ES2354696T3

ES2354696T3 - Planta que produce ácido hialurónico.

Info

Publication number: ES2354696T3
Application number: ES04771309T
Authority: ES
Inventors: Shigeo Shibatani; Shuhei Misawa; Izumi Ihara; Hiroaki Kitazawa
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2011-03-17
Anticipated expiration: 2024-07-30
Also published as: EP1652928B1; ES2354696T8; WO2005012529A1; JPWO2005012529A1; JP4816082B2; EP1652928A4; BRPI0412582A; CN1833026A; CA2533925A1; US20060168690A1; DE602004030345D1; US7547819B2; EP1652928A1; CA2533925C

Abstract

Procedimiento para la producción de ácido hialurónico, en el que (1) una célula de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presentan una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico, (2) se cultiva un transformado obtenido por dicha transformación, y (3) se separa el ácido hialurónico producido por dicho transformado.

Description

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere principalmente a un procedimiento de producción de ácido hialurónico (o hialuronano o hialuronato; AH) por las células transformadas de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen o espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados con capacidad de producir ácido hialurónico, y a los 5 procedimientos de dichas células transformadas de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen o de dichos espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Una planta es un sistema ideal para la producción de hidratos de carbono con baja carga de energía, en la que los carbohidratos son producidos por fotosíntesis a partir de agua y dióxido de carbono. A excepción 10 de una parte de los organismos, los demás organismos no pueden sintetizar hidratos de carbono por sí mismos ni utilizar los azúcares procedentes de las plantas. Mientras tanto, cada animal y cada microorganismo intrínsecamente tiene capacidad de sintetizar hidratos de carbono modificando los azúcares y extendiendo las cadenas de azúcar utilizando como fuentes los azúcares procedentes de las plantas, y existen derivados de azúcares e hidratos de carbono procedentes de animales y microorganismos, que no pueden producir las 15 plantas. Los hidratos de carbono que no se pueden producir en las plantas y son producidos por animales y microorganismos incluye el ácido hialurónico.

El ácido hialurónico es un glucosaminoglucano (mucopolisacárido) aislado del cuerpo del humor vítreo del globo ocular de la especie bovina por Meyer y Palmer en 1934 (Meyer, K. y Palmer, J.W. (1934) J. Biol. Chem., 107, 629-634). Ellos han demostrado que esta sustancia es un polisacárido lineal de unidades 20 repetidas de disacárido ácido β-1,3-N-acetilglucosamina β-1,4 glucurónico, (Weissman, B. y Meyer, K. (1954) J. Am. Chem. Soc., 76, 1753-57).

Posteriormente, en las décadas de 1950 y 1960, el estudio sobre la biosíntesis del ácido hialurónico se realizó mediante un sistema exento de células del grupo A de Streptococcus. La actividad enzimática de los estreptococos localizada en la fracción de la membrana se demostró utilizando nucleótidos con dos azúcares 25 de ácido uridina-5'-difosfoglucurónico (a veces denominado ácido UDP-glucurónico o UDP-GlcA) y uridina-5'-difosfo-N-acetilglucosamina (a veces denominada UDP-N-acetilglucosamina o UDP-GlcNAc) en la producción de una cadena de ácido hialurónico (Markovitz, M., Cifonelli, J.A. y Dorfman, A. (1959) J. Biol. Chem., 234, 2343-2350). Ha sido difícil desde hace mucho tiempo solubilizar y purificar en gran medida la ácido hialurónico sintasa en forma activa estable, pero un gen (hasA) que codifica la ácido hialurónico sintasa estreptocócica se 30 clonó en 1993 (DeAngelis, P. L., Papaconstantinou, J. y Weigel, P.H. (1993) J. Biol. Chem., 268, 14568-14571). Desde entonces, se publicaron clonaciones de los genes que codifican la ácido hialurónico sintasa en células de mamífero (Itano, N. y Kimata, K. (1996) J. Biol. Chem., 271, 9875-9878.; Itano, N. y Kimata, K., (1996) Biochem. Biophys. Res;. Commun., 222, 816-820 Spicer, A. P., Augustine, M. L. y McDonald, J. A. (1996) J. Biol. Chem., 271, 23400-23406; Spicer, A. P., Olson, J. S. y McDonald J. A. (1997) J. Biol. Chem., 272, 8957-35 8961.; Shyjan A. M., Heldin, P., Butcher C. E., Yoshino T. y Briskin, M. J. (1996) J. Biol. Chem., 271, 23395-23399; Watanabe, K. y Yamaguchi, Y. (1996) J. Biol. Chem., 1., 271, 22945-22948), además se han descubierto los genes que codifican la ácido hialurónico sintasa en el virus PBCV chlorella (DeAngelis, P. L., Jing W., Graves, M. V., Burbank, D. E. y vam Etten, J. L. (1998) Science, 278, 1800-1804) y Passteurella multocida (DeAngelis, P. L., Jing W., Drake, R. R. y Achyuthan, A.M. (1998) J. Biol. Chem., 273, 8454-8458), y 40 se han obtenido las enzimas recombinantes de la forma activa.

Junto con el avance de estos estudios, se han dilucidado ampliamente las funciones fisiológicas del ácido hialurónico, y se han demostrado las propiedades físico-químicas exclusivas y las funciones biológicas del mismo. El ácido hialurónico de alto peso molecular se ha utilizado para el tratamiento de la artrosis deformante, una ayuda de la cirugía para la oftalmología, para la prevención de la adherencia y la aceleración 45 de la cicatrización de heridas. También se ha publicado que el ácido hialurónico de bajo peso molecular tiene efectos fisiológicamente activos, y ha sido previsto su aplicación a los biomateriales y las nuevas utilizaciones médicas.

Hasta ahora, el ácido hialurónico se ha producido por extracción de tejidos de mamíferos o fermentación microbiana. Sin embargo, el riesgo de contaminación, por ejemplo, con las encefalopatías 50 espongiformes transmisibles (priones) o la transmisión de virus a los seres humanos ha preocupado en la extracción de los tejidos de mamíferos. Para las células de mamíferos, su mantenimiento es difícil y requiere medios costosos, y, además, una tasa de crecimiento del mismo es lenta. Mientras tanto para la fermentación microbiana, los medios que contienen los azúcares y el costo de la inversión en equipo son problemáticos. En Escherichia coli , no se produce el tratamiento de una proteína, es probable que se formen cuerpos de 55 inclusión y una proteasa degrade un producto, que son problemáticos (Petrides, D. et al. (1995) Biotech.

Bioeng., 48, 529). Cuando la sustancia terapéutica se produce en el microorganismo, el costo de purificación se vuelve sumamente caro para impedir la contaminación con endotoxinas.

A partir de estos resultados, si se producen azúcares originales en las plantas mediante la fotosíntesis y el ácido hialurónico se puede producir en las plantas utilizando dichos azúcares, parece ser industrialmente ventajoso en términos de seguridad y coste. 5

Sin embargo, aunque hay ejemplos en los que las proteínas procedentes de las células de mamíferos o microorganismos se expresan en las plantas (Giddings, G. et al. (2000) Nat. Biotecnol., 18, 1151-1155; Daniell, H. et al. (2001) Trends Plant Sci., 6, 219-226), la configuración y estructura de la cadena de azúcar necesaria para mantener la función de la proteína son diferentes de las del organismo original, y por lo tanto, la proteína producida con frecuencia no ha tenido la función original. Por ejemplo, la eritropoyetina se expresó en 10 las células BY-2 del tabaco, pero no había actividad fisiológica in vivo (Matsumoto, S. et al. (1995) Plant Mol. Biol., 27, 1163-1172).

En la tecnología convencional, proteínas procedentes de las células de mamíferos o de microorganismos se han expresado en las plantas, y las propias proteínas se han extraído y utilizado principalmente. Se ha publicado poco que las proteínas procedentes de las células de mamíferos o 15 microorganismos se han expresado en las plantas y que se produce una sustancia en la planta aprovechando la proteína expresada en la planta.

Como producción de sustancias en las plantas, se ha publicdo de que β-1,4-galactosiltransferasa humana se expresó en las células BY-2 del tabaco y, por consiguiente la galactosa estaba recién unida por el enlace β-1,4 a la cadena del azúcar de la glucoproteína convencionalmente presente (Palacpac, N. Q. et al. 20 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci.. EE.UU., 96, 4692 a 4697). Sin embargo, esta reacción es la reacción en la que se transfiere un azúcar desde un nucleótido de azúcar utilizando la glucosiltransferasa, y es muy diferente de la reacción en la que una macromolécula, tal como el ácido hialurónico se genera transfiriendo dos tipos de azúcar de los tipos de nucleótidos de azúcar varias miles de veces.

La ácido hialurónico sintasa tiene generalmente muchos dominios transmembranarios o asociados a la 25 membrana. Cuando el gen extraño se expresa en el hospedador, en la proteína unida a la membrana tal como la ácido hialurónico sintasa, los dominios trans o asociados a la membrana a menudo no pueden mantener la estructura correcta. Por ejemplo, se ha sugerido que en la ácido hialurónico sintasa activa, una proteína ácido hialurónico sintasa y alrededor de 14 a 18 moléculas de cardiolipina que es uno de los fosfolípidos corrientes presentes en la membrana forman un complejo que afecta a la actividad de la ácido hialurónico sintasa 30 (Tlapak-Simmons, V. L. (1999) J. Biol. Chem., 274, 4239-4245). De esta manera, se prevé que es considerablemente difícil expresar en la planta la ácido hialurónico sintasa que la planta no tiene de forma natural.

Aunque se prevé que la tecnología mediante la cual se produce el ácido hialurónico en la planta será de gran utilidad, el ácido hialurónico es el carbohidrato extraño que las plantas son incapaces de producir, y se 35 ha considerado a partir de la tecnología convencional que es considerablemente difícil producir en las plantas la sustancia que las plantas no producen en la naturaleza y producir la sustancia macromolecular como el ácido hialurónico.

La presente invención se propone principalmente expresar la ácido hialurónico sintasa en espermatofitas, pteridofitas, briofitas o líquenes y producir el ácido hialurónico que no se produce de forma 40 natural en las plantas mencionadas anteriormente utilizando células vegetales o las plantas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es una curva por HPLC de una mezcla de oligosacáridos de hialuronano producidos después de la digestión con hialuronidasa.

La figura 2 es el análisis de RT-RCP para vcAHS en hojas de tabaco transformadas con electroforesis 45 en gel de agarosa del ADN.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Como resultado de un amplio estudio para resolver los problemas anteriores, se ha descubierto que una enzima activa para la síntesis de ácido hialurónico se expresa en células vegetales o en plantas mediante la transformación de las células vegetales o de las plantas con un ADN que codifica una ácido hialurónico 50 sintasa o un ADN que codifica un polipéptido que tiene actividad de sintetizar el ácido hialurónico, además el ácido hialurónico se produce en las plantas, estudiando más ampliamente, y ha completado la presente invención.

Es decir, la presente invención se refiere a los apartados siguientes.

[1] Procedimiento de producción de ácido hialurónico en el que (1) una célula de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene actividad de síntesis del ácido hialurónico, (2) un 5 transformado obtenido mediante dicha transformación se cultiva, y (3) se separa el ácido hialurónico producido por dicho transformado.

[2] Procedimiento de producción de ácido hialurónico que comprende (1) una espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una o más 10 supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y con actividad de sintetizar el ácido hialurónico, (2) se cultiva un transformado obtenido mediante dicha transformación, y (3) se separa el ácido hialurónico, producido por dicho transformado.

[3] Procedimiento de preparación de una célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o 15 de liquen con capacidad de producción de ácido hialurónico, en el que una célula de espermatofita, pteridofita, briofita o de liquen se transforma en (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa transformada o (ii) un ADN que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y con actividad de sintetizar el ácido hialurónico. 20

[4] Procedimiento de preparación de una espermatofita, pteridofita, briofita o de liquen transformado con una capacidad de producción de ácido hialurónico, en el que una espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido 25 hialurónico sintasa y con actividad de síntesis del ácido hialurónico.

[5] Procedimiento según cualquiera de los apartados [1] a [4] en el que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o de un microorganismo.

[6] Procedimiento según cualquiera de los apartados [1] a [4] en el que la ácido hialurónico sintasa es de virus de chlorella. 30

[7] Célula transformada de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen que tiene una capacidad de producir ácido hialurónico, obtenida mediante la transformación de una célula de espermatofita, pteridofita, briofita o de liquen con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido 35 hialurónico sintasa y que tiene actividad de síntesis del ácido hialurónico.

[8] Espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen transformado que tiene una capacidad de producción de ácido hialurónico o de un descendiente del mismo o un órgano del mismo o un tejido del mismo, obtenido mediante la transformación de una espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen con (i) un ADN que codifica de la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido 40 que tiene una secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y con una actividad de sintetizar ácido hialurónico, en el que dicha descendencia, órgano o tejido comprende el ADN mencionado en (i) o (ii).

[9] Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformado o la descendiente del mismo o el órgano 45 del mismo o el tejido del mismo, según el apartado [8] en el que el órgano es uno o dos o más órganos seleccionados de entre una raíz, un tronco, un rizoma, una hoja, una flor,una semilla y una punta de un brote.

[10] Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformado o la descendencia de la misma o el órgano de la misma o el tejido de la misma según el apartado [8] en el que el tejido es uno o dos o 50 más tejidos seleccionados del grupo constituido por una epidermis, floema, un parénquima, xilema y un haz vascular.

[11] Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen que produce ácido hialurónico sintasa, obtenida mediante la transformación de una célula vegetal con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de 55 aminoácidos tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en

una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene actividad de síntesis del ácido hialurónico.

[12] Espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen transformado que produce ácido hialurónico sintasa o de una descendencia del mismo o un órgano del mismo o un tejido del mismo, obtenido mediante la transformación de una espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen con (i) un ADN que 5 codifica de la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y con una actividad de sintetizar ácido hialurónico, en el que dicha descendencia, órgano o tejido comprende el ADN mencionado en (i) o (ii). 10

[13] Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen según el apartado [7] o [11] en el que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o de un microorganismo.

[14] Espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen transformado que produce ácido hialurónico sintasa o de una descendencia del mismo o un órgano del mismo o un tejido del mismo según cualquiera de los apartados [8] a [10] en el que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o de 15 un microorganismo.

[15] Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen según el apartado [7] o [11] en el que la ácido hialurónico sintasa es del virus de chorella.

[16] Espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen transformado o la descendencia del mismo o el órgano del mismo o el tejido del mismo según cualquiera de los apartados [8] a [10] en el que la ácido 20 hialurónico sintasa es del virus de chorella.

La presente invención se describe con detalle a continuación.

En la presente invención, una célula de planta de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen o una espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen se transforma utilizando un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una o más 25 supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene actividad de síntesis de ácido hialurónico.

La fuente de la ácido hialurónico sintasa no está particularmente limitada, siempre y cuando la sintasa sintetice el ácido hialurónico que tiene una estructura de polímero compuesta por una estructura repetida de ácido glucurónico y glucosamina utilizando ácido UDP-glucurónico y UDP-N-acetilglucosamina como sustratos. 30 Por ejemplo, es posible utilizar el ácido hialurónico sintasas procedentes de seres humanos, ratón, conejo, pollo, ganado vacuno o Xenopus laevis, el ácido hialurónico sintasas procedentes de bacterias pertenecientes a los géneros Streptococcus o Passteurella , la ácido hialurónico sintasa procedente del virus de chlorella y similares.

Entre estas ácido hialurónico sintasas, la ácido hialurónico sintasa procedente del virus de chlorella es 35 particularmente preferida.

El polipéptido que tiene una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene la actividad de sintetizar el ácido hialurónico es el polipéptido mutado hasta un punto en que la actividad de sintetizar el ácido hialurónico no se pierde, e incluye tanto el polipéptido que es una parte de la ácido hialurónico sintasa y tiene la actividad de 40 sintetizar el ácido hialurónico como el polipéptido que es la supresión, adición, inserción o la sustitución de la ácido hialurónico sintasa y tiene actividad de sintetizar el ácido hialurónico.

El polipéptido que es una parte de la ácido hialurónico sintasa y tiene la actividad de sintetizar el ácido hialurónico es el polipéptido que comprende los sitios de aminoácidos esenciales para efectuar la actividad de sintetizar el ácido hialurónico en el anterior la ácido hialurónico sintasa, eliminar una parte de los sitios de 45 aminoácidos no esencial y que tiene actividad de sintetizar el ácido hialurónico.

Como un ejemplo del polipéptido que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene la actividad de sintetizar el ácido hialurónico, se ha publicado de que la ácido hialurónico sintasa procedente de Passteurella multocida tiene actividad de sintetizar el ácido hialurónico, incluso cuando unos 270 restos de 50 aminoácidos parecían corresponder a los dominios transmembranarios o asociados a la membrana se han eliminado (Jing et al., 2000, Glycobiology, 10, 883-889).

Dichas mutaciones suceden en la naturaleza y también incluyen las mutaciones artificiales. El número de aminoácidos mutados no están limitados siempre y cuando no se pierda la actividad de sintetizar el ácido hialurónico.

En la presente invención, el ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o el ADN que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones 5 o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene la actividad de la sintetizar el ácido hialurónico no está particularmente limitado, siempre y cuando el ADN codifique la ácido hialurónico sintasa anterior o el polipéptido, y se incluye también el ADN que tiene una secuencia diferente debido a la degeneración de codones.

Como dicho ADN, pueden utilizarse opcionalmente genes de ácido hialurónico sintasa de 10 conocimiento público. Por ejemplo, pueden utilizarse genes de ácido hialurónico sintasa procedentes de seres humanos, ratón, conejo, pollo, vacas, Xenopus laevis, géneros Streptococcus, Pasteurella y el virus de chlorella.

Más concretamente, es posible utilizar AHS1, AHS2 y AHS3 del gen de la ácido hialurónico sintasa (hAHS) humana, AHS1, AHS2 y AHS3 del gen de la ácido hialurónico sintasa (mAHS) procedente del ratón, 15 AHS1, AHS2 y AHS3 del gen de la ácido hialurónico sintasa (gHAS) procedente del pollo, AHS2 del gen de la ácido hialurónico sintasa (rAHS) procedente de la rata, AHS2 del gen de la ácido hialurónico sintasa (bAhS) procedente del ganado bovino, AHS1, AHS2 y AHS3 del gen de la ácido hialurónico sintasa (xAHS) procedente de Xenopus laevis, el gen de la ácido hialurónico sintasa (pmAHS) procedente de Pasteurella multocida, el gen de la ácido hialurónico sintasa (pmAHS) procedente de Streptococcus pyogenes, el gen de la ácido hialurónico 20 sintasa (seAHS) procedente de Streptococcus equisimilis y el gen de la AHs procedente del virus de chlorella PBCV-1 (vcAHS).

Algunos genes de ácido hialurónico sintasa (AHS) tienen varios tipos, tales como AHS1, AHS2 y AHS3, y los tipos no están particularmente limitados.

Entre ellos, el gen AHS procedente del virus de chlorella es particularmente preferible. 25

El transformado de la presente invención, es decir, la célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen o la espermatofita, pteridofita, briofita o un liquen transformado se prepara transformando la célula de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen o la espermatofita, pteridofita, briofita o el liquen con (i) el ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) el ADN que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones en la secuencia de 30 aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene la actividad de sintetizar ácido hialurónico.

La célula vegetal transformada o la planta transformada puede obtenerse introduciendo el vector de expresión recombinante en el que (i) el ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) el ADN que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que 35 tiene la actividad de sintetizar ácido hialurónico se ha insertado en una hospedador para transformar de modo que se puede expresar un gen objetivo.

En la presente memoria, el hospedador significa alguna parte de la planta, la semilla, los órganos de la planta (por ejemplo, hojas, flores, tallos, raíces, rizomas, etc.), los tejidos de las plantas (por ejemplo, la epidermis, floema, parénquima, xilema y el haz vascular, etc), y cultivos de células vegetales. 40

En la presente memoria, las plantas significan plantas multicelulares incluyendo espermatofitas, pteridofitas, briofitas y líquenes e incluyen alguna parte de la planta, la semilla, los órganos de la planta (por ejemplo, hojas, flores, tallos, raíces, rizomas, etc.), los tejidos vegetales (por ejemplo, la epidermis, floema, parénquima, xilema y el tejido vascular, etc.), y cultivos de células vegetales.

El ácido hialurónico se produce cultivando el transformado obtenido por transformación y separación 45 del ácido hialurónico, producido por el transformado.

Como vector de expresión recombinante, es posible utilizar el vector normalmente utilizado para preparar la célula vegetal transformada o la planta transformada.

Dicho vector no está particularmente limitado, siempre y cuando el vector comprenda una secuencia activadora capaz de ser transcrita en la célula vegetal y un sitio de poliadenilación necesarios para la 50 estabilización de una transcripción. Por ejemplo, pueden utilizarse los plásmidos, "pBI121", "pBI221", "pBI101", "pIG121Hm" y similares.

Cuando se utiliza como hospedador la célula vegetal cultivada, la transformación puede llevarse a cabo mediante la introducción del vector de expresión recombinante en el que (i) el ADN que codifica la ácido

hialurónico sintasa o (ii) el ADN que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones en la secuencia aminoácido de la ácido hialurónico sintasa y que tiene la actividad de sintetizar ácido hialurónico se ha insertado en la célula de la planta cultivada por un procedimiento de electroporación, el procedimiento de vector binario de Agrobacterium o un bombardeo de partículas. Se seleccionan las células vegetales en las que se ha introducido el vector de la 5 expresión basándose en la resistencia a los antibióticos como la kanamicina. Las células transformadas de la planta pueden utilizarse para el cultivo celular, el cultivo de tejidos y el cultivo de órganos, y también es posible reproducir la planta utilizando un procedimiento de cultivo de tejidos vegetales convencionalmente conocido.

Los ejemplos de las células vegetales sometidas a la transformación incluyen las células BY-2 y las células T-13 procedentes del tabaco, las células kurodagosun procedentes de la zanahoria, las células VR y las 10 células VW procedentes de la uva, las células PAR, células PAP y las células PAW procedentes de Phytolacca americana L., las células T87 procedentes de Arabidopsis, las células Asp-86, las células por A. per, las células A. pas y la células A. plo procedentes del espárrago, las células Cba-1 procedentes de sandía, las células Sly-1 procedentes de tomate, las células 1-Mar procedentes de la menta, las células de CRA y V208 procedentes de bígaro de Madagascar, las células Spi-WT, las células Spi-I-1 y las células Spi-12F procedentes de la hierba de 15 la marisma, las células Lcy-1, las células LcyD6 y LcyD7 células procedentes de calabaza, las células OS-1 procedentes de arroz, las células Vma-1 procedentes de Vinca rosea, las células PSB, las células PSW y PSG procedentes de sésamo y las células ZE3 procedentes de Zinnia elegans.

Cuando la planta, el órgano de la planta o el tejido de la planta se utiliza como hospedador, la transformación puede realizarse introduciendo el vector de expresión recombinante en el que (i) el ADN que 20 codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) el ADN que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones en la secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene la actividad de sintetizar ácido hialurónico se ha insertado en una sección de planta recolectada por el procedimiento del vector binario de Agrobacterium o un bombardeo de partículas o en los protoplastos por electroporación, y separando un tejido tumoral, un brote o 25 una raíz peluda obtenida como resultado de la transformación.

Es posible utilizar directamente el tejido tumoral, el brote o la raíz peluda obtenidos de esta manera para el cultivo celular, el cultivo de tejidos o el cultivo de órganos. También es posible reproducir la planta mediante la administración de hormona vegetal a una concentración adecuada utilizando el procedimiento de cultivo tejido de plantas convencionalmente conocido. 30

Para reproducir las plantas procedentes de las células vegetales en las que se ha introducido el gen de la ácido hialurónico sintasa, tales células vegetales pueden cultivarse en un medio de rediferenciación o un medio MS sin hormonas. Las plantas transgénicas se pueden prepararse transplantando los plantones, enraizándolos al suelo y cultivándolos. Los procedimientos de reproducción (re-diferenciación) son diferentes dependiendo de los tipos de células vegetales, pero es posible utilizar opcionalmente el procedimiento de 35 cultivo de tejido vegetal convencionalmente conocido.

Por ejemplo, el procedimiento de Fujimura et al. (Fujimura et al., (1955), Plant Tissue Culture de Tejidos Lett., vol. 2: pág. 74) se puede utilizar en el arroz. El procedimiento de Shillito et al. (Shillito et al. Bio/Technology, vol. 7: pág. 581, Gorden-Kamm, 1990, Plant Cell, 2, 603, 1989) puede utilizarse en el maíz. El procedimiento de Visser et al. (Visser et al.,. Theor. Appl. Genet., vol. 78 pág. 589, 1989) se puede utilizar en la 40 patata. El procedimiento de Nagata et al. (Nagata et al., Planta 99, 12, 1971) se puede utilizar en el tabaco. El procedimiento de Akama et al. (Akama et al. Plant Cell Rep., vol. 12: pág. 7) se puede utilizar en Arabidopsis.

Las plantas preparadas por estos procedimientos o las descendencias de las mismas (los medios de reproducción, por ejemplo, las plantas obtenidas de semillas, tallos, tubérculos y orejas cortadas) que comprenden el ADN mencionado en (i) o (ii) son los temas de la presente invención. 45

Cuando la enzima que tiene actividad de sintetizar el ácido hialurónico se expresa en la planta y además el ácido hialurónico se produce, acumula o segrega en la planta, resulta preferido controlar el gen de la ácido hialurónico sintasa de manera que la ácido hialurónico sintasa se exprese específicamente en un tejido u órgano adecuado en la planta.

Para realizar dicho control, el activador específico de tejido o específico de órganos puede además 50 insertarse en el vector de expresión recombinante.

Los ejemplos del activador específico de órganos incluyen un activador específico de la raíz, un activador específico del rizoma, un activador específico de la hoja, un activador específico de la semilla y un activador madre específico del tallo.

Los ejemplos del activador específico de tejido incluyen un activador específico de tejido verde. 55

Más concretamente, como ejemplos de activadores utilizables, el activador de expresión constitutivamente alta incluye el activador CaMV35S que es el activador de 35S ARN del virus mosaico de la coliflor. El activador específico de tejido verde incluye un activador del gen rbs que codifica una proteína de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa, un activador del gen CAB que codifica una proteína con enlace de clorofila a/b, y un activador del gen GapA que codifica una proteína de la subunidad A 5 de aldehído glutárico-3-fosfato deshidrogenasa. El activador específico de semillas incluye activador LOX del gen de lipoxigenasa, el activador Psl del gen de lectina, y el activador AmylA del gen de la amilasa. El activador específico de la raíz incluye el activador A6H6H del gen de la hiosciamina 6b-hidroxilasa y el activador PMT de putrescina N-metil-transferasa. El activador específico del tallo incluye un activador del gen Sus4 de la sacarosa sintasa y un activador del gen patatin que codifica una glucoproteína. 10

Se cree también que controlan la expresión del gen de la ácido hialurónico sintasa con un activador de la inducción. Los ejemplos del activador de inducción se describen a continuación.

Se incluyen el activador PR1a que es el activador del gen relacionado con la resistencia a las enfermedades cuyo nivel de expresión está reforzado por lesión o adición de ácido salicílico y el activador génico rd29A cuyo nivel de expresión se refuerza por la sequedad, la baja temperatura, alta concentración de 15 sal o la conversión de ácido abscísico. El activador, cuya expresión se induce por un compuesto utilizado como producto químico agrícola incluye un activador de la codificación del gen GST-27 que codifica una proteína de 27 KDa subunidad de la glutatión S-transferasa, cuya expresión es inducida por un herbicida Safener, un activador del gen quinasa y un activador de la proteína del gen presión inducida por el éster S-metílico del ácido benzo(1,2,3) tiadiazol-7-carbotioico (BTH). Además, a fin de expresar de manera más estable el gen de 20 la ácido hialurónico sintasa en las células vegetales, puede utilizarse un aislante, se puede agregar un péptido señal paraa localizar la ácido hialurónico sintasa en el orgánulo objetivo, y una parte de la ácido hialurónico sintasa puede sustituirse o eliminarse.

Las plantas sometidas a la transformación incluye todas las plantas capaces de introducir el gen.

Las plantas o los órganos de la planta de la presente invención incluyen monocotiledóneas y 25 dicotiledóneas de angiospermas y gimnospermas. Dichas plantas incluyen plantas útiles opcionales, en particular las plantas de cultivo, hortalizas, plantas con flores y plantas leñosas.

Las plantas o los órganos de la planta de la presente invención también incluyen las pteridofitas y las briofitas.

Los ejemplos de especies de plantas que puedan utilizarse en la presente invención son 30 concretamente las plantas pertenecientes a las familias de las solanáceas, gramíneas, crucíferas, rosáceas, leguminosas, cucurbitáceas, labiadas, liliáceas, quenopodiáceas, umbelíferas, mirtáceas y convolvuláceas.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las solanáceas incluyen las plantas que pertenecen al género Nicotiana, Solanum, Datura, Lycopersion o Petunia , e incluyen, por ejemplo, tabaco, berenjena, patata, tomate, pimiento rojo y petunia. 35

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las gramíneas son las plantas que pertenecen al género Oryza, Hordeum, Secale, Sccharum, Echinochloa o Zea , e incluyen el arroz, la cebada, el centeno, el espino blanco, cereales y maíz.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las crucíferas incluyen las plantas pertenecientes al género Raphanus, Brassica, Arabidopsis, Wasabia o Capsella e incluyen el rábano oriental, la col, Arabidopsis , el 40 rábano picante japonés y zurrón de pastor.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las rosáceas son las plantas que pertenecen al género Orunus, Malus, Pynus, Fragaria o Rosa, e incluyen el albaricoque japonés, melocotón, manzana, pera, fresa y rosa.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las leguminosas son las plantas que pertenecen al género 45 Glycine, Vigna, Phaseolus, Pisum, Vicia, Arachis, Trifolium, Alphalfa o Medicago, e incluyen la soja, la alubia adzuki, la alubia blanca, el guisante, haba, cacahuete, trébol y trébol de olor.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las cucurbitáceas son las plantas que pertenecen al género Luffa, Cucurbita o Cucumis, e incluyen la calabaza, pepino y melón.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las labiadas incluyen las plantas pertenecientes a este 50 género Lavadula, Mentha o Perilla, e incluyen la lavanda, la menta y la albahaca japonesa.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las liliáceas incluyen las plantas que pertenecen al género Allium, Lilium o Tulipa, e incluyen la cebolleta, el ajo, el lirio y el tulipán.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las quenopodiáceas incluyen las plantas pertenecientes a este género Spinacia , e incluyen la hierba de la marisma.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las umbelíferas incluyen las plantas pertenecientes al género Angelica, Daucus, Cryptotaenia o Apitum, e incluyen shishiudo, zanahoria, honewort y apio.

Los ejemplos de plantas pertenecientes a las convolvuláceas incluyen las plantas pertenecientes al 5 género Ipomoea, e incluyen la batata.

Las descendencias que comprenden el mismo ADN que en las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen o los órganos o los tejidos de las mismas son también temas de la presente invención.

Las células transformadas de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen que producen la ácido hialurónico sintasa están incluidas en la presente invención. Las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen 10 transformadas que producen la ácido hialurónico sintasa o sus descendencias, sus órganos o sus tejidos que comprenden el mismo ADN también están incluidas.

Las células transformadas de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen que producen la ácido hialurónico sintasa se pueden obtener por transformación de las células de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen con (i) el ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) el ADN que codifica el polipéptido 15 que tiene la secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene actividad de sintetizar el ácido hialurónico.

Las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen transformadas que producen la ácido hialurónico sintasa se pueden obtener mediante la transformación de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen con (i) 20 el ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) el ADN que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tienen una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que tiene actividad de sintetizar el ácido hialurónico.

En las células transformadas de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen o en las espermatofitas, 25 pteridofitas, briofitas o liquen el gen de la ácido hialurónico sintasa se expresa como la enzima que tiene la actividad de sintetizar el ácido hialurónico.

Se hace posible producir el ácido hialurónico en las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen utilizando las células transformadas de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen o las de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen transformadas que tiene capacidad de producir el ácido hialurónico, o utilizando 30 las células transformadas de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen o las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen transformadas que producen la ácido hialurónico sintasa.

Los procedimientos de separación o de obtención del ácido hialurónico producido por las células transformadas de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen o las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen transformadas incluyen, por ejemplo, los procedimientos siguientes. 35

La célula transformada de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen o las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen se cultivan y el ácido hialurónico se produce en las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen, y posteriormente, el ácido hialurónico se extrae opcionalmente de las células transformadas de espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen por el procedimiento públicamente conocido.

Por ejemplo, en el caso de las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen transformadas, hojas 40 secas de las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen se parten y se extraen con un solvente orgánico apropiado.

Se filtra una solución del extracto que contiene el ácido hialurónico, y se obtiene una solución del filtrado del ácido hialurónico que no contiene células de espermatofitas, pteridofitas, briofitas ni de liquen. Esta solución se purifica por diafiltración para eliminar las impurezas de bajo peso molecular. Es posible separar el 45 ácido hialurónico por diafiltración de la solución de filtrado que contiene el ácido hialurónico disuelto con agua purificada seguido del descarte continuo del filtrado. Cuando se necesitan productos farmacéuticos, puede realizarse además una etapa de precipitación de los ácidos nucleicos en la solución. Esta etapa puede realizarse mediante la adición de un tensioactivo catiónico, tal como los compuestos de amonio cuaternario de cloruro de cetilpiridinio. 50

El ácido hialurónico obtenido por el procedimiento de la presente invención puede ser utilizado útilmente para los componentes de los cosméticos y productos farmacéuticos o biomateriales. En concreto, el ácido hialurónico puede utilizarse útilmente como un componente hidratante en los productos cosméticos o

agentes terapéuticos para la artritis, la artritis reumatoide, lesiones por quemaduras y lesiones por corte, o un componente de colirios.

Según la presente invención, el ácido hialurónico que no se ha producido de forma natural en las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen se produce en las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o el liquen. Según la presente invención, la ácido hialurónico sintasa se expresa en la planta y, además, el ácido 5 hialurónico se produce en las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o el liquen.

Como sistema hospedador para la producción de proteínas mediante manipulación genética, es posible utilizar actualmente plantas modificadas genéticamente, células vegetales cultivadas, células de microorganismos tales como Escherichia coli y levadura, células de mamíferos cultivadas y animales modificados genéticamente. Sin embargo, todos los sistemas de producción tienen puntos buenos y malos, y 10 es necesario seleccionar el sistema óptimo en consideración de los usos deseados, de las propiedades y las cantidades de producción de la proteína recombinante objetivo. En cuanto a los sistemas de producción aparte de los de la planta, en Escherichia coli , no se produce ningún tratamiento de la proteína, probablemente se forman cuerpos de inclusión, y se produce la descomposición por la proteasa que es problemática. En la levadura, se modifica la cadena del azúcar, pero la modificación es inherente en la levadura. Cuando la 15 sustancia terapéutica se produce en el microorganismo, el costo de purificación se vuelve sumamente caro a fin de evitar la contaminación por endotoxinas. Para las células de mamíferos, es difícil mantener las células, y se requieren medios costosos. Además, la producción a gran escala es difícil porque la velocidad de crecimiento es lenta. Por otra parte, existe el riesgo de contaminarse con virus y oncogenes. En el caso de los animales modificados genéticamente, hay problemas éticos, además de problemas de mantenimiento. 20

Mientras tanto, para las células de plantas cultivadas y la planta en el sistema de producción de la planta, existen problemas de un largo periodo de desarrollo y de alcaloides, pero pueden utilizarse sistemas convencionales de producción agrícola, el aumento progresivo es sencillo, y es posible producir la sustancia objetivo de manera económica en gran cantidad. Tampoco hay preocupación por los virus de toxina e infecciosos que son problemáticos en caso de utilizar microorganismos o células de mamíferos como 25 hospedadores. De este modo, la célula vegetal cultivada y la planta son sistemas de producción de sustancias prometedores.

El sistema de producción de ácido hialurónico por espermatofitas, pteridofitas, briofitas o liquen en la presente invención es el sistema de producción industrial ventajoso porque la seguridad es mayor y el costo y la carga de energía son menores en comparación con los sistemas convencionales de producción por las 30 células de mamíferos o de microbios.

Hasta ahora en el sistema de producción de la planta, aun cuando se expresa la proteína procedente de las células de mamíferos o microbianas, dado que los antecedentes genéticos son diferentes, no se mantienen la estructura de la configuración y la estructura requerida de la cadena de azúcar, y de este modo la proteína producida a menudo no ha tenido ninguna función original del mismo. Convencionalmente, la proteína 35 procedente de las células de mamíferos o de microbios se ha expresado en la planta, y la propia proteína se ha extraído y utilizado. Sin embargo, apenas se ha publicado que la proteína (enzima) procedente de las células de mamíferos o de microbios se ha expresado en la planta y la sustancia se produce en la planta utilizando la enzima expresada en la planta como en la presente invención. Se ha publicado de que la estructura de azúcar se convirtió en la estructura de la cadena de azúcar que la planta tenía naturalmente en la planta en la que la 40 glicosiltransferasa procedente de seres humanos se había recombinado. En este caso, se cambió la estructura de la cadena del azúcar que había producido la planta de forma natural. Convencionalmente, no ha habido ningún ejemplo concreto en el que la sustancia que la planta no ha producido en absoluto se produzca en la planta como el ácido hialurónico de la presente invención. Además, no hay ningún ejemplo en el que se produzca en la planta la sustancia macromolecular, tal como el ácido hialurónico en la que dos tipos de 45 azúcares se repiten en determinado orden varios miles de veces.

La ácido hialurónico sintasa tiene generalmente múltiples dominios transmembranarios o asociados a la membrana. Cuando la proteína extraña unida a la membrana, tal como la ácido hialurónico sintasa se expresa en el hospedador, los dominios transmembranarios o asociados a la membrana a menudo no pueden mantener la configuración correcta. En particular, se ha sugerido que en la ácido hialurónico sintasa activa, 50 una proteína ácido hialurónico sintasa y aproximadamente 14 a 18 moléculas de cardiolipina que es uno de los fosfolípidos corrientes presentes en la membrana forman un complejo que afecta a la actividad de la ácido hialurónico sintasa. Por lo tanto, está más allá de las expectativas convencionales que la ácido hialurónico sintasa que la planta no tiene de forma natural se expresa en la planta y que se mantiene la configuración en la que puede producirse el ácido hialurónico. 55

De esta manera, las espermatofitas, pteridofitas, briofitas o el liquen que producen el ácido hialurónico en la presente invención es la tecnología que no puede predecirse a partir de la tecnología convencional y logra efectos industriales sumamente ventajosos.

Mejor modo de poner en práctica

La presente invención se describe con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos siguientes no 5 limitativos de la invención.

EJEMPLOS

1. Aislamiento del gen de la ácido hialurónico sintasa procedente del virus de chlorella

Se prepararon cebadores de RCP con el fin de aislar un gen de la ácido hialurónico sintasa del virus de chlorella (vcAHS) por RCP. Los cebadores se diseñaron haciendo referencia a la información de la 10 secuencia del genoma del virus de chlorella ya mostrado (Kutish et al., 1996, Virology, 223, 303-317) (Li et al., 1995, Virology, 212, 134-150) (Li et al., 1997, Virology, 237, 360-377) (Lu et al., 1995, Virology, 206, 339-352) (Lu et al., 1996, Virology, 216, 102-123) y la información de identificación del gen de la ácido hialurónico sintasa procedente del virus de chlorella (DeAngelis et al., 1997, Science, 278, desde 1800-1803), y realizado mediante la adición de zonas de la enzima de restricción necesaria para la introducción en un vector de 15 expresión. Como zonas de la enzima de restricción, se añadió la zona NdeI al cebador en 5 ' y la zona XbaI se añadió al cebador en 3'.

Cebador en 5 ' (SEC. ID. nº 3)

5 '- GCC GCC GCA TAT GGG TAA AAA TAT AAT CAT AAT GGT TTC G - 3’

3'-cebador (SEC. ID. nº 4) 20

5 '- CTT GCA GTC TAG ATC ACA CAG ACT GAG CAT TGG TAG -3’

Para las plantillas de la RCP se utilizaron, ADN genómico de las cepas CVHI1 y CVKA1 del virus de chlorella (proporcionado por el profesor Takashi Yamada, Departamento de Biotecnología Molecular, Graduated School of Advanced Science of Matter, Hiroshima University).

Se realizó la RCP utilizando KOD-plus- (Toyobo) como ADN polimerasa por un sistema de reacción a 25 94°C durante 2 minutos, 2 ciclos (94°C durante 15 segundos, 40°C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto) y 25 ciclos (94°C durante 15 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto). El fragmento de la RCP resultante se insertó en el vector de expresión (pBS modificado) modificado de tal manera que un codón de iniciación, una zona ATG del gen β-galactosidasa de pBluescript IIKS (+) (abreviado como pBS) era la zona NdeI. Los fragmentos insertados fueron identificados como una secuencia de ADN de vcAHS-30 HI (SEC. ID. nº 1), el gen de la ácido hialurónico sintasa procedente de la cepa CVHI1 y una secuencia de ADN de vcAHS-KA (SEC. ID. nº 2), el gen de la ácido hialurónico sintasa procedente de la cepa CVKA1 utilizando un secuenciador de ADN.

2. Expresión de vcAHS en Escherichia coli y extracción de la misma

JM109 de Escherichia coli portadora de vcAHS-HI o vcAHS-KA cultivada durante la noche a 37°C en 35 un medio Luria-Bertani (LB: 10 g/l de Polypeton, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl) que contiene 50 mg/ml de ampicilina se inoculó en 50 ml de medio LB reciente (1:100), que contiene 50 mg/ml de ampicilina, 0,2% de glucosa e isopropil-β-D-tiogalactopiranosido 0,3 mM (IPTG). La inducción con IPTG se realizó a 20°C durante 72 horas. Las células inducidas con IPTG se recolectaron por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 30 ml de tampón (que contiene Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM, benzamidina 40 1 mM y 2-mercaptoetanol (2-ME) 1 mM) y se homogeneizó. Una fracción de la membrana que contiene vcAHS se extrajo centrifugando (12.000 rpm, 20 minutos), las células microbianas partidas y realizando la ultracentrifugación de su sobrenadante (× 100.000 g, una hora), y se volvió a poner en suspensión en 200 µl del tampón (igual que la anterior) para preparar una solución de extracto de vcAHS.

3. Medición de la actividad de vcAHS 45

La actividad de sintetizar el ácido hialurónico se representó sintetizando el ácido hialurónico in vitro utilizando la solución de extracto de vcAHS producido en Escherichia coli y la medición de la concentración del ácido hialurónico en la mezcla de reacción. Para la síntesis in vitro del ácido hialurónico, una mezcla de reacción que contenía Tris-HCl 100 mM (pH 7,0), MgCl2 40 mM, EGTA 0,2 mM, 2-ME 20 mM, 0,1% de BSA, UDP-GlcA 2 mM, UDP-GlcNAc 2 mM, 20% de glicerol y 10 μl de solución de extracto de AH y ajustado a 50 μl 50 de volumen total se hizo reaccionar a 37°C durante 2 horas, 4 horas y 20 horas (O/N). La mezcla de reacción se calienta a 90°C durante 3 minutos para terminar la reacción. Después de la centrifugación de la mezcla de reacción, para la cuantificación del ácido hialurónico se utilizó el sobrenadante.

Para la cuantificación del ácido hialurónico se utilizó una placa "Chugai" (Fujirebio, Inc.) con ácido hialurónico que utiliza un agente de medición para el ácido hialurónico mediante una proteína de unión al ácido hialurónico.

La placa "Chugai" de ácido hialurónico es un procedimiento de cuantificación tipo ligadura sándwich del ácido hialurónico que utiliza la proteína de unión al ácido hialurónico. El ácido hialurónico en una muestra 5 se une a la proteína de unión a ácido hialurónico inmovilizada en una placa de microvaloración, y a continuación, una proteína que se une al ácido hialurónico marcada con enzima se une al mismo para formar un sándwich. Posteriormente, cuando se agregan tetrametilbenzidina (TMB) y peróxido de hidrógeno, la TMB se oxida por la acción de la peroxidasa que es la enzima marcada para desarrollar un color. Después de agregar una solución de interrupción de la reacción, puede evaluarse la concentración del ácido hialurónico en 10 la muestra midiendo la absorbancia (A450) en una longitud de onda de 450 nm y una longitud de onda de control de 620 nm utilizando un lector de microplacas.

Se preparó una curva patrón utilizando soluciones patrón de ácido hialurónico se adjuntas en este kit, la concentración del ácido hialurónico contenido en la muestra se determinó restando la absorbancia de la solución (simulada) que no contiene ácido hialurónico de la absorbancia de la muestra (ΔA450), y se describió 15 como la concentración de ácido hialurónico (concentración de AH, ng/ml) en la Tabla 1.

Para el valor de la actividad de la ácido hialurónico sintasa, se convirtió la absorbancia en moles mediante los cálculos siguientes para representar la cantidad de ácido hialurónico sintetizado. La absorbancia del ácido hialurónico patrón (concentración de 100 ng/ml) fue A, y la absorbancia de cada muestra fue B. Entonces, la cantidad total de la solución de reacción fue de 50 ml. Por lo tanto, la actividad de cada ácido 20 hialurónico sintasa se calculó como B × 100 ng/ml / A × 50 μl / 1000 = C ng/tiempo de reacción.

El peso molecular de la unidad componente (GlcA-GlcNAc) del ácido hialurónico es 398,35, y por lo tanto, el peso molecular de (GlcA-GlcNAc)n se puede representar como 398,5Xn-18X (n-1). En consecuencia, en el caso de n = 10, el peso molecular de (GlcA-GlcNAc)10 se calcula como 398,8 × 10-18 × (10-1) = 3821,5 Da. 25

Por lo tanto, las moléculas de GlcA incorporados en el ácido hialurónico para cada período de tiempo de reacción se calcula como C / 3821,5 Xn (n = 10) × 100 = D pmol

La concentración de proteínas en la solución del extracto se midió mediante el reactivo de análisis Bio-Rad de proteínas (Bio-Rad) utilizando BSA como proteína patrón. Los resultados se describieron en cantidad de proteína en la Tabla 1. 30

La actividad de la ácido hialurónico sintasa se representó como la actividad de AHS en la Tabla 1 mediante el cálculo de las moléculas (pmoles) de GlcA incorporados en el ácido hialurónico sintetizado durante una hora por 1 mg de la proteína contenida en la solución de extracto del ácido hialurónico.

En la Tabla 1, la solución del extracto de Escherichia coli transformada con el vector que no contiene ácido hialurónico sintasa se representa como simulada. La solución de extracto de la ácido hialurónico sintasa 35 de Escherichia coli transformada con el vector que lleva el gen de la ácido hialurónico sintasa procedente de Streptococcus pyogenes se representó como spAHS. La solución de extracto de la ácido hialurónico sintasa procedente de Escherichia coli transformada con el vector que lleva el gen de la ácido hialurónico sintasa procedente de la cepa CVKA1 del virus de chlorella se representó como vcAHS-KA. Las obtenidos repitiendo dos veces se representaron como vcAHS-KA1 y KA2 vcAHS, respectivamente. La solución de extracto de la 40 ácido hialurónico sintasa procedente de Escherichia coli transformada con el vector que lleva el gen de la ácido hialurónico sintasa procedente de la cepa CVHI1 del virus de chlorella se representó como vcAHS-HI. Los obtenidos repitiendo dos veces se representaron como vcAHS-HI1 y vcAHS HI2, respectivamente.

Un procedimiento de representación de la actividad de AHS es el mismo que los procedimientos representados en el documento JP 200-4886 A, Tano, N. y Kimata, K. (1996) J. Biol. Chem., 271, 9875-9878, 45 Tlapak-Summons L. et al., (1999) J. Biol. Chem., 274, 4246-4253.

Tabla 1

Análisis de expresión de cvAHS en Escherichia coli

Muestra: Tiempo de reacción A450 (med.) ΔA450 Concentración de AH (ng/ml) Concentración de AH (pmol-GlcA) Cantidad proteína* Actividad de AHS (pmol/mg- proteína/h)

Simulada: 2 horas 0,035 - - - - -

: 4 horas 0,059 - - - - -

spAHS: 2 horas 0,062 0,027 14,2 5.312 851

: 4 horas 0,122 0,063 33,2 12.395 3,12 993

vcAHS-KA1: 2 horas 0,045 0,010 5,3 1.967 426

4 horas: 0,090 0,031 16,3 6.099 2,31 660

O/N: 0,231 0,172 90,5 33.841 732

cVAHS-KA2: 2 horas 0,045 0,010 5,3 1.967 475

4 horas: 0,080 0,021 11,1 4.132 2,07 499

O/N: 0,232 0,173 91,1 34.038 822

vcAHS-HI1: 2 horas 0,094 0,059 31,1 11.608 3.120

4 horas: 0,150 0,091 47,9 17.904 1,86 2.406

O/N: 0,117 0,058 30,5 11.411 1.534

vcAHS-HI2: 2 horas 0,057 0,022 11,6 4.328 1.258

4 horas: 0,106 0,047 24,7 9.247 1,72 1.344

O/N: 0,271 0,212 111,6 41.711 1.213

Tal como se muestra en los resultados en la Tabla 1, se demuestra que los productos de los genes aislados presentan actividad de ácido hialurónico sintasa.

4. Construcción del vector de expresión de la planta 5

Los fragmentos de vcAHS-HI y cvAHS-KA se ampliaron por RCP con el ADN plásmido que contenía vcAHS-HI o vcAHS-KA preparadas y cuya actividad de AHS se ha demostrado en el Ejemplo 3 anterior como plantilla, utilizando los cebadores de RCP preparados añadiendo las secuencias de la enzima de restricción por RCP. Como cebador de RCP en 5’, se diseñó el cebador en el que se añadió la secuencia DraI de la enzima de restricción en la secuencia del pBS modificado, y como cebador en 3’, se utilizó una zona que contiene la 10 secuencia ScaI de la enzima de restricción en la secuencia de multiclonación del pBS modificado.

Cebador en 5’ (SEC. ID. nº: 5): 5’ – GTG TGG AAT TTA AAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG- 3’.

Cebador en 3’ (SEC. ID. nº: 6): 5’ – GGG CGA ATT GGA GCT CCA CCG CGG – 3’.

Posteriormente, se insertó vcAHS en el vector pBI121 (Jefferson et al., 1987, EMBO J., 6, 3901-3907) para la transformación de la planta digiriendo pBI121 con SmaI y ScaI y digiriendo vcAHS que debe injertarse 15 con DraI y ScaI.

Mediante lo anterior, se pudieron preparar el plásmido pBI121 (pBI121cvHI) que contiene vcHAS-HI y pBI121 (pBI121cvKa) que contiene cvHAS-KA.

5. Preparación de células competentes para electroporación

Para las células competentes para la electroporación, se inoculó una sola colonia de la cepa LBA4404 20 de Agrobacterium tumefaciens en 5 ml de medio LB y se cultivó en agitación a 28ºC durante la noche. Este medio de cultivo se inoculó en 500 ml del medio LB y se cultivó en agitación a 28ºC hasta que la turbidez fue de 0,5 a 600 nm. Se recolectaron células microbianas centrifugando (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC) el medio de

cultivo y removiendo el sobrenadante. Para lavar las células microbianas, se añadieron 500 ml de agua esterilizada para poner las células microbianas en suspensión, y de nuevo se recolectaron las células microbianas centrifugando (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC) y removiendo el sobrenadante. Esta manipulación ser repitió dos veces. Posteriormente se añadieron a un precipitado 20 ml de solución al 10% esterilizada de glicerol y enfriada para poner las células microbianas en suspensión, y las células microbianas se recolectaron 5 por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC) y extrayendo el sobrenadante. A continuación, se añadieron al precipitado 3 ml de solución de glicerol al 10% esterilizada y enfriada para poner en suspensión las células microbianas, y 40 μl de una alícuota se administraron a un tubo de centrifugadora de 1,5 ml, que se congeló en nitrógeno líquido y a continuación se almacenó a -80ºC.

6. Introducción de vcAHS-HI y vcAHS-KA en la cepa LBA4404 de Agrobacterium 10

El ADN plásmido pBI121vcHI o pBI121vcKA se preparó y se introdujo en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación. Una suspensión en la que 40 μl de células competentes LBA4404 de A. tumefaciens para electroporación y 1 μl del plásmido de expresión (200 μg/ml) que se habían mezclado se infundieron en una cubeta previamente enfriada en hielo que tiene 1 mm de distancia entre los electrodos, y se aplicó a ésta un campo eléctrico pulsante (1,8 kV, 25 μF, 200 Ω). Inmediatamente se 15 añadieron 500 μl de SOC y se cultivaron las células a 28ºC durante 3 horas. Posteriormente, se aplicó el medio de cultivo al medio de la placa LB que contenía kamicina, y se cultivaron a 25ºC durante 3 días para dar células de Agrobacterium que llevan pBI121vcHI o pBI121vcKA.

7. Infección de células de tabaco cultivadas (BY-2) con LBA4404 de Agrobacterium que llevan pBI121vcHI o pBI121vcKA 20

Se utilizó Nicotiana tabacum L. cv Amarillo Brillante 2 (abreviadas a veces como BY-2, Nagata et al., 1981, Mol. Gen. Genet., 184, 161-165) como células de tabaco cultivadas para transformación. Las células BY-2 se cultivaron según el procedimiento de Nagata et al. (Nagata et al., 1981, Mol. Gen. Genet., 184, 161-165), y se utilizó medio LS (Linsmaier y Skoog) modificado (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant, 18, 100-127) en el que KH2PO4 y HCl de tiamina se habían aumentado hasta 370 mg/l y 1 mg/l respectivamente y sacarosa a una 25 concentración final del 3% y ácido 2,4-diclofenoxiacético (2,4-D) a una concentración final de 0,2 mg/l se había añadido en medio LS.

La transformación de las células BY-2 del tabaco se realizó esencialmente según el procedimiento de An (An, 1985, Plant Physiol. 79, 568-570). Un medio de cultivo de Agrobacterium (100 μl) portador pBI121vcHI o pBI121vcKA cultivado en 5 ml de medio LB que contiene 50 mg/l de kanamicina a 28ºC durante la noche y 4 30 ml de una suspensión de las células BY-2 del tabaco cultivadas durante 4 días se colocaron en una placa Petri, se mezclaron intensamente y se cultivaron conjuntamente a 25ºC durante dos días a la oscuridad. Con objeto de eliminar Agrobacterium, el medio de cultivo en la placa Petri se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 ml, 20 ml de medio LS modificado que contenía de 100 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina se añadieron además a éste, y el sobrenadante se separó por centrifugación (1000 rpm, 4 minutos). 35 Inmediatamente, se añadieron 25 ml de medio LS modificado reciente y las células se lavaron por centrifugación (100 rpm, 4 minutos). Esta manipulación se repitió tres veces. Las células cultivadas de las que se había separado Agrobacterium se transfirieron al medio LS modificado que contiene 100 mg/l de kanamicina, 250 mg/l de carbenicilina y 0,3% de goma gelan, y se cultivaron en la oscuridad. Después de 3 semanas, las células con callosidades se transfirieron a una nueva placa, y se seleccionaron los clones en 40 crecimiento. Por último, se transfirieron las colonias a 30 ml del medio LS modificado que contiene 100 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina, y se realizó el cultivo líquido.

8. Producción de vcAHS en células cultivadas y extracción de la misma

Se separaron las células del medio por centrifugación (1000 rpm, 20 minutos), 150 ml de las células BY-2 de tabaco se cultivaron en el medio LS modificado durante 7 días. Las células se pusieron en suspensión 45 en 30 ml de tampón (que tenía Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM, benzamidina 1 mM y 2-ME 10 mM) y se homogeneizó. Una fracción de la membrana que contiene vcAHS se extrajo centrifugando (12.000 rpm, 20 minutos) la solución de células microbianas descompuestas y realizando la ultracentrifugación de su sobrenadante (x 100.000 g, 1 hora), y se volvieron a poner en suspensión en 300 μl de tampón (que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM, benzamidina 1 mM y 2-ME 10 mM) para preparar una 50 solución de extracto de vcAHS.

9. Cuantificación del ácido hialurónico producido por células cultivadas

El medio separado de las células después del cultivo celular anterior, la solución de extracto de vcAHS y la solución del extracto de vcAHS tratadas con hialuronidasa se utilizaron como muestras para la cuantificación del ácido hialurónico producido por las células de BY-2 del tabaco. La cuantificación se realizó 55 para dos cepas de las células BY-2 del tabaco que llevan vcHAS-HI y vcHAS-KA, respectivamente. El medio

separado de las células se concentró dos veces por liofilización. La digestión con hialuronidasa se realizó disolviendo hialuronidasa (Sigma) procedente de testículos bovinos en 100 ml de tampón fosfato (pH 5,3) que contenía NaCl 150 mM a una concentración de 100 mg/ml, añadiéndolo en la solución de extracto de vcAHS e incubando a 37ºC durante 4 horas. Después de calentar cada muestra a 90ºC durante 3 minutos, se realizó la centrifugación (12.000 rpm, 10 minutos), y su sobrenadante se utilizó para la cuantificación del ácido 5 hialurónico. La cuantificación del ácido hialurónico se realizó utilizando la placa “Chugai” (Fujirebio, Inc.) del ácido hialurónico. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

En la Tabla 2, la muestra procedente de BY-2 transformada con el vector que contiene la ácido hialuronicosintasa procedente del virus de chlorella vcKA1 se representó como vcAHS-KA, y las obtenidas repitiendo dos veces se representaron como vcAHS-KA1y vcAHS-KA2, respectivamente. La muestra 10 procedente de BY-2 transformada con el vector que contiene la ácido hialurónico sintasa procedente del virus vcKHI1 del virus de chlorella se representó como vcAHS-HI, y las obtenidas repitiendo dos veces se representaron como vcAHS-HI1 y vcAHS-HI2, respectivamente. Los resultados de la medición de las soluciones patrón de ácido hialurónico adjuntas a la placa “Chugai” de ácido hialurónico (Fujirebio, Inc.) se describieron como “ácido hialurónico (patrón)”. La concentración entre paréntesis representa la concentración 15 del ácido hialurónico en la solución patrón de ácido hialurónico.

Tabla 2

Cuantificación del ácido hialurónico producido por las células cultivadas

Muestra: A450 Concentración de ácido hialurónico (ng/ml)

Medio: vcAHS-HI1 0,824 2.035

vcAHS-HI2: 0,672 1.655

vcAHS-KA1: 0,654 1.610

vcAHS-KA2: 0,903 2.233

Solución del extracto de vcAHS: vcAHS-HI1 0,332 805

vcAHS-HI2: 0,300 725

vcAHS-KA1: 0,285 688

vcAHS-KA2: 0,357 868

Solución del extracto de vcAHS digerido con hialuronidasa: vcAHS-HI1 0,013 -

vcAHS-HI2: 0,013 -

vcAHS-KA1: 0,010 -

vcAHS-KA2: 0,010 -

Ácido hialurónico (patrón) (0 ng/ml): 0,010 -

Ácido hialurónico (patrón) (100 ng/ml): 0,042 -

Ácido hialurónico (patrón) (200 ng/ml): 0,080 -

Ácido hialurónico (patrón) (500 ng/ml): 0,187 -

Como se muestra en la Tabla 2, se demuestra que cada línea de las células BY-2 del tabaco produce 20 ácido hialurónico.

10. Medición de la actividad de vcAHS producida por células cultivadas

Se evaluó la actividad de sintetizar el ácido hialurónico sintetizando el ácido hialurónico in vitro utilizando la solución de extracto de vcAHS producida en el cultivo de células vegetales y midiendo la concentración de ácido hialurónico en la solución de reacción. Para la síntesis in vitro del ácido hialurónico, una 25 mezcla de reacción que contiene tampón Tris 100 mM (pH 7,0, MgCl2 40 mM, EGTA 0,2 mM, 2-mercaptoetanol 20 mM, BSA al 0,1%, UDT-GlcA 2 mM, UDP-GlcNAc 2 mM, glicerol al 20% y 10 μl de solución de extracto de AHS y ajustada a 50 μl de un volumen total se hizo reaccionar a 37ºC durante 0 ó 2 horas. Después de la reacción, la mezcla de reacción se calentó a 90ºC durante 3 minutos hasta terminar la reacción. Después de la centrifugación de la mezcla de reacción, el sobrenadante se utilizó para la cuantificación del ácido hialurónico. 30 La placa “Chugai” (Fujirebio, Inc.) con ácido hialurónico se utilizó para la cuantificación del ácido hialurónico mediante la proteína de fijación al ácido hialurónico. La concentración de proteína en la solución del extracto de AHS se midió con el reactivo analítico de la proteína Bio-Rad (Bio-Rad) utilizando ASB como proteína patrón. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

35

Tabla 3

Medición de la actividad de vcAHS producida por las células BY-2 del tabaco

Muestra: Tiempo de reacción A450 (Aye) ΔA450 (Aye) Concentración de AH (ng/ml) Concentración de AH (pmol/GlcA) Cantidad de proteína* Actividad de AHS (pmoles/mg-proteína/h)

vcAHSHI1: 0 hora 2 horas 0,332 0,475 0,143 358 133.829 24,2 2.765

vcAHSHI2: 0 hora 2 horas 0,300 0,403 0,103 258 96.477 14,8 3.258

vcAHSKA1: 0 hora 2 horas 0,285 0,475 0,190 475 177.567 32,8 2.707

vcAHSKA2: 0 hora 2 horas 0,357 0,483 0,126 315 177.755 25,0 2.355

Como se muestra en la Tabla 3, se demuestra que vcAHS, tanto vcAHS-AHÍ como vcAHS-KA producidos en las células tienen actividad de sintetizar el ácido hialurónico. Se sugiere que la ácido hialuronico 5 sintasa procedente de otra fuente puede también sintetizar la ácido hialurónico en las células vegetales.

11. Preparación de la fracción que contiene ácido hialurónico producido por células de tabaco cultivadas y transformadas

La suspensión celular (150 ml) de BY-2 transformada cultivada en medio LS modificado que contiene kanamicina (100 mg/l) y carbenicilina (250 mg/l) durante 10 días se centrifugó (1.000 rpm, 20 minutos) y se 10 recolectó el medio sobrenadante. Este medio se ultrafiltró (amicon YM-10) para concentrar hasta aproximadamente un cuarto, posteriormente se añadió una cantidad doble de etanol y se recolectó un precipitado por centrifugación. Se demostró que la fracción que contiene el ácido hialurónico se había obtenido disolviendo el precipitado en agua y detectando el ácido hialurónico en la disolución por la placa de ácido hialurónico. Un volumen igual de una solución de hialuronidasa en la que la hialuronidasa (Sigma) procedía de 15 testículos bovinos se había disuelto en tampón fosfato 100 mM (pH 5,3) que contenía NaCl 150 mM se añadió a esta fracción que contenía ácido hialurónico hasta comenzar una reacción de hialuronidasa a una concentración final de 2 kU/ml a 37ºC. Después de un determinado periodo, la mezcla de reacción se calentó a 95ºC durante 20 minutos para interrumpir la reacción. El sobrenadante obtenido centrifugando la mezcla de reacción se sometió a análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En la HPLC, esencialmente 20 según el procedimiento de Tawada et al. (Tawada et al., 2002, Glycobiology, 12, 421-426), 50 μl de la muestra se analizaron con una columna amino YMC-Pack NH2 (4,6 mm x 15 cm) a flujo constante (1 ml/min) a 50ºC utilizando un gradiente lineal de 30 minutos de NaH2PO4 20 a 500 mM como fase móvil, y se detectó por UV (210 nm). La figura 1 presenta el perfil por HPLC de la mezcla de oligosacáridos de hialuronano producida después de la digestión con hialuronidasa. 25

Una hora después de comenzar la reacción, se detectaron múltiples picos de azúcar que se supone que corresponden a una mezcla de ácido hialurónico de bajo peso molecular producida por digestión con hialuronidasa. Junto con el transcurso del tiempo de tratamiento con hialuronidasa, los pesos moleculares de la mezcla de ácido hialurónico de bajo peso molecular se desplazaron hasta un peso molecular más bajo. Veinticuatro horas después de comenzar la reacción, la mayoría de los picos de la mezcla en fase precoz 30 desaparecieron, y solamente se detectaron el tetrasacárido y el hexasacárido que eran los productos finales. Dicho modelo de degradación de los oligosacáridos observado junto con el transcurso del tiempo de tratamiento con hialuronidasa era el mismo que la digestión con hialuronidasa del ácido hialurónico auténtico, lo que sugiere que la fracción extraída del medio de BY-2 contenía el ácido hialurónico de alto peso molecular.

12. Infección de tabaco con la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene pBI121vcHI o pBI121vcKA 35

La transformación del tabaco (SR-1 de Nicotiana tabacum) se llevó a cabo según un procedimiento de discos foliares utilizando Agrobacterium (“Plant Biotechnology II” editado por Yasuyuki Yamada y Yoshimi Okada, Tokyo Kagaku Dojin, 1991). Los discos foliares esterilizados del tabaco se sumergieron durante 3 minutos en medio de cultivo de Agrobacterium que contiene pBI121vcHI o pBI121vcKA cultivados en 5 ml del medio LB que contiene 50 mg/l de kanamicina a 28ºC durante la noche. Las células microbianas sobrantes se 40 separaron a continuación en papel de filtro. Los discos foliares se colocaron en medio de diferenciación en el que se había añadido sacarosa al 3%, vitamina B5, 1 mg/ml de bencilaminopurina, 1 mg/ml de acetato de naftaleno y goma gelan al 0,3% a la sal inorgánica de MS (Murashige y Skoog) (Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15, 473) y el pH se había ajustado a 5,7, y se dejó en reposo en la oscuridad a 28ºC durante 2

días. Los discos foliares infectados se lavaron tres veces con agua esterilizada y se retiró el agua sobrante en el papel de filtro. Posteriormente, los discos foliares se dejaron en reposo en medio de diferenciación que contiene kanamicina (100 mg/l) y claforán (250 mg/l) y se provocó la formación de callos en la condición de 16 horas de luz a 25ºC. Tres semanas después de comenzar la inducción, se seleccionó el brote morfológicamente normal, se cortó en un estado que contenía tallos y hojas y se transfirió a un medio de 5 enraizamiento (sal inorgánica de MS, 3% de sacarosa, Vitamina B5 y goma gelan al 0,3%, pH 5,7) que contenía kanamicina (100 mg/l) y claforán (250 mg/l) para provocar enraizamiento en la condición de 16 horas de luz a 25ºC. Después de 2 semanas, el tallo enraizó se transfirió al medio de enraizamiento reciente, y se obtuvieron múltiples líneas con tallos y hojas en desarrollo.

13. Cuantificación del ácido hialurónico producido con tabaco transformado 10

Las hojas (aproximadamente 100 mg) de 6 líneas del tabaco transformado obtenido mediante la infección anterior con Agrobacyterium se transfirieron a un tubo de 2 ml y se pusieron en suspensión en 200 μl de tampón (que contiene Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM y 2-ME 10 mM) y se añadieron a esto 400 mg de perlas de zirconia (2 mm de diámetro). Las hojas de tabaco se pulverizaron meneando y agitando el tubo utilizando Bead Smash (Wakenyaku, BS-12) (2.500 rpm, 5 minutos). Se centrifugó (15.000 15 rpm, 10 minutos) una solución después de la pulverización y se recolectó el sobrenadante como una solución de extracto en bruto. La solución del extracto en bruto se diluyó 10 veces, y se utilizó como muestra para la cuantificación. La cuantificación del ácido hialurónico se realizó utilizando la placa “Chugai” (Fujirebio Inc.) con ácido hialurónico. Los resultados se muestran en la Tabla 4. El mismo tratamiento de pulverización se llevó a cabo utilizando hojas de una cepa natural de tabaco (natural) y simulada (tabaco transformado con pBI121), 20 que se utilizaron como referencia. Ya que el ácido hialurónico se detectó de forma significativa en una línea (nº 2) de vcAHS-KA, se confirmó también que el ácido hialurónico se produce también en la planta de tabaco obtenida mediante la transformación.

Tabla 4

Cuantificación del ácido hialurónico producido por tabaco transformado 25

Muestra: A450 Concentración de ácido hialurónico (ng/ml)

vcAHS-HI3, nº 1: 0,062 0

vcAHS-HI3, nº 2: 0,054 0

vcAHS-HI3, nº 3: 0,054 0

vcAHS-HI3, nº 4: 0,052 0

vcAHS-KA1, nº 1: 0,083 0

vcAHS-KA1, nº 2: 0,780 4.211

Simulada: 0,068 0

Natural: 0,057 0

Patrón de ácido hialurónico (0 ng/ml): 0,055 -

Patrón de ácido hialurónico (20 ng/ml): 0,090 -

Patrón de ácido hialurónico (50 ng/ml): 0,254 -

Patrón de ácido hialurónico (100 ng/ml): 0,337 -

Patrón de ácido hialurónico (200 ng/ml): 0,566 -

Patrón de ácido hialurónico (500 ng/ml): 0,840 -

14. Identificación de la transcripción de vcAHS en tabaco transformado

Se extrajo el ARN completo de las hojas de 6 estirpes del tabaco transformado obtenido por infección con Agrobacterium descrita anteriormente. La extracción del ARN completo se realizó utilizando el mini Kit NRneasy Plant (QIAGEN) según un protocolo adjunto. Las hojas (100 mg) se transfirieron a un mortero 30 enfriado intensamente con nitrógeno líquido, y se pulverizaron con una mano de mortero en nitrógeno liquido para preparar el polvo. Inmediatamente, las células pulverizadas se pusieron en suspensión en 450 μl de tampón RFT que contenía 2-mercaptoetanol al 1%, y se agitaron en un mezclador de remolinos. Esta solución pulverizada se transfirió a una columna de agitación QIAshredder, y la eliminación del deshecho celular y del homogeneizado se realizaron por centrifugación. Se agregó una cantidad media de etanol al sobrenadante 35 resultante de la solución pulverizada, y se transfirió a una mini columna RNeasy. Después, de acuerdo con el protocolo, el lavado y la elución se realizaron sucesivamente para extraer el ARN completo. El mismo tratamiento de pulverización se llevo a cabo utilizando las hojas de una cepa silvestre de tabaco (silvestre) y simulada (tabaco transformado con pBI121), que se utilizaron como referencia.

Posteriormente, se realizó la RT-RCP utilizando el ARN completo anterior como plantilla. Se sintetizó un ADNc de la 1ª cadena utilizando Rever Tra Ace-α- (Toyobo) procedente de 1 μg del ARN completo anterior y cebadores aleatorios según el protocolo. La RCP con el ADN de la 1ª cadena como plantilla se realizó utilizando KOD Dash ADN polimerasa (Toyobo) como ADN polimerasa mediante el programa de reacción de 30 ciclos (95ºC durante 30 segundos, 59ºC durante 2 segundos y 74ºC durante 30 segundos). Como 5 cebadores se utilizaron, el cebador en 5’ (SEC. ID. nº 3) y el cebador en 3’ (SEC. ID. nº 4). La figura 2 presenta el análisis RT-RCP para vcHAS en hojas de tabaco transformadas con electroforesis en gel de agarosa del ADN. Una banda ampliada transparente que tiene un tamaño correspondiente se detectó solamente en una línea de vcAHS-KA en la que la producción de ácido hialurónico se había observado entre las estirpes de tabaco transformadas con vcAHS, y se identificó la transcripción del gen de vcAHS. 10

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> TOYOBO RESEARCH CENTER CO., LTD.

<120> Ácido hialurónico sintasa 15

<130> P04-78

<150> JP2003-204896

<151> 2003-07-31 20

<150> JP2004-89135

<151> 2004-03-25

<160> 6 25

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1707 30

<212> ADN

<213> Chlorella virus

<400> 1

<210> 2

<211> 1707

<212> ADN 5

<213> Chlorella virus

<400> 2

<210> 3

<211> 40

<212> ADN 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

10

<400> 3

gccgccgcat atgggtaaaa atataatcat aatggtttcg 40

<210> 4

<211> 36 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 20

<400> 4

cttgcagtct agatcacaca gactgagcat tggtag 36

<210> 5 25

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30

<223> cebador

<400> 5

gtgtggaatt taaagcggat aacaatttca cacagg 36

<210> 6

<211> 24

<212> ADN 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 10

<400> 6

gggcgaattg gagctccacc gcgg 24

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la producción de ácido hialurónico, en el que (1) una célula de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presentan una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido 5 hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico, (2) se cultiva un transformado obtenido por dicha transformación, y (3) se separa el ácido hialurónico producido por dicho transformado.
2. Procedimiento para la producción de ácido hialurónico, en el que (1) una espermatofita, pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, 10 sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácido en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico, (2) se cultiva un transformado obtenido por dicha transformación, y (3) se separa el ácido hialurónico producido por dicho transformado.
3. Procedimiento para la preparación de una célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen que presenta capacidad de producción de ácido hialurónico, en el que una célula de espermatofita, 15 pteridofita, briofita o liquen, se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico.
4. Procedimiento para la preparación de una espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados 20 que presentan capacidad de producción de ácido hialurónico, en el que una espermatofita, pteridofita, briofita o liquen se transforma con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica una polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico. 25
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o un microorganismo.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la ácido hialurónico sintasa es del virus de chlorella.
7. Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen que presenta capacidad de 30 producción de ácido hialurónico, obtenida mediante la transformación de una célula de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica una polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico. 35
8. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados que presentan capacidad de producción de ácido hialurónico o una descendencia de los mismos, o un órgano de los mismos o un tejido de los mismos, obtenidos mediante la transformación de una/un espermatofita, pteridofita, briofita o liquen con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en 40 una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis de ácido hialurónico, en los que dichos descendencia, órgano o tejido comprenden el ADN mencionado en (i) o (ii).
9. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados o la descendencia de los mismos, o el órgano de los mismos o el tejido de los mismos según la reivindicación 8, en los que el órgano es uno o dos o más órganos seleccionados de entre una raíz, un tallo, un rizoma, una hoja, una flor, una semilla y un ápice del 45 brote.
10. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados o la descendencia de los mismos, o el órgano de los mismos o el tejido de los mismos según la reivindicación 8, en el que el tejido es uno o dos o más tejidos seleccionados de entre el grupo constituido por una epidermis, el floema, un parénquima, un xilema y un haz vascular. 50
11. Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen que produce ácido hialurónico sintasa, obtenida mediante la transformación de una célula vegetal con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o (ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico. 55
12. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados que producen ácido hialurónico sintasa o una descendencia de los mismos, o un órgano de los mismos o un tejido de los mismos, obtenidos mediante la transformación de una espermatofita, pteridofita, briofita o liquen con (i) un ADN que codifica la ácido hialurónico sintasa o ( ii) un ADN que codifica un polipéptido que presenta secuencia de aminoácidos que presenta una o más supresiones, sustituciones, adiciones o inserciones de aminoácidos en una secuencia de 5 aminoácidos de la ácido hialurónico sintasa y que presenta actividad de síntesis del ácido hialurónico, en los que dichos descendencia, órgano o tejido comprenden el ADN mencionado en (i) o (ii).
13. Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen según la reivindicación 7 u 11, en la que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o un microorganismo.
14. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados o la descendencia de los mismos, o el 10 órgano de los mismos o el tejido de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en los que la ácido hialurónico sintasa es de un vertebrado o de un microorganismo.
15. Célula transformada de espermatofita, pteridofita, briofita o liquen según la reivindicación 7 u 11, en la que la ácido hialurónico sintasa es del virus de chlorella.
16. Espermatofita, pteridofita, briofita o liquen transformados o la descendencia de los mismos, o el 15 órgano de los mismos o el tejido de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en los que la ácido hialurónico sintasa es del virus de chlorella.