ES2339224T3 - Mezclas monodispersas de conjugados de farmaco de calcitonina con oligomero que comprende polietilenglicol, sus usos, y metodo para obtenerlas. - Google Patents

Mezclas monodispersas de conjugados de farmaco de calcitonina con oligomero que comprende polietilenglicol, sus usos, y metodo para obtenerlas. Download PDF

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ES2339224T3 ES02732030T ES02732030T ES2339224T3 ES 2339224 T3 ES2339224 T3 ES 2339224T3 ES 02732030 T ES02732030 T ES 02732030T ES 02732030 T ES02732030 T ES 02732030T ES 2339224 T3 ES2339224 T3 ES 2339224T3
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Nnochiri N. Ekwuribe
Christopher H. Price
Aslam M. Ansari
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Abstract

Una mezcla monodispersa de conjugados en la que alrededor de 100 por cien de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular, una mezcla sustancial y puramente monodispersa de conjugados en la que al menos alrededor de 95 por ciento de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular, o una mezcla puramente monodispersa de conjugados en la que alrededor de 100 por cien de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular; en la que los conjugados comprenden calcitonina de salmón acoplada a un primer oligómero y a un segundo oligómero; en la que cada oligómero comprende un resto de polietilenglicol que tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 subunidades de polietilenglicol y uno o más restos lipófilos; en la que el uno o más restos lipófilos se seleccionan de un resto alquilo lineal, saturado o insaturado que tiene 1 a 28 átomos de carbono, y un resto de ácido graso lineal, saturado o insaturado que tiene 2 a 18 átomos de carbono; en la que el primer oligómero está acoplado covalentemente a una función amina de Lys11 de la calcitonina de salmón, y el segundo oligómero está acoplado covalentemente a una función amina de Lys18 de la calcitonina de salmón.

Description

Mezclas monodispersas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que comprende polietilenglicol, sus usos, y métodos para obtenerlas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a conjugados de fármaco con oligómero, y, más particularmente, a conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero.
Antecedentes de la invención
La calcitonina es una hormona de origen natural con una semivida corta que se cree que actúa directamente sobre osteoclastos (vía receptores sobre la superficie celular para calcitonina). Esta acción puede inhibir directamente la resorción ósea osteoclástica, lo que puede conducir a efectos séricos hipocalcémicos y/o hipofosfatémicos. La calcitonina puede ser útil para tratar diversos trastornos óseos, incluyendo osteoporosis y enfermedad de Paget.
La osteoporosis es una osteopatía en la que el tejido óseo se mineraliza normalmente, pero la cantidad de hueso disminuye y la integridad estructural del hueso trabecular se ve alterada. El hueso cortical se hace más poroso y más delgado. Esto hace al hueso más débil y más tendente a la fractura. En los Estados Unidos de América, alrededor de 21% de mujeres postmenopáusicas tienen osteoporosis (baja densidad ósea), y alrededor de 16% han tenido una fractura. En mujeres mayores de 80, alrededor de 40% han experimentado una fractura de la cadera, vértebras, brazo, o pelvis. La población de hombres y mujeres ancianos está aumentando, y por lo tanto el número de personas con osteoporosis está aumentando.
La calcitonina, dada como una inyección subcutánea, ha mostrado mejoras significativas en la densidad ósea; sin embargo, se ha dado a conocer una incidencia elevada de efectos secundarios, incluyendo dolor en el sitio de la inyección, sofoco y náusea, lo que puede limitar el uso del fármaco.
La enfermedad de Paget del hueso es un trastorno óseo metabólico de origen desconocido que normalmente afecta a personas ancianas. La enfermedad provoca una formación incrementada e irregular de hueso a medida que los osteocitos, que son responsables de disolver el hueso viejo del cuerpo y sustituirlo por nuevo, pierden el control. Durante un período de tiempo, el nuevo hueso deformado se hace más grande, más débil, y tiene más vasos sanguíneos que el hueso normal. A diferencia del hueso normal, la estructura es irregular y consecuentemente más débil, lo que hace que tenga tendencia a la fractura incluso después de una pequeña lesión.
En la forma más leve, la enfermedad no tiene síntomas. En casos más graves, el dolor puede ser intenso. La progresión imparable de la enfermedad puede hacer que los huesos se arqueen, el cráneo puede aumentar de tamaño, y la médula espinal se puede curvar. A medida que los huesos se agrandan, pueden provocar presión en los nervios cercanos, lo que puede dar como resultado debilidad muscular. En el caso de un grave agrandamiento del cráneo, esta presión puede dar como resultado sordera, metamorfopsia, mareos y acúfenos.
La calcitonina puede ser eficaz tratando trastornos de la remodelación esquelética incrementada, tal como enfermedad de Paget. En el tratamiento de la enfermedad de Paget, el uso crónico de calcitonina puede producir una reducción de los síntomas a largo plazo; sin embargo, los efectos secundarios de la administración de calcitonina pueden incluir náusea, hinchamiento de las manos, urticaria, y retortijón.
Diversas referencias han propuesto conjugar polipéptidos, tales como calcitonina, con mezclas polidispersas de polietilenglicol o polímeros que contienen polietilenglicol. Por ejemplo, la patente U.S. nº 5.359.030 de Ekwuribe propone conjugar polipéptidos tales como calcitonina con mezclas polidispersas de polímeros glucolipídicos modificados con polietilenglicol, y mezclas polidispersas de polímeros de ácidos grasos modificados con polietilenglicol. Se prefiere que el peso molecular medio numérico del polímero que resulta de cada combinación esté en el intervalo de alrededor de 500 a alrededor de 10.000 Daltons.
La polidispersidad de las mezclas poliméricas y conjugados descritos en Ekwuribe es probablemente el resultado del uso de polietilenglicol polidisperso en la síntesis de polímeros. PEG se produce típicamente mediante polimerización de apertura del anillo de óxido de etileno catalizada por bases. La reacción se inicia añadiendo óxido de etileno a etilenglicol, con hidróxido de potasio como catalizador. Este proceso da como resultado una mezcla polidispersa de polímeros de polietilenglicol que tienen un peso molecular medio numérico en un intervalo dado de pesos moleculares. Por ejemplo, los productos de PEG ofrecidos por Sigma-Aldrich de Milwaukee, Wisconsin, se proporcionan en mezclas polidispersas tales como PEG 400 (M_{n} 380-420); PEG 1.000 (M_{n} 950-1.050); PEG 1.500 (M_{n} 1.400-1.600); y PEG 2.000 (M_{n} 1.900-2.200).
Higgins et al. (British Journal of Pharmacology, 134, Proceedings Supplement, 2001-11, 53P) describen la bioeficacia de un análogo de calcitonina de salmón conjugado covalentemente a oligómeros anfifílicos.
\newpage
El documento WO 97/14740 A1 describe el suministro oral de calcitonina mediante conjugación con oligómeros anfifílicos. Los oligómeros anfifílicos consisten en un segmento de polietilenglicol (PEG_{n}, n = de media 7, 8, 9, 12 y 20) y una unidad alquílica o una unidad de azúcar protegido.
Radha Krishnan B. et al. (Proceedings of the Controlled Release Society, 26, 1999, 149-150) describen calcitonina de salmón conjugada con oligómeros anfifílicos que consisten en un segmento de PEG hidrófilo y una unidad alquílica hidrófoba.
La patente US 6.191.105 describe insulina acoplada covalentemente con un polímero que incluye (i) un resto de polialquilenglicol lineal y (ii) un resto lipófilo, en el que la insulina, el resto de polialquilenglicol lineal y el resto lipófilo están dispuestos conformacionalmente en relación entre sí de forma que la insulina en la composición tiene una resistencia in vivo aumentada frente a la degradación enzimática, con relación a la insulina sola.
El documento WO 00/78302 A describe un conjugado de insulina, PEG, y ácido oleico, que se puede administrar oralmente.
El documento WO 00/09073 A describe un compuesto terapéutico conjugado con un oligómero, en el que el oligómero comprende un resto lipófilo acoplado a un resto hidrófilo.
Es deseable proporcionar mezclas no polidispersas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en las que el oligómero comprende polietilenglicol.
Sumario de la invención
Se ha descubierto inesperadamente que una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que comprende polietilenglicol según realizaciones de la presente invención puede reducir los niveles de calcio sérico en 10, 15 o incluso 20 por ciento o más. Además, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que comprende polietilenglicol según realizaciones de la presente invención puede ser más eficaz sobreviviendo en un modelo in vitro de digestión intestinal que calcitonina no conjugada. Además, mezclas de conjugados de calcitonina con oligómero que comprende polietilenglicol según realizaciones de la presente invención pueden mostrar una mayor biodisponibilidad que la calcitonina no conjugada.
Según realizaciones de la presente invención, se proporciona una mezcla monodispersa de conjugados en la que alrededor de 100 por cien de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular, una mezcla sustancial y puramente monodispersa de conjugados en la que al menos alrededor de 95 por ciento de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular, o una mezcla puramente monodispersa de conjugados en la que alrededor de 100 por cien de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular;
en la que los conjugados comprenden calcitonina de salmón acoplada a un primer oligómero y a un segundo oligómero;
en la que cada oligómero comprende un resto de polietilenglicol que tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 subunidades de polietilenglicol y uno o más restos lipófilos;
en la que el uno o más restos lipófilos se seleccionan de un resto alquilo lineal, saturado o insaturado que tiene 1 a 28 átomos de carbono, y un resto de ácido graso lineal, saturado o insaturado que tiene 2 a 18 átomos de carbono;
en la que el primer oligómero está acoplado covalentemente a una función amina de Lys^{11} de la calcitonina de salmón, y el segundo oligómero está acoplado covalentemente a una función amina de Lys^{18} de la calcitonina de salmón. El resto de polietilenglicol tiene al menos 2, 3 ó 4 subunidades de polietilenglicol, y, lo más preferible, tiene al menos 7 subunidades de polietilenglicol. El oligómero comprende además un resto lipófilo. El conjugado está preferiblemente equilibrado anfifílicamente, de forma que el conjugado es soluble de forma acuosa y es capaz de penetrar membranas biológicas.
Según otras realizaciones de la presente invención, se proporciona una mezcla sustancialmente monodispersa de conjugados en la que cada conjugado incluye calcitonina de salmón acoplada covalentemente en Lys^{11} de la calcitonina de salmón a un resto de ácido carboxílico de un primer oligómero que comprende ácido octanoico acoplado covalentemente, en el extremo distal al resto de ácido carboxílico, a un resto de polietilenglicol terminado en metilo que tiene al menos 7 subunidades de polietilenglicol, y acoplada covalentemente en Lys^{18} de la calcitonina de salmón a un resto de ácido carboxílico de un segundo oligómero que comprende ácido octanoico acoplado covalentemente, en el extremo distal al resto de ácido carboxílico, a un resto de polietilenglicol terminado en metilo que tiene al menos 7 subunidades de polietilenglicol.
Estas mezclas de conjugados pueden ser capaces de reducir los niveles de calcio sérico en un sujeto en al menos 5 por ciento.
\newpage
Estas mezclas de conjugados pueden ser capaces de reducir los niveles de calcio sérico en un sujeto en al menos 5 por ciento.
Estas mezclas de conjugados pueden tener una resistencia incrementada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero.
Estas mezclas pueden tener una bioeficacia mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero.
Estas mezclas pueden tener una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar de menos de 22 Daltons.
Las mezclas de la presente invención pueden tener un coeficiente de dispersidad (DC) mayor de 10.000 en el que
1
en la que:
n es el número de diferentes moléculas en la muestra;
N_{i} es el número de i moléculas en la muestra; y
M_{i} es la masa de la i^{a} molécula.
\vskip1.000000\baselineskip
Según todavía otras realizaciones de la presente invención, se proporciona una mezcla de conjugados en la que cada conjugado tiene el mismo peso molecular y tiene la fórmula:
(A)Fármaco de calcitonina - [B-L_{j}-G_{k}-R-G'_{m}-R'-C''_{n}-T]_{p}
en la que:
\quad
B es un resto enlazante;
\quad
L es un grupo ligador;
\quad
G, G' y G'' son grupos espaciadores seleccionados individualmente;
\quad
R es un grupo lipófilo, y R' es un grupo de polialquilenglicol, o R' es el grupo lipófilo y R es el grupo polióxido de alquileno;
\quad
T es un grupo terminador;
\quad
j, k, m y n son individualmente 0 ó 1; y
\quad
p es un número entero de 1 al número de restos nucleofílicos en el fármaco de calcitonina.
\vskip1.000000\baselineskip
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden mezclas de conjugados de la presente invención, y su uso en el tratamiento de osteoporosis. Adicionalmente, se proporcionan métodos para sintetizar tales mezclas de conjugados.
Las mezclas de conjugados de calcitonina con oligómero según realizaciones de la presente invención pueden reducir los niveles de calcio sérico en 20 por ciento o más. Además, tales conjugados pueden proporcionar una reducción de la degradación por enzimas intestinales, y/o pueden proporcionar una biodisponibilidad aumentada, cuando se comparan con calcitonina no conjugada.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra un esquema genérico para sintetizar una mezcla de polímeros activados que comprenden un resto de polietilenglicol y un resto de ácido graso según realizaciones de la presente invención;
la Figura 2 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de mPEG según realizaciones de la presente invención;
la Figura 3 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de oligómeros activados de mPEG7-hexilo según realizaciones de la presente invención;
la Figura 4 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de oligómeros activados de mPEG7-octilo según realizaciones de la presente invención;
la Figura 5 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de oligómeros activados de mPEG-decilo según realizaciones de la presente invención;
la Figura 6 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de oligómeros activados de estearato-PEG6 según realizaciones de la presente invención;
la Figura 7 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de oligómeros activados de estearato-PEG8 según realizaciones de la presente invención;
la Figura 8 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de oligómeros activados de PEG3 según realizaciones de la presente invención;
la Figura 9 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de oligómeros activados de palmitato-PEG3 según realizaciones de la presente invención;
la Figura 10 ilustra un esquema para sintetizar una mezcla de oligómeros activados de PEG6 según realizaciones de la presente invención;
la Figura 11 ilustra un esquema para sintetizar diversos monómeros de propilenglicol según realizaciones de la presente invención;
la Figura 12 ilustra un esquema para sintetizar diversos polímeros de propilenglicol según realizaciones de la presente invención;
la Figura 13 ilustra un esquema para sintetizar diversos polímeros de propilenglicol según realizaciones de la presente invención;
la Figura 14 ilustra una comparación de las AUC medias para diversas mezclas de conjugados de calcitonina con oligómero según realizaciones de la presente invención con calcitonina no conjugada, que se proporciona solamente con fines comparativos y no forma parte de la invención;
la Figura 15 ilustra una curva de respuesta frente a la dosis para una mezcla de diconjugados de mPEG7-octil-calcitonina según realizaciones de la presente invención, comparada con una curva de respuesta frente a la dosis para calcitonina, que se proporciona con fines comparativos y no es parte de la presente invención;
la Figura 16 ilustra una curva de respuesta frente a la dosis tras la administración oral de una mezcla de diconjugados de mPEG7-octil-calcitonina según realizaciones de la presente invención;
la Figura 17 ilustra una curva de respuesta frente a la dosis tras la administración subcutánea de una mezcla de diconjugados de mPEG7-octil-calcitonina según realizaciones de la presente invención; y
la Figura 18 ilustra una curva de respuesta frente a la dosis tras la administración subcutánea de calcitonina de salmón, que se proporciona con fines comparativos y no es parte de la presente invención.
Descripción detallada de realizaciones preferidas
La invención se describirá ahora con respecto a realizaciones preferidas descritas aquí. Sin embargo, se debe apreciar que estas realizaciones son con el fin de ilustrar la invención.
Como se usa aquí, la expresión "no polidispersa" se usa para describir una mezcla de compuestos que tiene una dispersidad que contrasta con las mezclas polidispersas descritas en la patente U.S. nº 5.359.030 de Ekwuribe.
Como se usa aquí, la expresión "sustancialmente monodispersa" se usa para describir una mezcla de compuestos en la que al menos 95 por ciento de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular.
Como se usa aquí, el término "monodispersa" se usa para describir una mezcla de compuestos en la que 100 por cien de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular.
Como se usa aquí, la expresión "sustancial y puramente monodispersa" se usa para describir una mezcla de compuestos en la que al menos 95 por ciento de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular. De este modo, una mezcla sustancial y puramente monodispersa es una mezcla sustancialmente monodispersa, pero una mezcla sustancialmente monodispersa no es necesariamente una mezcla sustancial y puramente monodispersa.
Como se usa aquí, la expresión "puramente monodispersa" se usa para describir una mezcla de compuestos en la que 100 por cien de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular. De este modo, una mezcla puramente monodispersa es una mezcla monodispersa, pero una mezcla monodispersa no es necesariamente una mezcla puramente monodispersa.
Como se usa aquí, la expresión "peso molecular medio ponderal" se define como la suma de los productos de la fracción en peso para una molécula dada en la mezcla multiplicada por la masa de la molécula para cada molécula en la mezcla. El "peso molecular medio ponderal" se representa mediante el símbolo M_{w}.
Como se usa aquí, la expresión "peso molecular medio numérico" se define como el peso total de una mezcla dividido entre el número de moléculas en la mezcla, y se representa mediante el símbolo M_{n}.
Como se usa aquí, la expresión "coeficiente de dispersidad" (DC) se define mediante la fórmula:
2
en la que:
n es el número de diferentes moléculas en la muestra;
N_{i} es el número de i moléculas en la muestra; y
M_{i} es la masa de la iª molécula.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se usa aquí, la expresión "variabilidad intrasujeto" significa la variabilidad en actividad que se produce dentro del mismo sujeto cuando al sujeto se le administra la misma dosis de un fármaco o composición farmacéutica a diferentes tiempos.
Como se usa aquí, la expresión "variabilidad intersujetos" significa la variabilidad en actividad entre dos o más sujetos cuando a cada sujeto se le administra la misma dosis de un fármaco o formulación farmacéutica dada.
Como se usa aquí, el término "bioeficacia" significa la capacidad de un fármaco o conjugado farmacéutico para interaccionar in vivo con uno o más receptores deseados.
Como se usa aquí, la expresión "fármaco de calcitonina" significa un fármaco que posee toda o parte de la actividad biológica de calcitonina.
Como se usa aquí, el término "calcitonina" significa calcitonina de pollo, calcitonina de anguila, calcitonina humana, calcitonina porcina, calcitonina de rata o calcitonina de salmón, proporcionada por fuentes naturales, sintéticas, o manipuladas mediante ingeniería genética.
Como se usa aquí, la expresión "análogo de calcitonina" significa calcitonina en la que se ha sustituido uno o más de los aminoácidos, a la vez que se retiene parte o toda la actividad de la calcitonina. El análogo se describe señalando los aminoácidos sustituidos, con la posición de la sustitución como un superíndice, seguido de una descripción de la calcitonina. Por ejemplo, "Pro^{2} calcitonina, humana" significa que la glicina encontrada típicamente en la posición 2 de una molécula de calcitonina humana se ha sustituido por prolina.
Los análogos de calcitonina se pueden obtener por diversos medios, como entenderán los expertos en la técnica. Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en la estructura de calcitonina sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígenos de anticuerpos, o sitios de unión en moléculas sustrato. Puesto que la capacidad interactiva y la naturaleza de la calcitonina definen su actividad funcional biológica, se pueden realizar en la secuencia de aminoácidos ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos y, no obstante, seguir siendo un polipéptido con propiedades similares.
Al realizar tales sustituciones, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir función biológica interactiva a un polipéptido generalmente es bien comprendida en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria del polipéptido resultante, lo que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, por ejemplo enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobia y características de la carga según lo siguiente: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5). Como entenderán los expertos en la técnica, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tengan un índice o puntuación hidropática similar, y todavía dan como resultado un polipéptido con actividad biológica similar, es decir, todavía se obtiene un polipéptido biológico funcionalmente equivalente. Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm2 entre sí; se prefieren particularmente aquellos que están dentro de \pm1 entre sí; e incluso más particularmente se prefieren aquellos dentro de \pm0,5 entre sí.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer efectivamente en base a la hidrofilia. La patente U.S. 4.554.101 afirma que la hidrofilia media local más elevada de una proteína, gobernada por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente U.S. 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (\pm3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 + 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Como entienden los expertos en la técnica, un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilia similar y todavía obtener un polipéptido biológicamente equivalente, y en particular un polipéptido inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro de \pm2 entre sí; se prefieren particularmente aquellos que están dentro de \pm1 entre sí; e incluso más particularmente se prefieren aquellos dentro de \pm0,5 entre sí.
Como se esquematiza anteriormente, las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan por lo tanto en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño. Las sustituciones ejemplares (es decir, aminoácidos que se pueden intercambiar sin alterar significativamente la actividad biológica del polipéptido) que tienen en cuenta diversas de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
Como se usa aquí, la expresión "fragmento de calcitonina" significa un segmento de la secuencia de aminoácidos encontrado en la calcitonina que retiene parte o toda la actividad de la calcitonina.
Como se usa aquí, la expresión "análogo de fragmento de calcitonina" significa un segmento de la secuencia de aminoácidos encontrada en la molécula de calcitonina en la que se ha sustituido uno o más de los aminoácidos en el segmento a la vez que se retiene parte o toda la actividad de la calcitonina.
Como se usa aquí, el término "PEG" se refiere a polímeros de polietilenglicol lineales o ramificados, e incluye el éter monometílico de polietilenglicol (mPEG). Las expresiones "subunidad de PEG" y "subunidad de polietilenglicol" se refieren a una unidad individual de polietilenglicol, es decir, -(CH_{2}CH_{2}O)-.
Como se usa aquí, el término "lipófilo" significa la capacidad para disolverse en lípidos, y/o la capacidad para penetrar, interaccionar con y/o atravesar membranas biológicas, y la expresión "resto lipófilo" o "lipófilo" significa un resto que es lipófilo y/o que, cuando se une a otra entidad química, aumenta la lipofilia de tal entidad química. Los ejemplos de restos lipófilos incluyen alquilos, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, colesterilo, adamantilo.
Como se usa aquí, la expresión "alquilo inferior" se refiere a restos alquílicos sustituidos o no sustituidos que tienen de 1 a 5 átomos de carbono.
Como se usa aquí, la expresión "alquilo superior" se refiere a restos alquílicos sustituidos o no sustituidos que tienen 6 o más átomos de carbono.
En realizaciones de la presente invención, se proporcionan mezclas monodispersas, mezclas sustancial y puramente monodispersas, y mezclas puramente monodispersas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. Cada conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero en la mezcla monodispersa incluye un fármaco de calcitonina acoplado a un oligómero que comprende un resto de polietilenglicol. Preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los conjugados en la mezcla tienen el mismo peso molecular. Preferiblemente, la mezcla es una mezcla monodispersa. Incluso más preferiblemente, la mezcla es una mezcla sustancial y puramente monodispersa. Aún más preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los conjugados en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular. Lo más preferible, la mezcla es una mezcla puramente monodispersa.
El oligómero puede ser diversos oligómeros que comprenden un resto de polietilenglicol y uno o más restos lipófilos, como entenderán los expertos en la técnica. El resto de polietilenglicol del oligómero tiene al menos 2, 3 ó 4 subunidades de polietilenglicol. Más preferiblemente, el resto de polietilenglicol tiene al menos 5 ó 6 subunidades de polietilenglicol, y, lo más preferible, el resto de polietilenglicol tiene al menos 7 subunidades de polietilenglicol.
El oligómero puede comprender uno o más restos, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo restos hidrófilos adicionales, restos lipófilos, restos espaciadores, restos ligadores, y restos terminadores. Los diversos restos en el oligómero están acoplados covalentemente entre sí por enlaces hidrolizables o no hidrolizables.
El oligómero puede comprender además uno o más restos hidrófilos adicionales (es decir, restos además del resto de polietilenglicol), incluyendo azúcares, polióxidos de alquileno, y copolímeros de poliamina/PEG. Como el polietilenglicol es un polióxido de alquileno, el resto hidrófilo adicional puede ser un resto de polietilenglicol. Los restos de polietilenglicol adyacentes se considerarán el mismo resto si están acoplados mediante un enlace de éter. Por ejemplo, el resto
-O-C_{2}H_{4}-O-C_{2}H_{4}-O-C_{2}H_{4}-O-C_{2}H_{4}-O-C_{2}H_{4}-O-C_{2}H_{4}-
es un único resto de polietilenglicol que tiene seis subunidades de polietilenglicol. Si este resto fuese el único resto hidrófilo en el oligómero, el oligómero no contendría ningún resto hidrófilo adicional. Los restos de polietilenglicol adyacentes se considerarán restos diferentes si están acoplados mediante un enlace distinto de un enlace de éter. Por ejemplo, el resto
3
es un resto de polietilenglicol que tiene cuatro subunidades de polietilenglicol y un resto hidrófilo adicional que tiene dos subunidades de polietilenglicol. Preferiblemente, los oligómeros según realizaciones de la presente invención comprenden un resto de polietilenglicol y ningún resto hidrófilo adicional.
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El oligómero comprende además uno o más restos lipófilos, como entenderán los expertos en la técnica. El resto lipófilo se selecciona de un resto alquilo lineal, saturado o insaturado, que tiene 1 a 28 átomos de carbono, y un resto de ácido graso lineal, saturado o insaturado, que tiene 2 a 18 átomos de carbono. Más preferiblemente, el resto alquílico tiene 2 a 12 átomos de carbono. Cuando el resto lipófilo es un resto de ácido graso, preferiblemente es un resto de ácido graso natural que es lineal, saturado o insaturado, que tiene 2 a 18 átomos de carbono. Más preferiblemente, el resto de ácido graso tiene 3 a 14 átomos de carbono. Lo más preferible, el resto de ácido graso tiene al menos 4, 5 ó 6 átomos de carbono.
El oligómero puede comprender además uno o más restos espaciadores, como entenderán los expertos en la técnica. Los restos espaciadores se pueden usar, por ejemplo, para separar un resto hidrófilo de un resto lipófilo, para separar un resto lipófilo o un resto hidrófilo del fármaco de calcitonina, para separar un primer resto hidrófilo o lipófilo de un segundo resto hidrófilo o lipófilo, o para separar un resto hidrófilo o un resto lipófilo de un resto ligador. Los restos espaciadores se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en restos de azúcar, colesterol y glicerina.
El oligómero puede comprender además uno o más restos ligadores que se usan para acoplar el oligómero con el fármaco de calcitonina, como entenderán los expertos en la técnica. Los restos ligadores se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en restos alquílicos y de ácidos grasos.
El oligómero puede comprender además uno o más restos terminadores en uno o más extremos del oligómero que no estén acoplados al fármaco de calcitonina. El resto terminador es preferiblemente un resto alquilo o alcoxi, y es más preferiblemente un resto de alquilo inferior o de alcoxi inferior. Lo más preferible, el resto terminador es metilo o metoxi. Aunque el resto terminador es preferiblemente un resto alquilo o alcoxi, se entenderá que el resto terminador puede ser diversos restos, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo azúcares, colesterol, alcoholes, y ácidos grasos.
El oligómero está acoplado preferiblemente de forma covalente al fármaco de calcitonina. En algunas realizaciones, el fármaco de calcitonina se acopla al oligómero utilizando un enlace hidrolizable (por ejemplo, un enlace de éster o de carbonato). Un acoplamiento hidrolizable puede proporcionar un conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero que actúa como un profármaco. En ciertos casos, por ejemplo cuando el conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero es inactivo (es decir, el conjugado carece de la capacidad para afectar al organismo a través del mecanismo primario de acción del fármaco de calcitonina), un acoplamiento hidrolizable puede proporcionar un efecto de liberación en el tiempo o de liberación controlada, administrando el fármaco de calcitonina durante un período de tiempo dado a medida que uno o más oligómeros se escinden de sus conjugados respectivos de fármaco de calcitonina con oligómero para proporcionar el fármaco activo. En otras realizaciones, el fármaco de calcitonina se acopla al oligómero utilizando un enlace no hidrolizable (por ejemplo, un enlace de carbamato, amida, o éter). El uso de un enlace no hidrolizable puede ser preferible cuando es deseable permitir que el conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero circule en el torrente sanguíneo durante un período de tiempo prolongado, preferiblemente al menos 2 horas. Cuando el oligómero está acoplado covalentemente al fármaco de calcitonina, el oligómero comprende además uno o más restos enlazantes, que se usan para acoplar covalentemente el oligómero con el fármaco de calcitonina, como entenderán los expertos en la técnica. Los restos enlazantes se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en un enlace o enlaces covalentes, restos de éster, restos de carbonato, restos de carbamato, restos de amida y restos de amina secundaria. Más de un resto en el oligómero se puede acoplar covalentemente al fármaco de calcitonina.
Aunque el oligómero está preferiblemente acoplado covalentemente al fármaco de calcitonina, se entenderá que el oligómero se puede acoplar no covalentemente al fármaco de calcitonina para formar un complejo de fármaco de calcitonina con oligómero conjugado no covalentemente. Como entenderán los expertos en la técnica, los acoplamientos no covalentes incluyen enlace de hidrógeno, enlace iónico, enlace de Van der Waals, y encapsulamiento micelular o liposómico. Según realizaciones de la presente invención, los oligómeros se pueden construir adecuadamente, modificar y/o funcionalizar apropiadamente para proporcionar una capacidad para la conjugación no covalente de manera seleccionada (por ejemplo, para proporcionar una capacidad de enlazamiento mediante enlace de hidrógeno), como entenderán los expertos en la técnica. Según otras realizaciones de la presente invención, los oligómeros se pueden derivatizar con diversos compuestos, incluyendo aminoácidos, oligopéptidos, péptidos, ácidos biliares, derivados de ácidos biliares, ácidos grasos, derivados de ácidos grasos, ácidos salicílicos, derivados de ácidos salicílicos, ácidos aminosalicílicos, y derivados de ácidos aminosalicílicos. Los oligómeros resultantes se pueden acoplar no covalentemente (complejar) con moléculas farmacéuticas, productos farmacéuticos, y/o excipientes farmacéuticos. Los complejos resultantes tienen preferiblemente propiedades lipófilas e hidrófilas balanceadas. Todavía según otras realizaciones de la presente invención, los oligómeros se pueden derivatizar con amina y/o alquilaminas. En condiciones ácidas adecuadas, los oligómeros resultantes pueden formar complejos conjugados no covalentemente con moléculas farmacéuticas, productos farmacéuticos y/o excipientes farmacéuticos. Los productos resultantes de tal complejación tienen preferiblemente propiedades lipófilas e hidrófilas balanceadas.
Más de un oligómero (es decir, una pluralidad de oligómeros) se puede acoplar al fármaco de calcitonina. Los oligómeros en la pluralidad son preferiblemente el mismo. Sin embargo, se entenderá que los oligómeros en la pluralidad pueden ser diferentes entre sí, o, como alternativa, algunos de los oligómeros en la pluralidad pueden ser iguales y algunos pueden ser diferentes. Cuando una pluralidad de oligómeros se acopla al fármaco de calcitonina, puede ser preferible acoplar uno o más de los oligómeros al fármaco de calcitonina con enlaces hidrolizables, y acoplar uno o más de los oligómeros al fármaco de calcitonina con enlaces no hidrolizables. Como alternativa, todos los enlaces que acoplan la pluralidad de oligómeros al fármaco de calcitonina pueden ser hidrolizables, pero tienen grados variables de capacidad de hidrólisis, de forma que, por ejemplo, uno o más de los oligómeros se elimina rápidamente del fármaco de calcitonina mediante hidrólisis en el cuerpo, y uno o más de los oligómeros se elimina lentamente del fármaco de calcitonina mediante hidrólisis en el cuerpo.
Se observa una mayor bioeficacia, tal como una capacidad mejorada para reducir el calcio sérico, para la calcitonina de salmón diconjugada, en la que un oligómero se acopla a las funcionalidades amino de Lys^{11} y Lys^{18}.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero de la presente invención se pueden sintetizar mediante diversos métodos. Por ejemplo, una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de oligómeros que consisten en ácido carboxílico y polietilenglicol se sintetiza poniendo en contacto una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de ácido carboxílico con una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de polietilenglicol, en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de oligómeros. Los oligómeros de la mezcla se activan entonces de forma que sean capaces de reaccionar con un fármaco de calcitonina para proporcionar un conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero. Una realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros se ilustra en la Figura 3, y se describe en los Ejemplos 11-18 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros se ilustra en la Figura 4, y se describe en los Ejemplos 19-24 aquí más abajo. Todavía otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros se ilustra en la Figura 5, y se describe en los Ejemplos 25-29 aquí más abajo. Aún otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros se ilustra en la Figura 6, y se describe en los Ejemplos 30-31 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros se ilustra en la Figura 7, y se describe en los Ejemplos 32-37 aquí más abajo. Todavía otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros se ilustra en la Figura 8, y se describe en el Ejemplo 38 aquí más abajo. Aún otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros se ilustra en la Figura 9, y se describe en el Ejemplo 39 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros se ilustra en la Figura 10, y se describe en el Ejemplo 40 aquí más abajo.
La mezcla de oligómeros activados se puede hacer reaccionar con una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de fármacos de calcitonina en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. En el Ejemplo 41 aquí más abajo se describe una síntesis preferida. Como entenderán los expertos en la técnica, las condiciones de reacción (por ejemplo, relaciones molares seleccionadas, mezclas de disolventes, y/o pH) se pueden controlar de forma que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que resulta de la reacción de la mezcla de oligómeros activados y la mezcla de fármacos de calcitonina sea una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa. Por ejemplo, la conjugación en la funcionalidad amino de lisina se puede suprimir manteniendo el pH de la disolución de la reacción por debajo del pK_{a} de la lisina. Como alternativa, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar y aislar utilizando, por ejemplo, HPLC, para proporcionar una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero, por ejemplo mono-, di- o triconjugados. El grado de conjugación (por ejemplo, si la molécula aislada es un mono-, di-, o triconjugado) de un conjugado aislado particular se puede determinar y/o verificar utilizando diversas técnicas como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo espectroscopía de masas. La estructura del conjugado particular (por ejemplo, si el oligómero está en Lys^{11}, Lys^{18} o el término N de un monoconjugado de calcitonina de salmón) se puede determinar y/o verificar utilizando diversas técnicas, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo análisis de secuencias, cartografiado peptídico, escisión enzimática selectiva, y/o escisión con endopeptidasas.
Como entenderán los expertos en la técnica, uno o más de los sitios de reacción en el fármaco de calcitonina se puede bloquear, por ejemplo, haciendo reaccionar el fármaco de calcitonina con un agente bloqueante adecuado tal como N-terc-butoxicarbonilo (t-BOC), o N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo) (N-FMOC). Este procedimiento puede ser preferido, por ejemplo, cuando el fármaco de calcitonina es un polipéptido y se desea formar un conjugado insaturado (es decir, un conjugado en el que no todos los restos nucleófilos están conjugados) que tenga un oligómero en el término N del polipéptido. Después de tal bloqueo, la mezcla de fármacos de calcitonina bloqueados se puede hacer reaccionar con la mezcla de oligómeros activados, para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen oligómero u oligómeros acoplados a uno o más restos nucleófilos y que tienen restos bloqueantes acoplados a otros restos nucleófilos. Después de la reacción de conjugación, los conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se pueden desbloquear como entenderán los expertos en la técnica. Si es necesario, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar entonces como se describe anteriormente para proporcionar una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. Como alternativa, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar antes del desbloqueo.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero según realizaciones de la presente invención preferiblemente tienen propiedades mejoradas cuando se comparan con las de mezclas convencionales. Por ejemplo, una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de calcitonina con oligómero preferiblemente es capaz de reducir los niveles de calcio sérico en al menos 5 por ciento. Preferiblemente, la mezcla de conjugados es capaz de reducir los niveles de calcio sérico en al menos 10, 11, 12, 13 ó 14 por ciento. Más preferiblemente, la mezcla de conjugados es capaz de reducir niveles de calcio sérico en al menos 15, 16, 17, 18 ó 19 por ciento, y, lo más preferible, la mezcla de conjugados es capaz de reducir niveles de calcio sérico en al menos 20 por ciento.
Como otro ejemplo, una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de calcitonina con oligómero preferiblemente tiene una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina, cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina, respectivamente, del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. La resistencia a quimiotripsina o tripsina corresponde al porcentaje que queda cuando la molécula a ensayar se digiere en la enzima aplicable usando el procedimiento presentado en el Ejemplo 51 más abajo. Preferiblemente, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 10 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármacos de calcitonina que no están conjugados con el oligómero. Más preferiblemente, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 15 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero, y, lo más preferible, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 20 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero. Preferiblemente, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 10 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero. Más preferiblemente, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 20 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero, y, lo más preferible, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 30 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de calcitonina con oligómero tiene preferiblemente una bioeficacia mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. La bioeficacia de un compuesto particular corresponde a su valor de área bajo la curva (AUC). Preferiblemente, la bioeficacia de la mezcla es 5 por ciento mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. Más preferiblemente, la bioeficacia de la mezcla es 10 por ciento mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de calcitonina con oligómero tiene preferiblemente una actividad in vivo que es mayor que la actividad in vivo de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla sustancialmente monodispersa. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños, tal como cromatografía de permeación en gel como se describe, por ejemplo, en H.R. Allcock y F.W. Lampe, CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402 (2ª ed., 1991).
Como otro ejemplo, una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de calcitonina con oligómero tiene preferiblemente una actividad in vitro que es mayor que la actividad in vitro de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla sustancialmente monodispersa. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de calcitonina con oligómero tiene preferiblemente una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla sustancialmente monodispersa. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados de calcitonina con oligómero tiene preferiblemente una variabilidad intersujetos que es menor que la variabilidad intersujetos de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla sustancialmente monodispersa. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños. La variabilidad intersujetos se puede medir por diversos métodos, como entenderán los expertos en la técnica. La variabilidad intersujetos se calcula preferiblemente según lo siguiente. Se determina para cada sujeto el área bajo una curva de respuesta frente a la dosis (AUC) (es decir, el área entre la curva de respuesta frente a la dosis y un valor inicial de referencia). La AUC media para todos los sujetos se determina sumando las AUC de cada sujeto y dividiendo la suma entre el número de sujetos. Entonces se determina para cada sujeto el valor absoluto de la diferencia entre la AUC del sujeto y la AUC media. Los valores absolutos de las diferencias obtenidas se suman entonces para dar un valor que representa la variabilidad intersujetos. Menores valores representan menores variabilidades intersujetos, y mayores valores representan mayores variabilidades intersujetos.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero según realizaciones de la presente invención tienen preferiblemente dos o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente. Más preferiblemente, las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero según realizaciones de la presente invención tienen tres o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente. Lo más preferible, las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero según realizaciones de la presente invención tienen cuatro o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente.
Todavía en otras realizaciones según la presente invención, se proporciona una mezcla de conjugados según la reivindicación 1 y que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. Cada conjugado en la mezcla incluye un fármaco de calcitonina acoplado a un oligómero que comprende un resto de polietilenglicol que tiene al menos 4 subunidades de polietilenglicol. La desviación estándar es preferiblemente menor que 14 Daltons, y es más preferiblemente menor que 11 Daltons. La distribución de pesos moleculares se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños, tal como cromatografía de permeación en gel como se describe, por ejemplo, en H.R. Allcock y F.W. Lampe, CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402 (2ª ed., 1991). La desviación estándar de la distribución de pesos
moleculares se puede determinar entonces mediante métodos estadísticos, como entenderán los expertos en la técnica.
El oligómero puede ser diversos oligómeros que comprenden un resto de polietilenglicol, como entenderán los expertos en la técnica. El resto de polietilenglicol del oligómero tiene al menos 4 subunidades de polietilenglicol. Más preferiblemente, el resto de polietilenglicol tiene al menos 5 ó 6 subunidades de polietilenglicol, y, lo más preferible, el resto de polietilenglicol tiene al menos 7 subunidades de polietilenglicol.
El oligómero puede comprender uno o más restos, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo restos hidrófilos adicionales, restos lipófilos, restos espaciadores, restos ligadores, y restos terminadores. Los diversos restos en el oligómero están acoplados covalentemente entre sí mediante enlaces hidrolizables o no hidrolizables. Más abajo se explican los diversos restos adicionales.
El oligómero está acoplado preferiblemente de forma covalente al fármaco de calcitonina como se explica anteriormente, aunque se entiende que el oligómero puede estar acoplado no covalentemente al fármaco de calcitonina para formar un complejo de fármaco de calcitonina con oligómero conjugado no covalentemente.
Los oligómeros primero y segundo (es decir, una pluralidad de oligómeros) se pueden acoplar al fármaco de calcitonina como se explica anteriormente.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se pueden sintetizar por diversos métodos. Por ejemplo, una mezcla de oligómeros que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons que consiste en ácido carboxílico y polietilenglicol se sintetiza poniendo en contacto una mezcla de ácido carboxílico, que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons, con una mezcla de polietilenglicol, que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons, en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla de oligómeros que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. Los oligómeros de la mezcla que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se activan entonces de forma que sean capaces de reaccionar con un fármaco de calcitonina para proporcionar un conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero. Una realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se ilustra en la Figura 3, y se describe en los Ejemplos 11-18 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se ilustra en la Figura 4, y se describe en los Ejemplos 19-24 aquí más abajo. Todavía otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se ilustra en la Figura 5, y se describe en los Ejemplos 25-29 aquí más abajo. Aún otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se ilustra en la Figura 6, y se describe en los Ejemplos 30-31 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se ilustra en la Figura 7, y se describe en los Ejemplos 32-37 aquí más abajo. Todavía otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se ilustra en la Figura 8, y se describe en el Ejemplo 38 aquí más abajo. Aún otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se ilustra en la Figura 9, y se describe en el Ejemplo 39 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se ilustra en la Figura 10, y se describe en el Ejemplo 40 aquí más abajo.
La mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se hace reaccionar con una mezcla de fármacos de calcitonina que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons, en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. En el Ejemplo 41 aquí más abajo se describe una síntesis preferida. Como entenderán los expertos en la técnica, las condiciones de reacción (por ejemplo, relaciones molares seleccionadas, mezclas de disolventes, y/o pH) se pueden controlar de forma que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que resulta de la reacción de la mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons y la mezcla de fármacos de calcitonina que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons sea una mezcla que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. Por ejemplo, la conjugación en la funcionalidad amino de lisina se puede suprimir manteniendo el pH de la disolución de la reacción por debajo del pK_{a} de la lisina. Como alternativa, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar y aislar utilizando, por ejemplo, HPLC, para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero, por ejemplo mono-, di- o triconjugados, que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. El grado de conjugación (por ejemplo, si la molécula aislada es un mono-, di-, o triconjugado) de un conjugado aislado particular se puede determinar y/o verificar utilizando diversas técnicas, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo espectroscopía de masas. La estructura del conjugado particular (por ejemplo, si el oligómero está en Lys^{11}, Lys^{18} o el término N de un monoconjugado de calcitonina de salmón) se puede determinar y/o verificar utilizando diversas técnicas, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo análisis de secuencias, cartografiado peptídico, escisión enzimática selectiva, y/o escisión con endopeptidasas.
Como entenderán los expertos en la técnica, uno o más de los sitios de reacción en el fármaco de calcitonina se puede bloquear, por ejemplo, haciendo reaccionar el fármaco de calcitonina con un agente bloqueante adecuado tal como N-terc-butoxicarbonilo (t-BOC), o N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo) (N-FMOC). Este procedimiento puede ser preferido, por ejemplo, cuando el fármaco de calcitonina es un polipéptido y se desea formar un conjugado insaturado (es decir, un conjugado en el que no todos los restos nucleófilos están conjugados) que tenga un oligómero en el término N del polipéptido. Después de tal bloqueo, la mezcla de fármacos de calcitonina bloqueados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons se puede hacer reaccionar con la mezcla de oligómeros activados que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons, para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen oligómero u oligómeros acoplados a uno o más restos nucleófilos y que tienen restos bloqueantes acoplados a otros restos nucleófilos. Después de la reacción de conjugación, los conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se pueden desbloquear, como entenderán los expertos en la técnica. Si es necesario, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar entonces como se describe anteriormente para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. Como alternativa, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar antes del desbloqueo.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons según realizaciones de la presente invención tienen preferiblemente propiedades mejoradas cuando se comparan con las de mezclas convencionales. Por ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons preferiblemente es capaz de reducir los niveles de calcio sérico en al menos 5 por ciento. Preferiblemente, la mezcla de conjugados es capaz de reducir los niveles de calcio sérico en al menos 10, 11, 12, 13 ó 14 por ciento. Más preferiblemente, la mezcla de conjugados es capaz de reducir niveles de calcio sérico en al menos 15, 16, 17, 18 ó 19 por ciento, y, lo más preferible, la mezcla de conjugados es capaz de reducir niveles de calcio sérico en al menos 20 por ciento.
Como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons preferiblemente tiene una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina, cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina, respectivamente, del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. La resistencia a quimiotripsina o tripsina corresponde al porcentaje que queda cuando la molécula a ensayar se digiere en la enzima aplicable usando el procedimiento similar al presentado en el Ejemplo 51 más abajo. Preferiblemente, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 10 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármacos de calcitonina que no están conjugados con el oligómero. Más preferiblemente, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 15 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero, y, lo más preferible, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 20 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero. Preferiblemente, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 10 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero. Más preferiblemente, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 20 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero, y, lo más preferible, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 30 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons tiene preferiblemente una bioeficacia mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. La bioeficacia de un compuesto particular corresponde a su valor de área bajo la curva (AUC). Preferiblemente, la bioeficacia de la mezcla es 5 por ciento mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. Más preferiblemente, la bioeficacia de la mezcla es 10 por ciento mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons tiene preferiblemente una actividad in vivo que es mayor que la actividad in vivo de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños, tal como cromatografía de permeación en gel como se describe, por ejemplo, en H.R. Allcock y F.W. Lampe, CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402 (2ª ed., 1991).
Como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons tiene preferiblemente una actividad in vitro que es mayor que la actividad in vitro de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons tiene preferiblemente una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños.
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Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons tiene preferiblemente una variabilidad intersujetos que es menor que la variabilidad intersujetos de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños. La variabilidad intersujetos se puede medir por diversos métodos, como entenderán los expertos en la técnica. La variabilidad intersujetos se calcula preferiblemente según lo siguiente. Se determina para cada sujeto el área bajo una curva de respuesta frente a la dosis (AUC) (es decir, el área entre la curva de respuesta frente a la dosis y un valor inicial de referencia). La AUC media para todos los sujetos se determina sumando las AUC de cada sujeto y dividiendo la suma entre el número de sujetos. Entonces se determina para cada sujeto el valor absoluto de la diferencia entre la AUC del sujeto y la AUC media. Los valores absolutos de las diferencias obtenidas se suman entonces para dar un valor que representa la variabilidad intersujetos. Menores valores representan menores variabilidades intersujetos, y mayores valores representan mayores variabilidades intersujetos.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons según realizaciones de la presente invención tienen preferiblemente dos o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente. Más preferiblemente, las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons según realizaciones de la presente invención tienen tres o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente. Lo más preferible, las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que 22 Daltons según realizaciones de la presente invención tienen cuatro o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente.
Según todavía otras realizaciones de la presente invención, se proporciona una mezcla de conjugados según la reivindicación 1, en la que cada conjugado incluye un fármaco de calcitonina acoplado a un oligómero que comprende un resto de polietilenglicol, y la mezcla tiene un coeficiente de dispersidad (DC) mayor de 10.000 en el que
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en la que:
n es el número de diferentes moléculas en la muestra;
N_{i} es el número de i moléculas en la muestra; y
M_{i} es la masa de la i^{a} molécula.
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La mezcla de conjugados tiene preferiblemente un coeficiente de dispersidad mayor que 100.000. Más preferiblemente, el coeficiente de dispersidad de la mezcla de conjugados es mayor que 500.000, y, lo más preferible, el coeficiente de dispersidad es mayor que 10.000.000. Las variables n, N_{i}, y M_{i} se pueden determinar por diversos métodos, con entenderán los expertos en la técnica, incluyendo métodos descritos más abajo en el Ejemplo 49.
El oligómero puede ser diversos oligómeros que comprenden un resto de polietilenglicol como se expone anteriormente.
El oligómero puede comprender uno o más restos como se expone anteriormente.
El oligómero puede estar acoplado al fármaco de calcitonina como se expone anteriormente.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se pueden sintetizar por diversos métodos. Por ejemplo, una mezcla de oligómeros que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 que consiste en ácido carboxílico y polietilenglicol se sintetiza poniendo en contacto una mezcla de ácido carboxílico, que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000, con una mezcla de polietilenglicol, que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000, en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla de oligómeros que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000. Los oligómeros de la mezcla que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se activan entonces de forma que sean capaces de reaccionar con un fármaco de calcitonina para proporcionar un conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero. Una realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se ilustra en la Figura 3, y se describe en los Ejemplos 11-18 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se ilustra en la Figura 4, y se describe en los Ejemplos 19-24 aquí más abajo. Todavía otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se ilustra en la Figura 5, y se describe en los Ejemplos 25-29 aquí más abajo. Aún otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se ilustra en la Figura 6, y se describe en los Ejemplos 30-31 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se ilustra en la Figura 7, y se describe en los Ejemplos 32-37 aquí más abajo. Todavía otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se ilustra en la Figura 8, y se describe en el Ejemplo 38 aquí más abajo. Aún otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se ilustra en la Figura 9, y se describe en el Ejemplo 39 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se ilustra en la Figura 10, y se describe en el Ejemplo 40 aquí más abajo.
La mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se hace reaccionar con una mezcla de fármacos de calcitonina que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000, en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. En el Ejemplo 41 aquí más abajo se describe una síntesis preferida. Como entenderán los expertos en la técnica, las condiciones de reacción (por ejemplo, relaciones molares seleccionadas, mezclas de disolventes, y/o pH) se pueden controlar de forma que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que resulta de la reacción de la mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 y la mezcla de fármacos de calcitonina que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 sea una mezcla que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000. Por ejemplo, la conjugación en la funcionalidad amino de lisina se puede suprimir manteniendo el pH de la disolución de la reacción por debajo del pK_{a} de la lisina. Como alternativa, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar y aislar utilizando, por ejemplo, HPLC, para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero, por ejemplo mono-, di- o triconjugados, que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000. El grado de conjugación (por ejemplo, si la molécula aislada es un mono-, di-, o triconjugado) de un conjugado aislado particular se puede determinar y/o verificar utilizando diversas técnicas, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo espectroscopía de masas. La estructura del conjugado particular (por ejemplo, si el oligómero está en Lys^{11}, Lys^{18} o el término N de un monoconjugado de calcitonina de salmón) se puede determinar y/o verificar utilizando diversas técnicas, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo análisis de secuencias, cartografiado peptídico, escisión enzimática selectiva, y/o escisión con endopeptidasas.
Como entenderán los expertos en la técnica, uno o más de los sitios de reacción en el fármaco de calcitonina se puede bloquear, por ejemplo, haciendo reaccionar el fármaco de calcitonina con un agente bloqueante adecuado tal como N-terc-butoxicarbonilo (t-BOC), o N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo) (N-FMOC). Este procedimiento puede ser preferido, por ejemplo, cuando el fármaco de calcitonina es un polipéptido y se desea formar un conjugado insaturado (es decir, un conjugado en el que no todos los restos nucleófilos están conjugados) que tenga un oligómero en el término N del polipéptido. Después de tal bloqueo, la mezcla de fármacos de calcitonina bloqueados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 se puede hacer reaccionar con la mezcla de oligómeros activados que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000, para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen oligómero u oligómeros acoplados a uno o más restos nucleófilos y que tienen restos bloqueantes acoplados a otros restos nucleófilos. Después de la reacción de conjugación, los conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se pueden desbloquear, como entenderán los expertos en la técnica. Si es necesario, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar entonces como se describe anteriormente para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000. Como alternativa, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar antes del desbloqueo.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 según realizaciones de la presente invención tienen preferiblemente propiedades mejoradas cuando se comparan con las de mezclas convencionales. Por ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 preferiblemente es capaz de reducir los niveles de calcio sérico en al menos 5 por ciento. Preferiblemente, la mezcla de conjugados es capaz de reducir los niveles de calcio sérico en al menos 10, 11, 12, 13 ó 14 por ciento. Más preferiblemente, la mezcla de conjugados es capaz de reducir niveles de calcio sérico en al menos 15, 16, 17, 18 ó 19 por ciento, y, lo más preferible, la mezcla de conjugados es capaz de reducir niveles de calcio sérico en al menos 20 por ciento.
Como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 preferiblemente tiene una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina, cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina, respectivamente, del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. La resistencia a quimiotripsina o tripsina corresponde al porcentaje que queda cuando la molécula a ensayar se digiere en la enzima aplicable usando el procedimiento similar al presentado en el Ejemplo 51 más abajo. Preferiblemente, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 10 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármacos de calcitonina que no están conjugados con el oligómero. Más preferiblemente, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 15 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero, y, lo más preferible, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 20 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero. Preferiblemente, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 10 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero. Más preferiblemente, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 20 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero, y, lo más preferible, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 30 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 tiene preferiblemente una bioeficacia mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. La bioeficacia de un compuesto particular corresponde a su valor de área bajo la curva (AUC). Preferiblemente, la bioeficacia de la mezcla es 5 por ciento mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. Más preferiblemente, la bioeficacia de la mezcla es 10 por ciento mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 tiene preferiblemente una actividad in vivo que es mayor que la actividad in vivo de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños, tal como cromatografía de permeación en gel como se describe, por ejemplo, en H.R. Allcock y F.W. Lampe, CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402 (2ª ed., 1991).
Como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 tiene preferiblemente una actividad in vitro que es mayor que la actividad in vitro de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 tiene preferiblemente una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 tiene preferiblemente una variabilidad intersujetos que es menor que la variabilidad intersujetos de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños. La variabilidad intersujetos se puede medir por diversos métodos, como entenderán los expertos en la técnica. La variabilidad intersujetos se calcula preferiblemente según lo siguiente. Se determina para cada sujeto el área bajo una curva de respuesta frente a la dosis (AUC) (es decir, el área entre la curva de respuesta frente a la dosis y un valor inicial de referencia). La AUC media para todos los sujetos se determina sumando las AUC de cada sujeto y dividiendo la suma entre el número de sujetos. Entonces se determina para cada sujeto el valor absoluto de la diferencia entre la AUC del sujeto y la AUC media. Los valores absolutos de las diferencias obtenidas se suman entonces para dar un valor que representa la variabilidad intersujetos. Menores valores representan menores variabilidades intersujetos, y mayores valores representan mayores variabilidades intersujetos.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 según realizaciones de la presente invención tienen preferiblemente dos o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente. Más preferiblemente, las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 según realizaciones de la presente invención tienen tres o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente. Lo más preferible, las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene un coeficiente de dispersidad mayor que 10.000 según realizaciones de la presente invención tienen cuatro o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente.
Según todavía otras realizaciones de la presente invención, se proporciona una mezcla de conjugados según la reivindicación 1, en la que cada conjugado tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A:
(A)Fármaco de calcitonina - [B-L_{j}-G_{k}-R-G'_{m}-R'-G''_{n}-T]_{p}
en la que:
\quad
B es un resto enlazante;
\quad
L es un grupo ligador;
\quad
G, G' y G'' son grupos espaciadores seleccionados individualmente;
\quad
R es un grupo lipófilo, y R' es un grupo de polialquilenglicol, o R' es el grupo lipófilo y R es el grupo polióxido de alquileno;
\quad
T es un grupo terminador;
\quad
j, k, m y n son individualmente 0 ó 1; y
\quad
p es un número entero de 1 al número de restos nucleofílicos en el fármaco de calcitonina.
\vskip1.000000\baselineskip
Según estas realizaciones de la presente invención, el resto de polialquilenglicol del oligómero tiene al menos 2, 3 ó 4 subunidades de polialquilenglicol. Más preferiblemente, el resto de polialquilenglicol tiene al menos 5 ó 6 subunidades de polialquilenglicol, y, lo más preferible, el resto de polietilenglicol tiene al menos 7 subunidades de polialquilenglicol. El resto de polialquilenglicol es preferiblemente un resto de polialquilenglicol inferior, tal como un resto de polietilenglicol, un resto de polipropilenglicol, o un resto de polibutilenglicol. Más preferiblemente, el resto de polialquilenglicol es un resto de polietilenglicol o un resto de polipropilenglicol. Lo más preferible, el resto de polialquilenglicol es un resto de polietilenglicol. Cuando el resto de polialquilenglicol es un resto de polipropilenglicol, el resto tiene preferiblemente una estructura uniforme (es decir, no al azar). Un resto de polipropilenglicol ejemplar que tiene una estructura uniforme es como sigue:
5
Esta estructura de polipropilenglicol uniforme se puede describir como una estructura que tiene un átomo de carbono sustituido con un metilo sólo adyacente a cada átomo de oxígeno en la cadena de polipropilenglicol. Tales restos de polipropilenglicol uniforme pueden mostrar características tanto lipófilas como hidrófilas, y de este modo son útiles proporcionando conjugados anfifílicos de fármaco de calcitonina con oligómero sin el uso de restos poliméricos lipófilos. Además, el acoplamiento del resto de alcohol secundario del resto de polipropilenglicol con un fármaco de calcitonina puede proporcionar al fármaco de calcitonina (por ejemplo, calcitonina de salmón) una resistencia mejorada a la degradación provocada por enzimas, tales como tripsina y quimiotripsina, encontradas, por ejemplo, en el intestino.
El polipropilenglicol uniforme según realizaciones de la presente invención se sintetiza preferiblemente como se ilustra en las Figuras 11 a 13, que se describirán ahora. Como se ilustra en la Figura 11, el 1,2-propanodiol 53 se hace reaccionar con un reactivo bloqueante de alcohol primario para proporcionar un monómero 54 de extensión de alcohol secundario. El reactivo bloqueante de alcohol primario puede ser diversos reactivos bloqueantes de alcohol primario, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo compuestos de cloruro de sililo, tales como cloruro de t-butildifenilsililo y cloruro de t-butildimetilsililo, y reactivos esterificantes, tales como Ac_{2}O. Preferiblemente, el reactivo bloqueante de alcohol primario es un reactivo bloqueante de alcohol primario que es sustancialmente no reactivo con alcoholes secundarios, tal como cloruro de t-butildifenilsililo o cloruro de t-butildimetilsililo. El monómero (54) de extensión de alcohol secundario se puede hacer reaccionar con cloruro de metanosulfonilo (MeSO_{2}Cl) para proporcionar un mesilato 55 de monómero de extensión de alcohol primario.
Como alternativa, el monómero 54 de extensión de alcohol secundario se puede hacer reaccionar con un reactivo bloqueante de alcohol secundario para proporcionar el compuesto 56. El reactivo bloqueante de alcohol secundario puede ser diversos reactivos bloqueantes de alcohol secundario, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo cloruro de bencilo. El compuesto 56 se puede hacer reaccionar con un reactivo desbloqueante de B_{1}, para eliminar el resto bloqueante B_{1} y proporcionar un monómero 57 de extensión de alcohol primario. El reactivo desbloqueante de B_{1} se puede seleccionar de diversos reactivos desbloqueantes, como entenderán los expertos en la técnica. Cuando el alcohol primario se ha bloqueado formando un éster, el reactivo desbloqueante de B_{1} es un reactivo desesterificante, tal como una base (por ejemplo, carbonato de potasio). Cuando el alcohol primario se ha bloqueado usando un cloruro de sililo, el reactivo desbloqueante de B_{1} es preferiblemente fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF). El monómero 57 de extensión de alcohol primario se puede hacer reaccionar con cloruro de metanosulfonilo para proporcionar un mesilato 58 de monómero de extensión de alcohol secundario.
El monómero 54 de extensión de alcohol primario y el monómero 57 de extensión de alcohol secundario se pueden hacer reaccionar con un agente terminador de la cadena, según lo siguiente. El monómero 54 de extensión de alcohol secundario se puede hacer reaccionar con un reactivo terminador de la cadena, para proporcionar un compuesto 59. El reactivo terminador de la cadena puede ser diversos reactivos terminadores de la cadena, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo haluros de alquilo tales como cloruro de metilo. El compuesto 59 se puede hacer reaccionar con un agente desbloqueante de B_{1} como se describe anteriormente, para proporcionar un monómero 60 terminador de la cadena de alcohol primario. El monómero 60 terminador de la cadena de alcohol primario se puede hacer reaccionar con cloruro de metanosulfonilo para proporcionar el mesilato 61 de monómero terminador de la cadena de alcohol secundario. El monómero 57 de extensión de alcohol primario se puede hacer reaccionar con un reactivo terminador de la cadena para proporcionar un compuesto 62. El reactivo terminador de la cadena puede ser diversos reactivos terminadores de la cadena como se describe anteriormente. El compuesto 62 se puede hacer reaccionar con un reactivo desbloqueante de B_{2}, para eliminar el resto bloqueante B_{2} y proporcionar un monómero 63 terminador de la cadena de alcohol secundario. El reactivo desbloqueante de B_{2} puede ser diversos agentes desbloqueantes, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo H_{2} en presencia de un catalizador de paladio/carbón activado. El monómero terminador de la cadena de alcohol secundario se puede hacer reaccionar con cloruro de metanosulfonilo para proporcionar un mesilato 64 de monómero terminador de la cadena de alcohol primario. Aunque las realizaciones ilustradas en la Figura 11 muestran la síntesis de monómeros terminadores de la cadena, se entenderá que se pueden llevar a cabo reacciones similares para proporcionar polímeros terminadores de la cadena.
En general, las extensiones de la cadena se pueden efectuar haciendo reaccionar un monómero o polímero de extensión de alcohol primario, tal como el monómero 57 de extensión de alcohol primario, con un mesilato de monómero o polímero de extensión de alcohol primario, tal como el mesilato 55 de monómero de extensión de alcohol primario, para proporcionar diversas cadenas de polipropileno uniforme, o haciendo reaccionar un monómero o polímero de extensión de alcohol secundario, tal como el monómero 54 de extensión de alcohol secundario, con un mesilato de monómero o polímero de extensión de alcohol secundario, tal como el mesilato 58 de monómero de extensión de alcohol secundario.
Por ejemplo, en la Figura 13, el mesilato 55 de monómero de extensión de alcohol primario se hace reaccionar con el monómero 57 de extensión de alcohol primario para proporcionar un compuesto dimérico 65. Como alternativa, el mesilato 58 de monómero de extensión de alcohol secundario se puede hacer reaccionar con el monómero 54 de extensión de alcohol secundario para proporcionar el compuesto dimérico 65. El resto bloqueante B_{1} en el compuesto dimérico 65 se puede eliminar usando un reactivo desbloqueante de B_{1}, como se describe anteriormente, para proporcionar un dímero 66 de extensión de alcohol primario. El dímero 66 de extensión de alcohol primario se puede hacer reaccionar con cloruro de metanosulfonilo para proporcionar un mesilato 67 de dímero de extensión de alcohol secundario. Como alternativa, el resto bloqueante B_{2} en el compuesto dimérico 65 se puede eliminar usando el reactivo desbloqueante de B_{2}, como se describe anteriormente, para proporcionar un dímero 69 de extensión de alcohol secundario. El dímero 69 de extensión de alcohol secundario se puede hacer reaccionar con cloruro de metanosulfonilo para proporcionar un mesilato 70 de dímero de extensión de alcohol primario.
Como entenderán los expertos en la técnica, el proceso de extensión de la cadena se puede repetir para lograr otras diversas longitudes de cadena. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 13, el dímero 66 de extensión de alcohol primario se puede hacer reaccionar con el mesilato 70 de dímero de extensión de alcohol primario para proporcionar un compuesto tetramérico 72. Como se ilustra adicionalmente en la Figura 13, un esquema genérico de reacción de extensión de la cadena implica hacer reaccionar el monómero o polímero 73 de extensión de alcohol primario con el mesilato 74 de monómero o polímero de extensión de alcohol primario para proporcionar el polímero 75 de polipropileno uniforme. Los valores de m y n pueden oscilar cada uno desde 0 hasta 1000 o más. Preferiblemente, m y n son cada uno de 0 a 50. Aunque las realizaciones ilustradas en la Figura 13 muestran monómeros y/o polímeros de extensión de alcohol primario que se hacen reaccionar con mesilatos de monómeros y/o polímeros de extensión de alcohol primario, se entenderá que se pueden llevar a cabo reacciones similares usando monómeros y/o polímeros de extensión de alcohol secundario y mesilatos de monómeros y/o polímeros de extensión de alcohol secundario.
Un extremo de un monómero o polímero de extensión de alcohol primario, o un extremo de un mesilato de monómero o polímero de extensión de alcohol primario, se puede hacer reaccionar con un mesilato de monómero o polímero terminador de la cadena de alcohol primario, o con un monómero o polímero terminador de la cadena de alcohol primario, respectivamente, para proporcionar una cadena de polipropileno uniforme terminada en su extensión. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 12, el mesilato 70 de dímero de extensión de alcohol primario se hace reaccionar con el monómero 60 terminador de la cadena de alcohol primario para proporcionar el trímero 71 de extensión de alcohol primario de cadena terminada y bloqueado. Como entenderán los expertos en la técnica, el resto bloqueante B_{1} se puede eliminar, y el trímero de extensión de alcohol primario de cadena terminada resultante se puede hacer reaccionar con un mesilato de monómero o polímero de extensión de alcohol primario para extender la cadena del trímero 71 de cadena terminada.
Un extremo de un monómero o polímero de extensión de alcohol secundario, o un extremo de un mesilato de monómero o polímero de extensión de alcohol secundario, se puede hacer reaccionar con un mesilato de monómero o polímero terminador de la cadena de alcohol secundario, o con un monómero o polímero terminador de la cadena de alcohol secundario, respectivamente, para proporcionar una cadena de polipropileno uniforme de cadena terminada. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 12, el mesilato 67 de dímero de extensión de alcohol secundario se hace reaccionar con el monómero 63 terminador de la cadena de alcohol secundario, para proporcionar el trímero 68 de extensión de alcohol primario de cadena terminada y bloqueado. El resto bloqueante B_{2} se puede eliminar como se describe anteriormente, y el trímero de extensión de alcohol secundario de cadena terminada resultante se puede hacer reaccionar con un mesilato de mer de extensión de alcohol secundario para extender la cadena del trímero 68 de cadena terminada. Aunque las síntesis ilustradas en la Figura 12 muestran la reacción de un dímero con un monómero terminador de la cadena para proporcionar un trímero, se entenderá que el proceso de terminación de la cadena se puede llevar a cabo en cualquier punto en la síntesis de un resto de polipropilenglicol uniforme, o, como alternativa, se pueden proporcionar restos de polipropilenglicol uniforme que no tengan la cadena terminada. Aunque las realizaciones ilustradas en la Figura 12 muestran la terminación de la cadena de un oligómero de polibutileno mediante síntesis con un monómero terminador de la cadena, se entenderá que los oligómeros de polibutileno de la presente invención se pueden terminar directamente (es decir, sin adición de un monómero terminador de la cadena) usando un reactivo terminador de la cadena como se describe anteriormente en la Figura 11.
Los restos de polipropilenglicol uniforme según realizaciones de la presente invención se pueden acoplar a fármaco de calcitonina, a un resto lipófilo tal como un ácido carboxílico, y/o a otros diversos restos mediante diversos métodos como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo los descritos aquí con respecto a los restos de polietilenglicol.
Según estas realizaciones de la presente invención, el resto lipófilo es un resto alquilo lineal, saturado o insaturado, que tiene 1 a 28 átomos de carbono, o un resto de ácido graso lineal, saturado o insaturado, que tiene 2 a 18 átomos de carbono. Más preferiblemente, el resto alquílico tiene 2 a 12 átomos de carbono. Cuando el resto lipófilo es un resto de ácido graso, preferiblemente es un resto de ácido graso natural que es lineal, saturado o insaturado, que tiene 2 a 18 átomos de carbono. Más preferiblemente, el resto de ácido graso tiene 3 a 14 átomos de carbono. Lo más preferible, el resto de ácido graso tiene al menos 4, 5 ó 6 átomos de carbono.
Según estas realizaciones de la presente invención, los restos espaciadores, G, G' y G'', son restos espaciadores como entenderán los expertos en la técnica. Los restos espaciadores se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en restos de azúcar, colesterol y glicerina. Preferiblemente, los oligómeros de estas realizaciones no incluyen restos espaciadores (es decir, k, m y n son preferiblemente 0).
Según estas realizaciones de la presente invención, el resto ligador, L, se puede usar para acoplar el oligómero con el fármaco, como entenderán los expertos en la técnica. Los restos ligadores se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en restos alquílicos y de ácidos grasos.
Según estas realizaciones de la presente invención, el resto terminador es preferiblemente un resto alquilo o alcoxi, y es más preferiblemente un resto de alquilo inferior o de alcoxi inferior. Lo más preferible, el resto terminador es metilo o metoxi. Aunque el resto terminador es preferiblemente un resto alquilo o alcoxi, se entenderá que el resto terminador puede ser diversos restos, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo azúcares, colesterol, alcoholes, y ácidos grasos.
Según estas realizaciones de la presente invención, el oligómero, que está representado mediante la porción entre corchetes de la estructura de Fórmula A, está acoplado preferiblemente de forma covalente al fármaco de calcitonina. En algunas realizaciones, el fármaco de calcitonina se acopla al oligómero utilizando un enlace hidrolizable (por ejemplo, un enlace de éster o de carbonato). Un acoplamiento hidrolizable puede proporcionar un conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero que actúa como un profármaco. En ciertos casos, por ejemplo cuando el conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero es inactivo (es decir, el conjugado carece de la capacidad para afectar al organismo a través del mecanismo primario de acción del fármaco de calcitonina), un acoplamiento hidrolizable puede proporcionar un efecto de liberación en el tiempo o de liberación controlada, administrando el fármaco de calcitonina durante un período de tiempo dado a medida que uno o más oligómeros se escinden de sus conjugados respectivos de fármaco de calcitonina con oligómero para proporcionar el fármaco activo. En otras realizaciones, el fármaco de calcitonina se acopla al oligómero utilizando un enlace no hidrolizable (por ejemplo, un enlace de carbamato, amida, o éter). El uso de un enlace no hidrolizable puede ser preferible cuando es deseable permitir que el conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero circule en el torrente sanguíneo durante un período de tiempo prolongado, preferiblemente al menos 2 horas. El resto enlazante, B, puede ser diversos restos enlazantes que se pueden usar para acoplar covalentemente el oligómero con el fármaco de calcitonina, como entenderán los expertos en la técnica. Los restos enlazantes se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en un enlace o enlaces covalentes, restos de éster, restos de carbonato, restos de carbamato, restos de amida y restos de amina secundaria.
La variable p es un número entero de 1 al número de restos nucleofílicos en el fármaco de calcitonina. Cuando p es mayor que 1, más de un oligómero (es decir, una pluralidad de oligómeros) se acopla al fármaco. Según estas realizaciones de la presente invención, los oligómeros en la pluralidad son el mismo. Cuando una pluralidad de oligómeros se acopla al fármaco, puede ser preferible acoplar uno o más de los oligómeros al fármaco con enlaces hidrolizables, y acoplar uno o más de los oligómeros al fármaco con enlaces no hidrolizables. Como alternativa, todos los enlaces que acoplan la pluralidad de oligómeros al fármaco pueden ser hidrolizables, pero tienen grados variables de capacidad de hidrólisis, de forma que, por ejemplo, uno o más de los oligómeros se elimina rápidamente del fármaco mediante hidrólisis en el cuerpo, y uno o más de los oligómeros se elimina lentamente del fármaco mediante hidrólisis en el cuerpo.
Cuando el fármaco de calcitonina es calcitonina de salmón, p es preferiblemente 1 ó 2, y es más preferiblemente 2.
Se observa una mayor bioeficacia, tal como una capacidad mejorada para reducir el calcio sérico, para la calcitonina de salmón diconjugada, en la que un oligómero se acopla a las funcionalidades amino de Lys^{11} y Lys^{18}.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en las que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A se pueden sintetizar mediante diversos métodos. Por ejemplo, una mezcla de oligómeros que consisten en ácido carboxílico y polietilenglicol se sintetiza poniendo en contacto una mezcla de ácido carboxílico con una mezcla de polietilenglicol, en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla de oligómeros. Los oligómeros de la mezcla se activan entonces de forma que sean capaces de reaccionar con un fármaco de calcitonina para proporcionar un conjugado de fármaco de calcitonina con oligómero. Una realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se ilustra en la Figura 3, y se describe en los Ejemplos 11-18 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se ilustra en la Figura 4, y se describe en los Ejemplos 19-24 aquí más abajo. Todavía otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se ilustra en la Figura 5, y se describe en los Ejemplos 25-29 aquí más abajo. Aún otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se ilustra en la Figura 6, y se describe en los Ejemplos 30-31 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se ilustra en la Figura 7, y se describe en los Ejemplos 32-37 aquí más abajo. Todavía otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se ilustra en la Figura 8, y se describe en el Ejemplo 38 aquí más abajo. Aún otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se ilustra en la Figura 9, y se describe en el Ejemplo 39 aquí más abajo. Otra realización de una ruta sintética para proporcionar una mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se ilustra en la Figura 10, y se describe en el Ejemplo 40 aquí más abajo.
La mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A se hace reaccionar con una mezcla de fármacos de calcitonina en la que cada fármaco en la mezcla tiene el mismo peso molecular, en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. En el Ejemplo 41 aquí más abajo se describe una síntesis preferida. Como entenderán los expertos en la técnica, las condiciones de reacción (por ejemplo, relaciones molares seleccionadas, mezclas de disolventes, y/o pH) se pueden controlar de forma que la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que resulta de la reacción de la mezcla de oligómeros activados en la que cada oligómero tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A y la mezcla de fármacos de calcitonina sea una mezcla de conjugados en la que cada conjugado tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A. Por ejemplo, la conjugación en la funcionalidad amino de lisina se puede suprimir manteniendo el pH de la disolución de la reacción por debajo del pK_{a} de la lisina. Como alternativa, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar y aislar utilizando, por ejemplo, HPLC, para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero, por ejemplo mono-, di- o triconjugados, en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular numérico y tiene la estructura de Fórmula A. El grado de conjugación (por ejemplo, si la molécula aislada es un mono-, di-, o triconjugado) de un conjugado aislado particular se puede determinar y/o verificar utilizando diversas técnicas como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo espectroscopía de masas. La estructura del conjugado particular (por ejemplo, si el oligómero está en Lys^{11}, Lys^{18} o el término N de un monoconjugado de calcitonina de salmón) se puede determinar y/o verificar utilizando diversas técnicas, como entenderán los expertos en la técnica, incluyendo análisis de secuencias, cartografiado peptídico, escisión enzimática selectiva, y/o escisión con endopeptidasas.
Como entenderán los expertos en la técnica, uno o más de los sitios de reacción en el fármaco de calcitonina se puede bloquear, por ejemplo, haciendo reaccionar el fármaco de calcitonina con un agente bloqueante adecuado tal como N-terc-butoxicarbonilo (t-BOC), o N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo) (N-FMOC). Este procedimiento puede ser preferido, por ejemplo, cuando el fármaco de calcitonina es un polipéptido y se desea formar un conjugado insaturado (es decir, un conjugado en el que no todos los restos nucleófilos están conjugados) que tenga un oligómero en el término N del polipéptido. Después de tal bloqueo, la mezcla de fármacos de calcitonina bloqueados se puede hacer reaccionar con la mezcla de oligómeros activados, en la que cada oligómero en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene una estructura del oligómero de Fórmula A, para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tienen oligómero u oligómeros acoplados a uno o más restos nucleófilos y que tienen restos bloqueantes acoplados a otros restos nucleófilos. Después de la reacción de conjugación, los conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se pueden desbloquear como entenderán los expertos en la técnica. Si es necesario, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar entonces como se describe anteriormente, para proporcionar una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular numérico y tiene la estructura de Fórmula A. Como alternativa, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se puede separar antes del desbloqueo.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en las que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A según realizaciones de la presente invención preferiblemente tienen propiedades mejoradas cuando se comparan con las de mezclas convencionales. Por ejemplo, una mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A preferiblemente es capaz de reducir los niveles de calcio sérico en al menos 5 por ciento. Preferiblemente, la mezcla de conjugados es capaz de reducir los niveles de calcio sérico en al menos 10, 11, 12, 13 ó 14 por ciento. Más preferiblemente, la mezcla de conjugados es capaz de reducir niveles de calcio sérico en al menos 15, 16, 17, 18 ó 19 por ciento, y, lo más preferible, la mezcla de conjugados es capaz de reducir niveles de calcio sérico en al menos 20 por ciento.
Como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A preferiblemente tiene una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina, cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina, respectivamente, del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. La resistencia a quimiotripsina o tripsina corresponde al porcentaje que queda cuando la molécula a ensayar se digiere en la enzima aplicable usando un procedimiento similar al presentado en el Ejemplo 51 más abajo. Preferiblemente, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 10 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármacos de calcitonina que no están conjugados con el oligómero. Más preferiblemente, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 15 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero, y, lo más preferible, la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 20 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por quimiotripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero. Preferiblemente, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 10 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero. Más preferiblemente, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 20 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero, y, lo más preferible, la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es 30 por ciento mayor que la resistencia a la degradación por tripsina de la mezcla de fármaco de calcitonina que no está conjugado con el oligómero.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A tiene preferiblemente una bioeficacia mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. La bioeficacia de un compuesto particular corresponde a su valor de área bajo la curva (AUC). Preferiblemente, la bioeficacia de la mezcla es 5 por ciento mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero. Más preferiblemente, la bioeficacia de la mezcla es 10 por ciento mayor que la bioeficacia del fármaco de calcitonina que no está acoplado al oligómero.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A tiene preferiblemente una actividad in vivo que es mayor que la actividad in vivo de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños, tal como cromatografía de permeación en gel como se describe, por ejemplo, en H.R. Allcock y F.W. Lampe, CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402 (2ª ed., 1991).
Como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A tiene preferiblemente una actividad in vitro que es mayor que la actividad in vitro de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A tiene preferiblemente una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina y/o tripsina de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños.
Todavía como otro ejemplo, una mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A tiene preferiblemente una variabilidad intersujetos que es menor que la variabilidad intersujetos de una mezcla polidispersa de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que tiene el mismo peso molecular medio numérico que la mezcla de conjugados de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A. Como entenderán los expertos en la técnica, el peso molecular medio numérico de una mezcla se puede medir por diversos métodos, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaños. La variabilidad intersujetos se puede medir por diversos métodos, como entenderán los expertos en la técnica. La variabilidad intersujetos se calcula preferiblemente según lo siguiente. Se determina para cada sujeto el área bajo una curva de respuesta frente a la dosis (AUC) (es decir, el área entre la curva de respuesta frente a la dosis y un valor inicial de referencia). La AUC media para todos los sujetos se determina sumando las AUC de cada sujeto y dividiendo la suma entre el número de sujetos. Entonces se determina para cada sujeto el valor absoluto de la diferencia entre la AUC del sujeto y la AUC media. Los valores absolutos de las diferencias obtenidas se suman entonces para dar un valor que representa la variabilidad intersujetos. Menores valores representan menores variabilidades intersujetos, y mayores valores representan mayores variabilidades intersujetos.
Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en la que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A según realizaciones de la presente invención tienen preferiblemente dos o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente. Más preferiblemente, las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en las que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A según realizaciones de la presente invención tienen tres o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente. Lo más preferible, las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en las que cada conjugado en la mezcla tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de Fórmula A según realizaciones de la presente invención tienen cuatro o más de las propiedades mejoradas descritas anteriormente.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla de conjugados según realizaciones de la presente invención. Las mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero descritas anteriormente se pueden formular para la administración en un vehículo farmacéutico según técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9ª Ed. 1995). En la fabricación de una composición farmacéutica según realizaciones de la presente invención, la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se mezcla típicamente con, entre otros, un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo debe ser, por supuesto, aceptable en el sentido de ser compatible con cualesquiera otros ingredientes en la composición farmacéutica, y no debería ser perjudicial para el paciente. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y se formula preferiblemente con la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero como una formulación farmacéutica unitaria, por ejemplo un comprimido, que puede contener de 0,01 ó 0,5% a 95% o 99% en peso de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante cualquiera de las técnicas bien conocidas de farmacia, incluyendo mezclar los componentes, opcionalmente incluyendo uno o más ingredientes accesorios.
Las composiciones farmacéuticas según realizaciones de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, por inhalación (por ejemplo, vía un aerosol), bucal (por ejemplo, sublingual), vaginal, parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial, o intravenosa), tópica (es decir, superficies tanto de la piel como de las mucosas, incluyendo superficies de las vías respiratorias) y transdérmica, aunque la ruta más adecuada en cualquier caso dependerá de la naturaleza y gravedad de la afección tratada, y de la naturaleza de la mezcla particular de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero que se esté usando.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral se pueden presentar en unidades discretas, tales como cápsulas, saquitos, tabletas, o comprimidos, conteniendo cada una una cantidad predeterminada de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero; como un polvo o gránulos; como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. Tales formulaciones se pueden preparar mediante cualquier método adecuado de farmacia que incluya la etapa de asociar la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero y un vehículo adecuado (que puede contener uno o más ingredientes accesorios como se señala anteriormente). En general, la composición farmacéutica según realizaciones de la presente invención se prepara mezclando uniforme e íntimamente la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero con un vehículo líquido o sólido finalmente dividido, o ambos, y después, si es necesario, conformando la mezcla resultante. Por ejemplo, un comprimido se puede preparar comprimiendo o moldeando un polvo o gránulos que contienen la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos prensados se pueden preparar comprimiendo, en una máquina adecuada, la mezcla en una forma que fluye libremente, tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, y/o agente o agentes tensioactivos/dispersantes. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando, en una máquina adecuada, el compuesto en polvo humedecido con un aglutinante líquido inerte.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen tabletas que comprenden la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en una base con sabor, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; y pastillas que comprenden la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga.
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Las composiciones farmacéuticas según realizaciones de la presente invención adecuadas para administración parenteral comprenden disoluciones estériles acuosas y no acuosas para inyección de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero, preparaciones las cuales son preferiblemente isotónicas con la sangre del receptor pretendido. Estas preparaciones pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y solutos que hacen a la composición isotónica con la sangre del receptor pretendido. Las suspensiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las composiciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o de múltiples dosis, por ejemplo ampollas y viales cerrados herméticamente, y se pueden almacenar en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo disolución salina o agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Las disoluciones y suspensiones extemporáneas para inyección se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos de los tipos previamente descritos. Por ejemplo, se puede proporcionar una composición inyectable, estable, estéril, que comprende una mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en una forma farmacéutica unitaria en un recipiente cerrado herméticamente.
La mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero se proporciona en forma de un liofilizado que es capaz de ser reconstituido con un vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable para formar una composición líquida adecuada para su inyección en un sujeto. La forma farmacéutica unitaria comprende típicamente de 10 mg a 10 gramos de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. Cuando la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero es sustancialmente insoluble en agua, se puede emplear una cantidad suficiente de agente emulsionante, que es fisiológicamente aceptable, en una cantidad suficiente para emulsionar la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero en un vehículo acuoso. Uno de tales agentes emulsionantes útiles es fosfatidilcolina.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal se presentan preferiblemente como supositorios farmacéuticos unitarios. Estos se pueden preparar mezclando la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero con uno o más vehículos sólidos convencionales, por ejemplo manteca de cacao, y conformando después la mezcla resultante.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para aplicación tópica a la piel preferiblemente toman la forma de un ungüento, crema, loción, pasta, gel, pulverización, aerosol, o aceite. Los vehículos que se pueden usar incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, potenciadores transdérmicos, y combinaciones de dos o más de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración transdérmica se pueden presentar como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período prolongado de tiempo. Las composiciones adecuadas para administración transdérmica también se pueden suministrar mediante iontoforesis (véase, por ejemplo, Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986)), y típicamente toman la forma de una disolución acuosa opcionalmente tamponada de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. Las formulaciones adecuadas comprenden tampón de citrato o de bis/tris (pH 6) o etanol/agua, y contienen de 0,1 a 0,2 M de ingrediente activo.
La invención también proporciona el uso de tales composiciones farmacéuticas para tratar un trastorno óseo en un sujeto. El trastorno óseo se caracteriza por excesiva resorción ósea osteoclástica y/o efectos séricos hipercalcémicos. Los trastornos óseos que se pueden tratar y/o prevenir incluyen osteoporosis, enfermedad de Paget, e hipercalcemia.
La cantidad eficaz de cualquier mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero variará en cierto modo de una mezcla a otra, y de un paciente a otro, y dependerá de factores tales como la edad y afección del paciente, y la ruta de suministro. Tales dosificaciones se pueden determinar según procedimientos farmacológicos normales conocidos por los expertos en la técnica. Como una proposición general, una dosis de 0,1 a 50 mg/kg tendrá eficacia terapéutica, calculándose todos los pesos basándose en el peso de la mezcla de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero. Los problemas de toxicidad al nivel más alto pueden restringir dosificaciones intravenosas hasta un nivel más bajo, tal como hasta 10 mg/kg, calculándose todos los pesos basándose en el peso de la base activa. Para la administración oral se puede emplear una dosificación de 10 mg/kg a 50 mg/kg. Típicamente, para inyección intramuscular se puede emplear una dosis de 0,5 mg/kg a 5 mg/kg. La frecuencia de administración es habitualmente 1, 2, ó 3 veces por día, o según sea necesario para controlar la afección. Como alternativa, los conjugados de fármaco con oligómero se pueden administrar mediante infusión continua. La duración del tratamiento depende del tipo de trastorno óseo tratado, y puede durar tanto como la vida del paciente.
También se proporcionan métodos para sintetizar mezclas de conjugados según realizaciones de la presente invención. Aunque las siguientes realizaciones de una ruta sintética están dirigidas a la síntesis de una mezcla monodispersa, se pueden utilizar rutas sintéticas similares para sintetizar otras mezclas de conjugados de fármaco de calcitonina con oligómero según realizaciones de la presente invención.
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Una mezcla sustancialmente monodispersa de polímeros que comprenden restos de polietilenglicol se proporciona como se ilustra en la reacción 1:
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R^{1} es H o un resto lipófilo. R^{1} es preferiblemente H, alquilo, arilalquilo, un resto aromático, un resto de ácido graso, un éster de un resto de ácido graso, colesterilo o adamantilo. R^{1} es más preferiblemente H, alquilo inferior, o un resto aromático. R^{1} es lo más preferiblemente H, metilo o bencilo.
En la Fórmula I, n es de 1 a 25. Preferiblemente, n es de 1 a 6.
X^{+} es un ión positivo. Preferiblemente, X^{+} es cualquier ión positivo en un compuesto, tal como una base fuerte, que sea capaz de ionizar un resto hidroxilo en el PEG. Ejemplos de iones positivos incluyen iones sodio, iones potasio, iones litio, iones cesio e iones talio.
R^{2} es H o un resto lipófilo. R^{2} es preferiblemente alquilo lineal o ramificado, arilalquilo, un resto aromático, un resto de ácido graso, o un éster de un resto de ácido graso. R^{2} es más preferiblemente alquilo inferior, bencilo, un resto de ácido graso que tiene 1 a 24 átomos de carbono, o un éster de un resto de ácido graso que tiene 1 a 24 átomos de carbono. R^{2} es, lo más preferible, metilo, un resto de ácido graso que tiene 1 a 18 átomos de carbono o un éster etílico de un resto de ácido graso que tiene 1 a 18 átomos de carbono.
En la Fórmula II, m es de 1 a 25. Preferiblemente, m es de 1 a 6.
Ms es un resto de mesilato (es decir, CH_{3}S(O_{2})^{-}).
Según se ilustra en la reacción 1, una mezcla de compuestos que tienen la estructura de Fórmula I se hace reaccionar con una mezcla de compuestos que tienen la estructura de Fórmula II para proporcionar una mezcla de polímeros que comprenden restos de polietilenglicol y que tienen la estructura de Fórmula III. La mezcla de compuestos que tienen la estructura de Fórmula I es una mezcla sustancialmente monodispersa. Preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos en la mezcla de compuestos de Fórmula I tiene el mismo peso molecular, y, más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula I es una mezcla monodispersa. La mezcla de compuestos de Fórmula II es una mezcla sustancialmente monodispersa. Preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos en la mezcla de compuestos de Fórmula II tiene el mismo peso molecular, y, más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula II es una mezcla monodispersa. La mezcla de compuestos de Fórmula III es una mezcla sustancialmente monodispersa. Preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos en la mezcla de compuestos de Fórmula III tiene el mismo peso molecular. Más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula III es una mezcla monodispersa.
La reacción 1 se lleva a cabo preferiblemente entre 0ºC y 40ºC, y más preferiblemente se lleva a cabo entre 15ºC y 35ºC, y lo más preferible se lleva a cano a temperatura ambiente (25ºC).
La reacción 1 se puede llevar a cabo durante diversos períodos de tiempo, como entenderán los expertos en la técnica. La reacción 1 se lleva a cabo preferiblemente durante un período de tiempo entre 0,25, 0,5 ó 0,75 horas y 2, 4 u 8 horas.
La reacción 1 se lleva a cabo preferiblemente en un disolvente aprótico, tal como N,N-dimetilacetamida (DMA), N,N-dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), triamida hexametilfosfórica, tetrahidrofurano (THF), dioxano, éter dietílico, metil-t-butil-éter (MTBE), tolueno, benceno, hexano, pentano, N-metilpirrolidinona, tetrahidronaftaleno, decahidronaftaleno, 1,2-diclorobenceno, 1,3-dimetil-2-imidazolidinona, o una de sus mezclas. Más preferiblemente, el disolvente es DMF, DMA o tolueno.
La relación molar del compuesto de Fórmula I al compuesto de Fórmula II es preferiblemente mayor que 1:1. Más preferiblemente, la relación molar es al menos 2:1. Al proporcionar un exceso de los compuestos de Fórmula I, se puede asegurar que se hacen reaccionar sustancialmente todos los compuestos de Fórmula II, lo que puede ayudar en la recuperación de los compuestos de Fórmula III según se explica más abajo.
Los compuestos de Fórmula I se preparan preferiblemente como se ilustra en la reacción 2:
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R^{1} y X^{+} son como se describen anteriormente, y la mezcla de compuestos de Fórmula IV es sustancialmente monodispersa; preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos de la mezcla de compuestos de Fórmula IV tiene el mismo peso molecular y, más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula IV es una mezcla monodispersa.
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Los diversos compuestos capaces de ionizar un resto hidroxilo en el resto de PEG del compuesto de Fórmula IV serán conocidos por los expertos en la técnica. El compuesto capaz de ionizar un resto hidroxilo es preferiblemente una base fuerte. Más preferiblemente, el compuesto capaz de ionizar un resto hidroxilo se selecciona del grupo que consiste en hidruro sódico, hidruro potásico, t-butóxido sódico, t-butóxido potásico, butil-litio (BuLi) y diisopropilamiduro de litio. El compuesto capaz de ionizar un resto hidroxilo es más preferiblemente hidruro sódico.
La relación molar del compuesto capaz de ionizar un resto hidroxilo en el resto de PEG del compuesto de Fórmula IV al compuesto de Fórmula IV es preferiblemente al menos 1:1, y es más preferiblemente al menos 2:1. Al proporcionar un exceso del compuesto capaz de ionizar el resto hidroxilo, se asegura que sustancialmente todos los compuestos de Fórmula IV se hacen reaccionar para proporcionar los compuestos de Fórmula I. Así, se pueden evitar dificultades de separación, que se pueden presentar si tanto los compuestos de Fórmula IV como los compuestos de Fórmula I estaban presentes en la mezcla de productos de reacción.
La reacción 2 se lleva a cabo preferiblemente entre 0ºC y 40ºC, más preferiblemente se lleva a cabo entre 0ºC y 35ºC, y lo más preferible se lleva a cabo entre 0ºC y temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC).
La reacción 2 se puede llevar a cabo durante diversos períodos de tiempo, como entenderán los expertos en la técnica. La reacción 2 se lleva a cabo preferiblemente durante un período de tiempo entre 0,25, 0,5 ó 0,75 horas y 2, 4 u 8 horas.
La reacción 2 se lleva a cabo preferiblemente en un disolvente aprótico, tal como N,N-dimetilacetamida (DMA), N,N-dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), triamida hexametilfosfórica, tetrahidrofurano (THF), dioxano, éter dietílico, metil-t-butil-éter (MTBE), tolueno, benceno, hexano, pentano, N-metilpirrolidinona, diclorometano, cloroformo, tetrahidronaftaleno, decahidronaftaleno, 1,2-diclorobenceno, 1,3-dimetil-2-imidazolidinona, o una de sus mezclas. Más preferiblemente, el disolvente es DMF, diclorometano o tolueno.
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Los compuestos de Fórmula II se preparan preferiblemente según se ilustra en la reacción 3:
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R^{2} y Ms son como se describe anteriormente, y el compuesto de Fórmula V está presente como una mezcla sustancialmente monodispersa de compuestos de Fórmula V; preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos en la mezcla de compuestos de Fórmula V tiene el mismo peso molecular; y, más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula V es una mezcla monodispersa.
Q es un haluro, preferiblemente cloruro o fluoruro.
CH_{3}S(O_{2})Q es haluro de metanosulfonilo. El haluro de metanosulfonilo es preferiblemente cloruro de metanosulfonilo o fluoruro de metanosulfonilo. Más preferiblemente, el haluro de metanosulfonilo es cloruro de metanosulfonilo.
La relación molar del haluro de metanosulfonilo al compuesto de Fórmula V es preferiblemente mayor que 1:1, y es más preferiblemente al menos 2:1. Al proporcionar un exceso del haluro de metanosulfonilo, se asegura que sustancialmente todos los compuestos de Fórmula V se hacen reaccionar para proporcionar los compuestos de Fórmula II. Así, se pueden evitar dificultades de separación que se pueden producir si tanto los compuestos de Fórmula V como los compuestos de Fórmula II estuvieran presentes en la mezcla de productos de reacción.
La reacción 3 se lleva a cabo preferiblemente entre -10ºC y 40ºC, se lleva a cabo más preferiblemente entre 0ºC y aproximadamente 35ºC, y se lleva a cabo lo más preferible entre 0ºC y temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC).
La reacción 3 se puede llevar a cabo durante diversos períodos de tiempo, como entenderán los expertos en la técnica. La reacción 3 se lleva a cabo preferiblemente durante un período de tiempo entre 0,25, 0,5 ó 0,75 horas y 2, 4 u 8 horas.
La reacción 3 se lleva a cabo preferiblemente en presencia de una amina alifática, incluyendo monometilamina, dimetilamina, trimetilamina, monoetilamina, dietilamina, trietilamina, monoisopropilamina, diisopropilamina, mono-n-butilamina, di-n-butilamina, tri-n-butilamina, monociclohexilamina, diciclohexilamina, o sus mezclas. Más preferiblemente, la amina alifática es una amina terciaria tal como trietilamina.
Como entenderán los expertos en la técnica, diversas mezclas sustancialmente monodispersas de compuestos de Fórmula V están comercialmente disponibles. Por ejemplo, cuando R^{2} es H o metilo, los compuestos de Fórmula V son compuestos de PEG o mPEG, respectivamente, que están disponibles de Aldrich de Milwaukee, Wisconsin; Fluka de Suiza, y/o TCI America de Portland, Oregon.
Cuando R^{2} es un resto lipófilo tal como, por ejemplo, alquilo superior, ácido graso, un éster de un ácido graso, colesterilo o adamantilo, los compuestos de Fórmula V se pueden proporcionar mediante diversos métodos, como entenderán los expertos en la técnica. Los compuestos de Fórmula V se proporcionan preferiblemente según lo siguiente:
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R^{2} es un resto lipófilo, preferiblemente alquilo superior, éster de ácido graso, colesterilo o adamantilo, más preferiblemente un éster de alquilo inferior de un ácido graso, y lo más preferible un éster etílico de un ácido graso que tiene de 1 a 18 átomos de carbono.
R^{3} es H, bencilo, tritilo, tetrahidropirano, u otros grupos protectores de alcohol, como entenderán los expertos en la técnica.
X_{2}^{+} es un ión positivo como se describe anteriormente con respecto a X^{+}.
El valor de m es como se describe anteriormente.
En cuanto a la reacción 4, una mezcla de compuestos de Fórmula VI se hace reaccionar con una mezcla de compuestos de Fórmula VII en condiciones de reacción similares a las descritas anteriormente con referencia a la reacción 1. La mezcla de compuestos de Fórmula VI es una mezcla sustancialmente monodispersa. Preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos en la mezcla de compuestos de Fórmula VI tiene el mismo peso molecular. Más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula VI es una mezcla monodispersa. La mezcla de compuestos de Fórmula VII es una mezcla sustancialmente monodispersa. Preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos en la mezcla de compuestos de Fórmula VII tiene el mismo peso molecular. Más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula VII es una mezcla monodispersa.
En cuanto a la reacción 5, el compuesto de Fórmula VIII se puede hidrolizar para convertir el resto R^{3} en un alcohol mediante diversos métodos, como entenderán los expertos en la técnica. Cuando R^{3} es bencilo o tritilo, la hidrólisis se realiza preferiblemente utilizando H_{2} en presencia de un catalizador de paladio-carbón vegetal, como es conocido por los expertos en la técnica. Por supuesto, cuando R_{3} es H, la reacción 5 es innecesaria.
El compuesto de Fórmula VI puede estar disponible comercialmente, o se puede proporcionar como se describe anteriormente con referencia a la reacción 3. El compuesto de fórmula VII se puede proporcionar como se describe anteriormente con referencia a la reacción 2.
Las mezclas sustancialmente monodispersas de polímeros que comprenden restos de PEG y que tienen la estructura de Fórmula III anterior se pueden hacer reaccionar además con otros polímeros sustancialmente monodispersos que comprenden restos de PEG, a fin de extender la cadena de PEG. Por ejemplo, se puede emplear el siguiente esquema:
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Ms, m y n son como se describe anteriormente con referencia a la reacción 1; p es similar a n y m; y X_{2}^{+} es similar a X^{+} como se describe anteriormente con referencia a la reacción 1. Q es como se describe anteriormente con referencia a la reacción 3. R^{2} es como se describe anteriormente con referencia a la reacción 1, y es preferiblemente alquilo inferior. R^{1} es H. La reacción 6 se lleva a cabo preferiblemente de una manera similar a la descrita anteriormente con referencia a la reacción 3. La reacción 7 se lleva a cabo preferiblemente de una manera similar a la descrita anteriormente con referencia a la reacción 1. Preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos en la mezcla de compuestos de Fórmula III tiene el mismo peso molecular, y, más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula III es una mezcla monodispersa. La mezcla de compuestos de Fórmula X es una mezcla sustancialmente monodispersa. Preferiblemente, al menos 96, 97, 98 ó 99 por ciento de los compuestos en la mezcla de compuestos de Fórmula X tiene el mismo peso molecular, y, más preferiblemente, la mezcla de compuestos de Fórmula X es una mezcla monodispersa.
Un procedimiento según realizaciones de la presente invención se ilustra mediante el esquema mostrado en la Figura 1, que se describirá ahora. La síntesis de una mezcla sustancialmente monodispersa de oligómeros que contienen polietilenglicol comienza con la preparación del éter monobencílico (1) de un polietilenglicol sustancialmente monodisperso. Un exceso de un polietilenglicol sustancialmente monodisperso disponible comercialmente se hace reaccionar con cloruro de bencilo en presencia de hidróxido sódico acuoso, como se describe por Coudert et al.
(Synthetic Communications, 16(1): 19-26 (1986)). La sal sódica de 1 se prepara a continuación mediante la adición de NaH, y esta sal sódica se deja reaccionar con el mesilato sintetizado a partir del éster de un ácido hidroxialcanoico (2). El producto (3) del desplazamiento del mesilato se desbencila a través de hidrogenación catalítica para obtener el alcohol (4). El mesilato (5) de este alcohol se puede preparar mediante adición de cloruro de metanosulfonilo y se puede usar como el electrófilo en la reacción con la sal sódica del éter monometílico de un derivado de polietilenglicol sustancialmente monodisperso, extendiendo de ese modo la porción polietilenglicólica del oligómero hasta la longitud deseada, obteniendo el éster alargado (6). El éster se puede hidrolizar en el ácido (7) en una base acuosa, y se puede transformar en el éster activado (8) mediante reacción con una carbodiimida y N-hidroxisuccinimida. Aunque el oligómero ilustrado en la Figura 1 se activa usando N-hidroxisuccinimida, ha de entenderse que se pueden usar otros diversos reactivos para activar oligómeros de la presente invención, incluyendo cloroformiatos de fenilo activos tales como cloroformiato de para-nitrofenilo, cloroformiato de fenilo, 3,4-dicloroformiato de fenilo y 3,4-dicloroformiato de fenilo; tresilación; y formación de acetal.
En referencia todavía a la Figura 1, q es de 1 a 24. Preferiblemente, q es de 1 a 18, y q es más preferiblemente de 4 a 16. R^{4} es un resto capaz de sufrir hidrólisis para proporcionar el ácido carboxílico. R^{4} es preferiblemente alquilo inferior, y es más preferiblemente etilo. Las variables n y m son como se describe anteriormente con referencia a la reacción 1.
Todos los materiales de partida usados en los procedimientos descritos aquí están comercialmente disponibles o se pueden preparar mediante métodos conocidos en la técnica, usando materiales de partida comercialmente disponibles.
La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Debe apreciarse que estos ejemplos tienen el propósito de ilustrar aspectos de la presente invención.
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Ejemplos
Ejemplos 1 a 10
Las reacciones en los Ejemplos 1 a 10 se llevaron a cabo en nitrógeno con agitación magnética, excepto que se especifique de otro modo. "Tratamiento" significa extracción con un disolvente orgánico, lavado de la fase orgánica con disolución saturada de NaCl, secado (MgSO_{4}), y evaporación (evaporador giratorio). La cromatografía de capa fina se llevó a cabo con placas de vidrio Merck prerrevestidas con gel de sílice 60ºF - 254, y las manchas se visualizaron mediante vapor con yodo. Todos los espectros de masas se determinaron mediante Macromolecular Resources Colorado State University, CO, y se dan en el orden m/z (intensidad relativa). Los análisis elementales y los puntos de fusión se llevaron a cabo mediante Galbraith Laboratories, Inc., Knoxville, TN. Los Ejemplos 1-10 se refieren al esquema ilustrado en la Figura 2.
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Ejemplo 1
8-Metoxi-1-(metilsulfonil)oxi-3,6-dioxaoctano (9)
Una disolución de moléculas de trietilenglicolmonometiléter no polidispersas (4,00 ml, 4,19 g, 25,5 mmoles) y trietilamina (4,26 ml, 3,09 g, 30,6 mmoles) en diclorometano seco (50 ml) se enfrió en un baño de hielo y se colocó en una atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota, desde un embudo de adición, una disolución de cloruro de metanosulfonilo (2,37 ml, 3,51 g, 30,6 mmoles) en diclorometano seco (20 ml). Diez minutos después de terminar la adición del cloruro, la mezcla de reacción se retiró del baño de hielo y se dejó alcanzar la temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante una hora más, momento en el cual la TLC (CHCl_{3} con 15% de MeOH como el eluyente) mostró que no quedaba trietilenglicolmonometiléter.
La mezcla de reacción se diluyó con otros 75 ml de diclorometano, y se lavó sucesivamente con NaHCO_{3} saturado, con agua y con salmuera. Los orgánicos se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío para dar una mezcla no polidispersa de compuestos 9 como un aceite claro (5,31 g, 86%).
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Ejemplo 2
Etilenglicolmonometiléter (10) (m = 4, 5, 6)
A una disolución agitada de compuesto 11 no polidisperso (35,7 mmoles) en DMF seca (25,7 ml), en N_{2}, se añadió en porciones una dispersión al 60% de NaH en aceite mineral, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A esta sal 12 se añadió una disolución de mesilato 9 no polidisperso (23,36) en DMF seca (4 ml) en una única porción, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC (12% CH_{3}OH-CHCl_{3}). La mezcla de reacción se diluyó con una cantidad igual de HCl 1N, y se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 ml) y se desechó. La extracción de la disolución acuosa y el tratamiento dieron el polímero 10 no polidisperso (82-84% de rendimiento).
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Ejemplo 3
3,6,9,12,15,18,21-Heptaoxadocosanol (10) (m = 4)
Aceite; Rf 0,46 (metanol:cloroformo = 3:22); MS m/z calculado para C_{15}H_{32}O_{8} 340,21 (M^{+}+1), encontrado 341,2.
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Ejemplo 4
3,6,9,12,15,18,21,24-Octaoxapentacosanol (10) (m = 5)
Aceite; Rf 0,43 (metanol: cloroformo = 6:10); MS m/z calculado para C_{17}H_{36}O_{9} 384,24 (M^{+}+1), encontrado 385,3.
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Ejemplo 5
3,6,9,12,15,18,21,24,27-Nonaoxaoctacosanol (10) (m = 6)
Aceite; Rf 0,42 (metanol:cloroformo = 6:10); MS m/z calculado para C_{18}H_{40}O_{10} 428,26 (M^{+}+1), encontrado 429,3.
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Ejemplo 6
20-metoxi-1-(metilsulfonil)oxi-3,6,9,12,15,18-hexaoxaeicosano (14)
El compuesto 14 no polidisperso se obtuvo con un rendimiento cuantitativo a partir del alcohol 13 (m = 4) y cloruro de metanosulfonilo como se describe para 9, como un aceite; Rf 0,4 (acetato de etilo:acetonitrilo = 1:5); MS m/z calculado para C_{17}H_{37}O_{10} 433,21 (M^{+}+1), encontrado 433,469.
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Ejemplo 7
Etilenglicolmonometiléter (15) (m = 3, 4, 5)
Los compuestos 15 no polidispersos se prepararon a partir de un diol, usando el procedimiento descrito anteriormente para el compuesto 10.
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Ejemplo 8
3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-Decaoxaeneicosanol (15) (m = 3)
Aceite; Rf 0,41 (metanol:cloroformo = 6:10); MS m/z calculado para C_{21}H_{44}O_{11} 472,29 (M^{+}+1), encontrado 472,29.
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Ejemplo 9
3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-Undecaoxatetratricosanol (15) (m = 4)
Aceite; Rf 0,41 (metanol:cloroformo = 6:10); MS m/z calculado para C_{23}H_{48}O_{12} 516,31 (M^{+}+1), encontrado 516,31.
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Ejemplo 10
3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-Dodecaoxaheptatricosanol (15) (m = 5)
Aceite; Rf 0,41 (metanol:cloroformo = 6:10); MS m/z calculado para C_{25}H_{52}O_{13} 560,67 (M^{+}+1), encontrado 560,67.
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Los Ejemplos 11 a 18 se refieren al esquema ilustrado en la Figura 3.
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Ejemplo 11 Hexaetilenglicolmonobenciléter (16)
Una disolución acuosa de hidróxido de sodio preparada disolviendo 3,99 g (100 mmoles) de NaOH en 4 ml de agua se añadió lentamente a hexaetilenglicol no polidisperso (28,175 g, 25 ml, 100 mmoles). Se añadió cloruro de bencilo (3,9 g, 30,8 mmoles, 3,54 ml), y la mezcla de reacción se calentó con agitación hasta 100ºC durante 18 horas. Después, la mezcla de reacción se enfrió, se diluyó con salmuera (250 ml), y se extrajo con cloruro de metileno (200 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera una vez, se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío hasta un aceite marrón oscuro. La mezcla de producto bruto se purificó vía cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, gradiente de elución: acetato de etilo hasta acetato de etilo/metanol 9/1) para producir 8,099 g (70%) de 16 no polidisperso como un aceite amarillo.
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Ejemplo 12 6-Metilsulfoniloxihexanoato de etilo (17)
Una disolución de 6-hidroxihexanoato de etilo no polidisperso (50,76 ml, 50,41 g, 227 mmoles) en diclorometano seco (75 ml) se enfrió en un baño de hielo y se colocó en una atmósfera de nitrógeno. Se añadió trietilamina (34,43 ml, 24,99 g, 247 mmoles). Se añadió gota a gota, desde un embudo de adición, una disolución de cloruro de metanosulfonilo (19,15 ml, 28,3 g, 247 mmoles) en diclorometano seco (75 ml). La mezcla se agitó durante tres horas y media, dejando que alcanzase lentamente la temperatura ambiente a medida que el baño de hielo se fundió. La mezcla se filtró a través de gel de sílice, y el filtrado se lavó sucesivamente con agua, con NaHCO_{3} saturado, con agua y salmuera. Los orgánicos se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío hasta un aceite amarillo pálido. La purificación final del producto bruto se logró mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, 1/1 hexanos/acetato de etilo) para dar el producto no polidisperso (46,13 g, 85%) como un aceite transparente, incoloro. FAB MS: m/e 239 (M+H), 193 (M-C_{2}H_{5}O).
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Ejemplo 13 Éster etílico del ácido 6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-benciloxietoxi)etoxi]etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-hexanoico (18)
Se suspendió hidruro de sodio (3,225 g de una dispersión en aceite al 60%, 80,6 mmoles) en 80 ml de tolueno anhidro, se colocó en una atmósfera de nitrógeno y se enfrió en un baño de hielo. A la suspensión de NaH se añadió una disolución del alcohol 16 no polidisperso (27,3 g, 73,3 mmoles) en 80 ml de tolueno seco. La mezcla se agitó a 0ºC durante treinta minutos, se dejó alcanzar la temperatura ambiente y se agitó durante otras cinco horas, tiempo durante el cual la mezcla se convirtió en una disolución marrón transparente. El mesilato 17 no polidisperso (19,21 g, 80,6 mmoles) en 80 ml de tolueno seco se añadió a la mezcla de NaH/alcohol, y las disoluciones combinadas se agitaron a temperatura ambiente durante tres días. La mezcla de reacción se paralizó con 50 ml metanol, y se filtró a través de alúmina básica. El filtrado se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, gradiente de elución: 3/1 acetato de etilo/hexanos hasta acetato de etilo) para producir el producto no polidisperso como un aceite amarillo pálido (16,52 g, 44%). FAB MS: m/e 515 (M+H).
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Ejemplo 14 Éster etílico del ácido 6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-hexanoico (19)
Se disolvió éter bencílico 18 no polidisperso (1,03 g, 2,0 mmoles) en 25 ml de etanol. A esta disolución se añadieron 270 mg de Pd al 10%/C, y la mezcla se colocó en una atmósfera de hidrógeno y se agitó durante cuatro horas, momento en el cual la TLC mostró la desaparición completa del material de partida. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite 545 para eliminar el catalizador, y el filtrado se concentró a vacío para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite claro (0,67 g, 79%). FAB MS: m/e 425 (M+H), 447 (M+Na).
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Ejemplo 15 Éster etílico del ácido 6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metilsulfoniletoxi)etoxi]etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-hexanoico (20)
El alcohol 19 no polidisperso (0,835 g, 1,97 mmoles) se disolvió en 3,5 ml de diclorometano seco y se colocó en una atmósfera de nitrógeno. Se añadió trietilamina (0,301 ml, 0,219 g, 2,16 mmoles), y la mezcla se enfrió en un baño de hielo. Después de dos minutos, se añadió el cloruro de metanosulfonilo (0,16 ml, 0,248 g, 2,16 mmoles). La mezcla se agitó durante 15 minutos a 0ºC, y después a temperatura ambiente durante dos horas. La mezcla de reacción se filtró a través de gel de sílice para eliminar el cloruro de trietilamonio, y el filtrado se lavó sucesivamente con agua, con NaHCO_{3} saturado, con agua y salmuera. Los orgánicos se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice, 9/1 acetato de etilo/metanol) para dar el compuesto 20 no polidisperso como un aceite transparente (0,819 g, 83%). FAB MS: m/e 503 (M+H).
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Ejemplo 16 Éster etílico del ácido 6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metoxietoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-hexanoico (21)
Se suspendió NaH (88 mg de una dispersión en aceite al 60%, 2,2 mmoles) en tolueno anhidro (3 ml) en N_{2}, y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió dietilenglicolmonometiléter no polidisperso (0,26 ml, 0,26 g, 2,2 mmoles) que se había secado vía destilación azeotrópica con tolueno. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta la temperatura ambiente, y se agitó durante cuatro horas, tiempo durante el cual la suspensión turbia gris se volvió transparente y amarilla y después se puso marrón. Se añadió mesilato 20 (0,50 g, 1,0 mmoles) en 2,5 ml tolueno seco. Tras agitar a temperatura ambiente toda la noche, la reacción se paralizó mediante adición de 2 ml de metanol, y la disolución resultante se filtró a través de gel de sílice. El filtrado se concentró a vacío y la FAB MS: m/e 499 (M+H), 521 (M+Na). La purificación adicional mediante cromatografía preparatoria (gel de sílice, 19/3 cloroformo/metanol) proporcionó el producto no polidisperso como un aceite amarillo transparente (0,302 g 57%). FAB MS: m/e 527 (M+H), 549 (M+Na).
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Ejemplo 17 Ácido 6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metoxietoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-hexanoico (22)
El éster 21 no polidisperso (0,25 g, 0,46 mmoles) se agitó durante 18 horas en 0,71 ml de NaOH 1 N. Después de 18 horas, la mezcla se concentró a vacío para eliminar el alcohol, y el residuo se disolvió en otros 10 ml de agua. La disolución acuosa se acidificó hasta pH 2 con HCl 2 N, y el producto se extrajo en diclorometano (30 ml x 2). Los orgánicos combinados se lavaron entonces con salmuera (25 ml x 2), se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a vacío para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite amarillo (0,147 g, 62%). FAB MS: m/e 499 (M+H), 521 (M+Na).
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Ejemplo 18 Éster 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ílico del ácido 6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metoxietoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-hexanoico (23)
El ácido 22 no polidisperso (0,209 g, 0,42, mmoles) se disolvió en 4 ml de diclorometano seco, y se añadió a un matraz seco que ya contenía NHS (N-hidroxisuccinimida) (57,8 mg, 0,502 mmoles) y EDC (hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida) (98,0 mg, 0,502 mmoles) en una atmósfera de N_{2}. La disolución se agitó a temperatura ambiente toda la noche, y se filtró a través de gel de sílice para eliminar el exceso de reactivos y la urea formada a partir de la EDC. El filtrado se concentró a vacío para proporcionar el producto no polidisperso como un aceite amarillo oscuro (0,235 g, 94%). FAB MS: m/e 596 (M+H), 618 (M+Na).
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Los Ejemplos 19 a 24 se refieren al esquema ilustrado en la Figura 4.
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Ejemplo 19 Mesilato de trietilenglicolmonometiléter (24)
A una disolución de CH_{2}Cl_{2} (100 ml) enfriada hasta 0ºC en un baño de hielo se añadió trietilenglicolmonometiléter no polidisperso (25 g, 0,15 moles). Después se añadió trietilamina (29,5 ml, 0,22 moles), y la disolución se agitó durante 15 min. a 0ºC, seguido de la adición gota a gota de cloruro de metanosulfonilo (13,8 ml, 0,18 moles, disuelto en 20 ml de CH_{2}Cl_{2}). La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. a 0ºC, se dejó calentar hasta la temperatura ambiente, y después se agitó durante 2 h. La mezcla bruta de reacción se filtró a través de Celite (lavada con CH_{2}Cl_{2} \sim200 ml), después se lavó con H_{2}O (300 ml), 5% de NaHCO_{3} (300 ml), H_{2}O (300 ml), NaCl sat. (300 ml), se secó MgSO_{4}, y se evaporó hasta sequedad. El aceite se colocó entonces en una línea de vacío durante \sim2 h para asegurar la sequedad, y proporcionó el compuesto del título no polidisperso como un aceite amarillo (29,15 g, 80% de rendimiento).
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Ejemplo 20 Heptaetilenglicolmonometiléter (25)
A una disolución de tetraetilenglicol no polidisperso (51,5 g, 0,27 moles) en THF (1 l) se añadió t-butóxido de potasio (14,8 g, 0,13 moles, pequeñas porciones durante \sim30 min.). La mezcla de reacción se agitó entonces durante 1 h y después se añadió gota a gota 24 (29,15 g, 0,12 moles) disuelto en THF (90 ml), y la mezcla de reacción se agitó toda la noche. La mezcla de reacción bruta se filtró a través de Celite (lavada con CH_{2}Cl_{2}, \sim200 ml) y se evaporó hasta sequedad. El aceite se disolvió entonces en HCl (250 ml, 1 N) y se lavó con acetato de etilo (250 ml) para eliminar el exceso de 24. Pueden ser necesarios lavados adicionales de acetato de etilo (125 ml) para eliminar el 24 restante. La fase acuosa se lavó repetitivamente con CH_{2}Cl_{2} (volúmenes de 125 ml) hasta que la mayoría del 25 se hubo eliminado de la fase acuosa. La primera extracción contendrá 24, 25, y subproducto diacoplado, y se debería volver a extraer con HCl (125 ml, 1 N). Las capas orgánicas se combinaron y se evaporaron hasta sequedad. El aceite resultante se disolvió entonces en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y se lavó repetitivamente con H_{2}O (volúmenes de 50 ml) hasta que se eliminó 25. Las fracciones acuosas se combinaron, volumen total de 500 ml, y se añadió NaCl hasta que la disolución se puso turbia, y después se lavó con CH_{2}Cl_{2} (2 x 500 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron MgSO_{4}, y se evaporaron hasta sequedad para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite (16,9 g, 41% de rendimiento). Puede ser deseable repetir una o más etapas del procedimiento de purificación para asegurar una elevada pureza.
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Ejemplo 21 8-Bromooctoanato (26)
A una disolución de ácido 8-bromooctanoico (5,0 g, 22 mmoles) en etanol (100 ml) se añadió H_{2}SO_{4} (0,36 ml, 7,5 mmoles), y la reacción se calentó a reflujo con agitación durante 3 h. La mezcla de reacción bruta se enfrió hasta la temperatura ambiente, y se lavó con H_{2}O (100 ml), NaHCO_{3} sat. (2 x 100 ml), H_{2}O (100 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se evaporó hasta sequedad para producir un aceite transparente (5,5 g, 98% de rendimiento).
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Ejemplo 22 Síntesis de éster de mPEG7-C8 (27)
A una disolución del compuesto 25 no polidisperso (3,0 g, 8,8 mmoles) en éter (90 ml) se añadió t-butóxido de potasio (1,2 g, 9,6 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. Después se añadió la adición gota a gota del compuesto 26 no polidisperso (2,4 g, 9,6 mmoles), disuelto en éter (10 ml), y la mezcla de reacción se agitó toda la noche. La mezcla de reacción bruta se filtró a través de Celite (lavada con CH_{2}Cl_{2}, \sim200 ml), y se evaporó hasta sequedad. El aceite resultante se disolvió en acetato de etilo y se lavó con H_{2}O (2 x 200 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se evaporó hasta sequedad. Se llevó a cabo una cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo hasta acetato de etilo/metanol, 10:1), y produjo el compuesto del título no polidisperso como un aceite transparente (0,843 g, 19% de rendimiento).
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Ejemplo 23 Ácido de mPEG7-C8 (28)
Al aceite del compuesto 27 no polidisperso (0,70 g, 1,4 mmoles) se añadió NaOH 1 N (2,0 ml), y la mezcla de reacción se agitó durante 4 h. La mezcla de reacción bruta se concentró, se acidificó (pH\sim2), se saturó con NaCl, y se lavó con CH_{2}Cl_{2} (2 x 50 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con NaCl sat., se secaron sobre MgSO_{4}, y se evaporaron hasta sequedad para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite claro (0,35 g, 53% de rendimiento).
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Ejemplo 24 Activación del ácido de mPEG7-C8 (29)
Se disolvió ácido de mPEG7-C8 28 no polidisperso (0,31 g, 0,64 mmoles) en 3 ml de cloruro de metileno anhidro, y después se añadió disolución de N-hidroxisuccinimida (0,079 g, 0,69 mmoles) y EDCl\cdotHCl (135,6 mg, 0,71 mmoles) en cloruro de metileno anhidro. La reacción se agitó durante varias horas, después se lavó con HCl 1 N, con agua, se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en columna, se concentró para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite transparente, y se secó vía vacío.
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Los Ejemplos 25 a 29 se refieren al esquema ilustrado en la Figura 5.
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Ejemplo 25 10-Hidroxidecanoato (30)
A una disolución de ácido 10-hidroxidecanoico no polidisperso (5,0 g, 26,5 mmoles) en etanol (100 ml) se añadió H_{2}SO_{4} (0,43 ml, 8,8 mmoles), y la reacción se calentó a reflujo con agitación durante 3 h. La mezcla de reacción bruta se enfrió hasta la temperatura ambiente y se lavó con H_{2}O (100 ml), NaHCO_{3} sat. (2 x 100 ml), H_{2}O (100 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se evaporó hasta sequedad para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite transparente (6,9 g, 98% de rendimiento).
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Ejemplo 26 Mesilato de 10-hidroxidecanoato (31)
A una disolución de CH_{2}Cl_{2} (27 ml) se añadió 10-hidroxidecanoato 30 no polidisperso (5,6 g, 26 mmoles), y se enfrió hasta 0ºC en un baño de hielo. Después se añadió trietilamina (5 ml, 37 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante 15 min. a 0ºC. Después se añadió cloruro de metanosulfonilo (2,7 ml, 24 mmoles) disuelto en CH_{2}Cl_{2} (3 ml), y la mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 30 min., el baño de hielo se retiró, y la reacción se agitó durante 2 h adicionales a temperatura ambiente. La mezcla de reacción bruta se filtró a través de Celite (lavada con CH_{2}Cl_{2}, 80 ml), y el filtrado se lavó con H_{2}O (100 ml), NaHCO_{3} al 5% (2 x 100 ml), H_{2}O (100 ml), NaCl sat. (100 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se evaporó hasta sequedad para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite amarillento (7,42 g, 97% de rendimiento).
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Ejemplo 27 Éster de mPEG_{7}-C_{10} (32)
A una disolución de heptaetilenglicolmonometiléter 25 no polidisperso (2,5 g, 7,3 mmoles) en tetrahidrofurano (100 ml) se añadió hidruro de sodio (0,194 g, 8,1 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. Después se añadió gota a gota mesilato de 10-hidroxidecanoato 31 no polidisperso (2,4 g, 8,1 mmoles), disuelto en tetrahidrofurano (10 ml), y la mezcla de reacción se agitó toda la noche. La mezcla de reacción bruta se filtró a través de Celite (lavada con CH_{2}Cl_{2,} \sim200 ml), y se evaporó hasta sequedad. El aceite resultante se disolvió en acetato de etilo y se lavó con H_{2}O (2 x 200 ml), se secó sobre MgSO_{4}, se evaporó hasta sequedad, se cromatografió (sílice, acetato de etilo/metanol, 10:1), y se cromatografió (sílice, acetato de etilo) para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite transparente (0,570 g, 15% de rendimiento).
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Ejemplo 28 Ácido de mPEG_{7}-C_{10} (33)
Al aceite de éster de mPEG_{7}-C_{10} 32 no polidisperso (0,570 g, 1,1 mmoles) se añadió NaOH 1N (1,6 ml), y la mezcla de reacción se agitó toda la noche. La mezcla de reacción bruta se concentró, se acidificó (pH\sim2), se saturó con NaCl, y se lavó con CH_{2}Cl_{2} (2 x 50 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con NaCl sat. (2 x 50 ml), se secaron sobre MgSO_{4}, y se evaporaron hasta sequedad para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite transparente (0,340 g, 62% de rendimiento).
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Ejemplo 29 Activación del ácido de mPEG_{7}-C_{10} (34)
El ácido 33 no polidisperso se activó usando procedimientos similares a aquellos descritos anteriormente en el Ejemplo 24.
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Los Ejemplos 30 y 31 se refieren al esquema ilustrado en la Figura 6.
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Ejemplo 30 Síntesis de oligómero de C18(PEG6) (36)
Se añadió lentamente cloruro de estearoilo 35 no polidisperso (0,7 g, 2,31 mmoles) a una mezcla de PEG6 (5 g, 17,7 mmoles) y piridina (0,97 g, 12,4 mmoles) en benceno. La mezcla de reacción se agitó durante varias horas (\sim5). La reacción se siguió mediante TLC usando acetato de etilo/metanol como un disolvente desarrollador. Después, la mezcla de reacción se lavó con agua, se secó sobre MgSO_{4}, se concentró y se secó vía vacío. El compuesto purificado 36 no polidisperso se analizó mediante FABMS: m/e 549/M^{+}H.
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Ejemplo 31 Activación del oligómero de C18(PEG6)
La activación del oligómero de C18(PEG6) no polidisperso se logró en dos etapas:
1)
Se disolvió estearoil-PEG6 36 no polidisperso (0,8 g, 1,46 mmoles) en tolueno, y se añadió a una disolución de fosgeno (10 ml, 20% en tolueno) que se enfrió con un baño de hielo. La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a 0ºC, y después durante 3 h a temperatura ambiente. Después, el fosgeno y el tolueno se separaron por destilación, y el cloroformiato de estearoil PEG6 37 no polidisperso restante se secó sobre P_{2}O_{5} toda la noche.
2)
A una disolución de cloroformiato de estearoil PEG6 36 no polidisperso (0,78 g, 1,27 mmoles) y TEA (128 mg, 1,27 mmoles) en cloruro de metileno anhidro se añadió disolución de N-hidroxisuccinimida (NHS) en cloruro de metileno. La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas, después se lavó con agua, se secó sobre MgSO_{4}, se filtró, se concentró, y se secó vía vacío para proporcionar el oligómero de C18(PEG6) 38 no polidisperso activado.
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Los Ejemplos 32 a 37 se refieren al esquema ilustrado en la Figura 7.
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Ejemplo 32 Tetraetilenglicolmonobenciléter (39)
Al aceite de tetraetilenglicol no polidisperso (19,4 g, 0,10 moles) se añadió una disolución de NaOH (4,0 g en 4,0 ml), y la reacción se agitó durante 15 mm Después, se añadió cloruro de bencilo (3,54 ml, 30,8 mmoles), y la mezcla de reacción se calentó hasta 100ºC y se agitó toda la noche. La mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se diluyó con NaCl sat. (250 ml), y se lavó con CH_{2}Cl_{2} (2 x 200 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con NaCl sat., se secaron sobre MgSO_{4}, y se cromatografiaron (sílice, acetato de etilo) para producir el compuesto del título no polidisperso como un aceite amarillo (6,21 g, 71% de rendimiento).
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Ejemplo 33 Mesilato de tetraetilenglicolmonobenciléter (40)
A una disolución de CH_{2}Cl_{2} (20 ml) se añadió tetraetilenglicolmonobenciléter 39 no polidisperso (6,21 g, 22 mmoles), y se enfrió hasta 0ºC en un baño de hielo. Después se añadió trietilamina (3,2 ml, 24 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó durante 15 min. a 0ºC. Después se añadió cloruro de metanosulfonilo (1,7 ml, 24 mmoles) disuelto en CH_{2}Cl_{2} (2 ml), y la mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 30 min., el baño de hielo se eliminó, y la reacción se agitó durante 2 h adicionales a temperatura ambiente. La mezcla de reacción bruta se filtró a través de Celite (lavada con CH_{2}Cl_{2}, 80 ml), y el filtrado se lavó con H_{2}O (100 ml), NaHCO_{3} al 5% (2 x 100 ml), H_{2}O (100 ml), NaCl sat. (100 ml), y se secó sobre MgSO_{4}. El aceite amarillo resultante se cromatografió sobre una almohadilla de sílice que contiene carbón activado (10 g), para dar el compuesto del título no polidisperso como un aceite transparente (7,10 g, 89% de rendimiento).
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Ejemplo 34 Octaetilenglicolmonobenciléter (41)
A una disolución de tetrahidrofurano (140 ml) que contiene hidruro de sodio (0,43 g, 18 mmoles) se añadió gota a gota una disolución tetraetilenglicol no polidisperso (3,5 g, 18 mmoles) en tetrahidrofurano (10 ml), y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. Después se añadió gota a gota mesilato de tetraetilenglicolmonobenciléter 40 no polidisperso (6,0 g, 16,5 mmoles), disuelto en tetrahidrofurano (10 ml), y la mezcla de reacción se agitó toda la noche. La mezcla de reacción bruta se filtró a través de Celite (lavada, CH_{2}Cl_{2}, 250 ml), y el filtrado se lavó con H_{2}O, se secó sobre MgSO_{4}, y se evaporó hasta sequedad. El aceite resultante se cromatografió (sílice, acetato de etilo/metanol, 10:1) y se cromatografió (sílice, cloroformo/metanol, 25:1) para dar el compuesto del título no polidisperso como un aceite transparente (2,62 g, 34% de rendimiento).
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Ejemplo 35 Síntesis de estearato de PEG8-Bencil (43)
A una disolución enfriada y agitada de octaetilenglicolmonobenciléter 41 no polidisperso (0,998 g, 2,07 mmoles) y piridina (163,9 mg, 2,07 mmoles) se añadió cloruro de estearoilo 42 no polidisperso (627,7 mg, 2,07 mmoles) en benceno. La mezcla de reacción se agitó toda la noche (18 horas). Al día siguiente la mezcla de reacción se lavó con agua, se secó sobre MgSO_{4}, se concentró, y se secó vía vacío. Después el producto bruto se cromatografió en columna ultrarrápida sobre gel de sílice, usando 10% de metanol/90% de cloroformo. Las fracciones que contienen el producto se combinaron, se concentraron y se secaron vía vacío para dar el compuesto del título no polidisperso.
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Ejemplo 36 Hidrogenolisis de estearato-PEG8-bencilo
A una disolución metanólica de estearato-PEG8-Bzl 43 no polidisperso (0,854 g 1,138 mmoles) se añadió Pd/C(10%) (paladio, 10% en peso sobre carbón activado). La mezcla de reacción se agitó toda la noche (18 horas) en hidrógeno. Después, la disolución se filtró, se concentró, y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna usando 10% de metanol/90% de cloroformo, las fracciones con R_{t} = 0,6 se recogieron, se concentraron y se secaron para proporcionar el ácido 44 no polidisperso.
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Ejemplo 37 Activación de Oligómero de C18(PEG8)
La activación en dos etapas del oligómero de estearato-PEG8 no polidisperso se llevó a cabo como se describe para estearato-PEG6 en el Ejemplo 31 anterior, para proporcionar el oligómero de C18(PEG8) 45 no polidisperso activado.
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Ejemplo 38 Síntesis de Oligómeros Trietilenglicolmonometílicos Activados
La siguiente descripción se refiere al esquema ilustrado en la Figura 8. Una disolución de tolueno que contiene fosgeno al 20% (100 ml, aproximadamente 18,7 g, 189 mmoles de fosgeno) se enfrió hasta 0ºC en una atmósfera de N_{2}. Se disolvió mTEG no polidisperso (trietilenglicolmonometileter, 7,8 g, 47,5 mmoles) en 25 ml de acetato de etilo anhidro, y se añadió a la disolución enfriada de fosgeno. La mezcla se agitó durante una hora a 0ºC, después se dejó calentar hasta la temperatura ambiente, y se agitó durante otras dos horas y media. El fosgeno, acetato de etilo y tolueno restantes se eliminaron vía destilación a vacío para dejar el cloroformiato de mTEG 46 no polidisperso como un residuo aceitoso transparente.
El residuo 46 no polidisperso se disolvió en 50 ml de diclorometano seco, al que se añadió TEA (trietilamina, 6,62 ml, 47,5 mmoles) y NHS (N-hidroxisuccinimida, 5,8 g, 50,4 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera seca durante veinte horas, tiempo durante el cual apareció una gran cantidad de precipitado blanco. La mezcla se filtró para eliminar este precipitado, y se concentró a vacío. El aceite 47 resultante se recogió en diclorometano, y se lavó dos veces con agua desionizada fría, dos veces con HCl 1N, y una vez con salmuera. Los orgánicos se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron, y se concentraron para proporcionar el compuesto del título no polidisperso como un aceite amarillo claro, transparente. Si es necesario, el éster de NHS se puede purificar adicionalmente mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando EtOAc como eluyente.
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Ejemplo 39 Síntesis de Oligómeros de Palmitato-TEG Activados
La siguiente descripción se refiere al esquema ilustrado en la Figura 9. Se disolvió anhídrido palmítico no polidisperso (5 g; 10 mmoles) en THF seco (20 ml), y se agitó a temperatura ambiente. A la disolución agitada, se añadieron 3 moles de piridina en exceso, seguido de trietilenglicol no polidisperso (1,4 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora (el progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC; acetato de etilo-cloroformo; 3:7). Al final de la reacción, el THF se eliminó, y el producto se mezcló con ácido H_{2}SO_{4} al 10%, y se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 ml). El extracto combinado se lavó secuencialmente con agua, salmuera, se secó sobre MgSO_{4}, y se evaporó para dar el producto 48 no polidisperso. Se añadió una disolución de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (3 mmoles) en DMF (\sim10 ml) a una disolución del producto 48 no polidisperso (1 mmol) en 10 ml de DMF anhidra mientras se agitaba. Se añadió lentamente hidruro de sodio (3 mmoles) a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se agitó durante varias horas (por ejemplo, 5 horas). Se añadió éter dietílico para precipitar el oligómero activado. Este proceso se repitió 3 veces, y el producto se secó finalmente.
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Ejemplo 40 Síntesis de Oligómeros de Hexaetilenglicolmonometílicos Activados
La siguiente descripción se refiere al esquema ilustrado en la Figura 10. El hexaetilenglicolmonometiléter activado no polidisperso se preparó de manera análoga al trietilenglicol no polidisperso en el Ejemplo 39 anterior. Una disolución al 20% de fosgeno en tolueno (35 ml, 6,66 g, 67,4 mmol fosgeno) se enfrió en una atmósfera de N_{2} en un baño de agua con hielo/sal. Se disolvió hexaetilenglicol 50 no polidisperso (1,85 ml, 2,0 g, 6,74 mmoles) en 5 ml de EtOAc anhidro, y se añadió a la disolución de fosgeno vía una jeringuilla. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación en el baño de hielo durante una hora, se retiró y se agitó otras 2,5 horas a temperatura ambiente. El fosgeno, EtOAc, y tolueno se eliminaron mediante destilación a vacío, dejando el compuesto 51 no polidisperso como un residuo aceitoso, transparente.
El residuo 51 no polidisperso se disolvió en 20 ml de diclorometano seco y se colocó en una atmósfera seca, inerte. Se añadió trietilamina (0,94 ml, 0,68 g, 6,7 mmoles) y después NHS (N-hidroxisuccinimida, 0,82 g, 7,1 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se filtró a través de gel de sílice para eliminar el precipitado blanco, y se concentró a vacío. El residuo se recogió en diclorometano, y se lavó dos veces con agua fría, dos veces con HCl 1 N, y una vez con salmuera. Los orgánicos se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron. La purificación final se hizo vía cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, EtOAc) para obtener el éster de NHS 52 no polidisperso activado por UV.
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Ejemplo 41
Se disolvieron 150 mg de calcitonina de salmón (MW 3432, 0,043 mmoles) en 30 ml de DMF anhidra. Después se añadió TEA (35 \mul) y el oligómero activado del Ejemplo 24 (42 mg, 0,067 mmoles) en THF anhidro (2 ml). La reacción se agitó durante 1 hora, y después se paralizó con 2 ml de TFA al 0,1% en agua. La reacción se siguió mediante HPLC. Después, la mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante HPLC prep. (RC Vidac C18 Protein and peptide, columna 1 x 25, agua/acetonitrilo con TFA al 0,1%, detección a 280 nm). Se aislaron dos picos que corresponden al mono- y di-conjugado. Las muestras se analizaron mediante MALDI-MS. MS para PEG7-octil-sCT, mono-conjugado: 3897. MS para PEG7-octil-sCT, di-conjugado: 4361.
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Ejemplo 42
El procedimiento del Ejemplo 41 se usó para conjugar calcitonina de salmón con el oligómero activado del Ejemplo 29. MS para PEG7-decil-sCT, mono-conjugado: 3926. MS para PEG7-decil-sCT, di-conjugado: 4420.
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Ejemplo 43
El procedimiento del Ejemplo 41 se usó para conjugar calcitonina de salmón con el oligómero activado del Ejemplo 31. MS para estearato-PEG6-sCT, mono-conjugado: 4006. MS para estearato-PEG6-sCT, di-conjugado: 4582.
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Ejemplo 44
El procedimiento del Ejemplo 41 se usó para conjugar calcitonina de salmón con el oligómero activado del Ejemplo 37. MS para estearato-PEG8-sCT, mono-conjugado: 4095.
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Ejemplo 45
El procedimiento del Ejemplo 41 se usó para conjugar calcitonina de salmón con el oligómero activado del Ejemplo 18.
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Ejemplo 46
El procedimiento del Ejemplo 41 se usó para conjugar calcitonina de salmón con el oligómero activado del Ejemplo 38.
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Ejemplo 47
El procedimiento del Ejemplo 41 se usó para conjugar calcitonina de salmón con el oligómero activado del Ejemplo 39.
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Ejemplo 48
El procedimiento del Ejemplo 41 se usó para conjugar calcitonina de salmón con el oligómero activado del Ejemplo 40.
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Ejemplo 49 Determinación del Coeficiente de Dispersidad para una Mezcla de Conjugados de Calcitonina de Salmón con Oligómero
El coeficiente de dispersidad de una mezcla de conjugados de calcitonina de salmón con oligómero se determina según lo siguiente. Se proporciona una mezcla de conjugados de calcitonina de salmón con oligómero, por ejemplo como se describe anteriormente en el Ejemplo 41. Una primera muestra de la mezcla se purifica vía HPLC para separar y aislar los diversos conjugados de calcitonina de salmón con oligómero en la muestra. Suponiendo que cada fracción aislada contiene una mezcla puramente monodispersa de conjugados, "n" es igual al número de fracciones recogidas. La mezcla puede incluir uno o más de los siguientes conjugados, que se describen señalando la posición de la conjugación seguido del grado de conjugación: monoconjugado en Lys^{11}; monoconjugado en Lys^{18}; monoconjugado en el término N; diconjugado en Lys^{11,18}; diconjugado en Lys^{11}, término N; diconjugado en Lys^{18}, término N; y/o triconjugado en Lys^{11,18}, término N. Cada fracción aislada de la mezcla se analiza vía espectroscopía de masas para determinar la masa de la fracción, lo que permite categorizar a cada fracción aislada como un mono-, di- o triconjugado, y proporciona un valor para la variable "M_{i}" para cada conjugado en la muestra.
Una segunda muestra de la mezcla se analiza vía HPLC, para proporcionar una traza de HPLC. Suponiendo que la absortividad molar no cambia como resultado de la conjugación, el porcentaje en peso de un conjugado particular en la mezcla se proporciona mediante el área bajo el pico de la traza de HPLC correspondiente al conjugado particular como un porcentaje del área total bajo todos los picos de la traza de HPLC. La muestra se recoge y se liofiliza hasta sequedad para determinar el peso en gramos anhidro de la muestra. El peso en gramos de la muestra se multiplica por el porcentaje en peso de cada componente en la muestra, para determinar el peso en gramos de cada conjugado en la muestra. La variable "N_{i}" se determina para un conjugado particular (el conjugado iº) dividiendo el peso en gramos del conjugado particular en la muestra entre la masa del conjugado particular y multiplicando el cociente por el número de Avogadro (6,02205 x 20^{23} moles^{-1}), M_{i}, determinado anteriormente, para dar el número de moléculas del conjugado particular, N_{i}, en la muestra. El coeficiente de dispersidad se calcula entonces usando n, M_{i} como se determina para cada conjugado, y N_{i} como se determina para cada conjugado.
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Ejemplo 50 Estudios con Cytosensor®
Se suspendieron células T-47D (estirpe celular de carcinoma ductal mamario, obtenida de la American Type Culture Collection) a una densidad de 1 x 10^{7} células/ml en tampón de desplazamiento (medio RPMI 1640 libre de bicarbonato, libre de suero, poco tamponado, de Molecular Devices de Sunnyvale, California). Entonces se inmovilizaron aproximadamente 100.000 células en un medio de atrapamiento celular de agarosa en una gotita de 10 \mul, y se colocó entre dos membranas de policarbonato de 3 \mum en una copa de cápsula de citosensor. Las copas de cápsula de citosensor, colocadas en cámaras sensoras en el microfisiómetro Cytosensor®, se mantuvieron entonces de forma muy próxima a detectores sensibles al pH. Entonces se bombeó tampón de desplazamiento a través de las células a un caudal de 100 \mul/min., excepto durante intervalos de 30 segundos cuando se detuvo el flujo, y se midió la acidificación del tampón de desplazamiento en la cámara sensora. Las velocidades de acidificación se determinaron cada 2 minutos. La temperatura de las cámaras sensoras fue 37ºC. Se dejó que las células se equilibrasen en las cámaras sensoras durante 2-3 horas antes del comienzo del experimento, tiempo durante el cual se monitorizaron las velocidades de acidificación basales. Las células se expusieron entonces a compuestos de ensayo (calcitonina de salmón u octil-di-calcitonina) diluidos en tampón de desplazamiento, a diversas concentraciones de nM. La exposición de las células a los compuestos de ensayo se produjo durante los primeros 40 segundos de cada ciclo de bombeo de 2 minutos, en un patrón repetitivo durante un total de 20 minutos. Esto permitió una exposición suficiente de las células a los compuestos de ensayo para provocar una respuesta en el metabolismo celular mediada por receptores, seguido de aproximadamente 50 segundos de flujo del tampón de desplazamiento que no contiene ningún compuesto. Este procedimiento eliminó por lavado disoluciones de ensayo (que tuvieron un pH ligeramente menor que el tampón de desplazamiento solo) de la cámara sensora antes de medir la velocidad de acidificación. De este modo, las velocidades de acidificación fueron solamente una medida de la actividad celular. Se usó un procedimiento similar para obtener datos para PEG7-octil-sCT, monoconjugado (Octil-Mono); PEG7-decil-sCT, monoconjugado (Decil-Mono); PEG7-decil-sCT, diconjugado (Decil-Di); estearato-PEG6-sCT, monoconjugado (PEG6 Est. Mono); y estearato-PEG8-sCT, monoconjugado (PEG8 Est. Mono). Los datos se analizaron para determinar la actividad relativa de los compuestos calculando el Área Bajo la Curva (AUC) para cada gráfica de la velocidad de acidificación de la cámara citosensora, y se representaron gráficamente como un diagrama de barras ilustrado en la Figura 14, que muestra las medidas de AUC media tomadas de múltiples experimentos llevados a cabo en las mismas condiciones experimentales.
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Ejemplo 51 Estabilidad Enzimática
Los compuestos, suministrados como polvos liofilizados, se resuspendieron en tampón de fosfato 10 mM pH 7,4, y después se sometieron a determinación de la concentración mediante HPLC. El tampón de fosfato se usó para crear una disolución con un pH que es óptimo para la actividad de cada enzima intestinal particular. Las alícuotas del compuesto así preparadas se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,7 ml, y se agitaron en un baño de agua a 37ºC durante 15 minutos para permitir que los compuestos se equilibrasen a la temperatura. Después de 15 minutos, se añadieron a cada tubo 2 \mul de la enzima intestinal concentrada apropiada, para lograr la concentración final deseada. Se resuspendieron quimiotripsina y tripsina en HCl 1 mM. También, como control, los compuestos se trataron con 2 \mul de HCl 1 mM. Inmediatamente después de las adiciones, se retiraron del tubo de control 100 \mul de muestra, y se extinguieron con 25 \mul de disolución extintora de quimiotripsina/tripsina (1% de TFA:isopropanol 1:1). Esta muestra servirá como T = 0 min. Se repitió un procedimiento de toma de muestras a diversos intervalos de tiempo, dependiendo de la enzima intestinal usada. La quimiotripsina tuvo muestras de 15, 30 y 60 minutos. La tripsina tuvo muestras de 30, 60, 120 y 180 minutos. Una vez se adquirieron todos los puntos, se retiró una muestra final del tubo de control para estar seguros de que la degradación observada no está relacionada con la temperatura ni con el tampón. Las muestras de quimiotripsina y de tripsina se pueden recoger directamente en viales de HPLC. Se usó RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo) para determinar la AUC para cada muestra, y se calculó el % de degradación basándose en el control a T = 0 min. En las Tablas 1 a 4 a continuación se proporcionan los resultados.
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TABLA 1
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TABLA 2
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TABLA 3
14
TABLA 4
15 
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Ejemplo 52 Actividad y Variabilidad Intersujetos
Ratones CF-1 machos (Charles River, Raleigh, NC), que pesan 20-25 g, se enjaularon en el terrario Nobex en una habitación de luz (ciclo de luz:oscuridad de 12:12; las luces se encienden a las 0600 h), de temperatura (21-23ºC), y de humedad (40-60% de humedad relativa) controlada. A los animales se les permitió el libre acceso a comida de laboratorio (PMI Nutrition) y agua del grifo. Los animales se dejaron aclimatar a las condiciones del alojamiento durante 48-72 horas antes del día del experimento.
Antes de la dosificación, los ratones ayunaron toda la noche y se proporcionó agua a voluntad. Los ratones se distribuyeron al azar en grupos de cinco animales por punto de tiempo, y se les administró una única dosis oral de un PEG7-octil-sCT, diconjugado (Octil Di) según la presente invención, o calcitonina de salmón (sCT o Calcitonina) con fines comparativos. Las dosis orales se administraron usando una aguja nasogástrica (Popper #18, 5 cm desde el cuerpo del barril hasta el bisel) a 10 ml/kg en la siguiente formulación de PEG7-octil-sCT, diconjugado, tamponada con fosfato 0,2 \mug/ml:
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La formulación tamponada se preparó añadiendo 80 ml de tampón de fosfato en un vaso de precipitados de vidrio tarado limpio. Se añadió lentamente colato sódico al tampón de fosfato con agitación hasta que se disolvió. Entonces se añadió el desoxicolato, y la agitación se continuó hasta que se disolvió. Se añadió la disolución de PEG7-octil-sCT, diconjugado, equivalente a 20 \mug. Finalmente, se añadió el resto del tampón de fosfato para lograr un peso final de 100 g. En todos los experimentos se usaron ratones tratados con control de vehículo. Se construyeron curvas de respuesta frente a la dosis usando un único punto de tiempo 60 minutos después de la administración del fármaco. En las Figuras 15-18 se ilustran estas curvas.
En puntos de tiempo apropiados, los ratones se anestesiaron con éter, se exteriorizaron las venas cavas, y se obtuvieron muestras de sangre vía una jeringuilla con una aguja de calibre 25. Se dejó que las alícuotas de sangre coagulasen a 22ºC durante 1 hora, y los sueros se eliminaron y se pipetearon en un receptáculo limpio. Se determinó el calcio sérico total para cada animal usando un analizador calibrado Vitros DT60 II.
Los datos de calcio sérico se representaron gráficamente, y los parámetros farmacocinéticos se determinaron vía técnicas de ajuste de curvas usando el software SigmaPlot (Versión 4.1). Se calcularon la media y las desviaciones estándar (o errores estándar), y se representaron para determinar diferencias de efecto entre grupos de dosificación. En la Tabla 5 a continuación se proporcionan datos medios de calcio sérico para diversos conjugados.
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TABLA 5
18 
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A pesar de una actividad in vitro como se determina en el Ejemplo 50 anterior que puede no ser comparable a la actividad in vitro de los mono- y diconjugados de PEG7-octil-sCT y PEG7-decil-sCT, el diconjugado de estearato-PEG6-sCT, y el diconjugado de estearato-PEG8-sCT, parece que tienen actividad in vivo (según se muestra por las caídas en el % de calcio de valor de referencia a partir de la Tabla 5 anterior) que es comparable a la actividad in vivo observada para los mono- y diconjugados de PEG7-octil-sCT y PEG7-decil-sCT. Aunque no se desea estar atados por ninguna teoría particular, la actividad in vivo mejorada de los conjugados que contienen estearato puede indicar que estos conjugados están sufriendo hidrólisis in vivo para proporcionar una calcitonina de salmón activa o un conjugado de calcitonina de salmón con PEG activo.
En esta memoria descriptiva, se han descrito realizaciones preferidas típicas de la invención y, aunque se emplean términos específicos, se usan sólo en sentido genérico y descriptivo, exponiéndose el alcance de la invención en las siguientes reivindicaciones.

Claims (14)

1. Una mezcla monodispersa de conjugados en la que alrededor de 100 por cien de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular, una mezcla sustancial y puramente monodispersa de conjugados en la que al menos alrededor de 95 por ciento de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular, o una mezcla puramente monodispersa de conjugados en la que alrededor de 100 por cien de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular;
en la que los conjugados comprenden calcitonina de salmón acoplada a un primer oligómero y a un segundo oligómero;
en la que cada oligómero comprende un resto de polietilenglicol que tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 subunidades de polietilenglicol y uno o más restos lipófilos;
en la que el uno o más restos lipófilos se seleccionan de un resto alquilo lineal, saturado o insaturado que tiene 1 a 28 átomos de carbono, y un resto de ácido graso lineal, saturado o insaturado que tiene 2 a 18 átomos de carbono;
en la que el primer oligómero está acoplado covalentemente a una función amina de Lys^{11} de la calcitonina de salmón, y el segundo oligómero está acoplado covalentemente a una función amina de Lys^{18} de la calcitonina de salmón.
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2. La mezcla según la reivindicación 1, en la que la adición del resto de polietilenglicol proporciona características seleccionadas de las siguientes: (a) la capacidad para reducir los niveles de calcio sérico en al menos 5 por ciento, (b) una resistencia aumentada a la degradación por quimiotripsina o tripsina cuando se compara con la resistencia a la degradación por quimiotripsina o tripsina de la calcitonina que no está acoplada al oligómero, (c) una bioeficacia que es mayor que la bioeficacia de la calcitonina que no está acoplada al oligómero, y sus combinaciones.
3. La mezcla según la reivindicación 1, en la que la calcitonina está acoplada covalentemente al oligómero mediante un enlace hidrolizable, un enlace no hidrolizable, o ambos.
4. La mezcla según la reivindicación 1, en la que cada oligómero tiene la misma estructura molecular.
5. Una composición farmacéutica que comprende:
la mezcla según la reivindicación 1; y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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6. Una mezcla sustancialmente monodispersa de conjugados según la reivindicación 1, que comprende calcitonina de salmón acoplada covalentemente en Lys^{11} de la calcitonina de salmón a un resto de ácido carboxílico de un ácido carboxílico, que está acoplado covalentemente, en el extremo distal al resto de ácido carboxílico, a un resto de polietilenglicol terminado en metilo que tiene al menos 7 subunidades de polietilenglicol, y acoplada covalentemente en Lys^{18} de la calcitonina de salmón a un resto de ácido carboxílico de un ácido carboxílico, que está acoplado covalentemente, en el extremo distal al resto de ácido carboxílico, a un resto de polietilenglicol terminado en metilo que tiene al menos 7 subunidades de polietilenglicol.
7. La mezcla según la reivindicación 6, en la que los conjugados consisten cada uno en calcitonina de salmón acoplada covalentemente en Lys^{11} de la calcitonina de salmón a un resto de ácido carboxílico de ácido octanoico, que está acoplado covalentemente, en el extremo distal al resto de ácido carboxílico, a un resto de polietilenglicol terminado en metilo que tiene 7 subunidades de polietilenglicol, y acoplada covalentemente en Lys^{18} de la calcitonina de salmón a un resto de ácido carboxílico de ácido octanoico, que está acoplado covalentemente, en el extremo distal al resto de ácido carboxílico, a un resto de polietilenglicol terminado en metilo que tiene al menos 7 subunidades de polietilenglicol.
8. Uso de una mezcla de conjugados de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno óseo caracterizado por una excesiva resorción ósea osteoclástica o efectos séricos hipercalcémicos.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el trastorno óseo es osteoporosis, enfermedad de Paget, o hipercalcemia.
10. Una mezcla de conjugados según la reivindicación 1, en la que cada conjugado comprende una calcitonina acoplada a un oligómero que comprende un resto de polietilenglicol que tiene al menos 4 subunidades de polietilenglicol, teniendo dicha mezcla una distribución de pesos moleculares con una desviación estándar menor que alrededor de 22 Daltons.
11. Una mezcla de conjugados según la reivindicación 1, en la que cada conjugado comprende una calcitonina acoplada a un oligómero que comprende un resto de polietilenglicol,
en la que la mezcla tiene un coeficiente de dispersidad (DC) mayor que 10.000 en el que
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en la que
n es el número de diferentes moléculas en la muestra;
N_{i} es el número de iª moléculas en la muestra; y
M_{i} es la masa de la iª molécula.
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12. La mezcla de conjugados según la reivindicación 11, en la que el coeficiente de dispersidad es mayor que 100.000.
13. Una mezcla de conjugados según la reivindicación 1, en la que cada conjugado tiene el mismo peso molecular y tiene la estructura de la fórmula:
(A)Fármaco de calcitonina - [B-L_{j}-G_{k}-R-G'_{m}-R'-G''_{n}-T]_{p}
en la que:
\quad
B es un resto enlazante, en la que el resto enlazante se selecciona del grupo que consiste en enlaces covalentes, restos de éster, restos de carbonato, restos de amida y restos de amina secundaria;
\quad
L es un resto ligador, en la que el resto ligador se selecciona del grupo que consiste en restos alquilo y de ácido graso;
\quad
G, G' y G'' son grupos espaciadores seleccionados individualmente, en la que los grupos espaciadores se seleccionan del grupo que consiste en restos de azúcar, colesterol y glicerina;
\quad
R es un resto lipófilo y R' es un resto de polialquilenglicol, o R' es el resto lipófilo y R es el resto de polialquilenglicol;
\quad
T es un resto terminador, en la que el resto terminador es un resto alquilo o alcoxi;
\quad
j, k, m y n son individualmente 0 ó 1; y
\quad
p es un número entero de 1 al número de restos nucleofílicos en el fármaco de calcitonina.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Un procedimiento para sintetizar una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de conjugados según la reivindicación 1, en la que cada conjugado comprende calcitonina de salmón acoplada a un primer oligómero y a un segundo oligómero, comprendiendo cada oligómero un resto de polietilenglicol que tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 subunidades de polietilenglicol y uno o más restos lipófilos seleccionados de un resto de alquilo lineal, saturado o insaturado, que tiene 1 a 28 átomos de carbono, y un resto de ácido graso lineal, saturado o insaturado, que tiene 2 a 18 átomos de carbono; comprendiendo dicho procedimiento:
\quad
hacer reaccionar una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa que comprende compuestos que tienen la estructura de Fórmula I:
(I)R^{1}(OC_{2}H_{4})_{m}-O^{-}X^{+}
\quad
en la que R^{1} es H o un resto lipófilo; m es de 1 a 25; y X^{+} es un ión positivo,
\newpage
\quad
con una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa que comprende compuestos que tienen la estructura de Fórmula II:
(II)R^{2}(OC_{2}H_{4})_{n}-OMs
\quad
en la que R^{2} es H o un resto lipófilo; y n es de 1 a 25, en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa que comprende polímeros que tienen la estructura de Fórmula III:
(III);R^{2}(OC_{2}H_{4})_{m+n}-OR^{1}
\quad
activar la mezcla que comprende polímeros de Fórmula III para proporcionar una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de polímeros activados capaces de reaccionar con una calcitonina, en el que la activación de la mezcla comprende hacer reaccionar la mezcla de polímeros de Fórmula III con N-hidroxisuccinimida; y
\quad
hacer reaccionar la mezcla de polímeros activados con Lys^{11} y Lys^{18} de la calcitonina de salmón en condiciones suficientes para proporcionar una mezcla monodispersa o una mezcla sustancial y puramente monodispersa o una mezcla puramente monodispersa de diconjugados, comprendiendo cada uno una calcitonina de salmón acoplada a dos oligómeros que comprenden cada uno un resto de polietilenglicol con m+n subunidades.
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