos HEL-seleccionados
(Figuras 6 y 7). Los dos clones son del tipo I NAR convencional y
también se ilustran alineados frente a un clon tipo I típico en la
Figura 8. Los dos clones difieren entre sí sólo en dos posiciones
(43 y 44), ambos yacen dentro de Fr2 y portan regiones CDR3
idénticas.
Los clones 4H11 y 3E4 se eligieron para
representar las dos secuencias diferentes de aminoácidos encontrados
dentro de los clones positivos Ova-seleccionados
(Figuras 9 y 10). De nuevo estos clones fueron del tipo I NAR
convencional y, como tales, se muestran alineados frente a un clon
tipo I típico en la Figura 11. Estos clones difieren en 6
aminoácidos; tres dentro de Fr1 (posiciones 13, 14 y 30), dos dentro
de Fr2 (posiciones 46 y 47) y uno dentro de CDR3 (posición
101).
Se utilizó una colonia individual de E.
coli transformado para inocular 5 ml de LB que contenía un 1%
de glucosa (v/v), 12.5 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de
ampicilina e incrementados a 37ºC/250 rmp por la noche. Este cultivo
se utilizó para sembrar 50 ml de TB medio que contenía 1% de glucosa
(v/v), 12.5 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de ampicilina
en frascos con deflectores de 250 ml a 1% de v/v. Los cultivos de
50 ml crecieron durante un periodo de 24 horas a 25ºC/250 rpm, con
un cambio de media después de aproximadamente 10 horas de
crecimiento. El crecimiento de todos los cultivos fue bueno con el
OD_{600} nocturno en el orden de 10-20 unidades de
OD.
Los cultivos nocturnos fueron sometidos a pelet
a 4 K rpm/4ºC durante 20 min. Los pelets volvieron a suspenderse en
50 ml de TB fresco que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y dado 1
hora a 25ºC/250 rpm para recuperarse antes de la inducción con 1.5
mM IPTG durante 3.5-4 y liberación de contenido
periplásmico.
El pelet celular resultante del centrifugado
volvió a suspenderse en un 10% del volumen del cultivo original del
tapón de fraccionamiento (100 ml 200 mM de Tris-HCl,
20% de sacarosa, pH 7.5, 1 ml 100 mM EDTA/L del cultivo). La
suspensión se incubó en hielo agitando suavemente durante 15 min.
después de los cuales un volumen igual de H_{2}0 estéril y helada
se añadió y la incubación continuó durante otros15 min (método
modificado de French et al. Enzyme & Microbial
Technology 19 pp332-338 1996). Las suspensión se
removió a 13K rpm/4ºC durante 20 min, el sobrenadante contenía la
fracción periplásmica recolectada y filtrada a través de un filtro
0.22 \mum (Sartorius Instruments Ltd.).
Ninguno de los cultivos mostró ningún signo de
lisis durante el periodo de inducción de 4 h y se obtuvieron
rendimientos de expresión en el orden 1 mg de proteína NAR cruda por
litro de cultivo. En este ejemplo, la proteína expresada de cuatro
clones seleccionados fue IMAC purificada a través de la cola
6His.
Una placa ELISA de fondo plano con
96-pozos de Immulon 4 se recubrió con una
concentración adecuada del antígeno deseado a 100 \mul por pozo y
la placa se incubó a 37ºC durante 1 h. La placa se lavó 3 veces con
PBST antes de bloquear con 200 \mul por pozo de PBS que contenía
2% de Marvel (w/v) durante 1 h a 37ºC. Los pozos se lavaron otras
tres veces con PBST antes de añadir las muestras.
Se preparó un l en una dilución 5 de solución de
liberación periplásmica de crudo, añadida a los pozos superiores de
la placa a 200 \mul por pozo y doblando las diluciones en el PBS
realizado. Las placas se incubaron a 4ºC durante 1 hora. Cada placa
se lavó otras 5 veces con PBST. Se diluyó el anticuerpo conjugado de
peroxidasa anti-HucCk de cabra 1:1000 en PBS y 100
\mul añadido a los pozos que contenían dominios de unión a
antígenos. Las placas se incubaron durante 1 hora a 4ºC y después
de 6 lavados con PBST el ELISA se desarrolló como se describe
anteriormente y la placa se leyó a 450 nm.
El clon 5A7 HEL-seleccionado
(Figura 12) muestra buena unión a HEL en la dilución superior y,
como muestra, se diluye serialmente y la unión se reduce en
consecuencia. La unión limitada a la proteína altamente relacionada
de la lisozoma de la clara de huevo del pavo (TEL) se observa en la
dilución más alta, pero no se observa ninguna unión a la
ovoalbumina del Pollo (Ova), albúmina de suero bovino (BSA),
hemocianina de lapa californiana, o el agente bloqueador Marvel. Un
patrón idéntico de unión de proteína también se observa para el
clon 4F11 HEL-seleccionado (Figura 13), que
sorprendentemente no considera el alto grado de la similitud de la
secuencia del aminoácido entre estos dos clones (111/113 aa
idénticos). Las señales OD_{450} obtenidas para 3F11 son
ligeramente superiores a las de 5A7, pero esto puede deberse
simplemente a las pequeñas diferencias en la cantidad de proteína
presente en las muestras.
El clon 4H11 Ova-seleccionado
(Figura 14) no mostró ninguna unión a ninguna de las proteínas
sometidas a ensayo, incluyendo Ova, el antígeno contra el que fue
seleccionado. Para asegurar que esto no fue simplemente una
consecuencia de haber poca proteína presente en el ensayo, un ensayo
de unión se realizó con la solución liberadora periplásmica no
diluida. En este caso, alguna unión a todas las proteínas se observó
para los pozos que contenían las diluciones superiores de las
proteínas 4H11. Esta unión se perdió inmediatamente cuando la
muestra se diluyó y es probable que no sea específica, que sin duda
resulta de las concentraciones muy altas de la proteína presente.
Estos datos respaldaron el hallazgo inicial de que el clon 4H11 no
se une significativamente a Ova. El clon 3E4, como 4H11 no muestra
unión a las proteínas HEL, BSA, KLH, TEL o el agente de bloqueo
Marvel. Sin embargo, el bajo nivel de unión se observa para este
clon en la selección del Ova antígeno. El patrón de unión por este
clon a Ova no es usual en que la unión en la concentración de
proteína más alta es baja y no muestra una caída significativa en
la dilución de la muestra. Cuando la concentración de proteína se
aumenta repitiendo el ensayo con la solución periplásmica no
diluida, un patrón similar de unión se observó, negando, por tanto,
la posibilidad de que la concentración de la proteína fue
inicialmente demasiado baja. La razón de esta unión no usual aún no
se conoce, pero puede deberse a la unión 3E4 sólo con "baja
afinidad a Ova".
La falta distintiva de los clones NAR capaces de
unir el antígeno en una biblioteca previamente construida del
material de un animal nunca sometido a tratamiento y el aislamiento
de la unión a HEL, pero no los clones de unión a Ova, de la
biblioteca construida con animales inmunizados a HEL ilustra la
naturaleza altamente específica de la respuesta NAR después del
desafío del antígeno. En otras palabras, se producen dominios de
unión a antígenos específicos de antígeno con una especificad
específica.
Dado que los clones 5A7 y 4F11 se mostraron
capaces de unirse a HEL en el ELISA de unión a antígenos, es posible
probar la estabilidad de estos clones a la desnaturalización
termal. Las diluciones por debajo de la saturación de los dos
clones, establecidas de las curvas de unión a antígenos se
prepararon y se incubaron en un tramo de temperaturas durante 3
horas antes de su añadido a una placa ELISA revestida con HEL. Las
muestras se incubaron entonces en la placa ELISA durante una hora a
4ºC y la unión detectada con un anticuerpo conjugado
anti-HuCk HRP. La estabilidad de los dominios de
unión antígenos fue determinada como un porcentaje del obtenido para
una muestra de control que no haya sido tratada con calor (Figura
15).
Tanto el clon 5A7 y el clon 4F11 muestran una
resistencia considerable a la desnaturalización irreversible
perdiendo el 50% de la funcionalidad a aproximadamente el 85ºC y
manteniendo aproximadamente el 30% de la funcionalidad después de 3
h a 95ºC. Esta alta estabilidad es probablemente una consecuencia de
los residuos adicionales de cisteína no canónicos encontrados en el
dominio NAR V. Ambos clones codifican los residuos de cisteína 6 y,
por tanto, son capaces de formar 3 enlaces disulfuros intradominios,
que (si se forman) contribuirían en gran medida a la alta
estabilidad de estos dominios. La forma de las curvas de estabilidad
para los dos clones es casi idéntica y la menor diferencia en la
estabilidad entre los clones puede deberse simplemente a la
variabilidad del ensayo.
La repetición de este ensayo utilizando un
anticuerpo conjugado anti-His HRP para detectar la
unión generó valores que no fueron significativamente diferentes a
los obtenidos con el anticuerpo secundario
anti-HuCk, indicando que la caída en la señal está
causada por la unión reducida de los dominios NAR V, debido a la
desnaturalización y no simplemente una detección reducida a través
de la etiqueta HuCk.
La habilidad de HEL-5A7 para
inhibir la actividad enzimática de HEL se sometió a ensayo mezclando
12.5 \mul de HEL con 12.5 \mul de la proteína
HEL-5A7 purificada en una placa de cultivo de tejido
de pozo 96 esteril para dar una concentración final HEL de 10
\mug/ml y concentraciones HEL-5A7 de 2500 nM, 250
nM y 25 nM. El pozo de control se estableció con el tapón que
sustituía a HEL-5A7. Una muestra de Micrococcus
lysodeikticus fue reconstituida en un tapón de 0.1 M de
fosfato/citrato (pH 5.8) que contenía 0.09% NaCl mezclado
totalmente y 175 \mul añadido a los pozos preparados. La placa se
leyó durante un periodo de 30 minutos (a intervalos de 1 minuto) a
450 nm. La actividad enzimática fue determinada con absorbancia
inicial de porcentaje frente al tiempo para cada muestra.
La introducción de la proteína
HEL-5A7 al ensayo redujo la tasa de lisis celular en
una manera dependiente de concentración respecto del control
(Figura 16). Con la proteína HEL-5A7 en la
concentración final de 2500 nM el tipo de lisis celular
(9.3x10^{-3} OD unidades/min) es casi la mitad cuando se compara
con el control (17x10^{-3} OD unidades/min) indicando que la
región HEL-5A7 se hunde dentro o adyacente a la
cavidad del punto activo de la lisozima. Un dominio de unión a
antígenos específicos a antígeno preparado similarmente surgió
contra un antígeno no relacionado que no mostró efecto con la tasa
de lisis celular cuando se introdujo al ensayo en las mismas
concentraciones.
Se entenderá que la realización ilustrada
muestra una aplicación de la invención sólo para los fines de la
ilustración. En la práctica, la invención puede aplicarse a muchas
configuraciones diferentes, las realizaciones detalladas son
fáciles de aplicar para los familiarizados en la materia.
Dominios de unión a antígenos
Versión Patente 3.0
Ginglymostoma cirratum = tiburón
nodriza
<110> Aberdeen University
\hskip1cmUniversity of Maryland
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<120> Antigen Binding Domains
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<130> P145
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<150> GB 0119553.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-08-10
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0210508.8
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<151>
2001-05-08
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<171> PatentIn version 3.0
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<210> 1
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<213> Ginglymostoma cirratum
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<400> 30
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<400> 31
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<210> 32
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<211> 117
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
\newpage
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<400> 32
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<210> 33
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<211> 111
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<400> 33
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<212> PRT
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<211> 115
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<210> 39
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<211> 114
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<400> 39
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<210> 40
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<211> 120
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<210> 41
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<211> 114
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
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<400> 42
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<210> 43
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<211> 114
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 44
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<211> 113
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
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<400> 44
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<210> 45
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<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 45
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<210> 46
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<211> 110
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 46
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<210> 47
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<211> 112
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<212> PRT
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<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
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<210> 49
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<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
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<400> 49
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<210> 50
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 50
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<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1.2cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DBA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1.3cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ginglymostoma cirratum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> M13 reverse primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HuCk forward primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LMB3 primer
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pHEN primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
Claims (16)
1. Un proceso para la producción de dominio de
unión a antígeno específico de antígeno utilizando un huésped
transformado que contenga una secuencia DNA expresable que codifique
el dominio de unión a antígeno específico de antígeno, en donde el
dominio de unión a antígeno específico de antígeno se derive de una
región variable del isotipo NAR encontrado en especies de la
subclase de los elasmobranquios en donde la especificidad del
dominio de unión a antígeno específico de antígeno viene determinada
por un antígeno que se introduce en un miembro de la subclase de
los elasmobranquios.
2. Un proceso según la reivindicación 1 en donde
el huésped transformado es una procariota o una eucariota
inferior.
3. Un proceso según la reivindicación 2 en donde
el huésped de la procariota es Escherichia coli.
4. Un proceso según cualquier reivindicación
anterior en donde la secuencia de DNA que puede expresarse tiene la
forma de un vector fagémido.
5. Un proceso según cualquier reivindicación
anterior en donde la especie de la subclase de los elasmobranquios
es un tiburón o un cazón.
6. Un proceso según la reivindicación 5 en donde
el tiburón es un tiburón nodriza.
7. Un proceso según cualquier reivindicación
anterior en donde el dominio de unión a antígeno específico del
antígeno es asignado a un antígeno específico.
8. Un proceso según cualquier reivindicación
anterior en donde el dominio de unión a antígeno específico del
antígeno es elevado a un antígeno específico.
9. Un proceso para la producción de un dominio
de unión a antígeno específico del antígeno que incluye los pasos
de:
a) Inmunizar un miembro de la subclase de los
elasmobranquios con un antígeno;
b) Aislar los linfocitos del miembro;
c) Aislar el RNA de los linfocitos;
d) ampliar las secuencias de DNA que codifican
los dominios de unión a antígenos específicas de antígenos por
PCR;
e) Clonar el DNA ampliado a un vector de
visualización;
f) Transformar un huésped para producir una
biblioteca;
g) Seleccionar los clones deseados de la
biblioteca;
h) Aislar y purificar el dominio de unión a
antígeno específico de antígenos de estos clones;
i) Clonar las secuencias de DNA codificando el
dominio de unión a antígeno específico en un vector de
expresión;
j) Transformar un huésped para permitir la
expresión del vector de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un proceso según la reivindicación 9 antes
del paso d) se genera el cDNA del dominio de unión a antígeno
específico del antígeno.
11. Un proceso según cualquiera de las
reivindicaciones de 9 a 10 en donde las enzimas de restricción se
emplean para digerir las secuencias ampliadas de DNA codificando el
dominio de unión a antígeno específica del antígeno.
12. Un proceso según la reivindicación 11 en
donde las enzimas de restricción son Ncol y Notl.
13. Un proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12 en donde el vector de visualización es
cualquier vector fagémido.
14. Un proceso según la reivindicación 13 en
donde el vector de visualización es pHEN2.
\newpage
15. Un proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14 en donde el vector de visualización es un
vector de expresión soluble.
16. Un proceso según la reivindicación 15 en
donde el vector de expresión soluble es pIMSl00.
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