ES2407857T5 - Nuevo gen de resistencia a los herbicidas - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Nuevo gen de resistencia a los herbicidas.

Antecedentes de la invencion

Las malas hierbas pueden agotar rapidamente los nutrientes valiosos para el suelo necesarios para los cultivos y otras plantas deseadas. Existen muchos tipos diferentes de herbicidas utilizados actualmente para el control de las malas hierbas. Un herbicida muy popular es el gliofosfato.

Diversos cultivos como el mafz, soja, canola, algodon, remolacha azucarera, trigo, arroz y cesped, han sido desarrollados para convertirlos en resistentes al glifosato. Asf, por ejemplo, es posible sembrar los campos con mafz resistente al glifosato para mantener a raya las malas hierbas sin causar danos importantes a las plantas de mafz.

A mediados de los anos 90, debido a las tecnicas de ingenierfa genetica surgieron los cultivos tolerantes al glifosato (GTC): con ellos los cultivadores tuvieron a su disposicion una herramienta sencilla, comoda, flexible y asequible para controlar una amplia gama de malas hierbas latifolias y gramfneas, nunca vista en agricultura. Los productores adoptaron rapidamente los GTC y, en muchos casos, abandonaron muchas de las mejores practicas agronomicas como la rotacion de cultivos, la rotacion en el mecanismo de accion del herbicida, el uso de mezclas en tanque y la incorporacion del control mecanico al control de las malas hierbas por medios qufmicos y culturales. En la actualidad, en Estados Unidos y en otros pafses del hemisferio occidental se pueden adquirir variedades comerciales tolerantes al glifosato de soja, algodon, mafz y canola, y otros cultivos GTC (trigo, arroz, remolacha azucarera, cesped, etc.) permanecen sin comercializar a la espera de ganar aceptacion en el mercado mundial. Muchas otras especies resistentes al glifosato se encuentran en fase de experimentacion o desarrollo (entre otras, alfalfa, cana de azucar, girasol, remolachas, guisantes, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, tomate y tabaco; especies forestales como el chopo y el arbol del ambar; y especies de horticulture ornamental como tagetes, petunias y begonias. Vease el sitio web isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005). Por si todo esto no bastara, el coste del glifosato ha disminuido drasticamente en los ultimos anos, hasta el punto de que son muy pocos los programas convencionales para el control de las malas hierbas que pueden competir en precio y rendimiento con los sistemas de GTC basados en el glifosato.

El glifosato es utilizado con exito desde hace mas de 15 anos en el desherbado qufmico de los campos y en otras aplicaciones no agrfcolas como medio de control total de la vegetacion. En muchos casos, como sucede con los GTC, ha sido utilizado 1-3 veces al ano durante 3, 5, 10 y hasta 15 anos seguidos. Tal proceder ha propiciado una excesiva dependencia del glifosato y de la tecnologfa de GTC que ha generado una gran presion selectiva en la flora arvense autoctona en favor de las plantas que de forma natural son mas tolerantes a el o que han logrado desarrollar un mecanismo de resistencia a su accion herbicida.

El uso generalizado de los programas de control de malas hierbas basados exclusivamente en el glifosato esta provocando la seleccion de variedades resistentes al mismo y facilitando la propagacion de las malezas que son mas tolerantes que la mayorfa de las especies diana; en otras palabras, esta generando cambios en la flora arvense. (Ng et al., 2003; Simarmata et al., 2003; Lorraine-Colwill et al., 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002). Con todo, a pesar del amplio uso del glifosato en todo el mundo durante mas de 15 anos, hasta el momento son contadas las malas hierbas en las que se ha detectado resistencia (Heap, 2005); la mayorfa de casos se han descubierto durante los ultimos 3-5 anos. Entre las malas hierbas resistentes se encuentran tanto gramfneas como latifolias: Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis y Plantago lanceolata. Asimismo, malezas que no habfan supuesto problema alguno hasta el uso generalizado de los GTC estan adquiriendo cada vez mas prevalencia y resultan mas diffciles de controlar en el contexto de los GTC, que abarca mas del 80% de la superficie cultivada de algodon y soja en Estados Unidos y mas del 20% de la superficie dedicada al mafz en ese mismo pais (Gianessi, 2005). Tales cambios en la flora arvense atanen predominantemente, aunque no en exclusiva, a especies latifolias de diffcil control como por ejemplo Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum y Commelina.

En aquellas zonas donde los cultivadores se enfrentan a malas hierbas resistentes al glifosato o a un cambio en la flora arvense favorable a las especies de mas diffcil control, es posible compensar la perdida de eficacia del glifosato mezclandolo en el tanque o alternandolo con otros herbicidas capaces de controlar las malas hierbas “descarriadas”. Un compatible en tanque eficaz y muy utilizado para el control de las latifolias recalcitrantes es el acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D). El 2,4-D se emplea desde hace mas de 60 anos en agricultura y en otras disciplinas como herbicida de amplio espectro contra las malas hierbas latifolias y, a pesar de que se han descrito casos esporadicos de tolerancia, sigue siendo uno de los herbicidas mas utilizados en el mundo. No obstante, una desventaja que limita su uso es su escasa selectividad en cultivos de dicotiledoneas como la soja o el algodon, motivo por el cual no suele aplicarse a cultivos de dicotiledoneas sensibles, ni siquiera en las proximidades de los mismos. Por otra parte, su empleo en los cultivos de cereales se ve limitado por la

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naturaleza de los danos que puede ocasionar. La combinacion de 2,4-D y glifosato ha sido utilizada como un potente tratamiento de desherbado qmmico antes de la siembra sin laboreo de la soja y el algodon, aunque debido a la sensibilidad de ambas dicotiledoneas al 2,4-D, este tipo de tratamientos debe ser aplicado al menos entre 14 y 30 dfas antes de la plantacion (Agriliance, 2003).

El 2,4-D pertenece a los herbicidas derivados del acido fenoxi, como MCPA, mecoprop y diclorprop. Ha sido utilizado en muchos cultivos de monocotiledoneas (mafz, trigo y arroz, entre otros) para el control selectivo de las malas hierbas de hoja ancha sin danar gravemente a las plantas del cultivo. El 2,4-D es un derivado auxmico sintetico que actua desregulando la homeostasis normal entre la celula y las hormonas e impide un crecimiento equilibrado y controlado; su mecanismo de accion no se conoce con exactitud.

El 2,4-D presenta diferentes grados de selectividad en ciertas plantas, de tal modo que las dicotiledoneas son mas sensibles a el que las grammeas. Las diferencias en el metabolismo del 2,4-D entre plantas distintas explican en parte los grados de selectividad. En general, las plantas lo metabolizan lentamente, de modo que las diferencias observadas en la respuesta de las plantas al mismo probablemente puedan explicarse por la actividad sobre el o los sitios diana (WSSA, 2002). La metabolizacion del 2,4-D en la planta suele acaecer en dos fases: hidroxilacion seguida de la conjugacion con aminoacidos o glucosa (WSSA, 2002).

Con el paso del tiempo, los microbios del suelo han desarrollado una via alternativa y eficaz para degradar el 2,4- D, lo que desemboca en la completa mineralizacion de este xenobiotico. Las reiteradas aplicaciones del herbicida seleccionan a los microbios que son capaces de emplearlo como fuente de carbono para crecer, atributo que les confiere una ventaja competitiva en el suelo. Por esta razon, actualmente el 2,4-D se formula para tener una vida media relativamente breve en el suelo, sin que se hayan detectado efectos residuales destacables en los cultivos ulteriores. Ello supone una ventaja anadida a su accion herbicida.

Un microorganismo ampliamente estudiado por su capacidad para degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). El gen que codifica a la responsable de la primera reaccion enzimatica en la via de mineralizacion del 2,4-D es el tfdA. Vease la patente US n° 6.153.401 y el N.° de entrada M16730 del Genbank. El tfdA cataliza la transformacion del acido 2,4-D en diclorofenol (DCP) a traves de una reaccion mediada por una dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al., 2001). El DCP posee una escasa actividad herbicida en comparacion con el 2,4-D. El gen tfdA se ha insertado en dicotiledoneas sensibles (por ejemplo, algodon y tabaco) para crear plantas transgenicas resistentes al 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993) y patente US n° 5.608.147).

En el medio ambiente se ha identificado un gran numero de genes de tipo tfdA que codifican protemas capaces de degradar el 2,4-D y que figuran depositados en la base de datos Genbank. Muchos homologos son similares al tfdA (identidad de aminoacidos >85%) y poseen propiedades enzimaticas semejantes a las de dicho gen. Con todo, existen ciertos homologos que guardan una identidad notablemente menor con el tfdA (del 25-50%), pero que a pesar de ello poseen los residuos caractensticos vinculados a las a-cetoglutarato dioxigenasas y las Fe+2 dioxigenasas. Por tanto, no es evidente cuales son las especificidades de sustrato de estas dioxigenasas divergentes.

Un ejemplo unico de escasa homologfa con el tfdA (identidad de aminoacidos del 28%) es el gen rdpA de Sphingobium herbicidovorans (Kohler et al., 1999, Westendorf et al., 2002). Esta enzima cataliza la primera reaccion del proceso de mineralizacion del (R)-diclorprop (y de otros acidos (R)-fenoxipropionicos) asf como del 2,4-D (un acido fenoxiacetico) (Westendorf et al., 2003). Las secuencias del gen rdpA bacteriano ha sido publicado con los n° de acceso de Genebank AJ628859, AF516751 Y AF516752. Desde hace tiempo se conocen microorganismos que degradan el acido fenoxipropionico, pero hasta hace poco no se habfa progresado en la caracterizacion de esta ruta (Horvath et al., 1990). Otra complicacion que anadir a la degradacion del diclorprop es la estereospecificidad (R frente a S) que afecta tanto a su captacion (Kohler, 1999) como a su oxidacion inicial (Westendorf et al., 2003). La expresion heterologa del rdpA en otros microbios o su transformacion en plantas permanecen ineditas hasta el momento. La bibliograffa se ha centrado sobre todo en los homologos cercanos al tfdA que degradan fundamentalmente los acidos fenoxiaceticos aquirales como el 2,4- D.

El desarrollo de nuevas tecnicas de cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) ha cosechado un escaso exito sobre todo debido a la eficacia, el bajo coste y la comodidad de los GTC, cualidades que les han granjeado una enorme aceptacion entre los productores y que ofrecen pocos incentivos para el desarrollo de las nuevas tecnicas de HTC.

Las subestructuras qmmicas de ariloxialcanoato son habituales en muchos herbicidas comerciales, incluidos los auxmicos fenoxi (como el 2,4-D y el diclorprop), los auxmicos piridiloxi (como fluoroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP), inhibidores de la acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (como haloxifop, quizalofop y diclofop) e inhibidores fenoxiacetato 5-sustituidos de la protoporfirinogeno IX oxidasa (como piraflufen y flumiclorac). No obstante, estos tipos de herbicidas son bastante distintos y la bibliograffa actual no

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aporta indicios de que compartan una via de degradacion comun. El documento 98/02562 divulga genes quimericos que son utilizados para la generacion de resistencia de plantas a varios herbicidas que comprenden los inhibidores HPPD y EPSPS. El descubrimiento de una enzima degradadora de herbicidas multifuncional que abarcase multiples modos de accion constituirfa un caracter unico y valioso para el uso en HTC.

Breve sumario de la invencion

La invencion objeto proporciona unos procedimientos de control de por lo menos una mala hierba en una zona segun la reivindicacion 1.

Son proporcionadas nuevas plantas que no solo son resistentes al 2,4-D, sino tambien a los herbicidas AOPP. Hasta el momento no habfa ninguna expectativa o indicio de que pudiera crearse una planta dotada de estas dos propiedades ventajosas por medio de la introduccion de un unico gen. Se incluyen asimismo unas plantas que producen una o varias enzimas de la presente invencion “apiladas” junto con uno o varios genes de resistencia a herbicidas, incluidos, entre otros, genes de resistencia al glifosato, a las imidazolinonas y al glufosinato, de tal forma que proporciona plantas tolerantes a herbicidas que son compatibles con un control de las malas hierbas mas amplio y mas potente y que ofrecen opciones para el manejo de la resistencia a los herbicidas. La presente invencion incluye ademas metodos y composiciones que utilizan homologos de los genes y de las protefnas ejemplificados en la presente memoria.

Estan previstas unas plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas tolerantes al 2,4-D, al AOPP y a uno o mas herbicidas comerciales (como por ejemplo, glifosato, imidazolinonas, glufosinato, sulfonilureas, dicamba, bromoxinilo y otros). Tambien se revelan vectores que comprenden secuencias de acidos nucleicos responsables de dicha tolerancia a herbicidas, asf como metodos para utilizar tales plantas tolerantes y combinaciones de herbicidas para controlar las malas hierbas y prevenir los cambios en la flora arvense. La presente invencion posibilita el uso de nuevas combinaciones de herbicidas de modos igualmente novedosos. Ademas, proporciona nuevos metodos para evitar el desarrollo y controlar estirpes de malas hierbas resistentes a uno o varios herbicidas, como el glifosato. La presente invencion permite nuevos usos de nuevas combinaciones de herbicidas y cultivos, como la aplicacion en presiembra, inmediatamente antes de la siembra de las semillas, con plantas que de otro modo serfan sensibles al herbicida en cuestion (como el 2,4-D).

Tambien se describe la identificacion de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-D, sino que sorprendentemente tambien posee propiedades novedosas que distinguen a dicha enzima de la presente invencion de otras protefnas tfdA conocidas hasta ahora, por ejemplo. Mas especfficamente, la presente invencion se refiere al uso de una enzima que es capaz de degradar tanto el 2,4-D como los herbicidas AOPP, de una manera enantioespecffica. Hasta el momento no se ha descrito ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que pueda degradar herbicidas pertenecientes a clases qufmicas diferentes y que esten dotados de mecanismos de accion distintos. En la presente memoria, la enzima y el gen preferidos para el uso con arreglo a la presente invencion se denominan AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa). Este descubrimiento sumamente novedoso ofrece oportunidades para servir de base a un cultivo tolerante a herbicidas (HTC) y como un caracter de marcador seleccionable.

No existfa motivacion alguna para producir plantas portadoras de un gen AAD-1 (preferiblemente un polinucleotido AAD-1 dotado de una secuencia optimizada para la expresion en uno o mas tipos de plantas, como se ejemplifica en la presente memoria) y no habfa expectativas de que tales plantas pudieran producir de manera efectiva una enzima AAD-1 que las convirtiera en resistentes tanto a herbicidas derivados del acido fenoxi (como el 2,4-D) como a herbicidas AOPP (como quizalofop, haloxifop, etc.). Por tanto, la presente invencion aporta numerosas ventajas que hasta el momento no se crefan posibles en la disciplina.

Asimismo, se describe la identificacion y el uso de genes que codifican enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa capaces de degradar herbicidas auxfnicos fenoxi y herbicidas ariloxifenoxipropionato. Se revelan metodos para buscar sistematicamente protefnas dotadas de esas actividades, incluida la degradacion del acido 2,4- diclorofenoxiacetico, de otros herbicidas auxfnicos de fenoxialcanoato y de herbicidas de ariloxifenoxipropionato mediante una enzima AAD-1 recombinante. Estan previstos asimismo unos metodos para el control de las malas hierbas que comprenden la aplicacion de uno o varios herbicidas AOPP, auxfnicos fenoxi, u otros herbicidas de ariloxialcanoato a plantas portadoras de un gen AAD-1. Tambien proporciona metodos para utilizar un gen AAD- 1 como un marcador seleccionable para identificar celulas vegetales y plantas enteras transformadas con AAD-1, que opcionalmente pueden incluir uno, dos o mas genes foraneos insertados simultaneamente en celulas vegetales diana. Los metodos de la presente invencion incluyen la seleccion de celulas transformadas que son resistentes a niveles apropiados de un herbicida. Ademas, se describen metodos para la preparacion de un polipeptido dotado de la actividad biologica de la ariloxialcanoato dioxigenasa mediante el cultivo de plantas y/o celulas de la presente invencion.

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Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra un esquema general de la degradacion que sufren los herbicidas auxfnicos fenoxi y AOPP por la accion de la dioxigenasa.

La figura 2 muestra la perdida de actividad herbicida de una solucion de 2,4-D tratada con AAD-1.

La figura 3 muestra la perdida de actividad herbicida de una solucion de haloxifop tratada con AAD-1.

La figura 4 representa los fenoles previstos producidos a partir de los herbicidas representantivos catalizados mediante AaD-1..

La figura 5 muestra la produccion de 2,4-diclorofenol por la accion del AAD-1 recombinante.

Las figuras 6A y 6B muestran la produccion de fenoles por la accion del AAD-1 recombinante a partir de varios sustratos herbicidas.

La figura 7 muestra la velocidad de la reaccion catalizada por la AAD-1 en funcion de la concentracion de sustrato con cuatro sustratos herbicidas distintos.

Las figuras 8A y 8B muestran que el AAD-1 (v3) se expreso por igual en hojas de Arabidopsis de distintas edades pero siguio acumulandose durante los 25 dfas del experimento. Las plantas que no fueron pulverizadas con el herbicida 2,4-D (panel A) expresaron un poco mas de AAD-1 (v3) que las que habfan sido pulverizadas (panel B). Las barras representan la media ± EEM de 5 hojas de 5 plantas distintas, con el porcentaje de expresion de la AAD-1 (v3) normalizado para la protefna total soluble. Las barras claras representan la tercera hoja joven (N-3) recogida de la parte superior de la planta, las barras oscuras representan la quinta hoja mas vieja de la parte inferior.

Las figuras 9A, 9B y 9C muestran las lesiones sufridas por plantas de Arabidopsis tras el tratamiento con 2,4- D. Cuatro lfneas distintas fueron tratadas con cuatro dosis distintas de 2,4-D y los danos causados se evaluaron 4 (panel A) y 14 (panel B) dfas despues del tratamiento. Tambien se determino la expresion de la AAD-1 (v3) en las hojas con ensayos ELISA (panel C). Los resultados corresponden a la media ± EEM de cinco hojas extrafdas de cinco plantas distintas que recibieron el mismo tratamiento.

La figura 10 ilustra que las plantas de Arabidopsis transformadas con pDAB3230 (AAD-1 + EPSPS) muestran un nivel de tolerancia al glifosato >14 veces mayor a los 7 DAT que las lfneas naturales y transformadas de Arabidopsis utilizadas como control.

La figura 11 muestra la dosis-respuesta al R-haloxifop en suspensiones de callos de mafz.

La figura 12 muestra que con una concentracion de fenoles derivados del cihalofop de 1 pM el crecimiento sigue siendo del 76%, tan alto como el control no expuesto a dichos fenoles.

La figura 13 ofrece los datos de dosis-respuesta de un evento transgenico, el 3404-006, expuesto a haloxifop.

La figura 14 muestra las respuestas de varios clones de eventos transformados y sin transformar con AAD-1 (v3) frente a dosis letales de dos herbicidas AOPP (haloxifop y quizalofop) aplicadas 1 semana antes en postemergencia.

La figura 15 muestra tres linajes T2 distintos hallados entre 3404 transformaciones que fueron preseleccionadas con Liberty® para eliminar los nulos. Los linajes fueron escogidos para comparar su tolerancia al quizalofop teniendo en cuenta su expresion de AAD-1. La expresion se midio a los 14 DAT (datos no mostrados) y a los 30 DAT.

La figura 16 muestra un mafz transformado con AAD-1 (v3) tolerante a 8X la dosis de campo de quizalofop (Assure II) en condiciones de campo.

La figura 17 ilustra los datos de embriones inmaduros de mafz cultivados en medios que contenfan cihalofop.

La Figura 18 muestra el analisis por transferencia Western de callos de soja transformados con el gen AAD-1 (V3) que indica que las celulas del callo estan expresando la protefna AAD-1 (v3).

La figura 19 compara las curvas ajustadas correspondientes a las velocidades de degradacion del 2,4-D con AAD-2 (v1) y AAD-1 (v1).

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La figura 20 muestra la respuesta de plantas de Arabidopsis Ti transformadas con el gen AAD-1 v3 (optimizado para vegetales) o AAD-1 (v2) (natural), AAD-2 (v1) (natural) o AAD-2 (v2) (optimizado para vegetales) frente a una gama de dosis de 2,4-D aplicadas en postemergencia. Cada maceta representa un evento de transformacion individual dentro de cada familia de genes Ti.

La figura 21 muestra los resultados de transferencias Western de plantas Ti de Arabidopsis transformadas con el gen AAD-2 (v1) natural. Demuestran que las plantas que expresan la protefna AAD-2 (v1) estan sufriendo graves danos a causa de los tratamientos con 2,4-D a 200 g e.a.(equivalente acido)/ha, que normalmente apenas causan dano alguno a las plantas de Arabidopsis transformadas con el AAD-1 (v2) natural o con el AAD-1 (v3) optimizado para vegetales. La protefna AAD-2 aparece identificada en el gel. En las muestras transformadas con AAD-2 y con Pat/Cry1F se detectaron varias bandas de fondo.

La figura 22 muestra que la actividad relativa de la AAD-2 (v1) sobre los sustratos fue:

2,4-D = diclorprop > (R,S)-haloxifop >> (R)-haloxifop.

Breve descripcion de las secuencias

La SEC ID n° 1 es la secuencia de un cebador directo utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (v1).

La SEC ID n° 2 es la secuencia de un cebador inverso utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (v1).

La SEC ID n° 3 es la secuencia de nucleotidos del AAD-1 (v1) de Sphingobium herbicidovorans.

La SEC ID n° 4 es la secuencia de acidos nucleicos del gen AAD-1 natural con la diana de restriccion interna para NotI eliminada. Este gen se designa AAD-1 (v2). La secuenciacion del ADN confirmo que se habfa generado el producto de PCR correcto, aunque se habfa producido un cambio inadvertido en el aminoacido n.° 212, que paso de arginina a cistefna.

La SEC ID n° 5 es una secuencia de ADN del gen AAD-1 (v3) “optimizada para vegetales”. Este “gen” codifica la

SEC ID n° 11, que es la misma que la SEC ID n° 9 salvo por la adicion de un residuo de alanina en la segunda

posicion. El codon adicional de alanina (GCT) se incorporo para codificar una diana para Nco I (CCATGG) que abarcaba desde el codon de inicio ATG, con el fin de posibilitar posteriores operaciones de clonaje.

La SEC ID n° 6 (“rdpA(ncoI)”) y la SEC ID n° 7 (“3' saci”) se usaron para amplificar un fragmento de ADN mediante el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter).

La SEC ID n° 8 es otro cebador de PCR (“BstEII/Del NotI”) que se uso con el cebador “3' SacI”.

La SEC ID n° 9 es la secuencia de aminoacidos natural codificada por el gen AAD-1 (v1) de Sphingobium herbicidovorans.

La SEC ID n° 10 es la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de ADN del AAD-1 (v2) de la SEC ID n° 4.

La SEC ID n° 11 es la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de ADN AAD-1 (v3) optimizada para vegetales de la SEC ID n° 5.

La SEC ID n° 12 es la secuencia de ADN del gen AAD-2 (v1) natural.

La SEC ID n° 13 es la secuencia de aminoacidos de la protefna AAD-2 (v1).

La SEC ID n° 14 es un cebador directo utilizado para amplificar el ADN de AAD-2 (v1) para clonacion.

La SEC ID n° 15 es un cebador inverso utilizado para amplificar el ADN de AAD-2 (v1) para clonacion.

La SEC ID n° 16 es el cebador directo de M13.

La SEC ID n° 17 es el cebador inverso de M13.

La SEC ID n° 18 es un cebador directo utilizado para amplificar el ADN del AAD-2 (v1) para clonacion.

La SEC ID n° 19 es un cebador inverso utilizado para amplificar el ADN del AAD-2 (v1) para clonacion.

La SEC ID n° 20 es la protefna EPSPS natural de la soja.

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La SEC ID n° 21 es una secuencia de la protefna EPSPS de la soja portadora de dos mutaciones: una mutacion en el residuo 183 (sustitucion de la treonina de la protefna natural por una isoleucina) y otra en el residuo 187 (sustitucion de la prolina de la protefna natural por una serina).

La SEC ID n° 22 es la secuencia de ADN adaptada a la soja que codifica la protefna EPSPS de la SEC ID n° 21. La SEC ID n° 23 es el cebador Pat 5-3.

La SEC ID n° 24 es el cebador Pat 3-3.

La SEC ID n° 25 es el cebador directo de la PTU de AAD-1.

La SEC ID n° 26 es el cebador inverso de la PTU de AAD-1.

La SEC ID n° 27 es el cebador directo para la PCR de la region codificante de AAD-1.

La SEC ID n° 28 es el cebador inverso para la PCR de la region codificante de AAD-1.

La SEC ID n° 29 es las secuencias de nucleotidos del AAD-2 (v2) (optimizado para vegetales).

La SEC ID n° 30 es la secuencia de la protefna AAD-2 (v2) traducida.

La SEC ID n° 31 es el cebador directo de AAD-1 para la PCR del fragmento de Southern.

La SEC ID n° 32 es el cebador inverso de AAD-1 para la PCR del fragmento de Southern.

Descripcion detallada de la invencion

El desarrollo de un gen de resistencia al 2,4-D y el subsecuente desarrollo de cultivos resistentes proporcionan excelentes opciones para el control de las malas hierbas latifolias y resistentes al glifosato (o muy tolerantes y modificadas) durante el cultivo. El 2,4-D es un potente herbicida contra latifolias, de amplio espectro y relativamente asequible que serfa de gran utilidad para los agricultores si a los cultivos, tanto de dicotiledoneas como de monocotiledoneas, se les pudiera conferir una mayor tolerancia al mismo. Los cultivos de dicotiledoneas transgenicas tolerantes al 2,4-D tambien ofrecerfan una mayor flexibilidad en cuanto al momento y la dosis de aplicacion. Otra virtud de un caracter de tolerancia a herbicidas, en este caso al 2,4-D, serfa su utilidad para prevenir danos en cultivos que normalmente son sensibles a la deriva, volatilizacion o inversion del 2,4-D (o cualquier otro fenomeno de desplazamiento fuera de lugar), aplicacion erronea, vandalismo y similares. Otro beneficio del gen AAD-1 es que, a diferencia de todos los homologos del tfdA caracterizados hasta el momento, la AAD-1 es capaz de degradar los R-enantiomeros (isomeros con actividad herbicida) de los herbicidas auxfnicos fenoxi quirales (por ejemplo, diclorprop y mecoprop) ademas de los auxfnicos fenoxi aquirales (como por ejemplo el 2,4-D, MCPA y acido 4-clorofenoxiacetico). Vease la Tabla 1. En todo el mundo se utilizan numerosas mezclas de diferentes combinaciones de herbicidas auxfnicos fenoxi para combatir espectros especfficos de malas hierbas en las diferentes condiciones ambientales imperantes. El uso del gen AAD-1 en vegetales conferirfa proteccion frente a una gama mucho mas amplia de herbicidas auxfnicos fenoxi, lo cual mejora la flexibilidad y el espectro de malas hierbas que pueden ser controladas y protege a los cultivos de la deriva y de otros danos causados por el desplazamiento fuera de lugar de los herbicidas fenoxi en toda la gama de fenoxi auxinas comerciales.

Tabla 1. Herbicidas auxfnicos fenoxi comerciales. Los herbicidas auxfnicos fenoxi suelen nombrarse con el acido activo, pero algunos se comercializan como formulaciones del ester correspondiente y estas tambien se consideran sustratos de la enzima AAD-1 en la planta puesto que las esterasas vegetales en general convierten dichos esteres en los acidos activos en la planta. Tambien se puede hacer alusion a la sal organica o inorganica del acido correspondiente. Cuando se aluda a herbicidas quirales, ya sea en forma de ester, sal o acido propionico, los enantiomeros racemicos (R,S) u opticamente puros (R o S) se consideraran el mismo herbicida a efectos de nombrar estos herbicidas, aunque los compuestos opticamente puros reciban numeros CAS distintos. Los rangos de dosificacion utilizables pueden corresponder a tratamientos individuales o en combinacion con otros herbicidas, tanto en aplicaciones agrfcolas como de otro tipo.

Tabla 1. Fenoxi auxinas disponibles comercialmente

Nombre

qufmico

N°CAS

Rangos de

dosificacion utilizables (g e.a./ha)

Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha)

Estructura

2,4-D

94-75-7

25 - 4000

280 - 1120

imagen1

2,4,5-T

93-76-5

25 - 4000

25 - 4000

imagen2

4-CPA

122-88-3

25 - 4000

25 - 4000

imagen3

3,4-DA

588-22-7

25 - 4000

25 - 4000

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MCPA

94-74-6

25 - 4000

125 - 1550

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Diclorprop

120-36-5

25 - 12000

100 - 2240

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Mecoprop

7085-19-0

25 - 4000

250 - 3360

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Cloprop

101-10-0

25 - 4000

25 - 4000

Tabla 1. Fenoxi auxinas disponibles comercialmente

Nombre quimico

N°CAS Rangos de dosificacion utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha) Estructura

XX i"' *■■■■ Cl ^0—CK—C

4-CPP

3307-39-9 25 - 4000 25 - 4000 XX r* / —-CH—C \)H

Fenoprop

93-72-1 25 - 4000 25 - 4000 Cl Cl.Jx XX ^ O1—en—c . ci Noh

3,4-DP

3307-41-3 25 - 4000 25 - 4000 ”XX f t Cl 0—-CH—C

Otro beneficio mas del gen AAD-1 es su capacidad sin precedentes para degradar simultaneamente una multitud de graminicidas comerciales y no comerciales pertenecientes a la clase general de los ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Vease la Tabla 2. Esta caracterfstica hace posible la utilizacion de una serie de compuestos AOPP en 5 cultivos transgenicos portadores del AAD-1, cultivos cuya tolerancia no era posible garantizar hasta ahora. Entre estos se hallan sobre todo cereales como el mafz, arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo, especies de cesped para clima templado y frfo, hierbas de pasto y muchas otras, pero tambien podrfa incluir cultivos de dicotiledoneas en que la tolerancia al AOPP (presente de forma natural en la mayorfa de las dicotiledoneas) no alcanza niveles comercialmente aceptables para permitir su uso.

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Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre comun aceptado. Los herbicidas AOPP se denominan en general por su acido activo, pero la mayorfa estan formulados comercialmente en diversas formulaciones de ester y estos tambien se consideran sustratos de la enzima AAD-1 en la planta, puesto que las esterasas vegetales en general convierten estos esteres en los acidos activos en la planta. Tambien se puede hacer

15 alusion a la sal organica o inorganica del acido correspondiente. Cuando se aluda a herbicidas quirales, ya sea en forma de ester, sal o acido propionico, los enantiomeros racemicos (R,S) u opticamente puros (R o S) se consideraran el mismo herbicida a efectos de nombrar estos herbicidas, aunque los compuestos opticamente puros reciban numeros CAS distintos. Los rangos de dosificacion utilizables pueden corresponder a tratamientos individuales o en combinacion, tanto en aplicaciones agrfcolas como de otro tipo.

Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre comun aceptado

Nombre quimico

N°CAS Rangos de dosificacion utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha) Estructura

Clorazifop

72492-94-7 10-2000 10-2000 ,<bou/:

Clodinafop

105512-06-9 10-2000 20-200

Clofop

59621-49-7 10-2000 10-2000

Cyhalofop

122008-85-9 10-2000 105-560

Diclofop

71283-65-3 10-2000 280-2000

Fenoxaprop

66441-23-4 10-2000 20-200

Fentiaprop

95721-12-3 10-2000 10-2000 . ■

Fluazifop

69335-91-7 10-2000 25-420

Haloxifop

69806-40-2 10-2000 20-600 •KVok

Isoxapirifop

87757-18-4 10-2000 30-240

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Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre comun aceptado

Nombre quimico

N°CAS Rangos de dosificacion utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha) Estructura

D

Metamifop

256412-89-2 10-2000 35-280

Propaquizafop

111479-05-1 10-2000 30-240

Quizalofop

76578-14-8 10-2000 20-240

Trifop

58597-74-4 10-2000 10-2000 DM

Se ha logrado identificar un gen unico (AAD-1) que, introducido mediante tecnicas de ingenierfa genetica para expression en vegetales, permite utilizar herbicidas auxfnicos fenoxi en plantas que o bien no poseen una tolerancia intrfnseca o bien resulta insuficiente para permitir su uso. Asimismo, el AAD-1 puede proteger a la planta contra los herbicidas AOPP en aquellos casos en que la tolerancia natural tampoco es suficiente para garantizar la selectividad. Las plantas que sean portadoras unicamente del AAD-1 podran ser tratadas de manera secuencial o simultanea con uno, dos o una combinacion de varios herbicidas auxfnicos fenoxi. La dosis de cada herbicida auxfnico fenoxi puede oscilar entre 25 y 4000 g e.a./ha, y mas habitualmente entre 100 y 2000 g e.a./ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas dicotiledoneas. De modo similar, se pueden aplicar uno, dos o una mezcla de varios graminicidas AOPP a plantas que expresan el AAD-1 con un menor riesgo de danos provocados por tales herbicidas. La dosis de cada AOPP puede oscilar entre 10 y 2000 g e.a./ha, y mas habitualmente entre 20-500 g e.a./ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas monocotiledoneas. Las combinaciones de tales clases qufmicas y herbicidas con distintos mecanismos de accion y espectros en el mismo campo (secuencial o simultaneamente en la mezcla de tanque) permitirfa controlar la mayorfa de malas hierbas que se pretenden controlar con herbicidas.

El glifosato es un herbicida muy utilizado porque controla un espectro amplfsimo de malas hierbas latifolias y gramfneas. No obstante, su uso reiterado en cultivos GTC y en otras aplicaciones no agrfcolas ha provocado, y continuara provocando, la seleccion de malas hierbas que son tolerantes naturales o biotipos resistentes al mismo. La mayorfa de las estrategias para la prevencion de la resistencia a herbicidas propugnan como metodo para retrasar la aparicion de malezas resistentes la adicion a la mezcla de tanque de otros herbicidas dotados de mecanismos de accion distintos, en dosis que permitan controlar la especie en cuestion. El apilamiento del AAD- 1 con un caracter de tolerancia al glifosato (y/o con otros caracteres de tolerancia a herbicidas) podrfa proporcionar un mecanismo para controlar las malas hierbas resistentes al glifosato (ya sean gramfneas por medio de uno o varios herbicidas AOPP, o dicotiledoneas con uno o varios auxfnicos fenoxi) en GTC al permitir el uso del glifosato y de uno o varios herbicidas auxfnicos fenoxi (por ejemplo, el 2,4-D) y AOPP (por ejemplo, quizalofop) de manera selectiva en el mismo cultivo. Las aplicaciones de estos herbicidas podrfan ser simultaneas, con una mezcla de tanque que contenga dos o mas herbicidas con diferentes mecanismos de accion; aplicaciones individuales de una sola composicion herbicida en aplicaciones secuenciales en presiembra,

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preemergencia o postemergencia y fraccionamiento de las aplicaciones entre 2 horas y 3 meses; o, alternativamente, se puede aplicar cualquier combinacion de cualquier numero de herbicidas representativos de cada clase qufmica en cualquier momento en el plazo de 7 meses desde la siembra del cultivo hasta la cosecha (o el intervalo de seguridad antes de la cosecha del herbicida, el que sea mas corto).

El control de un amplio espectro de malas hierbas gramfneas y latifolias requiere disponer de flexibilidad en terminos del calendario de aplicacion, dosis de herbicidas y capacidad para controlar malezas diffciles o resistentes. Las aplicaciones de glifosato en un cultivo portador de un apilamiento de gen de resistencia al glifosato/AAD-1 podrfan oscilar entre 250-2500 g e.a./ha; la del o los herbicidas auxfnicos fenoxi entre 25-4000 g e.a./ha; y la del o los herbicidas AOPP entre 10-2000 g e.a./ha. Las combinaciones y el calendario de aplicacion mas adecuados dependen de cada situacion, de las especies implicadas y del entorno, decisiones que corresponden a un experto en control de malas hierbas que conozca los pormenores de esta invencion.

Las formulaciones herbicidas (por ejemplo, formulacion de ester, acido o sal; o concentrado soluble o emulsificable, o lfquido soluble) y los aditivos para la mezcla en tanque (por ejemplo, adyuvantes o agentes de compatibilidad) pueden modificar sustancialmente la capacidad del herbicida o de una combinacion de ellos para controlar las malas hierbas. Cualquier combinacion de los anteriores con cualquiera de las clases qufmicas de herbicida citadas queda incluida en el alcance de esta invencion.

Un experto en la materia tambien sabra apreciar que el beneficio ofrecido por la combinacion de dos o mas mecanismos de accion para aumentar el espectro de malas hierbas controladas y/o controlar especies que de forma natural son mas tolerantes o resistentes tambien puede hacerse extensible a aquellas clases qufmicas de herbicidas a las que los cultivos son tolerantes merced a la accion humana (por metodos transgenicos y de otro tipo) y que trascienden los GTC. Asf pues, los caracteres que codifican la resistencia al glifosato (por ejemplo los genes de resistencia vegetales o bacterianos EPSPS, GOXy GAT), resistencia al glufosinato (por ejemplo Pat, bar), resistencia a herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) (por ejemplo imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos y otras clases qufmicas = AHAS, Csr1, SurA, etc.), resistencia a bromoxinilo (por ejemplo Bxn), resistencia a inhibidores de la enzima HPPD (4-hidroxifenil- piruvato-dioxigenasa), resistencia a inhibidores de la fitoeno desaturasa (PDS), resistencia a herbicidas inhibidores del fotosistema II (por ejemplo psbA), resistencia a herbicidas inhibidores del fotosistema I, resistencia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno IX oxidasa (PPO) (por ejemplo PPO-1), resistencia a herbicidas fenilureicos (por ejemplo CYP76B1), enzimas degradadores de dicamba (vease, por ejemplo US 20030135879) y otros se podrfan apilar solos o en multiples combinaciones a fin de conferir la capacidad para controlar o evitar los cambios en la flora arvense y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases citadas.

Por lo que respecta a otros herbicidas, algunos inhibidores de ALS preferidos son las triazolopirimidina sulfonanilidas (como cloransulam-metil, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (como bispiribac y pirithiobac) y flucarbazona. Algunos inhibidores de HPPd preferidos son mesotriona, isoxaflutola y sulcotriona. Algunos inhibidores de PPO preferidos son flumiclorac, flumioxazin, flufenpir, piraflufen, fluthiacet, butafenacilo, carfentrazona, sulfentrazona y los difenileteres (como acifluorfen, fomesafen, lactofen y oxifluorfen).

Ademas, el AAD-1 solo o apilado con uno o varios caracterfsticas de HTC , se puede combinar con otros caracteres agronomicos (resistencia a insectos o a hongos, tolerancia al estres, etc.) o de calidad (mayor rendimiento, mejor perfil de aceites, mejor calidad de la fibra, etc.). Por tanto, la presente invencion puede formar parte de un paquete agronomico completo destinado a mejorar la calidad del cultivo, con la ventaja de aportar un control flexible y rentable de cualquier numero de plagas agronomicas.

Se describe la identificacion de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-D, sino que sorprendentemente tambien posee propiedades novedosas que la diferencian de las protefnas tfdA conocidas hasta el momento, por ejemplo. Aunque esta enzima presenta una homologfa muy baja con el tfdA, los genes utilizados se pueden clasificar en general en la misma familia general de las dioxigenasas dependientes de a- cetoglutarato. Esta familia de protefnas se caracteriza por tres residuos de histidina conservados en un motivo “HX(D/E)X23-26(T/S)X114-183HX10-13R” que comprende el centro activo. Las histidinas coordinan el ion Fe+2 en el centro activo que resulta esencial para la actividad catalftica (Hogan et al., 2000). En la presente memoria se comentan experimentos preliminares de expresion in vitro que fueron modificados a proposito para ayudar a seleccionar los atributos novedosos.

Mas especfficamente, la presente invencion se refiere en parte al uso de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-D, sino tambien herbicidas AOPP. Hasta el momento no se habfa descrito ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato capaz de degradar herbicidas de diferentes clases qufmicas y con distintos mecanismos de accion. Las enzimas y genes preferidos para el uso con arreglo a la presente invencion se denominan en la presente memoria genes y protefnas AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa).

Asimismo, se describe la identificacion y el uso de genes que codifican enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa

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capaces de degradar herbicidas auxfnicos fenoxi y ariloxifenoxipropionato, acido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros herbicidas auxfnicos fenoxialcanoicos y herbicidas ariloxifenoxialcanoato por la accion de una enzima AAD-1 expresada con tecnicas de ADN recombinante.

Las protefnas fueron sometidas a ensayos analfticos y biologicos para comprobar que, efectivamente, catalizaban la conversion del 2,4-D en 2,4-diclorofenol (“DCP”; sin actividad herbicida). Las protefnas parcialmente purificadas de la presente invencion pueden convertir rapidamente el 2,4-D en DCP (la conversion oscila entre el 50-100%) en condiciones in vitro. Otra ventaja de las plantas transformadas con AAD-1 es que los compuestos herbicidas originales son metabolizados y transformados en formas inactivas, reduciendo las posibilidades de hallar residuos en el grano o el forraje.

La presente invencion incluye metodos para el control de malas hierbas que comprenden la aplicacion de un herbicida AOPP y/o un herbicida auxfnico fenoxi a plantas que comprenden un gen AAD-1.

A partir de estos descubrimientos, ahora se facilitan nuevas plantas que comprenden un polinucleotido que codifica este tipo de enzima. Hasta el momento no habfa motivacion alguna para producir tales plantas y no habfa expectativas de que tales plantas pudieran producir efectivamente esta enzima para convertirlas en resistentes no solo a herbicidas fenoxi (como el 2,4-D) sino tambien a herbicidas AOPP. Por tanto, la presente invencion proporciona muchas ventajas que hasta el momento no se habfan crefdo posibles en la disciplina.

Es posible adquirir y analizar cepas accesibles publicamente (depositadas en colecciones de cultivos como ATCC o DSMZ) por medio de las tecnicas reveladas en la presente memoria para buscar nuevos genes. Las secuencias mostradas en la presente memoria pueden ser utilizadas para amplificar y clonar los genes homologos en un sistema de expresion recombinante con objeto de realizar mas busquedas sistematicas y ensayos con arreglo a la presente invencion.

Tal y como se ha comentado en el apartado de antecedentes, un microorganismo muy estudiado por su capacidad para degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). El gen que codifica la primera enzima de la via de degradacion es el tfdA. Vease la patente US n° 6.153.401 y la entrada N.° M16730 del Genbank. El tfdA cataliza la conversion del acido 2,4-D en el DCP, carente de accion herbicida, a traves de una dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al., 2001). Este gen ha sido utilizado en plantas transgenicas para conferir resistencia frente al 2,4-D en plantas dicotiledoneas (por ejemplo algodon y tabaco) que normalmente son sensibles al mismo (Streber et al., 1989; Lyon et al., 1989; Lyon et al., 1993). En el medio ambiente se ha identificado un gran numero de genes de tipo tfdA que codifican protefnas capaces de degradar el 2,4-D y que figuran depositados en la base de datos Genbank. Muchos homologos son bastante similares al tfdA (identidad de aminoacidos >85%) y poseen propiedades enzimaticas semejantes a las de dicho gen. Con todo, se conoce un pequeno conjunto de homologos de la a-cetoglutarato dioxigenasa que guardan un bajo nivel de homologfa con el tfdA.

El gen RdpA, procedente de Sphingobium herbicidovorans (Westendorf et al., 2002), es un ejemplo singular de baja homologfa (identidad de aminoacidos 28%). Se ha demostrado que esta enzima cataliza la primera etapa del proceso de mineralizacion del (R)-diclorprop (y de otros acidos (R)-fenoxipropionicos) asf como del 2,4-D (un acido fenoxiacetico) (Westendorf et al., 2003). Desde hace tiempo se conocen microorganismos que degradan el acido fenoxipropionico, pero hasta hace poco no se habfa progresado en la caracterizacion de esta ruta (Horvath et al., 1990). Otra complicacion que anadir a la degradacion del diclorprop es la estereospecificidad (R frente a S) que afecta tanto a su captacion (Kohler, 1999) como a su oxidacion inicial (Westendorf et al., 2003). La expresion heterologa del rdpA en otros microbios, o la transformacion de este gen en plantas, permanecen ineditas hasta el momento. La bibliograffa se ha centrado sobre todo en los homologos cercanos al tfdA que degradan fundamentalmente los acidos fenoxiaceticos aquirales. No se esperaba previamente que los genes RdpA o AAD- 1 pudieran ser expresados satisfactoriamente en plantas para proporcionar las plantas resistentes al 2,4-D (sin mencionar la resistencia a AOPP completamente sorprendente).

Como se describe con mas detalle en los ejemplos de las paginas siguientes, el rdpA de Sphingobium herbicidovorans se clono y se analizo con varias clases qufmicas de herbicidas para determinar su promiscuidad de sustrato. Ya se habfa demostrado que esta enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato purificada en su forma natural degrada el 2,4-D y el diclorprop (Westendorf et al., 2002 y 2003), pero no se habfa descrito que una enzima de su tipo tuviera la capacidad de degradar herbicidas de diferentes clases qufmicas y distintos mecanismos de accion. El rdpA nunca se habfa expresado en plantas, ni existfa motivacion para hacerlo porque el desarrollo de nuevas tecnicas de cultivos HTC se ha visto limitado en gran medida por la eficacia, el bajo costo y demas ventajas ofrecidas por los cultivos GTC (Devine, 2005).

A partir de esta actividad novedosa, las protefnas y los genes de la presente invencion se denominan en la presente memoria protefnas y genes AAD-1. En poco tiempo se confirmo que la AAD-1 degradaba in vitro diversos herbicidas auxfnicos fenoxiaceticos y fenoxipropionicos. Pero, tal y como se describe por primera vez en la presente memoria, sorprendentemente tambien se descubrio que era capaz de degradar otros sustratos

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pertenecientes a la clase de las moleculas de ariloxialcanoato. Los graminicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP) son sustratos de notable importancia agronomica. Este descubrimiento sumamente novedoso ofrece oportunidades para servir de base a un cultivo tolerante a herbicidas (HTC) y como un caracter marcador seleccionable.

En la presente memoria se describe que los graminicidas AOPP de amplio espectro son excelentes sustratos de la AAD-1, al igual que el 2,4-D, el diclorprop y otros herbicidas auxfnicos fenoxi. Esta enzima es unica por su capacidad para degradar una amplia gama tanto de latifolicidas de amplio espectro (herbicidas auxfnicos fenoxi) como de graminicidas de amplio espectro muy activos (AOPP).

Por tanto, la presente invencion se refiere en parte a la degradacion del acido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros herbicidas auxfnicos fenoxialcanoicos y herbicidas de ariloxifenoxialcanoato mediante la expresion por tecnicas recombinantes de una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1). Tambien se revela la identificacion y los usos de genes que codifican una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa degradadora (AAD-1), capaz de degradar herbicidas auxfnicos fenoxi y ariloxifenoxipropionato.

La expresion transgenica de la enzima confiere tolerancia a combinaciones de herbicidas que podrfan controlar la practica totalidad de malas hierbas latifolias y gramfneas. El AAD-1 puede actuar como una excelente caracterfstica para cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) que es posible apilar con otras caracterfsticas de HTC (resistencia a glifosato, resistencia a glufosinato, a imidazolinona, a bromoxinilo, etc.) y caracteres de resistencia a insectos (Cry1F, Cry1Ab, Cry 34/45, etc.) por ejemplo. Asimismo, el AAD-1 puede servir como un marcador seleccionable util para la seleccion de transformantes primarios de plantas geneticamente modificadas con un segundo gen o grupo de genes.

Ademas, el gen microbiano ha sido redisenado de modo que la protefna esta codificada por codones que son utilizados preferentemente por plantas, tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas (hemicot). Plantas de Arabidopsis, mafz, tabaco, algodon, soja, canola y arroz han sido transformadas con constructos que contenfan el AAD-1 y han demostrado altos niveles de resistencia tanto a herbicidas auxfnicos fenoxi como AOPP. Como se muestra a continuacion en el Ejemplo 6, el gen reconstruido a modo de ejemplo resulto mas eficaz que el gen bacteriano a la hora de conferir a la planta la resistencia contra herbicidas.

Los grupos oxialcanoato son utiles para introducir en los herbicidas una funcionalidad de acido estable. El grupo acido puede facilitar el desplazamiento por el floema gracias al “atrapamiento acido”, un atributo deseable para la accion herbicida y que podrfa incorporarse a nuevos herbicidas para mejorar su movilidad. Ciertos aspectos de la presente invencion tambien proporcionan un mecanismo para crear HTC. Existen muchos herbicidas comerciales y experimentales que podrfan servir como sustratos de la AAD-1. Por ello, el uso de los genes de interes tambien podrfa conferir tolerancia a esos otros herbicidas.

Los caracteres HTC de la presente invencion pueden ser utilizadas en combinaciones novedosas con otros caracterfsticas HTC (como, por ejemplo, la tolerancia al glifosato). Tales combinaciones de caracteres dan lugar a metodos novedosos para controlar las malas hierbas (y especies similares), gracias a la nueva resistencia adquirida o a la tolerancia intrfnseca a los herbicidas (por ejemplo al glifosato). Por consiguiente, ademas de los caracteres HTC, dentro del alcance de la invencion quedan incluidos nuevos metodos para el control de las malas hierbas con herbicidas, en que la tolerancia a estos se crea mediante la citada enzima en cultivos transgenicos.

Por su parte, los cultivos tolerantes al glifosato predominan en todo el mundo. Cultivados muchas veces en rotacion con otros cultivos tolerantes al glifosato, el control de los ricios resistentes al glifosato puede resultar diffcil en los cultivos rotativos. Por ello, el uso de los caracteres transgenicos de la presente invencion, apilados o insertados individualmente en los cultivos, proporciona una herramienta para controlar otros cultivos HTC que aparecen como ricios.

Esta invencion se puede aplicar en el contexto de la comercializacion de un caracter de resistencia al 2,4-D apilado con caracteres ya disponibles de resistencia al glifosato en plantas de soja, por ejemplo. Por ello, la presente invencion proporciona una herramienta para combatir los cambios en las arvenses latifolias y/o la seleccion de latifolias resistentes a herbicidas, consecuencias del intensfsimo uso del glifosato contra las malas hierbas en diversos cultivos.

La expresion transgenica de los genes AAD-1 de interes se ha logrado, entre otros ejemplos, en Arabidopsis, mafz, tabaco, algodon, arroz, soja y canola, lo que no obsta para que la presente invencion pueda aplicarse en cualquier otro tipo de plantas deseado. La soja es un cultivo preferido para la transformacion con arreglo a la presente invencion. No obstante, esta invencion puede ser aplicada a otros muchos cultivos de gramfneas y latifolias. De igual forma, el 2,4-D puede ser utilizado mejor en cultivos de gramfneas cuya tolerancia al mismo es moderada y en los que la mejora de dicha tolerancia por medio de este caracter proporcionarfa a los cultivadores la oportunidad de utilizar el 2,4-D en dosis mas eficaces y durante mas tiempo sin riesgo de danar el cultivo.

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Es mas, la presente invencion utiliza un unico gen que puede proporcionar resistencia a herbicidas que controlan malas hierbas de hoja ancha (auxmicos) y grammeas (AOPP). Este gen podna ser utilizado en multiples cultivos, lo que permetina el uso de una combinacion de herbicidas de amplio espectro. La presente invencion tambien puede controlar las malas hierbas resistentes a los herbicidas disponibles y ayudar a controlar los cambios en la flora arvense causados por las practicas agronomicas actuales. La AAD-1 de interes tambien puede ser utilizada para neutralizar con eficacia otros sustratos herbicidas transformandolos en compuestos sin actividad herbicida. Por todo ello, la presente invencion facilita el desarrollo de otros caracteres para HTC y/o de tecnicas de marcadores seleccionables.

Con independencia del uso de los genes de interes para producir HTC, o como un anadido al mismo, los genes de interes tambien se pueden utilizar como marcadores seleccionables para seleccionar los transformantes en cultivos celulares, en invernadero o en el campo. Los genes de interes poseen un gran valor intrmseco simplemente como marcadores seleccionables para proyectos de biotecnologfa. La promiscuidad de la AAD-1 frente a otros herbicidas auxmicos fenoxialcanoicos brinda muchas oportunidades para utilizar este gen en aplicaciones de HTC y/o como marcador seleccionable.

Un gen, denominado en la presente memoria AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa), se clono de Sphingobium herbicidovorans (ATCC 700291) mediante una PCR en pET 280-S/S (designado pDAB 3203) y se expreso en E.coli BL-21 Star. Cuando este gen se sobreexpresa (induccion con IPTG 1 mM y lisado de cultivo combinado con la siguiente mezcla de reaccion: 2,4-D 112,5 pg/ml, acido ascorbico 1 mM, a-cetoglutarato 1 mM, Fe(NH4)2(SO4)2 50 pM), la enzima recombinante resultante degrada el 2,4-D transformandolo en DCP, compuesto que carece de actividad herbicida (determinado por HPLC, espectrometna de masas, colorimetna y bioanalisis en placa con Arabidopsis). Ademas, se ha demostrado que la AAD-1 convierte los siguientes herbicidas en su correspondiente fenol inactivo: diclorprop, mecoprop, haloxifop, diclofop y otros (veanse las Tablas 3 y 4).

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Tabla 3. Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varios compuestos auxfnicos y analogos auxfnicos dotados de accion herbicida

ESTRUCTURA

ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x)

yCp~ a

117613 (R,S)-diclorprop 0,566 2,594 398166 sesona 0,02 0,177

188874 (R,S)-mecoprop 0,341 2,085 190252 0,008 0,211

a

83293 (R,S)-2-cloro, 4-fluorofenoxi-proprionato 0,304 2,358 yjy- o 124988 0,007 0,058

0H

11113675 (R,S)-3-aminodiclorpop 0,228 2,676 •* r 11263526 0,004 0,069

ie

188476 0,077 0,687 178577 0,003 0,021

a

192132 0,064 0,204 v-v^r 178587 0,003 0,02

y«xy a

195517 2,4-D 0,034 0,383 o 188527 0,003 0,036

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Tabla 4. Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varios graminicidas AOPP y analogos y sobre cloquintocet.

ESTRUCTURA

ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x)

18706 (R)-quizalofop 0,43 2,1 460511 (R,S)-diclofop 0,155 1,663

■XC'Oja3t’

67131 (R.S)-fluazifop 0,427 2,17 a 25646 0,144 1,69

« OH w

11044492 (R)-fenoxaprop 0,408 0,597 70222 (R,S)-clorazlfop 0,128 1,584

a

34697 (R,S)-clodinofop 0,295 1,98 -EC 199608 cihalofop 0,114 1,26

14603 (R)-cihalofop 0,222 1,989 a 43865 haloxifo p-oxiacetato 0,004 0,053

14623 (R,S)-cyhalofop 0,215 1,815 7466 (S)-cihalofop 0,003 0,017

62942 (R,S)-fenthiaprop 0,199 1,055 204558 Cloquintocet 0 0,001

66905 haloxifop 0,172 1,63

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Proteinas (y aislamientos fuente).

La presente invencion utiliza proteinas funcionales. Por “actividad funcional” (o “activo/a”) se entiende en la presente memoria que las proteinas/enzimas destinadas al uso con arreglo a la presente invencion poseen la capacidad para degradar o disminuir la actividad de un herbicida (solas o en combinacion con otras proteinas). Las plantas que producen proteinas de la presente invencion preferiblemente produciran “una cantidad efectiva” de la protefna, de modo que cuando la planta sea tratada con un herbicida, el nivel de expresion de la protefna sera suficiente para convertir a la planta en parcial o totalmente resistente o tolerante al herbicida (a una dosis habitual, si no se indica otra cosa; las dosis de aplicacion habituales se pueden encontrar en el conocido Herbicide Handbook (Weed Science Society of America, 8a edicion, 2002), por ejemplo). El herbicida se puede aplicar en dosis que normalmente matarfan a la planta diana, en concentraciones y dosis normales en el campo. (Gracias a la invencion de interes, el nivel y/o la concentracion podrfan ser mayores que las utilizadas hasta ahora). Preferiblemente, las celulas vegetales y las plantas de la presente invencion quedan protegidas contra la inhibicion del crecimiento o los danos causados por el tratamiento herbicida. Las plantas y las celulas vegetales transformadas de la presente invencion preferiblemente se convierten en resistentes o tolerantes a un herbicida, como se comenta en la presente memoria, lo cual significa que la planta y las celulas vegetales transformadas pueden crecer en presencia de cantidades eficaces de uno o varios herbicidas como se comenta en la presente memoria. Las proteinas preferidas poseen actividad catalftica para metabolizar uno o mas compuestos de ariloxialcanoato.

La transferencia de la actividad funcional a los sistemas vegetales o bacterianos puede implicar una secuencia de acidos nucleicos, la codificacion de la secuencia de aminoacidos de una protefna integrada en un vector de expresion proteica adecuado para el hospedador en el que reside el vector. Una forma de obtener una secuencia de acidos nucleicos que codifique una protefna con actividad funcional consiste en aislar el material genetico natural de la especie bacteriana que sintetiza la protefna de interes, utilizando informacion deducida de la secuencia de aminoacidos de la protefna, como se revela en la presente memoria. Las secuencias naturales pueden ser optimizadas para la expresion en plantas, por ejemplo, tal y como se comenta mas detalladamente en las paginas siguientes. Tambien se puede disenar un polinucleotido optimizado a partir de la secuencia de la protefna.

La presente invencion utiliza clases de proteinas dotadas de actividades novedosas como las indicadas en la presente memoria. Una forma de caracterizar dichas clases de proteinas y los polinucleotidos que las codifican consiste en definir un polinucleotido por su capacidad para hibridarse, bajo un rango de condiciones concretas, con una secuencia de nucleotidos ejemplificada (la complementaria de la misma y/o una sonda o sondas derivadas de una de las hebras) y/o por su capacidad para ser amplificada mediante PCR con cebadores derivados de las secuencias ejemplificadas.

Existen varios metodos para obtener las proteinas destinadas al uso con arreglo a la presente invencion. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos dirigidos contra las proteinas reveladas en la presente memoria con el fin de identificar y aislar otras proteinas en una mezcla. En concreto, se pueden generar anticuerpos contra las porciones de las proteinas que estan mas conservadas o que son mas distintas de otras proteinas relacionadas. Esos anticuerpos se pueden utilizar entonces para identificar especfficamente proteinas equivalentes dotadas de la actividad caracterfstica mediante inmunoprecipitacion, enzimoinmunoadsorcion (ELISA) o inmunotransferencia. Los anticuerpos contra las proteinas mostradas en la presente memoria, o contra proteinas equivalentes, o fragmentos de dichas proteinas, se pueden preparar facilmente con procedimientos ordinarios. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, preferiblemente producidos en respuesta a una protefna ejemplificada o sugerida.

Un experto en la materia reconocera facilmente que las proteinas (y los genes) de la presente invencion se pueden obtener de diversas fuentes. Dado que ciertos elementos transponibles como los plasmidos codifican operones de degradacion de herbicidas enteros, y que estos tambien pueden estar integrados en el genoma, es posible obtener proteinas de la presente invencion de una amplia variedad de microorganismos, entre ellos bacterias recombinantes y/o naturales. Otros miembros de los ordenes Firmicutes y Proteobacteria, asf como generos portadores del rdpA, como Sphingobium, Delftia, Rodoferax y Comamonas, entre otros, pueden ser utilizados como fuentes.

Tambien es posible fabricar mutantes de aislamientos bacterianos mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la disciplina. Por ejemplo, se pueden obtener mutantes asporogenos de un aislamiento mediante mutagenesis con etilmetanosulfonato (EMS). Tambien se pueden conseguir mutantes con luz ultravioleta y nitrosoguanidina por medio de procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.

Una protefna “procedente de” u “obtenible de” cualquiera de los aislamientos de interes referidos o sugeridos en la presente memoria significa que la protefna (o una protefna similar) se puede obtener del aislamiento o de alguna otra fuente, como otra cepa bacteriana o una planta. “Derivado de” tambien tiene esta connotacion e incluye proteinas obtenibles de un tipo determinado de bacteria que ha sido modificada para la expresion en una planta, por ejemplo. Un experto en la materia reconocera facilmente que, dado que se trata de un gen y de una protefna de origen bacteriano, es posible modificar una planta con tecnicas de ingenierfa genetica para que produzca la protefna. Se pueden disponer preparaciones de anticuerpos, sondas de acidos nucleicos (ADN, ARN o APN, por ejemplo) y

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similares utilizando el polinucleotido y/o las secuencias de aminoacidos revelados en la presente memoria, con el fin de detectar y recuperar otros genes relacionados en otras fuentes (naturales).

Es posible utilizar tecnicas ordinarias de biologfa molecular para clonar y secuenciar las protefnas y los genes descritos en la presente memoria. Se puede encontrar mas informacion en Sambrook et al., 1989.

Polinucleotidos y sondas.

Ademas se proporcionan secuencias de nucleotidos que codifican protefnas para ser utilizadas con arreglo a la presente invencion. La presente invencion proporciona asimismo metodos para identificar y caracterizar genes que codifican protefnas dotadas de la actividad herbicida deseada. En una forma de realizacion, la presente invencion proporciona secuencias de nucleotidos unicas que son utiles como sondas de hibridacion y/o cebadores para tecnicas PCR. Los cebadores producen fragmentos genicos caracterfsticos que pueden ser utilizados para la identificacion, caracterizacion y/o aislamiento de genes de interes concretos. Las secuencias de nucleotidos de la presente invencion codifican protefnas que son distintas de las protefnas descritas hasta la fecha.

Los polinucleotidos pueden ser utilizados para formar “genes” enteros que codifiquen protefnas o peptidos en una celula hospedadora deseada. Por ejemplo, como un experto en la materia puede reconocer facilmente, los polinucleotidos de interes se pueden colocar adecuadamente bajo el control de un promotor en un hospedador de interes, como es conocido en la tecnica. El nivel de expresion del gen y su expresion especffica en un tejido concreto o en un momento dado pueden tener una gran repercusion en la utilidad de la invencion. En general, cuanto mayor sea el nivel de expresion proteica de un gen degradador mas rapida y mas completa sera la degradacion del sustrato (en este caso un herbicida). En general, se pretende que los promotores expresen el gen diana en niveles elevados a menos que la expresion elevada cause un impacto negativo en la salud de la planta. Normalmente, se pretende que el gen AAD-1 se exprese de manera constitutiva en todos los tejidos para conferir una proteccion completa a la planta en todas las etapas de crecimiento. No obstante, como alternativa se puede utilizar un gen de resistencia que se exprese vegetativamente; de este modo se podrfa utilizar el herbicida de interes en los cultivos para controlar las malezas y, posteriormente, para controlar la reproduccion sexual del cultivo de interes mediante su aplicacion durante la etapa de floracion.

Como apreciara el experto en la materia, el ADN forma normalmente una doble cadena. En esta disposicion, una hebra es complementaria de la otra y viceversa. A medida que el ADN se replica en una planta (por ejemplo), se producen hebras complementarias del mismo. El termino “hebra codificante” es utilizado a menudo en la tecnica para referirse a la hebra que se une con la hebra antisentido. El ARNm se transcribe a partir de esta hebra antisentido del ADN. La hebra codificante contiene una serie de codones (un codon son tres nucleotidos que pueden ser lefdos como una unidad de tres residuos que designan un aminoacido concreto) que pueden ser lefdos como un marco abierto de lectura (ORF) para formar una protefna o un peptido de interes. Para producir una protefna in vivo, normalmente una hebra de ADN se transcribe en una hebra complementaria de ARNm que servira como molde de la protefna. Por tanto, la presente invencion incluye el uso de los polinucleotidos ejemplificados mostrados en la lista de secuencias adjunta y/o de equivalentes que incluyen las hebras complementarias. La presente invencion incluye los ARN y los APN (acidos peptidos nucleicos) que son equivalentes funcionales de las moleculas de ADN ejemplificadas.

Los aislamientos bacterianos se pueden cultivar en condiciones favorables para conseguir una elevada multiplicacion del microbio. Despues de tratar el microbio para obtener su acido nucleico genomico monocatenario, el ADN se puede poner en contacto con los cebadores de la invencion y ser sometido a una amplificacion por PCR. Con dicho procedimiento, los fragmentos caracterfsticos de los genes de interes quedan amplificados, revelando asf la presencia del gen o genes de interes.

Otros aspectos incluyen genes y aislamientos identificados con los metodos y las secuencias de nucleotidos descritos en la presente memoria. Los genes identificados de esta manera pueden codificar protefnas de resistencia a herbicidas de la presente invencion.

Las protefnas y los genes para uso con arreglo a la presente invencion pueden ser identificados y obtenidos mediante sondas de oligonucleotidos, por ejemplo. Dichas sondas son secuencias de nucleotidos que pueden ser detectadas en virtud de un marcador adecuado o que pueden ser de por sf fluorescentes, tal y como se describe en la Solicitud internacional N.° WO 93/16094. Las sondas (y los polinucleotidos de la presente invencion) pueden ser de ADN, ARN o APN. Ademas de adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U; en las moleculas de ARN), las sondas (y polinucleotidos) sinteticas de la presente invencion tambien pueden contener inosina (una base neutra capaz de aparearse con las cuatro bases que a veces se utiliza como sustituto de la mezcla de cuatro bases en las sondas sinteticas) y/u otras bases sinteticas (no naturales). Por tanto, siempre que en la presente memoria se aluda a un oligonucleotido sintetico y degenerado “N” o “n” se utilizaran genericamente, pudiendo ser G, A, T, C o inosina. Los codigos de ambiguedad se utilizan en la presente memoria de acuerdo con las normas de nomenclatura de la IUPAC vigentes en el momento de la presentacion de esta solicitud (por ejemplo, R significa A o G, Y significa C o T, etc.).

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Como es bien sabido por los expertos en la materia, si una sonda molecular se hibrida con una muestra de acido nucleico, es razonable suponer que la sonda y la muestra guardan entre sf una homologfa/similitud/identidad sustancial. Preferiblemente, primero se realiza la hibridacion del polinucleotido y despues se efectuan lavados en condiciones de baja, moderada o alta restrictividad mediante tecnicas bien conocidas, como se describe por ejemplo en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pags. 169-170. Por ejemplo, como se indica en dicha obra, se pueden conseguir condiciones de baja restrictividad con un primer lavado con (solucion salina con citrato) SSC 2*/SDS 0,1% (dodecilsulfato sodico) durante 15 minutos a temperatura ambiente; normalmente se hacen dos lavados. Se puede conseguir mas restrictividad disminuyendo la concentracion de sal y/o elevando la temperatura. Por ejemplo, despues del lavado descrito se pueden hacer dos lavados con SSC 0,1 */SDS 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos cada uno, seguidos por lavados con SSC 0,1*/SDS 0,1% a 55°C durante 30 minutos cada uno. Estas temperaturas se pueden utilizar con otros protocolos de hibridacion y de lavado citados en la presente memoria y como debena saber un experto en la materia (por ejemplo, como sal se puede usar SSPE en lugar de SSC). La solucion de SSC 2*/SDS 0,1% se puede elaborar anadiendo 50 ml de SSC 20* y 5 ml de SDS 10% a 445 ml de agua. El SSC 20* se puede preparar combinando NaCl (175,3 g/0,150 M), citrato sodico (88,2 g/0,015 M) y agua, ajustando el pH a 7,0 con NaOH 10 N, y despues enrasando el volumen hasta 1 litro. El SDS 10% se puede preparar disolviendo 10 g de SDS en 50 ml de agua autoclavada, diluyendo despues hasta un volumen final de 100 ml.

La deteccion de la sonda proporciona unos medios para determinar de una manera conocida si la hibridacion se ha mantenido. Este analisis con sonda proporciona un metodo rapido para identificar genes de la presente invencion. Los segmentos de nucleotidos que se utilizan como sondas con arreglo a la invencion se pueden sintetizar con un sintetizador de ADN y procedimientos ordinarios. Estas secuencias de nucleotidos tambien se pueden utilizar como cebadores de PCR para amplificar genes de la presente invencion.

Las caractensticas de hibridacion de una molecula pueden ser utilizadas para definir los polinucleotidos utilizados en la presente invencion. Por lo tanto, la presente invencion comprende polinucleotidos (y/o sus complementos, preferiblemente sus complementos completos) que hibridan con un polinucleotido ejemplificado en la presente memoria. Es decir, una forma de definir un gen (y la protema que este codifica) consiste, por ejemplo, en determinar su capacidad para hibridar con un gen conocido o ejemplificado espedficamente (bajo cualquiera de las condiciones reveladas espedficamente en la presente memoria).

En la presente memoria, condiciones “restrictivas” de hibridacion se refiere a las condiciones que consiguen el mismo, o aproximadamente el mismo, grado de especificidad de la hibridacion que las condiciones empleadas por los solicitantes actuales. En concreto, se puede llevar a cabo una hibridacion de ADN inmovilizado sobre filtros de transferencia Southern con sondas genicas marcadas con 32P mediante metodos ordinarios (vease por ejemplo, Maniatis et al. 1982). En general, la hibridacion y los lavados posteriores se pueden llevar a cabo en condiciones que permiten la deteccion de las secuencias diana. En el caso de las sondas genicas de ADN bicatenario, la hibridacion se puede prolongar hasta el dfa siguiente a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del Idbrido de ADN en SSPE 6*, solucion de Denhardt 5*, SDS 0,1% y ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La temperatura de fusion se describe mediante la formula siguiente (Beltz et al. 1983):

Tm= 81,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41(% G+C)-0,61(% fo rmamida)-600/longitud del ADN bicatenario en

pares de bases.

Los lavados se llevan a cabo normalmente del modo siguiente:

(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1 *, SDS 0,1% (lavado de restrictividad baja).

(2) Una vez a Tm-20°C durante 15 minutos en SSPE 0,2*, SDS 0,1% (lavado de restrictividad moderada).

Con las sondas de oligonucleotidos, la hibridacion se puede prolongar hasta el dfa siguiente a 10-20°C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del dbrido en SSPE 6*, solucion de Denhardt 5*, SDS 0,1% y ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La Tm de las sondas de oligonucleotidos se describe mediante la formula siguiente:

Tm (°C)= 2 (numero de pares de bases T/A) + 4 (nume ro de pares de bases G/C)

(Suggs et al., 1981).

Los lavados se llevan a cabo normalmente del modo siguiente:

(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1 *, SDS 0,1% (lavado de restrictividad baja).

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(2) Una vez a la temperatura de hibridacion durante 15 minutos en SSPE 1 x, SDS 0,1% (lavado de restrictividad moderada).

En general, la sal y/o la temperatura se pueden alterar para modificar la restrictividad. Con un fragmento de ADN marcado de >70 bases de longitud aproximadamente, se pueden utilizar las siguientes condiciones:

Baja: SSPE 1 x

2x, temperatura ambiente Baja: SSPE 1 x

2x, 42°C

Moderada: SSPE 0,2x 1 x, 65°C

Alta: SSPE 0,1x, 65°C

La formacion de la molecula bicatenaria y su estabilidad dependen de la existencia de una complementariedad sustancial entre las dos hebras del hfbrido y, como se ha indicado anteriormente, resulta tolerable un cierto grado de desapareamiento. Por tanto, las secuencias de las sondas incluyen mutaciones (unicas y multiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas y de combinaciones de las mismas, en las que dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formacion de hfbridos estables con el polinucleotido diana de interes. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en un polinucleotido dado de muchas maneras, y tales metodos son conocidos por una persona versada en la materia. En el futuro, podrfan aparecer nuevos metodos.

Tecnica de PCR.

La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es una sfntesis enzimatica, repetitiva y conservadora de una secuencia de acidos nucleicos. Este procedimiento es bien conocido y utilizado habitualmente por los expertos en la materia (vease Mullis, Patentes U.S. N.° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159; Saiki et al., 1985). La PCR se basa en la amplificacion enzimatica de un fragmento de ADN de interes que esta flanqueado por dos cebadores oligonucleotidos que hibridan con las hebras opuestas de la secuencia diana. Los cebadores se orientan preferiblemente con sus extremos 3' encarados. Los repetidos ciclos de desnaturalizacion termica del molde, la reasociacion de los cebadores con sus secuencias complementarias y la extension de los cebadores reasociados por medio de una ADN polimerasa dan como resultado la amplificacion del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de PCR. El producto de la extension de cada cebador puede servir como molde para el otro cebador, de modo que con cada ciclo se duplica la cantidad del fragmento de ADN producida en el ciclo anterior. Esto provoca la acumulacion exponencial del fragmento diana especffico, hasta alcanzar varios millones de copias en pocas horas. Por medio de una ADN polimerasa termoestable como la polimerasa Taq, aislada de la bacteria termofila Thermus aquaticus, el proceso de amplificacion puede automatizarse completamente. Los expertos en la materia conocen otras enzimas adecuadas.

Las secuencias de ADN ejemplificadas, o segmentos de las mismas, pueden ser utilizadas como cebadores para la amplificacion por PCR. Durante este proceso de amplificacion, resulta tolerable un cierto grado de desapareamiento entre las bases del cebador y del molde, como mutaciones, deleciones e inserciones (especialmente adiciones de nucleotidos en el extremo 5') en los cebadores ejemplificados. Cualquier experto en la materia conoce metodos para producir mutaciones, inserciones y deleciones en un cebador.

Modificacion de genes y proteinas.

Los genes y las proteinas de interes pueden fusionarse con otros genes y proteinas para producir proteinas quimericas o de fusion. Los genes y proteinas utiles con arreglo a la presente invencion no solo incluyen las secuencias enteras ejemplificadas especfficamente, sino tambien porciones, segmentos y/o fragmentos (incluidos fragmentos contiguos y deleciones internas y/o terminales respecto a las moleculas enteras) de tales secuencias, variantes, mutantes, quimeras y fusiones de los mismos. Las proteinas pueden tener aminoacidos sustituidos siempre que conserven la actividad funcional deseada. Los genes “variantes” tienen secuencias de nucleotidos que codifican las mismas proteinas o proteinas equivalentes dotadas de una actividad equivalente o similar a una protefna ejemplificada. Los terminos “proteinas variantes” y “proteinas equivalentes” se refieren a proteinas dotadas de la misma o basicamente la misma actividad biologica/funcional contra las plagas diana y las secuencias equivalentes como las proteinas expuestas a modo de ejemplo. En la presente memoria, la alusion a una secuencia “equivalente” concierne a secuencias portadoras de sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoacidos que mejoran o que no afectan negativamente a la actividad en un grado significativo. Los fragmentos que conservan la actividad tambien quedan incluidos en esta definicion. Los fragmentos y otros equivalentes que conserven una funcion o actividad igual o similar a la de un fragmento correspondiente de una protefna ejemplificada estan comprendidos en el alcance de la presente invencion. Se pueden hacer cambios, como sustituciones o

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adiciones de aminoacidos, con diversos fines, tales como aumentar (o disminuir) la estabilidad frente a proteasas de la protema (sin disminuir material o sustancialmente la actividad funcional de la misma), eliminar o anadir una diana de restriccion, y similares. Se pueden construir facilmente variaciones de genes utilizando, por ejemplo, tecnicas ordinarias que provocan mutaciones puntuales.

Ademas, la patente US n° 5.605.793, por ejemplo, describe metodos para generar una diversidad molecular adicional utilizando el reensamblaje de ADN tras una fragmentacion al azar o dirigida. Esta se puede denominar transposicion de genes (“shuffling”), proceso que normalmente implica la mezcla de fragmentos (de un tamano idoneo) de dos o mas moleculas de ADN distintas, seguida por repetidas rondas de renaturalizacion. Esto puede mejorar la actividad de una protema codificada por un gen inicial. El resultado es una protema quimerica dotada de una actividad mejor, de una especificidad por el sustrato alterada, mayor estabilidad enzimatica, estereoespecificidad alterada, u otras caractensticas.

La transposicion se puede disenar y dirigir despues de obtener y examinar las coordenadas atomicas 3D (tridimensionales) y la estructura cristalina de la protema de interes. Por tanto, la “transposicion dirigida” se puede dirigir a ciertos segmentos de una protema idoneos para ser modificados, como los segmentos expuestos en la superficie, y preferiblemente no a segmentos internos implicados en el plegamiento de la protema y que resulten esenciales para mantener la integridad de su estructura 3D.

Se pueden utilizar genes variantes para producir protemas variantes; de modo similar se pueden utilizar hospedadores recombinantes para producir las protemas variantes. Utilizando las citadas tecnicas de “transposicion de genes” se pueden construir genes y protemas equivalentes que comprenden 5, 10 o 20 residuos contiguos (aminoacidos o nucleotidos) de cualquier secuencia ejemplificada en la presente memoria. Como un experto en la materia sabe, las tecnicas de transposicion de genes, por ejemplo, se pueden ajustar para obtener equivalentes portadores de, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,

91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115,

116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138,

139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161,

162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184,

185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207,

208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230,

231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253,

254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276,

277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296 o 297 residuos contiguos (aminoacidos o nucleotidos), correspondientes a un segmento (del mismo tamano) de cualquiera de las secuencias ejemplificadas o sugeridas (o las complementarias (completas) de las mismas). Segmentos de tamano similar, especialmente los pertenecientes a regiones conservadas, tambien pueden ser utilizados como sondas y/o cebadores.

Tambien se pueden obtener fragmentos de genes enteros por medio de exonucleasas o endonucleasas comerciales siguiendo procedimientos ordinarios. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas tales como la Bal31 o tecnicas de mutagenesis dirigida para cortar sistematicamente nucleotidos de los extremos de tales genes. Asimismo, se pueden obtener genes que codifiquen fragmentos activos mediante diversas enzimas de restriccion. Tambien se pueden usar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de tales protemas.

En la presente memoria se describen protemas que pueden ser truncadas sin perder por ello la actividad funcional. Por “protema truncada” se entiende una porcion de protema que puede ser escindida sin que la protema truncada restante pierda la actividad deseada despues de la escision. La escision se puede efectuar con diversas proteasas. Asimismo, se pueden producir protemas escindidas con tecnicas de biologfa molecular eliminando bases de ADN que codifiquen dicha protema, bien mediante la digestion con endonucleasas de restriccion bien con otras tecnicas disponibles para los expertos en la tecnica. Despues del truncamiento, dichas protemas se pueden expresar en sistemas heterologos como E. coli, baculovirus, sistemas de virus vegetales, levaduras y similares y a continuacion someterse a bioanalisis en insectos del modo descrito en la presente memoria para determinar su actividad. Los expertos en la materia saben bien que es posible producir con exito protemas truncadas que conserven su actividad funcional pese a haber perdido parte de su secuencia completa. Por ejemplo, se pueden utilizar protemas de Bacillus thuringiensis en una forma truncada (protema central) (veanse por ejemplo, Hofte et al. (1989) y Adang et al. (1985)). Senalar que en la presente memoria, el termino “protema” puede incluir truncamientos funcionalmente activos.

En ciertos casos, sobre todo para la expresion en vegetales, puede ser ventajoso utilizar genes truncados que expresen protemas truncadas. Los genes truncados preferidos codificaran normalmente un 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o un 99% de la protema entera.

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Ciertas protefnas se ejemplifican especfficamente en la presente memoria. Dado que tales protefnas se muestran meramente a tftulo de ejemplo, debe quedar claro de inmediato que protefnas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleotidos que codifican las equivalentes de las mismas) estan dotadas de una actividad igual o similar a la de las protefnas ejemplificadas. Las protefnas equivalentes deben guardar una similitud en sus aminoacidos (y/u homologfa) con una protefna ejemplificada. La identidad de aminoacidos sera normalmente de al menos el 60%, preferiblemente al menos del 75%, mas preferiblemente de al menos el 80%, incluso mas preferiblemente de al menos el 90% y puede ser de al menos del 95%. Las protefnas preferidas tambien se pueden definir en terminos de intervalos de identidad y/o similitud mas concretos. Por ejemplo, la identidad y/o similitud puede ser del 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% en comparacion con una secuencia ejemplificada o sugerida en la presente memoria. Se puede utilizar cualquiera de los numeros indicados arriba para definir los lfmites superior e inferior.

A menos que se indique otra cosa, en la presente memoria la identidad y/o similitud porcentuales entre las secuencias de dos acidos nucleicos se han calculado utilizando el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, modificado segun Karlin y Altschul, 1993. Este algoritmo esta incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990. Las busquedas de nucleotidos con BLAST se llevan a cabo con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12. Se puede utilizar el Gapped BLAST del modo descrito en Altschul et al., 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se emplean los parametros por defecto de cada programa (NBLAST y XBLAST). Vease el sitio web de NCBI/NIH. Para obtener alineaciones con huecos a efectos comparativos, se utilizo la funcion AlignX de Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., North Bethesda, Md., EE.UU.) empleando los parametros por defecto. Estos fueron: una penalizacion por apertura de hueco de 15, una penalizacion por extension de hueco de 6,66, y un intervalo de penalizacion por separacion de hueco de 8.

Tambien se pueden modificar diversas propiedades y caracterfsticas tridimensionales de la protefna sin afectar negativamente a la actividad/funcionalidad de la misma. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos se pueden tolerar o hacer sin afectar negativamente a la actividad y/o la configuracion tridimensional de la molecula. Los aminoacidos se pueden clasificar en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, basicos y acidos. Las sustituciones conservadoras en las que un aminoacido de una clase es sustituido por otro aminoacido del mismo tipo estan comprendidas en el alcance de la presente invencion siempre que la sustitucion no afecte negativamente a la actividad biologica del compuesto. La Tabla 5 contiene un listado de ejemplos de aminoacidos pertenecientes a cada clase.

Tabla 5

Clase de aminoacido

Ejemplos de aminoacidos

No polar

Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp

Polar sin carga

Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln

Acido

Asp, Glu

Basico

Lys, Arg, His

En ciertos casos tambien se pueden hacer sustituciones no conservadoras, pero se prefieren las sustituciones que no deterioren significativamente la actividad funcional/biologica de la protefna.

En la presente memoria, la alusion a polinucleotidos “aislados” y/o protefnas “purificadas” se refiere a dichas moleculas cuando no estan asociadas con otras moleculas de su tipo con las que se encuentran en la naturaleza. Por tanto, la referencia a “aislado/a” y/o “purificado/a” implica la intervencion humana tal y como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, un “gen” bacteriano de la presente invencion introducido en una planta para ser expresado es un “polinucleotido aislado”. De forma similar, una protefna derivada de una protefna bacteriana y producida por una planta es una “protefna aislada”.

Debido a la degeneracion/redundancia del codigo genetico, varias secuencias de ADN pueden codificar las secuencias de aminoacidos reveladas en la presente memoria. Un experto en la materia sabra crear secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas o basicamente las mismas protefnas. Estas se comentan con mas detalle a continuacion en la seccion titulada “Optimizacion de la secuencia para la expresion en vegetales”.

Optimizacion de la secuencia para la expresion en vegetales.

Para obtener una elevada expresion de genes heterologos en plantas se prefiere en general redisenar con tecnicas de ingenierfa genetica los genes, de modo que se expresen con mas eficiencia en el citoplasma de las celulas vegetales. El mafz es una de tales plantas en las que puede ser preferible redisenar el gen o genes heterologos antes de la transformacion para aumentar su nivel de expresion en dicha planta. Por consiguiente, una etapa adicional en el diseno de genes que codifican una protefna bacteriana consiste en la modificacion de un gen

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heterologo para lograr una expresion optima, utilizando una preferencia codonica mas estrechamente alineada con la secuencia de la planta diana, ya sea dicotiledonea o monocotiledonea. Las secuencias tambien se pueden optimizar para la expresion en cualquiera de los tipos concretos de plantas comentados a lo largo de la presente memoria.

Hospedadores transgenicos.

Los genes que codifican las protefnas de la presente invencion se pueden introducir en una amplia variedad de hospedadores microbianos o vegetales. La presente invencion incluye celulas vegetales transgenicas y plantas transgenicas. Las plantas (y celulas vegetales) preferidas son mafz, Arabidopsis, tabaco, soja, algodon, canola, arroz, trigo, cesped y hierbas de pasto, y similares. Tambien se pueden crear otros tipos de plantas transgenicas con arreglo a la presente invencion, tales como frutas, hortalizas y arboles. Mas en general, en varios aspectos de la presente invencion se pueden utilizar dicotiledoneas y/o monocotiledoneas.

En formas de realizacion preferidas, la expresion del gen propicia, directa o indirectamente, la produccion intracelular (y el mantenimiento) de la protefna o protefnas de interes. De esta manera, las plantas se pueden convertir en resistentes a herbicidas. Tales hospedadoras se pueden calificar como hospedadoras y/o celulas transgenicas, recombinantes, transformadas y/o transfectadas. En ciertos aspectos de la presente invencion (por ejemplo, en lo que concierne a la clonacion y la preparacion del gen de interes), se pueden producir y utilizar celulas microbianas (preferiblemente bacterianas) siguiendo tecnicas estandar, con el beneficio de la presente descripcion.

Las celulas vegetales transfectadas con un polinucleotido se pueden regenerar en plantas enteras. La utilizacion de cultivos celulares comprende cultivos de tejidos celulares, cultivos lfquidos y cultivos en placa. Las semillas producidas y/o utilizadas para engendrar plantas tambien son asimismo divulgadas y otros tejidos y partes de las plantas estan asimismo incluidos en la exposicion y .etodos para producir plantas o celulas que comprenden un polinucleotido. Un metodo preferido para producir tales plantas consiste en sembrar una semilla de la presente invencion.

Insercion de los genes para crear los hospedadores transgenicos.

Un aspecto de la presente invencion consiste en la transformacion/transfeccion de plantas, celulas vegetales y otras celulas hospedadoras con polinucleotidos que expresan protefnas de la presente invencion. Las plantas transformadas de esta manera se pueden convertir en resistentes a diversos herbicidas dotados de diferentes mecanismos de accion.

Esta disponible una gran diversidad de metodos para introducir un gen que codifica una protefna deseada en el hospedador diana, en condiciones que permiten su mantenimiento y expresion estables. Tales metodos son bien conocidos por los expertos en la materia y aparecen descritos, por ejemplo, en la patente US n° 5.135.867.

Por ejemplo, se dispone de un gran numero de vectores de clonacion que comprenden un sistema de replicacion en E. coli y un marcador para seleccionar las celulas transformadas que permiten hacer los preparativos para la insercion de genes foraneos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, series pUC, series M13mp, pACYC184, etc. Asf pues, la secuencia que codifica la protefna puede ser insertada en el vector a traves de una diana de restriccion adecuada. El plasmido resultante se utiliza para la transformacion de E. coli. Las celulas de E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado y despues se recogen y se lisan. El plasmido se recupera con un proceso de purificacion que lo separa del ADN genomico. Como metodos de analisis se emplean en general analisis de la secuencia, analisis de restriccion, electroforesis y otros metodos de biologfa molecular y bioqufmicos. Despues de cada manipulacion, la secuencia de ADN utilizada se puede digerir con enzimas de restriccion y unirse a la secuencia de ADN contigua. Cada secuencia plasmfdica se puede clonar en el mismo o en otros plasmidos.

Dependiendo del metodo escogido para insertar los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se escoge el plasmido Ti o Ri para la transformacion de la celula vegetal, entonces como mfnimo el borde derecho del T-ADN del plasmido, y a menudo tanto este como el borde izquierdo, debe estar unido como region flanqueadora a los genes que se desean insertar. El uso del T-ADN para la transformacion de celulas vegetales ha sido ampliamente investigado y descrito en EP 120 516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); y An et al. (1985).

Son numerosas las tecnicas disponibles para insertar ADN en una celula hospedadora vegetal. Entre ellas se cuentan la transformacion con T-ADN por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformacion, fusion, inyeccion, biobalfstica (bombardeo con micropartfculas), triquitas de carburo de silicio, chorro de aerosol, PEG o electroporacion, aparte de otros metodos factibles. Si para la transformacion se opta por las agrobacterias, el ADN a insertar debe estar clonado en plasmidos especiales, ya sea en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios se pueden integrar en el plasmido Ti o Ri mediante recombinacion homologa gracias a secuencias que son homologas con las secuencias del T-ADN. El plasmido Ti o

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Ri tambien comprende una region vir necesaria para la transferencia del T-ADN. Los vectores intermediarios no se pueden autorreplicar en las agrobacterias y para su transferencia a Agrobacterium tumefaciens se precisa un plasmido auxiliar (conjugacion). En cambio, los vectores binarios se pueden autorreplicar tanto en E. coli como en las agrobacterias. Estos comprenden un gen marcador de seleccion y un conector o policonector que estan enmarcados por los bordes derecho e izquierdo del T-ADN. Este tipo de vectores se pueden transformar directamente en las agrobacterias (Holsters, 1978). El Agrobacterium utilizado como celula hospedadora debe contener un plasmido dotado de una region vir. La region vir es necesaria para la transferencia del T-ADN a la celula vegetal. Puede contener T-ADN adicional. La bacteria transformada de ese modo se utiliza para la transformacion de las celulas vegetales. Se pueden cultivar ventajosamente explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para transferir el ADN a la celula vegetal y, a continuacion, regenerar plantas enteras a partir del material vegetal infectado (por ejemplo pedazos de hojas, segmentos de pedunculo, rafces y protoplastos o celulas cultivadas en suspension) en un medio adecuado, que puede contener antibioticos o biocidas como agentes de seleccion. Las plantas obtenidas se pueden analizar para detectar la presencia del ADN insertado. En el caso de la inyeccion y la electroporacion no es necesario recurrir a plasmidos especiales y se pueden emplear tipos convencionales como los derivados de pUC, entre otros.

Las celulas transformadas crecen en el interior de las plantas de la manera habitual. Pueden formar celulas germinales y transmitir el caracter o caracteres transformados a la progenie. Estas plantas a su vez se pueden cultivar de manera normal y cruzarse con plantas portadoras de los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los hfbridos resultantes poseen las propiedades fenotfpicas correspondientes.

En algunas formas de realizacion preferidas de la invencion, los genes que codifican la protefna bacteriana se expresan a traves de unidades transcripcionales insertadas en el genoma de la planta. Preferiblemente, dichas unidades transcripcionales son vectores recombinantes capaces de lograr una integracion estable en el genoma vegetal y permitir la seleccion de las lfneas vegetales transformadas que expresan el ARNm que codifica las protefnas.

Una vez el ADN insertado ha quedado integrado en el genoma, permanece relativamente estable en el (y no vuelve a salir). Suele contener un marcador de seleccion que confiere a las celulas de la planta transformada resistencia frente a un biocida o un antibiotico como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o cloramfenicol, entre otros. Algunos marcadores vegetales seleccionables tambien suelen proporcionar resistencia a varios herbicidas como glufosinato (PAT), glifosato (EPSPS), imazetapir (AHAS) y muchos otros. El marcador utilizado debe permitir la seleccion de las celulas transformadas en lugar de las celulas que no contienen el ADN insertado. El gen o genes de interes se expresan preferiblemente por medio de promotores constitutivos o inducibles en la celula vegetal. Una vez expresado, el ARNm se traduce en protefnas, incorporando aminoacidos de interes en ellas. Los genes que codifican una protefna expresada en las celulas vegetales pueden estar sometidos al control de un promotor constitutivo, un promotor especffico de tejido o un promotor inducible.

Existen varias tecnicas para introducir vectores recombinantes foraneos en celulas vegetales y para obtener plantas que mantengan y expresen de manera estable el gen introducido. Entre dichas tecnicas se incluyen la introduccion directa en las celulas de micropartfculas recubiertas con material genetico (Patentes U.S. N.° 4.945.050 concedida a Cornell y 5.141.131 concedida a DowElanco, ahora Dow AgroSciences, LLC). Asimismo, se pueden transformar plantas utilizando tecnicas con Agrobacterium, veanse las Patentes U.S. N.° 5.177.010 concedida a la University of Toledo y 5.104.310 a Texas A&M, la solicitud de patente europea 0131624B1; las solicitudes de patente europea 120516, 159418B1 y 176.112 concedidas a Schilperoot; las Patentes U.S. N.° 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940.838 y 4.693.976 concedidas a Schilperoot; las solicitudes de patente europea 116718, 290799, 320500, todas concedidas a Max Planck; las solicitudes de patente europea 604662 y 627752 y la patente US n° 5.591.616, concedidas a Japan Tobacco; las solicitudes de patente europea 0267159 y 0292435 y la patente US n° 5.231.019, todas concedidas a Ciba Geigy, ahora Syngenta; las patentes U.S. N.° 5.463.174 y 4.762.785, ambas concedidas a Calgene; y las patentes U.S. N.° 5.004.863 y 5.159.135, ambas concedidas a Agracetus. Otros metodos de transformacion incluyen las tecnicas con triquitas. Veanse las patentes U.S. N.° 5.302.523 y 5.464.765, ambas concedidas a Zeneca, ahora Syngenta. Las tecnicas de electroporacion tambien han sido utilizadas para transformar plantas. Vease la WO 87/06614 concedida a Boyce Thompson Institute; las Patentes U.S. N.° 5.472.869 y 5.384.253, ambas concedidas a Dekalb; y WO 92/09696 y WO 93/21335, ambas otorgadas a Plant Genetic Systems. Asimismo, tambien se pueden usar vectores virales para producir plantas transgenicas que expresen la protefna de interes. Por ejemplo, se pueden transformar plantas monocotiledoneas con un vector viral utilizando los metodos descritos en la patente U.S. N.° 5.569.597 concedida a Mycogen Plant Science y Ciba-Geigy (ahora Syngenta), asf como en las patentes U.S. N.° 5.589.367 y 5.316.931, ambas concedidas a Biosource, ahora Large Scale Biology.

Como se ha mencionado con anterioridad, la manera de introducir el constructo de ADN en la planta hospedadora no es crftica para esta invencion. Se puede emplear cualquier metodo que proporcione una transformacion eficiente. Por ejemplo, en la presente memoria se describen varios metodos para la transformacion de celulas vegetales que incluyen el uso de plasmidos Ti o Ri y similares para llevar a cabo la transformacion mediada por Agrobacterium. En muchos casos, sera deseable que el constructo utilizado para la transformacion disponga en uno o ambos lados de

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los bordes del T-ADN, mas concretamente el borde derecho. Estos resulta particularmente util cuando el constructo utiliza Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como vehmulo de la transformacion, aunque los bordes del T-ADN tambien pueden ser utiles con otros vehmulos de transformacion. Cuando se utiliza Agrobacterium para la transformacion de celulas vegetales, se puede utilizar un vector que puede ser introducido en el hospedador para la recombinacion homologa con el T-ADN o con el plasmido Ti o Ri presente en el anfitrion. El vector se puede introducir a traves de electroporacion, cruzamiento triparental y otras tecnicas de transformacion de bacterias gramnegativas conocidas por los expertos en la disciplina. El modo en que se lleva a cabo la transformacion con el vector en el Agrobacterium hospedador no es cntico para esta invencion. El plasmido Ti o Ri que contiene el T-ADN para la recombinacion no tiene por que ser capaz de provocar la formacion de agallas y no resulta cntico para dicha invencion siempre que dicho hospedador disponga de genes vir.

En ciertos casos de transformacion con Agrobacterium, el constructo de expresion situado entre los bordes del T- ADN se insertara en un vector de amplio espectro como pRK2 o derivados del mismo, tal y como se describe en Ditta et al. (1980) y EPO 0 120 515. El constructo de expresion y el T-ADN deben contener uno o mas marcadores como los descritos en la presente memoria que permitan la seleccion del Agrobacterium transformado y de las celulas vegetales transformadas. El marcador concreto no es esencial para esta invencion y dependera del hospedador y de la construccion utilizada.

Para la transformacion de las celulas vegetales con Agrobacterium se pueden combinar e incubar explantes con el Agrobacterium transformado durante el tiempo suficiente para posibilitar la transformacion de los mismos. Despues de la transformacion, las agrobacterias son eliminadas por seleccion con el antibiotico adecuado y las celulas vegetales se cultivan en el medio selectivo apropiado. Una vez formados los callos, se puede estimular la formacion de brotes empleando las hormonas vegetales adecuadas de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica de cultivo de tejidos vegetales y regeneracion de plantas. No obstante, no siempre es necesario un estadio intermedio de callo. Despues de la formacion del brote, dichas celulas vegetales pueden ser transferidas a un medio que estimula la formacion de rafces y completar asf la regeneracion de la planta. Las plantas pueden entonces cultivarse para obtener semillas, y estas se pueden utilizar para engendrar las generaciones futuras. Con independencia de la tecnica de transformacion utilizada, es preferible que el gen codificador de una protema bacteriana se incorpore a un vector de transferencia genica adaptado para expresar dicho gen en una celula vegetal, incluyendo en el vector un elemento regulador promotor vegetal, asf como regiones de terminacion de la transcripcion no traducidas 3' como Nos y similares.

Ademas de las numerosas tecnicas disponibles para transformar plantas, tambien puede variar el tipo de tejido que entra en contacto con los genes foraneos. Dicho tejido incluina, entre otros tipos: tejido embriogenico, tejido de callo de los tipos I, II y III, hipocotilo, meristemo, tejido radicular, tejidos para la expresion en floema, y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden ser transformados durante la desdiferenciacion mediante tecnicas adecuadas descritas en la presente memoria.

Como se ha mencionado anteriormente, si se desea es posible utilizar diferentes marcadores seleccionables. La preferencia por un marcador concreto queda a discrecion del experto, pero se puede utilizar cualquiera de los siguientes marcadores seleccionables con cualquier otro gen no enumerado en la presente memoria que pueda funcionar con un marcado seleccionable. Tales marcadores seleccionables incluyen, entre otros, el gen de la aminoglucosido fosfotransferasa del transposon Tn5 (Aph II) que codifica la resistencia a los antibioticos kanamicina, neomicina y G418, asf como aquellos genes que codifican resistencia o tolerancia al glifosato, higromicina, metotrexato, fosfinotricina (bialafos o glufosinato), imidazolinonas, sulfonilureas y herbicidas triazolopirimidmicos, como clorsulfuron, bromoxinilo, dalapon y similares.

Ademas de un marcador seleccionable, puede ser deseable utilizar un gen marcador (reporter). En ciertos casos se puede utilizar un gen marcador con o sin un marcador seleccionable. Los genes marcadores son genes que normalmente no estan presentes en el organismo o tejido receptor y que codifican protemas que ocasionan un cambio fenotfpico o tienen una propiedad enzimatica. Ejemplos de tales genes se pueden consultar en Weising et al., 1988. Los genes marcadores preferidos incluyen la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de la cloramfenicol acetiltransferasa del Tn9 de E. coli, la protema fluorescente verde de la medusa bioluminescente Aequorea victoria y los genes de luciferasa de la luciernaga Photinus piralis. A continuacion se puede efectuar un ensayo para detectar la expresion del gen marcador en el momento adecuado una vez introducido en las celulas receptoras. Un ensayo tal preferido consiste en el uso del gen que codifica la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli del modo descrito por Jefferson et al., (1987) para identificar celulas transformadas.

Ademas de los elementos reguladores promotores de origen vegetal, en celulas vegetales se pueden utilizar elementos de esa naturaleza procedentes de otras fuentes para expresar genes foraneos. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores reguladores de origen bacteriano, como el promotor de la octopina sintasa, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la mannopina sintasa; promotores de origen viral, como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (un promotor 35S modificado geneticamente, vease la patente US n° 6.166.302, sobre todo el Ejemplo 7E) y similares. Los promotores reguladores vegetales incluyen, entre otros, la subunidad pequena (ssu) de la ribulosa-1,6-bifosfato (RUBP) carboxilasa, el promotor de la beta-conglicinina, el promotor de la beta-faseolina,

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promotor de ADH, promotores de shock termico y promotores especfficos de tejido. Otros elementos como regiones de anclaje a matriz, regiones de anclaje a andamio, intrones, intensificadores, secuencias de poliadenilacion y similares pueden estar presentes y mejorar la eficiencia de la transcripcion o de la integracion del ADN. Tales elementos pueden ser necesarios, pero no necesariamente, para la funcion del ADN, aunque pueden facilitar una mejor expresion o funcionamiento del ADN modificando la transcripcion, la estabilidad del ARNm, y similares. Tales elementos pueden incluirse en el ADN a voluntad para obtener un rendimiento optimo del ADN transformado en la planta. Los elementos habituales incluyen, entre otros, Adh-intron 1, Adh-intron 6, la secuencia lfder de la protefna de la capside del virus del mosaico de la alfalfa, secuencias UTR de la osmotina, la secuencia lfder de la protefna de la capside del virus del rayado del mafz, asf como otras disponibles para el experto. Tambien se pueden utilizar elementos reguladores consistentes en promotores constitutivos que provocan la expresion continua del gen en todos los tipos celulares y en todo momento (por ejemplo actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares). Por otra parte, algunos elementos reguladores consistentes en promotores especfficos de tejido son los responsables de la expresion genica en ciertos tipos de celulas y tejidos, como las hojas o las semillas (por ejemplo zefna, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y estos tambien pueden ser utilizados.

Los elementos reguladores promotores tambien pueden permanecer activos (o inactivos) durante una cierta etapa del desarrollo de la planta, asf como activos en ciertos tejidos y organos vegetales. Ejemplos de tales promotores incluyen, entre otros, elementos reguladores promotores especfficos del polen, especfficos del embrion, especfficos de los estigmas del mafz, especfficos de la fibra del algodon, especfficos de las rafces, especfficos del endospermo de las semillas o especfficos de la fase vegetativa, y similares. En ciertas circunstancias podrfa ser deseable utilizar un elemento regulador consistente en un promotor inducible, que sea responsable de la expresion de genes como respuesta a una senal especffica, por ejemplo: un estfmulo ffsico (genes de shock termico), luz (RUBP carboxilasa), hormona (Em), metabolitos, sustancias qufmicas (respuesta a tetraciclina) y estres. Tambien se pueden utilizar otros elementos de transcripcion y traduccion que funcionen en plantas. Son conocidos en la tecnica numerosos vectores de transformacion genica especfficos para vegetales.

Los sistemas basados en virus de ARN vegetales tambien se pueden usar para expresar protefnas bacterianas. De ese modo, el gen codificante de una protefna se puede insertar en una region promotora de la capside de un virus vegetal adecuado para infectar a la planta hospedadora de interes. La protefna puede entonces expresarse y conferir proteccion a la planta frente al dano causado por el herbicida. Sistemas basados en virus de ARN vegetales aparecen descritos en la patente U.S. N.° 5.500.360 concedida a Mycogen Plant Sciences, Inc. y en las patentes U.S. N.° 5.316.931 y 5.589.367 concedidas a Biosource, ahora Large Scale Biology.

Todas las patentes, las solicitudes de patente, las solicitudes provisionales, y las publicaciones a las que se hace referencia o son citadas en la presente memoria son incorporadas como referencia en su totalidad hasta el punto de que no resulten inconsistentes con las ensenanzas explfcitas de la presente memoria.

A continuacion se describen ejemplos de procedimientos para poner en practica la invencion. Tales ejemplos no se deben considerar como excluyentes. Todos los porcentajes se indican en peso y todas las proporciones de mezcla de solventes se expresan en volumen a menos que se indique otra cosa.

Ejemplo 1 - Metodo para la identificacion de genes que confieren resistencia al 2,4-D en la planta

Para identificar genes capaces de degradar herbicidas en la planta se puede comenzar consultando las bases de datos publicas como NCBI (National Center for Biotechnology Information). Como punto de partida, es preciso disponer de una secuencia genica funcional identificada que codifique una protefna con las caracterfsticas deseadas (en este caso la actividad a-cetoglutarato dioxigenasa). Esta secuencia protefnica se utiliza como dato de entrada para el algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) que la comparara con las secuencias protefnicas disponibles en la NCBI. Utilizando los ajustes por defecto, la busqueda da como resultado mas de 100 secuencias protefnicas con diversos grados de homologfa. Este abanico ofrece desde una identidad de aminoacidos elevada (85-98%) hasta una identidad baja (23-32%). Normalmente, se supone que solo las secuencias con una homologfa elevada ostentan propiedades similares a la secuencia introducida. En este caso solo se escogieron las secuencias con una homologfa < 50%. A continuacion vamos a mostrar a modo de ejemplo que la clonacion y la expresion recombinante de homologos con apenas un 27% de aminoacidos conservados es factible como medio para conferir niveles comerciales de resistencia no solo frente al herbicida previsto, sino tambien frente a sustratos que nunca se habfan puesto a prueba con tales enzimas.

PCR y clonacion del gen en pET.

En la base de datos de NCBI se identifico un gen (rdpA) (vease el sitio web ncbi.nlm.nih.gov; entrada n.° AF516752) homologo del tfdA de Ralstonia eutropha que solo guardaba con este una identidad de aminoacidos del 28%. La identidad porcentual se determino traduciendo primero a protefna las secuencias de ADN de rdpA y tfdA que figuraban en la base de datos, y realizando despues el alineamiento multiple de las secuencias con el programa ClustalW, del paquete de software Vector NTI.

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La cepa de Sphingobium herbicidovorans portadora del gen rdpA se obtuvo de la ATCC (American Type Culture Collection, cepa n.° 700291). La cepa liofilizada se revivio siguiendo el protocolo de la ATCC y se conservo a -80°C en glicerol al 20% para uso interno como cepa Dow Bacterial DB 536. A partir de esta solucion madre congelada, para aislar las celulas se sembro una placa de agar de triptona y soja con el contenido de un asa de Henle y se incubo a 28°C durante 3 dfas.

Se utilizo una sola colonia para sembrar en 100 ml de caldo de triptona y soja en un matraz de 500 ml con tres placas deflectoras, que se dejo incubar hasta el dfa siguiente a 28°C en un agitador de plataforma a 1 50 rpm. De este cultivo se aislo todo el ADN con el protocolo para gramnegativos del kit DNeasy de Qiagen (n.° catalogo de Qiagen 69504). Para amplificar el gen diana a partir del ADN genomico se disenaron los siguientes cebadores: Directo, 5' TCT AGA AGG AGA TAT ACC ATG CAT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC CAG CG 3' [(SEC ID n° 1) (se anadio una diana de restriccion para Xba I y un sitio de union a ribosoma (RBS))], e Inverso, 5' CTC GAG TTA CTA GCG CGC CGG GCG CAC GCC ACC GAC CG 3' [(SEC ID n° 2) (se le anadio un codon extra de parada y una diana para Xho I)].

Se prepararon reacciones de veinte microlitros del modo siguiente: MasterMix 8 pl, cada cebador 1 pl (50 pmol/pl), ADNg 2,5 pl, H2O 7,5 pl. A continuacion se efectuo la PCR en las condiciones siguientes: 94°C durante 45 s, 52°C durante 1,5 minutos, 72°C durante 1,5 minutos, durante 30 ciclos, seguidos por un ciclo final a 72°C durante 5 minutos, utilizando un kit Master Taq de Eppendorf (Eppendorf, n.° catalogo 0032 002.250). El producto resultante de la PCR ~1 kb se clono en pCR 2.1 (Invitrogen, n.° catalogo K4550-40) siguiendo el protocolo incluido y utilizando como cepa hospedadora E. coli TOP10F' qufmicamente competente para verificar la secuencia de nucleotidos.

Diez de las colonias blancas resultantes se introdujeron en 4 ml de caldo Luria + 50 pg/ml de kanamicina (abreviado, LB K) y se dejaron crecer hasta el dfa siguiente a 37°C con agitacion. Los plasmidos de cada cultivo s e purificaron con el kit Wizard Plus SV de Promega (Promega, n.° catalogo A1460) siguiendo el protocolo incluido. La secuenciacion se llevo a cabo con el kit CEQ Quick Start de Beckman (Beckman Coulter, n.° catalogo 608120) utilizando un cebador directo de M13 (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3') (SEC ID n° 16) y un cebador inverso de M13 (5' CAG GAA ACA GCT ATG aC 3') (SEC ID n° 17), segun las instrucciones del fabricante. Esta secuencia genica (SEC ID n° 3) y su protefna correspondiente (SEC ID n° 9) recibieron la nueva designacion general de AAD-1 (v1) (ariloxialcanoato dioxigenasa) para mantener la coherencia interna.

Utilizando las enzimas de restriccion correspondientes a las dianas anadidas con los conectores del cebador (Xba 1, Xho 1) se escindio el gen AAD-1 (v1) del vector pCR2.1 y se ligo a un vector pET 280 con resistencia a estreptomicina/espectinomicina. Los productos ligados se transformaron a continuacion en E. coli TOP10F' y se cultivaron en placas de agar con caldo Luria + 50 pg/ml de estreptomicina y espectinomicina (abreviado, LB S/S). Para distinguir entre las ligaciones AAD-1 (v1):pET 280 y pCR2.1:pET 280, se resembraron unas 20 colonias aisladas en 6 ml de LB S/S y se cultivaron a 37°C d urante 4 horas con agitacion.

A continuacion cada cultivo se sembro en placas con LB K, que se incubaron a 37°C hasta el dfa siguiente. Las colonias que crecieron en el medio LB K se supusieron portadoras del vector pCR2.1 ligado y fueron descartadas. Los plasmidos de los cultivos restantes se aislaron del modo antes indicado. Este constructo de expresion recibio la designacion de pDAB 3203.

Ejemplo 2 - Expresion y analisis

2.1-Analisis por HPLC

El plasmido pDAB 3203 se mantuvo congelado a -8013 en celulas TOP10F' (Invitrogen) como cepa Dow Recombinant DR 1878. Para la expresion, el ADN plasmfdico del cultivo de TOP10F' se purifico con el kit Wizard de Promega (Fisher, n.° catalogo PR-A1460) se transformo en celulas BL-21 Star (DE3) (Invitrogen, n.° catalogo C6010-03) siguiendo el protocolo del fabricante. Despues de la transformacion, 50 pl de las celulas se sembraron en placas de agar LB S/S y se incubaron hasta el dfa siguiente a 37°C.

La manana siguiente, todas las colonias de la placa se recogieron y se introdujeron en 100 ml de LB en un matraz de 500 ml con tres placas deflectoras y se incubaron a 37°C/200 rpm durante 1 h. A continuacion, se in dujo la expresion del gen con IPTG 1 mM y se dejaron incubar otras 4 h a 30°C/200 rpm. Los 100 ml del cultivo se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min, se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de MOPS 50 mM. Despues se sometieron a tres rondas de sonicacion de 45 s para lisar las celulas. Los lisados se centrifugaron a 15.000 rpm para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se pipeteo y almaceno a 4°C. Para comprobar la expresion recombinante se hizo correr una alfcuota de 20 pl en gel Tris Glicina al 4-20% (Invitrogen, n.° catalogo EC60255).

Una vez confirmada la expresion, la actividad enzimatica se analizo del modo siguiente. En primer lugar, se desalinizo una alfcuota del extracto celular con un cartucho PD-10 (Amersham, n.° catalogo 17-0435-01), que seguidamente se utilizo para las reacciones enzimaticas con herbicida.

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En cada reaccion se emplearon los siguientes elementos: 2,4-D (125 pg/ml), [ascorbato (1 mM), ion ferroso (50 pM), a-cetoglutarato (1 mM), en MOPS 100 mM], extracto celular (100 pl). La reaccion se dejo incubar a temperatura ambiente durante 30 min., tras lo cual se detuvo con la adicion de HCl 0,1 N hasta que el pH se situo entre 2 y 3. La mitad del volumen de reaccion (~500 pl) se reservo para el bioanalisis, y el volumen restante se sometio a una extraccion en fase organica con tubos de extraccion de fase solida (Fisher, n.° catalogo 11-131-6) y 400 pl de acetonitrilo + TFA 0,05% como eluyente.

Los extractos se analizaron con HPLC para detectar la perdida del pico de 2,4-D o la presencia de cualquier otro pico producto de la degradacion o modificacion del 2,4-D. Las condiciones de la HPLC fueron: Luna 10 p C18(2) 250 x 4,6 mm (Phenomenex, n.° catalogo 00G-4253-E0), elucion con ACN 50% + TFA 0,05%: H2O 50% + TFA 0,05% a ACN 100% + TFA 0,05% durante 5 min.

2.2-Bioanalisis en placa para determinar la degradacion del herbicida.

Los bioanalisis con plantas permitieron averiguar si la transformacion enzimatica in vitro del herbicida comportaba la perdida de su actividad herbicida. Dada la naturaleza selectiva de los herbicidas estudiados (monocotiledoneas controladas con herbicidas AOPP y dicotiledoneas controladas con herbicidas auxfnicos), en el ensayo se emplearon Agrostis palustris natural var. Pencross como planta monocotiledonea y Arabidopsis thaliana var. Columbia como dicotiledonea. Ambas especies pueden hacerse germinar y crecer en placas de Petri pequenas.

Las semillas de Arabidopsis se sometieron a esterilizacion superficial durante 10 min. en una solucion al 50% de lejfa comercial/agua desionizada (v/v) con 1 pl de Tween-20 anadido como humectante con agitacion vigorosa (agitador a 250 rpm). La solucion de lejfa se decanto en el interior de una campana esteril y se lavo tres veces con agua esteril. La superficie de las semillas de agrostide se esterilizo durante 20 minutos de forma similar.

Entre veinte y treinta semillas esterilizadas de cada especie se depositaron en medio de ensayo en placa de agar solidificado esteril (PTM, Plate Test Medium) [KNO3 2,5 mM, KH2PO4 2,5 mM, FeSO4 50 mM, NaEDTA 10 mM (pH 8,0), MgSO4 2 mM, Ca(NOa)2 2 mM, H3BO3 70 pM, MnCh 14 pM, CuSO4 0,5 pM, ZnSO4 1 pM, NaMoO4.2H2O 0,2 pM, NaCl 10 pM, CoCl2.H2O 10 nM, sacarosa 0,8% (p/v), agarosa 0,4% (p/v)] en placas de Petri de 60x15 mm (Falcon 1007). El PTM se modifico anadiendo hasta seis dosis de patrones de los herbicidas a analizar o diluciones de solucion de herbicida-enzima a analizar, de modo tal que los incrementos de concentracion de 4x abarcaran un rango de dosificacion de tres ordenes de magnitud, con el GR50 (reduccion del crecimiento del 50%) situado aproximadamente en el centro del rango.

En las soluciones problema de herbicida-enzima, la concentracion maxima se determino a partir de la concentracion nominal antes de que se produjera la degradacion enzimatica. Las semillas se esparcieron uniformemente anadiendo 3 ml de PTM fundido de la misma composicion, agitandolo con movimientos circulares y dejandolo solidificar. Las placas se cerraron y se mantuvieron en condiciones esteriles en una camara de crecimiento con poca luz (24 h dfa'1, 100 pE/m2s1, 23°C) durante 7 dfas. La longitud de las rafces y de las rafces+brotes se midieron en cinco plantas escogidas al azar de Arabidopsis y de agrostide, respectivamente, y se calculo la longitud media promedio (porcentaje del control no tratado) respecto a la concentracion nominal del herbicida y el GR50.

Este bioanalisis permitio confirmar la perdida de la actividad herbicida fruto de la degradacion por la AAD-1 (v1) de la cadena lateral de oxialcanoato en varios herbicidas de uso habitual en agronomfa. En varios casos, el producto fenolico previsto se habfa eluido junto con el acido original en la HPLC y el bioanalisis sirvio como principal prueba de la degradacion del herbicida. Las Tablas 6 y 7 ofrecen los sustratos herbicidas analizados.

Tabla 6. Bioanalisis en placa con Arabidopsis de sustratos auxfnicos comerciales de tipo fenoxi y piridiniloxialcanoato.

GR50 (nM)

Producto qufmico analizado

Prod. qufmico solo Prod. qufmico + Vector blanco* Prod. qufmico + AAD-1 v1 Cociente GR50** Estructura

2,4-D

22 17 267 16 Y'Y°

DCP

>1000 nd nd nd CL

Diclorprop

nd 30 1000 33 vCjQt HO a

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Tabla 6. Bioanalisis en placa con Arabidopsis de sustratos auxfnicos comerciales de tipo fenoxi y piridiniloxialcanoato.

GR50 (nM)

Producto qufmico analizado

Prod. qufmico solo Prod. qufmico + Vector blanco* Prod. qufmico + AAD-1 v1 Cociente GR50** Estructura

Triclopir

255 1000 1000 1 F VvH-" □

Fluroxipir

2200 2250 1825 <1 j ^

*El vector blanco representa el tratamiento con lisado celular en que el vector pET de E. coli no tenia insertado ningun gen.

**El cociente GR50 es una medida de la perdida de la actividad herbicida en el tratamiento con lisado que expresa la enzima respecto a los tratamientos con el vector blanco. El umbral para detectar la perdida de actividad herbicida con este ensayo se situa en > 2.

Tabla 7. Bioanalisis en placa con agrostide de sustratos ariloxifenoxialcanoato inhibidores de la ACCasa.

GR50 (nM)

Producto qufmico analizado

Prod. qufmico solo Prod. qufmico + Vector blanco* Prod. qufmico + AAD-1 v1 Cociente GR50** Estructura

Haloxifop-RS

28 21 520 25

Diclofop-RS

nd 20 130 7 hrol Q OH

*El vector blanco representa el tratamiento con lisado celular en que el vector pET de E. coli no tenia insertado ningun gen.

**El cociente GR50 es una medida de la perdida de la actividad herbicida en el tratamiento con lisado que expresa la enzima respecto a los tratamientos con el vector blanco. El umbral para detectar la perdida de actividad herbicida con este ensayo se situa en > 2.

2.3-Resultados de la HPLC

La bibliograffa revela que las enzimas dioxigenasa de esta clase requieren a-cetoglutarato como cosubstrato (vease un esquema general en la Figura 1) y el ion ferroso para unirse al centro activo. Otros experimentos presentes en la bibliograffa han demostrado que la adicion de ascorbato aumenta la actividad enzimatica al mantener el hierro en estado reducido, lo que evita la degradacion de la enzima. A tenor de este trabajo previo, se prepararon ensayos iniciales suponiendo que la enzima de interes actuarfa del mismo modo que otros miembros de esta clase general de enzimas.

Sorprendentemente, los resultados iniciales de la HPLC revelaron la presencia de un nuevo pico en el minuto 6,1, ademas de un pico reducido de 2,4-D a los 5,5 min. Este nuevo pico no estaba presente en el analisis control. Para identificar inicialmente el pico de los 6,1 minutos, se analizo un control de DCP en las mismas condiciones y, como cabfa esperar, este tambien eluyo a los 6,1 minutos. La formacion de este producto quedo confirmada por un analisis colorimetrico que detecto fenoles (vease el ejemplo 3.1), asf como por una espectrometrfa de masas. Como se esperaba, la AAD-1 (v1) cataliza una reaccion similar a la de otros miembros de esta clase de enzimas. En los bioanalisis estas mismas muestras tambien evidenciaron una perdida casi completa de la actividad herbicida del 2,4- D en el ensayo en placa con Arabidopsis (Figura 2). Independientemente de las condiciones especfficas del ensayo (tiempo de incubacion mas largo, mas enzima), la HPLC revelo que solo el 50-75% del 2,4-D pudo ser degradado a DCP. De hecho, la prolongacion de la induccion de las celulas de E. coli BL-21 con IPTG solo se tradujo en una reduccion de la actividad de la enzima, a pesar de que se expreso una mayor cantidad de protefna recombinante.

Una vez demostrada la degradacion del 2,4-D, se analizaron otros sustratos con grupos cfclicos similares

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(oxiacetatos y oxipropionatos). Los primeros compuestos analizados fueron los analogos piridfnicos fluoroxipir y triclopir, que son piridiniloxiacetatos: no se detecto actividad enzimatica en ninguno de ellos. Otros ensayos con varios analogos de estos dos piridiniloxiacetatos desprovistos de fluor o de los grupos amino tampoco revelaron degradacion alguna. Resulta destacable, empero, que la adicion de fluor en la posicion 5 del 2,4-D provocara una perdida casi total de la degradacion enzimatica (veanse mas resultados en el apartado siguiente).

A continuacion se analizaron los inhibidores de ACCasa haloxifop y diclofop en las mismas condiciones que el 2,4-D. (Los metabolitos fenolicos correspondientes coeluyeron con el compuesto original en las condiciones de HPLC empleadas). Los resultados de los bioanalisis de estas muestras revelaron una perdida de la actividad herbicida tanto en el caso del haloxifop (Figura 3) como del diclofop. Tales resultados quedaron confirmados por el analisis colorimetrico, que tambien se utilizo para analizar una muestra mas amplia de estos compuestos.

2.4-Bioanalisis en placa para estudiar la degradacion del herbicida.

Los resultados de los bioanalisis corroboraron los resultados iniciales de la HPLC que indicaban una perdida del 2,4- D original tras la incubacion de soluciones del mismo con extractos sin purificar de AAD-1 recombinante (v1) (Figura 2). Asimismo, la actividad herbicida del acido fenoxipropionico diclorprop, tambien se vio degradada de manera efectiva. El cociente GR50 nominal correspondiente a la solucion de herbicida+enzima y a la solucion de herbicida sola sirvio como medida de la perdida de actividad del herbicida original causada por la actividad enzimatica. Un valor de 2-3 estuvo correlacionado normalmente con una perdida del 50-75% de la actividad del herbicida original (Tabla 6). Con frecuencia no se pudo determinar el GR50 tras el tratamiento enzimatico porque, de hecho, no quedaba actividad herbicida detectable.

Por su parte, los herbicidas AOPP tambien resultaron ser un sustrato excelente para la AAD-1 (v1), como demuestra la casi completa degradacion de la actividad graminicida en el bioanalisis en placa con agrostide (Figura 3 y Tabla 7). Este hecho resulta significativo porque supone la primera descripcion de un miembro de esta clase de enzimas que es activo contra herbicidas que no son auxfnicos fenoxi. De ello se deduce que esta enzima es lo bastante promfscua para catabolizar sustancias qufmicas dotadas de subestructuras fenoxialcanoato similares, aunque posean mecanismos de accion herbicida completamente dispares.

Ejemplo 3 - Valoracion in vitro de la actividad de la AAD-1 (v1) mediante la deteccion colorimetrica de compuestos fenolicos

3.1- Valoracion de la AAD-1 (v1).

La actividad de la enzima AAD-1 (v1) se valoro con la deteccion colorimetrica de los productos fenolicos mediante un version modificada del protocolo de Fukumori y Hausinger (1993) (J. Biol. Chem. 268: 24311-24317) que permitfa el analisis de microplacas de 96 pocillos. El analisis colorimetrico para valorar la actividad de las dioxigenasas que hidrolizan el 2,4-D y el diclorprop hasta convertirlo en 2,4-diclorofenol ya ha sido descrito. No obstante, se podrfan producir otros fenoles distintos a partir de otros herbicidas ariloxialcanoato como haloxifop y cihalofop (vease la Figura 4). El color desarrollado por varios fenoles se comparo con el del 2,4-diclorofenol con el metodo de deteccion descrito para averiguar que productos fenolicos podrfan detectarse facilmente. Los fenoles y los analogos fenolicos se analizaron a un concentracion final de 100 pM en 0,15 ml de MOPS 20 mM y pH 6,75 que contenfa NH4(FeSO4)2 200 pM y ascorbato sodico 200 pM. Los fenoles derivados del haloxifop y del cihalofop presentaron colores equivalentes a los del 2,4-diclorofenol y, por tanto, se detectaron facilmente. Los piridinoles derivados del fluoroxipir y el triclopir no generaron ningun color significativo. El color desarrollado por el 2,4-diclorofenol y el fenol de haloxifop resulto lineal y proporcional a la concentracion de fenol en la valoracion hasta ~500 pM. Una curva de calibracion realizada en las condiciones de valoracion estandar (160 pl de volumen final analizado) indico que con 172 pM de fenol se obtenfa una absorbancia a 510 nm de 0,1.

Los analisis de la enzima se efectuaron con un volumen total de 0,15 ml de MOPS 20 mM y pH 6,75 que contenfan NH4FeSO4 200 pM, ascorbato sodico 200 pM, a-cetoglutarato 1 mM, el sustrato adecuado (obtenido de una solucion madre 100 mM y disuelto en DMSO) y enzima. Las valoraciones se iniciaron anadiendo el sustrato de ariloxialcanoato, enzima o a-cetoglutarato en el momento cero. Al cabo de 15 minutos de incubacion a 25°C, la reaccion se detuvo anadiendo 10 pl de EDTA sodico 100 mM. El color se desarrollo anadiendo 15 pl de tampon a pH 10 (3,09 g de acido borico + 3,73 g de KCl + 44 ml de KOH 1 N), 1,5 pl de 4-aminoantipirina al 2% y 1,5 pl de ferricianuro potasico al 8%. Transcurridos de 10 a 20 min, se midio la absorbancia a 510 nm en un espectrofotometro de microplacas. Los blancos contenfan todos los reactivos excepto la enzima para tener en cuenta la pequena contaminacion que a veces afecta a algunos sustratos por pequenas cantidades de fenoles. Las valoraciones posteriores se refinaron modificando los reactivos anadidos, tal y como se indica a continuacion: la reaccion se detuvo anadiendo 30 pl de una mezcla 1:1:1 de EDTA sodico 50 mM, tampon a pH 10 y 4- aminoantipirina al 0,2%, y despues 10 pl de ferricianuro potasico al 0,8%.

3.2- Extraccion

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Actividad de la AAD-1 recombinante (v1) expresada en Escherichia coli.

Se resuspendieron sedimentos celulares de E. coli con Tris 0,1 M, pH 7,4 + lisozima 1 mg/ml (5 ml/celulas para un cultivo de 250 ml; 20 ml/celulas para 1 litro) a temperatura ambiente. Transcurridos unos 15 minutos con agitacion ocasional, la suspension se congelo en nitrogeno lfquido y despues se descongelo. Se anadio ADNasa a una concentracion final de 0,02 mg/ml y MgCh a 1 mM. Una vez el extracto perdio la viscosidad, se centrifugo durante 15 min y el sobrenadante se transfirio a una columna BioRad 10DG preequilibrada con MOPS 20 mM pH 6,75 y el eluato se fracciono en alfcuotas y congelo a -70°C. Los analisis se realizaron con estos extractos desalados sin purificar o con las enzimas purificadas.

Con los protocolos descritos anteriormente se extrajo y se valoro el sedimento celular de un cultivo de 250 ml de celulas E. coli inducidas que expresaban el pDAB3203 portador del gen AAD-1 (v1). La actividad degradadora del

2,4-D en el extracto de AAD-1 (v1) se comparo con la de celulas E. coli que expresaban un vector sin AAD-1 (v1) utilizando 2,4-D 1 mM; los resultados se muestran en la Figura 5. La cantidad de 2,4-diclorofenol formada es claramente proporcional a la cantidad de extracto anadido para la valoracion, mientras que el extracto control no muestra ninguna actividad degradadora del 2,4-D.

La actividad de este extracto se analizo con otros cuatro herbicidas, a saber, (R,S)-diclorprop, (R,S)-mecoprop, (R,S)-haloxifop y (R,S)-diclofop y se comparo con la del 2,4-D (todos a una concentracion final de 0,5 mM) con 4 pl de extracto de E. coli por analisis con un periodo de analisis de 15 min. La Figura 6A muestra que la AAD-1 (v1) degrado todos los cinco herbicidas transformandolos en fenol. La actividad relativa sobre los sustratos analizados fue la siguiente: diclorprop = mecoprop > diclofop > haloxifop > 2,4-D. Asf pues, la AAD-1 (v1) despliega actividad tanto contra los graminicidas de ariloxifenoxipropionato como contra los herbicidas auxfnicos fenoxi.

Seguidamente, el extracto de AAD-1 (v1) se analizo con el racemato (R,S)-haloxifop, el R-enantiomero del haloxifop y el S-enantiomero del cihalofop (todos a 0,5 mM) como sustratos potenciales para dilucidar la posible especificidad enantiomerica de la AAD-1 (v1). Los resultados se presentan en la Figura 6B. La actividad de la enzima sobre el (R)- haloxifop resulto equivalente a la manifestada con (R,S)-haloxifop, mientras que no se aprecio actividad alguna con el S-enantiomero del cihalofop, lo que indica que la AAD-1 (v1) presenta una especificidad R en los AOPP.

Ejemplo 4 - Especificidad de sustrato de la AAD-1 (v1)

4.1- Otros sustratos de la AAD-1 (v1).

La especificidad de sustrato de la AAD-1 (v1) hacia diversos herbicidas comerciales y experimentales se analizo empleando AAD-1 (v1) purificada en una concentracion de 1 FALTA ALGO 10 pg por analisis de 160 pl; cada sustrato se analizo a 1 mM, con un tiempo para la valoracion de 15 minutos. La Tabla 3 muestra la A510 detectada despues de la accion de la AAD-1 (v1) sobre diversos herbicidas auxfnicos y analogos auxfnicos de ariloxialcanoato. El mejor sustrato analizado fue el diclorprop, aunque el mecoprop tambien se degrado notablemente. Otros dos fenoxipropionatos, los analogos 4-fluoro y 3-amino del diclorprop, tambien fueron degradados con eficacia por la AAD-1 (v1). La AAD-1 (v1) produjo pequenas cantidades de fenol a partir de diversos fenoxiacetatos, incluido el 2,4- D. Las tasas relativas sobre estos sustratos se aprecian mejor en los analisis realizados con la cantidad mas grande (10 pg) de AAD-1 (v1). De estos datos se deduce que el 2,4-D es degradado por la AAD-1 (v1), al igual que dos fenoxialquilsulfonatos, X188476 y X398166 (sesona).

La Tabla 4 contiene los datos de diversos graminicidas AOPP en calidad de sustratos de la AAD-1, asf como del fitoprotector cloquintocet. Todos los herbicidas AOPP comerciales analizados fueron degradados de manera efectiva por la AAD-1 (v1). Se trata de un descubrimiento inesperado que aumenta enormemente la utilidad potencial de esta enzima para conferir resistencia a una amplia gama de herbicidas graminicidas en aplicaciones transgenicas, ademas de frente a herbicidas auxfnicos. La AaD-1 (v1) presento su mayor actividad contra el quizalofop (76% de la tasa del diclorprop) y la menor contra el cihalofop (27% de la tasa del quizalofop, 21% de la tasa del diclorprop). El analogo ariloxiacetato del haloxifop (X043865) fue degradado muy lentamente, con solo un pequeno aumento de la A510 tras la exposicion a la cantidad mas elevada de enzima (10 pg). Este hecho concuerda con la mayor actividad de la AAD-1 (v1) manifestada contra los fenoxipropionatos respecto a los fenoxiacetatos auxfnicos. La actividad minima se detecto con (S)-cihalofop, lo cual indica que la AAD-1 (v1) presenta una preferencia significativa por los R-enantiomeros de los sustratos ariloxipropionato. De forma similar, no se aprecio actividad contra el cloquintocet, un fitoprotector quinolinoxiacetato, lo que coincide con la observacion de que la AAD-1 (v1) prefiere los sustratos ariloxipropionato a los herbicidas auxfnicos fenoxi.

Los sustratos X11115427, X124987 y MCPA se analizaron a 1 mM empleando 27 pg de AAD-1 (v1) recombinante sin purificar por valoracion. Los tres compuestos fueron degradados por la AAD-1 (v1) pero con diferente efectividad relativa (Tabla 8). El X11115427 actuo como un sustrato ligeramente mejor que el 2,4-D (125% de la tasa del 2,4-D) a diferencia del analogo cercano 3-amino-diclorprop, que es ~7 veces mejor que el 2,4-D como sustrato (Tabla 3). La sustitucion 5-F parece disminuir la efectividad del X11115427 como sustrato de la AAD-1 (v1). Las tasas de formacion de producto correspondientes al 5-F-fenoxiacetato y al MCPA supusieron el 32% y 55% de las del 2,4-D,

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respectivamente.

Tabla 8: Efecto de la AAD-1 (v1) sobre tres substratos respecto al 2,4-D. Los sustratos fueron valorados como se indica en la Tabla 6 a 1 mM utilizando un extracto sin purificar de AAD-1 (v1) recombinante obtenido en E. coli.

Tabla 8. Efecto de la AAD-1 (v1) sobre tres substratos respecto al 2,4-D.

ID de registro

Estructura molecular Compuesto A510 % 2,4-D

195517

Hrvp"° 2,4-D 0,177 100

11115427

o (R,S)-3-amino, 5-F- diclorprop 0,221 125

124987

F 5-F, 2,4-D 0,056 32

192711

HO hfi MCPA 0,097 55

4.2-Analisis cinetico.

Los valores Km y kcat de la AAD-1 (v1) purificada (vease el Ejemplo 10) se calcularon con cuatro sustratos herbicidas, a saber: (R)-diclorprop, (R)-haloxifop, (R)-quizalofop y 2,4-D, en condiciones de analisis estandar (MOPS 25 mM a pH 6,8; ascorbato sodico 200 pM; Fe2+ 200 pM; a-cetoglutarato 1 mM; 25°C). Las curvas dosis-respue sta se ajustaron con Grafit (Erithacus Software, Reino Unido) y las graficas y las constantes obtenidas se muestran en la Figura 7 y la Tabla 9. Los valores Km de los cuatro sustratos resultaron bastante similares (75-125 pM), pero los valores kcat variaron sustancialmente. El (R)-diclorprop presento el valor kcat mas alto y el 2,4-D el mas bajo (10% del valor del (R)-diclorprop). Estos valores kcat concordaron con el rango de valores observado en los ensayos de especificidad para el sustrato que aparecen en las Tablas 3 y 4, ya que estos se realizaron con elevadas (saturantes) concentraciones de sustrato (1 mM).

Tabla 9: Constantes cineticas de los sustratos de la AAD-1 (v1). Las constantes cineticas se calcularon con los datos de la Figura 7 aplicando un ajuste con Grafit a la ecuacion de Michaelis-Menten.

Tabla 9. Constantes cineticas de los sustratos de la AAD-1 (v1).

Sustrato

Km(pM) ±SE Vmax (pmol min-1 mg-1 AAD1) ± SE kcat (min-1) kcat/Km (min-1 mM-1)

R-diclorprop

75 ± 10 0,79 ±0.03 26,1 348

R-quizalofop

125 ±20 0,57 ± 0.03 18,9 151

R-haloxifop

120 ±54 0,34 ± 0.04 11,2 94

2,4-D

96 ±8 0,57 ±0.00 2,7 28

Los valores relativos de Km y kcat correspondientes al diclorprop y al 2,4-D difirieron significativamente de los publicados para la dioxigenasa R-especffica de Delftia acidovorans por Westendorf et al. (2003) (Acta Biotechnol. 23: 3-17). El valor kcat/Km publicado del 2,4-D supone el 0,6% del valor del diclorprop, mientras que en nuestros estudios, el valor kcat/Km del 2,4-D supone el 8% del de diclorprop. Por tanto, en el presente estudio, la AAD-1 (v1) resulto inesperadamente eficaz a la hora de catalizar la degradacion del 2,4-D. Esto aumenta su utilidad potencial para conferir diversos caracteres de tolerancia a herbicidas en aplicaciones transgenicas.

4.3-Otros sustratos de la AAD-1 (v1).

Tres sustratos mas se analizaron a 1 mM utilizando 27 pg de AAD-1 recombinante (v1) bruta por valoracion: X11115427, X124987 y MCPA. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Los tres compuestos fueron degradados por la AAD-1 (v1), pero con diferente efectividad relativa. El X11115427 solo fue ligeramente mejor (125%) como

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sustrato que el 2,4-D. Esto contrasta con el 3-aminodiclorprop, que es >7 veces mejor que el 2,4-D como sustrato (Tabla 3). Por tanto, la sustitucion 5-F redujo significativamente la efectividad del Xl1l15427 como sustrato para la AAD-1 (v1). Una tendencia similar se observo en el caso del 5-F-2,4-D, que solo alcanzo una efectividad del 32% como sustrato respecto al 2,4-D. En este analisis, el MCPA tambien resulto menos efectivo como sustrato de la AAD-1 (v1) (55% respecto al 2,4-D).

Ejemplo 5 - Optimizacion de la secuencia para la expresion en vegetales

5.1- Antecedentes.

A fin de obtener una elevada de expresion de genes heterologos en vegetales, puede ser preferible modificar con tecnicas de ingenierfa genetica dichos genes para que se expresen con mas eficiencia en (el citoplasma de) las celulas vegetales. El mafz es una de las especies vegetales en las que puede ser preferible redisenar el gen o genes heterologos antes de la transformacion para aumentar su nivel de expresion en la planta. Por consiguiente, un paso adicional en el diseno de genes que codifican una protefna bacteriana consiste en modificar el gen heterologo para lograr una expresion optima.

Uno de los motivos para modificar con tecnicas de ingenierfa genetica una protefna bacteriana que pretenda expresarse en el mafz radica en el contenido inadecuado de G+C del gen original. Por ejemplo, el contenido sumamente bajo de G+C de muchos genes bacterianos (y por tanto, la tendencia a un elevado contenido de A+T) da lugar a secuencias que imitan o duplican las secuencias de control genico de los vegetales que son muy ricas en A+T. La presencia de ciertas secuencias ricas en A+T en el ADN del gen o genes introducidos en las plantas puede ocasionar una transcripcion aberrante (por ejemplo, las regiones TATA box que suelen hallarse en los promotores genicos). Por otro lado, la presencia de otras secuencias reguladoras en el ARNm transcrito (por ejemplo, secuencias de senal de poliadenilacion (AAUAAA), o secuencias complementarias a los ARN nucleares pequenos implicados en el empalme del pre-ARNm) puede provocar inestabilidad en el ARN. Asf pues, un objetivo en el diseno de genes que codifican una protefna bacteriana que se pretende expresar en mafz, preferiblemente denominados genes optimizados para vegetales, consiste en crear una secuencia de ADN con un contenido mas elevado de G+C que, preferiblemente, resulte similar a la de los genes del mafz que codifican las enzimas metabolicas. Otro objetivo en el diseno de los genes optimizados para vegetales que codifican una protefna bacteriana consiste en generar una secuencia de ADN cuyas modificaciones no obstaculicen su traduccion.

La Tabla 10 ilustra el elevado contenido de G+C del genoma del mafz. Las regiones codificantes de los genes se extrajeron de las entradas del GenBank (Release 71) y las composiciones de bases se calcularon con el programa MacVector™ (Accelerys, San Diego, California, EE.UU.). Las secuencias intronicas no se tuvieron en cuenta en los calculos.

Tabla 10: Compilacion de contenidos G+C en las regiones codificantes de protefnas de genes del mafz

Clase de protefna a

Rango % G + C Media % G + C b

Enzimas metabolicos (76)

44,4-75,3 59,0 (+- 8,0)

Protefnas estructurales (18)

48,6-70,5 63,6 (+- 6,7)

Protefnas reguladoras (5)

57,2-68,8 62,0 (+- 4,9)

Protefnas sin caracterizar (9)

41,5-70,3 64,3 (+- 7,2)

Todas las protefnas (108)

44,4-75,3 60,8 (+- 5,2)

a El numero de genes de la clase se indica entre parentesis.

b Valores de la desviacion estandar indicados entre parentesis.

c La media de los grupos combinados no se tuvo en cuenta en el calculo de la media.

Debido a la flexibilidad proporcionada por la redundancia/degeneracion del codigo genetico (algunos aminoacidos son codificados por mas de un codon), la evolucion de los genomas en distintos organismos o clases de organismos se ha decantado hacia un uso diferencial de codones redundantes. Esta “preferencia codonica” queda reflejada en la composicion media de bases de las regiones codificantes de protefnas. Por ejemplo, los organismos con un contenido relativamente bajo de G+C utilizan codones portadores de A o T en la tercera posicion de los codones redundantes, mientras que aquellos con contenidos de G+C mas altos utilizan codones cuya tercera posicion acoge G o C. Se cree que la presencia de codones “menores” dentro del ARNm podrfa reducir su tasa absoluta de traduccion, especialmente cuando la abundancia relativa del ARNt cargado correspondiente al codon menor es baja. Una consecuencia de esto es que la disminucion de la tasa de traduccion por codones menores individuales serfa como mfnimo aditiva para los codones menores multiples. Y, por consiguiente, los ARNm cuyo contenido de codones menores sea relativamente alto tendran bajas tasas de traduccion. Y esto, a su vez, darfa como resultado niveles bajos de la protefna codificada.

En genes modificados geneticamente que codifican una protefna bacteriana para ser expresada en mafz (u otra planta, como el algodon o la soja) se ha determinado la preferencia codonica de la planta. La preferencia codonica

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del mafz es la distribucion estadfstica de los codones que la planta utiliza para codificar sus protefnas; los codones utilizados con mas preferencia se muestran en la Tabla 11. Una vez determinada la preferencia, se determina la frecuencia porcentual de los codones en el gen o genes de interes. Deben averiguarse que codones son preferidos en primer lugar por la planta, asf como las segundas, terceras y cuartas opciones de codones, en el caso de que existan. Entonces se puede disenar una nueva secuencia de ADN que codifique la secuencia de aminoacidos de la protefna bacteriana, pero esta nueva secuencia de ADN diferira de la secuencia bacteriana original (que codifica la protefna) por la sustitucion con codones vegetales (primera, segunda, tercera o cuarta opcion preferidas) para especificar el aminoacido en cada posicion de la secuencia proteica. A continuacion, la nueva secuencia se analiza para detectar dianas de restriccion que se hayan podido crear accidentalmente a rafz de la modificacion. Las dianas identificadas son modificadas reemplazandolas por codones de primera, segunda, tercera o cuarta opcion. Otros lugares de la secuencia que pueden alterar la transcripcion o la traduccion del gen de interes son las uniones ex6n:intron (5' o 3'), senales de adicion de poli A, o senales de terminacion para la ARN polimerasa. La secuencia se vuelve a analizar y a modificar para reducir la frecuencia de dobletes Ta o GC. Ademas de los dobletes, los segmentos de secuencia G o C que contienen mas de cuatro residuos iguales aproximadamente pueden afectar a la transcripcion de la secuencia y, por consiguiente, estos bloques tambien se modifican sustituyendo los codones de primera o segunda eleccion, etc. con la siguiente opcion preferida.

Tabla 11. Codones de aminoacidos preferidos para las

protefnas expresadas en el mafz

Aminoacido

Codon*

Alanina

GCC/GCG

Cistefna

TGC/TGT

Acido aspartico

GAC/GAT

Acido glutamico

GAG/GAA

Fenilalanina

TTC/TTT

Glicina

GGC/GGG

Histidina

CAC/CAT

Isoleucina

ATC/ATT

Lisina

AAG/AAA

Leucina

CTG/CTC

Metionina

ATG

Asparragina

AAC/AAT

Prolina

CCG/CCA

Glutamina

CAG/CAA

Arginina

AGG/CGC

Serina

AGC/TCC

Treonina

ACC/ACG

Valina

GTG/GTC

Triptofano

TGG

Tirosina

TAC/TAT

Parada

TGA/TAG

Se prefiere que los genes optimizados para vegetales que codifican una protefna bacteriana contengan alrededor del 63% de codones de primera eleccion, entre aproximadamente el 22% y aproximadamente el 37% de codones de segunda eleccion y entre alrededor del 15% y alrededor del 0% de codones de tercera o cuarta eleccion, hasta sumar el porcentaje total del 100%. Los genes optimizados para vegetales preferidos principalmente contienen alrededor de un 63% de codones de primera eleccion, al menos aproximadamente un 22% de codones de segunda eleccion, aproximadamente un 7,5% de codones de tercera eleccion y aproximadamente un 7,5% de codones de cuarta eleccion, hasta sumar el porcentaje total del 100%. El metodo descrito permite a un experto en la materia modificar un gen o genes que son foraneos para una planta dada, de modo que se expresen optimamente en plantas. El metodo se muestra con mas detalle en la solicitud PCT WO 97/13402.

Asf pues, el diseno de genes optimizados para vegetales que codifiquen una protefna bacteriana pasa por disenar una secuencia de ADN que codifique la secuencia de aminoacidos de dicha protefna utilizando un codigo genetico redundante confeccionado a partir de una tabla de preferencia codonica compilada a partir de las secuencias genicas de esa planta en particular. La secuencia de ADN resultante posee un mayor grado de diversidad codonica, una composicion de bases conveniente, puede contener dianas para enzimas de restriccion ubicadas estrategicamente y carece de secuencias que puedan interferir con la transcripcion del gen o con la traduccion del ARNm resultante. De ese modo, los genes sinteticos que sean funcionalmente equivalentes a las protefnas/genes de la presente invencion se podran utilizar para transformar hospedadores, incluidas plantas. Se pueden encontrar mas directrices sobre la produccion de genes sinteticos en, por ejemplo, la patente US n° 5.380.831.

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5.2 - Analisis de la reconstruccion

El analisis exhaustivo de las 888 pares de bases (pb) de la secuencia de ADN de la region codificante original del AAD-1 (v1) (SEC ID n° 3) revelo la presencia de varios motivos de secuencia que se cree que afectan negativamente a la expresion optima en vegetales, asf como una composicion codonica que no resulta optima. Para mejorar la produccion de la protefna recombinante tanto en monocotiledoneas como en dicotiledoneas, se desarrollo una secuencia de ADN “optimizada para vegetales” (SEC ID n° 5) que codifica la SEC ID n° 11, que es la misma que la SEC ID n° 9 original excepto por la adicion de un residuo de alanina en la segunda posicion. El codon adicional de alanina (GCT; subrayado en la SEC ID n° 5) se incluyo para codificar una diana para Nco I (CCATGG) que abarcaba el codon de inicio ATG, para permitir posteriores operaciones de clonacion. Las protefnas codificadas por las regiones codificantes original (v1) y optimizadas para vegetales (v3) son identicas en un 99,3%, difiriendo unicamente en el aminoacido numero 2. En cambio, las secuencias de ADN original (v1) y optimizadas para vegetales (v3) de las regiones codificantes unicamente son identicas en un 77,7%. Se efectuo una alineacion de la secuencia del ADN original y del ADN optimizado para vegetales y en la Tabla 12 se muestran las diferencias en la composicion codonica de la secuencia original y de la secuencia optimizada para plantas.

Tabla 12. Comparacion de la composicion codonica de la region codificante del AAD-1 (v1) original y de su version optimizada para vegetales.

Amino acido

Codon N.° gen original % gen origi-nal N.° gen opt. plantas % gen opt. plantas Amino acido Codon N.° gen original N.° gen opt. plantas % gen opt. plantas

ALA (A)

GCA 2 9,1 5 22 LEU (L) CTA 0 0,0 0 0

GCC

10 45,5 8 35 CTC 5 22,7 7 32

22

GCG 9 40,9 0 0 CTG 16 72,7 0 0

GCT 1 4,5 10 43 22 CTT 0 0,0 8 36

ARG (R)

AGA 0 0,0 7 30 TTA 0 0,0 0 0

AGG

0 0,0 7 30 TIG 1 4,5 7 32

CGA 0 0,0 0 0 LYS (K) AAA 1 14,3 2 29

23

CGC 16 69,6 5 22 7 AAG 6 85,7 5 71

CGG 4 17,4 0 0 MET(M) ATG 8 100 8 100

CGT 3 13,0 4 17 PHE(F) TTC 10 76,9 9 69

ASN (N)

AAC 8 100,0 4 50 13 TTT 3 23,1 4 31

8

AAT 0 0,0 4 50 PRO (P) CCA 1 5,9 8 47

ASP(D)

GAC 15 78,9 10 53 CCC 9 52,9 1 6

19

GAT 4. 21,1 9 47 17 CCG 7 41,2 o- 0

CYS (C)

TGC 3 100,0 2 67 CCT 0 0,0 8 47

3

TGT 0 0,0 1 33 SER (S) AGC 11 73,3 4 27

END

TAA 0 0,0 0 0 AGT 0 0,0 0 0

1

TAG 1' 100,0 0 0 15 TCA 0 0,0 4 27

TGA 0 0,0 1 100 TCC 2 13,3 3 20

GLN (Q)

CAA 0 0,0 7 54 TCG 2 13,3 0 0

13

CAG 13 100,0 6 46 TCT 0 0,0 4 27

GLU (E)

GAA 8 50,0 5 31 THR (T) ACA 1 4,3 6 26

16

GAG 8 50,0 11 69 ACC 16 69,6 9 39

GLY (G)

GGA 0 0,0 6 29 23 ACG 5 21,7 0 0

GGC

15 71,4 7 33 ACT 1 4,3 8 35

21

GGG 3 14,3 2 10 TRP(W) TGG 5 100 5 100

GGT 3 14,3 6 29 TYR (Y) TAC 7 70,0 6 60

HIS(H)

CAC 6 60,0 5 50 10 TAT 3 30,0 4 40

10

CAT 4 40,0 5 50 VAL(V) GTA 2 7,1 0 0

ILE(I)

ATA 0 0,0 3 25 GTC 11 39,3 8 29

12

ATC 12 100,0 5 42 28 GTG 15 53,6 10 36

ATT 0 0,0 4 33 GTT 0 0,0 10 36

Totales

148 149 Totales 148 148

5.3 - Construccion de los vectores binarios

5.3.1- AAD-1 reconstruido (v3).

El gen optimizado para vegetales AAD-1 (v3) fue suministrado por Picoscript (acabado el diseno de reconstruccion del gen (vease arriba), la sfntesis se encargo a Picoscript) y la secuencia (SEC ID n° 5) se verifico internamente para confirmar que no contenfa alteraciones respecto a la secuencia esperada. Las reacciones de secuenciacion se llevaron a cabo con cebadores directos de M13 (SEC ID n° 16) e inversos de M13 (SEC ID n° 17) utilizando

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reactivos del “Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit” de Beckman Coulter como se ha indicado antes. Los datos de la secuencia se analizaron y los resultados indicaron que la secuencia de ADN del AAD-1 (v3) optimizado para plantas no contenfa anomalfas. El gen AAD-1 (v3) se clono en pDAB726 como un fragmento Nco I- Sac I. El constructo resultante se diseno como un pDAB720, que contenfa: [promotor AtUbi10: Nt OSM 5'UTR; AAD- 1 (v3): Nt OSM3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR] (verificado con digestiones con la enzima de restriccion Not I). Un fragmento Not I-Not I que contenfa la casete descrita se clono a continuacion en el sitio Not I del vector binario pDAB3038. El vector binario resultante, pDAB721, que contenfa la siguiente casete [promotor AtUbi10: Nt OSM5'UTR: AAD-1 (v3): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR] se digirio con enzimas de restriccion (Bam HI, EcoR I, EcoR V, HinD III, Pac I y Xmn I) para verificar que la orientacion era correcta. El constructo acabado y verificado (pDAB721) se empleo para la transformacion en Agrobacterium (vease el apartado 6.2).

5.3.2-AAD1 natural (v1) y AAD-1 modificado (v2).

El gen AAD-1 (v1) (SEC ID n° 3) se amplifico con PCR a partir del pDAB3203. Durante la reaccion de PCR, se modificaron los cebadores para introducir dianas de restriccion para NcoI y SacI en el cebador 5' y en el cebador 3', respectivamente. Para amplificar el fragmento de ADN se emplearon los cebadores “rdpA(ncoI)” [CCC ATG GCT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC] (SEC ID n° 6) y “3' saci” [GAG CTC ACT AGC GCG CCG GGC GCA CGC CAC CGA] (SEC ID n° 7) con el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter).

El amplicon de PCR se ligo a un vector de clonacion pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) y la secuencia se verifico con cebadores directos de M13 (SEC ID n° 16) e inversos de M13 (SEC ID n° 17) utilizando los reactivos de secuenciacion del “Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit” de Beckman Coulter.

Los datos de secuenciacion identificaron a un clon con la secuencia correcta. Durante el analisis se descubrio una diana de restriccion para NotI que era superflua, situada hacia el extremo 3' del AAD-1 (v1). Esta diana se elimino para facilitar la clonacion en pDAB3038; para eliminarla se llevo a cabo una reaccion de PCR con un cebador 5' interno. La diana de NotI se altero incorporando un nuevo codon para un aminoacido con el fin de eliminar la diana falsa de NotI. Este cambio alterarfa la arginina de la posicion 212 convirtiendola en una cistefna. Se usaron los cebadores de PCR “BstEII/Del NotI” [TGG TGG TGA CCC ATC CGG GCA GCG GCT GCA AGG GCC] (SEC ID n° 8) y “3' saci” (SEC ID n° 7).

Se realizo una reaccion PCR con el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter) y el fragmento resultante se clono en el kit de clonacion pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen). La confirmacion del producto de PCR correcto se llevo a cabo secuenciando el ADN y el gen “fijado” recibio la designacion de AAD-1 (v2) (SEC ID n° 4).

La reaccion de secuenciacion con el cebador inverso de M13 (SEC ID n° 17) y los reactivos de secuenciacion “Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit” de Beckman Coulter indico que se habfa aislado el fragmento de PCR correcto. Este constructo se digirio con las enzimas BstEII y SacI. El fragmento resultante se clono en el constructo pCR2.1 AAD-1 (v2) (pCR2.1 Delta NotI) y se confirmo mediante una digestion con enzima de restriccion.

Acto seguido, el gen AAD-1 (v2) modificado se clono en el pDAB726 en forma de un fragmento de ADN NcoI/SacI. El constructo resultante (pDAB708) se verifico con digestiones por enzimas de restriccion y despues se clono en el vector binario pDAB3038 como un fragmento NotI-NotI. El constructo final resultante recibio la designacion pDAB766, que contenfa el [promotor AtUbi10: Nt OSM5'UTR: AAD-1 (v2): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR] y fue digerido con enzimas de restriccion para verificar que la orientacion era correcta. El constructo acabado se uso entonces para la transformacion en Agrobacterium.

5.3.3 - Diseno de una secuencia de ADN con codones adaptados a la soja que codifica una EPSPS de soja portadora de mutaciones que confieren tolerancia al glifosato.

Este ejemplo ilustra el diseno de una nueva secuencia de ADN que codifica una 5-enolpiruvoilshikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS) mutante de soja, optimizada para la expresion en celulas de soja. La secuencia de aminoacidos de una EPSPS de soja con tres mutaciones se muestra como la SEC ID n° 5 del documento WO 2004/009761. Los aminoacidos mutados en dicha secuencia son el residuo 183 (treonina de la protefna original sustituida por una isoleucina), residuo 186 (arginina de la protefna original sustituida por una lisina) y residuo 187 (prolina de la protefna original sustituida por una serina). Asf pues, es posible deducir la secuencia de aminoacidos de la protefna EPSPS de soja original reemplazando los aminoacidos sustituidos de la SEC ID n° 5 del documento WO 2004/009761 con los aminoacidos originales en las posiciones adecuadas. Esta secuencia original de la protefna se presenta en la presente memoria como la SEC ID n° 20. En la presente memoria tambien se expone una secuencia de protefna EPSPS de soja portadora de dos mutaciones, a saber, una mutacion en el residuo 183 (treonina de la protefna original sustituida por una isoleucina) y en el residuo 187 (prolina de la protefna original sustituida por una serina), presentada en la presente memoria como la SEC ID n° 21.

A partir de la pagina web “kazusa.or.jp/codon” se obtuvo una tabla de uso de codones correspondiente a las

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   1. Metodo de control de por lo menos una mala hierba en una zona, en el que dicha zona comprende al menos una planta transgenica, comprendiendo dicha planta transgenica un polinucleotido aislado que codifica una protefna que degrada enzimaticamente un herbicida seleccionado de entre el grupo constituido por un herbicida fenoxi auxina y un herbicida ariloxifenoxipropionato, en el que dicha protefna es identica por lo menos 70% a una protefna codificada por una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 3, SEC ID n°: 4 y SEC ID n°: 5, en el que dicho polinucleotido se hibrida en condiciones restrictivas con el complemento completo de una molecula de acido nucleico que codifica la SEC ID n° 9, en el que dicha planta expresa dicho nucleotido y produce dicha protefna, en el que dicho metodo comprende la aplicacion de dicho herbicida en dicha zona.
2. 2. Metodo de control de por lo menos una mala hierba en una zona, en el que dicha zona comprende por lo menos una planta transgenica, comprendiendo dicha planta transgenica un polinucleotido aislado que codifica una protefna que degrada enzimaticamente

   (i) un R-enantiomero de herbicidas fenoxi auxina quiral ademas de fenoxi auxinas aquirales,

   (ii) un herbicida ariloxifenoxipropionato, o

   (iii) un herbicida fenoxi auxina y un herbicida ariloxifenoxipropionato,

   en el que dicho polinucleotido hibrida en condiciones restrictivas con un complemento completo de una molecula de acido nucleico que codifica SEC ID n°: 9, en el que dicha planta expresa dicho polinucleotido y produce dicha protefna, en el que dicho metodo comprende aplicar dicho herbicida a dicha zona.
3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho metodo incluye aplicar dicho herbicida a dicha planta.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho herbicida es un herbicida fenoxi auxina, preferentemente un herbicida 2,4-D.
5. 5. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho herbicida comprende la estructura qufmica siguiente

   o

   o una sal de la misma.
6. 6. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo ademas dicha planta uno o varios otros genes de resistencia a herbicida.
7. 7. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo ademas dicha planta una caracterfstica de tolerancia al glifosato y una caracterfstica de tolerancia al glufosinato, y comprendiendo dicho metodo aplicar 2,4-D, glifosato y glufosinato a dicha zona.
8. 8. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo ademas dicha planta un gen para la tolerancia al dicamba, y comprendiendo dicho metodo aplicar dicamba a dicha zona.
9. 9. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo ademas dicha planta un gen para la tolerancia a un herbicida que es un inhibidor de la acetolactato sintasa.
10. 10. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo ademas dicha planta un gen para la tolerancia al glufosinato.
11. 11. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha planta es una planta de mafz.
12. 12. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho herbicida se aplica en la presiembra, preemergencia y/o posemergencia de dicha planta.
13. 13. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho metodo comprende plantar una semilla en dicha zona, y permitir que dicha semilla se convierta en dicha planta.
14. 14. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que dicha aplicacion se lleva a cabo en la preemergencia de dicha planta.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40
15. 15. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo dicha protefna la secuencia de aminoacidos de la SEC ID n°: 9 o una variante de la misma en el que dicha variante presenta una actividad dioxigenasa dependiente de alfa- cetoglutarato, por lo menos una eliminacion de aminoacido o una sustitucion conservadora, y una identidad de secuencia de por lo menos 95% con la SEC ID n° 9.
16. 16. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que las malas hierbas resistentes al glifosfato son controladas en un campo de plantas de cultivo tolerantes al glifosfato.
17. 17. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha zona es un campo y dicho metodo comprende aplicar dicho herbicida a dicho campo y plantar una semilla en dicho campo en el plazo de 14 dfas desde la aplicacion de dicho herbicida, y permitir que dicha semilla se convierta en dicha planta transgenica.
18. 18. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho metodo comprende aplicar un herbicida original a dicha zona.
19. 19. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho metodo comprende aplicar uno o mas herbicidas a dicha zona, preferentemente de manera secuencial y/o a partir de una mezcla en tanque o simultaneamente.
20. 20. Metodo de control de por lo menos una mala hierba en un campo, en el que dicho campo contiene por lo menos una planta que comprende un polinucleotido aislado que codifica una protefna que degrada enzimaticamente un herbicida seleccionado de entre el grupo que consiste en una fenoxi auxina y un ariloxifenoxipropionato, en el que dicha protefna es identica por lo menos 70% a una protefna codificada por una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 3, SEC ID n°: 4 y SEC ID n°: 5, en el que dicha molecula de acido nucleico que codifica dicha protefna hibrida en condiciones restrictivas con el complemento completo de una secuencia especificada por la SEC ID n°: 5 y en el que dicho polinucleotido esta ligado funcionalmente a un promotor que es funcional en una celula vegetal, en el que el metodo comprende aplicar una combinacion de herbicidas a dichos campos.
21. 21. Metodo de control de por lo menos una mala hierba en un campo, en el que dicho campo contiene por lo menos una planta que comprende un polinucleotido aislado que codifica una protefna que degrada enzimaticamente

    (i) un R-enantiomero de herbicidas fenoxi auxina quiral ademas de fenoxi auxinas aquirales,

    (ii) un herbicida ariloxifenoxipropionato, o

    (iii) un herbicida fenoxi auxina y un herbicida ariloxifenoxipropionato,

    en el que dicha molecula de acido nucleico que codifica dicha protefna hibrida en condiciones restrictivas con el complemento completo de una secuencia especificada por SEC ID n°: 5 y en el que dicho polinucleotido esta ligado funcionalmente a un promotor que es funcional en una celula vegetal, en el que el metodo comprende aplicar una combinacion de herbicidas a dichos campos.
22. 22. Metodo segun la reivindicacion 20 o 21, en el que dicha combinacion de herbicidas comprende 2,4-D.

    imagen1

    Adicion de 02 es estereoespecifica

    Descomposicion del intermediario a fenol + glioxilato es espontanea

    fenol

    glioxilato

    Fig. 1

    imagen2

    100

    10 DO

    Concentracion de 2,4-D en los medios antes de la incubacion

    Bioanahsis de raices de Arabidopsis (+)

    ~23 nM

    Control del vector pET en el bioanahsis de raices de Arabidopsis (+)

    ~22 nM

    Estirpe de Arabidopsis empleada en el bioanahsis de raices(+) I50

    >500 nM

    Fig. 2

    Ensayo en placa con Arabidopsis Efecto sobre el alargamiento de las raices provocado por la solucion de reaccion a base de 2,4-D + extracto de AAD-1 (v1)

    Longitud de las raices - % del control

    113

    Efecto sobre raices + brotes de agrostide estolonifera provocado por la solucion de reacclon a base de haloxifop + extracto de AAD-1 (v1)

    Raices -- % del control

    imagen3

    Concentracion de haloxifop en los medios antes de la incubacion

    Raices + brotes en agrostide estolonifera por haloxifop mediante pET I50

    Raices + brotes en agrostide estolonifera por haloxifop mediante 3203 I50

    ~22 nM -520 nM

    Fig. 3

    114

    o

    imagen4

    o

    Cl

    2,4-0

    AAD-1 fV1)

    imagen5

    Cl

    Dichlorprop

    AAD-1 {V1)

    imagen6

    AAD-T (V1}

    imagen7

    0 AAD-1 (V1)

    Quizalofop

    Fig. 4

    imagen8

    imagen9

    imagen10

    115

    imagen11

    imagen12

    2 4 6 8

    Extracto, |jl

    Fig. 5

    imagen13

    Absorbancia (510 nm)

    o k> cn bo

    2,4-D 1 ' i 1 K 1 4 • 1 i J

    -ig. 6A

    (RS)-dichtorprop (RS)-mecoprop

    (RS)-haloxyfop pa '

    (RS)-diclofop —l—j—,—i_____,_____i_____

    Absorbancia (510 nm)

    RS-dichlorprop

    RS-haloxyfop

    R-haloxyfop

    S-cyhalofop

    “‘J’ 7^'-*' 'Vt?T^r“~V—‘-'J • — :: ' • : - ' • ’ ' ■ ■ - .1-' •• ■ ! . • ■ . ' ■

    J

    '4: ■Hi- *

    ' , H

    ip

    —«1—*—1—*—1—1—1—1—lj_____J_ _l_____

    117

    imagen14

    imagen15

    R-diichlorprop -O- R-quizalofop -O- R-haloxyfop

    ,4-D

    500 1000 1500 2000

    Sustrato (pM)

    Fig. 7

    imagen16

    119

    25

    20

    Dano

    15

    10

    □ 4 DAT ■ 14 DAT

    5

    0

    imagen17

    200 BOO 3200 010.013

    (Tolerancia baja)

    0 200 &QQ 3200
23. 003.043

    (Tolerancia media)

    imagen18

    0 200 800 3200
24. 315.076

    (Tolerancia alta)

    imagen19
25. 345.163

    (Tolerancia alta)

    ___________________________J

    1.200%-

    1.000%--------------

    % nivel de expresion
26. 0.800%-
27. 0.600%
28. 0.40D%- “ 0.200%- 0.00Q%“

    imagen20

    Respuesto al dosis 4 DAT

    S3 003.043 (Tolerancia media) ■ 010.013 (Tolerancia baja) EH 315.076 (Tolerancia alta) 345.163 (Tolerancia alta)

    imagen21

    200

    Dosis de 2,4-D (g/ha)

    0,400
29. 0.35013

    imagen22

    imagen23

    j^| 003.043 (Tolerancia media)

    || 010.013 (Tolerancia baja) I I 315.076 (Tolerancia alta) [yv] 345.163 (Tolerancia alta)

    imagen24

    0

    200

    600

    3200

    Dosis de 2,4-D (g/ha)

    imagen25

    PMYC375! PAT * GrytF T3

    1 DO -

    p DAB 721 Ubi:AAD-1 *

    Csvrnv :PAT T5

    60

    Wrfstype

    PDAS3230 (C*VMV:AA0-1 +

    50

    LJhi1Q:[TPSPS-TlPS)

    T.00
30. 10.00
31. 100.00
32. 1000.00
33. 10000.00

    Dosis de glifosato (log)

    Fig. 10

    123

    Aumento medio de peso fresco

    O 2 semanas ■ 4 semanas

    4000%

    3500%

    3000%

    2500%

    2000%

    1000%

    500%

    0%

    0

    30

    100

    300

    [Acido haloxifop] en nM

    Fig. 11

    3438%

    L

    . .

    V

    1 R7% 02%

    Control

    bialafos

    124

    Aumento medio de peso fresco

    2000%

    __ □ 2 semanas

    ■ 4 semanas

    imagen26

    1 pM R- Bialafos acido cihalofop

    [Cihalofop-fenol] en nM

    Fig. 12

    125

    Aumento medio de peso fresco

    □ natural

    3404-006

    4000 ■

    imagen27

    100 400 Control

    bialafos

    Haloxifop en Gallant* Super, en nM

    126

    imagen28

    Respuesta de maiz AAD1 (v3) T0 a dos AOPP (7DAT)

    No r Transformado

    ^ transformado g jBBgOgMfcjfe [ jm

    N.°eventoT0 q^q

    072 I 022 031 053

    N.° cion 006

    007 \ 016 016 016

    Proteina AAD-1 i »

    tf^J'i'iULii—. ml — + + +

    17,5 g/ha Quizalofop

    N.° evento TO

    018 072 022 031 053

    N.° cion

    007 008 017 018 021

    Proteina AAD-1

    1 - + +

    127

    Expresion (% TSP)

    0,0201)%?
34. 0.0180% ■

    0 0160%

    0,0140%
35. 0.0120%
36. 0.0100%
37. 0.0060%

    0,0060%
38. 0.0040%
39. 0.0020%
40. 0.0000^

    0 g?ha

    Expresion de AAD-1 (v3) en hojas de maiz a los 30 DAT

    imagen29
41. 8.8 g/h a 35 g/h a 140 g/ha

    Dosis de quizalofop

    500 g/ha

    2240 gitia

    imagen30

    Respuesta de maiz a 280 g e.a./ha quizalofop* 9 DAA

    m . ■ ■

    £v>>- . *V ■ J- ■ -J 0 • v- . V• it .■ .'

    F •'• '■ ' ■■•• T | . 1 ■

    ’ '*• ' • ' ,\l '. .

    / ' &SK- > . :.*■ A ’■ .u •s*t i

    - i

    ~ ; :’V: te;

    (No transformados) ^ ' /v ";. (Transformados con AAD-1)

    rate Aplicado en el estadio de crecimiento v3 u* "'

    ■ • -#■ ■ ' *•••• • .

    Fig. 16

    129

    % Callo embriogenico, formacion

    ^20%

    imagen31

    10 30 100 300 Control 100nM

    bialafos Pursuit®

    □ 2 semanas ■ 4 semanas

    [Acido R-cihalofop] en nM

    Fig. 17

    imagen32

    MW fkOal

    148

    mm

    -n: ->

    Western

    Linea

    Callo N° 1

    Callo N

    Negativo

    Mai'z AAD1

    Patron 5 |jg/ml

    Patron 0,5 |jg/ml

    Fig. 18

    Dosis relativa

    imagen33

    0 200 400 600 800

    [2,4-D], MM

    Fig.

    imagen34

    imagen35
42. 2.4- D 3202 AAD-2
43. 2.4- D 3203 AAD-1

    ■i _L_-, 1000

    CO

    ro

    imagen36

    ► 1 ir'j-

    ’JQS.1

    .. . . ,v

    Familia Tt AAD-2 (gen natural)

    Familia T1 AAD-1 (v3) (gen optimizado para vegetales)

    AAD-1 natural y reconstruida frente a AAD-2 natural transformada Respuesta de Arabidopsis al 2,4-D (g e.a./ha) (7DAT) Familia AAD-1 (v2) (gen natural)

    BDO

    Fig. 20

    133

    imagen37

    CrylF [Patron (|jg.ml) Control

    % de dano en T1 a los 14 DAT con 2,4-D

    100 70 80' 90 80 90 GO

    imagen38

    55 56 57 58 59 60 61

    Plantas individuales de Arabidopsis AAD-2

    Fig. 21

    <t— AAD-2

    134

    Fig. 22

    2t40

    RS-dichlorprop

    RS-haioxyfop

    R-haoxyfop