ES2435247T5 - Nuevo gen de resistencia a los herbicidas - Google Patents
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Description
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La SEC ID nº 28 es el cebador inverso para la PCR de la región codificante de AAD-1.
La SEC ID nº 29 es el nucleótido del AAD-2 (v2) (optimizado para vegetales).
La SEC ID nº 30 es la secuencia de la proteína AAD-2 (v2) traducida.
La SEC ID nº 31 es el cebador directo de AAD-1 para la PCR del fragmento de Southern.
La SEC ID nº 32 es el cebador inverso de AAD-1 para la PCR del fragmento de Southern.
Descripción detallada de la invención
El desarrollo de un gen de resistencia al 2,4-D y el subsecuente desarrollo de cultivos resistentes proporcionan excelentes opciones para el control de las malas hierbas latifolias y resistentes al glifosato (o muy tolerantes y modificadas) durante el cultivo. El 2,4-D es un potente herbicida contra latifolias, de amplio espectro y relativamente asequible que sería de gran utilidad para los agricultores si a los cultivos, tanto de dicotiledóneas como de monocotiledóneas, se les pudiera conferir una mayor tolerancia al mismo. Los cultivos de dicotiledóneas transgénicas tolerantes al 2,4-D también ofrecerían una mayor flexibilidad en cuanto al momento y la dosis de aplicación. Otra virtud de un carácter de tolerancia a herbicidas, en este caso al 2,4-D, sería su utilidad para prevenir daños en cultivos que normalmente son sensibles a la deriva, volatilización o inversión del 2,4-D (o cualquier otro fenómeno de desplazamiento fuera de lugar), aplicación errónea, vandalismo y similares. Otro beneficio del gen AAD-1 es que, a diferencia de todos los homólogos del tfdA caracterizados hasta el momento, la AAD-1 es capaz de degradar los R-enantiómeros (isómeros con actividad herbicida) de los herbicidas auxínicos fenoxi quirales (por ejemplo, diclorprop y mecoprop) además de los auxínicos fenoxi aquirales (como por ejemplo el 2,4-D, MCPA y ácido 4-clorofenoxiacético). Véase la Tabla 1. En todo el mundo se utilizan numerosas mezclas de diferentes combinaciones de herbicidas auxínicos fenoxi para combatir espectros específicos de malas hierbas en las diferentes condiciones ambientales imperantes. El uso del gen AAD-1 en vegetales conferiría protección frente a una gama mucho más amplia de herbicidas auxínicos fenoxi, lo cual mejora la flexibilidad y el espectro de malas hierbas que pueden ser controladas y protege a los cultivos de la deriva y de otros daños causados por el desplazamiento fuera de lugar de los herbicidas fenoxi en toda la gama de auxinas fenoxi comercializados.
Tabla 1. Herbicidas auxínicos fenoxi comerciales. Los herbicidas auxínicos fenoxi suelen nombrarse con el ácido activo, pero algunos se comercializan como formulaciones del éster correspondiente y estas también se consideran sustratos de la enzima AAD-1 en la planta puesto que las esterasas vegetales en general convierten dichos ésteres en los ácidos activos en la planta. También se puede hacer alusión a la sal orgánica o inorgánica del ácido correspondiente. Cuando se aluda a herbicidas quirales, ya sea en forma de éster, sal o ácido propiónico, los enantiómeros racémicos (R,S) u ópticamente puros (R o S) se considerarán el mismo herbicida a efectos de nombrar estos herbicidas, aunque los compuestos ópticamente puros reciban números CAS distintos. Los intervalos de dosificación utilizables pueden corresponder a tratamientos individuales o en combinación con otros herbicidas, tanto en aplicaciones agrícolas como de otro tipo.
- Tabla 1. Herbicidas auxínicos fenoxi comerciales.
- Nombre químico
- N°CAS Intervalos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Intervalos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura
- 2,4-D
-
94-75-7
25 -4000
280 -1120
imagen6
- 2,4,5-T
-
93-76-5
25 -4000
25 -4000
imagen7
- 4-CPA
-
122-88-3
25 -4000
25 -4000
imagen8
7
- Tabla 1. Herbicidas auxínicos fenoxi comerciales.
- Nombre químico
- N°CAS Intervalos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Intervalos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura
- 3,4-DA
-
588-22-7
25 -4000
25 -4000
imagen9
- MCPA
-
94-74-6
2S -4000
125 -1550
imagen10
- Dichlorprop
-
120-36-5
25 -12000
100 -2240
imagen11
- Mecoprop
-
7085-19-0
25 -4000
250 -3360
imagen12
- Cloprop
-
101-10-0
25 -4000
25 -4000
imagen13
- 4-CPP
-
3307-39-9
25 -4000
25 -4000
imagen14
- Fenoprop
-
93-72-1
25 -4000
25 -4000
imagen15
- 3,4-DP
-
3307-41-3
25 -4000
25 -4000
imagen16
Otro beneficio más del gen AAD-1 es su capacidad sin precedentes para degradar simultáneamente una multitud de graminicidas comerciales y no comerciales pertenecientes a la clase general de los ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Véase la Tabla 2. Esta característica hace posible la utilización de una serie de compuestos AOPP en cultivos
5 transgénicos portadores del AAD-1, cultivos cuya tolerancia no era posible garantizar hasta ahora. Entre estos se hallan sobre todo cereales como el maíz, arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo, especies de césped para clima templado y frío, hierbas de pasto y muchas otras, pero también podría incluir cultivos de dicotiledóneas en que la tolerancia al AOPP (presente de forma natural en la mayoría de las dicotiledóneas) no alcanza niveles comercialmente aceptables para permitir su uso.
10 Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre común aceptado. Los herbicidas AOPP se denominan en general por su ácido activo, pero la mayoría están formulados comercialmente en diversas formulaciones de éster y
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estos también se consideran sustratos de la enzima AAD-1 en la planta, puesto que las esterasas vegetales en general convierten estos ésteres en los ácidos activos en la planta. También se puede hacer alusión a la sal orgánica o inorgánica del ácido correspondiente. Cuando se aluda a herbicidas quirales, ya sea en forma de éster, sal o ácido propiónico, los enantiómeros racémicos (R,S) u ópticamente puros (R o S) se considerarán el mismo herbicida a efectos de nombrar estos herbicidas, aunque los compuestos ópticamente puros reciban números CAS distintos. Los intervalos de dosificación utilizables pueden corresponder a tratamientos individuales o en combinación, tanto en aplicaciones agrícolas como de otro tipo.
- Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre común aceptado.
- Nombre químico
- N°CAS Intervalos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Intervalos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura
- Clorazifop
-
72492-94-7
10-2000
10-2000
imagen17
- Clodinafop
-
105512-06-9
10-2000
20-200
imagen18
- Clofop
-
59621-49-7
10-2000
10-2000
imagen19
- Cyhalofop
-
122008-85-9
10-2000
105-560
imagen20
- Diclofop
-
71283-65-3
10-2000
280-2000
imagen21
- Fenoxaprop
-
66441-23-4
10-2000
20-200
imagen22
- Fenthiaprop
-
95721-12-3
10-2000
10-2000
imagen23
- Fluazifop
-
69335-91-7
10-2000
25-420
imagen24
- Haloxyfop
-
69806-40-2
10-2000
20-600
imagen25
- Isoxapyrifop
-
87757-18-4
10-2000
30-240
imagen26
- Metamifop
-
256412-89-2
10-2000
35-280
imagen27
- Propaquizafop
-
111479-05-1
10-2000
30-240
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9 5
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- Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre común aceptado.
- Nombre químico
- N°CAS Intervalos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Intervalos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura
- Quizalofop
-
76578-14-8
10-2000
20-240
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- Trifop
-
58597-74-4
10-2000
10-2000
imagen30
Se ha logrado identificar un gen único (AAD-1) que, introducido mediante técnicas de ingeniería genética para expresión en vegetales, permite utilizar herbicidas auxínicos fenoxi en plantas que o bien no poseen una tolerancia intrínseca o bien resulta insuficiente para permitir su uso. Asimismo, el AAD-1 puede proteger a la planta contra los herbicidas AOPP en aquellos casos en que la tolerancia natural tampoco es suficiente para garantizar la selectividad. Las plantas que sean portadoras únicamente del AAD-1 podrán ser tratadas de manera secuencial o simultánea con uno, dos o una combinación de varios herbicidas auxínicos fenoxi. La dosis de cada herbicida auxínico fenoxi puede oscilar entre 25 y 4.000 g e.a./ha, y más habitualmente entre 100 y 2.000 g e.a./ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas dicotiledóneas. De modo similar, se pueden aplicar uno, dos o una mezcla de varios graminicidas AOPP a plantas que expresan el AAD-1 con un menor riesgo de daños provocados por tales herbicidas. La dosis de cada AOPP puede oscilar entre 10 y 2.000 g e.a./ha, y más habitualmente entre 20500 g e.a./ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas monocotiledóneas. Las combinaciones de tales clases químicas y herbicidas con distintos mecanismos de acción y espectros en el mismo campo (secuencial o simultáneamente en la mezcla de tanque) permitiría controlar la mayoría de malas hierbas que se pretenden controlar con herbicidas.
El glifosato es un herbicida muy utilizado porque controla un espectro amplísimo de malas hierbas latifolias y gramíneas. No obstante, su uso reiterado en cultivos GTC y en otras aplicaciones no agrícolas ha provocado, y continuará provocando, la selección de malas hierbas que son tolerantes naturales o biotipos resistentes al mismo. La mayoría de las estrategias para la prevención de la resistencia a herbicidas propugnan como método para retrasar la aparición de malezas resistentes la adición a la mezcla de tanque de otros herbicidas dotados de mecanismos de acción distintos, en dosis que permitan controlar la especie en cuestión. El apilamiento del AAD-1 con un carácter de tolerancia al glifosato (y/o con otros caracteres de tolerancia a herbicidas) podría proporcionar un mecanismo para controlar las malas hierbas resistentes al glifosato (ya sean gramíneas por medio de uno o varios herbicidas AOPP, o dicotiledóneas con uno o varios auxínicos fenoxi) en GTC al permitir el uso del glifosato y de uno
o varios herbicidas auxínicos fenoxi (por ejemplo, el 2,4-D) y AOPP (por ejemplo, quizalofop) de manera selectiva en el mismo cultivo. Las aplicaciones de estos herbicidas podrían ser simultáneas, con una mezcla de tanque que contenga dos o más herbicidas con diferentes mecanismos de acción; aplicaciones individuales de una sola composición herbicida en aplicaciones secuenciales en presiembra, preemergencia o postemergencia y fraccionamiento de las aplicaciones entre 2 horas y 3 meses; o, alternativamente, se puede aplicar cualquier combinación de cualquier número de herbicidas representativos de cada clase química en cualquier momento en el plazo de 7 meses desde la siembra del cultivo hasta la cosecha (o el intervalo de seguridad antes de la cosecha del herbicida, el que sea más corto).
El control de un amplio espectro de malas hierbas gramíneas y latifolias requiere disponer de flexibilidad en términos del calendario de aplicación, dosis de herbicidas y capacidad para controlar malezas difíciles o resistentes. Las aplicaciones de glifosato en un cultivo portador de un apilamiento de gen de resistencia al glifosato/AAD-1 podrían oscilar entre 250-2.500 g e.a./ha; la del o los herbicidas auxínicos fenoxi entre 25-4.000 g e.a./ha; y la del o los herbicidas AOPP entre 10-2.000 g e.a./ha. Las combinaciones y el calendario de aplicación más adecuados dependen de cada situación, de las especies implicadas y del entorno, decisiones que corresponden a un experto en control de malas hierbas que conozca los pormenores de esta invención.
Las formulaciones herbicidas (por ejemplo, formulación de éster, ácido o sal; o concentrado soluble o emulsificable,
o líquido soluble) y los aditivos para la mezcla en tanque (por ejemplo, adyuvantes o agentes de compatibilidad) pueden modificar sustancialmente la capacidad del herbicida o de una combinación de ellos para controlar las malas hierbas. Cualquier combinación de los anteriores con cualquiera de las clases químicas de herbicida mencionadas está comprendida en el alcance de la presente invención.
Un experto en la materia también sabrá apreciar que el beneficio ofrecido por la combinación de dos o más mecanismos de acción para aumentar el espectro de malas hierbas controladas y/o controlar especies que de forma natural son más tolerantes o resistentes también puede hacerse extensible a aquellas clases químicas de herbicidas a las que los cultivos son tolerantes debido a la acción humana (por métodos transgénicos y de otro tipo) y que trascienden los GTC. Así pues, los caracteres que codifican la resistencia al glifosato (por ejemplo los genes de
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Los grupos oxialcanoato son útiles para introducir en los herbicidas una funcionalidad de ácido estable. El grupo ácido puede facilitar el desplazamiento por el floema gracias al “atrapamiento ácido”, un atributo deseable para la acción herbicida y que podría incorporarse a nuevos herbicidas para mejorar su movilidad. Ciertos aspectos de la presente invención también proporcionan un mecanismo para crear HTC. Existen muchos herbicidas comerciales y experimentales que podrían servir como sustratos de la AAD-1. Por ello, el uso de los genes de interés también podría conferir tolerancia a esos otros herbicidas.
Las características de HTC de la presente invención pueden ser utilizadas en combinaciones novedosas con otras características de HTC (como, por ejemplo, la tolerancia al glifosato). Tales combinaciones de caracteres dan lugar a métodos novedosos para controlar las malas hierbas (y especies similares), gracias a la nueva resistencia adquirida
o a la tolerancia intrínseca a los herbicidas (por ejemplo al glifosato). Por consiguiente, además de los características de HTC, comprendidas en el alcance de la invención se encuentran incluidos nuevos métodos para el control de las malas hierbas con herbicidas, en que la tolerancia a estos se crea mediante dicha enzima en cultivos transgénicos.
Adicionalmente, los cultivos tolerantes al glifosato predominan en todo el mundo. Cultivados muchas veces en rotación con otros cultivos tolerantes al glifosato, el control de los ricios resistentes al glifosato puede resultar difícil en los cultivos rotativos. Por ello, el uso de los caracteres transgénicos de la presente invención, apilados o insertados individualmente en los cultivos, proporciona una herramienta para controlar otros cultivos HTC que aparecen como ricios.
Esta invención se puede aplicar en el contexto de la comercialización de un carácter de resistencia al 2,4-D apilado con caracteres ya disponibles de resistencia al glifosato en plantas de soja, por ejemplo. Por ello, la presente invención proporciona una herramienta para combatir los cambios en las arvenses latifolias y/o la selección de latifolias resistentes a herbicidas, consecuencias del intensísimo uso del glifosato contra las malas hierbas en diversos cultivos.
La expresión transgénica de los genes AAD-1 de interés se ha logrado, entre otros ejemplos, en Arabidopsis, maíz, tabaco, algodón, arroz, soja y canola, lo que no obsta para que la presente invención pueda aplicarse en cualquier otro tipo de plantas deseado. La soja es un cultivo preferido para la transformación según la presente invención. No obstante, esta invención puede ser aplicada a otros muchos cultivos de gramíneas y latifolias. De igual forma, el 2,4-D puede ser utilizado mejor en cultivos de gramíneas cuya tolerancia al mismo es moderada y en los que la mejora de dicha tolerancia por medio de este carácter proporcionaría a los cultivadores la oportunidad de utilizar el 2,4-D en dosis más eficaces y durante más tiempo sin riesgo de dañar el cultivo.
Es más, la presente invención utiliza un único gen que puede proporcionar resistencia a herbicidas que controlan malas hierbas de hoja ancha (auxínicos) y gramíneas (AOPP). Este gen podría ser utilizado en múltiples cultivos, lo que permetiría el uso de una combinación de herbicidas de amplio espectro. La presente invención también puede controlar las malas hierbas resistentes a los herbicidas disponibles y ayudar a controlar los cambios en la flora arvense causados por las prácticas agronómicas actuales. La AAD-1 de interés también puede ser utilizada para neutralizar con eficacia otros sustratos herbicidas transformándolos en compuestos sin actividad herbicida. Por todo ello, la presente invención facilita el desarrollo de otros caracteres para HTC y/o de técnicas de marcadores seleccionables.
Con independencia del uso de los genes de interés para producir HTC, o como un añadido al mismo, los genes de interés también se pueden utilizar como marcadores seleccionables para seleccionar los transformantes en cultivos celulares, en invernadero o en el campo. Los genes de interés poseen un gran valor intrínseco simplemente como marcadores seleccionables para proyectos de biotecnología. La promiscuidad de la AAD-1 frente a otros herbicidas auxínicos fenoxialcanoicos brinda muchas oportunidades para utilizar este gen en aplicaciones de HTC y/o como marcador seleccionable.
Un gen, denominado en la presente memoria AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa), se clonó de Sphingobium herbicidovorans (ATCC 700291) mediante una PCR en pET 280-S/S (designado pDAB 3203) y se expresó en E.coli BL-21 Star. Cuando este gen se sobreexpresa (inducción con IPTG 1 mM y lisado de cultivo combinado con la siguiente mezcla de reacción: 2,4-D 112,5 µg/ml, ácido ascórbico 1 mM, α-cetoglutarato 1 mM, Fe(NH4)2(SO4)2 50 µM), la enzima recombinante resultante degrada el 2,4-D transformándolo en DCP, compuesto que carece de actividad herbicida (determinado por HPLC, espectrometría de masas, colorimetría y bioanálisis en placa con Arabidopsis). Además, se ha demostrado que la AAD-1 convierte los siguientes herbicidas en su correspondiente fenol inactivo: diclorprop, mecoprop, haloxifop, diclofop y otros (véanse las Tablas 3 y 4).
Tabla 3: Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varias auxinas y análogos auxínicos dotados de acción herbicida. Los sustratos se analizaron a una concentración de 1 mM en MOPS 25 mM y pH 6,8, Fe2+ 200 µM, ascorbato sódico 200 µM, α-cetoglutarato 1 mM utilizando 1 µg o 10 µg (10X) de AAD-1 (v1) purificada por ensayo de 0,16 ml.
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- Tabla 3. Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varios compuestos auxínicos y análogos auxínicos dotados de acción herbicida
- ESTRUCTURA
- ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x)
- imagen33
- 117613 (R,S)-diclorprop 0,566 2,594 imagen33 398166 sesona 0,02 0,177
- imagen33
- 188874 (R,S)-mecoprop 0,341 2,085 imagen33 190252 0,008 0,211
- imagen33
- 83293 (R,S)-2-cloro, 4fluorofenoxiproprionato 0,304 2,358 I 124988 0,007 0,058
- imagen33
- 11113675 (R,S)-3aminodiclorpop 0,228 2,676 imagen33 11263526 0,004 0,069
- imagen33
- 188476 0,077 0,687 imagen33 178577 0,003 0,021
- imagen33
- 192132 0,064 0,204 imagen33 178587 0,003 0,02
- imagen33
- 195517 2,4-D 0,034 0,383 imagen33 188527 0,003 0,036
Tabla 4: Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varios graminicidas AOPP y análogos y sobre cloquintocet. Los sustratos se analizaron a una concentración de 1 mM en MOPS 25 mM y pH 6,8, Fe2+ 200 µM, ascorbato sódico 200 µM, α-cetoglutarato 1 mM utilizando 1 µg o 10 µg (10X) de AAD-1 (v1) purificada por ensayo de 0,16 ml.
- Tabla 4. Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varios graminicidas AOPP y análogos y sobre cloquintocet.
- ESTRUCTURA
- ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x)
- imagen33
- 18706 (R)quizalofop 0,43 2,1 imagen33 460511 (R,S)diclofop 0,155 1,663
- imagen33
- 67131 (R.S)fluazifop 0,427 2,17 imagen33 25646 0,144 1,69
- imagen33
- 11044492 (R)fenoxaprop 0,408 0,597 I 70222 (R,S)clorazlfop 0,128 1,584
- imagen33
- 34697 (R,S)clodinofop 0,295 1,98 imagen33 199608 cihalofop 0,114 1,26
- o
-
14603 14623
(R)cihalofop (R,S)cyhalofop
0,222 0,215
1,989 1,815
imagen34 43865 7466 haloxifopoxiacetato (S)-cihalofop 0,004 0,003 0,053 0,017
- imagen33
- 62942 (R,S)fenthiaprop 0,199 1,055 imagen33 204558 Cloquintocet 0 0,001
- imagen33
- 66905 haloxifop 0,172 1,63
Proteínas (y aislamientos fuente). La presente invención utiliza proteínas funcionales. Por “actividad funcional” (o “activo/a”) se hace referencia en la presente memoria a que las proteínas/enzimas destinadas al uso según la
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presente invención poseen la capacidad para degradar o disminuir la actividad de un herbicida (solas o en combinación con otras proteínas). Las plantas que producen proteínas de la presente invención preferiblemente producirán “una cantidad efectiva” de la proteína, de modo que cuando la planta sea tratada con un herbicida, el nivel de expresión de la proteína será suficiente para convertir a la planta en parcial o totalmente resistente o tolerante al herbicida (a una dosis habitual, si no se indica otra cosa; las dosis de aplicación habituales se pueden encontrar en el conocido Herbicide Handbook (Weed Science Society of America, 8ª edición, 2002), por ejemplo). El herbicida se puede aplicar en dosis que normalmente matarían a la planta diana, en concentraciones y dosis normales en el campo. (Debido a la invención de interés, el nivel y/o la concentración podrían ser mayores que las utilizadas hasta ahora). Preferiblemente, las células vegetales y las plantas de la presente invención resultan protegidas contra la inhibición del crecimiento o los daños causados por el tratamiento herbicida. Las plantas y las células vegetales transformadas de la presente invención preferiblemente se convierten en resistentes o tolerantes a un herbicida, como se expone en la presente memoria, lo cual significa que la planta y las células vegetales transformadas pueden crecer en presencia de cantidades eficaces de uno o varios herbicidas como se expone en la presente memoria. Las proteínas preferidas poseen actividad catalítica para metabolizar uno o más compuestos de ariloxialcanoato.
La transferencia de la actividad funcional a los sistemas vegetales o bacterianos puede implicar una secuencia de ácidos nucleicos, la codificación de la secuencia de aminoácidos de una proteína de la presente invención integrada en un vector de expresión proteica adecuado para el hospedador en el que reside el vector. Una forma de obtener una secuencia de ácidos nucleicos que codifique una proteína con actividad funcional consiste en aislar el material genético natural de la especie bacteriana que sintetiza la proteína de interés, utilizando información deducida de la secuencia de aminoácidos de la proteína, como se revela en la presente memoria. Las secuencias naturales pueden ser optimizadas para la expresión en plantas, por ejemplo, tal y como se expone con mayor detalle a continuación. También se puede diseñar un polinucleótido optimizado a partir de la secuencia de la proteína.
La presente invención utiliza clases de proteínas dotadas de actividades novedosas como las indicadas en la presente memoria. Una forma de caracterizar dichas clases de proteínas y los polinucleótidos que las codifican consiste en definir un polinucleótido por su capacidad para hibridarse, bajo un intervalo de condiciones concretas, con una secuencia de nucleótidos ejemplificada (la complementaria de la misma y/o una sonda o sondas derivadas de una de las hebras) y/o por su capacidad para ser amplificada mediante PCR con cebadores derivados de las secuencias ejemplificadas.
Existen varios métodos para obtener las proteínas destinadas al uso según la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos dirigidos contra las proteínas reveladas en la presente memoria con el fin de identificar y aislar otras proteínas en una mezcla. En concreto, se pueden generar anticuerpos contra las porciones de las proteínas que están más conservadas o que son más distintas de otras proteínas relacionadas. Esos anticuerpos se pueden utilizar entonces para identificar específicamente proteínas equivalentes dotadas de la actividad característica mediante inmunoprecipitación, enzimoinmunoadsorción (ELISA) o inmunotransferencia. Los anticuerpos contra las proteínas mostradas en la presente memoria, o contra proteínas equivalentes, o fragmentos de dichas proteínas, se pueden preparar fácilmente con procedimientos ordinarios. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, preferiblemente producidos en respuesta a una proteína ejemplificada o sugerida.
Resultará evidente para un experto en la materia que las proteínas (y los genes) de la presente invención se pueden obtener de diversas fuentes. Dado que ciertos elementos transponibles como los plásmidos codifican operones de degradación de herbicidas enteros, y que estos también pueden estar integrados en el genoma, es posible obtener proteínas de la presente invención de una amplia variedad de microorganismos, entre ellos bacterias recombinantes y/o naturales. Otros miembros de los órdenes Firmicutes y Proteobacteria, así como géneros portadores del rdpA, como Sphingobium, Delftia, Rodoferax y Comamonas, entre otros, pueden ser utilizados como fuentes.
También es posible fabricar mutantes de aislamientos bacterianos mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la disciplina. Por ejemplo, se pueden obtener mutantes asporógenos de un aislamiento mediante mutagénesis con etilmetanosulfonato (EMS). También se pueden conseguir mutantes con luz ultravioleta y nitrosoguanidina por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica.
Una proteína “procedente de” u “obtenible de” cualquiera de los aislamientos de interés referidos o sugeridos en la presente memoria significa que la proteína (o una proteína similar) se puede obtener del aislamiento o de alguna otra fuente, como otra cepa bacteriana o una planta. “Derivado de” también tiene esta connotación e incluye proteínas obtenibles de un tipo determinado de bacteria que ha sido modificada para la expresión en una planta, por ejemplo. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que, dado que se trata de un gen y de una proteína de origen bacteriano, es posible modificar una planta con técnicas de ingeniería genética para que produzca la proteína. Se pueden disponer preparaciones de anticuerpos, sondas de ácidos nucleicos (ADN, ARN o APN, por ejemplo) y similares utilizando el polinucleótido y/o las secuencias de aminoácidos revelados en la presente memoria, con el fin de detectar y recuperar otros genes relacionados en otras fuentes (naturales).
Es posible utilizar técnicas ordinarias de biología molecular para clonar y secuenciar las proteínas y los genes
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La formación de la molécula bicatenaria y su estabilidad dependen de la existencia de una complementariedad sustancial entre las dos hebras del híbrido y, como se ha indicado antes, resulta tolerable un cierto grado de desapareamiento. Por tanto, las secuencias de las sondas incluyen mutaciones (únicas y múltiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas y de combinaciones de las mismas, en las que dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido diana de interés. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en un polinucleótido dado de muchas maneras, y tales métodos son conocidos por una persona versada en la materia. En el futuro, podrían aparecer nuevos métodos.
Técnica de PCR. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una síntesis enzimática, repetitiva y conservadora de una secuencia de ácidos nucleicos. Este procedimiento es bien conocido y utilizado habitualmente por los expertos en la materia (véase Mullis, Patentes US nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159; Saiki et al., 1985). La PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que está flanqueado por dos cebadores oligonucleótidos que hibridan con las hebras opuestas de la secuencia diana. Los cebadores se orientan preferiblemente con sus extremos 3′ encarados. Los repetidos ciclos de desnaturalización térmica del molde, la reasociación de los cebadores con sus secuencias complementarias y la extensión de los cebadores reasociados por medio de una ADN polimerasa dan como resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5′ de los cebadores de PCR. El producto de la extensión de cada cebador puede servir como molde para el otro cebador, de modo que con cada ciclo se duplica la cantidad del fragmento de ADN producida en el ciclo anterior. Esto provoca la acumulación exponencial del fragmento diana específico, hasta alcanzar varios millones de copias en pocas horas. Por medio de una ADN polimerasa termoestable como la polimerasa Taq, aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, el proceso de amplificación puede automatizarse completamente. Los expertos en la materia conocen otras enzimas adecuadas.
Las secuencias de ADN ejemplificadas, o segmentos de las mismas, pueden ser utilizadas como cebadores para la amplificación por PCR. Durante este proceso de amplificación, resulta tolerable un cierto grado de desapareamiento entre las bases del cebador y del molde, como mutaciones, deleciones e inserciones (especialmente adiciones de nucleótidos en el extremo 5′) en los cebadores ejemplificados. Cualquier persona versada en la técnica conoce métodos para producir mutaciones, inserciones y deleciones en un cebador.
Modificación de genes y proteínas. Los genes y las proteínas de interés pueden fusionarse con otros genes y proteínas para producir proteínas quiméricas o de fusión. Los genes y proteínas útiles según la presente invención no sólo incluyen las secuencias enteras ejemplificadas específicamente, sino también porciones, segmentos y/o fragmentos (incluidos fragmentos contiguos y deleciones internas y/o terminales respecto a las moléculas enteras) de tales secuencias, variantes, mutantes, quimeras y fusiones de los mismos. Las proteínas pueden tener aminoácidos sustituidos siempre que conserven la actividad funcional deseada. Los genes “variantes” tienen secuencias de nucleótidos que codifican las mismas proteínas o proteínas equivalentes dotadas de una actividad equivalente o similar a una proteína ejemplificada. Los términos “proteínas variantes” y “proteínas equivalentes” se refieren a proteínas dotadas de la misma o básicamente la misma actividad biológica/funcional contra las plagas diana y las secuencias equivalentes como las proteínas expuestas a modo de ejemplo. En la presente memoria, la alusión a una secuencia “equivalente” concierne a secuencias portadoras de sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que mejoran o que no afectan negativamente a la actividad en un grado significativo. Los fragmentos que conservan la actividad también quedan incluidos en esta definición. Los fragmentos y otros equivalentes que conserven una función o actividad igual o similar a la de un fragmento correspondiente de una proteína ejemplificada quedan incluidos dentro del ámbito de la presente invención. Se pueden hacer cambios, como sustituciones o adiciones de aminoácidos, con diversos fines, tales como aumentar (o disminuir) la estabilidad frente a proteasas de la proteína (sin disminuir material o sustancialmente la actividad funcional de la misma), eliminar o añadir una diana de restricción, y similares. Se pueden construir fácilmente variaciones de genes utilizando, por ejemplo, técnicas ordinarias que provocan mutaciones puntuales.
Además, la patente US nº 5.605.793, por ejemplo, describe métodos para generar una diversidad molecular adicional utilizando el reensamblaje de ADN tras una fragmentación al azar o dirigida. Ésta se puede denominar transposición de genes (shuffling), proceso que normalmente implica la mezcla de fragmentos (de un tamaño idóneo) de dos o más moléculas de ADN distintas, seguida por repetidas rondas de renaturalización. Esto puede mejorar la actividad de una proteína codificada por un gen inicial. El resultado es una proteína quimérica dotada de una actividad mejor, de una especificidad por el sustrato alterada, mayor estabilidad enzimática, estereoespecificidad alterada, u otras características.
La transposición se puede diseñar y dirigir después de obtener y examinar las coordenadas atómicas 3D (tridimensionales) y la estructura cristalina de la proteína de interés. Por tanto, la “transposición dirigida” se puede dirigir a ciertos segmentos de una proteína idóneos para ser modificados, como los segmentos expuestos en la superficie, y preferiblemente no a segmentos internos implicados en el plegamiento de la proteína y que resulten esenciales para mantener la integridad de su estructura 3D.
Se pueden utilizar genes variantes para producir proteínas variantes; de modo similar se pueden utilizar hospedadores recombinantes para producir las proteínas variantes. Utilizando las citadas técnicas de “transposición de genes” se pueden construir genes y proteínas equivalentes que comprenden 5, 10 ó 20 residuos contiguos
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-
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