ES2411479T3 - Clados de virus adeno-asociados (AAV), secuencias, vectores que los contienen, y usos de los mismos - Google Patents

Clados de virus adeno-asociados (AAV), secuencias, vectores que los contienen, y usos de los mismos Download PDF

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James M. Wilson
Guangping Gao
Mauricio R. Alvira
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Abstract

Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una cápside de AAV de serotipo 9, en el que la cápside de AAV9 es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos 203 a 736 de SEQ ID Núm. 123, y en el que el AAV comprende además un minigén que tiene repeticiones terminales de AAV invertidas y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias regulatorias que dirigen su expresión en una célula anfitrión.

Description

Clados de virus adeno-asociados (AAV), secuencias, vectores que los contienen, y usos de los mismos.
Declaracion relacionada con la investigacion o el desarrollo patrocinados por el gobierno federal
Esta solicitud contiene un trabajo soportado por subvenciones N100K P30 0K47757 y HLB1 P01 HL59407 del 1nstituto Nacional de Salud (N1H). El gobierno de U.S. puede tener ciertos derechos en la presente invenci6n.
Antecedentes de la invencion
El virus adeno-asociado (AAV), un miembro de la familia de los Parvovirus, es un virus pequeno icosaedrico, sin envoltura, con genomas de A0N lineales de cadena recta de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV se asigna al genero Oependovirus, puesto que el virus fue descubierto como un contaminante en poblaciones purificadas de adenovirus. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infecci6n, son integrados especificamente en el sitio en cromosomas anfitri6n, y una fase infecciosa en la que, a continuaci6n de la infecci6n ya sea por adenovirus o ya sea por virus de herpes simplex, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no-patogenicidad, la amplia gama de infectividad del anfitri6n, incluyendo las celulas que no se dividen, y la integraci6n cromos6mica potencial especifica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para transferencia de gen.
Los recientes estudios sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehiculo preferido para el suministro de genes. Hasta la fecha, han existido varios AAVs diferentes bien caracterizados, aislados a partir de humanos o de primates no humanos (NHP).
Se ha encontrado que los AAVs de diferentes serotipos presentan diferentes eficacias de transfecci6n, y presentan tambien tropismo para diferentes celulas o tejidos. Sin embargo, la relaci6n entre estos diferentes serotipos no ha sido explorada con anterioridad.
Lo que resulta deseable son construcciones basadas en AAV para el suministro de moleculas heterogeneas.
Sumario de la invencion
La presente invenci6n incluye "superfamilias" o "Clados" de AAV de secuencias relacionadas filogeneticamente. Estos Clados de AAV proporcionan una fuente de secuencias de AAV utiles para objetivar y/o suministrar moleculas a celulas o tejidos objetivo deseados.
En un aspecto, la invenci6n proporciona virus adeno-asociados (AAV) que comprenden una capside de AAV de serotipo 9 en el que la capside de AAV9 es al menos un 95% identica a la secuencia de aminoacidos 203 a 736 de SEQ 10 Num. 123, y en el que el AAV comprende ademas un minigen que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heter6logo enlazado operativamente a secuencias regulatorias que implica directamente su expresi6n en la celula anfitri6n.
La invenci6n proporciona tambien una proteina de capside aislada que comprende un virus adeno-asociado de proteina de capside de serotipo 9 (AAV9) elegido en el grupo consistente en: proteina de capside vp1, aminoacidos (aa) 1 a 736, SEQ 10 Num. 123; proteina de capside vp2, aa 138 a 736, SEQ 10 Num. 123; y proteina de capside vp3, aa 203 a 736, SEQ 10 Num. 123, asi como virus adeno-asociados (AAV) recombinantes que comprenden tales proteinas de capside.
Adicionalmente, la invenci6n se extiende a moleculas de acido de nucleico que codifican tales proteinas de capside, incluyendo nt 1 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 (vp1), nt 411 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 (vp2), y nt 609 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 (vp3). Tales moleculas de acido nucleico pueden comprender adicionalmente una secuencia de AAV que codifica una proteina rep funcional de AAV.
Segun otro aspecto, la invenci6n proporciona un metodo de generaci6n de un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una capside de AAV, que comprende las etapas de cultivar una celula anfitri6n que contiene: (a) moleculas que codifican una proteina de capside de AAV; (b) un gen rep funcional; (c) un minigen que comprende repeticiones terminales invertidas de AAV (1TRs) y un transgen; y (d) funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigen en la proteina de capside de AAV, en el que dicha celula anfitri6n comprende una molecula de acido nucleico conforme a la invenci6n.
Los vectores construidos con este huAAV9 han mostrado eficacias de transferencia de gen similares al AAV8 en el higado, superiores al AAV1 en el musculo, y 200 veces mas altas que el AAV5 en el pulm6n. Ademas, este novedoso serotipo de AAV humano comparte menos de un 85% de identidad de secuencia con los AAV1 a AAV8 descritos con anterioridad, y no es susceptible de neutralizaci6n cruzada por parte de cualquiera de estos AAVs.
La presente invenci6n proporciona tambien composiciones que contienen estas secuencias, y hace uso de las mismas. Ventajosamente, estas composiciones son particularmente adecuadas para su uso en composiciones que requieren la readministraci6n de vectores de AAV con fines terapeuticos o profilacticos.
Estos y otros aspectos de la invenci6n resultaran facilmente evidentes a partir de la descripci6n detallada que sigue de la invenci6n.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un arbol que muestra la relaci6n filogenica construida con la utilizaci6n de Neighbor-Joining heuristica con medici6n de distancia de correcci6n de Poisson. La relaci6n fue determinada en base a la proteina de capside vp1 de AAV aislado, con el AAV aislado agrupado en clados. Los grupos de clones de capside individuales se clasifican en clados en base a su ascendencia comun. La nomenclatura del clado va desde A a F; los subtipos estan representados por la letra del clado seguida de un numero;
Las Figuras 2A-2E son un alineamiento de las secuencias de aminoacido de proteinas de capside vp1 de AAV con la numeraci6n de las secuencias individuales informadas, y publicadas previamente: AAV1 [SEQ 10 Num. 219]; AAV2 [SEQ 10 Num. 221]; AAV3-3 [SEQ 10 Num. 217]; AAV4-4 [SEQ 10 Num. 218]; AAV5 [SEQ 10 Num. 216]; AAV6 [SEQ 10 Num. 220]; AAV7 [SEQ 10 Num. 222]; AAV8 [SEQ 10 Num. 223]; y, rh. 25/42; 29.3/bb.1; cy.2; 29.5/bb.2; rh.32, rh.33, rh.34, rh.10; rh.24, rh.14, rh.16, rh.17, rh.12, rh.18, rh.21 (denominado anteriormente 41.10); rh.25 (denominado anteriormente 41.15); rh.2; rh.31; cy.3; cy.5; rh.13; cy.4; cy.6; rh.22; rh.19; rh.35; rh.37; rh.36; rh.23; rh.8, y ch.5 [Solicitud de Patente US publicada num. 2003/0138772 A1 (24 de Julio de 2003)]. Las secuencias incluyen hu.14/AAV9 [SEQ 10 Num. 123]; hu.17 [SEQ 10 Num. 83], hu.8 [SEQ 10 Num. 84], hu.42 [SEQ 10 Num. 85], rh.38 [SEQ 10 Num. 86], hu.40 [SEQ 10 Num. 87], hu.37 [SEQ 10 Num. 88],rh.40 [SEQ 10 Num. 92], rh.52 [SEQ 10 Num. 96]; rh.53 [SEQ 10 Num. 97]; rh.49 [SEQ 10 Num. 103]; rh.51 [SEQ 10 Num. 104]; rh.57 [SEQ 10 Num. 105]; rh.58 [SEQ 10 Num. 106], rh.61 [SEQ 10 Num. 107]; rh.50 [SEQ 10 Num. 108]; rh.43 [SEQ 10 Num. 163]; rh.62 [SEQ 10 Num. 114]; rh.48 [SEQ 10 Num. 115]; 4-9/rh.54 (SEQ 10 Num. 116); y 4-19/rh.55 (SEQ 10 Num. 117); hu.31 [SEQ 10 Num. 121]; hu.32 [SEQ 10 Num. 122]; hu.34 [SEQ 10 Num. 125]; hu.45 [SEQ 10 Num. 127]; hu.47 [SEQ 10 Num. 128]; hu.13 [SEQ 10 Num. 129]; hu.28 [SEQ 10 Num. 130]; hu.29 [SEQ 10 Num. 132]; hu.19 [SEQ 10 Num. 133]; hu.20 [SEQ 10 Num. 134]; hu.21 [SEQ 10 Num. 135]; hu.23.2 [SEQ 10 Num. 137]; hu.22 [SEQ 10 Num. 138]; hu.27 [SEQ 10 Num. 140]; hu.4 [SEQ 10 Num. 141]; hu.2 [SEQ 10 Num. 143]; hu.1 [SEQ 10 Num. 144]; hu.3 [SEQ 10 Num. 145]; hu.25 [SEQ 10 Num. 145]; hu.11 [SEQ 10 Num. 153]; hu.9 [SEQ 10 Num. 155]; hu.10 [SEQ 10 Num. 156]; hu.48 [SEQ 10 Num. 157]; hu.44 [SEQ 10 Num. 158]; hu.46 [SEQ 10 Num. 159]; hu.43 [SEQ 10 Num. 160]; hu.35 [SEQ 10 Num. 164]; hu.24 [SEQ 10 Num. 136]; rh.64 [SEQ 10 Num. 99]; hu.41 [SEQ 10 Num. 91]; hu.39 [SEQ 10 Num. 102]; hu.67 [SEQ 10 Num. 198]; hu.66 [SEQ 10 Num. 197]; hu.51 [S·Q 10 Num. 190]; hu.52 [SEQ 10 Num. 191]; hu.49 [SEQ 10 Num. 189]; hu.56 [SEQ 10 Num. 192]; hu.57 [SEQ 10 Num. 193]; hu.58 [SEQ 10 Num. 194]; hu.63 [SEQ 10 Num. 195]; hu.64 [SEQ 10 Num. 196]; hu.60 [SEQ 10 Num. 184]; hu.61 [SEQ 10 Num. 185]; hu.53 [SEQ 10 Num. 186]; hu.55 [SEQ 10 Num. 187]; hu.54 [SEQ 10 Num. 188]; hu.6 [SEQ 10 Num. 84]; y rh.56 [SEQ 10 Num. 152]. Estas secuencias de capside estan reproducidas tambien en el Listado de Secuencias que se acompana.
Las Figuras 3A-3CN son un alineamiento de secuencias de acido nucleico de proteinas de capside vp1 de AAV, con la numeraci6n de las secuencias individuales informadas, y previamente publicadas AAV5 (SEQ 10 Num. 199); AAV3-3 (SEQ 10 Num. 200); AAV4-4 (SEQ 10 Num. 201); AAV1 (SEQ 10 Num. 202); AAV6 (SEQ 10 Num. 203); AAV2 (SEQ 10 Num. 211); AAV7 (SEQ 10 Num. 213) y AAV8 (SEQ 10 Num. 214); rh.25/42-15; 29.3/bb.1; cy.2; 29,5/bb.2; rh.32, rh.33, rh.34, rh.10; rh.24; rh.14, rh.16, rh.17, rh.12, rh.18, rh.21 (denominada anteriormente 41.10); rh.25 (denominada anteriormente 41.15; accesi6n AY530557 de GenBank); rh.2; rh.31; cy.3; cy.5; rh.13; cy.4; cy.6; rh.22; rh.19; rh.35; rh.37; rh.36; rh.23; rh.8; y ch.5 [Solicitud de Patente US publicada num. 2003/0138772 A1 (24 de Julio de 2003)]. Las secuencias de acido nucleico incluyen hu.14/AAV9 (SEQ 10 Num. 3); LG-4/rh.38 (SEQ 10 Num. 7); LG-1D/rh.40 (SEQ 10 Num. 14); N721-8/rh.43 (SEQ 10 Num. 43); 1-8/rhy.49 (S·EQ 10 Num. 25); 2-4/rh.50 (SEQ 10 Num. 23); 2-5/rh.51 (SEQ" 10 Num. 22); 3-9/rh.52 (SEQ 10 Num. 18); 3-11/rh.53 (SEQ 10 Num. 17); 5-3/rh.57 (SEQ 10 Num. 26); 5-22/rh.58 (SEQ 10 Num. 27); 2-3/rh.61 (SEQ 10 Num. 21); 4-8/rh.64 (SEQ 10 Num. 15); 3.1/hu.6 (SEQ 10 Num. 5); 33.12/hu.17 (SEQ 10 Num. 4); 106.1/hu.37 (SEQ 10 Num. 10); LG-9/hu.39 (SEQ 10 Num. 24); 114.3/hu.40 (SEQ 10 Num. 11); 127.2/hu.41 (SEQ 10 Num. 6); 127.5/hu.42 (SEQ 10 Num. 8); y hu.66 (SEQ 10 Num. 173); 2-15/rh.62 (SEQ 10 Num. 33); 1-7/rh.48 (SEQ 10 Num. 32); 4-9/rh.54 (SEQ 10 Num. 40); 4-19/rh.55 (SEQ 10 Num. 37); 52/hu.19 (SEQ 10 Num. 62); 52.1/hu.20 (SEQ 10 Num. 63), 54.5/hu.23 (SEQ 10 Num. 60); 54.2/hu.22 (SEQ 10 Num. 67), 54.7/hu.24 (SEQ 10 Num. 66), 54.1/hu.21 (SEQ 10 Num. 65), 54.4R/hu.27 (SEQ 10 Num. 64); 46.2/hu.28 (SEQ 10 Num. 68); 46.6/hu.29 (SEQ 10 Num. 69); 128.1/hu.43 (SEQ 10 Num. 80); 128.3/hu.44 (SEQ 10 Num. 81) y 130.4/hu.48 (SEQ 10 Num. 78); 3.1/hu.9 (SEQ 10 Num. 58); 16.8/hu.n10 (SEQ 10 Num. 56); 16.12/hu.11 (SEQ 10 Num. 57); 145.1/hu.53 (SEQ 10 Num. 176); 145.6/hu.55 (SEQ 10 Num. 178); 145.5/hu.54 (SEQ 1d Num. 177); 7.3/hu.7 (SEQ 10 Num. 55); 52/hu.19 (SEQ 10 Num. 62); 33.4/hu.15 (SEQ 10 Num. 50); 33.8/hu.16 (SEQ 10 Num. 51); 58.2/hu.25 (SEQ 10 Num. 49); 161.10/hu.60 (SEQ 10 Num. 170); H-5/hu.3 (SEQ 10 Num. 44); H-1/hu.1 (SEQ 10 Num. 46); 161.6/hu.61 (SEQ 10 Num. 174); hu.31 (SEQ 10 Num. 1); hu.32 (SEQ 10 Num. 2); hu.46 (SEQ 10 Num. 82); hu.34 (SEQ 10 Num. 72); hu.47 (SEQ 10 Num. 77); hu.63 (SEQ 10 Num. 204); hu.56 (SEQ 10 Num. 205); hu.45 (SEQ 10 Num. 76); hu.57 (SEQ 10 Num. 206); hu.35 (SEQ 10 Num. 73); hu.58 (SEQ 10 Num. 207); hu.51 (SEQ 10 Num. 208); hu.49 (SEQ 10 Num. 209); hu.52 (SEQ 10 Num. 210); hu.13 (SEQ 10 Num. 71); hu.64 (SEQ 10 Num. 212); rh.56 (SEQ 10 Num. 54); hu.2 (SEQ 10 Num. 48); hu.18 (SEQ 10 Num. 52); hu.4 (SEQ 10 Num. 47); y hu.67 (SEQ 10 Num. 215). Estas secuencias estan tambien reproducidas en el Listado de Secuencias.
Las Figuras 4A-40 proporcionan una evaluaci6n de la eficacia de transferencia de gen de vectores basados en AAV de primate in vitro e in vivo. Los vectores de AAV fueron seudotipados segun se ha descrito [Gao et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 11854-11859 (3 de Septiembre de 2002)] con capsides de AAVs 1, 2, 5, 7, 8 y 6 y ch.5, rh.34, cy.5, rh.20, rh.8 y AAV9. Para el estudio in vitro, segun la Figura 4A, celulas 84-32 (celulas 293 que expresan E4 de serotipos de adenovirus) cultivadas en una placa de 95 pocillos, fueron infectadas con vectores AAVCMVEGFP seudotipados a un M01 de 1 x104GC por celula. La eficacia de transducci6n de EGFP relativafueestimada como el porcentaje de celulas verdes utilizando un microscopio de UV a las 48 horas post-infecci6n y se ha mostrado en el eje Y. Para el estudio in vivo, los vectores que expresan el A1AT informador segregado fueron administrados al higado (Fig. 4B), al pulm6n (Figura 4C) y al musculo (Fig. 40) de rat6n desnudo NCR (4-6 semanas de edad) a una dosis de 1 x 1011 GC por animal mediante inyecciones por via intraportal (Fig. 4B), por via intratraqueal (Fig. 4C), y por via intramuscular (Fig. 40), respectivamente. Los niveles de A1AT del suero (ng/ml) fueron comparados el dia 28 posterior a la transferencia de gen y se han representado en el eje Y. El eje X indica los AAVs analizados y los clados a los que pertenecen.
Descripcion detallada de la invencion
En cualquier arsenal de vectores utiles en terapia o profilaxis, resulta deseable una diversidad de vectores distintos capacitados para transportar una macromolecula hasta una celula objetivo, con el fin de permitir la selecci6n de una fuente de vector para una aplicaci6n deseada. Hasta la fecha, una de las cuestiones relacionadas con el uso de AAV como vectores ha sido la carencia de una diversidad de fuentes de virus diferentes.
Los clados de AAV discutidos en la presente memoria son utiles para seleccionar AAV relacionado filogeneticamente, o donde se desee para un regimen seleccionado, filogeneticamente distinto, y para la funci6n de predicci6n.
Los terminos "homologia sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refieren a acido nucleico, o a fragmentos del mismo, indican que, cuando esta alineados 6ptimamente con inserciones o supresiones de nucle6tido apropiadas con otro acido nucleico (o con su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucle6tido en al menos aproximadamente un 95 a 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homologia es sobre una secuencia de longitud completa, o sobre una pauta de lectura de la misma, u otro fragmento adecuado que sea al menos de 15 nucle6tidos de longitud. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente memoria.
Los terminos "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" o "identico porcentaje" en el contexto de las secuencias de acido nucleico, se refieren a residuos de las dos secuencias que sean los mismos cuando se alinean para una maxima correspondencia. La longitud de comparaci6n de identidad de secuencia puede ser sobre la longitud completa del genoma, la longitud completa de un gen que codifica la secuencia, o un fragmento de al menos aproximadamente 500 a 5000 nucle6tidos, si se desea. Sin embargo, se puede desear tambien una identidad entre fragmentos mas pequenos, por ejemplo de al menos nueve nucle6tidos, normalmente de al menos aproximadamente 20 a 24 nucle6tidos, al menos aproximadamente 28 a 32 nucle6tidos, al menos aproximadamente 36 o mas nucle6tidos. 0e manera similar, el "porcentaje de identidad de secuencia" puede ser determinado facilmente para secuencias de aminoacidos, sobre la longitud completa de una proteina o sobre un fragmento de la misma. 0e forma adecuada, un fragmento tiene al menos 8 aminoacidos de longitud, y puede ser de hasta aproximadamente 700 aminoacidos. Se describen ejemplos de fragmentos adecuados en la presente memoria.
El termino "homologia sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refiere a aminoacidos o a fragmentos de los mismos, indica que, cuando se alinean 6ptimamente inserciones o supresiones apropiadas de aminoacido con las de otro aminoacido (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de aminoacido que es de al menos, aproximadamente, un 95 a 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homologia se refiere a la secuencia de longitud completa, o a una proteina de la misma, por ejemplo una proteina cap, una proteina rep o un fragmento de las mismas que tenga al mes 8 aminoacidos, o mas deseablemente, al menos 15 aminoacidos de longitud. En la presente memoria se describen ejemplos de fragmentos adecuados.
Mediante el termino "altamente conservado" se pretende indicar al menos una identidad del 80%, con preferencia una identidad de al menos el 90%, y mas preferiblemente una identidad del 97%. La identidad puede ser determinada facilmente por un experto en la materia recurriendo a algoritmos y programas de ordenador conocidos por los expertos en la materia.
En general, cuando se hace referencia a "identidad", "homologia" o "similitud" entre dos virus adeno-asociados diferentes, la "identidad", "homologia" o "similitud" se determina con referencia a secuencias "alineadas". Secuencias "alineadas" o "alineamientos" se refieren a multiples secuencias de acido nucleico o secuencias de proteina (aminoacidos), que con frecuencia contienen correcciones respecto a bases o aminoacidos faltantes o adicionales, en comparaci6n con una secuencia de referencia. En los ejemplos, los alineamientos de AAV se realizan utilizando las secuencias de AAV2 o AAV1 publicadas como punto de referencia. Sin embargo, un experto en la materia puede elegir facilmente otra secuencia de AAV como referencia.
Los alineamientos se realizan utilizando una diversidad de Programas Multiples de Alineamiento de Secuencia disponibles comercialmente. Ejemplos de tales programas incluyen "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "MAP" y "MEME", los cuales son accesibles a traves de Servidores de Web por 1nternet. 0tras fuentes para tales programas son conocidas por los expertos en la materia. Alternativamente, tambien se usan utilidades de Vector NT1. Existe tambien un numero de algoritmos conocidos en el estado de la tecnica que pueden ser usados para medir identidad de secuencia de nucle6tido, incluyendo los contenidos en los programas descritos con anterioridad. Segun otro ejemplo, las secuencias de polinucle6tido pueden ser comparadas usando Fasta™, un programa en Versi6n 6.1 de GCG. Fasta™ proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de busqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de acido nucleico puede ser determinado usando Fasta™ con sus parametros por defecto (un tamano de palabra de 6n y un factor N0PAM para la matriz de puntuaci6n) segun se ha previsto en la Versi6n 6.1 de GCG. Los programas multiples de alineamiento de secuencia estan tambien disponibles para secuencias de aminoacido, por ejemplo los programas "Clustal X", "MAP", "P1MA", "MSA", "BL0CKMAKER", "MEME" y "Match-Box". En general, se utiliza cualquiera de estos programas en configuraciones por defecto, aunque un experto en la materia puede modificar estas configuraciones segun lo necesite. Alternativamente, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa de ordenador que proporcione al menos un nivel de identidad o de alineamiento como el proporcionado por los algoritmos y programas referenciados. Vease, por ejemplo, J.0. Thomson et al., Nucl. Acids. Res., "Una comparaci6n completa de multiples alineamientos de secuencia", 27(13): 2682-2690 (1999).
El termino "serotipo" es una distinci6n con respecto a un AAV que tiene una capside que es serol6gicamente distinta de otros serotipos de AAV. La distintividad serol6gica se determina en base a la falta de reactividad cruzada entre anticuerpos en el AAV en comparaci6n con otro AAV.
La reactividad cruzada se mide tipicamente en un ensayo de anticuerpo neutralizante. Para este ensayo, se genera suero policlonal frente a un AABV especifico en un conejo u otro modelo de animal adecuado utilizando virus adenoasociados. En este ensayo, el suero generado contra un AAV especifico se prueba a continuaci6n en cuanto a su habilidad para neutralizar ya sea el mismo AAV (hom6logo) o ya sea un AAV heter6logo. La diluci6n que alcanza un 50% de neutralizaci6n se considera como titulo de anticuerpo neutralizante. Si para dos AAVs el cociente del titulo heter6logo dividido por el titulo hom6logo es menor que 16 de una manera reciproca, esos dos vectores se consideran como un mismo serotipo. A la inversa, si la relaci6n del titulo heter6logo sobre el titulo hom6logo es de 16 o mas de una manera reciproca, los AAVs se consideran serotipos distintos.
Segun se define en la presente memoria, para formar el serotipo 9, los anticuerpos generados respecto a una capside de AAV seleccionada no deben mostrar reactividad cruzada con cualquiera de los AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 o AAV8. La presente invenci6n se refiere a una capside de AAV de un serotipo novedoso, identificado en la presente memoria como serotipo 9 de AAV humano.
Segun se utiliza a traves de la presente descripci6n y de las reivindicaciones, los terminos "comprendiendo" e "incluyendo" son inclusivos de otros componentes, elementos, numeros enteros, etapas y similares. A la inversa, el termino "consistiendo" y sus variantes son exclusivos de otros componentes, elementos, numeros enteros, etapas y similares.
I. Clados
Un clado es un grupo de AAVs que estan filogeneticamente relacionados con otros segun se determina usando un algoritmo de Neighbor-Joining mediante un valor de arranque de al menos un 75% (al menos 100 replicaciones) y una medici6n de distancia de correcci6n de Poisson de no mas de 0,05, en base al alineamiento de la secuencia de aminoacido de vp1 de AAV.
El algoritmo Neighbor-Joining ha sido descrito ampliamente en la literatura. Vease, por ejemplo, M. Nei y S. Kumar, Evoluci6n Molecular y Filogenetica (0xford University Press, New York (2000). Se encuentran disponibles programas de ordenador que pueden ser usados para implementar este algoritmo. Por ejemplo, el programa MEGA v2.1 implementa el metodo Nei-Gojobori modificado. Utilizando estas tecnicas y programas de ordenador, y la secuencia de una proteina de capside vp1 de AAV, un experto en la materia puede determinar facilmente si un AAV seleccionado esta contenido en uno de los clados identificados en la presente memoria, en otro clado, o esta fuera de estos clados.
Mientras que los clados definidos en la presente memoria se basan principalmente en capsides vp1 de AAV que se producen de forma natural, los clados no se limitan a los AAV que se producen de forma natural. Los clados pueden abarcar un AAV que se genere de forma no natural, incluyendo sin limitaci6n los AAVs recombinantes, modificados o alterados, quimericos, hibridos, sinteticos, artificiales, etc., que esten relacionados filogeneticamente segun se determina usando un algoritmo Neighbor-Joining en al menos un 75% (de al menos 1000 replicaciones) y una medici6n de distancia de correcci6n de Poisson de no mas de 0,05, en base al alineamiento de secuencia de aminoacido vp1 de AAV.
Los clados descritos en la presente memoria incluyen Clado A (representado por AAV1 y AAV6), Clado B (representado por AAV2) y Clado C (representado por hibridos de AAV2 -AAV3), Clado 0 (representado por AAV7), Clado E (representado por AAV8) y Clado F (representado por AAV9 humano). Estos clados estan representados por un miembro del clado que es un serotipo de AAV descrito con anterioridad. El AAV1 y el AAV6 descritos anteriormente son miembros de un solo clado (Clado A) en el que se recuperaron 4 aislados a partir de 3 humanos. Los serotipos de AAV3 y el AAV5 descritos anteriormente son claramente distintos entre si, pero no fueron detectados en la criba descrita en la presente memoria, y no han sido incluidos en ninguno de esos clados.
El Clado B (AAV2) y el Clado C (el hibrido AAV2 - AAV3) son los mas abundantes entre los encontrados en los humanos (22 aislados a partir de 12 individuos para el AAV2 y 17 aislados procedentes de 8 individuos para el Clado C).
Existe un gran numero de secuencias agrupadas tanto en el Clado 0 (AAV7) como en el Clado E (AAV8). 0e manera interesante, ambos clados mencionados son predominantes en diferentes especies. El Clado 0 es unico para macacos Rhesus y cinomolgos, habiendose aislado 15 miembros a partir de 10 animales diferentes. El Clado E es interesante puesto que se encuentra tanto en humanos como en primates no humanos: se recuperaron 9 aislados a partir de 7 humanos y se obtuvieron 21 aislados en 9 primates no humanos diferentes incluyendo macacos Rhesus, un babuino y un mono rab6n.
En otros dos animales, se prob6 la naturaleza hibrida de ciertas secuencias, aunque todas las secuencias parecen haberse originado en este caso por medio de recombinaciones individuales y diferentes de dos virus co-infectantes (ambos en animales de Clado 0 con virus de Clado E). Ninguno de estos recombinantes fue identificado en otros animales o sujetos.
Puesto que el Clado C (el hibrido de AAV2 -AAV3) fue identificado en 6 sujetos humanos diferentes, el evento de recombinaci6n dio como resultado una progenie conveniente. En el caso de los hibridos de AAV7 -AAV8, por otra parte, se pueden extraer s6lo unas pocas conclusiones en cuanto a la implicaci6n de la recombinaci6n en evoluci6n de AAV2. Estos eventos de recombinaci6n muestran que el AAV es susceptible de recombinaci6n, creando con ello genes dentro de estructura y en algunos casos estructuras de capside empaquetables y/o infecciosas. El Clado C (el clado hibrido de AAV2 -AAV3), por otra parte, es un grupo de virus que han adquirido una ventaja selectiva mediante recombinaci6n que hace que soporten ciertas presiones medioambientales.
A. Clado A (representado por AAV1 y AAV6)
El Clado A esta caracterizado por contener el AAV1 y el AAV6 anteriormente publicados. Vease, por ejemplo, la Publicaci6n 1nternacional num. W0 002/28061, del 18 de Mayo de 2000; Rutledge et al., J. Virol. 72(1): 309.319 (Enero de 1998). Adicionalmente, este clado contiene AAVs que incluyen, sin limitaci6n, 128:1/hu.43 [SEQ 10 Nums. 80 y 160]; 128.3/hu.44 [SEQ 10 Nums. 81 y 158]; 130.4/hu.48 [SEQ 10 Nums. 78 y 157]; hu.46 [SEQ 10 Nums. 82 y 159]; capside modificada de hu.43 [SEQ 10 Num. 236], y capside modificada de hu.46 [SEQ 10 Num. 224].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capside con una identidad de aminoacido de al menos un 85% de identidad, al menos un 95% de identidad, o al menos un 97% de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capside de AAV1 y/o AAV6.
El Clado A contiene tambien AAVs que no comprenden ninguna capside de ninguno de los AAV1 o AAV6. Estos AAVs pueden incluir, sin limitaci6n, un AAV que tenga una capside derivada de uno o mas de entre 128.1/hu.43 [SEQ 10 Nums. 80 y 160]; hu.43 modificado [SEQ 10 Num. 236]; 128.3/hu.44 [SEQ 10 Nums. 81 y 158]; hu.46 [SEQ 10 Nums. 82 y 159]; hu.46 modificado [SEQ 10 Num. 224]; y, 130.4/hu.48 [SEQ 10 Nums. 78 y 147].
B. Clado B (Clado de AAV2)
El Clado B se caracteriza por contener, como minimo, el AAV2 y el AAV previamente descritos incluyendo 52/hu.19 [SEQ 10 Nums. 62 y 133], 52:1/hu.20 [SEQ 10 Nums. 53 y 134], 54.5/hu.23 [SEQ 10 Nums. 60 y 137], 54.2/hu.22 [SEQ 10 Nums. 67 y 138], 54.7/hu.24 [SEQ 10 Nums. 66 y 136], 54.1/hu.2.1 [SEQ 10 Nums. 65 y 135], 54.5R/hu.27 [SEQ 10 Nums. 64 y 140]; 46.2/hu.28 [SEQ 10 Nums. 68 y 130]; 46.6/hu.29 [SEQ 10 Nums. 60 y 132]; hu.29 modificado [SEQ 10 Num. 225]; 172.1/hu.63 [SEQ 10 Num. 171 y 195; GenBank Accesi6n Num. AY530624]; 172.2/hu.64 [SEQ 10 Nums. 172 y 196; GenBank Accesi6n Num. AY530625]; 24.5/hu.13 [SEQ 10 Nums. 71 y 129; GenBank Accesi6n Num. AY530578]; 145.6/hu.56 [SEQ 10 Nums. 168 y 192]; hu.57 [SEQ 10 Nums. 169 y 183]; 136.1/hu.49 [SEQ 10 Nums. 165 y 189]; 156.1/hu.58 [SEQ 10 Nums. 179 y 194]; 72.2/hu.34 [SEQ 10 Nums. 72 y 125; GenBank Accesi6n Num. AY530598]; 72.3 [SEQ 10 Nums. 73 y 164; GenBank Accesi6n Num. AY530599]; 130:1/hu.47 [SEQ 10 Nums. 77 y 128]; 129.1/hu.45 (SEQ 10 Nums. 76 y 127; GenBank Accesi6n Num. AY530608); 1401/hu.51 [SEQ 10 Nums. 161 y 190; GenBank Accesi6n Num. AY530613]; y 140.2/hu.52 [SEQ 10 Nums. 167 y 191; GenBank Accesi6n Num. AY530614].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capside con una identidad de aminoacido de al menos un 85% de identidad, al menos un 90% de identidad, al menos un 95% de identidad, o al menos un 97% de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2, o la vp3 de la capside de AAV2.
El clado B contiene tambien AAVs que no tienen ninguna capside de AAV2. Estos AAVs pueden incluir, sin limitaci6n, un AAV que tenga una capside derivada de uno o mas de los siguientes: 52/hu.19 [SEQ 10 Nums. 62 y 133], 52.1/hu.20 [SEQ 10 Nums. 63 y 134], 54.5/hu.23 [SEQ 10 Nums. 60 y 137], 54.2/hu.22 [SEQ 10 Nums. 67 y 138], 54.7/hu.24 [SEQ 10 Nums. 66 y 136], 54.1/hu.21 [SEQ 10 Nums. 65 y 1351], 54.4R/hu.27 [SEQ 10 Nums. 64 y 140]; 46.2/hu.28 [SEQ 10 Nums. 68 y 130]; 46.6/hu.29 [SEQ 10 Nums. 69 y 132]; hu.29 modificado [SEQ 10 Num. 225]; 172.1/hu.63 [SEQ 10 Num. 171 y 195]; 172.2/hu.64 [SEQ 10 Nums. 172 y 196]; 24.5/hu.13 [SEQ 10 Nums. 71 y 129]; 145.6/hu.56 [SEQ 10 Nums. 168 y 119; GenBank Accesi6n Num. AY530618]; hu.57 [SEQ 10 Nums. 169 y 193; GenBank Accesi6n Num. AY530619]; 136.1/hu.49 [SEQ 10 Nums. 165 y 189; GenBank Accesi6n Num. AY530612]; 156.1/hu.58 [SEQ 10 Nums. 179 y 194; GenBank Accesi6n Num. AY530&20]; 72.2/hu.34 [SEQ 10 Nums. 72 y 125]; 72.3/hu.35 [SEQ 10 Nums. 73 y 164]; 129.1/hu.45 [SEQ 10 Nums. 76 y 127]; 130.1/hu.47 [SEQ 10 Nums. 77 y 128; GenBank Accesi6n Num. AY530610]; 140.1/hu.51 [SEQ 10 Nums. 161 y 190; GenBank Accesi6n Num. AY530613]; y, 140.2/hu.52 [SEQ 10 Nums. 167 y 191; GenBank Accesi6n Num. Y530614].
C. Clado C (Clado Hibrido de AAV2-AAV3)
El clado C se caracteriza por contener AAVs que son hibridos de los AAV2 y AAV3 anteriormente publicados, tal como H-6/hu.4; H-2/hu.2 [Solicitud de Patente US num. 2003/0138772 (24 de Junio de 2003). Adicionalmente este clado contiene AAVs que incluyen, sin limitaci6n, 3.1/hu.2 [SEQ 10 Nums. 56 y 156]; 16.12/hu [SEQ 10 Nums. 57 y 153]; 145.1/hu.53 [SEQ 10 Nums. 176 y 186]; 145.6/hu.55 [SEQ 10 Nums. 178 y 187]; 145.5/hu.54 [SEQ 10 Nums. 177 y 188]; 7.3/hu.7 [SEQ 10 Nums. 55 y 150; depositada ahora como GenBank Accesi6n Num. AY530628]; hu.7 modificado [SEQ 10 Num. 226]; 33.4/hu.15 [SEQ 10 Nums. 50 y 147]; 33.8/hu.16 [SEQ 10 Nums. 51 y 148]; hu.18 [SEQ 10 Nums. 52 y 149]; 58.2/hu.25 [SEQ 10 Nums. 49 y 146]; 16.1.10/hu.60 [SEQ 10 Nums. 170 y 184]; H-5/hu.3 [SEQ 10 Nums. 44 y 145]; H-1/hu.1 [SEQ 10 Nums. 46 y 144]; t 161.6/hu.61 [SEQ 10 Nums. 174 y 185].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capside con una identidad de aminoacido de al menos 85% de identidad, al menos un 90% de identidad, al menos un 95% de identidad, o al menos un 97% de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capside de hu.4 y/o hu.2.
El clado C (el clado hibrido de AAV2 -AAV3) contiene tambien AAVs que no comprenden capside alguna de hu.2 o hu.4. Estos AAVs pueden incluir, sin limitaci6n, una capside de AAV derivada de uno o mas de entre 3.1/hu.9 [SEQ 10 Nums. 58 y 155]; 16.8/hu.10 [SEQ 10 Nums. 56 y 156]; 16.12/hu.11 [SEQ 10 Nums. 176 y 186]; 145.6/hu.55 [SEQ 10 Nums. 178 y 187]; 145.5/hu.54 [S·EQ 10 Nums. 177 y 188]; 7.3/hu.7 [SEQ 10 Nums. 55 y 150]; hu.7 modificado [SEQ 10 Num. 226]; 33.4/hu.15 [SEQ 10 Nums. 50 y 174]; 33.8/hu.16 [SEQ 10 Nums. 51 y 148]; 58.2/hu.25 [SEQ 10 Nums. 49 y 146]; 161.10/hu.60 [SEQ 10 Nums. 170 y 184]; H-5/hu.3 [SEQ 10 Nums. 44 y 145]; H-1/hu.1 [SEQ 10 Nums. 46 y 144]; y, 161.6/hu.61 [S·EQ 10 Nums. 174 y 185].
D. Clado D (clado de AAV7)
El clado 0 esta caracterizado por contener el AAV7 descrito anteriormente [G. Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
99: 11854-9 (3 de Septiembre de 2002)]. Las secuencias de acido nucleico que codifican la capside de AAV7 estan reproducidas en SEQ 10 Num. 184; las secuencias de aminoacidos de la capside de AAV7 estan reproducidas en SEQ 10 Num. 185. Adicionalmente, el clado contiene un numero de secuencias de AAV descritas con anterioridad, incluyendo: cy.2; cy.3; cy.4; cy.5; cy.6; rh.13; rh.37; rh.36; y rh.35 [Solicitud de Patente US Publicada num. US 2003/0138772 A1 (24 de Julio de 2003)]. Adicionalmente, el clado de AAV7 contiene secuencias de AAV que incluyen, sin limitaci6n, 2-15/rh.62 [SEQ 10 Nums. 33 y 114]; 1-7/rh.48 [SEQ 10 Nums. 32 y 115]; 4-9/rh.54 [SEQ 10 Nums. 40 y 116]; y, 4-19/rh.55 [SEQ 10 Nums. 37 y 117]; cy.5 modificado [SEQ 10 Num. 227]; rh.13 modificado [SEQ 10 Num. 228]; y, rh.37 modificado [SEQ 10 Num. 229].
Uno o mas de los miembros de este clado tienen una capside con una identidad de aminoacido de al menos un 85% de identidad, al menos un 90% de identidad, al menos un 95% de identidad, o al menos un 97% de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capside de AAV7, SEQ 10 Nums. 184 y 185.
El clado 0 contiene tambien AAVs que no comprenden ninguna capside de cy.2; cy.3; cy.4; cy.5y; cry.6; rh.13; rh.37; rh.36; y, rh.35. Estos AAVs pueden incluir, sin limitaci6n, un AAV que tenga una capside derivada de uno o mas de entre los siguientes: 2-15/rh.62 [SEQ 10 Nums. 33 y 114]; 1-7/rh.48 [SEQ 10 Nums. 32 y 115]; 4-9/rh.54 [SEQ 10 Nums. 40 y 116]; y 4-19/rh.55 [SEQ 10 Nums. 37 y 117].
E. Clado E (clado de AAV8)
El clado E esta caracterizado por contener el AAV8 descrito con anterioridad [G. Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 11854-9 (3 de Septiembre de 2002)], 43.1/rh.2; 44.2/rh.25; 29-3/bb.1; y 29.5/bb.2 [Solicitud de Patente US Publicada Num. US 2003/0138772 A1 (24 de Julio de 2003)].
Este clado comprende secuencias de AAV que incluyen, sin limitaci6n, por ejemplo, 30-10/pi.1 [SEQ 10 Nums. 28 y 93], 30.12/pi.2 [SEQ 10 Nums. 30 y 95], 30.19/pi.3 [SEQ 10 Nums. 29 y 94], LG-4/rh.38 [SEQ 10 Nums. 7 y 86]; LG10/rh.40 [SEQ 10 Nums. 14 y 92]; N721-8/rh.43 [SEQ 10 Nums. 43 y 163]; 1-8/rh.49 [SEQ 10 Nums. 25 y 103]; 24/rh.50 [SEQ 10 Nums. 23 y 108]; 2-5/rh.51 [SEQ 10 Nums. 22 y 104]; 3-9/rh.52 [SEQ 10 Nums. 18 y 96]; 3-11/rh.53 [SEQ 10 Nums. 17 y 97]; 5-3/rh.57 [SEQ 10 Nums. 26 y 105]; 5-22/rh.58 [SEQ 10 Nums. 27 y 58]; 2-3/rh.61 [SEQ 10 Nums. 21 y 107]; 4-8/rh.64 [SEQ 10 Nums. 15 y 99]; 3.1/hu.6 [SEQ 10 Nums. 5 y 84]; 33.12/hu.17 [SEQ 10 Nums. 4 y 83]; 106.1/hu.37 [SEQ 10 Nums. 10 y 88]; LG-9/hu.39 [SEQ 10 Nums. 24 y 102]; 114.3/hu.40 [SEQ 10 Nums. 11 y 87]; 127.2/hu.41 [SEQ 10 Nums. 6 y 91]; 127.5/hu.42 [SEQ 10 Nums. 8 y 85]; hu 66 [SEQ 10 Nums. 173 y 197]; y, hu 67 [SEQ 10 Nums. 174 y 198]. Este clado incluye ademas rh.2 modificado [SEQ 10 Num. 231]; rh.58 modificado [SEQ 10 Num. 232]; rh.64 modificado [SEQ 10 Num. 233].
Uno o mas de los miembros de este clado posee una capside con una identidad de aminoacido de al menos un 85% de identidad, al menos un 90% de identidad, al menos un 95% de identidad, o al menos un 97% de identidad sobre la longitud completa de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capside de AAV8. Las secuencias de acido nucleico que codifican la capside de AAV8 estan reproducidas en SEQ 10 Num. 186 y la secuencia de aminoacidos de la capside esta reproducida en SEQ 10 Num. 187.
El clado E contiene tambien AAVs que no comprenden ninguna capside de AAV8. Rh.8. 44.2/rh.10; rh.25; 293/bb.1; y 29.5/bb.2 [Solicitud de Patente US Publicada num. US 2003/0138772 A1 (24 de Julio de 2003)]. Estos AAVs pueden incluir, sin limitaci6n, un AAV que tenga una capside derivada de uno de los siguientes: 30.10/pi.1 [SEQ 10 Nums. 28 y 93], 30.12/pi.2 [SEQ 10 Nums. 30 y 95], 30.19/pi.3 [SEQ 10 Nums. 29 y 94], 1.G-4/rh.38 [SEQ 10 Nums. 7 y 86]; LG10/rh.40 [SEQ 10 Nums. 14 y 92]; N721-8/rh.43 [SEQ 10 Nums. 43 y 163]; 1-8/rh49 [SEQ 10 Nums. 25 y 103]; 24/rh.50 [SEQ 10 Nums. 23 y 108]; 2-5/rh.51 [SEQ 10 Nums. 22 y 104]; 3-9/rh.52 [SEQ 10 Nums. 17 y 97]; 5-3/rh.57 [SEQ 10 Nums. 26 y 105]; 5-22/rh.58 [SEQ 10 Nums. 27 y 58]; rh.58 modificado [SEQ 10 Num. 232]; 2-3/rh.61 [SEQ 10 Nums. 21 y 107]; 4-8/rh.64 [SEQ 10 Nums. 15 y 99]; rh.64 modificado [SEQ 10 Num. 233]; 3.1/hu.6 [SEQ 10 Nums. 5 y 84]; 33.12/hu.17 [SEQ 10 Nums. 4 y 83]; 106.1/hu.37 [SEQ 10 Nums. 10 y 88]; LG-9/hu.39 [SEQ 10 Nums. 24 y 102]; 114.3/hu.40 [SEQ 10 Nums. 11 y 87]; 127.2/hu.41 [SEQ 10 Nums. 6 y 91]; 127.5/hu.42 [SEQ 10 Nums. 8 y 85]; hu.66 [SEQ 10 Nums. 173 y 197], y hu.67 [SEQ 10 Nums. 174 y 198].
F. Clado F (clado de AAV9)
Este clado se identifica mediante el nombre de un serotipo de AAV identificado en la presente memoria como hu.14/AAV9 [SEQ 10 Nums. 3 y 123]. El clado tiene al menos tres miembros de AAV que estan filogeneticamente relacionados segun se determina usando Neighbor-Joining heuristica mediante un valor de arranque de al menos un 75% (en base a 1000 replicaciones) y una medici6n de distancia de correcci6n de Poisson de no mas de 0,05 en base al alineamiento de la secuencia de aminoacido de la vp1 del AAV. Adicionalmente, este clado contiene otras secuencias novedosas incluyendo hu.31 [SEQ 10 Nums. 1 y 121] y hu.32 [SEQ 10 Nums. 2 y 122].
Uno o mas de los miembros de este clado poseen una capside con una identidad de aminoacido de al menos un 85% de identidad, al menos un 90% de identidad, al menos un 95% de identidad, o al menos un 97% de identidad sobre la longitud total de la vp1, la vp2 o la vp3 de la capside de AAV, SEQ 10 Nums. 3 y 123.
El Clado F incluye, sin limitaci6n, un AAV que tiene una capside derivada de uno o mas de entre hu.14/AAV9 [SEQ 10 Nums. 3 y 123], hu.31 [SEQ 10 Nums. 1 y 121], y hu.32 [SEQ 10 Nums. 1 y 122].
Los clados de AAV son utiles para una diversidad de prop6sitos, incluyendo la provisi6n de colecciones de AAVs relacionados, listas para la generaci6n de vectores virales y para la generaci6n de moleculas objetivo. Estos clados pueden ser usados tambien como herramientas para una diversidad de prop6sitos que pueden resultar facilmente evidentes para un experto en la materia.
II. Secuencias novedosas de AAV
La invenci6n se refiere a secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de un nuevo serotipo de AAV, que se denominan intercambiablemente en la presente memoria como clones hu.14/28 y hu.AAV9. La invenci6n se refiere a un serotipo 9 de AAV compuesto por una capside de AAV que esta serol6gicamente relacionada con una capside de la secuencia de aminoacidos 1 a 736 de SEQ 10 Num. 123, y es serol6gicamente distinta de una proteina de capside de cualquiera de entre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 o AAV8. Estas secuencias son utiles para construir vectores que son altamente eficientes en la transducci6n del higado, del musculo y del pulm6n. Este nuevo AAV y sus secuencias son utiles para una diversidad de otros prop6sitos. Estas secuencias estan siendo presentadas con GenBank y les han sido asignados los numeros de accesi6n identificados en la presente memoria.
Las secuencias de acido nucleico y las secuencias de aminoacidos de un numero de AAVs, son tambien de interes. Muchas de estas secuencias incluyen las descritas en lo que antecede como miembros de un clado, segun se resume en lo que sigue.
128.1/hu.43 [SEQ 10 Nums. 80 y 160, GenBank Accesi6n Num. AY530606]; hu.43 modificado [SEQ 10 Num. 236]; 128.3/hu.44 [SEQ 10 Nums. 81 y 158; GenBank Accesi6n Num. AY530607], y 130.4/hu.48 [SEQ 10 Nums. 78 y 157; GenBank Accesi6n Num. AY530611]; del Clado A;
52/hu.19 [SEQ 10 Nums. 62 y 133; GenBank Accesi6n Num. AY530584], 52.1/hu.20 [SEQ 10 Nums. 63 y 134; GenBank Accesi6n Num. AY530586], 54.5/hu.23 [SEQ 10 Nums. 60 y 137; GenBank Accesi6n Num. AY530589], 54.2/hu.22 [SEQ 10 Nums. 67 y 138; GenBank Accesi6n Num. Ay530588], 54.7/hu.24 [SEQ 10 Nums. 66 y 136; GenBank Accesi6n Num. AY530590], 54.1/hu.21 [SEQ 10 Nums. 65 y 135; GenBank Accesi6n Num. AY530587], 54.4/hu.27 [SEQ 10 Nums. 64 y 140; GenBank Accesi6n Num. AY530592]; 46.2/hu.28 [SEQ 10 Nums. 68 y 130; GenBank Accesi6n Num. AY530593]; 46.6/hu.29 [SEQ 10 Nums. 69 y 132; GenBank Accesi6n Num. AY530594]; hu.29 modificado [SEQ 10 Num. 225]; 172.1/hu.63 [SEQ 10 Nums. 171 y 195]; y 140.2/hu.52 [SEQ 10 Nums. 167 y 191]; del Clado B;
3.1/hu.9 [SEQ 10 Nums. 58 y 155; GenBank Accesi6n Num. AY530626]; 16.8/hu.10 [SEQ 10 Nums. 56 y 156; GenBank Accesi6n Num. AY530576]; 16.12/hu.11 [SEQ 10 Nums. 57 y 153; GenBank Accesi6n Num. AY530577]; 145.1/hu.53 [SEQ 10 Nums. 176 y 186; GenBank Accesi6n Num. AY530615]; 145.6/hu.55 [SEQ 10 Nums. 178 y 187; GenBank Accesi6n Num. AY530617]; 145.5/hu.54 [SEQ 10 Nums. 177 y 188; GenBank Accesi6n Num. AY530616]; 7.3/hu.7 [SEQ 10 Nums. 55 y 150; GenBank Accesi6n Num. AY530628]; hu.7 modificado [SEQ 10 Num. 226]; hu.18 [SEQ 10 Nums. 52 y 149; GenBank Accesi6n Num. AY530583]; 33.4/hu.15 [SEQ 10 Nums. 50 y 147; GenBank Accesi6n Num. AY530580]; 33.8/hu.16 [SEQ 10 Nums. 51 y 148; GenBank Accesi6n Num. AY530581]; 58.2/hu.25 [SEQ 10 Nums. 49 y 146; GenBank Accesi6n Num. AY530591]; 161.10/hu.60 [SEQ 10 Nums. 170 y 184; GenBank Accesi6n Num. AY530622]; H-5/hu.3 [SEQ 10 Nums. 44 y 145; GenBank Accesi6n Num. AY530595]; H-1/hu.1 [SEQ 10 Nums. 46 y 144; GenBank Accesi6n Num. AY530575]; y 161.6/hu.61 [SEQ 10 Nums. 174 y 185; GenBank Accesi6n Num. AY530622]; del Clado C;
2-15/rh.62 [SEQ 10 Nums. 33 y 114; GenBank Accesi6n Num. AY530573]; 1-7/rh.48 [SEQ 10 Nums. 32 y 115; GenBank Accesi6n Num. AY530561]; 4-9/rh.54 [SEQ 10 Nums. 40 y 116; GenBank Accesi6n Num. AY530567]; y 419/rh.55 [SEQ 10 Nums. 37 y 117; GenBank Accesi6n Num. AY530568]; cy.5 modificado [SEQ 10 Num. 227]; rh.13 modificado [SEQ 10 Num. 228]; y rh.37 modificado [SEQ 10 Num. 229]; del Clado 0;
30.10/pi.1 [SEQ 10 Nums. 28 y 93; GenBank Accesi6n Num. AY53055]; 30.12/pi.2 [SEQ 10 Nums. 30 y 95; GenBank Accesi6n Num. AY530554]; 30.19/pi.3 [SEQ 10 Nums. 29 y 94; GenBank Accesi6n Num. AY530555]; LG-4/rh.38 [SEQ 10 Nums. 7 y 86; GenBank Accesi6n Num. AY530558]; LG-10/rh.40 [SEQ 10 Nums. 14 y 92; GenBank Accesi6n Num. AY530559]; N721-8/rh.43 [SEQ 10 Nums. 43 y 163; GenBank Accesi6n Num. AY530560]; 1-8/rh.49 [SEQ 10 Nums. 25 y 103; GenBank Accesi6n Num. AY530561]; 2-4/rh.50 [SEQ 10 Nums. 23 y 108; GenBank Accesi6n Num. AY530563]; 2-5/rh.51 [SEQ 10 Nums. 22 y 104; GenBank Accesi6n Num. 530564]; 3-9/rh.52 [SEQ 10 Nums. 18 y 96; GenBank Accesi6n Num. AY530565]; 3-11/rh.53 [SEQ 10 Nums. 17 y 97; GenBank Accesi6n Num. AY530566]; 5-3/rh.57 [SEQ 10 Nums. 26 y 105; GenBank Accesi6n Num. AY530569]; 5-22/rh.58 [SEQ 10 Nums. 27 y 58; GenBank Accesi6n Num. 530570]; rh.58 modificado [SEQ 10 Num. 232]; 2-3/rh.61 [SEQ 10 Nums. 21 y 107; GenBank Accesi6n Num. AY530572]; 4-8/rh.64 [SEQ 10 Nums. 15 y 99; GenBank Accesi6n Num. AY530574]; rh.64 modificado [SEQ 10 Num. 233]; 3.1/hu.6 [SEQ 10 Nums. 5 y 84; GenBank Accesi6n Num. AY530621]; 33.12/hu.17 [SEQ 10 Nums. 4 y 83; GenBank Accesi6n Num. AY530582]; 106.1/hu.37 [SEQ 10 Nums. 10 y 86; GenBank Accesi6n Num. AY530600]; LG-9/hu.39 [SEQ 10 Nums. 24 y 102; GenBank Accesi6n Num. AY530601]; 114.3/hu.40 [SEQ 10 Nums. 11 y 87; GenBank Accesi6n Num. AY530603]; 127.2/hu.41 [SEQ 10 Nums. 6 y 91; GenBank Accesi6n Num. AY530604]; 127.5/hu.42 [SEQ 10 Nums. 8 y 85; GenBank Accesi6n num. AY530605]; y hu.66 [SEQ 10 Nums. 173 y 197; GenBank Accesi6n Num. AY530626]; y hu.67 [SEQ 10 Nums. 174 y 198; GenBank Accesi6n Num. AY530627]; y rh.2 modificado [SEQ 10 Num. 231]; del Clado E;
hu.14/AAV9 [SEQ 10 Nums. 3 y 123; GenBank Accesi6n Num. AY530579]; hu.31 [SEQ 10 Nums. 1 y 121; AY530596], y hu.32 [SEQ 10 Nums. 1 y 122; GenBank Accesi6n Num. AY530597]; del Clado F.
Adicionalmente, las secuencias de AAV que incluyen rh.59 [SEQ 10 Nums. 49 y 110]; rh.60 [SEQ 10 Nums. 31 y 120; GenBank Accesi6n Num. AY530571]; ch.5 modificado [SEQ 10 Num. 234]; y rh.8 modificado [SEQ 10 Num. 235], estan fuera de la definici6n de los clados descritos en lo que antecede.
Tambien son de relevancia fragmentos de las secuencias de AAV. Cada uno de estos fragmentos puede ser utilizado facilmente en una diversidad de sistemas de vector y de celulas anfitri6n. Entre los fragmentos de AAV deseables estan las proteinas cap, incluyendo la vp1, la vp2, la vp3 y las regiones hipervariables. Cuando se desee, la metodologia descrita en la Publicaci6n de Patente US publicada num. US 2003/0138772 A1 (24 de Julio de 2003), puede ser usada para obtener las secuencias rep para los clones de AAV identificados en lo que antecede. Tales secuencias rep incluyen, por ejemplo, rep 78, rep 68, rep 52, y rep 40, y las secuencias que codifican estas proteinas. 0e forma similar, se pueden obtener otros fragmentos de estos clones usando las tecnicas descritas en la publicaci6n de patente referenciada, incluyendo las repeticiones terminales invertidas (1TRs) de AAV, secuencias P19 de AAV, secuencias P-40 de AAV, el sitio de uni6n rep, y el sitio resoluto terminal (TRS). Ademas, otros fragmentos adecuados resultaran facilmente evidentes para el experto en la materia.
La capside de la invenci6n puede ser utilizada facilmente en una diversidad de sistemas de vector y de celulas anfitri6n. Tales fragmentos pueden ser usados solos, en combinaci6n con otras secuencias o fragmentos de AAV, o en combinaci6n con elementos de otras secuencias virales de AAVs o no de AAVs. En una realizaci6n particularmente deseable, un vector contiene las secuencias cap y/o rep de AAV de la invenci6n.
Las secuencias y fragmentos de AAV son por lo tanto utiles en la producci6n de rAAV, y son tambien utiles como vectores de suministro antisentido, vectores de terapia de gen, o vectores de vacuna. La invenci6n proporciona ademas moleculas de acido nucleico, vectores de suministro de gen, y celulas anfitri6n que contienen las secuencias de AAV de la invenci6n.
Se pueden determinar fragmentos adecuados usando la informaci6n proporcionada en la presente memoria.
Segun se describe en la presente memoria, los vectores de la invenci6n que contienen las proteinas de capside de AAV de la invenci6n son particularmente adecuados para su uso en aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes disminuyen la efectividad de otros vectores basados en serotipo de AAV, asi como de otros vectores virales. Los vectores de rAAV de la invenci6n son particularmente ventajosos en la readministraci6n de rAAV y de terapia de gen repetitiva.
Estas y otras realizaciones y ventajas de la invenci6n se describen con mayor detalle en lo que sigue.
A. Secuencias de Serotipo 9/hu14 de AAV
La invenci6n proporciona las secuencias de acido nucleico y los aminoacidos de un novedoso AAV, que se denominan de manera intercambiable en la presente invenci6n como el clon hu.14 (denominado anteriormente 28.4) y el huAAV9. Segun se define en la presente memoria, el novedoso serotipo AAV9 se refiere a un AAV que tiene una capside que genera anticuerpos que realizan reacci6n cruzada serol6gicamente con la capside que tiene la secuencia de hu.14 [SEQ 10 Num. 123] y cuyos anticuerpos no realizan reacci6n cruzada serol6gicamente con anticuerpos generados respecto a las capsides de cualquiera de los AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7
o AAV8.
1. Secuencias de Acido Nucleico
Las secuencias de acido nucleico de AAV9 de la invenci6n incluyen las secuencias de A0N de SEQ 10 Num. 3, que consisten en 2211 nucle6tidos.
Las secuencias de acido nucleico de la invenci6n abarcan ademas la cadena que es complementaria con SEQ 10 Num. 3, asi como las secuencias de ARN y de cA0N correspondientes a SEQ 10 Num. 3, y su cadena complementaria. Tambien estan incluidas en las secuencias de acido nucleico de la invenci6n las variantes naturales y las modificaciones de diseno de SEQ 10 Num. 3 y su cadena complementaria. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas que son conocidas en el estado de la tecnica, metilaci6n y sustituci6n de uno o mas de los nucle6tidos que se generan de manera natural con un nucle6tido degenerado.
Ademas estan incluidas en la presente invenci6n las secuencias de acido nucleico que sean mayores de alrededor de un 90%, mas preferentemente al menos alrededor de un 95%, y mas preferiblemente al menos alrededor de un 98 a 99%, identicas u hom6logas de SEQ 10 Num. 3.
Tambien son de interes los fragmentos de SEQ 10 Num. 3, su cadena complementaria, y el cA0N y ARN complementarios de los mismos. Los fragmentos adecuados son de al menos 15 nucle6tidos de longitud, y abarcan fragmentos funcionales, es decir fragmentos que son de interes biol6gico. Ejemplos de tales fragmentos, que estan dentro del alcance de la invenci6n, son las secuencias que codifican las tres proteinas variables (vp) de la capside de AAV9/HU.14 que son variantes de empalme alternativas: vp1 [nt 1 a 2211 de SEQ 10 Num. 3]; vp2 [aproximadamente nt 411 a 2211 de SEQ 10 Num. 3]; y vp3 [alrededor de nt 609 a 2211 de SEQ 10 Num. 3]. 0tros fragmentos adecuados de SEQ 10 Num. 3 incluyen el fragmento que contiene el cod6n de inicio para la proteina de capside de AAV9/HU.14, y los fragmentos que codifican las regiones hipervariables de la proteina de capside vp1, las cuales se describen en la presente memoria.
Ademas de incluir las secuencias de acido nucleico proporcionadas en las Figuras y en el Listado de Secuencias, la presente invenci6n incluye moleculas y secuencias de acido nucleico que estan disenadas para expresar las secuencias de aminoacido, las proteinas y los peptidos de los serotipos de AAV de la invenci6n. Asi, la invenci6n incluye secuencias de acido nucleico que codifican las secuencias novedosas de aminoacido de AAV reivindicadas y los serotipos de AAV artificiales generados con la utilizaci6n de estas secuencias.
Segun se utiliza en la presente memoria, los serotipos de AAV artificiales incluyen, sin limitaci6n, AAVs con proteina de capside que se produce de forma no natural. Tal capside artificial puede ser generada mediante cualquier tecnica adecuada, utilizando una secuencia novedosa de AAV de la invenci6n (por ejemplo, un fragmento de una proteina de capside vp1) en combinaci6n con secuencias heter6logas que pueden ser obtenidas a partir de otro serotipo de AAV (conocido o novedoso), porciones no contiguas del mismo serotipo de AAV, a partir de una fuente de AAV no viral, o a partir de una fuente no viral. Un serotipo de AAV artificial puede ser, sin limitaci6n, una capside quimerica de AAV, una capside de AAV recombinante, o una capside de AAV "humanizada".
2. Secuencias de aminoacido de HU.14/AAV9, proteinas y peptidos
La invenci6n proporciona ademas proteinas y fragmentos de las mismas que son codificadas por los acidos nucleicos de hu.14/AAV9 de la invenci6n, y proteinas y fragmentos de hu.14/AAV9 que son generados por medio de otros metodos. Segun se utiliza en la presente memoria, estas proteinas incluyen la capside ensamblada. La invenci6n abarca ademas serotipos de AAV generados con la utilizaci6n de secuencias del serotipo novedoso de AAV de la invenci6n, que se generan utilizando tecnicas sinteticas, recombinantes u otras tecnicas conocidas por los expertos en la materia. La invenci6n no se limita a las secuencias novedosas de aminoacido de AAV, los peptidos y las proteinas expresados a partir de las secuencias novedosas de acido nucleico de la invenci6n, sino que abarca las secuencias de aminoacido, los peptidos y las proteinas que se generan por medio de otros metodos conocidos en el estado de la tecnica, incluyendo, por ejemplo por sintesis quimica, por otras tecnicas sinteticas, o por medio de otros metodos. Las secuencias de cualquiera de las capsides de AAV proporcionadas en la presente invenci6n pueden ser generadas facilmente utilizando una diversidad de tecnicas.
Las tecnicas de producci6n adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Clonaci6n Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativamente, los peptidos pueden ser tambien sintetizados mediante metodos bien conocidos de sintesis de peptidos de fase s6lida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1962); Stewart and Young, Sintesis de Peptido de Fase S6lida (Freeman, San Francisco, 1969), pp. 27-62). Estos y otros metodos de producci6n adecuados caen dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no constituyen una limitaci6n de la presente invenci6n.
Proteinas particularmente deseables incluyen proteinas de capside de AAV, que son codificadas por las secuencias de nucle6tido identificadas en lo que antecede. La capside de AAV esta compuesta por tres proteinas, vp1, vp2 y vp3, las cuales son variantes alternativas de empalme. La secuencia de longitud completa proporcionada en la Figura 2 es una parte de vp1. Las proteinas de capside de AAV9/HU.14 incluyen vp1 [aminoacidos (aa) 1 a 736 de SEQ 10 Num. 123], vp2 [aproximadamente aa 138 a 736 de SEQ 10 Num. 123], vp3 [aproximadamente aa 203 a 736 de SEQ 10 Num. 123], y fragmentos funcionales de las mismas. 0tros fragmentos deseables de la proteina de capside incluyen las regiones constantes y variables, localizadas entre regiones hipervariables (HVR). 0tros fragmentos deseables de la proteina de capside incluyen las propias HVR. Un algoritmo desarrollado para determinar areas de divergencia de secuencia en AAV2 ha generado 12 regiones hipervariables (HVR) de 5 solapamientos, o que son parte de las cuatro regiones variables previamente descritas. [Chiorini et al., J. Virol., 73: 1309-19 (1999); Rutledge et al., J. Virol., 72; 309-319]. Usando este algoritmo y/o las tecnicas de alineamiento descritas en la presente memoria, se determinan las HVR de los nuevos serotipos de AAV. Por ejemplo, las HVR se localizan como sigue: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182-186; HVR3, aa 262-264; HVR4, aa 381-383; HVR5, aa 450474; HVR6, aa 490-195; HVR7, aa 500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581-594; HVR11, aa 658-667; y HVR12, aa 705-719 [el sistema de numeraci6n se basa en un alineamiento que utiliza la vp1 de AAV2 como punto de referencia]. Utilizando el alineamiento proporcionado en la presente memoria usando el programa Clustal X y configuraciones por defecto, o utilizando otros comandos o programas de alineamiento comercial o publicamente disponibles en configuraciones por defecto tal como las descritas en la presente memoria, un experto en la materia puede determinar facilmente fragmentos correspondientes de las capsides novedosas de AAV de la invenci6n.
1ncluso otros fragmentos deseables de la proteina de capside de AAV9/HU.145 incluyen aminoacidos 1 a 84 de SEQ 10 Num. 123, aminoacidos 199 a 259; aminoacidos 274 a 446; aminoacidos 603 a 659; aminoacidos 670 a 708; aminoacidos 724 a 736 de SEQ 10 Num. 123; aa 185-198; aa 260-273; aa 447-477; aa 495-602; aa 660-669; y aa 707-723. Adicionalmente, ejemplos de otros fragmentos adecuados de capside de AAV incluyen: con respecto a la numeraci6n de AAV9 [SEQ 10 Num. 123], aa 24-42, aa 25-28; aa 81-85; aa 133-165; aa 134-165; aa 137-143; aa 154-156; aa 194-208; aa 261-274; aa 262-274; aa 171-173; aa 413-417; aa 449-478; aa 494-525; aa 534-571; aa 581-601; aa 660-671; aa 709-723. Utilizando el alineamiento proporcionado en la presente memoria, realizado con la utilizaci6n del programa Clustal X y configuraciones por defecto, o utilizando otros programas de alineamiento comercial o publicamente disponibles, un experto en la materia puede determinar facilmente fragmentos correspondientes de las capsides novedosas de AAV de la invenci6n.
Aun mas, otras proteinas de AAV9/HU.14 deseables incluyen las proteinas rep, incluyendo rep68/78 y rep40/52.
Adecuadamente, los fragmentos son de al menos 8 aminoacidos de longitud. Sin embargo, se pueden utilizar facilmente fragmentos de otras longitudes deseadas. Tales fragmentos pueden ser producidos recombinantemente o mediante otros medios adecuados, por ejemplo mediante sintesis quimica. Tambien son de interes otras secuencias de AAV9/HU.14 que se identifican usando la informaci6n de secuencia proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, dadas las secuencias de AAV9/HU.14 proporcionadas en la presente memoria, se puede aislar laAAV9/HU.14 infecciosa utilizando tecnologia de ruta del genoma (Siebert et al., 1995; 1nvestigaci6n de Acido Nucleico; 23: 1087-1088, Friezner-0egen et al., 1988; J. Biol. Chem. 261: 6972-6985, B0 Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). La ruta del genoma es particularmente adecuada para identificar y aislar las secuencias adyacentes a las secuencias novedosas identificadas conforme al metodo descrito en la presente memoria. Esta tecnica es tambien util para aislar repeticiones terminales invertidas (1TRs) del nuevo serotipo de AAV9/HU.14, en base a la capside novedosa de AAV y a las secuencias rep proporcionadas en la presente memoria.
Las secuencias, proteinas y fragmentos de la invenci6n pueden ser producidas con cualquier medio adecuado, incluyendo producci6n recombinante, sintesis quimica, u otros medios sinteticos. Tales metodos de producci6n estan dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no constituyen una limitaci6n para la presente invenci6n.
III. Produccion de rAAV con nuevas capsides de AAV
La invenci6n abarca secuencias novedosas de capside de AAV que estan libres de A0N y/o de material celular con las que estos virus estan asociados en la naturaleza.
En otro aspecto, la presente invenci6n proporciona moleculas que utilizan las secuencias novedosas de AAV de la invenci6n, para la producci6n de moleculas utiles en el suministro de un gen heter6logo u otras secuencias de acido nucleico a una celula objetivo.
En otro aspecto, la presente invenci6n proporciona moleculas que utilizan las secuencias de AAV de la invenci6n, para la producci6n de vectores virales utiles en el suministro de un gen heter6logo u otras secuencias de acido nucleico a una celula objetivo.
Las moleculas de la invenci6n que contienen secuencias de AAV incluyen cualquier elemento (vector) genetico que puede ser suministrado a una celula anfitri6n, por ejemplo, A0N desnudo, un plasmido, fago, transpos6n, c6smido, episoma, una proteina en un vehiculo de suministro no viral (por ejemplo, un portador a base de lipido), virus, etc., que transfiera las secuencias portadas por el mismo. El vector seleccionado puede ser suministrado por medio de cualquier metodo adecuado, incluyendo electroporaci6n por transfecci6n, suministro de liposoma, tecnicas de fusi6n de membrana, granulos recubiertos de A0N de alta velocidad, infecci6n viral y fusi6n de protoplasto. Los metodos usados para construir cualquier realizaci6n de la presente invenci6n son conocidos por los expertos en manipulaci6n de acido nucleico e incluyen ingenieria genetica, ingenieria recombinante y tecnicas sinteticas. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al., Clonaci6n Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
En una realizaci6n, los vectores de la invenci6n contienen, inter alia, secuencias que codifican una capside de AAV de la invenci6n. 0pcionalmente, los vectores de la invenci6n pueden contener tanto proteinas cap como rep de AAV. En vectores en los que se proporcionan ambas proteinas rep y cap de AAV, las secuencias rep de AAV y cap de AAV pueden originarse a partir del mismo clado. Alternativamente, la presente invenci6n proporciona vectores en los que las secuencias rep proceden de una fuente de AAV que difiere de la que esta proporcionando las secuencias cap. En una realizaci6n, las secuencias rep y cap se expresan a partir de fuentes separadas (por ejemplo, vectores separados, o una celula anfitri6n y un vector). En otras realizaciones, estas secuencias rep se fusionan en una estructura con secuencias cap de una fuente de AAV diferente para formar un vector quimerico de AAV. 0pcionalmente, los vectores de la invenci6n son vectores empaquetados en una capside de AAV de la invenci6n. Estos vectores, y otros vectores descritos en la presente memoria, pueden contener ademas un minigen que comprenda un transgen seleccionado que este flanqueado por 1TR 5' de AAV e 1TR 3' de AAV.
Asi, en una realizaci6n, los vectores descritos en la presente memoria contienen secuencias de acido nucleico que codifican una capside de AAV intacta que puede proceder de una secuencia simple de AAV (AAV9/HU.14). Una capside de ese tipo puede comprender aminoacidos 1 a 736 de SEQ 10 Num. 123. Alternativamente, estos vectores contienen secuencias que codifican capsides artificiales que contienen uno o mas fragmentos de la capside AAV9/HU.14 fusionados en proteinas (o fragmentos de las mismas) de capside heter6loga de AAV o que no sean de AAV. Estas proteinas de capside artificial se eligen a partir de porciones no contiguas de la capside de AA9/HU.14 o a partir de capsides de otros AAVs. Por ejemplo, un rAAV puede tener una proteina de capside que comprenda una
o mas regiones de capside del AAV9/HU.14 elegidas a partir de la vp2 y/o la vp3, o a partir de vp1, o fragmentos de las mismas elegidos a partir de aminoacidos 1 a 184, aminoacidos 199 a 259; aminoacidos 274 a 446; aminoacidos 603 a 659, aminoacidos 670 a 706; aminoacidos 724 a 738 de la capside de AAV9/HU.14, SEQ 10 Num. 123. En otro ejemplo, puede resultar deseable alterar el cod6n de inicio de la proteina vp3 a GTG. Alternativamente, el rAAV puede contener una o mas de las regiones hipervariables de proteina de capside de serotipo 9 de AAV que se identifican en la presente memoria, u otro fragmento incluyendo, sin limitaci6n, aa 185-198; aa 260-273; aa 447-477; aa 496-602; aa 660-669; y aa 707-723 de la capside de AAV9/HU.14. Vease SEQ 10 Num. 123. Estas modificaciones pueden ser para aumentar la expresi6n, el rendimiento; y/o para mejorar la purificaci6n en los sistemas de expresi6n seleccionados, o para otro prop6sito deseado (por ejemplo, para cambiar tropismos o para alterar epitopes de anticuerpos neutralizantes).
Los vectores descritos en la presente memoria, por ejemplo un plasmido, son utiles para una diversidad de prop6sitos, pero son particularmente adecuados para su uso en la producci6n de rAAV que contenga una capside que comprenda secuencias de AAV o un fragmento de las mismas. Estos vectores que incluyen rAAV, sus elementos, construcci6n y usos, se describen con detalle en la presente memoria.
En un aspecto, la invenci6n proporciona un metodo de generaci6n de un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que tiene una capside de serotipo 9 de AAV, o una porci6n de la misma. Un metodo de ese tipo incluye cultivar una celula anfitri6n que contenga una secuencia de acido nucleico que codifique una proteina de capside de serotipo 9 de AAV, o un fragmento de la misma, segun se define en la presente memoria; un gen rep funcional; un minigen compuesto por, como minimo, repeticiones terminales invertidas (1TRs) de AAV y un transgen; y funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigen en la proteina de capside de AAV9/HU.14.
Los componentes que se requiere cultivar en la celula anfitri6n para empaquetar un minigen de AAV en una capside de AAV pueden ser proporcionados a la celula anfitri6n en trans. Alternativamente, uno o mas de los componentes requeridos (por ejemplo, minigen, secuencias rep, secuencias cap, y/o funciones auxiliares) pueden ser proporcionados por una celula anfitri6n estable que haya sido disenada para contener uno o mas de los componentes requeridos usando metodos conocidos por los expertos en la materia. Mas adecuadamente, una celula anfitri6n estable podra contener el (los) componente(s) requerido(s) bajo el control de un promotor inducible. Ejemplos de promotores adecuados inducibles y constitutivos se proporcionan en la presente memoria, en la discusi6n de los elementos regulatorios adecuados para su uso con el transgen. En otra alternativa mas, una celula anfitri6n estable seleccionada puede contener componente(s) seleccionado(s) bajo el control de un promotor constitutivo y otro(s) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de uno o mas promotores inducibles. Por ejemplo, se puede generar una celula anfitri6n estable que se derive de celulas 293 (que contengan funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contengan las proteinas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. 0tras celulas anfitri6n estables pueden ser generadas por un experto en la materia.
El minigen, las secuencias rep, las secuencias cap, y las funciones auxiliares que se requieren para producir el rAAV de la invenci6n, pueden ser suministrados a la celula anfitri6n de empaquetamiento en forma de un elemento genetico cualquiera que transfiera las secuencias portadas en el mismo. El elemento genetico seleccionado puede ser suministrado mediante cualquier metodo adecuado, incluyendo los que se describen en la presente memoria. Los metodos usados para construir cualquier realizaci6n de la presente invenci6n son conocidos por los expertos en la materia sobre manipulaci6n de acido nucleico, e incluyen ingenieria genetica, ingenieria recombinante, y tecnicas sinteticas. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Clonaci6n Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. 0e forma similar, los metodos de generaci6n de viriones de rAAV son bien conocidos, y la selecci6n de un metodo adecuado no constituye una limitaci6n de la presente invenci6n. Vease, por ejemplo, K. Fischer et al., J. Virol., 70: 520-532 (1993) y la Patente U.S. num. 5.478.745.
A menos que se especifique lo contrario, las 1TRs de AAV, y otros componentes de AAV seleccionados descritos en la presente memoria, pueden ser elegidos facilmente entre cualesquiera AAVs, incluyendo sin limitaci6n los AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9. Estas 1TRs u otros componentes de AAV pueden ser aislados facilmente usando tecnicas disponibles por los expertos en la materia a partir de una secuencia de AAV. Tal AAV puede ser aislado u obtenido a partir de fuentes academicas, comerciales u otras fuentes publicas (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, las secuencias de AAV pueden ser obtenidas a traves de medios sinteticos u otros medios adecuados por referencia a secuencias publicadas tales como las que estan disponibles en la literatura o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank®, PubMed®, o similares.
A. El minigen
El minigen esta compuesto, como minimo, por un transgen y sus secuencias regulatorias, y repeticiones terminales invertidas (1TRs) 5' y 3' de AAV. En una realizaci6n deseable, se usan 1TRs de serotipo 2 de AAV. Sin embargo, se pueden seleccionar 1TRs de otras fuentes adecuadas. El minigen es el que se empaqueta en una proteina de capside y se suministra a una celula anfitri6n seleccionada.
1. El transgen
El transgen es una secuencia de acido nucleico, heter6loga respecto a las secuencias de vector que flanquean el transgen, que codifica un polipeptido, una proteina u otro producto de interes. La secuencia de codificaci6n de acido nucleico esta enlazada operativamente a componentes regulatorios de una manera que permite la transcripci6n, traducci6n y/o expresi6n de transgen en una celula anfitri6n.
La composici6n de la secuencia de transgen dependera del uso al que se destine el vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de transgen incluye una secuencia informadora, que tras la expresi6n produce una senal detectable. Tales secuencias informadoras incluyen, sin limitaci6n, secuencias de A0N que codifican �-lactamasa, �galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina; timidina quinasa, proteina fluorescente verde (GFP), GFP potenciada (EGFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteinas vinculadas por membrana que incluyen, por ejemplo, C02, C04, C08, la proteina de hemaglutinina de la influenza, y otras bien conocidas en el estado de la tecnica, respecto a las que existen anticuerpos de alta afinidad dirigidos a las mismas o pueden ser producidos con medios convencionales, y proteinas de fusi6n que comprenden una proteina vinculada por membrana fusionada apropiadamente con un dominio de etiqueta de antigeno, entre otros, hemaglutinina o Myc.
Estas secuencias de codificaci6n, cuando se asocian con elementos regulatorios que activan su expresi6n, proporcionan senales detectables con medios convencionales, incluyendo ensayos enzimaticos, radiograficos, colorimetricos, de fluorescencia u otros ensayos espectrograficos, ensayos de clasificaci6n de celulas de activaci6n fluorescente y ensayos inmunol6gicos, incluyendo el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (EL1SA), radioinmunoensayo (R1A) e inmunohistoquimica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LacZ, la presencia del vector que porta la senal es detectada por medio de ensayos de actividad beta-galactasa. Cuando el gen es proteina fluorescente verde o luciferasa, el vector que porta la senal puede ser medido visualmente por producci6n de luz o color en un lumin6metro.
Sin embargo, deseablemente, el transgen es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es util en biologia y medicina, tal como proteinas, peptidos, ARN, enzimas, mutantes negativos dominantes, o ARNs cataliticos. Las moleculas deseables de ARN incluyen tARN, dsARN, ARN ribos6mico, ARNs cataliticos, ARN de horquilla pequena, ARN trans-empalme, y ARNs antisentido. 0tro ejemplo de una secuencia de ARN util es una secuencia que inhibe o extingue expresi6n de una secuencia objetivada de acido nucleico en el animal tratado. Tipicamente, las secuencias objetivo adecuadas incluyen objetivos oncol6gicos y enfermedades virales. Veanse, como ejemplos de tales objetivos, los objetivos oncol6gicos y los virus identificados en lo que sigue, en la secci6n relativa a inmun6genos.
El transgen puede ser usado para corregir o mejorar deficiencias geneticas, las cuales pueden incluir deficiencias en las que los genes normales se expresan a niveles mas bajos que los normales, o deficiencias en las que el producto de gen funcional no esta expresado. Alternativamente, el transgen puede proporcionar un producto a una celula que no este expresada de forma natural en el tipo de celula o en el anfitri6n. Un tipo preferido de secuencia de transgen codifica una proteina terapeutica o polipeptido que se expresa en una celula anfitri6n. La invenci6n incluye ademas la utilizaci6n de multiples transgenes. En determinadas situaciones, se puede usar un transgen diferente para codificar cada subunidad o una proteina, o para codificar diferentes peptidos o proteinas. Esto resulta deseable cuando el tamano del A0N que codifica la subunidad de proteina es grande, por ejemplo para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaqueta, o una proteina de distrofina. Con el fin de que la celula produzca la proteina multi-subunidad, se infecta una celula con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, diferentes subunidades de una proteina pueden ser codificadas por el mismo transgen. En ese caso, un transgen simple incluye el A0N que codifica cada una de las subunidades, estando el A0N separado para cada subunidad mediante un sitio de entrada de ribozima interno (1RES). Esto es deseable cuando el tamano del A0N que codifica cada una de las subunidades es pequeno, por ejemplo el tamano total del A0N que codifica las subunidades y los 1RES es menor de cinco kilobases. Como alternativa a un 1RES, el A0N puede estar separado por secuencias que codifican un peptido 2A, que se auto-escinde en un evento posttraducci6n. Vease, por ejemplo, M.L. 0onelly, et al., J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (Enero de 1997); Furler, S., et al., Gene Ther., 8(11): 864-873 (Junio de 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10): 811-817 (Mayo de 2001). Este peptido 2A es significativamente mas pequeno que un 1RES, lo que hace que sea muy adecuado para su uso cuando el espacio es un factor de limitaci6n. Con mas frecuencia, cuando el transgen es grande, consiste en multisubunidades, o se co-suministran dos trans-genes, portando el rAAV el (los) transgen(es) deseado(s) o las subunidades son co-administradas para permitirles concatamerizar in vivo para formar un genoma de vector simple. En una realizaci6n de ese tipo, un primer AAV puede portar un casete de expresi6n que exprese un transgen simple y un segundo AAV puede portar un casete de expresi6n que exprese un transgen diferente para su co-expresi6n en la celula anfitri6n. Sin embargo, el transgen seleccionado puede codificar cualquier producto biol6gicamente activo u otro producto, por ejemplo un producto que se desee estudiar.
Los transgenes adecuados pueden ser seleccionados facilmente por un experto en la materia. La selecci6n de los transgenes no se considera una limitaci6n de la presente invenci6n.
2. Elementos regulatorios
Adicionalmente a los elementos principales identificados anteriormente para el minigen, el vector incluye tambien elementos de control convencionales que estan enlazados operativamente al transgen de una manera que permite su transcripci6n, traducci6n y/o expresi6n en una celula transfectada con el vector de plasmido o infectada con el virus producido por la invenci6n. Segun se utiliza en la presente memoria, las secuencias "enlazadas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de expresi6n que son contiguas con el gen de interes, como secuencias de control de expresi6n que actuan en trans o a una distancia para controlar el gen de interes.
Las secuencias de control de expresi6n incluyen secuencias promotoras y potenciadoras apropiadas de iniciaci6n y terminaci6n de transcripci6n; senales de procesamiento eficiente de ARN tales como senales de empalme y poliadenilaci6n (poliA); secuencias que estabilizan el mARN citoplasmico; secuencias que potencian la eficacia de traducci6n (es decir, secuencias de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteina; y cuando se desee, secuencias que incrementan la secreci6n del producto codificado. Un gran numero de secuencias de control de expresi6n, incluyendo los promotores que sean naturales, constitutivos, inducibles y/o especificos del tejido, son conocidos en el estado de la tecnica y pueden ser utilizados.
Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, aunque sin limitaci6n, el promotor LTR del virus de sarcoma retroviral de Rous (RSV) (opcionalmente con un potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (opcionalmente con el potenciador de CMV) [vease, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)], el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de �-lactina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1 [1nvitrogen]. Los promotores inducibles permiten regulaci6n de expresi6n de gen y pueden ser regulados mediante compuestos suministrados ex6genamente. Factores medioambientales tales como la temperatura, o la presencia de un estado fisiol6gico especifico, por ejemplo fase aguda, un estado de diferenciaci6n particular de la celula, o en celulas replicantes solamente. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles estan disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales, incluyendo, sin limitaci6n, 1nvitrogen, Clontech y Ariad. Muchos otros sistemas han sido descritos y pueden ser seleccionados facilmente por el experto en la materia. Ejemplos de promotores inducibles regulados por compuestos suministrados ex6genamente incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus del tumor mamario de rat6n (MMTV) inducible por dexametasona (0ex), el sistema promotor de polimerasa T7 [Publicaci6n de Patente 1nternacional num. W0 98/10088]; el promotor del insecto de ecdisoma [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), vease tambien Harvey et al., Curr. 0pin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)], el sistema inducible por RU-486 [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997)] y Wang et al., Gene Ther.,
4: 432-441 (1997)], y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al., J. Clin. 1nvest., 100: 2865-2872 (1997)]. 0tros tipos de promotores inducibles que pueden ser utiles en este contexto son los que estan regulados por un estado fisiol6gico especifico, por ejemplo temperatura, fase aguda, un estado de diferenciaci6n particular de la celula, o en celulas replicantes unicamente.
En otra realizaci6n, se podra usar el promotor natural para el transgen. El promotor natural puede ser preferido cuando se desea que la expresi6n del transgen mimetice la expresi6n natural. El promotor natural puede ser usado cuando la expresi6n del transgen debe estar regulada temporalmente o por desarrollo, o de una manera especifica del tejido, o en respuesta a estimulos transcripcionales especificos. En una realizaci6n adicional, otros elementos de control de expresi6n natural, tal como los elementos potenciadores, sitios de poliadenilaci6n o secuencias de consenso de Kozak, pueden ser usados tambien para mimetizar la expresi6n natural.
0tra realizaci6n del transgen incluye un gen ligado operativamente a un promotor especifico del tejido. Por ejemplo,si se desea expresi6n en el musculo esqueletico, se debera usar un promotor activo en el musculo. Estos incluyen los promotores procedentes de genes que codifican la �-actina esqueletica, la cadena 2A ligera de miosina, la distrofina, la creatina quinasa del musculo, asi como tambien promotores sinteticos del musculo con actividades mas altas que los promotores que se generan de forma natural (vease Li et al., Nat. Biotech., 17: 1541-245 (1999)). Se conocen ejemplos de promotores que son especificos del tejido para el higado (albumina, Miyatake et al., J. Virol.,
71: 5124-32 (1997); promotor esencial del virus de la hepatitis B, Sanding, et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfafetoproteina (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina 6sea (Stein, et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteina 6sea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), linfocitos (C02, Hensal et al., J. 1mmunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena receptora de celulas T), neuronales tal como el promotor de enolasa especifica de neuronas (NSE) (Andersen, et al., Cell. Mol. Neurobiol.,
13: 1503-15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), y el gen vgf especifico de neurona (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre otros.
0pcionalmente, los plasmidos portadores de transgenes terapeuticamente utiles pueden incluir tambien genes marcadores o informadores seleccionables, que pueden incluir secuencias de codificaci6n de resistencia a la geneticina, higromicina o purimicina, entre otros. Tales genes informadores o marcadores seleccionables (localizados con preferencia fuera del genoma viral que va a ser rescatado por medio del metodo de la invenci6n) pueden ser usados para senalar la presencia de los plasmidos en celulas bacterianas, tal como la resistencia a la ampicilina. 0tros componentes del plasmido pueden incluir un origen de replicaci6n. La selecci6n de estos y otros promotores y los elementos de vector son convencionales y muchas de esas secuencias se encuentran disponibles [vease, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias citadas en el mismo].
La combinaci6n del transgen, el promotor/potenciador, y las 1TRs 5' y 3' de AAV, se conocen como "minigen" por facilidad de referencia a los mismos. Las ensenanzas de la presente invenci6n proporcionan el diseno de un minigen de ese tipo que puede ser construido recurriendo a tecnicas convencionales.
3. Suministro del minigen a una celula anfitrion de empaquetamiento
El minigen puede ser transportado por cualquier vector adecuado, por ejemplo, un plasmido, que se suministra a una celula anfitri6n. Los plasmidos utiles en la presente invenci6n pueden ser disenados de tal modo que los mismos sean adecuados para replicaci6n y, opcionalmente, para integraci6n en celulas procari6ticas, o ambas. Estos plasmidos (u otros vectores portadores de la molecula heter6loga 5' de 1TR de AAV -3' de 1TR de AAV) contienen secuencias que permiten la replicaci6n del minigen en eucariotas y/o procariotas o marcadores de selecci6n para esos sistemas. Los genes marcadores o informadores seleccionables pueden incluir secuencias que codifican la resistencia a la geneticina, a la higromicina o a la purimicina, entre otros. Los plasmidos pueden contener tambien ciertos genes informadores o marcadores seleccionables que pueden ser usados para indicar la presencia del vector en celulas bacterianas, tal como resistencia a la ampicilina. 0tros componentes del plasmido pueden incluir como origen de replicaci6n un amplic6n, tal como el sistema amplic6n que emplea el antigeno nuclear del virus de Epstein Barr. Este sistema de amplic6n, u otros componentes de amplic6n similares, permiten una alta replicaci6n episomal de copia en las celulas. Con preferencia, la molecula portadora del minigen es transfectada en la celula, donde puede existir transitoriamente. Alternativamente, el minigen (que porta la molecula heter6loga 5' de 1TR de AAV -3' de 1TR de AAV) puede ser integrado de manera estable en el genoma de la celula anfitri6n, ya sea cromos6micamente o como episoma. En algunas realizaciones, el minigen puede estar presente en multiples copias, opcionalmente en concatameros de cabeza a cabeza, de cabeza a cola, o de cola a cola. Se conocen tecnicas de transfecci6n adecuadas y pueden ser utilizadas facilmente para suministrar el minigen a la celula anfitri6n.
En general, cuando se suministra el vector que comprende el minigen por transfecci6n, el vector se suministra segun una cantidad comprendida entre aproximadamente 5 Ig a aproximadamente 100 Ig de A0N, aproximadamente 10 Ig a aproximadamente 50 Ig de A0N, a aproximadamente 1 x 104 celulas a aproximadamente 1 x 1013 celulas, o a aproximadamente 1 x 105 celulas. Sin embargo, las cantidades relativas de A0N vector a celulas anfitri6n pueden ser ajustadas teniendo en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el metodo de suministro y las celulas anfitri6n seleccionadas.
B. Secuencias rep y cap
Adicionalmente al minigen, la celula anfitri6n contiene las secuencias que activan la expresi6n de una nueva proteina de capside de AAV segun la invenci6n (o una proteina de capside que comprende un fragmento de la misma) en la celula anfitri6n, y secuencias rep de la misma fuente que la fuente de las 1TRs encontradas en el minigen, o de una fuente de complementaci6n cruzada. Las secuencias cap y rep de AAV pueden ser obtenidas independientemente de una fuente de AAV segun se ha descrito anteriormente, y pueden ser introducidas en la celula anfitri6n de cualquier manera conocida por el experto en la materia, segun se ha descrito anteriormente. Adicionalmente, cuando se seudotipa un vector de AAV (por ejemplo, una capside de AAV9/HU.14), las secuencias que codifican cada una de los proteinas rep esenciales pueden ser suministradas por diferentes fuentes de AAV (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8). Por ejemplo, las secuencias de rep78/66 pueden ser procedentes del AAV2, mientras que las secuencias rep52/40 pueden proceder del AAV8.
En una realizaci6n, la celula anfitri6n contiene de manera estable la proteina de capside bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito en lo que antecede. 0e manera mas deseable, en esta realizaci6n, la proteina de capside se expresa bajo el control de un promotor inducible. En otra realizaci6n, la proteina de capside se suministra a la celula anfitri6n en trans. Cuando se suministra a la celula anfitri6n en trans, la proteina de capside puede ser suministrada por medio de un plasmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir expresi6n de la proteina de capside seleccionada en la celula anfitri6n. 0e manera mas deseable, cuando se suministra a la celula anfitri6n en trans, el plasmido que porta la proteina de capside porta tambien otras secuencias requeridas para empaquetar el rAAV, por ejemplo, las secuencias rep.
En otra realizaci6n, la celula anfitri6n contiene de manera estable las secuencias rep bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito en lo que antecede. 0e manera mas deseable, en esta realizaci6n, las proteinas rep esenciales se expresan bajo el control de un promotor inducible. En otras realizaciones, las proteinas rep se suministran a la celula anfitri6n en trans. Cuando se suministran a la celula anfitri6n en trans, las proteinas rep pueden ser suministradas a traves de un plasmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la expresi6n de las proteinas rep seleccionadas en la celula anfitri6n. 0e manera mas deseable, cuando se suministra a la celula anfitri6n en trans, el plasmido que porta la proteina de capside porta tambien otras secuencias requeridas para empaquetar el rAAV, por ejemplo las secuencias rep y cap.
0e ese modo, en una realizaci6n, las secuencias rep y cap pueden ser transfectadas en una celula anfitri6n sobre una unica molecula de acido nucleico y existir de manera estable en la celula como un episoma. En otra realizaci6n, las secuencias rep y cap estan integradas de manera estable en el cromosoma de la celula. 0tra realizaci6n tiene las secuencias rep y cap expresadas transitoriamente en la celula anfitri6n. Por ejemplo, una molecula util de acido nucleico para tal transfecci6n comprende, desde 5' a 3', un promotor, un separador opcional intercalado entre el promotor y el lugar de inicio de la secuencia de gen rep, una secuencia de gen rep de AAV, y una secuencia de gen cap de AAV.
0pcionalmente, las secuencias rep y/o cap pueden ser suministradas en un vector que consista en secuencias de A0N distintas de las que van a ser introducidas en las celulas anfitri6n. Por ejemplo, el vector puede contener la construcci6n de rAAV que comprende el minigen. El vector puede comprender uno o mas de los genes que codifican las funciones auxiliares, por ejemplo las proteinas adenovirales E1, E2a, y E4 0RF6, y el gen para VA1 ARN.
Con preferencia, el promotor usado en esta construcci6n puede ser cualquiera de los promotores constitutivo, inducible o natural, conocidos por los expertos en la materia o segun se ha discutido en lo que antecede. En una realizaci6n, se emplea una secuencia de promotor P5 de AAV. La selecci6n del AAV para proporcionar cualquiera de estas secuencias no limita la invenci6n.
En otra realizaci6n preferida, el promotor para rep es un promotor inducible, tal como los que se han discutido en lo que antecede en relaci6n con los elementos regulatorios de transgen. Un promotor preferido para expresi6n rep es el promotor T7. El vector que comprende el gen rep regulado por el promotor T7 y el gen cap, es transfectado o transformado en una celula que expresa, ya sea de manera constitutiva o y sea de manera inducible, la T7 polimerasa. Vease la Publicaci6n de Patente 1nternacional num. W0 98/10088, publicada el 12 de Marzo de 1998.
El separador es un elemento opcional en el diseno del vector. El separador es una secuencia de A0N intercalada entre el promotor y sitio de inicio de ATG del gen rep. El separador puede tener cualquier diseno deseado; es decir, puede ser una secuencia aleatoria de nucle6tidos, o alternativamente, puede codificar un producto de gen, tal como un gen marcador. El separador puede contener genes que incorporen tipicamente sitios de inicio/detenci6n y de poliA. El separador puede ser una secuencia de A0N no codificadora procedente de un procariota o un eucariota, una secuencia no codificadora repetitiva, una secuencia de codificaci6n sin controles transcripcionales, o una secuencia de codificaci6n con controles transcripcionales. 0os ejemplos de fuentes de secuencias separadoras son las secuencias fago en escalera o las secuencias de levadura en escalera, las cuales se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo en Gibco o en 1nvitrogen, entre otros. El separador puede ser de un tamano cualquiera, suficiente para reducir la expresi6n de los productos de gen rep78 y rep68, dejando los productos de gen rep52, rep40 y cap expresados a niveles normales. La longitud del separador puede estar por lo tanto comprendia en la gama de aproximadamente 10 bp a aproximadamente 10,0 kbp, con preferencia en la gama de aproximadamente 100 bp a aproximadamente 8,0 kbp. Para reducir la posibilidad de recombinaci6n, el separador es preferentemente de una longitud menor que 2 kbp; sin embargo, la invenci6n no se limita a eso.
Aunque la(s) molecula(s) que proporcionan rep y cap pueden existir en la celula anfitri6n transitoriamente (es decir, mediante transfecci6n), se prefiere que una o ambas de las proteinas rep y cap y el (los) promotor(es) que controla(n) su expresi6n este(n) expresado(s) de manera estable en la celula anfitri6n, por ejemplo a modo de episoma o mediante integraci6n en el cromosoma de la celula anfitri6n. Los metodos empleados para construir realizaciones de la presente invenci6n son tecnicas convencionales de ingenieria genetica o de ingenieria recombinante tales como las descritas en las referencias que anteceden. Aunque la presente descripci6n proporciona ejemplos ilustrativos de construcciones especificas, utilizando la informaci6n proporcionada en la presente memoria, un experto en la materia puede seleccionar y disenar otra senal de detenci6n adecuada, y la adici6n opcional de sitios de poliadenilaci6n.
En otra realizaci6n de la presente invenci6n, la proteina rep o cap puede ser proporcionada de manera estable por medio de una celula anfitri6n.
C. Las funciones auxiliares
La celula anfitri6n de empaquetamiento requiere tambien funciones auxiliares a efectos de empaquetar el rAAV de la invenci6n. 0pcionalmente, estas funciones pueden ser proporcionadas por un herpesvirus. Mas deseablemente, las funciones auxiliares necesarias son proporcionadas, cada una de ellas, a partir de una fuente de adenovirus de primate humano o no humano, tal como las que se han descrito en lo que antecede y/o estan disponibles a partir de una diversidad de fuentes, incluyendo la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA (US). En una realizaci6n actualmente preferida, la celula anfitri6n esta dotada de, y/o contiene, un producto de gen E1a, un producto de gen E2a, y/o un producto de gen E4 0RF6. La celula anfitri6n puede contener genes adenovirales tal como VA1 ARN, pero estos genes no son necesarios. En una realizaci6n preferida, no se encuentran presentes otros genes de adenovirus ni funciones de gen en la celula anfitri6n.
Mediante "A0N adenoviral que expresa el producto de gen E1a", se indica cualquier secuencia de adenovirus que codifica E 1 a, o cualquier porci6n funcional de E 1 a. El A0N adenoviral que expresa el producto de gen E2a y el A0N adenoviral que expresa los productos de gen E4 0RF6, se definen de manera similar. Tambien estan incluidos cualesquiera alelos u otras modificaciones del gen adenoviral o de una porci6n funcional del mismo. Tales modificaciones pueden ser introducidas deliberadamente recurriendo a ingenieria genetica convencional o a tecnicas mutagenicas para aumentar la funci6n adenoviral de alguna manera, asi como a variantes alelicas de los mismos que se producen de forma natural. Tales modificaciones y metodos para la manipulaci6n de A0N para conseguir estas funciones de gen de adenovirus son conocidos por los expertos en la materia.
Los adenovirus E1a, E1b, E2a, y/o los productos de gen E40RF6, asi como otras funciones deseadas cualesquiera, pueden ser proporcionados utilizando cualquier medio que permita su expresi6n en una celula. Cada una de las secuencias que codifican estos productos puede estar en un vector, o uno o mas genes pueden estar en el mismo vector. El vector puede ser cualquier vector conocido en la materia o descrito en lo que antecede, incluyendo los plasmidos, c6smidos y virus. La introducci6n del vector en la celula anfitri6n puede ser llevada a cabo por cualquier medio conocido en el estado de la tecnica o discutido en lo que antecede, incluyendo transfecci6n, infecci6n, electroporaci6n, suministro de liposoma, tecnicas de fusi6n de membrana, fragmentos recubiertos de A0N de alta velocidad, infecci6n viral y fusi6n de protoplasto, entre otros. Uno o mas de los genes adenovirales pueden ser integrados de manera estable en el genoma de la celula anfitri6n, expresados de manera estable a modo de episomas, o expresados transitoriamente. Los productos de gen pueden ser expresados en su totalidad transitoriamente, sobre un episoma o integrados de manera estable, o algunos de los productos de gen pueden ser expresados de manera estable mientras otros son expresados transitoriamente. Ademas, los promotores para cada uno de los genes adenovirales pueden ser seleccionados independientemente a partir de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral natural. Los promotores pueden estar regulados por un estado fisiol6gico especifico del organismo o de la celula (es decir, por el estado de diferenciaci6n o en celulas de replicaci6n o quiescentes) o mediante factores anadidos ex6genamente, por ejemplo.
D. Celulas anfitrion ylineas de celulas de empaquetamiento
La propia celula anfitri6n puede ser seleccionada a partir de cualquier organismo biol6gico que incluya celulas procari6ticas (por ejemplo, bacterianas), y celulas eucari6ticas, incluyendo celulas de insectos, celulas de levadura, y celulas de mamiferos. Las celulas anfitri6n particularmente deseables se eligen entre algunas especies de mamiferos incluyendo, sin limitaci6n, celulas tales como A549, WEH1, 3T3, 10T1/2, BHK, M0CK, C02 1, C0S 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VER0, W138, HeLa, celulas 293 (las cuales expresan E1 adenoviral funcional), Saos, C2CL2, celulas L, HT1080, HepG2 y fibroblasto primario, celulas de hepatocito y mioblasto derivadas de mamiferos que incluyen el ser humano, el mono, el rat6n, la rata, el conejo y el hamster. La selecci6n de las especies de mamiferos que proporcionan las celulas no es una limitaci6n de la presente invenci6n; ni lo es el tipo de celula de mamifero, es decir, fibroblasto, hepatocito, celula de tumor, etc. Los requisitos para la celula utilizada consisten en que no sea portadora de ningun gen de adenovirus distinto de E1, E2a y/o E4 0RF6: no contenga ningun otro gen de virus que pudiera dar como resultado recombinaci6n hom6loga de un virus contaminante durante la producci6n de rAAV; y que sea capaz de infecci6n o transfecci6n de A0N y de expresi6n del A0N transfectado. En una realizaci6n preferida, la celula anfitri6n es una que tenga rep y cap transfectados de manera estable en la celula.
Una celula anfitri6n util en la presente invenci6n es una celula anfitri6n transformada de manera estable con las secuencias que codifican rep y cap, y que este transfectada con el A0N de los adenovirus E1, E2a y de E40RF6 y una construcci6n portadora del minigen segun se ha descrito en lo que antecede. Las lineas celulares que expresan rep y/o cap estables, tal como B50 (Publicaci6n de Solicitud de Patente 1nternacional num. W0 99/15685), o las que se describen en la Patente US num. 5.658.785, pueden ser tambien empleadas de manera similar. 0tra celula anfitri6n deseable contiene el A0N adenoviral minimo que es suficiente para expresar E4 0RF6. 0tras lineas celulares adicionales pueden ser construidas usando las nuevas secuencias cap de AAV9 de la invenci6n.
La preparaci6n de una celula anfitri6n conforme a la presente invenci6n incluye tecnicas tales como el ensamblaje de secuencias de A0N seleccionadas. Este ensamblaje puede ser llevado a cabo con la utilizaci6n de tecnicas convencionales. Tales tecnicas incluyen cA0N y clonaci6n gen6mica, las cuales son bien conocidas y estan descritas en Sambrook et al., citado anteriormente, el uso de secuencias solapantes de oligonucle6tido del adenovirus y de los genomas de AAV, combinado con metodos sinteticos, de reacci6n de cadena de polimerasa, y cualesquiera otros metodos adecuados que proporcionen la secuencia de nucle6tido deseada.
La introducci6n de las moleculas (como plasmidos o virus) en la celula anfitri6n puede ser tambien llevada a cabo usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia y segun se ha discutido a traves de la presente descripci6n. En la realizaci6n preferida, se usan tecnicas de transfecci6n estandar, por ejemplo transfecci6n de CaP04 o electroporaci6n, y/o infecci6n por adenovirus hibridos/vectores de AAV en lineas celulares tales como la linea HEK 293 de celulas de rin6n de embri6n humano (una linea de celulas de rin6n humano que contiene genes de adenovirus F.1 funcional que proporcionan proteinas E1 de actuaci6n trans).
Los vectores basados en AAV9/HU.14 que son generados por un experto en la materia son beneficiosos para el suministro de gen a celulas anfitri6n seleccionadas y a pacientes de terapia de gen puesto que no se han encontrado anticuerpos neutralizantes frente al AAV9/HU.14 en la poblaci6n humana. Un experto en la materia puede preparar facilmente otros vectores virales de rAAV que contengan las proteinas de capside de AAV9/HU.14 proporcionadas en la presente memoria utilizando una diversidad de tecnicas conocidas por los expertos en la materia. Se pueden preparar todavia otros vectores virales de rAAV que contengan la secuencia de AAV9/HU.14 y capsides de AAV a partir de otra fuente.
Un experto en la materia podra comprender facilmente que las nuevas secuencias de AAV de la invenci6n pueden ser adaptadas facilmente para su uso en estos y otros sistemas de vector viral para suministro de gen in vitro, ex vivo o in vivo. 0e forma similar, un experto en la materia puede seleccionar facilmente otros fragmentos del genoma de AAV de la invenci6n para su uso en una diversidad de sistemas de vector que, tanto si son de rAAV como si no son de rAAV. Tales sistemas de vector pueden incluir, por ejemplo, lentivirus, retrovirus, pirovirus, virus de vacuna, y sistemas adenovirales, entre otros. La selecci6n de estos sistemas de vector no constituye una limitaci6n de la presente invenci6n.
Asi, la invenci6n proporciona ademas vectores generados usando las secuencias de acido nucleico y de aminoacido del nuevo AAV de la invenci6n. Tales vectores son utiles para una diversidad de prop6sitos que incluyen el suministro de moleculas terapeuticas y el uso en regimenes de vacuna. Particularmente deseables para el suministro de moleculas terapeuticas son los AAVs recombinantes que contienen capsides del nuevo AAV de la invenci6n. Estas u otras construcciones de vector que contengan las nuevas secuencias de AAV de la invenci6n pueden ser usadas en regimenes de vacuna, por ejemplo para el co-suministro de una citoquina, o para el suministro del propio inmun6geno.
IV. Virus recombinantes yusos de los mismos
Utilizando las tecnicas descritas en la presente memoria, un experto en la materia puede generar un rAAV que tenga una capside de un AAV de la invenci6n o que tenga una capside que contenga uno o mas fragmentos de un AAV de la invenci6n. En una realizaci6n, se puede utilizar una capside de longitud completa procedente de un unico AAV, la hu.14/AAV9 [SEQ 10 Num. 123]. En otra realizaci6n, se puede generar una capside de longitud completa que contenga uno o mas fragmentos de la nueva capside de AAV de la invenci6n fusionada en su estructura con secuencias de otro AAV seleccionado, o de porciones heter6logas (es decir, no contiguas) del mismo AAV. Por ejemplo, un rAAV puede contener una o mas de las nuevas secuencias de regi6n hipervariable de AAV9/HU.14. Alternativamente, las secuencias unicas de AAV de la invenci6n pueden ser usadas en construcciones que contengan otras secuencias virales o no virales. 0pcionalmente, un virus recombinante puede portar secuencias rep de AAV que codifiquen una o mas de las proteinas rep de AAV.
A. Suministro de virus
En otro aspecto, la presente invenci6n facilita el suministro de un transgen a un anfitri6n, lo que incluye la transfecci6n o la infecci6n de una celula anfitri6n seleccionada con un vector viral recombinante generado con las secuencias de AAV9/HU.14 (o con fragmentos funcionales del mismo), segun la invenci6n. Los metodos de suministro son bien conocidos por los expertos en la materia y no constituyen una limitaci6n de la presente invenci6n.
En una realizaci6n deseable, la invenci6n facilita el suministro mediado por AAV de un transgen a un anfitri6n. Este metodo incluye transfectar o infectar un anfitri6n seleccionado con un vector viral recombinante que contiene un transgen seleccionado bajo el control de secuencias que dirigen la expresi6n del mismo y de proteinas de capside de AAV9.
0pcionalmente, una muestra del anfitri6n puede ser ensayada en primer lugar en cuanto a la presencia de anticuerpos respecto a una fuente de AAV seleccionada (por ejemplo, un serotipo). Los expertos en la materia conocen bien una diversidad de formatos de ensayo para la detecci6n de anticuerpos neutralizantes. La selecci6n de un ensayo de ese tipo no es una limitaci6n de la presente invenci6n. Vease, por ejemplo, Fisher et al., Nature Med., 3(3): 306-312 (Marzo de 1997) y W.C. Manning et al, Human Cene Therapy. 9: 477-485 (1 de Marzo de 1998). Los resultados de este ensayo pueden ser usados para determinar que vector de AAV que contenga proteinas de capside de una fuente particular, es el preferido para el suministro, por ejemplo mediante la ausencia de anticuerpos neutralizantes especificos para esa fuente de capside.
En un aspecto de este metodo, el suministro de un vector con proteinas de capside de AAV de la invenci6n puede preceder o seguir al suministro de un gen por medio de un vector con una proteina de capside de AAV diferente. 0e ese modo, el suministro de un gen por medio de vectores de rAAV puede ser usado para el suministro repetitivo de gen a una celula anfitri6n seleccionada. 0eseablemente, los vectores de rAAV suministrados posteriormente llevan el mismo transgen que el primer vector de rAAV, pero los vectores administrados posteriormente contienen proteinas de capside de fuentes (y con preferencia, serotipos diferentes) que difieren del primer vector. Por ejemplo, si un primer vector tiene proteinas de capside de AAV9/HU.14, los vectores administrados posteriormente pueden tener proteinas de capside seleccionadas entre otros AAVs, opcionalmente, a partir de otro serotipo o a partir de otro clado.
0pcionalmente, se pueden usar multiples vectores de rAAV para suministrar transgenes grandes o transgenes multiples por co-administraci6n de vectores de rAAV concatamerizados in vivo para formar un genoma de vector simple. En una realizaci6n de ese tipo, un primer AAV puede portar un casete de expresi6n que exprese un unico transgen (o una subunidad del mismo) y un segundo AAV puede portar un casete de expresi6n que exprese un segundo transgen (o una subunidad diferente) para co-expresi6n en la celula anfitri6n. Un primer AAV puede portar un casete de expresi6n que sea una primera pieza de una construcci6n policistr6nica (por ejemplo, un promotor y transgen, o subunidad) y un segundo AAV puede portar un casete de expresi6n que sea una segunda pieza de una construcci6n policistr6nica (por ejemplo, transgen o subunidad y una secuencia de poliA). Estas dos piezas de construcci6n policistr6nica concatamerizan in vivo para formar un unico genoma de vector que co-exprese los transgenes suministrados por el primer y el segundo AAVs. En tales realizaciones, el vector de rAAV portador del primer casete de expresi6n y el vector de rAAV portador del segundo casete de expresi6n pueden ser suministrados en una sola composici6n farmaceutica. En otras realizaciones, los dos o mas vectores de rAAV son suministrados como composiciones farmaceuticas separadas que pueden ser administradas de forma sustancialmente simultanea,
o un poco antes, o una despues de la otra.
Los vectores recombinantes descritos en lo que antecede pueden ser suministrados a celulas anfitri6n de acuerdo con metodos publicados. El rAAV, con preferencia suspendido en un portador fisiol6gicamente compatible, puede ser suministrado a un paciente mamifero humano o no humano. Los portadores adecuados pueden ser seleccionados facilmente por un experto en materia en vista de la indicaci6n para la que el virus de transferencia vaya dirigido. Por ejemplo, un portador adecuado incluye soluci6n salina, la cual puede estar formulada con una diversidad de soluciones tamp6n (por ejemplo, soluci6n salina tamponada con sulfato). 0tros portadores ejemplares incluyen soluci6n salina esteril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sesamo y agua. La selecci6n del portador no constituye una limitaci6n de la presente invenci6n.
0pcionalmente, las composiciones de la invenci6n pueden contener, adicionalmente al rAAV y al (a los) portador(es), otros ingredientes farmaceuticos convencionales, tal como conservantes o estabilizadores quimicos. Los ejemplos de conservantes adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, acido s6rbico, di6xido de azufre, propil galato, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Los estabilizadores quimicos adecuados incluyen gelatina y albumina.
Los vectores son administrados en cantidades suficientes para transfectar las celulas y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresi6n de gen para proporcionar un beneficio terapeutico sin efectos adversos indebidos, o con efectos fisiol6gicos medicamente aceptables, que pueden ser determinados por los expertos en las artes medicas. Las rutas convencionales y farmaceuticamente aceptables de administraci6n incluyen, aunque sin limitaci6n a las mismas, el suministro directo a un 6rgano deseado (por ejemplo, el higado (opcionalmente a traves de la arteria hepatica) o al pulm6n), via oral, por inhalaci6n, intranasal, intratraqueal, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica, y otras rutas de administraci6n parenteral. Las rutas de administraci6n pueden ser combinadas, si se desea.
Las dosificaciones del vector viral dependen principalmente de factores tales como la condici6n que va a ser tratada, la edad, el peso y el estado de salud del paciente, y pueden variar por tanto entre pacientes. Por ejemplo, una dosificaci6n humana terapeuticamente efectiva del vector viral esta comprendida en general en la gama de alrededor de 0,1 ml a alrededor de 100 ml de soluci6n de modo que contenga concentraciones de entre alrededor de 1 x 109 a 1 x 1016 genomas en el vector viral. Una dosis humana preferida para el suministro a 6rganos grandes (por ejemplo, el higado, el musculo, el coraz6n y el pulm6n) puede estar entre alrededor de 5 x 1010 y 5 x 1013 genomas por kg, en un volumen de alrededor de 1 a 100 ml. Una dosis preferida para el suministro al ojo es de alrededor de 5 x 109 a 5 x 1012 copias de genoma, en un volumen de alrededor de 0,1 ml a 1 ml. La dosis se ajustara de modo que se equilibre el beneficio terapeutico frente a cualesquiera efectos colaterales, y tales dosis pueden variar dependiendo de la aplicaci6n terapeutica para la que se emplee el vector recombinante. Se pueden monitorizar los niveles de expresi6n del transgen para determinar la frecuencia de la dosificaci6n resultante de vectores virales, con preferencia vectores de AAV que contienen el minigen. 0pcionalmente, se pueden utilizar regimenes de dosificaci6n similares a los descritos con fines terapeuticos a efectos de inmunizaci6n utilizando las composiciones de la invenci6n.
Ejemplos de productos terapeuticos y de productos inmunogenicos para el suministro por medio de vectores contenedores de AAV segun la invenci6n, se proporcionan en lo que sigue. Estos vectores pueden ser usados para una diversidad de regimenes terapeuticos o de vacuna, segun se describe en la presente memoria. Adicionalmente, estos vectores pueden ser suministrados en combinaci6n con uno o mas de otros vectores o ingredientes activos en un regimen terapeutico y/o de vacuna deseado.
B. Transgenes terapeuticos
Los productos terapeuticos utiles codificados por el transgen incluyen hormonas y factores de crecimiento y diferenciaci6n que incluyen, sin limitaci6n, insulina, glucag6n, hormona del crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberaci6n de hormona de crecimiento (GRF), hormona de estimulaci6n del foliculo (FSH), hormona leutinizante (LH), gonadotropina cori6nica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor de estimulaci6n de colonia de granulocito (GCSF), eritropoyetina (EP0), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblasto basico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblasto acidico (aFGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (P0GF), factores 1 y 11 de crecimiento de insulina (1GF-1 e 1GF-11), uno cualquiera de la superfamilia del factor de crecimiento de transformaci86n, incluyendo TGFa, activinas, inhibinas, o cualquiera de las proteinas morfogenicas 6seas (BMP) HMPs 1-15, uno cualquiera de la familia de factores de crecimiento del factor de diferenciaci6n hereuglin/neuregluin/AR1A/neu (N0F), factor de crecimiento nerveo (NGF), factor neurotr6fico derivado del cerebro (B0NF), neurotrofinas NT-3 y NT-45, factor neurotr6fico ciliar (CNTF), factor neurotr6fico derivado de linea de celula glial (Q0NF), neurturin, agrin, una cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrin-1 y netrin-2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrinas, noggin, hedgehog s6nico y tirosina hidroxilasa.
0tros productos de transgen utiles incluyen proteinas que regulan el sistema inmune incluyendo, sin limitaci6n, las citoquinas y las linfoquinas tales como la trombopoyetina (TP0), las interleuquinas (1L) 1L-1 a 1L-25 (incluyendo, por ejemplo, la 1L-2, 1L-4, 1L-12 e 1L-18), la proteina quimioatrayente de monocito, el factor inhibitorio de leucemia, el factor de estimulaci6n de colonia macr6fago de granulocito, ligando Fas, factores a y de necrosis tumoral, interferones a, y y, factor de celulas madre, ligando flk-2/flt3. Los productos de gen producidos por el sistema inmune son tambien utiles en la invenci6n. Estos incluyen, sin limitaci6n, inmunoglobulinas 1gG, 1gM, 1gA, 1g0 e 1gE, inmunoglobulina quimerica, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, receptores de celulas T, receptores de celulas T quimericos, receptores de celulas T de cadena simple, moleculas MHC de clase 1 y de clase 11, asi como moleculas de diseno de inmunoglobulina y de MHC. Los productos de gen utiles incluyen tambien proteinas regulatorias complementarias tales como las proteinas regulatorias de complemento, la proteina de cofactor de membrana (MCP), el factor de aceleraci6n de la descomposici6n (0AF), CR1, CF2 y C059.
0tros productos de gen utiles adicionales incluyen uno cualquiera de los receptores para las hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, linfocinas, proteinas regulatorias y proteinas de sistema inmune. La invenci6n abarca el uso de receptores para regulaci6n del colesterol y/o modulaci6n de lipidos, incluyendo el receptor de lipoproteina de baja densidad (L0L), el receptor de lipoproteina de alta densidad (H0L), el receptor de muy baja densidad (VL0L) y los receptores scavenger. La invenci6n abarca tambien el uso de productos de gen tal como los miembros de la superfamilia receptora de la hormona esteroide incluyendo los receptores de glucocorticoides y los receptores de estr6geno, receptores de vitamina 0 y otros receptores nucleares. Adicionalmente, los productos de gen utiles incluyen factores de transcripci6n tales como jun, fos, max, mad, el factor de respuesta de suero (SRF), AP-1, AP2, myb, Myo0 y miogenina, proteinas que contienen el dominio ETS, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteinas de enlace de dominio CCAAT, factor de regulaci6n de interferon (1RF1), proteina de tumor de Wilms, proteina de enlace de ETS, STAT, proteinas de enlace de dominio GATA, por ejemplo GATA-3, y la familia de cabeza bifurcada de proteinas de helice alada.
0tros productos de gen utiles incluyen carbamoil sintetasa 1, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetato hidrolasa, fenilamjina hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6fosfatasa, porfobilin6geno desaminasa, cistationa beta-sintasa, cetoacido descarboxilasa de cadena ramificada, albumina, isovaleril-coA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvirato carboxilato, fosforilasa hepatica, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, H-proteina, T-proteina, una secuencia reguladora transmembrana de fibrosis quistica (CFTR), y un producto de gen de distrofina [por ejemplo, un mini- o micro-distrofina]. 0tros productos de gen utiles adicionales incluyen enzimas tales como las que pueden ser utiles en terapia de sustituci6n de enzima, la cual es util en una variedad de condiciones resultantes de una actividad deficiente de la enzima. Por ejemplo, las enzimas que contienen manosa-6-fosfato pueden ser utilizadas en terapias para enfermedades de acumulaci6n lisos6mica (por ejemplo, un gen adecuado incluye la que codifica la -glucuronidasa (GUSB)).
1ncluso otros productos de gen utiles incluyen los utilizados para el tratamiento de la hemofilia, incluyendo la hemofilia B (que incluye el Factor 1X) y la hemofilia A (que incluye el Factor V111 y sus variantes, tal como la cadena ligera y la cadena pesada del heterodimero y del dominio suprimido en B; Patente US num. 6.200.560 y Patente US num. 6.221.349). El gen de Factor V111 codifica 2351 aminoacidos y la proteina tiene seis dominios, designados desde el amino hasta el termino carboxi terminal como A1 -A2 -B -A3 -C1 -C2 [Wood et al., Nature, 312: 330 (1984); Vehar et al., Nature 312: 337 (1984); y Toole et al., Nature 342: 337 (1984)]. El Factor V111 humano es procesado en el interior de la celula para producir un heterodimero que comprende en primer lugar una cadena pesada que contiene los dominios A1, A2 y B, y una cadena ligera que contiene los dominios A3, C1 y C2. Tanto el polipeptido de cadena simple como el heterodimero, circulan en el plasma como precursores inactivos, hasta que son activados por escisi6n de trombina entre los dominios de A2 y B, lo que libera el dominio B y da como resultado una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2. El dominio B se suprime en forma de procoagulante activado de la proteina. Adicionalmente, en la proteina natural, dos cadenas de polipeptido ("a" y "b"), que flanquean al dominio B, estan enlazadas a un cati6n de calcio divalente.
En algunas realizaciones, el minigen comprende los primeros 57 pares de bases de la cadena pesada de Factor V111 que codifica la secuencia de senal de 10 aminoacidos, asi como la secuencia de poliadenilaci6n de la hormona de crecimiento humano (hGH). En realizaciones alternativas, el minigen comprende ademas los dominios A1 y A2, asi como 5 aminoacidos procedentes del termino N del dominio B, y/o 85 aminoacidos del termino C del dominio B, asi como tambien los dominios A3, C1 y C2. En otras realizaciones mas, los acidos nucleicos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de Factor V111, son suministrados en un unico minigen separado por 42 acidos nucleicos que codifican 14 aminoacidos del dominio B [Patente US Num. 6.200.560].
Segun se utiliza en la presente memoria, una cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad de vector de AAV que produce cantidades suficientes de Factor V111 para reducir el tiempo que se necesita para que la sangre de un sujeto coagule. Generalmente, los hemofilicos severos que tienen menos del 1% de niveles normales de Factor V111, tienen un tiempo de coagulaci6n sanguinea total mayor de 60 minutos en comparaci6n con los 10 minutos aproximadamente de los no hemofilicos.
La presente invenci6n no se limita a ninguna secuencia especifica de Factor V111. Muchas formas naturales y recombinantes de Factor V111 han sido aisladas y generadas. Ejemplos de formas que ocurren de forma natural y recombinantes de Factor V11 pueden ser encontrados en la literatura cientifica y de patentes, incluyendo la Patente US num. 5.563.045, Patente US num. 5.451.521, Patente US num. 5,422.260, Patente US num. 5.004.803, Patente US num. 4.757.0006, Patente US num. 5.661.008, Patente US num. 5.789.203, Patente US num. 5.681.746, Patente US num. 5.595.886, Patente US num. 5.045.455, Patente US num. 5.668.108, Patente US num. 5.633.150, Patente US num. 5.693.499, Patente US num. 5.587.310, Patente US num. 5.171.844, Patente US num. 5.149.637, Patente US num. 5.112.950, Patente US num. 4.886.876; Publicaci6n de Patentes 1nternacionales nums. W0 94/11503, W0 87/07144, W0 92/16557, W0 91/09122, W0 97/03195, W0 96/21035 y W0 91/07490; Solicitudes de Patentes Europeas nums. EP 0 672 138, EP 0 270 618, EP 0 182 448, EP 0 162 067, EP 0 786 474, E0 0 533 862, EP 0 506 757, EP 0 874 057, EP 0 795 021, EP 0 670 332, EP 0 500 734, EP 0 232 112 y EP 0 160 457; Sanberg et al., XXD Congreso 1ntern. 0e la Fed. Mundial de Hemofilia (1992), y Lind et al., Eur. J. Biochem., 232: 19 (1995).
Las secuencias de acidos nucleicos codificantes para el Factor V111 descrito anteriormente pueden ser obtenidas usando metodos recombinantes o derivando la secuencia desde un vector que se sepa que incluye la misma. Ademas, la secuencia deseada puede ser aislada directamente de las celulas y los tejidos que la contengan, usando tecnicas estandar, tal como extracci6n de fenol y PCR de cA0N o de A0N gen6mico [Vease, por ejemplo, Sambrook et al]. Las secuencias de nucle6tido pueden ser tambien producidas sinteticamente, en vez de clonadas. La secuencia completa puede ser ensamblada a partir de oligonucle6tidos de superposici6n preparados por medio de metodos estandar y ensamblados en una secuencia de codificaci6n completa [Vease, por ejemplo, Edge; Nature
292: 757 (1981); Nambari et al., Science, 223: 1299 (1984); y Jay et al., J. Biol. Chem. 259: 6311 (1984).
Ademas, la invenci6n no se limita al Factor V111 humano. En efecto, se pretende que la presente invenci6n abarque el uso de Factor V111 de animales distintos de los humanos, incluyendo aunque sin limitaci6n los animales de compania (por ejemplo, caninos, felinos y equinos), ganado (por ejemplo, bovinos, caprinos y ovinos), animales de laboratorio, mamiferos marinos, grandes gatos, etc.
Los vectores de AAV pueden contener un acido nucleico de codificaci6n de fragmentos de Factor V111 que en si mismo no sea biol6gicamente activo, incluso cuando, administrado a un sujeto, mejore o restaure el tiempo de coagulaci6n de la sangre. Por ejemplo, segun se ha discutido con anterioridad, la proteina de Factor V111 comprende dos cadenas de polipeptido: una cadena pesada y una cadena ligera, separadas por un dominio B que es escindido durante el procesamiento. Segun se ha demostrado mediante la presente invenci6n, las celulas receptoras de cotransducci6n con las cadenas pesada y ligera de Factor V111 conducen a la supresi6n de Factor V111 biol6gicamente activo. Puesto que la mayor parte de los hemofilicos contienen una mutaci6n o supresi6n en una sola de las cadenas (por ejemplo, la cadena pesada o la ligera), puede ser posible administrar solamente la cadena defectuosa al paciente que suministre la otra cadena.
0tros productos de gen utiles incluyen polipeptidos que se producen de forma no natural, tal como polipeptidos quimericos o hibridos que tengan una secuencia de aminoacido que ocurra de forma no natural, que contenga inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacido. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de diseno de cadena simple podrian ser utiles en pacientes inmunocomprometidos de cortina. 0tros tipos de secuencias de gen que no ocurren de manera natural incluyen moleculas antisentido y acidos nucleicos cataliticos, tal como ribozimas, que podrian ser utilizados para reducir la sobre-expresi6n de un objetivo.
La reducci6n y/o la modulaci6n de expresi6n de un gen es particularmente deseable para el tratamiento de condiciones hiperproliferativas caracterizadas por celulas hiperproliferantes, como son los canceres y la psoriasis. Los polipeptidos objetivo incluyen aquellos polipeptidos que son producidos exclusivamente por, o a niveles mas altos en, celulas hiperproliferativas en comparaci6n con celulas normales. Los antigenos objetivo incluyen polipeptidos codificados por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y el gen de translocaci6n bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Adicionalmente a los productos de oncogen como antigenos objetivo, los polipeptidos objetivo para tratamientos anti-cancer y para regimenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos realizados por linfomas de celula B y regiones variables de receptores de celula T de linfomas de celula T que, en algunas realizaciones, son usados tambien como antigenos objetivo para la enfermedad autoinmune. Se pueden usar como polipeptidos objetivo otros polipeptidos asociados a tumor, tal como los polipeptidos que se encuentran a niveles mas altos en celulas tumorales que incluyan el polipeptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1A y polipeptidos de enlace de folato.
0tros polipeptidos terapeuticos y proteinas adecuados incluyen los que pueden ser utiles para tratamiento de individuos que adolecen de enfermedades y des6rdenes autoinmunes, confiriendo una respuesta protectora inmune de amplia base frente a objetivos que estan asociados a autoinmunidad incluyendo receptores celulares y celulas que producen anticuerpos "auto"-dirigidos. Las enfermedades autoinmunes mediadas por celulas T incluyen artritis reumatoide (MS), sindrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes melitus dependiente de insulina (100M), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn, y colitis ulcerosa. Cada una de esas enfermedades esta caracterizada por receptores de celula T (TCRs) que enlazan con antigenos end6genos e inician la cascada inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunes.
C. Transgenes inmunogenicos
0e manera adecuada, los vectores de AAV de la invenci6n evitan la generaci6n de respuestas inmunes a las secuencias de AAV contenidas dentro del vector. Sin embargo, estos vectores pueden no obstante ser formulados de una manera que permita la expresi6n de un transgen portado por los vectores para inducir una respuesta inmune a un antigeno seleccionado. Por ejemplo, con el fin de promover una respuesta inmune, el transgen puede ser expresado a partir de un promotor constitutivo, pudiendo el vector ser adyuvado segun se describe en la presente memoria, y/o pudiendo el vector ser situado en el tejido degenerativo.
Ejemplos de transgenes inmunogenicos adecuados incluyen los seleccionados a partir de una diversidad de familias virales. Ejemplos de familias virales deseables contra las que una respuesta inmune puede resultar deseable incluyen la familia picornavirus, la cual incluye los generos rinovirus, coxsackievirus, ecovirus, y enterovirus humanos tal como el virus de la hepatitis A; y los generos aptovirus, los cuales son responsables de enfermedades de los pies y la boca, principalmente en animales no humanos. 0entro de la familia de virus del picomavirus, los antigenos objetivo incluyen el Up1, VP2, VP3, VP4 y VPG. 0tras familias de virus incluyen los astrovirus y la familia calcivirus. La familia calcivirus abarca el grupo de virus de Norwalk, los cuales son un importante agente causante de gastroenteritis epidemica. 0tra familia viral mas, que es deseable para su uso en la objetivaci6n de antigenos para inducir respuestas inmunes en humanos y animales no humanos, es la familia togavirus, la cual incluye los generos alfavirus, que incluyen los virus de Sindbis, virus de RossRiver, encefalitis Venezuelan, Eastern & Western Equina, y los rubivirus, que incluye el virus Rubella. La familia flaviviridae incluye el dengue, la fiebre amarilla, la encefalitis japonesa, la encefalitis de St. Louis, incluyendo el virus Rubella y la encefalitis transmitida por garrapatas. 0tros antigenos objetivo pueden ser generados a partir de la Hepatitis C o la familia de coronavirus, los cuales incluyen un numero de virus no humanos tales como el virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral), virus gastroenterico transmisible porcino (cerdo), virus de encefalitis de hemaglutinatina porcina (cerdo), virus de la peritonitis infecciona felina (gato), coronavirus enterica felina (gato), coronavirus canina (perro), y coronavirus respiratorios humanos, los cuales pueden causar el resfriado comun y/o la hepatitis no A, B o C, y los cuales incluyen la causa putativa del sindrome respiratorio repentino agudo (SARS). 0entro de la familia de coronavirus, los antigenos objetivo incluyen el E1 (llamado tambien proteina M o matriz), E2 (llamado tambien proteina S o Spike), E3 (llamado tambien HE o hemaglutina-elterosa), glicoproteina (no presente en todos los coronavirus), o N (nucleocapside). 0tros antigenos adicionales pueden ser objetivados frente a la familia artevirus y la familia rabdovirus. La familia rabdovirus incluye los generos vesiculovirus (por ejemplo, el Virus Estomatitis Vesicular) y el lisavirus general (por ejemplo, las rabias). 0entro de la familia rabdovirus, los antigenos adecuados pueden ser derivados de la proteina G o de la proteina N. La familia filoviridae, la cual incluye virus de la fiebre hemorragica tales como el virus Marburg y el Ebola, pueden ser una fuente de antigenos adecuada. La familia paramixovirus incluye el Virus Tipo 1 de parainfluenza, el Virus Tipo 3 de parainfluenza, el rubulavirus (virus de las paperas, Virus Tipo 2 de parainfluenza, Virus Tipo 4 de parainfluenza, virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), peste bovina, morbilivirus, que incluyen el sarampi6n y el moquillo canino, y nemovirus, que incluyen el virus sincitial respiratorio. El virus de influenza esta clasificado dentro de la familia ortomixovirus y es una fuente adecuada de antigeno (por ejemplo, la proteina HA, la proteina N1). La familia bunyavirus incluye los generos bunyavirus (encefalitis California, La Crosse), flebovirus (Fiebre del Valle del Rift), haravirus (la familia puremala es un virus de la fiebre de hemahagin) nairovirus (enfermedad de la oveja de Nairobi) y varios bungavirus no asignados. La familia arenavirus proporciona una fuente de antigeno contra LCM y el virus de la fiebre de Lassa. 0tra fuente de antigenos es la familia bomavirus. La familia reovirus incluye los generos reovirus, rotavirus (que causa gastroenteritis aguda en ninos), orbivirus, y cultivirus (fiebre transmitida por la garrapata de Colorado, Lebombo (humanos), encefalitis equina, lengua azul). La familia retrovirus incluye la subfamilia oncorivirinal que abarca enfermedades humanas y veterinarias tales como el virus de la leucemia felina, HTLV1 y HTLV11, lentivirinal (que incluye HV, virus de inmunodeficiencia del simio, virus de inmunodeficiencia felina, virus de la anemia infecciosa equina, y espumavirinal). La familia papovirus incluye la subfamilia poliomavirus (virus BKU y JCU) y la subfamilia papilomavirus (asociado a canceres o a progresi6n maligna de papiloma). La familia adenovirus incluye virus (EX, A07, AR0, 0.B.) que causan enfermedades respiratorias y/o enteritis. La familia parvovirus incluye parvovirus felino (enteritis felina), virus de panleucopenia felina, parvovirus canino, y parvovirus porcino. La familia herpesvirus incluye la subfamilia alfaherpesvirus, que abarca los generos simplexvirus (HSV1, HSV11), varicelovirus (pseudo-rabias, varicela zoster) y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye los generos citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, que incluye los generos linfocriptovirus, EBV (linfoma de Burkitts), herpesvirus humano 6A, 6B y 7, el herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi y el herpesvirus cercopitecino (virus B), rinotraqueitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, y radinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia cordopoxvirinae, la cual abarca los generos ortopoxvirus (Variola mayor (Viruela) y Vaccinia (Viruela de la vaca), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la Hepatitis B. Un virus sin clasificar que puede ser una fuente adecuada de antigenos es el virus delta de la Hepatitis, el virus E de la Hepatitis, y priones. 0tro virus que es una fuente de antigenos es el Nipan Virus. 0tras fuentes virales mas pueden incluir la enfermedad bursal infecciosa aviar y el virus del sindrome respiratorio y reproductivo porcino. La familia alfavirus incluye el virus de la arteritis equina y varios virus de encefalitis.
La presente invenci6n puede abarcar tambien inmun6genos que son utiles para inmunizar un humano o un animal no humano frente a otros pat6genos incluyendo bacterias, hongos, microorganismos parasitos o parasitos multicelulares que infectan a los vertebrados humanos o no humanos, o procedentes de una celula de cancer o celula de tumor. Ejemplos de pat6genos bacterianos incluyen los cocos patogenicos Gram-positivos incluyendo los neumococos, estafilococos (y las toxinas producidas por los mismos, por ejemplo la enterotoxina B); y los estreptococos. Los cocos patogenicos Gram-negativos incluyen los meningococos, gonococos. Los bacilos Gramnegativos entericos patogenicos incluyen la enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria y eiquenella; meloidosis; salmonella; shigella; hem6filos; moraxella; H. ducreyl (que causa el cancroide); especies de brucella (brucelosis); Francisella tularensis (que causa la tularemia); Yersinia pestis (plaga) y otra yersinia (pasteurella); streptobacillus moniliformis y spirillum; bacilos Gram-positivos que incluyen listeria monocitogenes; erysipelothrix rhusiopathiae; corynebacterium diphteria (difteria); c6lera; B. anthracis (antrax); donovanosis (granuloma inguinal), y bartonellosis. Las enfermedades causadas por bacterias anaer6bicas patogenicas incluyen el tetanos, botulismo (Clostridium botulinum y sus toxinas); Clostridium perfringens y su toxina epsilon; otras clostridias; tuberculosis; lepra; y otras microbacterias. Las enfermedades espiroquetales patogenicas incluyen la sifilis; trepanomatosas: sifilis pian, pinta y endemica; y la leptoespirosis. 0tras infecciones causadas por bacterias pat6genas mas altas y por hongos patogenicos incluyen muermo (Burkholderia mallei); actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidiyodomicosis; candidiasis, aspergilosis, y mucomicosis; esporotricosis; paracocidiyodomicosis, petrielidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones por rickettsia incluyen fiebre del tifus, fiebre maculosa de las Montanas Rocosas, fiebre Q (Coxiella burnetif), y rickettsiosis. Los ejemplos de infecciones de micoplasma y por clamidia incluyen: mycoplasma pneumoniae; linfogranuloma venereo; psitacosis, e infecciones por clamidia perinatales. Los eucariotas patogenicos abarcan protozoos y helmintos patogenicos, y las infecciones producidas por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Panuemocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; trematodos o trematodos; e infecciones por cestodos (tenia).
Muchos de estos organismos y/o toxinas que son producidas por los mismos, han sido identificados por el Centro para el Control de Enfermedades [(C0C), 0epartamento de Sanidad y Servicios Humanos, USA], como agentes que tienen un potencial para su uso en ataques biol6gicos. Por ejemplo, algunos de estos agentes biol6gicos incluyen Bacillus anthracis (antrax), Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (plaga), variola mayor (viruela), Francisella tularensis (tularemia), y fiebres hemorragicas virales [filovirus (por ejemplo, Ebola, Marburg], y arenavirus [por ejemplo, Lassa, Machupo], todos los cuales estan actualmente clasificados como agentes de Categoria A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies Brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), Burkolderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina epsilon), especies de Staphilococcus y sus toxinas (enterotoxina B), Clamydia psittaci (psitacosis), amenazas de la seguridad del agua (por ejemplo, Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), fiebre del tifus (Richettsia powazekii) y encefalitis viral (alfavirus, por ejemplo encefalitis equina Venezuelan; encefalitis equina Eastern; encefalitis equina western); todas las cuales estan actualmente clasificadas como agentes de Categoria B; y virus y hantavirus Nipan, los cuales estan actualmente clasificados como agentes de Categoria C. Adicionalmente, otros organismos, que estan clasificados de ese modo o clasificados de manera diferente, pueden ser identificados y/o usados para tal prop6sito en el futuro. Se comprendera facilmente que los vectores virales y otras construcciones descritas en la presente memoria son utiles para suministro de antigenos a partir de estos organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, que podran evitar y/o tratar la infecci6n u otras reacciones adversas con estos agentes biol6gicos.
La administraci6n de los vectores de la invenci6n para suministrar inmun6genos contra la regi6n variable de las celulas T provocan una respuesta inmune que incluye CTLs para eliminar esas celulas T. En artritis reumatoide (RA), han sido caracterizadas varias regiones variables especificas de TCRs que estan involucradas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen V-3, V-14, V-17 y V-17. 0e ese modo, el suministro de una secuencia de acido nucleico que codifique al menos uno de esos polipeptidos provocara una respuesta inmune que objetivara celulas T involucradas en RA. En esclerosis multiple (MS), varias regiones variables especificas de TCRs que estan involucradas en la enfermedad han sido caracterizadas, incluyendo estas TCRs los V-7 y V-10. Asi, el suministro de una secuencia de acido nucleico que codifica al menos uno de esos polipeptidos, provocara una respuesta inmune que objetivara celulas T involucradas en MS. En escleroderma, han sido caracterizadas varias regiones variables especificas de TCRs que estan involucradas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen V-6, V-8, V-14 y V-16, V-3C, V7, V-14, V-15, V-16, V-28 y V-12. Asi, el suministro de una molecula de acido nucleico que codifique al menos uno de estos polipeptidos provocara una respuesta inmune que objetivara celulas T involucradas en escleroderma.
0e ese modo, un vector viral recombinante derivado de rAAV segun la invenci6n, proporciona un vehiculo eficiente de transferencia de gen que puede suministrar un transgen seleccionado a una celula anfitri6n in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo tiene anticuerpos neutralizantes respecto a una o mas fuentes de AAV. En una realizaci6n, el rAAV y las celulas se mezclan ex vivo; las celulas infectadas son cultivadas utilizando metodologias convencionales; y las celulas transducidas son re-infundidas en el paciente.
Estas composiciones son particularmente adecuadas en cuanto a suministro de gen para fines terapeuticos y para inmunizaci6n, incluyendo inducci6n de inmunidad protectora. Ademas, las composiciones de la invenci6n pueden ser usadas para la producci6n de un producto de gen deseado in vitro. Para la producci6n in vitro se puede obtener un producto deseado (por ejemplo, una proteina) a partir de un cultivo deseado a continuaci6n de la transfecci6n de celulas anfitri6n con un rAAV que contiene la molecula que codifica el producto deseado y cultivando el cultivo celular bajo condiciones que permitan expresi6n. El producto expresado puede entonces ser purificado y aislado, segun se desee. Tecnicas adecuadas para transfecci6n, cultivo celular, purificaci6n y aislamiento son conocidas por los expertos en la materia.
Los ejemplos que siguen ilustran varios aspectos y realizaciones de la invenci6n.
Ejemplo 1 - analisis computacional de secuencias de AAV de primate
A. Recogida de tejidos de primate
Se han descrito anteriormente fuentes de tejidos de primate no humano [N. Muzycka, K. 1. Berns, en Fields Virology
0. M. Knipe, P. M. Howley, Eds. (Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, 2001) vol. 2, pp. 2327-2359]. Los tejidos humanos fueron recogidos a partir de procedimientos quirurgicos o de examen postmortem o de donantes de 6rganos a traves de dos importantes proveedores nacionales de tejido humano, Cooperative Human Tissue network (CHTN) y National 0isease Research 1nterchange (N0R1). Los tejidos humanos usados para el presente estudio comprendian 18 tipos de tejido diferentes que incluian el colon, higado, pulm6n, bazo, rin6n, cerebro, intestino delgado, medula 6sea, coraz6n, ganglios linfaticos, musculo esqueletico, ovario, pancreas, est6mago, es6fago, cerviz, testiculos y pr6stata. Las muestras de tejido proceden de un grupo variado de individuos de diferentes generos, razas (caucasianos, afro-americanos, asiaticos de hispanos) y edades (23 -83 anos). Entre 259 muestras analizadas procedentes de 250 individuos, aproximadamente un 28% fueron asociadas a patologias.
B. Detecci6n y aislamiento de secuencias de AAV
La totalidad de los A0Ns celulares fueron extraidos de tejidos humanos y de primates no humanos segun ha sido descrito con anterioridad [Atchison, et al., Science 194, 754-756 (1965)]. La prevalencia molecular y la distribuci6n del tejido de AAVs humanos, fueron determinadas ya sea por signatura o ya sea por PCR de cap de longitud completa, usando imprimadores y condiciones que fueron similares a los usados para el analisis de primates no humanos. La misma estrategia de clonaci6n de PCR usada para el aislamiento y la caracterizaci6n de una familia expandida de AAVs en primates no humanos, fue desplegada en el aislamiento de AAVs procedentes de tejidos humanos seleccionados. 0e forma resumida, un fragmento de 3,1 kb que contiene una parte de la secuencia rep y la secuencia cap de longitud completa, fue amplificado mediante PCR y Topo-clonado (1nvitrogen). Los clones de AAV humano fueron analizados inicialmente mediante mapeo de restricci6n para ayudar a identificar diversidad de secuencias de AAV, los cuales fueron sometidos posteriormente a analisis de secuencia completa mediante SeqWright (SeqWright, Houston, TX) con una precisi6n de un 99,9%. Se caracteriz6 un total de 67 clones de capside aislados a partir de tejidos humanos (hu. 1 -hu.67). Procedentes de tejidos de primate no humano, fueron secuenciados 86 clones cap, entre los cuales 70 clones eran procedentes de macacos Rhesus, 6 clones de macacos cinomolgos, 3 clones de macacos rabones, 2 clones de babuino y 5 clones de chimpance.
C. Analisis de secuencias de AAV
A partir de todas las secuencias contiguas, se analizaron estructuras de lectura abierta (0RFs) de proteina viral (vp1) de capside de AAV. Las secuencias de proteina VP1 de capside de AAV fueron alineadas con el programa ClustalX1.81™ [H. 0. mayor, J. L. Melnick, Nature 210, 331-332 (1966)] y se realiz6 un alineamiento de A0N en estructura con el paquete de software BioEdit™ [U. Bantel-Schaal, H. Zur Hausen, Virologia 134, 52-63 (1984)]. Fueron inferidas filogenias con el paquete MEGA™ v2.1 y el TreePuzzle. Se usaron algoritmos Neighbor-Joining, Maximum Parsimony, y Maximum Likelihood [M. Nei, S. Kumar, Evoluci6n Molecular y Fiologenetica (0xford University Press, New York, 2000); H. A. Schmidt, K. Strimmer, M. Vingron, A. von Haeseler, Bioinformatica 18, 5024 (Marzo de 2002); N. Saitou, M. Nei, Mol Biol Evol 4, 406-25 (Julio de 1987)] para confirmar un agrupamiento similar de secuencias en grupos monoliticos.
A continuaci6n se definieron clados a partir de un arbol filogenetico de Neighbor-Joining de todas las secuencias de proteina. Las distancias de aminoacido fueron estimadas haciendo uso de correcci6n de Poisson. Se realiz6 analisis de arranque con 1000 replicaciones. Las secuencias se consideraron monoliticas cuando tenian un nodo de conexi6n dentro de una distancia genetica de 0,05. Un grupo de secuencias originadas a partir de 3 o mas fuentes se consider6 un clado. La filogenia del AAV fue evaluada a continuaci6n en cuanto a evidencia de recombinaci6n mediante un analisis secuencial. Se inform6 de la homoplasia mediante implementaci6n del algoritmo de Split 0ecomposition [H. J. Bandelt, A. W. 0ress, Mol Phylogenet Evol 1, 242-52 (Septiembre de 1992)]. Los fragmentos que fueron recogidos de esta manera se analizaron a continuaci6n en cuanto a recombinaci6n haciendo uso del algoritmo de Bootscan en el software de Simplot [M. Nei y S. Kumar, Evoluci6n Molecular y Filogenetica (0xford University Press, New York, (2000)]. Se utiliz6 una ventana deslizante de 400nt (10 nt/escal6n) para obtener 100 arboles de Neighbor-Joining de replicaci6n de arranque. A continuaci6n, las filogenias de Split 0ecomposition y de Neighbor-Joining fueron inferidas a partir de fragmentos de recombinaci6n putativa. Una mejora significativa de los valores de arranque, reducci6n de escisiones y reagrupamiento de las secuencias hibridas con sus fuentes parentales, fueron considerados en el criterio de recombinaci6n.
Un numero de secuencias cap diferentes amplificadas a partir de 8 sujetos humanos diferentes, mostraron relaciones filogeneticas respecto a AAV2 (5') y AAV3 (3') en torno a un punto de interrupci6n comun en la posici6n 1400 de la secuencia de A0N de cap, consecuente con la recombinaci6n y la formaci6n de un virus hibrido. Esta es la regi6n general del gen cap donde la recombinaci6n fue detectada a partir de aislados procedentes de un ganglio linfatico mesenterico de un macaco Rhesus [Gao et al., Proc Natl Acad Sci USA 100, 6081-6086 (13 de Mayo de 2002)]. Una prueba Z basada en cod6n global para la selecci6n, fue llevada a cabo implementando el metodo de Neib-Gojobori [R. M. Kotin, Hum Gene Ther 5, 793-801 (Julio de 1994)].
Los analisis filogeneticos fueron repetidos excluyendo los clones que fueron identificados positivamente como hibridos. En estos analisis, se incluyeron como exogrupos AAVs aviares y de ganso [(1. Bossis, J. A. Chiorini, J Virol 77, 6799-810 (Junio de 2003)]. La Figura 1 es un arbol de Neighbor-Joining; se obtuvieron relaciones similares usando analisis de maxima frugalidad y maxima probabilidad.
Estos analisis mostraron 11 grupos filogeneticos, que aparecen resumidos en la Tabla 1. El origen de las especies de los 6 clados de AAVs y de los 5 clones (o conjuntos de clones) de AAVs individuales, ha sido representado mediante el numero de fuentes a partir de las cuales fueron recuperadas las secuencias durante la toma de muestras. El numero total de secuencias acumuladas por especies y por agrupaci6n, ha sido mostrado entre parentesis. Las referencias a secuencias previamente descritas por clado estan en la columna de la derecha: Rhesus - macacos Rhesus; cyno - macacos cinomolgos; chimp -chimpances; rab6n - macacos rabones.
Tabla 1
Clasificaci6n del numero de fuentes (secuencias) por especies y por clado o clon
Humano
Rhesus Cyno Babuino Chimp Rab6n
Clado/representante
A / AAV1 (AAV6)
3(4)
B / AAV2
12(22)
C / AAV2 - AAV3
8(17)
hibrido
0 / AAV7
5(10) 5(5)
E / AAV8
7(9) 7(16) 1(2) 1(3)
F / AAV9
3(3)
Clones
AAV3
AAV4
1(3)
AAV5
Ch.5
1(1)
Rh.8
2(2)
Puesto que, segun se ha indicado anteriormente, la recombinaci6n no se implementa en los algoritmos filogeneticos estandar usados, con el fin de construir un arbol filogenetico apropiado, esas secuencias fueron excluidas del analisis, a partir del cual se estableci6 su ascendencia recombinante. Un analisis de Neighbor-Joining de todas las secuencias no recombinadas ha sido representado lado con lado con los clados que evolucionaron haciendo uso de recombinaci6n. Se gener6 una salida similar con el algoritmo diferente utilizado y con la secuencia de nucle6tido como entrada.
Se realizaron experimentos adicionales para evaluar la relaci6n de parentesco filogenetico con la funci6n segun fue medida mediante actividad serol6gica y tropismo, segun se describe en los ejemplos que siguen.
Ejemplo 2 - Analisis serologico de los nuevos AAVs humanos
El ultimo clado obtenido segun el ejemplo anterior, se deriv6 de aislados procedentes de 3 humanos y no contenia ningun serotipo previamente descrito. Se generaron antisueros policlonales contra un miembro representativo de este clado y se llev6 a cabo un estudio exhaustivo de reactividad serol6gica cruzada entre los serotipos descritos previamente. Esto mostr6 que el nuevo clado humano es serol6gicamente distinto de los otros serotipos conocidos y por lo tanto, se denomin6 Clado F (representado por el AAV9).
Se generaron anticuerpos policlonales de conejo contra serotipos 1-9 de AAV mediante inoculaci6n intramuscular de animales con 1 x 1013 copias de genoma de cada uno de los vectores de AAV, junto con un volumen igual de adyuvante de Freud incompleto. Las inyecciones fueron repetidas en el dia 34 para aumentar los titulos de anticuerpos. La reactividad serol6gica cruzada entre los AAVs 1-9 fue determinada mediante evaluaci6n del efecto inhibitorio de antisuero de conejo sobre la transducci6n de celulas 293 por vectores portadores de un gen informador (AAVCMVEGFP, que porta la proteina fluorescente verde potenciada), seudotipado con capsides derivadas de diferentes fuentes de AAVs. Se evalu6 la transducci6n de celulas 84-31 mediante vectores AAVCMVEGFP bajo un microscopio de UV. En la evaluaci6n de las relaciones serol6gicas entre dos AAVs, se comprob6 la capacidad de ambos sueros, heter6logo y hom6logo, para neutralizar vectores procedentes de cada AAV. Cuando la neutralizaci6n mediante el suero fue 16 veces mas baja frente a vectores heter6logos que frente a vectores hom6logos de una manera reciproca, los AAVs se consideraron serotipos distintos. Los titulos de neutralizaci6n fueron definidos segun ha sido descrito con anterioridad [(G. P. Gao et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 11854-9 (3 de Septiembre de 2002)].
Tabla 2
Evaluaci6n serol6gica de los nuevos vectores de AAV
Seudotipos de vector usados en el ensayo de neutralizaci6n
de conejo inmunizado con:
AAV2/1 AAV2/2 AAV2/3 AAV2/4 AAV2/5 AAV2/6 AAV2/7 AAV2/8 AAV2/9
AAV2/1
1/163,840 Ningun NAB Ningun NAB Ningun NAB 1/40,960 1/40,960 1/40 Ningun NAB Ningun NAB
AAV2/2
1/80 1/81,920 1/5,120 1/20 1/80 1/80 1/40 1/40 Ningun NAB
AAV2/3
1/1,280 ,560 1/40,9600 1/20 ,560 ,560 1/1,280 1/1,280 Ningun NAB
AAV2/4
1/20 Ningun NAB Ningun NAB 1/1,280 Ningun NAB Ningun NAB Ningun NAB Ningun NAB 1/40
AAV2/5
1/20,480 Ningun NAB 1/80 Ningun NAB 1/5,120 1/5, 120 1/40 Ningun NAB Ningun NAB
AAV2/6
1/81,920 Ningun NAB 1/640 1/40 1/327,680 1/327,680 1/40 Ningun NAB 1/40
AAV2/7
1/1,280 1/640 1/1,280 1/20 1/1,280 1/1,280 /1/163,840 1/5, 120 1/80
AAV/8
1/20 1/1,280 1/1,280 Ningun NAB Ningun NAB Ningun NAB 1/640 1/327,680 ,560
AAV2/9
Ningun NAB Ningun NAB Ningun NAB Ningun NAB Ningun NAB Ningun NAB 1/20 1/640 1/20 480
Estos datos confirman los agrupamientos filogeneticos de los diferentes clones y clados excepto en lo que se refiere a reactividad serol6gica no anticipada de los serotipos de AAV5 y AAV1 estructuralmente distintos (es decir, la relaci6n de titulo heter6logo/hom6logo fue 1/4 y 1/8 en titulaciones reciprocas).
El resultado indic6 ademas que el AAVhu.14 tenia una propiedad serol6gica distinta y no tenia reactividad cruzada significativa con los antisueros generados a partir de cualquiera de los serotipos de AAV conocidos. La distintividad serol6gica del AAVhu.14 estaba soportada ademas por su unicidad en la estructura de capside que compartia menos del 85% de identidad de secuencia de aminoacido con todos los demas serotipos de AAV comparados en este estudio. Estos hallazgos nos proporcionaron la base para denominar al AAVhu.14 como un nuevo serotipo, el AAV9.
Ejemplo 3 - Evaluacion de AAVs de primate como vectores de transferencia de gen
Se estudiaron los tropismos biol6gicos de los AAVs mediante generaci6n de un vector seudotipado en el que los genomas de AAV2 recombinantes que expresan ya sea GFP o ya sea el gen informador secretado a-1 antitripsina (A1AT) fueron empaquetados con capsides derivadas de diversos clones y de un miembro representativo de cada clado de AAV de primate para su comparaci6n. Por ejemplo, los datos obtenidos a partir del AAV1 fueron usados para presentar el Clado A, seguido por el AAV2 para el Clado B, el Rh.34 para el AAV4, el AAV7 para el Clado 0, el AAV8 para el Clado E, y el AAVHu.14 para el Clado F. El AAV5, el AAVCh.5 y el AAVRh.8 se mantienen como genotipos de AAVs simples para la comparaci6n.
Los vectores fueron evaluados en cuanto a eficiencia de transducci6n in vitro, en base a transducci6n GFP, y eficacia de transducci6n in vivo en el higado, el musculo o el pulm6n (Figura 4).
A. ln vitro
Se usaron vectores que expresan proteina fluorescente verde potenciada (EGFP) para examinar su eficacia de transducci6n in vitro en celulas 84-31 y para estudiar sus propiedades serol6gicas. Para analisis funcional, se midi6 la transducci6n in vitro de diferentes vectores de AAVCMVEGFP en celulas 84-31 que fueron cultivadas en una placa de 96 pocillos e infectadas con vectores de AAVCMVEGFP seudotipados a un M01 de 1 x 104 GC por celula. Los vectores de AAV fueron seudotipados con capsides de AAVs 1, 2, 5, 7, 8 y 6 distintos de los nuevos AAVs (Ch.5, Rh.34, Cy5, rh.20, Rh.8 y AAV9) usando la tecnica descrita por G. Gao et al., en Proc Natl Acad Sci USA 99, 11854-9 83 de Septiembre de 2002). La transducci6n de EGFP relativa fue puntuada como 0, 1, 2 y 3 en correspondencia con 0-10%, 10-30%, 30-70% y 70-100% de celulas verdes estimadas usando un microscopio de UV a las 48 horas post infecci6n.
B. ln vivo
Para estudios in vivo, se seleccion6 a-tripsina humana (A1AT) como un gen informador sensitivo y cuantitativo en los vectores y fue expresado bajo el control del promotor de �-actina de pollo potenciada CMV. El empleo del promotor de CB permite que se consigan niveles altos de tejido no especifico y constitutivo de transferencia de gen de A1AT, y tambien permite el uso de la misma preparaci6n de vector para estudios de transferencia de gen en cualquier tejido de interes. Ratones desnudos NCR de cuatro a seis semanas de edad, fueron tratados con los nuevos vectores de AAV (AAVCBhA1AT) a una dosis de 1 x 1011 copias de genoma por animal por medio de inyecciones intraportal, intratraqueal e intramuscular para transferencia de gen dirigida al higado, al pulm6n y al musculo, respectivamente. Se recogieron muestras de suero en diferentes momentos de tiempo despues de la transferencia de gen y se determinaron las concentraciones de A1AT mediante ensayo basado en EL1SA y se puntuaron como 0, 1, 2 y 3 en relaci6n con los diferentes niveles de A1AT del suero despues de la transferencia de gen, dependiendo de la ruta de administraci6n del vector (Higado: 0 = A1AT < 400 ng/ml, 1 = A1AT 400-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000
10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml; Pulm6n: 0 = A1AT < 200 ng/ml, 1 = A1AT 200-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000
10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml; Musculo: 0 = A1AT < 100 ng/ml, 1 = A1AT 100-1000 ng/ml, 2 = A1AT 1000
10.000 ng/ml, 3 = A1AT > 10.000 ng/ml).
En un AAV humano, el clon 28.4/hu.14 (denominado ahora AAV9), tiene la capacidad de transducir el higado a una eficiencia similar al AAV8, 2 registros de pulm6n, mejor que el AAV5, y de musculo superior al AAV1, mientras que el rendimiento de los otros dos clones humanos, el 24.5 y el 16.12 (hu.12 y hu.13) fue marginal en los 3 tejidos objetivo. El clon N721.8 (AAVrh.43) es tambien de un alto rendimiento en los tres tejidos.
Para analizar mejor la eficacia de trasferencia de gen del AAV9 y del rh.43 en comparaci6n con los de banco para el higado (AAV8), pulm6n (AAV5) y musculo (AAV1), se llev6 a cabo un experimento de respuesta de dosis. Ambos vectores nuevos demostraron al menos una transferencia de gen 10 veces mejor que el AAV1 en el musculo, un rendimiento similar al AAV8 en el higado y 2 registros mas eficaces que el AAV5 en el pulm6n.
Un grupo de AAVs demostr6 una transferencia de gen eficiente en los 3 tejidos que fue similar o superior a la de comportamiento de su marcador de banco en cada tejido. Hasta la fecha, 3 nuevos AAVs han caido dentro de esta categoria, dos procedentes de Rhesus (rh10 y 43) y uno de humanos (hu.14 o AAV9). Una comparaci6n directa de eficacia relativa de transferencia de gen de estos 3 AAVs respecto a sus marcadores de banco en el higado, el pulm6n y el musculo de rat6n murina, sugiere que algunos AAVs de primate con la mejor condici6n fisica han evolucionado a partir de una selecci6n y evoluci6n biol6gica rigurosa como "super" virus. Estos son particularmente adecuados para aplicaciones de transferencia de gen.
C. Perfiles de actividad biol6gica
Se demostraron los perfiles unicos de actividad biol6gica, en terminos de eficacia de transferencia de gen, para los diferentes AAVs con concordancia sustancial entre los miembros de un conjunto de clones o clado. Sin embargo, la transducci6n in vitro no pronostic6 la eficacia de transferencia de gen in vivo. Se desarroll6 un algoritmo para comparaci6n de la actividad biol6gica entre dos seudotipos de AAV diferentes en base a la puntuaci6n relativa del nivel de expresi6n de transgen y de analisis acumulativo de diferencias.
Las diferencias acumulativas de las puntuaciones de transferencia de gen in vitro e in vivo entre pares de AAVs, fueron calculadas y presentadas en la tabla (N0 = no determinado) de acuerdo con la siguiente f6rmula: 0iferencia funcional acumulativa en terminos de puntuaciones entre los vectores A y B = in vitro (A-B) + pulm6n (A-B) + higado (A -B) + musculo (A -B). Cuanto mas pequeno es el numero, mas similar es la funci6n de los AAVs. En el area sombreada gris, la diferencia de porcentaje en secuencia ha sido representada con italica en negrita. La diferencia de porcentaje en estructura cap fue determinada dividiendo el numero de diferencias de aminoacido tras una supresi6n por pares de espacios de separaci6n por 750, la longitud de alineamiento de secuencia de la proteina VP1.
AAV1
AAV2 AAV3 Ch.5 AAV4 AAV5 AAV7 AAV8 Rh.8 AAV9
AAV1
0 5 N0 4 4 4 2 4 5 4
AAV2
16.3 0 N0 3 2 4 7 7 6 9
AAV3
13.2 12.3 0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N0
Ch.5
15.5 10.5 1.5 0 2 4 6 6 5 8
AAV4
33.7 36.7 34.8 34.9 0 2 7 6 5 8
AAV5
39.1 38.8 38.5 38.4 42.7 0 4 4 3 6
AAV7
14.1 16.7 14.9 15.6 33.2 38.5 38.9 0 2 3 2
AAV8
15.6 16.4 14 15.6 33.2 38.9 1.6 0 1 2
Rh.8
14.1 15.2 14.3 14.4 33.7 39.6 12.1 8.8 0 3
AAV9
17.2 17.3 15.6 14.8 34.5 39.7 17.5 14.3 12.5 0
Estos estudios ponen de relieve un numero de aspectos relevantes en cuanto al estudio de parvovirus humanos. La prevalencia de secuencias de AAV end6genas en una amplia bateria de tejidos humanos, sugiere que las infecciones naturales con este grupo de virus son totalmente comunes. La amplia distribuci6n en el tejido de secuencias virales y la detecci6n frecuente en el higado, bazo e intestino, indican que la transmisi6n ocurre a traves del tracto gastrointestinal y que la viremia puede ser una caracteristica de la infecci6n.
La tremenda diversidad de secuencia presente tanto en humanos como en primates no humanos tiene correlaciones funcionales en terminos de tropismo y serologia, lo que sugiere que esta impulsada por presiones biol6gicas reales tales como escape inmune. 0e manera clara, la recombinaci6n contribuye a esta diversidad como ha evidenciado el segundo clado humano mas comun, que es un hibrido de dos AAVs descritos con anterioridad.
La inspecci6n de la topologia del analisis filogenetico revela percepci6n en la relaci6n entre la evoluci6n del virus y su restricci6n de anfitri6n. El genero completo de dependovirus parece derivarse de AAV aviar consecuente con Lukaschov y Goudsmit [(V.V. Lukashov, J. Goudsmit, J Virol 75, 2729-40 (Marzo de 2001)]. Los aislados de AAV4 y AAV5 divergieron pronto del desarrollo consiguiente de los otros AAVs. El siguiente nodo importante divide las especies en dos grupos monofilicos principales. El primer grupo contiene clones aislados unicamente de humanos e incluye el Clado B, el clon AAV3, el Clado C y el Clado A; la unica excepci6n respecto a la restricci6n de especies de este grupo es el clon simple de chimpances, denominado ch.5. El otro grupo monofilico, que representa el resto de los miembros del genero, se deriva tanto de humanos como de primates no humanos. Este grupo incluye el Clado 0 y el clon rh.8, los cuales fueron aislados exclusivamente de macacos, y el Clado F, que es especifico del ser humano. El clado restante de este grupo (es decir, el Clado E), tiene miembros procedentes tanto de humanos como de un numero de especies de primates no humanos lo que sugiere la transmisi6n de este clado a traves de barreras entre especies. Es interesante que las estructuras de capside de los miembros del Clado E procedentes de algunos humanos sean esencialmente identicas a las procedentes de primates no humanos, lo que indica que ha ocurrido una adaptaci6n de anfitri6n muy pequena. El analisis de la biologia de vectores derivados de AA8 demostr6 una amplia gama de tropismo del tejido con niveles altos de transferencia de gen, lo que es conforme con una gama de infectividad mas promiscua y puede explicar su zoonosis aparente. Una gama y una eficacia de transferencia de gen incluso mas grandes, fueron observadas en cuanto al Clado F, destacando el potencial de transmisi6n de especies cruzadas, lo que hasta la fecha no habia sido detectado.
La presencia de AAVs latentes ampliamente diseminados a traves del ser humano y de primates no humanos, y su aparente predisposici6n a recombinarse y cruzar barreras entre especies, constituyen cuestiones importantes. Esta combinaci6n de eventos tiene el potencial de conducir a la emergencia de nuevos agentes infecciosos con virulencia modificada. La evaluaci6n de este potencial se complica por el hecho de que las secuelas clinicas de estas infecciones de AAVs en primates no han sido aun definidas. Adicionalmente, la alta prevalencia de secuencias de AAV en el higado puede contribuir a la diseminaci6n del virus en la poblaci6n humana en cuanto al establecimiento de trasplante de higado alogenico y xenogenico. Finalmente, el hallazgo de AAVs end6genos en humanos tiene implicaciones en el uso de AAVs para terapia de gen humana. El hecho de que el AAV de tipo natural sea tan prevalente en primates sin haber sido nunca asociado con un tumor maligno, sugiere que no es particularmente oncogenico. 0e hecho, se ha demostrado que la expresi6n de genes rep de AAVs suprime la transformaci6n [P.L. Hermonat, Virologia 172, 253-61 (Septiembre de 1989)]
Ejemplo 4 -Vector de AAVs 2/9 para el tratamiento de enfermedad de las vias respiratorias por fibrosis quistica
Hasta la fecha, la transferencia de gen al pulm6n para el tratamiento de enfermedades de las vias aereas por FQ, ha estado limitada por el pobre rendimiento de vector combinado con las significativas barreras que el epitelio de las vias respiratorias plantea a una trasferencia de gen eficiente. El genoma de AAV2 empaquetado en la capside de AAV9 (AAV2/9) fue comparado con el AAV2/5 en varios sistemas de modelos de vias respiratorias.
Una dosis unica de 50 Il de 1 x 1011 copias de genoma (gc) de AAV2/9 que expresan ya sea el gen de galactosidasa nuclear (nLacZ) objetivado o ya sea el gen de proteina fluorescente verde (GFP) bajo el control transcripcional del promotor de -actina de pollo, fue instilada intranasalmente en el rat6n desnudo y tambien en el C57B1/6. Veintid6s dias despues, el pulm6n y la nariz fueron procesados en cuanto a expresi6n de gen. En animales de control transducidos con AAV2/9-GFP, no se observaron celulas LacZ positivas. El AAV2/9-nLacZ transdujo con exito las vias aereas principalmente, mientras que el AAV2/5-nLacZ transdujo principalmente alveolos y unas pocas vias aereas. A traves del epitelio de las vias aereas nasales, ambos AAV2/5 y AAV2/9 transdujeron celulas epiteliales ciliadas y no ciliadas.
Se estan evaluando en la actualidad los promotores especificos de celulas epiteliales para mejorar la objetivaci6n de las celulas de las vias aereas in vivo. En base a los hallazgos in vivo, la eficacia de transferencia de gen del AAV2/9 en cuanto a celulas epiteliales de las vias aereas humanas ha sido probada a continuaci6n. Las celulas epiteliales de las vias aereas fueron aisladas a partir de la traquea y los bronquios humanos, y cultivadas en interfaz de aireliquido (AL1) sobre soportes de membrana recubierta de colageno. Una vez que las celulas estuvieron polarizadas y diferenciadas, estas fueron transducidas con AAV2/9 o AAV2/5 que expresan GFP desde el lado apical y tambien desde el basolateral. Ambos AAV2/5 y AAV2/9 tuvieron exito en la transducci6n de celulas epiteliales procedentes de la superficie basolateral. Sin embargo, cuando se aplicaron sobre la superficie apical, el AAVs/9 dio como resultado un incremento de 10 veces en el numero de celulas transducidas en comparaci6n con el AAV2/5. Actualmente, se esta evaluando el rendimiento de transferencia de gen del AAV2/9 en los pulmones y en las vias aereas nasales de primates no humanos.
Este experimento demuestra que el AAV2/9 puede transducir eficazmente las vias aereas del pulm6n de rat6n murina y las celulas epiteliales de las vias aereas humanas bien diferenciadas cultivadas en AL1.
Ejemplo 5 - Comparacion de inyeccion directa de AAV1 (2/1) yAAV9 (2/9) en corazones de rata adulta
0os ratas adultas (3 meses de edad) recibieron una unica inyecci6n de 5 x 1011 particulas de AAV2/1 y AAV2/9 en el ventriculo izquierdo.
Los resultados fueron espectaculares, siendo observada una expresi6n significativamente mayor en el coraz6n de la rata adulta con vectores de AAV2/9 en comparaci6n con los AAV2/1, segun fue evaluado mediante histoquimica de lacZ. Los AAV2/9 muestran tambien una transferencia de gen superior en el coraz6n del rat6n neonatal.
Ejemplo 6 - Vector de AAV2/9 para terapia de gen de hemofilia B
En este estudio, los vectores de AAV 2/9 han demostrado ser vectores mas eficaces y menos inmunogenicos para terapia de gen dirigida tanto al higado como al musculo en relaci6n con la hemofilia B que las fuentes de AAV tradicionales.
Para una alternativa dirigida al higado, se realiz6 una evaluaci6n del vector seudotipado de AAV2/9 en modelos hemofilicos de rat6n y de perro. En ratones con hemofilia B inmunocompetente (en el C57BL6 en segundo plano), los niveles super-fisiol6gicos a largo plazo de Factor 1X canino (cF1X, 41-70 Ig/ml) y de tiempo abreviado de tromboplastina parcialmente activada (aPTT) han sido conseguidos a continuaci6n de una siguiente inyecci6n intraportal de 1 x 1011 copias de genoma (GC)/rat6n de vectores de AAV2/7, 2/8 y 2/9 en los que el cF1X esta expresado bajo un promotor especifico del higado y un elemento de respuesta post-transcripcional de hepatitis B de marmota de America (WPRE). Una dosis 10 veces mas baja (1 x 1010 GC/rat6n) de vector de AAV2/8 gener6 un nivel normal de cF1X y de tiempo aPTT. En perros con hemofilia B, en la Universidad de Carolina del Norte (UNC), se habia demostrado anteriormente que la administraci6n de un vector de AAV2/8 en un perro tratado previamente con un vector de AAV2 tuvo exito; la expresi6n de cF1X tuvo un pico a 10 Ig/ml el 6D dia despues de la 2a inyecci6n intraportal (dosis = 5 x 1012 GC/kg), a continuaci6n disminuy6 y se estabiliz6 gradualmente en torno a 700 ng/ml (16% del nivel normal) durante el estudio (1,5 anos). Este nivel fue aproximadamente 3 veces mas alto que el obtenido a partir de un perro con hemofilia B que habia recibido una inyecci6n unica de AAV2-cF1X a una dosis similar. Recientemente, dos perros con hemofilia B nativa fueron inyectados con vectores de AAV2/8 intraportalmente a una dosis de 5,25 x 1012 GC/kg. Los niveles de cF1X en uno de los perros (macho) alcanzaron el 30% del nivel normal (1,5 Ig/ml) diez semanas despues de la inyecci6n y se mantuvo en 1,3-1,5 Ig/ml, mientras que el segundo perro (hembra) mantuvo la expresi6n de cF1X a aproximadamente un 10% del nivel normal. El tiempo global de coagulaci6n sanguinea y el aPTT fueron ambos acortados despues de la inyecci6n, lo que sugiere que el antigeno era biol6gicamente activo. Las enzimas del higado (aspartato amino transferasa (SC0T), alanina amino transferasa (SGPT)) en ambos perros se mantuvieron dentro de la gama normal tras la cirugia. Estos AAVs fueron evaluados tambien en cuanto a terapia de gen objetivada en el musculo respecto a la hemofilia B. El AAV-CMV-cF1X-WPRFE [un AAV portador de cF1X bajo el control de un promotor de CMV y que contiene el WPRE], empaquetado con seis fuentes diferentes de AAV, fue comparado en ratones con hemofilia B inmunocompetente (en C57BL/6 en segundo plano) tras una inyecci6n intramuscular a una dosis de 1 x 1011 GC/rat6n. Se monitoriz6 la expresi6n de gen de cF1X y la formaci6n de anticuerpos. Se detect6 expresi6n mas alta en el plasma de ratones inyectados con vectores de AAV2/8 (1460 + 392 ng/ml en el dia 42), seguido de AAV2/9 (773 + 171 ng/ml en el dia 42) y AAV2/7 (500 + 311 ng/ml en el dia 42). Los niveles se mantuvieron durante 5 meses. Sorprendentemente, la expresi6n de cF1X mediante AAV2/1 se mantuvo en la gama de 0-253 ng/ml (promedio: 66+82 ng/ml). Se detect6 inhibidor de anti-cF1X ((1gG) en algunos ratones inyectados con AAV2/1. Los niveles de expresi6n de cF1X en esos ratones estuvieron bien correlacionados con los niveles del inhibidor. Se realiz6 una investigaci6n adicional de formaci6n de inhibidor sobre 28 muestras diarias para todos los AAVs. Los ratones con hemofilia B mostraron formaci6n mas alta de inhibidor frente a AAV2/2, seguido del AAV2/5 y el AAV2/1. Solamente inhibidores esporadicos y a bajo nivel fueron detectados en animales inyectados con AAV2/7, AAV2/8 y AAV2/9. Asi, las ventajas de los nuevos serotipos 2/9 de AAV para terapia de gen dirigida al musculo para la hemofilia B demostraron ser vectores mas eficientes y seguros sin suscitar ninguna formaci6n significativa de anticuerpos anti-F1X.
Ejemplo 7 - Vectores de Rh.43
A. Comparaci6n de vector de expresi6n de AlAT basado en AAVrh.43 con AAVB y AAV9 en cuanto a transferencia de gen dirigida al higado de rat6n
El AAVrh.43, que pertenece al Clado E, fue comparado mediante vector de analisis filogenetico con el AAV8 y el nuevo AAV9 en cuanto a niveles de hA1AT tras la infusi6n intraportal en el higado del rat6n. Mas en particular, los vectores seudotipados de AAVrh.43, AAV2/8 y AAV2/9 fueron comparados en cuanto a transferencia de gen dirigida al higado de rat6n. Los vectores seudotipados, en dosis de 1 x 1011 GC, 3 x 1010 y 1 x 1010 GC por animal, fueron administrados a ratones C57BL/6 de 4-6 semanas de edad, intramuscularmente. Se recogieron muestras de suero de los animales en el dia 28 posterior a la infusi6n del vector durante el ensayo de alfa 1 anti-tripsina humana (hA1AT).
Los datos indicaron que el vector de AAVrh.43 tuvo de hecho un rendimiento similar al del AAV9 en el modelo de rat6n.
B. Transferencia de gen LacZ de objetivo nuclear al higado y al musculo del rat6n mediado por vectores de AAVs seudotipados
Los vectores basados en AAV9 y AAVrh.43 fueron comparados con el vector basado en AAV1 y AAV2. Los vectores fueron inyectados a una dosis de 1 x 1011 GC por rat6n, tanto intrapolarmente con el higado como objetivo, como intramuscularmente en el musculo tibial derecho de ratones C57BL/6. Los animales fueron sacrificados en el dia 28 posterior a la transferencia de gen y los tejidos de interes fueron cultivados mediante coloraci6n histoquimica X-gal.
El vector de AAVrh.43 demostr6 una eficacia de transferencia de gen que fue cercana a la del AAV9 pero al menos 5 veces mas alta que la del AAV1. La idoneidad del AAVrh.43 fue analizada ademas tanto en el higado como en el musculo usando el gen LacZ objetivado nuclear como informador para visualizar la extensi6n de transferencia de gen histoquimicamente.
C. Comparaci6n del vector de expresi6nde A1ATbasado en AAVrh.43 conel AAV5 en transferencia degen dirigida al pulm6n del rat6n
El vector basado en rh.43 demostr6 tambien una potencia superior de transferencia de gen en el tejido del pulm6n. Se administraron diferentes dosis (1 x 1010, 3 x 1010 y 1 x 1011 GC por animal) de vectores seudotipados a pulmones de rat6n C57BL/6 de 4-6 semanas de edad, intratraquealmente. Se recogieron muestras de suero de los animales en diferentes momentos de tiempo para el ensayo de hA1AT.
El vector fue comparado con el AAV5 a diferentes dosis para niveles de hA1AT detectados sistematicamente tras la instilaci6n intratraqueal en el pulm6n del rat6n. Los datos indicaron que este nuevo vector era al menos 100 veces mas eficiente que el AAV5 en el modelo de rat6n.
Ejemplo 8 -Vectores basados en AAV humano en modelos de raton para transferencia de gen dirigida al 5 higado y al pulmon
Los clones humanos AAVhu.37, AAVhu.41 y AAVhu.47 fueron seudotipados y examinados en cuanto a potencia de transferencia de gen en tejidos de rat6n. Los vectores AAVCBA1AT seudotipados con capsides de hu.37, hu.41 y hu.47 fueron preparados usando los metodos descritos en la presente memoria, y administrados a un rat6n C56BL/6 de 4-6 semanas mediante inyecciones intraportal e intratraqueal. Se recogieron muestras de suero de los animales
10 en el dia 14D posterior a la inyecci6n de vector para el ensayo de hA1AT, el cual fue realizado de acuerdo con tecnicas publicadas. El AAVhu.47 pertenece a la familia del AAV2 (clado B) y fue aislado a partir de una muestra de medula 6sea humana. El AAVhu.3 y el AAVhu.41 proceden de tejido testicular humano y de una muestra de medula 6sea humana, respectivamente. Filogeneticamente, estos estan dentro del clado del AAV8 (clado E).
El analisis de A1AT del suero de los animales inyectados indic6 que el AAV hu.41 y el AAV hu.47 se comportaron
15 pobremente en los tres tejidos probados. Sin embargo, la potencia de transferencia de gen del vector derivado de AAVhu.37 fue similar al del AAV8 en el higado y del AAV9 en el pulm6n.
Aunque la invenci6n ha sido descrita con referencia a una realizaci6n particular de la misma, se apreciara que se pueden realizar modificaciones, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Listado de secuencias
<110> Los fideicomisarios de la universidad Wilson de Pennsylvania, James, M. Gao, Guangpin Alvira, Mauricio R.
5 Vanderberghe, Luk H.
<120> Clados de virus adeno-asociados (AAVs), secuencias, vectores que los contienen y sus usos consiguientes
<130> UPN-P3230PCT
<150> US 60/508.226
<151>
<160> 236
<170> Patentin versi6n 3.3
<210> 1
<211> 2211 20 <212> A0N
<213> virus adeno-asociado, clon hu.31
<400> 1
<210> 2
<211> 2211
<212> A0N
<213> Nuevo serotipo de AAV, clon hu.32
<400> 2 <210> 3
<211> 2211
<212> A0N
<213> virus adeno-asociado, clon humano 9
<400> 3
<210> 4
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.17
<400> 4 <210> 5
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.6
<400> 5 <210> 6
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.41
<400> 6 <210> 7
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.38
<400> 7
<210> 8
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.42
<400> 8 <210> 9
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.72
<400> 9
<210> 10
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.37
<400> 10
<210> 11
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.40
<400> 11
<210> 12
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.38
<400> 12
<210> 13
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.39
<400> 13 <210> 14
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.40
<400> 14 <210> 15
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.64
<400> 15
<210> 16
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.68
<400> 16
<210> 17
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.53
<400> 17
<210> 18
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.52
<400> 18
<210> 19
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.46
<400> 19
<210> 20
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.70
<400> 20
<210> 21
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.61
<400> 21
<210> 22
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.51
<400> 22 <210> 23
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.50
<400> 23 <210> 24
<211> 2217
<212> A0N
<213> nuevo serotipo de AAV, clon hu.39
<400> 24

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1.- Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una capside de AAV de serotipo 9, en el que la capside de AAV9 es al menos un 95% identica a la secuencia de aminoacidos 203 a 736 de SEQ 10 Num. 123, y en el que el AAV comprende ademas un minigen que tiene repeticiones terminales de AAV invertidas y un gen heter6logo enlazado operativamente a secuencias regulatorias que dirigen su expresi6n en una celula anfitri6n.
  2. 2.- Un AAV de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que dicha capside esta codificada por la secuencia de acido nucleico de SEQ 10 Num. 3
  3. 3.- Un virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que la capside de AAV tiene una secuencia de aminoacido que comprende los aminoacidos 138 a 736 de SEQ 10 Num. 123.
  4. 4.- Un virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que la capside de AAV tiene una secuencia de aminoacido que comprende los aminoacidos 1 a 736 de SEQ 10 Num. 123.
  5. 5.- Un virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que la capside de AAV tiene una secuencia de aminoacido que comprende los aminoacidos 203 a 736 de SEQ 10 Num. 123.
  6. 6.- Un virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que la capside de AAV tiene una secuencia de aminoacido que es al menos un 97% identica a 1 a 736 de SEQ 10 Num. 123.
  7. 7.- Una proteina de capside aislada que comprende un virus adeno-asociado de proteina de capside de serotipo 9 (AAV9) seleccionada en el grupo consistente en:
    proteina de capside vp1, aminoacidos (aa) 1 a 736, SEQ 10 Num. 123; proteina de capside vp2, aa 138 a 736, SEQ 10 Num. 123; y, proteina de capside vp3, aa 203 a 736, SEQ 10 Num. 123.
  8. 8.- Un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una proteina de capside conforme a la reivindicaci6n 7.
  9. 9.- Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina conforme a la reivindicaci6n 7.
  10. 10.- Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 9, en la que dicha secuencia de acido nucleico se selecciona en el grupo consistente en:
    nt 1 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 [vp1];
    nt 411 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 [vp2], y
    nt 609 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 [vp3].
  11. 11.- Una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, que comprende ademas una secuencia de AAV que codifica una proteina rep funcional de AAV.
  12. 12.- Una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha molecula es un plasmido.
  13. 13.- Un metodo de generaci6n de un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una capside de AAV, que comprende las etapas de cultivar una celula anfitri6n que contiene:
    (a) una molecula que codifica una proteina de capside de AAV; (b) un gen rep funcional; (c) un minigen que comprende repeticiones terminales invertidas (1TRs) de AAV y un transgen; y, (d) funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigen en la proteina de capside de AAV, en el que dicha celula anfitri6n comprende una molecula de acido nucleico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
  14. 14.- Una celula anfitri6n transfectada in vitro con un virus adeno-asociado conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  15. 15.- Una celula anfitri6n in vitro transfectada con una molecula de acido nucleico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
  16. 16.- Una composici6n que comprende un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un portador fisiol6gicamente compatible.
  17. 17.- Una composici6n que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y un portador fisiol6gicamente compatible.
  18. 18.- Uso de un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparaci6n de un medicamento para el suministro de una molecula a una celula.
  19. 19.- Un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el suministro de una molecula a una celula.
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