ES2406809T5 - Nuevos genes de resistencia a los herbicidas - Google Patents

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Description

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DESCRIPCION
Nuevos genes de resistencia a los herbicidas.
Antecedentes de la invencion
Las malas hierbas pueden privar al suelo con rapidez de los nutrientes que los cultivos y otras plantas utiles necesitan, y para mantenerlas bajo control se recurre a una multitud de herbicidas distintos; uno de los mas utilizados es el glifosato.
Diversos cultivos como el mafz, soja, canola, algodon, remolacha azucarera, trigo, arroz y cesped, han sido desarrollados para convertirlos en resistentes al glifosato. Asf, por ejemplo, es posible sembrar los campos con mafz resistente al glifosato para mantener a raya las malas hierbas sin causar danos importantes a las plantas de mafz.
A mediados de los anos 90, gracias a las tecnicas de ingenierfa genetica surgieron los cultivos tolerantes al glifosato (GTC, por sus siglas en ingles): con ellos los cultivadores tuvieron a su disposicion una herramienta sencilla, comoda, flexible y asequible para controlar una amplia gama de malas hierbas latifolias y gramfneas, nunca vista en agricultura. Los productores adoptaron rapidamente los GTC y, en muchos casos, abandonaron muchas de las mejores practicas agronomicas como la rotacion de cultivos, la rotacion en el mecanismo de accion del herbicida, el uso de mezclas en tanque y la incorporacion del control mecanico al control de las malas hierbas por medios qufmicos y culturales. En la actualidad, en Estados Unidos y en otros pafses del hemisferio occidental se pueden adquirir variedades comerciales tolerantes al glifosato de soja, algodon, mafz y canola, y otros cultivos GTC (trigo, arroz, remolacha azucarera, cesped, etc.) permanecen sin comercializar a la espera de ganar aceptacion en el mercado mundial. Muchas otras especies resistentes al glifosato se encuentran en fase de experimentacion o desarrollo (entre otras, alfalfa, cana de azucar, girasol, remolachas, guisantes, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, tomate y tabaco; especies forestales como el chopo y el arbol del ambar; y especies de horticulture ornamental como tagetes, petunias y begonias. Vease el sitio web isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005). Por si todo esto no bastara, el coste del glifosato ha disminuido drasticamente en los ultimos anos, hasta el punto de que son muy pocos los programas convencionales para el control de las malas hierbas que pueden competir en precio y rendimiento con los sistemas de GTC basados en el glifosato.
El glifosato viene siendo utilizado con exito desde hace mas de 15 anos en el desherbado qufmico de los campos y en otras aplicaciones no agrfcolas como medio de control total de la vegetacion. En muchos casos, como sucede con los GTC, ha sido utilizado 1-3 veces al ano durante 3, 5, 10 y hasta 15 anos seguidos. Tal proceder ha propiciado una excesiva dependencia del glifosato y de la tecnologfa de GTC que ha generado una gran presion selectiva en la flora arvense autoctona en favor de las plantas que de forma natural son mas tolerantes a el o que han logrado desarrollar un mecanismo de resistencia a su accion herbicida.
El uso generalizado de los programas de control de malas hierbas basados exclusivamente en el glifosato esta provocando la seleccion de variedades resistentes al mismo y facilitando la propagacion de las malezas que son mas tolerantes que la mayorfa de las especies diana; en otras palabras, esta generando cambios en la flora arvense. (Ng et al., 2003; Simarmata et al., 2003; Lorraine-Colwill et al., 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002). Con todo, a pesar del amplio uso del glifosato en todo el mundo durante mas de 15 anos, hasta el momento son contadas las malas hierbas en las que se ha detectado resistencia (Heap, 2005); la mayorfa de casos se han descubierto durante los ultimos 3-5 anos. Entre las malas hierbas resistentes se encuentran tanto gramfneas como latifolias: Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis y Plantago lanceolata. Asimismo, malezas que no habfan supuesto problema alguno hasta el uso generalizado de los GTC estan adquiriendo cada vez mas prevalencia y resultan mas diffciles de controlar en el contexto de los GTC, que abarca mas del 80% de la superficie cultivada de algodon y soja en Estados Unidos y mas del 20% de la superficie dedicada al mafz en ese mismo pais (Gianessi, 2005). Tales cambios en la flora arvense atanen predominantemente, aunque no en exclusiva, a especies latifolias de diffcil control como por ejemplo Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum y Commelina.
En aquellas zonas donde los cultivadores se enfrentan a malas hierbas resistentes al glifosato o a un cambio en la flora arvense favorable a las especies de mas diffcil control, es posible compensar la perdida de eficacia del glifosato mezclandolo en el tanque o alternandolo con otros herbicidas capaces de controlar las malas hierbas “descarriadas”. Un compatible en tanque eficaz y muy utilizado para el control de las latifolias recalcitrantes es el acido 2,4- diclorofenoxiacetico (2,4-D). El 2,4-D se emplea desde hace mas de 60 anos en agricultura y en otras disciplinas como herbicida de amplio espectro contra las malas hierbas latifolias y, a pesar de que se han descrito casos esporadicos de tolerancia, sigue siendo uno de los herbicidas mas utilizados en el mundo. No obstante, una desventaja que limita su uso es su escasa selectividad en cultivos de dicotiledoneas como la soja o el algodon, motivo por el cual no suele aplicarse a cultivos de dicotiledoneas sensibles, ni siquiera en las proximidades de los mismos. Por otra parte, su empleo en los cultivos de cereales se ve limitado por la naturaleza de los danos que puede ocasionar. La combinacion de 2,4-D y glifosato ha sido utilizada como un potente tratamiento de desherbado qufmico antes de la siembra sin laboreo de la soja y el algodon, aunque debido a la sensibilidad de ambas
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dicotiledoneas al 2,4-D, este tipo de tratamientos debe ser aplicado al menos entre 14 y 30 dfas antes de la plantacion (Agriliance, 2003).
El 2,4-D pertenece a los herbicidas derivados del acido fenoxi, como MCPA, mecoprop y diclorprop. Ha sido utilizado en muchos cultivos de monocotiledoneas (mafz, trigo y arroz, entre otros) para el control selectivo de las malas hierbas de hoja ancha sin danar gravemente a las plantas del cultivo. El 2,4-D es un derivado auxfnico sintetico que actua desregulando la homeostasis normal entre la celula y las hormonas e impide un crecimiento equilibrado y controlado; su mecanismo de accion no se conoce con exactitud.
El 2,4-D presenta diferentes grados de selectividad en ciertas plantas, de tal modo que las dicotiledoneas son mas sensibles a el que las gramfneas. Las diferencias en el metabolismo del 2,4-D entre plantas distintas explican en parte los grados de selectividad. En general, las plantas lo metabolizan lentamente, de modo que las diferencias observadas en la respuesta de las plantas al mismo probablemente puedan explicarse por la actividad sobre el o los sitios diana (WSSA, 2002). La metabolizacion del 2,4-D en la planta suele acaecer en dos fases: hidroxilacion seguida de la conjugacion con aminoacidos o glucosa (WSSA, 2002).
Con el paso del tiempo, los microbios del suelo han desarrollado una via alternativa y eficaz para degradar el 2,4-D, lo que desemboca en la completa mineralizacion de este xenobiotico. Las reiteradas aplicaciones del herbicida seleccionan a los microbios que son capaces de emplearlo como fuente de carbono para crecer, atributo que les confiere una ventaja competitiva en el suelo. Por esta razon, actualmente el 2,4-D se formula para tener una vida media relativamente breve en el suelo, sin que se hayan detectado efectos residuales destacables en los cultivos ulteriores. Ello supone una ventaja anadida a su accion herbicida.
Un microorganismo ampliamente estudiado por su capacidad para degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). El gen que codifica a la responsable de la primera reaccion enzimatica en la via de mineralizacion del 2,4-D es el tfdA. Vease la Patente U.S. N.° 6.153.401 y el N.° de entrada M16730 del Genbank. El tfdA cataliza la transformacion del acido 2,4-D en diclorofenol (DCP) a traves de una reaccion mediada por una dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al., 2001). El DCP posee una escasa actividad herbicida en comparacion con el 2,4-D. El gen tfdA se ha insertado en dicotiledoneas sensibles (p. ej., algodon y tabaco) para crear plantas transgenicas resistentes al 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993) y Patente U.S. N.° 5.608.147).
En el medio ambiente se ha identificado un gran numero de genes de tipo tfdA que codifican protefnas capaces de degradar el 2,4-D y que figuran depositados en la base de datos Genbank. Muchos homologos son similares al tfdA (identidad de aminoacidos >85%) y poseen propiedades enzimaticas semejantes a las de dicho gen. Con todo, existen ciertos homologos que guardan una identidad notablemente menor con el tfdA (del 25-50%), pero que a pesar de ello poseen los residuos caracterfsticos vinculados a las a-cetoglutarato dioxigenasas y las Fe+2 dioxigenasas. Por tanto, no es evidente cuales son las especificidades de sustrato de estas dioxigenasas divergentes.
Un ejemplo unico de escasa homologfa con el tfdA (identidad de aminoacidos del 28%) es el gen rdpA de Sphingobium herbicidovorans (Kohler et al., 1999, Westendorf et al., 2002). Esta enzima cataliza la primera reaccion del proceso de mineralizacion del (R)-diclorprop (y de otros acidos (R)-fenoxipropionicos) asf como del 2,4-D (un acido fenoxiacetico) (Westendorf et al., 2003). Desde hace tiempo se conocen microorganismos que degradan el acido fenoxipropionico, pero hasta hace poco no se habfa progresado en la caracterizacion de esta ruta (Horvath et al., 1990). Otra complicacion que anadir a la degradacion del diclorprop es la estereospecificidad (R frente a S) que afecta tanto a su captacion (Kohler, 1999) como a su oxidacion inicial (Westendorf et al., 2003). La expresion heterologa del rdpA en otros microbios o su transformacion en plantas permanecen ineditas hasta el momento. La bibliograffa se ha centrado sobre todo en los homologos cercanos al tfdA que degradan fundamentalmente los acidos fenoxiaceticos aquirales como el 2,4-D.
El desarrollo de nuevas tecnicas de cultivos tolerantes a herbicidas (HTC, por sus siglas en ingles) ha cosechado un escaso exito sobre todo debido a la eficacia, el bajo coste y la comodidad de los GTC, cualidades que les han granjeado una enorme aceptacion entre los productores y que ofrecen pocos incentivos para el desarrollo de las nuevas tecnicas de HTC.
Las subestructuras qufmicas de ariloxialcanoato son habituales en muchos herbicidas comerciales, incluidos los auxfnicos fenoxi (como el 2,4-D y el diclorprop), los auxfnicos piridiloxi (como fluoroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP), inhibidores de la acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (como haloxifop, quizalofop y diclofop) e inhibidores fenoxiacetato 5-sustituidos de la protoporfirinogeno IX oxidasa (como piraflufen y flumiclorac). No obstante, estos tipos de herbicidas son bastante distintos y la bibliograffa actual no aporta indicios de que compartan una via de degradacion comun. El descubrimiento de una enzima degradadora de herbicidas multifuncional que abarcase multiples modos de accion constituirfa un caracter unico y valioso para el uso en HTC.
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Breve sumario de la invencion
La invencion objeto proporciona unos polinucleotidos aislados segun la reivindicacion 1.
Se proporcionan nuevas plantas que no solo son resistentes al 2,4-D, sino tambien a los herbicidas AOPP. Hasta el momento no habfa ninguna expectativa o indicio de que pudiera crearse una planta dotada de estas dos propiedades ventajosas por medio de la introduccion de un unico gen. La presente invencion tambien incluye plantas que producen una o varias enzimas de la presente invencion “apiladas” junto con uno o varios genes de resistencia a herbicidas, incluidos, entre otros, genes de resistencia al glifosato, a las imidazolinonas y al glufosinato, de tal forma que proporciona plantas tolerantes a herbicidas que son compatibles con un control de las malas hierbas mas amplio y mas potente y que ofrecen opciones para el manejo de la resistencia a los herbicidas. La presente invencion incluye ademas metodos y composiciones que utilizan homologos de los genes y de las protefnas ejemplificados en la presente memoria.
Son divulgadas plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas tolerantes al 2,4-D, al AOPP y a uno o mas herbicidas comerciales (como por ejemplo, glifosato, imidazolinonas, glufosinato, sulfonilureas, dicamba, bromoxinilo y otros). Tambien se revelan vectores que comprenden secuencias de acidos nucleicos responsables de dicha tolerancia a herbicidas, asf como metodos para utilizar tales plantas tolerantes y combinaciones de herbicidas para controlar las malas hierbas y prevenir los cambios en la flora arvense. La presente invencion posibilita el uso de nuevas combinaciones de herbicidas de modos igualmente novedosos. Ademas, proporciona nuevos metodos para evitar el desarrollo y controlar estirpes de malas hierbas resistentes a uno o varios herbicidas, como el glifosato. La presente invencion permite nuevos usos de nuevas combinaciones de herbicidas y cultivos, como la aplicacion en presiembra, inmediatamente antes de la siembra de las semillas, con plantas que de otro modo serfan sensibles al herbicida en cuestion (como el 2,4-D).
Tambien es divulgada la identificacion de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-D, sino que sorprendentemente tambien posee propiedades novedosas que distinguen a dicha enzima de la presente invencion de otras protefnas tfdA conocidas hasta ahora, por ejemplo. Mas especfficamente, la presente invencion se refiere al uso de una enzima que es capaz de degradar tanto el 2,4-D como los herbicidas AOPP, de una manera enantioespecffica. Hasta el momento no se ha descrito ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que pueda degradar herbicidas pertenecientes a clases qufmicas diferentes y que esten dotados de mecanismos de accion distintos. En la presente memoria, la enzima y el gen preferidos para el uso con arreglo a la presente invencion se denominan AAD-1 (del ingles AryloxiAlkanoate Dioxigenase, ariloxialcanoato dioxigenasa). Este descubrimiento sumamente novedoso ofrece oportunidades para servir de base a un cultivo tolerante a herbicidas (HTC) y como un caracter de marcador seleccionable.
No existfa motivacion alguna para producir plantas portadoras de un gen AAD-1 (preferiblemente un polinucleotido AAD-1 dotado de una secuencia optimizada para la expresion en uno o mas tipos de plantas, como se ejemplifica en la presente memoria) y no habfa expectativas de que tales plantas pudieran producir de manera efectiva una enzima AAD-1 que las convirtiera en resistentes tanto a herbicidas derivados del acido fenoxi (como el 2,4-D) como a herbicidas AOPP (como quizalofop, haloxifop, etc.). Por tanto, la presente invencion aporta numerosas ventajas que hasta el momento no se crefan posibles en la disciplina.
La presente invencion se refiere asimismo en parte a la identificacion y el uso de genes que codifican enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa capaces de degradar herbicidas auxfnicos fenoxi y herbicidas ariloxifenoxipropionato. Se revelan metodos para buscar sistematicamente protefnas dotadas de esas actividades, incluida la degradacion del acido 2,4-diclorofenoxiacetico, de otros herbicidas auxfnicos de fenoxialcanoato y de herbicidas de ariloxifenoxipropionato mediante una enzima AAD-1 recombinante. La presente invencion tambien incluye metodos para el control de las malas hierbas que comprenden la aplicacion de uno o varios herbicidas AOPP, auxfnicos fenoxi, u otros herbicidas de ariloxialcanoato a plantas portadoras de un gen AAD-1. Tambien proporciona metodos para utilizar un gen AAD-1 como un marcador seleccionable para identificar celulas vegetales y plantas enteras transformadas con AAD-1, que opcionalmente pueden incluir uno, dos o mas genes foraneos insertados simultaneamente en celulas vegetales diana. Los metodos de la presente invencion incluyen la seleccion de celulas transformadas que son resistentes a niveles apropiados de un herbicida. Ademas, se describen metodos para la preparacion de un polipeptido dotado de la actividad biologica de la ariloxialcanoato dioxigenasa mediante el cultivo de plantas y/o celulas de la presente invencion.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra un esquema general de la degradacion que sufren los herbicidas auxfnicos fenoxi y AOPP
por la accion de la dioxigenasa.
La Figura 2 muestra la perdida de actividad herbicida de una solucion de 2,4-D tratada con AAD-1.
La Figura 3 muestra la perdida de actividad herbicida de una solucion de haloxifop tratada con AAD-1.
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La Figura 4 muestra los fenoles que presumiblemente generarfan algunos herbicidas representatives al ser sometidos a la catalisis por la AAD-1.
La Figura 5 muestra la produccion de 2,4-diclorofenol por la accion del AAD-1 recombinante.
Las Figuras 6A y 6B muestran la produccion de fenoles por la accion del AAD-1 recombinante a partir de varios sustratos herbicidas.
La Figura 7 muestra la velocidad de la reaccion catalizada por la AAD-1 en funcion de la concentracion de sustrato con cuatro sustratos herbicidas distintos.
Las Figuras 8A y 8B muestran que el AAD-1 (v3) se expreso por igual en hojas de Arabidopsis de distintas edades pero siguio acumulandose durante los 25 dfas del experimento. Las plantas que no fueron pulverizadas con el herbicida 2,4-D (panel A) expresaron un poco mas de AAD-1 (v3) que las que habfan sido pulverizadas (panel B). Las barras representan la media ± EEM de 5 hojas de 5 plantas distintas, con el porcentaje de expresion de la AAD-1 (v3) normalizado para la protefna total soluble. Las barras claras representan la tercera hoja joven (N-3) recogida de la parte superior de la planta, las barras oscuras representan la quinta hoja mas vieja de la parte inferior.
Las Figuras 9A, 9B y 9C muestran las lesiones sufridas por plantas de Arabidopsis tras el tratamiento con 2,4-D. Cuatro lfneas distintas fueron tratadas con cuatro dosis distintas de 2,4-D y los danos causados se evaluaron 4 (panel A) y 14 (panel B) dfas despues del tratamiento. Tambien se determino la expresion de la AAD-1 (v3) en las hojas con ensayos ELISA (panel C). Los resultados corresponden a la media ± EEM de cinco hojas extrafdas de cinco plantas distintas que recibieron el mismo tratamiento.
La Figura 10 ilustra que las plantas de Arabidopsis transformadas con pDAB3230 (AAD-1 + EPSPS) muestran un nivel de tolerancia al glifosato >14 veces mayor a los 7 DAT que las lfneas naturales y transformadas de Arabidopsis utilizadas como control.
La Figura 11 muestra la dosis-respuesta al R-haloxifop en suspensiones de callos de mafz.
La Figura 12 muestra que con una concentracion de fenoles derivados del cihalofop de 1 pM el crecimiento sigue siendo del 76%, tan alto como el control no expuesto a dichos fenoles.
La Figura 13 ofrece los datos de dosis-respuesta de un evento transgenico, el 3404-006, expuesto a haloxifop.
La Figura 14 muestra las respuestas de varios clones de eventos transformados y sin transformar con AAD-1 (v3) frente a dosis letales de dos herbicidas AOPP (haloxifop y quizalofop) aplicadas 1 semana antes en postemergencia.
La Figura 15 muestra tres linajes T2 distintos hallados entre 3404 transformaciones que fueron preseleccionadas con Liberty® para eliminar los nulos. Los linajes fueron escogidos para comparar su tolerancia al quizalofop teniendo en cuenta su expresion de AAD-1. La expresion se midio a los 14 DAT (datos no mostrados) y a los 30 DAT.
La Figura 16 muestra un mafz transformado con AAD-1 (v3) tolerante a 8X la dosis de campo de quizalofop (Assure II) en condiciones de campo.
La Figura 17 ilustra los datos de embriones inmaduros de mafz cultivados en medios que contenfan cihalofop.
La Figura 18 muestra el analisis por transferencia Western de callos de soja transformados con el gen AAD-1 (V3) que indica que las celulas del callo estan expresando la protefna AAD-1 (v3).
La Figura 19 compara las curvas ajustadas correspondientes a las velocidades de degradacion del 2,4-D con AAD-2 (v1) y AAD-1 (v1).
La Figura 20 muestra la respuesta de plantas de Arabidopsis T1 transformadas con el gen AAD-1 v3 (optimizado para vegetales) o AAD-1 (v2) (natural), AAD-2 (v1) (natural) o AAD-2 (v2) (optimizado para vegetales) frente a una gama de dosis de 2,4-D aplicadas en postemergencia. Cada maceta representa un evento de transformacion individual dentro de cada familia de genes T1.
La Figura 21 muestra los resultados de transferencias Western de plantas T1 de Arabidopsis transformadas con el gen AAD-2 (v1) natural. Demuestran que las plantas que expresan la protefna AAD-2 (v1) estan sufriendo graves danos a causa de los tratamientos con 2,4-D a 200 g e.a.(equivalente acido)/ha, que normalmente
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apenas causan dano alguno a las plantas de Arabidopsis transformadas con el AAD-1 (v2) natural o con el AAD- 1 (v3) optimizado para vegetales. La protefna AAD-2 aparece identificada en el gel. En las muestras transformadas con AAD-2 y con Pat/Cry1F se detectaron varias bandas de fondo.
La Figura 22 muestra que la actividad relativa de la AAD-2 (v1) sobre los sustratos fue:
2,4-D = diclorprop > (R,S)-haloxifop >> (R)-haloxifop.
Breve descripcion de las secuencias
La SEC ID n° 1 es la secuencia de un cebador directo utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (v1).
La SEC ID n° 2 es la secuencia de un cebador inverso utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (v1).
La SEC ID n° 3 es la secuencia de nucleotidos del AAD-1 (v1) de Sphingobium herbicidovorans.
La SEC ID n° 4 es la secuencia de acidos nucleicos del gen AAD-1 natural con la diana de restriccion interna para NotI eliminada. Este gen se designa AAD-1 (v2). La secuenciacion del ADN confirmo que se habfa generado el producto de PCR correcto, aunque se habfa producido un cambio inadvertido en el aminoacido n.° 212, que paso de arginina a cistefna.
La SEC ID n° 5 es una secuencia de ADN del gen AAD-1 (v3) “optimizada para vegetales”. Este “gen” codifica la SEC ID n° 11, que es la misma que la SEC ID n° 9 salvo por la adicion de un residuo de alanina en la segunda posicion. El codon adicional de alanina (GCT) se incorporo para codificar una diana para Nco I (CCATGG) que abarcaba desde el codon de inicio ATG, con el fin de posibilitar posteriores operaciones de clonaje.
La SEC ID n° 6 (“rdpA(ncoI)”) y la SEC ID n° 7 (“3' saci”) se usaron para amplificar un fragmento de ADN mediante el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter).
La SEC ID n° 8 es otro cebador de PCR (“BstEII/Del NotI”) que se uso con el cebador “3' SacI”.
La SEC ID n° 9 es la secuencia de aminoacidos natural codificada por el gen AAD-1 (v1) de Sphingobium herbicidovorans.
La SEC ID n° 10 es la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de ADN del AAD-1 (v2) de la SEC ID n° 4.
La SEC ID n° 11 es la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de ADN AAD-1 (v3) optimizada para vegetales de la SEC ID n° 5.
La SEC ID n° 12 es la secuencia de ADN del gen ADD-2 (v1) natural.
La SEC ID n° 13 es la secuencia de aminoacidos de la protefna ADD-2 (v1).
La SEC ID n° 14 es un cebador directo utilizado para amplificar el ADN de AAp-2 (v1) para clonacion.
La SEC ID n° 15 es un cebador inverso utilizado para amplificar el ADN de ADD-2 (v1) para clonacion.
La SEC ID n° 16 es el cebador directo de M13.
La SEC ID n° 17 es el cebador inverso de M13.
La SEC ID n° 18 es un cebador directo utilizado para amplificar el ADN del Add-2 (v1) para clonacion.
La SEC ID n° 19 es un cebador inverso utilizado para amplificar el ADN del Add-2 (v1) para clonacion.
La SEC ID n° 20 es la protefna EPSPS natural de la soja.
La SEC ID n° 21 es una secuencia de la protefna EPSPS de la soja portadora de dos mutaciones: una mutacion
en el residuo 183 (sustitucion de la treonina de la protefna natural por una isoleucina) y otra en el residuo 187 (sustitucion de la prolina de la protefna natural por una serina).
La SEC ID n° 22 es la secuencia de ADN adaptada a la soja que codifica la protefna EPSPS de la SEC ID n° 21. La SEC ID n° 23 es el cebador Pat 5-3.
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La SEC ID n° 24 es el cebador Pat 3-3.
La SEC ID n° 25 es el cebador directo de la PTU de AAD-1.
La SEC ID n° 26 es el cebador inverso de la PTU de AAD-1.
La SEC ID n° 27 es el cebador directo para la PCR de la region codificante de AAD-1.
La SEC ID n° 28 es el cebador inverso para la PCR de la region codificante de AAD-1.
La SEC ID n° 29 es la secuencia de nucleotidos del AAD-2 (v2) (optimizado para vegetales).
La SEC ID n° 30 es la secuencia de la protefna AAD-2 (v2) traducida.
La SEC ID n° 31 es el cebador directo de AAD-1 para la PCR del fragmento de Southern.
La SEC ID n° 32 es el cebador inverso de AAD-1 para la PCR del fragmento de Southern.
Descripcion detallada de la invencion
El desarrollo de un gen de resistencia al 2,4-D y el subsecuente desarrollo de cultivos resistentes proporcionan excelentes opciones para el control de las malas hierbas latifolias y resistentes al glifosato (o muy tolerantes y modificadas) durante el cultivo. El 2,4-D es un potente herbicida contra latifolias, de amplio espectro y relativamente asequible que serfa de gran utilidad para los agricultores si a los cultivos, tanto de dicotiledoneas como de monocotiledoneas, se les pudiera conferir una mayor tolerancia al mismo. Los cultivos de dicotiledoneas transgenicas tolerantes al 2,4-D tambien ofrecerfan una mayor flexibilidad en cuanto al momento y la dosis de aplicacion. Otra virtud de un caracter de tolerancia a herbicidas, en este caso al 2,4-D, serfa su utilidad para prevenir danos en cultivos que normalmente son sensibles a la deriva, volatilizacion o inversion del 2,4-D (o cualquier otro fenomeno de desplazamiento fuera de lugar), aplicacion erronea, vandalismo y similares. Otro beneficio del gen AAD-1 es que, a diferencia de todos los homologos del tfdA caracterizados hasta el momento, la AAD-1 es capaz de degradar los R-enantiomeros (isomeros con actividad herbicida) de los herbicidas auxfnicos fenoxi quirales (p. ej., diclorprop y mecoprop) ademas de los auxfnicos fenoxi aquirales (como p. ej. el 2,4-D, MCPA y acido 4- clorofenoxiacetico). Vease la Tabla 1. En todo el mundo se utilizan numerosas mezclas de diferentes combinaciones de herbicidas auxfnicos fenoxi para combatir espectros especfficos de malas hierbas en las diferentes condiciones ambientales imperantes. El uso del gen AAD-1 en vegetales conferirfa proteccion frente a una gama mucho mas amplia de herbicidas auxfnicos fenoxi, lo cual mejora la flexibilidad y el espectro de malas hierbas que pueden ser controladas y protege a los cultivos de la deriva y de otros danos causados por el desplazamiento fuera de lugar de los herbicidas fenoxi en toda la gama de auxinas fenoxi comerciales.
Tabla 1. Herbicidas auxfnicos fenoxi comerciales. Los herbicidas auxfnicos fenoxi suelen nombrarse con el acido activo, pero algunos se comercializan como formulaciones del ester correspondiente y estas tambien se consideran sustratos de la enzima AAD-1 en la planta puesto que las esterasas vegetales en general convierten dichos esteres en los acidos activos en la planta. Tambien se puede hacer alusion a la sal organica o inorganica del acido correspondiente. Cuando se aluda a herbicidas quirales, ya sea en forma de ester, sal o acido propionico, los enantiomeros racemicos (R,S) u opticamente puros (R o S) se consideraran el mismo herbicida a efectos de nombrar estos herbicidas, aunque los compuestos opticamente puros reciban numeros CAS distintos. Los rangos de dosificacion utilizables pueden corresponder a tratamientos individuales o en combinacion con otros herbicidas, tanto en aplicaciones agrfcolas como de otro tipo.
Tabla 1. Herbicidas auxfnicos fenoxi comerciales.
Nombre qufmico
N°CAS Rangos de dosificacion utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha) Estructura
2,4-D
94-75-7 25 - 4000 280-1120 ”XX / I >*
Nombre
qufmico
N°CAS
Rangos de dosificacion utilizables (g e.a./ha)
Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha)
Estructura
2,4,5-T
93-76-5
25 - 4000
25 - 4000
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4-CPA
122-88-3
25 - 4000
25-4000
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3,4-DA
588-22-7
25 - 4000
25 - 4000
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MCPA
94-74-6
Diclorprop
120-36-5
25 - 4000
25 -12000
125 - 1550
100-2240
Mecoprop
7085-19-0
25-4000
250 - 3360
Cloprop
101-10-0
25-4000
25 - 4000
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4-CPP
3307-39-9
25 - 4000
25 - 4000
Fenoprop
93-72-1
25-4000
25 - 4000
Tabla 1. Herbicidas auxfnicos fenoxi comerciales.
Nombre quimico
N°CAS Rangos de dosificacion utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha) Estructura
3,4-DP
3307-41-3 25-4000 25-4000 °XX / Cl x0—CH—c \ OH
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Otro beneficio mas del gen AAD-1 es su capacidad sin precedentes para degradar simultaneamente una multitud de graminicidas comerciales y no comerciales pertenecientes a la clase general de los ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Vease la Tabla 2. Esta caracterfstica hace posible la utilizacion de una serie de compuestos AOPP en cultivos transgenicos portadores del AAD-1, cultivos cuya tolerancia no era posible garantizar hasta ahora. Entre estos se hallan sobre todo cereales como el mafz, arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo, especies de cesped para clima templado y frfo, hierbas de pasto y muchas otras, pero tambien podrfa incluir cultivos de dicotiledoneas en que la tolerancia al AOPP (presente de forma natural en la mayorfa de las dicotiledoneas) no alcanza niveles comercialmente aceptables para permitir su uso.
Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre comun aceptado. Los herbicidas AOPP se denominan en general por su acido activo, pero la mayorfa estan formulados comercialmente en diversas formulaciones de ester y estos tambien se consideran sustratos de la enzima AAD-1 en la planta, puesto que las esterasas vegetales en general convierten estos esteres en los acidos activos en la planta. Tambien se puede hacer alusion a la sal organica o inorganica del acido correspondiente. Cuando se aluda a herbicidas quirales, ya sea en forma de ester, sal o acido propionico, los enantiomeros racemicos (R,S) u opticamente puros (R o S) se consideraran el mismo herbicida a efectos de nombrar estos herbicidas, aunque los compuestos opticamente puros reciban numeros CAS distintos. Los rangos de dosificacion utilizables pueden corresponder a tratamientos individuales o en combinacion, tanto en aplicaciones agrfcolas como de otro tipo.
Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre comun aceptado
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Nombre quimico
N°CAS
Rangos de dosificacion utilizables (g e.a./ha)
Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha)
Clorazifop
72492-94-7
10-2000
10-2000
Clodinafop
105512-06-9
10-2000
20-200
Clofop
Cyhalofop
59621-49-7
10-2000
10-2000
122008-85-9
10-2000
105-560
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Diclofop
71283-65-3
10-2000
280-2000
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Fenoxaprop
66441-23-4
10-2000
20-200
XXH
XX
r/
'T\,
Nombre qufmico
N°CAS
Rangos de dosificacion utilizables (g e.a./ha)
Rangos de dosificacion preferidos (g e.a./ha)
Estructura
Fentiaprop
95721-12-3
10-2000
10-2000
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Fluazifop
69335-91-7
10-2000
25-420
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Haloxifop
69806-40-2
10-2000
20-600
Isoxapirifop
87757-18-4
10-2000
30-240
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Metamifop
256412-89-2
10-2000
35-280
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Propaquizafop
111479-05-1
10-2000
30-240
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Quizalofop
76578-14-8
10-2000
20-240
Trifop
58597-74-4
10-2000
10-2000
Se ha logrado identificar un gen unico (AAD-1) que, introducido mediante tecnicas de ingenierfa genetica para expression en vegetales, permite utilizar herbicidas auxfnicos fenoxi en plantas que o bien no poseen una tolerancia intrfnseca o bien resulta insuficiente para permitir su uso. Asimismo, el AAD-1 puede proteger a la planta contra los 5 herbicidas AOPP en aquellos casos en que la tolerancia natural tampoco es suficiente para garantizar la selectividad. Las plantas que sean portadoras unicamente del AAD-1 podran ser tratadas de manera secuencial o simultanea con uno, dos o una combinacion de varios herbicidas auxfnicos fenoxi. La dosis de cada herbicida auxfnico fenoxi puede oscilar entre 25 y 4000 g e.a./ha, y mas habitualmente entre 100 y 2000 g e.a./ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas dicotiledoneas. De modo similar, se pueden aplicar uno, dos o una 10 mezcla de varios graminicidas AOPP a plantas que expresan el AAD-1 con un menor riesgo de danos provocados por tales herbicidas. La dosis de cada AOPP puede oscilar entre 10 y 2000 g e.a./ha, y mas habitualmente entre 20500 g e.a./ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas monocotiledoneas. Las combinaciones de tales clases qufmicas y herbicidas con distintos mecanismos de accion y espectros en el mismo campo (secuencial o simultaneamente en la mezcla de tanque) permitirfa controlar la mayorfa de malas hierbas que se pretenden 15 controlar con herbicidas.
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El glifosato es un herbicida muy utilizado porque controla un espectro amplfsimo de malas hierbas latifolias y gramfneas. No obstante, su uso reiterado en cultivos GTC y en otras aplicaciones no agrfcolas ha provocado, y continuara provocando, la seleccion de malas hierbas que son tolerantes naturales o biotipos resistentes al mismo. La mayorfa de las estrategias para la prevencion de la resistencia a herbicidas propugnan como metodo para retrasar la aparicion de malezas resistentes la adicion a la mezcla de tanque de otros herbicidas dotados de mecanismos de accion distintos, en dosis que permitan controlar la especie en cuestion. El apilamiento del AAD-1 con un caracter de tolerancia al glifosato (y/o con otros caracteres de tolerancia a herbicidas) podrfa proporcionar un mecanismo para controlar las malas hierbas resistentes al glifosato (ya sean gramfneas por medio de uno o varios herbicidas AOPP, o dicotiledoneas con uno o varios auxfnicos fenoxi) en GTC al permitir el uso del glifosato y de uno o varios herbicidas auxfnicos fenoxi (p. ej., el 2,4-D) y AOPP (p. ej., quizalofop) de manera selectiva en el mismo cultivo. Las aplicaciones de estos herbicidas podrfan ser simultaneas, con una mezcla de tanque que contenga dos o mas herbicidas con diferentes mecanismos de accion; aplicaciones individuales de una sola composicion herbicida en aplicaciones secuenciales en presiembra, preemergencia o postemergencia y fraccionamiento de las aplicaciones entre 2 horas y 3 meses; o, alternativamente, se puede aplicar cualquier combinacion de cualquier numero de herbicidas representativos de cada clase qufmica en cualquier momento en el plazo de 7 meses desde la siembra del cultivo hasta la cosecha (o el intervalo de seguridad antes de la cosecha del herbicida, el que sea mas corto).
El control de un amplio espectro de malas hierbas gramfneas y latifolias requiere disponer de flexibilidad en terminos del calendario de aplicacion, dosis de herbicidas y capacidad para controlar malezas diffciles o resistentes. Las aplicaciones de glifosato en un cultivo portador de un apilamiento de gen de resistencia al glifosato/AAD-1 podrfan oscilar entre 250-2500 g e.a./ha; la del o los herbicidas auxfnicos fenoxi entre 25-4000 g e.a./ha; y la del o los herbicidas AOPP entre 10-2000 g e.a./ha. Las combinaciones y el calendario de aplicacion mas adecuados dependen de cada situacion, de las especies implicadas y del entorno, decisiones que corresponden a un experto en control de malas hierbas que conozca los pormenores de esta invencion.
Las formulaciones herbicidas (p. ej., formulacion de ester, acido o sal; o concentrado soluble o emulsificable, o lfquido soluble) y los aditivos para la mezcla en tanque (p. ej., adyuvantes o agentes de compatibilidad) pueden modificar sustancialmente la capacidad del herbicida o de una combinacion de ellos para controlar las malas hierbas. Cualquier combinacion de los anteriores con cualquiera de las clases qufmicas de herbicida citadas queda incluida en el ambito de esta invencion.
Un experto en la tecnica tambien sabra apreciar que el beneficio ofrecido por la combinacion de dos o mas mecanismos de accion para aumentar el espectro de malas hierbas controladas y/o controlar especies que de forma natural son mas tolerantes o resistentes tambien puede hacerse extensible a aquellas clases qufmicas de herbicidas a las que los cultivos son tolerantes merced a la accion humana (por metodos transgenicos y de otro tipo) y que trascienden los GTC. Asf pues, los caracteres que codifican la resistencia al glifosato (p. ej. los genes de resistencia vegetales o bacterianos EPSPS, GOX y GAT), resistencia al glufosinato (p. ej. Pat, bar), resistencia a herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) (p. ej. imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos y otras clases qufmicas = AHAS, Csr1, SurA, etc.), resistencia a bromoxinilo (p. ej. Bxn), resistencia a inhibidores de la enzima HPPD (4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa), resistencia a inhibidores de la fitoeno desaturasa (PDS), resistencia a herbicidas inhibidores del fotosistema II (p. ej. psbA), resistencia a herbicidas inhibidores del fotosistema I, resistencia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno IX oxidasa (PPO) (p. ej. PPO-1), resistencia a herbicidas fenilureicos (p. ej. CYP76B1), enzimas degradadores de dicamba (vease, p. ej. US 20030135879) y otros se podrfan apilar solos o en multiples combinaciones a fin de conferir la capacidad para controlar o evitar los cambios en la flora arvense y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases citadas.
Por lo que respecta a otros herbicidas, algunos inhibidores de ALS preferidos son las triazolopirimidina sulfonanilidas (como cloransulam-metil, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (como bispiribac y pirithiobac) y flucarbazona. Algunos inhibidores de HPPD preferidos son mesotriona, isoxaflutola y sulcotriona. Algunos inhibidores de PPO preferidos son flumiclorac, flumioxazin, flufenpir, piraflufen, fluthiacet, butafenacilo, carfentrazona, sulfentrazona y los difenileteres (como acifluorfen, fomesafen, lactofen y oxifluorfen).
Ademas, el AAD-1 solo o apilado con uno o varios caracteres de HTC, se puede combinar con otros caracteres agronomicos (resistencia a insectos o a hongos, tolerancia al estres, etc.) o de calidad (mayor rendimiento, mejor perfil de aceites, mejor calidad de la fibra, etc.). Por tanto, la presente invencion puede formar parte de un paquete agronomico completo destinado a mejorar la calidad del cultivo, con la ventaja de aportar un control flexible y rentable de cualquier numero de plagas agronomicas.
Se describe la identificacion de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-D, sino que sorprendentemente tambien posee propiedades novedosas que la diferencian de las protefnas tfdA conocidas hasta el momento, por ejemplo. Aunque esta enzima presenta una homologfa muy baja con el tfdA, los genes utilizados se pueden clasificar en general en la misma familia general de las dioxigenasas dependientes de a-cetoglutarato. Esta familia de protemas se caracteriza por tres residuos de histidina conservados en un motivo “HX(D/E)X23-26(T/S)X114-183HX10- 13R” que comprende el centro activo. Las histidinas coordinan el ion Fe+2 en el centro activo que resulta esencial para la actividad catalftica (Hogan et al., 2000). En la presente memoria se comentan experimentos preliminares de
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expresion in vitro que fueron modificados a proposito para ayudar a seleccionar los atributos novedosos.
Mas espedficamente, la presente invencion se refiere en parte al uso de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-D, sino tambien herbicidas AOPP. Hasta el momento no se hada descrito ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato capaz de degradar herbicidas de diferentes clases qmmicas y con distintos mecanismos de accion. Las enzimas y genes preferidos para el uso con arreglo a la presente invencion se denominan en la presente memoria genes y protemas AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa).
Asimismo, se describe la identificacion y el uso de genes que codifican enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa capaces de degradar herbicidas auxmicos fenoxi y ariloxifenoxipropionato, acido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros herbicidas auxmicos fenoxialcanoicos y herbicidas ariloxifenoxialcanoato por la accion de una enzima AAD-1 expresada con tecnicas de ADN recombinante.
Las protemas fueron sometidas a ensayos analtticos y biologicos para comprobar que, efectivamente, catalizaban la conversion del 2,4-D en 2,4-diclorofenol (“DCP”; sin actividad herbicida). Las protemas parcialmente purificadas de la presente invencion pueden convertir rapidamente el 2,4-D en DCP (la conversion oscila entre el 50-100%) en condiciones in vitro. Otra ventaja de las plantas transformadas con AAD-1 es que los compuestos herbicidas originales son metabolizados y transformados en formas inactivas, reduciendo las posibilidades de hallar residuos en el grano o el forraje.
Tambien se describen La presente invencion tambien incluye metodos para el control de malas hierbas que comprenden la aplicacion de un herbicida AOPP y/o un herbicida auxmico fenoxi a plantas que comprenden un gen AAD-1.
A la luz de estos descubrimientos, ahora se facilitan nuevas plantas que comprenden un polinucleotido que codifica este tipo de enzima. Hasta el momento no hada motivacion alguna para producir tales plantas y no hada expectativas de que tales plantas pudieran producir efectivamente esta enzima para convertirlas en resistentes no solo a herbicidas fenoxi (como el 2,4-D) sino tambien a herbicidas AOPP. Por tanto, la presente invencion proporciona muchas ventajas que hasta el momento no se hadan crefdo posibles en la disciplina.
Es posible adquirir y analizar cepas accesibles publicamente (depositadas en colecciones de cultivos como ATCC o DSMZ) por medio de las tecnicas reveladas en la presente memoria para buscar nuevos genes. Las secuencias mostradas en la presente memoria pueden ser utilizadas para amplificar y clonar los genes homologos en un sistema de expresion recombinante con objeto de realizar mas busquedas sistematicas y ensayos con arreglo a la presente invencion.
Tal y como se ha comentado en el apartado de antecedentes, un microorganismo muy estudiado por su capacidad para degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). El gen que codifica la primera enzima de la via de degradacion es el tfdA. Vease la Patente U.S. N.° 6.153.401 y la entrada N.° M16730 del Genbank. El tfdA cataliza la conversion del acido 2,4-D en el DCP, carente de accion herbicida, a traves de una dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al., 2001). Este gen ha sido utilizado en plantas transgenicas para conferir resistencia frente al 2,4-D en plantas dicotiledoneas (p. ej. algodon y tabaco) que normalmente son sensibles al mismo (Streber et al., 1989; Lyon et al., 1989; Lyon et al., 1993). En el medio ambiente se ha identificado un gran numero de genes de tipo tfdA que codifican protemas capaces de degradar el 2,4-D y que figuran depositados en la base de datos Genbank. Muchos homologos son bastante similares al tfdA (identidad de aminoacidos >85%) y poseen propiedades enzimaticas semejantes a las de dicho gen. Con todo, se conoce un pequeno conjunto de homologos de la a-cetoglutarato dioxigenasa que guardan un bajo nivel de homologfa con el tfdA.
El gen RdpA, procedente de Sphingobium herbicidovorans (Westendorf et al., 2002), es un ejemplo singular de baja homologfa (identidad de aminoacidos 28%). Se ha demostrado que esta enzima cataliza la primera etapa del proceso de mineralizacion del (R)-diclorprop (y de otros acidos (R)-fenoxipropionicos) asf como del 2,4-D (un acido fenoxiacetico) (Westendorf et al., 2003). Desde hace tiempo se conocen microorganismos que degradan el acido fenoxipropionico, pero hasta hace poco no se hada progresado en la caracterizacion de esta ruta (Horvath et al., 1990). Otra complicacion que anadir a la degradacion del diclorprop es la estereospecificidad (R frente a S) que afecta tanto a su captacion (Kohler, 1999) como a su oxidacion inicial (Westendorf et al., 2003). La expresion heterologa del rdpA en otros microbios, o la transformacion de este gen en plantas, permanecen ineditas hasta el momento. La bibliograffa se ha centrado sobre todo en los homologos cercanos al tfdA que degradan fundamentalmente los acidos fenoxiaceticos aquirales.
Como se describe con mas detalle en los ejemplos de las paginas siguientes, el rdpA de Sphingobium herbicidovorans se clono y se analizo con varias clases qmmicas de herbicidas para determinar su promiscuidad de sustrato. Ya se hada demostrado que esta enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato purificada en su forma natural degrada el 2,4-D y el diclorprop (Westendorf et al., 2002 y 2003), pero no se hada descrito que una enzima de su tipo tuviera la capacidad de degradar herbicidas de diferentes clases qmmicas y distintos mecanismos
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de accion. El rdpA nunca se habfa expresado en plantas, ni existfa motivacion para hacerlo porque el desarrollo de nuevas tecnicas de cultivos HTC se ha visto limitado en gran medida por la eficacia, el bajo costo y demas ventajas ofrecidas por los cultivos GTC (Devine, 2005).
A tenor de esta actividad novedosa, las protefnas y los genes de la presente invencion se denominan en la presente memoria protefnas y genes AAD-1. En poco tiempo se confirmo que la AAD-1 degradaba in vitro diversos herbicidas auxfnicos fenoxiaceticos y fenoxipropionicos. Pero, tal y como se describe por primera vez en la presente memoria, sorprendentemente tambien se descubrio que era capaz de degradar otros sustratos pertenecientes a la clase de las moleculas de ariloxialcanoato. Los graminicidas de ariloxifenoxipropionato (AOpP) son sustratos de notable importancia agronomica. Este descubrimiento sumamente novedoso ofrece oportunidades para servir de base a un cultivo tolerante a herbicidas (HTC) y como un caracter marcador seleccionable.
En la presente memoria se describe que los graminicidas AOPP de amplio espectro son excelentes sustratos de la AAD-1, al igual que el 2,4-D, el diclorprop y otros herbicidas auxfnicos fenoxi. Esta enzima es unica por su capacidad para degradar una amplia gama tanto de latifolicidas de amplio espectro (herbicidas auxfnicos fenoxi) como de graminicidas de amplio espectro muy activos (AOPP).
Por tanto, la presente invencion se refiere en parte a la degradacion del acido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros herbicidas auxfnicos fenoxialcanoicos y herbicidas de ariloxifenoxialcanoato mediante la expresion por tecnicas recombinantes de una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1). Tambien se revela la identificacion y los usos de genes que codifican una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa degradadora (AAD-1), capaz de degradar herbicidas auxfnicos fenoxi y ariloxifenoxipropionato.
La expresion transgenica de la enzima confiere tolerancia a combinaciones de herbicidas que podrfan controlar la practica totalidad de malas hierbas latifolias y gramfneas. El AAD-1 puede actuar como un excelente caracter para cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) que es posible apilar con otros caracteres de HTC (resistencia a glifosato, resistencia a glufosinato, a imidazolinona, a bromoxinilo, etc.) y caracteres de resistencia a insectos (Cry1F, Cry1Ab, Cry 34/45, etc.) por ejemplo. Asimismo, el AAD-1 puede servir como un marcador seleccionable util para la seleccion de transformantes primarios de plantas geneticamente modificadas con un segundo gen o grupo de genes.
Ademas, el gen microbiano ha sido redisenado de modo que la protefna esta codificada por codones que son utilizados preferentemente por plantas, tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas (hemicot). Plantas de Arabidopsis, mafz, tabaco, algodon, soja, canola y arroz han sido transformadas con constructos que contenfan el AAD-1 y han demostrado altos niveles de resistencia tanto a herbicidas auxfnicos fenoxi como AOPP. Como se muestra abajo en el Ejemplo 6, el gen reconstruido a modo de ejemplo resulto mas eficaz que el gen bacteriano a la hora de conferir a la planta la resistencia contra herbicidas.
Los grupos oxialcanoato son utiles para introducir en los herbicidas una funcionalidad de acido estable. El grupo acido puede facilitar el desplazamiento por el floema gracias al “atrapamiento acido”, un atributo deseable para la accion herbicida y que podrfa incorporarse a nuevos herbicidas para mejorar su movilidad. Ciertos aspectos de la presente invencion tambien proporcionan un mecanismo para crear HTC. Existen muchos herbicidas comerciales y experimentales que podrfan servir como sustratos de la AAD-1. Por ello, el uso de los genes de interes tambien podrfa conferir tolerancia a esos otros herbicidas.
Los caracteres HTC de la presente invencion pueden ser utilizadas en combinaciones novedosas con otros caracteres HTC (como, por ejemplo, la tolerancia al glifosato). Tales combinaciones de caracteres dan lugar a metodos novedosos para controlar las malas hierbas (y especies similares), gracias a la nueva resistencia adquirida o a la tolerancia intrfnseca a los herbicidas (p. ej. al glifosato). Por consiguiente, ademas de los caracteres HTC, dentro del ambito de la invencion quedan incluidos nuevos metodos para el control de las malas hierbas con herbicidas, en que la tolerancia a estos se crea mediante la citada enzima en cultivos transgenicos.
Por su parte, los cultivos tolerantes al glifosato predominan en todo el mundo. Cultivados muchas veces en rotacion con otros cultivos tolerantes al glifosato, el control de los ricios resistentes al glifosato puede resultar diffcil en los cultivos rotativos. Por ello, el uso de los caracteres transgenicos de la presente invencion, apilados o insertados individualmente en los cultivos, proporciona una herramienta para controlar otros cultivos HTC que aparecen como ricios.
Esta invencion se puede aplicar en el contexto de la comercializacion de un caracter de resistencia al 2,4-D apilado con caracteres ya disponibles de resistencia al glifosato en plantas de soja, por ejemplo. Por ello, la presente invencion proporciona una herramienta para combatir los cambios en las arvenses latifolias y/o la seleccion de latifolias resistentes a herbicidas, consecuencias del intensfsimo uso del glifosato contra las malas hierbas en diversos cultivos.
La expresion transgenica de los genes AAD-1 de interes se ha logrado, entre otros ejemplos, en Arabidopsis, mafz, tabaco, algodon, arroz, soja y canola, lo que no obsta para que la presente invencion pueda aplicarse en cualquier
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otro tipo de plantas deseado. La soja es un cultivo preferido para la transformacion con arreglo a la presente invencion. No obstante, esta invencion puede ser aplicada a otros muchos cultivos de grammeas y latifolias. De igual forma, el 2,4-D puede ser utilizado mejor en cultivos de grammeas cuya tolerancia al mismo es moderada y en los que la mejora de dicha tolerancia por medio de este caracter proporcionana a los cultivadores la oportunidad de utilizar el 2,4-D en dosis mas eficaces y durante mas tiempo sin riesgo de danar el cultivo.
Es mas, la presente invencion utiliza un unico gen que puede proporcionar resistencia a herbicidas que controlan malas hierbas de hoja ancha (auxmicos) y grammeas (AOPP). Este gen podna ser utilizado en multiples cultivos, lo que permetina el uso de una combinacion de herbicidas de amplio espectro. La presente invencion tambien puede controlar las malas hierbas resistentes a los herbicidas disponibles y ayudar a controlar los cambios en la flora arvense causados por las practicas agronomicas actuales. La AAD-1 de interes tambien puede ser utilizada para neutralizar con eficacia otros sustratos herbicidas transformandolos en compuestos sin actividad herbicida. Por todo ello, la presente invencion facilita el desarrollo de otros caracteres para HTC y/o de tecnicas de marcadores seleccionables.
Con independencia del uso de los genes de interes para producir HTC, o como un anadido al mismo, los genes de interes tambien se pueden utilizar como marcadores seleccionables para seleccionar los transformantes en cultivos celulares, en invernadero o en el campo. Los genes de interes poseen un gran valor intrmseco simplemente como marcadores seleccionables para proyectos de biotecnologfa. La promiscuidad de la AAD-1 frente a otros herbicidas auxmicos fenoxialcanoicos brinda muchas oportunidades para utilizar este gen en aplicaciones de HTC y/o como marcador seleccionable.
Un gen, denominado en la presente memoria AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa), se clono de Sphingobium herbicidovorans (ATCC 700291) mediante una PCR en pET 280-S/S (designado pDAB 3203) y se expreso en E.coli BL-21 Star. Cuando este gen se sobreexpresa (induccion con IPTG 1 mM y lisado de cultivo combinado con la siguiente mezcla de reaccion: 2,4-D 112,5 pg/ml, acido ascorbico 1 mM, a-cetoglutarato 1 mM, Fe(NH4)2(SO4)2 50 pM), la enzima recombinante resultante degrada el 2,4-D transformandolo en DCP, compuesto que carece de actividad herbicida (determinado por HPLC, espectrometna de masas, colorimetna y bioanalisis en placa con Arabidopsis). Ademas, se ha demostrado que la AAD-1 convierte los siguientes herbicidas en su correspondiente fenol inactivo: diclorprop, mecoprop, haloxifop, diclofop y otros (veanse las Tablas 3 y 4).
Tabla 3. Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varios compuestos auxinicos y analogos auxinicos dotados de accion herbicida
ESTRUCTURA
ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x)
yCqr a
117613 (R,S)-diclorprop 0,566 2,594 398166 sesona 0,02 0,177
188874 (R,S)-mecoprop 0,341 2,085 190252 0,008 0,211
yyy a
83293 (R,S)-2-cloro, 4-fluorofenoxi-proprionato 0,304 2,358 a 124988 0,007 0,058
i5cv OH
11113675 (R,S)-3-aminodiclorpop 0,228 2,676 -& V 11263526 0,004 0,069
■A a
188476 0,077 0,687 Wpr- 178577 0,003 0,021
a
192132 0,064 0,204 178587 0,003 0,02
yyy- a
195517 2,4-D 0,034 0,383 p 188527 0,003 0,036
Tabla 4. Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varios graminicidas AOPP y analogos y sobre cloquintocet.
ESTRUCTURA
ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x)
18706 (R)-quizalofop 0,43 2,1 460511 (R,S)-diclofop 0,155 1,663
'Vcxo3'-
67131 (R.S)-fluazifop 0,427 2,17 ca 25646 0,144 1,69
11044492 (R)-fenoxaprop 0,408 0,597 70222 (R,S)-clorazlfop 0,128 1,584
34697 (R,S)-clodinofop 0,295 1,98 ,C&^P 199608 cihalofop 0,114 1,26
14603 (R)-cihalofop 0,222 1,989 0 43865 h a I oxifo p-oxi acetato 0,004 0,053
14623 (R,S)-cyhalofop 0,215 1,815 7466 (S)-cihalofop 0,003 0,017
62942 (R,S)-fenthiaprop 0,199 1,055 °5 A. 204558 Cloquintocet 0 0,001
Af(Xtf
66905 haloxifop 0,172 1,63
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Proteinas (y aislamientos fuente).
La presente invencion utiliza protemas funcionales. Por “actividad funcional” (o “activo/a”) se entiende en la presente memoria que las proteinas/enzimas destinadas al uso con arreglo a la presente invencion poseen la capacidad para degradar o disminuir la actividad de un herbicida (solas o en combinacion con otras proteinas). Las plantas que producen proteinas de la presente invencion preferiblemente produciran “una cantidad efectiva” de la protema, de modo que cuando la planta sea tratada con un herbicida, el nivel de expresion de la proteina sera suficiente para convertir a la planta en parcial o totalmente resistente o tolerante al herbicida (a una dosis habitual, si no se indica otra cosa; las dosis de aplicacion habituales se pueden encontrar en el conocido Herbicide Handbook (Weed Science Society of America, 8a edicion, 2002), por ejemplo). El herbicida se puede aplicar en dosis que normalmente matarian a la planta diana, en concentraciones y dosis normales en el campo. (Gracias a la invencion de interes, el nivel y/o la concentracion podrian ser mayores que las utilizadas hasta ahora). Preferiblemente, las celulas vegetales y las plantas de la presente invencion quedan protegidas contra la inhibicion del crecimiento o los danos causados por el tratamiento herbicida. Las plantas y las celulas vegetales transformadas de la presente invencion preferiblemente se convierten en resistentes o tolerantes a un herbicida, como se comenta en la presente memoria, lo cual significa que la planta y las celulas vegetales transformadas pueden crecer en presencia de cantidades eficaces de uno o varios herbicidas como se comenta en la presente memoria. Las proteinas preferidas poseen actividad catalftica para metabolizar uno o mas compuestos de ariloxialcanoato.
La transferencia de la actividad funcional a los sistemas vegetales o bacterianos puede implicar una secuencia de acidos nucleicos, la codificacion de la secuencia de aminoacidos de una proteina integrada en un vector de expresion proteica adecuado para el hospedador en el que reside el vector. Una forma de obtener una secuencia de acidos nucleicos que codifique una proteina con actividad funcional consiste en aislar el material genetico natural de la especie bacteriana que sintetiza la proteina de interes, utilizando informacion deducida de la secuencia de aminoacidos de la proteina, como se revela en la presente memoria. Las secuencias naturales pueden ser optimizadas para la expresion en plantas, por ejemplo, tal y como se comenta mas detalladamente en las paginas siguientes. Tambien se puede disenar un polinucleotido optimizado a partir de la secuencia de la proteina.
La presente invencion utiliza clases de proteinas dotadas de actividades novedosas como las indicadas en la presente memoria. Una forma de caracterizar dichas clases de proteinas y los polinucleotidos que las codifican consiste en definir un polinucleotido por su capacidad para hibridarse, bajo un rango de condiciones concretas, con una secuencia de nucleotidos ejemplificada (la complementaria de la misma y/o una sonda o sondas derivadas de una de las hebras) y/o por su capacidad para ser amplificada mediante PCR con cebadores derivados de las secuencias ejemplificadas.
Existen varios metodos para obtener las proteinas destinadas al uso con arreglo a la presente invencion. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos dirigidos contra las proteinas reveladas en la presente memoria con el fin de identificar y aislar otras proteinas en una mezcla. En concreto, se pueden generar anticuerpos contra las porciones de las proteinas que estan mas conservadas o que son mas distintas de otras proteinas relacionadas. Esos anticuerpos se pueden utilizar entonces para identificar especfficamente proteinas equivalentes dotadas de la actividad caracterfstica mediante inmunoprecipitacion, enzimoinmunoadsorcion (ELISA) o inmunotransferencia. Los anticuerpos contra las proteinas mostradas en la presente memoria, o contra proteinas equivalentes, o fragmentos de dichas proteinas, se pueden preparar facilmente con procedimientos ordinarios. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, preferiblemente producidos en respuesta a una proteina ejemplificada o sugerida.
Una persona versada en la tecnica reconocera facilmente que las proteinas (y los genes) de la presente invencion se pueden obtener de diversas fuentes. Dado que ciertos elementos transponibles como los plasmidos codifican operones de degradacion de herbicidas enteros, y que estos tambien pueden estar integrados en el genoma, es posible obtener proteinas de la presente invencion de una amplia variedad de microorganismos, entre ellos bacterias recombinantes y/o naturales. Otros miembros de los ordenes Firmicutes y Proteobacteria, asf como generos portadores del rdpA, como Sphingobium, Delftia, Rodoferax y Comamonas, entre otros, pueden ser utilizados como fuentes.
Tambien es posible fabricar mutantes de aislamientos bacterianos mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la disciplina. Por ejemplo, se pueden obtener mutantes asporogenos de un aislamiento mediante mutagenesis con etilmetanosulfonato (EMS). Tambien se pueden conseguir mutantes con luz ultravioleta y nitrosoguanidina por medio de procedimientos bien conocidos por los expertos en la disciplina.
Una proteina “procedente de” u “obtenible de” cualquiera de los aislamientos de interes referidos o sugeridos en la presente memoria significa que la proteina (o una proteina similar) se puede obtener del aislamiento o de alguna otra fuente, como otra cepa bacteriana o una planta. “Derivado de” tambien tiene esta connotacion e incluye proteinas obtenibles de un tipo determinado de bacteria que ha sido modificada para la expresion en una planta, por ejemplo. Un experto en la tecnica reconocera facilmente que, dado que se trata de un gen y de una proteina de origen bacteriano, es posible modificar una planta con tecnicas de ingenierfa genetica para que produzca la proteina.
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Se pueden disponer preparaciones de anticuerpos, sondas de acidos nucleicos (ADN, ARN o APN, por ejemplo) y similares utilizando el polinucleotido y/o las secuencias de aminoacidos revelados en la presente memoria, con el fin de detectar y recuperar otros genes relacionados en otras fuentes (naturales).
Es posible utilizar tecnicas ordinarias de biologfa molecular para clonar y secuenciar las protefnas y los genes descritos en la presente memoria. Se puede encontrar mas informacion en Sambrook et al., 1989.
Polinucleotidos y sondas.
Ademas se proporcionan secuencias de nucleotidos que codifican protefnas para ser utilizadas con arreglo a la presente invencion. La presente invencion proporciona asimismo metodos para identificar y caracterizar genes que codifican protefnas dotadas de la actividad herbicida deseada. En una forma de realizacion, la presente invencion proporciona secuencias de nucleotidos unicas que son utiles como sondas de hibridacion y/o cebadores para tecnicas PCR. Los cebadores producen fragmentos genicos caracterfsticos que pueden ser utilizados para la identificacion, caracterizacion y/o aislamiento de genes de interes concretos. Las secuencias de nucleotidos de la presente invencion codifican protefnas que son distintas de las protefnas descritas hasta la fecha.
Los polinucleotidos pueden ser utilizados para formar “genes” enteros que codifiquen protemas o peptidos en una celula hospedadora deseada. Por ejemplo, como un experto en la materia puede reconocer facilmente, los polinucleotidos de interes se pueden colocar adecuadamente bajo el control de un promotor en un hospedador de interes, como es conocido en la tecnica. El nivel de expresion del gen y su expresion especffica en un tejido concreto o en un momento dado pueden tener una gran repercusion en la utilidad de la invencion. En general, cuanto mayor sea el nivel de expresion proteica de un gen degradador mas rapida y mas completa sera la degradacion del sustrato (en este caso un herbicida). En general, se pretende que los promotores expresen el gen diana en niveles elevados a menos que la expresion elevada cause un impacto negativo en la salud de la planta. Normalmente, se pretende que el gen AAD-1 se exprese de manera constitutiva en todos los tejidos para conferir una proteccion completa a la planta en todas las etapas de crecimiento. No obstante, como alternativa se puede utilizar un gen de resistencia que se exprese vegetativamente; de este modo se podrfa utilizar el herbicida de interes en los cultivos para controlar las malezas y, posteriormente, para controlar la reproduccion sexual del cultivo de interes mediante su aplicacion durante la etapa de floracion.
Como una persona versada en la tecnica sabe, el ADN forma normalmente una doble cadena. En esta disposicion, una hebra es complementaria de la otra y viceversa. A medida que el ADN se replica en una planta (por ejemplo), se producen hebras complementarias del mismo. El termino “hebra codificante” es utilizado a menudo en la tecnica para referirse a la hebra que se une con la hebra antisentido. El ARNm se transcribe a partir de esta hebra antisentido del ADN. La hebra codificante contiene una serie de codones (un codon son tres nucleotidos que pueden ser lefdos como una unidad de tres residuos que designan un aminoacido concreto) que pueden ser lefdos como un marco abierto de lectura (ORF) para formar una protefna o un peptido de interes. Para producir una protefna in vivo, normalmente una hebra de ADN se transcribe en una hebra complementaria de ARNm que servira como molde de la protefna. Por tanto, la presente invencion incluye el uso de los polinucleotidos ejemplificados mostrados en la lista de secuencias adjunta y/o de equivalentes que incluyen las hebras complementarias. La presente invencion incluye los ARN y los APN (acidos peptidos nucleicos) que son equivalentes funcionales de las moleculas de aDn ejemplificadas.
Los aislamientos bacterianos se pueden cultivar en condiciones favorables para conseguir una elevada multiplicacion del microbio. Despues de tratar el microbio para obtener su acido nucleico genomico monocatenario, el aDn se puede poner en contacto con los cebadores de la invencion y ser sometido a una amplificacion por PCR. Con dicho procedimiento, los fragmentos caracterfsticos de los genes de interes quedan amplificados, revelando asf la presencia del gen o genes de interes.
Otros aspectos incluyen genes y aislamientos identificados con los metodos y las secuencias de nucleotidos descritos en la presente memoria. Los genes identificados de esta manera pueden codificar protefnas de resistencia a herbicidas de la presente invencion.
Las protefnas y los genes para uso con arreglo a la presente invencion pueden ser identificados y obtenidos mediante sondas de oligonucleotidos, por ejemplo. Dichas sondas son secuencias de nucleotidos que pueden ser detectadas en virtud de un marcador adecuado o que pueden ser de por sf fluorescentes, tal y como se describe en la Solicitud internacional N.° WO 93/16094. Las sondas (y los polinucleotidos de la presente invencion) pueden ser de ADN, ARN o APN. Ademas de adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U; en las moleculas de ARN), las sondas (y polinucleotidos) sinteticas de la presente invencion tambien pueden contener inosina (una base neutra capaz de aparearse con las cuatro bases que a veces se utiliza como sustituto de la mezcla de cuatro bases en las sondas sinteticas) y/u otras bases sinteticas (no naturales). Por tanto, siempre que en la presente memoria se aluda a un oligonucleotido sintetico y degenerado “N” o “n” se utilizaran genericamente, pudiendo ser G, A, T, C o inosina. Los codigos de ambiguedad se utilizan en la presente memoria de acuerdo con las normas de nomenclatura de la IUPAC vigentes en el momento de la presentacion de esta solicitud (por ejemplo, R significa A o G, Y significa
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C o T, etc.).
Como es bien sabido por los expertos en la tecnica, si una sonda molecular se hibrida con una muestra de acido nucleico, es razonable suponer que la sonda y la muestra guardan entre sf una homologfa/similitud/identidad sustancial. Preferiblemente, primero se realiza la hibridacion del polinucleotido y despues se efectuan lavados en condiciones de baja, moderada o alta restrictividad mediante tecnicas bien conocidas, como se describe por ejemplo en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pags. 169-170. Por ejemplo, como se indica en dicha obra, se pueden conseguir condiciones de baja restrictividad con un primer lavado con (solucion salina con citrato) SSC 2*/SDS 0,1% (dodecilsulfato sodico) durante 15 minutos a temperatura ambiente; normalmente se hacen dos lavados. Se puede conseguir mas restrictividad disminuyendo la concentracion de sal y/o elevando la temperatura. Por ejemplo, despues del lavado descrito se pueden hacer dos lavados con SSC 0,1*/SDS 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos cada uno, seguidos por lavados con SSC 0,1*/SDS 0,1% a 55°C durante 30 minutos cada uno. Estas temperaturas se pueden utilizar con otros protocolos de hibridacion y de lavado citados en la presente memoria y como debena saber un experto en la tecnica (por ejemplo, como sal se puede usar SSPE en lugar de SSC). La solucion de SSC 2*/SDS 0,1% se puede elaborar anadiendo 50 ml de SSC 20* y 5 ml de SDS 10% a 445 ml de agua. El SSC 20* se puede preparar combinando NaCl (175,3 g/0,150 M), citrato sodico (88,2 g/0,015 M) y agua, ajustando el pH a 7,0 con NaOH 10 N, y despues enrasando el volumen hasta 1 litro. El SDS 10% se puede preparar disolviendo 10 g de SDS en 50 ml de agua autoclavada, diluyendo despues hasta un volumen final de 100 ml.
La deteccion de la sonda proporciona un medio para determinar de una manera conocida si la hibridacion se ha mantenido. Este analisis con sonda proporciona un metodo rapido para identificar genes de la presente invencion. Los segmentos de nucleotidos que se utilizan como sondas con arreglo a la invencion se pueden sintetizar con un sintetizador de ADN y procedimientos ordinarios. Estas secuencias de nucleotidos tambien se pueden utilizar como cebadores de PCR para amplificar genes de la presente invencion.
Las caractensticas de hibridacion de una molecula pueden ser utilizadas para definir los polinucleotidos (y/o sus complementarios, preferiblemente sus complementarios completos) que hibridan con un polinucleotido ejemplificado en la presente memoria. Es decir, una forma de definir un gen (y la protema que este codifica) consiste, por ejemplo, en determinar su capacidad para hibridar con un gen conocido o ejemplificado espedficamente (bajo cualquiera de las condiciones reveladas espedficamente en la presente memoria).
En la presente memoria, condiciones “restridivas” de hibridacion se refiere a las condiciones que consiguen el mismo, o aproximadamente el mismo, grado de especificidad de la hibridacion que las condiciones empleadas por los solicitantes actuales. En concreto, se puede llevar a cabo una hibridacion de ADN inmovilizado sobre filtros de transferencia Southern con sondas genicas marcadas con 32P mediante metodos ordinarios (vease p. ej., Maniatis et al. 1982). En general, la hibridacion y los lavados posteriores se pueden llevar a cabo en condiciones que permiten la deteccion de las secuencias diana. En el caso de las sondas genicas de ADN bicatenario, la hibridacion se puede prolongar hasta el dfa siguiente a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del Idbrido de ADN en SSPE 6*, solucion de Denhardt 5*, SDS 0,1% y ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La temperatura de fusion se describe mediante la formula siguiente (Beltz et al. 1983):
Tm= 81,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41(% G+C)-0,61(% formamida)-600/longitud del ADN bicatenario en pares de
bases.
Los lavados se llevan a cabo normalmente del modo siguiente:
(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1*, SDS 0,1% (lavado de restrictividad baja).
(2) Una vez a Tm-20°C durante 15 minutos en SSPE 0,2*, SDS 0,1% (lavado de restrictividad moderada).
Con las sondas de oligonucleotidos, la hibridacion se puede prolongar hasta el dfa siguiente a 10-20°C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del dbrido en SSPE 6*, solucion de Denhardt 5*, SDS 0,1% y ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La Tm de las sondas de oligonucleotidos se describe mediante la formula siguiente:
Tm (°C)= 2 (numero de pares de bases T/A) + 4 (numero de pares de bases G/C)
(Suggs et al., 1981).
Los lavados se llevan a cabo normalmente del modo siguiente:
(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1*, SDS 0,1% (lavado de restrictividad baja).
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(2) Una vez a la temperatura de hibridacion durante 15 minutos en SSPE 1 *, SDS 0,1% (lavado de restrictividad moderada).
En general, la sal y/o la temperatura se pueden alterar para modificar la restrictividad. Con un fragmento de ADN marcado de >70 bases de longitud aproximadamente, se pueden utilizar las siguientes condiciones:
Baja: SSPE 1* o 2*, temperatura ambiente
Baja: SSPE 1* o 2*, 42°C
Moderada: SSPE 0,2* o 1*, 65°C
Alta: SSPE 0,1*, 65°C
La formacion de la molecula bicatenaria y su estabilidad dependen de la existencia de una complementariedad sustancial entre las dos hebras del hfbrido y, como se ha indicado antes, resulta tolerable un cierto grado de desapareamiento. Por tanto, las secuencias de las sondas incluyen mutaciones (unicas y multiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas y de combinaciones de las mismas, en las que dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formacion de hfbridos estables con el polinucleotido diana de interes. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en un polinucleotido dado de muchas maneras, y tales metodos son conocidos por una persona versada en la materia. En el futuro, podrfan aparecer nuevos metodos.
Tecnica de PCR.
La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es una sfntesis enzimatica, repetitiva y conservadora de una secuencia de acidos nucleicos. Este procedimiento es bien conocido y utilizado habitualmente por los expertos en la tecnica (vease Mullis, Patentes U.S. N.° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159; Saiki et al., 1985). La PCR se basa en la amplificacion enzimatica de un fragmento de ADN de interes que esta flanqueado por dos cebadores oligonucleotidos que hibridan con las hebras opuestas de la secuencia diana. Los cebadores se orientan preferiblemente con sus extremos 3' encarados. Los repetidos ciclos de desnaturalizacion termica del molde, la reasociacion de los cebadores con sus secuencias complementarias y la extension de los cebadores reasociados por medio de una ADN polimerasa dan como resultado la amplificacion del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de PCR. El producto de la extension de cada cebador puede servir como molde para el otro cebador, de modo que con cada ciclo se duplica la cantidad del fragmento de ADN producida en el ciclo anterior. Esto provoca la acumulacion exponencial del fragmento diana especffico, hasta alcanzar varios millones de copias en pocas horas. Por medio de una ADN polimerasa termoestable como la polimerasa Taq, aislada de la bacteria termofila Thermus aquaticus, el proceso de amplificacion puede automatizarse completamente. Los expertos en la tecnica conocen otras enzimas adecuadas.
Las secuencias de ADN ejemplificadas, o segmentos de las mismas, pueden ser utilizadas como cebadores para la amplificacion por PCR. Durante este proceso de amplificacion, resulta tolerable un cierto grado de desapareamiento entre las bases del cebador y del molde, como mutaciones, deleciones e inserciones (especialmente adiciones de nucleotidos en el extremo 5') en los cebadores ejemplificados. Cualquier persona versada en la tecnica conoce metodos para producir mutaciones, inserciones y deleciones en un cebador.
Modificacion de genes y proteinas.
Los genes y las proteinas de interes pueden fusionarse con otros genes y proteinas para producir proteinas quimericas o de fusion. Los genes y proteinas utiles con arreglo a la presente invencion no solo incluyen las secuencias enteras ejemplificadas especfficamente, sino tambien porciones, segmentos y/o fragmentos (incluidos fragmentos contiguos y deleciones internas y/o terminales respecto a las moleculas enteras) de tales secuencias, variantes, mutantes, quimeras y fusiones de los mismos. Las proteinas pueden tener aminoacidos sustituidos siempre que conserven la actividad funcional deseada. Los genes “variantes” tienen secuencias de nucleotidos que codifican las mismas proteinas o proteinas equivalentes dotadas de una actividad equivalente o similar a una protema ejemplificada. Los terminos “proteinas variantes” y “proteinas equivalentes” se refieren a proteinas dotadas de la misma o basicamente la misma actividad biologica/funcional contra las plagas diana y las secuencias equivalentes como las proteinas expuestas a modo de ejemplo. En la presente memoria, la alusion a una secuencia “equivalente” concierne a secuencias portadoras de sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoacidos que mejoran o que no afectan negativamente a la actividad en un grado significativo. Los fragmentos que conservan la actividad tambien quedan incluidos en esta definicion. Los fragmentos y otros equivalentes que conserven una funcion o actividad igual o similar a la de un fragmento correspondiente de una protefna ejemplificada quedan incluidos dentro del ambito de la presente invencion. Se pueden hacer cambios, como sustituciones o adiciones de aminoacidos, con diversos fines, tales como aumentar (o disminuir) la estabilidad frente a proteasas de la protefna (sin disminuir material o sustancialmente la actividad funcional de la misma), eliminar o anadir una diana de restriccion, y similares. Se pueden construir facilmente variaciones de genes utilizando, por ejemplo, tecnicas ordinarias que provocan mutaciones puntuales.
Ademas, la Patente U.S. N.° 5.605.793, por ejemplo, describe metodos para generar una diversidad molecular
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adicional utilizando el reensamblaje de ADN tras una fragmentacion al azar o dirigida. Esta se puede denominar transposicion de genes (“shuffling”), proceso que normalmente implica la mezcla de fragmentos (de un tamano idoneo) de dos o mas moleculas de ADN distintas, seguida por repetidas rondas de renaturalizacion. Esto puede mejorar la actividad de una protefna codificada por un gen inicial. El resultado es una protefna quimerica dotada de una actividad mejor, de una especificidad por el sustrato alterada, mayor estabilidad enzimatica, estereoespecificidad alterada, u otras caracterfsticas.
La transposicion se puede disenar y dirigir despues de obtener y examinar las coordenadas atomicas 3D (tridimensionales) y la estructura cristalina de la protema de interes. Por tanto, la “transposicion dirigida” se puede dirigir a ciertos segmentos de una protefna idoneos para ser modificados, como los segmentos expuestos en la superficie, y preferiblemente no a segmentos internos implicados en el plegamiento de la protefna y que resulten esenciales para mantener la integridad de su estructura 3D.
Se pueden utilizar genes variantes para producir protefnas variantes; de modo similar se pueden utilizar hospedadores recombinantes para producir las protemas variantes. Utilizando las citadas tecnicas de “transposicion de genes” se pueden construir genes y protemas equivalentes que comprenden 5, 10 o 20 residuos contiguos (aminoacidos o nucleotidos) de cualquier secuencia ejemplificada en la presente memoria. Como un experto en la tecnica sabe, las tecnicas de transposicion de genes, por ejemplo, se pueden ajustar para obtener equivalentes portadores de, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296 o 297 residuos contiguos (aminoacidos o nucleotidos), correspondientes a un segmento (del mismo tamano) de cualquiera de las secuencias ejemplificadas o sugeridas (o las complementarias (completas) de las mismas). Segmentos de tamano similar, especialmente los pertenecientes a regiones conservadas, tambien pueden ser utilizados como sondas y/o cebadores.
Tambien se pueden obtener fragmentos de genes enteros por medio de exonucleasas o endonucleasas comerciales siguiendo procedimientos ordinarios. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas tales como la Bal31 o tecnicas de mutagenesis dirigida para cortar sistematicamente nucleotidos de los extremos de tales genes. Asimismo, se pueden obtener genes que codifiquen fragmentos activos mediante diversas enzimas de restriccion. Tambien se pueden usar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de tales protefnas.
En la presente memoria se describen protefnas que pueden ser truncadas sin perder por ello la actividad funcional. Por “protema truncada” se entiende una porcion de protema que puede ser escindida sin que la protema truncada restante pierda la actividad deseada despues de la escision. La escision se puede efectuar con diversas proteasas. Asimismo, se pueden producir protefnas escindidas con tecnicas de biologfa molecular eliminando bases de ADN que codifiquen dicha protefna, bien mediante la digestion con endonucleasas de restriccion bien con otras tecnicas disponibles para los expertos en la tecnica. Despues del truncamiento, dichas protefnas se pueden expresar en sistemas heterologos como E. coli, baculovirus, sistemas de virus vegetales, levaduras y similares y a continuacion someterse a bioanalisis en insectos del modo descrito en la presente memoria para determinar su actividad. Los expertos en la tecnica saben bien que es posible producir con exito protefnas truncadas que conserven su actividad funcional pese a haber perdido parte de su secuencia completa. Por ejemplo, se pueden utilizar protefnas de Bacillus thuringiensis en una forma truncada (protefna central) (veanse p. ej., Hofte et al. (1989) y Adang et al. (1985)). Senalar que en la presente memoria, el termino “protema” puede incluir truncamientos funcionalmente activos.
En ciertos casos, sobre todo para la expresion en vegetales, puede ser ventajoso utilizar genes truncados que expresen protefnas truncadas. Los genes truncados preferidos codificaran normalmente un 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o un 99% de la protefna entera.
Ciertas protefnas se ejemplifican especfficamente en la presente memoria. Dado que tales protefnas se muestran meramente a tftulo de ejemplo, debe quedar claro de inmediato que protefnas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleotidos que codifican las equivalentes de las mismas) estan dotadas de una actividad igual o similar a la de las protefnas ejemplificadas. Las protefnas equivalentes deben guardar una similitud en sus aminoacidos (y/u homologfa) con una protefna ejemplificada. La identidad de aminoacidos sera normalmente de al
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menos el 60%, preferiblemente al menos del 75%, mas preferiblemente de al menos el 80%, incluso mas preferiblemente de al menos el 90% y puede ser de al menos del 95%. Las protefnas preferidas tambien se pueden definir en terminos de intervalos de identidad y/o similitud mas concretos. Por ejemplo, la identidad y/o similitud puede ser del 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% en comparacion con una secuencia ejemplificada o sugerida en la presente memoria. Se puede utilizar cualquiera de los numeros indicados arriba para definir los lfmites superior e inferior.
A menos que se indique otra cosa, en la presente memoria la identidad y/o similitud porcentuales entre las secuencias de dos acidos nucleicos se han calculado utilizando el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, modificado segun Karlin y Altschul, 1993. Este algoritmo esta incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990. Las busquedas de nucleotidos con BLAST se llevan a cabo con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12. Se puede utilizar el Gapped BLAST del modo descrito en Altschul et al., 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se emplean los parametros por defecto de cada programa (NBLAST y XBLAST). Vease el sitio web de NCBI/NIH. Para obtener alineaciones con huecos a efectos comparativos, se utilizo la funcion AlignX de Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., North Bethesda, Md., EE.UU.) empleando los parametros por defecto. Estos fueron: una penalizacion por apertura de hueco de 15, una penalizacion por extension de hueco de 6,66, y un intervalo de penalizacion por separacion de hueco de 8.
Tambien se pueden modificar diversas propiedades y caracterfsticas tridimensionales de la protefna sin afectar negativamente a la actividad/funcionalidad de la misma. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos se pueden tolerar o hacer sin afectar negativamente a la actividad y/o la configuracion tridimensional de la molecula. Los aminoacidos se pueden clasificar en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, basicos y acidos. Las sustituciones conservadoras en las que un aminoacido de una clase es sustituido por otro aminoacido del mismo tipo quedan dentro del ambito de la presente invencion siempre que la sustitucion no afecte negativamente a la actividad biologica del compuesto. La Tabla 5 contiene un listado de ejemplos de aminoacidos pertenecientes a cada clase.
Tabla 5
Clase de aminoacido
Ejemplos de aminoacidos
No polar
Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Polar sin carga
Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Acido
Asp, Glu
Basico
Lys, Arg, His
En ciertos casos tambien se pueden hacer sustituciones no conservadoras, pero se prefieren las sustituciones que no deterioren significativamente la actividad funcional/biologica de la protefna.
En la presente memoria, la alusion a polinucleotidos “aislados” y/o protemas “purificadas” se refiere a dichas moleculas cuando no estan asociadas con otras moleculas de su tipo con las que se encuentran en la naturaleza. Por tanto, la referencia a “aislado/a” y/o “purificado/a” implica la intervencion humana tal y como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, un “gen” bacteriano de la presente invencion introducido en una planta para ser expresado es un “polinucleotido aislado”. De forma similar, una protefna derivada de una protefna bacteriana y producida por una planta es una “protema aislada”.
Debido a la degeneracion/redundancia del codigo genetico, varias secuencias de ADN pueden codificar las secuencias de aminoacidos reveladas en la presente memoria. Una persona experta en la materia sabra crear secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas o basicamente las mismas protefnas. Estas se comentan con mas detalle a continuacion en la seccion titulada “Optimizacion de la secuencia para la expresion en vegetales”.
Optimizacion de la secuencia para la expresion en vegetales.
Para obtener una elevada expresion de genes heterologos en plantas se prefiere en general redisenar con tecnicas de ingenierfa genetica los genes, de modo que se expresen con mas eficiencia en el citoplasma de las celulas vegetales. El mafz es una de tales plantas en las que puede ser preferible redisenar el gen o genes heterologos antes de la transformacion para aumentar su nivel de expresion en dicha planta. Por consiguiente, una etapa adicional en el diseno de genes que codifican una protefna bacteriana consiste en la modificacion de un gen heterologo para lograr una expresion optima, utilizando una preferencia codonica mas estrechamente alineada con la secuencia de la planta diana, ya sea dicotiledonea o monocotiledonea. Las secuencias tambien se pueden optimizar para la expresion en cualquiera de los tipos concretos de plantas comentados a lo largo de la presente memoria.
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Hospedadores transaenicos
Los genes que codifican las protemas de la presente invencion se pueden introducir en una amplia variedad de hospedadores microbianos o vegetales. La presente invencion incluye celulas vegetales transgenicas y plantas transgenicas. Las plantas (y celulas vegetales) preferidas son mafz, Arabidopsis, tabaco, soja, algodon, canola, arroz, trigo, cesped y hierbas de pasto, y similares. Tambien se pueden crear otros tipos de plantas transgenicas con arreglo a la presente invencion, tales como frutas, hortalizas y arboles. Mas en general, en varios aspectos de la presente invencion se pueden utilizar dicotiledoneas y/o monocotiledoneas.
En formas de realizacion preferidas, la expresion del gen propicia, directa- o indirectamente, la produccion intracelular (y el mantenimiento) de la protema o protemas de interes. De esta manera, las plantas se pueden convertir en resistentes a herbicidas. Tales hospedadoras se pueden calificar como hospedadoras y/o celulas transgenicas, recombinantes, transformadas y/o transfectadas. En ciertos aspectos de la presente invencion (por ejemplo, en lo que concierne a la clonacion y la preparacion del gen de interes), se pueden producir y utilizar celulas microbianas (preferiblemente bacterianas) siguiendo tecnicas estandar, con el beneficio de la presente descripcion.
Las celulas vegetales transfectadas con un polinucleotido se pueden regenerar en plantas enteras. La presente invencion incluye cultivos celulares, que incluyen cultivos de tejidos celulares, cultivos lfquidos y cultivos en placa. Las semillas producidas y/o utilizadas para engendrar plantas de la presente invencion tambien quedan incluidas dentro del ambito de la misma; otros tejidos y partes de las plantas tambien quedan incluidos en ella. Tambien se proporciona una parte, progenie o propagulo asexual de la planta de la invencion, en la que dicha parte, progenie o propagulo asexual comprende una pluralidad de celulas acordes a la invencion, y en cuyo seno la expresion de dicho polinucleotido las convierte en tolerantes a un herbicida ariloxialcanoato. La presente invencion tambien incluye metodos para producir plantas o celulas que comprenden un polinucleotido de la presente invencion. Un metodo preferido para producir tales plantas consiste en sembrar una semilla de la presente invencion.
Insercion de los genes para crear los hospedadores transgenicos.
Un aspecto de la presente invencion consiste en la transformacion/transfeccion de plantas, celulas vegetales y otras celulas hospedadoras con polinucleotidos de la presente invencion que expresan protemas de la presente invencion. Las plantas transformadas de esta manera se pueden convertir en resistentes a diversos herbicidas dotados de diferentes mecanismos de accion.
Existe una gran diversidad de metodos para introducir un gen que codifica una protema deseada en el hospedador diana, en condiciones que permiten su mantenimiento y expresion estables. Tales metodos son bien conocidos por los expertos en la tecnica y aparecen descritos, por ejemplo, en la Patente U.S. N.° 5.135.867.
En la presente memoria se revelan vectores que comprenden un polinucleotido AAD-1. Por ejemplo, Existe un gran numero de vectores de clonacion que comprenden un sistema de replicacion en E. coli y un marcador para seleccionar las celulas transformadas que permiten hacer los preparativos para la insercion de genes foraneos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, series pUC, series M13mp, pACYC184, etc. Asf pues, la secuencia que codifica la protema puede ser insertada en el vector a traves de una diana de restriccion adecuada. El plasmido resultante se utiliza para la transformacion de E. coli. Las celulas de E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado y despues se recogen y se lisan. El plasmido se recupera con un proceso de purificacion que lo separa del ADN genomico. Como metodos de analisis se emplean en general analisis de la secuencia, analisis de restriccion, electroforesis y otros metodos de biologfa molecular y bioqmmicos. Despues de cada manipulacion, la secuencia de ADN utilizada se puede digerir con enzimas de restriccion y unirse a la secuencia de ADN contigua. Cada secuencia plasirndica se puede clonar en el mismo o en otros plasmidos.
Dependiendo del metodo escogido para insertar los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se escoge el plasmido Ti o Ri para la transformacion de la celula vegetal, entonces como mmimo el borde derecho del T-ADN del plasmido, y a menudo tanto este como el borde izquierdo, debe estar unido como region flanqueadora a los genes que se desean insertar. El uso del T-ADN para la transformacion de celulas vegetales ha sido ampliamente investigado y descrito en EP 120 516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); y An et al. (1985).
Son numerosas las tecnicas disponibles para insertar ADN en una celula hospedadora vegetal. Entre ellas se cuentan la transformacion con T-ADN por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformacion, fusion, inyeccion, biobalfstica (bombardeo con micropartmulas), triquitas de carburo de silicio, chorro de aerosol, PEG o electroporacion, aparte de otros metodos factibles. Si para la transformacion se opta por las agrobacterias, el ADN a insertar debe estar clonado en plasmidos especiales, ya sea en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios se pueden integrar en el plasmido Ti o Ri mediante recombinacion homologa gracias a secuencias que son homologas con las secuencias del T-ADN. El plasmido Ti o Ri tambien comprende una region vir necesaria para la transferencia del T-ADN. Los vectores intermediarios no se pueden autorreplicar en las agrobacterias y para su transferencia a Agrobacterium tumefaciens se precisa un
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plasmido auxiliar (conjugacion). En cambio, los vectores binarios se pueden autorreplicar tanto en E. coli como en las agrobacterias. Estos comprenden un gen marcador de seleccion y un conector o policonector que estan enmarcados por los bordes derecho e izquierdo del T-ADN. Este tipo de vectores se pueden transformar directamente en las agrobacterias (Holsters, 1978). El Agrobacterium utilizado como celula hospedadora debe contener un plasmido dotado de una region vir. La region vir es necesaria para la transferencia del T-ADN a la celula vegetal. Puede contener T-ADN adicional. La bacteria transformada de ese modo se utiliza para la transformacion de las celulas vegetales. Se pueden cultivar ventajosamente explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para transferir el ADN a la celula vegetal y, a continuacion, regenerar plantas enteras a partir del material vegetal infectado (p. ej. pedazos de hojas, segmentos de pedunculo, rafces y protoplastos o celulas cultivadas en suspension) en un medio adecuado, que puede contener antibioticos o biocidas como agentes de seleccion. Las plantas obtenidas se pueden analizar para detectar la presencia del ADN insertado. En el caso de la inyeccion y la electroporacion no es necesario recurrir a plasmidos especiales y se pueden emplear tipos convencionales como los derivados de pUC, entre otros.
Las celulas transformadas crecen en el interior de las plantas de la manera habitual. Pueden formar celulas germinales y transmitir el caracter o caracteres transformados a la progenie. Estas plantas a su vez se pueden cultivar de manera normal y cruzarse con plantas portadoras de los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los hfbridos resultantes poseen las propiedades fenotfpicas correspondientes.
En algunas formas de realizacion preferidas de la invencion, los genes que codifican la protefna bacteriana se expresan a traves de unidades transcripcionales insertadas en el genoma de la planta. Preferiblemente, dichas unidades transcripcionales son vectores recombinantes capaces de lograr una integracion estable en el genoma vegetal y permitir la seleccion de las lfneas vegetales transformadas que expresan el ARNm que codifica las protefnas.
Una vez el ADN insertado ha quedado integrado en el genoma, permanece relativamente estable en el (y no vuelve a salir). Suele contener un marcador de seleccion que confiere a las celulas de la planta transformada resistencia frente a un biocida o un antibiotico como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o cloramfenicol, entre otros. Algunos marcadores vegetales seleccionables tambien suelen proporcionar resistencia a varios herbicidas como glufosinato (PAT), glifosato (EPSPS), imazetapir (AHAS) y muchos otros. El marcador utilizado debe permitir la seleccion de las celulas transformadas en lugar de las celulas que no contienen el ADN insertado. El gen o genes de interes se expresan preferiblemente por medio de promotores constitutivos o inducibles en la celula vegetal. Una vez expresado, el ARNm se traduce en protefnas, incorporando aminoacidos de interes en ellas. Los genes que codifican una protefna expresada en las celulas vegetales pueden estar sometidos al control de un promotor constitutivo, un promotor especffico de tejido o un promotor inducible.
Existen varias tecnicas para introducir vectores recombinantes foraneos en celulas vegetales y para obtener plantas que mantengan y expresen de manera estable el gen introducido. Entre dichas tecnicas se incluyen la introduccion directa en las celulas de micropartfculas recubiertas con material genetico (Patentes U.S. N.° 4.945.050 concedida a Cornell y 5.141.131 concedida a DowElanco, ahora Dow AgroSciences, LLC). Asimismo, se pueden transformar plantas utilizando tecnicas con Agrobacterium, veanse las Patentes U.S. N.° 5.177.010 concedida a la University of Toledo y 5.104.310 a Texas A&M, la solicitud de patente europea 0131624B1; las solicitudes de patente europea 120516, 159418B1 y 176.112 concedidas a Schilperoot; las Patentes U.S. N.° 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940.838 y 4.693.976 concedidas a Schilperoot; las solicitudes de patente europea 116718, 290799, 320500, todas concedidas a Max Planck; las solicitudes de patente europea 604662 y 627752 y la Patente U.S. N.° 5.591.616, concedidas a Japan Tobacco; las solicitudes de patente europea 0267159 y 0292435 y la Patente U.S. N.° 5.231.019, todas concedidas a Ciba Geigy, ahora Syngenta; las patentes U.S. N.° 5.463.174 y 4.762.785, ambas concedidas a Calgene; y las patentes U.S. N.° 5.004.863 y 5.159.135, ambas concedidas a Agracetus. Otros metodos de transformacion incluyen las tecnicas con triquitas. Veanse las patentes U.S. N.° 5.302.523 y 5.464.765, ambas concedidas a Zeneca, ahora Syngenta. Las tecnicas de electroporacion tambien han sido utilizadas para transformar plantas. Vease la WO 87/06614 concedida a Boyce Thompson Institute; las Patentes U.S. N.° 5.472.869 y 5.384.253, ambas concedidas a Dekalb; y WO 92/09696 y WO 93/21335, ambas otorgadas a Plant Genetic Systems. Asimismo, tambien se pueden usar vectores virales para producir plantas transgenicas que expresen la protefna de interes. Por ejemplo, se pueden transformar plantas monocotiledoneas con un vector viral utilizando los metodos descritos en la patente U.S. N.° 5.569.597 concedida a Mycogen Plant Science y Ciba-Geigy (ahora Syngenta), asf como en las patentes U.S. N.° 5.589.367 y 5.316.931, ambas concedidas a Biosource, ahora Large Scale Biology.
Como se ha mencionado con anterioridad, la manera de introducir el constructo de ADN en la planta hospedadora no es crftica para esta invencion. Se puede emplear cualquier metodo que proporcione una transformacion eficiente. Por ejemplo, en la presente memoria se describen varios metodos para la transformacion de celulas vegetales que incluyen el uso de plasmidos Ti o Ri y similares para llevar a cabo la transformacion mediada por Agrobacterium. En muchos casos, sera deseable que el constructo utilizado para la transformacion disponga en uno o ambos lados de los bordes del T-ADN, mas concretamente el borde derecho. Estos resulta particularmente util cuando el constructo utiliza Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como vehfculo de la transformacion, aunque los
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bordes del T-ADN tambien pueden ser utiles con otros vehfculos de transformacion. Cuando se utiliza Agrobacterium para la transformacion de celulas vegetales, se puede utilizar un vector que puede ser introducido en el hospedador para la recombinacion homologa con el T-ADN o con el plasmido Ti o Ri presente en el anfitrion. El vector se puede introducir a traves de electroporacion, cruzamiento triparental y otras tecnicas de transformacion de bacterias gramnegativas conocidas por los expertos en la disciplina. El modo en que se lleva a cabo la transformacion con el vector en el Agrobacterium hospedador no es crftico para esta invencion. El plasmido Ti o Ri que contiene el T-ADN para la recombinacion no tiene por que ser capaz de provocar la formacion de agallas y no resulta crftico para dicha invencion siempre que dicho hospedador disponga de genes vir.
En ciertos casos de transformacion con Agrobacterium, el constructo de expresion situado entre los bordes del T- ADN se insertara en un vector de amplio espectro como pRK2 o derivados del mismo, tal y como se describe en Ditta et al. (1980) y EPO 0 120 515. El constructo de expresion y el T-ADN deben contener uno o mas marcadores como los descritos en la presente memoria que permitan la seleccion del Agrobacterium transformado y de las celulas vegetales transformadas. El marcador concreto no es esencial para esta invencion y dependera del hospedador y de la construccion utilizada.
Para la transformacion de las celulas vegetales con Agrobacterium se pueden combinar e incubar explantes con el Agrobacterium transformado durante el tiempo suficiente para posibilitar la transformacion de los mismos. Despues de la transformacion, las agrobacterias son eliminadas por seleccion con el antibiotico adecuado y las celulas vegetales se cultivan en el medio selectivo apropiado. Una vez formados los callos, se puede estimular la formacion de brotes empleando las hormonas vegetales adecuadas de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica de cultivo de tejidos vegetales y regeneracion de plantas. No obstante, no siempre es necesario un estadio intermedio de callo. Despues de la formacion del brote, dichas celulas vegetales pueden ser transferidas a un medio que estimula la formacion de rafces y completar asf la regeneracion de la planta. Las plantas pueden entonces cultivarse para obtener semillas, y estas se pueden utilizar para engendrar las generaciones futuras. Con independencia de la tecnica de transformacion utilizada, es preferible que el gen codificador de una protefna bacteriana se incorpore a un vector de transferencia genica adaptado para expresar dicho gen en una celula vegetal, incluyendo en el vector un elemento regulador promotor vegetal, asf como regiones de terminacion de la transcripcion no traducidas 3' como Nos y similares.
Ademas de las numerosas tecnicas disponibles para transformar plantas, tambien puede variar el tipo de tejido que entra en contacto con los genes foraneos. Dicho tejido incluirfa, entre otros tipos: tejido embriogenico, tejido de callo de los tipos I, II y III, hipocotilo, meristemo, tejido radicular, tejidos para la expresion en floema, y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden ser transformados durante la desdiferenciacion mediante tecnicas adecuadas descritas en la presente memoria.
Como se ha senalado antes, si se desea es posible utilizar diferentes marcadores seleccionables. La preferencia por un marcador concreto queda a discrecion del experto, pero se puede utilizar cualquiera de los siguientes marcadores seleccionables con cualquier otro gen no enumerado en la presente memoria que pueda funcionar con un marcado seleccionable. Tales marcadores seleccionables incluyen, entre otros, el gen de la aminoglucosido fosfotransferasa del transposon Tn5 (Aph II) que codifica la resistencia a los antibioticos kanamicina, neomicina y G418, asf como aquellos genes que codifican resistencia o tolerancia al glifosato, higromicina, metotrexato, fosfinotricina (bialafos o glufosinato), imidazolinonas, sulfonilureas y herbicidas triazolopirimidfnicos, como clorsulfuron, bromoxinilo, dalapon y similares.
Ademas de un marcador seleccionable, puede ser deseable utilizar un gen marcador (reporter). En ciertos casos se puede utilizar un gen marcador con o sin un marcador seleccionable. Los genes marcadores son genes que normalmente no estan presentes en el organismo o tejido receptor y que codifican protefnas que ocasionan un cambio fenotfpico o tienen una propiedad enzimatica. Ejemplos de tales genes se pueden consultar en Weising et al., 1988. Los genes marcadores preferidos incluyen la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de la cloramfenicol acetiltransferasa del Tn9 de E. coli, la protefna fluorescente verde de la medusa bioluminescente Aequorea victoria y los genes de luciferasa de la luciernaga Photinus piralis. A continuacion se puede efectuar un ensayo para detectar la expresion del gen marcador en el momento adecuado una vez introducido en las celulas receptoras. Un ensayo tal preferido consiste en el uso del gen que codifica la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli del modo descrito por Jefferson et al., (1987) para identificar celulas transformadas.
Ademas de los elementos reguladores promotores de origen vegetal, en celulas vegetales se pueden utilizar elementos de esa naturaleza procedentes de otras fuentes para expresar genes foraneos. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores reguladores de origen bacteriano, como el promotor de la octopina sintasa, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la mannopina sintasa; promotores de origen viral, como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (un promotor 35S modificado geneticamente, vease la Patente U.S. N.° 6.166.302, sobre todo el Ejemplo 7E) y similares. Los promotores reguladores vegetales incluyen, entre otros, la subunidad pequena (ssu) de la ribulosa-1,6-bifosfato (RUBP) carboxilasa, el promotor de la beta-conglicinina, el promotor de la beta- faseolina, promotor de ADH, promotores de shock termico y promotores especfficos de tejido. Otros elementos como regiones de anclaje a matriz, regiones de anclaje a andamio, intrones, intensificadores, secuencias de
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poliadenilacion y similares pueden estar presentes y mejorar la eficiencia de la transcripcion o de la integracion del ADN. Tales elementos pueden ser necesarios, pero no necesariamente, para la funcion del ADN, aunque pueden facilitar una mejor expresion o funcionamiento del ADN modificando la transcripcion, la estabilidad del ARNm, y similares. Tales elementos pueden incluirse en el ADN a voluntad para obtener un rendimiento optimo del ADN transformado en la planta. Los elementos habituales incluyen, entre otros, Adh-intron 1, Adh-intron 6, la secuencia lfder de la protefna de la capside del virus del mosaico de la alfalfa, secuencias UTR de la osmotina, la secuencia lfder de la protefna de la capside del virus del rayado del mafz, asf como otras disponibles para el experto. Tambien se pueden utilizar elementos reguladores consistentes en promotores constitutivos que provocan la expresion continua del gen en todos los tipos celulares y en todo momento (p. ej. actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares). Por otra parte, algunos elementos reguladores consistentes en promotores especfficos de tejido son los responsables de la expresion genica en ciertos tipos de celulas y tejidos, como las hojas o las semillas (p. ej. zefna, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y estos tambien pueden ser utilizados.
Los elementos reguladores promotores tambien pueden permanecer activos (o inactivos) durante una cierta etapa del desarrollo de la planta, asf como activos en ciertos tejidos y organos vegetales. Ejemplos de tales promotores incluyen, entre otros, elementos reguladores promotores especfficos del polen, especfficos del embrion, especfficos de los estigmas del mafz, especfficos de la fibra del algodon, especfficos de las rafces, especfficos del endospermo de las semillas o especfficos de la fase vegetativa, y similares. En ciertas circunstancias podrfa ser deseable utilizar un elemento regulador consistente en un promotor inducible, que sea responsable de la expresion de genes como respuesta a una senal especffica, por ejemplo: un estfmulo ffsico (genes de shock termico), luz (RUBP carboxilasa), hormona (Em), metabolitos, sustancias qufmicas (respuesta a tetraciclina) y estres. Tambien se pueden utilizar otros elementos de transcripcion y traduccion que funcionen en plantas. En la disciplina se conocen numerosos vectores de transformacion genica especfficos para vegetales.
Los sistemas basados en virus de ARN vegetales tambien se pueden usar para expresar protefnas bacterianas. De ese modo, el gen codificante de una protefna se puede insertar en una region promotora de la capside de un virus vegetal adecuado para infectar a la planta hospedadora de interes. La protefna puede entonces expresarse y conferir proteccion a la planta frente al dano causado por el herbicida. Sistemas basados en virus de ARN vegetales aparecen descritos en la patente U.S. N.° 5.500.360 concedida a Mycogen Plant Sciences, Inc. y en las patentes U.S. N.° 5.316.931 y 5.589.367 concedidas a Biosource, ahora Large Scale Biology.
A continuacion se describen ejemplos de procedimientos para poner en practica la invencion. Tales ejemplos no se deben considerar como excluyentes. Todos los porcentajes se indican en peso y todas las proporciones de mezcla de solventes se expresan en volumen a menos que se indique otra cosa.
Ejemplo 1 - Metodo para la identificacion de genes que confieren resistencia al 2,4-D en la planta
Para identificar genes capaces de degradar herbicidas en la planta se puede comenzar consultando las bases de datos publicas como NCBI (National Center for Biotechnology Information). Como punto de partida, es preciso disponer de una secuencia genica funcional identificada que codifique una protefna con las caracterfsticas deseadas (en este caso la actividad a-cetoglutarato dioxigenasa). Esta secuencia protefnica se utiliza como dato de entrada para el algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) que la comparara con las secuencias protefnicas disponibles en la NCBI. Utilizando los ajustes por defecto, la busqueda da como resultado mas de 100 secuencias protefnicas con diversos grados de homologfa. Este abanico ofrece desde una identidad de aminoacidos elevada (85-98%) hasta una identidad baja (23-32%). Normalmente, se supone que solo las secuencias con una homologfa elevada ostentan propiedades similares a la secuencia introducida. En este caso solo se escogieron las secuencias con una homologfa < 50%. A continuacion vamos a mostrar a modo de ejemplo que la clonacion y la expresion recombinante de homologos con apenas un 27% de aminoacidos conservados es factible como medio para conferir niveles comerciales de resistencia no solo frente al herbicida previsto, sino tambien frente a sustratos que nunca se habfan puesto a prueba con tales enzimas.
PCR y clonacion del gen en pET.
En la base de datos de NCBI se identifico un gen (rdpA) (vease el sitio web ncbi.nlm.nih.gov; entrada n.° AF516752) homologo del tfdA de Ralstonia eutropha que solo guardaba con este una identidad de aminoacidos del 28%. La identidad porcentual se determino traduciendo primero a protefna las secuencias de ADN de rdpA y tfdA que figuraban en la base de datos, y realizando despues el alineamiento multiple de las secuencias con el programa ClustalW, del paquete de software Vector NTI.
La cepa de Sphingobium herbicidovorans portadora del gen rdpA se obtuvo de la ATCC (American Type Culture Collection, cepa n.° 700291). La cepa liofilizada se revivio siguiendo el protocolo de la ATCC y se conservo a -80°C en glicerol al 20% para uso interno como cepa Dow Bacterial DB 536. A partir de esta solucion madre congelada, para aislar las celulas se sembro una placa de agar de triptona y soja con el contenido de un asa de Henle y se incubo a 28°C durante 3 dfas.
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Se selecciono una sola colonia para sembrar en 100 ml de caldo de triptona y soja en un matraz de 500 ml con tres placas deflectoras, que se dejo incubar hasta el dfa siguiente a 28°C en un agitador de plataforma a 150 rpm. De este cultivo se aislo todo el ADN con el protocolo para gramnegativos del kit DNeasy de Qiagen (n.° catalogo de Qiagen 69504). Para amplificar el gen diana a partir del ADN genomico se disenaron los siguientes cebadores: Directo, 5' TCT AGA AGG AGA TAT ACC ATG CAT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC CAG CG 3' [(SEC ID n° 1) (se anadio una diana de restriccion para Xba I y un sitio de union a ribosoma (RBS))], e Inverso, 5' CTC GAG TTA CTA GCG CGC CGG GCG CAC GCC ACC GAC CG 3' [(SEC ID n° 2) (se le anadio un codon extra de parada y una diana para Xho I)].
Se prepararon reacciones de veinte microlitros del modo siguiente: MasterMix 8 pl, cada cebador 1 pl (50 pmol/pl), ADNg 2,5 pl, H2O 7,5 pl. A continuacion se efectuo la PCR en las condiciones siguientes: 94°C durante 45 s, 52°C durante 1,5 minutos, 72°C durante 1,5 minutos, durante 30 ciclos, seguidos por un ciclo final a 72°C durante 5 minutos, utilizando un kit Master Taq de Eppendorf (Eppendorf, n.° catalogo 0032 002.250). El producto resultante de la PCR ~1 kb se clono en pCR 2.1 (Invitrogen, n.° catalogo K4550-40) siguiendo el protocolo incluido y utilizando como cepa hospedadora E. coli TOP10F' qmmicamente competente para verificar la secuencia de nucleotidos.
Diez de las colonias blancas resultantes se introdujeron en 4 ml de caldo Luria + 50 pg/ml de kanamicina (abreviado, LB K) y se dejaron crecer hasta el dfa siguiente a 37°C con agitacion. Los plasmidos de cada cultivo se purificaron con el kit Wizard Plus SV de Promega (Promega, n.° catalogo A1460) siguiendo el protocolo incluido. La secuenciacion se llevo a cabo con el kit CEQ Quick Start de Beckman (Beckman Coulter, n.° catalogo 608120) utilizando un cebador directo de M13 (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3') (SEC ID n° 16) y un cebador inverso de M13 (5' CAG GAA ACA GCT ATG aC 3') (SEC ID n° 17), segun las instrucciones del fabricante. Esta secuencia genica (SEC ID n° 3) y su protema correspondiente (SEC ID n° 9) recibieron la nueva designacion general de AAD-1 (v1) (ariloxialcanoato dioxigenasa) para mantener la coherencia interna.
Con las enzimas de restriccion correspondientes a las dianas anadidas con los conectores del cebador (Xba 1, Xho 1) se escindio el gen AAD-1 (v1) del vector pCR2.1 y se ligo a un vector pET 280 con resistencia a estreptomicina/espectinomicina. Los productos ligados se transformaron a continuacion en E. coli TOP10F' y se cultivaron en placas de agar con caldo Luria + 50 pg/ml de estreptomicina y espectinomicina (abreviado, LB S/S). Para distinguir entre las ligaciones AAD-1 (v1):pET 280 y pCR2.1:pET 280, se resembraron unas 20 colonias aisladas en 6 ml de LB S/S y se cultivaron a 37°C durante 4 horas con agitacion.
A continuacion cada cultivo se sembro en placas con LB K, que se incubaron a 37°C hasta el dfa siguiente. Las colonias que crecieron en el medio LB K se supusieron portadoras del vector pCR2.1 ligado y fueron descartadas. Los plasmidos de los cultivos restantes se aislaron del modo antes indicado. Este constructo de expresion recibio la designacion de pDAB 3203.
Ejemplo 2 - Expresion y analisis
2.1-Analisis por HPLC
El plasmido pDAB 3203 se mantuvo congelado a -80°C en celulas TOP10F' (Invitrogen) como cepa Dow Recombinant DR 1878. Para la expresion, el ADN plasmfdico del cultivo de TOP10F' se purifico con el kit Wizard de Promega (Fisher, n.° catalogo PR-A1460) se transformo en celulas BL-21 Star (DE3) (Invitrogen, n.° catalogo C6010-03) siguiendo el protocolo del fabricante. Despues de la transformacion, 50 pl de las celulas se sembraron en placas de agar LB S/S y se incubaron hasta el dfa siguiente a 37°C.
La manana siguiente, todas las colonias de la placa se recogieron y se introdujeron en 100 ml de LB en un matraz de 500 ml con tres placas deflectoras y se incubaron a 37°C/200 rpm durante 1 h. A continuacion, se indujo la expresion del gen con IPTG 1 mM y se dejaron incubar otras 4 h a 30°C/200 rpm. Los 100 ml del cultivo se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min, se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de MOPS 50 mM. Despues se sometieron a tres rondas de sonicacion de 45 s para lisar las celulas. Los lisados se centrifugaron a 15.000 rpm para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se pipeteo y almaceno a 4°C. Para comprobar la expresion recombinante se hizo correr una alfcuota de 20 pl en gel Tris Glicina al 4-20% (Invitrogen, n.° catalogo EC60255).
Una vez confirmada la expresion, la actividad enzimatica se analizo del modo siguiente. En primer lugar, se desalinizo una alfcuota del extracto celular con un cartucho PD-10 (Amersham, n.° catalogo 17-0435-01), que seguidamente se utilizo para las reacciones enzimaticas con herbicida.
En cada reaccion se emplearon los siguientes elementos: 2,4-D (125 pg/ml), [ascorbato (1 mM), ion ferroso (50 pM), a-cetoglutarato (1 mM), en MOPS 100 mM], extracto celular (100 pl). La reaccion se dejo incubar a temperatura ambiente durante 30 min., tras lo cual se detuvo con la adicion de HCl 0,1 N hasta que el pH se situo entre 2 y 3. La mitad del volumen de reaccion (~500 pl) se reservo para el bioanalisis, y el volumen restante se sometio a una extraccion en fase organica con tubos de extraccion de fase solida (Fisher, n.° catalogo 11-131-6) y 400 pl de
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acetonitrilo + TFA 0,05% como eluyente.
Los extractos se analizaron con HPLC para detectar la perdida del pico de 2,4-D o la presencia de cualquier otro pico producto de la degradacion o modificacion del 2,4-D. Las condiciones de la HPLC fueron: Luna 10 p C18(2) 250 x 4,6 mm (Phenomenex, n.° catalogo 00G-4253-E0), elucion con ACN 50% + TFA 0,05%: H2O 50% + TFA 0,05% a ACN 100% + TFA 0,05% durante 5 min.
2.2-Bioanalisis en placa para determinar la degradacion del herbicida.
Los bioanalisis con plantas permitieron averiguar si la transformacion enzimatica in vitro del herbicida comportaba la perdida de su actividad herbicida. Dada la naturaleza selectiva de los herbicidas estudiados (monocotiledoneas controladas con herbicidas AOPP y dicotiledoneas controladas con herbicidas auxfnicos), en el ensayo se emplearon Agrostis palustris natural var. Pencross como planta monocotiledonea y Arabidopsis thaliana var. Columbia como dicotiledonea. Ambas especies pueden hacerse germinar y crecer en placas de Petri pequenas.
Las semillas de Arabidopsis se sometieron a esterilizacion superficial durante 10 min. en una solucion al 50% de lejfa comercial/agua desionizada (v/v) con 1 pl de Tween-20 anadido como humectante con agitacion vigorosa (agitador a 250 rpm). La solucion de lejfa se decanto en el interior de una campana esteril y se lavo tres veces con agua esteril. La superficie de las semillas de agrostide se esterilizo durante 20 minutos de forma similar.
Entre veinte y treinta semillas esterilizadas de cada especie se depositaron en medio de ensayo en placa de agar solidificado esteril (PTM, Plate Test Medium) [KNO3 2,5 mM, KH2PO4 2,5 mM, FeSO4 50 mM, NaEDTA 10 mM (pH 8,0), MgSO4 2 mM, Ca(NO3)2 2 mM, H3BO3 70 pM, MnCh 14 pM, CuSO4 0,5 pM, ZnSO4 1 pM, NaMoO4.2H2O 0,2 pM, NaCl 10 pM, CoCl2.H2O 10 nM, sacarosa 0,8% (p/v), agarosa 0,4% (p/v)] en placas de Petri de 60x15 mm (Falcon 1007). El PTM se modifico anadiendo hasta seis dosis de patrones de los herbicidas a analizar o diluciones de solucion de herbicida-enzima a analizar, de modo tal que los incrementos de concentracion de 4x abarcaran un rango de dosificacion de tres ordenes de magnitud, con el GR50 (reduccion del crecimiento del 50%) situado aproximadamente en el centro del rango.
En las soluciones problema de herbicida-enzima, la concentracion maxima se determino a partir de la concentracion nominal antes de que se produjera la degradacion enzimatica. Las semillas se esparcieron uniformemente anadiendo 3 ml de PTM fundido de la misma composicion, agitandolo con movimientos circulares y dejandolo solidificar. Las placas se cerraron y se mantuvieron en condiciones esteriles en una camara de crecimiento con poca luz (24 h dfa-1, 100 pE/m2s1, 23°C) durante 7 dfas. La longitud de las rafces y de las rafces+brotes se midieron en cinco plantas escogidas al azar de Arabidopsis y de agrostide, respectivamente, y se calculo la longitud media promedio (porcentaje del control no tratado) respecto a la concentracion nominal del herbicida y el GR50.
Este bioanalisis permitio confirmar la perdida de la actividad herbicida fruto de la degradacion por la AAD-1 (v1) de la cadena lateral de oxialcanoato en varios herbicidas de uso habitual en agronomfa. En varios casos, el producto fenolico previsto se habfa eluido junto con el acido original en la HPLC y el bioanalisis sirvio como principal prueba de la degradacion del herbicida. Las Tablas 6 y 7 ofrecen los sustratos herbicidas analizados.
Tabla 6. Bioanalisis en placa con Arabidopsis de sustratos auxfnicos comerciales de tipo fenoxi y _______________________________piridiniloxialcanoato._______________________________
GR50 (nM)
Producto qufmico analizado
Prod. qufmico solo Prod. qufmico + Vector blanco* Prod. qufmico + AAD-1 v1 Cociente GR50**
2,4-D
22 17 267 16
DCP
>1000 nd nd nd
Diclorprop
nd 30 1000 33
Triclopir
255 1000 1000 1
Estructura
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Tabla 6. Bioanalisis en placa con Arabidopsis de sustratos auxfnicos comerciales de tipo fenoxi y piridiniloxialcanoato.
GR50 (nM)
Producto qufmico analizado
Prod. qufmico solo Prod. qufmico + Vector blanco* Prod. qufmico + AAD-1 v1 Cociente GR50** Estructura
Fluroxipir
2200 2250 1825 <1
*El vector blanco representa el tratamiento con lisado celular en que el vector pET de E. coli no tenia insertado ningun gen.
**El cociente GR50 es una medida de la perdida de la actividad herbicida en el tratamiento con lisado que expresa la enzima respecto a los tratamientos con el vector blanco. El umbral para detectar la perdida de actividad herbicida con este ensayo se situa en > 2.
Tabla 7. Bioanalisis en placa con agrostide de sustratos ariloxifenoxialcanoato inhibidores de la ACCasa.
GR50 (nM)
Producto qufmico analizado
Prod. qufmico Prod. qufmico + solo Vector blanco* Prod. qufmico + AAD-1 v1 Cociente GR50** Estructura
Haloxifop-RS
Diclofop-RS
28
nd
21
20
520
130
25
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7
*El vector blanco representa el tratamiento con lisado celular en que el vector pET de E. coli no tenia insertado ningun gen.
**El cociente GR50 es una medida de la perdida de la actividad herbicida en el tratamiento con lisado que expresa la enzima respecto a los tratamientos con el vector blanco. El umbral para detectar la perdida de actividad herbicida con este ensayo se situa en > 2.
2.3-Resultados de la HPLC
La bibliograffa revela que las enzimas dioxigenasa de esta clase requieren a-cetoglutarato como cosubstrato (vease un esquema general en la Figura 1) y el ion ferroso para unirse al centro activo. Otros experimentos presentes en la bibliograffa han demostrado que la adicion de ascorbato aumenta la actividad enzimatica al mantener el hierro en estado reducido, lo que evita la degradacion de la enzima. A tenor de este trabajo previo, se prepararon ensayos iniciales suponiendo que la enzima de interes actuarfa del mismo modo que otros miembros de esta clase general de enzimas.
Sorprendentemente, los resultados iniciales de la HPLC revelaron la presencia de un nuevo pico en el minuto 6,1, ademas de un pico reducido de 2,4-D a los 5,5 min. Este nuevo pico no estaba presente en el analisis control. Para identificar inicialmente el pico de los 6,1 minutos, se analizo un control de DCP en las mismas condiciones y, como cabfa esperar, este tambien eluyo a los 6,1 minutos. La formacion de este producto quedo confirmada por un analisis colorimetrico que detecto fenoles (vease el ejemplo 3.1), asf como por una espectrometrfa de masas. Como se esperaba, la AAD-1 (v1) cataliza una reaccion similar a la de otros miembros de esta clase de enzimas. En los bioanalisis estas mismas muestras tambien evidenciaron una perdida casi completa de la actividad herbicida del 2,4- D en el ensayo en placa con Arabidopsis (Figura 2). Independientemente de las condiciones especfficas del ensayo (tiempo de incubacion mas largo, mas enzima), la HPLC revelo que solo el 50-75% del 2,4-D pudo ser degradado a DCP. De hecho, la prolongacion de la induccion de las celulas de E. coli BL-21 con IPTG solo se tradujo en una reduccion de la actividad de la enzima, a pesar de que se expreso una mayor cantidad de protefna recombinante.
Una vez demostrada la degradacion del 2,4-D, se analizaron otros sustratos con grupos cfclicos similares (oxiacetatos y oxipropionatos). Los primeros compuestos analizados fueron los analogos piridfnicos fluoroxipir y triclopir, que son piridiniloxiacetatos: no se detecto actividad enzimatica en ninguno de ellos. Otros ensayos con
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varios analogos de estos dos piridiniloxiacetatos desprovistos de fluor o de los grupos amino tampoco revelaron degradacion alguna. Resulta destacable, empero, que la adicion de fluor en la posicion 5 del 2,4-D provocara una perdida casi total de la degradacion enzimatica (veanse mas resultados en el apartado siguiente).
A continuacion se analizaron los inhibidores de ACCasa haloxifop y diclofop en las mismas condiciones que el 2,4-D. (Los metabolites fenolicos correspondientes coeluyeron con el compuesto original en las condiciones de HPLC empleadas). Los resultados de los bioanalisis de estas muestras revelaron una perdida de la actividad herbicida tanto en el caso del haloxifop (Figura 3) como del diclofop. Tales resultados quedaron confirmados por el analisis colorimetrico, que tambien se utilizo para analizar una muestra mas amplia de estos compuestos.
2.4-Bioanalisis en placa para estudiar la degradacion del herbicida.
Los resultados de los bioanalisis corroboraron los resultados iniciales de la HPLC que indicaban una perdida del 2,4- D original tras la incubacion de soluciones del mismo con extractos sin purificar de AAD-1 recombinante (v1) (Figura 2). Asimismo, la actividad herbicida del acido fenoxipropionico diclorprop, tambien se vio degradada de manera efectiva. El cociente GR50 nominal correspondiente a la solucion de herbicida+enzima y a la solucion de herbicida sola sirvio como medida de la perdida de actividad del herbicida original causada por la actividad enzimatica. Un valor de 2-3 estuvo correlacionado normalmente con una perdida del 50-75% de la actividad del herbicida original (Tabla 6). Con frecuencia no se pudo determinar el GR50 tras el tratamiento enzimatico porque, de hecho, no quedaba actividad herbicida detectable.
Por su parte, los herbicidas AOPP tambien resultaron ser un sustrato excelente para la AAD-1 (v1), como demuestra la casi completa degradacion de la actividad graminicida en el bioanalisis en placa con agrostide (Figura 3 y Tabla 7). Este hecho resulta significativo porque supone la primera descripcion de un miembro de esta clase de enzimas que es activo contra herbicidas que no son auxfnicos fenoxi. De ello se deduce que esta enzima es lo bastante promfscua para catabolizar sustancias qufmicas dotadas de subestructuras fenoxialcanoato similares, aunque posean mecanismos de accion herbicida completamente dispares.
Ejemplo 3 - Valoracion in vitro de la actividad de la AAD-1 (v1) mediante la deteccion colorimetrica de compuestos fenolicos
3.1- Valoracion de la AAD-1 (v1).
La actividad de la enzima AAD-1 (v1) se valoro con la deteccion colorimetrica de los productos fenolicos mediante un version modificada del protocolo de Fukumori y Hausinger (1993) (J. Biol. Chem. 268: 24311-24317) que permitfa el analisis de microplacas de 96 pocillos. El analisis colorimetrico para valorar la actividad de las dioxigenasas que hidrolizan el 2,4-D y el diclorprop hasta convertirlo en 2,4-diclorofenol ya ha sido descrito. No obstante, se podrfan producir otros fenoles distintos a partir de otros herbicidas ariloxialcanoato como haloxifop y cihalofop (vease la Figura 4). El color desarrollado por varios fenoles se comparo con el del 2,4-diclorofenol con el metodo de deteccion descrito para averiguar que productos fenolicos podrfan detectarse facilmente. Los fenoles y los analogos fenolicos se analizaron a un concentracion final de 100 pM en 0,15 ml de MOPS 20 mM y pH 6,75 que contenfa NH4(FeSO4)2 200 pM y ascorbato sodico 200 pM. Los fenoles derivados del haloxifop y del cihalofop presentaron colores equivalentes a los del 2,4-diclorofenol y, por tanto, se detectaron facilmente. Los piridinoles derivados del fluoroxipir y el triclopir no generaron ningun color significativo. El color desarrollado por el 2,4-diclorofenol y el fenol de haloxifop resulto lineal y proporcional a la concentracion de fenol en la valoracion hasta ~500 pM. Una curva de calibracion realizada en las condiciones de valoracion estandar (160 pl de volumen final analizado) indico que con 172 pM de fenol se obtenfa una absorbancia a 510 nm de 0,1.
Los analisis de la enzima se efectuaron con un volumen total de 0,15 ml de MOPS 20 mM y pH 6,75 que contenfan NH4FeSO4 200 pM, ascorbato sodico 200 pM, a-cetoglutarato 1 mM, el sustrato adecuado (obtenido de una solucion madre 100 mM y disuelto en DMSO) y enzima. Las valoraciones se iniciaron anadiendo el sustrato de ariloxialcanoato, enzima o a-cetoglutarato en el momento cero. Al cabo de 15 minutos de incubacion a 25°C, la reaccion se detuvo anadiendo 10 pl de EDTA sodico 100 mM. El color se desarrollo anadiendo 15 pl de tampon a pH 10 (3,09 g de acido borico + 3,73 g de KCl + 44 ml de KOH 1 N), 1,5 pl de 4-aminoantipirina al 2% y 1,5 pl de ferricianuro potasico al 8%. Transcurridos de 10 a 20 min, se midio la absorbancia a 510 nm en un espectrofotometro de microplacas. Los blancos contenfan todos los reactivos excepto la enzima para tener en cuenta la pequena contaminacion que a veces afecta a algunos sustratos por pequenas cantidades de fenoles. Las valoraciones posteriores se refinaron modificando los reactivos anadidos, tal y como se indica a continuacion: la reaccion se detuvo anadiendo 30 pl de una mezcla 1:1:1 de EDTA sodico 50 mM, tampon a pH 10 y 4- aminoantipirina al 0,2%, y despues 10 pl de ferricianuro potasico al 0,8%.
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Actividad de la AAD-1 recombinante (v1) expresada en Escherichia coli.
Se resuspendieron sedimentos celulares de E. coli con Tris 0,1 M, pH 7,4 + lisozima 1 mg/ml (5 ml/celulas para un cultivo de 250 ml; 20 ml/celulas para 1 litro) a temperatura ambiente. Transcurridos unos 15 minutos con agitacion ocasional, la suspension se congelo en nitrogeno lfquido y despues se descongelo. Se anadio ADNasa a una concentracion final de 0,02 mg/ml y MgCl2 a 1 mM. Una vez el extracto perdio la viscosidad, se centrifugo durante 15 min y el sobrenadante se transfirio a una columna BioRad 10DG preequilibrada con MOPS 20 mM pH 6,75 y el eluato se fracciono en alfcuotas y congelo a -70°C. Los analisis se realizaron con estos extractos desalados sin purificar o con las enzimas purificadas.
Con los protocolos descritos anteriormente se extrajo y se valoro el sedimento celular de un cultivo de 250 ml de celulas E. coli inducidas que expresaban el pDAB3203 portador del gen AAD-1 (v1). La actividad degradadora del
2,4-D en el extracto de AAD-1 (v1) se comparo con la de celulas E. coli que expresaban un vector sin AAD-1 (v1) utilizando 2,4-D 1 mM; los resultados se muestran en la Figura 5. La cantidad de 2,4-diclorofenol formada es claramente proporcional a la cantidad de extracto anadido para la valoracion, mientras que el extracto control no muestra ninguna actividad degradadora del 2,4-D.
La actividad de este extracto se analizo con otros cuatro herbicidas, a saber, (R,S)-diclorprop, (R,S)-mecoprop, (R,S)-haloxifop y (R,S)-diclofop y se comparo con la del 2,4-D (todos a una concentracion final de 0,5 mM) con 4 pl de extracto de E. coli por analisis con un periodo de analisis de 15 min. La Figura 6A muestra que la AAD-1 (v1) degrado todos los cinco herbicidas transformandolos en fenol. La actividad relativa sobre los sustratos analizados fue la siguiente: diclorprop = mecoprop > diclofop > haloxifop > 2,4-D. Asf pues, la AAD-1 (v1) despliega actividad tanto contra los graminicidas de ariloxifenoxipropionato como contra los herbicidas auxfnicos fenoxi.
Seguidamente, el extracto de AAD-1 (v1) se analizo con el racemato (R,S)-haloxifop, el R-enantiomero del haloxifop y el S-enantiomero del cihalofop (todos a 0,5 mM) como sustratos potenciales para dilucidar la posible especificidad enantiomerica de la AAD-1 (v1). Los resultados se presentan en la Figura 6B. La actividad de la enzima sobre el (R)- haloxifop resulto equivalente a la manifestada con (R,S)-haloxifop, mientras que no se aprecio actividad alguna con el S-enantiomero del cihalofop, lo que indica que la AAD-1 (v1) presenta una especificidad R en los AOPP.
Ejemplo 4 - Especificidad de sustrato de la AAD-1 (v1)
4.1- Otros sustratos de la AAD-1 (v1).
La especificidad de sustrato de la AAD-1 (v1) hacia diversos herbicidas comerciales y experimentales se analizo empleando AAD-1 (v1) purificada en una concentracion de 1 o 10 pg por analisis de 160 pl; cada sustrato se analizo a 1 mM, con un tiempo para la valoracion de 15 minutos. La Tabla 3 muestra la A510 detectada despues de la accion de la AAD-1 (v1) sobre diversos herbicidas auxfnicos y analogos auxfnicos de ariloxialcanoato. El mejor sustrato analizado fue el diclorprop, aunque el mecoprop tambien se degrado notablemente. Otros dos fenoxipropionatos, los analogos 4-fluoro y 3-amino del diclorprop, tambien fueron degradados con eficacia por la AAD-1 (v1). La AAD-1 (v1) produjo pequenas cantidades de fenol a partir de diversos fenoxiacetatos, incluido el 2,4-D. Las tasas relativas sobre estos sustratos se aprecian mejor en los analisis realizados con la cantidad mas grande (10 pg) de AAD-1 (v1). De estos datos se deduce que el 2,4-D es degradado por la AAD-1 (v1), al igual que dos fenoxialquilsulfonatos, X188476 y X398166 (sesona).
La Tabla 4 contiene los datos de diversos graminicidas AOPP en calidad de sustratos de la AAD-1, asf como del fitoprotector cloquintocet. Todos los herbicidas AOPP comerciales analizados fueron degradados de manera efectiva por la AAD-1 (v1). Se trata de un descubrimiento inesperado que aumenta enormemente la utilidad potencial de esta enzima para conferir resistencia a una amplia gama de herbicidas graminicidas en aplicaciones transgenicas, ademas de frente a herbicidas auxfnicos. La AAD-1 (v1) presento su mayor actividad contra el quizalofop (76% de la tasa del diclorprop) y la menor contra el cihalofop (27% de la tasa del quizalofop, 21% de la tasa del diclorprop). El analogo ariloxiacetato del haloxifop (X043865) fue degradado muy lentamente, con solo un pequeno aumento de la A510 tras la exposicion a la cantidad mas elevada de enzima (10 pg). Este hecho concuerda con la mayor actividad de la AAD-1 (v1) manifestada contra los fenoxipropionatos respecto a los fenoxiacetatos auxfnicos. La actividad minima se detecto con (S)-cihalofop, lo cual indica que la AAD-1 (v1) presenta una preferencia significativa por los R-enantiomeros de los sustratos ariloxipropionato. De forma similar, no se aprecio actividad contra el cloquintocet, un fitoprotector quinolinoxiacetato, lo que coincide con la observacion de que la AAD-1 (v1) prefiere los sustratos ariloxipropionato a los herbicidas auxfnicos fenoxi.
Los sustratos X11115427, X124987 y MCPA se analizaron a 1 mM empleando 27 pg de AAD-1 (v1) recombinante sin purificar por valoracion. Los tres compuestos fueron degradados por la AAD-1 (v1) pero con diferente efectividad relativa (Tabla 8). El X11115427 actuo como un sustrato ligeramente mejor que el 2,4-D (125% de la tasa del 2,4-D) a diferencia del analogo cercano 3-amino-diclorprop, que es ~7 veces mejor que el 2,4-D como sustrato (Tabla 3). La
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sustitucion 5-F parece disminuir la efectividad del X11115427 como sustrato de la AAD-1 (v1). Las tasas de formacion de producto correspondientes al 5-F-fenoxiacetato y al MCPA supusieron el 32% y 55% de las del 2,4-D, respectivamente.
Tabla 8: Efecto de la AAD-1 (v1) sobre tres substratos respecto al 2,4-D. Los sustratos fueron valorados como se indica en la Tabla 6 a 1 mM utilizando un extracto sin purificar de AAD-1 (v1) recombinante obtenido en E. coli.
Tabla 8. Efecto de la AAD-1 (v1) sobre tres substratos respecto al 2,4-D.
ID de registro
Estructura molecular Compuesto A510 % 2,4-D
195517
y^r 2,4-D 0,177 100
11115427
& (R,S)-3-amino, 5-F- diclorprop 0,221 125
124987
F 5-F, 2,4-D 0,056 32
192711
yy>° H„C MCPA 0,097 55
4.2-Analisis cinetico.
Los valores Km y kcat de la AAD-1 (v1) purificada (vease el Ejemplo 10) se calcularon con cuatro sustratos herbicidas, a saber: (R)-diclorprop, (R)-haloxifop, (R)-quizalofop y 2,4-D, en condiciones de analisis estandar (MOPS 25 mM a pH 6,8; ascorbato sodico 200 pM; Fe2+ 200 pM; a-cetoglutarato 1 mM; 25°C). Las curvas dosis-respuesta se ajustaron con Grafit (Erithacus Software, Reino Unido) y las graficas y las constantes obtenidas se muestran en la Figura 7 y la Tabla 9. Los valores Km de los cuatro sustratos resultaron bastante similares (75-125 pM), pero los valores kcat variaron sustancialmente. El (R)-diclorprop presento el valor kcat mas alto y el 2,4-D el mas bajo (10% del valor del (R)-diclorprop). Estos valores kcat concordaron con el rango de valores observado en los ensayos de especificidad para el sustrato que aparecen en las Tablas 3 y 4, ya que estos se realizaron con elevadas (saturantes) concentraciones de sustrato (1 mM).
Tabla 9: Constantes cineticas de los sustratos de la AAD-1 (v1). Las constantes cineticas se calcularon con los datos de la Figura 7 aplicando un ajuste con Grafit a la ecuacion de Michaelis-Menten.
Tabla 9. Constantes cineticas de los sustratos de la AAD-1 (v1).
Sustrato
Km(pM) ±SE Vmax (pmol min-1 mg-1 AAD1) ± SE kcat (min-1) kcat/Km (min-1 mM-1)
R-diclorprop
75 ± 10 0,79 ±0.03 26,1 348
R-quizalofop
125 ±20 0,57 ± 0.03 18,9 151
R-haloxifop
120 ±54 0,34 ± 0.04 11,2 94
2,4-D
96 ±8 0,57 ±0.00 2,7 28
Los valores relativos de Km y kcat correspondientes al diclorprop y al 2,4-D difirieron significativamente de los publicados para la dioxigenasa R-especffica de Delftia acidovorans por Westendorf et al. (2003) (Acta Biotechnol. 23: 3-17). El valor kcat/Km publicado del 2,4-D supone el 0,6% del valor del diclorprop, mientras que en nuestros estudios, el valor kcat/Km del 2,4-D supone el 8% del de diclorprop. Por tanto, en el presente estudio, la AAD-1 (v1) resulto inesperadamente eficaz a la hora de catalizar la degradacion del 2,4-D. Esto aumenta su utilidad potencial para conferir diversos caracteres de tolerancia a herbicidas en aplicaciones transgenicas.
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4.3-Otros sustratos de la AAD-1 (v1).
Tres sustratos mas se analizaron a 1 mM utilizando 27 |jg de AAD-1 recombinante (v1) bruta por valoracion: X11115427, X124987 y MCPA. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Los tres compuestos fueron degradados por la AAD-1 (v1), pero con diferente efectividad relativa. El X11115427 solo fue ligeramente mejor (125%) como sustrato que el 2,4-D. Esto contrasta con el 3-aminodiclorprop, que es >7 veces mejor que el 2,4-D como sustrato (Tabla 3). Por tanto, la sustitucion 5-F redujo significativamente la efectividad del X11115427 como sustrato para la AAD-1 (v1). Una tendencia similar se observo en el caso del 5-F-2,4-D, que solo alcanzo una efectividad del 32% como sustrato respecto al 2,4-D. En este analisis, el MCPA tambien resulto menos efectivo como sustrato de la AAD-1 (v1) (55% respecto al 2,4-D).
Ejemplo 5 - Optimizacion de la secuencia para la expresion en vegetales
5.1- Antecedentes.
A fin de obtener una elevada de expresion de genes heterologos en vegetales, puede ser preferible modificar con tecnicas de ingenierfa genetica dichos genes para que se expresen con mas eficiencia en (el citoplasma de) las celulas vegetales. El mafz es una de las especies vegetales en las que puede ser preferible redisenar el gen o genes heterologos antes de la transformacion para aumentar su nivel de expresion en la planta. Por consiguiente, un paso adicional en el diseno de genes que codifican una protefna bacteriana consiste en modificar el gen heterologo para lograr una expresion optima.
Uno de los motivos para modificar con tecnicas de ingenierfa genetica una protefna bacteriana que pretenda expresarse en el mafz radica en el contenido inadecuado de G+C del gen original. Por ejemplo, el contenido sumamente bajo de G+C de muchos genes bacterianos (y por tanto, la tendencia a un elevado contenido de A+T) da lugar a secuencias que imitan o duplican las secuencias de control genico de los vegetales que son muy ricas en A+T. La presencia de ciertas secuencias ricas en A+T en el ADN del gen o genes introducidos en las plantas puede ocasionar una transcripcion aberrante (p. ej., las regiones TATA box que suelen hallarse en los promotores genicos). Por otro lado, la presencia de otras secuencias reguladoras en el ARNm transcrito (p. ej., secuencias de senal de poliadenilacion (AAUAAA), o secuencias complementarias a los ARN nucleares pequenos implicados en el empalme del pre-ARNm) puede provocar inestabilidad en el ARN. Asf pues, un objetivo en el diseno de genes que codifican una protefna bacteriana que se pretende expresar en mafz, preferiblemente denominados genes optimizados para vegetales, consiste en crear una secuencia de ADN con un contenido mas elevado de G+C que, preferiblemente, resulte similar a la de los genes del mafz que codifican las enzimas metabolicas. Otro objetivo en el diseno de los genes optimizados para vegetales que codifican una protefna bacteriana consiste en generar una secuencia de ADN cuyas modificaciones no obstaculicen su traduccion.
La Tabla 10 ilustra el elevado contenido de G+C del genoma del mafz. Las regiones codificantes de los genes se extrajeron de las entradas del GenBank (Release 71) y las composiciones de bases se calcularon con el programa MacVector™ (Accelerys, San Diego, California, EE.UU.). Las secuencias intronicas no se tuvieron en cuenta en los calculos.
Tabla 10: Compilacion de contenidos G+C en las regiones codificantes de protefnas de genes del mafz
Clase de protefna Enzimas metabolicos (76) Protefnas estructurales (18) Protefnas reguladoras (5) Protefnas sin caracterizar (9) Todas las protefnas (108)
Rango % G + C
44.4- 75,3 48,6-70,5 57,2-68,8
41.5- 70,3 44,4-75,3
Media % G + C b
59.0 63,6
62.0 64,3 60,8
+- 8,0) +- 6,7) +- 4,9) +- 7,2) +- 5,2)
a El numero de genes de la clase se indica entre parentesis.
b Valores de la desviacion estandar indicados entre parentesis.
c La media de los grupos combinados no se tuvo en cuenta en el calculo de la media.
Debido a la flexibilidad proporcionada por la redundancia/degeneracion del codigo genetico (algunos aminoacidos son codificados por mas de un codon), la evolucion de los genomas en distintos organismos o clases de organismos se ha decantado hacia un uso diferencial de codones redundantes. Esta “preferencia codonica” queda reflejada en la composicion media de bases de las regiones codificantes de protefnas. Por ejemplo, los organismos con un contenido relativamente bajo de G+C utilizan codones portadores de A o T en la tercera posicion de los codones redundantes, mientras que aquellos con contenidos de G+C mas altos utilizan codones cuya tercera posicion acoge G o C. Se cree que la presencia de codones “menores” dentro del ARNm podna reducir su tasa absoluta de traduccion, especialmente cuando la abundancia relativa del ARNt cargado correspondiente al codon menor es baja. Una consecuencia de esto es que la disminucion de la tasa de traduccion por codones menores individuales serfa como mfnimo aditiva para los codones menores multiples. Y, por consiguiente, los ARNm cuyo contenido de codones menores sea relativamente alto tendran bajas tasas de traduccion. Y esto, a su vez, darfa como resultado
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niveles bajos de la protefna codificada.
En genes modificados geneticamente que codifican una protefna bacteriana para ser expresada en mafz (u otra planta, como el algodon o la soja) se ha determinado la preferencia codonica de la planta. La preferencia codonica del mafz es la distribucion estadfstica de los codones que la planta utiliza para codificar sus protefnas; los codones utilizados con mas preferencia se muestran en la Tabla 11. Una vez determinada la preferencia, se determina la frecuencia porcentual de los codones en el gen o genes de interes. Deben averiguarse que codones son preferidos en primer lugar por la planta, asf como las segundas, terceras y cuartas opciones de codones, en el caso de que existan. Entonces se puede disenar una nueva secuencia de ADN que codifique la secuencia de aminoacidos de la protefna bacteriana, pero esta nueva secuencia de ADN diferira de la secuencia bacteriana original (que codifica la protefna) por la sustitucion con codones vegetales (primera, segunda, tercera o cuarta opcion preferidas) para especificar el aminoacido en cada posicion de la secuencia proteica. A continuacion, la nueva secuencia se analiza para detectar dianas de restriccion que se hayan podido crear accidentalmente a rafz de la modificacion. Las dianas identificadas son modificadas reemplazandolas por codones de primera, segunda, tercera o cuarta opcion. Otros lugares de la secuencia que pueden alterar la transcripcion o la traduccion del gen de interes son las uniones exon:intron (5' o 3'), senales de adicion de poli A, o senales de tenriinacion para la ARN polimerasa. La secuencia se vuelve a analizar y a modificar para reducir la frecuencia de dobletes Ta o GC. Ademas de los dobletes, los segmentos de secuencia G o C que contienen mas de cuatro residuos iguales aproximadamente pueden afectar a la transcripcion de la secuencia y, por consiguiente, estos bloques tambien se modifican sustituyendo los codones de primera o segunda eleccion, etc. con la siguiente opcion preferida.
Tabla 11. Codones de aminoacidos preferidos para las protefnas expresadas en el mafz
Aminoacido
Codon*
Alanina
GCC/GCG
Cistefna
TGC/TGT
Acido aspartico
GAC/GAT
Acido glutamico
GAG/GAA
Fenilalanina
TTC/TTT
Glicina
GGC/GGG
Histidina
CAC/CAT
Isoleucina
AAG/AAT
Leucina
CTG/CTC
Metionina
ATG
Asparragina
AAC/AAT
Prolina
CCG/CCA
Glutamina
CAG/CAA
Arginina
AGG/CGC
Serina
AGC/TCC
Treonina
ACC/ACG
Valina
GTG/GTC
Triptofano
TGG
Tirosina
TAC/TAT
Parada
TGA/TAG
Se prefiere que los genes optimizados para vegetales que codifican una protefna bacteriana contengan alrededor del 63% de codones de primera eleccion, entre aproximadamente el 22% y aproximadamente el 37% de codones de segunda eleccion y entre alrededor del 15% y alrededor del 0% de codones de tercera o cuarta eleccion, hasta sumar el porcentaje total del 100%. Los genes optimizados para vegetales preferidos principalmente contienen alrededor de un 63% de codones de primera eleccion, al menos aproximadamente un 22% de codones de segunda eleccion, aproximadamente un 7,5% de codones de tercera eleccion y aproximadamente un 7,5% de codones de cuarta eleccion, hasta sumar el porcentaje total del 100%. El metodo descrito permite a un experto en la tecnica modificar un gen o genes que son foraneos para una planta dada, de modo que se expresen optimamente en plantas. El metodo se muestra con mas detalle en la solicitud PCT WO 97/13402.
Asf pues, el diseno de genes optimizados para vegetales que codifiquen una protefna bacteriana pasa por disenar una secuencia de ADN que codifique la secuencia de aminoacidos de dicha protefna utilizando un codigo genetico redundante confeccionado a partir de una tabla de preferencia codonica compilada a partir de las secuencias genicas de esa planta en particular. La secuencia de ADN resultante posee un mayor grado de diversidad codonica, una composicion de bases conveniente, puede contener dianas para enzimas de restriccion ubicadas estrategicamente y carece de secuencias que puedan interferir con la transcripcion del gen o con la traduccion del ARNm resultante. De ese modo, los genes sinteticos que sean funcionalmente equivalentes a las protefnas/genes de la presente invencion se podran utilizar para transformar hospedadores, incluidas plantas. Se pueden encontrar mas directrices sobre la produccion de genes sinteticos en, por ejemplo, la Pat. U.S. N.° 5.380.831.
El analisis exhaustivo de las 888 pares de bases (pb) de la secuencia de ADN de la region codificante original del AAD-1 (v1) (SEC ID n° 3) revelo la presencia de varios motivos de secuencia que se cree que afectan 5 negativamente a la expresion optima en vegetales, asf como una composicion codonica que no resulta optima. Para mejorar la produccion de la protefna recombinante tanto en monocotiledoneas como en dicotiledoneas, se desarrollo una secuencia de ADN “optimizada para vegetales” (SEC ID n° 5) que codifica la SEC ID n° 11, que es la misma que la SEC ID n° 9 original excepto por la adicion de un residuo de alanina en la segunda posicion. El codon adicional de alanina (GCT; subrayado en la SEC ID n° 5) se incluyo para codificar una diana para Nco I (CCATGG) que abarcaba 10 el codon de inicio ATG, para permitir posteriores operaciones de clonacion. Las protefnas codificadas por las regiones codificantes original (v1) y optimizadas para vegetales (v3) son identicas en un 99,3%, difiriendo unicamente en el aminoacido numero 2. En cambio, las secuencias de ADN original (v1) y optimizadas para vegetales (v3) de las regiones codificantes unicamente son identicas en un 77,7%. Se efectuo una alineacion de la secuencia del ADN original y del ADN optimizado para vegetales y en la Tabla 12 se muestran las diferencias en la 15 composicion codonica de la secuencia original y de la secuencia optimizada para plantas.
Tabla 12. Comparacion de la composicion codonica de la region codificante del AAD-1 (v1) original y de su version
optimizada para vegetales.
Amino acido
Codon N.° gen origi nal % gen original N.° gen opt. plantas % gen opt. plantas Amino-acido Codon N.° gen origi nal N.° gen opt. plantas % gen opt. plantas
ALA (A)
GCA 2 9,1 5 22 LEU (L) CTA 0 0,0 0 0
GCC 10 45,5 8 35 CTC 5 22,7 7 32
22
GCG 9 40,9 0 0 CTG 16 72,7 0 0
GCT 1 4,5 10 43 22 CTT 0 0,0 8 36
ARG (R)
AGA 0 0,0 7 30 TTA 0 0,0 0 0
AGG 0 0,0 7 30 TIG 1 4,5 7 32
CGA 0 0,0 0 0 LYS (K) AAA 1 14,3 2 29
23
CGC 16 69,6 5 22 7 AAG 6 85,7 5 71
CGG 4 17,4 0 0 MET(M) ATG 8 100 8 100
CGT 3 13,0 4 17 PHE(F) TTC 10 76,9 9 69
ASN (N)
AAC 8 100,0 4 50 13 TTT 3 23,1 4 31
8
AAT 0 0,0 4 50 PRO (P) CCA 1 5,9 8 47
ASP(D)
GAC 15 78,9 10 53 CCC 9 52,9 1 6
19
GAT 4. 21,1 9 47 17 CCG 7 41,2 o- 0
CYS (C)
TGC 3 100,0 2 67 CCT 0 0,0 8 47
3
TGT 0 0,0 1 33 SER (S) AGC 11 73,3 4 27
END
TAA 0 0,0 0 0 AGT 0 0,0 0 0
1
TAG 1' 100,0 0 0 15 TCA 0 0,0 4 27
TGA 0 0,0 1 100 TCC 2 13,3 3 20
GLN (Q)
CAA 0 0,0 7 54 TCG 2 13,3 0 0
13
CAG 13 100,0 6 46 TCT 0 0,0 4 27
GLU (E)
GAA 8 50,0 5 31 THR (T) ACA 1 4,3 6 26
16
GAG 8 50,0 11 69 ACC 16 69,6 9 39
GLY (G)
GGA 0 0,0 6 29 23 ACG 5 21,7 0 0
GGC 15 71,4 7 33 ACT 1 4,3 8 35
21
GGG 3 14,3 2 10 TRP(W) TGG 5 100 5 100
GGT 3 14,3 6 29 TYR (Y) TAC 7 70,0 6 60
HIS(H)
CAC 6 60,0 5 50 10 TAT 3 30,0 4 40
10
CAT 4 40,0 5 50 VAL(V) GTA 2 7,1 0 0
ILE(I)
ATA 0 0,0 3 25 GTC 11 39,3 8 29
12
ATC 12 100,0 5 42 28 GTG 15 53,6 10 36
ATT 0 0,0 4 33 GTT 0 0,0 10 36
Totales 148 149 Totales 148 148
5.3 - Construccion de los vectores binarios
20 5.3.1- AAD-1 reconstruido (v3).
El gen optimizado para vegetales AAD-1 (v3) fue suministrado por Picoscript (acabado el diseno de reconstruccion del gen (vease arriba), la sfntesis se encargo a Picoscript) y la secuencia (SEC ID n° 5) se verifico internamente para
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confirmar que no contenfa alteraciones respecto a la secuencia esperada. Las reacciones de secuenciacion se llevaron a cabo con cebadores directos de M13 (SEC ID n° 16) e inversos de M13 (SEC ID n° 17) utilizando reactivos del “Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit” de Beckman Coulter como se ha indicado antes. Los datos de la secuencia se analizaron y los resultados indicaron que la secuencia de ADN del AAD-1 (v3) optimizado para plantas no contenfa anomalfas. El gen AAD-1 (v3) se clono en pDAB726 como un fragmento Nco I- Sac I. El constructo resultante se diseno como un pDAB720, que contenfa: [promotor AtUbi10: Nt OSM 5'UTR; AAD- 1 (v3): Nt OSM3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR] (verificado con digestiones con la enzima de restriccion Not I). Un fragmento Not I-Not I que contenfa la casete descrita se clono a continuacion en el sitio Not I del vector binario pDAB3038. El vector binario resultante, pDAB721, que contenfa la siguiente casete [promotor AtUbi10: Nt OSM5'UTR: AAD-1 (v3): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR] se digirio con enzimas de restriccion (Bam HI, EcoR I, EcoR V, HinD III, Pac I y Xmn I) para verificar que la orientacion era correcta. El constructo acabado y verificado (pDAB721) se empleo para la transformacion en Agrobacterium (vease el apartado 6.2).
5.3.2-AAD1 natural (v1) y AAD-1 modificado (v2).
El gen AAD-1 (v1) (SEC ID n° 3) se amplifico con PCR a partir del pDAB3203. Durante la reaccion de PCR, se modificaron los cebadores para introducir dianas de restriccion para NcoI y SacI en el cebador 5' y en el cebador 3', respectivamente. Para amplificar el fragmento de ADN se emplearon los cebadores “rdpA(ncol)” [CCC ATG GCT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC] (SEC ID n° 6) y “3' saci” [GAG CTC ACT AGC GCG CCG GGC GCA CGC CAC CGA] (SEC ID n° 7) con el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter).
El amplicon de PCR se ligo a un vector de clonacion pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) y la secuencia se verifico con cebadores directos de M13 (SEC ID n° 16) e inversos de M13 (SEC ID n° 17) utilizando los reactivos de secuenciacion del “Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit” de Beckman Coulter.
Los datos de secuenciacion identificaron a un clon con la secuencia correcta. Durante el analisis se descubrio una diana de restriccion para Notl que era superflua, situada hacia el extremo 3' del AAD-1 (v1). Esta diana se elimino para facilitar la clonacion en pDAB3038; para eliminarla se llevo a cabo una reaccion de PCR con un cebador 5' interno. La diana de NotI se altero incorporando un nuevo codon para un aminoacido con el fin de eliminar la diana falsa de NotI. Este cambio alterarfa la arginina de la posicion 212 convirtiendola en una cistefna. Se usaron los cebadores de PCR “BstEN/Del Notl” [TGG TGG TGA CCC ATC CGG GCA GCG GCT GCA AGG GCC] (SEC ID n° 8) y “3' saci” (SEC ID n° 7).
Se realizo una reaccion PCR con el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter) y el fragmento resultante se clono en el kit de clonacion pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen). La confirmacion del producto de PCR correcto se llevo a cabo secuenciando el ADN y el gen “fijado” recibio la designacion de AAD-1 (v2) (SEC ID n° 4).
La reaccion de secuenciacion con el cebador inverso de M13 (SEC ID n° 17) y los reactivos de secuenciacion “Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit” de Beckman Coulter indico que se habfa aislado el fragmento de PCR correcto. Este constructo se digirio con las enzimas BstEII y SacI. El fragmento resultante se clono en el constructo pCR2.1 AAD-1 (v2) (pCR2.1 Delta NotI) y se confirmo mediante una digestion con enzima de restriccion.
Acto seguido, el gen AAD-1 (v2) modificado se clono en el pDAB726 en forma de un fragmento de ADN NcoI/SacI. El constructo resultante (pDAB708) se verifico con digestiones por enzimas de restriccion y despues se clono en el vector binario pDAB3038 como un fragmento NotI-NotI. El constructo final resultante recibio la designacion pDAB766, que contenfa el [promotor AtUbi10: Nt OSM5'UTR: AAD-1 (v2): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR] y fue digerido con enzimas de restriccion para verificar que la orientacion era correcta. El constructo acabado se uso entonces para la transformacion en Agrobacterium.
5.3.3 - Diseno de una secuencia de ADN con codones adaptados a la soja que codifica una EPSPS de soja portadora de mutaciones que confieren tolerancia al glifosato.
Este ejemplo ilustra el diseno de una nueva secuencia de ADN que codifica una 5-enolpiruvoilshikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS) mutante de soja, optimizada para la expresion en celulas de soja. La secuencia de aminoacidos de una EPSPS de soja con tres mutaciones se muestra como la SEC ID n° 5 de la WO 2004/009761. Los aminoacidos mutados en dicha secuencia son el residuo 183 (treonina de la protefna original sustituida por una isoleucina), residuo 186 (arginina de la protefna original sustituida por una lisina) y residuo 187 (prolina de la protefna original sustituida por una serina). Asf pues, es posible deducir la secuencia de aminoacidos de la protefna EPSPS de soja original reemplazando los aminoacidos sustituidos de la SEC ID n° 5 de la WO 2004/009761 con los aminoacidos originales en las posiciones adecuadas. Esta secuencia original de la protefna se presenta en la presente memoria como la SEC ID n° 20. En la presente memoria tambien se expone una secuencia de protefna EPSPS de soja portadora de dos mutaciones, a saber, una mutacion en el residuo 183 (treonina de la protefna original sustituida por una isoleucina) y en el residuo 187 (prolina de la protefna original sustituida por una serina), presentada como la SEC ID n° 21.
Consultando la pagina web “kazusa.or.jp/codon” se obtuvo una tabla de uso de codones correspondiente a las secuencias codificantes de protefnas de la soja (Glycine max), calculada a partir de 362.096 codones (aproximadamente 870 secuencias codificantes). Estos datos se reformatearon tal y como se muestra en la Tabla 5 13. Las columnas D y H de la Tabla 13 presentan las distribuciones (en % de uso de todos los codones para ese
aminoacido) de los codones sinonimos de cada aminoacido, tal y como se hallan en las regiones codificantes de protefnas de los genes de soja. Es evidente que algunos codones sinonimos de algunos aminoacidos (un aminoacido puede estar codificado por 1, 2, 3, 4 o 6 codones) raramente estan presentes en las regiones codificantes de protefnas de la soja (por ejemplo, comparese el uso de los codones GCG y GCT que codifican la 10 alanina). A partir de los datos de la Tabla l3 se elaboro una tabla con los codones preferidos por la soja. Los codones hallados en los genes de soja con una frecuencia inferior aproximadamente al 10% del total de apariciones de un aminoacido en particular se descartaron. Para equilibrar la distribucion de las restantes opciones de codon para un aminoacido, se calculo un promedio ponderado de cada codon con la formula:
15 % ponderado de C1 =1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) * %C1 * 100
donde C1 es el codon en cuestion, C2, C3, etc. representan los codones sinonimos restantes y los valores % para los codones relevantes se toman de las columas D y H de la Tabla 13 (descartando los valores de los codones muy poco frecuentes, senalados en negrita). El valor % ponderado de cada codon se ofrece en las columnas C y G de la 20 Tabla 13. TGA se escogio arbitrariamente como codon terminador de la traduccion. Las frecuencias de los codones preferidos se introdujeron en una tabla de codigo genetico especializada para el uso con el programa de diseno de genes OptGene™ (Ocimum Biosolutions LLC, Indianapolis, Indiana, EE.uU.).
Tabla 13. Representacion de los codones sinonimos presentes en las secuencias codificantes de protefna de la soja y calculo de un conjunto de representacion de los codones preferidos para el diseno de un gen sintetico optimizado ________________________________________para la soja._______________________________________
A
B C D E F G H
Amino-
Codon Ponderado Soja Amino-acido Codon Ponderado Soja
acido
% % % %
ALA (A)
GCA 33,1 30,3 LEU (L) CTA DNU 9,1
GCC 24,5 22,5 CTC 22,4 18,1
GCG DNU* 8,5 CTG 16,3 13,2
GCT 42,3 38,7 CTT 31,5 25,5
ARG (R)
AGA 36,0 30,9 TTA DNU 9,8
AGG 32,2 27,6 TTG 29,9 24,2
CGA DNU 8,2 LYS (K) AAA 42,5 42,5
CGC 14,8 12,7 AAG 57,5 57,5
CGG DNU 6,0 MET(M) ATG 100,0 100
CGT 16,9 14,5 PHE (F) TTC 49,2 49,2
ASN (N)
AAC 50,0 50,0 TTT 50,8 50,8
AAT 50,0 50,0 PRO (P) CCA 39,8 36,5
ASP (D)
GAC 38,1 38,1 CCC 20,9 19,2
GAT 61,9 61,9 CCG DNU 8,3
CYS (C)
TGC 50,0 50,0 CCT 39,3 36,0
TGT 50,0 50,0 SER (S) AGC 16,0 15,1
END
TAA DNU 40,7 AGT 18,2 17,1
TAG DNU 22,7 TCA 21,9 20,6
TGA 100,0 36,6 TCC 18,0 16,9
GLN (Q)
CAA 55,5 55,5 TCG DNU 6,1
CAG 44,5 44,5 TCT 25,8 24,2
GLU (E)
GAA 50,5 50,5 THR (T) ACA 32,4 29,7
GAG 49,5 49,5 ACC 30,2 27,7
GLY (G)
GGA 31,9 31,9 ACG DNU 8,3
GGC 19,3 19,3 ACT 37,4 34,3
GGG 18,4 18,4 TRP (W) TGG 100,0 100
GGT 30,4 30,4 TYR (Y) TAC 48,2 48,2
HIS (H)
CAC 44,8 44,8 TAT 51,8 51,8
CAT 55,2 55,2 VAL (V) GTA 11,5 11,5
ILE (I)
ATA 23,4 23,4 GTC 17,8 17,8
ATC 29,9 29,9 GTG 32,0 32,0
ATT 46,7 46,7 GTT 38,7 38,7
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DNU = no usar
Para obtener una secuencia de ADN optimizada para soja que codificase la protefna EPSPS portadora de dos mutaciones, se tradujo en sentido inverso la secuencia protefnica de la SEC ID n° 21 con el programa OptGene™ utilizando el codigo genetico adaptado a la soja indicado arriba. La secuencia inicial de ADN obtenida de esa forma se modifico compensando los cambios de codon (conservando la representacion media ponderada total de los codones) para reducir el numero de dobletes CG y TA entre codones adyacentes, aumentar el numero de dobletes CT y TG entre codones adyacentes, eliminar estructuras secundarias intracatenarias muy estables, eliminar o anadir dianas de restriccion y eliminar otras secuencias que pudieran afectar negativamente a la expresion o las operaciones de clonacion del gen modificado. Otros refinamientos de la secuencia consistieron en eliminar posibles sitios de escision de intrones vegetales, largos tramos de residuos de A/T o C/G y otros motivos que podrfan interferir con la estabilidad del ARN, su transcripcion o la traduccion de la region codificante en las celulas vegetales. Se hicieron otros cambios para eliminar grandes marcos de lectura abiertos internos (marcos distintos de +1). Estos cambios se aplicaron de forma limitada para conservar la composicion de codones adaptados a la soja descrita arriba y preservar la secuencia de aminoacidos revelada en la SEC ID n° 21.
La secuencia de ADN adaptada a la soja que codifica la protefna EPSPS de la SEC ID n° 21 se ofrece como las bases 1-1575 de la SEC ID n° 22. La sfntesis del fragmento de ADN que comprende la SEC ID n° 22 corrio a cargo de un proveedor comercial (PicoScript, Houston Texas, EE.UU.).
5.3.4 - Clonacion de otros constructos binarios.
Para acabar los pDAB3295 y pDAB3757 se utilizo la tecnica de clonacion GateWay (Invitrogen, n.° catalogo 11791043 y n.° catalogo 12535-019). Esta tecnica utiliza una recombinacion especffica de sitio basada en el fago lambda para insertar una casete genica en un vector. Para mas informacion vease Gateway Technology: A universal technology to clone DNA sequence for functional analysis and expression in multiple systems, © 1999-2003, Invitrogen Corp., 1600 Faraday Ave., Carlsbad, California 92008, EE.UU. (publicado - 2003). Los demas constructos creados para la transformacion en especies vegetales adecuadas se construyeron por medio de procedimientos similares al de arriba y otros metodos moleculares de clonacion habituales (Maniatis et al., 1982). La Tabla 14 enumera todos los constructos de transformacion utilizados con los promotores apropiados y las caracterfsticas definidas, asf como el cultivo objeto de la transformacion.
El gen sacB se inserto en el vector binario pDAB3289 como un marcador de seleccion bacteriano negativo para reducir la persistencia de Agrobacterium asociada con el tejido vegetal transformado. SacB es una enzima levano- sacarasa sintetizada por Bacillus spp. que resulta toxica para la mayorfa de bacterias gramnegativas cuando crecen en presencia de sacarosa (Gay et al., 1983). El gen sacB se recupero en un fragmento Hind III del plasmido pRE112 (Edwards, et al., 1998) y se clono en la diana unica para Hind III del pDAB3289.
CO
CD
Tabla 14. Constructos binarios utilizados para la transformacion de diversas especies vegetales.
N° pDAB
N° pDA S Especies * transforma- das Gen de interes (GOI) Promo tor Caracte -ristica 1 Caracte -ristica 2 GOI 2 Promo tor Gen de seleccion bacteriano Gen de selec. bact. 2 Gen de selec. vegetal Promotor Metodo transforma cion
721
A, T, Ct, S, Ca AAD1v3 AtUbilO NtOsm “ Eritromicina " pat CsVMV Binario con Agro.
3230
A EPSPS AtUbilO NtOsm RB7 Mar v2 " " Espectinomi- cina AAD1 v3 CsVMV Binario con Agro.
3289
S AAD1v3 CsVMV NtOsm RB7 Mar v2 EPSP S AtUbilO Espectinomi- cina sacB Hptll AtUbi3 Binario con Agro.
3291
S AAD1v3 CsVMV NtOsm RB7 Mar v2 EPSP S AtUbilO Espectinomi- cina " Hptll AtUbi3 Binario con Agro.
3295
S AAD1v3 CsVMV NtOsm RB7 Mar v2 Espectinomi- cina " pat AtUbilO Chorro aerosol
3297
1270 A, T AAD1v3 CsVMV NtOsm RB7 Mar v2 " " Espectinomi- cina pat AtUbilO Binario con Agro.
3403
Cn, R AAD1v3 ZmUbil " RB7 Mar v2 " Ampicilina " Como GOI Traquitas/Pist ola
3404
Cn AAD1v3 ZmUbil RB7 Mar v2 " " Ampicilina " pat OsActl Traquitas
3415
1283 Cn AAD1v3 ZmUbil RB7 Mar v2 " Ampicilina " AHAS v3 OsActl Traquitas
3602
1421 Cn AAD1v3 ZmUbil " RB7 Mar v2 " Espectinomi- cina " AHAS v3 OsActl Superbinario con Agro
3757
Ca AAD1v3 CsVMV NtOsm RB7 Mar v2 EPSP S AtUbilO Espectinomi- cina " pat AtUbil 1 Binario con Agro.
3705
A AAD2v2 AtUbilO NtOsm RB7 Mar v2 " Eritromicina " pat CsVMV Binario con Agro.
*A = Arabidopsis CsVMV = promotor del virus del mosaico de las nervaduras de mandioca ZmUbil = promotor de la ubiquitina 1 de Zea mays
! T = Tabaco j AtUbilO = promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana
l S = Soja l RB7 Mar v2 = region asociada a matriz (MAR) de Nicotiana tabacum
Hptll = higromicina fosfotransferasa
l Ct = Algodon l NtOsm = region sin traducir 5' de la osmotina de Nicotiana tabacum y region sin traducir 3' de la osmotina de Nicotiana tabacum
| R = Arroz j
I Cn = Maiz | (721 y 793) Atu ORF1 3' UTR = region sin traducir 3' del marco de lectura abierto 1 de Agrobacterium tumefaciens
l Ca = Canola l (3295 y 3757) Atu ORF24 3' UTR = region sin traducir 3' del marco de lectura abierto 24 de Agrobacterium tumefaciens
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Ejemplo 6 - Transformacion en Arabidopsis y seleccion
6.1 - Condiciones de crecimiento de Arabidopsis thaliana.
Semillas de Arabidopsis silvestres se suspendieron en una solucion de agarosa al 0,1% (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, EE.UU.). Las semillas suspendidas se almacenaron a 4°C durante 2 dfas para cumplir los requerimientos de dormicion y asegurar la germinacion simultanea de las semillas (estratificacion).
Sustrato de semillero Sunshine LP5 Mix (Sun Gro Horticulture, Bellevue, Washington, EE.UU.) se cubrio con vermiculita fina y se rego con goteo subterraneo con solucion de Hoagland hasta dejarlo empapado. La mezcla de suelo se dejo drenar durante 24 horas. Las semillas estratificadas se sembraron en la vermiculita y se taparon con cubiertas para retener la humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) durante 7 dfas.
Las semillas germinaron y las plantas se cultivaron en una camara Conviron (modelos CMP4030 y CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) en condiciones de dfa largo (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) con una intensidad lummica de 120-150 pmol/m2s con temperatura (22°C) y humedad (40-50%) constantes. Las plantas se regaron inicialmente con solucion de Hoagland y despues con agua desionizada para mantener el suelo humedo pero no mojado.
6.2 - Transformacion de Agrobacterium
De una placa de LB + agar con eritromicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, EE.UU.) (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) que contema colonias DH5a sembradas en estna se escogio una colonia para inocular cultivos mini prep de 4 ml (LB lfquido + eritromicina). Los cultivos se incubaron hasta el dfa siguiente a 37°C en agitacion constante. Para purificar el ADN plasirndico se usaron Spin Mini Preps de Qiagen (Valencia, California, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se prepararon celulas electrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens (cepas Z707, EHA101 y LBA4404) con un protocolo de Weigel y Glazebrook (2002). Las celulas competentes de Agrobacterium se transformaron con un metodo de electroporacion adaptado de Weigel y Glazebrook (2002). 50 pl de celulas competentes de Agrobacterium se descongelaron en hielo y se les anadieron 10-25 ng del plasmido deseado. El ADN y la mezcla de celulas se vertieron en cubetas de electroporacion preenfriadas (2 mm). La transformacion se llevo a cabo con un Electroporator 2510 de Eppendorf con los siguientes ajustes: Voltaje: 2,4 kV, duracion del impulso: 5 ms.
Tras la electroporacion, se anadio 1 ml de caldo YEP (composicion por litro: 10 g de extracto de levadura, 10 g de Bacto-peptona, 5 g de NaCl) a la cubeta y la suspension de celulas-YEP se transfirio a un tubo de cultivo de 15 ml. Las celulas se incubaron a 28°C en un bano mana con agitacion constante durante 4 horas. Finalizada la incubacion, el cultivo se sembro en placas de YEP + agar con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., EE.UU.) (250 mg/l). Las placas se incubaron durante 2-4 dfas a 28°C.
Las colonias se seleccionaron y sembraron en estna en placas de YEP + agar fresco con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l) que se incubaron a 28°C durante 1-3 dfas. Las colonias se seleccionaron para el analisis PCR para verificar la presencia del gen insertado utilizando cebadores espedficos del vector. Con Spin Mini Preps de Qiagen, y siguiendo las instrucciones del fabricante, se purifico el ADN piasmidico de las colonias seleccionadas de Agrobacterium con la excepcion siguiente: para la purificacion del aDn se usaron alfcuotas de 4 ml de un cultivo mini prep de 15 ml cultivado de un dfa para otro (YEP lfquido + eritromicina (200 mg/l)
0 espectinomicina (100 mg/l)) y estreptomicina (250 mg/l)). Una alternativa al uso del Spin Mini Prep ADN consistio en lisar las celulas transformadas de Agrobacterium, suspendidas en 10 pl de agua, sometiendolas a 100°C durante 5 minutos. El ADN plasmfdico del vector binario utilizado para la transformacion de Agrobacterium se incluyo como control. La reaccion de PCR se completo con ADN-polimerasa Taq de Takara Minis Bio Inc. (Madison, Wisconsin, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante a concentraciones 0,5*. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con un termociclador MJ Research Peltier programado con los siguientes ajustes: 1) 94°C durante 3 minutos, 2) 94°C durante 45 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) 72°C durante 1 minuto, durante 29 ciclos y despues
1 ciclo de 72°C durante 10 minutos. La reaccion se mantuvo a 4°C despues de la ciclacion. La amplificacion se analizo con electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizo con tincion de bromuro de etidio. Se selecciono una colonia cuyo producto de PCR era identico al plasmido control.
6.3 - Transformacion de Arabidopsis.
Las plantas de Arabidopsis se transformaron utilizando el metodo de inmersion floral. La colonia seleccionada se inoculo en uno o varios precultivos de 15-30 ml de caldo YEP con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l). El o los cultivos se incubaron hasta el dfa siguiente a 28°C con agitacion constante a 220 rpm. Cada precultivo se uso para inocular dos cultivos de 500 ml de caldo YEP con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l) y los cultivos se incubaron hasta el dfa siguiente a 28°C con
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agitacion constante. Las celulas se precipitaron centrifugandolas a aprox. 8700*g durante 10 minutos a temperature ambiente, descartando el sobrenadante. El sedimento celular se resuspendio suavemente en 500 ml de medio de infiItracion que contenfa: 1^x de sales de Murashige y Skoog/vitaminas B5 de Gamborg, sacarosa 10% (p/v), bencilaminopurina 0,044 pM (10 pl/litro de solucion madre 1 mg/ml en DMSO) y Silwet L-77 300 pl/litro. Plantas de aproximadamente un mes de edad se sumergieron en el medio durante 15 segundos, asegurandose de que las inflorescencias mas recientes quedaran sumergidas. A continuacion las plantas se dejaron tumbadas y se cubrieron (con cubierta transparente u opaca) durante 24 horas, despues se lavaron con agua y se colocaron en pie. Las plantas se dejaron crecer a 22°C, con un fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Unas 4 semanas despues de la inmersion, se recogieron las semillas.
6.4 - Seleccion de las plantas transformadas.
Las semillas T1 recien recogidas (transformadas con el gen original [AAD-1 (v2)] o el gen optimizado para plantas [AAD-1 (v3)]) se dejaron secar durante 7 dfas a temperatura ambiente. Las semillas T1 se sembraron en bandejas de germinacion de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, Minn., EE.UU.), a razon de una alfcuota de 200 mg de semillas T1 estratificadas (~10.000 semillas) por bandeja. Las semillas habfan permanecido suspendidas en 40 ml de una solucion de agarosa al 0,1% y almacenadas a 4°C durante 2 dfas para cumplir los requisitos de dormicion y asegurar una germinacion simultanea.
Sustrato de semillero Sunshine LP5 Mix (Sun Gro Horticulture, Bellevue, Washington, EE.UU.) se cubrio con vermiculita fina y se rego con goteo subterraneo con solucion de Hoagland hasta dejarlo empapado, y despues se dejo drenar por gravedad. Cada alfcuota de 40 ml de semillas estratificadas se sembro uniformemente en la vermiculita con una pipeta y se tapo con cubiertas para retener la humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) durante 4-5 dfas. Las cubiertas se retiraron 1 dfa antes de la seleccion inicial de las transformantes por medio de la pulverizacion con glufosinato en postemergencia (seleccion para el gen PAT cotransformado).
Entre cinco y seis dfas despues de la siembra (DAP) y de nuevo 10 DAP, las plantas T1 (cotiledon y estadio de 2-4 hojas, respectivamente) se pulverizaron con una solucion al 0,2% de herbicida Liberty (200 g m.a./l de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, Mo., EE.UU.) con un volumen de pulverizacion de 10 ml/bandeja (703 l/ha) con una boquilla de aire comprimido DeVilbiss ajustada para suministrar una dosis efectiva de 280 g m.a./ha de glufosinato por aplicacion. Las supervivientes (plantas con crecimiento activo) se identificaron 5-7 dfas despues de la ultima pulverizacion y se trasplantaron individualmente a macetas de 3 pulgadas rellenas de medio para macetas (Metro Mix 360). Las plantas trasplantadas se taparon con cubiertas para retener la humedad durante 3-4 dfas y se depositaron en una camara de crecimiento a 22°C como se ha indicado antes. Las cubiertas se retiraron y las plantas se trasladaron al invernadero (22 ± 5°C, 50 ± 30% HR, 14 h de luz:10 h de oscuridad, mfnimo 500 pE/mV de luz natural + suplementaria) al menos 1 dfa antes del analisis para valorar la capacidad del AAD-1 (v3) (gen optimizado para vegetales) o del AAD-1 (v2) (gen microbiano natural) para conferir resistencia frente a herbicidas auxfnicos fenoxi.
En las plantas T1 seleccionadas al azar para determinar la resistencia al glufosinato indicadas arriba se confirmo la expresion de la protefna PAT con un kit ELISA para PAT (N.° artfculo 7000045, Strategic Diagnostics, Inc., Newark, Del., EE.UU.) con el fin de confirmar la fidelidad del proceso de seleccion sin destruir las plantas (protocolo del fabricante). A continuacion, las plantas se separaron en grupos al azar para recibir varias dosis de herbicidas fenoxi (diclorprop o 2,4-D). Las dosis de fenoxi aplicadas inicialmente fueron de 12,5 g e.a./ha de 2,4-D y 50 o 200 g e.a./ha de diclorprop. El GR99 de Arabidopsis ronda aproximadamente los 50 g e.a./ha con 2,4-D y los 200 g e.a./ha con diclorprop. En los ensayos posteriores se aplicaron dosis elevadas (50, 200, 800 o 3200 g e.a./ha).
Todas las aplicaciones de herbicidas auxfnicos se realizaron con un pulverizador DeVilbiss del modo descrito para aplicar un volumen de 703 l/ha (0,4 ml de solucion/maceta de 3 pulgadas) o fueron aplicadas con un pulverizador de carril con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. El 2,4-D utilizado era de calidad tecnica (Sigma, St. Louis, Mo., EE.UU.) disuelto en DMSO y diluido en agua (concentracion final de DMSO <1%) o bien la formulacion comercial de sal dimetilamina (456 g e.a./l, NuFarm, St Joseph, Mo., EE.UU.). El diclorprop utilizado era de calidad tecnica (Sigma, St. Louis, Mo., EE.UU.) disuelto en DMSO y diluido en agua (concentracion final de DMSO <1%). Como las dosis de herbicida sobrepasaron los 800 g e.a./ha, el pH de la solucion pulverizada resulto demasiado acido y quemo las hojas de las plantas jovenes y tiernas de Arabidopsis, complicando la evaluacion de los efectos primarios de los herbicidas. En lo sucesivo se decidio aplicar siempre estas dosis elevadas de herbicidas fenoxi diluyendolas en tampon Tris 200 mM (pH 9,0) hasta conseguir un pH final de ~7-8.
Algunos individuos T1 fueron expuestos a otros herbicidas comerciales en lugar de a herbicidas auxfnicos fenoxi. Una cuestion de interes consistio en determinar si el haloxifop podia ser degradado efectivamente en la planta.
Aunque Arabidopsis, por ser una dicotiledonea, no es un sistema optimo para analizar los graminicidas AOPP que inhiben la ACCasa, plantas T1 transformadas con AAD-1 (v3) fueron sometidas a dosis elevadas (400-1600 g e.a./ha) de acido RS-haloxifop (sintetizado internamente) con el pulverizador DeVilbiss utilizado del modo descrito arriba; tales dosis provocaron anomalfas en el crecimiento y muerte de plantas Arabidopsis naturales. Los danos se
evaluaron 7 y 14 dfas despues del tratamiento. Asimismo, otros individuos T1 fueron tratados con fluoroxipir, un herbicida auxfnico piridiloxiacetato.
6.5 - Resultados de la seleccion de las plantas transformadas.
5
Las primeras transformaciones de Arabidopsis se efectuaron con el AAD-1 (v3) (gen optimizado para vegetales). Las transformantes Ti se seleccionaron primero entre la fraccion mayoritaria de semillas no transformadas por medio de un esquema de seleccion con glufosinato. Entre las aproximadamente 400.000 semillas Ti cribadas se hallaron 493 plantas resistentes al glufosinato (gen PAT), lo que equivale a una frecuencia de transformacion/seleccion del 10 0,12%. Dependiendo del lote de semillas analizadas, esta oscilo entre 0,05-0,23% (vease la Tabla 15). Un lote
pequeno de semillas transformadas con el AAD-1 (v2) (natural) tambien se seleccionaron utilizando el glufosinato como agente de seleccion. Se identificaron 278 individuos T1 resistentes al glufosinato entre 84.000 semillas cribadas (frecuencia de transformacion/seleccion del 0,33%).
Tabla 15: Seleccion de plantas Ti transformadas con AAD-1 (v3) (optimizado para vegetales), o AAD-1 (v2) (natural), AAD-2 (v1) (natural), o AAD-2 (v2) por medio de glufosinato y 2,4-D._________________________________________________________________________
Agente de seleccion
Gen Preferen- cia codonica Semillas totales sembradas y cribadas Numero de Ti resistentes Tasa de seleccion Rango de la tasa de seleccion % de plantas seleccionadas que expresaban PAT3
Glufosinate'
AAD-1 (v2) n 84.000 278 0,33% 0,33% nd4
Glufosinate1
AAD-1 (v3) p 400.500 v 493 0,12% 0,05 - 0,23% 97%
2,4-D2
AAD-1 ( v3) p 70.000 53 0,08% 0,07 -0,08% 96%
Glufosinate1
AAD-2 (vl) n 1.301.500 228 0,018% 0,007 -0,021% 100%
Glufosinate1
AAD-2(v2) _e_____ 200.000 224 0,11% 0,11% nd4
' Esquema de seleccion con glufosinato: 280 g m.a./ha de glufosinato aplicados a los 5-6 + 10 DAP
2 Esquema de seleccion con 2,4-D: 50 g m.a./ha de 2,4-D aplicados a los 5-7 + 10-14 DAP
3 Expresion de la proteina PAT determinada con tiras de ELISA PAT
4 nd, no determinado
5Preferencia codonica, n = gen microbiano natural, p = optimizado para vegetales
5
10
15
20
25
30
Las plantas Ti seleccionadas arriba se trasplantaron despues a macetas individuales y fueron pulverizadas con diversas dosis de herbicidas ariloxialcanoato comerciales. La Tabla 16 compara la respuesta del gen AAD-1 (v2) natural y del gen AAD-1 (v3) optimizado para vegetales a la hora de conferir resistencia contra el 2,4-D a las transformantes T1 de Arabidopsis. Ambos genes confirieron resistencia a plantas T1 de Arabidopsis individuales. Los niveles de respuesta de las plantas sometidas a un mismo tratamiento manifestaron una gran variabilidad, lo que puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformacion distinto. Cabe subrayar que a cualquiera de las dosis de 2,4-D probadas, hubo individuos que no se vieron afectados en absoluto, mientras que otros lo fueron gravemente. En la Tabla 16 se presenta el promedio de danos en la poblacion total por cada dosis a fin de demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con AAD-1 (v2) o con AAD-1 (v3) respecto a los controles naturales o transformados con PAT/Cry1F. Asimismo, resulta evidente que la tolerancia parece ser significativamente mayor (frecuencia y nivel total de la respuesta individual) con la secuencia de AAD-1 (v3) optimizada para vegetales frente a la secuencia natural del AAD-1 (v2) (vease la Tabla 16). Se han aplicado dosis mas altas de 2,4-D (hasta 3.200 g e.a./ha) a otros individuos T1 que expresaban el AAD-1 (v3). Con tales dosis (6* la dosis de campo), el nivel de dano tiende a ser mayor y la frecuencia de plantas muy resistentes menor. Tambien a estas elevadas dosis, la solucion pulverizada resulta demasiado acida si no se amortigua. Las plantas de Arabidopsis que crecen sobre todo en la camara de crecimiento presentan una cutfcula muy fina y las graves quemaduras pueden complicar las pruebas con estas dosis elevadas. A pesar de ello, algunos individuos soportaron 3200 g e.a./ha de 2,4-D sufriendo pocos o ningun dano.
Tabla 16. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 transformadas con AAD-1 v3 (optimizado para vegetales), o AAD- 1 v2 (natural), o AAD-2 (natural) a un rango de dosis de 2,4-D aplicadas en postemergencia. La respuesta se presenta en terminos de % de dano visual a las 2 semanas del tratamiento. Los datos se presentan en forma de histograma de los individuos que manifestaron dano limitado o nulo (<20%), dano moderado (20-40%) o dano grave (>40%). Dado que cada T1 es un evento de transformacion independiente, cabe esperar una variacion significativa de las respuestas T1 individuales dentro de una dosis dada. Se muestra la media aritmetica y la desviacion estandar de cada tratamiento. El rango de la respuesta individual tambien aparece indicado en la ultima columna para cada dosis y transformacion. Las plantas de Arabidopsis transformadas con PAT/Cry1F sirvieron como control transformado sensible a los herbicidas auxfnicos. La Arabidopsis natural no esta transformada.
Tabla 16. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 transformadas con AAD-1 v3 (utilizada para vegetales), o AAD-1 v2 (natural), o AAD-2 (natural) a un rango de dosis de 2,4-D aplicadas en postemergencia.
Gen AAD-1 (v2) natural Promedios
<20% % Dano 20-40% >40% % Dano Med Std Dev
Tampon control no tratado
20 6 7 25,3 34,7
50 g e.a./ha 2,4-D
55 16 9 14,8 22,7
200 g e.a./ha 2,4-D
45 11 24 34,1 39,3
800 g e.a./ha 2,4-D
11 32 37 52,5 34,2
Gen AAD-2 natural
% Dano % Dano Std
Promedios
<20% 20-40% >40% Med Dev
Tampon control no tratado
4 1 1 25,0 21,7
50 g e.a./ha 2,4-D
1 2 11 68,2 30,2
200 g e.a./ha 2,4-D
0 3 11 82,7 28,8
800 g e.a./ha 2,4-D
0 0 14 99,8 0,8
Gen AAD-1 (v3) reconstruido
% Dano % Dano Std
Promedios
<20% 20-40% >40% Med Dev
Tampon control no tratado
9 0 0 0,0 0,0
50 g e.a./ha 2,4-D
10 1 5 24,3 35,9
200 g e.a./ha 2,4-D
11 4 1 14,0 25,9
800 g e.a./ha 2,4-D
11 4 1 14,7 26,1
Natural
% Dano % Dano Std
Promedios
<20% 20-40% >40% Med Dev
Tampon control no tratado
11 0 0 0,0 0,0
50 g e.a./ha 2,4-D
0 0 15 90,0 0,0
200 g e.a./ha 2,4-D
0 0 15 95,1 0,5
800 g e.a./ha 2,4-D
0 0 15 100,0 0,0
PAT/CrylF (control transformado)
% Dano % Dano Std
Promedios
<20% 20-40% >40% Med Dev
Tampon control no tratado
11 0 0 0,0 0,0
50 g e.a./ha 2,4-D
0 0 15 90,7 4,2
5
10
15
20
25
30
35
200 g e.a./ha 2,4-D 800 g e.a./ha 2,4-D
0 0 15
0 0 15
97,2 1,7
100,0 0,0
La Tabla 17 muestra una respuesta a la dosis similar de plantas de Arabidopsis T1 al acido fenoxipropionico, diclorprop. Tambien se observaron tendencias similares con el 2,4-D, lo cual indica que la cadena lateral quiral de acido propionico sirve como un sustrato aceptable. A continuacion, se determino que era posible conferir cierto grado de tolerancia al haloxifop a plantas de Arabidopsis transformadas expuestas a dosis elevadas de 400-1.600 g e.a./ha (Tabla 18). La dosis de haloxifop (graminicida) utilizada normalmente en el campo es de unos 50-70 g e.a./ha. Las dicotiledoneas se consideran por lo general tolerantes naturales a los herbicidas AOPP, pero en cambio, con tales dosis elevadas se produjeron efectos fisiologicos en Arabidopsis. Algunos individuos transformados con AAD-1 (v3) manifestaron una mayor tolerancia al haloxifop. Esto proporciona los primeros datos en plantas de que el AAD-1 (v3) proporciona resistencia frente a AOPP. No se observo resistencia alguna a fluoroxipir (un herbicida auxfnico piridiloxiacetato) en las Arabidopsis transformadas, dato que concuerda con los estudios in vitro en los que se utilizaron una enzima expresada heterologamente.
Tabla 17. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 a un rango de dosis de diclorprop aplicadas en postemergencia. La respuesta se presenta en terminos de % de dano visual a las 2 semanas del tratamiento. Los datos se presentan en forma de histograma de los individuos que manifestaron poco o ningun dano (<20%), dano moderado (20-40%) o dano grave (>40%). Dado que cada T1 es un evento de transformacion independiente, cabe esperar una variacion significativa de las respuestas T1 individuales dentro de una dosis dada. Se muestra la media aritmetica y la desviacion estandar de cada tratamiento. El rango de la respuesta individual tambien aparece indicado en la ultima columna para cada dosis y transformacion. Las plantas de Arabidopsis transformadas con PAT/Cry1F sirvieron como control transformado sensible a los herbicidas auxfnicos. La Arabidopsis natural no esta transformada.
Tabla 17. Respuesta de Arabidopsis T1 a un rango de dosis de diclorprop aplicadas en postemergencia.
AAD-1 v3 Promedios
<20% % Dano 20-40% >40% % Dano Med Std Dev Rango
Control no tratado
3 0 0 0,0 0,0 0
12,5 g e.a./ha RS-diclorprop
7 1 0 5,0 7,6 0-20
50 g e.a./ha RS-diclorprop
7 1 0 3,1 8,8 0-25
200 g e.a./ha RS-diclorprop
4 1 3 40,0 50,1 0-100
800 g e.a./ha RS-diclorprop
0 5 3 51,9 40,0 20-100
PAT/Cry1F Promedios
<20% % Dano 20-40% >40% % Dano Med Std Dev Rango
Control no tratado
3 0 0 0,0 0,0 0
12,5 g e.a./ha RS-diclorprop
0 6 2 38,1 25,3 20-95
50 g e.a./ha RS-diclorprop
0 0 8 80,0 25,3 50-100
200 g e.a./ha RS-diclorprop
0 0 8 98,3 2,2 95-100
800 g e.a./ha RS-diclorprop
0 0 8 100,0 0,0 100
Natural Promedios
<20% % Dano 20-40% >40% % Dano Med Std Dev Rango
Control no tratado
3 0 0 0,0 0,0 0
12,5 g e.a./ha RS-diclorprop
3 0 0 13,3 2,9 10-15
50 g e.a./ha RS-diclorprop
0 0 3 53,3 5,8 50-60
200 g e.a./ha RS-diclorprop
0 0 3 95,0 5,0 90-100
800 g e.a./ha RS-diclorprop
0 0 3 100,0 0,6 100
Tabla 18. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 a un rango de dosis de haloxifop aplicadas en postemergencia y artificialmente altas para demostrar la tolerancia de esta dicotiledonea al graminicida. La respuesta se presenta en terminos de % dano visual a las 2 semanas del tratamiento. Los datos presentados en forma de histograma corresponden a los individuos que sufrieron un dano escaso o nulo (<20%), dano moderado (20-40%), o dano grave (>40%). Dado que cada T1 es un evento de transformacion independiente, cabe esperar una variacion significativa de las respuestas T1 individuales dentro de una dosis dada. Se muestra la media aritmetica y la desviacion estandar de cada tratamiento. El rango de la respuesta individual tambien aparece indicado en la ultima columna para cada dosis y transformacion. Las plantas de Arabidopsis transformadas con PAT/Cry1F sirvieron como control transformado sensible a los herbicidas auxfnicos. La Arabidopsis natural no esta transformada.
Tabla 18. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 a un rango de dosis de haloxifop aplicadas en postemergencia y artificialmente altas con objeto de demostrar la tolerancia de esta dicotiledonea al graminicida.
AAD-1 v3
% Dano % Dano
Promedios
<20% 20-40% >40% Med Std Dev Rango
5
10
15
20
25
30
35
Control no tratado
3 0 0 0,0 0.0 0
100 g e.a./ha haloxifop
4 0 0 0,0 0,0 0
200 g e.a./ha haloxifop
4 0 0 0,0 0,0 0
400 g e.a./ha haloxifop
3 1 0 6,3 9,5 0-20
800 g e.a./ha haloxifop
1 1 2 46,3 42,7 0-85
1600 g e.a./ha haloxifop
1 0 3 65,0 47,3 0-100
PAT/CrylF
% Dano % Dano
Promedios
<20% 20-40% >40% Med Std Dev Rango
Control no tratado
3 0 0 0,0 0,0 0
100 g e.a./ha haloxifop
4 0 0 0,0 0,0 0
200 g e.a./ha haloxifop
4 0 0 10,0 0,0 10
400 g e.a./ha haloxifop
0 4 0 27,5 5,0 20-30
800 g e.a./ha haloxifop
0 0 4 78,8 6,3 70-85
1600 g e.a./ha haloxifop
0 0 4 47,5 43,5 80-100
Natural
% Dano % Dano
Promedios
<20% 20-40%> >40% Med Std Dev Rango
Untreated control
3 0 0 0,0 0,0 0
100 g e.a./ha haloxifop
3 0 0 0,0 0,0 0
200 g e.a./ha haloxifop
3 0 0 0,0 0,0 0
400 g e.a./ha haloxifop
0 3 0 20,0 0,0 20
800 g e.a./ha haloxifop
0 0 3 73,3 10,4 70-85
1600 g e.a./ha haloxifop
0 0 3 93,3 11,5 80-100
6.6 - AAD-1 (v3) como un marcador seleccionable
La capacidad para usar el AAD-1 (v3) como un marcador seleccionable utilizando el 2,4-D como agente de seleccion se analizo inicialmente con Arabidopsis transformadas del modo descrito anteriormente. Semillas Ti transformadas con PAT y AAD-1 (v3) (pDAB 721) se sembraron en bandejas, germinaron como se ha descrito antes y fueron comparadas con semillas similares tratadas con el esquema de seleccion normal con glufosinato (5 y 10 DAP). El 2,4-D (50 g e.a./ha) se aplico a las plantulas de Arabidopsis del mismo modo que el glufosinato. Se estudiaron variaciones en el numero y en el calendario de aplicaciones. Cada bandeja de plantas recibio una o dos aplicaciones de 2,4-D de acuerdo con uno de los siguientes esquemas de tratamiento: 5+10 DAP, 5+14 DAP, 10 DAP, 10+14 DAP, 14 DAP. Las plantas se calificaron como resistentes o sensibles a los 19 DAP y se llevo a cabo una prueba con tiras ELISA para determinar la frecuencia de contransformacion efectiva de un gen PAT activo.
Cincuenta y tres de las 70.000 semillas plantadas fueron identificadas como resistentes al 2,4-D. Con el ELISA se analizo un subgrupo de 44 individuos de esta poblacion para detectar la expresion de la protefna PAT. El 96% de los individuos resultaron positivos, lo que indica la presencia del gen cotransformado, PAT. El escaso numero de resultados negativos hallados en el ELISA (4%) concuerda con la tasa de error del 3% hallada en poblaciones de plantas resistentes al glufosinato (Tabla 15). La eficiencia de la seleccion con 2,4-D (0,08%) aparenta ser algo menor que la del glufosinato (0,12%), pero el rango de las tasas de seleccion en todos los experimentos parece indicar que ambos agentes de seleccion son igualmente buenos para la seleccion de las plantas de Arabidopsis transformadas con los genes AAD-1 (v3) o PAT, respectivamente. Dos aplicaciones sucesivas permiten identificar con mas precision a los individuos resistentes con los dos herbicidas analizados.
6.7 - Heredabilidad
Diversos eventos T1 se autopolinizaron para producir las semillas T2. Estas semillas constituyeron la progenie analizada mediante la aplicacion de 2,4-D (200 g e.a./ha) a 100 hermanas T2 escogidas al azar. Cada planta T2 se trasplanto a macetas cuadradas de 7,5 cm antes de recibir la pulverizacion (pulverizador de carril a una dosis de aplicacion de 187 l/ha). Mas del 60% de las familias T1 (plantas T2) segregaron en la proporcion prevista de 3 resistentes:1 sensible correspondiente a un solo locus heredado de forma dominante siguiendo un patron mendeliano, segun determino el analisis de la ji al cuadrado (P>0,05).
Se recogieron semillas de entre 12 y 20 individuos T2 (semillas T3). Veinticinco hermanas T3 de cada una de las ocho familias T2 escogidas al azar constituyeron la progenie analizada del modo antes descrito. En todas las lfneas analizadas se identificaron aproximadamente el tercio de las familias T2 que debfan ser homocigotas (poblaciones no segregantes): la frecuencia oscilo entre una y cuatro de las ocho familias estudiadas. Estos datos demuestran que el AAD1 (v3) permanece integrado de forma estable y que se hereda siguiendo un patron mendeliano durante al menos tres generaciones.
5
10
15
20
25
30
35
40
6.8 - Resistencia contra otros herbicidas atribuible a la AAD-1 en Arabidopsis
La capacidad del gen AAD-1 (v3) para proporcionar resistencia frente a otros herbicidas ariloxifenoxialcanoato en plantas de Arabidopsis transgenicas se determino utilizando un ensayo en placa in vitro modificado. Semillas de Arabidopsis thaliana naturales y portadoras del gen optimizado para vegetales AAD-1 (v3) (plantas homocigotas T4 id=PAAD1.315.064) fueron esterilizadas por agitacion durante 10 min en una solucion de lejfa al 50%. Despues se lavaron cuatro veces con agua esteril para eliminar la lejfa.
Los analisis de dosis-respuesta se efectuaron con un medio nutritivo (vease mas adelante) al que se le anadieron diversas dosis de compuestos problema. Dichos compuestos se anadieron al medio calentado (55°C) en forma de soluciones concentradas en DMSO. Los pocillos de control contenfan la cantidad apropiada de DMSO sin ningun compuesto adicional. La concentracion final de DMSO nunca supero el 1% (v/v). Una vez mezclada cuidadosamente, se anadio una alfcuota de 6 ml del medio calentado con la concentracion adecuada del compuesto a pocillos de una bandeja para cultivo de tejidos de poliestireno de 6 pocillos y fondo plano (Falcon 353046, Becton Dickson and Company, Franklin Lakes, N.J., EE.UU.). Una vez solidificado el medio, se depositaron encima aproximadamente entre 20 y 30 semillas de Arabidopsis, vertiendo los restantes 2 ml sobre las semillas. Las placas se agitaron suavemente para esparcir las semillas, se cubrieron y se dejaron enfriar hasta que el medio se solidifico completamente. A continuacion, las placas se incubaron durante 7 dfas a 25°C bajo iluminacion fluorescente continua (75 pE m-2 s-1). La composicion del medio nutritivo es la descrita en el Ejemplo 2.2 y en Somerville y Orgen (1982).
Evaluacion de la reduccion del crecimiento.
La porcion apical de las plantas de Arabidopsis cultivadas en los medios tratados se evaluo visualmente comparandola con la porcion apical de las plantas que crecfan en los medios que solo contenfan DMSO. Los valores se registraron como % de reduccion del crecimiento. Las evaluaciones de la inhibicion del crecimiento radicular en las plantas de Arabidopsis que crecfan en los medios tratados se llevaron a cabo extrayendo con cuidado las plantas del medio y midiendo la longitud de la rafz. La longitud radicular se comparo entonces con la de las plantas control para calcular el porcentaje de reduccion del crecimiento. Se evaluaron como mfnimo cinco plantas de cada tratamiento. Los valores registrados corresponden a la media de todas las plantas evaluadas. Se calculo la concentracion necesaria para lograr un efecto inhibitorio del 50% (I50) en las rafces y en los brotes de las plantas de Arabidopsis naturales y transformadas con AAD-1. En la Tabla 19 se muestran los cocientes de los biotipos resistentes respecto a los sensibles aparecen. Un cociente >2 tanto en las mediciones de las rafces como de los brotes implica una resistencia significativa. Y a mayor cociente, mayor nivel de resistencia. Se observaron niveles significativos de resistencia frente a todos los herbicidas fenoxi comerciales, incluidos los acidos oxiaceticos (2,4-D y MCPA) y los acidos oxipropionicos (diclorprop y mecoprop). De hecho, la evaluacion a largo plazo de las rafces demuestra que la resistencia propiciada por el AAD-1 (v3) contra el acido oxipropionico es superior a la evidenciada frente a los acidos oxiaceticos, hecho que concuerda con las caracterfsticas enzimaticas de la AAD-1 (v1). La evaluacion de otros herbicidas auxfnicos dotados de anillos piridfnicos demostro que el AAD-1 (v3) no protege de forma efectiva a Arabidopsis contra triclopir y fluoroxipir, ambos herbicidas piridiloxiacetato, ni contra el herbicida de acido picolfnico picloram. La amplia resistencia contra herbicidas auxfnicos fenoxi es la primera descrita en plantas in vivo. Los herbicidas auxfnicos frente a los cuales la AAD-1 resulta ineficaz podrfan ser herramientas viables de control y contencion de los cultivos comerciales o las especies vegetales experimentales transformadas con AAD-1.
Tabla 19. Evaluacion con el ensayo en placa in vitro de la resistencia cruzada frente a sustratos herbicidas proporcionada por el AAD-1 (v3) en Arabidopsis T4 homocigotas (ARBTH).
Compuesto
Estructura wt ARBTH shoot 150 PAAD1.31 5.064 T3 ARBTH shoot I50 wt ARBTH root I50 PAAD 1.315.064 ARBTH root I50 Cociente brotes Cociente rafces
____________________ppm__________________
Auxinas fenoxi
2,4-D
0,2 10 <0,01 0,04 50 >4
diclorprop
•'CCri. 2 5 0,01 1,5 2,5 150
Tabla 19. Evaluacion con el ensayo en placa in vitro de la resistencia cruzada frente a sustratos herbicidas proporcionada por el AAD-1 (v3) en Arabidopsis T4 homocigotas (ARBTH).
Compuesto
Estructura wt ARBTH shoot 150 PAAD1.31 5.064 T3 ARBTH shoot I50 wt ARBTH root I50 PAAD 1.315.064 ARBTH root I50 Cociente brotes Cociente raices
ppm
Mecoprop
2 25 0,01 1,5 12,5 150
MCPA
"'QCa. 0,2 1 0,01 0,03 5 3
2,4,5-T
Yf . JL, 1,5 10 <0,01 <0,01 6,67 NA
Auxinas piridfnicas
Fluroxipir
2 1 0,2 0,2 0,5 1
Triclopir
YY p 0,2 0,04 0,02 0,02 0,2 1
Picloram
N O 1 0,5 0,3 0,15 0,5 0,5
6.9 - Resistencia a herbicidas aplicados por via foliar en Arabidopsis portadora del AAD-1
La capacidad del AAD-1 (v3) para conferir resistencia frente a otros herbicidas auxfnicos ariloxifenoxialcanoato en 5 Arabidopsis transgenicas se determino mediante la aplicacion foliar de diversos sustratos descritos en el Ejemplo 6.8. La generacion de semillas T4 de Arabidopsis, que eran homocigotas para el AAD-1 (v3) (lfnea AAD1.01.315.076) se estratifico y se sembro en bandejas de seleccion de forma muy similar a las plantas Arabidopsis del Ejemplo 6.4. Una lfnea de control transformada portadora del gen PAT y del gen de resistencia a insectos CrylF se planto de manera similar. Las plantulas se trasplantaron a macetas individuales de 3 pulgadas en el invernadero. Todas las 10 plantas se pulverizaron con un pulverizador de carril a 187 l/ha. Fueron expuestas a una gama de herbicidas auxfnicos fenoxi: 12,5-1600 g e.a./ha de la sal dimetilamina del 2,4-D (DMA) (Riverside Chemicals), 12,5-1600 g e.a./ha de mecoprop (AH Marks), 50-3200 g e.a./ha de R-diclorprop (AH Marks), 8,75-1120 g e.a./ha de 2,4,5-T (calidad tecnica); herbicidas piridiloxiacetatos 50-3200 g e.a./ha de triclopir (Dow AgroSciences) y 50-3200 g e.a./ha de fluoroxipir (Dow AgroSciences); y, por ultimo, el metabolito del 2,4-D resultado de la actividad de AAD-1, el 2,415 diclorofenol (DCP, Sigma) (a 50-3200 g e.a./ha, calidad tecnica). Todas las aplicaciones se formularon en tampon Hepes 200 mM (pH 7,5). Cada tratamiento se repitio 3-4 veces. Las plantas se evaluaron a los 3 y 14 dfas despues del tratamiento y se promediaron dos experimentos.
Estos resultados (vease la Tabla 20) confirman que el AAD-1 (v3) en Arabidopsis proporciona una fuerte resistencia 20 contra los herbicidas auxfnicos fenoxiaceticos, auxfnicos fenoxipropionicos, pero no confiere una resistencia cruzada significativa contra los auxfnicos piridiloxiaceticos analizados, resultado que corrobora los datos de los ensayos enzimaticos in vitro y de la especificidad de sustrato en placa entera. Ademas, en las plantas de Arabidopsis naturales y transgenicas no se aprecia efecto alguno del metabolito, el 2,4-diclorofenol (DCP).
Tabla 20. Comparacion de las respuestas de plantas Arabidopsis T4 naturales y homocigotas para AAD-1 (v3) frente a varios herbicidas auxfnicos aplicados por via foliar.
Auxfnicos fenoxipropionicos
Media % de dano en la 14DAT
AAD1.01.315.076.T4
Tratamiento herbicida
Plantas homocigotas AAD1 PatCrylf-Control
50 g e.a./ha R-diclorprop
3 31
200 g e.a./ha R-diclorprop
3 73
800 g e.a./ha R-diclorprop
3 89
3200 g e.a./ha R-diclorprop
3 95
12.5 g e.a./ha Mecoprop
3 0
25 g e.a./ha Mecoprop
0 2
50 g e.a./ha Mecoprop
0 17
100 g e.a./ha Mecoprop
0 33
200 g e.a./ha Mecoprop
3 62
400 g e.a./ha Mecoprop
0 78
800 g e.a./ha Mecoprop
0 93
1600 g e.a./ha Mecoprop
0 100
Phenoxyacetic auxins
Media % de dano a 14DAT
AAD1.01.315.076.T4
Tratamiento herbicida
Plantas homocigotas AAD1 Pat/Crylf-Control
12.5 g e.a./ha 2,4-D DMA
0 67
25 g e.a./ha 2,4-D DMA
0 78
50 g e.a./ha 2,4-D DMA
0 93
100 g e.a./ha 2,4-D DMA
0 100
200 g e.a./ha 2,4-D DMA
0 100
400 g e.a./ha 2,4-D DMA
0 100
800 g e.a./ha 2,4-D DMA
0 100
1600 g e.a./ha 2,4-D DMA
0 100
8.75 g e.a./ha 2,4,5-T
0 0
17.5 g e.a./ha 2,4,5-T
3 20
35 g e.a./ha 2,4,5-T
0 43
70 g ae/ha 2,4,5-T
3 85
140 g e.a./ha 2,4,5-T
0 95
280 g e.a./ha 2,4,5-T
0 98
560 g e.a./ha 2,4,5-T
17 100
1120 g e.a./ha 2,4,5-T
3 100
Auxfnicos piridiloxiaceticos
Media % de dano a 14DAT
AAD1.01.315.076.T4
Tratamiento herbicida
Plantas homocigotas AAD1 Pat/Cry If-Control
50 g e.a./ha Triclopyr
31 36
200 g e.a./ha Triclopyr
58 65
800 g e.a./ha Triclopyr
74 84
3200 g e.a./ha Triclopyr
97 95
50 g e.a./ha Fluroxypyr
48 76
200 g e.a./ha Fluroxypyr
75 85
800 g e.a./ha Fluroxypyr
88 85
3200 g e.a./ha Fluroxypyr
95 95
Metabolito DCP inactivo
50 g e.a./ha 2,4-DCP
0 0
200 g e.a./ha 2,4-DCP
0 0
800 g e.a./ha 2,4-DCP
0 0
3200 g e.a./ha 2,4-DCP
0 0
6.10 - Relacion del crecimiento de la planta con la expresion de la AAD-1 (v3) en Arabidopsis
Se diseno un experimento para examinar si el nivel de expresion de la AAD-1 (v3) en Arabidopsis varfa dependiendo 5 de la etapa de crecimiento. Con tal fin, se cultivo en invernadero una lfnea T4 homocigota para AAD-1 (v3) y de alta tolerancia (id=PAAD1.01.345.163). La mitad de las plantas fue tratada con 800 g e.a./ha de 2,4-D (del modo antes descrito) y la otra mitad no recibio tratamiento alguno. Dos hojas, la tercera desde el extremo superior y la quinta desde el extremo inferior, se arrancaron de 5 plantas, tanto tratadas como sin tratar, y se analizaron con ELISA y transferencia Western (del modo descrito en el Ejemplo 11) a los 4, 10, 14, 20 y 25 DAT. Las Figuras 8A y 8B 10 demuestran que no hubo una diferencia estadfsticamente significativa en la expresion de la AAD-1 (v3) en las hojas
5
10
15
20
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30
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40
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60
65
jovenes y viejas. Asimismo, el herbicida 2,4-D tuvo escaso impacto en el nivel de expresion de la protefna AAD-1 (v3). La protefna se habfa acumulado mas en las plantas mas viejas y se observo cierta degradacion sustancial de la misma en los intervalos de tiempo mas largos.
En otro experimento distinto, cuatro lfneas T4 homocigotas distintas de Arabidopsis que presentaban diferentes niveles de tolerancia al herbicida 2,4-D fueron pulverizadas con diversas dosis (0, 200, 800 y 3200 g/ha) de 2,4-D tras lo cual se examinaron los danos causados por el herbicida y la expresion de AAD-1 (v3). Cuatro dfas despues del tratamiento herbicida, apenas se observaron danos en tres de las cuatro lfneas, incluso con la dosis mas elevada (Figura 9A). Dichas plantas tambien expresaron niveles elevados de AAD-1 (v3), de entre el 0,1% y el 0,25% (Figura 9B). En cambio, la lfnea con escasa tolerancia expreso menos del 0,1% de AAD-1 (v3) en la TSP y sufrio danos apreciables. Pero lo que resulta mas destacable es que estas plantas se habfan recuperado de los danos a los 14 DAT (Figura 9A), lo que indica que un bajo nivel de expresion de la AAD-1 (v3) consiguio protegerlas de los danos graves causados por el herbicida. Todas las plantas control sufrieron danos graves y habfan muerto a los 14 DAT tras recibir dosis de al menos 800 g e.a./ha de 2,4-D y mayores.
6.11 - Analisis molecular de las Arabidopsis portadoras del AAD-1 (v3)
Con objeto de determinar la integracion estable de la unidad de transformacion vegetal compuesta por los genes PATy AAD-1 (v3) a varias lfneas homocigotas de AAD-1 (v3) se les practico un ensayo Invader (metodos de Third Wave Agbio Kit Procedures) para determinar el numero de copias del gen PAT y/o una transferencia Southern con el ADN total obtenido con el kit DNeasy de Qiagen. El analisis supuso que existfa un ligamiento ffsico directo entre ambos genes, ya que estaban contenidos en el mismo plasmido.
Para el analisis Southern, se sometio un total de 1 pg de ADN a una digestion hasta el dfa siguiente con Nsi I del pDAB721 a fin de obtener los datos de integracion. Las muestras se procesaron en un gel grande de agarosa al 0,85% hasta el dfa siguiente a 40 voltios. A continuacion, el gen se desnaturalizo con NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos y despues se neutralizo con Tris HCl 0,5 M, NaCl 1,5 M y pH de 7,5 durante 30 minutos. Seguidamente se preparo un aparato de gel con SSC 20x para transferir por gravedad el gel a una membrana de nilon (Millipore INYC00010), dejandolo hasta el dfa siguiente. Acabada la transferencia, la membrana se expuso a luz UV en presencia de un entrelazador (stratagene UV stratalinker 1800) a 1200*100 microjulios. Despues la membrana se lavo con SDS 0,1%, SSC 0,1 durante 45 minutos. Finalizado el lavado de 45 minutos, la membrana fue horneada durante 3 horas a 80°C y se conservo a 4°C hasta la hibridacion. El molde de hibridacion consistio en los cebadores preparados (Pat 5-3 AGATACCCTTGGTTGGTT GC) (SEC ID n° 23) y (Pat 3-3 CAGATGGATCGTTTGGAAGG) (SEC ID n° 24) disenados para obtener la region codificante del gen PAT. El producto se inyecto en un gel de agarosa al 1%, se recorto y despues se extrajo el gel con el procedimiento de extraccion de Qiagen (28706). La membrana se sometio entonces a una etapa de prehibridacion a 60°C durante 1 hora en tampon Perfect Hyb (Sigma H7033). Con el procedimiento Prime it RmT dCTP-labeling r*n (Stratagene 300392) se procedio al revelado con una sonda de 32P (Perkin Elmer). La sonda sobrante se lavo con columnas ProbeQuant G50 (Amersham 27-5335-01). Se usaron 2 millones de CPM por ml de tampon Perfect Hyb para hibridar las membranas de transferencia hasta el dfa siguiente. Finalizada la hibridacion las membranas se sometieron a dos lavados de 20 minutos a 65°C con SDS 0,1%, SSC 0,1. Finalmente, las membranas se expusieron a pelfcula fotografica dejandolas hasta el dfa siguiente, incubadas a -80°C.
Los resultados demuestran que todas las plantas resistentes al 2,4-D analizadas contenfan el gen PAT (y, por tanto, se deduce que el AAD-1 (v3) tambien). El analisis del numero de copias revelo que el numero total de insertos oscilaba entre 1 y >10 copias. Este resultado concuerda con los datos de expresion de la protefna AAD-1 (v3), lo cual indica que la presencia de la enzima se traduce en niveles significativamente altos de resistencia (>>200 veces) a todos los acidos fenoxiaceticos y fenoxipropionicos comerciales.
6.12 - Arabidopsis transformada con el apilamiento molecular del gen AAD-1 (v3) y el gen de resistencia al glifosato
Del modo antes descrito se produjeron semillas T1 de Arabidopsis portadoras del plasmido pDAB3230 (AAD-1 (v3) + EPSPS) que codificaba un supuesto caracter de resistencia al glifosato. Las transformantes T1 se seleccionaron utilizando el AAD-1 (v3) como marcador seleccionable del modo descrito en el Ejemplo 6.6, con la salvedad de que la dosis de 2,4-D utilizada fue de 75 g e.a./ha. En el primer intento de seleccion se obtuvieron 24 eventos transformados T1 que se trasplantaron a macetas de tres pulgadas en el invernadero como se ha descrito antes. Tambien se analizaron tres lfneas de control de Arabidopsis distintas: natural Columbia-0, lfneas T5 homocigotas AAD-1 (v3) + PAT (transformadas con pDAB721), y una lfnea homocigota PAT + Cry1F (control transformado). Solo las plantas portadoras del pDAB3230 fueron preseleccionadas en el estadio de plantula por su tolerancia al 2,4-D. Cuatro dfas despues del trasplante, las plantas se dividieron en partes iguales para recibir el tratamiento foliar con un pulverizador de carril del modo antes descrito con 0, 26,25, 105, 420 o 1680 g e.a./ha de glifosato (Glyphomax Plus, Dow AgroSciences) en tampon Hepes 200 mM (pH 7,5). Todos los tratamientos se repitieron 4 o 5 veces. Las plantas se evaluaron 7 y 14 dfas despues del tratamiento. El calculo de los valores I50 revelo un nivel de tolerancia >14 veces mayor conferido por el apilamiento del EPSPS con el AAD-1 (v3) (vease la Figura 10). El AAD-1 (v3) no confirio resistencia al glifosato (re: respuesta pDAB721). Estas plantas T1 se cultivaron para obtener semillas, siendo autopolinizadas para engendrar las semillas T2. Las plantas T1 portadoras del pDAB3230 han demostrado tolerancia
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a dosis letales de 2,4-D y de glifosato. Las plantas T2 seguiran siendo analizadas para demostrar que estas plantas cotransformadas pueden resistir los tratamientos de mezcla en tanque a base de glifosato+2,4-D como se describe en el Ejemplo 21 y se ha demostrado en mafz transformado con AAD-1 (v3) en el Ejemplo 8.
Ejemplo 7 - Transformacion con triquitas del mafz, y uso del AAD-1 (v3) como marcador seleccionable
7.1 - Clonacion del AAD-1 (v3)
El fragmento de AAD-1 (v3) se recibio integrado en un fragmento Ncol/Sacl. El constructo pDAB4005 se digirio con Ncol y Sacl y se aislo el fragmento central de 5175 pb. Los dos fragmentos se unieron con ADN-ligasa de T4 y se transformaron en celulas DH5a. Se realizaron minipreps de las colonias resultantes con el kit mini prep QIA Spin de Qiagen, y despues se digirieron para comprobar la orientacion. El plasmido intermedio correcto se denomino pDAB3403. El pDAB3403 y el pDAB8505 (OsAct1/PAT/ZmLip) se digirieron con Notl. La banda de 3442 pb derivada del pDAB3403 y la banda de 11017 pb del pDAB8505 se aislaron y se purificaron. Ambos fragmentos se unieron juntos, se insertaron en celulas DH5a y los plasmidos resultantes se analizaron para comprobar la orientacion. El constructo final se designo pDAB3404, que contiene ZmUbi1/po-aad1/ZmPer5::OsAct1/PAT/ZmLip.
7.2 - lniciacion del callo/suspension
Con objeto de obtener embriones inmaduros para iniciar el cultivo de callos, se practicaron cruces F1 entre progenitores Hi-ll A y B cultivados en invernadero (Armstrong et al. 1991). Cuando los embriones tenfan 1,0-1,2 mm de tamano (unos 9-10 dfas despues de la polinizacion) se recogieron las espigas y su superficie se esterilizo lavandolas con jabon Liqui-Nox®, sumergiendolas en etanol al 70% durante 2-3 minutos y, despues, en lejfa comercial al 20% (hipoclorito sodico 0,1%) durante 30 minutos.
Las espigas se lavaron con agua destilada esteril, los embriones cigoticos inmaduros se extrajeron en condiciones asepticas y se cultivaron en medio 15Ag10 (medio N6 (Chu et al., 1975), 2,4-D 1,0 mg/l, sacarosa 20 g/l, hidrolizado de casefna 100 mg/l (digestion enzimatica), L-prolina 25 mM, AgNO3 10 mg/l, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) durante 2-3 semanas con el escutelo apartado del medio. El tejido que presentaba la morfologfa adecuada (Welter et al., 1995) se transfirio selectivamente a intervalos quincenales a medio 15Ag10 fresco durante aproximadamente 6 semanas, y despues se transfirio a medio 4 (medio N6, 2,4-D 1,0 mg/l, sacarosa 20 g/l, hidrolizado de casefna 100 mg/l (digestion enzimatica), L-prolina 6 mM, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) a intervalos quincenales durante aproximadamente 2 meses.
Para iniciar los cultivos embriogenicos en suspension, se anadieron aproximadamente 3 ml de volumen celular compactado (PCV) del callo generado a partir de un unico embrion a aproximadamente 30 ml de H9CP + medio lfquido (mezcla basal de sales MS (Murashige y Skoog, 1962), vitaminas Ms modificadas con un contenido 10 veces menor de acido nicotfnico y 5 veces mas de tiamina-HCl, 2,4-D 2,0 mg/l, acido a-naftalenacetico (NAA) 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, hidrolizado de casefna 200 mg/l (digestion con acido), mioinositol 100 mg/l, L-prolina 6 mM, agua de coco 5% v/v (anadida justo antes del subcultivo), pH 6,0). Los cultivos en suspension se mantuvieron a oscuras en matraces Erlenmeyer de 125 ml en un agitador de temperatura controlada a 125 rpm y 28°C. Las lfneas celulares quedaron establecidas por lo general en el plazo de dos a tres meses desde la iniciacion. Durante el establecimiento, las suspensiones se subcultivaron cada 3,5 dfas anadiendo 3 ml de PCV de celulas y 7 ml de medio acondicionado a 20 ml de H9CP + medio lfquido fresco con una micropipeta de punta ancha. Cuando el tejido comenzo a doblar su tamano, las suspensiones se ampliaron y se introdujeron en matraces de 500 ml en los cuales 12 ml de PCV de celulas y 28 ml de medio acondicionado se transfirieron a 80 ml de H9CP + medio. Una vez las suspensiones quedaron completamente establecidas, se criopreservaron para uso futuro.
7.3 - Criopreservacion y descongelacion de la suspensiones
Dos dfas despues del subcultivo, se anadieron 8 ml de crioprotector (disuelto en medio H9CP+ sin agua de coco, glicerol 1 M, DMSO 1 M, sacarosa 2 M, esterilizado con filtro) a 4 ml de PCV de celulas en suspension y 4 ml de medio acondicionado, y a continuacion se agito a 125 rpm y 4°C durante 1 hora en un matraz de 125 ml. Al cabo de 1 hora se anadieron 4,5 ml a un criovial Corning de 5,0 ml preenfriado. Una vez llenos los viales, estos se mantuvieron durante 15 minutos a 4°C en un congelador de velocidad controlada, y despues se dejaron congelar a una velocidad de -0,5°C/minuto hasta alcanzar una temperatura final de -40°C. Alcanzada dicha temperatura, los viales se transfirieron a cajas con gradillas contenidas en una unidad de almacenamiento Cryoplus 4 (Forma Scientific) llena con vapores de nitrogeno lfquido.
Para la descongelacion los viales se extrajeron de la unidad de almacenamiento, se depositaron en un contenedor cerrado con hielo seco y despues se sumergieron en un bano maria a 40-45°C hasta que la “ebuMicion” desaparecio. Una vez descongelados, los contenidos se vertieron sobre una pila de ~8 papeles de filtro esteriles Whatman de 70 mm (N.° 4) en placas de Petri de 100*25 mm tapadas. Tras dejar durante unos minutos que los filtros absorbieran el lfquido, el filtro superior con las celulas se transfirio a medio GN6 (medio N6, 2,4-D 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) durante 1 semana. Al cabo de la semana, solo el tejido con una morfologfa conveniente se transfirio del papel de filtro directamente a medio GN6 fresco. Este tejido se subcultivo cada 7-14 dfas hasta disponer de 1 a 3
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gramos para iniciar el cultivo en suspension en aproximadamente 30 ml de medio H9CP+ en matraces Erlenmeyer de 125 ml. Tres mililitros de PCV se subcultivaron en medio H9CP+ fresco cada 3,5 dfas hasta obtener un total de 12 ml de PCV, momento en que se inicio el subcultivo del modo descrito.
7.4 - Dosis-respuesta de tejido no transformado al acido haloxifop
Se agruparon varias lfneas celulares Hi-II donantes sin transformar, se trataron con triquitas sin ADN, se filtraron en medio GN6 a razon de 6 ml por filtro, y se dejo que formaran un callo durante 2-3 semanas a 28°C. Por cada tratamiento, se transfirieron aproximadamente 200 mg del tejido de callo en suspension a los medios de seleccion en placas de 60*20 mm que contenfan acido R-haloxifop 30, 100 o 300 nM. Se hicieron tres duplicados de cada concentracion. Tambien se preparo un medio control con bialafos 1 mg/l (formulacion comercial Herbiace, Meiji Seika, Japon) y GN6 (1H) para comparar. El callo se extrajo a las 2 semanas, se peso y se transfirio a medio fresco con la misma concentracion durante otras 2 semanas. Transcurridas un total de 4 semanas, se extrajo el tejido, se peso por ultima vez y se desecho. Los resultados se presentan en la Figura 11.
Tambien se llevaron a cabo dos estudios independientes de dosis respuesta del callo a los productos de degradacion fenolicos del haloxifop y cihalofop para confirmar que estos productos finales no serfan perjudiciales para el crecimiento del mismo. Los datos de dosis-respuesta a los fenoles derivados del cihalofop (vease la Figura 12) demuestran que con una concentracion de fenoles del cihalofop de 1 pM, el crecimiento sigue suponiendo el 76% del observado en el control exento de fenoles del cihalofop. Los datos correspondientes a la dosis-respuesta de los fenoles del haloxifop demuestran que incluso con una concentracion de fenoles del haloxifop de 300 nM, el crecimiento fue igual o superior al del control no expuesto a tales fenoles (datos no mostrados).
7.5 - Transformacion con triquitas con seleccion por bialafos
Alrededor de 24 horas antes de la transformacion, 12 ml de PCV de celulas de mafz embriogenicas criopreservadas en suspension mas 28 ml de medio acondicionado se subcultivaron en 80 ml de medio lfquido GN6 (medio GN6 sin Gelrite) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, colocandose en un agitador a 125 rpm y 28°C. Este paso se repitio dos veces con la misma lfnea celular, de modo que en total se repartieron 36 ml de PCV en 3 matraces. Veinticuatro horas despues se extrajo el medio lfquido GN6 y se sustituyo por 72 ml de medio osmotico GN6 S/M (medio N6, 2,4- D 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, sorbitol 45,5 g/l, manitol 45,5 g/l, mioinositol 100 mg/l, pH 6,0) por matraz con el fin de lisar las celulas. Los matraces se colocaron en un agitador a oscuras durante 30-35 minutos, y durante ese tiempo se preparo una suspension de triquitas de carburo de silicio de 50 mg/ml anadiendo el volumen adecuado de medio lfquido GN6 S/M a ~405 mg de triquitas de carburo de silicio autoclavadas (Advanced Composite Materials, Inc.).
Tras la incubacion en GN6 S/M, se vertieron los contenidos de los matraces en un unico frasco de centrffuga de 250 ml. Una vez sedimentadas las celulas, se extrajo todo el lfquido GN6 S/M menos ~14 ml y se reservo en un matraz esteril de 1 litro para su uso posterior. La suspension prehumedecida de triquitas se vorteo durante 60 segundos a maxima velocidad y se anadieron 8,1 ml al frasco, al cual se anadieron despues 170 pg de ADN como ultimo paso. El frasco se coloco inmediatamente en un mezclador comercial de pintura Red Devil 5400 modificado y se agito durante 10 segundos. Acabada la agitacion, la mezcla de celulas, medios, triquitas y ADN se anadio al contenido del matraz de 1 litro junto con 125 ml de medio lfquido GN6 fresco para reducir la osmolaridad. Las celulas se dejaron recuperar en un agitador durante 2 horas antes de filtrarlas en un papel de filtro Whatman n.° 4 (5,5 cm) utilizando una unidad recolectora de celulas de vidrio que estaba conectada a un tubo de vacfo.
Sobre la superficie del filtro sometido a vacfo se pipetearon 3 o 6 ml de suspension dispersada. Los filtros se depositaron en placas de 60 * 20 mm con medio GN6, y las placas se cultivaron durante 1 semana a 28°C en una caja oscura cubierta con una lamina de plastico (<2 milfmetros de espesor), pero no hermeticamente, a fin de reducir la evaporacion de las placas.
Al cabo de 1 semana, los papeles de filtro se transfirieron a placas de 60*20 mm con medio GN6 (1H) (medio N6, 2,4-D 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, mioinositol 100 mg/l, bialafos 1,0 mg/l, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) o medio Gn6D (1H) (igual que el GN6 (1H) excepto por la presencia de dicamba 8,0 mg/l y 2,4-D 0,8 mg/l).
Las placas se depositaron en cajas y se cultivaron como antes durante otra semana. Dos semanas despues de la transformacion, el tejido se incluyo sembrando la mitad de las celulas de la placa o bien la totalidad en 3,0 ml de medio de agarosa GN6 fundido (medio N6, 2,4-D 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, mioinositol 100 mg/l, agarosa Sea Plaque 7 g/l, pH 5,8, autoclavada durante solamente 10 minutos a 121°C) que contenfa bialafos 1 mg/l. El tejido se disgrego y 3 ml de agarosa y tejido se vertieron uniformemente sobre la superficie de una placa de 100 * 15 mm con medio gN6 (1H) o GN6D (1H). Este paso se repitio con las demas placas. Finalizada la inclusion, las placas se sellaron individualmente con Nescofilm® o Parafilm M®, y despues se cultivaron durante 1 semana a 28°C en cajas oscuras.
Los aislamientos presumiblemente transformados solfan hacerse visibles entre 5 y 8 semanas despues de la transformacion. Los aislamientos potenciales se extrajeron de la placa incluida y se transfirieron a medio de seleccion fresco de la misma concentracion utilizada en las placas de 60 * 20 mm. Si al cabo de 2 semanas
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45
aproximadamente se apreciaba un crecimiento sostenido, el evento se consideraba resistente y era sometido al analisis molecular.
La regeneracion se inicio transfiriendo el tejido de callo a un medio inductor con citocininas, 28 (1H), que contenfa bialafos 1 mg/l, sales y vitaminas MS, sacarosa 30,0 g/l, BAP 5 mg/l, 2,4-D 0,25 mg/l, Gelrite 2,5 g/l; pH 5,7. Las celulas se dejaron crecer con poca luz (13 pEm-2s-1) durante una semana y despues con luz mas intensa (40 pEm-2s-1) otra semana mas antes de transferirlas al medio de regeneracion, 36 (1H), identico al 28 (1H) salvo porque carecfa de reguladores del crecimiento vegetal. Las plantulas pequenas (3-5 cm) se sacaron y se depositaron en tubos de cultivo de 150 x 25 mm que contenfan medio SHGA sin agente de seleccion (sales basales y vitaminas de Schenk y Hildebrandt, 1972; mioinositol 1 g/l, sacarosa 10 g/l, Gelrite 2,0 g/l, pH 5,8). Una vez las plantulas desarrollaron un sistema radicular y aereo suficiente, se trasplantaron a suelo en un invernadero.
7.6 - Transformacion con triquitas con seleccion por haloxifop
Los parametros de insercion del ADN utilizados para la seleccion directa con herbicidas “fop” fueron identicos a los del procedimiento de seleccion con bialafos, excepto en que se cotransformaron juntos 85 pg de pDAB3403 y 85 pg de un constructo que contenfa un gen marcador de GFP (protefna verde fluorescente), y que solo se filtraron 3 ml de suspension en medio GN6 despues de la recuperacion de 2 horas.
Al cabo de 0-7 dfas en medio GN6 sin agentes de seleccion, los papeles de filtro se transfirieron a placas de 60x20 mm con medio GN6 que contenfa 2,4-D 2 mg/l mas acido R-haloxifop 50, 100 o 200 nM. Las placas se colocaron en cajas y se cultivaron durante otra semana mas. Al cabo de esa semana, el tejido se incluyo sembrando todas las celulas de la placa en 3,0 ml de medio de agarosa GN6 fundido que contenfa la misma concentracion de agente de seleccion que en la transferencia previa. Todas las etapas posteriores fueron identicas al protocolo de seleccion con PAT/regeneracion salvo porque el medio de regeneracion contenfa acido R-haloxifop 100 nM en lugar de bialafos 1 mg/l.
7.7 - Resultados. Se iniciaron varios experimentos de analisis con diversos niveles de haloxifop y cihalofop, y se recuperaron 47 aislamientos por seleccion directa. Un subgrupo de eventos en callo fue analizado con PCR y transferencia Western. Tras obtener los datos de expresion, 21 eventos destacados fueron sometidos a un analisis con transferencia Southern. Los resultados obtenidos con Ncol, enzima de restriccion de corte unico, para obtener los datos de integracion despues del analisis con sonda del AAD-1 (v3), demuestran sin lugar a dudas la integracion estable del AAD-1 (v3) tras la transformacion con triquitas combinada con la seleccion con herbicidas “fop” (ariloxifenoxipropionato).
7.8 - Demostracion cuantitativa de la tolerancia in vitro de eventos en callo que expresan la AAD-1 (v3) sometidos a seleccion con bialafos
Noventa y siete aislamientos de callo recuperados de la seleccion con bialafos fueron sometidos a un analisis Invader para conocer el numero de copias de PAT asf como a un analisis de PTU del AAD-1 (v3) con PCR (vease el Ejemplo 7.10). El analisis de la expresion de la protefna AAD-1 (v3) con transferencia Western/ELISA en sandwich (Ejemplo 11) se llevo a cabo con un subgrupo de los eventos. En la Tabla 21 se describe un resumen. De cada uno de estos eventos se regeneraron al menos 15 plantas T0 con las que se efectuaron pruebas de pulverizacion y de las que se obtuvieron semillas.
Tabla 21.
Evento N.°
N.° de copias de PAT PCR de la PTU del AAD-1 (v3) Western del callo
3404-001
2 + +
3404-006
2 + +
3404-013
3 + +
3404-017
1 + +
3404-020
3 + nd
3404-022
2 + +
3404-025
2 + +
3404-027
3 + +
3404-031
1 + +
3404-033
2 + nd
3404-036
3 + +
3404-044
3 + +
3404-050
3 + +
3404-053
3 + +
3404-074
2 + +
3404-082
2 + +
5
10
15
20
25
30
Un subgrupo mas pequeno de estos eventos se evaluo en estudios de dosis-respuesta comparandolo con un control no transformado. Se analizo un rango de concentraciones de haloxifop de hasta 400 nM (formulacion Gallant Super). Los datos de dosis-respuesta de un evento, el 3404-006, se generaron utilizando los metodos generales del Ejemplo 7.4, y se muestran en la Figura 13. Estos demuestran que el evento 3404-006 no manifesto una reduccion significativa del crecimiento del callo a concentraciones de haloxifop de hasta 400 nM, mientras que el crecimiento del callo de mafz no transgenico si se vio inhibido a dicha dosis. Estos datos no han sido normalizados para tener cuenta las diferencias inherentes de crecimiento que no estan vinculadas con la expresion del transgen.
7.9 - Transformacion con traquitas con seleccion por imazetapir
La casete ZmUbi1/AAD-1 (v3)/ZmPer5 se extrajo del pDAB3404 con Ascl/Swal y se inserto en pDAB2212 para crear el vector para transformacion de AAD-1 (v3) y AHAS con triquitas pDAB3415, tambien denominado pDAS1283). Una vez acabado, este constructo se transformo en mafz por medio de triquitas de carburo de silicio como se ha descrito en el Ejemplo 7.4, excepto porque se filtraron 2 ml de celulas, proceso al que siguieron una recuperacion de 7 dfas en medio GN6 y la seleccion con un medio que contenfa imazetapir 3 pM procedente del herbicida Pursuit® DG. El analisis Invader permitio identificar 36 eventos que contenfan los genes AAD-1 (v3) y AHAS.
Cincuenta y tres eventos de callos de mafz derivados de estas transformaciones se analizaron con ELISA y con transferencia Western para determinar la expresion de AAD-1 (v3) - un subgrupo de los datos se muestra a continuacion. En los eventos citados en la Tabla 22, los niveles de expresion de los eventos detectados como positivos oscilaron entre 90 y mas de 1000 ppm en la protefna soluble total.
Tabla 22.
Numero de ID del evento AAD-1
Nivel de expresion (ppm) Transferencia Western
1283[1]-001
2 -
1283[l]-002
206 + + +
1283[l]-003
1 -
1283[l]-004
90 + + +
1283[l]-005
1 -
1283[l]-006
105 + + +
1283[l]-007
212 + +
1283[l]-008
114 ±
1283[l]-009
305 +
1283[1]-010
2 -
1283[1]-011
4 -
1283[1]-012
200 + + +
1283[1]-013
134 + + +
1283[1]-014
4 -
1283[1]-015
194 + + +
1283[1]-016
4 -
1283[1]-017
196 + + +
1283[1]-018
3 -
1283[1]-019
178 +
1283[l]-020
260 + +
1283[1]-021
144 + + +
1283[l]-022
140 + + +
1283[l]-023
191 + + +
1283[l]-024
392 + +
1283[l]-025
368 + +
1283[l]-026
14 -
1283[l]-027
1006 + +
Control Neg
3 -
Control Neg
3 -
Patron (0,5 pg/mL)
+ +
Patron (5 pg/mL)
+ + + +
7.10 - Analisis molecular: materiales y metodos aplicados a mafz
7.10.1 - Obtencion del tejido, aislamiento y cuantificacion del ADN.
Tejido fresco repartido en varios tubos se liofilizo a 4°C durante 2 dfas. Una vez completamente seco, se introdujo una perla de tungsteno (Valenite) en cada tubo y las muestras de tejido se sometieron durante 1 minuto a molturacion en seco con un molino de perlas Kelco. Despues se realizo el procedimiento de aislamiento de ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
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55
60
65
DNeasy del modo acostumbrado (Qiagen, DNeasy 69109). A continuacion, una alfcuota del ADN extrafdo se tino con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyo en el fluorfmetro (BioTek) con patrones conocidos para obtener la concentracion en ng/pl.
7.10.2 - Analisis con ensayo Invader.
Las muestras de ADN se diluyeron hasta 20 ng/pl y se desnaturalizaron incubandolas en un termociclador a 95°C durante 10 minutos. A continuacion se preparo la mezcla Signal Probe con la mezcla de oligonucleotidos facilitada y MgCl2 (Third Wave Technologies). Alfcuotas de 7,5 pl se colocaron en cada pocillo de la placa del ensayo Invader seguidas por alfcuotas de 7,5 pl de los controles, patrones y muestras desconocidas diluidas a 20 ng/pl. A todos los pocillos se les anadio 15 pl de aceite mineral (Sigma) para cubrirlos. Las placas se incubaron entonces a 63°C durante 1 hora y se leyeron en el fluorfmetro (Biotek). El % de senal respecto al fondo de la sonda diana se dividio por el % de senal respecto al fondo de la sonda de control interna para calcular el cociente. El cociente de los patrones (cuyo numero de copias es conocido) desarrollados y validados con transferencia Southern, se uso para estimar el numero de copias de los eventos desconocidos.
7.10.3 - Reaccion en cadena de la polimerasa.
Como molde se emplearon 100 ng de ADN total. Se usaron 20 mM de cada cebador con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Los cebadores utilizados para la PTU del AAD-1 (v3) fueron: (Directo- ATAATGCCAGC CTGTTAAACGCC) (SEC ID n° 25) e (Inverso-CTCAAGCATATGAATGACCT CGA) (SEC ID n° 26). La reaccion de PCR se realizo en un termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 63°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos seguidos por 72°C durante 10 minutos. Los cebadores utilizados para la PCR de la region codificante del AAD-1 (v3) fueron: (Directo-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC) (SEC ID n° 27) e (Inverso- CGGGC AGGCCTAACTCCACCAA) (SEC ID n° 28). La reaccion de PCR se llevo a cabo con un termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos seguidos por 72°C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se analizaron con una electroforesis en gel de agarosa al 1% y tincion con EtBr.
7.10.4 - Analisis con transferencia Southern.
El analisis con transferencia Southern se llevo a cabo con el ADN total obtenido con el kit DNeasy de Qiagen. Un total de 2 pg de ADN fueron sometidos a una digestion hasta el dfa siguiente con Afl II y tambien con EcoRV en el caso del pDAB3404, con NcoI en el del pDAB3403, y con SpeI en el del pDAB1421 a fin de obtener los datos de integracion. Acabada la digestion se inyecto una alfcuota de ~100 ng en un gel al 1% para confirmar que la digestion habfa sido completa. Despues de esta comprobacion, las muestras se procesaron en un gel de agarosa grande al 0,85% hasta el dfa siguiente a 40 voltios. A continuacion, el gel se desnaturalizo con NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos y se neutralizo con Tris HCl 0,5 M, NaCl 1,5 M y pH de 7,5 durante 30 minutos. Seguidamente se preparo un aparato de gel con SSC 20x para transferir por gravedad el gel a una membrana de nilon (Millipore INYC00010), dejandolo hasta el dfa siguiente. Acabada la transferencia, la membrana se expuso a luz UV en presencia de un entrelazador (stratagene UV stratalinker 1800) a 1200*100 microjulios. Despues la membrana se lavo con SDS 0,1%, SSC 0,1 durante 45 minutos. Finalizado el lavado de 45 minutos, la membrana fue horneada durante 3 horas a 80°C y despues se conservo a 4°C hasta la hibridacion. El molde de hibridacion se preparo con la PCR de la region codificante antes senalada utilizando el plasmido pDAB3404. El producto se inyecto en un gel de agarosa al 1%, se recorto y despues se extrajo el gel con el procedimiento de extraccion de Qiagen (28706). La membrana se sometio entonces a una etapa de prehibridacion a 60°C durante 1 hora en tampon Perfect Hyb (Sigma H7033). Con el procedimiento Prime it RmT dCTP-labeling r*n (Stratagene 300392) se procedio al revelado con una sonda de 32P (Perkin Elmer). La sonda sobrante se lavo con columnas ProbeQuant G50 (Amersham 27-5335-01). Se usaron 2 millones de CPM para hibridar las membranas de transferencia hasta el dfa siguiente. Finalizada la hibridacion, las membranas se sometieron a dos lavados de 20 minutos a 65°C con SDS 0,1%, SSC 0,1. Finalmente, las membranas se expusieron a pelfcula fotografica dejandolas hasta el dfa siguiente, incubadas a -80°C.
Ejemplo 8 - Datos de tolerancia in vivo y de tolerancia en el campo generados por eventos portadores del AAD-1 (v3) seleccionados con PAT (pDAB3404)
8.1 - Tolerancia de plantas de mafz Tn a herbicidas AOPP
Cuando se pudieron regenerar mas de 15 plantas clonales por evento, se transfirieron plantas adicionales al invernadero para someterlas a una seleccion preliminar por tolerancia aplicando en postemergencia herbicidas AOPP a plantas de mafz T0. Las plantas aclimatadas en el invernadero se dejaron crecer hasta que brotaron 2-4 hojas nuevas de aspecto normal del verticilio (es decir, plantas que habfan superado con exito la transicion del cultivo in vitro a las condiciones del invernadero). Las plantas se cultivaron en el invernadero a 27°C con 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad. A continuacion, las plantas se trataron con formulaciones comerciales de uno de los tres herbicidas AOPP siguientes: Assure® II (DuPont), Clincher* (Dow AgroSciences) o Gallant Super* (Dow
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25
AgroSciences) correspondientes respectivamente a quizalofop, cihalofop y haloxifop. Las aplicaciones de herbicida se efectuaron con un pulverizador de carril con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha, altura de pulverizacion 50 cm, y todas las pulverizaciones incorporaron el aceite vegetal concentrado Agridex al 1% v/v. El numero de clones de cada evento vario de una semana a otra debido al ritmo de regeneracion y aclimatacion de cada evento. En conjunto, se intento tratar a clones representativos de cada evento con un rango de dosificacion del herbicida comprendido entre 1* dosis letal (~%* dosis de campo) hasta 8* dosis de campo (64* dosis letal). La dosis letal se define como la dosis que causa danos >95% a la lfnea endogamica Hi-II. La Hi-II constituye la base genetica de las transformantes de la presente invencion.
Los AOPP son en general herbicidas muy potentes que matan el mafz. El mafz Hi-II nacido de semillas de tres o cuatro hojas es erradicado (danos >95%) con 8,8, 62,5, y 4,4 g e.a./ha de haloxifop, cihalofop y quizalofop, respectivamente. Todas las lfneas transformadas con AAD-1 (v3) estudiadas sobrevivieron a una dosis mfnimamente letal de todos los herbicidas AOPP analizados. De hecho, la mayorfa de las lfneas analizadas sobrevivieron sin danos visibles (14 DAT) aun despues de recibir una 8* dosis de campo de quizalofop (64* dosis letal). Varios clones individuals de los eventos “017” y “038,” empero, sufrieron danos significativos a dosis elevadas. Ello podrfa ser resultado de una menor expresion del gen debido al lugar o al modo de insercion del mismo.
En la mayorfa de los eventos quedo demostrado un alto nivel de tolerancia a AOPP, incluso cuando las aplicaciones tuvieron lugar en plantas recien salidas del cultivo in vitro (estadio To). Resulta destacable que esta tolerancia se consumara frente a los tres herbicidas AOPP y que probablemente pueda hacerse extensiva a todos los herbicidas de esa clase, como se ha demostrado previamente con la AAD-1 in vitro.
La Figura 14 ofrece las respuestas de varios clones del evento transformados con AAD-1 (v3) y sin transformar a dosis letales de dos herbicidas AOPP (haloxifop y quizalofop) aplicados 1 semana antes.
La Tabla 23 contiene los datos de las respuestas de eventos seleccionados de mafz To transformados con AAD-1 (v3) a tres herbicidas AOPP aplicados en postemergencia.
Tabla 23. Respuesta de eventos seleccionados de maiz To transformados con AAD-1 (v3) a tres herbicidas AOPP aplicados en postemergencia.
Constructo
Evento Cloneo Haloxifop* g e.a./ha Cyhalofop** g e.a./ha Quizalofop*** e.a./ha % dano a 14 DAT
3404
001 016 8.8 0
3404
001 018 62.5 0
3404
001 017 8.8 0
3404
001 019 8.8 30
3404
001 020 35 0
3404
017 018 35 0
3404
017 019 35 0
3404
017 020 70 0
3404
017 021 70 0
3404
017 022 140. 0
3404
017 023 140 30
3404
017 024 ' 280 30
3404
017 025 280 20
3404
022 019 8.8 0
3404
022 020 17.5 0
3404
022 016 17.5 0
3404
022 024 62.5 0
3404
022 018 125 0
3404
022 021 8.8 0
3404
022 017 17.5 0
3404
022 022 35 0
3404
022 023 70 0
3404
033 012 35 0
3404
033 013 70 0
3404
033 014 70 0
3404
033 015 140 0
3404
033 016 280 0
3404
038 016 8.8 0
3404
038 018 62.5 0
3404
038 017 8.8 0
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 23. Respuesta de eventos seleccionados de maiz T0 transformados con AAD-1 (v3) a tres herbicidas AOPP aplicados en postemergencia.
Constructo
Evento Cloneo Haloxifop* g e.a./ha Cyhalofop** g e.a./ha Quizalofop*** e.a./ha % dano a 14 DAT
3404
038 019 35 70
3404
038 020 35 80
3404
038 021 70 80
3404
038 022 70 80 .
(dosis letal = dosis letal = (dosis letal =
8.8 e e.a./ha) 62.5 g e.a./ha) 4.4 g e.a./ha)
*Gallant super# + COC 1% (v/v)
**Clincher# + COC 1% (v/v)
***Assure II + COC 1% (v/v)
#Marca registrada de Dow AgroSciences, LLC
8.2 - Tolerancia en campo de plantas de maiz T1 portadoras del pDAB3404 a los herbicidas quizalofop, 2,4-D y glufosinato
Se llevaron a cabo dos ensayos de campo en estaciones agrfcolas de Hawai e Indiana. Semillas de maiz de plantas T1 endogamicas fueron utilizadas para evaluar la tolerancia de 16 lfneas de evento AAD-1 frente a quizalofop y 2,4- D. Tres hfbridos no transformados se incluyeron a efectos comparativos. El hfbrido Hi-II * 5XH571 comparte el mismo linaje que las lfneas del evento AAD-1 (v3). El hfbrido Croplan 585SR es una lfnea resistente a setoxidim.
El diseno experimental consistio en un sistema de parcelas subdivididas con cuatro replicas. La parcela principal fue el tratamiento herbicida y la subparcela el evento AAD-1 (v3) o el hfbrido de comparacion. Las parcelas consistfan en una hilera de 3,7 metros con aproximadamente 25 semillas plantadas en cada hilera. Por lo que respecta a los eventos AAD-1, en cada replicado se sembraron semillas de un linaje diferente de cada evento.
Las parcelas de AAD-1 (v3) recibieron en el estadio V2 la aplicacion de glufosinato a 560 g m.a./ha para eliminar las plantas no transformadas. Los tratamientos del experimento incluyeron formulaciones comerciales de quizalofop aplicadas a 70 y 140 g e.a./ha, 2,4-D (sal dimetilamina) a 560 y 1120 g e.a./ha, y un control no tratado. Los tratamientos se aplicaron con una mochila pulverizadora con lanza difusora que proporcionaba un volumen de pulverizacion de 187 l/ha a una presion de 130-200 kPa. Los tratamientos con quizalofop se aplicaron en el estadio V3-V4 y los tratamientos con 2,4-D en el estadio V5-V6.
Las parcelas tratadas con quizalofop se evaluaron visualmente para detectar los danos al cultivo al cabo de una y tres semanas de la aplicacion (WAA) utilizando una escala de 0-100%, en la cual 0 significa sin danos y 100 muerte completa. Las parcelas tratadas con 2,4-D se evaluaron visualmente para detectar el encamado de las plantas 2 dfas despues de la aplicacion (DAA) utilizando una escala de 0-100% en la que 0 equivale a ninguna planta encamada y 100 equivale a todas las plantas encamadas. Asimismo, las parcelas tratadas con 2,4-D fueron analizadas visualmente 3-4 WAA para evaluar la deformacion de las rafces fulcreas con una escala de 0-10.
8.2.1 - Resultados
La respuesta del evento AAD-1 (v3) a las dosis mas altas analizadas de quizalofop y 2,4-D se muestran en la Tabla 24. Dichas dosis representan aproximadamente el doble de las dosis comerciales normales. Los hfbridos no transformados resultaron gravemente danados (80-100%) por el quizalofop a 70 g e.a./ha, incluida la lfnea resistente a setoxidim, aunque esta manifesto una tolerancia ligeramente mejor que los otros dos hfbridos. Todos los eventos AAD-1 (v3) excepto un linaje del evento 3404.001 manifestaron una tolerancia excelente al quizalofop a 70 g e.a./ha. No se observaron sfntomas visibles en los eventos AAD-1 (v3) excepto en los casos senalados arriba.
Tabla 24.
Treatmiento (dosis) =
Quizalofop (140 g e.a./ha) 2,4-D amina (1120 g e.a./ha) 2,4-D amina (1120 g e.a./ha) Resultados del analisis Cocientes de segregacion de resistencia tras pulverizacion con Liberty
Evaluacion Evento o Hfbrido
% de dano 3 WAA (escala 0100) % de encamado (escala 0-100) Deformacion rafces fulcreas 3-4 WAA (escala 0-10) Numero ... , Transf. c°.priaf e Western ELISA de AAhD-1 en deAAD- AAD-1 en , hoja . 1 en hojas T0 (analisis 0 southern) ojas 0 .. .. Media de Media de .. ., .. ., ... poblacion poblacion T1 12
IN HI
IN HI
IN HI
IN HI HI
5
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Tabla 24.
Treatmiento (dosis) =
Quizalofop (140 g e.a./ha) 2,4-D amina (1120 g e.a./ha) 2,4-D amina (1120 g e.a./ha) Resultados del analisis Cocientes de segregacion de resistencia tras pulverizacion con Liberty
Evaluacion Evento o Hfbrido
% de dano 3 WAA (escala 0100) % de encama- do (escala 0-100) Deformacion rafces fulcreas 3-4 WAA (escala 0-10) Numero copias de AAD-1 en hoja (analisis southern) Transf. Western de AAD- 1 en hojas T0 ELISA de AAD-1 en hojas T0 Media de poblacion T1 Media de poblacion T2
IN
HI IN HI IN HI IN HI HI
3404.001
25 25 0 5 1 2 3 + + + + + + 40% 47% X
3404.006
0 0 0 0 0 0 1 + + + + + 33% 26% X
3404.013
0 0 0 0 0 0 1 + + + + 63% 58% X
3404.017
0 0 1 0 0 0 2 +/- + + 48% 47% X
3404.020
0 0 0 0 0 0 2 + + + + + 50% 51% X
3404.022
0 0 1 0 0 0 1 + + + .51% 57% 76%*
3404.025
0 0 0 0 0 0 2 + + + + + + + 55% 59% X
3404.027
0 0 3 0 0 0 5 + + + 51% 50% X
3404.031
0 0 1 0 0 0 1 + + + + + + 47% 43% 61%*
3404.033
0 0 0 0 0 0 2 o 3 + + + 52% 49% X
3404.036
0 0 0 0 0 0 4 + + + + + 52% 48% X
3404.044
0 0 1 0 0 1 1 + +/- 50% 48% X
3404.050
0 0 0 1 0 1 2 nd nd 38% 28% X
3404.053
0 0 1 0 0 0 2 + + + + + + 48% 56% X
3404.074
0 0 0 0 0 0 1 + + + + + 53% 52% 73%*
3404.082
0 0 0 0 0 1 3 nd nd 38% 36% X
DK493
100 100 20 23 8 9
Hl-ll X
5XH571
100 100 13 34 7 9
CROPLAN
585SR
80 96 11 33 9 9
*Concuerda con la segregacion de un caracter regido por un solo locus dominante segun el analisis de la ji al cuadrado (P > 0,05)
El 2,4-D aplicado a la dosis de 1120 g e.a./ha provoco niveles significativos (11-33%) de epinastia en los hfbridos no transformados, una respuesta normal cuando se aplican a partir del estadio de crecimiento V4. En todos los eventos de AAD-1 (v3) se observo una escasa o nula epinastia, excepto en un linaje de 3404.001 (estudiado solo en Indiana) donde se produjeron niveles moderados (5-13%).
Las rafces fulcreas de los hfbridos no transformados quedaron gravemente deformadas (evaluadas con 9 en una escala de 0-10) por el 2,4-D a 1120 g e.a./ha. De nuevo, esta es una respuesta normal al 2,4-D cuando se aplica a partir del estadio de crecimiento V4. Al igual que con la respuesta de epinastia, se observaron pocos o nulos danos en las rafces fulcreas en los eventos AAD-1 (v3), excepto en un linaje de 3404.001.
Tendencias similares se observaron con las dosis mas bajas de quizalofop y 2,4-D, aunque en los hfbridos no transformados se observaron niveles de respuesta reducidos pero todavfa significativos (datos no mostrados).
Estos resultados indican que la mayorfa de lfneas de eventos transformados con AAD-1 (v3) manifestaron un alto nivel de resistencia al quizalofop y al 2,4-D a dosis que eran letales o que causaban graves malformaciones epinasticas a los hfbridos de mafz no transformados. Vease tambien la Figura 16.
8.2.2 - Proporciones de segregacion mendeliana previstas en tres eventos T?.
Plantas de linajes individuales de cada evento fueron autopolinizadas al azar en el campo. Las semillas T2 se recolectaran a mano cuando alcanzaron la madurez fisiologica. Partiendo del numero de copias del gen unico (vease la Tabla 24 anterior) y del rendimiento global de la generacion T1 (segregacion, tolerancia a herbicidas y vigor), se escogieron tres eventos (022, 031 y 074) para proseguir la evaluacion en el campo. Las hileras de cada evento se plantaron con una sembradora de cono de precision, a razon de 2500-3000 semillas por hilera. En el estadio de crecimiento V2, todas las lfneas AAD-1 (v3) fueron pulverizadas con 140 g e.a./ha de quizalofop (Assure® II) utilizando una mochila pulverizadora como se ha descrito previamente. Esta dosis mato rapidamente todos los segregantes “nulos” (no transformados). Todos los eventos presentaron una proporcion de segregacion concordante
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con la herencia mendeliana de un locus unico de herencia dominante (3 resistentes:1 sensible, o supervivencia del 75%) (vease la Tabla 24). Los homocigotos y los hemicigotos del evento 74 fueron identificados analizando la cigosidad (vease la descripcion del ensayo Invader de AAD-1 (v3) en mafz). Las plantas hemicigotas se eliminaron y las plantas homocigotas AAD-1 (v3) se cruzaron con mafz BE1146 endogamico por introgresion y homocigoto para el caracter de resistencia al glifosato NK603, dando lugar a una semilla hfbrida F1 homogenea que es hemicigota para la resistencia al glifosato, el AAD-1 (v3) y la resistencia al glufosinato.
8.3 - Apilamiento del AAD-1 (v3) y de PAT con los genes de resistencia al glifosato en mafz
Plantas de mafz T2 homocigotas para AAD-1 (v3)/PAT se cruzaron con plantas de mafz resistentes al glifosato para producir semillas F1 portadoras de los genes AAD-1 (v3), PAT y de resistencia al glifosato como se describe en el ejemplo anterior.
Las semillas F1 se sembraron individualmente en macetas de 3 pulgadas rellenas con medio de crecimiento Metro- Mix® 360 (Sun Gro Horticulture). Las macetas se regaron inicialmente con solucion de Hoagland por goteo subterraneo hasta empapar el sustrato, que despues se dejo drenar por gravedad, cultivandose a 27°C en condiciones de 16 horas de luz:8 horas de oscuridad en el invernadero. Durante el resto del estudio las plantas se regaron con goteo subterraneo con agua desionizada.
Las plantas se dejaron crecer hasta que brotaron 2-4 hojas del verticilio. En este momento las aplicaciones de herbicida se efectuaron con un pulverizador de carril con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha, a una altura de 50 cm. Las plantas se pulverizaron con dosis de 2,4-D DMA, glifosato, glufosinato, y con diversas combinaciones de los tres. Todas las aplicaciones se formularon en tampon Hepes de 200 mM (pH 7,5). En las pulverizaciones que inclufan glufosinato el tratamiento se formulo anadiendo sulfato amonico al 2% p/v.
A los 3 y 14 dfas del tratamiento (DAT) se evaluaron las plantas. Se les asigno una puntuacion de danos observando si presentaban enanismo, clorosis y necrosis. Las plantas calificadas con una puntuacion de danos del 90% o superior se consideraron muertas. Los resultados del estudio a los 14 DAT se ofrecen en la Tabla 25.
Tabla 25.
Dosis de campo % danos en el 14 DAT
Hi II X 5XH751
RR/PAT/AAD1
Med
Med
Control no tratado
- 0 0
840 g e.a./ha glifosato
1X 98 0
1680 g e.a./ha glifosato
2X 100 0
3360 g e.a./ha glifosato
4X 100 0
560 g e.a./ha 2,4-D DMA
1X 10 0
1120 g e.a./ha 2,4-D DMA
2X 14 0
2240 g e.a./ha 2,4-D DMA
4X 29 0
470 g e.a./ha glufosinato
1X 80 0
940 g e.a./ha glufosinato
2X 90 3
1880 g e.a./ha glufosinato
4X 96 15
840 g e.a./ha glifosato + 560 g e.a./ha 2,4-D DMA
1X + 1X 96 1
1680 g e.a./ha glifosato +1120 g e.a./ha 2,4-D DMA
2X + 2X 100 2
3360 g e.a./ha glifosato + 2240 g e.a./ha 2,4-D DMA
4X + 4X 100 1
470 g e.a./ha glufosinato + 560 g e.a./ha 2,4-D DMA
1X + 1X 89 5
940 g e.a./ha glufosinato + 1120 g e.a./ha 2,4-D DMA
2X + 2X 91 10
1880 g e.a./ha glufosinato + 2240 g e.a./ha 2,4-D DMA
4X + 4X 97 13
840 g e.a./ha glifosato + 470 g e.a./ha glufosinato
1X + 1X 90 5
1680 g e.a./ha glifosato + 940 g e.a./ha glufosinato
2X + 2X 98 15
3360 g e.a./ha glifosato + 1880 g e.a./ha glufosinato
4X + 4X 100 15
Este estudio demostro que el gen AAD-1 (v3) en mafz se puede apilar con un gen de resistencia al glifosato y otro gen de resistencia al glufosinato para proporcionar una fuerte tolerancia en el campo al 2,4-D, el glifosato y el glufosinato, solos o en combinaciones de tanque.
8.3.1 - Resistencia del mafz portador del AAD-1 (v3) a las combinaciones de 2,4-D DMA y quizalofop.
Semillas T2BC1 del evento hemicigoto numero 3404-025.001R/R001 Bulked.001.S058 se sembraron individualmente en macetas de 3 pulgadas preparadas con medio de crecimiento Metro-Mix® 360. Las macetas se regaron inicialmente con solucion de Hoagland por goteo subterraneo hasta empapar el sustrato, y despues se dejo drenar por gravedad, cultivandose a 27°C en condiciones de 16 horas de luz:8 horas de oscuridad en el invernadero. Durante el resto del estudio las plantas se regaron con goteo subterraneo con agua desionizada.
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Las plantas se dejaron crecer hasta el estadio V1 en el invernadero. En ese momento las plantas se seleccionaron con 560 g e.a./ha de Assure® II al que se habfa anadido aceite vegetal concentrado Agridex al 1% en tampon Hepes 200 mM con un pulverizador de carril de laboratorio ajustado a 187 l/ha. Se dejaron pasar 4 dfas para que las plantas manifestaran los smtomas de la seleccion. Ninguna de las plantas sufrio danos. Las aplicaciones de herbicida se realizaron con un pulverizador de carril a un volumen de pulverizacion de 187 l/ha, a una altura de 18 pulgadas. Todas las aplicaciones se formularon con tampon Hepes 200 mM (pH 7,5) con la adicion de Agridex al 1% v/v.
A los 3 y 14 dfas del tratamiento (DAT) se evaluaron las plantas asignandolas una puntuacion de danos si presentaban enanismo, clorosis o necrosis. Las plantas calificadas con una puntuacion de danos del 90% o superior se consideraron muertas. Las plantas de este linaje presentaron un 0% de danos a los 14 DAT con todas las combinaciones de mezcla en tanque, mientras que las plantas naturales sufrieron danos del 100%. Estos resultados indican que el AAD-1 (v3) no solo proporciona una solida resistencia en el campo frente al 2,4-D y el quizalofop, sino tambien frente a dosis exageradas de multiples combinaciones de las dos familias qmmicas. Resulta logico pensar que se pueden implementar nuevas medidas de control de malas hierbas basadas en combinaciones de herbicidas auxmicos fenoxi y graminicidas de AOPP en el mafz (o en otros cultivos transformados con AAD-1) que hasta ahora no eran posibles con un solo gen HTC.
8.3.2 - Tolerancia de plantas de maiz Tn (pDAB3403) al herbicida quizalofop.
Un conjunto de aproximadamente ocho clones T0 de 17 eventos distintos se regenero y se transfirio al invernadero para someterlos a una seleccion preliminar por tolerancia con una dosis discriminadora de quizalofop aplicada en postemergencia. El tratamiento se aplico con un pulverizador de carril a 35 g e.a./ha (1* dosis de campo, 4* dosis letal) a las plantas de mafz T0 con 3 hojas adaptadas al invernadero, con las condiciones del pulverizador de carril antes descritas. Las plantas se calificaron como resistentes o sensibles 7 dfas despues del tratamiento. En cada aplicacion del herbicida se incluyo un mafz control no transgenico. Dos eventos, los eventos 014 y 047, presentaron dos o mas clones T0 sensibles a 35 g e.a./ha de quizalofop, lo cual indica un nivel inesperado de sensibilidad en tales eventos. Los 15 eventos restantes manifestaron una integracion estable, asf como una expresion estable de la protema y la capacidad para tolerar una concentracion 4* dosis letal de quizalofop en toda la planta.
8.3.3 Expresion del AAD-1 (v3) en terminos de tolerancia al quizalofop
Tres linajes T2 distintos extrafdos de 3404 transformaciones que habfan sido preseleccionadas con Liberty® (como previamente se ha descrito) para eliminar los nodulos se escogieron para comparar su tolerancia al quizalofop merced a la expresion del AAD-1 (v3). La expresion se midio a los 14 DAT (datos no mostrados) y a los 30 DAT (vease la Figura 15). La lmea con mayor tolerancia, el evento 3404-074, siempre expreso una cantidad mas elevada de AAD-1 (v3) que los otros dos eventos a dosis de campo 1 * y superiores. De estos datos se concluye que el mafz que expresa el AAD-1 (v3) puede quedar protegido de los danos causados por quizalofop en la dosis mas elevada analizada (2240 g/ha), que es 16 veces la 1* dosis de campo de 35 g/ha. Asimismo, el nivel de expresion resulto uniforme a lo largo de todo el experimento.
Ejemplo 9 - Transformacion de mafz con el AAD-1 (v3) mediante Agrobacterium
9.1 - Material vegetal
Semillas de un cruce F1 de “High II” (esto es, Progenitor A y B) (Armstrong et al., 1991) se plantaron directamente en macetas de 5 galones que conteman una mezcla de Metro-Mix® 360:suelo mineral 95:5. Las plantas se cultivaron en invernadero con un fotoperiodo de 16 horas complementado con una combinacion de lamparas de haluro metalico y sodio de alta presion.
9.2 - Fuente de tejido
Para obtener embriones Hi-II (F2) inmaduros, se llevaron a cabo polinizaciones controladas entre hermanas. El dfa de la polinizacion se embolsaron las parnculas que desprendfan polen recogiendo asf el polen fresco que despues se aplico cuidadosamente a los estigmas. Los embriones inmaduros se aislaron tal y como se describe en el Ejemplo 7.2.
9.3 - Preparacion de un vector superbinario
La construccion de un constructo de Agrobacterium, el pDAB2272, portador del gen AAD-1 (v3) y del gen marcador seleccionable AHAS se efectuo aislando el fragmento NotI de 3443 pares de bases del pDAB3404 portador de ZmUbi1 v2/AAD-1 (v3)/ZmPer5 v2 e insertandolo en el sitio NotI del pDAB8549. El plasmido resultante contiene las casetes ZmUbi1 v2/AAD-1 (v3)/ZmPer5 v2 y OsAct1 v2/AHAS v3/ZmLip v1 flanqueadas por regiones MAR no identicas en la orientacion directa. Este plasmido se transformo posteriormente en el LBA4404/pSB1 para crear un vector superbinario, que se denomino pDAB3602 y que tambien se designa como pDAS1421.
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9.4 - Fuente de bacterias
Todas las transformaciones se llevaron a cabo con el vector “superbinario” de Japan Tobacco descrito en la Pate nte U.S. N.° 5.591.616 (“Method for Transforming Monocotyledons”). Para preparar la suspension de Agrobacterium del tratamiento, 1-2 contenidos de asas con bacterias recombinantes pDAS142l, sembradas en estrfa en una placa con medio YP, se depositaron en 5 ml de medio LS-inf. Mod (Medio basal LS (Linsmaier y Skoog, 1965), vitaminas N6,
2,4-D 1,5 mg/l, sacarosa 68,5 g/l, glucosa 36,0 g/l, L-prolina 6 mM, pH 5,2). La mezcla se vorteo hasta conseguir una suspension uniforme. La concentracion bacteriana se determino con un fotocolorfmetro Klett-Summerson midiendo la densidad de la solucion. La solucion se ajusto a una concentracion de 200 unidades Klett (~1*109 ufc/ml) y se le anadio acetosiringona 100 pM.
9.5 - Infeccion y cocultivo
Los embriones inmaduros se afslan directamente en un tubo de microcentrffuga que contiene 2 ml de medio lfquido LS-inf. Mod. Cada tubo, que contiene ~100 embriones, se vortea durante 3-5 s. El medio se elimina y se sustituye con medio lfquido fresco y se repite el vorteo. El medio lfquido se descarta de nuevo y se sustituye por una solucion de Agrobacterium a la concentracion de 200 Klett. La mezcla de Agrobacterium y embriones se vortea durante 30 s. Despues de 5 minutos de incubacion a temperatura ambiente, los embriones se transfirieron a medio LS-As Mod (medio basal LS, vitaminas N6, 2,4-D 1,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l, L-prolina 6 mM, AgNO3 0,85 mg/l, acetosiringona 100 pM, Gelrite 3,0 g/l, pH 5,8) durante 5 dfas de cocultivo a 25°C.
9.6 - Estudios de dosis-respuesta con embriones inmaduros
Los estudios de dosis-respuesta se iniciaron con embriones inmaduros tratados con la cepa de Agrobacterium LBA4404 carente de un plasmido como se ha descrito antes. Una vez tratados, los embriones se cocultivaron durante 5 dfas a 25°C y a continuacion se transfirieron a medios de seleccion que contenfan diversos niveles de R- haloxifop o R-cihalofop. Los embriones tambien se transfirieron a medios que contenfan bialafos 1 mg/l e imazetapir 100 nM como controles negativos. Los embriones se evaluaron calculando el % de formacion de callos embriogenicos al cabo de 2 semanas y, de nuevo, a las 4 semanas. Los embriones se expusieron a niveles de R- haloxifop de hasta 30 nM, pero pese a ello se observo una reduccion insuficiente de la formacion de callos con los niveles mas elevados, por lo que en los experimentos de transformacion se opto por emplear concentraciones aun mas elevadas (50-100 nM). Los datos del crecimiento de los embriones en el medio con cihalofop se muestran en la Figura 17.
9.7 - Seleccion
Despues del cocultivo, los embriones fueron sometidos a un proceso de seleccion en dos etapas con el cual se obtuvieron los aislamientos transformados. Para la seleccion se empleo medio LSD Mod (medio basal LS, vitaminas N6, 2,4-D 1,5 mg/l, MES 0,5 g/l, sacarosa 30,0 g/l, L-prolina 6 mM, AgNO3 1,0 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,7) que se uso junto con uno o dos niveles de seleccion de haloxifop, cihalofop o imazetapir. Durante la fase de seleccion, los embriones se cultivaron a oscuras a 28°C. Los embriones fueron sometidos a una primer nivel de seleccion (R-haloxifop 50-100 nM o R-cihalofop 300 nM) durante 14 dfas, y despues a otro nivel superior (acido R- haloxifop 250-500 nM o cihalofop 1,5 pM) a razon de 5 embriones/placa. Una parte de los embriones tambien se expuso en dos pasos a imazetapir (100 y despues 500 nM) mediante el preparado Pursuit® DG como control positivo. Pursuit® se utiliza como agente de seleccion qufmico cuando se emplea el gen AHAS, segun la Patente U.S. N.° 5.731.180. El tejido se transfirio cada 15 dfas al mismo medio hasta obtener colonias embriogenicas. Estas colonias se mantuvieron sometidas a una elevada presion selectiva durante el resto del periodo de cultivo. Las colonias transgenicas recuperadas se hicieron recrecer transfiriendolas a medio de seleccion fresco cada quince dfas para su regeneracion y posterior analisis.
9.8 - Regeneracion y produccion de semillas
Para la regeneracion, los cultivos se transfirieron a medio de “induccion” 28 y medio de “regeneracion” 36 (citados previamente) que contenfan R-haloxifop 100 nM o cihalofop 1,5 pM para diferenciar las plantulas. Una vez establecidas las plantulas, se trasladaron a tubos con SHGA para permitir el crecimiento y el desarrollo de los brotes y las rafces tal y como se ha descrito antes. A continuacion se realizaron polinizaciones controladas para producir semillas del modo antes descrito.
9.9 - Recuperacion de eventos y detalles del analisis; Seleccion de plantas enteras de los linajes de mafz Tn portadores de los genes AAD-1 (v3) y AHAS (pDAS1421).
Setenta y dos eventos transformados con Agrobacterium se seleccionaron con varios niveles de acido R-haloxifop y acido R-cihalofop in vitro. Veintidos muestras de callo se analizaron con transferencia Southern para confirmar la integracion estable del AAD-1 (v3) en el genoma del modo previamente descrito. Diez eventos de copia unica, indicados en la Tabla 26, se escogieron para la regeneracion.
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Tabla 26.
Evento en mafz
Agente de seleccion in vitro N.° de copias por Southern (callo) Transferencia Western (AAD-1) Callo To Evaluacion de linajes To resistentes a 35 g e.a./ha de quizalofop
(nM) AAD-1 Resistante Sensible
1421T211-016
50 Haloxifop 1 + 8 0
1421[22]-020
100 Haloxifop 1 + + 8 0
1421[221-022
100 Haloxifop 1 + 8 0
1421[221-023
100 Haloxifop 1 + + 8 0
1421[31-036
100 Haloxifop 1 + + 8 0
1421 [41-031
300 Cihalofop 1 + + 9 0
1421 [41-032
300 Cihalofop 1 + + 8 0
1421 [4J-033
300 Cihalofop 1 + + 12 0
1421 [41-034
300 Cihalofop 1 + + 8 0
1421 [41-035
300 Cihalofop 1 + + 6 0
Los eventos con mas de 1 copia no se trasladaron al invernadero
Un mfnimo de seis linajes clonicos regenerados por evento se transplantaron al suelo en el invernadero y se seleccionaron con un pulverizador de carril del modo antes descrito aplicando 35 g e.a./ha de quizalofop cuando brotaron 2-4 hojas nuevas normales (vease el apartado 8.3.3). La presencia de la protefna AAD-1 en la transferencia Western concordo perfectamente con la resistencia al herbicida en la generacion T0, independientemente del herbicida AOPP empleado en la seleccion. El segundo gen de HTC (AHAS) no tuvo ninguna repercusion negativa sobre la funcion del gen AAD-1 (v3).
Ejemplo 10 - Purificacion de la AAD-1 (v1) para la creacion de anticuerpos y la caracterizacion bioqufmica
Todas las operaciones realizadas durante la purificacion se llevaron a cabo a 4°C. Celulas de E. coli congeladas o frescas procedentes de un cultivo de aproximadamente 1 litro, cultivadas y estimuladas como en el Ejemplo 3, se resuspendieron en 200 ml de tampon de extraccion que contenfa Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM y 2 ml de Cocktail inhibidor de proteasas (Sigma), y se disgregaron con sonicacion en hielo con un sonicador Branson. El extracto soluble se obtuvo por centrifugacion en una centrffuga GSA (Sorvall) a 12.000 rpm (24.000 g) durante 20 minutos. A continuacion, el sobrenadante se introdujo en una columna de intercambio ionico Mono Q (Pharmacia HR 10/10) equilibrada con Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, y la columna se lavo con el mismo tampon con 10 volumenes de columna (80 ml). La protefna se eluyo con 80 ml de un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,25 M en el tampon de la columna, recogiendose fracciones de 2 ml. Las fracciones que contenfan la AAD-1 (v1) se agruparon y se concentraron con columnas para centrffuga dotadas con una membrana MWCO de 30 kDa (Millipore). A continuacion, la muestra se separo con una columna de exclusion por tamano Superdex 200 (Pharmacia, XK 16/60) con tampon a base de Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M y DTT 1 mM, pH 8,0 y un caudal de 1 ml/min. Las fracciones purificadas se analizaron con SDS-PAGE y la concentracion de protefnas se determino con el ensayo de Bradford utilizando albumina de suero bovino como patron.
Ejemplo 11 - Purificacion de la AAD-1 recombinante y produccion de anticuerpos
El plasmido pDAB3203 portador del gen AAD-1 (v1) se mantuvo congelado a -80°C en celulas TOP10F' (Invitrogen) como cepa Dow Recombinant DR1878. Para la expresion, el ADN plasmfdico purificado del cultivo de celulas TOP10F' con el kit Wizard de Promega (Fisher, n.° catalogo PR-A1460) se transformo en celulas BL-21 Star (DE3) (Invitrogen, n.° catalogo C6010-03) siguiendo el protocolo del fabricante. Despues de la transformacion, 50 pl de las celulas se sembraron en placas de agar LB S/S y se incubaron hasta el dfa siguiente a 37°C. Todas las colonias de la placa de agar se recogieron y se introdujeron en un matraz de 500 ml dotado de tres placas deflectoras con 100 ml de LB y se incubaron a 37°C con una velocidad de agitacion de 200 rpm durante 1 h. Acto seguido, se indujo la expresion del gen con IPTG 1 mM, y se incubaron durante 4 h a 30°C con 200 rpm de agitacion. Los 100 ml de cultivo se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min. Tras descartar el sobrenadante, el sedimento se resuspendio en 200 ml de medio para extraccion que contenfa Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y 2 ml de Cocktail inhibidor de proteasas (Sigma), y se disgregaron con sonicacion en hielo con un sonicador Branson. El lisado se centrifugo a 24.000* g durante 20 min para eliminar los restos celulares. Por ultimo, el sobrenadante que contenfa la protefna AAD-1 se sometio a un protocolo de purificacion.
Las purificaciones de la AAD-1 (v1) se llevaron a cabo a 4°C, tal y como se comenta en el Ejemplo 10, a menos que se indique lo contrario. El lisado celular se deposito en una columna de intercambio ionico Mono Q (Pharmacia, n.° catalogo HR 10/10) equilibrada con Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, seguida de un lavado con 80 ml del mismo tampon. Las protefnas de eluyeron con 80 ml de un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,25 M en tampon de columna, recogiendose fracciones de 2 ml. Las fracciones que contenfan la AAD-1 se agruparon y concentraron con columnas para centrifugacion dotadas de una membrana MWCO de 30 kDa (Millipore). A continuacion, la muestra
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se separo con una columna de exclusion por tamano Superdex 200 (Pharmacia, XK 16/60) con tampon a base de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 0,15 M y DTT 1 mM. La concentracion de protemas se determino con el ensayo de Bradford utilizando la albumina de suero bovino como patron.
Cinco miligramos de AAD-1 (v1) purificada se remitieron a Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, California, EE.UU.) para iniciar la produccion de anticuerpos policlonales de conejo. El conejo recibio 5 inyecciones en el lapso de 5 semanas; cada inyeccion contema 0,5 mg de la protema purificada suspendidos en 1 ml de adyuvante incompleto de Freund. Los sueros se analizaron con ELlSA y transferencia Western para confirmar la especificidad y la afinidad antes de proceder a la purificacion por afinidad y la conjugacion con peroxidasa de rabano (HRP) (Zymed Lab Inc).
11.1 - Extraccion de la AAD-1 (v3) de las hojas de las plantas
Se cortaron aproximadamente entre 50 y 100 mg de tejido foliar en pequenos trozos y se depositaron en tubos de microcentnfuga que conteman 2 perlas de acero inoxidable (4,5 mm; Daisy Co., n.° catalogo 145462-000) y 300 pl de tampon de extraccion para plantas (PBS con Triton X-100 0,1% y DTT 10 mM). Los tubos se agitaron durante 4 min en un homogeneizador de tipo Bead beater a velocidad maxima y despues se centrifugaron durante 10 min a 5.000*g. El sobrenadante que contema las protemas solubles de la planta se analizo para determinar la protema soluble total (TSP) y las concentraciones de AaD-1 (v3).
11.2 - Ensayo de Bradford
La concentracion de protema soluble total extrafda del tejido foliar se determino con el ensayo de Bradford utilizando la albumina de suero bovino (BSA) como patron. Cinco microlitros de BSA diluida en serie en PBS o del extracto vegetal se transfirieron a una placa de microtitulacion de 96 pocillos con las muestras por triplicado. Las concentraciones de patron oscilaron entre 2000 y 15,6 pg/ml. El concentrado de protema a analizar se diluyo en primer lugar 5x en pBs, solucion de la que se anadieron 250 pl a cada pocillo, incubandose a temperatura ambiente durante 5 min. La densidad optica (D.O.) se midio a 595 nm con un lector de microplacas. La concentracion de protema de cada muestra se extrapolo a partir de la curva patron con el programa Softmax® Pro (version 4.0) (Molecular Devices).
11.3 - Enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA).
El ensayo se realizo a temperatura ambiente si no se indica lo contrario. Se tapizo una placa de microtitulacion de 96 pocillos con cien microlitros de anticuerpo anti-AAD-1 purificado (0,5 pg/ml) que permanecio en incubacion a 4°C durante 16 horas. La placa se lavo cuatro veces con tampon de lavado (solucion salina tamponada con fosfato 100 mM (PBS; pH 7,4) que contema Tween 20 al 0,05%) utilizando un lavador de placas, y despues se bloqueo con leche descremada al 4% disuelta en PBS durante 1 hora. Finalizado el lavado, se incubaron en los pocillos 100 pl de AAD-1 patron a concentraciones conocidas o de extracto vegetal (vease el apartado anterior). La curva patron se trazo con concentraciones de AAD-1 purificada comprendidas entre 100 y 1,6 ng/ml por triplicado. Los extractos vegetales se diluyeron 5, 10, 20 y 40x en PBS y se analizaron por duplicado. Al cabo de una hora de incubacion la placa se lavo del mismo modo indicado arriba. Cien microlitros de conjugado de anticuerpo anti-AAD-1 con HRP (0,25 pg/ml) se incubaron en cada pocillo durante 1 hora antes de eliminarlos por lavado. Cien microlitros de sustrato de HRP, 1-Step™ Ultra TMB-ELISA (Pierce), se incubaron en cada pocillo durante 10 minutos y despues la reaccion se detuvo anadiendo 100 pl de H2SO4 0,4 N. A continuacion se midio la D.O. de cada pocillo con un lector de microplaca a 450 nm. Para determinar las concentraciones de AAD-1 en el extracto vegetal, se promedio el valor de la D.O. de las muestras duplicadas y la concentracion se extrapolo a partir de la curva patron con el programa Softmax® Pro version 4.0 (Molecular Devices).
Para la comparacion, cada muestra se normalizo con su concentracion TSP y se calculo el porcentaje de expresion respecto a la TSP.
11.4 - Analisis por transferencia Western
Los extractos vegetales y los patrones de AAD-1 (5 y 0,5 pg/ml) se incubaron con tampon para muestra de Laemmli a 95°C durante 10 minutos y se separaron por electroforesis en un gel prefabricado de Tris-Glicina al 8-16%. A continuacion, las protemas se trasladaron por electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa con un protocolo ordinario. Tras bloquear la membrana con leche descremada al 4% disuelta en PBS, se procedio a detectar la protema AAD-1 con un antisuero anti-AAD-1 seguido por conjugados anti-conejo de cabra/HRP. La protema detectada se visualizo utilizando el sustrato quimioluminiscente ECL Western Analysis Reagent (Amersham, n.° catalogo RPN 21058).
Ejemplo 12 - Transformacion de tabaco
La transformacion de plantas de tabaco con Agrobacterium tumefaciens se llevo a cabo siguiendo un metodo similar, aunque no identico, a metodos publicados (Horsch et al., 1988). El tejido para la transformacion se obtuvo con el
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proceso siguiente: semillas de tabaco (Nicotians tabacum cv. Kentucky 160) con la superficie esterilizada se sembraron sobre medio TOB, un medio sin hormonas de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962) solidificado con agar. Las plantas se cultivaron durante 6-8 semanas en una sala de incubacion iluminada a 28-30°C y las hojas para el protocolo de transformacion se recogieron en condiciones esteriles. Se cortaron trozos de hoja de aproximadamente un centfmetro cuadrado en condiciones esteriles, descartando el nervio principal. Cultivos de una cepa de Agrobacterium (EHA101S, portadora del pDAB721, AAD-1 (v3) + PAT), se hicieron crecer durante un dfa en un matraz en agitacion a 250 rpm y a 28°C; despues se extrajo el sedimento por centrifugacion y se resuspendio en sales de Murashige y Skoog esteriles, ajustandose hasta obtener una densidad optica final de 0,5 a 600 nm. Los trozos de hoja se sumergieron en esta suspension bacteriana durante aproximadamente 30 segundos, despues se secaron con toallitas de papel esteriles y se depositaron cara arriba sobre medio TOB+ (medio de Murashige y Skoog con acido indolacetico 1 mg/l y benciladenina 2,5 mg/l) y se incubaron a oscuras a 28°C. Dos dfas despues los trozos de hoja se trasladaron a medio TOB+ con cefotaxima 250 mg/l (Agri-Bio, North Miami, Florida, EE.UU.) y glufosinato amonico 5 mg/l (materia activa de Basta, Bayer Crop Sciences) y se incubaron a 28-30°C con luz. El medio TOB+ con cefotaxima y Basta se renovo dos veces a la semana durante las dos primeras semanas y una vez a la semana a partir de entonces. Entre 4 y 6 semanas despues los trozos fueron tratados con las bacterias, y las plantas pequenas que brotaban de los focos transformados se sacaron de la preparacion y se plantaron en cajas Phytatray™ II (Sigma) llenas de medio TOB que contema cefotaxima 250 mg/l y Basta 10 mg/l. Estas plantulas se cultivaron en una sala de incubacion iluminada. Tres semanas despues, se cortaron pedazos de tallo que se replantaron en el mismo medio. Las plantas estuvieron listas para el traslado al invernadero al cabo de 2 o 3 semanas mas.
Una vez en el invernadero, el agar de las rafces se elimino lavandolas y se trasplantaron en tierra en macetas cuadradas de 13,75 cm. Las macetas se colocaron en una bolsa Ziploc® (Sc Johnson & Son, Inc.), por cuyo fondo circulaba agua corriente, permaneciendo bajo luz indirecta a 30°C durante una semana. Al cabo de 3-7 dfas, se abrio la bolsa, las plantas se fertilizaron y se dejaron crecer en la bolsa abierta hasta que se aclimataron al invernadero, momento en el que se retiro la bolsa. Las plantas se cultivaron en condiciones calidas ordinarias (30°C, 16 horas de dfa, 8 horas de oscuridad, mfnimo de luz natural + complementaria = 500 pE/mV).
Antes de la propagacion, las plantas T0 se muestrearon para analizar su ADN y determinar el numero de copias insertadas. Por conveniencia se analizo el gen PAT, que estaba ligado molecularmente al AAD-1 (v3). El tejido fresco se coloco en tubos y se liofilizo a 4°C durante 2 dfas. Una vez completamente seco el tejido, se coloco en el tubo una perla de tungsteno (Valenite) y las muestras se sometieron durante 1 minuto a molturacion en seco con un molino de perlas Kelco. Despues se procedio a aislar el ADN con DNeasy (Qiagen, DNeasy 69109). Una alfcuota del ADN extrafdo se tino con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyo en un fluorfmetro (BioTek) con patrones conocidos para obtener la concentracion en ng/pl.
Las muestras de ADN se diluyeron a 9 ng/pl, y despues se desnaturalizaron incubandolas en un termociclador a 95°C durante 10 minutos. A continuacion se preparo la mezcla Signal Probe utilizando la mezcla de oligonucleotidos proporcionada y MgCh (Third Wave Technologies). En los pocillos de una placa para ensayo Invader se depositaron alfcuotas de 7,5 pl y despues alfcuotas de 7,5 pl de los controles, patrones y de las muestras desconocidas diluidas a 20 ng/pl. Todos los pocillos se cubrieron con 15 pl de aceite mineral (Sigma). A continuacion, las placas se incubaron a 63°C durante 1,5 horas y se leyeron en un fluorfmetro (Biotek). El % de senal respecto al fondo de la sonda diana se dividio por el % de senal respecto al fondo de la sonda de control interna para calcular el cociente. El cociente de los patrones (cuyo numero de copias es conocido) desarrollados y validados con transferencia Southern, se uso para estimar el numero de copias de los eventos desconocidos (Tabla 27).
Tabla 27. Eventos To en plantas de tabaco transformadas con pDAB721 (AAD-1(v3) + PAT).
Evento
N.° copias PAT (Southern) Region codificante PCR de AAD-1 ELISA frig AAD-1 /ml extracto vegetal) Tolerancia relativa de To a pulverizacion con 2,4-D*
721(1)1
1 + 0.9 Media
721(2)1
nd nd 0.6 Media
721(2)2
5 + 0.3 Baja
721(2)3
3 + 2.6 Media
721(2)5
5 + 4.1 Variable
721(2)6
3 + 0.5 Variable
721(2)8
5 + 0.3 Alta
721(2)11
3 + n/a Alta
721(2)12
3 + 4.1 Media
721(2)13
2 + 0.5 Media
721(2)14
5 + 0.2 Alta
721(2)16
4 + .3.2 Media
721(2)17
3 + nd Alta
721(2)18
5 + nd Alta
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Tabla 27. Eventos To en plantas de tabaco transformadas con pDAB721 (AAD-1(v3) + PAT).
Evento
N.° copias PAT (Southern) Region codificante PCR de AAD-1 ELISA frig AAD-1 /ml extracto vegetal) Tolerancia relativa de To a pulverizacion con 2,4-D*
721(2)19
>10 + nd Baja
721(2)20
5 + nd Media
721(2)21
4 + nd Alta
721(2)22
7 + nd Media
721(2)23
>10 + nd Variable
721(3)003
3 + nd Variable
721(3)008
2 + nd Alta
721(3)012
1 + nd Alta
721(3)4
2 + 0.5 Alta
721(3)5
9 + 3.3 Alta
721(3)6
4 + 7.1 Variable
721(3)9
2 + 1 Baja
721(3)10
3 + 0.6 Alta
721(3)11
7 + 6 Baja
721(3)13
4 + 0.1 Alta
721(3)014
2 + 0.1 Media
nd = no realizado Leyenda: Tolerancia relativa* Dano a 3200 g e.a./ha de 2,4-D (14 DAT) Baja Dano >50% Media Dano 20-50% Alta Dano <20% Variable Contradictorio
Las estimaciones del numero de copias fueron confirmadas analizando varios eventos con transferencia Southern. El analisis por transferencia Southern se efectuo con el ADN total obtenido con el kit DNeasy de Qiagen. Un total de 2 pg de aDn se sometieron a una digestion hasta el dfa siguiente con Nsil y con Hindlll para el pDAB721 a fin de obtener los datos de integracion. Despues de la digestion se proceso una alfcuota de ~100 ng en un gel al 1% para comprobar que la digestion era completa. Despues de esta comprobacion, las muestras se procesaron con el mismo protocolo indicado en el Ejemplo 6, apartado 11.
Todos los eventos se analizaron asimismo con PCR para determinar la presencia del gen AAD-1 (v3) utilizando las mismas muestras de ADN extrafdo. Como molde se utilizo un total de 100 ng de ADN total. Se usaron 20 mM de cada cebador con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase kit (Mirus TAKRR001A). Los cebadores utilizados para la PCR de la region codificante del AAD-1 fueron: (RdpAcodF ATGGCTCA TGCTGCCCTCAGCC) (SEC ID n° 27) y (RdpAcodR CGGGCAGGCCTAACTCCACC AA) (SEC ID n° 28). La reaccion de PCR se llevo a cabo con un termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 64°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos seguidos por 72°C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se analizaron con electroforesis en gel de agarosa al 1% y tincion con EtBr. Entre 4 y 12 linajes clonales de cada uno de los 30 eventos positivos en la PCR se generaron y se trasladaron al invernadero.
Plantas representativas de 19 eventos (a razon de una planta por evento) se analizaron para determinar la expresion de la AAD-1 (v3) con los metodos ELISA descritos previamente. Todos los eventos analizados manifestaron niveles detectables de la AAD-1 (v3) (Tabla 27). La expresion de la protefna resulto variable en los diferentes eventos.
Plantas T0 de los 30 eventos fueron expuestas a un amplio rango de dosis de 2,4-D aplicadas cuando tenfan 3-4 pulgadas de altura. Las pulverizaciones se hicieron del modo antes descrito con un pulverizador de carril a un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. A clones representativos de cada evento se les aplico la sal dimetilamina de
2,4-D (Riverside Corp) a 0, 50, 200, 800 o 3200 g e.a./ha mezclada con agua desionizada. Cada tratamiento se repitio 1-3 veces. Las evaluaciones de los danos se efectuaron a los 3 y 14 DAT. Todos los eventos analizados resultaron mas tolerantes al 2,4-D que la lfnea de control sin transformar KY160. En varios eventos se produjo cierta epinastia inicial provocada por el herbicida auxfnico con la dosis de 800 g e.a./ha y con dosis inferiores a esta. Algunos eventos no sufrieron danos con esta dosis (equivalente a 1,5* la dosis de campo). Todos los eventos manifestaron a los 3 DAT algun grado de dano auxfnico temporal tras ser tratados con 3200 g e.a./ha. Con esta elevada dosis tambien se observaron algunas quemaduras foliares debido a la acidez de la solucion pulverizada. En los ensayos sucesivos las soluciones que contenfan dosis elevadas de 2,4-D se tamponaron. La respuesta de las plantas T0 tratadas con 3200 g e.a./ha de 2,4-D (~6x la dosis de campo) se empleo para clasificar la tolerancia relativa de cada evento como “baja” (dano >50% a los 14 DAT), “media” (dano 20-50%), “alta” (dano <20%). Algunos eventos manifestaron una respuesta desigual en las replicas del tratamiento y se consideraron “variables” (Tabla 27).
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Verificacion de la alta tolerancia al 2,4-D
De cada uno de los eventos que sobrevivieron a las dosis elevadas de 2,4-D se reservaron entre dos y cuatro individuos T0 que se dejaron autofecundar en el invernadero para engendrar las semillas Ti. De la generacion T0 se escogieron dos lfneas de tabaco portadoras del AAD-1 (v3) (eventos 721(2)-013.010 y 721(3)-008.005). Las semillas Ti se estratificaron y se sembraron en bandejas de seleccion muy similares a las de Arabidopsis (Ejemplo 6.4); despues se eliminaron selectivamente los nulos no transformados de esta poblacion segregante con 280 g m.a./ha de glufosinato (seleccion por PAT). Las supervivientes se trasplantaron a macetas individuales de 3 pulgadas en el invernadero. Estas lfneas habfan manifestado niveles medios y altos de resistencia al 2,4-D en la generacion T0. En las plantas T1 que no proceden directamente del tejido cultivado cabe esperar una respuesta mas coherente. Estas plantas se compararon con tabaco KY 160 natural. Todas las plantas fueron tratadas con un pulverizador de carril a 187 l/ha, con el que recibieron un rango de 70-4480 g e.a./ha de 2,4-D sal dimetilamina (DMA), R-diclorprop, y una mezcla 50/50 de ambos herbicidas. Todas las aplicaciones se formularon con tampon Hepes 200 mM (pH 7,5). Cada tratamiento se repitio 4 veces. Las plantas se evaluaron 3 y 14 dfas despues del tratamiento, asignandolas una puntuacion de danos si presentaban enanismo, clorosis o necrosis. La generacion T1 esta segregando, de modo que cabe esperar una respuesta variable debido a la diferencia en cigosidad (Tabla 28). No se observaron danos con las dosis inferiores a 1x la dosis de campo (560 g e.a./ha) de 2,4-D y de R-diclorprop en ningun evento. Los danos observados con dosis de hasta 8x la dosis de campo (4480 g de e.a./ha) resultaron fnfimos, en forma de enanismo, sin que hubiera danos por el herbicida auxfnico. Estos resultados indican que el AAD-1 (v3) puede conferir un grado de tolerancia comercial, incluso a una dicotiledonea tan sensible a las auxinas como el tabaco. Estos resultados tambien demuestran que es posible conferir resistencia contra los herbicidas auxfnicos fenoxi quirales (acido 2,4- diclorofenoxipropionico) y aquirales (acido 2,4-diclorofenoxiacetico), tanto solos como combinados en mezcla de tanque.
Tabla 28. Respuesta de plantas de tabaco T1 segregantes para AAD-1 a herbicidas auxfnicos fenoxi.
KY160- natural 721(2)013.010 (tolerancia media en la generacion To) 721(3)008.005 (tolerancia alta en la generacion T0)
Herbicida
Dano % medio de las replicas a los 14 DAT
560 g e.a./ha 2,4-D DMA
75 5 0
1120 g e.a./ha 2,4-D DMA
80 5 2
2240 g e.a./ha 2,4-D DMA
90 5 0
4480 g e.a./ha 2,4-D DMA
95 5 5
560 g e.a./ha R-diclorprop
70 5 0
1120 g e.a./ha R-diclorprop
75 5 0
2240 g e.a./ha R-diclorprop
88 5 0
4480 g e.a./ha R-diclorprop
95 10 5
560 g e.a./ha 2,4-D DMA/R-diclorprop
80 5 5
1120 g e.a./ha 2,4-D DMA/R-diclorprop
80 10 10
2240 g e.a./ha 2,4-D DMA/R-diclorprop
95 15 15
4480 g e.a./ha 2,4-D DMA/R-diclorprop
95 15 15
Tambien se llevo a cabo una prueba con 100 plantas de la progenie de cada una de las dos lfneas AAD-1 (v3) (eventos 721(2)-013.010 y 721(3)-008.005). Las semillas se estratificaron, sembraron y trasplantaron con el mismo procedimiento indicado, con la salvedad de que las plantas nulas no fueron eliminadas por seleccion con Liberty. Todas fueron pulverizadas con 560 g e.a./ha de 2,4-D DMA del modo antes descrito. Al cabo de 14 DAT, se contabilizaron las plantas resistentes y sensibles. Ambos eventos, '013' y '008', segregaron como un caracter mendeliano dominante (3R:1S) segun determino el analisis de la ji al cuadrado. La AAD-1 se hereda como un gen de resistencia a herbicidas auxfnicos fenoxi en muchas especies.
La tolerancia en el campo quedo demostrada plantando semillas T1 o T2 en el invernadero, eliminando selectivamente las plantas nulas con Liberty del modo descrito, y cultivando las plantulas en bandejas de trasplante de 72 alveolos (Hummert International) con medio Metro 360 en las condiciones de cultivo indicadas arriba. Las plantas se trasplantaron en parcelas en el campo con una plantadora industrial de hortalizas. Para mantener el crecimiento vigoroso de las plantas se utilizo riego por goteo o aspersion. Una vez alcanzaron 6-12 pulgadas de altura, las plantas de tabaco se pulverizaron con una amplia gama de herbicidas auxfnicos fenoxi y se evaluaron como se muestra arriba. Los factores de estres ambiental son mas acusados en las condiciones de campo, pero a tenor de la experiencia con el mafz transformado con AAD-1 (v3), cabe esperar una solida transferencia de la resistencia del invernadero al campo.
Ejemplo 13 - Transformacion de soja
Las tecnicas de transferencia genica han sido utilizadas con exito para mejorar la soja mediante la introduccion de caracteres como la tolerancia a herbicidas (Padgette et al., 1995), la modificacion de aminoacidos (Falco et al.,
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1995) y la resistencia a insectos (Parrott et al., 1994). La introduccion de caracteres foraneos en especies cultivadas requiere metodos que permitan la produccion rutinaria de lineas transgenicas con secuencias marcadoras seleccionables, que contienen insertos sencillos. Los transgenes deberfan heredarse en forma de un solo locus funcional para simplificar la mejora genetica. Se ha descrito la insercion de genes foraneos en soja cultivada mediante el bombardeo con microproyectiles de ejes embrionarios cigoticos (McCabe et al., 1988) o cultivos embriogenicos somaticos (Finer y McMullen, 1991), y la transformacion con Agrobacterium de explantes de cotiledon (Hinchee et al., 1988) o embriones cigoticos (Chee et al., 1989).
Las plantas transformadas con Agrobacterium suelen contener insertos sencillos con un bajo numero de copias (Birch, 1991). Los tres tejidos diana investigados para la transferencia de genes en la soja poseen ventajas y desventajas: ejes embrionarios cigoticos (Chee et al., 1989; McCabe et al., 1988), cotiledon (Hinchee et al., 1988) y cultivos embriogenicos somaticos (Finer y McMullen, 1991). Este ultimo ha sido objeto de extensas investigaciones como tejido diana para la transferencia directa de genes. Los cultivos embriogenicos suelen ser bastante prolfficos y son viables durante mucho tiempo. No obstante, se ha vinculado la esterilidad y las aberraciones cromosomicas sufridas por transformantes primarias a la edad de las suspensiones embriogenicas (Singh et al., 1998) y, por tanto, la iniciacion continua de nuevos cultivos parece ser necesaria para que los sistemas de transformacion de la soja puedan emplear este tejido. Este sistema requiere un elevado nivel de 2,4-D, una concentracion de 40 mg/l, para iniciar el callo embriogenico y ello plantea un problema fundamental para el uso del gen AAD-1 (v3), ya que el locus transformado podrfa no desarrollarse con 2,4-D en el medio. Asf pues, la transformacion del meristemo parece ser el metodo ideal para el desarrollo de plantas resistentes al 2,4-D con el AAD-1 (v3).
13.1 - Metodo de transformacion 1: transformacion del nudo cotiledonar de la soja con Agrobacterium tumefaciens
Las primeras descripciones de transformacion de la soja refirieron el uso como diana de celulas meristematicas de la region del nudo cotiledonar (Hinchee et al., 1988) y la multiplicacion de brotes a partir de los meristemos apicales (McCabe et al., 1988). En el metodo del nudo cotiledonar con A. tumefaciens, la preparacion del explante y la composicion de los medios de cultivo estimulan la proliferacion de meristemos auxiliares en el nudo (Hinchee et al., 1988). Todavfa no se sabe con certeza si tales tratamientos desencadenan la formacion de un callo realmente desdiferenciado, pero totipotente. La recuperacion de multiples clones de un evento de transformacion originado a partir de un solo explante y la infrecuente recuperacion de plantas quimericas (Clemente et al., 2000; Olhoft et al., 2003) apuntan a su origen en una sola celula, celula transgenica que se multiplica hasta engendrar bien un cultivo meristematico transgenico que prolifera, bien un brote uniformemente transformado que se multiplica en nuevos brotes. El metodo para la multiplicacion de brotes de soja, basado originalmente en el bombardeo con microproyectiles (McCabe et al., 1988) y, en fecha mas reciente, adaptado a la transformacion con Agrobacterium (Martinell et al., 2002), no sufre aparentemente el mismo grado o tipo de desdiferenciacion que el metodo del nudo cotiledonar, porque el sistema esta basado en la identificacion de quimeras en la lfnea germinal. El rango de genotipos que se estan logrando transformar con el metodo del nudo cotiledonar con Agrobacterium crece sin cesar (Olhoft y Somers, 2001). Este metodo basado en la formacion de meristemo de novo y la multiplicacion de brotes esta menos limitado a genotipos especfficos. Ademas, se trata de un protocolo que no esta basado en el 2,4-D, lo que resulta ideal para un sistema de seleccion con este herbicida. Por consiguiente, el metodo del nudo cotiledonar podrfa ser el metodo de eleccion para el desarrollo de cultivares de soja resistentes al 2,4-D. Aunque la descripcion de este metodo se remonta a 1988 (Hinchee et al., 1988), solo en fecha muy reciente se ha podido refinar para conseguir de forma rutinaria la transformacion con alta frecuencia de varios genotipos de soja (Zhang et al., 1999; Zeng et al., 2004).
13.1.1 - Preparacion de Agrobacterium.
El plasmido, pDAB721, contiene el gen AAD-1 (v3) bajo el control del promotor Ubi10 de Arabidopsis. Este plasmido tambien contiene el gen PAT, controlado con el promotor de la actina del arroz, el cual codifica una enzima que degrada el glufosinato y que puede ser utilizado como agente de seleccion para las transformantes. Este vector puede ser utilizado en el experimento de transformacion descrito a continuacion. El constructo pDAB721 se introdujo en la cepa de Agrobacterium EHA101S mediante electroporacion.
Los cultivos de Agrobacterium portadores del pDAB721 destinados a las transformaciones se pueden cultivar en medio YEP (peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l y NaCl 5 g/l, pH 7,0). Los cultivos de Agrobacterium se precipitan a baja velocidad y se resuspenden en medio lfquido SCM (vease abajo) hasta obtener una D.O.660 de 0,6 antes de proceder a la inoculacion.
13.1.2 - T ransformacion de la planta.
Semillas de “Thorne,” “WiNiams82” y “NE3001”, genotipos publicos de soja, se pueden desinfectar con un lavado de 20 minutos en lejfa comercial (NaClO) al 20% (v/v) a la que se anaden 2 gotas de Liqui-Nox®. Las semillas deben enjuagarse cinco veces con agua esteril y sembrarse en medio sin hormonas SHGA, dejandolas germinar durante 5 dfas a 24°C con un fotoperiodo de 18/6 horas de luz/oscuridad. El medio B5 contiene macro y micronutrientes y vitaminas y esta descrito por Gamborg et al. (1968) (Sigma, n.° catalogo G 5893, St. Louis). Todos los medios se solidifican con agar lavado al 0,8% (p/v) (Sigma, n.° catalogo A 8678). Como alternativa, ciertos genotipos de soja
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pueden ser sometidos a un procedimiento de esterilizacion superficial en seco con gas cloro (CI2) en que las semillas maduras se depositan en placas de Petri de 100 * 25 mm formando una monocapa, a razon de unas 130 semillas por placa. Se colocan 3 o 4 placas en un desecador con una campana extractora de gases, de tal forma que las placas queden medio abiertas y que haya espacio suficiente para colocar un vaso de precipitados de 250 ml en medio del desecador. El vaso de precipitados se llena con 95 ml de lejfa comercial, a los que se anaden gota a gota 5 ml de HCl concentrado (12N) dejandolos resbalar por el costado del vaso. El desecador se cierra inmediatamente y se deja durante al menos 16 horas en la campana extractora. Acabada la esterilizacion, las placas se cierran y se depositan en una cabina de flujo laminar donde se dejan abiertas durante unos 30 minutos para eliminar el gas Ch sobrante. A continuacion las semillas se hacen germinar del modo descrito anteriormente. Las semillas esterilizadas en seco permanecen esteriles a temperatura ambiente durante unas 2 semanas. Los explantes para la inoculacion se preparan de un modo antes descrito (Hinchee et al., 1988).
Los explantes deben inocularse durante 30 minutos. El medio de cocultivo y de resuspension de Agrobacterium consiste en medio B5 complementado con BAP 1 mg/l, GA3 1 mg/l, sacarosa 3% (p/v), MES (acido 2-[N- morfolinojetanosulfonico) 20 mM, L-cistefna 400 mg/l (Olhoft y Somers, 2001) pH 5,7, ditiotreitol (DTT) 0,99 mM y acetosiringona (AS) 200 pM. Los explantes se cocultivan durante 5 dfas a 25°C. Tras el cocultivo, los explantes se lavan con el medio de cocultivo que contiene timentin 100 mg/l y cefotaxima 200 mg/l, sin MES ni AS.
A continuacion, los explantes deben colocarse en un medio inductor de brotes y transferirse cada 14 dfas durante un total de 28 dfas antes de la seleccion con herbicida. El medio inductor de brotes consiste en medio B5 sin diluir complementado con BAP 1,7 mg/l, timentin 100 mg/l, cefotaxima 200 mg/l pH 5,7 y sacarosa 3% (p/v). Los cotiledones deben colocarse con su lado adaxial hacia arriba y la region del nudo cotiledonar a ras con el medio, y ser expuestos a niveles crecientes de Basta (2, 5, 6 y por ultimo 7 mg/l de glufosinato amonico) o a niveles subletales de 2,4-D comprendidos entre 10 mg y 400 mg/l cada 2 semanas durante un total de 8 semanas.
Los explantes diferenciados se trasfieren entonces a un medio de elongacion de brotes durante 4 a 10 semanas mas, donde permanecen expuestos a la misma seleccion con glufosinato o bajo una menor presion selectiva con
2,4-D, en concentraciones de 10 mg a 100 mg/l. El medio de elongacion consiste en medio B5 (Sigma, n.° catalogo M0404) con ribosido de zeatina 1 mg/l, IAA (acido indol-3-acetico) 0,1 mg/l, GA3 0,5 mg/l, glutamina 50 mg/l, asparragina 50 mg/l, y sacarosa 3 % (p/v), pH 5,8. Los brotes elongados se hacen enraizar, sin ninguna otra seleccion, en medio MS diluido a la mitad/vitaminas B5 sin diluir, mas NAA (acido a-naftalenacetico) 0,5 mg/l o IAA 0,1 mg/l y sacarosa 2% (p/v).
Los antibioticos, timentin y cefotaxima, se mantienen presentes en los medios durante toda la seleccion. El medio de los cultivos se renueva cada 2 semanas. Las plantulas se aclimatan durante 1 o 2 semanas antes del traslado al invernadero.
13.1.3 - Evaluacion de la progenie.
Plantas T0 se dejan autofecundar en el invernadero para engendrar las semillas T1. Las plantas T1 (y en la medida en que se disponga de suficientes clones, tambien las plantas T0) son pulverizadas con diferentes dosis de herbicida para determinar el nivel de proteccion frente al mismo proporcionado por los genes AAD-1 (v3) y PAT en la soja transgenica. Las dosis de 2,4-D aplicadas a las plantas T0 consisten normalmente en una o dos dosis selectivas del orden de 100 a 400 g e.a./ha. Por su parte, las semillas T1 reciben dosis de herbicida mas amplias, comprendidas entre 50-3200 g e.a./ha de 2,4-D. De igual forma, las plantas T0 y T1 se pueden seleccionar por su resistencia al glufosinato mediante un tratamiento en postemergencia con 200-800 y 50-3200 g e.a./ha de este herbicida, respectivamente. El analisis de la expresion de la protefna se efectua del modo descrito en el Ejemplo 9 para Arabidopsis y mafz. La herencia del AAD-1 (v3) se averigua analizando la segregacion en la progenie T1 y T2 de los caracteres de tolerancia a los herbicidas.
13.2 - Metodo de transformacion 2: transformacion con Agrobacterium “sin agitacion” de una suspension de celulas de soja no regenerables
Suspensiones de celulas de soja DAS se cultivaron en un tercer ciclo con 10 ml de volumen de suspension sedimentada transferidos a 115 ml de medio lfquido fresco. El volumen de celulas sedimentadas se determino dejando asentar la suspension celular durante 2 min en un matraz de 125 ml tras una agitacion energica y extrayendo las celulas del fondo del mismo con una micropipeta de 10 ml con punta ancha. Despues, los matraces se colocaron en agitadores orbitales a 140 rpm.
Alfcuotas de 4 ml de celulas en suspension a una D.O.600 de 0,72 se transfirieron junto con acetosiringona (AS) 200 pM a una placa de Petri esteril de 100*25. Despues, se anadieron 100 pl de una suspension de Agrobacterium EHA105 con una densidad a D.O.650 de 1,2 y se mezclo bien. La placa con la mezcla de Agrobacterium y de celulas en suspension se agito bien con movimientos circulares y se deposito en una camara oscura de crecimiento a una temperatura constante de 25°C.
13.2.1 - Seleccion de las celulas de soja en suspension y aislamiento de las colonias transformadas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Al cabo de 4 dfas de cocultivo la placa se volvio a agitar para mezclar la suspension y se transfirio una alfcuota de 1,5 ml al medio de seleccion que a continuacion se esparcio sobre medio gelificado en una placa de Petri de 100*15 ml. El medio de seleccion consistfa en medio B5 sin disolver complementado con BAP 1,7 mg/l, timentin 100 mg/l, cefotaxima 200 mg/l pH 5,7 y sacarosa al 3% (p/v), anadiendosele ademas glufosinato amonico en una concentracion de 5 mg/l. Tras permanecer 10 min en la campana extractora para el secado, las placas se incubaron durante 4 semanas a oscuras y a 28°C. Las colonias seleccionadas crecieron y once de ellas se transfirieron a medio fresco para 3 experimentos distintos y se mantuvieron durante 3-4 meses. Las 11 colonias resistentes escogidas produjeron callos que crecieron en el medio de seleccion con glufosinato 5 mg/l. Las celulas en suspension sin transformar resultaron sensibles a la siembra en medio con glufosinato amonico 0,5 mg/l. En cambio, las colonias transformadas resistieron una concentracion 5* de glufosinato amonico y se mantuvieron hasta 4 meses.
Los eventos de callo se muestrearon para los analisis cuando alcanzaron entre 2 y 3 cm de diametro. Al menos dos colonias aisladas en dos experimentos distintos fueron analizadas para determinar la expresion de la protefna AAD- 1. Los analisis con ELISA y Western de ambos aislamientos arrojaron un resultado positivo para la expresion de protefnas AAD-1. Los analisis con ELISA (Tabla 29) y con transferencia Western (Figura 18) de los dos callos de soja independientes transformados con el gen AAD-1 (v3) indicaron que las celulas del callo estaban expresando la protefna AAD-1 (v3). El ELISA en sandwich detecto un 0,0318% y un 0,0102% de AAD-1 (v3) en la protefna soluble total extrafda de dos muestras de tejido de callo. Debido a la sensibilidad y la reactividad cruzada del antisuero, en la transferencia Western se observaron bandas multiples. Pese a ello, en ambas muestras de callo se observo la banda especffica de la AAD-1 (v3), a diferencia del tejido natural (negativo) donde no estaba presente. Los analisis por PCR de la region codificante demostraron la presencia de productos del tamano esperado de las regiones codificantes de AAD1 y PAT en estas colonias, lo cual indica que habfan sido transformadas.
Tabla 29. Datos de PCR y ELISA de los eventos transgenicos de soja.
Evento
PCR de la region codificante de AAD-1 PCR de la region codificante de PAT TSP (Hg/ml) AAD-1 (ng/ml) % Expression
1-1
+ + 1995,13 633,89 0,0318%
2-1
+ + 2018,91 205,92 0,0102%
Control negativo
- - 2074,63 -1,22 -0,0001%
13.3 - Metodo de transformacion 3: Transformacion con chorro de aerosol de callo embriogenico de soja
El cultivo de callo embriogenico de soja y el proceso de exposicion al chorro de aerosol se describen en la patente U.S. N.° 6.809.232 (Held et al.).
Callos embriogenicos de varias variedades de elite Stine, 96E750, 96E94, 97E986, 96E144 y 96E692 inclufdo, entre otras se recogieron por separado en el centro de placas de B1-30 3Co5My o B1-30 3Co5My0.25PA0.5K tres dfas despues de haber sido trasladadas a medio fresco. A continuacion, el tejido se pulverizo con pDAB3295 utilizando ADN linealizado a una concentracion aproximada de 0,2 pg/ml. Despues de la pulverizacion del aerosol, el callo embriogenico se transfirio a B1-30 3Co5My o B1-30 3Co5My0.25PA0.5K frescos para un pase de un mes. El tejido se transfirio seguidamente a un medio selectivo que contenfa bialafos 1 mg/l. Durante la seleccion, el bialafos se mantuvo normalmente a 1 mg/l durante los dos primeros pases de un mes y despues se aumento a 2 mg/l durante los tres a siete meses siguientes. Los eventos transgenicos se identificaron cuando el tejido de callo generado por los experimentos de transformacion comenzo a organizarse y a generar estructuras embriogenicas mientras todavfa permanecfa en medio selectivo con 2,4-D mas bialafos. Una vez identificadas, las estructuras en maduracion se regeneraron en plantas siguiendo el protocolo siguiente: las estructuras embriogenicas se trasladaron de B1-30 3Co5My o B1-30 3/co5My0.25PA0.5K a medio B3. Al cabo de 3 o 4 semanas de crecimiento en medio B3, las estructuras individuales se transfirieron a medio fresco. Transcurridas otras 3 o 4 semanas, los embriones maduros se transfirieron a medio B5G y se expusieron a la luz. Los embriones que se alargaron y produjeron rafces se transfirieron a tubos con medio 1/2 B5G donde prosiguieron su desarrollo en plantulas; por ultimo, estas se sacaron de los tubos y se plantaron en macetas.
Se probaron algunas variantes de los medios citados en la Tabla 30, p. ej., B1-30 3Co5My, elaborado con agua de coco al 3% y mioinositol 5 g/l anadidos a B1-30. Otras variantes incluyeron: B1-30 3Co5My0.25 PA0.5K, que contenfa medio basal B1-30 mas agua de coco al 3%, mioinositol 5 g/l, acido fftico 0,25 g/l y KH2PO4 adicional 0,5 g/l; y 1/2 B5G, que contenfa todos los ingredientes del medio B5G diluidos a la mitad.
Tabla 30. Medios de crecimiento para soja
Ingredientes por litro
Bl-30
B3 B5G
Sales Ms
4,43 g 4,43 g
Sales B5
3,19g
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 30. Medios de crecimiento para soja
Ingredientes por litro
Bl-30
B3 B5G
NaEDTA
37,3 mq 37,3 mq 37,3 mq
2,4-D
30 mq
Carbon activado
5q
Phytaqar
8q 8q
Gelrite
2q
PH
5,8 5,8 5,8
Ejemplo 14 - Introduccion del AAD-1 (v3) en algodon
14.1 - Protocolo de transformacion del alqodon
Semillas de alqodon (qenotipo Co310) se sumerqen en etanol al 95% durante 1 minuto para esterilizar su superficie, se lavan, se esterilizan con lejfa comercial al 50% durante veinte minutos, y despues se lavan 3 veces con aqua destilada esteril antes de dejarlas qerminar en medio G (vease Tabla 31) en cajas Maqenta GA-7 expuestas a una alta intensidad lumfnica, 40-60 pE/m2, con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 28°C.
Seqmentos cuadrados de cotiledon (~5 mm) se extrajeron de plantulas de 7-10 dfas de edad y se depositaron en placas de Petri con medio lfquido M (vease Tabla 31) (Nunc, n.° artfculo 0875728). Los seqmentos cortados se trataron con una solucion de Agrobacterium durante 30 minutos y despues se transfirieron a medio M semisolido (Tabla 31), permaneciendo en cocultivo durante 2-3 dfas. Al termino de este, los seqmentos se transfirieron a medio MG (Tabla 31). La carbenicilina es el antibiotico utilizado para matar a Agrobacterium y el qlufosinato amonico es el aqente de seleccion que unicamente debe permitir el crecimiento de las celulas portadoras del qen transferido.
Preparacion de Agrobacterium.
Inocular 35 ml de medio Y (Tabla 31) (con estreptomicina (solucion madre de 100 mq/ml) y eritromicina (solucion madre 100 mq/ml)) con el contenido de un asa de bacterias dejadas crecer durante un dfa a oscuras y 28°C, en aqitacion a 150 rpm. El dfa siquiente, la solucion de Agrobacterium se vierte en un tubo de centrffuqa Oakridqe esteril (Nalqe-Nunc, 3139-0050), y se centrifuqa con un aparato Beckman J2-21 a 8.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se descarta, el sedimento se resuspende en 25 ml de lfquido M (Tabla 31) y se vortea. Una alfcuota del mismo se coloca en un tubo de cultivo de vidrio (Fisher, 14-961-27) para la lectura en un fotocolorfmetro (Klett- Summerson, modelo 800-3). La nueva suspension se diluye con medio lfquido M para proceder a la lectura en el fotocolorfmetro Klett de 108 ufc/ml con un volumen total de 40 ml.
Al cabo de tres semanas, el callo formado a partir de los seqmentos de cotiledon se afsla y se transfiere a medio MG fresco. El callo se transfiere a medio MG durante 3 semanas mas. A continuacion, se traslada a medio CG (Tabla 31) y se transfiere de nuevo a medio fresco de seleccion al cabo de tres semanas. Despues de otras tres semanas, el tejido de callo se transfiere a medio D (Tabla 31) carente de requladores del crecimiento veqetal para la induccion del callo embrioqenico. Tras 4-8 semanas en este medio, se forma el callo embrioqenico, que puede distinquirse del callo no embrioqenico por su color amarillento-blancuzco y las celulas qranulares. Los embriones comienzan a reqenerarse poco despues y presentan un distintivo color verde.
Los embriones mas qrandes y desarrollados se afslan y se transfieren a medio DK (Tabla 31) para completar el desarrollo embrionario. Tres semanas despues (o cuando los embriones hayan crecido), los embriones qerminados se transfieren a medio fresco para el desarrollo de brotes y rafces. Al cabo de 4-8 semanas, todas las plantas bien desarrolladas se trasplantan al suelo y se cultivan hasta que alcanzan la madurez. Al cabo de un par de meses, la planta ya ha crecido lo suficiente para ser pulverizada y determinar su resistencia al 2,4-D.
Tabla 31. Medios para la transformacion del algodon
Ingredientes por litro
G M liquido M MG CG D DK Y
Sales LS (5X)
200 ml 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml
Glucosa
30 q 30 q 30 q 30 q 20 q
vit B5 modificada(1000x)
1 ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10 ml 1 ml
Cinetina (1mM)
1ml 1ml 1 ml 4,6 ml 0,5ml
2,4-D (1mM)
1ml 1 ml 1ml
Agar
8g 8g 8 g 8 g 8 qs 8 g
Sales DKW (D190)
1 saquete 1 saquete
Mioinositol (100x)
1 ml 10 ml
Sacarosa 3%
30 q 30 q 10 qramos
NAA
Carbenicilina (250 mg/ml)
2 ml 0,4 ml
GLA (10mg/ml)
0,5 ml 0,3 ml
Peptona
10 q
Extracto de levadura
10 q
NaCI
5g_____________
14.2 - Pormenores del experimento
Para este experimento se trataron 500 segmentos de cotiledon con pDAB721. De los 500 segmentos tratados, 475 5 presentaron callos aislados durante la seleccion (frecuencia de transformacion del 95%). El callo se selecciono con glufosinato amonico, debido a la inclusion del gen PAT en el constructo, puesto que ya se habfa elaborado un esquema de seleccion. El analisis de la lfnea del callo mediante PCR e Invader permitio determinar los patrones de insercion y comprobar que el gen estuviera presente en el estadio de callo; las lfneas de callos que eran embriogenicas fueron sometidas a un analisis Western.
10
14.3 - Resultados del analisis de los callos
El analisis tenia por proposito descartar todas las lfneas que no contuvieran la PTU completa, no manifestaran expresion o tuvieran un alto numero de copias; tales lfneas no se regenerarfan. De las 475 lfneas de callos 15 transformados con pDAB721, 306 se sometieron al analisis PCR y al ensayo Invader (Tabla 32). Muy pocas lfneas arrojaron un resultado negativo en la PCR. Los resultados de Invader no estan listos todavfa fntegramente porque de algunas muestras no se pudo extraer suficiente ADN, y tuvieron que volver a enviarse. No obstante, los datos disponibles hasta ahora del ensayo Invader demuestran que pocas lfneas analizadas presentan un gran numero de copias (>2 copias) (Tabla 32). Debido al gran numero de lfneas que superaron el analisis, fue preciso reducir el 20 numero de lfneas de callos embriogenicos mantenidas por su excesivo volumen. Noventa lfneas se enviaron para el analisis con Western, y ocho de ellas resultaron negativas. Este analisis revelo una elevada expresion en la mayorfa de las lfneas (Tabla 32). A tenor de los resultados de estos analisis (y de los resultados pendientes) se estan manteniendo 82 lfneas de callos embriogenicos para la regeneracion de las plantas.
Tabla 32. Analisis de los callos de algodon
Lfnea
N.° de copias PTU Western Lfnea N.° de copias PTU Western
1
2 pos *** 43 1 pos *****
2
1 pos *** 44 ADN escaso pos *****
3
1 pos *** 45 1 pos *****
4
pos *** 46 2 pos *****
5
1 pos *** 47 1 pos ***
6
1 pos neg 48 1 pos ***
7
1 pos **** 49 3 pos. dudoso neg
8
1 pos ***** 50 1 pos ****
9
pos * 51 4 pos neg
10
1 pos * 52 2 pos ****
11
1 pos ***** 53 1 pos ***
12
1 pos * 54 1 pos ****
13
1 pos * 55 1 pos neg
14
1 pos ** 56 5 pos *
15
1 pos **** 57 2 pos. dudoso neg
16
1 pos ***** 58 8 pos ****
17
1 pos * 59 2 pos ****
18
1 pos *** 60 5 pos *****
19
1 pos ** 61 1 pos **
20
1 pos ***** 62 1 pos **
21
pos ***** 63 1 pos ***
22
1 pos ***** 64 1 pos ***
23
1 pos ***** 65 3 pos ****
24
pos * o neg 66 5 pos *
25
1 pos **** 67 6 pos *
26
1 pos **** 68 ADN escaso pos neg
27
ADN escaso pos ***** 69 ADN escaso pos ****
28
ADN escaso pos ** 70 ADN escaso pos **
29
ADN escaso pos ***** 71 ADN escaso pos. dudoso **
30
17 pos * 72 ADN escaso pos ****
31
ADN escaso pos ***** 73 ADN escaso neg ***
32
ADN escaso pos ***** 74 ADN escaso pos. dudoso ***
33
ADN escaso pos **** 75 ADN escaso pos ***
34
ADN escaso pos. dudoso ***** 76 ADN escaso pos neg
35
ADN escaso pos **** 77 ADN escaso pos. dudoso ****
36
ADN escaso pos neg 78 ADN escaso pos ****
37
ADN escaso pos **** 79 1 pos **
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tabla 32. Analisis de los callos de algodon
Lfnea
N.° de copias PTU Western Lfnea N.° de copias PTU Western
38
ADN escaso neg ***** 80 ADN escaso pos ***
39
1 pos **** 81 ADN escaso pos ***
40
ADN escaso pos * 82 ADN escaso pos ***
41
ADN escaso pos * 83 ADN escaso neg ****
42
ADN escaso pos ** 84 ADN escaso pos ***
Patron
AAD1 5pg/ml ***** 85 ADN escaso pos **
Patron
AAD1 0,5pg/ml ** 86 ADN escaso pos *
14.4 - Regeneracion de la planta
Dos lfneas de algodon portadoras del AAD-1 (v3) que produjeron plantas con arreglo al protocolo indicado se enviaron al invernadero. Para demostrar que el gen AAD-1 (v3) confiere al algodon resistencia frente al 2,4-D, plantas de algodon portadoras del AAD-1 (v3) y otras naturales fueron tratadas con un pulverizador de carril a 187 l/ha. Las plantas recibieron una dosis de 560 g e.a./ha de 2,4-DMA formulado en tampon Hepes 200 mM (pH 7,5) y fueron evaluadas 3, 7 y 14 dfas despues del tratamiento. Se les asigno una puntuacion de danos observando si presentaban enanismo, clorosis y necrosis. Las plantas que recibieron una puntuacion de dano igual o superior al 90% se consideraron muertas. Tres dfas despues del tratamiento (DAT) las plantas naturales comenzaron a mostrar epinastia y recibieron una puntuacion del 15%; en cambio, las plantas portadoras del AAD-1 (v3) manifestaron 0% de danos. A los 7 DAT, las plantas naturales segufan presentando epinastia y los brotes nuevos habfan comenzado a amarronarse; recibieron una puntuacion del 50%. A los 14 DAT, las plantas con AAD-1 (v3) segufan indemnes, mientras que las naturales presentaban un acusado enanismo, con las zonas de nuevo crecimiento marrones y marchitas, recibiendo una valoracion del 90% en esa fecha.
Este estudio demuestra que el gen AAD-1 (v3) confiere al algodon una notable tolerancia frente al 2,4-D aplicado en dosis de hasta 560 g e.a./ha.
Ejemplo 15 - Transformacion con Agrobacterium de otros cultivos
A la luz de la presente descripcion, es posible transformar otros cultivos con arreglo a la presente invencion por medio de tecnicas conocidas en la disciplina. Para la transformacion de centeno con Agrobacterium, vease p. ej., Popelka y Altpeter (2003). Para la transformacion de soja con Agrobacterium, vease p. ej., Hinchee et al., 1988. Para la transformacion de sorgo con Agrobacterium, vease p. ej., Zhao et al., 2000. Para la transformacion de cebada con Agrobacterium, vease p. ej., Tingay et al., 1997. Para la transformacion de trigo con Agrobacterium, vease p. ej., Cheng et al., 1997. Para la transformacion de arroz con Agrobacterium, vease p. ej., Hiei et al., 1997.
Los nombres cientfficos de esas y otras plantas se enumeran a continuacion. Debe quedar claro que es posible utilizar esas y otras tecnicas de transformacion (sin Agrobacterium) para llevar a cabo la transformacion del gen AAD-1 (v3), por ejemplo, en las plantas siguientes, entre otras: mafz (Gramineae, Zea mays), trigo (Pooideae, Triticum spp.), arroz (Gramineae, Oryza spp. y Zizania spp.), cebada (Pooideae, Hordeum spp.), algodon (Abroma Dicotyledoneae, Abroma augusta, y Malvaceae, Gossypium spp.), soja (Leguminosae, Glycine max), remolacha azucarera (Chenopodiaceae, Beta vulgaris altissima), cana de azucar (Arenga pinnata), tomate (Solanaceae, Lycopersicon esculentum y otras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum y otras spp., y Cyphomandra betacea), patata, batata, centeno (Pooideae, Secale spp.), pimientos (Solanaceae, Capsicum annuum, sinense y frutescens), lechuga (Compositae, Lactuca sativa, perennis y pulchella), col, apio (Umbelliferae Apium graveolens), berenjena (Solanaceae, Solanum melongena), sorgo (todas las especies de Sorghum), alfalfa (Leguminosae, Medicago sativum), zanahoria (Umbelliferae, Daucus carota sativa), judfas (Leguminosae, Phaseolus spp. y otros generos), avenas (Avena sativa y strigosa), guisantes (Leguminosae, Pisum, Vigna y Tetragonolobus spp.), girasol (Compositae, Helianthus annuus), calabaza (Dicotyledoneae, Cucurbita spp.), pepino (Dicotyledoneae genera), tabaco (Solanaceae, Nicotiana spp.), Arabidopsis (Cruciferae, Arabidopsis thaliana), cesped (Lolium, Agrostis y otras familias), y trebol (Leguminosae). Tales plantas, con genes AAD-1 (v3), por ejemplo, estan incluidas en la presente invencion.
Ejemplo 16 - Apilamiento del gen AAD-1 (v3) con el gen de resistencia a herbicidas AHAS
El apilamiento de AAD-1 (v3) con el gen de resistencia a herbicidas AHAS se describe en el Ejemplo 7.9.
Ejemplo 17 - Mas pruebas de resultados sorprendentes: AAD-1 vs. AAD-2
17.1 - Clonacion inicial del AAD-2 (v1)
En la base de datos de NCBI se identifico otro gen homologo (vease el sitio web ncbi.nlm.nih.gov; entrada n.° AP005940) que solo mantenfa una identidad de aminoacidos del 44% con el tfdA. Este gen se denomina en la presente memoria AAD-2 (v1) por coherencia. La identidad porcentual se determino traduciendo las secuencias de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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ADN del AAD-2 y del tfdA (SEC ID n° 12 y entrada GENBANK N.° M16730, respectivamente) a sus respectivas protefnas (SEC ID n° 13 y entrada GENBANK N.° M16730, respectivamente), y despues procediendo al alineamiento multiple de las secuencias por medio del programa ClustalW, incluido en el paquete de software Vector NTI.
La cepa de Bradyrhizobium japonicum portadora del gen AAD-2 (v1) se adquirio en el Northern Regional Research Laboratory (NRRL, cepa n.° B4450). La cepa liofilizada se revivio siguiendo el protocolo del NRRL y se conservo a -80°C en glicerol al 20% para uso interno como la cepa bacteriana Dow Bacterial DB 663. De esta solucion madre congelada, se sembro el contenido de celulas de un asa en una placa de agar triptona y soja para el aislamiento, incubandose a 28°C durante 3 dfas. Una sola colonia se sembro en 100 ml de caldo de triptona y soja contenidos en un matraz de 500 ml con tres placas deflectoras, que se incubo hasta el dfa siguiente a 28°C en un agitador de plataforma a 150 rpm. De este se aislo el ADN total con el protocolo para gramnegativas del kit DNeasy de Qiagen (Qiagen, n.° catalogo 69504). Para amplificar el gen diana a partir del ADN genomico se disenaron los siguientes cebadores: Directo: 5' ACT AGT AAC AAA GAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T 3' [(brjap 5'(speI) SEC ID n° 14 (anadidos una diana de restriccion para Spe I y un sitio de union a ribosoma (RBS))], e Inverso: 5' TTC TCG AGC TAT CAC TCC GCC GCC TGC TGC TGC 3' [(br jap 3' (xhol) SEC ID n° 15 (anadido una diana para Xho I)].
Reacciones de 50 microlitros se prepararon del modo siguiente: tampon Fail Safe Buffer 25 pl, cada cebador 1 pl (50 ng/pl), ADNg 1 pl (200 ng/pl), H2O 21 pl, polimerasa Taq 1 pl (2,5 unidades/pl). Tres tampones Fail Safe - A, B y C - se usaron en tres reacciones distintas. A continuacion, se llevo a cabo la pCr con las condiciones siguientes: ciclo de desnaturalizacion por calor a 95°C durante 3,0 minutos; 95°C durante 1,0 minuto, 50°C durante 1,0 minuto, 72°C durante 1,5 minutos, durante 30 ciclos; seguidos de un ciclo final de 72°C durante 5 minutos, utilizando el FailSafe PCR System (Epicenter, n.° catalogo FS99100). El producto resultante de la PCR de ~1 kb se clono en pCR 2.1 (Invitrogen, n.° catalogo K4550-40) siguiendo el protocolo incluido, utilizando como cepa hospedadora la E. coli TOP10F' qmmicamente competente, para verificar la secuencia de nucleotidos.
Diez de las colonias blancas surgidas se sembraron en 3 pl de caldo Luria + ampicilina 1000 pg/ml (LB Amp) y se dejaron crecer hasta el dfa siguiente a 37°C con agitacion. Los plasmidos de cada cultivo se purificaron con el kit Nucleospin Plus Plasmid Miniprep Kit (BD Biosciences, n.° catalogo K3063-2) siguiendo el protocolo incluido. El ADN aislado se sometio a una digestion con enzimas de restriccion para confirmar la presencia del producto de la PCR en el vector pCR2.1. El ADN plasmfdico se digirio con la enzima de restriccion EcoRI (New England Biolabs, n.° catalogo R0101S). La secuenciacion se llevo a cabo con el kit Beckman CEQ Quick Start (Beckman Coulter, n.° catalogo 608120) utilizando un cebador directo de M13 [5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'] (SEC ID n° 16) y otro inverso [5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3'] (SEC ID n° 17), segun las instrucciones del fabricante. Esta secuencia genica y su protefna correspondiente recibieron una nueva designacion general de AAD-2 (v1) para mantener la coherencia interna.
17.2 - Construccion del vector binario de AAD-2 (v1)
El gen AAD-2 (v1) se amplifico por PCR a partir del pDAB3202. Durante la reaccion de PCR se modificaron los cebadores para introducir dianas de restriccion para Afllll y SacI en el cebador 5' y en el cebador 3', respectivamente. Los cebadores “Ncol de Brady” [5' TAT ACC ACA TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGC TT 3'] (SEC ID n° 18) y “SacI de Brady” [5' GAG CTC CTA TCA CTC CGC CGC CTG CTG CTG CAC 3'] (SEC ID n° 19) se usaron para amplificar un fragmento de ADN por medio del sistema Fail Safe PCR System (Epicentre). El producto de la PCR se clono en el vector de clonacion pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) y la secuencia se verifico con los cebadores M13 directo e inverso utilizando los reactivos para secuenciacion del kit “Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit”, de Beckman Coulter. Los datos de la secuenciacion permitieron identificar un clon con la secuencia correcta (pDAB716). Seguidamente, el fragmento del gen AAD-2 (v1) AflIII/SacI se clono en el vector pDAB726 NcoI/SacI. El constructo resultante (pDAB717); promotor AtUbi10: Nt OSM 5'UTR: AAD-2 (v1): Nt OSM3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR se verifico con digestiones con enzimas de restriccion (con NcoI/SacI). Este constructo a su vez se clono en el pDAB3038 binario con un fragmento de ADN NotI-NotI. El constructo resultante (pDAB767); promotor AtUbi10: Nt OSM5'UTR: AAD-2 (v1): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor del CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR se digirio con enzimas de restriccion (NotI, EcoRI, HinDIII, NcoI, PvuII y SalI) para verificar la correcta orientacion. El constructo acabado (pDAB767) se empleo para la transformacion en Agrobacterium.
17.3 - Comparacion de las especificidades de sustrato de AAD-2 (v1) y AAD-1 (v1)
La actividad de un extracto de E. coli que expresaba la AAD-2 (v1) (pDAB3202) preparado como en el Ejemplo 11 se analizo con cuatro herbicidas, a saber, 2,4-D, (R,S)-diclorprop, (R,S)-haloxifop y (R)-haloxifop (todos en una concentracion final de 0,5 mM) utilizando 3 pl (42 pg) de extracto de E. coli por ensayo, con un perfodo de ensayo de 15 min. La Figura 22 muestra que la actividad relativa de la AAD-2 (v1) sobre los sustratos fue: 2,4-D = diclorprop > (R,S)-haloxifop >> (R)-haloxifop. Por tanto, la AAD-2 (v1) difiere de la AAD-1 (v1) en que posee un nivel similar de actividad sobre el 2,4-D y el diclorprop (mientras que la actividad de la AAD-1 (v1) sobre el 2,4-D es ~10% de la manifestada contra diclorprop). La AaD-2 (v1) tambien difiere de la AAD-1 (v1) en que es incapaz de actuar contra el (R)-haloxifop. La Tabla 33 contiene los datos de otros sustratos analizados con AAD-1 (v1) y AAD-2 (v1) que confirman que esta ultima es especffica para sustratos (S)-enantiomeros, a diferencia de la AAD-1 (v1), que lo es
para (R)-enantiomeros. En otra prueba la AAD-2 (v1) difirio de la AAD-1 (v1) en que se detectaron pequenas o nulas cantidades de fenoles derivados del 2,4-D sulfonato (en el que un grupo sulfonato sustituye al carboxilato del 2,4-D) mientras que la AAD-1 (v1) genera niveles significativos de fenoles a partir de este compuesto (~25% del 2,4-D).
Tabla 33. Comparacion de la actividad de AAD-1 y AAD-2 sobre varios sustratos. Los sustratos se analizaron a 0,5 mM durante 15 min en MOPS 25 mM pH 6,8, Fe2+ 200 pM, ascorbato sodico 200 pM, a-cetoglutarato 1 mM con 4 pl de extracto de AAD-1 (32 pg de protefna) o 3 pl de extracto de AAD-2 (42 pg de protefna).
A510
ESTRUCTURA
ID Reg Compuesto Enantiomero AAD1 AAD2
XXX ^Xu ^ OH
18706 quizalofop R 0,27 0,01
■ X
8671 haloxifop R 0,12 0
/OXJpV a
66905 haloxifop R,S 0,1 0,3
r
14623 cihalofop R,S 0,12 0,1
■ PH
14603 cihalofop R 0,14 0
Z OX
7466 cihalofop S 0 0,15
11044492 fenoxaprop R 0,14 0 0,22
43865 haloxifop- acetato - 0
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La cinetica enzimatica de las protefnas AAD-1 (v1) y AAD-2 (v1) parcialmente purificadas se comparo utilizando el
2,4-D como sustrato. Vease la Figura 19. Los valores Km correspondientes al 2,4-D ascendieron a 97 y 423 pM para la AAD-1 (v1) y la AAD-2 (v1) respectivamente, y los valores de la Vmax. aparente fueron de 0,11 y 0,86 unidades de A510, respectivamente (Tabla 34). Dado que en los analisis se utilizaron cantidades equivalentes de enzima 10 (determinadas por el analisis con SDS-PAGE), se puede concluir que la kcat de la AAD-2 (v1) con el 2,4-D es casi ocho veces mayor que la de la AAD-1 (v1), y que el kcat/Km es dos veces mayor. Por tanto, la AAD-2 (v1) es significativamente mas eficiente a la hora de degradar el 2,4-D in vitro que la AaD-1 (v1). Este hecho contrasta sorprendentemente con los resultados hallados in vivo en las plantas y que se describen a continuacion, en los cuales las plantas que expresaban la AAD-1 (v1) resultaron significativamente mas resistentes al 2,4-D que las 15 portadoras de AAD-2 (v1).
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Tabla 34. Comparacion de los valores Km y Vmax.correspondientes a las ariloxialcanoato dioxigenasas (AAD) de pDAB3202 (AaD-2) y pDAB3203 [AAD-1 (v1)] obtenidos con diferentes sustratos herbicidas:
Enzima
Compuesto Km (pM) ±SE Vmax (unidades de A510) Km/Vmax (unidades arbitrarias)
AAD-2
2,4-D 423 (±1) 0,86 2,03
AAD-1 (v1)
2,4-D 97 (±21) 0,11 1,16
Nota: los ensayos se realizaron en MOPS pH 6,75 + a-cetoglutarato 1 mM + ascorbato sodico 0,1 mM + Fe2+ 0,1 mM y los fenoles liberados se detectaron por colorimetrfa con 4-aminoantipirina/ferricianuro.
17.4 - Evaluacion de las plantas de Arabidopsis transformadas
Semillas T1 transformadas con un gen natural [AAD-1 (v2)], un gen optimizado para vegetales [AAD-1 (v3)] o un gen natural AAD-2 (v1) recien recogidas se dejaron secar por espacio de 7 dfas a temperatura ambiente. Despues se sembraron en bandejas de germinacion de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, Minnesota, EE.UU.), en cada una de las cuales se plantaron alfcuotas de 200 mg de semillas T1 estratificadas (~10.000 semillas) que previamente habfan sido suspendidas en 40 ml de solucion de agarosa al 0,1% y mantenidas a 4°C durante 2 dfas para completar los requerimientos de la dormicion y asegurar una germinacion simultanea.
Sustrato de semillero Sunshine LP5 Mix (Sun Gro Horticulture, Bellevue, Washington, EE.UU.) se cubrio con vermiculita fina, se rego por goteo subterraneo con solucion de Hoagland hasta dejarlo empapado, y despues se dejo drenar por gravedad. Cada alfcuota de 40 ml de semillas estratificadas se sembro uniformemente en la vermiculita con una pipeta y se tapo con una cubierta para retener la humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) durante 4-5 dfas. Las cubiertas se retiraron 1 dfa antes de la seleccion inicial de transformantes mediante una pulverizacion en postemergencia con glufosinato (que selecciono a las contransformadas con el gen PAT).
Entre 5 y 6 dfas despues de la siembra (DAP) y de nuevo a los 10 DAP, las plantas T1 (cotiledon y estadio de 2-4 hojas, respectivamente) se pulverizaron con una solucion de herbicida Liberty al 0,2% (200 g m.a./l de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, Mo., EE.UU.) con un volumen de pulverizacion de 10 ml/bandeja (703 l/ha) utilizando una boquilla de aire comprimido DeVilbiss para suministrar una dosis efectiva de 280 g m.a./ha de glufosinato por aplicacion. Las plantas supervivientes (las que continuaban creciendo) se identificaron 5-7 dfas despues de la ultima pulverizacion y se trasplantaron de forma individual a macetas de 3 pulgadas rellenas con medio para macetas (Metro Mix 360). Las plantas trasplantadas se taparon con cubiertas para retener la humedad durante 3-4 dfas y se mantuvieron en una camara de crecimiento a 22°C como antes. Posteriormente, las cubiertas se retiraron y las plantas se trasladaron al invernadero (22 ± 5°C, 50 ± 30% HR, 14 h de luz:10 h de oscuridad, mfnimo de luz natural + complementaria = 500 pE/mV) al menos 1 dfa antes del ensayo destinado a analizar la capacidad de AAD-1 (v3), AAD-1 (v2) o AAD-2 (v1) para conferir resistencia contra herbicidas auxfnicos fenoxi.
En plantas T1 seleccionadas por su resistencia frente al glufosinato y escogidas al azar se confirmo la expresion de la protefna PAT por medio de un kit de ELISA para PAT (n.° artfculo 7000045, Strategic Diagnostics, Inc., Newark, Delaware, EE.UU.); de ese modo se confirmo de forma no destructiva la fidelidad del proceso de seleccion (protocolo del fabricante). A continuacion las plantas se asignaron al azar para recibir diversas dosis de 2,4-D (50800 g e.a./ha).
Las aplicaciones de herbicida se realizaron con un pulverizador de carril ajustado a un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. El 2,4-D empleado consistio en una formulacion comercial de la sal dimetilamina (456 g e.a./l, NuFarm, St Joseph, Mo., EE.UU.) mezclada con tampon Tris 200 mM (pH 9,0).
17.5 - Resultados de la seleccion de las plantas transformadas
Las primeras transformaciones de Arabidopsis se efectuaron con el gen AAD-1 (v3). En primer lugar, las transformantes T1 se seleccionaron entre el conjunto de semillas no transformadas mediante un esquema de seleccion con glufosinato. Mas de 400.000 semillas T1 fueron sometidas a seleccion y entre ellas se hallaron 493 plantas resistentes al glufosinato (gen PAT), lo que equivale a una frecuencia de transformacion/seleccion de 0,12%. Dependiendo del lote de semillas analizado, esta oscilo entre 0,05-0,23% (vease la Tabla 15 en el Ejemplo 6.5 precedente). Tambien con el glufosinato como agente de seleccion, se detecto un pequeno lote de semillas transformadas con el gen natural AAD-1 (v2). Entre las 84.000 semillas analizadas se identificaron 278 individuos T1 resistentes al glufosinato (frecuencia de transformacion/seleccion del 0,33%). Sorprendentemente, las transformaciones de Arabidopsis con el gen natural AAD-2 (v1) arrojaron una frecuencia de transformacion muy baja al seleccionarse por la tolerancia al glufosinato (funcion de marcador seleccionable PAT). Entre las alrededor de 1,3 millones de semillas analizadas solo se recuperaron 228 plantas transformantes para el glufosinato, lo que equivale a una frecuencia de transformacion/seleccion del 0,018% (vease la Tabla 15). Asf pues, la frecuencia de transformacion del AAD-2 (v1) natural solo supuso el 6% de la del AAD-1 (v2) natural. El gen AAD-2 (v1) natural fue optimizado posteriormente de manera artificial, clonado e incorporado en un pDAB3705 para transformar
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Arabidopsis con los metodos antes descritos (vease el Ejemplo 5). El gen AAD-2 (v2) optimizado para vegetales (SEC ID n° 29, que codifica la SEC ID n° 30) manifesto una frecuencia de seleccion en Arabidopsis Ti con herbicida Liberty que resulto normal, de aproximadamente 0,11% (vease la Tabla 15).
Las plantas T1 seleccionadas se trasplantaron a macetas individuales y se pulverizaron con diversas dosis de herbicidas ariloxialcanoato comerciales. La Tabla 16 (en el Ejemplo 6.5 anterior) compara la respuesta de los genes AAD-1 (v2), AAD-1 (v3), AAD-2 (v1) y AAD-1 (v2) para conferir resistencia contra el 2,4-D a plantas Arabidopsis T1 transformadas. Todos los genes proporcionaron cierta resistencia sustancial contra el 2,4-D respecto a las lfneas control transformadas y sin transformar, aunque los diversos constructos manifestaron una amplia variabilidad en su capacidad para conferir resistencia frente al 2,4-D a las plantas T1 de Arabidopsis. Los niveles de respuesta de las plantas sometidas a un mismo tratamiento manifestaron una gran variabilidad, lo que puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformacion distinto. Cabe subrayar que a cualquiera de las dosis de
2.4- D probadas, hubo individuos que no se vieron afectados en absoluto, mientras que otros lo fueron gravemente. En la Tabla 16 se presenta el promedio de danos en la poblacion total por cada dosis con objeto de demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con AAD-1 (v2), AAD-1 (v3), AAD-2 (v1) o con AAD-1 respecto a los controles naturales o transformados con PAT/Cry1F.
Sorprendentemente, las plantas transformadas con AAD-2 (v1) resultaron mucho menos resistentes al 2,4-D que las transformadas con los genes AAD-1 (v2) o AAD-1 (v3) (Tabla 16), tanto en terminos de frecuencia de plantas muy tolerantes como de promedio total de danos. Ninguna planta transformada con AAD-2 (v1) sobrevivio a 200 g e.a./ha de 2,4-D relativamente indemne (danos visuales <20%), y los danos de la poblacion global oscilaron alrededor del 83%. En cambio, el 56% (45 de 80) de las plantas T1 transformadas con AAD-1 (v2) sobrevivieron a 200 g e.a./ha de
2.4- D sin danos sustanciales (promedio de danos en la poblacion = 34%), y >73% (11 de 15) de las plantas T1 portadoras del AAD-1 (v3) resultaron indemnes (promedio de danos en la poblacion = 14%). Vease la Figura 20. La tolerancia en las portadoras del gen AAD-2 (v2) optimizado para vegetales resulto ligeramente mejor respecto al gen natural; en cambio, la comparacion de los genes AAD-1 y -2 optimizados para vegetales indica una ventaja significativa para el AAD-1 (v3) expresado en planta (vease la Tabla 16).
Estos resultados son inesperados, dado que la comparacion in vitro de las AAD-1 (v2) y AAD-2 (v1) naturales indicaba que el 2,4-D era mas degradado por la AAD-2 (v1). La AAD-2 (v1) se expresa en las plantas T1 en diferentes grados con el tamano previsto, pero su expresion confiere escasa proteccion contra los danos causados por el 2,4-D. Existe poca correlacion entre el nivel de expresion observado en la transferencia Western y el nivel de dano causado por el 2,4-D en las mismas plantas. Vease la Figura 21. No resulto patente ninguna gran diferencia en el nivel de expresion de la protefna (en planta) entre los genes AAD-2 natural y optimizado para vegetales. Estos datos corroboran los resultados previos que convierten la expresion funcional de la AAD-1 (v3) en la planta como un medio de conferir resistencia a los herbicidas 2,4-D y AOPP en un hecho inesperado.
Ejemplo 18 - Aplicaciones de desherbado en presiembra
Este ejemplo y los siguientes son ejemplos concretos de nuevas aplicaciones herbicidas que la presente invencion de AAD-1 hace posibles.
Las aplicaciones de herbicidas en presiembra tienen por finalidad matar las malas hierbas que han brotado durante el invierno o a inicios de primavera antes de plantar los cultivos. Normalmente dichas aplicaciones se realizan en sistemas de cultivo sin laboreo o laboreo reducido donde antes de la siembra no se ha llevado a cabo la eliminacion ffsica de las malas hierbas. El programa herbicida, por tanto, debe controlar un espectro muy amplio de malas hierbas dicotiledoneas y gramfneas que esta presente en el momento de la siembra. Glifosato, gramoxona y glufosinato son ejemplos de herbicidas no selectivos y no residuales muy utilizados en las aplicaciones herbicidas en presiembra. Algunas malezas, sin embargo, resultan diffciles de controlar en esa epoca del ano debido a uno o varios de los factores siguientes: insensibilidad intrfnseca de la especie o el biotipo al herbicida, tamano relativamente grande de las malezas anuales de invierno, y condiciones meteorologicas frfas que limitan la absorcion y actividad del herbicida. Existen varias opciones para la mezcla en tanque de los herbicidas a fin de aumentar el espectro y la actividad contra las malas hierbas cuando los herbicidas mas selectivos resultan ineficientes. Un ejemplo consistirfa en aplicar una mezcla en tanque de 2,4-D y glifosato para controlar a Conyza canadensis (calta). El glifosato se puede utilizar en dosis de 420 a 1680 g e.a./ha, mas habitualmente entre 560 y 840 g e.a./ha, para el control en presiembra de la mayorfa de malezas presentes, pero tambien se pueden aplicar entre 280-1120 g e.a./ha de 2,4-D para ayudar a controlar numerosas malas hierbas de hoja ancha (p. ej., la calta). El 2,4-D es un herbicida de eleccion por su eficacia contra un amplfsimo abanico de malas hierbas dicotiledoneas, incluso a bajas temperaturas, y su modico coste. No obstante, si el futuro cultivo es una dicotiledonea sensible, los residuos de 2,4-D que permanezcan en el suelo (a pesar de su breve vida media) pueden afectarlo. La soja es un cultivo sensible que requiere un periodo mfnimo de tiempo de 7 (para 280 g e.a./ha de 2,4-D) a 30 dfas (para aplicaciones de 2,4-D de 1120 g e.a./ha) entre las aplicaciones de desherbado y la siembra. El uso del 2,4-D como tratamiento en presiembra del algodon esta prohibido (veanse las etiquetas oficiales, la mayorfa disponibles en el CPR, 2003 o en lfnea en cdms.net/manuf/manuf.asp). En el caso del algodon o la soja transformados con AAD-1 (v3), estos cultivos deben ser capaces de sobrevivir a los residuos de 2,4-D presentes en el suelo a causa de los tratamientos de desherbado efectuados hasta justo antes o incluso despues de la siembra, pero antes de la
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emergencia del cultivo. La mayor flexibilidad y el menor coste de los otros integrantes de la mezcla de tanque (o de la premezcla comercial) mejoraran las opciones de control de malas hierbas y aumentaran la efectividad de las aplicaciones de desherbado en situaciones importantes de laboreo reducido o nulo. Este ejemplo es una de las muchas opciones que estaran disponibles. Los expertos en tecnicas de control de malas hierbas advertiran otras aplicaciones como, por ejemplo, gramoxona + 2,4-D o glufosinato + 2,4-D utilizando los productos descritos en las etiquetas oficiales de los herbicidas (CPR, 2003) y los usos descritos en la Agriliance Crop Protection Guide (2003), entre otras. Los expertos en la tecnica tambien reconoceran que el ejemplo anterior tambien se puede aplicar a cualquier cultivo sensible al 2,4-D (o a otro herbicida auxfnico fenoxi), que quedara protegido por el gen AAD-1 (v3) siempre que este quede integrado de forma estable.
Ejemplo 19 - Uso en cultivo de los herbicidas auxfnicos fenoxi en soja, algodon y otros cultivos de dicotiledoneas transformados unicamente con AAD-1 (v3)
El gen AAD-1 (v3) puede posibilitar el uso de los herbicidas auxfnicos fenoxi (p. ej., 2,4-D, diclorprop, MCPA y otros) para el control de un amplio espectro de malas hierbas latifolias directamente en cultivos que normalmente son sensibles al 2,4-D. La aplicacion del 2,4-D en dosis de 280 a 2240 g e.a./ha permitirfa controlar la mayorfa de arvenses latifolias presentes en los entornos agrfcolas; habitualmente se utilizan sobre todo 560-1120 g e.a./ha. En un sistema de control integral de las malas hierbas tambien se deben controlar las gramfneas. En estos momentos hay registrada una amplia gama de graminicidas, como por ejemplo haloxifop, quizalofop, fenoxaprop, fluazifop, setoxidim y cletodim, para el uso en la mayorfa de cultivos de dicotiledoneas, los cuales toleran de forma natural tales herbicidas. Una combinacion de quizalofop (20-100 g e.a./ha) y 2,4-D (420-840 g e.a./ha) podrfa proporcionar dos mecanismos de accion herbicidas en un cultivo de dicotiledonea transformada con AAD-1 (v3) (esto es, soja o algodon) que controlarfan la mayorfa de malas hierbas agronomicas de manera similar al glifosato en cultivos tolerantes al mismo (veanse los espectros de control de malas hierbas en las caracterfsticas tecnicas de la Crop Protection Guide de Agriliance).
Una ventaja de esta herramienta adicional es el coste sumamente bajo del herbicida de hoja ancha y el potencial control residual de breve vida que proporcionan las dosis mas altas de 2,4-D y/o los herbicidas AOPP cuando se utilizan en dosis elevadas, a diferencia de un herbicida no residual como el glifosato, que no consigue controlar las malas hierbas que germinan tardfamente. Esta herramienta tambien facilita un mecanismo para rotar los modos de accion herbicidas con las ventajas de los HTC como una estrategia integrada para el manejo de la resistencia a herbicidas y los cambios en la flora arvense en una estrategia de rotacion de HTC con un cultivo tolerante a glifosato/AAD-1 (v3), tanto si se rotan las especies de cultivo como si no. Asimismo, los componentes para el control de gramfneas y dicotiledoneas de este sistema son independientes el uno del otro, lo que permite a un experto en tecnicas de control de malas hierbas decidir cual es la proporcion de herbicida AOPP y auxfnico mas eficaz y rentable economicamente. Por ejemplo, si en el momento de la aplicacion del herbicida predominan las latifolias, se puede aplicar un tratamiento con 560 a 1120 g e.a./ha de 2,4-D, sin ningun herbicida mas. Asf se reducirfan las aplicaciones innecesarias de herbicida, proporcionando flexibilidad para reducir los costes de produccion y la carga ambiental de pesticidas, al tiempo que se reducirfa la presion selectiva innecesaria que puede acabar generando resistencia a los herbicidas entre las malas hierbas.
Otros beneficios pueden incluir la tolerancia a la deriva o la volatilizacion del 2,4-D, fenomenos responsables de danos en cultivos de dicotiledoneas cercanos; no es necesario respetar un periodo entre la aplicacion y la siembra (vease el ejemplo anterior); y se reducen los problemas de danos por contaminacion en cultivos de dicotiledoneas provocados por una limpieza poco esmerada de los tanques que han contenido 2,4-D. El dicamba y otros herbicidas se pueden seguir utilizando para el control de los ricios de dicotiledoneas transformadas con AAD-1 (v3).
Los expertos en la tecnica tambien reconoceran que el ejemplo anterior es aplicable a cualquier cultivo sensible al
2,4-D (o a otro herbicida auxfnico fenoxi) que quedarfa protegido por el gen AAD-1 (v3) si queda transformado de forma estable. Un experto en las tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion con AAD-1 (v3) posibilita el uso de varios herbicidas auxfnicos fenoxi comerciales solos o en combinacion con cualquier herbicida AOPP comercial. Las dosis especfficas de otros herbicidas representativos de estas familias qufmicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion similar o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, se consideran dentro del ambito de la presente invencion.
Ejemplo 20 -Uso en cultivo de los herbicidas auxfnicos fenoxi y AOPP en mafz, arroz y otras especies de monocotiledoneas transformadas unicamente con AAD-1 (v3)
De un modo analogo, la transformacion de especies de gramfneas (como, entre otras, mafz, arroz, trigo, cebada o cesped y gramfneas forrajeras) con AAD-1 (v3) permitirfa el uso de graminicidas AOPP muy eficaces en cultivos que normalmente son sensibles a estos herbicidas. La mayorfa de gramfneas presentan una tolerancia natural a los herbicidas auxfnicos como los herbicidas auxfnicos fenoxi (2,4-D, diclorprop y otros). No obstante, el nivel relativamente bajo de selectividad para el cultivo ha mermado la utilidad en dichos cultivos debido a la mayor
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brevedad del intervalo de aplicacion y a malas hierbas latifolias alternativas. Los cultivos de monocotiledoneas transformados con AAD-1 (v3) permitirfan el uso de una combinacion de tratamientos similar a la descrita en los cultivos de dicotiledoneas, como es la aplicacion de 2,4-D a dosis de 280 a 2240 g e.a./ha para controlar la mayorfa de malas hierbas latifolias, aunque generalmente se utilizarfan 560-1120 g e.a./ha. Por su parte, se pueden utilizar diversos graminicidas AOPP de amplio espectro (haloxifop, quizalofop, fenoxaprop, fluazifop, etc.) para controlar un gran numero de malas hierbas gramfneas. Los graminicidas de ciclohexanodiona como setoxidim, cletodim, etc. no podrfan ser utilizados en este sistema como en los cultivos de dicotiledoneas, ya que la AAD-1 no confiere proteccion contra esta familia qufmica y los cultivos de gramfneas son sensibles de forma natural a los derivados de la ciclohexanodiona. No obstante, este atributo posibilitarfa el uso de tales herbicidas como medio para controlar los ricios de monocotiledoneas transformadas con el AAD-1 (v3). A partir de ahora, la AAD-1 hace posible la adopcion de estrategias de control de malas hierbas similares a las de los cultivos de dicotiledoneas. Una combinacion de quizalofop (20-100 g e.a./ha) y 2,4-D (420-840 g e.a./ha) proporcionarfa dos mecanismos de accion distintos en un cultivo de monocotiledoneas transformadas con AAD-1 (v3) (p. ej. mafz y arroz) que controlarfa la mayorfa de malas hierbas agronomicas de un modo similar al glifosato en los cultivos tolerantes a este (veanse los espectros de control de malas hierbas consultando las caracterfsticas tecnicas en la Crop Protection Guide de Agriliance).
Una ventaja de esta herramienta adicional es el coste sumamente bajo del herbicida de hoja ancha y el potencial control residual de breve vida que proporcionan las dosis mas altas de 2,4-D y/o los herbicidas AOPP cuando se utilizan en dosis elevadas, a diferencia de un herbicida no residual como el glifosato, que no consigue controlar las malas hierbas que germinan tardfamente. Esta herramienta tambien facilita un mecanismo para rotar los modos de accion herbicidas con las ventajas de los HTC como una estrategia integrada para el manejo de la resistencia a herbicidas y los cambios en la flora arvense en una estrategia de rotacion de HTC con un cultivo tolerante a glifosato/AAD-1 (v3), tanto si se rotan las especies de cultivo como si no. Asimismo, los componentes para el control de gramfneas y dicotiledoneas de este sistema son independientes el uno del otro, lo que permite a un experto en tecnicas de control de malas hierbas decidir cual es la proporcion de herbicida AOPP y auxfnico mas eficaz y rentable economicamente. Por ejemplo, si en el momento de la aplicacion del herbicida predominan las latifolias, se puede aplicar un tratamiento con 560 a 1120 g e.a./ha de 2,4-D, sin ningun herbicida mas. Asf se reducirfan las aplicaciones innecesarias de herbicida, proporcionando flexibilidad para reducir los costes de produccion y la carga ambiental de pesticidas, al tiempo que se reducirfa la presion selectiva innecesaria que puede acabar generando resistencia a los herbicidas entre las malas hierbas. La mayor tolerancia del mafz y de otras monocotiledoneas a los herbicidas auxfnicos fenoxi fomentara el uso de tales herbicidas en cultivo sin las restricciones impuestas por el estadio de crecimiento o el riesgo de encamado, fenomenos como la inhibicion del desenrollamiento de las hojas, encamado, fragilidad de la raspa provocada por reguladores del crecimiento en el mafz, o la deformacion de las rafces fulcreas.
Los expertos en la tecnica tambien reconoceran ahora que el ejemplo anterior puede ser aplicable a cualquier cultivo de monocotiledonea que quedara protegido por el gen AAD-1 (v3) de los danos causados por cualquier herbicida AOPP. Un experto en las tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion con AAD-1 (v3) posibilita el uso de varios herbicidas auxfnicos fenoxi comerciales, solos o en combinacion con cualquier herbicida AOPP comercial. Las dosis especfficas de otros herbicidas representativos de estas familias qufmicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion similar o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, se consideran dentro del ambito de la presente invencion.
Ejemplo 21 - AAD-1 (v3) apilado con un caracter de tolerancia al glifosato en cualquier cultivo
La gran mayorfa de hectareas de algodon, canola y soja sembradas en Norteamerica contienen un caracter de tolerancia al glifosato (GT), y la adopcion del mafz gT crece dfa a dfa. Otros cultivos GT (p. ej. trigo, arroz, remolacha azucarera y cesped) se encuentran en fase de desarrollo pero no han sido comercializados hasta la fecha. Muchas otras especies resistentes al glifosato se encuentran en fase experimental o de desarrollo (p. ej. alfalfa, cana de azucar, girasol, remolacha, guisantes, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, tomate y tabaco; especies forestales como el chopo y el arbol de ambar; y especies de horticultura ornamental como tagetes, petunias y begonias; isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005 en el web). Los cultivos GTC son herramientas valiosas por la amplfsima variedad de malas hierbas que permiten controlar y por la comodidad y rentabilidad economica que ofrecen. No obstante, el actual uso del glifosato como un tratamiento basico ordinario esta seleccionando malas hierbas resistentes a el. Es mas, las malezas en que el glifosato resulta de forma natural menos eficaz estan desplazando a las especies predominantes en los campos donde solo se aplican programas herbicidas a base de glifosato. El apilamiento del AAD-1 (v3) con un caracter GT, ya sea mediante cruzamiento convencional o conjuntamente con un evento de transformacion novedoso, mejorarfa el control de las malas hierbas, la sensibilidad y la capacidad para manejar los cambios de la flora arvense y la aparicion de resistencia a herbicidas. Tal y como se ha senalado en ejemplos precedentes, la transformacion de los cultivos con AAD-1 (v3) posibilita la aplicacion selectiva de herbicidas AOPP en los cultivos de monocotiledoneas, ofrece un mayor margen de seguridad a los cultivos de monocotiledoneas frente a los herbicidas auxfnicos fenoxi y, por ultimo, permite la aplicacion selectiva de los herbicidas auxfnicos fenoxi en los cultivos de dicotiledoneas. Se pueden imaginar diversas opciones para mejorar
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el control de las malas hierbas mediante el apilamiento del AAD-1 (v3) y de un caracter GTC en una especie cultivada de monocotiledonea o dicotiledonea:
a) El glifosato se puede aplicar en postemergencia a una dosis ordinaria (420 a 2160 g e.a./ha, preferiblemente 560 a 840 g e.a./ha) para el control de la mayorfa de malas hierbas gramfneas y latifolias. Para el control de las malas hierbas resistentes al glifosato como Conyza canadensis o de malas hierbas que resultan de por si diffciles de controlar con el (p. ej., Commelina spp), se puede aplicar 2,4-D a 280-2240 g e.a./ha (preferiblemente 560-1120 g e.a./ha) de manera secuencial, en mezcla en tanque, o en premezcla con glifosato para lograr un control eficaz.
b) El glifosato se puede aplicar en postemergencia a una dosis ordinaria (420 a 2160 g e.a./ha, preferiblemente 560 a 840 g e.a./ha) para el control de la mayorfa de malas hierbas gramfneas y latifolias. Para el control de las malas hierbas resistentes al glifosato como Lolium rigidum o Eleusine indica, se puede aplicar quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente 20-100 g e.a./ha) de manera secuencial, en mezcla en tanque o en premezcla con glifosato para lograr un control eficaz.
c) Actualmente, las dosis de glifosato usadas en los GTC oscilan en general entre 560 a 2240 g e.a./ha por aplicacion. El glifosato es mucho mas eficaz contra las especies de gramfneas que contra las latifolias. El apilamiento de los caracteres AAD-1 (v3) + GT permitirfa la administracion del glifosato en dosis graminicidas eficaces (105-840 g e.a./ha, y preferiblemente 210-420 g e.a./ha). El 2,4-D (a 280-2240 g e.a./ha, y preferiblemente 560-1120 g e.a./ha) se podrfa aplicar entonces de manera secuencial, mezclado en tanque o como premezcla con dosis de glifosato eficaces contra las gramfneas para conseguir el necesario control de las malas hierbas latifolias. Un herbicida AOPP como el quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente a 20100 g e.a./ha y mas preferiblemente a 20-35 g e.a./ha), podrfa conseguir un control mas solido de las gramfneas y/o retrasar el desarrollo de gramfneas resistentes al glifosato. La baja dosis de glifosato tambien serfa beneficiosa para el control de las malas hierbas latifolias, aunque el control primario radicarfa en el 2,4- D.
Un experto en tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion de cultivos con AAD-1 (v3) permitira el uso de uno o varios herbicidas auxfnicos fenoxi comerciales, solos o en combinacion con uno o varios herbicidas AOPP comerciales (secuencial o independientemente). Las dosis especfficas de otros herbicidas representativos de estas familias qufmicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion similar o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, se consideran dentro del ambito de la presente invencion
Ejemplo 22 - AAD-1 (v3) apilado con un caracter de tolerancia al glufosinato en cualquier cultivo
La tolerancia al glufosinato (PAT o bar) ya esta presente en varias especies cultivadas en Norteamerica en forma de marcador seleccionable de un caracter agronomico como protefnas de resistencia a insectos o especfficamente como un caracter de HTC. Entre tales cultivos se encuentran, entre otros, la canola, el mafz y el algodon tolerantes al glufosinato. Otros cultivos tolerantes al glufosinato (p. ej. arroz, remolacha azucarera, soja y cesped) se encuentran en fase de desarrollo pero no han sido comercializados hasta la fecha. El glufosinato, al igual que el glifosato, es un herbicida de amplio espectro para gramfneas y hoja ancha, dotado de una relativa selectividad. El mecanismo de accion del glufosinato difiere del del glifosato. Actua con rapidez, pues provoca la desecacion y la necrosis en las hojas tratadas entre 24 y 48 horas despues de la aplicacion, lo que supone una ventaja para lograr un rapido control de las malas hierbas. Sin embargo, ello tambien limita la translocacion del glufosinato a los tejidos meristematicos de la planta, lo que se traduce en un control menos eficiente, tal y como evidencia el rendimiento relativo de ambos compuestos en muchas especies (Agriliance, 2003).
El apilamiento del AAD-1 (v3) con un caracter de tolerancia al glufosinato, ya sea mediante cruzamiento convencional o conjuntamente con un evento de transformacion novedoso, mejorarfa la eficacia y la flexibilidad en el control de las malas hierbas, la sensibilidad y la capacidad para manejar los cambios de la flora arvense y la aparicion de resistencia a herbicidas. Tal y como se ha senalado en ejemplos precedentes, la transformacion de los cultivos con AAD-1 (v3) posibilita la aplicacion selectiva de herbicidas AOPP en los cultivos de monocotiledoneas, ofrece un mayor margen de seguridad a los cultivos de monocotiledoneas frente a los herbicidas auxfnicos fenoxi y, por ultimo, permite la aplicacion selectiva de los herbicidas auxfnicos fenoxi en los cultivos de dicotiledoneas. Se pueden imaginar diversas opciones para mejorar el control de las malas hierbas mediante el apilamiento del AAD-1 (v3) y de un caracter de tolerancia al glufosinato en una especie cultivada de monocotiledonea o dicotiledonea:
a) El glufosinato se puede aplicar en postemergencia a una dosis ordinaria (200 a 1700 g e.a./ha, preferiblemente 350 a 500 g e.a./ha) para el control de la mayorfa de malas hierbas gramfneas y latifolias. Hasta la fecha no se ha confirmado la existencia de malas hierbas resistentes al glufosinato, pero son mas las especies de malezas que de forma natural son tolerantes a el que en el caso del glifosato.
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i) Las malas hierbas gramfneas que son tolerantes naturales (p. ej. Echinochloa spp. o Sorghum spp.) se pueden controlar con su mezcla en tanque con quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente 20-100 g e.a./ha).
ii) Las malas hierbas latifolia que son tolerantes naturales (p. ej., Cirsium arvensis y Apocynum cannabinum) se pueden controlar con la mezcla en tanque de 2,4-D a 280-2240 g e.a./ha, y preferiblemente a 560-2240 g e.a./ha, para el control eficaz de estas especies perennes de diffcil control y reforzar el control de las latifolias anuales.
b) Una triple combinacion de glufosinato (200-500 g e.a./ha) + 2,4-D (280-1120 g e.a./ha) + quizalofop (10-100 g e.a./ha), por ejemplo, proporcionarfa un espectro de control solapado mas solido. Ademas, el solapamiento del espectro proporciona un mecanismo adicional para el manejo o el retraso en la aparicion de malas hierbas resistentes a herbicidas.
Un experto en las tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion con AAD-1 (v3) posibilita el uso de varios herbicidas auxfnicos fenoxi comerciales, solos o en combinacion con cualquier herbicida AOPP comercial. Las dosis especfficas de otros herbicidas representativos de estas familias qufmicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion o manual similar, con las etiquetas compiladas en lfnea (p. ej. cdms.net/manuf/manuf.asp) o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, se consideran dentro del ambito de la presente invencion.
Ejemplo 23 - AAD-1 (v3) apilado con un caracter AHAS en cualquier cultivo
La tolerancia a los herbicidas de imidazolinona (AHAS y otros) ya esta presente en varias especies cultivadas en Norteamerica como, por ejemplo, mafz, arroz y trigo. Otros cultivos tolerantes a las imidazolinonas (p. ej. algodon y remolacha azucarera) se encuentran en fase de desarrollo pero no han sido comercializados hasta la fecha. Muchos herbicidas de imidazolinona (p. ej. imazamox, imazetapir, imazaquin e imazapic) se utilizan de forma selectiva en varios cultivos convencionales. La incorporacion de caracteres de tolerancia a las imidazolinonas como AHAS y similares ha posibilitado el uso de imazetapir, imazamox y del no selectivo imazapir. Los HTC tolerantes a las imidazolinonas disponibles hasta la fecha tienen la ventaja de no ser transgenicos. Esta familia qufmica tambien ejerce una sustancial actividad residual en el suelo, lo que permite prolongar el control de las malas hierbas mas alla del momento de la aplicacion, a diferencia de los sistemas basados en el glifosato o el glufosinato. No obstante, el espectro de malas hierbas controlado por los herbicidas de imidazolinona no es tan extenso como el del glifosato (Agriliance, 2003). Asimismo, las imidazolinonas poseen un mecanismo de accion (inhibicion de la acetolactato sintasa, ALS) contra el cual muchas especies arvenses han generado resistencia (Heap, 2004). El apilamiento del AAD-1 (v3) con un caracter de tolerancia a las imidazolinonas, ya sea mediante cruzamiento convencional o conjuntamente con un evento de transformacion novedoso, mejorarfa la eficacia y la flexibilidad del control de las malas hierbas, la capacidad para manejar los cambios de la flora arvense y la aparicion de resistencia a herbicidas. Tal y como se ha senalado en ejemplos precedentes, la transformacion de los cultivos con AAD-1 (v3) posibilita la aplicacion selectiva de herbicidas AOPP en los cultivos de monocotiledoneas, ofrece un mayor margen de seguridad a los cultivos de monocotiledoneas frente a los herbicidas auxfnicos fenoxi y, por ultimo, permite la aplicacion selectiva de los herbicidas auxfnicos fenoxi en los cultivos de dicotiledoneas. Se pueden imaginar diversas opciones para mejorar el control de las malas hierbas mediante el apilamiento del AAD-1 (v3) y de un caracter de tolerancia a las imidazolinonas en una especie cultivada de monocotiledonea o dicotiledonea:
a) Imazetapir puede aplicarse en postemergencia a una dosis estandar (35 a 280 g e.a./ha, preferiblemente 70140 g e.a./ha) para el control de numerosas malas hierbas gramfneas y latifolias.
i) Las malas hierbas latifolias resistentes a los inhibidores de ALS como Amaranthus rudis, Ambrosia trifida, Chenopodium album (entre otras, Heap, 2004) pueden ser controladas mediante la mezcla en tanque de
2,4-D a 280-2240 g e.a./ha, y preferiblemente a 560-1120 g e.a./ha.
ii) Las malas hierbas latifolias que toleran de forma natural las imidazolinonas, como Ipomoea spp., tambien pueden ser controladas mediante la mezcla en tanque de 2,4-D a 280-2240 g e.a./ha, y preferiblemente a 560-1120 g e.a./ha.
iii) Las malas hierbas gramfneas que son resistentes a los inhibidores de ALS como Sorghum halepense y Lolium spp., pueden ser controladas mediante la mezcla en tanque de quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente a 20-100 g e.a./ha).
iv) Las malas hierbas gramfneas que son tolerantes naturales (p. ej. Agropiron repens) tambien pueden ser controladas mediante la mezcla en tanque de quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente a 20-100 g e.a./ha).
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b) Una triple combinacion de imazetapir (35 a 280 g e.a./ha, preferiblemente 70-140 g e.a./ha) + 2,4-D (2801120 g e.a./ha) + quizalofop (10-100 g e.a./ha), por ejemplo, puede proporcionar un espectro de control solapado mas solido. Ademas, el solapamiento del espectro proporciona un mecanismo adicional para el manejo o el retraso en la aparicion de malas hierbas resistentes a herbicidas.
Un experto en las tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion con AAD-1 (v3) y su apilamiento con cualquier caracter de tolerancia a imidazolinona mediante cruzamiento convencional o ingenierfa genetica permiten el uso de varios herbicidas de imidazolinona, herbicidas auxfnicos fenoxi o herbicidas AOPP comerciales, solos o en multiples combinaciones. Las dosis especfficas de otros herbicidas representativos de estas familias qufmicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion o manual similar, con las etiquetas compiladas en lfnea (p. ej. cdms.net/manuf/manuf.asp) o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, se consideran dentro del ambito de la presente invencion
Ejemplo 24 - AAD-1 (v3) en arroz
24.1 - Descripcion de los medios
Los medios de cultivo empleados se ajustaron a un pH 5,8 con KOH 1 M y se solidificaron con Phytagel 2,5 g/l (Sigma). Los callos embriogenicos se cultivaron en placas de Petri de 100 x 20 mm que contenfan 40 ml de medio semisolido. Las plantulas de arroz se cultivaron en 50 ml de medio en cajas Magenta. Las suspensiones celulares se mantuvieron en matraces de Erlenmeyer de 125 ml, con 35 ml de medio lfquido agitado a 125 rpm. La induccion y el mantenimiento de los cultivos embriogenicos tuvo lugar a oscuras y a 25-26°C, y la regeneracion de las plantas y el cultivo de las plantas enteras se realizo con un fotoperiodo de 16 h (Zhang et al. 1996).
La induccion y el mantenimiento del callo embriogenico se efectuaron en medio basal NB del modo descrito con anterioridad (Li et al. 1993), pero modificado para contener glutamina 500 mg/l. Los cultivos en suspension se iniciaron y mantuvieron en medio lfquido SZ (Zhang et al. 1998) con la adicion de sacarosa 30 g/l en lugar de maltosa. El medio osmotico (NBO) consistio en medio NB al que se anadio manitol y sorbitol, ambos en una concentracion de 0,256 M. Los callos resistentes a higromicina B se seleccionaron con medio NB complementado con higromicina B 50 mg/l durante 3-4 semanas. La prerregeneracion se efectuo en un medio (PRH50) elaborado con medio NB sin acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), pero con 6-bencilaminopurina (BAP) 2 mg/l, acido a- naftalenacetico (NAA) 1 mg/l, acido abscfsico (ABA) 5 mg/l e higromicina B 50 mg/l durante 1 semana. La regeneracion de las plantulas se llevo a cabo en medio de regeneracion (RNH50), consistente en medio NB sin 2,4- D, complementado con BAP 3 mg/l, NAA 0,5 mg/l e higromicina B 50 mg/l hasta que se regeneran los brotes. Estos se transfirieron a medio de enraizamiento con sales basales de Murashige y Skoog y vitaminas B5 de Gamborg diluidas a la mitad, complementado con sacarosa 50 mg/l e higromicina B (1/2MSH50).
24.2 - Desarrollo del cultivo de tejido.
Semillas maduras desecadas de Oryza sativa L. japonica cv. Taipei 309 se esterilizaron del modo descrito por Zhang et al. 1996. Los tejidos embriogenicos se indujeron cultivando semillas de arroz maduras y esteriles en medio NB a oscuras. El callo primario de aproximadamente 1 mm de diametro se extrajo del escutelo y con el se inicio la suspension celular en medio lfquido SZ. A continuacion, las suspensiones se mantuvieron del modo descrito por Zhang 1995. Los tejidos embriogenicos contenidos en la suspension se extrajeron del cultivo lfquido 3-5 dfas despues del subcultivo anterior y se colocaron en medios osmotico NBO hasta formar un cfrculo de unos 2,5 cm de diametro en una placa de Petri, cultivandose durante 4 h antes del bombardeo. Entre 16 y 20 h despues del bombardeo, los tejidos se transfirieron del medio NBO a medio de seleccion NBH50 con higromicina B, asegurandose de que la superficie bombardeada quedara cara arriba, y se incubaron a oscuras durante 14-17 dfas. Los callos recien formados se separaron de los explantes originales bombardeados y se colocaron cerca sobre el mismo medio. Al cabo de otros 8-12 dfas, se seleccionaron visualmente los callos opacos y relativamente compactos y se trasladaron a medio de prerregeneracion PRH50 durante 7 dfas a oscuras. El callo en crecimiento, ahora mas compacto y opaco, paso a cultivarse en el medio de regeneracion RNH50 durante 14-21 dfas con un fotoperiodo de 16 h. Los brotes regenerados se transfirieron a cajas Magenta que contenfan medio A MSH50. Las plantas regeneradas de un mismo explante se consideran hermanas y son tratadas como una lfnea vegetal independiente. Las plantas se consideraron portadoras del gen hph si producfan rafces gruesas y blancas y crecfan con vigor en medio A MSH50. Una vez las plantulas alcanzaron la parte superior de las cajas Magenta, se trasplantaron a suelo en una maceta de 6 cm con humedad del 100% durante una semana, y despues se trasladaron a una camara de crecimiento con un periodo de luz de 14 h a 30°C y en oscuridad a 21°C durante 2-3 semanas antes de trasplantarlas en macetas de 13 cm en el invernadero. Las semillas se recogieron y se secaron a 37°C durante una semana antes de conservarlas a 4°C.
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Los bombardeos se llevaron a cabo con el sistema Biolistic PDS-1000/He™ (Bio-Rad, Laboratories, Inc.). Tres miligramos de partfculas de oro de 1,0 micrometro de diametro se lavaron una vez con etanol al 100%, dos veces con agua destilada esteril y se resuspendieron en 50 pl de agua en un tubo Eppendorf siliconado. A la suspension de oro se le anadieron cinco microgramos de ADN plasmfdico que representaba un cociente molar 1:6 de pDOW3303 (vector portador de Hpt) a pDAB3403, 20 pl de espermidina (0,1 M) y 50 pl de cloruro calcico (2,5 M). La mezcla se incubo a temperatura ambiente durante 10 min, se sedimento a 10.000 rpm durante 10 s, despues se resuspendio en 60 pl de etanol 100% frfo y a continuacion se introdujeron 8-9 pl de la misma en cada pelfcula circular de plastico (macrocarrier). Las muestras de tejidos se bombardearon a 1100 psi y un vacfo de 27 pulgadas de Hg, como describen Zhang et al. (1996).
24.4 - Analisis de la tolerancia
Plantulas de arroz en estadio de 3-5 hojas se pulverizaron con una solucion al 0,3% (v/v) de DuPont™ Assure® II que contenfa aceite vegetal concentrado Agridex al 1% (v/v) con un pulverizador de perilla DeVilbiss (atomizador de vidrio modelo 15-RD). Esta concentracion corresponde aproximadamente a 140 g e.a./ha. Las plantas se pulverizaron bajo una campana extractora de vapores a una distancia de 8-12 pulgadas con 6 chorros dirigidos de tal modo que la planta entera quedo cubierta con una fraccion igual de herbicida. Cada chorro suministra aproximadamente 100 pl de solucion a la plantula. Una vez tratadas, las plantulas se dejaron secar durante una hora antes de sacarlas de la campana extractora. La evaluacion de la sensibilidad o la resistencia se efectuo 10-14 dfas despues del tratamiento (DAT) y los resultados se muestran en la Tabla 35.
Tabla 35.
Nombre de la muestra
140 g ae/ha quizalofop
Control
Muerto
63-1A
Sin danos
63-1F
Sin danos
63-4B
Sin danos
63-4D
Sin danos
63-6C
Muerto
24.5 - Recoleccion del tejido, aislamiento y cuantificacion del ADN
Se deposito tejido fresco en tubos y se liofilizo a 4°C durante 2 dfas. Una vez completamente seco, se coloco una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras de tejido fueron sometidas durante 1 minuto a molturacion en seco con un molino de perlas Kelco. A continuacion, se procedio a aislar el ADN con un procedimiento DNeasy ordinario (Qiagen, DNeasy 69109). Despues, una alfcuota del ADN extrafdo se tino con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se visualizo en el fluorfmetro (BioTek) con patrones conocidos para obtener la concentracion en ng/pl.
24.6 - Analisis con transferencia Southern
El analisis con transferencia Southern se efectuo con el ADN total obtenido con el kit DNeasy de Qiagen. Un total de 2 pg de ADN se sometieron a una digestion hasta el dfa siguiente con HindIII para el pDAB3403 a fin de obtener los datos de integracion. De manera similar, un total de 2 pg de ADN fueron sometidos a una digestion hasta el dfa siguiente con Mfel para obtener los datos de la PTU. Acabada la digestion, se proceso una alfcuota de ~100 ng en un gel al 1% para comprobar que la digestion era completa. Despues de esta comprobacion las muestras se procesaron en un gel grande de agarosa al 0,85% hasta el dfa siguiente a 40 voltios. Acto seguido, el gel se desnaturalizo con NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos. El gel se neutralizo seguidamente con Tris HCl 0,5 M, NaCl 1,5 M y pH 7,5 durante 30 minutos. Acto seguido, se preparo un aparato de gel con SSC 20x para transferir por gravedad el gel a una membrana de nilon (Millipore INYC00010), dejandolo hasta el dfa siguiente. Acabada la transferencia, la membrana se expuso a luz UV en presencia de un entrelazador (stratagene UV stratalinker 1800) a 1200*100 microjulios. Despues la membrana se lavo con SDS 0,1%, SSC 0,1 durante 45 minutos. Finalizado el lavado de 45 minutos, la membrana fue horneada durante 3 horas a 80°C y se conservo a 4°C hasta la hibridacion. El molde de hibridacion se preparo con la PCR de la region codificante mediante el plasmido pDAB3404. Como molde se emplearon en total 100 ng de ADN total. Se usaron 20 mM de cada cebador con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Los cebadores utilizados para el fragmento Southern fragment PCR AAD-1 fueron (Directo-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC) (SEC ID n° 31) y (Inverso-GGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEC ID n° 32). La reaccion de PCR se llevo a cabo con un termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos seguidos por 72°C durante 10 minutos.
El producto se inyecto en un gel de agarosa al 1%, se recorto y despues se extrajo el gel con el procedimiento de extraccion de Qiagen (28706). La membrana se sometio entonces a una etapa de prehibridacion a 60°C durante 1
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hora en tampon Perfect Hyb (Sigma H7033). Con el procedimiento Prime it RmT dCTP-labeling r*n (Stratagene 300392) se procedio al revelado con una sonda de 32P (Perkin Elmer). La sonda sobrante se lavo con columnas ProbeQuant G50 (Amersham 27-5335-01). Se usaron 2 millones de CPM por ml de tampon Perfect Hyb para hibridar las membranas de transferencia hasta el dfa siguiente. Finalizada la hibridacion las membranas se sometieron a dos lavados de 20 minutos a 65°C con SDS 0,1%, SSC 0,1. Finalmente, las membranas se expusieron a una pantalla de imagen de fosforo durante toda la noche y se procesaron en un escaner Storm (Molecular Devices). Los resultados se resumen en la Tabla 36.
Tabla 36. Resultados de la transferencia Southern.
Evento
Datos de integracion del Southern Datos de PTU del Southern
Numbero of bandas
Tamano esperado 3049bp
63-1 A
8 sf, 7 bandas distintas
63-1 F
5 . sf, 9 bandas distintas
63-4 A
20 sf, 20 bandas distintas
63-4 D
20 sf, 19 bandas distintas
63-6 C
2 ADN insuficiente para ambos cortes
Las plantas 63-1 A y 63-1 F no pertenecen al mismo evento; las plantas 63-4 A y 63-4 D son del mismo evento. Estos eventos tienen PTU del tamano esperado, pero son muy complejos. Estos datos de PTU obtenidos en la transferencia Southern concuerdan con los datos de expresion y los datos de la pulverizacion. La muestra 63-6 C no contaba con suficiente ADN para realizar las transferencias Southerns de integracion y de PTU.
24.7 - Datos de la transferencia Western
La preparacion de la muestra y las condiciones de analisis corresponden a las descritas previamente. Cinco lfneas de arroz transgenico y una lfnea de control no transgenica fueron analizadas para detectar la expresion de la AAD-1 con ELISA y transferencia Western. La AAD-1 se detecto en cuatro lfneas (63-1A, 63-1F, 63-4B y 63-4D) pero no asf en la lfnea 63-1C en la planta control. Los niveles de expresion oscilaron entre 15,6 y 183 ppm de protefna soluble total. Se presenta un resumen de los resultados en la Tabla 37.
Tabla 37.
Lfnea
Nombre de la muestra TSP (pg/mL) [AAD1] (ng/mL) ELISA Expression (ppm) Western
1
Control 6719,58 0,00 0,00 -
2
63-1A 8311,87 351,17 42,25 ±
3
63-1F 11453,31 2092,35 182,69 + +
4
63-4B 13835,09 216,00 15,61 +
5
36-4D 13656,49 717,05 52,51 + +
6
63-6C 5343,63 0,00 0.00 -
7
Patron de AAD1 (0,5 pg/ml) + + +
8
Patron de AAD1 (5,0 pg/ml) + + + + +
Ejemplo 25 - Procedimientos de transformacion de cesped
La transformacion genetica con Agrobacterium tumefaciens de la agrostide estolonffera, consistente en sustituir el gen “bar” por el AAD-1 (v3), puede conseguirse mediante un callo embriogenico obtenido a partir de semillas (cv. Penn-A-4), tal y como se describe de forma general a continuacion. Vease “Efficiency of Agrobacterium tumefaciens- mediated turfgrass (Agrostis stolonifera L) transformation” (Luo et. al., 2004).
El callo se infecta con una cepa de A. tumefaciens (LBA4404) portadora de un vector superbinario que contiene un gen bar resistente a herbicida controlado por un promotor de ubiquitina de arroz. La eficiencia total de la transformacion estable oscila entre el 18% y el 45%. Los analisis con transferencia Southern y geneticos confirmaron la integracion del transgen en el genoma de la agrostide estolonffera asf como su transmision normal y su expresion estable en la generacion T1. Todos los eventos de transformaciones independientes contenfan entre una y tres copias del transgen, y la mayorfa (60-65%) portaban una sola copia del gen foraneo sin reordenamientos aparentes.
25.1 - Preparacion de las semillas para la induccion del callo embriogenico
Semillas maduras se descascarillaron con papel de lija y se esterilizaron superficialmente con lejfa Clorox al 10% (v/v) (hipoclorito sodico al 6%) mas Tween 20 0,2% (v/v) (Polisorbato 20) con agitacion vigorosa durante 90 min. Despues de cinco lavados con agua destilada esteril, las semillas se introdujeron en medio inductor de callos (sales basales y vitaminas MS, sacarosa 30 g/l, hidrolizado de casefna 500 mg/l, acido 3,6-dicloro-o-anfsico (dicamba) 6,6 mg/l, 6-bencilaminopurina (BAP) 0,5 mg/l y Phytagel 2 g/l. El pH del medio se ajusto a 5,7 antes de autoclavar a 120°C durante 20 min).
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25.2 - Induccion del callo embriogenico
Las placas de cultivo con los explantes de semillas preparados se mantuvieron a oscuras y temperatura ambiente durante 6 semanas. Los callos embriogenicos se seleccionaron visualmente y se cultivaron en medio inductor de callo fresco a oscuras y temperatura ambiente durante 1 semana antes del cocultivo.
25.3 - Infeccion y cocultivo con Agrobacterium
Un dfa antes de la infeccion con Agrobacterium, el callo embriogenico se dividio en trozos de 1 a 2 mm y se coloco en medio inductor de callo que contenfa acetosiringona 100 pM. A continuacion, a cada trozo de callo se le aplico una alfcuota de 10 pl de suspension de Agrobacterium (LBA4404) (D.O.= 1,0 a 660 nm), seguida de 3 dfas de cocultivo a oscuras y 25°C.
25.4 - Etapa de reposo y control de Agrobacterium
Para la fase de tratamiento con antibiotico, el callo se transfirio y se cultivo durante 2 semanas en un medio inductor de callo con cefotaxima 125 mg/l y carbenicilina 250 mg/l para suprimir el crecimiento bacteriano.
25.5 - Seleccion e identificacion de las colonias potencialmente transgenicas
Despues, para la seleccion, el callo se introdujo en medio inductor de callo dotado de cefotaxima 250 mg/l y fosfinotricina (PPT) 10 mg/l durante 8 semanas. Tanto el tratamiento antibiotico como el proceso de seleccion entero se realizaron a temperatura ambiente y a oscuras. El intervalo de subcultivo durante la seleccion fue normalmente de 3 semanas.
25.6 - Regeneracion de plantas transgenicas
Para la regeneracion de la planta, los eventos de callos que proliferan en presencia de PPT (resistentes) se colocan primero en medio de regeneracion (medio basal MS, sacarosa 30 g/l, mioinositol 100 mg/l, BAP 1 mg/l y Phytagel 2 g/l) complementado con cefotaxima, PPT o higromicina. Estos callos se mantuvieron a oscuras y a temperatura ambiente durante 1 semana y despues se emplazaron bajo luz durante 2-3 semanas para el desarrollo de los brotes. No hubo plantas albinas a rafz de la seleccion con PPT (el uso de higromicina como agente de seleccion provoca la aparicion de muchas plantas albinas).
25.7 - Induccion de raices y traslado al invernadero
Los pequenos brotes se separaron y se transfirieron a medio de regeneracion sin hormonas que contenfa PPT y cefotaxima para estimular el enraizamiento al tiempo que se mantenfa la presion de seleccion y se erradicaba cualquier celula superviviente de Agrobacterium. Las plantulas con raices bien desarrolladas (3-5 semanas) se trasladaron a suelo y se cultivaron en invernadero o en el campo.
25.8 - Vernalizacion y polinizacion cruzada de las plantas transgenicas
Las plantas transgenicas permanecieron al aire libre en un vivero con medidas de contencion (3-6 meses) hasta el solsticio de invierno en diciembre. Las plantas vernalizadas se trasladaron entonces al invernadero y se mantuvieron a 25°C bajo un fotoperfodo de 16/8 h y rodeadas de plantas naturales no transgenicas que las aislaron ffsicamente de otras fuentes de polen. Las plantas comenzaron a florecer 3-4 semanas despues de trasladarlas de nuevo al invernadero. Se fecundaron con el polen de las plantas naturales circundantes. Las semillas recogidas de cada planta transgenica se hicieron germinar en suelo a 25°C, y las plantas T1 se cultivaron en el invernadero para ser analizadas posteriormente.
25.9 - Otras gramineas diana
Otras gramineas que pueden ser blanco de la transformacion con AAD-1 con arreglo a la presente invencion son: espiguilla (Poa annua), pasto bahfa, grama de Bermuda, cerillos, bromo, agrostide comun (Agrostis capillaries), canamazo, alpiste, zacate amargo, ciempies, canuela roja encespedante (Festuca rubra commutata), garranchuelo, agrostide estolonffera (Agrostis stolonifera), rabillo de zorra (Koeleria macrantha), gramalote, festucas, Festolium, canuela de oveja (Festuca ovina), navajita pelillo, avenilla, canota, amor de hortelano, mezclas (equinas, pastos, etc.), gramineas autoctonas, dactilo, ballico (Lolium perenne), agrostide blanca, cebadilla, ballico perenne y ballico de Italia, canuela roja semirreptante (Festuca rubra trichophylla), canuela (Poa pratensis), cintillo, canuela roja reptante (Festuca rubra rubra), pasto del Sudan, pasto varilla, canuela alta (Festuca arundinacea), fleo, aira de cesped (Deschampsia caespitosa), cespedes diversos, grama y hierba Manila.
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Ejemplo 26 - AAD-1 (v3) en canola
26.1 - Transformacion de la canola
El gen AAD-1 (v3) que confiere resistencia frente al 2,4-D se uso para transformar plantas de Brassica napus var. Nexera* 710 con Agrobacterium. El constructo portador del gen aAD-1 (v3) estaba controlado por un promotor del CsVMV y el gen Pat por el promotor AtUbi10.
La superficie de las semillas se esterilizo con lejfa comercial al 10% y se lavaron tres veces con agua destilada esteril. A continuacion, se colocaron en medio basal MS diluido a la mitad (Murashige y Skoog, 1962) y se mantuvieron en un regimen de crecimiento a 25°C, con un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad.
De las plantulas de 5-7 dfas de edad se cortaron segmentos de hipocotilo (3-5 mm) y se colocaron en medio inductor de callo K1D1 (medio MS con cinetina 1 mg/l y 2,4-D 1 mg/l) durante 3 dfas como pretratamiento. Los segmentos se transfirieron a continuacion a una placa de Petri, donde fueron tratados con las cepas de Agrobacterium Z7075 o LBA4404 portadoras del pDAB721. Agrobacterium se habfa cultivado hasta el dfa siguiente a 28°C en oscuridad con un agitador a 150 rpm y despues se resuspendio en el medio de cultivo.
Finalizados los 30 min de tratamiento de los segmentos de hipocotilo con Agrobacterium, se volvieron a depositar en medio inductor de callo durante 3 dfas. Despues del cocultivo, los segmentos se colocaron en K1D1TC (medio inductor de callo con carbenicilina 250 mg/l y Timentin 300 mg/l) durante una semana para la recuperacion. Otra alternativa consistio en colocar directamente los segmentos en medio de seleccion K1D1H1 (el medio anterior pero con Herbiace 1 mg/l). La carbenicilina y el Timentin fueron los antibioticos utilizados para matar a Agrobacterium. El agente de seleccion Herbiace permitio el crecimiento de las celulas transformadas.
Muestras de callo de 35 eventos independientes se analizaron con PCR. Las 35 muestras arrojaron un resultado positivo para la presencia de AAD-1 (v3), mientras que los controles no transformados dieron negativo (apartado del ensayo de PCR). En diez muestras de callo se confirmo la expresion de la protefna AAD-1 con un ELISA (apartado de analisis de la protefna).
Los segmentos de hipocotilo transformados en callo se depositaron a continuacion en medio de regeneracion de brotes B3Z1H1 (medio MS, bencilaminopurina 3 mg/l, zeatina 1 mg/l, MES 0,5 g/l [acido 2-(N-morfolino) etanosulfonico], nitrato de plata 5 mg/l, Herbiace 1 mg/l, carbenicilina y Timentin). Al cabo de 3 semanas, los brotes comenzaron a regenerarse. Los segmentos de hipocotilo junto con los brotes se transfirieron a medio B3Z1H3 (medio MS, bencilaminopurina 3 mg/l, zeatina 1 mg/l, MES 0,5 g/l [acido 2-(N-morfolino) etanosulfonico], nitrato de plata 5 mg/l, Herbiace 3 mg/l, carbenicilina y Timentin) durante 3 semanas mas.
Los brotes se separaron de los segmentos de hipocotilo y se transfirieron a medio de elongacion de brotes MESH10 (MS, MES 0,5 g/l, Herbiace 10 mg/l, carbenicilina, Timentin) durante 2-4 semanas. Para inducir el enraizamiento, los brotes alargados se cultivaron en MSI.1 (MS con acido indolbutfrico 0,1 mg/l). Una vez las plantas mostraron un sistema radicular bien desarrollado, se plantaron en suelo. Las plantas se cultivaron en condiciones ambientales controladas en una camara Conviron durante 1-2 semanas antes del traslado al invernadero.
Las plantas T0 transformadas se autopolinizaron en el invernadero para obtener las semillas T1. Las plantas T0 y la progenie T1 fueron pulverizadas con un rango de concentraciones de herbicida para averiguar el nivel de proteccion conferida por el gen AAD-1 (v3).
26.2 - “Analisis molecular”: Materiales de canola y metodos
26.2.1 - Recoleccion del tejido, aislamiento y cuantificacion del ADN. Se coloco tejido fresco en tubos y se liofilizo a 4°C durante 2 dfas. Una vez completamente seco, se introdujo una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras de tejido se sometieron durante 1 minuto a molturacion en seco en un molino de perlas Kelco. A continuacion se procedio a aislar el ADN con el procedimiento DNeasy (Qiagen, DNeasy 69109). Una alfcuota del ADN extrafdo se tino con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyo en el fluorfmetro (BioTek) con patrones conocidos para obtener la concentracion en ng/pl.
26.2.2 - Reaccion en cadena de la polimerasa. Un total de 100 ng de ADN total se usaron como molde. 20 mM de cada cebador se usaron con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase kit (Mirus TAKRR001A). Los cebadores utilizados para la PCR de la region codificante del AAD-1 (v3) fueron (Directo-ATGGCTCATG CTGCCCTCAGCC) (SEC ID n° 27) y (Inverso-CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEC ID n° 28). La reaccion de PCR se llevo a cabo con un termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 2 minutos seguidos por 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron con electroforesis en un gel de agarosa al 1% tenido con EtBr. Treinta y cinco muestras de 35 plantas con eventos de AAD-1 (v3) dieron positivo. Tres muestras de control negativo dieron negativo.
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El ELISA descrito en el apartado anterior detecto la protefna AAD-1 en 10 eventos distintos de transformacion de canola. Los niveles de expresion oscilaron entre 150 y mas de 1000 ppm de protefna soluble total (TSP). Tres muestras diferentes de callos sin transformar se analizaron en paralelo sin que se detectara una senal sustancial, lo cual indica que los anticuerpos utilizados en el ensayo presentaban una fnfima reactividad cruzada con la matriz celular de canola. Un resumen de los resultados se presenta en la Tabla 38.
Tabla 38. Expresion de la AAD-1 en callos de canola.
n.° de muestra
Peso (mg) [TSP] (pg/mL) [AAD1] (ng/mL) Expression (ppm TSP) PCR de AAD1
1
114 757,02 119,36 157,67 +
2
55 839,79 131,84 156,99
3
53 724,41 202,12 279,01
4
52 629,01 284,89 452,92 +
5
55 521,75 175,88 337,08 +
6
61 707,69 74,24 153,71 +
7
51 642,02 559,11 1026,73
8
65 707,69 270,73 382,56 +
9
51 642,02 197,90 308,25 +
10
51 1417,42 220,63 156,66 +
Control 1
53 2424,67 18,67 7,70 -
Control 2
61 2549,60 35,00 13,73 -
Control 3
59 2374,41 22,79 9,60 -
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Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. Polinucleotido aislado que codifica una protefna que presenta una actividad de dioxigenasa dependiente de alfa- cetoglutarato, en el que dicha protefna degrada enzimaticamente un herbicida seleccionado de entre el grupo que consiste en un herbicida fenoxi auxina y un herbicida ariloxifenoxipropionato, en el que una molecula de acido nucleico que codifica dicha protefna hibrida en condiciones restrictivas con el complemento completo de una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 5, SEC ID n°: 3 y SEC ID n°: 4, en el que dicha protefna es por lo menos 70% identica a una protefna codificada por una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 3, SEC ID n°: 4 y SEC ID n°: 5, y en el que dicho polinucleotido esta ligado operativamente a un promotor que es funcional en una celula vegetal.
  2. 2. Polinucleotido aislado que codifica una protefna que presenta una actividad de dioxigenasa dependiente de alfa- cetoglutarato, en el que dicha protefna degrada enzimaticamente
    (i) un R-enantiomero de herbicidas fenoxi auxina quiral ademas de fenoxi auxinas aquirales,
    (ii) un herbicida ariloxifenoxipropionato, o
    (iii) un herbicida fenoxi auxina y un herbicida ariloxifenoxipropionato,
    en el que dicha molecula de acido nucleico que codifica dicha protefna hibrida en condiciones restrictivas con el complemento completo de una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 5, SEC ID n°: 3 y sEc ID n°: 4, en el que dicho polinucleotido esta ligado operativamente a un promotor que es funcional en una celula vegetal.
  3. 3. Polinucleotido segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho polinucleotido comprende una preferencia codonica que es optimizada para la expresion en una planta, preferentemente una planta dicotiledonea o una planta monocotiledonea.
  4. 4. Polinucleotido segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho polinucleotido codifica la protefna que presenta una actividad dioxigenasa dependiente de alfa-cetoglutarato R-especffica respecto a fenoxi auxinas quirales.
  5. 5. Polinucleotido segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho polinucleotido comprende la SEC ID n°: 5.
  6. 6. Polinucleotido segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho promotor es un promotor vegetal o de origen viral, preferentemente un promotor del virus del mosaico de la nervadura de mandioca.
  7. 7. Metodo para seleccionar una celula vegetal transformada, en el que dicho metodo comprende someter una pluralidad de celulas vegetales a transformacion con un polinucleotido segun la reivindicacion 1 o 2 y cultivar dichas celulas en una concentracion de un herbicida que permita a las celulas transformadas que expresan dicho polinucleotido crecer mientras se destruyen o se inhibe el crecimiento de las celulas no transformadas, en el que dicho herbicida es seleccionado de entre el grupo que consiste en una fenoxi auxina y un ariloxifenoxialcanoato.
  8. 8. Metodo para detectar si una planta comprende un polinucleotido segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho metodo comprende recoger una muestra de dicha planta y analizar dicha muestra respecto a la presencia de dicho polinucleotido.
  9. 9. Metodo segun la reivindicacion 8, en el que dicho metodo comprende analizar dicha muestra respecto a la presencia de una protefna codificada por dicho polinucleotido.
  10. 10. Metodo segun la reivindicacion 8, en el que dicho metodo comprende utilizar un cebador o sonda de PCR para detectar la presencia de dicho polinucleotido.
  11. 11. Metodo segun la reivindicacion 9, en el que dicho metodo comprende utilizar un anticuerpo para detectar la presencia de dicha protefna.
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