ES2533352T3

ES2533352T3 - Proteínas de fijación al antígeno receptor A de la IL-17

Info

Publication number: ES2533352T3
Application number: ES07867194.8T
Authority: ES
Inventors: Joel Tocker; Jacques J. Peschon; David Fitzpatrick; James F. Smothers; Christopher Mehlin; Ai Ching Lim
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2015-04-09
Anticipated expiration: 2027-10-01
Also published as: LT3165539T; NO2020036I1; HUS1800005I1; WO2008054603A3; DK2487188T3; PL2076541T3; MY187263A; AU2010219370A1; US20080221307A1; PT3165539T; AU2007314519C1; IL197636B; EP2518085A1; US20100292442A1; EA200900514A1; LT2487188T; JP5013383B2; AU2007314519B2; US20110166331A1; AR063090A1

Abstract

Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID n.º 224, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID n.º 225, una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID n.º 226, una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada que comprende la SEQ ID n.º 146, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID n.º 147 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID n.º 148, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se fija al receptor A de la IL-17 humana.

Description

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Las proteínas de fijación a antígeno de la invención incluyen regiones armazón y las CDR. Una proteína de fijación a antígeno de la invención puede tener seis CDR (como típicamente hacen los anticuerpos naturales), por ejemplo, una CDR1 de cadena pesada («H-CDR1»), una CDR2 de cadena pesada («H-CDR2»), una CDR3 de cadena pesada («H-CDR3»), una CDR1 de cadena ligera («L-CDR1»), una CDR2 de cadena ligera («L-CDR2») y una

5 CDR3 de cadena ligera («L-CDR3»).

La terminología «natural» y «que se produce de forma natural», tal y como se utiliza a lo largo de esta especificación en relación con los materiales biológicos, tales como péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza. En los anticuerpos que se producen de forma natural, una H-CDR1 suele comprender de aproximadamente cinco (5) a aproximadamente siete (7) aminoácidos, 10 una H-CDR2 suele comprender de aproximadamente dieciséis (16) a aproximadamente diecinueve (19) aminoácidos, y una H-CDR3 suele comprender de aproximadamente tres (3) a aproximadamente veinticinco (25) aminoácidos. Una L-CDR1 suele comprender de aproximadamente diez (10) a aproximadamente diecisiete (17) aminoácidos, una L-CDR2 suele comprender aproximadamente siete (7) aminoácidos y una L-CDR3 suele comprender de aproximadamente siete (7) a aproximadamente diez (10) aminoácidos. Las CDR específicas de los

15 diferentes anticuerpos de la invención se dan a conocer en la tabla 1 y en la Lista de secuencias.

TABLA 1: Secuencia polinucleotídica correspondiente

Secuencia aminoacídica de CDR1 de Vh de AMH14: SEQ ID n.º 146 imagen6 SEQ ID n.º 305

Secuencia aminoacídica de CDR2 de Vh de AMH14: SEQ ID n.º 147 imagen7 SEQ ID n.º 306

Secuencia aminoacídica de CDR3 de Vh de AMH14: SEQ ID n.º 148 imagen8 SEQ UD n.º 307

Secuencia aminoacídica de CDR1 de Vl de AML14: SEQ ID n.º 224 imagen9 SEQ ID n.º 384

Secuencia aminoacídica de CDR2 de Vl de AML14: SEQ ID n.º 225 imagen10 SEQ ID n.º 385

Secuencia aminoacídica de CDR3 de Vl de AML14: SEQ ID n.º 226 imagen11 SEQ ID n.º 386

La estructura general y las propiedades de las CDR dentro de los anticuerpos naturales están descritas en la técnica. Brevemente, en un armazón de anticuerpo tradicional, las CDR están insertadas dentro de una secuencia flanqueante en la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, donde forman las regiones en buena 20 parte responsables de la fijación al antígeno y su reconocimiento. Una región variable comprende al menos tres CDR de cadena pesada o ligera, véase más arriba (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service NIH, Bethesda, MD; véase también Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de una región flanqueante (regiones flanqueantes denominadas de 1 a 4, FR1, FR2, FR3 y FR4, por Kabat et al, 1991, más arriba; véase también Chothia y Lesk, 1987, más arriba).

25 Véase más adelante. Sin embargo, las CDR dadas a conocer por la presente invención no sólo se pueden utilizar para definir el dominio de fijación al antígeno de una estructura de anticuerpo tradicional, sino que también se puede insertar en otros armazones estructurales diferentes, como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos de la invención pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. La región constante de la cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo κ o λ, p. ej., una

30 región constante de cadena ligera de tipo κ o λ humana. La región constante de la cadena pesada puede ser, por ejemplo, regiones constantes de la cadena pesada de tipo α, δ, ε, γ o μ, p. ej., una región constante de la cadena pesada de tipo α, δ, ε, γ o μ humana. La región constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante o muteína de una región constante natural.

La invención da a conocer una proteína de fijación a antígeno que se fija específicamente al IL-17RA, en donde

35 dicha proteína de fijación a antígeno comprende una CDR1, CDR2, CDR3 de cadena ligera y una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, CDR1 (SEQ ID n.º 224), CDR2 (SEQ ID n.º 225), CDR3 (SEQ ID n.º 226) de cadena ligera y CDR1 (SEQ ID n.º 146), CDR2 (SEQ ID n.º 147), CDR3 (SEQ ID n.º 148) de cadena pesada del anticuerpo AM-14; y fragmentos del mismo.

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Las CDR también incluyen secuencias de consenso procedentes de grupos de anticuerpos monoclonales relacionados. Los anticuerpos puede estar relacionados tanto por la homología de la secuencia como por la función, como se muestra en los ejemplos. Tal y como se describe en la presente memoria, una «secuencia de consenso» se refiere a secuencias aminoacídicas que tienen aminoácidos conservados comunes entre una serie de secuencias y

5 aminoácidos variables que varían dentro de determinadas secuencias aminoacídicas. Las secuencias de consenso de CDR incluyen las CDR que corresponden a cada una de H-CDR1, H-CDR2. H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3.

Las secuencias de consenso se determinaron con análisis filogenéticos estándares a partir de las CDR que corresponden a la VH (a saber, pesada variable, etc.) y VL de los anticuerpos anti-IL-17RA. Se emplearon dos

10 estrategias diferentes. En una primera estrategia, las secuencias de consenso se determinaron manteniendo las CDR contiguas dentro de la misma secuencia que corresponde a una VH o VL. En una segunda estrategia, las secuencias de consenso se determinaron por alineamiento de los diferentes tipos de CDR, a saber, las secuencias de H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 de las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA descritas en la presente memoria de forma independiente.

15 En la primera estrategia, brevemente, las secuencias de aminoácidos que corresponden a los dominios variables enteros de VH o de VL se convirtieron al formato FASTA para facilitar el procesamiento de los alineamientos comparativos e inferir filogenias. A continuación, las regiones flanqueantes de estas secuencias se reemplazaron imagen12con una secuencia conectora artificial ( , SEQ ID n.º 448) para poder realizar el examen de las CDR solas sin introducir ninguna ponderación de la posición del aminoácido debido a acontecimientos coincidentes

20 (p. ej., tales como anticuerpos sin relacionar que comparten por casualidad una herencia común de secuencias flanqueantes en las células reproductoras), mientras que sigue manteniendo las CDR contiguas dentro de la misma secuencia que corresponde a VH o VL. Luego, las secuencias de VH o VL de este formato se sometieron a una interrogación por alineamiento de similitud de secuencias con un programa que emplea un algoritmo de tipo ClutalW estándar (véase, Thompson et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). Se emplearon una penalización por

25 creación de huecos de 8,0 junto con una penalización por extensión de huecos de 2,0. De igual modo, este programa generó filogramas (ilustraciones de árboles filogenéticos) basándose en los alineamientos de similitud de secuencias con el método UPGMA (procedimiento de grupos de emparejamientos sin ponderar basado en medias aritméticas) o bien el Neighbor-Joining (véase Saitou y Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4: 406-425) para construir e ilustrar la similitud y la distinción de grupos de secuencias a través de la comparación y el agrupamiento

30 de la longitud de las ramas. Ambos procedimientos produjeron resultados similares, pero finalmente se utilizaron los árboles procedentes de UPGMA porque el procedimiento emplea un conjunto de suposiciones más simples y más conservativas. Los árboles elaborados con UPGMA se muestran en la figura 1, donde grupos de secuencias similares se definieron por tener menos de 15 sustituciones cada 100 restos (véase la leyenda de las ilustraciones del árbol para conocer la escala) entre secuencias individuales dentro del grupo y se utilizaron para definir las

35 colecciones de secuencias de consenso. Los alineamientos originales de las secuencias que se generaron se emplearon para examinar empíricamente y documentar la aparición de aminoácidos tolerados en cada posición con un grupo de consenso y se muestran en las figuras 2 y 3. Después se prepararon las secuencias de consenso para los grupos de secuencias similares dentro de cada CDR. Los aminoácidos que variaban dentro de cada grupo se anotaron con la notación Xn dentro de cada secuencia de consenso.

40 Las secuencias de consenso de H-CDR1 incluyen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a) X1YGIS (SEQ ID n.º 453), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en R, S y G; b) X1YX2MX3 (SEQ ID n.º 454), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en D y S; X2 se selecciona del grupo que consiste en Y y S; y X3 se selecciona del grupo que consiste en S y N; y c) SYGMX1 (SEQ ID n.º 455), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en H y Q;

(SEQ ID n.º 456), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en A y T; X2 se selecciona del grupo que consiste en N, S y K; X3 se selecciona del grupo que consiste en N y K; X4 se selecciona del grupo que consiste en K y N; y Ximagen135 se selecciona del grupo que consiste en L y F; b)

(SEQ ID n.º 457), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en Y, I y F; X2

50 se selecciona del grupo que consiste en I y S; X3 se selecciona del grupo que consiste en S y A; X4 se selecciona del grupo que consiste en S y R; y X5 se selecciona del grupo que consiste en G, S y ningún aminoácido; X6 se selecciona del grupo que consiste en T e I; y Ximagen147 se selecciona del grupo que consiste en Y y H; y c)

(SEQ ID n.º 458), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en S y N; X2 se selecciona del grupo que consiste en N y K; y X3 se selecciona del grupo que consiste en H e Y.

55 Las secuencias de consenso de H-CDR3 incluyen la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste imagen15

en: a) (SEQ ID n.º 459), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en R y K; Ximagen162 se selecciona

del grupo que consiste en Y, V y A; y X3 se selecciona del grupo que consiste en F y L; y b)

(SEQ ID n.º 460), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en R y K, y X2 se selecciona del grupo que consiste en Y y V.

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La secuencia de consenso de L-CDR1 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste

(SEQ ID n.º 461), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en G, S y A; X2 se selecciona del grupo que consiste en R y S; X3 se selecciona del grupo que consiste en S, I y N; X4 se selecciona del

grupo que consiste en W e Y; y X5 se selecciona del grupo que consiste en A y N; b) 5 n.º 462), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en V e I; X2 se selecciona del grupo que consiste en I y S; X3 se selecciona del grupo que consiste en S y T; Ximagen194 se selecciona del grupo que consiste en N y S; y X5 se

selecciona del grupo que consiste en A y N; y c)

(SEQ ID n.º 463), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en Y y S; X2 se selecciona del grupo que consiste en S y R; y X3 se selecciona del grupo que consiste en A y V.

10 La secuencia de consenso de L-CDR2 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste imagen20 imagen21

en: a) (SEQ ID n.º 464), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en L y F; b) imagen22

(SEQ ID n.º 465), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en S y T; c) , en donde X1 se

selecciona del grupo que consiste en G y D; Ximagen232 se selecciona del grupo que consiste en A y T; y X3 se selecciona del

grupo que consiste en T y A; y d)

(SEQ ID n.º 466), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste 15 en A, T y N.

Las secuencias de consenso de L-CDR3 incluyen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste (SEQ ID n.º 467), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en K y N; X2 se en P y N; y X3 se selecciona del grupo que consiste en L, F y P; b)

(SEQ ID n.º 468), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en Q y K; X2 se selecciona 20 del grupo que consiste en A, S e Y; X3 se selecciona del grupo que consiste en N, Y y S; X4 se selecciona del grupo que consiste en N, S y R; X5 se selecciona del grupo que consiste en F, T, Y y A; y X6 se selecciona del grupo que

(SEQ ID n.º 469), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en N, T e

(SEQ ID n.º 470), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en H y Q; X2 se selecciona del grupo que consiste en I, Y, N y K; X3 se selecciona del grupo que consiste en N y S; X4 se selecciona 25 del grupo que consiste en P y R; X5 se selecciona del grupo que consiste en K, ningún aminoácido y T; y X6 se

selecciona del grupo que consiste en W y ningún aminoácido.

En las figuras 1, 2, 3, 16A, 16B, 19 y 22 se muestra que existe un patrón claro en los datos entre la homología de secuencias en los dominios de CDR y la función de los anticuerpos, como se determina mediante el encestado de los que compiten entre sí y la determinación de adónde se fijan los anticuerpos al IL-17RA. Así pues, se ha

30 establecido una relación entre la estructura y la función para las clases de anticuerpos para los anticuerpos contra el IL-17RA descritos en la presente memoria.

En una segunda estrategia, se determinaron las secuencias de consenso de CDR para cada CDR por separado, independientemente de su contexto contiguo dentro de la misma secuencia que corresponde a una VH o VL. En esta estrategia, las secuencias de consenso se determinaron con el alineamiento de cada H-CDR1, H-CDR2, H35 CDR3, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 en grupos, a saber, con el alineamiento de las secuencias de H-CDR1 individuales de las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA descritas en la presente memoria para determinar una secuencia de consenso de H-CDR1, con el alineamiento de las secuencias de H-CDR2 individuales de las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA descritas en la presente memoria para determinar una secuencia de consenso de H-CDR2, con el alineamiento de las secuencias de H-CDR3 individuales de las proteínas de fijación al antígeno IL40 17RA descritas en la presente memoria para determinar una secuencia de consenso de H-CDR3, con el alineamiento de las secuencias de L-CDR1 individuales de las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA descritas en la presente memoria para determinar una secuencia de consenso de L-CDR1, con el alineamiento de las secuencias de L-CDR2 individuales de las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA descritas en la presente memoria para determinar una secuencia de consenso de L-CDR2, y con el alineamiento de las secuencias de L-CDR3 individuales

45 de las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA descritas en la presente memoria para determinar una secuencia de consenso de L-CDR3. Se identificaron las similitudes entre secuencias dentro de cada secuencia de CDR individual. Luego se prepararon las secuencias de consenso para los grupos de secuencias similares dentro de cada CDR. Los aminoácidos que variaban dentro de cada grupo se anotaron con la notación Xn dentro de cada secuencia de consenso.

50 La invención da a conocer una proteína de fijación a antígeno que se fija específicamente al IL-17RA, en donde dicha proteína de fijación a antígeno comprende al menos tres regiones H-CDR de SEQ ID n.ºs 146, 147, 148 y al menos tres regiones L-CDR de SEQ ID n.ºs 224, 225, 226.

Tal y como se observa en la presente memoria, las proteínas de fijación a antígeno de la presente invención comprenden un armazón estructural en el cual se pueden injertar la CDR o las CDR de la invención. El género de 55 las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA comprende los subgéneros de los anticuerpos, como se definen de muchas maneras en la presente memoria. Los aspectos incluyen realizaciones en donde el armazón estructural es una estructura de anticuerpo tetramérica tradicional. Así pues, las combinaciones de proteínas que se fijan a

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biespecíficos (solicitud de patente internacional WO/1993/011161) y (ix) «dianticuerpos» o «trianticuerpos», fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión génica (Tomlinson et al., 2000, Methods Enzymol. 326: 461-479; solicitud de patente internacional WO 94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 64444-6448). Los fragmentos de anticuerpo se pueden modificar. Por ejemplo, las moléculas se pueden

5 estabilizar mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14: 1239-1245). Los aspectos de la invención incluyen realizaciones en donde los componentes de estos fragmentos que no son las CDR son secuencias humanas.

En una realización, la proteína de fijación al antígeno IL-17RA es un anticuerpo completamente humano. En esta realización, como se describió más arriba, las estructuras específicas comprenden las cadenas ligera y pesada

10 completas descritas que comprenden las regiones CDR. Otras realizaciones utilizan una o varias de las CDR de la invención, con las otras CDR, regiones flanqueantes, regiones J y D, regiones constantes, etc., que vienen de otros anticuerpos humanos. Por ejemplo, las CDR de la invención pueden reemplazar las CDR de cualquier número de anticuerpos humanos, en particular los anticuerpos comercialmente relevantes.

Los anticuerpos de cadena única se pueden formar con la unión de los fragmentos del dominio variable de las

15 cadenas ligera y pesada (región Fv) a través de un aminoácido de puente (conector peptídico corto), lo que da lugar a una sola cadena polipeptídica. Se han preparado Fv de cadena única (scFv) mediante la fusión del ADN que codifica un conector peptídico entre los ADN que codifican los dos polipéptidos del dominio variable (VL y VH). Los polipéptidos resultantes se pueden replegar sobre sí mismos para formar monómeros de fijación a antígeno o pueden formar multímeros (p. ej., dímeros, trímeros o tetrámeros), según la longitud de un conector flexible entre los

20 dos dominios variables (Kortt et al., Prot. Eng. 10: 423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 95-108). Al combinar diferentes polipéptidos que comprenden VL y VH, se pueden formar scFv multiméricos que se fijan a diferentes epítopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena única incluyen las descritas en la patente de los EE. UU. n.º 4.946.778; Bird, 1988, Science

242: 423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879; Ward et al., 1989, Nature, 334: 544, de Graaf et

25 al., 2002, Methods Mol. Biol. 178: 379-87. Quedan abarcados por la presente invención los anticuerpos de cadena única procedentes de los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria (que incluyen, pero sin limitarse a ellos, los scFv que comprenden combinaciones de los dominios variables de AML14/AMH14 (SEQ ID n.º 40/SEQ ID n.º 14).

En una realización, la proteína de fijación al antígeno IL-17RA es una proteína de fusión del anticuerpo (a veces

30 denominada en la presente memoria un «conjugado de anticuerpo»). El compañero del conjugado puede ser proteínico o no proteínico; este último se suele generar con grupos funcionales sobre la proteína de fijación a antígeno (véase la discusión sobre modificaciones covalentes de las proteínas de fijación a antígeno) y sobre el compañero del conjugado. Por ejemplo, se conocen conectores en la técnica; por ejemplo, se conocen bien los conectores homo-o heterobifuncionales (véase el catálogo de 1994 de Pierce Chemical Company sobre la sección

35 técnica de los interconectores, páginas 155-200).

En una realización, la proteína de fijación al antígeno IL-17RA es un análogo de anticuerpo, a veces denominada «anticuerpo sintético». Por ejemplo, muchos trabajos recientes utilizan armazones proteicos alternativos o bien armazones artificiales con CDR injertadas. Tales armazones incluyen, pero sin limitarse a ellas, mutaciones introducidas para estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de fijación, así como armazones totalmente

40 sintéticos que consisten, por ejemplo, en polímeros biocompatibles. Véase, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, volumen 53, número 1: 121-129, Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654. Además, se pueden utilizar los imitadores de anticuerpos peptídicos («IAP»), así como el trabajo basado en los imitadores de anticuerpos que utilizan componentes de fibronección a modo de armazón.

Tal y como se conoce en la técnica, se pueden utilizar muchos programas diferentes para identificar el grado de 45 identidad o similitud de secuencia que una proteína o ácido nucleico tiene con una secuencia conocida.

Con «proteína», tal y como se utiliza en la presente memoria, se hace referencia a al menos dos aminoácidos unidos covalentemente, lo que incluye proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. En algunas realizaciones, los dos o más aminoácidos unidos covalentemente están unidos mediante un enlace peptídico. La proteína puede estar formada por aminoácidos naturales y enlaces peptídicos, por ejemplo, cuando la proteína se hace con técnicas 50 recombinantes con sistemas de expresión y células hospedadoras, como se describe más adelante. Otra alternativa es que la proteína puede incluir aminoácidos sintéticos (p. ej., homofenilalanina, citrulina, ornitina y norleucina) o estructuras peptidomiméticas, a saber, «análogos de proteínas o peptídicos», tales como peptoides (véase, Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 9367), que pueden ser resistentes a proteasas u otras condiciones fisiológicas y/o de conservación. Tales aminoácidos sintéticos se pueden incorporar, en particular, cuando la

55 proteína de fijación a antígeno se sintetiza in vitro mediante procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. Además, se puede utilizar cualquier combinación de restos/estructuras peptidomiméticos, sintéticos y naturales. «Aminoácido» también incluye restos de iminoácidos tales como prolina e hidroxiprolina. El «grupo R» o la «cadena lateral» del aminoácido puede estar en la configuración L o en la S. En una realización específica, los aminoácidos están en la configuración L o S.

60 En algunos aspectos, la invención da a conocer proteínas de fijación a antígeno recombinantes que se fijan a un IL

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17RA, en algunas realizaciones un IL-17RA humano recombinante o porción del mismo. En este contexto, una «proteína recombinante» es una proteína fabricada con técnicas recombinantes que utilizan cualquier tecnología y procedimiento conocidos en la técnica, a saber, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe en la presente memoria. Los procedimientos y las técnicas para la producción de proteínas recombinantes

5 se conocen bien en la técnica. Las realizaciones de la invención incluyen proteínas de fijación a antígeno recombinantes que se fijan al IL-17RA genéticamente intacto y a variantes del mismo.

«Consiste esencialmente en» significa que la secuencia aminoacídica puede variar aproximadamente un 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15% respecto a la secuencia SEQ ID n.º citada antes y que aún conserva actividad biológica, como se describe en la presente memoria.

10 En algunas realizaciones, las proteínas de fijación a antígeno de la invención son proteínas aisladas o proteínas sustancialmente puras. Una proteína «aislada» no está acompañada de al menos parte del material con el cual suele estar asociada en su estado natural, por ejemplo, que constituye al menos aproximadamente el 5%, o al menos aproximadamente el 50% en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir del 5 al 99,9% en peso del contenido de proteína total según las circunstancias. Por ejemplo,

15 la proteína se puede fabricar en una concentración significativamente más alta mediante el uso de un promotor inducible o de un promotor para alta expresión, para que la proteína se fabrique a una concentración cada vez mayor. La definición incluye la producción de una proteína de fijación a antígeno en una amplia variedad de organismos y/o células hospedadoras que se conocen en la técnica.

Para las secuencias aminoacídicas, la identidad y/o similitud de secuencia se determina con los métodos estándares

20 conocidos en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, el algoritmo de identidad local de secuencias de Smith y Waterman, 1981, Avd. Appl. Math. 2: 482, el algoritmo de alineamiento por identidad de secuencias de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, la búsqueda por el procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 2444, implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas informáticos del Genetics Computer Group, de la

25 Universidad de Wisconsin, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa para secuencias BestFit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res. 12: 387-395, preferiblemente con los ajustes por defecto, o mediante inspección. Preferiblemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante FastDB basándose en los siguientes parámetros: penalización de 1 por discordancia; penalización de 1 por huecos; penalización de 0,33 por el tamaño del hueco; y penalización de 30 por agrupamiento, «Current Methods in Sequence Comparision and Analysis»,

30 Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, págs. 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento múltiple de secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas con alineamientos progresivos de dos en dos. También puede representar un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una

35 simplificación del procedimiento de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35: 351-360; el procedimiento es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Los parámetros de PILEUP útiles incluyen una ponderación por huecos por defecto de 3,00, una ponderación por la longitud de los huecos por defecto de 0,10 y huecos terminales ponderados.

Otro ejemplo de algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410;

40 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; y Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 58735787. Un programa de BLAST particularmente útil es el programa informático WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se corresponden a los valores por defecto. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0,125, umbral de palabra (T) = II. Los

45 parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y los fija el propio programa según la composición de la secuencia concreta y la composición de la base de datos concreta contra la cual se busca la secuencia de interés; sin embargo, los valores se pueden ajustar para incrementar la sensibilidad.

Otro algoritmo útil es BLAST con huecos, como se describe en Altschul et al., 1993, Nucl. Acids. Res. 25: 3389-3402. El BLAST con huecos utiliza puntuaciones de sustituciones BLOSUM-62; el parámetro del umbral T se fija en 9; el

50 procedimiento de dos coincidencias para empezar a extender sin huecos carga un coste de 10 + k a la longitud del hueco k; Xu se fija en 16, y Xg se fija en 40 para la etapa de búsqueda en la base de datos, y en 67 para la etapa de salida de los algoritmos. Los alineamientos con huecos están favorecidos por una puntuación que corresponde a aproximadamente 22 bits.

Por lo general, la homología, similitud o identidad de los aminoácidos entre cada una de las CDR variantes son al

55 menos del 80% con las secuencias descritas en la presente memoria, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% y casi del 100%. De manera similar, «porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico» respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de fijación identificadas en la presente memoria se define como el porcentaje de restos nucleotídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos nucleotídicos de la

60 secuencia codificante de la proteína de fijación a antígeno. Un procedimiento específico utilizada el módulo BLASTN

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de WU-BLAST-2 ajustado a los parámetros por defecto, con un intervalo de solapamiento y fracción de solapamiento fijados en 1 y 0,125, respectivamente.

Por lo general, la homología, similitud o identidad de secuencias de ácido nucleico entre las secuencias nucleotídicas que codifican cada una de las CDR variantes y las secuencias nucleotídicas descritas en la presente

5 memoria son al menos del 80% y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% y casi el 100%.

Así pues una «CDR variante» es una con la homología, similitud o identidad especificada con la CDR madre de la invención, y con la que comparte la función biológica, que incluye, pero sin limitarse a ellas, al menos el 80%, 81%,

10 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la especificidad y/o actividad de la CDR madre.

Aunque el sitio o región para introducir una variación de la secuencia aminoacídica está predeterminada, la mutación propiamente dicha no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se puede llevar a cabo la mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y luego cribar

15 en busca de la combinación óptima de la actividad deseada las variantes de las CDR de la proteína de fijación a antígeno expresadas. Se conocen bien las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida, por ejemplo, la mutagénesis con cebadores en M13 y la mutagénesis por PCR. El cribado de los mutantes se realiza con ensayos de las actividades de la proteína de fijación a antígeno, tal como la fijación al IL-17RA.

20 Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de restos únicos; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente uno (1) a aproximadamente veinte (20) restos de aminoácidos, aunque se pueden tolerar inserciones considerablemente más grandes. Las deleciones oscilan de aproximadamente uno (1) a aproximadamente veinte (20) restos de aminoácidos, aunque en algunos casos las deleciones pueden ser mucho más grandes.

25 Se pueden utilizar sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para llegar a un derivado o variante final. Por lo general, estos cambios se hacen en unos pocos aminoácidos para disminuir al mínimo la alteración de la molécula, en particular la capacidad inmunógena y la especificidad de la proteína de fijación a antígeno. Sin embargo, se pueden tolerar cambios más grandes en algunas circunstancias. Las sustituciones conservativas se hacen por lo general de acuerdo con el siguiente cuadro descrito como tabla 2.

30 TABLA 2

Resto original: Sustituciones de ejemplo

Ala: Ser

Arg: Lys

Asn: Gln, His

Asp: Glu

Cys: Ser

Gln: Asn

Glu: Asp

Gly: Pro

His: Asn, Gln

Ile: Leu, Val

Leu: Ile, Val

Lys: Arg, Gln, Glu

Met: Leu, Ile

Phe: Met, Leu, Tyr

Ser: Thr

Thr: Ser

Trp: Tyr

Tyr: Trp, Phe

Val: Ile, Leu

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Los cambios considerables en el funcionamiento o en la identidad inmunológica se realizan mediante la selección de sustituciones que son menos conservativas que las mostradas en la tabla 2. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones que afectan más significativamente: la estructura del esqueleto del polipéptido en la zona de la alteración, por ejemplo, la estructura α-helicoidal o de lámina β; la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana;

5 o la mayor parte de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera en general que produzcan los mayores cambios en las propiedades del polipéptido son aquéllas en las que (a) un resto hidrófilo, p. ej., serilo o treonilo, se sustituye por (o con) un resto hidrófobo, p. ej., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o con) cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisilo, arginilo o histidilo, se sustituye por (o con) un resto electronegativo, p. ej., glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, se sustituye por (o con) una que no tiene cadena lateral, p. ej., glicina.

Las variantes muestran típicamente la misma actividad biológica cualitativa y desencadenarán la misma respuesta inmunitaria que el análogo natural, aunque también se seleccionan variantes que modifican las características de las proteínas de fijación a antígeno cuando sea necesario. Otra posibilidad es que la variante se puede diseñar de tal

15 forma que se altera la actividad biológica de la proteína de fijación a antígeno. Por ejemplo, los sitios de glucosilación se pueden alterar o retirar como se explica en la presente memoria. Tal modificación de las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA, incluidos los anticuerpos, es un ejemplo de un derivado. Un «derivado» de un polipéptido es un polipéptido (p. ej., un anticuerpo) que se ha modificado químicamente, p. ej., por conjugación, con otro resto químico tal como, por ejemplo, polietilenglicol, albúmina (p. ej., seroalbúmina humana), fosforilación y glucosilación.

Otros derivados de anticuerpos contra IL-17RA incluyen conjugados covalentes o agregativos de los anticuerpos contra IL-17RA, o fragmentos de los mismos, con otras proteínas o polipéptidos, tal como mediante la expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados al extremo amino o al extremo carboxilo de un polipéptido de anticuerpo contra IL-17RA. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un 25 polipéptido señal (o líder) heterólogo, p. ej., el líder del factor α de la levadura, o un péptido tal como una etiqueta de epítopo. Las proteínas de fusión que contienen el anticuerpo contra IL-17RA pueden comprender la adición de péptidos para facilitar la purificación o la identificación del anticuerpo contra el IL-17RA (p. ej., poli-His). Un imagen30

polipéptido de anticuerpo contra IL-17RA también se puede unir al péptido FLAG

(SEQ ID n.º 447) como se describe en Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988 y en la patente de los EE. UU. n.º 5.011.912. El péptido FLAG es muy antigénico y proporciona un epítopo al que se puede unir reversiblemente un anticuerpo monoclonal (Acm) específico, lo que permite un ensayo rápido y facilita la purificación de la proteína recombinante expresada. En el mercado (Sigma, St. Louis, MO) se pueden adquirir los reactivos útiles para preparar proteínas de fusión en las que el péptido FLAG está fusionado a un polipéptido dado.

Los oligómeros que contienen uno más polipéptidos de anticuerpo contra el IL-17RA se pueden emplear como

35 antagonistas del IL-17RA. Los oligómeros pueden estar en forma de dímeros, trímeros u oligómeros más grandes unidos covalentemente o unidos no covalentemente. Se contempla el uso de los oligómeros que comprenden dos o más polipéptidos de anticuerpo contra el IL-17RA, en donde un ejemplo sería un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

Una realización se dirige a los oligómeros que comprenden varios polipéptidos del anticuerpo contra el IL-17RA unidos a través de interacciones covalentes o no covalentes entre los restos peptídicos fusionados con los polipéptidos del anticuerpo contra el IL-17RA. Tales péptidos pueden ser conectores peptídicos (espaciadores) o péptidos que tienen la propiedad de favorecer la oligomerización. Las cremalleras de leucinas y algunos polipéptidos procedentes de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que favorecen la oligomerización de los polipéptidos de anticuerpo contra IL-17RA a los que van unidos, como se describe con más detalle a continuación.

45 En determinadas realizaciones, los oligómeros comprenden de dos a cuatro polipéptidos de anticuerpo contra el IL17RA. La porción del anticuerpo contra IL-17RA del oligómero puede ser cualquiera de las formas descritas más arriba, p. ej., variantes o fragmentos. Preferiblemente, los oligómeros comprenden polipéptidos de anticuerpo contra el IL-17RA que tienen actividad de fijación al IL-17RA.

En una realización, se prepara un oligómero con los polipéptidos procedentes de las inmunoglobulinas. Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden determinados polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos procedentes de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc), p. ej., por Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535; Bym et al., 1990, Nature, 344: 677; y Hollenbaugh et al., 1992 «Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins» en Current Protocols in Immunology, supl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11.

Una realización de la presente invención se dirige a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas

55 mediante la fusión de un fragmento de fijación al IL-17RA de un anticuerpo contra el IL-17RA con la región Fc de un anticuerpo. El dímero se puede fabricar mediante, por ejemplo, la inserción de una fusión génica que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión adecuado, la expresión de la fusión génica en las células hospedadoras transformadas con el vector de expresión recombinante, y que permite que la proteína de fusión expresada se ensamble de una forma muy parecida a las moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman puentes disulfuro intercatenarios entre las porciones Fc para producir el dímero.

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La terminología «polipéptido Fc», tal y como se utiliza en la presente memoria, incluye formas nativas y de muteína de los polipéptidos procedentes de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que favorece la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden restos Fc (y los oligómeros que se derivan de ellos) ofrecen la ventaja de que se purifican con facilidad mediante

5 cromatografía de afinidad en columnas con proteína A o proteína G.

Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la publicación de PCT WO 93/10151, es un polipéptido de cadena única que se extiende desde la región de la bisagra del extremo amino hasta el extremo carboxilo nativo de la región Fc de un anticuerpo de IgG humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína Fc descrita en la patente de los EE. UU. n.º

5.457.035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. La secuencia aminoacídica de esta muteína es idéntica

10 a la de la secuencia de la Fc nativa presentada en la solicitud patente internacional WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha cambiado de Leu a Glu y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína muestra menos afinidad por los receptores de Fc.

En otras realizaciones, la porción variable de las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo contra IL-17RA se puede sustituir por la porción variable de una cadena pesada y/o ligera del anticuerpo.

15 Otra posibilidad es que el oligómero sea una proteína de fusión que comprende varios polipéptidos de anticuerpo contra IL-17RA, con o sin conectores peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los conectores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las patentes de los EE. UU. 4.751.180 y 4.935.233.

Otro procedimiento para preparar derivados oligoméricos del anticuerpo contra el IL-17RA implica el uso de una cremallera de leucinas. Los dominios de cremallera de leucinas son péptidos que favorecen la oligomerización de las 20 proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucinas se identificaron originalmente en varias proteínas de fijación a ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240: 1759) y desde entonces se han encontrado en muchas proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucinas conocidas se encuentran péptidos naturales y los derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cremallera de leucinas adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la solicitud de PCT WO 94/10308, y la cremallera de 25 leucinas procedente de la proteína D del tensioactivo de pulmón (SPD, por su nombre en inglés) descrito en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344: 191, incorporado aquí por referencia. El uso de una cremallera de leucinas modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a ésta se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. En una estrategia, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de anticuerpo contra el IL-17RA fusionado a un péptido con cremallera de leucinas se

30 expresan en células hospedadoras adecuadas y se recuperan del sobrenadante del cultivo los fragmentos o derivados oligoméricos y solubles de anticuerpo contra el IL-17RA que se formen.

Las modificaciones covalentes también se consideran derivados de las proteínas de fijación al antígeno IL-17RA y están incluidas dentro del alcance de esta invención, y se hacen por lo general, pero no siempre, de forma postraduccional. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes de la proteína de fijación a antígeno se

35 introducen en la molécula al hacer reaccionar determinados restos aminoacídicos específicos de la proteína de fijación a antígeno con un agente orgánico de modificación que es capaz de reaccionar con determinadas cadenas laterales o los restos del extremo amino o carboxilo.

Los restos cisteinilo se hacen reaccionar con mucha frecuencia con α-haloacetatos (y las correspondientes aminas), tales como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para dar derivados carboximetilados o carboxiamidometilados.

40 Los restos cisteinilo también se modifican al hacerlos reaccionar con bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(5imidozoíl)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metilo y 2piridilo, p-cloromercuriobenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los restos de histidilo se modifican al hacerlos reaccionar con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7-0 porque este agente es relativamente específico de la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de para-bromofenacilo; la

45 reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio a 0,1 M a pH 6,0.

Los restos lisinilo y del extremo amino se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La modificación con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los restos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para la modificación restos con α-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y

50 reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.

Los restos de arginilo se modifican al hacerlos reaccionar con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La modificación de los restos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de la lisina, así como con el grupo ε-amino de la arginina.

55 Se pueden modificar específicamente los restos de tirosilo, con particular interés en la introducción de las etiquetas espectrales en los restos tirosilo al hacerlos reaccionar con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Lo más habitual es que el N-acetilimidizol y el tetranitrometano se utilicen para formar especies de tirosilo O

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acetilado y derivados 3-nitro, respectivamente. Los restos de tirosilo se yoduran con o 131I para preparar

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proteínas marcadas para el uso en radioinmunoensayos, en donde resulta adecuado el procedimiento de cloroamina T descrito más arriba.

Los grupos laterales con carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente al hacerlos reaccionar con carbodiimidas (R'—N=C=N—R'), en donde R y R' son opcionalmente grupos alquilo diferentes, tales como 1

5 ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los restos aspartilo y glutamilo se convierten en los restos asparraginilo y glutaminilo al hacerlos reaccionar con iones de amonio.

La modificación con agentes bifuncionales es útil para entrecruzar proteínas de fijación a antígeno con una matriz o superficie de apoyo insoluble en agua para usarlas en una serie de procedimientos. Los agentes de 10 entrecruzamiento que se usan habitualmente incluyen, p. ej., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes para modificación tales como metil-3-[(pazidofenil)ditio]propioimidato producen intermedios fotoactivables que son capaces de formar entrecruzamientos en

15 presencia de luz. Otra posibilidad es que para la inmovilización de proteínas se empleen las matrices reactivas insolubles en agua tales como glúcidos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactantes descritos en las patente de los EE. UU. n.ºs 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 y 4.330.440.

Los restos de glutaminilo y asparraginilo se desamidan con frecuencia en los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente. Otra alternativa es que estos restos se desamiden en condiciones levemente ácidas.

20 Cualquiera de las formas de estos restos se encuentra dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos α-amino de la cadena lateral de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, págs. 79-86), la acetilación de la amina del extremo amino y la amidación de cualquier grupo carboxilo del extremo carboxilo.

25 Otro tipo de modificación covalente de la proteína de fijación a antígeno incluida dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glucosilación de la proteína. Tal y como se sabe en la técnica, los patrones de glucosilación pueden depender de la secuencia de la proteína (p. ej., la presencia o ausencia de restos aminoacídicos concretos para glucosilación, que se explican más adelante) así como del organismo o célula hospedador en la que se sintetiza la proteína. Más adelante se explican una serie de sistemas de expresión.

30 La glucosilación de los polipéptidos está típicamente unida a un N o unida a un O. Unida a un N se refiere a la formación de un enlace entre el resto glucídico y a la cadena lateral de un resto de asparragina. Las secuencias tripeptídicas asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido salvo prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto glucídico a la cadena lateral de asparragina. Así pues, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de

35 glucosilación. La glucosilación unida a un O se refiere a la formación de un enlace entre uno de los azúcares Nacetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, más corrientemente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de los sitios de glucosilación a la proteína de fijación a antígeno se lleva a cabo convenientemente por alteración de la secuencia de aminoácidos, de tal forma que contiene una o más de las secuencias tripeptídicas 40 descritas más arriba (para los sitios de glucosilación unidos a un N). La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o la sustitución con, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia original (para los sitios de glucosilación unidos a un O). Por comodidad, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fijación a antígeno se altera preferiblemente a través de cambios a nivel del ADN, en particular al mutar el ADN que codifica el polipéptido deseado en las bases preseleccionadas, de tal forma que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos

45 deseados.

Otro medio para incrementar el número de restos de glúcidos sobre la proteína de fijación a antígeno es mediante el acoplamiento químico o enzimático de los glucósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos por no necesitar que se produzca la proteína en una célula hospedadora que es capaz de glucosilar un N y un O para unirles un polisacárido. Según el modo de acoplamiento utilizado, se pueden unir uno o varios azúcares a (a)

50 arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como los de las cisteínas, (d) grupos hidroxilo libres, tal como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo de amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en la solicitud de patente internacional WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306.

55 La retirada de los restos de glúcidos presentes en la proteína de fijación a antígeno original se puede llevar a cabo química o enzimáticamente. La desglucosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da lugar a la escisión de la mayoría, o de todos, los azúcares, salvo el azúcar conector (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que el

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polipéptido permanece intacto. La desglucosilación química está descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys, 259: 52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. La escisión enzimática de los restos de glúcidos sobre los polipéptidos se puede conseguir mediante el uso de una serie de endo-y exoglucosidasas como describen Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350. La glucosilación en los posibles sitios de glucosilación se puede

5 impedir mediante el uso del compuesto tunicamicina, como se describe en Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces entre la proteína y el glucósido en un N.

Otro tipo de modificación covalente de la proteína de fijación a antígeno comprende conectar la proteína de fijación a antígeno a diferentes polímeros de naturaleza no proteica, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, diversos polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera presentada en las patentes de los

10 EE.UU. n.ºs 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, como se sabe en la técnica, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en diferentes posiciones dentro de la proteína de fijación a antígeno para facilitar la adición de polímeros, tales como PEG.

En algunas realizaciones, la modificación covalente de las proteínas de fijación a antígeno de la invención

comprende la adición de uno o varias marcaciones.

15 La terminología «grupo marcador» significa cualquier marcación detectable. Ejemplos de grupos marcadores adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., 3H, 14C, 15N, 35S,90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos lantánidos), grupos enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., secuencias de

20 parejas de cremalleras de leucinas, sitios de fijación para anticuerpos secundarios, dominios de fijación a metales, etiquetas de epítopos). En algunas realizaciones, el grupo marcador se acopla a la proteína de fijación a antígeno a través de brazos espaciadores de diferente longitud para reducir el posible impedimento estérico. En la técnica se conocen una serie de procedimientos para marcar proteínas y se pueden utilizar para poner en práctica la presente invención.

25 En general, las marcaciones se clasifican en una serie de clases, según el ensayo en el que se tienen que detectar: a) marcaciones isotópicas, que puede ser isótopos radioactivos o pesados; b) marcaciones magnéticas (p. ej., partículas magnéticas); c) restos activos de oxidorreducción; d) colorantes ópticos; grupos enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopos polipeptídicos predeterminados que reconoce un indicador secundario (p. ej., secuencias de parejas de cremalleras

30 de leucinas, sitios de fijación para anticuerpos secundarios, dominios que se fijan a metales, etiquetas de epítopos, etc). En algunas realizaciones, el grupo marcador se acopla a la proteína de fijación a antígeno a través de brazos espaciadores de diferente longitud para reducir el posible impedimento estérico. En la técnica se conocen una serie de procedimientos para marcar proteínas y se pueden utilizar para poner en práctica la presente invención.

Las marcaciones específicas incluyen colorantes ópticos, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, cromóforos,

35 fósforos y fluoróforos, de los que los últimos son específicos en muchos casos. Los fluoróforos pueden ser bien flúor en «moléculas pequeñas» o flúor en proteínas.

Con «marcación fluorescente» se quiere decir cualquier molécula que se puede detectar gracias a sus propiedades fluorescentes inherentes. Las marcaciones fluorescentes adecuadas incluyen, pero sin limitarse a ellas, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metilcoumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno,

40 amarillo Lucifer, Cascade BlueJ, rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, verde Oregon, los colorantes de Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), azul Cascade, amarillo Cascade y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina y rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5,5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Los colorantes ópticos adecuados, entre ellos los

45 fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.

Las marcaciones fluorescentes adecuadas de naturaleza proteica también incluyen, pero sin limitarse a ellas, proteína fluorescente verde, que incluye una GFP de especies de Renilla, Ptilosarcus o Aequorea (Chalfie et al., 1994, Science, 263: 802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., número de acceso de GenBank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., 1801 del Blvd Maisonneuve, West, 8º piso, Montreal,

50 Quebec, Canadá H3H IJ9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417), β-galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2603-2607) y Renilla (solicitudes de patente internacional WO 92/15673, WO 95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, patentes de los EE. UU. n.os 5.292.658, 5.418.155, 5.683.888, 5.741.668, 5.777.079, 5.804.387, 5.874.304,

55 5.876.995, 5.925.558).

Polinucleótidos que codifican proteínas de fijación al antígeno IL-17RA

Dentro de la invención quedan englobados los ácidos nucleicos que codifican proteínas de fijación al antígeno IL

17RA, que incluyen anticuerpos, como se define en la presente memoria. La secuencia polinucleotídica de las

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Otra realización más incluye: una célula aislada, que comprende el vector de expresión de la invención.

La célula aislada se selecciona del grupo que consiste en: a, una célula procariota; b, una célula eucariota; c, una célula de mamífero; d, una célula de insecto; y e, una célula CHO. Otra realización más incluye: un procedimiento para fabricar un anticuerpo de la invención que se fija específicamente al receptor A de la IL-17, que comprende 5 incubar dicha célula aislada de la invención en las condiciones que le permiten expresar dicho anticuerpo. Dicho anticuerpo se puede seleccionar del grupo que consiste en: a, un anticuerpo humanizado; b, un anticuerpo quimérico; c, un anticuerpo recombinante; d, un anticuerpo de cadena única; e, un dianticuerpo; f, un trianticuerpo; g, un tetranticuerpo; h, un fragmento Fab; i, un fragmento F(ab')2; j, un anticuerpo de IgD; k, un anticuerpo de IgE; l, un anticuerpo de IgM; m, un anticuerpo de IgG1; n, un anticuerpo de IgG2; o, un anticuerpo de IgG3; y p, un anticuerpo

10 de IgG4.

Una realización de la invención incluye un polinucleótido que codifica dicho anticuerpo de la invención y en donde

dicho anticuerpo es:

a) un anticuerpo que consiste en una secuencia de cadena pesada de SEQ ID n.º 427 y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID n.º 429;

15 b) un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena pesada de SEQ ID n.º 427 y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID n.º 429;

c) un anticuerpo o un fragmento del mismo que se fija al receptor A de la IL-17 que comprende una secuencia de cadena pesada de SEQ ID n.º 427 y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID n.º 429;

d) un anticuerpo o un fragmento del mismo que se fija al receptor A de la IL-17 que comprende una

20 secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID n.º 40 y una secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID n.º 14;

e) un anticuerpo o un fragmento del mismo que se fija al receptor A de la IL-17 que comprende una CDR1 de cadena pesada de SEQ ID n.º 146, una CDR2 de cadena pesada de SEQ ID n.º 147, una CDR3 de cadena pesada de SEQ ID n.º 148, una CDR1 de cadena ligera de SEQ ID n.º 224, una CDR2 de cadena

25 ligera de SEQ ID n.º 225 y una CDR3 de cadena ligera de SEQ ID n.º 226, y

Otra realización más incluye el polinucleótido de la realización anterior, en donde dicho anticuerpo está codificado

por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

a) una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena pesada que consiste en la SEQ ID n.º 426 y una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera que consiste en la SEQ ID n.º 428;

30 b) una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena pesada que comprende la SEQ ID n.º 426 y una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera que comprende la SEQ ID n.º 428;

c) secuencia polinucleotídica que codifica una cadena pesada o un fragmento de la misma que se fija al receptor A de la IL-17 que comprende la SEQ ID n.º 426 y secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera o un fragmento de la misma que se fija al receptor A de la IL-17 que comprende la SEQ ID n.º

35 428;

d) secuencia polinucleotídica que codifica una región variable de cadena pesada o un fragmento de la misma que se fija al receptor A de IL-17 que comprende la SEQ ID n.º 67 y secuencia polinucleotídica que codifica una región variable de cadena ligera o un fragmento de la misma que se fija al receptor A de IL-17 que comprende la SEQ ID n.º 93;

40 e) de cadena ligera, un polinucleótido que codifica la CDR1 que comprende la SEQ ID n.º 384, un polinucleótido que codifica la CDR2 que comprende la SEQ ID n.º 385, un polinucleótido que codifica la CDR3 que codifica la SEQ ID n.º 386, y de cadena pesada, un polinucleótido que codifica la CDR1 que comprende la SEQ ID n.º 305, un polinucleótido que codifica la CDR2 que comprende la SEQ ID n.º 306, un polinucleótido que codifica la CDR3 que comprende la SEQ ID n.º 307; y

45 El plásmido de la invención puede incluir el polinucleótido de cualquier realización. La célula aislada de la invención incluye un vector de expresión que comprende el polinucleótido de cualquier realización. La célula puede ser una célula CHO. También se incluye en la invención un anticuerpo aislado, que comprende un anticuerpo producido por la célula CHO de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada codificada por una secuencia que comprende la SEQ ID n.º 426 y una cadena ligera codificada por una secuencia que

50 comprende la SEQ ID n.º 428.

Las secuencias de nucleótidos que corresponden a las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, para ser utilizadas como sondas o cebadores para el aislamiento de ácidos nucleicos o como secuencias problema para búsquedas en las bases de datos, se pueden obtener mediante la «retrotraducción» de las secuencias aminoacídicas, o mediante la identificación de regiones de identidad de aminoácidos con polipéptidos

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Tabla 3: Tipos de excipientes y sus funciones

Tipo: Función

Líquidos: Liofilizados

Agentes de: Proporciona isotonicidad a la formulación Los estabilizantes incluyen crio-y lioprotectores.

tonicidad /: para que sea adecuada para la inyección. Los ejemplos incluyen polioles, azúcares y

Estabilizantes: Los ejemplos incluyen polioles, sales y aminoácidos. Ayudan a mantener la proteína en un estado más compacto (polioles). Disminuyen al mínimo las interacciones electroestáticas entre proteínas en solución (sales). polímeros. Los crioprotectores protegen a las proteínas de las tensiones de la congelación. Los lioprotectores estabilizan las proteínas en el estado de liofilización.

Voluminadores: No aplicable Se usan para mejorar el acabado del producto y para impedir que exploten. Proporciona fuerza estructural a la torta de liofilización. Los ejemplos incluyen el manitol y la glicina.

Tensioactivos: Impiden/controlan la agregación, la formación de partículas y la absorción del fármaco a la superficie. Los ejemplos incluyen el polisorbato 20 y el 80. Se emplean si se produce el problema de agregación durante la liofilización. Pueden servir para reducir el tiempo de reconstitución. Los ejemplos incluyen el polisorbato 20 y el 80.

Antioxidantes: Controlan la oxidación de la proteína No se suelen emplear, las reacciones moleculares en la torta liofilizada se retrasan enormemente.

Iones metálicos: Se incluye un ion metálico específico en una Se pueden incluir si se incluye un ion metálico

/ Quelantes: formulación líquida sólo como cofactor. Los cationes divalentes, tales como el cinc y el magnesio, se utilizan en las formulaciones de suspensión. Se utilizan quelantes para inhibir las reacciones catalizadas por los iones de metales pesados. específico sólo como cofactor. Los quelantes no se suelen necesitar en las formulaciones liofilizadas.

Conservantes: Particularmente importantes para las formulaciones en multidosis. Protege contra el crecimiento microbiano. Ejemplo: alcohol bencílico. Solo para formulaciones en multidosis. Proporciona protección contra el crecimiento microbiano en la formulación. Normalmente se incluye en el diluyente de reconstitución (p. ej., bWFI).

Las sales se pueden utilizar de acuerdo con determinadas realizaciones de la invención para, por ejemplo, ajustar la fuerza iónica y/o la isotonicidad de una formulación autotamponada y/o para mejorar la solubilidad y/o la estabilidad 5 física de una proteína autotamponante u otro ingrediente de una composición de proteína autotamponante de acuerdo con la invención.

Como se sabe bien, los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas mediante su fijación a los restos cargados de la superficie de las proteínas y el apantallamiento de los grupos polares y cargados de la proteína, con lo que se reduce la fuerza de sus interacciones electroestáticas, atractivas y repulsivas. Los iones también pueden

10 estabilizar el estado desnaturalizado de una proteína mediante la fijación, en particular, a los enlaces peptídicos desnaturalizados (-CONH) de la proteína. Además, la interacción iónica con los grupos cargados y los polares en una proteína también puede reducir las interacciones electroestáticas intermoleculares y con ello impedir o reducir la agregación y la insolubilidad de las proteínas.

Las especies iónicas difieren significativamente respecto a su efecto sobre las proteínas. Se han desarrollado varias

15 clasificaciones de los iones y sus efectos sobre las proteínas que se pueden utilizar para formular composiciones de proteínas autotamponantes de acuerdo con la invención. Un ejemplo es la serie de Hofmeister, que ordena los solutos iónicos y no iónicos polares en función de su efecto sobre la estabilidad conformacional de las proteínas en la solución. Los solutos estabilizantes se denominan «cosmótropos». Los solutos desestabilizantes se denominan caótropos. Los cosmótropos se suelen utilizar a concentraciones elevadas (p. ej., sulfato de amonio a > 1 M) para

20 precipitar las proteínas de la solución («precipitación con sal»). Los caótropos se suelen utilizar para desnaturalizar y/o solubilizar las proteínas («solubilización por salinización»). La eficacia relativa de los iones para solubilizar o precipitar con sal define su posición en la serie de Hofmeister.

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que expresan el IL-17RA y el bioensayo con las HFF. Un ejemplo de la selección se muestra en las tablas 5, 6 y 7. Tabla 5

% de positivos
% de positivos: IFM Bioensayo con HFF

Control negativo: 1,09 1,57 10 Repetición Ensayos

IL-17 biotinilada (500 ng/ml): 8,85 10,22 77 1:4 dil. 1:32 1:4 1:32 1:128

% de inhibición de la producción de IL-6

Sobrenadante I.D

1: 1,34 1,78 9 56 14

2 (incl. AMH15/AML15): 0,60 3,77 6 80 72 98 91 81

3: 1,04 1,60 8 46 –5

4 (incl. AMH14/AML14): 1,72 0,79 10 90 82 99 92 84

5: 1,59 1,43 11 76 52

6: 1,45 1,93 14 82 79

7: 1,00 1,28 8 71 58

8: 1,43 1,60 14 69 31

9: 1,34 2,28 18 59 20

10: 0,79 1,96 11 58 –2

11: 1,93 1,69 11 72 21

12: 2,23 1,69 8 69 7

13 (incl. AMH21/AML21): 1,49 0,49 6 82 53

14: 1,01 1,25 8 63 23

15: 1,31 1,45 9 74 45

16: 1,39 0,72 8 58 4

17: 0,91 0,94 7 73 38

18: 1,37 2,85 13 49 6

19: 1,47 1,15 8 74 61

20: 1,60 1,20 7 72 46

21: 1,30 1,65 8 47 4

22: 0,93 1,02 8 54 16

23: 1,08 1,12 7 72 59

En la tabla 5, los sobrenadantes de hibridomas no clonales anti-IL-17RA se cribaron por la fijación al IL-17RA. La

5 primera mitad de la tabla 5 muestra el % de positivos y la intensidad de fluorescencia media (IFM) en los resultados de la citometría de flujo (a saber, FACS). El % de positivos muestra la inhibición de la fijación de la biotina-huIL-17A a las células CHO huIL-17RA+ debida a los sobrenadantes de hibridomas no clonales. La columna de la IFM muestra la inhibición de la fijación de la huIL-17A biotinilada a las células CHO cino-IL-17RA+ debida a los sobrenadantes de hibridomas no clonales. La segunda mitad de la tabla 5 muestra la intensidad de fijación de los

10 HFF por los Acm y los no clonales según se mide por el % de intensidad de la producción de IL-6. Las primeras 2 columnas muestran un bioensayo IL-17A/HFF con sobrenadantes de hibridomas no clonales y las últimas 4 columnas son resultados del bioensayo IL-17A/HFF de repetición con los sobrenadantes de hibridomas no clonales.

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Tabla 6

Resultados de FACS sobre expresan el cino-IL-17RA: células 293 que

Bioensayo de HFF: repetición

Dilución 1:4: 1:32 1:4 1:32 1:128 1: 512

% de positivos
% de positivos: IFM % de inhibición de producción de IL6

Control negativo: 1,09 1,57 1,0

IL-17biot. (500 ng/ml): 8,85 10,22 77

Sobrenadante I.D.

1 (incl. AMH11/AML11): 1,32 1,4 9

2: 0,87 2,92 9

3: 1,0 4,47 16

4: 1,03 5,01 17

5: 0,6 6,53 18

6 (incl. AMH5/AML5): 0,73 4,55 9

7: 0,59 5,18 8

8: 0,45 7,25 7

9: 2,34 2,36 6 61 36

10: 6,76 8,35 64 37 12

11: 0,78 1,16 6 61 24

12: 0,61 1,64 6 74 56 71 67 45 35

13: 2,98 5,48 22 –2 –13

14: 5,34 10,64 49 22 2 3 39 31 34

15: 0,5 3,24 11 51 –7

16 (incl. AMH22/AML22): 0,54 2,93 18 92 72 91 73 73 29

17: 1,25 2,2 17 –8 –76

18: 0,61 0,99 7 73 28

19 (incl. AMH23): 0,69 1,72 10 79 72 86 76 67 50

20: 1,53 1,94 31 5 –31

21: 6,66 9,63 66 –15 4

22: 6,33 10,32 71 1 14

23: 0,3 2,55 7 50 35

24: 0,24 4,11 6 34 15

25: 0,81 0,99 8 –49 11

26: 0,43 1,31 7 67 48

27: 0,7 1,23 11 50 26

28: 0,58 1,32 9 56 47

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Sobrenadante ID.

29 (inc. AMH1/AML1): 0,8 1,85 11 77 76 90 87 79 66

30: 0,69 1,55 11 40 16

31: 0,56 1,96 12 12 –11

32: 0,21 1,11 8 46 7

33: 1,24 1,15 13 68 43

34: 0,74 0,81 11 36 8

35: 0,71 1,37 9 65 21

36: 0,57 1,21 7 78 32

37: 0,59 1,0 8 71 3

38: 0,65 1,43 8 63 –38

39: 0,28 1,23 7 43 –21

40: 0,35 2,48 9 50 –39

41: 0,64 1,61 8 49 –19

42: 0,12 1,04 8 87 68 96 92 80 66

43: 0,21 1,12 11 79 34

44: 0,32 1,33 8 68 –3

45: 0,74 1,68 10 40 –16

46: 0,58 1,74 10 64 7

La tabla 6 muestra los datos de cribado de los sobrenadantes de hibridomas no clonales del IL-17RA. Las columnas del % de positivos y de IFM muestran los resultados de la citometría de flujo (FACS). Las columnas de % de positivos muestran la inhibición de la fijación de la biotina—huIL-17A a las células CHO huIL-17RA+ debida a los

5 sobrenadantes de hibridomas no clonales. La columna de la IFM muestra la inhibición de la fijación de la huIL-17A biotinilada a las células CHO cino-IL-17RA+ debida a los sobrenadantes de hibridomas no clonales. Las primeras 2 columnas del bioensayo con HFF son el bioensayo de HFF/IL-17A con sobrenadantes de hibridomas no clonales y las últimas 4 columnas del bioensayo son resultados del bioensayo de HFF/IL-17A repetido con sobrenadantes de hibridomas no clonales seleccionados. Se seleccionó una serie de sobrenadantes para la subclonación.

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Tabla 7

% de positivos: IFM

Control negativo: 1,09 1,57 10

IL-17biot. (500 ng/ml): 8,85 10,22 77 Bioensayo de HFF

1:4: 1:32 1:128

Sobrenadante I.D.: % de inhibición producción de IL-6 de la

1: 1,85 1,33 10 29 9 21

2: 1,08 1,46 16 90 61 50

3: 1,29 1,39 22 33 10 4

4: 1,55 1,33 18 53 66 58

5: 1,69 0,7 8 76 46 30

6 (incl. AMH13/AML13): 1,52 0,89 6 73 78 75

7: 1,54 0,98 7 79 71 45

8: 1,78 3,44 34 73 63 30

9: 6,34 8,45 53 57 48 34

10: 1,23 1,58 10 82 71 31

11: 1,62 2,1 28 –10 –6 –10

12: 1,15 1,04 16 71 63 37

13: 2,43 1,67 12 58 23 –4

14: 1,43 1,03 13 42 17 18

15: 1,62 1,59 18 67 59 31

16: 1,79 2,2 25 61 57 45

17: 0,91 1,85 10 49 54 23

18 (incl. AMH12/AML12): 1 1,36 6 75 82 61

19 (incl. AMH17/AML17): 1,75 1,23 8 90 81 73

20: 2,31 0,49 9 35 20 38

21 (incl. AMH16/AML16): 1,84 0,76 6 86 90 71

La tabla 7 muestra los datos de cribado de sobrenadantes de hibridoma no clonales de anti-IL-17RA. Las primeras dos columnas son datos de citometría de flujo (FACS). Las columnas con el % de positivos muestran la inhibición de

5 la fijación de la biotina—huIL-17A a las células CHO huIL-17RA+ debida a los sobrenadantes de hibridomas no clonales. La columna de IFM muestra la inhibición de la fijación de la huIL-17A biotinilada a las células CHO cino-IL17RA+ debida a los sobrenadantes de hibridomas no clonales. Las tres columnas finales muestran los resultados del bioensayo de HFF/IL-17A con los sobrenadantes de hibridomas no clonales. Los sobrenadantes 6, 18, 19 y 21 se seleccionaron para la subclonación.

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Tabla 8

ID de subclón: Bioensayo de HFF/IL-17A CI50 (nM) BIAcore de baja resolución KD (nM)

1. Subclón de (AMH14/AML14): 0,12 0,69

2. Subclón de (AMH14/AML14)2: 0,20 ND

3. Subclón de (AMH14/AML14)3: 0,075 ND

4. Subclón de (AMH21/AML21): 2,3 ND

5. Subclón de (AMH21/AML21): 3,1 ND

6. Subclón de (AMH21/AML21): 3,3 16,7

7. Subclón de (AMH20/AML20): 8,1 ND

8. Subclón de (AMH20/AML20): 6,6 ND

9. Subclón de (AMH20/AML20): 6,7 11,6

10. Subclón de (AMH19/AML19): 0,22 3,1

11. Subclón de (AMH19/AML19): 1,1 ND

12. Subclón de (AMH19/AML19): 0,50 ND

13. Subclón de (AMH13/AML13): > 10 7,6

14. Subclón de (AMH18/AML18): 0,44 ND

15. Subclón de (AMH18/AML18): 0,40 ND

16. Subclón de (AMH18/AML18): 0,17 14,9

17. Subclón de (AMH12/AML12): 3,5 ND

18. Subclón de (AMH12/AML12): 3,7 8,2

20. Subclón de (AMH12/AML12): 5,5 ND

21. Subclón de (AMH17/AML17): 2,5 8,2

22. Subclón de (AMH17/AML17): 5,3 ND

23. Subclón de (AMH17/AML17): 0,57 ND

24. Subclón de (AMH16/AML16): 1,6 ND

25. Subclón de (AMH16/AML16): 2,3 6,2

26. Subclón de (AMH16/AML16): 1,4 ND

27. Subclón de (AMH22/AML22): 0,046 1,5

28. Subclón de (AMH22/AML22): 0,09 ND

29. Subclón de (AMH22/AML22): 0,07 ND

ND = no determinado.

La tabla 8 muestra los valores de CI50 del bioensayo con HFF/IL-17A y los valores de KD de BIAcore® de baja resolución para los hibridomas subclonados. Los valores de KD y CI50 más bajos en los ensayos de fijación de la IL5 17A/HFF al IL-17RA mostraban que los Acm contra IL-17RA inhibieron la fijación de la IL-17A al receptor A de la IL

17. Se seleccionaron los anticuerpos para una caracterización posterior basándose en los valores de KD bajos para inhibir la fijación de la IL-17A al IL-17RA humano.

Ejemplo 9

Los clones de Acm humanos contra el IL-17RA que tienen las secuencias de las cadenas ligera y pesada

10 (AMH22/AML22), (AMH19/AML19), (AMH18/AML18) y (AMH14/AML14) se seleccionaron para una caracterización adicional por bioensayo. La tabla 9 que viene a continuación muestra los valores de CI50 para los Ac seleccionados en el bioensayo con HFF y un bioensayo con fibroblastos de pulmón humano contra IL-17A e IL-17F.

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Claims

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