ES2533876T3 - Análisis multiplexado de ácidos nucleicos mediante fragmentación de ADN bicatenario - Google Patents

Abstract

Método para detectar secuencias de nucleótidos particulares en una muestra de oligonucleótidos bicatenarios, que consiste esencialmente en las siguientes etapas: a. amplificar segmentos de la muestra e incorporar marcadores en los amplicones durante la amplificación para generar amplicones bicatenarios marcados; b. escindir los amplicones bicatenarios usando ácido clorhídrico durante minutos para despurinizar las bases, seguido por la adición de hidróxido de sodio y desnaturalización térmica, en ubicaciones que no están alineadas entre las hebras de amplicón, para generar fragmentos sentido y antisentido que no son totalmente complementarios seguido por congelación rápida de los fragmentos; c. mezclar los fragmentos con un tampón de hibridación; d. poner los fragmentos en contacto con un conjunto de oligonucleótidos monocatenarios en condiciones de apareamiento, en el que los oligonucleótidos monocatenarios en el conjunto son complementarios a los fragmentos o a subsecuencias de los fragmentos y e. detectar la hibridación entre dicho conjunto de oligonucleótidos monocatenarios y los fragmentos.

Description

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27-03-2015

Pueden unirse BeadChip para diferentes loci en una cámara común para la reacción de hibridación.

EJEMPLO 5: ANÁLISIS DE ELONGACIÓN MEDIADA POR CAPTURA

Tal como se comentó anteriormente, tras el análisis mediado por hibridación, pueden confirmarse o refutarse los resultados usando reacciones de elongación mediada por captura. Tal como se muestra en la figura 5, un ensayo con BeadChip de eMAP típico usando dianas de ADN escindidas químicamente debe tener cuatro etapas tal como sigue: etapa 1, amplificación por PCR de ADN genómicos. Etapa 2, se despurinizan los productos de PCR en presencia de ácido clorhídrico seguido por desnaturalización térmica en disolución alcalina. Etapa 3, se usan los ADN monocatenarios fragmentados como dianas para la hibridación con sondas específicas de secuencia seguido por una reacción de elongación en presencia de dNTP marcados de manera fluorescente, tales como dCTP y dATP marcados con Cy3. Etapa 4, se retiran los moldes diana mediante lavado intenso seguido por detección mediante READ de las sondas elongadas (figura 5).

EJEMPLO 6: SONDAS SENTIDO Y ANTISENTIDO EN UN ENSAYO DE HMAP MULTIPLEXADO

Pueden hibridarse las dianas de ADN escindidas químicamente descritas en el presente documento con un panel de múltiples sondas de oligonucleótidos en formato de ensayo multiplexado, por ejemplo, pueden someterse a ensayo genes de HLA en un formato de este tipo. En un ensayo multiplexado de este tipo, las sondas de oligonucleótidos pueden contener secuencias de captura complementarias a las hebras o bien sentido o bien antisentido de susbsecuencias de HLA diana. Cuando se usó tal ensayo en el examen de un conjunto de muestras de ADN humano de genotipos conocidos, pudo determinarse la razón de señal de sonda con respecto a señal de control positivo (la “razón de señal”) en cada muestra para cada una de las sondas del conjunto de sondas. Puede ajustarse un umbral arbitrariamente en la razón de señal para distinguir el “apareamiento perfecto”, entre sonda y diana, del “apareamiento erróneo”. Mediante la unión a la hebra complementaria de los ADN diana, la adición de sondas antisentido en el panel puede potenciar la eficacia de captura de las sondas sentido en el ensayo de hMAP multiplexado. Experimentalmente, se mostró que la adición de sondas antisentido no redujo la eficacia de captura de ninguna de las sondas sentido y de hecho mejoró la eficacia de captura cuando se añadieron las sondas antisentido (resultados no mostrados). En la figura 6, sólo se muestra un ensayo de sondas sentido.

EJEMPLO 7: MODELADO DE LA FRAGMENTACIÓN DE ADN

En este ejemplo se trata sobre el modelado de dos aspectos diferentes del proceso de fragmentación de ADN, es decir, la distribución del tamaño de fragmento de ADN monocatenario (de una composición conocida) y la probabilidad de supervivencia de un tramo particular de ADN en la hebra tras la fragmentación. El valor de este análisis es doble. En primer lugar, identifica cómo evoluciona la distribución del tamaño de fragmento en función del % de fragmentación. En segundo lugar, mediante el modelado de la distribución del tamaño de fragmento, proporciona una manera única de estimar la probabilidad de supervivencia de una región diana en la hebra de ADN de interés. Esto tiene implicaciones importantes en lo que se refiere al diseño de las sondas de captura porque sólo aquella fracción de fragmentos que contienen las subsecuencias intactas de interés, o aquellos fragmentos que permiten un solapamiento sonda-diana sustancial, pueden aparearse satisfactoriamente con la sonda de captura. Los fragmentos con regiones de solapamiento mutuo más pequeñas se desnaturalizan antes de que tenga lugar la detección o extensión. Además, puesto que la distribución del tamaño de fragmento y el % de hebras que contiene una región sin cortar de interés son ambas cantidades accesibles experimentalmente, este método proporciona una manera única de corresponder los resultados experimentales con los del modelado, permitiendo posiblemente cuantificar parámetros importantes en el modelo.

Para el fin de la simulación, se supone que el protocolo de fragmentación experimental descrito anteriormente genera una distribución aleatoria de fragmentos de polinucleótidos. La fragmentación aleatoria implica que cada unión nucleótido-nucleótido escindible tiene una probabilidad igual, Pcut, de romperse. Esta suposición es razonable porque no se sabe si el protocolo de fragmentación depende de la frecuencia y si fragmenta todas las A y G disponibles de forma no sesgada. Otra suposición es que los acontecimientos de rotura de enlaces son independientes y así el orden en el que se producen los fragmentos no afecta a sus probabilidades de producirse. Se realizaron simulaciones usando un amplicón del exón 2 de HLA B monocatenario, que tiene 268 bases de longitud. Se muestra la secuencia a continuación (SEQ ID NO.1).

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