ES2469874T3 - Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y polinucle�tidos que los codifican - Google Patents

Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y polinucle�tidos que los codifican Download PDF

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Abstract

Polipéptido aislado con actividad de mejora celulolítica, y con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de la forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferiblemente al menos 97% de identidad con los aminoácidos 20 a 258 de la SEC ID nº: 6.

Description

Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y polinucle6lidos que los codifican
5 Declaración sobre los derechos de Invenciones realizadas por medio de investigación y desarrollo patrocinados federalmente [0001] Esta invención se realizó con el apoyo del Gobierno bajo el Subcontrato NREL No. ZCO-30017-02, Contrato
principal DE-AD36-98G010337, adjudicado por el Departamento de Energía. El gobierno tiene ciertos derechos sobre 10 esta invención. Antecedentes de la invención Campo de la invención
15 [0002] La presente invención se refiere a polip�ptidos aislados con actividad de mejora celulol�tica y polinucle�tidos aislados que codifican los polip�ptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los polinucle�tidos al igual que métodos para producir y usar los polip�ptidos.
20 Descripción de las técnicas relacionadas
[0003] La celulosa es un pol�mero de la glucosa de azúcar simple unida de manera covalente por beta-1,4-enlaces. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos beta-unidos. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polimero de celulosa en
25 lugares aleatorios, abriéndolo para atacar con celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de los extremos del pol�mero de celulosa. La celobiosa es un d�mero de glucosa hidrosoluble beta-1,4-unido. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.
[0004] La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de
30 cantidades grandes de materia prima, la conveniencia de evitar quema o vertido de los materiales y la limpieza del combustible de etanol. Madera, residuos agrícolas, brotes herbáceos y desperdicios sólidos municipales se han considerado como materias primas para producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez la celulosa se convierte en glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en etanol.
[0005] Sería ventajoso en la técnica mejorar la conversión de materias primas celulósicas.
[0006] Es un objeto de la presente invención proporcionar polip�ptidos aislados con actividad de mejora celulolitica y secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polip�ptidos para mejorar la conversión de materias primas 40 celulósicas.
Resumen de la invención
[0007] La presente invención se refiere a polip�ptidos aislados con actividad de mejora celulol�lica y con una secuencia 45 de amino�cidos que tiene al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, de la forma más preferible al menos 95%, e incluso más preferiblemente al menos 97% de identidad con los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6
[0008] La presente invención también se refiere a polinucle�tidos aislados que codifican un polip�ptido según la reivindicación 1 con actividad celul�tica mejorada.
50 [0009] La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células huésped recombinantes comprendiendo los polinucle�tidos.
[0010] La presente invención también se refiere a métodos para producir tal polip�ptido con actividad de mejora
55 celulolitica comprendiendo (a) cultivo de una célula huésped recombinante comprendiendo una construcción de ácidos nucleicos comprendiendo un polinucle�tido que codifica el polip�ptido bajo condiciones propicias para la producción del polip�ptido; y (b) recuperación del polip�ptido.
[001 1] La presente invención también se refiere a métodos para degradar o convertir un material celul6sico, que
60 comprende: tratar el material celulósico con una cantidad efectiva de proteína celulol�tica en presencia de una cantidad efectiva de un polip�ptico con actividad de mejora celulolitica, donde la presencia del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica aumenta la degradación de material celul6sico
[0012] La presente invención se refiere además a métodos para producir una sustancia orgánica, que comprende:
(a)
sacarificar un material celulósico con una cantidad efectiva de proteína celulol�lica en presencia de una cantidad efectiva de un polip�ptido con actividad de mejora celulolitica, donde la presencia del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica aumenta la degradación del material celulósico en comparación con la ausencia del polip�plido con actividad de mejora celulol�lica
(b)
fermentar el material celulósico sacarificado de la fase (a) con uno o más microorganismos que fermentan; y
(c)
recuperar la sustancia org�n ica de la fermentación
Breve descripción de las figuras
[0013]
Las figuras 1A y 1 B muestran la secuencia de ADN gen�mico y la secuencia de amino�cidos deducida de una polip�ptido de Thielavia te"estris NRRL 8126 GH61B con actividad de mejora celulolilica (SEC ID nO: 1 y 2, respectivamente). Intrones predichos est�n en cursiva. El p�ptido señal predicho est� subrayado. La figura 2 muestra la secuencia de ADN gen�mico y la secuencia de amino�cidos deducida de un polip�ptido de Thielavia lerreslris NRRL 8126 GH61C con actividad de mejora celulol�tica (SEC ID nO: 3 y 4, respectivamente). Intrones predichos est�n en cursiva. El p�ptido señal predicho est� subrayado. La figura 3 muestra la secuencia de ADN gen�mico y la secuencia de amino�cidos deducida de un polip�ptido de Thiela via lerreslris NRRL 8126 GH61 D con actividad de mejora celulol�tica (SEC ID nO: 5 y 6, respectivamente). lntrones predichos est�n en cursiva. El p�ptido señal predicho est� subrayado. La figura 4 muestra la secuencia de ADNc y la secuencia de amino�cidos deducida de un polip�ptido de Thielav�a terrestris NRRL 8126 GH61 E con actividad de mejora celulol�tica (SEC ID nO: 7 y 8, respectivamente). El p�ptido señal predicho est� subrayado. La figura 5 muestra la secuencia de ADNc y la secuencia de amino�cidos deducida de un polip�ptido Th�elavia ferresfris NRRL 8126 GH61 G con actividad de mejora celulol�tica (SEC ID nO: 9 y 10, respectivamente). El p�ptido señal predicho est� subrayado. La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pAILo1. La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pBANe10. La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pAILo2. La Figura 9 muestra un mapa de restricción de pPH27. La Figura 10 muestra un mapa de restricción de pPH29. La Figura 11 muestra un mapa de restricción de pPH28. La Figura 12 muestra un mapa de restricción de pEJG120. La Figura 13 muestra un mapa de restricción de pEJG111. La Figura 14 muestra un mapa de restricción de pEJG112. La Figura 15 muestra un mapa de restricción de pTter61C. La Figura 16 muestra un mapa de restricción de pTter61D. La Figura 17 muestra un mapa de restricción de pTter61E. La Figura 18 muestra un mapa de restricción de pTter61G. La Figura 19 muestra un mapa de restricción de pEJG108. La Figura 20 muestra un mapa de restricción de pAIL024. La Figura 21 muestra un mapa de restricción de pAIL028. La Figura 22 muestra un mapa de restricción de pMJ04. La Figura 23 muestra un mapa de restricción de pMJ06. La Figura 24 muestra un mapa de restricción de pMJ09. La Figura 25 muestra un mapa de restricción de pEmY10. La Figura 26 muestra un mapa de restricción de pSMA1155. La Figura 27 muestra un mapa de restricción de pEJG110. La Figura 28 muestra un mapa de restricción de pEJG114. La Figura 29 muestra un mapa de restricción de pCW076. La Figura 30 muestra un mapa de restricción de pCW078. La Figura 31 muestra un mapa de restricción de pEJG97. Las Figuras 32A e 32B muestran la secuencia de ADN gen�mico y la secuencia de amino�cidos deducida de una beta glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID nO: 75 y 76, respectivamente). El p�ptido señal predicho est� subrayado e intrones predichos est�n en cursiva. La Figura 33 muestra un mapa de restricción de pEJG107. La Figura 34 muestra el efecto de un polip�ptido Th�elavia le"estris GH61 B con actividad de mejora celulol�tica (1 mgJg PCS) en la hidrólisis de PCS (1% p/v) por caldo de fermentación de Trichoderma reese� que expresa actividad celulol�tica y una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (5 mg/g PCS) a 50-60�C. La Figura 35 muestra el efecto de un polip�ptido de Thiela via te"estris GH61B con actividad de mejora celulol�tica (1 mg/g PCS) en la hidrólisis de PCS (1% plv) por caldo de fermentación de Trichoderma raese� que expresa actividad celulol�tica de caldo de fermentación y una beta-glucosidasa Aspergillus fumigatus (5 mg/g peS) a 50�C. La Figura 36 muestra conversión de celulosa por TrfAoBG sola o Tr/AoBG complementada con polip�ptidos de Thielav�a terrestris GH61 con actividad celulolilica a 50"C, pH 5,0 durante 115 horas.
Definiciones
[0014] El término "actividad de mejora celulolitica" se define aqul como una actividad biológica que aumenta la hidrólisis de un material celulósico por proteínas con actividad celulol�tica. Para fines de la presente invención, actividad de mejora celulol�tica se determina por medición del aumento en azúcares reductores de la hidrólisis de un material celulósico por protelna celulol�tica bajo las siguientes condiciones: 5,0 mg de proteína celulol�tica/g de celulosa en PCS durante 5-7 días a 50"C en presencia y ausencia de 0,01-2,5 mg de actividad de mejora celulolitica por g de celulosa en PCS en comparación con una hidrólisis de control con carga igual de proteína total sin actividad de mejora celulol�tica (5,01-7,5 mg de proteína celulol�tica/g de celulosa en peS). En un aspecto preferido, una mezcla de muestra de Celluclast� 1,5L (Novozymes AJS, Bagsvaard, Dinamarca) en presencia de 3% de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae según la WQ 02/095014) o 3% de beta-glucosidasa de Aspergi/lus fum�gatus (producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae según el ejemplo 22) de carga de proteína de celulasa se usa como la fuente de la actividad celulol�tica.
[0015] El término "actividad celulol�tica" se define aqul como una actividad biológica que hidroliza un material celulósico. Para fines de la presente invención, actividad celulol�tica se determina por medición del aumento en la hidrólisis de un material celulósico por una mezcla celulol�tica bajo las siguientes condiciones: 1-10 mg de proteína celulol�ticalg de celulosa en PGS durante 5-7 días a 50"C en comparación con una hidrólisis de control sin adición de proteína celulolitica. En un aspecto preferido, una mezcla de muestra de Gelluclast� 1,5L (Novozymes AJS, Bagsvrerd, Dinamarca) en presencia de 3% de beta-glucosidasa de Asperg�llus oryzae (producida de manera recombinante en Asperg�llus oryzae según la WQ 02/095014) o 3% de beta glucosidasa de Asperg�llus fum�gatus (producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae según el ejemplo 22) de carga de proteína de celulasa como la fuente de la actividad celulol�tica.
[0016] El término "PCS" o "Restos de maíz pretratados" se define aquí como un material celulósico derivado de restos de maíz por tratamiento con calor y ácido diluido. Para fines de la presente invención, pes se hace por el método descrito en el ejemplo 24, o variaciones en tiempo, temperatura y cantidad de ácido.
[0017] El término "gluc�sido hidrolasa de la familia 61" o "familia GH61" se define aquí como un polip�ptido que entra en la familia 61 de hidrolasa gluc�sida según Henrissat B., 1991, A class�ficat�on of glycosyl hydrolases basad on am�noacid sequence similarit�es, Biochem. J. 280: 309-316 y Henrissat B., y Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Actualmente, Henrissat enumera la familia GH61 como sin clasificar indicando que propiedades tales como mecanismo, nucle�filo catalítico/base, donantes de protón catalíticos y estructura 3-D no se conocen para polip�ptidos de esta familia.
[0018] El material celul6sico puede ser cualquier material con celulosa. La celulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en los tallos, hojas, vainas, cáscaras y mazorcas de plantas o hojas, derivaciones y madera de árboles. El material celulósico puede también ser, pero no est� limitado a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos de silvicultura, desperdicios sólidos municipales, papel usado y pulpa y residuos de fábrica de papel. Se entiende aquí que la celulosa puede estar en forma de lignocelulosa, un material de pared celular vegetal con lignina, celulosa y hemicelulosa en una matriz mezclada.
[0019] En una forma de realización preferida, el material celulósico es restos de malz. En otra forma de realización preferida, el material celulósico es fibra de maíz. En otra forma de realización preferida, el material celulósico es paja de arroz. En otra forma de realización preferida, el material celulósico es residuos de tratamiento de papel y de pulpa. En otra forma de realización preferida, el material celulósico es plantas boscosas y herbáceas. En otra forma de realización preferida, el material celul6sico es bagazo.
[0020] El material celul6sico se puede utilizar como es o se puede someter a pretratamiento, usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, técnicas de pretratamiento físicas puede incluir varios tipos de fresado, irradiación, explosión por vapor e hidroterm6lisis; técnicas de pretratamiento químicas pueden incluir ácido diluido, solvente alcalino orgánico, amoníaco, di�xido de azufre, di�xido de carbono y hidroterm61isis con pH controlado; y técnicas de pretratamiento biológicas pueden implicar aplicación de microorganismos de solubilizaci�n de lignina (ver, por ejemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of b�omass, en Handbook on B�oethanol: Production and Ut�lization, Wyman,
C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, OC, 179-212 ; Ghosh, P., and Singh, A., 1993, Physicochemical and biological Irealmenls for enzymal�c/m�crob�al convers�an of lignocellulos�c b�omass, Adv. Appl. M�crob�ol. 39: 295-333; McMillan, J.
D., 1994, Pretreating lignoce/lulos�c b�omass: a rev�ew, �n Enzymatic Convers�on of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E. , Baker, J. O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, OC, chapter 15; Gong, C. S. , Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L., and Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentalion of lignocellulosic hydrolysales forethanol product�on, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; y Vallander, L., and Eriksson, K.-E. L., 1990, Product�on of ethanol from lignocellulosic materia/s: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechno/. 42: 63-95).
[0021] Los polip�ptidos de la presente invención tienen al menos 20%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferida al menos 95%, e
incluso de forma más preferida al menos 100% de la actividad de mejora celulol�lica del polip�ptido que consiste en la secuencia de amino�cidos mostrada como los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6.
[0022] Polip�ptido aislado: el término "polip�ptido aislado" como se usa aquí se refiere a un polip�ptido que es al menos 20% puro, preferiblemente al menos 40% puro, más preferiblemente al menos 60% puro, incluso más preferiblemente al menos 80% puro, de forma más preferida al menos 90% puro, e incluso de forma más preferida al menos 95% puro, como determinado por SDS-PAGE.
[0023] Polip�ptido substancialmente puro: el término "polip�ptido substancialmente puro" denota aquí una preparación de polip�ptido que contiene como mucho 10%, preferiblemente como mucho 8%, más preferiblemente como mucho 6%, más preferiblemente como mucho 5%, más preferiblemente como mucho 4%, más preferiblemente como mucho 3%, incluso más preferiblemente como mucho 2%, de forma más preferida como mucho 1%, e incluso de forma más preferida como mucho 0,5% en peso de otro material de polip�ptido con el cual se asocia originalmente. Se prefiere, por lo tanto, que el polip�ptido substancialmente puro sea al menos 92% puro, preferiblemente al menos 94% puro, más preferiblemente al menos 95% puro, más preferiblemente al menos 96% puro, más preferiblemente al menos 96% puro, más preferiblemente al menos 97% puro, más preferiblemente al menos 98%, puro incluso más preferiblemente al menos 99%, de forma más preferida al menos 99,5% puro, e incluso de forma más preferida 100% puro en peso del material de polip�ptido total presente en la preparación.
[0024] Los polip�ptidos de la presente invención est�n preferiblemente en una forma substancialmente pura. En particular, se prefiere que los polip�ptidos est�n en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polip�ptido est� esencialmente libre de otro material de polip�ptido con el cual se asocia originalmente. Esto se puede lograr, por ejemplo, preparando el polip�ptido mediante métodos recombinantes o por métodos de purificación tradicionales bien conocidos.
[0025] Aqul, el término "polip�ptido substancialmente puro" es sinónimo de los términos "polip�ptido aislado" y "polip�ptido en forma aislada".
[0026] Identidad: la relación entre dos secuencias de amino�cidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el par� metro "identidad".
[0027] Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de amino�cidos se puede determinar por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando el software LASERGENE'"" MEGAlIGN'"" (ONASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiples: penalizaci�n de espacio de 10 y penalizaci�n de longitud del espacio de 10. Parámetros de alineamiento por parejas son Ktuple=1, penalizaci�n de espacio=3, ventanas=5 y diagonales=5. El grado de identidad entre dos secuencias de amino�cidos pueden ser también determinado por el algoritmo de Smith-Waterman (Waterman et al., 1976, Adv. Math. 20: 367) con una penalizaci�n abierta de espacio de 11 , una penalizaci�n de extensión del espacio de 1 y la matriz BLOSUM62.
[0028] Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de nucle6tidos se determina por el método Wilbur-lipman (Wilbur and lipman, 1983, Proceedings ofthe National Academy of Science USA 80: 726-730) usando el software LASERGENE'"" MEGAlIGN'"" (ONASTAR, lnc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiples: penalizaci�n de espacio de 10 y penalizaci�n de longitud del espacio de 10. Parámetros de alineamiento por parejas son Ktuple=3, penalizaci�n de espacio=3 y ventanas=20.
[0029] Fragmento de polip�ptido: el término "fragmento de polip�ptido" se define aqul como un polip�ptido con uno o más amino�cidos eliminados del amino y/o carboxi terminal de los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6 o una secuencia homóloga de esta, donde el fragmento tiene actividad de mejora celulol�tica. Preferiblemente, un fragmento de los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6 contiene al menos 200 residuos de amino�cidos, más preferiblemente al menos 212 residuos de amino�cidos y de forma más preferida al menos 224 residuos de amino�cidos.
[0030] Subsecuencia: el término "subsecuencia" se define aquí como una secuencia de nucle6tidos con uno o más nucleótidos eliminados del final 5' y{o 3' de los nucleótidos 126 a 978 de la SEC ID nO 5; o una secuencia homóloga de la misma, donde la sub secuencia codifica un fragmento de polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica. Preferiblemente una subsecuencia de nucleótidos 126 a 978 de la SEC ID nO 5 contiene al menos 600 nucleótidos, más preferiblemente al menos 636 nucleótidos y de la forma más preferida al menos 672 nucleótidos.
[0031] Variante al�tica: el término "variante al�lica" denota aquí cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromos�mico. La variación al�lica surge naturalmente a través de mutación y puede suponer polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polip�ptido codificado) o pueden codificar polip�ptidos con secuencias de amino�cidos alteradas. Una variante al�lica de un polip�ptido es un polip�ptido codificado por una variante al�lica de un gen.
[0032] Polinucle�tido aislado: el término "polinucle�tido aislado" como se usa aqul se refiere a un polinucle�tido que es al menos 20% puro, preferiblemente al menos 40% puro, más preferiblemente al menos 60% puro, induso más
preferiblemente al menos 80% puro, de forma más preferida al menos 90% puro, e incluso de forma más preferida al menos 95% puro, como determinado por electroforesis de agarosa.
[0033] Polinucle�tido substancialmente puro: el término ~pol inucle6tido substancialmente puro" como se usa aqui se refiere a una preparación polinucle6tida libre de otros nucleótidos indeseados o extrat'ios y en una forma adecuada para uso dentro de sistemas de producción de proteina creada genéticamente. Asl, un polinucle�tido substancialmente puro contiene como mucho 10%, preferiblemente como mucho 8%, más preferiblemente como mucho 6%, más preferiblemente como mucho 5%, más preferiblemente como mucho 4%, más preferiblemente como mucho 3%, incluso más preferiblemente como mucho 2%, de forma más preferida como mucho 1%, e incluso de forma más preferida como mucho 0,5% en peso de otro material polinucle�tido con el cual se asocia originalmente. Un polinucle�tido substancialmente puro puede, no obstante, incluir 5' y 3' regiones no codificantes de origen natural, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucle�tido substancialmente puro sea al menos 90% puro, preferiblemente al menos 92% puro, más preferiblemente al menos 94% puro, más preferiblemente al menos 95% puro, más preferiblemente al menos 96% puro, más preferiblemente al menos 97% puro, incluso más preferiblemente al menos 98% puro, de forma más preferida al menos 99%, e incluso de forma más preferida al menos 99,5% puro en peso. Los polinucle�tidos de la presente invención est�n preferiblemente en una forma substancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucle�tidos descritos aqui est�n en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación polinucle�tida est� esencialmente libre de otro material polinucle�tido con el cual se asocia originalmente. Aquí, el término "polinucle�tido substancialmente puro" es sinónimo de los términos "polinucle�lido aislado" y "polinucle�tido en forma aislada". Los polinucle�tidos pueden ser de origen gen�mico, ADNc, ARN, semisint�tico, sintético, o cualquier combinaciones de estos.
[0034] ADNc: el término "ADNc" se define aqul como una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa de una molécula de ARNm maduro dividido obtenido de una célula eucariota. AONc carece de secuencias de intrones que est�n presentes normalmente en el AON gen�mico correspondiente. La transcripción inicial de ARN primario es un precursor para ARNm que se procesa a través de una serie de pasos antes de aparecer como ARNm maduro dividido. Estos pasos incluyen la eliminación de secuencias de intrones por un proceso llamado empalme. ADNc derivado de ARNm carece, por lo tanto, de cualquier secuencia de intrones.
[0035] Construcción de ácidos nucleicos: el término "construcción de ácidos nucleicos" como se utiliza en este caso se refiere a una molécula de ácido nucleico, mono o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otra forma no existirian en la naturaleza. El término construcción de ácidos nucleicos es sinónimo del término "casete de expresión" cuando la construcción de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.
[0036] Secuencia de control: el término "secuencias de control" se define aqui para incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de nucleótidos que codifica el polip�ptido o extranjero o nativo entre sr. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, una guia, secuencia de poliadenilaci�n, secuencia de prop�ptido, promotor, secuencia de p�ptido set'ial y terminador de transcripción. A un minimo, las secuencias de control incluyen un promotor y set'iales de parada traduccionales y transcripcionales. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores con el propósito de introducir sitios de restricción que facilitan ligamiento de las secuencias de control con la reg i�n de codificación de la secuencia de nucle6tidos que codifica un polip�ptido.
[0037] Operativa mente unido: el término "operativamente unido" denota aqul una configuración en que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada en relación a la secuencia de codificación de la secuencia polinucle�tida tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polip�ptido.
[0038] Secuencia codificante: cuando se usa aquí el término "secuencia codificante" significa una secuencia de nucleótidos que especifica directamente la secuencia de amino�cidos de su producto proteinico. Los bordes de la secuencia codificante son generalmente determinados por un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con el cod�n de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como ITG y GTG Y extremos con un cod�n de terminación tal como TAA, TAG Y TGA. La secuencia codificante puede ser un AON, ADNc, o secuencia de nucleótidos recombinante.
[0039] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de un polip�ptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
[0040] Vector de expresión: el término "vector de expresión" se define aquí como una molécula ADN circular o lineal que comprende un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de la invención y que se une operativa mente a nucleótidos adicionales que proporcionan su expresión.
[0041] Célula huésped: el término "célula huésped", como se utiliza en este caso, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible a transformación, transfecci�n, transducci�n y similares con una construcción de ácidos nucleicos o vector de expresión comprendiendo un polinucle�tido de la presente invención.
5 [0042] Modificación: et término "modificación" significa aqui cualquier modificación qulmica det polip�ptido que comprende o que consiste en los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6 o una secuencia homóloga de esta, al iguat que manipulación genética del ADN que codifica este polip�ptido. La modificación puede ser sustituciones, deleciones yfo inserciones de uno o más amino�cidos al igual que reemplazos de una o más cadenas laterales de amino�cidos.
10 [0043] Variante artificial: cuando se usa aqul, el término �variante artificial" significa un polip�ptido con actividad de mejora celulolitica producido por un organismo que expresa una secuencia de nucleótidos modificada de la SEC ID nO: 5
o una secuencia homóloga de esta, o la región de codificación madura de esta. La secuencia de nucleótidos modificada se obtiene a través de intervención humana por mod ificaci�n de la secuencia de nucleótidos descrita en la SEC ID nO: 5
o una secuencia homóloga de esta, o la región de codificación madura de esta.
15 Descripción detallada de la invención
Polip�ptidos con actividad de mejora celulolitica [0044] En un aspecto, la presente invención se refiere a polip�ptidos aislados con actividad de mejora celulolilica, 20 comprendiendo los siguientes motivos:
[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ[-X(4)-[HNQ[ y [FW]-[TF]-K-[AIV],
donde X es cualquier amono�cido, X(4,5) es cualquier amino�cido en 4 o 5 posiciones contiguas, y X(4) es cualquier 25 amino�cido en 4 posiciones contiguas.
[0045] El polip�ptido aislado que comprende los motivos mencionados arriba, puede comprender además:
H-X(1,2]-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],
30 [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FIL V]-X-[IL V], o
H-X{1 ,2)-G-P-X( 3 )-[YW]-[ AILMV] Y IEQ]-X-y -X(2)-C-X-[EHQN]-[FI L V)-X-[I LV],
donde X es cualquier amino�cido, X(1 ,2) es cualquier amino�cido en la posición 1 o 2 posiciones contiguas, X(3) es cualquier amino�cido en 3 posiciones contiguas, y X(2) es cualquier amino�cido en 2 posiciones contiguas. En los 35 motivos anteriores se emplea la abreviatura de amino�cido empleada de una sola letra IUPAC.
[0046] En una forma de realización preferida el polip�ptido aislado con actividad de mejora celulolitica comprende además H-X{1,2)-G-P-X{3)-IYW]-[AILMV). En otra forma de realización preferida el polip�ptido aislado con actividad de mejora celulolitica comprende además [EO]-X-Y-X(2)-C-X-(EHON]-(FILV]-X-[ILV). En otra forma de realización preferida
40 el polip�ptido aislado con actividad de mejora celulolitica comprende además H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] y [EO]X-Y -X(2)-C-X-lE HON]-IFI L VJ-X-[ ILV).
[0047] La presente invención se refiere a polip�ptidos aislados con una secuencia de amino�cidos que tiene un grado de identidad a los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6 (es decir, el polip�ptido maduro) de al menos 85%, más 45 preferiblemente al menos 90%, de la forma más preferida al menos 95%, e incluso de la forma más preferida al menos 97%, 98%, o 99%, que tienen actividad de mejora celulolitica (de ahora en adelante "polip�ptidos homólogos"). En un aspecto preferido, los polip�ptidos homólogos tienen una secuencia de amino�cidos que difiere por diez amino�cidos, preferiblemente por cinco amino�cidos, más preferiblemente por cuatro amino�cidos, incluso más preferiblemente por tres amino�cidos, de forma más preferida por dos amino�cidos, e incluso de forma más preferida por un amino�cido de
50 los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6.
[0048] Un polip�ptido de la presente invención comprende preferiblemente la secuencia de amino�cidos de SEC ID nO: 6 o una variante al�lica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de mejora celulol�tica. En un aspeclo preferido, un polip�ptido comprende la secuencia de amino�cidos de SEC ID nO: 6. En olro aspecto preferido un 55 polip�ptido comprende amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6 o una variante al�lica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de mejora celulol�tica. En otro aspecto preferido un polip�ptido comprende los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6. En otro aspecto preferido un polip�ptido consiste en la secuencia de amino�cidos de SEC ID nO: 6 o una variante al�lica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de mejora celulolitica. En olro aspeclo preferido un polip�ptido consisle en la secuencia de amino�cidos SEC ID nO: 6. En
60 otro aspecto preferido un polip�ptido consiste en los amino�cidos 20 a 258 de la SEC iD nO: 6 o una variante al�lica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de mejora celulol�tica. En otro aspecto preferido, un polip�ptido consiste en los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6.
[0049] En otro aspecto, la descripción se refiere a polip�ptidos aislados con actividad de mejora celulol�tica que son codificados por polinucle6tidos que hibridan bajo condiciones de astringencia muy bajas, preferiblemente condiciones de astringencia bajas, más preferiblemente condiciones de astringencia medias, más preferiblemente condiciones de astringencia medio-altas, incluso más preferiblemente condiciones de astringencia altas y de forma más preferida cond iciones de astringencia muy altas con (i) los nucleótidos 126 a 978 de la SEC ID nO: 5, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 98 a 821 de la SEC ID nO: 3, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) o (iv) una cadena complementaria de (i) o (ii) o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). Una subsecuencia de la SEC ID nO: 5 contiene al menos 100 nucleótidos contiguos o preferiblemente al menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polip�ptido que tiene actividad de mejora celulolitica.
[0050] La secuencia de nucle6tidos de la SEC ID nO: 5 o una subsecuencia de esta, as� como la secuencia de amino�cidos de la SEC ID nO: 6 o un fragmento de esta, se puede utilizar para disei'iar una sonda de ácidos nucleicos para identificar y clonar ADN que codifica polip�ptidos con actividad de mejora celulolitica de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridación con el gen�mico o ADNc del género o especie de interés, siguiendo procedimientos Southem blot, para identificar y aislar el gen correspondiente en este. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser al menos 14, preferiblemente al menos 25, más preferiblemente al menos 35 y de forma más preferida al menos 70 nucle6tidos en longitud. Se prefiere, no obstante, que la sonda de ácidos nucleicos sea al menos 100 nucle6tidos en longitud. Por ejemplo, la sonda de ácidos nucleicos puede ser al menos 200 nucleótidos, preferiblemente al menos 300 nucleótidos, más preferiblemente al menos 400 nucle6tidos, o de la forma más preferida al menos 500 nucle6tidos en longitud. Sondas incluso más largas pueden ser utilizadas, por ejemplo, sondas de ácidos nucleicos que son al menos 600 nucle6tidos, al menos preferiblemente al menos 700 nucle6tidos, más preferiblemente al menos 800 nucleótidos, o de la forma más preferida al menos 900 nucle6tidos en longitud. Ambas sondas de ADN y ARN pueden usarse. Las sondas se marcan típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32p, 3H, 35S, biotina, o avidina). Tales sondas est�n incluidas en la presente invenci6n.
[0051] Un ADN gen�mico o genoteca de ADNc obtenido a partir de estos otros organismos puede, por lo tanto, seleccionarse para ADN que hibridiza con las sondas anteriormente descritas y que codifica un polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica. Gen6mico u otro ADN de estos otros organismos se pueden separar por agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de separaci6n. ADN de las bibliotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que es homólogo a la SEC ID nO: 5, o una subsecuencia de esta, el material portador se usa en una transferencia de Southem.
[0052] Para fines de la presente divulgación, hibridación indica que la secuencia de nucle6tidos hibrida a una sonda de ácidos nucleicos marcada correspondiente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID nO: 5, la secuencia de ADNc contenida en la SEC ID nO: 5, su cadena complementaria, o una subsecuencia de esta, bajo condiciones de astringencia de muy bajas a muy altas. Moléculas a la que la sonda de ácidos nucleicos hibrida bajo estas condiciones pueden detectarse usando película radiogr�fica.
[0053] La sonda de ácidos nucleicos puede ser una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polip�ptido de la SEC ID nO: 6, o una subsecuencia de esta. En otra forma de realización preferida la sonda de ácidos nucleicos es la SEC ID N�: 5. En otra forma de realización preferida la sonda de ácidos nucleicos es la regi6n de codificación de polip�ptido maduro de la SEC ID nO: 5. En otra forma de realizaci6n preferida la sonda de ácidos nucleicos es la secuencia de ácidos nucleicos contenida en el pl�smido pTter61D que est� contenido en Escherichia col; NRRL B-30812, donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica. En otra forma de realización preferida, la sonda de ácidos nucleicos es la regi6n de codificaci6n del polip�ptido maduro contenida en el pl�smido pTter61 O que est� contenido en Escherichia coli NRRL 6-30812.
[0054] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos en longitud, condiciones de astringencia de muy bajas a muy altas se definen como prehibridaci�n e hibridación a 42Q C en 5X SSPE, 0,3% de SOS, 200 I1g/ml de AON de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, y bien 25% de formamida para astringencias bajas y muy bajas, 35% de forma mida para astringencias medias y medias-altas, o 50% de forma mida para astringencias altas y muy altas, seguido de procedimientos de transferencia de Southern blot estándar durante 12 a 24 horas óptimamente.
[0055] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos en longitud, el material portador se lava finalmente tres veces cada durante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% de SDS preferiblemente al menos a 45Q C (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50Q C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55Q C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60Q C (astringencia media-alta), incluso más preferiblemente al menos a 65Q C (astringencia alta), y más preferiblemente al menos a 70"C (astringencia muy alta).
[0056] Para sondas cortas que son aproximadamente de 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos en longitud, condiciones de astringencia se definen como prehibridaci�n, hibridación y post-hibridación de lavado de aproximadamente 5"C a aproximadamente 10"C por debajo de la Tm calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0,9 M de NaCI, 0,09 M de Tris-Hel pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5% de NP-40, solución de Denhardt 1X, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato
monob�sico de sodio, 0,1 mM de ATP y 0,2 mg de levadura ARN por mi seguido de procedimientos de transferencia de Southem blot estándar durante 12 a 24 horas óptimamente.
[0057] Para sondas cortas que son aproximadamente de 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos en longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC más 0,1% de SDS durante 15 minutos y dos veces cada durante 15 minutos usando 6X SSC a de 5"C a 10"C por debajo de la T m calculada.
[0058] La presente divulgación se refiere a variantes artificiales comprendiendo una substitución conservadora, eliminación, y/o inserción de uno o más amino�cidos. Preferiblemente, cambios de amino�cidos son de naturaleza secundaria, es decir sustituciones de amino�cido conservadoras o inserciones que significativamente no afectan al pliegue y/o actividad de la proteína; deleciones pequel'ias, típicamente de uno a aproximadamente 30 amino�cidos; pequel'ias extensiones ami no-o carboxi-terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un pequeño p�ptido de enlace de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequel'ia extensión que facilita purificación cambiando la carga de red u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un ep�topo antig�nico o un dominio de unión.
[0059] Ejemplos de sustituciones conservadoras est�n dentro del grupo de amino�cidos básicos (arginina, lisina e histidina), amino�cidos ácidos (ácido glut�mico y ácido asp�rtico), amino�cidos polares (glutamina y asparagina), amino�cidos hidrof�bicos (Ieucina, isoleucina y valina), amino�cidos aromáticos (fenilalanina, tript�fano y tirosina), y amino�cidos pequel'ios (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de amino�cidos que generalmente no alteran actividad específica se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L Hill, 1979, en The Proleins, Academic Press, New York. Los intercambios que ocurren más frecuentemente son Ala/Ser, Val/lIe, AspfGlu, Thr/Ser, Ala/Gly, AlafThr, Ser/Asn, AlaNal, Ser/Gly, TyrlPhe, Ala/Pro, Lys/Arg, AspfAsn, Leu/lIe, LeuNal, Ala/Glu y AspfGly.
[0060] Además de los 20 amino�cidos estándar, amino�cidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metilo lisina, ácido 2-aminoisobut�rico, isovalina, y alfa-metil serina) se pueden sustituir por residuos de amino�cidos de un polip�ptido de tipo salvaje. Un número limitado de amino�cidos no conservadores, amino�cidos que no se codifican por el código genético y amino�cidos no naturales se pueden sustituir por residuos de amino�cidos. "Amino�cidos no naturales" han sido modificados después de síntesis de proteína, y/o tienen una estructura química en su cadena(s) lateral diferente de los amino�cidos estándar. Amino�cidos no naturales pueden sintetizarse químicamente y, preferiblemente, est�n disponibles comercialmente, e incluyen ácido pipec�lico, tiazolidina ácido carbox�lico, dehidroprolina, 3-y 4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.
[0061] Alternativamente, los cambios de amino�cidos son de tal naturaleza que las propiedades físico-químicas de los polip�ptidos son alteradas. Por ejemplo, cambios de amino�cidos pueden mejorar la termoestabilidad del polip�ptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.
[0062] Amino�cidos esenciales en el polip�ptido progenitor se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutag�nesis dirigida o mutag�nesis de escaneado de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, mutaciones de alanina únicas se introducen en cada residuo en la molécula y las moléculas resultantes mutantes se evalúan en cuanto a actividad biológica (es decir, actividad de mejora celulol�tica) para identificar residuos de amino�cidos que son muy importantes para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton el al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica puede también determinarse por análisis físico de estructura, como determinado por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica, o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con mutación de amino�cidos de sitio de contactos putativo. Ver, por ejemplo, de Vos el al., 1992, Science 255: 306-312; Smith el al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver el al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Las identidades de amino�cidos esenciales pueden también inJerirse de análisis de identidades con polip�ptidos que se relacionan con un polip�ptido según la invención.
[0063] Sustituciones de amino�cidos múltiples o únicas pueden hacerse y evaluarse usando métodos conocidos de mutag�nesis, recombinación, yfo redistribución, seguidos de un procedimiento de selección pertinente, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Sc;ence 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95f17413; o WO 95122625. Otros métodos que pueden usarse incluyen PCR con tendencia al error, visualización de rago (p. ej., Lowman el al., 1991, B;ocl�em. 30: 10832-10837; U.S. Patent n� 5,223,40; WO 92(06204) y mutag�nesis dirigida por región (Derbyshire el al., 1986, Gene 46: 145; Ner el al. , 1988, DNA
7: 127).
[0064] Métodos de mutag�nesis/redistribución se pueden combinar con alto rendimiento, métodos de selección automatizados para detectar actividad de polip�ptidos clonados mutagenizados expresados por células huésped (Ness el al., 1999, Nalure Biolechnology 17: 893-896). Moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polip�ptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y rápidamente secuenciar usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de amino�cidos individuales en un polip�ptido de interés y se pueden aplicar a polip�ptidos de estructura desconocida.
[0065] El número total de sustituciones de amino�cido, deleciones y{o inserciones de los amino�cidos 23 a 250 de la SEC ID nO: 2 es 10, preferiblemente 9, más preferibtemente B, más preferiblemente 7, más preferiblemente como mucho 6, más preferiblemente 5, más preferiblemente 4, incluso más preferiblemente 3, de forma más preferida 2, e incluso de forma más preferida 1.
[0066] En un aspecto preferido, el polip�ptido es un potip�ptido de Thie/avía teffestris. En una forma de realización más preferida, el polip�ptido es un polip�ptido de Thielavia lerreslris NRRL 8126, por ejemplo, el polip�ptido con la secuencia de amino�cidos de la SEC ID nO: 6, o fragmentos de esta, por ejemplo, la proteína madura.
[0067] Cepas de estas especies son accesibles fácilmente al público en varias de colecciones de cultivo, tal como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (OSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0068] Polip�ptidos de la presente invención también incluyen polip�ptidos fundidos o polip�ptidos de fusión divisibles en los que otro polip�ptido se funde al N-terminal o el C-terminal del polip�ptido o fragmento de este. Un polip�ptido fusionado se produce por fundición de una secuencia de nucleótidos (o una parte de esta) que codifica otro polip�ptido a una secuencia de nucleótidos (o una parte de esta) de la presente invención. Técnicas para producir polip�ptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligar las secuencias de codificación que codifican los polip�ptidos de modo que estas est�n en marco y que expresión del polip�ptido fusionado est� bajo control del mismo promotor(es) y terminador.
Polinucle�tidos
[0069] La presente invención también se refiere a polinucle�tidos aislados con secuencias de nucleótidos que codifican polip�ptidos de la presente invención.
[0070] La secuencia de nucleótidos se expone en la SEC ID nO: 5. En un aspecto más preferido, la secuencia de nucleótidos es la secuencia contenida en el pl�smido pTter61 O que est� contenido en Escherichia coli NRRL B-30812. La secuencia de nucle6tidos es la región de codificación del polip�ptido maduro de la SEC ID nO: 5. En otro aspecto más preferido la secuencia de nucleótidos es la reg i�n de codificación del polip�ptido maduro contenido en el pl�smido pTter61 O que est� contenido en Escherich�a coli NRRL B-30812. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que cod ifican un polip�ptido con la secuencia de amino�cidos de la SEC ID nO: 6 o el polip�ptido maduro de la misma que difiere de la SEC ID nO: 5 en virtud de la degeneración del c�d igo genético.
Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucle�tido que codifica un polip�plido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de AON gen�mico, preparación de AONc, o una combinación de estos. La clonaci�n de los polinucle�tidos de la presente invención de este AON gen�mico puede ser efectuada, por ejemplo, usando reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o seleccionando anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tal como reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en secuencias de nucleótidos (NASBA) pueden utilizarse. Los polinucle�tidos se pueden clonar de una cepa de Thielav�a, u otra u organismo relacionado y as�, por ejemplo, puede ser una variante al�lica o de especies de la regi6n de codificación de polip�ptido de la secuencia de nucleótidos.
[0071] La presente invención también se refiere a polinucle�tidos con secuencias de nucleótidos que tienen un grado de identidad a la secuencia cod ificante del polip�ptido maduro de la SEC ID nO: 5 (es decir, los nucle6tidos 126 a 978) de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de la forma más preferida al menos 95%, e incluso de forma más preferida al menos 97% de identidad, que codifica un polip�ptido activo.
[0072] Modificación de una secuencia de nucle6tidos que codifica un polip�ptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polip�ptidos sustancialmente similares al polip�ptido. El término �substancialmente similar" al polip�ptido se refiere a formas que no ocurren de manera natural del polip�ptido. Estos polip�ptidos pueden diferir en alguna manera creada genéticamente del polip�ptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes artificiales que difieren en la actividad especifica, termostabilidad, pH óptimo, o similares. La secuencia variante puede construirse basándose en la secuencia de nucleótidos presentada como la reg i�n de cod ificaci�n del polip�ptido de la SEC ID nO: 1, por ejemplo, una subsecuencia de esta, ylo por introducción de sustituciones de nucle6tido que no dan lugar a otra secuencia de amino�cidos del polip�ptido cod ificadas por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponden al uso del cod�n del organismo huésped destinado para la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucle6tidos que pueden dar lugar a una secuencia de amino�cidos diferente. Para una descripción general de sustitución de nucle6tidos, ver, por ejemplo, Ford el al. , 1991, Prolein Express�on and Purification 2: 95-107.
[0073] Ser� evidente para los expertos en la t�cn ica que estas sustituciones pueden hacerse fuera de las reg iones más importantes a la función de la molécula y todavía suponer un polip�ptido activo. Residuos de amino�cidos esenciales a
la actividad del polip�ptido codificados por un polinude�tido aislado de la invención y, por lo tanto, preferiblemente no sujeto a sustitución , se puede identificar según procedimientos conocidos en la t�cn ica , tal como mutag�nesis dirigida o mutag�nesis de escaneado de alanina (ver, por ejemplo, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta técnica, mutaciones se introducen en cada residuo positivamente cargado en la molécula y las moléculas mutantes resultantes se evalúan para actividad de mejora celulol�tica para identificar residuos de amino�cidos que son muy importantes para la actividad de la molécula. Sitios de interacción sustrato-enzima pueden también ser determinados por análisis de la estructura tridimensional como determinado por tales técnicas como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografia o etiquetado de fotoafinidad (ver, por ejemplo, de Vos el al., 1992, Sc�ence 255: 306-312: Smith el al., 1992, Journal of Molecular B�ology 224: 899-904; Wlodaver el al., 1992, FEBS Letters 309: 59-644).
[0074] La presente divulgación también se refiere a pollinucle�tidos aislados que codifican un polip�ptido de la presente invención, que hibridan bajo condiciones de astringencia muy bajas, preferiblemente condiciones de astringencia bajas, más preferiblemente condiciones de astringencia medias, más preferiblemente condiciones de astringencia medio-altas, incluso más preferiblemente condiciones de astringencia altas y de la forma más preferida cond iciones de astringencia muy altas con (i) n�deotidos 126 a 978 de la SEC ID N� 5 (ii) la secuencia DNAc contenida en n�cleotidos 98 a 821 de la SEC ID N� o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); o variantes al�licas y subsecuencias de la misma (Sambrook st al., 1989, supra), como definida aqu1.
[0075] La presente divulgación también se refiere a polinucle�tidos aislados obtenidos por (a) hibridar una población de ADN bajo condiciones de astringencia muy bajas, bajas, medias, medio-altas, altas, o muy altas con (i) n�cleotidos 126 a 978 de la SEC ID N� 5 (ii) la secuencia DNAc contenida en n�cleotidos 126 a 978 de la SEC ID N� 5 o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); y (b) aislar el polinude�tido, que codifica un polinucle�tido con actividad de mejora celulolilica
Construcciones de ácidos nucleicos
[0076] La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos comprendiendo un polinude�tido aislado de la presente invención operativa mente unido a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
[0077] Un polinude6tido aislado que codifica un polip�ptido de la presente invención se puede manipular en una variedad de maneras para proveer expresión del polip�ptido. Manipulación de la secuencia del polinucle�tido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias polinude�tidas utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.
[0078] La secuencia de control puede ser una secuencia del promotor apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de la presente invención. La secuencia del promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polip�ptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección, incluyendo promotores mutantes, truncados e hibridos, y se pueden obtener de genes que codifican polip�ptidos intracelulares o extracelulares bien homólogos o heter�logos a la célula huésped.
[0079] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenido del oper�n lac de E. coli, gen de agarasa de Streplomyces coelicolor (dagA), gen de levansucrasa de Bac�llus subtilis (sacB), gen de alfaamilasa de Bacmus licheniformis (amyL), gen de amilasa maltog�nica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefac�ens (amyQ), gen de penicilinasa de Bacillus licheniform�s (penP), genes xylA y xylB de Bacillus sublilis y gen de beta-lacta masa procari�tica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731 ), asi como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sc�ences USA 80: 21-25). Además promotores son descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; yen Sambrook et al., 1989, supra.
[0080] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa f�ngica son promotores obtenidos de los genes para T AKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa asp�rtica de Rh�zomucor m�ehei, alfa-amitasa neutra de Asperg�llus niger, alfa amilasa estable en ácido de Aspergillus níger, glucoamilasa (glaA) de Asperg�llus nigero Asperg�llus awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergmus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00fS6900 ), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96f00787), beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa t de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa 11 de Trichoderma reesei, endoglucanasa t de Trichodenna reesei, endoglucanasa 11 de Trichodenna reese�, endoglucanasa 111 de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa 11 de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual el promotor NA2-tpi (un hibrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Asperg�llus niger e isomerasa de fosfato de triosa de Aspergillus oryzae); y promotores híbridos truncados mutanles de estos.
[0081] En un huésped de levadura, promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAl1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1,ADH2IGAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos el al., 1992, Yeasl8: 423-488.
[0082] La secuencia de control puede también ser una secuencia de terminación de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia de terminación se une operativamente al 3' terminal de la secuencia de nucleótidos que codifica el polip�ptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.
[0083] Terminadores preferidos para células huésped filamentosas f�ngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus niduJans, alfaglucosidasa de Aspergillus niger y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0084] Terminadores preferidos para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo de Saccharomyces cerevisiae C (CYC1) y gliceraldeh�do-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos el al., 1992, supra.
[0085] La secuencia de control puede también ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para traducción por la célula huésped. La secuencia !ider se une operativa mente al 5' terminal de la secuencia de nucleótidos que codifica el polip�ptido. Cualquier secuencia !ider que es funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.
[0086] Líderes preferidas para células huésped filamentosas f�ngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus otyzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0087] Líderes adecuadas para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerev�siae (ADH2IGAP).
[0088] La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilaci�n, una secuencia unida operativamente al 3' terminal de la secuencia de nucleótidos y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina a ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilaci�n que es funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.
[0089] Secuencias de poliadenilaci�n preferidas para células huésped filamentosas f�ngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus otyZae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.
[0090] Secuencias de poliadenilaci�n útiles para células huésped de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cel/ular Biology 15: 5983-5990.
[0091] La secuencia de control puede también ser una región de codificación de p�ptido señal que codifica a una secuencia de amino�cidos unida al amino terminal de un polip�ptido y dirige al polip�ptido codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia cod ificante de la secuencia de nucleótidos puede intrínsecamente contener una región de codificación de p�ptido señal naturalmente unida en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica el polip�ptido segregado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región de codificación de p�ptido señal que es extranjero a la secuencia codificante. La región de codificación de p�ptido señal extranjero puede requerirse donde la secuencia codificante no contiene naturalmente una región de codificación de p�ptido señal. Alternativamente, la región de codificación del p�ptido señal extranjero puede simplemente reemplazar la región de codificación del p�ptido señal natural para mejorar secreción del polip�ptido. No obstante, cualquier región de codificación del p�ptido señal que dirige al polip�ptido expresado en la via secretora de una célula huésped de elección, es decir, segregado en un medio de cultivo, se puede utilizar en la presente invención.
[0092] Regiones de codificación de p�ptido señal eficaces para células huésped bacterianas son las regiones de codificación de p�ptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltog�nica de Bacil/us NelB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothennophilus, dubtilisina de Nacillus lichenifonnis, beta-lacta masa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothennophilus (nprT, nprS,nprM) y Bacillus subtilis prsA. Además, p�ptidos señal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[0093] Regiones de codificación de p�ptido señal eficaces para células huésped filamentosas f�ngicas son las regiones de codificación del p�plido señal obtenido de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de
Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa asp�rtica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa.
[0094] La región de codificación del p�ptido señal es n�cleotidos 69 a 125 de la SEC ID N� 5 que codifica amino�cidos 1 a 19 de la SEC ID N� 6. P�ptidos señal útiles para células huésped de levadura son obtenidos de genes para alfafactor de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones de codificación útiles de codificación del p�ptido señal se describen por Romanos et al., 1992, supra.
[0095] La secuencia de control puede también ser una región de codificación de prop�ptido que codifica a una secuencia de amino�cidos situada en el amino terminal de un polip�ptido. El polip�ptido resultante es conocido como una proenzima o propol ip�ptido (o un zim�geno en algunos casos). Un propolip�ptido es generalmente inactivo y se puede convertir a un polip�ptido maduro activo por escisión autocatal�tica o catalítica del prop�ptido del propolip�ptido. La región de codificación del prop�ptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa asp�rtica de Rhizomucor mieheiy lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).
[0096] Donde ambos p�ptido señal y regiones de prop�ptido est�n presentes en el amino terminal de un polip�ptido, la región de prop�ptido est� situada junto al amino terminal de un polip�ptido y la región de p�ptido señal est� situada junto al amino terminal de la región de prop�ptido.
[0097] Puede también ser deseable añadir secuencias reguladoras que permiten la regulaci�n de la expresión del polip�ptido en relación al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que causan que la expresión del gen cambie de ON u OFF en respuesta a un estímulo físico o químico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procari�ticos incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL 1 pueden ser utilizados. En hongos filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son los que permiten amplificación g�nica. En sistemas eucariotas, estos incluyen el gen de dihidrofolato-reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotione�na que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polip�ptido sería unida operativamente con la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
[0098] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes comprendiendo un polinucle�tido de la presente invención, un promotor y señales de parada traduccionales y transcripcionales. Varios ácidos nucleicos y secuencias de control descritos aquí pueden juntarse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polip�ptido en estos sitios. Alternativamente, una secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede expresar por inserción de la secuencia de nucleótidos o una construcción de ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante se une operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
[0099] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un pl�smido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector típicamente depender� de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector debe ser introducida. Los vectores pueden ser pl�smidos circulares cerrados o lineales.
[0100] El vector puede ser un vector de replicaci�n autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromos�mica, la replicaci�n del cual es independiente de replicaci�n cromos�mica, por ejemplo, un pl�smido, un elemento extracromos�mico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar autorreplicaci�n. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el cromosoma{s) en el que ha sido integrado. Además , un único vector o pl�smido o dos o más vectores o pl�smidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transpos�n pueden ser utilizados.
[0101] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten selección fácil de células transformadas, modificadas, transducidas, o similares. Una etiqueta seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona resistencia biocida o v�rica, resistencia a metales pesados, prototrofia a aux�trofos y similares.
[0102] Ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como ampicilina, kanamicina, cloranfenicol, o resistencia a la tetraciclina. Marcadores adecuados para células huésped de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 Y URA3. Marcadores seleccionables para uso en una célula huésped filamentosa f�ngica incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (omitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph
SO
(higromicina fosfotransferasa), niaO (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (adeniltransferasa de sutfato), andtrpC (sintasa de antranilato), al igual que equivalentes de estos. Preferido para uso en una c�tula de Aspergillus son los genes amdS andpyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces higroscopicus.
[0103] Los vectores de ta presente invención preferiblemente contienen un etemento(s) que permite integración del vector en el genoma de la célula huésped o replicaci�n autónoma del vector en la celular independiente del genoma.
[0104] Para integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia del polinude�tido que codifica el potip�ptido o cuatquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homóloga o no hom�toga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionates para dirigir integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación(es) precisa en el cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucteicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, preferiblemente de 400 a 10.000 pares de bases y de forma más preferida de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia blanco correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a la secuencia blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias codif�cantes o no codif�cantes de nude�tidos. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
[0105] Para replicaci�n autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicaci�n que permite al vector replicar de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicaci�n puede ser cualquier replicador pl�smido que media replicaci�n autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicaci�n" o "replicador pl�smido" se define aquí como una secuencia de nucle�lidos que habilita a un pl�smido o vector para replicar in vivo.
[0106] Ejemplos de orígenes bacterianos de replicaci�n son los orígenes de replicaci�n de pl�smidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 permitiendo replicaci�n en E. coli y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMg1 permitiendo replicaci�n en Bacillus.
[0107] Ejemplos de orígenes de replicaci�n para uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicaci�n de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.
[0108] Ejemplos de orígenes de replicaci�n útiles en una célula filamentosa f�ngica son AMA1 y ANS1 (Gems el al., 1991 , Gene 98: 61-67; Cullen er al., 1987, NucJeic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Aislamiento del gen AMA1 y construcción de pl�smidos o vectores comprendiendo el gen, lo que se puede realizar según los métodos descritos en la WO 00124883.
[0109] Más de una copia de un polinucle�tido de la presente invención se puede insertar en la célula huésped para aumentar producción del producto genético. Un aumento en el número de copias del polinucle�tido se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador amplificable seleccionable con el polinucle�tido donde células con copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y as� copias adicionales del polinucle�tido, se pueden seleccionar para cultivar las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
[0110] Los procedimientos usados para unir los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención se conocen por un experto en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook
et al., 1989, supra).
C�lulas huésped
[0111] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, comprendiendo un polinucle�tido de la presente invención, que es ventajosamente usado en la producción recombinante de los polip�ptidos. Un vector comprendiendo un polinucle�tido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector ese mantiene como un integrante cromos�mico o como un vector extracromosomal que se duplica como se describe anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntico a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicaci�n. La elección de una célula huésped en gran parte depende del gen que cod ifica el polip�ptido y su fuente.
[0112] La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.
[0113] Microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram pOSitivas incluyendo, pero no limitado a, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacilfus brevis, Bacillus circulans, Bacillus e/ausH, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subt�lis y Bacillus thuring�ensis o una célula de Streptomyces, por
ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomices murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus lichen�form�s, Bac�llus stearothermophilus, o Bac�llus subt�lis. En olro aspeclo preferido, la célula de Bac�llus es un Bacillus alcalof�lico.
[0114] La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genet�cs 168: 111-115), usando células competentes (ver, por ejemplo, Young and Spizizen, 1961, Joumal of Bacterioiogy 81: 823-829, o Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971 , Joumal of Molecular B�ology 56: 209-221), electroporaci�n (ver, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988, B�otechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler and Thome, 1987, Joumal ofBacteriology 169: 5771-5278).
[0115] La célula huésped puede también ser un eucariota, tal como un mamífero, insecto, planta, o célula f�ngica.
[0116] En un aspecto preferido, la célula huésped es una célula f�ngica. "Hongo", como se utiliza en este caso, incluye los fila Ascomycota, Basid�omycota, Chytrid�omycota y Zygomycota (como se define por Hawksworth et al., En E�nsworth and Bisby's D�ct�onary of The Fung�, 8th edit�on, 1995, CAB Intemat�onal, Un�versity Press, Cambridge, UK) al igual que el Oomycota (como se cita en Hawksworth et al. , 1995, supra, page 171) y todos los hongos mitosp�ricos (Hawksworth etal., 1995, supra).
[0117] En un aspecto más preferido, la célula huésped f�ngica es una célula de levadura. "Levadura", como se utiliza en este caso, incluye levadura ascoespor�gena (Endomicetales), levadura basidiosporogenous y levadura de los hongos Imperfecti (Blastomycetes) . Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, FA, Passmore,
S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Sympos�um Series No. 9, 1980).
[0118] En un aspecto incluso más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yanuwia.
[0119] En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergens�s, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasi�, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, o Saccharomyces oviformis. En airo aspeclo más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lact�s. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrow�a l�polytica.
[0120] En olro aspecto más preferido, la célula huésped f�ngica es una célula mic:ética filamentosa. "Hongos filamentosos" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisac�ridos complejos. Crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y catabolismo de carbono es estrictamente aer�bico. En cambio, crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
[0121] En un aspecto incluso más preferido, la célula huésped filamentosa f�ngica es una célula de Acremon�um, Asperg�llus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Corio/us, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Hum�cola, Magnaporthe, Mucar, Myceliophthora, Neocallimast�x, Neurospora, Paecilomyces, Pen�cillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Toiypocladium, Trametes, o Trichoderma.
[0122] En un aspecto más preferido, la célula huésped filamentosa f�ngica es una célula de Asperg�llus awamori, Asperg�llus fum�gatus, Aspergillus foet�dus, Aspergillus japonicus, Asperg�llus nidulans, Asperg�llus niger o Asperg�llus oryzae. En otro aspecto más preferido, la célula huésped filamentosa f�ngica es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium gram�num, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium Ir�cholhec�oides, o Fusarium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula huésped filamentosa f�ngica es una células de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis ane�rina, Ceriporiopsis ane�rina, Ceriporiops�s caregiea, Ceriporiops�s gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Corio/us hirsutus, Humico/a insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia re"esrris, Trameres vil/osa, Trameres versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
[0123] Células f�ngicas se pueden transformar por un proceso implicando formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular en una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238 023 Y Yellon et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para transformación de
especies de Fusariurn son descritos por Malardier el al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. and S�mon, M.I., ed�lors, Guide lo Yeasl Genetics and Mo/ecular Biology, Melhods in Enzym%gy, Vo/urne 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito el al., 1983, Jouma/ of Bacteri%gy 153: 163; y Hinnen el al., 1978, Proceedings of lhe Nalional AcademyofSciences USA 75: 1920.
M�todos de producción
[0124] La presente divulgación también se refiere a métodos para producir un polip�ptido de la presente invención, comprendiendo (a) cultivo de una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polip�ptido, bajo condiciones propicias para la produCción del polip�ptido; y (b) recuperación el polip�ptido. Preferiblemente, la célula es del género Thie/avia, y más preferiblemente Thie/avia lerrestris.
[0125] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polip�ptido de la presente invención, comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del polip�ptido; y (b) recuperación del polip�ptido.
[0126] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polip�ptido usando métodos bien conocidos en la t�cn ica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitaci�n y fermentación a gran escala o a pequet'ia escala (incluyendo fermentaciones continua, por lotes, por lote alimentado, o de estado sólido) en el laboratorio o fermentadores industriales realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten al polip�ptido expresarse y/o aislarse. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados est�n disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polip�ptido se segrega en el medio nutritivo, el polip�ptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polip�ptido no se segrega en el medio, este se puede recuperar de lisatos celulares.
[0127] Los polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica son detectados usando los métodos descritos aquL
[0128] El polip�ptido resultante puede ser recuperado usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polip�ptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitado a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.
[0129] Los polip�ptidos de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatograf�a (p. ej., intercambio de iones, afinidad, cromatoenfoque hidrof�bico y exclusión por tamat'io), procedimientos electrofor�ticos (p. ej., isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato am�nico), SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purificat�on, J.
C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Pub/ishers, New York, 1989) para obtener polip�ptidos substancialmente puros.
Plantas
[0130] La presente divulgación también se refiere a una planta transg�nica, parte de planta, o célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un pol ip�ptido con actividad de mejora celulolltica de la presente invención para expresar y producir el polip�ptido en cantidades recuperables. El polip�ptido se puede recuperar de la planta o parte de planta. Altemativamente, la planta o parte de planta con el polip�ptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejora de valor nutritivo, palatabilidad y propiedades reol�gicas, o para destruir un factor antinutritivo.
[0131] La planta transg�nica puede ser dicoty/edonous (un dicotiled�neo) o monocotyledonous (un monocotiled�neo). Ejemplos de plantas monocotiled�neas son hierbas, tales como césped de pradera (pasto azul, Poa), hierba forrajera tal como Festuca, Lolium, césped templado, tal como Agrost�s y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.
[0132] Ejemplos de plantas dicotiled�neas son tabaco, leguminosas, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y semilla de soja, y plantas cruc�fereas (familia Brassicaceae), tal como coliflor, semilla de colza y el modelo cercanamente relacionado con organismo Arabidopsis thaliana.
[0133] Ejemplos de partes de planta son vástago, callo, hojas, raíz, frutas, semillas y tubérculos al igual que los tejidos individuales comprendiendo estas partes, por ejemplo, epidermis, mes�filo, par�nquima, tejidos vasculares, meristemas. Compartimentos de célula vegetal específicos, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma son también considerados como una parte de planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera como una parte de planta. Asimismo, partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención son también consideradas partes de planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semillas.
[0134] También incluido dentro del campo de la presente invención est� la progenie de tales plantas, partes de planta y células vegetales.
[0135] La planta transg�nica o célula vegetal que expresa un polip�ptido de la presente invención se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye por incorporación de una o más construcciones de expresión que codifican un polip�ptido de la presente invención en el genoma huésped de planta o genoma de cloroplasto y propagan la planta modificada resultante o célula vegetal en una planta transg�nica o célula vegetal.
[0136] La construcción de expresión es convenientemente una construcción de ácidos nucleicos que comprende un polinucle�lido que codifica un polip�ptido de la presente invención operativamente unido con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de nucleótidos en la planta o parte de planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender una etiqueta seleccionable útil para identificación de células huésped en las que la construcción de expresión ha sido integrada y secuencias de ADN necesarias para introducción de la construcción en la planta en cuestión (esta última depende del método de introducción de ADN que se usa).
[0137] La elección de secuencias reguladoras, tales como promotor y secuencias de terminación y opcionalmente secuencias señal o de tránsito son determinadas, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde y cómo se desea el polip�ptido que se exprese. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polip�ptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, fase o tejido específico, y el producto genético puede estar dirigido a un tejido específico o parte de planta tal como semillas o hojas. Secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague el al., 1988, Planl Physiology 86: 506.
[0138] Para expresión constitutiva, el 35S-CaMV, la ubiquitina de maíz 1, Y el promotor de actina de arroz 1 se pueden usar (Franck el al., 1980, Cell 21: 285-294, Chrislensen el al. , 1992, Planl Mo. Biol. 18: 675-689; Zhang el al., 1991, Planl Ce1/3: 1155-1165). Promotores específicos a un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tal como semillas, tubérculos de patata y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito el al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como la glutelina, prolamina, globulina, o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la leg�mina 84 y el gen de proteína de semilla desconocida de Vicia faba (Conrad el al., 1998, Joumal of Planl Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo de aceite de semilla (Chen el al., 1998, Planl and Cel! Physiology 39: 935-941), el promotor napA de la proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en la WO 91 /14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor de rbes de arroz o tomate (Kyozuka el al., 1993, Planl Physiology 102: 991-1000), el promotor de gen de metiltransferasa de adenina de virus de chlorella (Mitra and Higgins, 1994, Planl Molecular Biology 26: 85-93),
o el promotor aldP de gen de arroz (Kagaya el al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-67), o un promotor inducible dañado tal como el promotor pin2 de patata (Xu el al., 1993, Planl Molecular BiolO9y 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abi�ticos tales como temperatura, sequía, o alteraciones en la salinidad
o inducido por sustancias aplicadas ex�genamente que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estr�genos, hormonas de planta tal como etileno, ácido absc�sico y ácido giber�lico y metales pesados.
[0139] Un elemento promotor intensificador puede también ser usado para conseguir expresión mayor de un polip�ptido de la presente invención en la planta. Por ejemplo, el elemento promotor intensificador puede ser un intr�n que es colocado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu el al., 1993, supra, revela el uso del primer intr�n del gen de actina de arroz 1 para mejorar expresión.
[0140] El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte de la construcción de expresión se puede elegir de aquellas disponibles en la t�cn ica.
[0141] La construcción de ácidos nucleicos se incorpora en el genoma de planta según técnicas convencionales conocidas en la t�cn ica , incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyecci�n, bombardeo de partícula, transformación biol�stica y electroporaci�n (Gasser el al., 1990, Sdence 244: 1293; Polrykus, 1990, BiolTechnology B: 535; Shimamoto el al., 1989, Nalure 338: 274).
[0142] Actualmente, transferencia de gen mediada por Agrobacterium lumefaciens es el método de elección para generación de dicotiled�neas transg�nicas (para una revisión, ver Hooykas and Schilperoort, 1992, Planl Molecular BiolO9Y 19: 15-38) y también puede usarse para transformación de monocotiled�neas, aunque otros métodos de transformación se usan frecuentemente usado para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generación de monocotiled�neas transg�nicas es bombardeo de partículas (oro microscópico o partículas de tungsteno revestido con la transfomaci�n ADN) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Joumaf 2: 275-281; Shimamolo, 1994, Current Opinion Biolechnology 5: 158-162; Vasil el al., 1992, BiofTechnofogy 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocotiled�neas se basa en transformación de protoplasto como se describe por Omirulleh el al., 1993, Planl Molecular BiolO9y 21: 415-428.
[0143] Después de transformación, los transformantes que han sido incorporados a la construcción de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Con frecuencia, el proced imiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de selección de genes bien durante regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformaci�n con dos construcciones de TADN separados o escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.
[0144] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polip�ptido de la presente invención comprendiendo: (a) cultivo de una planta transg�nica o una célula vegetal comprendiendo un polinucle�tido que codifica un polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polip�ptido; y (b) recuperación del polip�ptido.
Composiciones
[0145] La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polip�ptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones est�n enriquecidas en tal polip�ptido. El término "enriquecido� indica que la actividad de mejora celulol�tica ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1.
[0146] La composición puede comprender un polip�ptido de la presente invención como componente principal, es decir, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender además una o más actividades enzim�ticas, tales como aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, chitinasa, cutinasa, ciclodextina glicosiltransferasa, deoxiribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, halaperoxidasa, invertasa, laccasa, lipasa, mannosidasa, oxidasa, enzima pectinolitica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, filasa, polifenoloxidasa, enzima proteol�tica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La(s) enzima(s) adicional(es) pueden ser producidas, por ejemplo, por un microorganismo que pertenece al género Aspergillus, preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fum�gatus, Aspergillus foetidus, Asperg�llus japon�cus, Aspergillus n�dulans, Aspergillus níger, o Asperg�llus oryzae;Fusar�um, preferiblemente Fusarium bactrid�oides, Fusarium cereal�s, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium ret�culatum, Fusarium roseum, Fusarium sambuc�num, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothec�oides, o Fusarium venenatum; Hum�cola, preferiblemente Humicola insolens o Humicola lanuginosa : o Trichoderma, preferiblemente Trichoderma harzianum, Trichodenna koningii, Trichoderma long�brach�atum, Trichodenna reese�, o Trichoderma v�ride.
[0147] Las composiciones de polip�tido pueden ser preparadas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polip�ptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polip�ptido por ser incluido en la composición puede ser estabilizado de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
[0148] A continuación son dados ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polip�ptido de la invención. La dosificación de la composición del polip�ptido de la invención y otras condiciones bajo las que se usa la composición se pueden determinar sobre la base de métodos conocidos en la técnica.
Degradaci�n o conversión de biomasa a monosac�ridos, disac�ridos y polisac�ridos
[0149] La presente invención también se refiere a métodos para degradar o convertir un material celulósico, comprendiendo: tratamiento del material celulósico con una cantidad eficaz de una proteína celulol�tica en presencia de una cantidad eficaz del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica, donde la presencia del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica aumenta la degradación del material celulósico en comparación con la ausencia del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica.
[0150] Los polip�ptidos y células huésped de la presente invención se pueden utilizar en la producción de monosac�ridos, disac�ridos y polisac�ridos como materias primas químicas o de fermentación a partir de biomasa para la producción de etanol, plástico, otros productos o productos intermedios. En particular, los polip�ptidos y células huésped de la presente invención se pueden utilizar para aumentar el valor de residuos de tratamiento (grano de destiladores secos, granos consumidos de elaboración, bagazo de ca�a de azúcar, etc.) por solubilizaci�n completa o parcial de celulosa o hemicelulosa. En el impulso del tratamiento por proteínas celulol�ticas de material celulósico para glucosa, xilosa, manosa, galactosa y arabinosa, sus pol�meros, o productos derivados de estos como se describe debajo. Los polip�ptidos pueden estar en forma de un caldo de fermentación crudo con o sin las células o en forma de una preparación semi-purificada o purificada enzim�tica. La proteína de mejora celulol�tica puede ser una preparación monocomponente, por ejemplo, una proteína de la familia 61, una preparación de proteína de varios componentes, por ejemplo, varias proteínas de la familia 61 o una combinación de preparaciones de proteína monocomponente y de varios componentes. Las proteínas de mejora celulol�ticas pueden impulsar la actividad de proteínas celulol�ticas, bien en el intervalo de pH ácido, neutro o alcalino. Alternativamente, una célula huésped de la presente invención se puede utilizar como una fuente del polip�ptido en un proceso de fermentación con la biomasa. la célula huésped puede también contener genes heter�logos o nativos que codifican proteína celulol�tica al igual que otras enzimas útiles en el procesamiento de biomasa.
[0151] La biomasa puede incluir, pero no est� limitado a, recursos de madera, desperdicios sólidos municipales, papel usado, cultivos y residuos de cultivo (ver, por ejemplo, Wiselogel et a/., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-118, Tay/or & Francis, Washington O.C.; Wyman, 1994, Bioresource Techn%gy 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et a/., 1999, Recent Progress en Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in B�ochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Vo/ume 65, pp.23-40 , Springer-Verlag, New York).
[0152] El polisac�rido predominante en la pared celular primaria de biomasa es celulosa, el segundo más abundante es hemicelulosa y el tercero es pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha detenido el crecimiento, también contiene polisac�ridos y se refuerza por lignina polim�rica reticulada de manera covalente a hemicelulosa. Celulosa es un homopol�mero de anhidrocelobiosa y as� un beta-(1-4)-D-glucano lineal, mientras hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanas y mananos en las estructuras ramificadas de complejo con un espectro de sustituyentes. Aunque generalmente celulosa polimorfa se encuentra en tejido vegeta l principalmente como una matriz de cristalina insoluble de cadenas de glucano paralelas. Hemicelulosas normalmente une hidrógeno a celulosa, al igual que a otras hemicelulosas, que ayudan estabilizan a la matriz de la pared celular.
[0153] En los métodos de la presente invención, la proteína celulol�tica puede ser cualquier proteína implicada en el procesamiento de material celulósico a glucosa, o hemicelulosa a xilosa, manosa, galactosa y arabinosa, sus pol�meros,
o productos derivados de estos como se describe abajo. La protelna celulolitica puede ser una preparación monocomponente, por ejemplo, una celulasa, una preparación de varios componentes, por ejemplo, endoglucanasa, celobiohidrolasa, glucohidrolasa, beta-glucosidasa, tal y como se define por debajo o una combinación de preparaciones de proteína monocomponente y de varios componentes. Las proteínas celulol�ticas pueden tener actividad, es decir, hidrolizar celulosa, bien en el intervalo de pH ácido, neutro, o alcalino.
[0154] La proteína celulol�tica puede ser de origen bacteriano o f�ngico, que puede ser obtenible o aislado y purificado de microorganismos que se conocen por ser capaces de producir enzimas celulol�ticas, por ejemplo, especies de
Bacil/us, Pseudomonas, Humicola, Coprinus, Thie/avía, Fusarium, Myceliophthora, Acremonium, Cepha/osporium, Scyta/idium, Penicillium o Aspergillus (ver, por ejemplo, EP 458162), especialmente aquellas producidas por una cepa seleccionada de la especie Humicola inso/ens (reclasificada como Scytalidium thermophilum, ver por ejemplo, patente US n�. 4,435,307), Coprinus cinereus, Fusarium oxysporum, Myceliophthora thermophila, Meripilus giganteus. Thielavia terrestris, Acremonium sp., Acremonium persicinum, Acremonium acremonium, Acremonium brachypenium, Acremonium dichromosporum, Acremonium obcJavatum, Acremonium pinkertoniae, Acremonium roseogriseum, Acremonium inc%ratum y Acremonium furatum; preferiblemente de la especie Humico/a insolens DSM 1800, Fusarium oxysporum DSM 2672, Myce/iophthora thermophila CBS 117.65, Cepha/osporium sp. RYM-202, Acremonium sp. CBS
478.94, Acremonium sp. CBS 265.95, Acremonium persicinum CBS 169.65, Acremonium acremonium AHU 9519, Cephalosporium sp. CBS 535.71 , Acremonium brachypenium CBS 866.73, Acremonium dichromosporum CBS 683.73, Acremonium obclavatum CBS 31 1.74, Acremonium pinkertoniae CBS 157.70, Acremonium roseogriseum CBS 134.56, Acremonium inc%ratum CBS 146.62 y Acremonium furatum CBS 299.70H. Proteínas celulol�ticas se pueden obtener también de Trichoderma (particularmente Trichoderma viride, Trichoderma reesei y Trichoderma koning�l), Bacillos alcalofilicos (ver, por ejemplo, patente US n�. 3,844,890 y EP 458162) Y Streptomyces (ver, por ejemplo, EP 458162). Mutantes de proteína químicamente modificados o creados genéticamente se incluyen.
[0155] Proteínas celuloliticas especialmente adecuadas son las celulasas neutras o alcalinas. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en EP 495,257, EP 531,372, WO 96/1 1262, WO 96129397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como los descritos en WO 94/07998, EP 531,315, patente US n�. 4,435,307, patente US n�. 5,457,046, patente US n�. 5,648,263, patente US neo 5,686,593, patente US neo 5,691 ,178, patente US n�. 5,763,254, patente US n�. 5,776,757, WO 89/09259, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
[0156] Las proteínas celulol�ticas y proteínas de mejora celulol�licas usadas en los métodos de la presente invención se pueden producir por fermentación de las cepas microbianas mencionadas anteriormente en un medio nutritivo con fuentes de nitrógeno y carbono adecuadas y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Bennetl, J.w. and LaSure, L. (eds.), More Gene Manipu/ations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Medios adecuados est�n disponibles de proveedores oomerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Intervatos de temperatura y otras condiciones adecuadas para crecimiento y producción de proteína celulol�lica se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Bailey, J.E., and Ollis, D.F.,
Biochemica/ Engineering Fundamenta/s, McGraw-HiII Book Company, NY, 1986).
[0157] La fermentación puede ser cualquier método de cultivo de una célula dando como resultado la expresión o aislamiento de una proteína cetulol�tica o proteína de mejora celutol�tica. Fermentación puede, por to tanto, ser entendida como comprendiendo cultivo en matraz de agitaci�n, fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por lote alimentado, o de estado sólido) en el laboratorio o fermentadores industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten a la proteína celulol�tica o proteína de mejor celulol�tica expresarse o aistarse.
65 El0180389
[0158] Las proteínas resultantes celulol�ticas o proteínas de mejora celulol�licas producidas por los métodos anteriormente descritos pueden ser recuperadas det medio de fermentación por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitado a, centrifugado, filtración, secado por pulverización, evaporación, o precipitación. La proteína recuperada puede luego ser además purificada por una variedad de procedimientos cromatogr�ficos, por ejemplo, cromatografia de intercambio de iones, cromatograf�a de filtración en get, cromatograf�a de afinidad, o similar.
[0159] La proteína celulol�tica puede hidroliz.ar o hidroliza carboximetilcelulosa (CMC), disminuyendo as� la viscosidad de la mezcla de incubaci�n. La reducción resultante en la viscosidad se puede determinar por un viscos�metro de vibración
(p. ej., MIVI 3000, de Sofraser Francia). Determinación de actividad de celulasa, medida en cuanto a unidad de viscosidad de celulasa (CEVU), cuantifica la cantidad de actividad catalítica presente en prueba A por medición de la capacidad de la muestra para reducir la viscosidad de una solución de carboximetilcelulosa (CMC). El ensayo se realiza a la temperatura y el pH adecuados para la proteína celulol�tica y sustrato. Para Celluclast™ (Novozymes AlS, Bagsv~rd, Dinamarca) el ensayo se realiza a 40~C en 0,1 M de tampón fosfato pH 9,0 durante 30 minutos con CMC como sustrato (33,3 gIL de carboximetilcelulosa Hercules 7 LFD) Y una concentración enzim�tica de aproximadamente 3,3-4,2 CEVU/ml. La actividad CEVU se calcula en relación a un estándar de enzima declarado, tal como CELLUZYME TM estándar 17-1194 (obtenido de Novozymes AlS).
[0160] Ejemplos de preparaciones celulol�ticas adecuadas para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, CELLUCLASTTM (disponible de Novozymes AlS) y NOVOZYMTM 188 (disponible de Novozymes AlS). Otras preparaciones disponibles comercialmente que comprenden celulasa que se puede usar incluyen CELLUZYME™, CEREFLO"TM Y ULTRAFLO"TM (Novozymes AlS), LAMINEX"TM y SPEZYME"TM CP (Genencor In1.) y ROHAMENT"TM a 7069 W (Rc5hm GmbH). Las enzimas de celulasa se agregan en cantidades efectivas de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 5,0 % en peso de sólidos, más preferiblemente de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 4,0% en peso de sólidos y de forma más preferida de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 2,0% en peso de sólidos.
[0161] Como se ha mencionado anteriormente, las proteínas celulol�licas o proteínas de mejora celulol�licas usadas en los métodos de la presente invención pueden ser preparaciones monocomponente, es decir, un componente esencialmente libre de otros componentes celuloliticos. El único componente puede ser un componente recombinante, es decir, producido por clonaci�n de una secuencia de ADN que codifica el único componente y célula posterior transformadas con la secuencia de ADN y expresada en un huésped (ver, por ejemplo, WO 91/17243 y WO 91/17244). Otros ejemplos de proteínas celuloliticas de monocomponente incluyen, pero de forma no limitativa, aquellas descritos en JP-07203960-A y WO-9206209. El huésped es preferiblemente un huésped heter�logo (la enzima es extranjera al huésped), pero el huésped puede bajo condiciones determinadas también ser un huésped homólogo (la enzima es nativa al huésped). Proteínas monocomponente celulol�ticas puede también ser preparadas por purificación de tal proteína de un caldo de fermentación.
[0162] Ejemplos de proteínas celulol�ticas monocomponente útiles en la práctica de los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, endoglucanasa, celobiohidrolasa, glucohidrolasa y beta-glucosidasa.
[0163] El término "endoglucanasa" se define aqul como una endo-1 ,4-(1,3, 1,4}-beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa (E.C. N". 3.2.1.4), que cataliza endohidr�lisis de enlaces 1,4-beta-D-glicos�dicos en la celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa y hidroxietil celulosa), liquenina, enlaces beta-1 ,4 en mezcla con beta-1,3 glucanos tales como beta-D-glucanos de cereal o xiloglucanos, y otro material vegetal con componentes celulósicos. Para fines de la presente invención, la actividad de endoglucanasa es determinada usando la hidrólisis de carboximetil celulosa (CMC) según el procedimiento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268.
[0164] Las exo-1,4-beta-D-glucanasas incluyen ambas celobiohidrolasas y glucohidrolasas.
[0165] El término "celobiohidrolasa" se define aqul como una 1 ,4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91), que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucos�dicos en la celulosa, celooligosac�ridos, o cualquier beta-l ,4-glucosa unida con pol�mero, liberando celobiosa de los extremos reductores o no reductores de la cadena. Para fines de la presente invención, actividad de celobiohidrolasa se determina según los procedimientos descritos por Lever el al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279 y por van Tilbeurgh el al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288. En la presente invención, el método de Lever el al. fue empleado para valorar hidrólisis de celulosa en los restos de maíz, mientras el método de van Tilbeurgh el al. fue usado para determinar la actividad de celobiohidrolasa en un derivado de disac�rido fluorescente.
[0166] El término "glucohidrolasa" se define aquí como una 1,4-beta-D-glucano glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.74), que cataliza la hidrólisis de lA-enlaces (enlaces O-glicosil) en l,4-beta-D-glucanos para eliminar unidades de glucosa sucesivas. Para fines de la presente invención, actividad de exoglucanasa se determina según el procedimiento descrito por Himmel el al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 12948-12955.
[0167] El término "beta-glucosidasa" se define aqul como una beta-O-gluc�sido glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de residuos de beta-D-glucosa terminal no-reductores con la liberación de beta-O-glucosa. Para fines de la presente invención, actividad de beta-glucosidasa se determina según el procedimiento básico descrito por
Venturi et al. , 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66, excepto que condiciones diferentes fueron empleadas como se describe en este caso. Una unidad de actividad de beta-gtucosidasa es definida como 1,0 IJmol de p-nitrofenol producido por minuto a SOQC, pH 5 de 4 mM de P-nitrofenil-beta-d-glucopiran�sido como sustrato en 100 mM de citrato sádico, 0,01% de Tween-20.
[0168] los polip�ptidos de ta presente invención se usan conjuntamente con proteínas celutoliticas para degradar et componente celulósico del sustrato de biomasa, (ver, por ejemplo, Brigham el al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.119-141, Taylor & Francis, Washington D.C .; lee, 1997, Joumal of Biotechnology 56: 124).
[0169] las cantidades óptimas de un polip�ptido con actividad de mejora cetulolitica y de proteínas cetuloliticas depende de los diferentes factores incluyendo, pero no limitado a, la mezcla de componentes de proteínas celulol�ticas, el sustrato celulósico, la concentración de sustrato celulósico, el pretratamiento(s) del sustrato celulósico, temperatura, tiempo, pH, e inclusión de organismo de fermentación (p. ej., levadura para sacarificaci�n y fermentación simultáneas). El término �prote�nas celulol�ticas� se define aquí como aquellas proteínas o mezclas de proteínas que muestran ser capaces de hidrolizaci�n o conversión o degradación de celulosa bajo las condiciones evaluadas. Sus cantidades son normalmente medidas por un ensayo común tal como BCA (ácido bicincon�nico, P.K. Smith et al., 1985, Anal. Biochem.
150: 76), y la cantidad preferida at'iadida en proporción a la cantidad de biomasa que se hidroliza.
[0170] la cantidad de polip�ptido con actividad de mejora celulolitica por 9 de material celulósico puede ser de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2,0 mg, preferiblemente de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 1,5 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,25 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 1,25 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,25 mg, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 1,25 mg, y de la forma más preferida aproximadamente desde 0,25 a aproximadamente 1,0 mg por 9 de material celulósico.
[0171] la cantidad de proteínas celulol�ticas por 9 de material celulósico puede ser de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 40 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 25 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 20 mg, más preferiblemente aproximadamente 0,75 a aproximadamente 15 mg, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg, y de forma más preferida de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 10 mg por 9 de material celulósico.
[0172] la cantidad de polip�ptido con actividad de mejora celulolitica por 9 de proteínas celuloliticas puede ser de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 1,0 g, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 g, más preferiblemente de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,75 g, más preferiblemente de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,5 g, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 g, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 g, Y de forma más preferida de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 9 por 9 de proteínas celulol�ticas.
[0173] los métodos de la presente invención se pueden utilizar para procesar un material celulósico para muchos productos orgánicos, productos químicos y combustibles útiles. Además de etanol, algunos productos químicos de consumo diario y de especialidad que se pueden producir a partir de celulosa incluyen xilosa, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgánicos (p. ej., ácido l�ctico), 1,3-propanediol, butanodiol, glicerol, elilenglicol, furfurol, polihidroxialcanoatos, cis, ácido cis-muc6nico, y pienso para animales (lynd, l. R. , Wyman, C. E. , and Gemgross, T. U., 1999, Biocommodity Engineering, Biotechnol. Prog., 15: 777-793; Philippidis, G. P., 1996, Cel/ulose bioconversion techno/ogy, en Handbook en Bioethano/: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, OC, 179-212; Y Ryu, D. D. Y., and Mandels, M., 1980, Cel/u/ases: biosynthesis and applications, Enz. Microb. Techno/.,
2: 91-102). Beneficios de coproducci�n potenciales se extienden más all� de la síntesis de productos múltiples orgánicos de carbohidrato fermentable. Residuos ricos en lignina restantes después de tratamiento biológico pueden convertirse a productos químicos derivados de lignina, o usados para producción de energía.
[0174] Métodos convencionales usados para procesar el material celulósico conforme a los métodos de la presente invención son bien entendidos por los expertos en la técnica. los métodos de la presente invención pueden ser implementados usando cualquier aparato de tratamiento de biomasa convencional configurado para operar conforme a la invención.
[0175] Tal aparato puede incluir un reactor agitado por lotes, un reactor agitado de flujo continuo con ultrafiltraci�n, un reactor de columna de flujo de tapón continua (Gusakov, A. V., and Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydro/ysis of cel/u/ose: 1. A mathematica/ model for a batch reactor process, Enz. Microb. Techno/. 7: 346-352), un reactor de fricción (Ryu, S. K., and lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cel/u/ose by using an aftrition bioreactor, Biotechno/. Bioeng. 25: 53-65), o un reactor con agitaci6n intensiva inducido por un campo electromagnético (Gusakov,
A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, l. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancemenl of enzymatic cel/u/ose hydro/ysis using a nove/ type of bioreactor with intensive stiffing induced by electromagnetic fíe/d, App/. Biochem. Biotechno/. 56: 141-153).
[0176] Los métodos convencionales incluyen, pero de forma no limitativa, sacarificaci�n, fermentación, hidrólisis y fermentación separadas (SHF), sacarificaci�n y fermentación simultáneas (SSF), sacarificaci�n y cofermentaci�n simultáneas (SSCF), hidrólisis híbrida y fermentación (HHF) y conversión directa microbiana (DMC).
[0177] SHF usa pasos de proceso separados para primero hidrolizar enzim�ticamente celulosa a glucosa y luego fermentar glucosa a etanol. En SSF, la hidrólisis enzim�tica de celulosa y la fermentación de glucosa a etanol se combina en un paso (Philippidis, G. P., 1996, Cel/ulose bioconversion technology, en Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, G. E., ed., Taylor & Francis, Washington, OC, 179-212). SSCF induye la coferemenlalion de azúcares múltiples (Sheehan, J., and Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environmenl: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research and development activ�ties far b�oethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF incluye dos pasos separados realizados en el mismo reactor pero a temperaturas diferentes, es decir, sacarificaci�n enzim�tica de alta temperatura segu ida de SSF a una temperatura inferior que la cepa de fermentación puede tolerar. DMC combina todos los tres procesos (producción de celulasa, hidrólisis de celulosa y fermentación) en un paso (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., and Pretorius, 1. S., 2002, Microbial cel/ulose utilization: Fundamentals and biotechnology. Microbio/. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577).
[0178] "Fermentación" o "proceso de fermentación" se refieren a cualquier proceso de fermentación o cualquier proceso comprendiendo un paso de fermentación. Un proceso de fermentación incluye, sin limitación, procesos de fermentación usados para producir productos de fermentación incluyendo alcocholes (p. ej., arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1 ,3-propanediol, sorbitol, y xilitol); ácidos orgánicos (p. ej., ácido acético, ácido acet�nico, ácido ad�pico, ácido asc�rbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-gluc�nico, ácido f�rmico, ácido fum�rico, ácido gluc�rico, ácido gluc�nico, ácido glucur�nico, ácido glut�rico, ácido 3-hidroxipropi�nico, ácido itac�nico, ácido l�ctico, ácido m�lico, ácido mal�nico, ácido ox�lico, ácido propi�nico, ácido succ�nico y ácido xil�nico); cetonas (p. ej., acetona); amino�cidos (p. ej., ácido asp�rtico, ácido glut�mico, glicina, lisina, serina y treonina); gases (p. ej., metano, hidrógeno (H2), di�xido de carbono (C02) y monóxido de carbono (CO�. Procesos de fermentación también incluyen procesos de fermentación usados en la industria del alcohol consumible (p. ej., cerveza y vino), industria de lechería (p. ej., productos lácteos fermentados), industria de cuero e industria del tabaco.
[0179] La presente invención además se refiere a métodos para producir una sustancia orgánica, comprendiendo: (a) sacarificaci�n de un material celulósico con una cantidad eficaz de una proteína celulol�tica en presencia de una cantidad eficaz de un polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica, donde la presencia del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica aumenta la degradación de material celulósico en comparación con la ausencia del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica; (b) fermentación del material sacarificado celulósico del paso (a) con uno o más microorganismos fermentadores; y (e) recuperación de la sustancia orgánica de la fermentación. El polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica puede estar en forma de un caldo de fermentación crudo con o sin células o en forma de una preparación enzim�tica semi-purificada o purificada. La proteína de mejora celulol�tica puede ser una preparación monocomponente, por ejemplo, una proteína de la familia 61 , una preparación de proteína de varios componentes, por ejemplo, varias proteínas de la familia 61, o una combinación de preparaciones de proteína monocomponente y de varios componentes.
[0180] La sustancia orgánica puede ser cualquier sustancia derivada de la fermentación. En un aspecto preferido, la sustancia orgánica es un alcohol. Se entender� que el término "alcohol" abarca una sustancia orgánica que contiene una o más fracciones de hidr�xilo. En una forma de realización más preferida, el alcohol es arabinitol. En otra forma de realización más preferida, el alcohol es butanol. En otra forma de realización más preferida, el alcohol es etanol. En otra forma de realización más preferida, el alcohol es glicerol. En otra forma de realización más preferida, el alcohol es metanol. En otra forma de realización más preferida, el alcohol es 1,3-propanediol. En otra forma de realización más preferida, el alcohol es sorbitol. En otra forma de realización más preferida, el alcohol es xilitol. Ver, por ejemplo, Gong,
C. S., Cao, N. J., Du, J., and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemica/ EngineeringJBiotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, M. M., and Jonas, R., 2002, The biotechnological production of somitol, Appl. Microbio/. Biotechnof. 59: 40040B; Nigam, P.; and Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol -a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. and Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerincki� BA 101 and in situ recovery by gas stripping, World Joumal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.
[0181] En otra forma de realización preferida, la sustancia orgánica es un ácido orgánico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido acético. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido acet�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es acido ad�pico. En otra fonna de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido asc�rbico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido cítrico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido 2,5-diceto-D-gluc�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido f�rmico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido fum�rico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido gluc�rico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido gluc�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido glucur�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido glut�rico. En otra forma de realización preferida, el ácido orgánico es �cid03-hidroxipropi�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido itac�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido
org�nico es ácido l�ctico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido m�lico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido mal�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido ox�lico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido propi�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido succ�nico. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido xil�nico. Ver, por ejemplo, Chen, R. , and Lee, Y. Y., 1997, Membrane-med�ated extract�ve fermentat�an far lact�c ac�d product�on from cellulos�c b�omass, Appl. B�ochem. B�otechnol. 63-65: 435-448.
[0182] En otra forma de realización preferida, la sustancia orgánica es una cetona. Se entender� que el término "cetona" abarca una sustancia orgánica que contiene una o más fracciones de cetona. En otra forma de realización más preferida, la cetona es acetona. Ver, por ejemplo, Qureshi y Blaschek, 2003, supra.
[0183] En otra forma de realización preferida, la sustancia orgánica es un amino�cido. En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido asp�rtico. En otra forma de realización más preferida, el amino�cido es ácido glut�mico. En otra forma de realización más preferida, el amino�cido es glicina. En otra forma de realización más preferida, el amino�cido es lisina. En otra forma de realización más preferida, el amino�cido es serina. En otra forma de realización más preferida, el amino�cido es treonina. Ver, por ejemplo, Richard, A., and Margaritis, A. , 2004, Emp�rical modeling of batch fermentat�on k�net�cs for poly(glutamic ac�d) product�on and other microb�al biopolymers, B�otechno/ogy and Bioengineering 87 (4): 501-515.
[0184] En otra forma de realización preferida, la sustancia orgánica es un gas. En otra forma de realización más preferida, el gas es metano. En otra forma de realización más preferida, el gas es metano. En otra forma de realización más preferida, el gas es H2. En otra forma de realización más preferida, el gas es C02. En otra forma de realización más preferida, el gas es CO. Ver, por ejemplo, Kataoka, N., A. Miya, and K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerob�c bacteria, Water Sc�ence and Technology 36 (6-7): 41-47; Y Gunaseelan V.N. en B�omass and B�oenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerob�c digest�on of biomass for methane production: A review.
[0185] Producción de una sustancia orgánica de material celulósico típicamente requiere cuatro pasos importantes. Estos cuatro pasos son pretratamiento, hidrólisis enzim�tica, fermentación y recuperación. Ejemplificado debajo est� un proceso para producir etanol, pero se entender� que procesos similares pueden utilizarse para producir otras sustancias orgánicas, por ejemplo, las sustancias anteriormente descritas.
[0186] Pretratamiento. En el paso de pretratamiento o de pre-hidrólisis, el material celulósico se calienta para descomponer la lignina y la estructura de carbohidrato, solubilizar la mayor parte de la hemicelulosa y hacer la fracción de celulosa accesible a enzimas celulol�ticas. La calefacción es realizada bien directamente con vapor o en el compuesto acuoso donde un catalizador puede también ser añadido al material para acelerar las reacciones. Catalizadores incluyen ácidos fuertes, tales como ácido sulfúrico y S02, o álcali, tal como hidróxido sádico. El propÓSito de la fase de pretratamiento es facilitar la penetraci�n de las enzimas y microorganismos. Biomasa celulósica puede también ser sujeto para un pretratamiento de explosión de vapor hidrot�rmico (ver solicitud de patente US n�. 20020164730).
[0187] Sacarificaci�n. En el paso de hidrólisis enzim�tica, también conocido como sacarificaci�n, enzimas como se describe en este caso se agregan al material pretratado para convertir la fracción de celulosa a glucosa y/o otros azúcares. La sacarificaci�n es generalmente realizada en los reactores de tanque agitado o fermentadores bajo condiciones de pH, temperatura y mezcla controladas. Un paso de sacarificaci�n puede durar hasta 200 horas. La sacarificaci�n se puede llevar a cabo a temperaturas de aproximadamente 30�C a aproximadamente 65�C, en particular, alrededor de sooC, y a un pH en el intervalo entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5, especialmente alrededor de pH 4,5. Para producir glucosa que se puede metabolizar por levadura, la hidrólisis es típicamente realizada en presencia de una beta-glucosidasa.
[0188] Fermentación. En el paso de fermentación, azúcares, liberados del material celulósico como resultado del pretratamiento y pasos de hidrólisis enzim�tica, se fermenlan a etanol por un organismo de fermentación, tal como levadura. la fermentación puede también efectuarse simultáneamente con la hidrólisis enzim�tica en el mismo recipiente, nuevamente bajo condiciones de pH, temperatura y mezcla controladas. Cuando la sacarificaci�n y la fermentación se realizan simultáneamente en el mismo recipiente, el proceso es generalmente denominado sacarificaci�n y fermentación simultáneas o SSF.
[0189] Cualquier sustrato celulósico o materia prima adecuados se puede utilizar en un proceso de fermentación de la presente invención. El sustrato es generalmente seleccionado basado en el producto de fermentación deseado, es decir, la sustancia orgánica para ser obtenida de la fermentación, y el proceso empleado, como es bien conocido en la técnica. Ejemplos de sustratos adecuados para uso en los métodos de presente invención, incluyen materiales con celulosa, tal como madera o residuos de planta o azúcares de peso molecular bajo DP1-3 obtenidos de material celulósico procesado que se puede metabolizar por el microorganismo fermentador y que se puede suministrar por adición directa al medio de fermentación.
[0190] El término "medio de fermentación" se entender� para referirse a un medio antes de que el microorganismo(s) fermentador(es) es(son) at'iadido, tal como, un medio que resulta de un proceso de sacarificaci�n, at iguat que un medio usado en una proceso de sacarificaci�n y fermentación simultáneas (SSF).
[0191] "Microorganismo fermentador" se refiere a cualquier microorganismo adecuado para uso en un proceso de fermentación deseado. Microorgan ismos fermentadores adecuados según la invención son capaces de fermentar, es decir, convertir azúcares, tales como glucosa, xilosa, arabinosa, manosa, galactosa, u oligosac�ridos directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de microorganismos fermentadores inCluyen organismos f�ngicos, tal como levadura. Levadura preferida incluye cepas de la Saccharomices spp. y, en particular, Saccharomyces cerevisiae. levadura disponible comercialmente inCluye, por ejemplo, Red Star�{''''llesaffre Ethanol Red (disponible de Red Star/lesaffre, EEUU) FAU (disponible de Fleischmann's Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., EEUU), SUPERSTART (disponible de Alltech), GERT STRAND (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties).
[0192] En una forma de realización preferida, la levadura es una Saccharomyce spp. En una forma de realización más preferida, la levadura es Saccharomices cerevisiae. En una forma de realización más preferida, la levadura es Saccharomyces distaticus. En una forma de realización más preferida, la levadura es Saccharomyces uvarum. En una forma de realización más preferida, la levadura es un K/uyveramices. En una forma de realización más preferida, la levadura es K/uyveramices marxianus. En una forma de realización más preferida, la levadura es K/uiveramices fragi/is. En una forma de realización más preferida, la levadura es una Candida. En una forma de realización más preferida, la levadura es Candida pseudotrapicalis. En una forma de realización más preferida, la levadura es Candida brassicae. En una forma de realización preferida, la levadura es una C/avispara. En una forma de realización más preferida, la levadura es C/avispara /usitaniae. En una foona de realización más preferida, la levadura es C/avispara opuntiae. En una forma de realización preferida, la levadura es un Pachyso/en. En una foona de realización más preferida, la levadura es Pachysa/en tannophilus. En una forma de realización preferida, la levadura es un Bretannomyces. En una forma de realización más preferida, la levadura es Bretannamyces c/ausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellu/ose biacanversion techna/ogy, en Handboak on Bioethano/: Production and Uti/izatian, Wyman, C. E., ed. , Tay/or & Francis, Washington, OC, 179-212).
[0193] Bacterias que pueden fermentar eficazmente glucosa a etanol incluyen, por ejemplo, Zymomonas mobilis y Clostridium thermacellum (Philippidis, 1996, supra ).
[0194] Es bien conocido en la técnica que los organ ismos descritos anteriormente también pueden usarse para producir otras sustancias orgánicas, como se describe en este caso.
[0195] La donación de genes heter�logos en Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae (ehen, l., Ho, N.
W. Y. , 1993, Cloning and impraving the expression of Pichia stipitis xy/ose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, App/. Biochem. B�otechnol. 39-40: 135-147; Ho, N. W. Y. , Chen, l, Brainard, A. P., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capab/e of effective/y cofermenting g/ucase and XY/OS9, App/. Enviran. Microbio/. 64: 1852-1859),
o en bacterias tales como Escherichia coli (Beall, D. S., Ohta, K., Ingram, L. O., 1991, Parametric studies af ethanol praduction trom xy/ose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303), K/ebsiella oxytoca (Ingram, L. O., Gomes, P. F., lai, X., Moniruzzaman, M., Wood, B. E., Yomano, L. P., York, S. W., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214), y lymomonas mobilis (lhang, M., Eddy, e., Deanda, K., Finkelstein, M., and Picataggio, S., 1995, Metaba/ic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic lymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda, K., Zhang, M., Eddy, C., and Picataggio, S., 1996, Deve/opment of an arabinose-fermenting Zymomanas mabilis strain by metabolic pathway engineering, App/. Enviran. Microbiol. 62: 4465-4470) han llevado a la construcción de organismos capaces de convertir hexosas y pentosas a etanol (cofermentaci�n).
[0196] Levadura u otro microorganismo típicamente se at'iade a la celulosa degradada o hidrolizada y la fermentación est� en curso durante de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas, tal como de aproximadamente 35 a aproximadamente 60 horas. la temperatura est� típicamente entre de aproximadamente 26"C a aproximadamente 40"C, en particular, a aproximadamente 32"C, y de sobre pH 3 a sobre pH 6, en particular, alrededor de pH 4-5.
[0197] En una forma de realización preferida, levadura u olro microorganismo se aplica a la celulosa degradada o hidrolizada y la fermentación est� en curso durante de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas, tal como típicamente 35-60 horas. En unas formas de realización preferidas, la temperatura est� generalmente entre de aproximadamente 26 a aproximadamente 40"e, en particular, aproximadamente 32"e y el pH est� generalmente de sobre pH 3 a sobre pH 6, preferiblemente alrededor de pH 4-5. Levadura u otro microorganismo se aplica preferiblemente en cantidades de aproximadamente 105 a 1012, preferiblemente de aproximadamente 107 a 1010, especialmente aproximadamente 5x107 a recuento viable por mi de caldo de fermentación. Durante una fase de producción de etanol, el recuento de células de levadura debería preferiblemente estar en el intervalo de aproximadamente 107 a 1010, especialmente alrededor de aproximadamente 2 x 108. Otras orientaciones respecto al uso de levadura para fermentación se pueden encontrar en, por ejemplo, ~The Alcohol Textbook" (Editors K. Jacques,
T.P. lyons and D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999), que es por la presente incorporado como referencia.
[0198] El proceso usado más ampliamente en la técnica es la sacarificaci�n y fermentación simultáneas (SSF) proceso donde no hay fase de retención para la sacarificaci�n, lo que significa que levadura y enzima se agregan juntas.
[0199] Para producción de etanol, después de la fermentación, la masa se destila para extraer el etanol. El etanol obtenido según el proceso de la invención puede ser utilizado como, por ejemplo, etanol de combustible; etanol potable, es decir, licores potables neutros, o etanol industrial.
[0200] Un estimulador de fermentación se puede utilizar en combinación con cualquiera de los procesos enzim�ticos descritos aqui para mejorar además el proceso de fermentación y, en particular, el rendimiento del microorganismo fermentador, tal como, mejorar la velocidad y rendimiento del etanol. Un ~estimulador de fermentación" se refiere a estimuladores para crecimiento de los microorganismos fermentadores, en particular, levadura. Estimuladores de fermentación preferidos para crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Ejemplos de vitaminas incluyen multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotinico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fálico, riboflavina y vitaminas A, B, e D, y E. Ver, por ejemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que se incorpora a la presente como referencia. Ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden suministrar nutrientes comprendiendo P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn y Cu.
[0201] Recuperación. El alcohol es separado del material celulósico fermentado y purificado por métodos convencionales de destilación. Etanol con una pureza de hasta aproximadamente 96 % vol. de etanol puede obtenerse, que se puede usar como, por ejemplo, etanol de combustible, etanol potable, es decir, licores potables neutros, o etanol industrial.
[0202] Para otras sustancias orgánicas, cualquier método conocido en la técnica se puede usar incluyendo, pero no limitado a, cromatografia (p. ej., intercambio de iones, afinidad, cromatoenfoque hidrof�bico y exclusión de tamaf'io), procedimientos electrofor�ticos (p. ej., isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato am�nico), SDS-PAGE, destilación, o extracción.
[0203] En los métodos de la presente invención, las proteína(s) celulol�ticas y polip�ptido(s) de mejora celulol�tico se puede complementar por una o más actividades enzim�ticas adicionales para mejorar la degradación del material celulósico. Enzimas preferidas adicionales son hemicelulasas, esterasas (p. ej., Ilpasas, fosfolipasas y/o cutinasas), proteasas, lacasas, peroxidasas, o mezclas derivadas.
[0204] En los métodos de la presente invención, la enzima{s) adicional puede ser af'iadida antes o durante fermentación, incluso durante o después de la propagación del microorganismo{s) fermentador.
[0205] Las enzimas referenciadas aqui pueden ser derivadas u obtenidas de cualquier origen adecuado, incluyendo origen bacteriano f�ngico, de levadura o mamífero. El término "obtenido� significa aquí que la enzima puede haber sido aislada de un organismo que produce naturalmente la enzima como una enzima nativa. El término "obtenido" significa también aqui que la enzima puede haber sido producida de manera recombinante en un organismo huésped, donde la enzima producida de manera recombinante es bien nativa o extranjera al organismo huésped o tiene una secuencia de amino�cidos modificada, por ejemplo, teniendo uno o más amino�cidos que son eliminados, insertados y/o sustituidos, es decir, una enzima producida de manera recombinante que es un mutante y/o un fragmento de una secuencia de amino�cidos nativa o una enzima producida por procesos de redistribución de ácido nucleico conocidos en la técnica. Abarcado en el significado de una enzima nativa son variantes naturales y en el significado de una enzima extranjera son variantes obtenidas de manera recombinante, tal como por mutag�nesis dirigida o redistribución.
[0206] Las enzimas pueden también ser purificadas. El término "purificado� como se utiliza en este caso cubre enzimas libres de otros componentes del organismo del que se deriva. El término "purificado" también cubre enzimas libres de componentes del organismo nativo del que es obten ida. Las enzimas puede ser purificadas, con cantidades solo menores de otra proteina que est�n presentes. La expresión "otras proteinas" se refiere en particular a otras enzimas. El término "purificado" como se utiliza en este caso también se refiere a eliminación de otros componentes, particularmente otras proteínas y más particularmente otras enzimas presentes en la célula de origen de la enzima de la invención. La enzima puede ser "substancialmente pura", que es, libre de otros componentes del organismo en el que es producida, que es, por ejemplo, un organismo huésped para enzimas producidas de manera recombinante. En un aspecto preferido, las enzimas son al menos 75% (p/p), preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, incluso más preferiblemente al menos 98%, o de forma más preferida al menos 99% puras. En otro aspecto preferido, la enzima es 100% pura.
[0207] Las enzimas usadas en la presente invención pueden estar en cualquier forma adecuada para uso en los procesos descritos aquí, tal como, por ejemplo, un caldo de fermentación crudo con o sin células, un polvo seco o granulado, un granulado no polvoriento, un líquido, un liquido estabilizado, o una enzima protegida. Granulados pueden ser producidos, por ejemplo, como se describen en las patentes US nO. 4,106,991 y 4,661,452, Y pueden ser revestidos opcionalmente por procesos conocidos en la técnica. Preparaciones enzim�ticas líquidas pueden, por ejemplo, ser
estabilizadas añadiendo estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido l�ctico u otro ácido orgánico según proceso establecido. Enzimas protegidas se pueden preparar según el proceso descrito en la EP 238,216.
Hemicelulasas
[0208] Hidrólisis enzim�tica de hemicelulosas se puede realizar por una amplia variedad de hongos y bacterias. Similar a la degradación de celulosa, hidrólisis de hemicelulosa requ iere acción coordinada de muchas enzimas. Hemicelulasas se pueden colocar en tres categorías generales: las enzimas de acción endo que atacan enlaces internos en la cadena polisac�rida, las enzimas de acción exo que actúan progresivamente de bien el extremo reductor o no reductor de la cadena polisac�rida, y las enzimas accesorio, acetilesterasas y esterasas que hidrolizan enlaces de lignina gluc�sido, tales como esterasa de ácido cum�rico y esterasa de ácido fer�lico (Wong, K. K. Y., Tan, L. U. L., and Saddler, J. N.,
1988, Muft�plicity of ?-1,4-xylanase in microorganisms: Functions and applications, Microbiol. Rev. 52: 305-317; Tenkanen, M., and Poutanen, K., 1992, Significance ofesterases �n the degradat�on of xylans, en Xylans and Xylanases, Visser, J., Beldman, G., Kuster-van Someren, M. A, and Voragen, A G. J., eds., Elsevier, New York, NY, 203-212; Coughlan, M. P., and Hazlewood, G. P., 1993, Hemicellulose and hemicellulases, Portland, London, UK; Brigham, J. S., Adney, W. S., and Himmel, M. E., 1996, Hemicellulases: D�versity and appl�cat�ons, en Handbook on B�oethanol: Product�on and Utilizat�on, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Wash�ngton, OC, 119-141).
[0209] Hemicelulasas incluyen xilanasas, arabinofuranosidasas, acetil xilano esterasa, glucuronidasas, endogalactanasa, mananasas, endo o endo arabinasas, endo-galactanses y sus mezclas derivadas. Ejemplos de hemicelulasas de acción endo y enzimas auxiliares incluyen endoarabinanasa, endoarabinogalactanasa, endoglucanasa, endomananasa, endoxilanasa y feraxan endoxilanasa. Ejemplos de hemicelulasas de acción endo y enzimas auxiliares incluyen ~-L-arabinosidasa, a-L-arabinosidasa, a-l ,2-L-fucosidasa, a-D-galactosidasa, ~-Dgalactosidasa, ~-D-glucosidasa, ~-D-glucuronidasa, ~-D-manosidasa, ~-D-xilosidasa, exoglucosidasa, exocelobiohidrolasa, exomanobiohidrolasa, exomananasa, exoxilanasa, xilano a-glucuronidasa y coniferin ~-glucosidasa. Ejemplos de esterasas incluyen acetil esterasas (acetilgalactano esterasa, acelilmanano esterasa y acetilxilano esterasa) y anl esterasas (esterasa de ácido cum�nco y esterasa de ácido fer�lico).
[0210] Preferiblemente, la hemicelulasa es una hemicelulasa de acción exo y, más preferiblemente, una hemicelulasa de acción exo que tiene la capacidad para hidrolizar hemicelulosa bajo cond iciones ácidas por debajo de pH 7. Un ejemplo de una hemicelulasa adecuada para uso en la presente invención incluye VISCOZYMETIoI (disponible de Novozymes NS). La hemicelulasa se añade en una cantidad eficaz de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 5,0% en peso de sólidos, más preferiblemente de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 4,0% en peso de sólidos y de forma más preferida de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 2,0% en peso de sólidos.
[0211] Una xilanasa (E.C. 3.2.1.8) se puede obtener de cualquier fuente adecuada, incluyendo organismos bacterianos y f�ngicos, tales como Asperg�llus, D�sporotrichum, Penic�llium, Neurospora, Fusarium, Trichoderma, Humicola, Thermomyces y 8acillus. Preparaciones preferidas disponibles comercialmente comprendiendo xilanasa incluyen SHEARZYME�, BIOFEED WHEAT�, BIOFEED Plus�L, CELLUCLAST�, ULTRAFLO�, VISCOZYME�, PENTOPAN MONO� BG, y PULPZYME� HC (Novozymes NS) y LAMJNEX� and SPEZYME� CP (Genencor In!.).
Esterasas
[0212] Esterasas que se pueden usar para bioconversi�n de celulosa incluyen acetil esterasas tales como acetilgalactano esterasa, acetilmanano esterasa y acetilxilano esterasa, y esterasas que hidrolizan enlaces de lignina gluc�sido, tales como esterasa de ácido cum�rico y esterasa de ácido fer�lico.
[0213] Como se utiliza en este caso, una Mesterasa" conocida también como éster hidrolasa carbox�lica, se refiere a enzimas que actúan en enlaces est�ricos e incluye enzimas clasificadas en EC 3.1.1 éster hidrolasas carbox�licas según nomenclatura enzim�tica (Enzyme Nomenclature, 1992, Academic Press, San Diego, California, with Supplement 1 (1993 J, Supplement 2 (1994 J, Supplement 3 (1995 J, Supplement 4 (1997 J and Supplement 5, �n Eur. J. 8�ochem. 223: 1-5, 1994; Eur. J. 8�ochem. 232: 1-6, 1995; Eur. J. 8�ochem. 237: 1-5, 1996; Eur. J. 8iochem. 250: 1-6, 1997 Y Eur. J. Biochem. 264: 610-650, 1999; respectivamente). Ejemplos no limitativos de esterasas incluyen arilesterasa, IriaciJglicerol-lipasa, acelileslerasa, acetilcolinesterasa, coJinesterasa, tropineslerasa, pectineslerasa, eslerol-esterasa, clorofilasa, L-arabinonolactonasa, gluconolactonasea, uronolactonasa, tanasa, retilnil-palmitato esterasa, hidroxibutiratod�mero hidrolasa, acilglicerol lipasa, 3-oxoadipato enol-Iactonasa, 1,4-lactonasa, galactolipasa, 4-piridoxolactonasa, acilcamitina hidrolasa, aminoacil-ARNt hidrolasa, D-arabinonolactonasa, 6-fosfogluconolactonasa, fosfolipasa A1, 6acetilglucosa deacetilasa, lipoprote�na-lipasa, dihidrocoumarina lipasa, limonina-D-anillo-Iactonasa, esteroide-Iactonasa, triacetato-Iactonasa, actinomicina lactonasa, orsellinato-depsido hidrolasa, cefalosporina-C deacetilasa, clorogenato hidrolasa, alfa-amino�cido esterasa, 4-metiloxaloacetato esterasa, carboximetiJenebutenolidasa, deoxilimonato A-anillolactonasa, 2-acetil-1-alquilglicerofosfocolina esterasa, fusarinina-C ornitinesterasa, sinapina esterasa, cera-éster hidrolasa, forbol-di�ster hidrolasa, fosfatidilinositol deacilasa, sialato O-acetilesterasa, acetoxibutinilbitiofeno deacetilasa, acetilsaliciJato deacetilasa, metiJumbeliferil-acetato deacetilasa, 2-pirona 4,6-dicarboxilato lactonasa, Nacetilgalactosaminoglicano deacetilasa, esterasa de hormona juvenil, bis(2-etilhexil) esterasa de ftalato, glutamato metilesterasa de proteína, 11-hidrolasa de cis-retinilo-palmitato, hidrolasa de todos-trans-retinilo-palmitato, L-rhamnono
1,4-lactonase, 5-(3,4-diacetoxibut-1-inil)-2,2'-bitiofeno deacetilasa, etil-éster-sintasa de ácido graso, xilono-1,4-lactonasa, N-acetilglucosaminilfosfatidilinositol deacetilasa, cetraxato bencilesterasa, acetilalquiilglicerol acetilhidrolasa y acetilxilano esterasa.
[0214] Esterasas preferidas para uso en la presente invención son enzimas lipol�ticas, tales como lipasas (clasificadas como EC 3.1.1.3, EC 3.1 .1.23 y/o EC 3.1 .1.26) y fosfolipasas (clasificadas como EC 3.1.1.4 y/o EC 3.1 .1.32, incluyendo lisofosfolipasas clasificadas como EC 3.1.1.5). Otras esterasas preferidas son cutinasas (clasificadas como EC
3.1 .1.74).
[0215] La esterasa se puede at'iadir en una cantidad eficaz para obtener el beneficio deseado para mejorar el rendimiento del microorganismo fermentador, por ejemplo, para cambiar la composici�nlconcentraci�n lip�dica interior ylo exterior del microorganismo fermentador o en la membrana celular del microorganismo fermentador, para suponer una mejora en el movimiento de solutos en ylo fuera de los microorganismos fermentadores durante fermentación ylo para proporcionar fuentes de energía más metabolizables (tales como, por ejemplo, conversión de componentes, tales como aceite del sustrato de maíz, a componentes útiles, el microorganismo fermentador, por ejemplo, ácidos insaturados grasos y glicerol), para aumentar rend imiento de etanol. Ejemplos de cantidades eficaces de esterasa son de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 400 LU/g OS (sólidos secos). Preferiblemente, la esterasa se usa en una cantidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 LU/g OS, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 LUfg OS, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 LU/g OS. Optimización adicional de la cantidad de esterasa se puede obtemer de aquí en adelante utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica.
[0216] Una unidad lip�sica (LU) es la cantidad de enzima que libera 1,0 IJmol de ácido graso con tributirino por minuto como sustrato y goma ar�bica como emulsionante a 30"C, pH 7,0 (tampón fosfato).
[0217] En una forma de realización preferida, la esterasa es una enzima lipol�tica, más preferiblemente, una lipasa. Como se utiliza en este caso, una "enzima lipol�tica" se refiere a lipasas y fosfolipasas (incluyendo lisofosfolipasas). La enzima lipol�tica es preferiblemente de origen microbiano, en particular de origen bacteriano, f�ngico o de levadura. La enzima lipol�tica usada puede derivar de cualquier fuente, incluyendo, por ejemplo, una cepa de Absidia, en particular, Absidia blakesleena y Absidia corymbifera , una cepa de Achromobacter, en particular, Achromobacter iofagus, una cepa de Aeromonas, una cepa de Afternaria, en particular, Altemaria brassiciola, una cepa de Aspergillus, en particular, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumiga tus y Aspergillus flavus, una cepa de Achromobacter, en particular, Achromobacter iofagus, una cepa de Aureobasidium, en particular, Aureobasidium pullulans, una cepa de Bacillus, en particular Bacillus pumilus, Bacillus stearothennophilus y Bacillus subtilis, una cepa de Beauveria, una cepa de Brochothrix, en particular, Brochothrix thennosohata, una cepa de Gandida, en particular, Candida cylindracea (Gandida rugosa), Candida paralipolytica y Gandida antarctica, una cepa de Ghromobacter, en particular, Ghromobacter viscosum, una cepa de Coprinus, en particular, Goprinus cinereus, una cepa de Fusarium, en particular, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium solani pisi, Fusarium roseum culmorum y Fusarium venenatum, una cepa de Geotricum, en particular, Geotricum penicillatum, una cepa de Hansenula, en particular, Hansenula anomala, una cepa de Humicola, en particular, Humico/a brewspora, Humicola brevis varo thermoidea y Humicola insolens, una cepa de Hifozima, una cepa de Lactobacillus, en particular, Lactobacillus curvatus, una cepa de Metarhizium, una cepa de Mucar, una cepa de Paec�lomyces, una cepa de Penicillium, en particular, Penicillium cyclopium, Penicillium crustosum y Penicillium expansum, una cepa de Pseudomonas, en particular, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas cepacia (sin. Burkholderia cepacia), Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas maltoph�lia, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas mephitica lipolytica, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas plantari, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri y Pseudomonas wisconsinensis, una cepa de Rhizooctonia, en particular, Rhizooctonia solani, una cepa de Rhizomucor, en particular, Rhizomucor miehei, una cepa de Rhizopus, en particular, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus y Rhizopus nodosus, una cepa de Rhodosporidium, en particular, Rhodosporidium toruloides, una cepa de Rhodotorula, en particular, Rhodotorula glutinis, una cepa de Sporobolomyces, en particular, Sporobolomyces shibatanus, una cepa de Thennomyces, en particular, Thermomyces lanuginosus (anteriormente Humicola lanuginosa), una cepa de Thiarosporella, en particular, Thiarosporella phaseolina, una cepa de Trichodenna, en particular, Trichoderma harzianum y Trichodenna reesei, ylo una cepa de Verticillium.
[0218] En una forma de realización preferida, la enzima lipol�tica deriva de una cepa de Aspergillus, Acllrumobacter, Bacillus, Gandida, Ghromobacter, Fusarium, Humicola, Hyphozyma, Pseudomonas, Rhizomucor, Rhizopus, o Thennomyces.
[0219] En formas de realización más preferidas, la enzima lipol�tica es una lipasa. Las lipasas se pueden aplicar aquí por su capacidad para modificar la estructura y composición de aceites de triglic�ridos y grasas en los medios de fermentación (incluyendo levadura de fermentación), por ejemplo, se producen de un sustrato de maíz. Las lipasas catalizan diferentes tipos de conversiones de triglic�ridos, tales como hidrólisis, esterificaci�n y transesterificaci�n. Lipasas adecuadas incluyen lipasas ácidas, neutras y básicas, como son bien conocidas en la técnica, aunque lipasas ácidas (tales como, por ejemplo, la lipasa G AMANQ 50, disponible de Amano) parecen ser más eficaces a concentraciones inferiores de lipasa en comparación con bien lipasas básicas o neutras. lipasas preferidas para uso en la presente invención incluyen lipasa de Gandida antarcitca y lipasa de Gandida cylindracea. Lipasas más preferidas son
lipasas purificadas tales como lipasa de Gandida antarcitca (Iipasa A), lipasa de Gandida antarcitca (Iipasa B), lipasa de Gandida cylindracea y lipasa de Penicillium camembertii.
[0220] La lipasa puede ser la describa en la EP 258,068-A o puede ser una variante de lipasa tal como una variante descrita en la WO 00160063 o WO 00132758, incorporadas a la presente por referencia. Lipasas comerciales preferidas incluyen LEGITASE"', LlPOLASET'" y Ll PEX'" (disponibles de Novozymes NS) y G AMANO'" 50 (disponible de Amano).
[0221] Las lipasas se añaden preferiblemente en cantidades de aproximadamente 1 a aproximadamente 400 LU/g DS, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 LUlg DS y más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 LU/g OS.
[0222] En otra fOnTIa de realización preferida de la presente divulgación, la esterasa es una cutinasa. Las cutinasas son enzimas que son capaces de degradar cutina. La cutinasa puede derivar de cualquier fuente. En un aspecto preferido, la cutinasa deriva de una cepa de Aspergillus, en particular, Aspergillus oryzae, una cepa de Altemaria, en particular, Altemaria brassiciola, una cepa de Fusarium, en particular, Fusarium solani, Fusarium so/ani pisi, Fusarium roseum culmorum, o Fusarium roseum sambucium, una cepa de Helminthosporum, en particular, Helminthosporum sativum, una cepa de Humico/a, en particular, Humicola inso/ens, una cepa de Pseudomonas, en particular, Pseudomonas mendocina o Pseudomonas pulida, una cepa de Rhizoocfonia, en particular, Rhizooctonia solani, una cepa de Streptomyces, en particular, Streptomyces scabies, o una cepa de Ulocladium, en particular, UlocJadium consortiale. En una fOnTIa de realización más preferida la cutinasa deriva de una cepa de Humico/a insolens, en particular, la cepa de Humicola insolens DSM 1800. Cutinasa de Humicola insolens se describe en la WO 96113580, que es por la presente incorporada como referencia. La cutinasa puede ser un variante tal como una de las variantes descritas en las WO 00/34450 y WO 01/92502, que son por la presente incorporadas como referencia. Variantes de cutinasa preferidas incluyen variantes catalogadas en el ejemplo 2 de la WO 01/92502 que es por la presente específicamente incorporada como referencia. Una cantidad eficaz de cutinasa es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 400 LU/g DS, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 LUfg DS, y más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 LUfg DS. Optimización adicional de la cantidad de cutinasa puede de aquí en adelante ser obtenida usando procedimientos estándar conocidos en la t�cn ica.
[0223] En otra forma de realización preferida, la esterasa es una fosfolipasa. Como se utiliza en este caso, el término "fosfolipasa" es una enzima que tiene actividad hacia fosfol�pidos, por ejemplo, actividad hidrolitica. Fosfol�pidos, tales como lecitina o fosfatidilcolina, consisten en glicerol esterificado con dos ácidos grasos en una posición extema (sn-1) y una en medio (sn-2) y esterificado con ácido fosf�rico en la tercera posición. El ácido fosf�rico se puede esterificar a un aminoalcohol. Varios tipos de actividad fosfolip�sica se pueden distinguir, incluyendo fosfolipasas A1 y Al que hidrolizan un grupo acilo graso (en las posiciones sn-1 y sn-2, respectivamente) para formar lisofosfol�pido; y lisofosfolipasa (o fosfolipasa B) que hidroliza el grupo �eilo graso restante en el lisofosfol�pido. Fosfolipasa C y fosfolipasa D (fosfodiesterasas) liberan diacil glicerol o �leido fosfatidico respectivamente.
[0224] El término "fosfolipasa" incluye enzimas con actividad fosfolip�sica, por ejemplo, fosfolipasa A (A1 o Al), actividad de fosfolip�sica B, actividad de fosfolipasa G, o actividad de fosfolipasa D. El t�nTIino "fosfolipasa A" como se utiliza en este caso se destina a cubrir una enzima con actividad de fosfolipasa A1 y/o de fosfolipasa Al. La actividad fosfolip�sica se puede proporcionar por enzimas con otras actividades también, tales como, por ejemplo, una lipasa con actividad fosfolip�sica. La actividad fosfolip�sica puede, por ejemplo, ser de una lipasa con actividad fosfolip�sica lateral. En otros aspectos, la actividad enzim�tica de fosfolipasa est� provista por una enzima con esencialmente solo actividad fosfolip�sica y donde la actividad enzim�tica de fosfolipasa no es una actividad secundaria.
[0225] La fosfolipasa puede ser de cualquier origen, por ejemplo, de origen animal (p. ej., mamífero, por ejemplo, páncreas bovino o porcino), o veneno de serpiente o veneno de abeja. Alternativamente, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por ejemplo, de hongos filamentosos, levadura o bacterias, tales como Asperg�llus, por ejemplo, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. niger, o A. oryzae, Dictyostelium, por ejemplo, D. discoideum; Fusarium, por ejemplo, F. culmorum, F. graminearum, F. heterosporum, F. solani, F. oxysporum, o F. venenatum; Mucor, por ejemplo,
M. javanicus, M. mucado, o M. subtil�ssimus; Neurospora, por ejemplo, N. crassa; Rhizomucor, por ejemplo, R. pus�llus; Rhizopus, por ejemplo, R. arrhizus, R. japonicus, o R. stolonifer,; Sclerotinia, por ejemplo, S. liberliana; Trichophyton, por ejemplo, T. rubrum; Whelzelinia, por ejemplo, W. scleroliorum; Bacillus, por ejemplo, B. megalerium o B. sublilis; Gitrobacter, por ejemplo, C. freundii; Enterobacler, por ejemplo, E. aerogenes o E. c/oacae; Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por ejemplo, E. heroico/a; Escherichia, por ejemplo, E. co/i; Klebsiella, por ejemplo, K. pneumoniae; Proteus, por ejemplo, P. vulgaris; Providencia, por ejemplo, P. stuarl��; Sa/monella, por ejemplo, S. lyphimurium; Serratia, por ejemplo, S. liquefasciens. S. marcescens; Shigella, por ejemplo, S. flexneri, Streptomyces, por ejemplo, S. vio/eceoruber, o Yersinia, por ejemplo, Y. enteroco/itica.
[0226] Fosfolipasas preferidas comerciales incluyen LECITASETM y LECITASETM ULTRA (disponibles de Novozymes AlS).
[0227] Una cantidad eficaz de fosfolipasa es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 400 LU/g DS, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 LUfg DS, y más preferiblemente de aproximadamente
1 a aproximadamente 50 LU/g DS. Optimización adicional de la cantidad de fosfolipasa puede de aquí en adelante ser obtenida usando procedimientos estándar conocidos en la técnica.
Proteasas
[0228] En otro aspecto preferido de ta divulgación, al menos un tensioactivo y al menos una enzima generadora de carbohidrato se usa en combinación con al menos una proteasa. La proteasa puede ser utilizada, por ejemplo, para digenr proteína para producir nitrógeno libre de amino (FAN). Esta función de amino�cidos libres como nutrientes para la levadura, mejora as� el crecimiento de la levadura y, consecuentemente, la producción de etanol.
10 [0229] El microorgan ismo fermentador para uso en un proceso de fermentación se puede producir mediante la propagación del microorganismo fermentador en presencia de al menos una proteasa. Aunque sin limitarse a ninguna teoría de operación, se cree que la propagación del microorganismo fermentador con una cantidad eficaz de al menos una proteasa reduce el tiempo de retraso del microorganismo fermentador cuando el microorganismo fermentador se
15 usa posteriormente en un proceso de fermentación en comparación con un microorganismo fermentador que fue propagado bajo las mismas condiciones sin la adición de la proteasa. La acción de la proteasa en el proceso de propagación se cree que directa o indirectamente supone la supresión o expresión de genes que son pe~udiciales o provechosos, respectivamente, al microorganismo fermentador durante fermentación, as� disminuye el tiempo de retardo y da como resultado un ciclo de fermentación más rápido.
20 [0230] Proteasas se conocen bien en la técnica y se refieren a enzimas que catalizan la escisión de enlaces pept�dicos. Proteasas adecuadas incluyen proteasas f�ng icas y bacterianas. Proteasas prefendas son proteasas ácidas, es decir, proteasas caracterizadas por la capacidad de hidrolizar proteínas bajo cond iciones ácidas por debajo de pH 7. Proteasas f�ng icas ácidas adecuadas incluyen proteasas f�ngicas derivadas de Asperg�llus, Mueor, Rhizopus, Candida,
25 Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Penieillium, Selerotium y Torulopsis. Se contemplan especialmente proteasas derivadas de Asperg�llus niger (ver, por ejemplo, Koaze et al., 1964, Agr. Biol. Chem. Japan 28: 216), Aspergillus saitoi (ver, por ejemplo, Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soe. Japan 28: 66), Aspergiflus awamori (Hayashida et al., 1977, Agric. Biol. Chem. 42: 927-933), Aspergillus aculeatus (WO 95/02044), o Aspergillus oryzae; y proteasas ácidas de Mueor pusillus o Mucor miehei.
30 [0231] Proteasas bacterianas, que no son proteasas ácidas, incluyen los productos disponibles comercialmente ALCALASE'" y NEUTRASE'" (disponibles de Novozymes NS). Otras proteasas incluyen GC106 de Genencor internacional, Inc., EEUU y NOVOZYM'" 50006 de Novozymes NS
35 [0232] Preferiblemente, la proteasa es una proteasa de ácido asp�rtico, como se describe, por ejemplo, en Hanclbook of Proteolytie Enzymes, Edited by AJ. Barrett, N.O. Rawlings and J.F. Woessner, Academie Press, San Diego, 1998, Chapter 270. Ejemplos adecuados de proteasas de ácido asp�rtico incluyen, por ejemplo, aquellos descritos por Berka et al., 1990, Gene 96: 313; Berka et al., 1993, Gene 125: 195-1 98; and Gom� et al., 1993, Biosci. Bioteeh. Bioehem. 57: 1095-1100.
Peroxidasas
[0233] Otros compuestos que poseen actividad de peroxidasa pueden ser cualquier peroxidasa (EC 1.11.1.7), o cualquier fragmento con actividad de peroxidasa derivado de esta, que muestra actividad de peroxidasa.
45 [0234] Preferiblemente, la peroxidasa se produce por plantas (p. ej., peroxidasa de alfalfa o de semilla de soja) o microorganismos tales como hongos o bacterias.
[0235] Algunos hongos preferidos incluyen cepas de la subdivisión Oeuteromyeotina, clase Hyphomycetes, por ejemplo,
50 Fusarium, Humirola, Tricoderma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium, o Oresehlera, en particular, Fusarium oxysporum (DSM 2672), Humicola insolens, Triehoderma reesei, Myrotheeium verrucaria (IFO 6113), Vertic�llum alboatrum, Vertie�llum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754), Caldariomyces fumago, Ulocladium chartarum, Embell�sia all�, o Oreschlera halodes.
55 [0236] Otros hongos preferidos incluyen cepas de la subdivisión Bas�diomycotina, clase Basidiomycolina, por ejemplo, Coprinus, Phanerochaete, Coriolus, o Trametes , en particular, Coprinus c�nereus f. mierosporus (IFO 8371), Coprinus maerorhizus, Phaneroehaete ehrysosporium (e.g. NA-12), o Trametes (anteriormente llamado Polyporus), por ejemplo,
r. versico/or (p. ej., PR4 28-A).
60 [0237] Otros hongos preferidos incluyen cepas de la subdivisión Zygomycotina, clase Mycoraeeae, por ejemplo, Rhizopus o Mueor, en particular, Muror hiemalis.
[0238] Algunas bacterias preferidas incluyen cepas del orden Actinomyeeta/es, por ejemplo, Streptomyces spheroides (ArrC 23965), Streptomyces thermovio/aeeus (IFO 12382), o Streptovert�e�llum vert�cillium ssp. vert�eillium.
[0239] Otras bacterias preferidas incluyen Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudomonas purrocin�a (ATCC 15958), Pseudomonas fluorescens (NRRL 6-11) Y cepas de Bacillus, por ejemplo, Bac�llus pum�lus (ATCC 12905) y Bac�llus stearothermoph�/us.
5 [0240] Otras bacterias preferidas incluyen cepas de Myxococcus, por ejemplo, M. virescens.
[0241] La peroxidasa puede también ser una que se produce por un método comprendiendo cultivo una célula huésped transformada con un vector de ADN recombinante que lleva una secuencia de ADN que codifica la peroxidasa al igual que secuencias de ADN para la expresión de la secuencia de ADN que codifica la peroxidasa, en un medio de cultivo
10 bajo condiciones que permiten la expresión de la peroxidasa y recuperación la peroxidasa del cultivo.
[0242] En una forma de realización preferida, una peroxidasa producida de manera recombinante es una peroxidasa derivada de un coprinus sp., en particular, G. macrorh�zus o G. cinereus según la WO 92/16634.
15 [0243] En la presente divulgación, compuestos que poseen actividad de peroxidasa comprenden enzimas peroxidasas y fragmentos activos de peroxidasa derivados de citocromos, hemoglobina, o enzimas peroxidasas.
[0244] Una unidad de peroxidasa (POXU) es la cantidad de enzima que bajo las siguientes condiciones cataliza la conversión de 1 IJmol de peróxido de hidrógeno por minuto a 30"C en 0,1 M de tampón de fosfato pH 7,0, 0,88 mM de
20 peróxidO de hidrógeno y 1,67 mM de 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (A6TS). La reacción es seguida durante 60 segundos (15 segundos después de mezcla) por el cambio en la absorbancia a 418 nm, que debería estar en el intervalo de 0,15 a 0,30. Para cálculo de actividad, un coeficiente de absorción de ABTS oxidado de 36 mM-1 cm-1 y una estequiometr�a de un IJmol de H202 convertida por dos IJmol de A6TS oxidado se usan.
25 Lacasas
[0245] En la presente divulgación, lacasas y enzimas relacionadas con la lacasa comprenden cualquier enzima lacasa clasificada como EC 1.10.3.2, cualquier enzima catecol oxidasa clasificada como EC 1.10.3.1, cualquier enzima bilirrubina oxidasa clasificada como Ec 1.3.3.5, o cualquier enzima de monofenol-monoxigenasa clasificada como Ec
30 1.14.18.1.
[0246] Las enzimas mencionadas arriba pueden ser microbianas, es decir, obtenidas de bacterias u hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras), o pueden derivar de plantas.
35 [0247] Ejemplos adecuados de hongos incluyen una lacasa obtenida de una cepa de Asperg�llus, Neurospora, por ejemplo, N. crassa, Podospora, Botryt�s, coIlybia, Fomes, Lent�nus, Pleurotus, Trametes, por ejemplo, T. v�l/osa and T. vers�color, Rhizooctonia, por ejemplo, R. solani, Coprinus, e.g., C. cinereus, C. comatus, C. fries�i, and C. pl�catilis, Psathyrel/a, por ejemplo, P. condel/eana, Panaeo/us, por ejemplo, P. pap�lionaceus, Myceliophthora, por ejemplo, M. thermophi/a, Schyta/idium, por ejemplo, S. thermophi/um, Polyporus, por ejemplo, P. pinsitus, Pycnoporus, por ejemplo,
40 P. cinnabarinus, Ph/ebia, por ejemplo, P. radita (WO 92/01046), o coriolus, por ejemplo, C. hirsutus (JP 2-238885).
[0248] Ejemplos adecuados de bacterias incluyen una lacasa obtenida de una cepa de Bacillus.
[0249] Una lacasa obtenida de Coprinus, Myceliophthora, Po/yporus, Pycnoporus, Scytafidium o Rhizoctonia es 45 preferida; en particular, una lacasa obtenida de coprinus cinereus, Mycefiophthora thermoph�la, Polyporus pinsitus, Pycnoporus cinnabarinus, Scytalidium thermoph�lum, o Rhizoctonia solani.
[0250] Lacasas comercialmente disponibles son NS51001 (una lacasa de Polyporus pinsifius, dispon ible de Novozymes AlS) y NS51002 (una lacasa de Myceliopthora thermophi/a, dispon ible de Novozymes AlS).
50 [0251] La lacasa o la enzima relacionada con la lacasa puede también ser una que se produce por un método comprendiendo cultivo de una célula huésped transformada con un vector ADN recombinante que lleva una secuencia de ADN que codifica la lacasa al igual que secuencias de AON para la expresión de la secuencia de ADN que codifica la lacasa, en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la expresión de la enzima lacasa y recuperación de la
55 lacasa del cultivo.
[0252] Actividad de la lacasa (LACU) se determina de la oxidación de siringaldazina bajo condiciones aer�bicas a pH 5,5. El color de violeta producido se fotometra a 530 nm. Las condiciones analíticas son 19 mM de siringaldazina, 23 mM de tampón acetato, pH 5,5, 30"C, 1 minuto de tiempo de reacción. Una unidad de lacasa (LACU) es la cantidad de
60 enzima que cataliza la conversión de 1.0 IJmol de siringaldazina por minuto bajo las condiciones anteriores.
[0253] La actividad de lacasa (LAMU) se determina de la oxidación de siringaldazina bajo condiciones aer�bicas a pH 7,5. El color de violeta producido se fotometra a 530 nm. Las condiciones analíticas son 19 mM de siringaldazina, 23 mM de trislmaleato pH 7,5, 30"C, 1 minuto de tiempo de reacción. Una unidad de lacasa (lAMU) es la cantidad de
65 enzima que cataliza la conversión de 1,0 IJmol de siringaldazina por minuto bajo las condiciones anteriores.
[0254] Los polip�ptidos de la presente invención se pueden utilizar conjuntamente con las enzimas mencionadas anteriormente y/o proteínas celulol�ticas para además degradar el componente de celulosa del sustrato de biomasa, (ver, por ejemplo, Brigham el al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.119-141, Taylor & Francis, Washington O.C .; Lee, 1997, Joumal of Biolechnology 56: 1-24).
[0255] Los polip�ptidos de la presente invención se pueden utilizar conjuntamente con las enzimas mencionadas anteriormente y/o proteínas celulol�ticas para además degradar el componente de celulosa del sustrato de biomasa, (ver, por ejemplo, Brigham et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.119-141 , Taylor & Francis, Washington O.C .; Lee, 1997, Joumal of Biotechnology 56: 1-24).
[0256] Las cantidades óptimas de un polip�ptido con actividad de mejora celulolitica y de proteínas celuloliticas depende de distintos factores incluyendo, pero no limitado a, la mezcla de enzimas componentes, el sustrato celulósico, concentración de sustrato celulósico, pretratamiento de sustrato celulósico, temperatura, tiempo, pH, e inclusión de organismo de fermentación (p. ej., levadura para SSF).
[0257] En un aspecto preferido, una cantidad eficaz de polip�ptido(s) con actividad de mejora celulol�lica para material celulósico es aproximadamente de 0,01 a aproximadamente 2,0 mg, preferiblemente de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 1,5 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,25 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 1,25 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,25 mg, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 1,25 mg y de forma más preferida de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 1,0 mg por 9 de material celulósico.
[0258] En otro aspecto preferido, una cantidad eficaz de proteína(s) celulol�lica para material celulósico es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 40 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 25 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 20 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 15 mg, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg y de forma más preferida de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 10 mg por 9 de material celulósico.
[0259] En un aspecto preferido, una cantidad eficaz de polip�ptido(s) con actividad de mejora celulol�tica para proteína(s) celulol�tica es de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 1,0 g, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 g, más preferiblemente de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,75 g, más preferiblemente de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,5 g, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 g, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 9 Y de forma más preferida de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 9 por 9 de proteína(s) celulol�tica.
Composiciones detergentes
[0260] Los polip�ptidos de la presente invención con actividad de mejora celulol�tica se pueden añadir y as� convertirse en un componente de una composición detergente.
[0261] La composición detergente de la presente invención puede ser formulada, por ejemplo, como una composición de detergente para ropa de lavado a mano o a máquina que incluye una composición aditiva de lavandería adecuada para pretratamiento de tejidos manchados y una composición suavizante añadida de enjuague, o ser formulada como una composición detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general, o ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máquina.
[0262] En un aspecto específico, la presente divulgación proporciona un aditivo detergente comprendiendo un polip�ptido de la invención. El aditivo detergente al igual que la composición detergente puede comprender una o más enzimas tal como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa ylo peroxidasa.
[0263] En general, las propiedades de la enzima(s) seleccionada deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes no enzim�ticos y enzim�ticos, etc.), y la enzima(s) debería estar presente en cantidades eficaces.
[0264] Celulasas: celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen f�ngico o bacteriano. Mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteína se incluyen. Celulasas adecuadas induyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas f�ngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263 , US 5,691,178, US 5,776,757 Y WO 89/09259.
[0265] Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas neutras o alcalinas con beneficios de cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en las EP O 495 257, EP O 531 372, WQ 96/11262, WO 96/29397, WO 98108940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como las descritas en las WO 94107998, EP O 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95124471, WO 98/12307 Y PCTIDK98f00299.
65 E1 0180389
[0266] Celulasas disponibles comercialmente incluyen CelluzymeTIol y Carezyme TIol (Novozymes AlS), Clazinase TIol y Puradax HATIoI (Genencor lnternationallnc.) y KAC-5OO(B) TM (Kao Corporation).
[0267] Proteasas: proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Origen microbiano es preferido. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteína se incluyen. la proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa alcalina microbiana o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bac�llus, por ejemplo, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, subtilisin 309, subtilisin 147 y subtilisin 168 (descritas en WO 89106279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (p. ej., de origen bovino o porcino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94125583.
[0268] Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98120115, WO 98/201 16 y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101,104, 120, 123,167,170, 194, 206,218, 222, 224, 235y 274.
[0269] Enzimas prote�sicas preferidas disponibles comercialmente incluyen AlcalaseTM, SavinaseTIol, Primase™, Durafase""", Esperase™ y Kannase TM (Novozymes AlS), Maxatase™. Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OXPTM, FN 2™ YFN 3™ (Genencor Intemacionallnc.).
[0270] lipasas: lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen f�ngico o bacteriano. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteína se incluyen. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thennomyces), por ejemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en EP 258 068 YEP 305 216 o de H. insolens como se describe en WO 96113580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo, de P. alcaligenes o
P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. slulzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95106720 y WO 96(27002), P. wisconsinensis 01'10 96/12012), una lipasa de Bacil/us, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois el al. , 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. slearolhermophilus (JP 64n44992) o B. pumilus (WO 91/16422).
[0271] Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WO 92105249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95122615, WO 97104079 y WO 97/07202.
[0272] Enzimas de lipasa preferidas disponibles comercialmente incluyen LipolaseTIol y lipolase Ultra TIol (Novozymes
NS).
[0273] Amilasas: amilasas adecuadas (a y/o 13) incluyen aquellas de origen f�ngico o bacteriano. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteína se incluyen. Amilasas incluyen, por ejemplo, Qamilasas obtenidas de Bacil/us, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita con más detalle en GB 1,296,839.
[0274] Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94102597, WO 94118314, WO 96123873, Y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124,128,133,154,156,181, 188,190, 197 , 202, 208, 209,243,264, 304,305,391,408y444.
[0275] Amilasas disponibles comercialmente son Duramyl TM, TermamylTM, FungamylTM y BANTM (Novozymes AlSl, RapidaseTN y PurastarTIol (de Genencor Intemacionallnc.).
[0276] Peroxidasasloxidasas: peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen de planta, f�ngico o bacteriano. Mutantes químicamente modificados o mutantes creados genéticamente de proteína se incluyen. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus y variantes de estas como aquellas descritas en WO 93124618, WO 95/10602 Y WO 98115257.
[0277] Peroxidasas disponibles comercialmente incluyen Guardzyme™ (Novozymes AlS).
[0278] la enzima(s) detergente se puede incluir en una composición detergente anadiendo aditivos separados con una
o más enzimas, o anadiendo un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. Un aditivo detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado, por ejemplo, como un granulado, líquido, composición acuosa, etc. Formulaciones de aditivo detergentes preferidas son granulados, en particular, granulados no polvorientos. líquidos, en particular, líquidos estabilizados, o compuestos acuosos.
[0279] Granulados no polvorientos pueden ser producidos, por ejemplo, como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 Y pueden ser revestidos opcionalmente por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de recubrimiento cerosos son productos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados con de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes etoxilados grasos en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos;
�cidos grasos; y mono-y di-Y triglic�ridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de recubrimiento que forman peliculas adecuadas para aplicación por técnicas de lecho fluidificado se dan en GB 1483591. Preparaciones enzim�ticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenoglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido l�ctico o ácido bórico según métodos establecidos. Enzimas protegidas se pueden preparar
5 según el método descrito en EP 238,216.
[0280] La composición detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un liquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente con hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.
10 [0281] La composición detergente comprende uno o más tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluyendo semipolares yfo ani�nicos yfo zwitteri�nicos yfo cati�nicos. Los tensioactivos est�n presentes típicamente a un nivel de 0,1 % a 60% en peso.
15 [0282] Cuando se incluye en esto el detergente normalmente contiene de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un surfactante ani�nico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato alcohólico, alcanosulfonato secundario, metil éster alfa-sulfo ácido graso, ácido alquilo alquenilsucc�nico, o jabón.
20 [0283] Cuando se incluye en esto el detergente normalmente contiene de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 40% de un surfactante no iónico tal como alcohol etoxilato, nonilfenol, etoxilato alquilpoliglic�sido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de polihidroxi alquil ácido graso, o derivados de N-acil N-alquil glucosamina ("glucamidas").
25 [0284] El detergente puede contener 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriac�tico, ácido etilenodiaminatetraac�tico, ácido dietilenotriaminopentaac�tico, ácido alquil o alquenilsucc�nico, silicatos solubles, o silicatos estratificados (p. ej., SKS-6 de Hoechst).
30 [0285] El detergente puede comprender uno o más pol�meros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli(etilenglicol), poli(vinil alcohol), poli(vinilpirrolidona-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolimeros de ácido mal�icofacr�lico y copol�meros de ácido de lauril metacrilatofacrilico.
[0286] El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H20 Z tal como
35 perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador blanqueante de formación de per�cido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. Alternativamente, el sistema blanqueante puede comprender peroxi�cidos del tipo, por ejemplo, amida, �mida, o sulfona.
[0287] La enzima(s) de la composición detergente de la invención puede ser estabilizada usando agentes estabilizantes
40 convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido l�ctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil bor�nico tal como ácido 4-formilfenilbor6nico y la composición se puede formular como se describe en, por ejemplo, WO 92119709 y WO 92f19708.
45 [0288] El detergente puede también contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como, por ejemplo, acondicionadores de tejido incluyendo arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspenSión de suciedad, agentes de reposición antisuciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidr�tropos, inhibidores de decoloración, o perfumes.
50 [0289] En las composiciones detergentes, cualquier enzima se puede añadir en una cantidad correspondiente a 0,01100 mg de proteína enzim�lica por litro de solución de lavado, preferiblemente 0,05-5 mg de proteína enzim�tica por litro de solución de lavado, en particular 0,1-1 mg de proteína enzim�tica por litro de solución de lavado.
[0290] En las composiciones detergentes, un polip�ptido de la presente invención con actividad de mejora celulol�lica se
55 puede afiad ir en una cantidad correspondiente a 0,001-100 mg de proteína, preferiblemente 0,005-50 mg de proteína, más preferiblemente 0,01-25 mg de proteína, incluso más preferiblemente 0,05-10 mg de proteína, de forma más preferida 0,05-5 mg de proteína, e incluso de forma más preferida 0,01-1 mg de proteína por litro de solución de lavado.
[0291] Un polip�ptido de la invención que tiene actividad de mejora celulol�tica puede también ser incorporado en las 60 formulaciones detergentes descritas en WO 97/07202, que es incorparada aquí por referencia.
Otros usos
[0292] En general, tratamiento de cualquier material de pared celular vegetal se puede aumentar por complementaci�n 65 de los polip�ptidos de la presente invención con actividad de mejora celulol�tica.
P�ptido sel'ial
[0293J La presenle divulgación también se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una proteína ligada operativamente a una secuencia de ácido nucleioco que consiste en los nucleótidos 69 a 125 de la SEC ID nO: 5 que codifica un p�ptido sel'ial que consiste en los amino�cidos 1 a 19 de la SEC ID nO: 6, que permite la secreción de la proteína a un medio de cultivo, donde el gen es extral'io a la secuencia de ácidos nudeicos.
[0294] La presente divulgación también se refiere a veclores de expresión recombinanle y células huésped recombinantes que comprenden tates construcciones de ácido nucleico.
[0295] La presente divulgación también se refiere a métodos para producir una proteína que comprenden (a) el cultivo de dicha célula huésped recombinante bajo condiciones adecuadas para la producción de la prot~ina; y (b) recuperar la proteína.
[0296] La proteína puede ser una nativa o heter�loga a una célula huésped. Con el término �prote�na" no se quiere referir a una longitud específica del producto codificado y, por tanto, comprende p�ptidos, oligop�ptidos y proteínas. El término "proteína"
[0297] Preferiblemente, la proteína es una hormona o variante de la misma, enzima, receptor o parte de la misma, anticuerpo o parte de la misma o indicador. En un aspecto más preferido, ta proteína es una �xidorreductasa, transferasa, hidrolasa, liasa, isomerasa o ligasa. En un aspecto incluso más preferido, la proteína es una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, chitinasa, cutinasa, ciclodextina glicosiltransferasa, deoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinol�tica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteol�ticas, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.
[0298] El gen puede ser obtenido de cualquier procari�tico, escari�tico o cualquier otra fuente.
Ejemplos
Materiales
[0299] Productos qulmicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de al menos grado reactivo.
Cepas
[0300] Thielavia terrestris NRRL 8126 fue usada como la fuente de los polip�ptidos de la familia 61 con actividad de mejora celulol�tica. Cepa de Aspergillus oryzae JaL250 (WO 99161651) y Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765: Montenecourt and Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181: 289-301) se usaron para la expresión de los polip�ptidos de la familia 61 con actividad de mejora celulol�tica.
Medios
[0301] Medio YEG se compuso por litro de 0,5% de extracto de levadura y 2% de glucosa.
[0302] Medio de dextrosa de patata se compuso por litro de 39 gramos de dextrosa de patata (Oifco).
[0303] Placas PDA se compusieron por litro de 39 gramos de agar de dextrosa de patata.
[0304] Medio MOU2BP se compuso por litro de 45 9 de maltosa, 1 9 de MgSO. �7H20 , 1 9 de NaCI, 2 9 de K2S0., 12 9 de KH2P04, 7 9 de extracto de levadura, 2 9 de urea y 0,5 mi de solución de metales traza AMG, pH a 5,0.
[0305] Solución de melales traza AMG se compuso por litro de 14,3 9 de ZnSO.�7H20, 2,5 9 de CuSO.�5H20, 0,5 9 de NiCI2�6H20 , 13,8 9 de FeSO.�7H20, 8,5 9 de MnS04�H2� y 3 9 de ácido cítrico.
[0306] Placas COVE se compusieron por litro de 342,3 9 de sacarosa, 20 mi de solución salina COVE, 10 mi de 1 M de acetamida, 10 mi de 1,5 M CsCI2 y 25 9 de agar noble.
[0307] Solución salina COVE se compuso por litro de 26 9 de KCI, 26 9 de MgS04-7H20 , 76 9 de KH2PO. y 50 mi de solución de metales traza COVE.
[0308] Solución de metales traza COVE se compuso por litro de 0,04 9 de Na2B.07 �10H20 , 0,4 9 de CuSO. �5H20 , 1,2 9 de FeS04�7H20, 0,7 9 de MnS04�H20 , 0,8 9 de Na2Mo02�2H20 y 10 9 de ZnSO.�7H20 .
65 E1 0180389
[0309] Medio CIM se compuso por litro de 20 9 de celulosa, 10 9 de sólidos maíz, 1,45 9 de (NH4)2S04, 2,08 9 de KHzP04, 0,28 9 de CaCI2, 0,42 9 de MgS04-7H20 y 0,42 mi de solución de metales traza, pH a 6,0.
[0310] Solución de metales traza se compuso por litro de 41,2 mg de FeCb�6H20, 11,6 mg de ZnS04�7H20, 5,4 mg de MnS04-H20 , 2,0 mg de CuS04�5H20 , 0,48 mg de H3B03 y 67,2 mg de ácido cítrico.
[0311] Medio NNCYP se compuso por litro de 5,0 9 de NH4N03, 0,5 9 de MgS04�7H20, 0,3 9 de CaClz, 2,5 9 de ácido cítrico, 1,0 9 de bacto-peptona, 5,0 9 de extracto de levadura, solución de metales traza COVE y suficiente K2HP04 para conseguir el pH final de aproximadamente 5,4.
[0312] Medio NNCYPmod se compuso por litro de 1,0 9 de NaCI, 5,0 9 de NH4N0 3, 0,2 9 de MgS04�7H20 , 0,2 g de CaClz, 2,0 9 de ácido cítrico, 1,0 9 de bacto-peptona, 5,0 9 de extracto de levadura, solución de metales traza COVE y suficiente KzHP04para conseguir el pH final de aproximadamente 5,4.
[0313] Placas LB se compusieron por litro de 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro sádico y 15 g de Agar Bacto.
[0314] Medio SOC se compuso por 2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 10 mM de NaCI, 2,5 mM de KCI, 10 mM de MgClz y 10 mM de MgS04 y glucosa esterilizada por filtro a 20 mM añadido después de autoclave.
[0315] Medio refrigerante se compuso por 60% de SOC y 40% de glicerol.
[0316] Medio 2XYT se compuso por litro de 16 9 de triptona, 10 9 de extracto de levadura, 5 9 de NaCI y 15 9 de agar Bacto.
Ejemplos
[0317] Los ejemplos 1 a 28 ilustran la provisión al igual que características determinadas del polip�ptido y polinucle�tido Thielavia teffestris NRRL 8126 GH61B (SEC ID nO: 5 y 6, respectivamente). La provisión al igual que características determinadas de polip�ptidos y polinucte�tidos GH61B, GH61C, GH61E y GH61G (SEC ID nO: 1-4 y 7-10) se incluyen solo para comparación.
Ejemplo 1: Identificación de polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica de ThieJavla terrestris NRRL 8126
[0318] Un tapón de agarosa de una placa fresca de Thielavia teffestris NRRL 8126 creció en medio NNCYPmod complementado con 1% de Sigmacell (Sigma Chemical Co., SI. Louis, MO) se inocul� en 50 mi de medio NNCYPmod complementado con 1% de glucosa e incubado a 45"C y 200 r.p.m. durante 25 horas. Oos-ml de este cultivo se us� para inocular 15 x 100 mi (matraz sao mi) y 2 x 50 mi (matraz 250 mi) de medio NNCYPmod complementado con 2% de Sigmacell-20 y se incub� a 45"C, 200 r.p.m. durante 4 días. Cultivos agrupados se centrifugaron a 3000 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se filtr� a través de un prefiltro de fibra de vidrio Nalgene 281-5000 (Nalge Nunc Int'l., Rochester, NY). El filtrado se enfri� a 4"C para almacenamiento.
[0319] Electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. Un mi de filtrado se precipit� añadiendo 100 �JI de ácido tricloroac�tico (ATC) saturado a 4"C y se incub� durante 10 minutos en hielo seguido de adición de g mi de acetona enfriada con hielo y además incubaci�n en el hielo durante 20 minutos. La solución precipitada se centrifug� a 10000 x g durante 10 minutos a 4"C, el sobrenadante se decant� y el granulado se enjuag� dos veces con acetona enfriada con hielo y se secó al aire. El granulado seco se disolvió en 0,2 mi de tampón de muestra de isoelectroenfoque (IEF) (9,0 M de urea, 3,1 % (plv) 3-[(3-colamidopropil) dimetil-amonio]-1-propanosulfonato (CHAPS, Pieree Chemical Co. Rockford, IL), 1% (v/v) pH 4-7 anf�litos, 50 mM de ditiotreitol (OIT) y 0,005% de bromofenol azul en agua destilada). Solución madre de urea se desioniz� usando AG 501 -X8 (D), 20-5-malla, resina de lecho mezclada de BioRad Laboratories (Hercules, CA). La solución desionizada fue almacenada a -20"C. A la mezcla resultante se le permitió solubilizar durante diferentes horas con mezcla suave en un agitador LabQuakeTIol (Lab Industries, Berkeley, CA). Doscientos �JI de cada mezcla de proteína de tampón de muestra IEF se aplicó a una banda de 11 cm IPG (BioRad Laboratories, Hercules, CA) en una bandeja de rehidrataci�n IPG (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Una parte alícuota de 750 �JI de fluido de cobertura de banda seco (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) se estratific� sobre las bandas IPG para prevenir evaporación y permitir rehidratar durante 12 horas mientras aplicación de 30 voltios usando una unidad de isoelectroenfoque IPGPhor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a 20"C. La unidad IPGfor se program� para voltaje constante pero con una corriente máxima de 50 �JA por banda. Después de 12 horas de rehidrataci�n, las condiciones de isoelectroenfoque fueron de la siguiente manera: 1 hora a 200 voltios, 1 hora a 500 voltios y 1 hora a 1000 voltios. Luego, se aplicó un gradiente de 1000 voltios a 8000 voltios durante 30 minutos e isoelectroenfoque se program� para ejecutarse a 8000 voltios y se complet� cuando >30,000 voltio horas se consiguió. Bandas de gellPG se redujeron y alquilaron antes del segundo análisis de dimensión por primera reducción durante 15 minutos en 100 mg de ditiotreitol por 10 mi de tampón de equilibrio de SDS (50 mM de Tris HCI pH 8,8,6,0 M de urea, 2% (pfv) dodecilsulfato de sodio (SOS), 30% de glicerol y 0,002% (plv) de bromofenol azul) seguido de 15 minutos de alquilaci�n en 250 mg de iodoacetamida por 10 mi de tampón de equilibrado a oscuras. Las bandas IPG se enjuagaron rápidamente en el tampón en ejecución de SOS-PAGE (InvitrogenfNovex, Carlsbad, CA) y se colocaron en un pocillo 11 cm 8-16% de gel de tris
glicina SDS-PAGE (BioRad Laboratories, Hercules, CA) y se sometieron a electroforesis usando una unidad de etectroforesis Criterion (BioRad Laboratories, Hercules, CA) a 50 voltios hasta que ta muestra se introdujo en el gel y luego el voltaje se aument� a 200 voltios y se le permitió ejecutar hasta que el tinte azul de bromofenol alcanzó el fondo del gel.
[0320] Detección de polip�ptido. Los dos geles dimensional se tirieron con un SYPRO Orange Protein Stain fluorescente (Molecular Probes, Eugene, OR). Métodos de coloración fluorescentes se optimizaron y adaptaron de Malone el al., 2001, Electrophoresis, 22, 919-932. Geles de SDS-PAGE se fijaron en 40% de etanol, 2% de ácido acético y 0,0005% de SDS en una plataforma oscilante durante 1 hora durante toda la noche. Solución de fijación se retir� y sustituyó con tres pasos de lavado repetidos que consisten en 2% de ácido acético y 0,0005% de SDS durante 30 minutos cada uno. Geles se tirieron durante 1,5 horas para durante toda la noche a oscuras con 2% de ácido acético, 0,0005% de SDS y 0,02% de SYPRO Orange Protein Stain. Coloración y decoloración se optimizó además para mejorar reproductibilidad y automatización en una unidad de coloración Hoefer Processor Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Imágenes de los geles de SDS-PAGE fluorescentes manchados se obtuvieron por escaneado en un sistema de imágenes Molecular Dynamics STORM 860 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) usando fluorescencia azul y tamarios de p�xel de 200 ~m y una ganancia de tubo fotomultiplicadora de 800 V. Imágenes se vieron y ajustaron usando ImageOuant versión 5.0 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Geles se visualizaron además en un transiluminador Dark Reader Blue con filtro de naranja (Ciare Chemical Co, Denver, CO). Manchas de gel de proteínas observadas se cortaron usando un punzón Acu-Punch Biopsy Punch de 2 mm (Acuderm Inc., Ft. Lauderdale, FL) y almacenaron en noventa y seis placas de pocillos que se prelavaron con 0,1% de ácido trifluoroac�tico (TFA) en 60% de acetonitrilo seguido de dos lavados adicionales con agua de calidad de HPLC. Las manchas de gel bidimensionales teñidas se almacenaron en 25-50 ~I de agua en las placas prelavadas a -20Q C hasta ser digeridas.
[0321] Digestión en gel de polip�ptidos para secuenciaci�n peptldica. Un robot de manipulación de líquidos MultiPROBE� 11 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA) se us� para realizar las digestiones en gel. Dos manchas de gel dimensionales con polip�ptidos de interés se redujeron con 50 ~I de 10 mM de DTT en 100 mM de bicarbonato de amonio pH 8,0 durante 30 minutos. Después de reducción, las piezas de gel se alquilaron con 50 ~I de 55 mM de yodoacetamida en 100 mM de tampón de bicarbonato de amonio pH 8,0 durante 20 minutos. Se les permitió a las piezas de gel secas dilatarse en una solución de digestión de tripsina (6 ng/~1 de tripsina de calidad de secuenciaci�n (Promega, Madison, WI) en 50 mM de tampón de bicarbonato de amonio pH 8) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de una digestión de 8 horas a 40Q C. A cada uno de los pasos de reacción descritos les siguieron lavados numerosos y prelavados con las soluciones apropiadas después del protocolo estándar de fabricación. Cinquenta ~I de acetonitrilo se us� para deshidratar el gel entre reacciones y piezas de gel se secaron al aire entre pasos. P�ptidos se extrajeron dos veces con 1% de ácido f�rmico/2% de acetonitrilo en el agua de calidad de HPLC durante 30 minutos. Soluciones de extracción pept�dicas se transfirieron a una placa de tipo PCR bordeada con 96 pocillos (ABGene, Rochester, NY) que se ha enfriado a 10-15Q C y cubierto con un tapa de placa de 96 pocillos (PerkinElmer Lite and Analytical Sciences, Boston, MA) para prevenir evaporación. Las placas se almacenaron además a 4Q C hasta que análisis de espectrometria de masas pudiera realizarse.
[0322] Secuenciaci�n pept�dica por espectrometr�a de masas en serie. Para secuenciaci�n pept�dica por espectrometr�a de masas en serie, un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuádruple ortogonal híbrido O-Tof microTM (Waters MicromasS� MS Technologies, Milford, MA) se us� para análisis LC-MSfMS. El espectrómetro de masas O-Tof micro'"" se equip� con un sistema HPLC capilar y de nanOflujO Ultimate'"" (Dionex, Sunnyvale, CA) que se acopl� con un micro automuestreador FAMOS (Dionex, Sunnyvale, CA) y un dispositivo de conmutación de columna Switchos 11 (Dionex, Sunnivale, CA) para concentrar y desalar muestras. Muestras se cargaron sobre una columna de dispositivo de seguridad (300 ~m de ID X 5 cm, C18 PepMapTM) (Dionex, Sunnyvale, CA) se equiparon en el bude de inyección y lavaron con 0,1% de ácido f�rmico en agua a 40 ~Vminuto durante 2 minutos usando una bomba Switchos 11 (Dionex, Sunnyvale, CA). P�ptidos se separaron en 75 ~m de ID x 15 cm, C18, 3 jJm, columna capilar fundida nanoflujo 100 PepMap'"" (Dionex, Sunnyvale, CA) a una velocidad de flujo de 175 nVminuto de un flujo de división de 175 I.Jl/minuto usando un calibrador NAN-75 (Dionex, Sunnyvale, CA). El gradiente de eluci�n lineal fue 5% a 60% de acetonitrilo en 0,1% de ácido f�rmico aplicado sobre un periodo de 45 minutos. El eluyente de columna se monitore� a 215 nm y se introdujo en el espectrómetro de masas Q-Tof micro'"" a través de una fuente de iones de electrospray equipada con la interfaz de nanopulverizaci�n. El espectrómetro de masas O-Tof micro'"" fue completamente controlado por microprocesador usando software MassLynx™ versión 3.5 (Waters MicromasS� MS Technologies, Milford, MA). Los datos se adquirieron en el modo de escaneado de encuesta y a partir un intervalo de masa de 50 a 2000 miz con criterio de conmutación para MS a MS/MS para incluir una intensidad iónica mayor de 10,0 cuentas/segundo y estados de carga de +2, +3 Y +4. Espectros de análisis de hasta 4 especies de co-eluci�n con un tiempo de escaneado de 1,9 segundos y tiempo de interescaneado de 0,1 segundos podrían obtenerse. Un voltaje de oono de 65 voltios se us� típicamente y la energía de colisión se program� para variar según la masa y estado de carga del p�ptido de eluci�n y en el intervalo de 10 -60 voltios. Los espectros adquiridos se combinaron, homogenizaron y centraron en una forma automatizada y una lista de valor máximo generado. La lista de valor máximo generada se buscó contra bases de datos seleccionadas usando el software ProteinLynx™ Global Server 1.1 (Waters Micromass� MS Technologies, Milford, MA). Resultados a partir de búsquedas de ProteinLynx™ se evaluaron y proteínas desconocidas se analizaron además evaluando los espectros MSfMS de cada i6n de interés y secuencia de novo determinado identificando la serie iónica y Y "b" Y coincidiendo diferencias de masa para el amino�cido apropiado.
[0323] Secuencias pept�d icas de Thielavia lerreslris GH61 B de secuenciaci�n de novo por especlrometr�a de masas se obtuvieron de diferentes iones con m�ttiptes cargas para aproximadamente una mancha de get de polip�ptido de 40 kDa. Un i�n doblemente cargado de p�ptido tríptico de 878,422 miz secuencia se determin� para ser [lIe o leu]-Pro-AlaSer-Asn-Ser-Pro-Val-Thr-Asn-Val-Ala-Ser-Asp-Asp-[lIe o Leu]-Arg (SEC ID nO: 11). Un segundo i�n doblemente cargado de p�ptido tríptico de 765,460 se determin� para ser [lIe o Leu]-pro-Glu-Asp-(lIe o Leu]-Gtu-pro-Gty-Asp-Tyr-[lIe
o Leu]-(lIe o Leu]-Arg (SEC ID nO: 12).
[0324] Veinte 111 de la fracción agrupada con la actividad de mejora celulolilica mayor después del paso de purificación de fenil sefarosa descrito en el ejemplo 24 se mezcl� con 20 !JI de tampón de carga 2X SDS-PAGE con 50 mM de DTT Y se hirvió durante 4 minutos. Cuarenta !JI se separ� por SDS-PAGE usando un gel gradiente 11 cm 8-16% de trisglicina SDS-PAGE (BioRad Laboratories, Hercules, CA) y tampón en ejecución de tris-glicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). El SDS-PAGE se ejecut� bajo condiciones de reducción y el protocolo recomendado del fabricante (BioRad laboratories, Hercules, CA). El gel se retir� del casete y se enjuag� 3 veces con agua durante al menos 5 minutos cada y se tifi� con Bio-Safe Coomassie Stain (BioRad Laboratories, Hercules, CA) durante 1 hora seguido de decoloración con agua doblemente destilada durante más que 30 minutos. Un enlace prote�nico visible a aproximadamente 27 kDa fue digerido en gel con tripsina como se ha descrito anteriormente. los p�ptidos recuperados del digerido se sometieron a secuenciaci�n peptidica por espectrometria de masas en serie como se ha descrito anteriormente. Un i�n de p�ptido triptico doblemente cargado de 903,895 mIz se determin� para tener una secuencia de Cys-Pro-Gly-SerPhe-Ser-Ser-Cys-Asp-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Trp-Phe-lys (SEC ID nO: 13, familia GH61 D). Un i�n de p�ptido tríptico triplemente cargado de 415,553 mIz se determin� para ser [lIe o Leu]-Asp-Glu-Ala-Gly-Phe-His-Gly-Asp-Gly-Val-Lys (SEC ID nO: 14, familia GH61D). Otro i�n doblemente cargado de p�ptido triptico de 565,857 mIz se determin� para ser X-X-Ala-Pro-Gly-Asn-Tyr-(lie or leu]-(lie or leu)-Arg (SEC ID nO: 15, familia GH61C). Estas secuencias pepl�dicas se usaron para dise"'o de cebadores para clonaci�n.
Ejemplo 2: Extracción de AON gen�mico de Thie/avia terrestris
[0325] Thielavia lerreslris NRRl8126 se cultiv� en 25 mi de medio YEG a 3rC y 250 r.p.m. durante 24 horas. Micelios se recogieron luego por filtración a través de Miracloth "TM (Calbiochem, La Jol1a, CA) y se lavaron una vez con 25 mi de tampón 10 mM de Tris-1 mM de EDTA (TE). El exceso de tampón se dren� de la preparación de micelios, que se congel� posteriormente en nitrógeno líquido. la preparación de micelios congelados se molió a un polvo fino en un
molinillo de café eléctrico, y el polvo se a�adi� a un tubo centrifugador de plástico desechable con 20 mi de tampón TE y 5 mi de 20% (plv) de dodecilsulfato de sodio (SDS). La mezcla se invirtió suavemente varias veces para asegurar la mezcla y se extrajo dos veces con un volumen igual de alcohol de fenol:cloroformo:isoamil (25:24:1 vfvfv). Acetato de sodio (3 M de solución) se a"'adi� a la muestra extra ida a una concentración final de 0,3 M seguido de 2,5 volúmenes de etanol helado para precipitar el ADN. El tubo se centrifug� a 15000 x g durante 30 minutos para granular del ADN. Se le permitió al granulado de ADN secarse por ventilación durante 30 minutos antes de resuspensi�n en 0,5 mi de tampón TE. Ribonucleasa A sin AONsa se ariadi� al granulado de ADN resuspendido a un concentración de 100!Jg por mi y la mezcla se incub� luego a 37"C durante 30 minutos. Proteinasa K (200 !J9/ml) se ariadi� y el tubo se incub� una hora adicional a 37"C. Finalmente, la muestra se centrifug� durante 15 minutos a 12000 x g, y el sobrenadante se aplicó a un colector Qiaprep 8 (QIAGEN Inc., Valencia, CA). las columnas se lavaron dos veces con 1 mi de PB (QIAGEN Inc., Valencia, CA) y 1 mi de PE (QIAGEN Inc., Valencia, CA) al vacio. El ADN aislado se eluy� con 100 !JI de TE, se precipit� con etanol, se lav� con 70% de etanol, se secó al vacio, se resuspendi� en tampón TE y se almacen� a 4"C.
[0326] Para generar ADN gen�mico para amplificación PCR, Thielavia lerreslris se cultiv� en 50 mi de medio NNCYP complementado con 1% de glucosa en un matraz de agitaci�n disipado a 42"C y 200 r.p.m. durante 24 horas. Los micelios se recogieron por filtración, se lavaron dos veces en TE (10 mM de Tris-1 mM de EDTA), y se congelaron bajo nitrógeno liquido. Una pieza del tamario de un guisante de micelios congelados se suspendió en 0,7 mi de 1% de sulfato de dodecilo de litio en TE y se interrumpió por agitaci�n con un volumen igual de 0,1 mm de perlas de zirconio/sílice (Biospec Producls, Inc., Bartlesville, OK) durante 45 segundos en un FastPrep FP120 (ThermoSavant, Holbrook, NY). Detrito se retir� por centrifugado a 13000 x 9 durante 10 minutos y el sobrenadante aclarado se llev� a 2,5 M de acetato am�nico y se incub� en hielo durante 20 minutos. Después del periodo de incubaci�n, los ácidos nucleicos se precipitaron por adición de 2 volúmenes de etanol. Después de centrifugado durante 15 minutos en un microcentrifugador a 4"C, el granulado se lav� en 70% de etanol y se secó al aire. El ADN se resuspendi� en 120 !JI de 0,1X TE y se incub� con 1 !JI de ribonuc!easa pancreática sin ADNsa a 37"C durante 20 minutos. Acetato am�nico se afladi� a 2,5 M Y el ADN se precipit� con 2 volúmenes de etanol. El granulado se lav� en 70% de etanol, se secó al aire y se resuspendi� en tampón TE.
Ejemplo 3: Construcción de vector de expresión pAIL02
[0327] Vector de expresión pAIL01 se construyó por modificación de pBANe6 (patente U.S. n�. 6,461 ,837), que comprende un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger e triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae (promotor NA2-tpi), secuencia terminadora de amiloglucosidasa de Aspergillus niger (terminador AMG) y gen de acetamidasa de Aspergillus nidulans (amdS). Todos los pasos de mutag�nesis se verificaron por secuenciaci�n usando la química de terminador Big_Dye"TM (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Modificación de pBANe6 se realizó por primera eliminación de tres sitios de restricción Nco I en las posiciones 2051, 2722 Y 3397 pares de bases del marcador de selección amdS por mutag�nesis dirig ida. Todos los cambios se diseñaron
para ser �silenciosos� dejando la secuencia de proteína real de el producto genético amdS sin cambios. Eliminación de estos tres sitios se realizó simultáneamente con un kit GeneEditor'" in vitro Site-Directed Mutagenesis (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante usando los siguientes cebadores (el nucleótido subrayado representa la base cambiada):
AMDS3NcoMut (2050): 5'-GTGCCCCATG~TACGCCTCCGG-3' (SEC ID NO: 16) AMDS2NcoMut (2721): 5'-GAGTCGTATTTCC~GGCTCCTGACC-3' (SEC ID NO: 17) AMDS1 NcoMut(3396): 5'-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3' (SEC ID NO: 18)
[0328] Un pl�smido comprendiendo todos los tres cambios de secuencia previstos se sometió luego a mutag�nesis dirigida, usando un kit de mutag�nesis dirigida QuickChange'" (Stratagene, La Jolta, CA), para eliminar el sitio de restricción Nco I al final del terminador AMG en la posición 1643. Los siguientes cebadores (el nucleótido subrayado representa la base cambiada) se usaron para mutag�nesis:
Cebador superior para mutagenizar la secuencia del terminador AMG: 5'-CACCGTGAAAGCCATGQTCTTTCCITCGTGTAGAAGACCAGACAG-3' (SEC ID nO: 19) Cebador inferior para mutagenizar la secuencia del terminador AMG: 5'-CTGGTCITCTACACGAAGGAAAGA�CATGGCITTCACGGTGTCTG-3' (SEC ID nO: 20)
[0329] El último paso en la modificación de pBANe6 fue la adición de un nuevo sitio de restricción Nco I al principio del poliligador usando un equipo de mutag�nesis dirigida QuickChange '" y los siguientes cebadores (los nucleótidos subrayados representan las bases cambiadas) para producir pAIL01 (Figura 6).
Cebador superior para mutagenizar el promotor NA2-tpi: 5'-CTATATACACAACTGGAITTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3' (SEC ID nO: 21) Cebador inferior para mutagenizar el promotor NA2-tpi: 5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGITGTGTATATAG-3' (SEC ID nO: 22)
[0330] El gen amdS de pAIl01 se cambi� con el gen pyrG de Aspergillus nidulans. Pl�smido pBANe10 (Figura 7) se us� como fuente para el gen pyrG como etiqueta de selección. Análisis de la secuencia de pBANe10 mostro que el marcador pyrG estaba contenido dentro de un fragmento de restricción Nsi I y no contiene sitios de restricción ni Neo I o Pac 1. Ya que el amdS es también flanqueado por sitios de restricción Nsi 1, la estrategia para cambiar el marcador de selección fue un simple intercambio de fragmentos de restricción Nsi 1. ADN pl�smido de pAIL01 y pBANe10 se digirieron con la enzima de restricción Nsi I y los productos purificados por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento Nsi I de pBANe1 O con gen thepyrG se ligó al esqueleto de pAIL01 para reemplazar el fragmento de ADN Nsi I original con el gen amdS. Clones recombinantes se analizaron por digestión de enzima de restricción para determinar que estos tenían el inserto correcto y también su orientación. Un clon con el gen pyrG transcrito en el sentido contrario a las agujas del reloj se seleccion�. El nuevo pl�smido se design� pAIL02 (Figura 8).
Ejemplo 4 : Amplificación PCR de un fragmento GH61 B de gen de ADN gen�mico de Thielavia terrestris NRRl
[0331] Cebadores se diseñaron basados en secuencias pept�dicas obtenidas a través de espectrometr�a de masas en serie como se describe en el ejemplo 1. Las secuencias pept�dicas específicas fueron de la siguiente manera:
[L,I]PASNSPVTNVASOO[L,I)R (SEC ID nO: 23) (L ,I]PED(L,I]EPGDY(L,I)[L,I]R (SEC ID nO: 24)
Las regiones de las secuencias mostradas en negrita se seleccionaron para diseño del cebador de ADN. Una extensión 5' más larga para la segunda secuencia se cre� genéticamente en la supOSición de que el siguiente amino�cido en la secuencia fue alanina (basado en conservación de secuencia en homólogos). Los cebadores fueron:
Cebador sentido: 5'-CCTCCAACTCCCCCGTCACNAAYGTN GC-3' (SEC ID nO: 25) Cebador antisentido: 5'-GGCGCGGAGGAGGTARTCNCCNGGYTC-3' (SEC ID nO: 26)
[0332] Amplificación PCR se realizó en un volumen de 50 1.11 con tampón 1X AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 unidades de polimerasa de AON AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1 I.IM de cada cebador sentido y anlisentido, y aproximadamente 1 I.Ig de AON gen�mico de Thiela via te"estris NRRL 8126. Amplificación se realizó en un Robocycler (Stratagene, La Jolta, CA) usando parámetros de ciclo de 3 minutos a 96"C y 3 minutos a 72"C (durante los que ADN polimerasa se al'iadi�), 35 ciclos de 45 segundos a 94"C, 45 segundos a 58"C, y 1 minuto a 72"C, seguido de una extensión final de 7 minutos a 72"C. Los productos reactivos se fraccionaron en un 3% de gel de
agarosa usando 40 mM de Tris base-20 mM de acetato de sodio-1 mM de lamp�n EOTA disodio (TAE) y una banda de aproximadamente 450 pares de bases se cort�, purificó usando un kit de extracción de gel QIAEX 11 (QIAGEN Inc., Valencia, CA), y se subclon� usando un kit TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El pl�smido de un transformante de E. coli se secuenci� y se encontr� que contenía un inserto de 452 de pares de bases que codifican a una proteína de la famitia 61 (GH61 B). Este pl�smido se design� pPH27 (Figura 9).
Ejemplo 5: Amplificación de un fragmento de gen GH61C y GH61 D de ADN gen�mico
[0333] Cebadores se diseñaron basados en secuencias pept�dicas obtenidas a través de espectrometr�a de masas en serie como se describe en el ejemplo 1, con la excepción de que la fuente de tos polip�ptidos fue una banda de aproximadamente 27 kOa cortada de un gel de SOS-PAGE unidimensional (Novex 4-1 2% de Bis-Tris, Invitrogen, Carlsbad, CA) después de la purificación parcial a través de Q Sefarosa como se describe en el ejemplo 24. La masa molecular similar de los polip�ptidos GH61C y GH61 O dieron lugar a la contaminación cruzada de los polip�ptidos en la porCión de gel usado para espectrometr�a de masas y asI las secuencias pept�dicas determinadas durante el análisis de espectrometr�a de masas derivaron de ambos polip�ptidos. Un cebador se dise�� para la secuencia de dos p�ptidos adyacentes trípticos posibles con secuencia combinada SGAGWFKIOEAGFHGO (SEC ID nO: 27). Esla result� ser la secuencia correcta para GH61 O; no obstante, el cebador diseñado estuvo suficientemente cerca de la secuencia GH61C (GOGWFKIOE) para amplificar ese gen también. El cebador antisentido se bas� en la secuencia derivada de espectrometr�a de masas APGNY[I,L](I,L]R (SEC ID nO: 28). Este se refinó y se extendió basado en conservación en un alineamiento de secuencia múltiple para APGNYURHEL (SEC ID nO; 29). Esto result� ser la secuencia correcta para GH61C, pero estuvo suficientemente cerca a la secuencia GH610 (APGNYLVRHEL, SEC ID nO; 30) para amplificar también ese gen. Las secuencias pept�dicas específicas usadas para diseñar el cebador fueron de la siguiente manera:
GAGWFKIOE (SEC ID nO: 31) APGNYURHEL (SEC ID nO: 29)
Los cebadores fueron:
Cebador sentido: 5'-CGGCGCGGGCTGGTITAARATHGAYGA-3' (SEC ID nO: 32) Cebador antisentido: 5' AGTTCATGGCGAATCAGATARTTNCCNGGNGC-3' (SEC ID nO: 33)
[0334] Amplificación PCR se realizó en un volumen de 50 �JI con tampón 1X AmpliTaq, 2,5 unidades de AON polimerasa AmpliTaq, 1 �JM de cada cebador sentido y antisentido, y aproximadamente 1 �Jg de ADN gen�mico de Thielavia terrestris NRRL 8126. Amplificación se realizó en un Stratagene Robocycler usando parámetros de ciclo de 3 minutos a 96"C y 3 minutos a 72"C (durante los que AON polimerasa se a�adi�), 35 ciclos de 45 seg a 94"C, 45 seg a 53, 56, o 59 "C y 1 minuto a 72"C, seguida de una extensión final de 7 minutos a 72"C. los productos reactivos se fraccionaron en un 3% de gel de agarosa y dos bandas de aproximadamente 150-200 pares de bases se cortaron, se purificaron usando el kit de extracción de gel QIAEX 11 (QIAGEN Inc., Valencia, CA), y se subclonaron juntos usando el kit Topo TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El pl�smido de un transformante de E. coli se secuenci� y se encontr� que contuvo un inserto de 156 pares de bases que codifican una proteína de la familia 61 (GH61C). Este pl�smido se design� pPH29 (Figura 10). El pl�sm ido de otro transformante de E. coli se secuenci� y se encontr� que contenía un inserto de 180 pares de bases que codifican otra proteína de la familia 61 (GH61 O). Este pl�smido se design� pPH28 (Figura 11 ).
Ejemplo 6: Construcción de biblioteca de ADN gen�mico
[0335] Bibliotecas de AON gen�mico se construyeron usando el vector de clonaci�n bacteri�fago hZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MO) con células de E. coliY1090ZL (Life Technologies, Gaithersburg, MO) como huésped para colocación en placas y purificación de bacteri�fago recombinante y E. coli OH10Bzip (Life Technologies, Gaithersburg, MO) para escisión de clones pZL 1 individuales con el gen GH61 B.
[0336] AON gen�mico de Thielavia terrestris NRRL 8126 se digirió parcialmente con Tsp 5091 y se dividió por tamaño en 1% de geles de agarosa usando tampón TAE. Fragmentos de AON migratorio en el intervalo de tamaño 3-7 kb se cortaron y eluyeron del gel usando reactivos Prep-a-Gene (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Los rragmentos de AON eluidos se ligaron con Eco Ri dividido y se desfoforilaron brazos de vector hZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MO), y las mezclas de ligamiento se embalaron usando extractos de embalaje comercial (Stratagene, La Jolta, CA). Las bibliotecas de AON empaquetadas se colocaron en placas y se amplificaron en células de E. coli Y1 090ZL. La biblioteca de ADN gen�mico no amplificada contuvo 3,1 X 106 a Pfu/ml (titulos de antecedentes sin AON fueron 2.0 X 10~ a Pfu/ml).
Ejemplo 7: Identificación de clones de Thie/avia terrestris GH61 B, GH61 e y GH61 D
[0337] Fragmentos de sonda de Thielavia te"estris GH61 B, GH61C y GH61 O se amplificaron a partir de pPH27, pPH29 Y pPH28, respectivamente, usando homólogos de cebadores del vector TOPO y AON polimerasa Herculase (Stratagene, la Jolta, CA), como se muestra debajo.
5'-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTA-3' (SEC ID nO: 34) 5'-ATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGAT-3' (SEC ID nO: 35)
[0338] Cinquenta picomoles de cada uno de los cebadores se usaron en una reacción PCR con 10 ng de tampón de amplificación Herculase pPH27, pPH28, o pPH29, 1X (Stratagene, La Jolla, CA), 1 �.JI de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP Y dCTP y 2,5 unidades de ADN polimerasa Herculase en un volumen final de 50 �.JI. Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94"C durante 1 minuto y 20 ciclos cada uno a 94"C durante 30 segundos, 55"C durante 30 segundos y 72"C durante 1 minuto. El bloque de calor luego fue a un ciclo de remojo de 4"C. Los productos reactivos se aislaron en 1,0% de gel de agarosa usando un tampón TAE donde tres <500 pares de bases de bandas de producto se cortaron del gel y se purificaron usando un kit de extracción de gel QIAquick (Q1AGEN Inc., Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Veinticinco ng de cada fragmento se radiomarc6 con 32p usando un kit Prime It 11 (Stratagene, La Jolla, CA).
[0339] Aproximadamente 90.000 placas de la biblioteca descrita en el ejemplo 6 se seleccionaron por hibridación de placa usando los tres fragmentos de PCR marcados como las sondas. EI ADN se reticul� sobre membranas (Hybond N+, Amersham, Arlington Heights, IL) usando un UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA). Cada fragmento de gen 32p_ radiomarcado se desnaturaliz� ariadiendo hidróxido sádico a una concentración final de 0,1 M, ~ se ariadi� a una solución de hibridación con 6X SSPE, 7% de SOS a una actividad de aproximadamente 1 x 10 a cpm por mi de solución de hibridación. Cada una de las mezclas se incub� durante toda la noche a 55"C en un bario maría de agitaci�n. Después de incubaci�n, las membranas se lavaron tres veces durante quince minutos en 0,2X SSC con 0,1% de SOS a 65"C. Las membranas se secaron en papel secante durante 15 minutos, se envolvieron en SaranWrap"N y se expusieron a película de rayos X durante toda la noche a 70"C con pantallas intensificantes (Kodak, Rochester, NY).
[0340] Basado en la producción de seriales de hibridación fuertes con las sondas GH61 anteriormente descritas, diferentes placas se eligieron para estudio posterior. Las placas se purificaron dos veces en células de E. col� Y1090ZL y los genes insertados y el pl�smido pZL 1 se cortaron posteriormente del vector AZipLox como derivados pZL 1 (D'Alessio et al., 1992, Focus� 14:76) usando escisión de in vivo por infección de células de E. coli DH1 0BZL (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las colonias se inocularon en tres mi de LB más 50 �.Jg/ml de medio de ampicilina y crecieron durante toda la noche a 37"C. ADN miniprep se prepar� a partir de cada de estos cultivos usando un Biorobot 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Clan pEJG120 (Figura 12) se mostr6 por secuenciaci6n de AON para contener el gen gen�mico en toda su longitud para GH61 B.
[034 1] Los genes gen�micos en toda su long itud para GH61C y GH61 D se aislaron de la misma manera como se describe para GH61 B.
[0342] E. coli pEJG120 con pl�smido pEJG120 se deposit� con la Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northem Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IIlinois, 61604, con una fecha de depósito de 19 de diciembre de 2003.
[0343] Para depósito, el gen Tter61C fue amplificado por PCR de su construcción de expresión pEJG11 1 (véase ejemplo 13, Figura 13) con los cebadores mostrados debajo.
Cebador directo InFusion: 5'-ACAACTGGATTTACCATGCGGTTCGACGCCTC-3' (SEC ID nO: 36) Cebador inverso Infusion: 5'-GTCAGTCACCTCTAGTTACTAAAACTCGAAGCC-3' (SEC ID nO; 37)
Las letras en negrita representan secuencia codificante. La secuencia restante contiene identidad de secuencia en los sitios de inserción de pAILo2.
[0344] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores de arriba se usaron en una reacción PCR con 50 ng de pEJG111 ADN, 1X Pb tampón de amplificación (Invitrogen, Carlsbad, CA), 6 �.JI de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP Y dCTP, 1 �.JI de 50 mM de MgS04, 5 �.JI de 10X pCRx solución intensificadora (Invitrogen, Carlsbad, CA), y 2,5 unidades de platino ADN polimerasa prlt (Invitrogen, Carlsbad, CA), en un volumen final de 50 IJI. Un Eppendorr Mastercycler 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY) se us� para amplificar el fragmento de ADN y se program� para un ciclo a 98"C durante 2 minutos y 35 ciclos cada uno a 94"C durante 30 segundos, 60"C durante 30 segundos y 68"C durante 1 minuto. Después de los 35. la reacción se incub� a 68"C durante 10 minutos y luego se enfri� a 10"C hasta procesado posterior. Un producto de reacción PCR de aproximadamente 800 pares de bases se aisl� en 0,8% de gel de agarosa GTG (Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ) usando tampón TAE y 0,1 I-Ig de bromuro de etidio por mI. La banda de ADN se visualizó con la ayuda de un Dark Reader"N (Ciare Chemical Research, Dolores, COl para evitar mutaciones inducidas por los UV. Los 800 pares de bases de banda de AON se cortaron con una hoja de afeitar desechable y se purificaron con un Ultrafree-OA Spin Cup (Millipore, Billerica, MA) según las instrucciones del fabricante.
[0345] La banda de AON purificada se clon� en un vector pCR4-Blunt TOPO según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Dos microlitros de la reacción TOPO se transformaron en células de E. coli TOP10 según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Car1sbad, CA). Las células transformadas se colocaron en placas sobre placas de agar 2X YT complementadas con 100 I1g de ampicilina por mi y se incubaron durante toda la noche a 3rC.
[0346] Ocho colonias se seleccionaron al azar para preparación de ADN pl�smido. Cada colonia creció durante toda la noche en 3 mi de LB complementado con 100 I1g de ampicilina por mI. De estos cultivos, 10 111 se us� para inocular en el lugar de una placa de agar 2X YT complementada con 100 I1g de ampicilina por mi para tener una materia prima bacteriana de cada colonia. El resto del cultivo se us� luego para preparar ADN pl�smido con un QIAGEN BioRobot 9600. Clones se analizaron por digestión de enzima de restricción Eco RI. Ocho clones tuvieron el modelo de digerido
OyeTIol
de restricción previsto. De estos clones, tres se ordenaron luego con química de terminador Big_como se ha descrito anteriormente, usando cebadores directos e inversos M13 estándar. Todos los tres clones mostraron tener la secuencia correcta del gen Tter61 E. Clan #7 se renombr� pTter61C (Figura 15) y su materia prima bacteriana se resembr� sobre una placa de 2X YT fresco complementada con 100 I1g de ampicilina por mi y incubada durante toda la noche a 37Q C. De esta placa, células se usaron para inocular dos 1,8 mi de crioviales con aproximadamente 1,5 mi de agarosa LB complementada con 100 I1g de ampicilina por mI. Los viales se sellaron con PetriSeal TIol (Diversified Biotech, Bastan MA) y se depositaron con la Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 Universily Street, Peoria, IIlinois, 61604, como pTter61 G NRRL B-30811, con fecha de depÓSito 21 de enero de 2005.
[0347] Para depósito, el gen Tter61 D fue amplificado por PCR a partir de su construcción de expresión pEJG112 (véase el ejemplo 13, Figura 14) con los siguientes cebadores.
Cebador directo: 5'-CATGCCATGGATGCTTCTCAC-3' (SEC ID nO: 38) Cebador inverso: 5'-CCTIAATIAATCAGGCGGTGAAGTC-3' (SEC ID nO: 39)
Letras en negrita representan secuencia cadificante. La secuencia restante contiene sitios de restricción únicos para futuros experimentos de clonaci�n.
[0348] La reacción PCR se realizó como se ha descrito anteriormente excepto con pEJGI12. Un producto de reacción PCR de aproximadamente 1 kb se aisl� en 0,8% de gel de GTG-agarosa usando tampón TAE y 0,1 I1g de bromuro de etidio por mI. La banda de AON se visualizó con la ayuda de un Dark ReaderTIol para evitar mutaciones inducidas por los UV. La banda de ADN 1 kb se cort� con una hoja de afeitar desechable y se purificó con un kit de purificación QIAquick PCR según las instrucciones del fabricante (QIAGEN Inc., Valencia, CA). La banda de AON purificada se clon� en el vector pCR4-Blunt TOPO según las instrucciones del fabricante y transformantes de células de E. coli TOP10 se aislaron como se ha descrito anteriormente.
[0349] Diez colonias se seleccionaron al azar para preparación del AON pl�smido. Cada colonia creció durante toda la noche en 3 mi de LB complementado con 100 I1g de ampicilina por mi y usada para preparar ADN pl�smido con un QIAGEN 8ioRobot 9600. Clones se analizaron por digestión de enzima de restricción Eco RI para confirmar la presencia del inserto clonado. Todos los diez clones tuvieron el modelo de digestión de restricción previsto. De estos clones cinco se ordenaron luego con química del terminador de Big-Dye TIol como se ha descrito anteriormente, usando cebadores directos e inversos M13. Uno de estos clones mostr� que tenía la secuencia correcta del gen Tter61 D. Este clan se renombr� pTter61 D (Figura 16) y se retransform� en células de E. coli TOP10 como se ha descrito anteriormente. De una única sembra de colonia, células se usaron para inocular dos crioviales de 1,8 mi con aproximadamente 1,5 mi de agarosa LB complementado con 100 I1g/ml de ampicilina por mI. Los viales se sellaron con PetriSealTIol y se depositaron con la Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 Universily Street, Pearia, lIIinois, 61604, como pTter61 D NRRL 8-30812, con fecha de depósito 21 de enero de 2005.
Ejemplo 8: Construcción de librerla de ADNc de etiquetas de secuencia expresadas (EST)
[0350] Dos mi de alícuota de un cultivo líquido de 24 horas (SO mi de medio NNCYPmod complementado con 1% de glucosa en matraz 250 mi, 45"C, 200 r.p.m.) de Tll�elav�a IflrTeslris NRRL 8126 se us� para sembrar un matraz 500 mi con 100 mi de medio NNCYPmod complementado con 2% de Sigmacell-20. El cultivo se incub� a 45"C, 200 r.p.m. durante 3 días. Los micelios se cosecharon por filtración a través de una unidad de filtración desechable con un prefiltro de fibra de vidrio (Nalgene, Rochester NY), se lav� dos veces con 10 mM de Tris-HCI-1 mM de EDTA pH 8 (TE), Y se congel� rápidamente en nitrógeno líquido.
[0351] El ARN total se aisl� usando el siguiente método. Micelios congelados de Thielav�a terrestris NRRL 8126 se molieron en un molinillo de café eléctrico. El material molido se mezcl� 1:1 VN con 20 mi de Fenazol (Ambion, Inc., Austin, TX) en un tubo Falcon de SO mI. Una vez los micelios se suspendieron, estos se extrajeron con cloroformo y tres veces con una mezcla de alcohol de fenol-cloroformo-isoamil 25:24:1 v/v/v. De la fase acuosa resultante, el ARN se precipit� al'iadiendo volumen 1/10 de 3 M de acetato sádico pH 5,2 Y 1,25 volúmenes de isopropanol. El precipitado de
ARN se recuper� por centrifugado a 12.000 x g durante 30 minutos a 4QC. El granulado final se lav� con etanol 70% frío, se secó at aire y se resuspendi� en 500 mt de agua tratada con dietilpirocarbonato (agua DEPC).
[0352] La calidad y cantidad del ARN purificado se evalu� con un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA). ARNm poliadenilado se aisl� de 360 �Jg de ARN total con la ayuda de un kit Poly(A) Purist Magnetic (Ambion, Inc., Austin, TX) según las instrucciones del fabricante.
[0353] Para crear la genoteca de ADNc, un kit CloneMiner ..... (Invitrogen, Carlsbad, CA) se emple� para construir una biblioteca direccional que no requiere el uso de donación de enzima de restricción, reduciendo as� el número de clones quiméricos y sesgo de tamaf'io.
[0354] Para asegurar la síntesis exitosa del ADNc, dos reacciones se realizaron en paralelo con dos concentraciones diferentes de ARNm (2,2 y 4,4 �Jg de poli(A)' ARNM). Las muestras de ARNm se mezdaron con un cebador BiotinattB2-0Iigo(dt) (kit CloneMiner ..... , Invitrogen, Carlsbad, CA), 1X primer tampón de cadena (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 �JI de 0,1 M de DTT, 10 mM de cada dNTP, yagua a un volumen final de 18 y 16 �JI respectivamente.
[0355] Las mezclas de reacción se mezclaron cuidadosamente y luego 2 y 4 �JI de transcriptasa inversa SuperScript""" (Invitrogen, Carlsbad, CA) se af'iadieron e incubaron a 45QC durante 60 minutos para sintetizar la primera cadena complementaria. Para segunda síntesis de cadena, para cada reacción de primera cadena se af'iadi� 30 �JI de 5X tampón de segunda cadena (Invitrogen, Carlsbad, CA), 3 �JI de 10 mM de cada dNTP, 10 unidades de ADN ligasa de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA), 40 unidades de ADN polimerasa I de E.coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 2 unidades de ribonucleasa H de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un volumen total de 150 �JI. Las mezclas se incubaron luego a 16QC durante dos horas. Después de la incubaci�n de dos horas, 2 �JI de ADN pol imerasa T4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) se af'iadieron a cada reacción y se incubaron a 16 QC durante 5 minutos para crear un ADNc de extremo romo. Las reacciones de ADNc se extrajeron con una mezcla de alcohol de fenol-cloroformo-isoamil 25:24:1 vlvfv y se precipitaron en presencia de 20 �Jg de glic�geno, 120 �JI de 5 M de acetato am�nico y 660 �JI de etanol. Después de centrifugado a
12.000 x g, 4QC durante 30 minutos, los gránulos de ADNc se lavaron con etanol frío 70%, se secaron al vacío durante 2-3 minutos y se resuspendieron en 18 �JI de agua DE PC. Por cada muestra de ADNc resuspendida se a�adi� 10 �JI de 5X tampón adaptado (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 �Jg de adaptador atfB1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 7 �JI de 0,1 M de DTT Y 5 unidades de ADN ligasa T4 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
5'-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAAGTTGG-3' (SEC ID nO: 40) 3'-CCCCTGTTGAAACATG II II II CAACCp-5' (SEC ID nO: 41)
[0356] Reacciones de ligamiento se incubaron durante toda la noche a 16QC. Exceso de adaptadores se retir� por cromatograf�a de exclusión de tamaf'io con 1 mi de resina Sephacryl""" S-500 HR (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Fracciones de columna se recogieron según las instrucciones del kit CloneMiner""" y las fracciones 3 a 14 se analizaron con un Agilent Bioanalyzer para determinar la fracción en la que los adaptadores attB1 comenzaron eluci�n. El análisis mostr� que los adaptadores comenzaron eluci�n fracción alrededor de eluci�n 10 o 11. Para las primeras fracciones de la biblioteca 6 a 11 se agruparon y para las segundas fracciones de la biblioteca 4-11 se agruparon.
[0357] Clonaci�n del ADNc se realizó por recombinación de ADN homóloga según el protocolo Gateway System (Invitrogen , Carlsbad, CA) usando BP Clonase""" (Invitrogen, Carlsbad, CA) como la recombinasa. Cada reacción de recombinación de BP donase""" contuvo aproximadamente 70 ng de attB-flanqueado-ADNc, 250 ng de pDONR"""222 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 �JI de 5X tampón de BP Clonase """ (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 �JI de TE y 3 �JI de BP Clonase""". Reacciones de recombinación se incubaron a 25QC durante toda la noche.
[0358] Reacciones de recambinaci�n activadas por calor BP se dividieron luego en 6 partes alícuotas y se sometieron a electroporaci�n en las células electrocompetentes ElectroMax """ DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando un BioRad Gene Pulser 11 (BioRad, Hercules, CA) con los siguientes parámetros: 2,0 kV, 200 O Y 25 �JF. Las células sometidas a electroporaci�n se resuspendieron en 1 mi de SOC y se incubadron a 3rC durante 60 minutos con agitaci�n constante (200 r.p.m.). Después del periodo de incubaci�n, las células transformadas se agruparon y se mezclaron 1:1 con medio refrigerante. 200 �JI de alicuota se retir� para titulación de biblioteca y luego el resto de cada biblioteca se dividió en partes alícuotas en 1,8 mi de crioviales (Wheaton Science Products, Millville, NJ) y se almacen� congelado a -80QC.
[0359] Cuatro diluciones en serie de cada biblioteca se prepararon: 11100, 111000, 1/104, 1/10s. De cada dilución, 100 �JI se colocaron en placas sobre placas LB 150 mm complementados con 50 tJg de kanamicina por mi y se incubaron a 3rC durante toda la noche. El número de colonias en cada placa de dilución se contaron y se usaron para calcular el número total de transformantes en cada biblioteca.
[0360] La primera biblioteca mostr� tener 5.4 millones de clones independientes y la segunda biblioteca mostr� tener 9 millones de clones independientes.
Ejemplo 9: Preparación de molde y secuenciaci�n nucle6tida de clones de ADNc
[0361] Partes alícuotas de ambas bibliotecas se mezclaron y colocaron sobre placas LB 25 x 25 cm complementado con 50 I-Ig de kanamicina por mI. Colonias individuales se dispusieron sobre placas de 96 pocillos con 100 1-11 de medio LB complementado con 50 !Jg de kanamicina por mi con la ayuda de un robot Genetix QPix (Genetix Inc. , Bastan, MA). Cuarenta y cinco placas de 96 pocillos se obtuvieron para un total de 4320 clones individuales. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37"C con agitaci�n a 200 r.p.m. Tras la incubaci�n, 100 !JI de glicerol 50% estéril se al'iadi� a cada pocillo. Los transformantes se replicaron con la ayuda de una herramienta de 96 pines (Boekel, Feasterville, PA) en placas hondas secundarias de microcultivo de 96 pocillos (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD) con 1 mi de Magnificent Broth TIol (MacConnell Research, San Diego, CA) complementado con 50!Jg de kanamicina por mi en cada pocillo. Las placas de microtitulaci�n primarias se almacenaron congeladas a _80�C. Las placas hondas secundarias se incubaron a 37"C durante toda la noche con agitaci�n vigorosa (300 r.p.m.) en un agitador rotatorio. Para prevenir vertido y contaminación cruzados y para permitir aireación suficiente, cada placa de cultivo seamdaria se cubrió con una almohadilla de polipropileno (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD) y una cobertura de plato de microtitulaci�n plástica. ADN pl�smido se prepar� con un MWG RobotSmart 384 (MWG Biotech Inc., High Point, NC) y kits Montage Plasmid Miniprep (Millipore, Billerica, MA).
[0362] Reacciones de secuenciaci�n se realizaron usando química de terminador Big-Dye TIoI (Giesecke et al., 1992, Joumal of Virology Methods 38: 47-60) y un cebador de secuenciaci�n directo M13 (-20):
5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' (SEC ID nO: 42)
[0363] Las reacciones de secuenciaci�n se realizaron en un formato de 384 pocillos con un Robot-Smart 384 (MWG Biotech Inc., High Point, NC). Eliminación de terminador se realizó con kits Millipore MultiScreen Seq384 Sequencing Clean-up (Millipore, Billerica, MA). Las reacciones contuvieron 6 !JI de ADN pl�smido y 4 !JI de mezcla maestra de secuenciaci�n con 1 !JI de 5X tampón de secuenciaci�n (Millipore, Billerica, MA), 1 !JI de terminador de Big_DyeTIol (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), 1,6 pmols de cebador directo M13 y 1 !JI de agua. Secuenciaci�n del ADN monopaso se realizó con un ABI PRISM Automated DNA Sequencer Model 3700 (Applied Biosystems, Foster city, CA).
Ejemplo 10: Análisis de datos de secuencia de ADN de clones de ADNc
[0364] Llamada de base, asignación de valor de calidad y recorte de vector se realizaron con la asistencia de software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA). Análisis de agrupamiento de los EST se realizó con un Parcel Transcript Assembler v. 2.6.2. (Paracel, Inc., Pasadena, CA). Análisis del agrupamiento de EST indicó la presencia de 395 cl�steres independientes.
[0365] Análisis de homología secuencial del las secuencias EST ensambladas contra la base de datos PIR se realizó con el programa Blastx (Altschul et. a/., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) en un cl�ster de Linux de 32 nodos (Paracel, Inc., Pasadena, CA) usando la matriz BLOSUM 62 (Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). De los 395 clusters, 246 tuvieron una identidad significante para genes conocidos en la base de datos de proteína pública y 149 no tuvo ninguna identidad significativa contra esta base de datos. Entre estos 246 cl�steres, 13 tuvieron golpes contra homólogos bien caracterizados de genes de glicosil hidrolasa.
Ejemplo 11: Identificación de clones de ADNc que codifican dos polip�ptidos de la familia 61 con actividad de mejora celulol�tica (GH61 E Y GH61 G)
[0366] Dos clones de ADNc que codifican polip�ptidos de la familia 61 con actividad de mejora cetulolitica (GH61 E Y GH61 G) se identificaron inicialmente por su identidad para la proteína de la familia 61 a partir de Va/variella va/vacea (GenPept 949333361). Este análisis indicó que las proteínas fueron 41% y 38%, respectivamente, idénticos a la V. velvacea al nivel de proteína sobre un extensión de 289 amino�cidos (867 pares de bases). Después de esta identificación inicial, el clones de EST Tter39E1 y Tter39H8 se recuperaron de sus placas de materia prima original congelada y se sembraron sobre LB complementado con 50 !Jg de kanamicina por mI. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37�C y el día siguiente una única colonia de cada placa se us� para inocular 3 mi de LB complementado con 50 !Jg de kanamicina por mI. Los cultivos I1quidos se incubaron durante toda la noche a 37"C y ADN pl�smido se prepar� con un QIAGEN BioRobot 9600. ADN pl�smido de cada clan de EST se orden� nuevamente con quimica de terminador de Big-Oye TIol como se ha descrito anteriormente, usando el cebador directo M1 y un cebador poly-T mostrado a continuación a la secuencia del 3' final del clon.
5'-1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 11 I 1 I 1 I 1 I 1 I 11 VN-3' (SEC ID nO: 43)
[0367] Donde V=G, A, o e y N= G, A, e, o T
[0368] Análisis de secuencias de clan Tter39E1 indicó que este clan no era de longitud completa y faltaban algunos nucleótidos al 5' final ya que no tiene un cod6n de inicio "ATG". Para obtener un clon de longitud completa, un par de cebadores se diseñaron amplificar el 5' final de este gen de la agrupación de ADNc original usada para construir la biblioteca.
[0369] El cebador sentido o directo se dise�� para encontrar el adaptador attB1 usado durante la construcción de la genoteca de AONc y el cebador inverso se dise�� para amplificar de aproximadamente 350 pares de bases deiS' final truncado, como se muestra debajo.
5 Cebador attB1 : 5'-GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3' (SEC ID nO: 44) Cebador inverso: 5'-AAAGGTAGGATGGTCCTCGTACACCTT-3' (SEC ID nO: 45)
10 [0370] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores de arriba se usaron en una reacción PCR con 1 1.11 del AONc agrupado, 1X tampón de amplificación Taq (New England BioLabs, Beverly. MA), 6 1.11 de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP Y dCTP, y 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq polimerasa (New England BioLabs, Beverly, MA), en un volumen final de 50 1.11. Un Eppendorf Mastercycler 5333 se us� para amplificar el fragmento programado para un ciclo a 98"C durante 2 minutos; 5 ciclos cada a 96"C durante 30 segundos, 55"C durante 30 segundos y 68"C durante 1
15 minuto; y 35 ciclos cada uno a 96"C durante 30 segundos, 61 "C durante 30 segundos, y 68"C durante 1 minuto. Después de los 35 ciclos, la reacción se incub� a 68"C durante 10 minutos y luego se enfri� a 10"C hasta proceso posterior.
[0371] Un producto de reacción PCR (aproximadamente 400 pares de bases) se aisl� en 0,8% de gel de GTG-agarosa
20 usando un tampón TAE y 0,1 I.Ig de bromuro de etidio por mI. La banda de AON se visualizó con la ayuda de un Dark ReaderTIol para evitar mutaciones inducidas por UV. Los 400 pares de bases de la banda de AON se cortaron con una hoja de afeitar desechable y se purificaron con una Ultrafree-DA Spin Cup según las instrucciones del fabricante. La banda de ADN purificada se clon� en un vector pCR2.1 TA-TOPO según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Dos microlitros de la reacción TA se transformaron en células E. coliTOP10 según las instrucciones del
25 fabricante. Las células transformadas se colocaron luego sobre placas de agar 2X YT complementadas con 100 I.Ig/ml de ampicilina y se incubaron durante toda la noche a 37"C. Ocho colonias se seleccionaron aleatoriamente para preparación de ADN pl�smido. Cada colonia creció durante toda la noche en 3 mi de medio LB complementado con 100 I.Ig de ampicilina por mi y ADN pl�smido se obtuvo a partir de cada uno usando un QIAGEN BioRobot 9600. Los clones se analizaron por digestión de enzima de restricción Eco RI. Todos los ocho clones tuvieron el modelo de digestión de
30 restricción prevista. A partir de estos tres clones se ordenaron luego con química de term inador Big-Dye TIol como se ha descrito anteriormente, usando un cebador inverso M13 estándar. Análisis de secuencias indicaron que todos los tres clones tienen un 5' final completo y que al clan EST pTter39E1 original le faltaron solo cinco nucleótidos en el 5' final.
[0372] De la secuencia en toda su longitud de los cebadores PCR Infusion del gen Tter61 R se disefiaron como se
35 muestra debajo para amplificar el gen truncado, para clonaci�n en el vector de expresión pAIL02 y afiadir al mismo tiempo los 5 nucleótidos que faltan en su 5' final.
Cebador directo en fusión: 5'-ACTGGATTACCATGCTCGCAAACGGTGCCATCGTCT-3' (SEC ID nO: 46)
40 Cebador inverso en fusión: 5'-TCACCTCTAGTTAATTAATCAGCAGCTGAAGACGGCCG-3' (SEC ID nO: 47)
Las letras en negrita representan secuencia codificante. Las letras en negrita y subrayadas representan los cinco nuc!e�tidos que faltan deiS' final del gen como se ha descrito anteriormente. La secuencia restante contiene identidad 45 de secuencia en los sitios de inserción de pAIL02.
[0373] La reacción PCR se llev� a cabo como se describe en el ejemplo 7 excepto con pTter39E1. Un producto de reacción PCR de aproximadamente 700 pares de bases se aisl� en un 0,8% de gel de GTG-agarosa usando tampón TAE y 0,1 I.Ig de bromuro de etidio por mI. La banda de ADN se visualizó con la ayuda de un Dark Reader™ para evitar
50 mutaciones inducidas por los UV. La banda de AON de 700 pares de bases se cort� con una hoja de afeitar desechable y se purificó con una Ultrafree-DA Spin Cup según las instrucciones del fabricante.
[0374] La banda de AON purificada se clon� en el vector pCR4-Blunt TOPO según las instrucciones del fabricante y transformantes de células E. coliTOP10 se aislaron como se describe en el ejemplo 7. Ocho colonias se seleccionaron 55 aleatoriamente para preparación del AON pl�smido. Cada oolonia creció durante toda la noche en 3 mi de LB complementado con 100 I.Ig de ampicilina por mi y se us� para preparar AON pl�smido con un QIAGEN BioRobot 9600. Los clones se analizaron por digestión de enzima de restricción Pac I/Pst 1. Siete de ocho clones tuvieron el patrón de digestión de restricción previsto. De estos siete clones, tres se secuenciaron luego con química de terminador Big-Dye™ como se ha descrito anteriormente, usando cebadores directos e inversos M13 estándar. Todos los tres clones 60 mostraron tener la secuencia oorrecta del gen Tter61 E. Clon #2 se renombr� pTter61 E (Figura 17) y se retra nsform� en células de E. coli TOP10 como se ha descrito anteriormente. De una única colonia sembrada, células se usaron para inocular dos crioviales de 1,8 mi con aproximadamente 1,5 mi de agarosa LB complementada con 100 I.Ig/ml de ampicilina por mI. Los viales se sellaron con PetriSeal™ y se depositaron con la Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northem Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IIlinois, 61604, como pTter61E
65 NRRL B-30814, con fecha de depósito 21 de enero 21 de 2005.
[0375] Una vez la identidad del clon Tter39H8 se confirm�, el pl�smido se renombr� pTter61G (Figura 18). 0,5 IJI de alícuota de AON pl�smido de este clon se transfirió en un frasco de células de E. coli TOP1 O, se mezcl� suavemente y se incub� en hielo durante 10 minutos. las células se sometieron a choque térmico luego a 42Q C durante 30 segundos y se incubaron nuevamente en hielo durante 2 minutos. Las células se resuspend ieron en 250 ~I de SOC y se incubaron a 3rC durante 60 minutos con agitaci�n constante (200 r.p.m.). Después del periodo de incubaci�n, dos partes alícuotas de 30 IJI se colocaron sobre placas LB complementadas con 50 IJg de kanamicina por mi y se incubaron durante toda la noche a 3rC. El día siguiente una única colonia se seleccion� y sembr� sobre una placa 2X YT fresca complementada con 50 IJg de kanamicina por mi y se incub� durante toda la noche a 3rC. De esta placa, células se usaron para inocular dos crioviales de 1,8 mi con aproximadamente 1,5 mi de agarosa LB complementada con 50 IJg de kanamicina por mi. Los viales se sellaron con PetriSeal™ y se depositaron con la colección de Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, lIIinois, 61604, como pTter61G NRRL B-30811 , con fecha de depósito 21 enero de 2005.
Ejemplo 12: Caracterización de las secuencias gen�micas de ThieJavla terrestris que codifican polip�ptidos de la familia GH61 B, GH61C y GH61 D con actividad de mejora celulol�tica y secuencias de ADNc que codifican polip�ptidos de la familia GH61G y GH61 E con actividad de mejora celulolitica.
[0376] Secuenciaci�n del AON del clon gen�mico (clon 15) de Thielavia terrestris GH61 B Y superposición múltiple de clones gen�micos GH61C y GH61 O clones gen�micos se realizó con un Applied Biosystems Model 3700 Automated ONA Sequencer usando quimica de terminador BigOye™ version 3.1 y química de dGTP (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) y estrategia de "primer walking". Datos de secuencia de nucleótidos se escrutinaron para calidad y todas las secuencias se compararon entre s� con asistencia de software PHREOIPHRAP (University of Washington, Seattle, WA).
[0377] Modelos de gen para las secuencias de AON gen�mico de Thielavia te"estris GH61 B, GH61C y GH61 O se construyeron basadas en similitud con genes homólogos de Diplodia gossypina, Trichophaea saccata y Pseudoplectania nigrella.
[0378] La secuencia de nucleótidos (SEC ID nO: 1) Y secuencia de amino�cidos deducida (SEC ID nO: 2) del gen de Thielavia te"estris GH61 se muestra en las figuras 1 A Y 1 B. La secuencia codificante es 1104 pares de bases que incluye el cod�n de terminación y se interrumpe por intrones de 60 y 63 pares de bases. la proterna codificada predicha es 326 amino�cidos. La región de codificación es 65,8% G+C. Usando el programa SignalP (SignaIP), un p�ptido sel'ial de 19 residuos se predijo. La proteína predicha madura contiene 307 amino�cidos con una masa molecular de 31 ,3 kDa.
[0379] Análisis de la secuencia de amino�cidos deducida del gen GH61 B con el programa Interproscan (Zdobnov and Apweiler, 2001, Bioinformatics 17: 847-848) mostr� que el gen GH61 B contuvo la firma de secuencia del dominio de enlace de celulosa f�ngica. Esta firma de secuencia conocida como el patrón Prosite PS00562 (Sigrist et al., 2002, Brief Bioinform. 3: 265-274) se encontr� de aproximadamente los residuos 271 a 307 del polip�ptido maduro.
[0380] Un alineamiento comparativo de secuencias de amino�cidos se determin� usando el algoritmo de SmithWaterman (Waterman et al., 1976, Adv. Math. 20: 367) con penalizaci�n abierta de espacio de 11, penalizaci�n de extensión del espacio de 1 y la matriz BLOSUM62. El alineamiento mostr� que la secuencia de amino�cidos deducida del gen de Thielavia te"estris que codifica un polip�ptido de la familia GH61 B con actividad de mejora celulol�tica compartió 70% y 64% de identidad (incluyendo espacios) con las secuencias de amino�cidos deducidas de dos proteínas de la familia 61 de Neurospora crassa (número de acceso EAA26873 y EAA36262).
[0381] la secuencia de nucleótidos (SEC ID nO: 3) y la secuencia de amino�cidos deducida (SEC ID nO: 4) del gen de Thielavia terrestris GH61C se muestran en la figura 2. La secuencia codificante es 778 pares de bases que incluye el cod�n de terminación y se interrumpe por un intr�n de 58 pares de bases. La proteína codificada predicha es 240 amino�cidos. La región codificante es 66,2% G+C. Usando el programa SignalP, un p�ptido sel'ial de 17 residuos se predijo. La proteina predicha madura contiene 223 amino�cidos con una masa molecular de 24,1 kDa.
[0382] Un alineamiento comparativo de secuencias de amino�cidos se determin� usando el algoritmo de Smith-Walerman (Walerman el al., 1976, Adv. Malh. 20: 367) con penalizaci�n abierta de espacio de 11, penalizaci�n de extensión del espacio de 1 y la matriz BLOSUM62. El alineamiento mostr� que la secuencia de amino�cidos deducida del gen Thielavia terrestris que codifica un polip�ptido de la familia GH61C con actividad de mejora celulol�tica compartió 76% y 72% de identidad con las secuencias de amino�cidos deducidas de dos proteínas de la familia 61 de Neurospora craSS8 (número de acceso Q9P3R7 y Q7RV41 , respectivamente).
[0383] La secuencia de nude6tidos (SEC ID nO: 5) y la secuencia de amino�cidos deducida (SEC ID nO; 6) del gen de Thielavia lerreslris GH61 D se muestran en la figura 3. La secuencia codificante es 913 pares de bases que incluye el cod�n de terminación y se interrumpe por intrones de 70 y 66 pares de bases. La proteína codificada predicha es 258 amino�cidos. La regi6n codificante es 63,1% G+C. Usando el programa SignalP, un p�ptido sel'ial de 19 residuos se predijo. La proteina predicha madura contiene 239 amino�cidos con una masa molecular de 25,7 kDa.
65 El0180389
[03B4] Un alineamiento comparativo de secuencias de amino�cidos se determin� usando el algoritmo de SmithWaterman (Waterman et al., 1976, Adv. Math. 20: 367) con penalizaci�n abierta de espacio de 11 , penalizaci�n de extensión del espacio de 1 y la matriz BLOSUM62. El alineamiento mostr� que la secuencia de amino�cidos deducida del gen de Thielavia ten-estris que codifica un polip�ptido de la familia GH61 D con actividad de mejora celulol�lica compartió 53% y 53% de identidad con las secuencias de amino�cidos deducidas de dos proteínas de la familia 61 de Neurospora crassa (número de acceso Q9P3R7 y Q7RV41 , respectivamente).
[0385] La secuencia de AONc (SEC ID nO: 7) y la secuencia de amino�cidos deducida (SEC ID nO: 8) del gen de Thielavia terrestris GH61 E se muestran en la figura 4. La secuencia codificante es 681 pares de bases que incluye el cod�n de terminación. La proteína codificada predicha es 226 amino�cidos. El % de contenido G+C di clon de AONc GH61E es 65,6% y de la región codificante de proteína madura (nucleótidos 55 a 681 de la SEC ID nO: 7) es 65,4%. Usando el programa SignalP, un p�ptido señal de 18 residuos se predijo. La proteína pred icha madura contiene 208 amino�cidos con una masa molecular de 22,3 kOa.
[0386] Un alineamiento comparativo de secuencias de amino�cidos se determin� usando el algoritmo de SmithWaterman (Waterman et al., 1976, Adv. Math. 20: 367) con penalizaci�n abierta de espacio de 11, penalizaci�n de extensión del espacio de 1 y la matriz BLOSUM62. El alineamiento mostr� que la secuencia de amino�cidos deducida del gen de Th�elavia ten-estris que codifica un polip�ptido de la familia GH61 E con actividad de mejora celulol�lica compartió 73% y 53% de identidad con las secuencias de amino�cidos deducidas de una proteína de la familia 61 de Neurospora crassa (número de acceso Q873Gl) y otro de Magnaporthe grisea (número de acceso EAA54517), respectivamente.
[0387] La secuencia de nude�tidos (SEC ID nO: 9) y la secuencia de amino�cidos deducida (SEC ID nO: 10) del gen de Thielav�a terrestris GH61 G se muestran en la fi9ura 5. La secuencia codificante es 915 pares de bases que incluye el cod�n de terminación. La proteína codificada predicha es 304 amino�cidos. El % de contenido G+C del clon de ADNc GH61 G es 64,5% y de la re9i�n codificante de proteína madura (nucleótidos 58 a 912 de la SEC ID nO: 9) es 64,4%. Usando el programa SignalP, un p�ptido señal de 19 residuos se predijo. La proteína predicha madura contiene 285 amino�cidos con una masa molecular de 30,0 kOa.
[0388] Análisis de la secuencia de amino�cidos deducida del gen GH61 G con el programa Interproscan mostr� que el gen GH61 G contuvo la firma de secuencia del dominio de enlace de celulosa f�ngica. Esta firma de secuencia estuvo presente de aproximadamente los residuos 271 a 304 del polip�ptido maduro.
[0389] Un alineamiento comparativo de secuencias de amino�cidos se determin� usando el algoritmo de Smith-Waterman (Waterman et al., 1976, Adv. Math. 20: 367) con penalizaci�n abierta de espacio de 11 , penalizaci�n de extensión del espacio de 1 y la matriz BLOSUM62. El alineamiento mostr� que la secuencia de amino�cidos deducida del gen Thielavia terrestris que codifica un polip�ptido de la familia GH61 G con actividad de mejora celulol�tica compartió 61 % y 61 % de identidad con las secuencias de amino�cidos deducidas de una proteína de la familia 61 de Neurospora crassa (número de acceso Q7SCJ5) y otro de G�bberella zeae (número de acceso EAA72972), respectivamente.
[0390] Un alineamiento comparativo de secuencias de la familia 61 de Th�elavia teffestris NRRL 8126 se determin� usando el método MAFFT NW con refinamiento iterativo y parámetros predeterminados (Katoh el al., 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059). Una matriz de identidad se calcul� usando software LASERGENP'" MEGALlGNTM (ONASTAR, Inc., Madison, WI). Los resultados del alineamiento se muestran en la tabla 1.
Tabla 1. Alineamiento de secuencias polipepl�dicas de Th�elavia teffestris GH61
Porcentaje de identidad
Divergencia
1
2 3 4 5
1
59,6 35,2 33,2 31,2 1 Thielavia teffestn's GH61C
2
59,6 32,2 27 ,5 26,7 2 Thielavia teffestn's GH61D
3
135,0 138,4 43,3 41,7 3 Thielavia teffestn's GH61G
4
142,6 174,6 129,6 42,1 4 Th�elavia teffestn's GH61E
5
134,4 157,0 116,4 98.8 5 Th�elavia teffestn's GH61B
1
2 3 4 5
Ejemplo 13: Construcción de un vector de expresión de Aspergillus oryzae para los genes de la familia de Thielavia terrestris GH61 B, GH61C, Gh61 D, GH61 E y GH61 G
[0391] Dos cebadores oligonucle�tidos sintéticos mostrados debajo se disel'iaron para amplificar por PCR el gen de Thiela via terrestris de la familia GH61 B a partir del clon gen�mico. Un kitlnFusion Cloning (BD Biosciences, Palo Alto,
CA) se us� para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión, pAIL02, sin necesidad de restricción de digestión y ligamiento.
Cebador directo:
5 5'-ACTGGATTTACCATGAAGTCGTTCACCATTG-3' (SEC ID nO: 48) Cebador inverso: 5'-AGTCACCTCT AGTT AGAGGCACTGCGAGT AG-3' (SEC ID nO: 49)
Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante es homóloga a los sitios de inserción 10 de pAILo2.
[0392] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores arriba se usaron en una reacción PCR con 100 ng de clan gen�mico 15 de Thielav�a terrestris AON (preparado como se describe en el ejemplo 2), tampón de ampl ificaci�n IX Pfx, 1,5 I.It de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP. dGTP Y dCTP, 2,5 unidades de platino Ptx AON polimerasa, 1 1.11 de 50 mM
15 de MgS04 y 5 1.11 de solución intensificadora 10X pCRx en un volumen final de 50 1.11. Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94Q C durante 2 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94Q C durante 15 segundos, 55Q C durante 30 segundos y 68"C durante 3 minutos. El bloque de calor luego fue a un 4"C ciclo de remojo.
[0393] Los productos reactivos se aislaron en un 1,0% de gel de agarosa usando tampón TAE donde una banda de 20 producto 3 kb se cort� del gel y se purificó usando un kit QIAquick Gel Extraction según las instrucciones del fabricante.
[0394] El fragmento se clon� luego en el vector de expresión pAIL02 usando un kit de InFusion Cloning. El vector se digirió con endonucleasas de restricción Nco I y Pac I (usando condiciones específicas por el fabricante). El fragmento se purifiCó por electroforesis en gel y purificación de gel QIAquick. El fragmento de gen y el vector digerido se unieron en 25 una reacción que dio lugar al pl�smido de expresión pEJG108 (Figura 19) en el que transcripción del gen de la familia GH61 B fue bajo el control del promotor NA2-tpi. La reacción de ligamiento (20 1.11) se compuso por el tampón de infusión 1X (BO Biosciences, Palo Alto, CA), 1X BSA (BO Biosciences, Palo Alto, CA), 1 1.11 de enzima InFusion (diluida 1:10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 100 ng de pAIL02 digerido con Nco I y Pac I y 100 ng de producto purificado PCR de Thielavia terrestris GH61 B. La reacción se incub� a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un 1.11 de la reacción se
30 us� para transformar células de E. coli XL10 Solopac Gold (Stratagene, La Jolla, CA). Un transformante de E. coli con pEJG108 (gen GH61 B) se detect� por digestión de enzima de restricción y ADN pl�smido se prepar� usando un QIAGEN BioRobot 9600.
[0395] Los genes de Thielavia terrestris de la familia GH61 C y GH61 D se generaron de la misma manera como se ha 35 descrito anteriormente usando los siguientes cebadores.
Para Tter61 C: Cebador directo InFusion: 5'-ACAACTGGATTTACCATGCGGTTCGACGCCTC -3' (SEC ID nO: 50)
40 Cebador inverso InFusion : 5'-GTCAGTCACCTCTAGTTACTAAAACTCGAAGCC-3' (SEC ID nO: 51)
Para Tter61 O
45 Cebador directo InFusion: 5'-ACTGGATTACCATGCTTCTCACATCAG-3' (SEC ID nO: 52) Cebador inverso InFusion : 5'-AGTCACCTCTAGTTATCAGGCGGTGAAGTC-3' (SEC ID nO: 53)
50 Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante es homóloga a los sitios de inserción de pAIL02.
[0396] Transformantes de E. coli con las construcciones de expresiones correctas recombinantes pEJG111 (gen GH61C) y pEJG1 12 (gen GH61 O) se identificaron por análisis de digestión de enzima de restricción y AON pl�smido se 55 prepar� usando un QIAGEN BioRobot 9600.
[0397] Dos cebadores oligonucle�tidos sintéticos, mostrados debajo, se diseñaron para amplifican por PCR el marco de lectura abierto en toda su longitud de EST pTter61 G de Thielavia terrestris que codifica el gen de la familia GH61 G. Un kit In-Fusion Cloning (BO Biosciences, Palo Alto, CA) se us� para clonar el fragmento directamente en pAIL02.
Cebador directo InFusion: 5'-ACTGGA TIACCATGAAGGGACTTTTCAGTGC-3' (SEC ID nO: 54) Cebador inverso InFusion: 5'-TCACCTCTAGTTAATTAATTACAAGCACTGCGAGTAGT-3' (SEC ID nO: 55)
Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante contiene identidad de secuencia comparado con tos sitios de inserción de pAIL02.
[0398] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores de arriba se usaron en una reacción PCR con 50 ng de ADN pTter61G, tampón de amptificaci�n 1X Pfx, 6 111 de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP Y dCTP, 2,5 unidades de ptatino Pfx ADN polimerasa, 1 I1t de 50 mM de MgS04 y 5 IJt de sotuci�n intensificadora 10X pCRx en un votumen finat de 50 111. Un Eppendorf Mastercycler 5333 se us� para amplificar el fragmento programado para un ciclo a 98Q C durante 2 minutos: y 35 ciclos cada a 94"C durante 30 segundos, 65"C durante 30 segundos y 68"C durante 1.5 minutos. Después de los 35 ciclos, la reacción se incub� a 68"C durante 10 minutos y luego se enfri� a 10"C hasta proceso posterior. Un producto de reacción PCR 1 kb se aisl� en un 0,8% gel de GTG-agarosa usando tampón TAE y 0,1 I1g de bromuro de etidio por mI. La banda de AON se visualizó con ta ayuda de un Dark Reader'" para evitar mutaciones inducidas por los UV. La banda de ADN 1 kb se cort� con una hoja de afeitar desechable y se purificó con un UltrafreeDA Spin Cup según las instrucciones del fabricante.
[0399] El vector pA1L02 fue linealizado por digestión con Nco I y Pac 1. El fragmento se purificó por eleclroforesis en gel y ultrafiltraci�n como se ha descrito anteriormente. Clonaci�n del fragmento PCR purificado en el vector pAIL02 lineatizado y purificado se reatiz� con un kit InFusion Cloning. La reacción (20 I1t) contuvo de tampón InFusion terrestris, 1X BSA, 1 I1t de enzima InFusion (dituida 1:10), 100 ng de pAIL02 digerido con Nco t y Pac I y 50 ng det producto PCR purificado de Thielavia terrestris GH61 G. La reacción se incub� a temperatura ambiente durante 30 minutos. Dos microlitros de ta reacción se usaron para transformar c�lutas de E. coli XL 10 SoloPaC� a Gotd (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. DespuÉS del periodo de recuperación, dos partes alícuotas de 100 111 de la reacción de transformación se colocaron sobre placas 150 mm 2X YT complementadas con 100 I1g de ampicilina por mI. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37"C. Seis clones putativos recombinantes se seleccionaron de manera aleatoria de las placas de selección y ADN plasmido se obtuvo a partir de cada uno usando un QIAGEN BioRobot 9600. Los clones se analizaron por digestión de enzima de restricción Pst!. Cinco de seis clones tuvieron el patrón de digestión de restricción previsto, dos clones se secuenciaron luego para confirmar que no había ninguna de las mutaciones en el inserto clonado. Clan #1 se seleccion� y se design� pAIL024 (Figura 20).
[0400] El gen Tter61 E truncado se amplificó por PCR con cebadores In-Fusion específicos disei'iados para ai'iadir los 5 nucleótidos faltantes en su 5' final como se describe en el ejemplo 11 . La banda de gel purificada se clono luego en pAILo2 como se ha descrito anteriormente. Dos microlitros de la reacción TOPO se transformaron en células de E. coli TOP10 según las instrucciones del fabricante. Las células transformadas se colocaron sobre placas de agar 2XYT complementadas con 100 I1gfml de ampicilina y se incubaron durante toda la noche a 37"C. Ocho colonias se seleccionaron de manera aleatoria y ADN plasmido se prepar� como se ha descrito anteriormente. Los clones se analizaom por digestión de enzima de restricción Sac 1. Siete de ocho clones tuvieron el patrón de digestión de restricción previsto, cuatro clones se secuenciaron luego para confirmar que no había ninguna de las mutaciones en el inserto clonado. Clon #5 se seleccion� y se design� pAIL028 (Figura 21).
Ejemplo 14: Expresión de genes de Thie/avia terrestris que codifican polip�ptidos de la familia gH61B, GH61C, GH61D, GH61E Y GH61G con actividad de mejora celulolitica en Aspergillus oryzae JaL250
[0401] Protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 se prepararon según el método de Christensen el al., 1988, B�ofTechnology 6: 1419-1422. Cinco I1g de pEJG108 (al igual que pAIL02 como vector de control) se us� para transformar Asperg�llus oryzae JaL250.
[0402] La transformación de Aspergillus oryzae JaL2500 con pEJG108 (gen GH61 B) liber� aproximadamente 100 transformantes. Diez transformantes se aislaron en placas PDA individuales.
[0403] Placas PDA confluyentes de todos los transformantes se lavaron con 5 mi de 0,01% de Tween 80 y se inocularon separadamente en 25 mi de medio MDU2BP en frascos de agitaci�n de vidrio 125 mi y se incubaron a 34"C, 200 r.p.m. Cinco días tras la incubaci�n, 5111 de sobrenadante de cada cultivo se analizó usando 8-16% de geles de SDS-PAGE de tris-glicina (tnvitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que 9 de los 10 transformantes tuvieron una nueva banda mayor a aproximadamente 42 kDa.
[0404] Una placa connuyente de transrormante 10 (crecida en PDA) se lav� con 10 mi de 0,01% de Tween 20 y se inocul� en un Fernbach de 2 litros con 500 mi de medio MDU2BP para generar catdo para caracterización de la enzima. El matraz se recogió en el día 5 y se filtr� usando una membrana GP Express plus 0,22 11m GP (Millipore, Bedford, MA).
[0405] Pl�smidos pEJG111 (gen GH61 C) y pEJG1 12 (gen GH61 D) se expresaron en Aspergillus oryzae JaL250 usando el mismo protocolo anteriormente descrito.
[0406] Protoplastos de Aspergillus oryzae Jal250 (WO 99/61651) se prepararon según el método de Christensen et al.,
1988, supra. Cinco microgramos de pAIL024 y pAIL028 (as� como pAIL02 como un vector de control) se usaron para transforma r protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250.
[0407] Las transformaciones de Aspergi/lus oryzae Jal250 liberaron aproximadamente 50 transformantes por construcción de expresión. Ocho transformantes se aislaron de cada transformación a placas POA individuales y se incubaron durante cinco días a 34�C.
5 [0408] Placas de espora confluyentes se lavaron con 3 mi de 0,01% de Tween 80 y la suspensión de esporas se us� para inocular 25 mi de medio MOU2BP en frascos 125 mi de agitaci�n de vidrio. Cultivos transformantes se incubaron a 34�C con agitaci�n constante a 200 r.p.m. El día cinco después de inoculación, los cultivos se centrifugaron a 6000 x g y sus sobrenadantes se recogieron. Cinco micro-litros de cada sobrenadante se mezclaron con un volumen igual de tampón de carga 2X (10% de r?-mercaptoetanol) y se cargaron sobre un gel SOS-PAGE 1,5 mm de tris-glicina 8 %-16 %
10 Y se til'ieron con Simply Blue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los perfiles de SOS-PAGE de los caldos de cultivo mostraron que siete de ocho transformantes pAIL024 tienen un nuevo enlace prote�nico de aproximadamente 45 kOa. Esta nueva proteína se ejecuta en los geles de SOS-poliacrilamida como una mancha de grasa más que una banda bien definida, sugiriendo la presencia de formas múltiples quizá debido a modificaciones postraduccionales como glicosilaci6n. Este tipo de modificaciones explicaría la diferencia entre el peso molecular deducido del T. terrestris
15 GH61G, 33,7 kOa, y el peso aparente molecular de la nueva proteína presente en estos lransformantes. Clan #3 se seleccion� para estudios posteriores. En el caso de los transformantes pAIL028 6 de ocho transformantes pAIL028 tienen un nuevo enlace prote�nico de aproximadamente 25 kOa muy cerca del peso calculado para la proteína madura de 22,5 kDa.
20 Ejemplo 15: Construcc��n de pMJ09
[0409] Vector pMJ04 se construyó por PCR amplificando el terminador de gen de celobiohidrolasa 1 (cbh1) de Trichoderma reese� Cel7A de AON gen�mico de Trichoderma reese� RutC30 usando 993429 (antisentido) y 993428 (sentido) mostrados debajo. El cebador antisentido se cre6 genéticamente para tener un sito Pac I en el 5'-final y un sitio
25 Spe en el 5'-final del cebador sentido.
Cebador 993429 (antisentido): 5'-AACGTTAATTAAGGAATCGITITGTGTIT-3' (SEC ID nO: 56) Cebador 993428 (sentido):
30 5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3' (SEC ID nO: 57)
[0410] Las reacciones de amplificaci6n (50 1.11) se compusieron de tampón de reacción 1X TermoPol (New England BioLabs, Beverly, MA), 0,3 mM de dNTPs, 100 ng de AON gen�mico de Trichoderma reesei RutC30 (que fue aislado usando un kit ONeasy Plant Maxi, QIAGEN Inc., Valencia, CA), 0,3 I.IM de cebador 993429, 0,3 I.IM de cebador 993428
35 y 2 unidades de polimerasa Vent (New England BioLabs, Beverly, MA). Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94�C, 30 segundos a 55�C y 30 segundos a 72�C (15 minutos extensión final).
[0411] Los productos reactivos se aislaron en un gel de agarosa 1,0% usando tampón TAE donde una banda de 40 producto de 229 pares de bases se cort� del gel y se purifiCó usando un kit QIAGEN QIAquick Gel Extraction según las instrucciones del fabricante.
[0412] El fragmento de PCR resultante se digirió con Pac I y Spe I y se ligó en pAIL01 digerido con las mismas enzimas de restricción que usan un kit Rapid Ligation (Rache, Indianapolis, IN), para generar pMJ04 (Figura 22).
45 [0413] Vector pMJ06 se construyó por PCR amplificando el promotor de gen de celobiohidrolasa 1 de Trichoderma reesei Cel7A de AON gen6mico de Trichoderma reesei RutC30 usando los cebadores 993696 (antisentido) y 993695 (sentido) mostrados debajo. El cebador antisentido se cre� genéticamente para tener un sitio Sal I en el 5'-final del cebador sentido y un sitio Nco I en el 5'-final del cebador anlisentido.
50 Cebador 993695 (sentido): 5'-ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGIT-3' (SEC ID nO: 58) Cebador 993696 (antisentido): 5'-TGACCATGGTGCGCAGTCC-3' (SEC ID nO: 59)
[0414] Las reacciones de amplificación (50 ~I) se compusieron de tampón de reacción 1X TermoPol, 0,3 mM de dNTPs, 100 ng de AON gen�mico de Trichoderma reesei RutC30 (que fue preparado usando un OIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit�, 0,3 IJM de cebador 993696, 0,3 I.IM de cebador 993695 y 2 unidades de polimerasa Ven!. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada uno durante 30
60 segundos a 94"C, 30 segundos a 55�C y 60 segundos a 72"C (15 minutos eX1ensi�n final).
[0415] Los productos reactivos se aislaron en un gel de agarosa 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto de 988 pares de bases se cort� del gel y se purificó usando un kit QIAGEN OIAquick Gel Extraction según las instrucciones del fabricante.
[0416] El fragmento de PCR resultante se digirió con Nco I y sal I y se ligó en pMJ04 digerido con las mismas enzimas de restricción, usando un kit Rapid ligation, para generar pMJ06 (Figura 23).
[0417] Vector de expresión pMJ09 se construyó por PCR amplificando el terminador del gen de celobiohidrolasa (cbh1)
5 de Trichoderma reese� Cel7A de AON gen�mico de Trichoderma reese� RutC30 usando los cebadores 993843 (antisentido) y 99344 (sentido) mostrados debajo. El cebador antisentido se creo genéticamente para tener un sitio Pac I y un Spe I en el 5'-final y un sitio Pvu I en el 5'-final del cebador de sentido.
Cebador 993844 (sentido):
10 5'-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3' (SEC ID nO: 60) Cebador 993843 (antisentido): 5'-ACTAGTIAATIAAGCTCCGTGGCGAAAG-3' (SEC ID nO: 61)
[0418] Las reacciones de amplificación (50 IJI) se compusieron de tampón de reacción 1 X TermoPol, 0,3 mM de dNTPs,
15 100 ng de ADN gen�mico de Trichoderma reesei RutC30 (que se extrajo usando un kit OIAGEN ONeasy Plant Maxi) 0,3 11M de cebador 993844, 0,3 11M de cebador 993843 y 2 unidades de polimerasa Vent. Las reacciones se incubaron en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94"C, 30 segundos a 55"C y 60 segundos a 72"C (15 minutos extensión final).
20 [0419] Los productos reactivos se aislaron en un gel de agarosa 1,0% usando tampón TAE donde un una banda de producto de 473 pares de bases se cort� del gel y se purificó usando un kit QIAGEN QIAquick Gel Extraction según las instrucciones del fabricante.
[0420] El fragmento de PCR resultante se digirió con Pvu I y Spe I y se ligó en pMJ06 digerido con Pac I y Spe I usando 25 un kit de Rapid ligation para generar pMJ09 (Figura 24). Ejemplo 16: Construcción de vector de expresión pSMAi155
[0421] Basado en el gen htp de E. coli encontrado en el pl�smido pPHTI (Cummings et al., 1999, Current Genetics 36: 371-82) los siguientes cebadores se disel'iaron para amplificación:
Directo (993863):
5'-GGGttooaaTTCATTIAAACGGCT-3' (SEC ID nO: 62) Bst BI 35 Inverso (993864):
5'-GGG~CAATATICATCTCTC-3' (SEC tD nO: 63) Eco 47111
40 [0422] El sistema de ADN polimerasa Vent� (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA) se utilizó para amplificar el gen de interés bajo las siguientes cond iciones de termociclado gradientes que usan un Robocycler Gradient 40 (Stratagene, La Jolla, CA): un ciclo a 95"C durante 2 minutos: 25 ciclos cada uno a 95"C durante 1 minuto, 51 "C -65"C durante 1 minuto, y 72"C durante 2 minutos: y 1 ciclo a 72"C durante 7 minutos. El fragmento 1,8 kb resultante se amplificó exitosamente a temperatura de reconocimiento 51 "C y gel purificado usando un kit OIAquick Gel Extraction. El
45 fragmento de gel purificado se clon� luego en pCR-Bluntll-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) creando pEmY10 (Figura 25).
[0423] Pl�smido pMJ09 se digirió con Nsi I para eliminar el gen marcador amdS. El digerido se fraccion� en un gel de agarosa 0,7% usando tampón TAE y una banda cortada 3,9 kb Y purificada usando un kit OIAquick Gel Extraction según 50 el protocolo sugerido del fabricante. El vector fue defosforilado usando fosfatasa alcalina de camar�n (Roche Diagnostics Corporalion, Indianapolis, IN) según el protocolo del fabricante. El gen de resistencia a higromicina se retir� del pl�smido pEmY10 por digestión con Nsi I y un fragmento 2,0 kb fragmento como arriba. Este fragmento se ligó con el fragmento 3,9 kb de pMJ09. La mezcla de ligamiento se transform� en células SURE de E. coli (Stratagene, La Jaita, CA), y ocho colonias resultantes se seleccionaron para ligamiento correcto por análisis de restricción y secuenciaci�n
55 del AON. Uno de los clones verificados se design� pSMai149. El sitio Nco I en el gen de resistencia a higromicina fue quitada de pSMai149 usando el kit Quickchange Site-Oirected Mutagenesis (Stratagene, La Jaita, CA) según el protocolo del fabricante. Los cebadores de mutag�nesis/amplificación tuvieron las siguientes secuencias, donde la G subrayado representa el sitio de mutación.
60 5'-GGTCGCGGAGGCGATGGATGCGATCG-3' (SEC ID nO: 64) 5'-CGATCGCATCCATCGCCTCCGCGACC-3' (SEC ID nO: 65)
[0424] Ocho colonias seleccionadas de forma aleatoria se cribaron por digestión con Nco 1, y una de estas, se design� clan 7, que mostr� p�rd ida del sitio Nco I fue además verificado por secuenciaci�n de AON y designado pSMa i155 65 (Figura 26).
Ejemplo 17: Expresión de genes de Thie/avia te"estris que codifican polip�ptidos de la familia GH61 B, GH61C, GH61 D, GH61 E Y GH61 G con actividad de mejora celulolitica en Trichoderma reesei
[0425] Dos cebadores oligonucle�tidos sintéticos mostrados debajo se diseñaron para amplificar por PCR un gen de Thie/avia terrestris que codifica una familia putativa GH61 B del clan gen�mico. Un kit de InFusion Cloning se us� para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión, pSMA1155, sin necesidad de restringir digeridos y ligamiento.
Cebador directo: 5'-cgcggactgcgcaccATGAAGTCGTTCACCATTG-3' (SEC ID nO: 66) Cebador inverso: 5'-tcgccacggagcttaGAGGCACTGCGAGTAG-3' (SEC ID nO: 67)
Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante es homóloga a los sitios de inserción del clan 7 pSMA11 55.
[0426] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores de arriba se usaron en una reacción PCR con 10 ng de ADN 15 de clan gen�mico de Thielavia terrestris, tampón de amplificación 1X Pfx, 1,5 !JI de 10 mM de mezcla de dATP, dITP, dGTP Y dCTP, 2,5 unidades de platino Pfx ADN polimerasa, 1 !JI de 50 mM de MgS04 y 5 !JI de solución intensificadora 10X pCRx en un volumen final de 50 !JI. Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94"C durante 2 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94"C durante 15 segundos, 55"C durante 30 segundos y 68"C durante 3 minutos. El bloque de calor luego fue a un 4 "C ciclo de remojo.
[0427] Los productos reactivos se aislaron en un del de agarosa 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto 3 kb se cort� del gel y se purificó usando un kit OIAquick Gel Extraction segun las instrucciones del fabricante.
[0428] El fragmento se clon� luego en el vector de expresión pSMAI155 usando un kit InFusion Cloning. El vector se digirió con endonucleasas de restricción Nco I y Pac 1. El fragmento se purifiCó por electroforesis en gel y gel de purificación OIAquick. El fragmento de gen y el vector digerido se unieron en una reacción resultante en el pl�smido de expresión pEJG110 (Figura 27) en el que transcripción del gen de la familia GH61 B fue bajo el control del promotor y terminador CBHI de Trichoderma reesei. La reacción de ligamiento (20 !JI) se compuso por tampón de infusión 1X, 1X BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 1 !JI de enzima InFusion (diluida 1:10), 100 ng de pSma155 digerido con Nco I y Pac 1, y 100 ng del producto PCR purificado de Thie/avia teffestris GH61 B. La reacción se incub� a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un !JI de la reacción se us� para transformar células Solopac Gold de E. coli XL 10 (Stratagene, La Jolla, CA). Un transformante de E. coli con el pl�smido pEJG110 se detect� por digestión de enzima de restricción y ADN pl�smido se prepar� usando un OIAGEN BioRobot 9600.
[0429] Secuenciaci�n del ADN de pEJG110 se realizó con un Applied Biosystems Model 3700 Automated DNA Sequencer usando terminador version 3.0 Big-Dye™ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) y estrategia de �walking primer". Datos de secuencia de nucleótidos se escrutinaron para calidad y todas las secuencias se compararon entre si con asistencia de software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA).
[0430] Para la expresión en T. reesei el gen Tter61 E se amplificó por PCR de su construcción de expresión pAIL028 con los siguientes cebadores.
Cebador directo:
5'-GCCCATGGACCATGCTCGCAAAC-3' (SEC ID nO: 68)
Cebador inverso:
5'-CCTCTAGITAAITAATCAGCAGC-3' (SEC ID nO: 69) Asimismo, el gen Tter61 G se amplificó por PCR de su construcción de expresión pAIL024 con los siguientes cebadores.
Cebador directo:
5'-GCCCATGGACCATGAAGGGACTT-3' (SEC ID nO: 70)
Cebador inverso:
5'-CCTCTAGTTAATTAATTACAAGC-3' (SEC ID nO: 71) Ambos experimentos se llevaron a cabo de la siguiente manera:
[0431] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores de arriba se usaron en una reacción PCR con 50 ng de ADN pAIL028, 1 IJI de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP Y dCTP, 5 !JI de tampón de ADN polimerasa 110X AmpliTaq� (Perkin-ElmerfApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA) y 5 unidades de ADN polimersasa AmpliTaq� (PerkinElmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), en un volumen final de 50 !J I. Un Eppendorf Mastercycler 5333 se us� para amplificar el fragmento de ADN y se program� para un ciclo a 95"C durante 3 minutos; y 25 ciclos cada uno a 95"C durante 45 segundos, 55"C durante 60 segundos y 72"C durante 1 minuto 30 segundos. Después de los 25 ciclos, la reacción se incub� a 72"C durante 10 minutos y luego se enfri� a 4"C hasta proceso posterior. Un producto de reacción PCR de aproximadamente 681 bases se aisl� en un gel de GTG-agarosa 0,8% usando tampón TAE y 0,1 !Jg de bromuro de etid io por mI. La banda de ADN se visualizó con la ayuda de un Dark Reader ™ para evitar mutaciones
inducidas por los UV. La banda ADN apropiada se cort� con una hoja de afeitar desechable y se purificó con un kit QIAquick PCR Purification según las instrucciones del fabricante. La banda ADN purificada se clon� en el vector pCR2.1-TOPO según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Car1sbad, CA). Dos microlitros de la TOPO-reacción se transformaron en células de E cofi TOP10 según las instrucciones del fabricante. Las células transformadas se colocaron sobre placas de agar 2X YT complementadas con 100 �.Jglml de ampicilina y se incubaron durante toda la noche a 37"C. Ocho colonias se seleccionaron de manera aleatoria para preparación de AON pl�smido. Cada colonia creció durante toda la noche en 3 mi de medio LB complementado con 100 �.Jg de ampicilina por mi y se us� para preparar ADN pl�smido con un QIAGEN BioRobot 9600. El ADN pl�smido se analizó por mapeo de restricción para identificar clones positivos para inserción GH61 E o GH61 G usando endonucleasas de restricción Pac I y Nco 1. Una vez que un clon se valid� que hubo inserción exitosa del gen GH61 E o GH61 G, el clon se secuenci� para fidelidad usando BigDye Terminator Version 3 y se analizó usando ABI 3700 DNA Analyzer (Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante.
[0432] El clon de ADN de E. coli TOPO con la secuencia GH61 E o GH61 G confirmada se digirió con Pac I y Nco I yel producto de reacción se resolvió luego en un gel de agarosa 0,8%. La banda ADN apropiada se cort� con una hoja de afeitar desechable y se purificó con un kit QIAquick PCR Purification según las instrucciones del fabricante.
[0433] Pl�smido pSMai155 se digirió de la misma manera con Pac I y Nco I para crear extremos compatibles con los fragmentos GH61. El producto de digestión se resolvió en un gel de agarosa 0,8% y el pl�smido lineal se cort� y purificó usando kit QIAquick PCR Purification según las instrucciones del fabricante.
[0434] El fragmento de gen Pac IINco I GH61 E o GH61 G se ligó en el pl�smido pSMai155 digerido PacllNcol usando el kit Rapid DNA Ligation (Roche, Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este ligamiento se us� luego para transformar células SURE de E. coli siguiendo las instrucciones del fabricante. Colonias se seleccionaron, cultivaron y pl�smido se prepar� como se ha descrito anteriormente. El ADN pl�smido se analizó por mapeo de restricción para identificar clones positivos para inserción GH61 E o GH61 G usando Pac I y Nco 1. Uno de los clones que tuvo el patrón de restricción correcto para el gen GH61 E se design� pCW095 y uno que tuvo el patrón correcto para el gen GH61 G se design� pCW096.
[0435] Un vector de expresión, pCW076, se cre� para utilizar el promotor CBHII de Trichod9rma reesei para expresión genética. Vector de expresión pSMai155 se digirió con endonucleasas de restricción Sal I y Nco I para eliminar el fragmento promotor CBHI. Construcción de expresión pEJG114 (Figura 28) se digirió también con Sall y Ncol para aislar el promotor CBHII para ligamiento en el pl�smido pSMai155 digerido Sall/Nco 1.
[0436] El promotor Sal l/Neo I CBHII se ligó en el Sall/Ncol pSMai155 digerido usando el kit Rapid DNA Ligation siguiendo las instrucciones del fabricante. Este ligamiento se us� luego para transformar células SURE de Ecoli siguiendo las instrucciones del fabricante. Colonias se seleccionaron, clonaron y pl�smido se prepar� como se ha descrito anteriormente. El ADN pl�smido se analizó por digestión de enzima de restricción para identificar clones positivos para inserción de promotor CBHII usando Sal! y Nco 1. Estos clones se secuenciaron luego usando cebador TrCBH2PrSeqF1, mostrado debajo, para confirmar la presencia del promotor CBHII. Uno de los clones que tuvo la secuencia correcta se design� pCW076 (Figura 29).
TrCBH2PrSeqF1 : 5'-GGATGAAGCTCAITAGCCG-3' (SEC ID nO: 72)
[0437] Para la expresión en Trichoderma reesei, el gen Tter61 O gen se aisl� de pTter61 O (como se describe en el ejemplo 7 usando endonucleasas de restricción Pac I y Nco 1). Pl�smido pCW076 se digirió de la misma manera con Pac I y Nco I para crear extremos compatibles con el fragmento GH61 D. Los productos de digestión se resolvieron en gel de agarosa 0,8% usando tampón TAE y los fragmentos lineales se cortaron y purificaron usando un kit QIAquick PCR Purification según las instrucciones del fabricante.
[0438] El fragmento del gen GH61 D Pac IINco I se ligó en Pac I/Nco I digerido pCW076 usando el kit Rapid DNA Ligation siguiendo las instrucciones del fabricante. Un microlitro de la reacción de ligamiento se us� luego para transformar células SURE de E Cofi siguiendo las instrucciones del fabricante. Colonias se seleccionaron, cultivaron y pl�smido se prepar� como se ha descrito anteriormente. El ADN pl�smido se analizó por digestión de enzima de restricción para identificar clones pOSitivos para inserción GH61 O usando Pac I y Nco l. Uno de los clones que tuvo el patrón de restricción correcto se design� pCW078 (Figura 30).
[0439] Protoplastos de Trichoderma reesei RutC30 se prepararon según el método de Christensen el al., 1988, supra. Cinco �.Jg de pEJG110, pCW095, pCW096, o pCW078 se usaron para transformar Trichoderma reesei RutC30. Cada transformación individual liber� aproximadamente 100 transformantes. Sesenta transformantes se aislaron , de cada transformación, a placas de uridina Cove/10 mM individuales y se incubaron a 28"C durante siete días.
[0440] Cepas transformantes se analizaron en lotes de ocho a la vez. Esporas se recogieron de ocho placas individuales con un asa estéril, se inocularon separadamente en 25 mi de medio CIM en frascos de agitaci�n de vidrio 125 mi y se incubaron a 28"C, 250 r.p.m. Cinco días después de inoculación, 0,5 �.JI de sobrenadante de cada cultivo se analizó
usando geles Tris SDS-PAGE 7,5% (BioRad, Hercules, CA) según las instrucciones del fabricante. Perfiles de SDSPAGE de los cultivos mostraron que de 20% a 50% de los transformantes produjeron un nuevo enlace proteinico correspondiente al gen recién introducido. Un transformante apropiado se seleccion� de cada construcción de expresión para estudios posteriores.
Ejemplo 18: Identlficaci6n de una familia de una beta-glucosidasa del gen de la familia GH3A en la secuencia gen�mica de Aspergillus fumigatus
[044 1] Una búsqueda BLAST (Altschul el al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) de la secuencia del genoma parcial de Asperg�llus fumigatus (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD) se llev� a cabo usando como consulta una secuencia de proteína de beta-glucosidasa de Aspergillus aculeatus (N� de acceso P48825). Diferentes genes se identificaron como homólogos de la familia putativa GH3A basados en un alto grado de similitud a la secuencia de consulta en el nivel de amino�cido. Una región gen�mica de aproximadamente 3000 pares de bases con más de 70% de identidad a la secuencia de consulta en el nivel de amino�cido se eligió para estudio posterior.
Ejemplo 19: Extracción de ADN gen�mico de Aspergillus fumigatus
[0442] Aspergillus fum�gatus creció en 250 mi de medio de dextrosa de patata en un matraz de agitaci�n disipado a 3rC y 240 r.p.m. Micelios se recogieron por filtración, se lavaron dos veces en TE (10 mM de Tris-1 mM EDTA) y se congelaron bajo nitrógeno líquido. Micelios congelados se molieron, por mortero y punzón, a un pOlvo fino, que se resuspendi� en pH 8,0 tampón con 10 mM de Tris, 100 mM de EDTA, 1% Tritón X-1 OO, 0,5 M de guanidina-HCI y 200 mM de NaCI. Ribonucleasa pancreática sin ADNsa se a�ad i� a una concentración de 20 mg/litro y ellisado se incub� a 3rC durante 30 minutos. Detrito celular se retir� por centrifugado y ADN se us� usando una columna Maxi 500 (QIAGEN Inc., Valencia, CA). las columnas se equilibraron en 10 mi de QaT se lavaron con 30 mi de QC y se eluyeron con 15 mi de QF (todos los tampones de QIAGEN Inc., Valencia, CA). ADN se precipit� en isopropanol, se lavo en etanol 70% y se recuper� por centrifugado. El ADN se resuspendi� en tampón TE.
Ejemplo 20: Clonaci�n del gen de beta-glucosidasa de la familia GH3A y construcción de un vector de expresión de Asperg�llus oryzae
[0443] Dos cebadores oligonucle6tidos sintéticos mostrados debajo se diseñaron para amplificar por PCR el gen de Aspergillus fum�gatus que codifica la beta-glucosidasa de la familia GH3A del ADN gen�mico preparado en el ejemplo
19. Un kit InFusion Cloning se us� para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión, pAIL02, sin necesidad de restricción de digeridos y ligamiento.
Cebador directo: 5'-ACTGGATTTACCATGAGATTCGGTTGGCTCG-3' (SEC ID nO: 73) Cebador inverso: 5'-AGTCACCTCTAGTTACTAGTAGACACGGGGC-3' (SEC ID nO: 74)
Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante es homóloga a los sitios de inserción de pAIL02.
[0444] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores de arriba se usaron en una reacción PCR con 100 ng de ADN gen�mico de Aspergillus fumigatus, tampón de amplificación 1X Pfx, 1,5 �JI de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP Y dCTP, 2,5 unidades de platino Pfx AON polimerasa, 1 �JI de 50 mM de MgS04 y 2,5 �JI de solución intensificadora 10X pCRx en un volumen final de 50 �JI. Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94"C durante 2 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94eC durante 15 segundos, 55e C durante 30 segundos y 68e C durante 3 minutos. El bloque de calor luego fue a un 4ec ciclo de remojo.
[0445] Los productos reactivos se aislaron en un gel de agarosa 1,0% usando tampón TAE donde una banda de productor 3 kb se cort� del gel y se purifiCó usando un kit QIAquick Gel Extraction según las instrucciones del fabricante.
[0446] El fragmento se clon� luego en el vector de expresión pAIL02 usando un kitlnFusion Cloning. El vector se digirió con endonucleasas de restricción Nco I y Pac I (usando condiciones especificadas por el fabricante). El rragmento se purifiCó por electroforesis en gel y purificación de gel QIAquick. El fragmento de gen y el vector digerido se ligaron juntos en una reacción resultante en el pl�smido de expresión pEJG97 (Figura 31) en la transcripción del gen de betaglucosidasa de la familia GH3A fue bajo el control del promotor NA2-tpi. La reacción de ligamiento (20 �JI) se compuso por tampón InFusion 1X, 1X BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 1 ~I de enzima InFusion (d iluida 1:10), 150 ng de pAILo2 digerido con Neo I y Pac 1, y 50 ng de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus purificada producto PCR. La reacción se incub� a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un �JI de la reacción se us� para transformar células XL 1 O Solopac Gold de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA). Un transformante de E. coli con el pl�smido pEJG97 se detect� por digestión de enzima de restricción y AON pl�smido se prepar� usando un QIAGEN BioRobot 9600.
Ejemplo 21 : Caracterización de la secuencia gen6mica de AspergiIJus fumigatus que codifica una betaglucosidasa de la familia GH3A
[0447] Secuenciaci�n del ADN del gen de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus de pEJG97 se realizó con un Perk.in-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL Automated DNA Sequencer (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) usando química de terminador Oye (Giesecke et al., 1992, Joumal of Virology Methods 3B: 47-60) y
5 estrategia "primer walking". Datos de secuencia de nucle6tidos se escrutinaron para calidad y todas las secuencias se compararon entre s� con asistencia de software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA).
[0448] Un modelo de gen para la secuencia de Aspergillus fumigatus se construyó basado en similitud a genes homólogos de Aspergillus aculealus, Aspergillus niger y Aspergillus kawachii. La secuencia de nucleótidos (SEC ID nO:
10 75) Y secuencia de amino�cidos deducida (SEC ID nO: 76) se muestran en las Figuras 32A y 326. El fragmento gen�mico codifica un polip�ptido de 863 amino�cidos, interrumpido por 8 intrones de 62, 55, 58, 63, 58, 58, 63 Y 51 pares de bases. El %G+C contenido del gen es 54,3%. Usando el programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, supra), un p�ptido se"'al de 19 residuos se predijo. La proteína predicha madura contiene B44 amino�cidos con una masa molecular de 91 ,7 kDa.
15 [0449] Un alineamiento comparativo de secuencias de beta-glucosidasa se determin� usando el método de Clustal W (Higgins, 1989, CABlOS 5: 151-153) usando el software LASERGENETIoI MEGALlGNTIoI (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiples: penalizaci�n del espacio de 10 y penalizaci�n de longitud del espacio de 10. Parámetros de alineamiento de pareja fueron Ktuple=1, penalizaci�n de
20 espacio espacio=3, ventanas=5 y diagonales=5. El alineamiento mostr� que la secuencia de amino�cidos deducida del gen de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus gen compartió 78%, 76% Y 76% de identidad a las secuencias de amino�cidos deducidas de las beta-glucosidasas de Aspergillus aculealus (número de acceso P48825), Aspergillus níger (000089) y Aspergillus kawach�i (P87076).
25 Ejemplo 22: Expresión del gen de beta-glucosidasa de la familia GH3A de Aspergillus fumigatus en Aspergillus o!)'zae JaL250
[0450] Protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 se prepararon según el método de Christensen el al., 1988, supra. Cinco I.Ig de pEJG97 (al igual que pAIL02 como un vector de control) se usaron para transformar Aspergillus oryzae
30 Jal250.
[0451] La transformación de Aspergillus oryzae JaL250 con pEJG97 liber� aproximadamente 100 transformantes.
Diez transformantes se aislaron a placas PDA individuales.
35 [0452] Placas confluyentes PDA de cinco de los diez transformantes se lavaron con 5 mi de Tween 80 0,01% Y se inocularon separadamente en 25 mi de medio MDU2BP en frascos de agitaci�n de vidrio 125 mi y se incubaron a 34�C, 200 r.p.m. Cinco días tras la incubaci�n, 0,51.11 de sobrenadante de cada cultivo se analizó usando 8-16% de geles TrisGlicina SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que uno de los transformantes (designado transformante 1) tuvo una banda principal de
40 aproximadamente 130 kDa.
[0453] Una placa confluyente de transformante 1 (crecida en PDA) se lav� con 10 mi de Tween 20 0,01 % Y se inocul� en un Fembach 2 litos con 400 mi de medio MDU26P para generar caldo para caracterización de la enzima. El matraz se recogió el día 5 y se filtr� usando una membrana 0,22 I.Im GP Express plus (Miliipore, Bedford, MA).
45 Ejemplo 23: Expresión del gen de beta-glucosidasa de la familia GH3A de Aspergillus fumigatus en gen de betaglucosidasa de Trichoderma reesel
[0454] Dos cebadores oligonucie6tidos sintéticos mostrados debajo se diseñaron para amplificar por PCR el gen de
50 beta-glucosidasa de Asperg�llus fumigatus de pEJG97 descrito en el ejemplo 20. Un kit InFusion Cloning se us� para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión, pMJ09, sin necesidad de restringir digeridos y ligamiento.
Cebador directo: 5'-GGACTGCGCACCATGAGATICGGTTGGCTC-3' (SEC ID nO: 77)
55 Cebador inverso: 5'-TCGCCACGGAGCTTACTAGTAGACACGGGG-3' (SEC ID nO: 76)
Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante es homóloga a los sitios de inserción de pMJ09.
60 [0455] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores de arriba se usaron en una reacción PCR (50 1.11) con 100 ng de pEJG97 ADN, tampón de amplificación 1X Pfx , 1,5 1.11 de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP Y dCTP, 2,5 unidades de PlatinumPfx AON polimerasa, 1 1.11 de 50 mM de MgS04 y 2,51.11 de solución intensificadora 10X pCRx. Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94"C durante 2 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94"C durante 15
65 segundos, 55"C durante 30 segundos y 68"C durante 3 minutos. El bloque de calor luego fue a un 4"C ciclo de remojo.
[0456] Los productos reactivos se aislaron en un gel de agarosa 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto 3 kb se cort� del gel y se purificó usando un kit QIAGEN QIAquick Gel Extraction según las instrucciones del fabricante.
[0457] El fragmento 3 kb purificado se clon� luego en pMJ09 usando un kit InFusion Cloning. El vector se digirió con Nco yo y Pac 1. El fragmento se purifiCó por electroforesis en gel y purificación de gel QIAquick, como se ha descrito anteriormente. El fragmento de gen y el vector digerido se ligaron juntos en una reacción resultante en el pl�smido de expresión pEJG107 (Figura 33) en la que transcripción del gen de beta-glucosidasa de la familia GH3A fue bajo el control del promotor cbhl de Trichoderma reesei. El ligamiento (50 �JI) se compuso por tampón InFusion 1X, 1X BSA, 1 �JI de enzima InFusion (diluida 1 :10), 100 ng de pMJ09 digerido con Neo I y Pac 1, y 100 ng del producto PCR purificado de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus. La reacción se incub� a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un �JI de la reacción se us� para transformar células DURE electrocompetentes de E. coli (Stratagene, La Jotla, CA). Un transfonnante de E.coli con el pl�smido pEJG107 se detect� por digestión de enzima de restricción y ADN pl�smido se prepar� usando un QIAGEN BioRobot 9600.
[0458] Secuenciaci�n del ADN del gen de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus de pEJG107 se realizó con un PPerkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL Automated DNA Sequencer (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) usando química de terminador Oye (Giesecke el al., 1992, Joumal of Virology Methods 38: 47-60) y estrategia "primer walking". Datos de secuencia de nucleótidos se escrutinaron para calidad y todas las secuencias se compararon entre s� con asistencia de software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA).
[0459] Protoplastos de Trichoderma reesei RutC30 se prepararon según el método de Christensen et al., 1988, supra. Cinco �Jg de pEJG107 se usaron para transformar Trichoderma reesei RutC30. La transfonnaci�n liber� aproximadamente 100 transfonnantes. Sesenta transformantes se aislaron en placas de uridina Cove/10 mM y se incubaron a 28Q C.
[0460] Esporas se recog ieron de placas de 8 de los 60 transformantes deslizando tres veces con un asa estéril y se inocularon separadamente en 25 mi de medio CIM en frascos de agitaci�n de vidrio 125 mi y se incubaron a 28"C, 250
r.p.m. Cinco días tras la incubaci�n, 0,5 �JI de sobrenadante de cada cultivo se analizó usado geles Tris SDS-PAGE 7,5% (Biorad, Hercules, CA) según las instrucciones del fabricante. Perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que uno de los transformantes (designado transfonnante 1) tuvo una nueva banda principal de aproximadamente 130 kDa.
Ejemplo 24: Purificación y caracterización de los polip�ptidos de ThieJavla terrestris con actividad de mejora celulol�tica
[0461] Cultivos en frascos de agitaci�n de Thielavia terrestris NRRL 8126 crecieron en 100 mi de medio NNCYPmod en un matraz de agitaci�n disipado 500 mi a 44"C, 175 r.p.m. Los matraces se inocularon con un tapón (aproximadamente 2 cm cuadrado) de una placa de agar fresca del mismo med io y se les permitió crecer durante aproximadamente 3-5 días antes de cosecha. Muestras de caldo crudas se obtuvieron por cultivos de centrifugado durante aproximadamente 10 minutos a 9500 x g para eliminar materia celular y cualquier fuente de carbono residual. El sobrenadante resultante se centrifug� luego otra vez como se ha descrito anteriormente. El sobrenadante se us� como la materia prima para análisis bioquímico y cuando no estuvo en uso se almacen� a 4"C.
[0462] Cultivos fermentadores de Thielavia terrestris crecieron por cultivo de Thielavia terrestris en medio NNCYP con 52 g de celulosa por litro, que se dosific� durante fermentación (sin fuente de carbono adicional) a 42"C y se mantuvieron a pH 5,0. A la fermentación se le permitió ejecutarse hasta que la celulosa dosificada se había agotado (típicamente aproximadamente 40 horas) en este tiempo el caldo se recogió y centrifug� para etiminar micelios como se ha descrito anteriormente.
[0463] Antes de realizar experimentos de purificación de proteina, preparaciones a pequei'ia escala de caldo de Thielavia terrestris se prepararon por concentración de muestras de sobrenadante aclaradas usando Centricon Plus 20 (Millipore, Bedford, MA) filtrando los dispositivos en un centrifugador rotor de cubo oscilante (Sorvall, RC3B Plus). Aproximadamente 3 mi de cada concentrado se cargó sobre una columna de desalaci�n 10 DG Econo PAC (BioRad, Hercules, CA) equilibrada con 50 mM de acetato sádico pH 5,0, Y muestras se eluyeron usando 4 mi de 50 mM de acetato sádico pH 5,0. Para preparaciones a gran escala de caldo de TMelavia lerreslris (aprolC.imadamente 0,5 litro a 10 litros), el protocolo descrito abajo se utilizó. Muestras de caldo crudas se aclararon de detrito celular por centrifugado de cultivos durante aprolC.imadamente 20 minutos a 9500 IC. g. Muestras de caldo esclarecidas se filtraron luego (membrana GP Express, polietersulfona, 0,22 �Jm, Millipore, Bedford, MA), tampón cambiado con 50 mM de acetato de sodio pH 5,0 (Pall Filtron, North Borough, MA, 10 kDa de membrana de polietersulfona, aproximadamente 10-20 psi), y concentrado usando un dispositivo de ultrafiltraci�n Amicon (Millipore, Bedford, MA, 10 kDa de membrana, 40 psi, 4"C). Concentraciones de proteina se determinaron usando un kit BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL) en el que albúmina de suero bovino se us� como estándar de proteína. Partes alícuotas del procedimiento de desalaci�n se elC.aminaron típicamente en geles SDS-PAGE 8-16% G (Invitrogen, Carisbad, CA; 200 V durante 1 hora) en los que estándares de peso moleculares de precisión (BioRad, Hercules, CA) se incluyeron. Geles se Meron para proteina usando Biosafe Coomassie Stain (BioRad, Hercules, CA) y se destit'ieron usando H20 desionizada.
65 El0180389
[0464] Los sobrenadantes de Thielavia terrestris se cargaron sobre una columna Q Sepharose Big Bead (Amersham Pharmacia, Uppsala Sweden) equilibrada con 20 mM de Tris-HCI pH 8,2. Flujo a través de material se recogió y se almacen� a 4Q C hasta uso. Antes de eluci�n, la columna se lav� con cinco volúmenes de columna de tampón de inicio. Material unido se eluy� con un gradiente lineal de Oa 0,40 M de NaCI (15 volúmenes de columna; 10 mi fracciones) en 20 mM de tampón Tris-HCI pH 8,2. Basado en el perfil UV (A280nm) fracciones individuales representativas de picos de proteína resueltos se agruparon para caracterización y tampón se cambi� (Ultrafree Biomax 10 kDa NMWL membrane, Millipore, Bedford, MA) usando 50 mM de acetato sádico pH 5,0.
[0465] Fracciones Q Sepharose Big Bead de Thielavia terrestris designadas se fraccionaron luego además usando una columna Phenyl Superose (HR 16110 Pharmacia Biotech, Uppsala Sweden) usando el protocolo descrito abajo. Sulfato am�nico sólido se al'iadi� a la muestra para fraccionarse para dar una concentración final de 1,7 M de (NH4)ZS04. La muestra se centrifug� y se filtr� luego (10 minutos, 5,000 x g, RT; 0,22 11m de membrana GP Express, Millipore, Bedford, MA) para eliminar materia granulosa antes de carga sobre una columna Phenyl Superose equilibrada con 1,7 M de (NH4 )2 S04 en 20 mM de Tris-HCI pH 8,2. Eluci�n de marteria unida se consiguió usando un gradiente lineal decreciente (15 volúmenes de columna usando HzO desionizada) de 1,7 M de (NH4)zS04 en 20 mM de Tris-HCI pH 8,2. Fracciones se agruparon basadas en absorbancia A280nm para enriquecer áreas de valor máximo resueltas. Agrupaciones se intercambiaron en tampón en 50 mM de acetato sádico pH 5,0 usando un dispositivo de ultrafiltraci�n Amicon (membrana de polietersulfona, 5 kDa de NMWL, Bedford, MA). Concentraciones de proteína se determinaron usando kit BCA Protein Assay y muestras se analizaron en geles de Tris-glicina SDS-PAGE 8-16% como se describe en el ejemplo 1.
[0466] Restos de maíz se pretataron en el U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando ácido sulfúrico diluido. Las siguientes condiciones se usaron para el pretratamiento: 1,4 % en peso de ácido sulfúrico a 165Q C y 107 psi durante 8 minutos. Según NREL, los sólidos insolubles en agua en los restos de maíz pretratados (PCS) contuvieron 56,5% de celulosa, 4,6% de hemicelulosa y 28,4% de lignina. Celulosa y hemicelulosa se determinaron por una hidrólisis de ácido sulfúrico de dos etapas con análisis posterior de azúcares por cromatograf�a líquida de alto rendimiento usando NREL Standard Analytical Procedure #002. Lignina se determin� gravim�tricamente después de hidrolizar la celulosa y fracciones de hemicelulosa con ácido sulfúrico usando NREL Standard Analylical Procedure #003. Antes de la hidrólisis enzim�tica, los PCS se lavaron con un volumen grande de agua DDI en un filtro de vidrio; el peso en seco del lavado de agua PCS result� ser 24,54%. PCS molidos (peso en seco 32,35%) se obtuvieron a partir del lavado de agua PCS por fresado en un desfibrador de café y lavado posterior con agua desionizada en un filtro Millipore 22 11m (6P Express Membrane, Stericup, Millipore, Bedford, MA).
[0467] Hidrólisis de PCS se llev� a cabo usando microtubos Immunoware 1,1 mi (Pierce, Rockford, IL) usando un volumen de reacción total de 1,0 mI. En este protocolo, hidrólisis de PCS (10 mg/ml en 50 mM de tampón acetato sádico pH 5,0) se realizó usando cargas de proteína diferentes (expresado como mg de enzima por gramo de PCS) de un caldo de Thielavia ferrestris o muestra Celluclast� 1,5L (Novozymes NS, Bagsvaerd, Denmark) en presencia de 3% de beta-glucosidasa de Asperg�llus oryzae (producida de manera recombinante en Asperg�llus oryzae según la WO 02/095014) o 3% de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae según el Ejemplo 22) de carga de proteína de celulasa. Selección de fracciones de proteína de Thielavia terrestris para capacidad de hidrolizaci�n PCS se realizaron a 50Q C (bal'ios maría Isotemp 102S o TS Autofiow COz Jacketed Incubator). Típicamente, las reacciones se ejecutaron en cuadriplicados y partes alícuotas tomadas durante el curso de la hidrólisis. Reacciones de hidrólisis PCS se detuvieron mediante la mezcla de una parte alícuota 20 111 de cada hidrolizado con 180111 de 0,11 M de NaOH (reactivo de parada). Diluciones apropiadas en serie se generaron para cada muestra y el contenido de azúcar reductor se determin� usando un ensayo de ácido para-hidroxibenzoico hidr�cida (PHBAH, Sigma, SI. Lou is, MO) adaptado a un formato de microplaca de 96 pocillos como se describe debajo. Brevemente, una alícuota de 90 111 de una muestra apropiadamente diluida se colocó en una microplaca de fondo c�nico de 96 pocillos. Reacciones se iniciaron al'iadiendo 60 111 de PHBAH 1,5% (p/v) en 2% de NaOH en cada pocillo. Las placas se calentaron descubiertas a 95Q C durante 10 minutos. A las placas se les permitió enfriarse a temperatura ambiente (RT) y 50 111 de H20 destilada se al'iad i� a cada pocillo. Una alícuota de 100 111 de cada pocillo se transfirió a una placa de fondo plano de 96 pocillos y la absorbancia a A410nm se midió usando un SpectraMax Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Estándares de glucosa (0,1-0,0125 mg/ml diluido con hidróxido sádico 0,4%) se usaron para preparar una curva estándar para traducir los valores A410nm obtenidos en los equivalentes de glucosa. Los equivalentes resultantes se usaron para calcular el porcentaje de conversión de celulosa PCS para cada reacción.
[0468] El grado de conversión de celulosa a azúcar reductor (conversión; %) se calcul� usando la siguiente ecuación:
Conversi�n (%) = RS (rngIrrj) ' 100 ' 162/ (Celulosa (mglmI) , 180) = =RS (mglmI) , 100 I (Celulosa (mglmI) , 1,111 )
En esta ecuación, RS es la concentración de azúcar reductor en la solución medido en los equivalentes de glucosa (mg/ml), y el factor 1,111 refleja el aumento de peso en la conversión de celulosa a glucosa.
[0469] En un intento por reconstruir la actividad de hidrólisis PCS de caldo de Thielavia terrestris original, depósitos seleccionados de una columna Q Sepharose Big Bead (Grupos A a F) se mezclaron en proporciones iguales y su actividad de hidrólisis PCS se examin�. La mezcla que se aproxima más estrechamente a la actividad PCS del material
de inicio original (caldo de Thielavia terrestris, 5 mg de carga enzim�tica = 77% conversión de celulosa PCS) fue una mezcla que consiste en grupos A+B+C+E (5 mg de carga enzim�tica = 83% conversión de celulosa PCS).
[0470] Un FPLC ejecutado (AKTA Design, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala Sweden) en el que un grupo de Q Sepharose Big Bead de Thielav�a terrestris (flujo a través de material) se fraccion� en una columna Phenyl Superose generando m�ltiptes fracciones que se agruparon posteriormente y se intercambiaron en tampón como se describe previamente. Basado en las concentraciones de proteína para cada una de las muestras agrupadas (kit BCA Protein Assay) aproximadamente 43% de la proteína cargada se recuper� de este paso de fraccionamiento.
[047 1] Para seleccionar muestras de Thielavia terrestris que podrían mejorar rendimiento Celluclast� 1,5L, reacciones de hidrólisis PCS (1 ,0 mi protocolo, 10 g de PCS por litro, 50"C, complementado por adición de 3% de carga total de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae) se realizaron en las que 2,5 mg de carga enzim�tica de Celluclast� 1,5L se mezcl� con 2,5 mg de carga enzim�tica de cada muestra agrupada (5 mg de proteína de carga enzim�tica por reacción). Reacciones de control Celluclast� 1,5L que consisten en 10 mg de carga enzim�tica, 5 mg de carga enzim�tica y 2,5 mg carga enzim�tica dio valores de conversión de celulosa PCS de 86%, 75% Y 53%, respectivamente. Análisis de la hidrólisis resultante de PCS mostr� que una muestra agrupada cuando se a�adi� a Celluclasl� 1 ,5L en una proporCión de proteína de 50:50 y carga total de 5 mg de enzima super� los 5 mg de carga enzim�tica de Celluclast� 1,5L de reacción de control (79% vs. 75%). Esta muestra cuando se analizó en un gel de gradiente de acrilamida 8-16% mostr� comprender enlace prote�nico principal a aproximadamente 42 kDa.
Ejemplo 25: Efecto de ThieJavla terrestris GH61B en la hidrólisis de restos de maíz pretratados por Trichoderma reesei que expresa beta-glucosidasa de AspergiJ/us fumigatus
[0472] Thielavia terrestris GH61 B (producido de manera recombinante en Aspergillus oryzae como se describe en et ejemplo 12) se desal� y cambi� a 50 mM de acetato sádico pH 5,0 usando un filtro centrífugo Centricon Plus-20 con una membrana Biomax-5 (5000 NMWL; Millipore, Bedford, MA) antes de experimentos de hidrólisis. Caldo de fermentación de Trichoderma reese� sin células que expresa beta-glucosidasa de Asperg�lfus fumigatus (véase ejemplo 23) se us� en experimentos de hidrólisis sin desalaci�n o intercambio de tampón.
[0473] La concentración de proteína en las muestras enzim�ticas se determin� por el ensayo de microplaca BCA como se describe en las instrucciones para kit BCA Protein Assay Reagenl (Pierce Chemical Cc., Rockford, IL). Caldo de fermentación de Trichoderma reesei que expresa beta-glucosidasa de Aspergillus fum�gatus (véase ejemplo 23) se desal� adicionalmente por paso a través de columnas Bio Spin 6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) según las instrucciones del fabricante antes de medición de la concentración de proteína.
[0474] Diluciones enzim�ticas se prepararon frescas antes de cada experimento a partir de soluciones de enzima de materia prima, que fueron almacenadas a -20"C.
[0475] Azúcares reductores (RS) se determinaron usando un ensayo de ácido p-hidroxibenzoico hidr�cida (PHBAH) (Lever, M., 1972, A new reaetian far colarimetrie determinatian of earbohydrates, Anal. Biaehem., 47: 273-279), que se modificó y adapt� a un formato de microplaca 96 pocillos.
[0476] Una alícuota de 90-~1 de la muestra diluida se colocó en cada pocillo de un microplaca de fondo c�nico de 96 pocillos (Corning Inc., Acton, MA, Costar" policarbonato claro). El ensayo se empezó añadiendo 60 ~I de PHBAH 1,25% en hidróxido sádico 2% para cada pocillo. La placa descubierta se calentó en un bloque de calefacción a medida durante 10 minutos a 95"C. Después de que la microplaca se enfri� a temperatura ambiente, 35 ~I de agua desionizada se a�adi� a cada pocillo. Una alícuota de 1 OO-~I se retir� de cada pocillo y se transfirió a una placa de fondo plano de 96 pocillos (Corning Inc., Acton, MA, Costar, poliestireno de unión medio). La absorbancia a 410 nm (A41O) se midió usando un lector de microplaca SpectraMAX (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El valor ~10 se tradujo en los equivalentes de glucosa usando una curva estándar.
[0477] La curva estándar se obtuvo con seis estándares de glucosa (0,005,0,010,0,025,0,050,0,075 Y 0,100 mgfml), que se trataron de forma similar a las muestras. Estándares de glucosa se prepararon por dilución de 10 mgfml de solución de glucosa de materia prima con agua desionizada.
[0478] El grado de conversión de celulosa a azúcar reductor (conversión; %) se calcul� usando la misma ecuación descrita en el ejemplo 24.
[0479] Hidrólisis de PCS molido (1% plv en una base de peso en seco) por un caldo de fermentación de Tr;chaderma reesei sin células que expresa beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (véase ejemplo 23) a 2,5, 5, 10 Y 20 mg proteína por 9 de PCS se llev� a cabo en placas 96 Deepwell (1,2 mi, Brinkmann, Westbury, NY) cubierto con Deepwell Mats 96 (Brinkmann, Westburi, NY). Todas las reacciones con el volumen inicial de 1 mi se ejecutaron en 50 mM de acetato sádico pH 5,0 con agitaci�n intermilenle a 50"C, 55"C y 60"C.
[0480] Reacciones con el caldo de fermentación de Trichaderma reesei en 5 mg por g de PCS se complementaron con Thielavia lerreslris GH61 B (producido de manera recombinanle en Aspergillus oryzae como se describe en esle caso) a
1 mg por g de PCS (20% de carga de proteína de celulasa), y los resultados se compararon con reacciones no complementadas.
[0481] Partes alícuotas de 20 !JI se retiraron de reacciones de hidrólisis PCS en puntos de tiempo específicos que usan una pipeta de 8 canates, y se ariadieron a 180 !Jt de mezcla alcalina (102 mM de Na2C03 y 58 mM de NaHC03) en ptaca de filtración de 96 pocillos MultiScreen HV (Millipore, Bedford, MA) para terminar la reacción. Las muestras se filtraron al vacío en otra microplana de fondo plana para eliminar el residuo PCS. Después de dilución apropiada, los filtrados se analizaron para RS usando el ensayo PHBAH como se describe en el ejemplo 24.
[0482] Los resultados como se muestra en las figuras 34 y 35 indicaron que caldo de fermentación de Trichoderma reesei que expresa beta-glucosidasa de Asperg�llus fumigatus (véase ejemplo 23) con la proteína de Thielavia terrestris GH61 B mejor� el rendimiento de hidrólisis de 94 horas por 16-30% en comparación con caldo no complementado y requ isitos de carga enzim�tica se redujeron. A 50~C y 55~C, la misma conversión de celulosa en 94 horas podría conseguirse usando caldo de fermentación complementado en carga de proteína total de 6 mg por g de caldo de fermentación no complementado y PCS a 10 mg por g de PCS.
Ejemplo 26: Hidrólisis de restos de maíz pretratados (peS) con Thlelavla terrestris GH61 B producido de manera recombinante en Aspergillus oryzae
[0483] Transformantes de Asperg�llus oryzae que expresan cultivos de Thielavia terrestris GH61 B crecieron en matraz de agitaci�n (SF) de la siguiente manera. Esporas se recogieron con 5 mililitros de una solución acuosa de Tween 80 0,01% Y uno o lavados más con MDU2BP para maximizar el número de esporas recogidas. La suspensión de esporas se us� luego para inocular 500 mililitros de medio MDU2BP en un matraz Fernbach 2 litros. Cultivos transformantes se incubaron a 34~C con agitaci�n constante (200 r.p.m.). El día cinco después de inoculación, los caldos de cultivo se recogieron por filtración en una unidad filtro de nilón 500 mililitro, 75 mm con un tamaño de poro de 0,45 !Jm. Una muestra de 5 !JI del caldo se analizó por SDS-PAGE. El caldo con rGH61 B contuvo una banda principal de aproximadamente 42.000 PM.
[0484] Los caldos se almacenaron a _20�C antes de concentración por ultrafiltraci�n de presión en células agitadas (Amicon, membrana PM10 con 10kD MWCO) a aproximadamente concentración 15X, seguido por desalado/intercambio de tampón en el tampón de citrato (50 mM, pH 5,0) usando columnas EEcono-Pac 10DG (BioRad). Después de ensayo de la concentración de proteina por un kit BeA Protein Assay, las materias primas enzim�ticas se almacenaron a -20"C. Las proteinas no se purificaron posteriormente, y materias primas se ariadieron a mezclas de reacción basadas en proteina medida.
[0485] Hidrólisis de PCS se llev� a cabo usando microtubos 1,1 mi Immunoware o 1 mi bloques deep-well (VWR) usando un volumen de reacción total de 1,0 mI. Hidrólisis de PCS (10 mgfml en 50 mM de tampón de acetato sádico pH 5,0) se realizó usando cargas de proteina diferentes (expresado como mg enzim�tico por gramo PCS) de proteína de Thielavia terrestris GH61B recombinante con o sin Celluclast� 1,5L añadido en presencia de beta-glucosidasa de Aspergillus fum�gatus 3% (BG, 3% de carga de proteína de celulasa). Incubaci�n de mezclas de hidrólisis se realizó a 50"C (barios maria Isotemp 102S o TS Autoflow C02 Jacketed Incubator con humidificaci�n). Tipicamente, reacciones se ejecutaron en triplicados y partes alícuotas tomadas durante el curso de hidrólisis. Datos proporcionados fue la media de triplicados. Reacciones de hidrólisis PCS se detuvieron mediante la mezcla una alícuota de 20 !JI de cada hidrolizado con 180 !JI de tampón de parada PCS (0,102 M de Na2C03, 0,058 M de NaHC03, pH -10). Muestras se evaluaron inmediatamente o se almacenaron congeladas a -20"C. El contenido de azúcar reductor determinado usando un ensayo de ácido p-hidroxibenzoico hidr�cida (PHBAH) se adapt� a un formato de microplaca de 96 pocillos. Brevemente, una alícuota de 100 !JI de una muestra apropiadamente diluida se colocó en una microplaca de fondo c�nico de 96 pocillos. Reacciones se iniciaron af'iadiendo 50 !JI de 1,5% (p/v) PHBAH en NaOH 2% a cada pocillo. Placas se calentaron descubiertas a 95�C durante 10 minutos. A las placas se les permitió refrescar a RT y 50ul de H20 se a�adi� a cada pocillo. Una alícuota de 100 !JI de cada pocillo se transfirió a una placa de fondo plano de 96 pocillos y la absorbancia a AtlQnm se midió usando un lector de microplaca SpectraMax (Molecular Devices). Estándares de glucosa (0,1-0,0125 mg/ml diluido con hidróxido sádico 0,4%) se usaron para preparar una curva estándar para traducir los valores A410 obtenidos en los equivalentes de glucosa (basado en el rendimiento previsto de la conversión teórica completa de celulosa a glucosa). Los equivalentes resultantes se usaron para calcular el porcentaje de conversión de celulosa PCS para cada reacción. Los resultados se representan como equivalentes de glucosa (porcentaje conversión) vs. carga de proteina total (mg enzima I g PCS).
[0486] Para examinar la capacidad de la proteína de Thie/avia te"estris GH61 B para mejorar la actividad de Celluclast� 1,5L, la hidrólisis dependiente de dosis de PCS se evalu� para mezclas de 2,5 mg de Celluclast� 1 ,5L más 0,078 a 1,25 mg de la proteína GH61 B por g de PCS usando el micro protocolo 1,0 mi PCS. Para fines de comparación, cargas de proteina totales similares se realizaron también para Celluclast� 1,5L sin adición de la proteina GH61 B. Todas las muestras tuvieron beta-glucosidasa de Asperg�llus fumigatus adicional a 3% de carga de celulasa total.
[0487] Los resultados mostrados en la tabla 2 demostraron que la adición de varias cantidades de proteina de Thielav�a terrestris GH61 B a 2,5 mg/g de Celluclast� PCS 1,5L con una carga enzim�tica resultante total de 2,578 a 3,75 mgfg de conversión de glucosa aumentada PCS de arriba que se obtuvo por Celluclast� 1,5L sin la proteína GH61 B a 2,5 o
3,75 mg/g de niveles de carga enzim�tica PCS. Adición de tan solo 0,078 mg de la proteína GH61 B a 2,5 mg de Celluclast� 1,5L mejor� hidrólisis de PCS sobre la cantidad medida para 3,75 mg de Celluclast� 1,5L sin la proteína GH61 B. La adición de la proteína GH61 B a soluciones con Celluclast� 1,5L aument�, por lo tanto, el rendimiento de azúcares reductores (predominantemente glucosa y celobiosa residual) sobre hidrólisis de restos de maíz pretratado con ácido (PCS). El aumento de rendimiento fue superior al conseguida por adición de cantidades iguales o inferiores de Celluclast� 1,5L, dando como resultado requisitos de carga enzim�tica reducidos y eficiencia de enzima aumentada.
Tabla 2. Valores de Celluclast� y de GH61 B est�n en mg enzima/g de PCS y glucosa est� en porcentaje de rend imiento teórico.Todas las mezclas contienen 3% p/p de beta-glucosidasa añadida para mejorar conversión de celobiosa a glucosa. Conversión de glucosa se muestra como porcentaje de glucosa teórica disponible por hidrólisis de PCS.
Ce"uc'ast�
GH61 B OD Enzima total (mg/g peS) Conversión de glucosa %)
2,5
O 2,5 59,3
2,5
0,078 2,578 65,4
2,5
0,16 2,66 65,3
2,5
0,31 2,81 66,9
2,5
0,63 3,13 67,8
2,5
1,25 3,75 66,8
O
1,25 1,25 2,6
3,75
O 3,75 62,7
6
O 6 70,9
8
O 8 73,7
Ejemplo 27: Hidrólisis de restos de maíz pretratado (PCS) con polip�ptidos GH61 e, GH61 E Y GH61 G producidos de manera recombinante en AspergiJJus otyzae
[0488] Tres polip�ptidos de la familia 61, incluyendo Thielavia terrestris GH61 B, GH61 E Y GH61 G se evaluaron en la misma serie de reacciones de hidrólisis pes como se describe en los ejemplos 24 y 25. Todos los polip�ptidos de la familia 61 se expresaron en Aspergillus otyzae como se describe en el ejemplo 14 y los caldos se concentraron usando una célula agitada de Amicon equipada con una membrana PM10, 10 kOa de corte (Millipore, Billerica, MA) y se desalaron usando una columna Econo-Pac 100G (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Después de ensayo de la concentración de proteina por BCA (Pieree, BSA usado como estándar), estas materias primas enzim�ticas se almacenaron a -20"C. Las proteínas no se purificaron posteriormente y materias primas se añadieron a mezclas de reacción basadas en proteína medida.
[0489] Hidrólisis de PCS (10 mg/ml en 50 mM de tampón de acetato sádico pH 5,0) se llev� a cabo usando microtubos 1,1 mllmmunoware (Pierce, Rockford, IL) con un volumen de reacción total de 1,0 mI. Los polip�ptidos de la familia 61 se evaluaron para su capacidad de mejorar la capacidad hidrol�tica de una preparación con celulasa derivada de fermentación de Trichoderma raesei una beta-glucosidasa de Aspergillus otyzae (WO 02/095014), de ahora en adelante llamada Tr/AoBG y obtenida de Novozymes NS, Bagsvrerd, Denmark. Hidrólisis de PCS se realizó usando 2,5 mg de Tr/AoBG por gramo de PCS, complementado con 0,2 mg de polip�ptido GH61 por gramo de PCS. La hidrólisis de PCS se realizó a 50"C (incubadora de doble pared TS Autoflow C02). Reacciones se ejecutaron en duplicados y partes alícuotas tomadas durante el curso de la hidrólisis. Reacciones de hidrólisis de pes se detuvieron mediante la mezcla de una alícuota 20 111 de cada hidrolizado con 180 111 de 0,11 M de NaOH (reactivo de parada). Diluciones en serie apropiadas se generaron para cada muestra y el contenido de azúcar reductor se determin� usando un ensayo de ácido para-hidroxibenzoico hidr�cida (PHBAH, Sigma, SI. Louis, MO) adaptado a un formato de microplaca de 96 pocillos como se describe abajo. Brevemente, una alícuota de 90 111 de una muestra apropiadamente diluida se colocó en una microplaca de fondo c�nico de 96 pocillos. Reacciones se iniciaron añadiendo 60 111 de 1,5% (plv) PHBAH en NaOH 2% a cada pocillo. Placas se calentaron descubiertas a 95"C durante 10 minutos. A las placas se les permitió refrescar a temperatura ambiente (RT) y 50 111 de H20 destilada se a�adi� a cada pocillo. Una alícuota de 100 111 de cada pocillO se transfirió a una placa de fondo plano de 96 pocillos y la absorbancia a ~lOnm se midió usando un lector de microplaca SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Estándares de glucosa (0,1-0,0125 mg/ml diluido con hidróxido sádico 0,4%) se usaron para preparar una curva estándar para traducir los valores ~lOnm obten idos en los equivalentes de glucosa. Los equivalentes resultantes se usaron para calcular el porcentaje de conversión de celulosa PCS para cada reacción.
SS
E1 0180389
[0490] El grado de conversión de celulosa a azúcar reductor (conversión; %) se calcul� usando la misma ecuación descrita en el ejemplo 24.
[0491] Conversión de celulosa por Tr/AoBG sola (2,5 mg/g PCS) o complementada con cada uno de los tres polip�ptidos GH61 (0,2 mglg PCS) se resumen en la tabla 3 yen la Figura 36.
Tabla 3. Conversión de celulosa por Tr/AoBG sola o Tr/AoBG complementada con polip�ptido GH61 a 115 h. 50�C, pH
Prueba #
Nombre Carga, mgl 9 PCS Conversión a 115 h, %
1
Tr/AoBG 2,5 74,6
2
Tr/AoBG + T.t.GH61 B 2,5+0,2 82,0
3
Tr/AoBG + T. t.GH61 E 2,5+0,2 82,0
4
Tr/AoBG+ T.t.GH61 G 2,5+0,2 82,2
5
Tr/AoBG 3,5 82,4
[0492] La tabla 3 y la Figura 36 muestran que todos los tres polip�ptidos GH61 mejoraron la actividad de Tr/AoBG en PCS. Complementaci�n de 0,2 mg de T.t. GH61 B, T.t. GH61 E, o T.t. GH61 G a 2,5 mg de Tr/AoBG liber� un nivel de conversión cerca o superior que la de 3,5 mg de Tr/AoBG, indicando actividad Tr/AoBG en PCS fue impulsada por los tres polip�ptidos GH61 .
[0493] Thielavia terrestris GH61 C se evalu� en un experimento separado usando 2,5 mglg PCS de Tr/AoBG y 0,125 mg/g PCS de T.t. GH61C con incubaci�n durante 120 horas. Conversión fue 63,1% con Tr/AoBG solo y 66,2% con adición T.1. GH61 C.
Ejemplo 28: Hidrólisis de restos de maíz pretratados (peS) con polip�ptido GH61 O producido de manera recombinante en Aspergillus oryzae
[0494] Polip�ptido de Thielavia teffestris GH61 D se expres� en Aspergillus oryzae como se describe en el ejemplo 14 y los caldos se desalaron y se concentraron como en el ejemplo 27. Hidrólisis de PCS se llevo a cabo usando bloques deep-well1 mi (VWR) usando un volumen de reacción total de 1,0 mI. Hidrólisis de PCS (10 mgfml en 50 mM de tampón de acetato sádico pH 5,0) se realizó usando cargas de proteína diferentes (expresado como mg enzim�tico por gramo PCS) de una proteína de Thielavia terrestris recombinante con o sin Celluclast� l ,5L al'iadido en presencia de ~glucosidasa de Aspergillus fumigatus 3% (6G, 3% de carga de proteína de celulasa). Incubaci�n de mezclas de hidrólisis se realizó a 50�C (incubadora de doble TS Autoflow C02 con humidificaci�n). Tlpicamente, reacciones se ejecutaron en triplicados y partes alícuotas tomadas durante el curso de la hidrólisis. Los datos proporcionados son la media de triplicados. Reacciones de hidrólisis de PCS se detuvieron mediante la mezcla de una alicuota de 20 ~I de cada hidrolizado con 180 �JI de tampón de parada PCS (0,102 M de Na2C03, 0,058 M de NaHC03, pH -10). Muestras se evaluaron inmediatamente o se almacenaron congeladas a _20�c. El contenido de azúcar reductor se determin� usando un ensayo de ácido p-hidroxibenzoico hidr�cida (PHBAH) adaptado a un formato de microplaca de 96 pocillos. Brevemente, una alícuota 100 ~I de una muestra apropiadamente diluida se colocó en una microplaca de fondo c�nico de 96 pocillos. Reacciones se iniciaron al'iadiendo 50 ~I de 1,5% (pfv) PHBAH en NaOH 2% a cada pocillo. Placas se calentaron descubiertas a 95�C durante 10 minutos. A las placas se les permitió refrescar a RT y 50 ~I de H20 al'iadido a cada pocillo. Una alícuota de 100 ~I de cada pocillo se transfirió a una placa de fondo plano de 96 pocillos y la absorbancia a A410nm se midió usando un leclor de microplaca SpectraMax (Molecular Devices). Estándares de glucosa (0.1-0,0125 mglml diluido con hidróxido sádico 0,4%) se usaron para preparar una curva estándar para traducir los valores A410 obtenidos en los equivalentes de glucosa (basadoa en el rendimiento previsto de la conversión teórica completa de celulosa a glucosa). Los equivalentes resultantes se usaron para calcular el porcentaje de conversión de celulosa PCS para cada reacción. Los resultados se representaron como equivalentes de glucosa (porcentaje conversión) vs. carga de proteína total (mg enzima/g PCS). Para examinar la capacidad de GH61 D para mejorar la actividad de Celluclast� 1,5L, la hidrólisis dependiente de dosis de PCS se evalu� para mezclas de 2,5 mg de Celluclast� más 0,1 a 0,8 mg GH61 Dfg PCS usando el micro protocolo 1,0 mi PCS. Para fines de comparación, cargas de proteína totales similares se realizaron también para Celludast� l,5L sin adición de GH61 D. Todas las muestras tuvieron ~-glucosidasa de Aspergillus fumigatus adicional a 3% de carga de celulasa total.
[0495] Adición de varias cantidades de GH61 D a 2,5 mgfg de Celluclast� PCS con una carga enzim�tica resultante total de 2,6 a 3,3 mgfg PCS aumenta conversión de glucosa de arriba de la obtenida por Celluclast� sin GH61 Da 3,4 mg/g PCS niveles de carga de enzima (tabla 4).
Tabla 4. Conversión de celulosa por Celluclast� solo o Celluclast� complementado con GH61 D
Celluclast�
GH61 O Enzima tota l (mg/g PCS) Conversi6n de glucosa (%)
2,5
O 2,5 66,1
2,5
0,1 2,6 73,2
2,5
0,2 2,7 75,4
2,5
0,4 2,9 76,5
2,5
0,8 3,3 78,5
2,7
O 2,7 67,3
2,9
O 2,9 68,3
3,4
O 3,4 71,7
4,0
O 4,0 73,6
Dep�sito de material biol�g ico
[04961 El siguiente material biológico se ha depositado según las condiciones del tratado de Budapest con la Agricultural 5 Research Service Patent Culture Collection, Northem Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, lIIinois, 61604, y se le ha dado los siguientes números de registro:
Dep�sito Número de acceso Fecha de depósito
Cepa de E coli pEJG120 NRRL 8-30699 19 diciembre, 2003
10 Cepa de E. col; pTter61 C NRRL 8-30823 21 enero, 2005 Cepa de E. coli pTter61 O NRRL 6-30812 21 enero, 2005 Cepa de E. col; pTter61 E NRRL 8-30814 21 enero, 2005 Cepa de E. col; pTter61 G NRRL 8-30811 21 enero, 2005
15 [0497] Las cepas se han depositado bajo condiciones que aseguran que acceso a los cultivos estar� disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente para uno determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas pata tener derecho a ellas bajo 37 C.F.R. �1, 4 Y 35 U.S.C. �122. Los depósitos representan cultivos substancialmente puros de las cepas depositadas. Las depósitos est�n disponibles según sea necesario por leyes de patentes extranjeras en paIses donde equivalentes de la presente solicitud, o su descendiente se solicitan. No obstante, se debe entender que
20 la disponibilidad de un depÓSito no constituye una licencia para practicar la presente invención en deroga de los derechos de patentes concedidas por acción gubemamental.
Listado de secuencias
25 [0498]
<110> NOVOZYMES 610TECH, INC.
<120> Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y ácidos nucleicos que los codifican 30
<130> 10587.204-WO
<150> 60/540,661
<151> 2004-01-30 35
<160> 78
<170> Versión de patentln 3.2
40 <210> 1
<211> 1846
<212> AON
<213> Th ielavia terrestris
45 <400> 1
aattgaagga gggagtggcg gagtggccac caagtcaggc ggctgtcaac taaccaagga 60 tgggaacagt tcggctcgcc ttgc ccgagg gcagcgttcc ctgat9gg9a cgaaccatgg 120 gactggggtc agctgctgta taaaagttca aatcgatgat ctctcagatg gcgctgctgg 1 60 ggtgttctgc gcttttccat cctcgcaacc tggtatccca ctagtccagc gt tcggcacc 240 atgaagtcgt tcaccattgc cgccttggca gccctatggg cccaggaggc cgccgcccac 300 gcgaccttcc aggacctctg gattgatgga gtcgactacg gctcgcaatg tgtccgcctc 360 ccggcgtcca actcccccgt caccaatgtt gcgtccgacg atatccgatg caatgtcggc 420 acct"cgaggc ccaccgtcaa gtgcccggtc aaggccggct ccacggtcac gatcgagatg 460 caccaggttc gcacgcctct ctgcgtaggc cccccagcta ctatatggca ctaacacgac 540 ctccagcaac ctggcgaccg gtcttgcgcc aacgaggcta tcggcggcga ccactacggc 600 cccgtaatgg tgtacatgtc caaggtcgat gacgcggtga cagccgacgg ttcatcgggc 660 tggttcaagg tgtt ccagga cagctgggcc aagaacccgt C999ttcgac gggcgacgac 720 gactactggg gcaccaagga cctcaact cg tgctgcggca agatgaacgt caagat cccc 760 gaagacatcg agccgggcga ct acctgctc cgcgccgagg ttatcgcgct gcacgtggcc 640 gccagctcgg gcggcgcgca gttctacatg tcctgctacc agctgaccgt gacgggctcc 900 ggcagcgcca ccccctcgac cgtgaatttc ccgggcgcct actcggccag cgacccgggc 960 atcct gatca acatccacgc gcccatgtcg acctacgtcg tcccgggccc gaccgtgtac 1020 gc999c9gct cgaccaagtc ggctggcagc tcctgctccg gctgcgaggc gacctgcacg 1080 gttggttccg gccccagcgc gacactgacg cagcccacct ccaccgcgac cgcgacctcc 1140
gcccctggcg gcggcggctc cggctgcacg gcggccaagt accagcagtg cggcggcacc 1200 ggctacactg ggtgcaccac ctgcgctgta agttccctcg tgatatgcag cggaacaccg 1260 tctggactgt tttgctaact cgcgtcgtag tccgggtcta cctgcagcgc cgtctcgcct 1320 ccgtactact cgcagtgcct ctaagccggg agcgcttgct cagcgggctg ctgtgaagga 1380 gctccatgtc cccatgccgc catggcc99a gtaccgggct gagcgcccaa ttcttgtata 1440 tagttgagtt ttcccaatca tgaatacata tgcatctgca tggactgttg cgtcgtcagt 1500 ctacatcctt tgctccactg aactgtgaga ccccatgtca tcc9g8ccat tcgatcggtg 1560 ctcgctctac catctcggtt gatgggtctg 99cttgagag tcactg9cac gtcctc9gc9 i620 gtaatgaaat 9t9gaggaaa gtgtgagctg tctgacgcac tC99cgctga tgagacgttg 1680 agcgcggccc acactggtgt tctgtaagcc agcacacaaa agaatactcc aggatggccc 1740 atagcggcaa atatacagta tcagggatgc aaaaagtgca aaagtaaggg gctcaatcgg 1800 ggatcgaacc cgagacctcg cacatgactt atttcaagtc aggggt 1846
<210> 2 5 <2 11 >326
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<400> 2
Met Lys Ser Phe Thr Ile Ala Ala Leu Ala Ala Leu Trp Ala Gln Glu 1 5 10 15
Ala Ala Ala His Ala Thr Phe Gln Asp Leu Trp Ile Asp Gly Val ASp 20 25 30
Tyr Gly Ser Gln Cys Val Arg Leu Pro Ala Ser Asn Ser Pro Val Thr 35 40 45
Asn Val Ala Ser Asp Asp Ile Arg Cys Asn Val Gly Thr Ser Arg Pro 50 55 60
Thr Val Lys Cys Pro Val Lys Ala Gly Ser Thr Val Thr Ile Glu Met 65 70 75 80
His Gln aln Pro Gly Asp Arg Ser Cys Ala Asn Glu Ala Ile Gly Gly 85 90 95
Asp His Tyr Gly Pro Val Met Val Tyr Met Ser Lys Val Asp ASp Ala 100 105 110
Val Thr Ala Asp Gly Ser Ser Gly Trp Phe Lys Val Phe Gln Asp Ser 115 120 125
Trp Ala Lys Asn pro Ser Gly Ser Thr Gly Asp Asp Asp Tyr Trp Gly 130 135 140
Thr Lys Asp Leu Asn Ser Cys Cys Gly Lys Met Asn Val Lys Ile Pro 145 150 155 160
Glu Asp Ile Glu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Val Ile Ala 165 170 175
Leu His Val Ala Ala Ser Ser Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Met Ser Cys 180 185 1~0
Tyr Gln Leu Thr Val Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Pro Ser Thr Val 195 200 205
Asn Phe Pro G1y Ala Tyr Ser Ala Ser ASp Pro Gly Ile Leu Ile Asn 210 215 220
Ile Hi s Ala Pro Met Ser Thr Tyr Val Val Pro Gly Pro Thr Val Tyr 225 230 235 240
Ala Gly Gly Ser Thr Lys Ser Ala Gly Ser Ser Cys Ser Gly Cya Glu 245 250 255
Ala Thr Cys Thr Val Gly Ser Gly Pro Ser Ala Thr Leu Thr Gln Pro 260 265 270
Thr Ser Thr Ala Thr Ala Thr Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly 275 280 285
eys Thr Ala Ala Lys Tyr Gln Cln Cys Gly Gly Thr Gly Tyr Thr Gly 290 295 300
Cys Thr Thr Cys Ala"Ser Gly Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Pro Pro 305 310 31 5 320
Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 125
<210> 3 <211 >880
<212> ADN
<213> Thielavia terrestris
<400> 3
accccgggat cactgcccct aggaaccagc acacctcggt ccaatcatgc ggttcgacgc 60 cctctccgcc ctcgctcttg cgccgcttgt ggctggccac ggcgccgtga ccagctacat 120 catcggcggc aaaacctatc ccggctacga gggcttetcg cctgcctcga gcccgccgac 180 gatccagtac cagtg9ccc9 actacaaccc gaccctgagc gtgaccgacc cgaagatgcg 240 ctgcaacggc ggcacctcgg cagagctcag cgcgcccgtc caggccggcg agaacgtgac 300 ggccgtctgg aagcagtgga cccaccagca aggccccgtc atggtctgga tgttcaagtg 360 ccccggcgac ttctcgtcgt gccacggcga cggcaagggc tggttcaaga tcgaccagct 420 gggcctgtgg ggcaacaacc tcaactcgaa caactggggc accgcgatcg tctacaagac 480 cctccagtgg agcaacccga tccccaagaa cctcgcgccg ggcaactacc tcatccgcca 540 cgagctgctc gccctgcacc aggccaacac gccgcagttc tacgccgagt gcgcccagct 600 ggtcgtctcc ggcagcggct ccgccctgcc cccgtccgac tacctctaca gcatccccgt 660 ctacgcgccc cagaacgacc ccggcatcac c9t9a9t999 cttccgttcc gC9gc9agct 720 ctgtggaaat cttgctgacg atgg9cta99 ttgacatcta caacg9C999 cttacctcct 780 acaccccgcc cggcggcccc gtctgstctg gcttcgagtt ttag9cgcat tgagtcg999 840 gctacgagg9 gaaggcatct gttcgcatga gc9t99gtac 880
5 <210> 4
<211> 478
<212> PRT
<213> Thielavia lerreslris 10 <400>4
Met Arg Phe Asp Ala Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Pro Leu Val Ala 1 5 10 15
Gly His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Pro 20 25 30
Gly Tyr Glu Gly Phe Ser Pro Ala Ser Ser Pro Pro Thr Ile Gln Tyr 35 40 45
Gln Trp Pro ASp Tyr Asn Pro Thr Leu Ser Val Thr Asp Pro Lys Met 50 SS 60
Arg eya Asn Gly Gly Thr Ser Ala Gly Leu Ser Ala Pro Val Gln Ala 65 70 75 80
Gly alu Asn Val Thr Ala val Trp Lys Gln Trp Thr His aln aln Gly 85 90 95
Pro Val Met
Val Trp Met Phe Lys cys Pro Gly Asp Phe Ser Ser Ser
100
105 110
His Gly Asp Gly Lys Gly Trp
Phe Lys Ile Asp Gln Leu Gly Leu Trp
115
120 125
Gly Asn
Asn Leu Asn Ser Asn Asn Trp Gly Thr Ala Ile Val Tyr Lys
130
135 140
Thr Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ile Pro Lys Asn Leu Ala Pro Gly Asn 145 150 15S 160
Tyr Leu Ile Arg His Glu Leu Leu Ala Leu His Gln Ala Asn Thr Pro 165 170 175
Gln Phe Tyr Ala Glu Cys Ala Gln Leu Val Val Ser Gly Ser Gly Ser 180 185 190
Ala Leu Pro Pro Ser Asp Tyr Leu Tyr Ser Ile Pro Val Tyr Ala Pro 195 200 205
Gln Asn Asp Pro Gly Ile Thr Val Asp Ile Tyr Asn Gly Gly Leu Thr 210 215 220
Ser Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro val Trp Ser Gly Phe Glu Phe Met 225 230 235 240
Arg Phe ASp Ala Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Pro Leu Val Ala Gly 245 250 255
His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Pro Gly 260 265 270
Tyr Glu Gly Phe Ser Pro Ala Ser Ser Pro Pro Thr Ile Gln Tyr Gln 275 280 285
Trp Pro ASp Tyr Asn Pro Thr Leu Ser Val Thr Asp Pro Lys Met Arg 290 295 300
Cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Glu Leu Ser Ala Pro Val Gln Ala Gly 305 310 315 320
Glu Asn Val Thr Ala Val Trp Lys Gln Trp Thr His Gln Gln Gly Pro 325 330 335
Val Met Val Trp Met Phe Lys Cys Pro Gly Asp Phe Ser Ser Ser His 340 345 350
Cly Asp Gly Lys Gly Trp Phe Lys lle Asp eln Leu Gly Leu Trp Gly 355 360 365
Asn Asn Leu Asn Ser Asn Asn Trp Gly Thr Ala lle Val Tyr Lys Thr 370 375 3BO
Leu Gln Trp Ser Asn Pro lle Pro Lys Asn Leu Ala Pro Gly Asn Tyr 385 390 395 400
Leu Ile Arg His Glu Leu Leu Ala Leu His Gln Ala Asn Thr Pro Gln 405 410 415
Phe Tyr Ala Glu Cys Ala eln Leu Val Val Ser Gly Ser Gly Ser Ala 420 425 430
Leu Pro Pro Ser Asp Tyr Leu Tyr Ser Ile Pro Val Tyr Ala Pro Gln 435 440 445
Asn Asp Pro Gly lle Thr val Asp Ile Tyr Asn Gly Gly Leu Thr Ser 450 455 460
Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro Val Trp Ser Gly Phe Glu Phe
465 470 475
<210> 5 5 <2 11 >1000
<212> ADN
<213> Thielavia terrestris
<400> 5 10
ctcctgttce tgggccaccg cttgttgcct gcactattgg tagagttggt ctattgctag 60 agttggccat gcttctcaca tcagtcctcg gctcggctgc cctgcttgct agcggcgctg 120 cggcacacgg cgccgt gacc agctacatca tcgccggcaa gaateacccg gggtgggtag 180 ctgattateg agggcgcatt caaggttcat accggtgtgc atggctgaea aceggctggc 240 agataceaag gcttttctcc tgcgaactcg ccgaaegtca tccaatggca atggcatgac 300 t a caaccccg tcttgtcgtg cagcgact.cg aagettcgct gcaacggcgg cacgtcggcc 360 accctgaacg ccacggccgc accgggcgac accatcaccg ccatetggge gcagtggacg 420 cacagccag9 gccccatcct ggtgtggatg taeaagtgCC cgggctcett cagctcctgt 480 gacggctccg gegct:ggetg gttcaagate gacgaggccg gcttCCACgg cgacggcgte 540 aaggtcttcc tcgacaccga gaaccegtcc 99ctg9gaca tcgccaagct cgtcggcggc 600 aacaageagt ggagcagcaa ggtccccgag 9gcctegcce ecggcaacta eetcgtccgc 660 cacgagttga tcgccctgca ccag9ccaac aacccgcagt tctacccgga gtgcgcccag 720 gtcgtcatca ccggctccgg caccgcgcag ccggatgcct catacaaggc ggctatcccc 780
99ctactgca accagaatga cccgaacatc aaggtgagat t9ct9gaaag aaagt9gtcC aagctaaace gcgctccagg atccctcaga cctacaagat tcccggccct cccgtcttca gcccgggact tcaccgcctg aagttgttga atcgatggag
<210> 6
<211 > 516
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<400> 6
ccaggcgtaa tgcagtctac 840 tgcceatcaa cgaccactce .00 agggcaccgc cagcaagaag .60 1000
Met Leu Leu Thr Ser val Leu Gly Ser Ala Ala Leu Leu Ala Ser Gly 1 S 10 15
Ala Ala Ala His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Ala Gly Lys Asn 20 25 30
Tyr Pro Gly Tyr Clo Gly Phe Ser Pro Ala Asn Ser Pro Asn Val Ile 35 40 45
Gln Trp OIn Trp His Asp Tyr Asn Pro Val Leu Soc eys Ser Asp Ser SO SS 60
Lys Leu Arg Cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asn Ala Thr Ala 65 70 75 80
Ala Pro Gly Asp Thr Ile Thr Ala Ile Trp Al a Gln Trp Thr Hia Ser 85 90 95
Gln Gly Pro Ile Leu val Trp Met Tyr Lys Cys Pro Gly Ser Phe Ser 100 105 no
Ser eys Asp Gly Ser Gly Ala Gly Trp Phe Lys Ile Asp Glu Ala Gly 115 120 125
Phe His Gly Asp Gly Val Lys Val Phe Leu Asp Thr Glu Aso Pro Ser DO 1]5 140
Gly Trp Asp lle Ala Lys Leu Val Gly Gly Aso Lys Gln Trp Ser Ser 14 S ISO 155 160
Lys Val Pro Glu Gly Leu Ala Pro Gly Aso Tyr Leu Val Arg Mis Glu 165 170 175
Leu tle Ala Leu His GIn Ala Asn Asn Gln Phe Tyr Pro Glu Cys
,.0 ,.5 Pro
Ala Cln Val Val �le Thr Gly Ser Gly Thr Al a CID Pro Asp Ala Ser 195 200 205
Tyr Lya Ala Ala Ile Pro Gly Tyr Cys Asn Cln Asn Asp Pro Asn Ile 210 215 220
Lys Val Pro �le Asn Asp His Ser Ile Pro CID Thr Tyr Lys lle Pro 225 230 235 240
GlY Pro Pro Val Phe Lys Gly Thr Ala Ser Lys Lys Ala Arg Asp phe 245 250 255
Thr Ala Met Leu Leu Thr Ser Val Leu Gly Ser Ala Ala Leu Leu Ala 260 265 270
Ser Gly Ala Ala Ala His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile tle Ala Gly 275 2.0 as
Ly' Asn Tyr Pro Gly Tyr Gl n Gly Phe Ser Pro Ala Asn Ser Pro Asn 290 295 JOO
Val lle CID Trp Gl n Trp His Asp Tyr Asn Pro Val Leu Ser Cys Ser ]05 310 315 ]20
Asp Ser Lys Leu Arg cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asn Ala 325 330 335
Thr Ala Ala Pro Gly ASp Thr lle Thr Ala Ile Trp Ala Gln Trp Thr 340 345 350
His Ser Gln Gly Pro Ile Leu Val Trp Met Tyr Lys Cys Pro Gly Ser )55 360 ]65
Phe Ser Ser cys Asp Gly Ser Gly Ala Gly Trp Phe Lys 370 375 380
Ile Asp Glu
Ala Gly Phe 385
His Oly Asp Gly Val 390 Lys Val Phe Leu Asp Thr Glu Asn 395 400
Pro Ser Gly Trp Asp Ile Ala 405
Lys Leu Val Gly Gly Aso Lys -410 Glo Trp 415
Ser Ser Lys Va l 420
Pro elu Gly Leu Ala 425 Pro Gly Aso Tyr Leu Val 430 Arg
His Glu Leu 435
lle Ala Leu Mis Glo Ala Aso 440 Asn Pro e l n 445 Phe Tyr Pro
Glu Cys Ala eln Val Val 450
Ile Thr Gly Ser Gly Thr Ala eln 455 460 Pro Asp
Ala Ser Tyr Lys 465
Ala Ala 470 Ile Pro Gly Tyr Cys Asn eln Asn Asp Pro 475 480
Aso
tle Lys Val Pro Ile Asn Asp Mis 485 Ser tIc Pro eln 490 Thr Tyr Lys 4.95
lle Pro Gly Pro Pro 500
Val Phe Lys Gly Thr Ala Ser Lys Lys Ala 505 510 Arg
Asp Phe Thr Ala 515
5
<210> 7 <21 1> 681 <212>AON <213> Thielavia terrestris
<400> 7 atgctcgcaa acg9tgccat cgtcttcctg gccgccgccc
tcggcgtcag tggccactac 60
acctggccac 9ggttaacga cggcgccgac
tggcaacagg tccgtaaggc g9acaactgg 120
caggacaacg gctacgtcgg ggatgtcacg tcgccacaga
tccgctgttt ccaggcgacc 180
ccgtcccc99 ccccatccgt cctcaacacc acggccggct cgaccgtgac ctactgggcc aaccccgacg tctaccaccc c999cct9t g cagttttaca t99cccgcgt gcccgatg9c g1l9gacatca actcgtggaa cggcgacg9c gccgtgtggt tcaaggtgta cga9gaccat
240 300 360
10
cctacctttg gcgc,tcagct cacatggccc agcacgggca agagctcgtt cgcggttccc 420
atccccccgt gcatcaagtc cggctactac ctcctccggg c9gagcaaat cggcctgcac
480
gtcgcccaga gcgtaggcgg agcgcagttc
tacatctcat gcgcccagct cagcgtcacc 540
99c9gc9gca gcaccgagcc gccgaacaag gtggccttcc ccggcgctta cagtgcgacg
600
gacccgggca ttctgatcaa catctactac cctgttccca cgtcctacca gaaccccggc
660
ccggccgt.ct t.cagctgctg
a 681
5
<210> 8 <2 11 > 452 <212> PRT <213> Thielavla lerreslris
<400> 8
Met 1 Leu Ala Asn Gly Ala 5 Ile Val Phe Leu Ala Ala Ala Leu Gly Val 10 15
Ser Gly His Tyr Thr Trp Pro Arg Val Asn Asp Gly Ala ASp Trp Gln 20 25 30
Gln Val
Arg Lys Ala Asp Asn Trp Gln Asp Asn Gly Tyr val Gly ASp 35 40 45
val Thr 50
Ser Pro Gln Ile Arg Cys 55 Phe Gln Ala Thr 60 Pro Ser Pro Ala
Pro Ser Val 65
Leu Asn Thr Thr Ala Gly Ser Thr Val 70 75 Thr Tyr Trp Ala 80
Asn
Pro Asp Val Tyr 85 His Pro Gly Pro Val 90 Gln Phe Tyr Met Ala Arg 95
Val
Pro Asp Gly Glu ASp lle Asn Ser Trp Asn Gly Asp Gly Ala Val 100 105 110
Trp Phe
Lys 115 Val Tyr Glu ASp His 120 Pro Thr Phe Gly Ala Gln Leu Thr 125
Trp Pro Ser Thr Gly Lys 130
Ser Ser Phe Ala Val 135 Pro 140 Ile Pro Pro Cys
Ile Lys 145
Ser Gly Tyr Tyr Leu 150 Leu Arg Ala Glu Gln 155 Ile Gly Leu His 160
10
Val Ala Gln Ser Val 165 Gly Gly Ala Gln Phe 170 Tyr Ile Ser eys Ala Gln 175
Leu Ser Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Glu Pro Pro Asn Lys Val Ala 180 185 190
Phe Pro Gly Ala Tyr Ser Ala Thr Asp Pro Gly Ile Leu �le Asn Ile 195 200 205
Tyr Tyr Pro Val Pro Thr Ser Tyr Cln Asn Pro Gly Pro Ala Val Phe 210 215 220
Ser Cys Met Leu Ala Asn Gly Ala Ile Val Phe Leu Ala Ala Ala Leu 225 230 235 240
Gly val Ser Gly His Tyr Thr Trp Pro Arg val Asn Asp Gly Ala ASp 245 250 255
Trp Gln Gln Val Arg Lys Ala Asp Asn Trp Gln Asp Asn Gly Tyr Val 260 265 270
Gly ASp Val Thr Ser Pro Gln Ile Arg cys Phe Gln Ala Thr Pro Ser 275 280 285
Pro Ala Pro Ser Val Leu Asn Thr Thr Ala Gly Ser Thr Val Thr Tyr 290 295 300
Trp Ala Asn
Pro Asp Val Tyr His Pro Gly Pro Val Gln Phe Tyr Met
305
310 315 320
Ala Arg Val
Pro ASp Gly Glu Asp Ile Asn Ser Trp Asn Gly Asp Gly
325
330 335
Ala Val
Trp Phe Lys Val Tyr Olu ASp His Pro Thr Phe Gly Ala Gln
340
345 350
Leu Thr Trp Pro Ser Thr Gly Lys Ser Ser Phe Ala Val Pro Ile Pro 355 360 365
Pro Cys Ile Lys Ser Gly Tyr Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Gln Ile Gly 370 375 380
Leu His Val Ala Gln Ser Val Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Cys 385 390 395 400
Ala Gln Leu Ser Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Glu Pro Pro Asn Lys 405 410 415
Val Ala Phe Pro Gly Ala Tyr Ser Ala Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile 420 425 430
Asn Ile Tyr Tyr Pro Val Pro Thr Ser Tyr Gln Asn Pro Gly Pro Ala
435 440 445
val Phe Ser Cys 450
<210> 9
<211> 960 5 <212>AON
<213> Thielavia terreslris
<400> 9
atgaagggac ttttcagtgc cgccgccctc tccctggccg tcggccaggc ttcggcccat 60 tacatcttcc agcaactctc catcaacggg aaccagtttc cggtgtacca atatattcgc 120 aagaacacca attataacag tcccgttacc gatctcacgt ccgacgatct tcggtgcaat 180 gtcggcgccc agggtgctgg gacagacacc gtcacggtga aggccggcga ccagttcacc 240 ttcacccttg acacccctgt ttaccaccag 99gcccatct ccatctacat gtccaaggcc 300 ccgggcgcg9 cgtcagacta cgatggcagc ggcggctggt tcaagatcaa ggactggggc 360 ccgactttca acgcc9ac99 cacggccacc t9ggacatg9 cC99ctcata cacctacaac 420 atcccgacct gcattcccga cg9cgactat ctgctccgca tccagtcgct ggccatccac 480 aacccctg9c c9gc99gcat cccgcagttc tacatctcct gcgcccagat caccgtgacc 540 99cg9cg9ca aC99caaccc t99cccgacg gccctcatcc cc99cgcctt caaggacacc 600 gacccgggct acacggtgaa catctacacg aacttccaca actacacggt tcccggcccg 660 gaggtcttca gctgcaacg9 c9gc9gctcg aacccgcccc cgccggtgag tagcagcacg 720 cccgcgacca cgacgct99t cacgtcgacg cgcaccacgt cctccacgtc ctccgcctcg 780
\
acgccggcct cgaccggc99 ctgcaccgtc gccaagtggg gccagtgc99 cg9caacggg 840
tacaccggct gcacgacctg cgcggccggg tccacctgca gcaagcagaa cg8ctactac 900
tCgC8gtgCt tgtaagggag gccgcaaagc atgaggtgtt tgaag8ggag gaga99ggtc 960
<210> 10
<211> 608
<212> PRT 15 <213> Thielavia lerrestris
<400> 10
Met Lys Gly Leu Phe Ser Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ala Val Gly Gln l 5 la 15
Ala Ser Ala His Tyr Ile Phe Gln Glo Leu Ser Ile Asn Gly Aso Gln
20 25 30
Phe Pro Val Tyr Gln Tyr Ile AIg Lys Aso Thr Asn Tyr Aso Ser Pro 35 40 45
Val Thr Asp Leu Thr Ser Asp ASp Leu Arg Cys Aso val Gly Ala Gln 50 55 60
Gly Ala Gly Thr ASp Thr Val Thr Val Lys Ala Gly Asp Glo Phe Thr 65 70 75 80
Phe Thr Leu Asp Thr Pro Val Tyr His Glo Gly Pro Ile Ser Ile Tyr
85 .0 '5
Met Ser Lys Ala Pro Gly Ala Ala Ser Asp Tyr Asp Gly Ser Gly Gly 100 105 110
Trp Phe Lys Ile Lys Asp Trp Gly Pro Thr Phe Aso Ala Asp Gly Thr 115 120 125
Ala Thr Trp Asp Met Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Asn Ile Pro Thr Cys 130 135 140
Ile Pro Asp Gly ASp Tyr Leu Leu Arg Ile Gln Ser Leu Ala lle His 145 150 155 160
Aso Pro Trp Pro Ala Gly Ile Pro Gln Phe Tyr Ile Ser Cys Ala Gln 165 170 175
Ile Thr Val Thr Gly Gly Gly Asn Gly Asn Pro Gly Pro Thr Ala Leu 180 185 190
Ile Pro Gly Ala Phe Lys ASp Thr Asp Pro Gly Tyr Thr Val Asn lle 195 200 205
Tyr Thr Asn Phe His Asn Tyr Thr Val Pro Gly Pro Glu Val Phe Ser 210 215 220
Cys Asn Gly Gly Gly Ser Asn Pro Pro Pro Pro Val Ser Ser Ser Thr 225 230 235 240
Pro Ala Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser 'I'hr Arg Thr Thr Ser Ser Thr 245 2:50 255
Ser Ser Ala Ser Thr Pro Ala Ser Thr Cay Gly Cys Thr Val Ala Lys 260 265 270
Trp Gly Gln Cys Gly Gly Asn Gly Tyr '!'hr Gly Cys Thr Thr Cys Ala 275 280 285
Ala Gly Ser Thr Cys Ser Lys GIn Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 290 295 300
Met Lys Gly Leu Phe Ser Ala Ala Ala l,eu Ser Leu Ala val Gly Gln 305 310 315 320
Ala Ser Ala His Tyr Ile Phe Gln Gln l,eu Ser Ile Asn Gly Asn Gln 325 330 335
Phe Pro Val Tyr Gln Tyr Ile Arg Lys Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Pro 340 345 350
Val Thr Asp Leu Thr Ser ASp ASp Leu Arg Cys Asn Val Gly Ala Gln 355 360 365
Gly Ala Gly Thr Asp Thr Val Thr Val l,ys Ala Gly Asp Gln Phe Thr 370 375 380
Phe Thr Leu Asp Thr Pro Val Tyr His Ciln Gly Pro Ile Ser Ile Tyr 385 390 395 400
Met Ser Lys Ala Pro Gly Ala Ala Ser P,sp Tyr Asp Gly Ser Gly Gly 405 4,10 415
Trp Phe Lys He Lys Asp Trp Gly Pro 1'hr Phe Asn Ala Asp Gly Thr 420 425 430
Ala Thr Trp Asp Met Ala Gly Ser Tyr 1'hr Tyr Asn Ile Pro Thr Cys 435 440 445
Ile Pro Asp Gly Asp Tyr Leu Leu Arg Ile Gln Ser Leu Ala Ile His 450 455 460
Asn Pro Trp Pro Ala Gly Ile Pro Gln Phe Tyr Ile Ser Cys Ala GIn 465 470 475 480
Ile Thr Val Thr Cly Cly Cly Asn Cly Asn 485 490
Pro Gly Pro Thr Ala Leu 495
Ile Pro Gly Ala Phe Lys ASp Thr Asp 500 505
Pro Gly Tyr Thr val Asn 510 Ile
Tyr Thr Asn 515
Phe His Asn Tyr Thr Val Pro Gly Pro Glu Val Phe Ser 520 525
Cys Asn Cly Cly Cly Ser Asn Pro Pro Pro 530 535
Pro Val Ser Ser Ser Thr 540
Pro 545
Ala Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Thr Arg Thr Thr Ser Ser Thr 55 0 555 560
Ser Ser Ala
Ser Thr Pro Ala Ser Thr Gly Gly Cys 565 570 Thr Val Ala Lys 575
Trp Cly Oln Cys Gly Gly Asn Gly Tyr Thr Gly Cys 580 585
Thr Thr Cys Ala 590
Ala Gly Ser Thr Cys Ser Lys Gln Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu 595 600 605
5
<210> 11 <2 11 > 17 <212> PRT <213> Thielavia terrestris
10
<220> <221> MISCfEATURE <222> (1) .. (1) <223> Xaa= lIe o Leu
15
<220> <221> MISCfEATURE <222> (16) .. (16) <223> Xaa= lIe o Leu
<400> 11
Xaa 1
Pro Ala Ser Asn 5 Ser Pro Val Thr Asn Val 10 Ala Ser Asp Asp 15 Xaa
20
Arg
25
<210> 12 <2 11 >13 <212> PRT <213> Thielavia terrestris
30
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> Xaa= lIe o Leu
78
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5).. (5)
<223> Xaa= l1e o leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11 )..(12)
<223> Xaa= lIe o Leu
<400> 12
Xaa Pro Glu Asp Xaa Glu Pro Gly Asp Tyr Xaa Xaa Arg 1 5 10
15 <210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<400> 13
Cys Pro Gly Ser Phe Ser Ser Cys Asp Gly Ser Gly Ala Gly Trp Phe 1 5 10 15
Lys
<210> 14 25 <211>12
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<220>
<221> MISC]EATURE
<222> (1) .. (1)
<223> Xaa= l1e o leu
<400> 14
35 xaa ASp Glu Ala Gly Phe H,s Gly ASp Gly val Lys 1 5 10
<210> 15 <2 11 >10
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<220>
<221> MISC_FEATURE 45 <222> (1) .. (2)
<223> Xaa= cualquier amino�cido
<220>
<221> MISC]EATURE
<222> (8) .. (9)
<223> Xaa= l1e o Leu
<400> 15
Xaa Xaa Ala Pro Gly Asn Tyr Xaa Xaa Arg 55 1 5 10
<210> 16 <2 11 >22
<212> ADN <213> Aspergillus nidulans
<400> 16 gtgccccatg atacgcctcc gg
22
<210> 17 <211 > 26 <212> ADN <213> Aspergillus nidulans
<400> 17 gagtcgtatt tccaaggctc ctgacc
26
<210> 18 <211 > 24 <212> ADN <213> Aspergillus nidulans
<400> 18 ggaggccatg aagtggacca acgg
24
<210> 19 <211 > 45 <212> ADN <213> Aspergillus niger
<400> 19 caccgtgaaa gccatgctct ttccttcgtg tagaagacca gacag
45
<210> 20 <211 > 45 <212> ADN <213> Aspergillus niger
<400> 20 ctggtcttct acacgaagga aagagcatgg ctttcacggt gtctg
45
<210> 21 <211 > 44 <212> ADN <213> Aspergillus niger
<400> 21 ctatatacac aactggattt accatgggcc gatc de cgcggccgca
44
<210> 22 <211 > 44 <212> ADN <213> Aspergillus niger
<400> 22 gatctgcggc cgcgggccca tggtaaatcc agttgtgtat atag
44
<2 10> 23 <211 >17 <212> PRT <213> Thielavia lerreslris
<220> <221> MISC]EATURE <222> (1) .. (1) <223> Xaa= lIe o Leu
<220> <221> MISC]EATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa= lIe o Leu
<400> 23
Xaa Pro Ala Ser Asn Ser Pro val Thr Asn val Ala Ser Asp Asp Xaa 1 S 10 15
Arg
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<220>
<221> MISC]EATURE
<222> (1) .. (1)
<223> Xaa= l1a o Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5) .. (5)
<223> Xaa= lIe o leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11 )..(12)
<223> Xaa= l1a o Leu
<400> 24
Xaa Pro Glu Asp Xaa Glu Pro Gly Asp Tyr Xaa Xaa Arg 1 5 10
<210> 25 <211 >28
<212> ADN
<213> Thielavia terrestris
<220>
<221> MISC]EATURE
<222> (20) .. (20)
<223> N =A, e, G,oT
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26) .. (26)
<223> N = A, e, G, aT
<400> 25 cctccaactc ccccgtcacn aaigtngc 28
<210> 26 <211 >27
<212> ADN
<213> Thielavia terrestris
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19) .. (19)
<223> N=A,C,G, o T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22)
<223> N=A, e, G, o T
<400> 26
5 ggcgcggagg aggtartcnc cnggitc 27
<210> 27
<2 11 >16
<212> PRT
<2 13> Thielavia terrestris
<400> 27
Ser Gly Ala Gly Trp Phe Lys Ile As p Glu Ala Gly Phe His Gly Asp 1 S 10 15 15
<210> 28
<2 11 >8
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6) .. (7)
<223> Xaa= l1e o leu
<400> 28
Ala Pro Gly Asn Tyr Xaa Xaa Arg
1 5
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<400> 29
Ala Pro Gly Asn Tyr Leu Ile Arg H1s Gl u ~eu
15M
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
45 <400> 30
Ala Pro Gly Asn Tyr Leu Val Arg His Glu Leu
1 5 10
<210> 31 <2 11 >9
<212> PRT
<213> Thielavia terrestris
<400> 31
55 Gly Ala Gly Trp Phe Lys Ile Asp Glu 1 5
<210> 32
<211> 27 <212> ADN
<213> Thielavia terrestris
<220>
<221> MISC]EATURE
<222> (19) .. (19)
<223> R= A o G
<220>
<221> MISC]EATURE
<222> (22) .. (22)
<223> H= A, C, o T
<220>
<221> MISC]EATURE
<222> (25) .. (25)
<223>Y=CoT
<400> 32 eggegeggge tggntaara tgaiga 27
<210> 33
<211> 32
<212> ADN
<213> Thielavia lerreslris
<220>
<221> misc_feature
<222> (21) .. (21)
<223> R= A o G
<220>
<221> misc_feature
<222> (24) .. (24)
<223> N= A, C, G, o T
<220>
<221> misc_feature
<222> (27) .. (27)
<223> N= A, C, G, o T
<220>
<221> misc_feature
<222> (30) .. (30)
<223> N= A, C, G, o T
<400> 33 agncatgge gaateagata rttnccnggn ge 32
<210> 34
<211> 25
<212> ADN
<213> Thielavia terrestris
<400> 34 enggtaccg ageteggate caeta 25
<210> 35
<211> 25
<212> ADN
<213> Thielavia terrestris
<400> 35 atagggcgaa ttgggeccte tagat 25
<210> 36
<211 > 32 <212> AON <213> Th ielavia lerreslris
<400> 36 acaaetggat ttaccatgcg gttcgacgcc te
32
<210> 37 <211 > 33 <212> AON <213> Th ielavia terrestris
<400> 37 gtcagteaee tetagttact aaaactcgaa gcc
33
<210> 38 <211 >21 <212> AON <213> Th ielavia terrestris
<400> 38 eatgecatgg atgettetca e
21
<210> 39 <211 > 25 <212> AON <213> Thielavia terrestris
<400> 39 eettaattaa tca99cg9t9 aa9tc
25
<210> 40 <211 > 32 <212> AON <213> Th ielavia lerreslris
<400> 40 eaaetttgta de tcgtcgggga caaaaaagtt gg
32
<210> 41 <211 >27 <212> AON <213> Th ielavia terrestris
<400> 41 eeccl9ttga aacal9tttt ttcaaec
27
<210> 42 <211 > 16 <212> AON <213> Th ielavia lerreslris
<400> 42 gtaaaacgac ggccag
16
<210> 43 <211> 25 <212> AON <213> Escherichia coli
<220> <221> misc_feature <222> (24) .. (27) <223> V= A, e , o G
<220>
84
<221> misc_fealure
<222> (25) .. (25)
<223> N=A, e, G, o T
<400> 43 t1t1t1l11ll11t1t1l11lttvn 25
<210> 44
<211> 27
<212> AON
<213> Escherichia coli
<400> 44 ggggacaact IIgtacaaaa aagtlgg 27
<210> 45 <211 >27
<212> AON
<213> Escherichia coli
<400> 45 aaagglagga Igglcclcgl acaccll 27
<210> 46
<211> 36
<212> AON
<213> Thielavia lerreslris
<400> 46 aclggatlac aacggtgcca de calgctcgca tcgtct ???36
<210> 47
<211> 38
<212> AON
<213> Thielavia lerreslris
<400> 47 tcacctctag ltaatlaatc agcagctgaa gacggccg 38
<210> 48 <211 >31
<212> AON
<213> Thielavia terrestris
<400> 48 actggallla ccalgaagle gtlcaecatl 9 31
<210> 49 <211 >31
<212> AON
<213> Thielavia lerreslris
<400> 49 agteacclct agtlagagge aelgegagla 9 31
<210> 50
<211> 32
<212> AON
<213> Thielavia terrestris
<400> 50 acaaetggat t1accatgcg gltcgacgec te 32
<210> 51
<211> 33
<212> AON
<213> Th ielavia lerreslris
5
<400> 51 glcaglcacc Ictagllacl aaaaclcgaa gcc <210> 52 <211> 27 <212> AD N <213> Th ielavia lerreslris 33
<400> 52 aclggattac calgcllclc acalcag
27
15
<210> 53 <211> 30 <212> ADN <213> Th ielavia lerreslris
<400> 53 aglcacclct agllalcagg cgglgaaglc
30
25
<210> 54 <211>31 <212> AD N <213> Th ielavia lerreslris
<400> 54 actggattac catgaaggga cllttcagtg e
31
<210> SS <211>31 <212> ADN <213> Th ielavia terrestris
35
<400> SS agtcacclct agllagaggc aclgcgagla 9 31
<210> 56 <211> 29 <212> AD N <213> Trichoderrna reesei
45
<400> 56 aacgltaatt aaggaatcgt Ittglglll <210> 57 <211> 29 <212> AD N <213> Trichoderma reesei 29
<400> 57 agtactagta gctccgtggc gaaagcctg
29
55
<210> 58 <2 11> 26 <212> ADN <213> Trichoderma reesei
<400> 58 actagtcgac cgaatgtagg attgtt
26
65
<210> 59 <211> 19 <212> AD N <213> Trichoderrna reesei
<400> 59 tgaccatggt gcgcagtcc
19
<210> 60 <211 > 26 <212> AO N <213> Trichoderma reesei
<400> 60 cgatcgtctc cctatgggtc attacc
26
<210> 61 <211 > 28 <212> AO N <213> Trichoderma reesei
<400> 61 actagttaat laagctccgt ggcgaaag
28
<210> 62 <211 > 24 <212> AON <213> Escherichia coli
<400> 62 gggttcgaat tcatttaaac ggct
24
<210> 63 <211 > 24 <212> AO N <213> Escherichia coli
<400> 63 gggagcgctc aatattcatc tete
24
<210> 64 <211 > 26 <212> AON <213> Escherichia coli
<400> 64 ggtcgcggag gcgatggatg cgatcg
26
<210> 65 <211 > 26 <212> AO N <213> Escherichia coli
<400> 65 cgatcgcatc catcgcctcc gcgacc
26
<210> 66 <211 > 34 <212> AO N <2 13> Th ielavia terrestris
<400> 66 cgcggactgc gcaccalgaa glcgttcacc attg
34
<210> 67 <211 >31 <212> AON <213> Th ielavia lerreslris
<400> 67 tcgccacgga gcttagaggc actgcgagta 9
31
5
<210> 68 <211 > 23 <212> ADN <213> Th ielavia terrestris
<400> 68 gcccatggac catgctcgca aac
23
<210> 69 <211 > 23 <212> ADN <213> Thielavia terrestris
15
<400> 69 cctctagtta attaatcagc agc 23
<210> 70 <211> 23 <212> ADN <213> Th ielavia terrestris
25
<400> 70 gcccatggac catgaaggga ctt <210> 71 <211> 23 <212> ADN <213> Th ielavia terrestris 23
<400> 71 attaattaca de cctctagtta agc
23
35
<210> 72 <211 > 19 <212> ADN <213> Trichoderrna reesei
<400> 72 ggatgaagct cattagccg
19
45
<210> 73 <211 >31 <212> ADN <213> Aspergillus fumigatus
<400> 73 actggattta ccatgagatt cggttggctc 9
31
<210> 74 <211 >31 <212> ADN <213> Aspergillus fumigatus
55
<400> 74 agtcacctct agttactagt agacacgggg e 31
<210> 75 <211 > 3060 <212> ADN <213> Aspergillus fumigatus
<400> 75
atgagattcg gttggctcga ggtggccgct ctgacggccg cttctgtagc caatgcccag 60 gtttgtgatg ctttcccgtc attgtttcgg atatagttga caatagtcat ggaaataatc 120 aggaattggc tttctctcca ccattctacc cttcgccttg ggctgatggc cagggagagt 180 gggcagatgc ccatcgacgc gccgtcgaga tcgtttctca gatgacactg gcggagaagg 240 ttaaccttac aacgggtact 999t9g9ttg cgactttttt gttgaca9t9 agctttcttc 300 actgaccatc tacacagatg 99aaatggac cgatgcgtcg gtcaaaccgg cagcgttccc 360 89gtaagctt gcaattctgc aacaacgtgc aagtgtagtt gctaaaacgc 99tS9tgca9 420 act~ggtatc aactggggtc tttgtggcca ggattcccct ttgggtatcc gtttctgtga 480 gctatacccg cggagtcttt cagtccttgt attatgtgct gatgattgtc tctgtatagc 540 tgacctcaac tccgccttcc ctgctggtac taatgtcgcc gcgacatggg acaagacact 600 cgcctacctt cgtggcaagg ccatgggtga ggaattcaac gacaagggcg tggacatttt 660 gctggggcct gctgctggtc ctctcggcaa atacccggac ggcggcagaa tctgggaagg 720 cttctctcct gatccggttc tcactggtgt acttttcgcc gaaactatca agggtatcca '80
agacgcgggt gtgattgcta ctgccaagca ttacattctg aatgaacagg agcatttccg 840 acaggttggc gaggcccagg gatatggtta caacatcacg gagacgatca gctccaacgt 900 ggatgacaag accatgcacg agttgtacct ttggtgagta gttgacactg caaatgagga 960 ccttgattga tttgactgac ctggaatgca ggccctttgc agatgctgtg cgcggtaaga 1020 ttttccgtag acttgacctc gcgacgaaga aatcgctgac gaaccatcgt agctg9c9tt 1080 ggcgctgtca tgtgttccta caatcaaatc aacaacagct acggttgtca aaacagtcaa 1140 actctcaaca agctcctcaa ggctgagctg ggcttccaag gcttcgtcat gagtgactgg 1200
agcgctcacc acagcggtgt cggcgctgcc ctcgctgggt tggatatgtc gatgcctgga 1260 gacatttcct tcgacgacgg actctccttc tggggcacga acctaactgt cagtgttctt 1320
aacggcaccg ttccagcctg gcgtgtcgat gacatggctg ttcgtatcat gaccgcgtac 1380 tacaaggttg gtcgtgaccg tcttcgtatt ccccctaact tcagctcctg gacccgggat 1440 gagtacggct gggagcattc tgctgtc:tcc gagggagcc:t ggaccaa99t gaacgac:ttc: 1500 gtcaatgtgc agcgcagtc:a c:tc:tcagatc atc:c:gtgaga ttggtgCc:gc tagtacagtg 1560 c:tcttgaaga acacgggtgc tcttcctttg ac:cggcaagg aggttaaagt gggtgttctc 1620 ggtgaagacg ctggttccaa cccgtggggt gctaacggct gccccgaccg cg9ctgtgat 1680 aacggcactc ttgctatggc ctggggtagt ggtactgcca acttccctta ccttgtcacc 1740 cccgagcagg ctatccagcg agaggtcatc agcaacggcg gcaatgtctt tgctgtgact 1800 gataacgggg ctctcagcca gatggcagat gttgcatctc aatccaggtg agtgcgggct 1860 cttagaaaaa gaacgttctc tgaatgaagt tttttaacca ttgcgaacag cgtgtctttg 1920 gtgtttgtca acgccgactc tggagagggt ttcatcagtg tcgacggcaa cgagggtgac 1980 cgcaaaaatc tcactctgtg gaagaacggc gaggccgtca ttgacactgt tgtcagccac 2040 tgcaacaaca cgattgtggt tattcacagt gttgggcccg tcttgatcga ccggtggtat 2100 gataacccca acgtcactgc catcatctgg gccggcttgc ccggtcagga gagtggcaac 2160 tccctggtcg acgtgctcta tggccgcgtc aaccccagcg Ccaagacccc gttcacctgg 2220 ggcaagactc gggagtctta C9999Ctccc ttgctcaccg agcctaacaa tggcaatggt 2290 gctccccagg atgatttcaa cgagggcgtc ttcattgact accgtcactt tgacaagcgc 2340 aatgagaccc ccatttatga gtttggccat 99cttgagct acaccacctt tggttactct 2400 caccttcggg ttcaggccct caatagttcg agttcggcat atgtcccgac tagcggagag 2460 accaagcctg cgccaaccta tggtgagatc ggtagtgccg ccgactacct gtatcccgag 2520 ggtctcaaaa gaattaccaa gtttatttac ccttggctca actcgaccga cctcgaggat 2580 tcttctgacg acccgaacta cggctgggag gactcggagt acattcccga aggcgctagg 2640 gatgggtctc ctcaacccct cctgaa99ct 9gc9gcgctc ct9gtggtaa ccctaccctt 2700 tatcaggatc ttgttagggt gtcggccacc ataaccaaca ctggtaacgt cgccggttat 2760 gaagtccctc aattggtgag tgacccgcat gttccttgcg ttgcaatttg gctaactcgc 2820 ttctagtatg tttcactgg9 cggaccgaac gagcctcg99 tcgttctgcg caagttcgac: 2880 cgaatcttcc tggctcctgg 9gagcaaaag gtttggacca cgactcttaa ccgtcgtgat 2940 ctcgccaatt gggatgtg9a 99ctcaggac tgggtcatca caaagtaccc caagaaagtg 3000 cacgtcggca gctcctcgcg taagctgcct ctgagagcgc ctctgccccg tgtctactag 3060
<210> 76
<211 > 863
<212> PRT
<213> Aspergillus fumigatus
<400> 76
Met Arg Phe Gly Trp Leu Glu Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ser Val 1 5 10 15
Ala Asn Ala Gln Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro 20 25 30
Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Asp Ala His Arg Arg Ala Val
35 40 45
Glu Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr 50 SS 60
Gly Thr Gly Trp Glu Met Asp Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser Val 65 70 75 80
Pro Arg Leu Gly Ile Asn Trp Gly Leu Cys Gly Gln ASp Ser Pro Leu 85 90 95
Gly Ile Arg Phe Ser Asp Leu Asn Ser Al a Phe Pro Ala Gly Thr Asn 100 105 110
Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala 115 120 125
Met Gly Glu Glu Phe As n Asp Lys Gly Val Asp Ile Leu Leu Gly Pro 130 135 140
Ala Ala Gly Pro Leu Gly Lys Tyr Pro Asp Gly Gly Arg Ile Trp Glu 145 150 155 160
Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr 165 170 175
Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr 180 185 190
Ile Leu Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln val Gly Glu Ala Gln Gly 195 200 205
Tyr Gly Tyr Asn Ile Thr Glu Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys
210 215 220
Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala val Arg Ala 225 230 235 240
Gly Val Gly Ala val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr 245 250 255
Gly Cys Gln Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu 260 265 270
Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ser Ala His Hi s Ser Gly 275 280 285
Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu ASp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile 290 295 300
Ser Phe ASp Asp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser 305 310 315 320
Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Ala Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val 325 330 335
Arg Ile Met Thr Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Arg Ile 340 345 350
Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Trp Glu His 355 360 365
Ser Ala Val Ser Gl u Gly Al a Trp Thr Lys Val Asn Asp Ph e Val Asn 370 375 380
Val Gln Arg Ser His Ser Gln Ile IIe Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser 385 390 395 400
Thr val Leu Leu Lys Asn Thr Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu 405 410 415
Val Lys Val Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly 420 425 430
Ala Asn Gly Cys Pro Asp Arg Gly Cys ASp Asn Gly Thr Leu Ala Met 435 440 445
Ala Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu
450 455 460
Gln Ala Ile Gln Arg Glu Val Ile Ser Asn Gly Gly Asn Val Phe Ala 465 470 475 480
Val Thr ASp Asn Gly Ala Leu Ser eln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln 485 490 495
Ser Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Phe 500 505 510
�le Ser val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp 515 520 525
Lys Asn Gly Glu Ala Val Ile ASp Thr Val Val Ser His Cys Asn Asn 530 535 540
Thr Ile Val Val Ile His Ser val Gly Pro Val Leu Ile ASp Arg Trp 545 550 555 560
Tyr Asp Asn Pro Asn Val Thr Ala Ile !le Trp Ala Gly Leu Pro Gly 565 570 575
Gln Glu Ser Gly Asn Ser Leu Val Asp val Leu Tyr Gly Arg Val Asn 580 585 590
Pro Ser Ala Lys Thr Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr 595 600 605
Gly Ala Pro Leu Leu Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln 610 615 620
Asp ASp
Phe Asn Glu Gly Val Phe Ile ASp Tyr Arg His Phe ASp Lys
625
630 635 640
Arg Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu
Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr
645
650 655
Thr Phe Gly Tyr Ser His Leu Arg
Val Gln Ala Leu Aso Ser Ser Ser
660
665 670
Ser Ala Tyr val Pro Thr Ser Gly Glu Thr Lys Pro Ala Pro Thr Tyr 675 680 685
Gly Glu Ile Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Lys
690 695 700
Arg Ile Thr Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Glu 705 710 715 720
Asp Ser Ser ASp Asp Pro Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Glu Tyr Ile 725 730 735
Pro Glu Gly Ala Arg ASp Gly Ser Pro Gln Pro Leu Leu Lys Ala Gly 740 745 750
Gly Ala Pro Gly Gly Asn Pro Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Val Arg Val 755 760 765
Ser Ala Thr Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Tyr Glu Val Pro 770 775 780
Gln Leu Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Arg Val Val Leu
785 790 795 800
Arg Lys Phe Asp Arg Ile Phe Leu Ala Pro Gly Glu Gln Lys Val Trp 805 810 815
Thr Thr Thr Leu Asn Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Glu Ala 820 825 830
Gln Asp Trp Val Ile Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser 835 840 845
Ser Ser Arg Lys Leu Pro Leu Arg Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr
850 855 860
5 <210> 77
<211> 30
<212> AON
<213> Aspergillus fumigatus
10 <400> 77 99act9cgca ccalgagatt cggttggctc 30
<210> 78
<21 1> 30
<212> AON 5 <213> Aspergillus fumigatus
<400> 78 tcgccacgga gcttactagt agacacgggg 30
10 -33

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Polip�ptido aislado con actividad de mejora cetulot�tica, y con una secuencia de amino�cidos que tiene al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de la forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferiblemente al menos 97% de identidad con los amino�cidos 20 a 258 de la SEC ID nO: 6.
  2. 2.
    Polip�ptido según la reivindicación 1, que est� codificado por el polinucle�tido contenido en el pl�smido pTter61D que est� contenido en E. col; NRRL 8-30812.
  3. 3.
    Polinucle�tido aislado comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polip�ptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 02.
  4. 4.
    Construcci�n de ácidos nucleicos comprendiendo el polinucle�tido según la reivindicación 3 unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polip�ptido en un huésped de expresión.
  5. 5.
    Vector de expresión recombinante comprendiendo la conslrucci�n de ácidos nucleicos según la reivindicación 4.
  6. 6.
    C�lula huésped recombinante comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 4.
  7. 7.
    M�todo para la producción del polip�ptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, comprendiendo (a) cultivo de una célula huésped comprendiendo una construcción de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucle�lidos que codifica el polip�ptido bajo condiciones propicias para la producción del polip�ptido; y (b) recuperación del polip�ptido.
  8. 8.
    Composici�n de detergente que comprende el polip�plido con aclividad de mejora celulolilica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, una actividad celulolitica y un tensioactivo.
  9. 9.
    M�todo para degradación o conversión de un material celulósico, comprendiendo: tratamiento del material celulósico con una cantidad eficaz de una proteína celulolitica en presencia de una cantidad eficaz del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la presencia del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica aumenta la degradaci6n del material celul6sico en comparación con la ausencia del polip�ptido con actividad de mejora celulolitica.
  10. 10.
    M�todo según la reivindicación 9, donde una o más enzimas celulolilicas se seleccionan del grupo que consiste en una celulasa, endoglucanasa, celobiohidrolasa y bela-glucosidasa.
  11. 11.
    M�todo para producir una sustancia orgánica, que comprende:
    (a)
    sacarificar un material celulósico con una cantidad efectiva de una proteína celulol�lica en presencia de una canlidad efectiva del polip�ptido con actividad de mejora celulol�tica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la presencia del polip�ptico con actividad de mejora celulol�tica aumenta la degradación del material celulósico en comparación con la ausencia del polip�ptido con actividad de mejora celulolitica;
    (b)
    fermentar el material celulósico sacarificado del paso (a) con uno o más microorganismos de fermentación; y
    (c)
    recuperar la sustancia orgánica de la fermentación
  12. 12.
    M�todo según la reivindicación 11, donde el material celulósico son restos de maíz.
  13. 13.
    M�todo según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde una o más enzimas celulol�ticas son seleccionadas del grupo que consiste en celulasa, endoglucanasa, celobiohidrolasa y beta-glucosidasa.
  14. 14.
    M�todo según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde la sustancia orgánica es un alcohol, ácido orgánico, cetona , amino�cido o gas.
  15. 15.
    M�todo según la reivindicación 14, donde el alcohol es arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanediol, sorbitol o xililol.
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