ES2338319T3 - Proteinas mutantes con menor respuesta alergenica en seres humanos para construir, identificar y producir dichas proteinas. - Google Patents

Abstract

Una variante de la proteasa subtilisina que comprende una sustitución hecha en una o más posiciones en una proteasa subtilisina precursora correspondiente a K170D y/o S173D de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

Description

Proteínas mutantes con menor respuesta alergénica en seres humanos para construir, identificar y producir dichas proteínas.

Antecedentes de la invención A. Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas que producen una respuesta alergénica menor en seres humanos expuestos a tales proteínas, y a una prueba predictiva de tal respuesta. Más específicamente, la presente invención se refiere a un nuevo mutante de proteína mejorado que produce respuestas alergénicas muy bajas en seres humanos sensibilizados a esa proteína mediante exposición, si se compara con el precursor de tal mutante de proteína.

B. Estado de la técnica

Cada vez predomina más la utilización de proteínas en aplicaciones industriales, farmacéuticas y comerciales. Como resultado, la mayor exposición debida a esta predominancia ha sido responsable de algunos riesgos relacionados con la seguridad causados por la sensibilización de ciertas personas a esos péptidos, con lo que la exposición subsiguiente causa reacciones alérgicas extremas que pueden ser perjudiciales e incluso fatales. Por ejemplo, se sabe que las proteasas causan una hipersensibilidad peligrosa en algunos individuos. Como resultado, a pesar de la utilidad de las proteasas en la industria, e.g. en detergentes para ropa, cosméticos, tratamientos textiles, etc..., y la numerosas investigaciones llevadas a cabo en el campo para proporcionar proteasas mejoradas que tengan, por ejemplo, una eliminación más eficaz de manchas bajo condiciones de detergencia, el uso de proteasas en la industria ha sido problemático debido a su capacidad para producir una respuesta alergénica hipersensible en algunos humanos.

Se ha realizado mucho trabajo para paliar estos problemas. Entre las estrategias exploradas para reducir el potencial inmunogénico del uso de proteasas están los procedimientos de producción mejorada que reducen el contacto potencial, controlando y minimizando las concentraciones en el lugar de trabajo de partículas de polvo o aerosol que llevan proteasas transportadas por el aire, los procedimientos de granulación mejorados que reducen la cantidad de polvo o aerosol producido en realidad a partir del producto proteasa, y los procedimientos de recuperación mejorados para reducir el nivel de contaminantes potencialmente alergénicos en el producto final. Sin embargo, los esfuerzos para reducir la alergenicidad de la proteasa, per se, han sido relativamente poco fructíferos. Alternativamente, se han realizado esfuerzos para ocultar epítopos en proteasas que se reconocen mediante inmunoglobulina E (IgE) en individuos hipersensibles (Publicación PCT Nº WO 92/10755) o para aumentar o cambiar la naturaleza de los determinantes antígenos mediante la unión de polímeros o péptidos/proteínas a la proteasa problemática.

Cuando ocurre una respuesta inmune adaptada en forma exagerada o inapropiada, el individuo experimenta una reacción denominada hipersensible. Las reacciones hipersensibles son consecuencia de respuestas normalmente beneficiosas actuando inapropiadamente y algunas veces causan reacciones inflamatorias y daño de tejido. Estas pueden ser provocadas mediante muchos antígenos; y la causa de la reacción hipersensible variará de un individuo a otro. La hipersensibilidad en sí misma normalmente no se manifiesta después del primer contacto con el antígeno, sino que normalmente aparece después de contactos sucesivos. Una forma de sensibilidad ocurre cuando una respuesta a IgE está dirigida contra antígenos medioambientalmente inocuos, tales como polen, ácaros o caspa animal. La producción resultante de mediadores farmacológicos por parte de las células mástil sensibilizadas con IgE produce una reacción inflamatoria aguda con síntomas tales como el asma o la rinitis.

De todas formas, una estrategia que comprenda modificar los sitios de la IgE generalmente no será satisfactoria para prevenir la causa de la reacción de sensibilización inicial. En consecuencia, tales estrategias, aunque quizás neutralicen o reduzcan la severidad de la reacción hipersensible subsiguiente no reducirá el número de personas que en realidad están sensibilizadas. Por ejemplo, cuando se sabe que una persona es hipersensible a cierto antígeno, la manera general y únicamente segura para tratar esta situación es aislar la persona hipersensible del antígeno lo más completamente posible. Ciertamente, cualquier otra acción podría ser peligrosa para la salud del individuo hipersensible. Así, mientras que es importante reducir el peligro de una proteína específica para un individuo hipersensible, para los propósitos industriales sería de mucho más valor convertir una proteína en incapaz de iniciar la reacción hipersensible inicial.

Los linfocitos T (células T) son claves en la inducción y regulación de las respuestas inmunes y en la ejecución de las funciones efectoras inmunológicas. Se sabe que la inmunidad específica contra agentes infecciosos y tumores depende de esas células y se cree que contribuyen a la curación de heridas. Por otra parte, un fallo en el control de estas respuestas puede conducir a autoagresión. En general, el antígeno se presenta a las células T en forma de células que presentan antígeno que, a través de una variedad de mecanismos de superficie celular, capturan y exponen el antígeno o antígeno parcial de manera adecuada para el reconocimiento del antígeno por las células T. Después que los receptores sobre la superficie de las células T (receptores de células T) reconozcan un epítopo específico las células T comienzan una serie de interacciones complejas, que incluyen la proliferación, que dan como resultado la producción de anticuerpos por parte de las células B. Mientras que las células T y las células B son ambas activadas por epítopos antigénicos que existen sobre una proteína o péptido dado, en realidad los epítopos reconocidos por estas células mononucleares generalmente no son idénticos. De hecho, el epítopo que activa una célula T para iniciar la creación de diversidad inmunológica, frecuentemente no es el mismo etítopo que es reconocido después por las células B en el curso de la respuesta inmunológica. Así, con respecto a la hipersensibilidad, mientras que la interacción antigénica específica entre la célula T y el antígeno es un elemento crítico en el inicio de la respuesta inmune a una exposición antigénica, las especificidades de esa interacción, i.e., el epítopo reconocido, normalmente no es relevante para el desarrollo subsiguiente de una reacción alérgica auténtica.

La publicación PCT Nº WO 96/40791 describe un procedimiento para producir conjugados polioxialquileno-polipéptido con una alergenicidad reducida, utilizando óxido de polioxialquileno como material de partida.

La publicación PCT Nº WO 97/30148 describe un conjugado polipéptido con alergenicidad reducida que comprende una molécula que transporta el polímero que tiene dos o más moléculas de polipéptido acopladas a ella.

La publicación PCT Nº WO 96/17929 describe un procedimiento para producir polipéptidos con alergenicidad reducida que comprende la etapa de conjugación de 1 a 30 polimoléculas al polipéptido padre.

La patente Nº WO 92/10755 describe un método para producir variantes de proteína que provocan una respuesta inmunogénica reducida en animales. En esta solicitud, se utilizaron las proteínas de interés, una serie de proteasas variantes de ellas, para inmunizar ratas. Entonces, el suero de las ratas se utilizó para medir la reactividad de los anticuerpos policlonales producidos y presentes en el suero inmunizado frente a la proteína de interés o sus variantes. A partir de estos resultados, fue posible determinar si los anticuerpos en la preparación eran comparativamente más o menos reactivos con la proteína y sus variantes, permitiendo así un análisis de qué cambios en la proteína tienen más posibilidad de neutralizar o reducir la capacidad de unir Ig. A partir de estas pruebas sobre ratas, se llegó a la conclusión que cambiando cualquiera de los 309 restos de subtilisina correspondientes a las posiciones 127, 128, 129, 130, 131, 151, 136, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251, 261 dará como resultado un cambio en el potencial inmunológico.

La publicación PCT Nº WO 94/10191 describe proteínas poco alergénicas que comprenden formas oligoméricas de las proteínas monoméricas padre, en donde el oligómero sustancialmente ha retenido su actividad.

La técnica anterior ha proporcionado métodos para reducir la alergenicidad de ciertas proteínas y la identificación de epítopos que causan reacciones alérgicas en algunos individuos, donde los ensayos utilizados para identificar estos epítopos generalmente implican la medida de anticuerpos IgE y IgG en el suero sanguíneo expuesto al antígeno. De todas formas, una vez se ha iniciado una reacción Ig, la sensibilización ya ha ocurrido. En consecuencia, existe una necesidad de un método para determinar epítopos que causan sensibilización en un primer lugar, ya que la neutralización de estos epítopos dará como resultado una posibilidad significativamente menor de que pueda ocurrir la sensibilización, reduciendo así las posibilidades de sensibilización inicial.

Compendio de la invención

Uno de los objetivos de la invención es proporcionar una proteína que tenga un potencial reducido para causar una respuesta alergénica en seres humanos, en comparación con una proteína precursora.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar una variante de proteasa que tenga una actividad útil en aplicaciones de proteasas comunes, tales como detergentes y o el tratamiento de lana para prevenir el apelmazamiento, en aplicaciones como jabones líquidos o en pastilla, formulaciones para el cuidado de la vajilla, soluciones o productos para limpieza de lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de aguas residuales, aplicaciones textiles tales como anti-apelmazante, en formulaciones cosméticas y para el cuidado de la piel, o como enzimas de fusión-ruptura en la producción de proteínas, donde dicha variante de proteasa puede ser utilizada de manera más segura debido a su potencial alergénico disminuido.

La invención proporciona una variante de la proteasa subtilisina, que comprende al menos una sustitución aminoacídica en una posición en el seno de una proteasa subtilisina precursora correspondiente a los restos 170 y/o 173 en BPN', en donde tales sustituciones comprenden reemplazar el resto 170 por ácido aspártico y/o reemplazar el resto 173 por ácido aspártico. En una realización muy preferida, la sustitución comprende reemplazar los restos 170, 171 y 173 por ácido aspártico, glutamina y ácido aspártico, respectivamente.

Un método para producir la proteína de la invención puede implicar la modificación de un ADN que codifica una proteína precursora de tal manera que el ADN modificado codifique la proteína mutante de la invención.

En otra realización adicional de la invención, se proporcionan las secuencias de ADN que codifican la proteína mutante, así como los vectores de expresión que contienen tales secuencias de ADN y las células hospedantes transformadas con tales vectores, donde dichas células hospedantes son, preferiblemente, capaces de expresar dicho ADN para producir la proteína mutante de la invención, ya sea intracelular o extracelularmente.

La proteína mutante de la invención es útil en cualquier composición o procedimiento en los que se sabe generalmente que la proteína precursora es útil. Por ejemplo, la proteasa subtilisina con alergenicidad reducida puede emplearse como componente en productos de limpieza tales como detergentes para la ropa y productos de limpieza para superficies duras, como ayuda en la preparación del cuero, en el tratamiento de textiles tales como la lana y/o la seda para reducir el apelmazamiento, como componente en productos para el cuidado personal, producto cosmético o crema facial, y como componente en piensos para animales domésticos para mejorar el valor nutritivo del pienso. De manera similar, cuando la proteína es una amilasa, la amilasa de alergenicidad reducida se puede emplear en la licuefacción del almidón, como componente en un detergente de lavavajillas, para suavizar textiles, en un detergente para la ropa o cualquier otro uso para el cual una amilasa es útil.

Una ventaja de la presente invención es que mediante la medida de la proliferación de células T como consecuencia del reconocimiento del epítopo de célula T, es posible identificar péptidos que contienen epítopos responsables de la sensibilización inicial de un individuo. Es decir, la proliferación de células T como consecuencia del reconocimiento del epítopo de la célula T da lugar a la sensibilización de un individuo a este péptido o a una proteína que lo contiene. La neutralización de tales epítopos de células T "sensibilizadores" dará inevitablemente como resultado un mayor grado de seguridad para los que manipulan o que son expuestos de otra manera al antígeno que contiene el epítopo porque no serán sensibilizados inicialmente, impidiendo de esta manera la producción de los típicos anticuerpos Ig de una reacción alérgica después de una exposición ulterior al antígeno.

Una ventaja de la presente invención es la preparación de proteínas, incluyendo enzimas, que pueden emplearse con apreciablemente menos peligro de sensibilización para los individuos expuestos. Así, por ejemplo, las proteínas de la invención pueden emplearse de manera más segura en cosméticos tales como cremas faciales, detergentes como detergentes para la ropa, composiciones limpiadoras de superficies duras y composiciones prelavado para la limpieza de superficies duras o cualquier otro uso de la proteína, incluyendo enzimas, en el cual la exposición humana es una consecuencia secundaria necesaria.

Breve descripción de los dibujos

Figs. 1A, B1, B2 y B3 ilustran la secuencia de ADN (SEQ ID:NO 1) y aminoácidos (SEQ ID: NO 2) de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (BPN') y un mapa parcialmente restringido de este gen.

Fig. 2 ilustra los restos de aminoácido que se conservan en subtilisinas procedentes de Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID: NO 3) y Bacillus lentus (tipo nativa) (SEQ ID: NO 4).

Figs. 3A y 3B ilustran un alineamiento de secuencia de aminoácidos de subtilisina de tipo proteasas procedentes de Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (SEQ ID: NO 5) y Bacillus lentus. El símbolo * indica la ausencia de un resto de aminoácido específico comparado con subtilisina BPN'.

La Fig. 4 ilustra la respuesta aditiva de células T de 16 muestras de sangre mononuclear periféricas a péptidos que corresponden con una proteasa Bacillus lentus. El péptido E05 incluye la región que comprende restos correspondientes a 170-173 en proteasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens.

Fig. 5 ilustra la respuesta aditiva de células T de 10 muestras de sangre mononuclear periféricas a péptidos correspondientes a la molécula de subtilisina humana. Los péptidos F10, F9, F8 y F7 todos contienen la secuencia de aminoácidos DQMD que corresponde a la región que comprende restos correspondientes a 170-173 en proteasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens en el alineamiento de secuencia de la Fig. 3.

Fig. 6A y 6B/6C ilustra cadenas de aminoácidos correspondientes a péptidos derivados de la secuencia de proteasa procedente de Bacillus lentus y una subtilisina humana, respectivamente.

Fig. 7 ilustra la secuencia de aminoácidos de subtilisina humana (SEQ ID: NO 6).

Fig. 8 ilustra un alineamiento de secuencia de aminoácidos de proteasa BPN' (Bacillus amyloliquefaciens), proteasa SAVINASE (Bacillus lentus) y subtilisina humana (S2HSBT).

Fig. 9 ilustra la respuesta de células T a péptidos derivados de proteasa procedente de Bacillus lentus en una muestra cogida de un individuo que se sabe es hipersensible a la proteasa procedente de Bacillus lentus. El péptido E05 representa la región correspondiente a 170-173 en proteasa procedente de Bacillus amyloliquefaciens.

Fig. 10 ilustra la respuesta de células T a varias sustituciones de alanina en el péptido E05 de la proteasa procedente de Bacillus lentus en una muestra cogida de un individuo que se sabe es hipersensible a proteasa procedente de Bacillus lentus.

Descripción detallada de la invención

Se describe un método para identificar epítopos de células T. El método identifica epítopos de la siguiente manera: se combinan células dendríticas diferenciadas con células T indiferenciadas humanas CD4+ y/o CD8+ y con un péptido de interés. Más específicamente, un epítopo de célula T es reconocido mediante: (a) obtención de una solución de células monocíticas y una solución de células T indiferenciadas CD4+ y/o CD8+ a partir de una sola fuente de sangre; (b) diferenciación promovida en la mencionada solución de las células monocíticas dando células dendríticas; (c) combinación de la mencionada solución de células dendríticas y células T indiferenciadas CD4+ y/o CD8+ con un péptido de interés; (d) medida de la proliferación de células T en la mencionada etapa (c).

El péptido que interesa analizar se deriva de una proteína o enzima para la cual se desea o requiere una alergenicidad reducida. Usando este método, es posible identificar con precisión la localización de un epítopo que puede causar sensibilización en un individuo o muestra de individuos. En una versión particularmente efectiva del método de la invención, se preparan una serie de oligómeros peptídicos que corresponden a toda o una parte de la proteína o enzima. Por ejemplo, se produce una librería de péptidos que cubre una porción relevante o toda la proteína. Una manera particularmente útil de producir los péptidos es introducir un solapamiento en la librería de péptidos, por ejemplo, producir un primer péptido que corresponde a una secuencia de los aminoácidos 1-10 de la proteína objetivo, un segundo péptido que corresponde a la secuencia de los aminoácidos 4-14 de la proteína objetivo, un tercer péptido que corresponde a la secuencia de los aminoácidos 7-17 de la proteína objetivo, un cuarto péptido que corresponde a la secuencia de los aminoácidos 10-20 de la proteína objetivo, etc... hasta crear péptidos representativos que corresponden a toda la molécula. Analizando cada uno de los péptidos individuales en la prueba que se proporciona aquí, es posible identificar de manera precisa la localización de los epítopos reconocidos por las células T. En el ejemplo anterior, la reacción de un péptido específico en mayor medida que lo hagan sus vecinos facilitará la localización de la región anclaje del epítopo con una precisión de tres aminoácidos. Después de determinar la localización de estos epítopos, es posible alterar los aminoácidos dentro de cada epítopo hasta que el péptido produzca una respuesta frente a células T menos significativa.

"Célula que presenta antígeno" como se emplea aquí significa una célula del sistema inmunitario que presenta antígeno en su superficie que es reconocible por receptores en la superficie de células T. Ejemplos de células que presentan antígeno son las células dendríticas, células interdigitadas, células B activadas y macrófagos.

"Proliferación de célula T" como se emplea aquí significa la cantidad de células T producidas durante la incubación de células T con las células que presentan antígeno, con o sin antígeno.

"Línea base de proliferación de células T" como se emplea aquí significa la proliferación de células T que se observa normalmente en un individuo en respuesta a su exposición a células que presentan antígeno en ausencia de un antígeno peptídico o proteínico. Para los presentes propósitos, el nivel de proliferación de células T línea base se determinó, sobre la base de una muestra por cada individuo, como la proliferación de células T en respuesta a células que presentan antígeno en ausencia de antígeno.

"Epítopo de célula T" significa una secuencia de un péptido o una proteína que es reconocida por un receptor de célula T durante la iniciación de la respuesta inmunológica al péptido que comprende este antígeno. En general se cree que el reconocimiento de un epítopo de célula T por una célula T ocurre mediante un mecanismo en el cual la células T reconocen fragmentos de péptido de antígenos que están unidos a moléculas de mayor histocompatibilidad (MHC) de clase I o de clase II expresados en células que presentan antígeno (ver e.g., Moeller, G. Ed., Antigenic Requirements for Activation of MHC-Restricted Responses, Immunological Review, Vol. 98, p. 187 (copenhagen; Munksgaard)(1987).

Entonces, se modifican los epítopos determinados según la prueba proporcionada aquí para reducir el potencial alergénico de la proteína de interés. Preferiblemente, el epítopo a modificar produce un nivel de proliferación de células T tres veces superior que la proliferación de célula T línea base en una muestra. Cuando se modifica, el epítopo produce menos de tres veces la proliferación de línea base, preferiblemente menos de dos veces la proliferación de línea base y más preferiblemente menos o sensiblemente lo mismo que la proliferación de línea base en una muestra.

Preferiblemente, el epítopo se modifica de una de las siguientes maneras: (a) se sustituye la secuencia de aminoácidos del epítopo por una secuencia análoga de un homólogo humano de la proteína de interés; (b) se sustituye la secuencia de aminoácidos del epítopo por un secuencia análoga de un homólogo no humano de la proteína de interés, cuya secuencia análoga produce una menor respuesta alergénica debida al reconocimiento del epítopo de células T que la proteína de interés; (c) se sustituye la secuencia de aminoácidos del epítopo por una secuencia que imita de manera sustancial las características más importantes de la estructura terciaria del epítopo, pero que produce una menor respuesta alergénica debida al reconocimiento del epítopo de células T que la proteína de interés; o (d) por cualquier secuencia que produzca una respuesta alergénica debida al reconocimiento del epítopo de células T menor que la proteína de interés.

"Muestra" como se emplea aquí comprende células mononucleares que no han sido estimuladas, i.e., no están sensibilizadas al antígeno en cuestión.

"Homólogo" como se emplea aquí significa una proteína o enzima que tiene una acción catalítica, estructura y/o uso similar al de la proteína de interés. Es deseable encontrar un homólogo que tenga una estructura terciaria y/o primaria similar a la de la proteína de interés ya que la sustitución del epítopo de la proteína de interés por un segmento análogo en el homólogo reducirá el efecto perturbador del cambio. De este modo, enzimas estrechamente idénticas proporcionarán la fuente más deseable de sustituciones de epítopo. Alternativamente, si es posible, es ventajoso buscar análogos humanos para una proteína dada. Por ejemplo, la sustitución de un epítopo específico en un subtilisina de origen bacteriano por una secuencia de un análogo humano de subtilisina (i.e., subtilisina humana) debería dar como resultado una menor alergenicidad en la proteína bacteriana.

Se puede determinar una secuencia "análoga" asegurándose que la sustitución de los aminoácidos muestra una función similar, y estructura terciaria de los restos conservados de aminoácidos en la proteína de interés en o cerca del epítopo. Así, donde la región epítopa contiene, por ejemplo, una estructura de alfa-hélice o una lámina-beta, los aminoácidos sustituidos deberían mantener esta estructura específica.

Las proteasas son hidrolasas de carbonilo que generalmente actúan rompiendo enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Como se emplea aquí, "proteasa" significa una proteasa de origen natural o una proteasa recombinante. Las proteasas de origen natural incluyen \alpha-aminoacilpéptido hidrolasa, peptidilaminoácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serin carbopeptidasa, metalocarboxipeptidasa, tiol proteinasa, carboxilproteinasa y metaloproteinasa.

Las subtilisinas son proteasas bacterianas o fúngicas que generalmente actúan rompiendo enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Como se utiliza aquí, "subtilisina" significa una subtilisina de origen natural o una subtilisina recombinante. Se sabe fabricar una serie de subtilisinas de origen natural, a menudo secretadas por varias especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de esta serie no son completamente idénticos. Sin embargo, las subtilisinas en esta serie presentan el mismo tipo de actividad proteolítica o similar. Esta clase de proteasas de serina comparten una secuencia de aminoácidos común que define una tríada catalítica que las distingue de las quimotripsinas, una clase de proteasas de serina relacionadas. Tanto las subtilisinas como las quimotripsinas, proteasas de serina relacionadas, tienen una tríada catalítica que comprende aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con subtilisina el orden relativo de estos aminoácidos, leyendo desde el grupo amino al carboxilo terminal es aspartato-histidina-serina. En las proteasas relacionadas con quimotripsina el orden relativo, sin embargo, es histidina-aspartato-serina. Así, subtilisina aquí se refiere a una proteasa de serina que tiene la tríada catalítica de proteasas relacionadas con subtilisina. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a las subtilisinas identificadas en la Fig. 3 de aquí. Generalmente, y para los propósitos de la presente invención, la numeración de los aminoácidos en proteasas corresponde a los números asignados a la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada en la Fig. 1.

"Subtilisina recombinante" o "proteasa recombinante" se refieren a una subtilisina o proteasa en la que la secuencia de ADN que codifica la subtilisina o proteasa se modifica para producir una secuencia de ADN diferente (o mutante) que codifica la sustitución, supresión o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de origen natural. Los métodos descritos en la patente US 4.760.025, patente US 5.204.015 y patente US 5.185.258 son adecuados para producir tal modificación, y pueden ser combinados con los descritos aquí.

Las "subtilisinas no humanas" y el ADN que las codifica puede obtenerse a partir de diferentes organismos procarióticos y eucarióticos. Ejemplos adecuados de organismos procarióticos incluyen organismos gram negativo tales como E. Coli o Pseudomonas y bacterias gram positivo tales como Micrococcus o Bacillus. Ejemplos de organismos eucarióticos a partir de los cuales pueden obtenerse subtilisina y sus genes incluyen levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, y hongos tales como Aspergillus sp.

"Subtilisina humana" significa proteínas de origen humano que tienen una actividad catalítica de tipo subtilisina, e.g., la familia de las kexinas de proteasas humanas. En la Fig. 7 está representada la secuencia de un ejemplo de tal proteína. Adicionalmente, para el propósito de esta invención se consideran subtilisinas humanas derivados u homólogos de subtilisina humana, que incluyen los de fuentes no humanas tales como ratón o conejo, que retienen la capacidad esencial para hidrolizar enlaces peptídicos y tienen al menos 50%, preferiblemente al menos 65% y más preferiblemente al menos 80% de identidad con la proteína de la Fig. 7.

Una "variante de proteasa" tienen una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de una "proteasa precursora". Las proteasas precursoras incluyen proteasas de origen natural y proteasas recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa "deriva" de la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora mediante la sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación es de la "secuencia del ADN precursor" que codifica la secuencia de aminoácidos del la proteasa precursora más que la manipulación de la enzima proteasa precursora per se. Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia del ADN precursor incluyen los métodos descritos aquí, así como los métodos conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, EP 0 328299, WO89/06279 y las patentes y solicitudes a las que hacen referencia).

Los números de posición de los aminoácidos utilizados aquí se refieren a los asignados a la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada en la Fig. 1. La invención, sin embargo, no se limina a la mutación de esta subtilisina en particular, sino que abarca a proteasas precursoras que contienen restos de aminoácidos en las posiciones que son "equivalentes" a los restos identificados en particular en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. En una realización preferida de la presente invención, la proteasa precursora es subtilisina de Bacillus lentus y se han hecho sustituciones, eliminaciones o inserciones en los restos de aminoácidos equivalentes en B. lentus correspondientes a las listadas anteriormente.

Un resto (aminoácido) de una proteasa precursora es equivalente a un resto de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens si es, bien homólogo (i.e., correspondiente en posición bien en estructura primaria o terciaria) o análogo a un resto específico o porción de este resto en subtilisina de Bacillus amuloliquefaciens (i.e., que tiene la misma capacidad funcional o similar para combinar, reaccionar o interaccionar químicamente).

Con objeto de establecer la homología en la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una proteína precursora se compara directamente con la secuencia primaria de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y particularmente a un conjunto de restos que se sabe no varían en subtilisinas, y para los que se conoce la secuencia. Por ejemplo, la Fig. 2 muestra los restos conservados entre subtilisina de B. amyloliquefaciens y subtilisina de B. lentus. Después de alinear los restos conservados, permitiendo las inserciones o eliminaciones necesarias para mantener el alineamiento (i.e., evitando la eliminación de los restos conservados mediante eliminación e inserción al azar), se definen los restos equivalentes de aminoácidos particulares en la secuencia primaria de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. El alineamiento de los restos conservados preferiblemente debería conservar el 100% de tales restos. Sin embargo, también es adecuado para definir restos equivalentes el alineamiento de más del 75% o como poco 50% de los restos conservados. Debería mantenerse la conservación de la tríada catalítica, Asp32/His64/Ser221.

Por ejemplo, puede alinearse la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) y Bacillus lentus para proporcionar la máxima cantidad de homología entre las secuencias de aminoácidos. Una comparación de las secuencias indica que hay un número de restos conservados contenidos en cada secuencia. En la Fig. 2 están identificados los restos conservados entre BPN' y B. lentus.

Así, estos restos conservados pueden utilizarse para definir los correspondientes restos de aminoácidos equivalentes de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en otras subtilisinas tales como subtilisina de Bacillus lentus (PCT Nº. WO89/06279 publicada el 13 Julio, 1989), la enzima precursora proteasa preferida aquí, o la subtilisina denominada PB92 (EP 0 328 299), que es altamente idéntica de la subtilisina Bacillus lentus preferida. Las secuencias de aminoácidos de ciertas de estas subtilisinas están alineadas en las Figs. 3A y 3B para producir la máxima homología de restos conservados con la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Como puede verse, existen un número de eliminaciones en la secuencia de Bacillus lentus comparada con subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Así, por ejemplo, el aminoácido equivalente Val165 en subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en las otras subtilisinas es isoleucina para B. lentus y B. licheniformis.

Así, por ejemplo, el aminoácido en posición +170 es lisina (K) tanto en subtilisinas de B. amyloliquefaciens como de B. licheniformis, y arginina (R) en Sabinasa. Sin embargo, en una realización de las variantes de la proteasa de la invención, el aminoácido equivalente del +170 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens está sustituido por ácido aspártico (D). Las abreviaciones y los códigos de una letra para todos los aminoácidos en la presente invención están conforme the Patentin User Manual (GenBank, Mountain View, CA) 1990, p.101.

"Restos equivalentes" se pueden definir también mediante la determinación de la homología a nivel de estructura terciaria de una proteasa precursora cuya estructura terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. Los restos equivalentes se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más átomos de la cadena principal de un resto aminoácido particular de la proteasa precursora y de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C y O sobre O) están a 0,13 nm y preferiblemente a 0,1 nm una de otra después de su alineamiento. El alineamiento se consigue después que el mejor modelo se haya orientado y posicionado para dar el máximo solapamiento de las coordenadas atómicas de los átomos de la proteína que no son hidrógeno de la proteasa en cuestión en relación con la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. El mejor modelo es el modelo cristalográfico que da el factor R más bajo en los datos de difracción experimentales a la mejor resolución disponible.

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Los restos equivalentes que son funcionalmente análogos de un resto específico de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se definen como los aminoácidos de la proteasa precursora que pueden adoptar una conformación tal que altere, modifique o contribuya a la estructura de la proteína, la unión con el sustrato o la catálisis de la manera definida y atribuida a un resto específico de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Además, están esos restos de la proteasa precursora (para los cuales se ha obtenido una estructura terciaria por cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga hasta el punto que, aunque los átomos de la cadena principal de un resto dado puede no cumplir el criterio de equivalencia sobre la base de ocupación de una posición homóloga, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del resto se encuentran a 0,13 nm de los correspondientes átomos de la cadena lateral de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Las coordenadas de la estructura tridimensional de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens están expuestas en la publicación EPO Nº. 0 251 446 (equivalente a la patente de EE.UU 5.182.204 cuya descripción se incorpora aquí por referencia) y pueden utilizarse como se ha mencionado anteriormente para determinar los restos equivalentes a nivel de estructura terciaria.

Algunos de los restos identificados para sustitución, inserción o eliminación son restos conservados mientras otros no lo son. En el caso de los restos que no se conservan, la sustitución de uno o más aminoácidos se limita a sustituciones que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a la encontrada en la naturaleza. En el caso de los restos conservados, tales sustituciones no deberían dar como resultado una secuencia que se encuentra en la naturaleza. Las variantes de proteasa de la presente invención incluyen tanto las formas maduras de las variantes de proteasa como las pro- y preproformas de tales variantes de proteasa. Las prepro-formas son la construcción preferida porque facilita la expresión, secreción, y maduración de las variantes de proteasa.

"Prosecuencia" se refiere a una secuencia de aminoácidos unidos a la porción N-terminal de la forma madura de una proteasa que cuando se elimina da lugar a la aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas proteolíticas se encuentran en la naturaleza como productos proenzimas traslacionales y, en ausencia de un tratamiento traslacional, se expresan de esta manera. Una prosecuencia preferida para producir variantes de proteasa es la prosecuencia putativa de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, aunque se pueden emplear otras prosecuencias de proteasa.

Una "secuencia señal" o "prosecuencia" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos unidos a la porción N-terminal de una proteasa o a la porción N-terminal de una proproteasa que puede participar en la secreción de las forma madura o proforma de la proteasa. Esta definición de secuencia señal es funcional, se supone incluye todas esas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N-terminal del gen de la proteasa que participa en la secreción de la proteasa bajo condiciones naturales. La presente invención utiliza tales secuencias para efectuar la secreción de las variantes de proteasa como se define aquí. Una secuencia señal posible comprende los primeros siete restos de aminoácidos de la secuencia señal de subtilisina de Bacillus subtilis fusionada al resto de la secuencia señal de subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).

Una "preproforma" de una variante de proteasa consiste en la forma madura de la proteasa que tiene una prosecuencia unida de manera operable al extremo amino de la proteasa y una secuencia "pre" o "señal" unida de manera operable al extremo amino de la prosecuencia.

El "vector de expresión" se refiere al fragmento de ADN que contiene una secuencia de ADN que está unida de manera operable a una secuencia control adecuada capaz de efectuar la expresión del mencionado ADN en un anfitrión adecuado. Tales secuencias control incluyen un promotor para efectuar la trascripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal trascripción, una secuencia que codifica sitios de mARN ribosómico adecuados y secuencias que controlan la terminación de la trascripción y la traslación. El vector puede ser un plásmido, una partícula fago, o simplemente una inserción genómica potencial. Una vez transformado en un anfitrión adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma anfitrión, o puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" son a veces utilizados indistintamente, ya que actualmente el plásmido es la forma usualmente más utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir estas otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que son, o se convierten en, conocidas en la técnica.

Las "células anfitrión" utilizadas en la presente invención generalmente son anfitriones procarióticos o eucarióticos que preferiblemente han sido manipulados mediante los métodos descritos en la patente EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) para convertirlos en incapaces de segregar endoproteasa enzimáticamente activa. Una célula anfitrión preferida para expresar proteasa es la cadena Bacillus BG2036 que es deficiente en proteasa neutra y proteasa alcalina (subtilisina) enzimáticamente activa. La construcción de la cadena BG2036 se describe en detalle en la patente EE.UU. 5.264.366. Otras células anfitrión para expresar proteasa incluyen Bacillus subtilis 1168 (también descrita en la patente EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) y la patente EE.UU. 5.264.366, cuya descripción se incorpora aquí por referencia) así como cualquier cadena de Bacillus tales como B. licheniformis, B. lentus, etc.

Las células hospedantes transformadas o transfectadas con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante. Tales células hospedantes transformadas son capaces de replicar vectores que codifican las variantes de proteasa o expresar la variante de proteasa deseada. En el caso de vectores que codifican la pre- o preproforma de la variante de proteasa, tales variantes, cuando se expresan, son segregadas típicamente por las células hospedantes en el medio de células hospedantes.

"Unidas de manera operable", cuando se describe la relación entre dos regiones de ADN, simplemente significa que están relacionadas funcionalmente una a la otra. Por ejemplo, un prosecuencia está unida operablemente a un péptido si funciona como una secuencia señal, que participa en la secrección de la forma madura de la proteína, lo más probablemente implicando una rotura de la secuencia señal. Un promotor está unido operablemente a la secuencia codificadora si controla la transcripción de la secuencia; un centro de complejación ribosómico está unido operablemente a una secuencia codificadora si se sitúa de tal manera que permite la traslación.

Los genes que codifican la proteasa subtilisina precursora natural pueden obtenerse de acuerdo con los métodos generales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos normalmente comprenden sintetizar muestras marcadas que tienen secuencias putativas que codifican regiones de la proteasa de interés, preparar librerías genómicas a partir de microorganismos que expresan la proteasa, y chequear las librerías para el gen de interés mediante hibridación de la muestra.

La proteasa clonada se utiliza entonces para transformar una célula hospedante con objeto de expresar la proteasa. Entonces, el gen de proteasa se liga a un plásmido con un gran número de copias. Este plásmido se replica en las hospedantes, en el sentido de que contiene los elementos necesarios bien conocidos para la replicación del plásmido: un promotor unido de manera operativa al gen en cuestión (que puede ser suministrado como el promotor homólogo del propio gen si es reconocido; i.e., transcrito, por la hospedante), una terminación de transcripción y una región de poliadenilación (necesaria para estabilizar el ARNm transcrito por la hospedante a partir del gen de la proteasa en ciertas células hospedantes eucarióticas) que es exógeno o es suministrado mediante la región del gen de la proteasa del terminador endógeno y, deseablemente, una selección de genes tales como un gen resistente a los antibióticos que permite un mantenimiento del cultivo continuo de células hospedantes infectadas con plásmido mediante su crecimiento en medios que contienen antibióticos. Los plásmidos con un gran número de copias también contienen un origen de replicación para la hospedante, por lo tanto permitiendo que un gran número de plásmidos puedan generarse en el citoplasma sin limitaciones cromosómicas. Sin embargo, dentro del alcance de la presente está integrar copias múltiples del gen de la proteasa en el genoma anfitrión. Esto se facilita mediante organismos procarióticos y eucarióticos que son particularmente susceptibles a la recombinación homóloga.

En una realización, el gen puede se un gen natural tal como el procedente de B. lentus o B. amyloliquefaciens. Alternativamente, puede fabricarse un gen sintético que codifique una proteasa precursora natural o mutante. En tal aproximación, se determina la secuencia del ADN y/o aminoácidos de la proteasa precursora. Entonces, se sintetizan múltiples fragmentos sintéticos de ADN de una sola hebra, que solapan, los cuales después de hibridarse y ligarse producen un ADN sintético que codifica la proteasa precursora. En el Ejemplo 3 de la patente de EE.UU 5.204.015, cuya descripción se incorpora aquí por referencia, se expone un ejemplo de construcción de gen sintético.

Una vez que el gen de la proteasa precursora natural o sintético se ha clonado, se realizan cierto número de modificaciones para aumentar el uso del gen más allá de la síntesis de la proteasa precursora natural. Tales modificaciones incluyen la producción de proteasas recombinantes tal como se describe en la patente de EE.UU. 4.760.025 (RE 34.606) y publicación EPO nº 0 251 446 y la fabricación de variantes de proteasas descritas allí.

El siguiente método de mutagénesis por inserción de casete puede utilizarse para facilitar la construcción de variantes de proteasa de la presente invención, aunque pueden utilizarse otros métodos. En primer lugar, se obtiene el gen natural que codifica la proteasa y se secuencia completamente o en parte. Entonces, se escanea la secuencia para el punto en el que se desea realizar una mutación (eliminación, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Se evalúan las secuencias que están al lado de este punto por si hubiera sitios de restricción para reemplazar un segmento pequeño del gen por una variedad de oligonucleótidos, los cuales cuando se expresen codificarán las diferentes mutantes. Tales sitios de restricción son preferiblemente sitios únicos en el gen de la proteasa que facilitan la sustitución del segmento del gen. Sin embargo, puede utilizarse cualquier sitio de restricción conveniente que no sea demasiado redundante en el gen de la proteasa, teniendo en cuenta que los fragmentos de gen generados mediante digestión por restricción pueden reensamblarse con la secuencia adecuada. Si no hay sitios de restricción en las localizaciones a una distancia conveniente del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), se generan tales sitios mediante nucleótidos de sustitución en el gen, del tal manera que no se cambian ni el esqueleto lector ni los aminoácidos codificados en la construcción final. Con objeto de cambiar su secuencia para conformar la secuencia deseada, la mutación del gen se lleva a cabo mediante extensión del M13 primer, de acuerdo con métodos generalmente conocidos. La misión de localizar regiones flanqueantes adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitios de restricción convenientes se hace de manera rutinaria mediante el estudio de la redundancia del código genético, un mapa de la restricción del enzima del gen y el gran número de enzimas de restricción diferentes. Fíjense que si se dispone de un sitio de restricción flanqueante conveniente, sólo es necesario utilizar el método anterior en relación con la región flanqueante que no contiene un sitio.

Una vez que se ha clonado el ADN natural o ADN sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones a ser mutadas se digieren con las enzimas de restricción afines y una pluralidad de casetes oligonucleotídicas con extremos complementarios se ligan en el gen. La mutagénesis se simplifica con este método ya que todos los oligonucleótidos pueden ser sintetizados de modo que tengan los mismos sitios de restricción, y no se necesita ningún enlazador sintético para crear los sitios de restricción.

El objetivo es asegurar una proteasa subtilisina variante que tenga el potencial alergénico alterado comparado con el de la proteasa subtilisina precursora, ya que la disminución de tal potencial permite un uso más seguro de la enzima. Si bien las variantes de la proteasa subtilisina de la presente invención son útiles para disminuir el potencial alergénico, las mutaciones que se especifican aquí pueden utilizarse en combinación con mutaciones conocidas en la técnica para dar como resultado estabilidades térmicas alteradas y/o especificidades por el sustrato alteradas, actividades modificadas o estabilidades alcalinas alteradas comparadas con las de los precursores.

Por consiguiente, la presente invención va dirigida a alterar la capacidad del epítopo de las células T que incluye las posiciones de los restos 170-173 en Bacillus lentus para inducir proliferación de células T. Una realización particularmente preferida de la invención comprende hacer las tres modificaciones R170D, Y171Q y N173D. De modo similar, como se ha discutido detalladamente más arriba, se cree que la modificación de los correspondientes restos en cualquier proteasa dará como resultado la neutralización de un epítopo de célula T fundamental en esa proteasa. Así, en combinación con las mutaciones aquí descritas en la región que corresponde a los restos aminoacídicos 170-173, se pueden usar sustituciones en posiciones que corresponden a N76D/S103A/V104I/G159D opcionalmente en combinación con una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en posiciones que corresponden a V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, y T260A de la subtilisina de Bacillus amylofolyquefaciens, además de disminuir el potencial alergénico de la proteasa variante de la invención, para modular la estabilidad global y/o la actividad proteolítica de la enzima. De manera similar, las sustituciones proporcionadas aquí se pueden combinar con la mutación en la Asparagina (N) en subtilisina de Bacillus lentus en la posición equivalente +76 a Aspartato (D) en combinación con las mutaciones S103A/V104I/G159D y opcionalmente en combinación con una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones correspondientes a V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R y T260A de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, para producir un aumento de la estabilidad y/o un aumento de la actividad de la enzima mutante resultante.

Las realizaciones más preferidas de la invención incluyen las siguientes combinaciones específicas de restos sustituidos correspondientes a las posiciones:

N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R; y V68A/N76D//S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Estas sustituciones se hacen preferiblemente en la subtilisina de Bacillus lentus (recombinante o natural), aunque las sustituciones también se pueden hacer en cualquier proteasa de Bacillus.

Sobre la base de los resultados de escrutinio obtenidos con las proteasas variantes, las mutaciones indicadas más arriba en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens son importantes para la actividad proteolítica, la eficacia y/o la estabilidad de estas enzimas y la limpieza o eficacia del lavado de estas enzimas variantes.

Muchas de las variantes de proteasa de la invención son útiles en la formulación de diversas composiciones detergentes. Un gran número de compuestos conocidos son tensioactivos adecuados, útiles en composiciones que comprende las mutantes de proteasa de la invención. Estos incluyen detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, o zwiteriónicos, tal como se describe en la patente de EE.UU. 4.404.128 de Barry J. Anderson y la patente de EE.UU. 4.261.868 de Jiri Flora, et al. Una formulación detergente adecuada es la descrita en el Ejemplo 7 de la patente de EE. UU. 5.204.015 (previamente incorporada por referencia). La técnica es familiar con las diferentes formulaciones que pueden utilizarse como composiciones limpiadoras. Además de lo que tienen en común con las típicas composiciones limpiadoras, se entiende fácilmente que las variantes de proteasa de la presente invención pueden utilizarse para cualquier propósito que utilice proteasas de tipo nativas o salvajes. Así, estas variantes pueden utilizarse, por ejemplo, en aplicaciones de jabones líquidos o en pastilla, formulaciones para el cuidado de la vajilla, soluciones o productos limpiadores de lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de restos, aplicaciones textiles, tales como enzimas de fusión-rotura en producción de proteínas, etc. Las variantes de la presente invención pueden comprender, además de una alergenicidad reducida, una actuación mejorada en una composición detergente (comparada con la de la precursora). Tal como se utiliza aquí, la actuación mejorada en un detergente se define como limpieza mejorada de ciertas manchas sensibles a los enzimas tales como hierba o sangre, tal como se determina mediante la evaluación usual después de un ciclo de lavado estándar.

Las proteasas de la invención pueden formularse como detergentes conocidos en polvo y líquidos que tienen un pH entre 6,5 y 12,0 a niveles de aproximadamente .01 a aproximadamente 5% (preferiblemente .1 a 5%) en peso. Estas composiciones detergentes limpiadoras también pueden incluir otras enzimas tales como proteasas conocidas, amilasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas, así como reforzantes y estabilizantes.

La adición de las proteasas de la invención a composiciones limpiadoras convencionales no crea ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuado para el detergente es también adecuado para las presentes composiciones, siempre que el pH esté dentro del intervalo anterior, y la temperatura esté por debajo de la temperatura de desnaturalización de la proteasa descrita. Además, las proteasas de la invención pueden utilizarse en composiciones limpiadoras son detergentes, de nuevo solas o en combinación con reforzantes y estabilizantes.

Las proteasas variantes de la presente invención pueden incluirse en piensos para animales tales como parte de los aditivos del pienso para animales, tal como se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.612.055; patente de EE.UU 5.314.692; y patente de EE.UU. 5.147.642.

Un aspecto de la invención es una composición para el tratamiento de un textil que incluye proteasas variantes de la presente invención. La composición puede utilizarse para tratar por ejemplo seda o lana, tal como se describe en publicaciones tales como RD 216.034; EP 134.267; US 4.533.359 y EP 344.259.

Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no pretende ser una limitación al alcance de las reivindicaciones.

Las variantes se pueden escrutar en busca de actividad proteolítica de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Variantes de proteasas preferidas incluyen las sustituciones múltiples en posiciones correspondientes a:

N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/D236H; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R; y V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T2 60A de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

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Ejemplos Ejemplo 1 Ensayo para la identificación de epítopos de células T utilizando células T humanas indiferenciadas

Se colectaron células sanguíneas periféricas humanas recientes procedentes de seres humanos no estimulados previamente, i.e., personas que se sabía no habían sido expuestas o sensibilizadas a proteasa de Bacillus lentus, para la determinación de los epítopos antigénicos en la protasa procedente de Bacillus lentus y subtilisina humana. Seres humanos no estimulados previamente quiere decir que el individuo no es conocido por haber sido expuesto a o haber desarrollado una reacción a la proteasa en el pasado. Se prepararon células sanguíneas mononucleares periféricas (almacenadas a temperatura ambiente, de no más de 24 horas) para utilizarlas como se explica a continuación: aproximadamente 30 mls de una solución de preparación de capa leucocitaria procedente de una unidad de sangre total se llevó a 50 ml con una solución tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) y se dividió en dos tubos. La capa de debajo de las muestras se protegieron con 12,5 ml de un medio de separación por densidad lymphoprep a temperatura ambiente (densidad Nycomed 1,077 g/ml). Los tubos se centrifugaron durante treinta minutos a 600G. Se recogió la interfase de las dos fases, se juntaron y lavaron en DPBS. La densidad de células de la solución resultante se midió con un hemocitómetro. La viabilidad se midió mediante exclusión de tripan azul.

A partir de la solución resultante se preparó un cultivo de células dendríticas diferenciadas a partir de la muestra de células mononucleares de sangre periférica con una densidad de 10^{8} células por 75 ml de matraz de cultivo en una solución tal como se indica a continuación:

(1)

50 ml de medio sin suero AIM V (Gibco) se complementaron con una dilución 1:100 de beta-mercaptoetanol (Gibco). Los matraces se dejaron en posición horizontal durante dos horas a 37ºC en 5% de CO_{2} para permitir la adherencia de los monocitos a las paredes del matraz.

(2)

La diferenciación de las células monocito en células dendríticas se hizo de la siguiente manera: se eliminaron las células no adherentes y las células adherentes resultantes (monocitos) se combinaron con 30 ml de AIM V, 800 unidades/ml de GM-CSF (Endogen) y 500 unidades/ml de IL-4 (Endogen); la mezcla resultante se cultivó durante 5 días bajo condiciones de 37ºC en 5% CO_{2}. Después de cinco días, se añadió la citoquina TNF\alpha (Endogen) hasta 0,2 unidades/ml, y se añadió la citoquina IL-1\alpha (Endogen) hasta una concentración final de 50 unidades/ml y la mezcla se incubó a 37ºC en 5% CO_{2} durante dos días más.

(3)

El séptimo día se añadió Mitomicina C hasta una concentración de 50 microgramos/ml para parar el crecimiento del cultivo de las ahora diferenciadas células dendríticas. La solución se incubó durante 60 minutos a 37ºC en 5% CO_{2}. Las células dendríticas se recogieron raspando suavemente las células adherentes del fondo del matraz con un raspador de células. Entonces, las células adherentes y las no adherentes se centrifugaron a 600G durante 5 minutos, se lavaron en DPBS y se contaron.

(4)

Las células dendríticas preparadas se colocaron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a 2x10^{4}/poci- llo en 100 microlitros de volumen total de medio AIM V. Las células T CD4+ se prepararon a partir de alícuotas congeladas de las muestras de células sanguíneas periféricas utilizadas para preparar las células dendríticas utilizando el kit Cellet CD4+ humano (Biotex) según las instrucciones del fabricante con las modificaciones siguientes: las alícuotas se descongelaron y se lavaron de tal manera que se aplicaron aproximadamente 10^{8} células por columna Cellect; las células se suspendieron de nuevo en 4 ml de DPBS y 1 ml del reactivo Cell del Cellect Kit, la solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 min. La solución resultante se centrifugó durante cinco minutos a 600G a temperatura ambiente y la bolita fue suspendida de nuevo en 2 ml de DPBS y se aplicó a las columnas Cellect. Las aguas residuales de la columna se recogieron en suero humano al 2% en DPBS. La solución de células CD4+ resultante se centrifugó, suspendida de nuevo en medio AIMV y se midió su densidad.

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La suspensión de células T CD4+ se suspendió de nuevo hasta una cuenta de 2x10^{6}/ml en medio AIMV para facilitar el manejo eficaz de la placa de 96 pocillos.

El antígeno del péptido se prepara a partir de una solución estándar 1M en DMSO mediante dilución en medio AIMV en proporción 1:10. 10 microlitros de solución estándar se colocan en cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene las células dendríticas diferenciadas. Además, se añaden a cada pocillo 100 microlitros de la solución de células T CD4+ diluida preparada como arriba. Controles útiles incluyen blancos de DMSO diluido, y controles positivos de toxoide del tétanos.

Las concentraciones finales en cada pocillo, con un volumen total de 210 microlitros son como se indica a continuación:

2x10^{4} CD4+

2x10^{5} células dendríticas (R:S de 10:1)

5 mM péptido.

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Ejemplo 2 Identificación de Epítopos de Células T en Proteasa de Bacillus lentus y subtilisina Humana

Los péptidos empleados en el ensayo descrito en el ejemplo 1 se prepararon basándose en la secuencia de aminoácidos de Bacillus lentus y de subtilisina humana. Los antígenos del péptido se diseñaron como se indica a continuación. A partir de la secuencia de aminoácidos completa de proteasa bien de subtilisina humana o proteasa de Bacillus lentus proporcionada en la Figura 1, se prepararon sintéticamente 15 mers, cada uno de los 15 mer solapándose con el anterior y el siguiente excepto para tres restos.

Los péptidos empleados corresponden a cadenas de restos de aminoácidos en Bacillus lentus como se proporciona en Figura 8, y los péptidos corresponden a los restos de aminoácidos en subtilisina humana como se proporciona en Figura 7. Los péptidos empleados que corresponden a las proteasas se proporcionan en la Figura 6. Todos los ensayos se llevaron a cabo al menos en duplicado. Todos los ensayos presentados enseñan respuestas de control positivas robustas al antígeno toxoide del tétanos. Las respuestas se promediaron en cada experimento, entonces se normalizaron respecto a la respuesta de la línea base. Se anotó un suceso positivo cuando la respuesta era al menos 3 veces la respuesta de la línea base.

Se ajustó la respuesta inmunogénica (i.e. proliferación de células T) a los péptidos preparados a partir de la subtilisina humana y Bacillus lentus y se proporciona en las Figuras 4 y 5, respectivamente. La proliferación de células T se midió mediante el método del tritio incorporado. Los resultados mostrados en las Figuras 4 y 5 a modo de comparación de la respuesta aditiva imunogénica a los diferentes péptidos en 10 individuos (Figura 4) y 16 individuos (Figura 5). La respuesta se indica como la respuesta aditiva en la cual 1,0 es igual a la respuesta de la línea base para cada muestra. Así, en la Figura 4, una lectura de 10,0 o menos es la respuesta de la línea base y en la Figura 5 una lectura de 16,0 o menos es la respuesta línea base.

Como se indica en la Figuras 4 y 5, la respuesta imunogénica de las muestras de sangre no estimulada previamente de individuos no sensibilizados muestra una respuesta alergénica marcada en el fragmento peptídico procedente de Bacillus lentus que corresponde a los restos 170-173 de la proteasa de Bacillus amyloliquefaciens. De manera esperada, el fragmento correspondiente en subtilisina humana provoca meramente una respuesta de línea base.

La Fig. 9 enseña la respuesta de células T a los péptidos derivados de la proteasa de Bacillus lentus en una muestra tomada a un individuo conocido por ser hipersensible a la proteasa de Bacillus lentus. El péptido E05 representa la región correspondiente a 170-173 en la proteasa procedente de Bacillus amyloloquefaciens. Como se muestra en la Figura 9, el individuo hipersensible tuvo una respuesta fuerte al epítopo de célula T representado por el péptido E05. Este resultado confirma que, mediante la puesta en práctica del ensayo según la invención, es posible predecir los principales epítopos identificados mediante las células T de un individuo hipersensible.

La Fig. 10 enseña la respuesta de células T a varias sustituciones de alanina en el péptido E05 derivado de la proteasa de Bacillus lentus en una muestra tomada a un individuo conocido por ser hipersensible a la proteasa de Bacillus lentus. La sustituciones de alanina se emplearon como sustituciones con el fin de determinar el papel de cualquier resto específico dentro del epítopo. La leyenda de la Figura 10 se refiere a la posición del péptido en el cual una alanina fue sustituida, i.e., en el péptido E06 (secuencia GSISYPARYANAMAV), G hasta A = 2, S hasta A = 3, I hasta A = 4, S hasta A = 5, Y hasta A = 6, P hasta A = 7, R hasta A = 8, Y hasta A = 9, N hasta A = 10, M hasta A = 11 y V hasta A = 12. Como se indica en la Figura 10, la sustitución de cualquiera de los restos R170A, Y171A y/o N173A en la proteasa de Bacillus lentus da como resultado una respuesta espectacularmente reducida en la muestra de sangre del individuo hipersensible.

A partir de estos resultados, parece que los restos 170, 171 y 173 dentro de este péptido son críticos para la respuesta de células T. En consecuencia, además parece que estos restos son ampliamente responsables de la iniciación de la reacción alergénica dentro de la proteasa procedente de Bacillus lentus.

Claims (16)

1. Una variante de la proteasa subtilisina que comprende una sustitución hecha en una o más posiciones en una proteasa subtilisina precursora correspondiente a K170D y/o S173D de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

2. La variante de la proteasa subtilisina según la reivindicación 1, que comprende además una sustitución en una o más posiciones en una proteasa subtilisina precursora equivalente a las seleccionadas del grupo que consiste en Y171Q, N76D, S103A, V104I, G159D, V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, y T260A.

3. La variante de la proteasa subtilisina según la reivindicación 2, que se deriva de una subtilisina de Bacillus.

4. La variante de la proteasa subtilisina según la reivindicación 3 que se deriva de subtilisina de Bacillus lentus o de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

5. Un ADN que codifica una variante de la proteasa subtilisina de la reivindicación 1.

6. Un vector de expresión que codifica el ADN de la reivindicación 5.

7. Una célula hospedante transformada con el vector de expresión de la reivindicación 6.

8. Una composición de limpieza que comprende la variante de la proteasa subtilisina de la reivindicación 1.

9. Un pienso que comprende la variante de la proteasa subtilisina de la reivindicación 1.

10. Una composición para tratar un textil, que comprende la variante de la proteasa subtilisina de la reivindica-
ción 1.

11. Una variante de la proteasa subtilisina según la reivindicación 1, que comprende los conjuntos de sustitución combinada seleccionados del grupo que consiste en las posiciones correspondientes a:

K170D/Y171Q/S173D; N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H; V68A/N76D/S103AN104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R; y V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

12. Un método para reducir la alergenicidad de una proteasa subtilisina, que comprende hacer una sustitución en una proteasa precursora en al menos una o más posiciones que corresponden a K170D, Y171Q y/o S173D de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, para producir una variante de la proteasa subtilisina que tiene menor alergenicidad que la proteasa subtilisina precursora.

13. Un método según la reivindicación 12, que comprende además hacer una o más sustituciones en la proteasa subtilisina precursora equivalente a las seleccionadas del grupo que consiste en N76D, S103A, V104I, G159D, V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R y T260A.

14. Un método según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde la proteína subtilisina precursora es una subtilisina de Bacillus.

15. Un método según la reivindicación 14, en donde la proteasa subtilisina precursora es subtilisina de Bacillus lentus o subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende modificar un ADN que codifica la proteasa subtilisina precursora para producir un ADN modificado que codifica la variante de la proteasa subtilisina.