ES2375962T3 - Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende: ligar covalentemente, a una temperatura de 65ºC, seroalbúmina bovina con la superficie funcionalizada de una micropartícula hecha de un polímero, resina polimérica, vidrio o látex, y ligar covalentemente moléculas de ácido nucleico que tienen extremos 3' o 5' funcionalizados con seroalbúmina bovina en los extremos 3' o 5' funcionalizados de las moléculas de ácido nucleico.

Description

Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención está en el campo de la química de polielectrolitos.

ANTECEDENTES

Como alternativa para resolver muchos de los problemas asociados al uso diagnóstico de “matrices punteadas”de oligonucleótidos (los problemas se esbozan en “Multianalyte Molecular Analysis Using Application-Specific RandomParticle Arrays”, solicitud de EE.UU. nº de serie 10/204.799, presentada el 23 de agosto de 2002; WO 01/98765), se forman matrices preferidas uniendo sondas oligonucleotídicas a partículas de microperlas codificadas, incluyendo partículas codificadas hechas de resina polimérica. Véase la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 10/271.602“Multiplexed Analysis of Polymorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-Mediated Detection”, presentada el 15 de octubre de 2002, y la nº de serie 10/204.799 anterior. Se ensamblan entonces los conjugados de partícula codificada-sonda en un formato de matriz bidimensional y se ponen en contacto con muestras que se prevé quecontienen polinucleótidos diana con subsecuencias complementarias de las sondas, en que los polinucleótidos diana en las muestras se marcaron fluorescentemente antes. Se determina la unión entre las sondas y las dianas mediante lapresencia de una señal de ensayo fluorescente. Las sondas particulares que generan una señal de ensayo positivapueden determinarse decodificando la matriz.

En Hirota y col. (documento US2002/0155481), se producen biochips planos en los que se inmovilizan sondas de ácido nucleico sobre una superficie funcionalizada. Puede añadirse seroalbúmina bovina como disolución reforzante para guiar a las sondas a los puntos de unión del chip antes del acoplamiento covalente de la sonda mediante técnicasestándares usando ácidos nucleicos modificados y superficies funcionalizadas.

En Trau y col. (documento WO02/12888), se describen micropartículas que tienen ligado covalentemente unpolielectrolito sobre una superficie funcionalizada y unida a la misma un ácido nucleico.

Hay varios procedimientos conocidos y comercialmente disponibles para el ligamiento de sondas oligonucleotídicas con microperlas. Se ha desarrollado un gran número de esquemas de inmovilización covalente desondas oligonucleotídicas en micropartículas y están disponibles en la bibliografía pública o comercialmente. Lastécnicas de inmovilización covalente tradicionales usan perlas funcionalizadas (concretamente, perlas funcionalizadascon grupos reactivos como amino, carboxilo, tosilo, aldehído, epóxido, hidrazida y otros) para ligar con gruposfuncionales complementarios en el extremo de sondas oligonucleotídicas (Maire K. Walsh, Xinwen Wang y Bart C.Weimer, “Optimizing the immobilization of single-stranded DNA onto glass beads”, J. Biochem. Biophys. Methods 2001;

47: 221-231). Muchas veces, dichos protocolos de unión conducen a una orientación inapropiada y a problemas deimpedimento estérico. El rendimiento de hibridación de dichas sondas inmovilizadas covalentemente puede mejorarsemediante la introducción de moléculas espaciadoras (Edwin Southern, Kalim Mir y Mikhail Shchepinov; “Molecular Interactions on Microarrays”. Nature Genetics Supplement, 21, 1999, pág. 5-9), sin embargo, la ejecución es a menudo difícil e impracticable.

Por lo tanto, una química de unión de sonda práctica y robusta es importante para el rendimiento óptimo de unensayo basado en matriz de microperlas. La química debe permitir a las sondas unirse a las partículas con alta eficacia para mantener una concentración consistente de sondas sobre la superficie de la perla y la reacción no debe alterartampoco la eficacia de la unión sonda-diana. Además, la reacción debe tener una variabilidad mínima de lote a lote. En un procedimiento usado habitualmente, se recubren las micropartículas funcionalizadas con neutravidina (Pierce, Rockford, Ill.), estreptavidina o avidina, que son proteínas de unión a biotina, para mediar la inmovilización de sondasbiotiniladas. La interacción de avidina-biotina es altamente específica y una de las más fuertes conocidas (con una

M-1

constante de asociación (KA) del orden de 1015 en disoluciones acuosas) y proporciona un ligamiento casiirreversible entre la proteína inmovilizada en la superficie de la perla y la molécula de sonda biotinilada. Véase lasolicitud de patente de EE.UU. nº de serie 10/271.602 anterior. El procedimiento descrito a continuación para unir sondas con polielectrolitos se prefiere a estos procedimientos conocidos porque se ha demostrado que es capaz deinducir el ligamiento de mayores números de oligonucleótidos a las perlas.

SUMARIO

La invención proporciona un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende: ligar covalentemente, a una temperatura de 65ºC, seroalbúmina bovina con la superficiefuncionalizada de una micropartícula hecha de polímero, resina polimérica, vidrio o látex y ligar covalentemente lasmoléculas de ácido nucleico que tienen extremos 3’ o 5’ funcionalizados con la seroalbúmina bovina en los extremos 3’

o 5’ funcionalizados de las moléculas de ácido nucleico.

Se inmoviliza un polielectrolito que tiene múltiples grupos funcionales expuestos, siendo cada grupo capaz de unirse covalentemente a una biomolécula, sobre una superficie con el fin de unirse a una biomolécula. La biomoléculaes un ácido nucleico, por ejemplo, un oligonucleótido funcionalizado con amina. La BSA (seroalbúmina bovina) estáunida a una superficie funcionalizada usando una estrategia de inmovilización covalente, por ejemplo, la reacción con lasuperficie de una micropartícula activada con tosilo. Después de dicha reacción, pueden utilizarse adicionalmentegrupos funcionales reactivos expuestos en la proteína, tales como grupos amina, carboxilo, tiol o hidroxilo, para acoplar covalentemente el oligonucleótido de interés usando una química adecuada.

En una realización, los oligonucleótidos modificados en posición terminal (la posición 3’ o 5’ terminal) conaminas (por ejemplo, oligonucleótidos modificados con amino) se unen covalentemente a BSA usando una reacción con EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (véase, por ejemplo, D. Seligal y col., Analytical Biochemistry 218: 87091 (1994)). La reacción covalente da como resultado la formación de un enlace amida entre el grupo amina en elextremo del oligonucleótido y grupos carboxilo en la BSA. La reacción se ilustra en la FIG. 1.

La superficie funcionalizada es la superficie de una perla o micropartícula, que puede estar compuesta por unaserie de materiales, incluyendo polímeros, resinas poliméricas, vidrio, látex u otros que pueden funcionalizarse para la inmovilización de un polielectrolito. Se efectuaron experimentos que comparaban perlas recubiertas con BSA con seroalbúmina humana (“HSA”), otro polielectrolito ejemplar, y también con neutravidina. Los resultados de los experimentos de hibridación indicaron que las perlas recubiertas con BSA eran capaces de ligar mayores concentraciones de oligonucleótidos con las perlas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 ilustra la unión de BSA a perlas funcionalizadas y la unión de una sonda oligonucleotídica a BSAusando una reacción con EDAC.

La Fig. 2 muestra las señales de hibridación de perlas oligofuncionalizadas acopladas con BSA en función de lacantidad de sonda aminada añadida para acoplamiento. Se ligó una sonda perfectamente coincidente a dos conjuntosde perlas acopladas con BSA. La BSA se acopló con el primer conjunto de perlas a 65ºC y con al segundo a 37ºC. Se observó una eficacia de hibridación mucho mayor (mayor señal) en el primer conjunto de perlas con las que se acopló laBSA a 65ºC. Un tercer conjunto de perlas acopladas con BSA a 65ºC y funcionalizadas con una sonda de control negativa no coincidente muestra una hibridación despreciable, indicando por tanto que la señal potenciada no es el resultado de una unión no específica aumentada.

La Fig. 3 muestra los resultados de valoración de perlas acopladas con BSA. Como en la Fig. 2, la eficacia dela hibridación es mayor para las perlas acopladas con BSA a mayor temperatura que a menor temperatura, como se demuestra por la diferencia en la señal de hibridación de una diana puesta en contacto con una sonda oligonucleotídicaunida a perlas acopladas con BSA en que la BSA se acopló con un conjunto de perlas a 37ºC y en que la BSA seacopló con otro conjunto de perlas a 65ºC (véase el ejemplo 4).

La Fig. 4 indica una diferencia en la eficacia de acoplamiento de BSA con perlas funcionalizadas con tosilo a diferentes temperaturas, como se determina usando un ensayo de hibridación, en que las sondas oligonucleotídicas se unen a BSA inmovilizada en las perlas y se hacen reaccionar entonces con una diana marcada fluorescentementecomplementaria (véase el ejemplo 6).

La Fig. 5 indica que para la incubación a 65ºC durante aproximadamente 1 hora, en la reacción de acoplamiento de BSA con perlas activadas con tosilo, la eficacia de unión de BSA con la superficie de las perlas no está afectada, como se demuestra por la diferencia en la señal de hibridación de una diana puesta en contacto con una sonda oligonucleotídica unida a perlas acopladas con BSA (véase el ejemplo 7).

La Fig. 6A muestra que las perlas funcionalizadas con tosilo recubiertas con BSA dan una señal de hibridaciónmás uniforme y fuerte, después de la unión de sondas y la hibridación con una diana, que una perla de tosilo recubiertacon neutravidina (véase el ejemplo 8).

La Fig. 6B muestra el coeficiente de variación de las señales en la Fig. 6A.

La Fig. 7 muestra una diferencia significativa en la hibridación cuando la HSA, en lugar de la BSA, es elpolielectrolito recubierto sobre perlas funcionalizadas con tosilo, en que las sondas oligonucleotídicas se unen, respectivamente, a BSA o HSA inmovilizada sobre perlas, y se hacen reaccionar entonces con una diana marcadafluorescentemente complementaria.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Ejemplo 1. Preparación de perlas funcionalizadas con tosilo recubiertas con BSA

Se prepara una disolución de BSA a una concentración de 5 mg/ml disolviendo 50 mg de BSA en 10 ml de PBS. Se añaden 2,0 ml de PBS-T a un tubo de centrífuga de 15 ml. Se transfiere 1 ml de perlas coloreadas porfluorescencia a una concentración de un 1% en sólidos (10 mg) al tubo de centrífuga y se mezcla bien con vórtice. Sesedimentan las perlas por centrifugación a 3.500 rpm durante 4 ± 0,5 minutos y se decanta el sobrenadante. Se resuspenden las perlas añadiendo 3,0 ml de PBST al tubo y se mezclan bien con vórtice. Se sedimentan de nuevo las perlas por centrifugación a 3.500 rpm durante 4 ± 0,5 minutos y se desecha el sobrenadante. Se añaden 3,0 ml de disolución de BSA (5 mg/ml) a las perlas y se mezclan bien con vórtice. Se disponen los tubos en un agitador en unaincubadora a 37ºC y se dejan reaccionar las perlas durante una noche con mezclado a 250 rpm.

Después de ello, se sedimentan las perlas por centrifugación a 3.500 rpm durante 4 minutos, y se desecha elsobrenadante. Se lavan entonces las perlas añadiendo 3,0 ml de PBS-T al tubo y se mezclan en un mezclador de vórtice. Se centrifugan de nuevo las perlas a 3.500 rpm durante 4 ± 0,5 minutos y se elimina por vertido el sobrenadante. Se repiten entonces las etapas de lavado y centrifugación.

Se añaden 3,0 ml de tampón de almacenamiento (PBS 0,1 M que contiene un 0,1% de NaN3) y se mezclan en un mezclador de vórtice. Se centrifugan de nuevo las perlas a 3.500 rpm durante 4 ± 0,5 minutos y se elimina por vertido el sobrenadante. Se resuspenden entonces las perlas en 1 ml de tampón de almacenamiento con vórtice. Las perlasestán a una concentración de un 1% en sólidos (10 mg/ml) y se almacenan a 4-6ºC. Están listas para el ligamiento conbiomateriales que contienen amina (por ejemplo BSA) mediante la reacción con EDAC, como se describe a continuaciónen el ejemplo 3.

Ejemplo 2. Preparación de perlas funcionalizadas con carboxilo recubiertas con BSA

Se lleva a cabo el acoplamiento de BSA con partículas carboxiladas como sigue. Se transfieren 100 il de partículas carboxiladas a una concentración de un 1% en sólidos a un tubo Eppendorf de 2 ml. Se precipitan entonceslas perlas por centrifugación y se retira el sobrenadante. Después de esto, se lavan las perlas 1 vez con 1 ml de tampón

5 MES (0,05 M) (pH 4,5). Separadamente, se preparan una disolución madre de BSA (5 mg de BSA/ml) en tampón MES y EDC (20 mg/ml) en tampón MES. Se añaden 100 µl de la disolución madre de BSA al sedimento de perlas y se mezcla bien la suspensión con vórtice. Después de esto, se añaden 400 µl de la disolución madre de EDC a la suspensión deperlas, se mezcla bien con vórtice y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h con mezclado rotativo. Después de 1 h de incubación, se añaden 100 µl de PBS-T a la suspensión y se centrifugan las perlas. Se lava elsedimento dos veces con 1 ml de PBS-T mediante un ciclo de centrifugación-redispersión y finalmente se suspenden lasperlas en 100 µl de tampón de almacenamiento (PBS 0,1 M que contiene 0,1% de azida de sodio, NaN3) y se almacena a 4-6ºC.

Ejemplo 3. Reacción con EDAC para el acoplamiento de sondas oligonucleotídicas aminadas con perlas de BSA

Se llevó a cabo como sigue el acoplamiento de sondas oligonucleotídicas aminadas con las perlas, preparadas

15 como en el ejemplo 1 y 2. Se tomaron una serie de tubos Eppendorf de 1,5 ml y se marcaron para identificar el tipo de micropartícula y la sonda oligonucleotídica para acoplar. Después de esto, se dispensaron 500 µl de PBST a cada tubo, seguido de 100 µl de perlas acopladas con BSA a una concentración de un 1% en sólidos. Se mezclaron bien los tuboscon un mezclador de vórtice durante 10 segundos. Se sedimentaron entonces las perlas a 9500 rpm durante 2 ± 0,5 miny se desechó el sobrenadante. Se añadió una alícuota de 500 µl de tampón MES 0,05 M (pH 4,5) al sedimento y semezcló bien con vórtice. Se centrifugaron entonces las perlas a 9500 rpm durante 2 ± 0,5 minutos y se desechó elsobrenadante. Se añadió una alícuota de 500 µl de EDAC 0,05 M en tampón MES (preparado justo antes del uso) a lasperlas y se mezcló bien con vórtice. Después, se añadieron 10 µl de cada sonda de ADN modificada con amino (porejemplo, la sonda MS-508 N25, adquirida en Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville IA) a una concentración 100µM a cada uno de los tubos que contenían las suspensiones de perla, y se mezcló bien. Se deja proceder la reacción

25 durante 1 h a temperatura ambiente (20-25ºC) con mezclado rotativo.

Después de la incubación, se añaden 100 µl de PBS-T a cada tubo y se mezcla con vórtice. Se sedimentanentonces las perlas en una centrífuga a 9500 rpm durante 2 ± 0,5 min y se desecha el sobrenadante. Se lavan entonces las perlas dos veces con 500 µl de PBS-T usando el ciclo de centrifugación-redispersión.

Se resuspenden las perlas en 100 µl de PBST-T para llevar la concentración final a un 1% en sólidos, y se almacenan a 4-6ºC para uso adicional.

Se muestra en la Fig. 2 el rendimiento de hibridación (véase el ejemplo 4 para el protocolo) de partículas funcionalizadas con oligonucleótido en función de la cantidad añadida de oligo (0,25, 0,4, 1, 2, 4, 8 µl de partículas o 100 µM/200 µg de partículas). La cantidad descrita anteriormente de 10 µl o 100 µM/1 mg representa por tanto una concentración de saturación.

35 También las perlas con BSA acoplada a mayor temperatura muestran un rendimiento de hibridación mejorado como se describe con más detalle a continuación.

Ejemplo 4. Ensayo de hibridación que usa perlas funcionalizadas con oligonucleótido

1.

Se ensamblan las mezclas de perlas en 8 chips diferentes. Se prepara una disolución diana madre de ADNmarcada fluorescentemente (MS508-CY5 de 90 unidades) en tampón de hibridación (1xTMAC). Se preparan 8 diluciones en serie diferentes a partir de la solución diana madre. Se añaden entonces 20 µl de cada una de las disoluciones diana diluidas en serie a los 8 chips separados.

2.

Se dispone un portaobjetos, que contiene los chips, en un calentador/agitador de hibridación, y se incuba a 55ºC durante 20 minutos a 100 rpm.

3. Se retira el portaobjetos, se enfría a temperatura ambiente y se retira la disolución de hibridación con la pipeta45 de transferencia.

4.

Se añaden 20 il de 1xTMAC a cada chip, y se lava el chip por pipeteado de la disolución de 8 a 10 veces.

5.

Se retira la disolución de lavado, se añaden 5 ml de disolución de montaje (1xTMAC) a cada chip y se lee la señal de ensayo (CY5) con un microscopio fluorescente usando un cubreobjetos.

6.

Se representa una curva de valoración de la señal de hibridación (CY5) frente a la concentración de sonda de ADN.

Se muestra en la Fig. 3 un ejemplo de curvas de valoración.

Ejemplo 5

Se realizaron experimentos para comparar el efecto de añadir EDAC a la suspensión de perla-sonda dos veces (EDAC es conocido por hidrolizar muy rápidamente a pH ácido) para valorar si esto conduce a una unión potenciada de 55 las sondas a la capa de BSA. En primer lugar, se acopló la sonda MS-508-N25 con perlas recubiertas con BSA en cada

una de las siguientes condiciones: (10 il de sonda 100 iM/100 il de 1% de perlas). Se retir

ó la mitad de las perlas delprimer tubo después de 1 hora de tiempo de reacción, se añadió EDAC reciente y la reacción procedió entonces en estetubo durante 1 hora adicional. Se repitió todo el proceso para la sonda no coincidente SSP 36. Se combinaron cadaconjunto de perlas con las perlas no específicas, se ensamblaron en un chip y se pusieron en contacto entonces todos los conjuntos con la diana MS 508-Cy5 de 40 unidades en condiciones de hibridación. Se registraron entonces los resultados y se resumen a continuación en la Tabla II. La adición de EDAC dos veces proporcionó señales de hibridación mayores.

Tabla II

Concentración de sonda

Señal Cy5 del ensayo modelo CV Señal Cy5 no específica CV

EDAC 1 vez

536,1 0,17 79,9 0,26

EDAC extra 2 veces

732,9 0,17 53,3 0,19

5 Ejemplo 6. Acoplamiento de BSA con perlas activadas con tosilo a diferentes temperaturas y sus características de hibridación

Se añadieron a cada uno de los 5 tubos de centrífuga de 15 ml 2,0 ml de PBS-T y 1 ml de perlas coloreadas por fluorescencia a una concentración de un 1% en sólidos (10 mg) y se mezclaron entonces las perlas con vórtice. Sesedimentaron las perlas por centrifugación a 3500 rpm durante 4 ± 0,5 minutos y se decantó el sobrenadante. Se

10 resuspendieron entonces las perlas en 3,0 ml de PBST, se mezclaron bien con vórtice y se sedimentaron de nuevo por centrifugación a 3500 rpm durante 4 ± 0,5 minutos. Se eliminó entonces el sobrenadante por vertido.

Se añadieron 2 ml de PBS (pH 7,2) y 1 ml de disolución de BSA (50 mg/ml en PBS) a cada tubo y semezclaron bien con vórtice. Se fijó la temperatura ambiente en una incubadora para cada uno de los tubos como sigue: tubo A-22ºC, tubo B-37ºC, tubo C-50ºC, tubo D-65ºC y tubo E-75ºC, y se dejaron reaccionar las perlas con BSA

15 durante 14 horas a la temperatura designada, con mezclado rotatorio. Se enfriaron entonces los tubos a temperatura ambiente, se sedimentaron las perlas por centrifugación a 3500 rpm durante 4 minutos y se eliminó el sobrenadante porvertido. Se lavaron entonces las perlas añadiendo 3,0 ml de PBST al tubo, se mezclaron en un mezclador de vórtice yse sedimentaron a 3500 rpm durante 4 ± 0,5 minutos. Se eliminó el sobrenadante por vertido.

Se añadió 1 ml de tampón de almacenamiento (PBS que contiene 0,1% de NaN3) y se mezclaron los tubos en20 un mezclador de vórtice. La concentración de perlas era de un 1% en sólidos (10 mg/ml). Se almacenaron las perlas acopladas con BSA a 4-6ºC.

Se conjugó la sonda oligonucleotídica biotinilada MS-508 N25 de 25 unidades con cada conjunto de perlas mediante el procedimiento de acoplamiento con EDAC descrito anteriormente. Se puso en contacto entonces cadaconjunto de perlas con una concentración fija de diana marcada (un oligonucleótido de 90 unidades marcado con Cy-5)

25 para la sonda en condiciones de hibridación. La cantidad de marcaje en las perlas se correlaciona con la concentración de sonda en las perlas.

Como se muestra en la Fig. 4, las perlas que se acoplaron con BSA a mayores temperaturas exhibieron másunión orientada a las sondas oligonucleotídicas exhibidas en la superficie de la perla. Esto indica que hay una mayorconcentración de sondas en la superficie de dichas perlas, lo que puede ser debido a que a 65ºC la BSA se

30 desnaturaliza y se abre, presentando más sitios de unión disponibles a las sondas.

Ejemplo 7. Comparación de un tiempo de incubación variable para el acoplamiento de BSA con partículas funcionalizadas con tosilo

Se realizó un experimento para estudiar el curso temporal de la reacción de acoplamiento de BSA en partículastosiladas. Siguiendo el mismo protocolo que en los ejemplos 1 y 5, se incubaron 12 tubos separados, que contenían 35 cada uno una mezcla de reacción de BSA-partículas de tosilo, a 65ºC en una estufa, y se incubó un tubo de control a 37ºC. Se sacó cada tubo después de un periodo de incubación predeterminado, se lavó y se acopló entonces con una sonda oligonucleotídica (incluyendo la sonda de control) siguiendo el procedimiento esbozado en el ejemplo 3. Después de esto, se efectuó una reacción de hibridación y se registró la intensidad del ensayo (véase el ejemplo 4). Se muestranlos resultados en la Fig. 5, que ilustra que la reacción de acoplamiento de BSA se completa esencialmente en menos de

40 una hora.

Ejemplo 8. Comparación con la química de acoplamiento biotina-avidina y recubrimiento con neutravidina convencional

Se llevó a cabo un experimento para comparar la eficacia de captura e hibridación de perlas oligoconjugadasfuncionalizadas con BSA con una perla biotinilada oligoconjugada con neutravidina. Se acoplaron las proteínas con la

45 superficie de la perla a 37ºC usando un protocolo como se expone en el ejemplo 1. Después de esto, se conjugaron los oligos biotinilados (y también aminados) con partículas (como en el ejemplo 3) y se llevó a cabo un ensayo dehibridación con una diana asociada.

Se tomaron dos partículas recubiertas con BSA codificadas diferentemente pero por lo demás idénticas y se unió una sonda coincidente con un grupo y se unió una sonda no coincidente con el otro grupo. De forma similar, se50 tomaron otras dos perlas funcionalizadas con neutravidina y se unieron a sondas biotiniladas coincidentes y no

coincidentes.

Se muestran los resultados del ensayo en las Fig. 6A y 6B. Es evidente que el recubrimiento con BSA proporciona una señal más uniforme (menor CV) y mayor relación de señal a ruido (la intensidad de hibridación en la sonda no coincidente se consideró como ruido) que la conseguida cuando se usa la química de captura de neutravidina.

Ejemplo 9. Comparación con recubrimiento con HSA

Se acopló HSA (seroalbúmina humana) en condiciones idénticas a las usadas para el acoplamiento de BSAcon partículas funcionalizadas con tosilo. Se acoplaron entonces las partículas funcionalizadas con HSA con sondas oligonucleotídicas y se hibridaron (valoraron) con una diana de ADN modelo marcada fluorescentemente (como en el

5 ejemplo 4). Se muestran los resultados en la Fig. 7. Se indica que el recubrimiento con HSA no es tan eficaz como el recubrimiento con BSA para la unión de las sondas oligonucleotídicas a pesar del hecho de que, como la BSA, la HSA tiene muchos grupos carboxilo funcionales disponibles para la unión a las sondas oligonucleotídicas.

Ejemplo 10. Variación entre lotes del acoplamiento de BSA

Se acoplaron separadamente tres lotes de 10 mg cada uno con BSA a 65ºC durante 14 horas, siendo la

10 relación de BSA-perla de 5 (p/p, mg/mg). El volumen de reacción para el acoplamiento era de 3 ml. Se acopló un lote de perlas con BSA a 37ºC para uso como control. Se determinó la eficacia de acoplamiento basándose en la intensidad deseñal para la hibridación de sondas de ADN acopladas con las perlas de dianas asociadas. Se realizó la hibridación a 55ºC durante 20 minutos en 1XTMAC, y la diana era MS508-CY5 de 90 unidades a una concentración 400 nM. Eltiempo de integración para la lectura del ensayo es de 200 ms. Se muestran los resultados en la Tabla I.

15 Tabla I

Lote

Intensidad de CY5 (100 ms)

1

6864

2

6515

3

6431

Control

3964

Los lotes a 65ºC tenían una intensidad consistentemente mayor que el lote acoplado a 37ºC y también lavariabilidad entre lotes era pequeña.

Los términos, expresiones y ejemplos anteriormente en la presente memoria son solo ejemplares y no 20 limitantes, y la invención se define solo en las reivindicaciones siguientes, e incluye todos los equivalentes de la materia en cuestión de las reivindicaciones.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de ligamiento de moléculas de ácido nucleico con una micropartícula que comprende:

   ligar covalentemente, a una temperatura de 65ºC, seroalbúmina bovina con la superficie funcionalizada de unamicropartícula hecha de un polímero, resina polimérica, vidrio o látex, y ligar covalentemente moléculas de ácido5 nucleico que tienen extremos 3’ o 5’ funcionalizados con seroalbúmina bovina en los extremos 3’ o 5’ funcionalizados de

   las moléculas de ácido nucleico.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico se unen a la seroalbúminabovina a través de un enlace amida, formado por una reacción con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
3. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la superficie de la micropartícula está funcionalizada con10 grupos funcionales tosilo.

4. 4.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las moléculas de ácido nucleico seligan a la seroalbúmina bovina a través de los grupos carboxilo o amino de la seroalbúmina bovina.

5. 5.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la molécula de ácido nucleico es unoligonucleótido.

   15 6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido se funcionaliza en su extremo 3’ o 5’ con un grupo amino primario.