ES2549070T3 - Prevención y tratamiento de una enfermedad sinucleinopática - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un agente que induce una respuesta inmunógena contra alfa-sinucleína, para el uso en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad caracterizada por los cuerpos de Lewy o la agregación de alfa-sinucleína en el cerebro, en la que el agente es alfa-sinucleína o un fragmento inmunógeno de la misma o un anticuerpo hacia alfa-sinucleína o un fragmento inmunógeno de la misma, y en la que la enfermedad es la enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad con cuerpos de Lewy difusos, disautonomía pura, disfagia con cuerpos de Lewy, enfermedad con cuerpos de Lewy incidentales, enfermedad con cuerpos de Lewy hereditaria o atrofia de múltiples sistemas.

Description

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dirigida contra un péptido amiloide en un paciente receptor. Tal respuesta puede ser una respuesta activa inducida mediante la administración del inmunógeno o una respuesta pasiva inducida mediante la administración del anticuerpo o de células T sensibilizadas. Una respuesta inmunitaria celular se provoca por la presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con las moléculas del MHC de Clase I o Clase II para activar las células auxiliares T CD4+ específicas del antígeno y/o las células T citotóxicas CD8+. La respuesta puede implicar también la activación de monocitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células de la microglia, eosinófilos u otros componentes de la inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células se puede determinar mediante ensayos de proliferación (células T CD4+) o ensayos de CTL (linfocitos T citotóxicos) (véase Burke, anteriormente mencionado; Tigges, anteriormente mencionado). Las contribuciones relativas de las respuestas humorales y celulares al efecto protector o terapéutico de un inmunógeno se pueden distinguir aislando por separado los anticuerpos y las células T de un animal singénico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto.

Un "agente inmunógeno" o "inmunógeno" es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí mismo tras la administración a un mamífero, opcionalmente junto con un adyuvante.

El término "todos D" se refiere a péptidos que tienen ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥95%, y 100% de aminoácidos de configuración D.

La expresión "polinucleótido desnudo" se refiere a un polinucleótido sin complejar con materiales coloidales. Los polinucleótidos desnudos a veces se clonan en un vector plasmídico.

El término "adyuvante" se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con un antígeno aumenta la respuesta inmunitaria hacia el antígeno, pero cuando se administra solo no genera una respuesta inmunitaria hacia el antígeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos, que incluyen la incorporación de linfocitos, la estimulación de células B y/o T, y la estimulación de macrófagos.

El término "paciente" incluye los sujetos humanos y otros mamíferos que reciben un tratamiento profiláctico o terapéutico.

La competición entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que la inmunoglobulina de ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como alfa-SN. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo competitivo de tipo sándwich (véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); EIA directo con biotina-avidina en fase sólida (véase Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); ensayo con marcador directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich con marcador directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA con marcador directo en fase sólida mediante el uso de un marcador de I-125 (véase Morel et al., Molec. Immunol. 25(1): 7-15 (1988)); EIA directo con biotina-avidina en fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); y RIA con marcador directo (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). En general, tal ensayo implica el uso de un antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que albergan alguno de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Normalmente, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competición (anticuerpos competitivos) incluyen los anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y los anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo al que se une el anticuerpo de referencia para que se dé un impedimento estérico. Normalmente, cuando un anticuerpo competitivo está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 50 ó 75%.

El término "síntoma" o "síntoma clínico" se refiere a una prueba subjetiva de una enfermedad, tal como un modo de andar alterado, tal como lo percibe el paciente. Un "signo" se refiere a una prueba objetiva de una enfermedad tal como lo observa un médico.

Las composiciones o métodos "que comprenden" uno o más elementos enumerados pueden incluir otros elementos que no se enumeran de manera específica. Por ejemplo, una composición que comprende un péptido alfa-SN abarca tanto un péptido alfa-SN aislado como un péptido alfa-SN como componente de una secuencia polipeptídica mayor.

Descripción detallada de la invención

I. General

La descripción proporciona métodos para prevenir o tratar varias enfermedades y afecciones caracterizadas por la presencia de depósitos de péptidos alfa-SN agregados hasta una masa insoluble en el cerebro de un paciente, en forma de cuerpos de Lewy. Tales enfermedades se denominan colectivamente enfermedades con cuerpos de Lewy (LBD), e incluyen la enfermedad de Parkinson (PD). Tales enfermedades se caracterizan por agregados de alfa-SN que tienen una estructura de lámina β y tinción con tioflavina-S y rojo Congo (véase Hasimoto, Ibíd). La descripción

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proporciona métodos para prevenir o tratar tales enfermedades mediante el uso de un agente que puede generar una respuesta inmunógena hacia alfa-SN. La respuesta inmunógena actúa para prevenir la formación de, o para eliminar, los depósitos de sinucleína dentro de las células del cerebro. Aunque la comprensión del mecanismo no es esencial para la práctica de la invención, la respuesta inmunógena puede inducir la eliminación como resultado de los anticuerpos hacia sinucleína que se interiorizan dentro de las células y/o que interaccionan con la membrana de tales células, y de ese modo interfieren con la agregación de sinucleína. En ciertos métodos, la respuesta de eliminación se puede efectuar al menos en parte mediante la fagocitosis mediada por los receptores de Fc. La inmunización con sinucleína puede reducir la acumulación de sinucleína en las sinapsis del cerebro. Aunque la comprensión del mecanismo no es esencial para la práctica de la invención, este resultado se puede explicar porque los anticuerpos hacia sinucleína son captados por las vesículas sinápticas.

Opcionalmente, los agentes que generan una respuesta inmunógena contra alfa-SN se pueden usar en combinación con agentes que generan una respuesta inmunógena hacia Aβ. La respuesta inmunógena es útil para eliminar los depósitos de Aβ en los individuos que tienen tales depósitos (p.ej., individuos que tienen tanto la enfermedad de Alzheimer como la de Parkinson); sin embargo, la respuesta inmunógena también tiene actividad en la eliminación de los depósitos de sinucleína. Así, la presente descripción usa tales agentes solos o en combinación con agentes que generan una respuesta inmunógena hacia alfa-SN en individuos con LBD pero que no padecen o corren el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer.

II. Agentes que generan una respuesta inmunógena contra alfa sinucleína

Una respuesta inmunógena puede ser activa, como cuando se administra un inmunógeno para inducir anticuerpos reactivos con alfa-SN en un paciente, o pasiva, como cuando se administra un anticuerpo que se une él mismo a alfa-SN en un paciente.

1. Agentes que inducen una respuesta inmunitaria activa

Los agentes terapéuticos inducen una respuesta inmunógena dirigida de manera específica a ciertos epítopos del péptido alfa-SN. Los agentes preferidos son el péptido alfa-SN propiamente dicho y los fragmentos del mismo. También se pueden usar variantes de tales fragmentos, análogos y moléculas miméticas del péptido alfa-SN natural que inducen y/o reaccionan de manera cruzada con anticuerpos hacia los epítopos preferidos del péptido alfa-SN.

La alfa sinucleína se identificó en un principio en cerebros humanos como la proteína precursora del componente no β-amiloide (NAC) de las placas de AD. (Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (23):11282-11286 (1993). Alfa-SN, también denominada precursor del componente no-Aβ del amiloide de AD (NACP), es un péptido de 140 aminoácidos. Alfa-SN tiene la secuencia de aminoácidos:

MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGV ATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEE GAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA (SEQ ID Nº:1)

(Uéda et al., Ibíd.; número de acceso de GenBank: P37840).

El componente no-Aβ del amiloide de AD (NAC) procede de alfa-SN. NAC, un dominio sumamente hidrófobo de la alfa sinucleína, es un péptido que consiste en al menos 28 residuos de aminoácidos (residuos 60-87) (SEQ ID Nº: 3) y opcionalmente 35 residuos de aminoácidos (residuos 61-95) (SEQ ID Nº: 2). Véase la Fig. 1. NAC muestra una tendencia a formar una estructura de lámina beta (Iwai, et al., Biochemistry, 34:10139-10145). Jensen et al. ha informado que NAC tiene la secuencia de aminoácidos:

EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV (SEQ ID Nº: 2)

(Jensen et al., Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94 (1995); número de acceso de GenBank S56746).

Uéda et al. ha informado que NAC tiene la secuencia de aminoácidos:

KEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGS (SEQ ID Nº: 3)

(Uéda et al., PNAS USA 90:11282-11286 (1993).

Alfa-SN desagregada, o los fragmentos de la misma, que incluyen NAC, significan unidades peptídicas monoméricas. La alfa-SN desagregada o los fragmentos de la misma en general son solubles, y son capaces de autoagregarse hasta formar oligómeros solubles. Los oligómeros de alfa-SN y los fragmentos de la misma normalmente son solubles, y existen predominantemente en forma de hélices alfa. La alfa-SN monomérica se puede preparar in vitro disolviendo péptido liofilizado en DMSO puro con sonicación. La disolución resultante se centrifuga para eliminar las partículas insolubles. La alfa-SN agregada o los fragmentos de la misma, que incluyen NAC, significan oligómeros de alfa-SN o fragmentos de la misma que se han asociado hasta estructuras de láminas beta insolubles. La alfa-SN agregada o los fragmentos de la misma, que incluyen NAC, significan también polímeros fibrilares. Las fibrillas normalmente son insolubles. Algunos anticuerpos se unen a alfa-SN soluble o a los fragmentos de la misma o a alfa-SN agregada o a los fragmentos de la misma. Algunos anticuerpos se unen a alfa-SN tanto

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soluble como agregada, o a los fragmentos de la misma.

Alfa-SN, el componente principal de la característica de los cuerpos de Lewy de PD, y los fragmentos epitópicos de la misma, tales como, por ejemplo, NAC, o fragmentos distintos de NAC, se pueden usar para inducir una respuesta inmunógena. Preferiblemente, tales fragmentos comprenden cuatro o más aminoácidos de alfa-SN o análogos de los mismos. Algunos fragmentos activos incluyen un epítopo en o cerca del extremo C-terminal de alfa-SN (p.ej., dentro de los aminoácidos 70-140, 100-140, 120-140, 130-140, o 135-140). En algunos fragmentos activos, el residuo C-terminal del epítopo es el residuo C-terminal de alfa-SN. También se pueden usar otros componentes de los cuerpos de Lewy, por ejemplo, sinfilina-1, Parkina, ubiquitina, neurofilamento, beta-cristalina, y los fragmentos epitópicos de los mismos, para inducir una respuesta inmunógena.

A menos que se indique de otra manera, la referencia a alfa-SN incluye las secuencias de aminoácidos humanas naturales indicadas anteriormente, así como los análogos, que incluyen las variantes alélicas, de especie e inducidas, las formas de longitud completa y los fragmentos inmunógenos de las mismas. Los análogos difieren en general de los péptidos naturales en una, dos o varias posiciones, a menudo en virtud de sustituciones conservativas. Los análogos exhiben en general al menos un 80 ó 90% de identidad de secuencia con los péptidos naturales. Algunos análogos también incluyen aminoácidos no naturales o modificaciones de los aminoácidos N-o C-terminales en una, dos o varias posiciones. Por ejemplo, el residuo de ácido glutámico natural de la posición 139 de alfa-SN se puede sustituir con ácido isoaspártico. Los ejemplos de aminoácidos no naturales son los aminoácidos D, alfa, alfa-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, 4-hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetil-lisina, épsilon-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, omega-N-metilarginina, β-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido gamma-amino butírico, homoserina, citrulina, y ácido isoaspártico. Los agentes terapéuticos también incluyen los análogos de los fragmentos de alfa-SN. Algunos agentes terapéuticos de la invención son péptidos todos-D, p.ej., alfa-SN todos-D o NAC todos-D, y los análogos peptídicos todos-D. Los fragmentos y análogos se pueden cribar en función de la eficacia profiláctica o terapéutica en modelos de animales transgénicos en comparación con los controles sin tratar o placebos como se describe más adelante.

Alfa-SN, sus fragmentos, y los análogos se pueden sintetizar mediante síntesis peptídica en fase sólida o expresión recombinante, o se pueden obtener de fuentes naturales. Hay disponibles comercialmente sintetizadores de péptidos automáticos de numerosos proveedores, tales como Applied Biosystems, Foster City, California. La expresión recombinante puede darse en bacterias, tales como E. coli, levadura, células de insecto o células de mamífero. Los procedimientos para la expresión recombinante se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2ª ed., 1989). Algunas formas del péptido alfa-SN también están disponibles comercialmente, por ejemplo, de BACHEM y American Peptide Company, Inc.

Los agentes terapéuticos también incluyen polipéptidos más largos que incluyen, por ejemplo, un fragmento activo del péptido alfa-SN, junto con otros aminoácidos. Por ejemplo, los agentes preferidos incluyen proteínas de fusión que comprenden un segmento de alfa-SN fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga que induce una respuesta de células T auxiliares contra la secuencia de aminoácidos heteróloga, y de ese modo una respuesta de células B contra el segmento de alfa-SN. Tales polipéptidos se pueden cribar en función de la eficacia profiláctica o terapéutica en modelos animales en comparación con los controles sin tratar o placebos como se describe más adelante. El péptido alfa-SN, análogo, fragmento activo u otro polipéptido se puede administrar en forma asociada o multimérica o en forma disociada. Los agentes terapéuticos también incluyen los multímeros de los agentes inmunógenos monoméricos. Los agentes terapéuticos de la invención pueden incluir secuencias de polilisina.

En una variación adicional, un péptido inmunógeno, tal como un fragmento de alfa-SN, se puede presentar mediante un virus o bacteria como parte de una composición inmunógena. Se incorpora un ácido nucleico que codifica el péptido inmunógeno en un genoma o episoma del virus o bacteria. Opcionalmente, el ácido nucleico se incorpora de tal manera que el péptido inmunógeno se expresa como una proteína secretada o como una proteína de fusión con una proteína de la superficie externa de un virus, o una proteína transmembrana de una bacteria, de forma que se expresa el péptido. Los virus o bacterias usadas en tales métodos deberían ser apatógenos o atenuados. Los virus adecuados incluyen adenovirus, HSV, virus de la encefalitis equina venezolana y otros alfa virus, virus de la estomatitis vesicular, y otros rhabdovirus, vaccinia y viruela aviar. Las bacterias adecuadas incluyen Salmonella y Shigella. La fusión de un péptido inmunógeno a HBsAg de HBV es especialmente adecuada.

Los agentes terapéuticos también incluyen péptidos y otros compuestos que no tienen necesariamente una similitud de secuencias de aminoácidos significativa con alfa-SN, pero sin embargo sirven como moléculas miméticas de alfa-SN, e inducen una respuesta inmunitaria similar. Por ejemplo, cualquier péptido y proteína que forme láminas beta se puede cribar en función de su idoneidad. También se pueden usar anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos monoclonales hacia alfa-SN u otros componentes de los cuerpos de Lewy. Tales anticuerpos anti-Id imitan el antígeno y generan una respuesta inmunitaria hacia él (véase Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA, 6ª ed., pág. 181). Los agentes distintos de alfa-SN deberían inducir una respuesta inmunógena contra uno o más de los segmentos preferidos de alfa-SN enumerados anteriormente (p.ej., NAC). Preferiblemente, tales agentes inducen una respuesta inmunógena que se dirige de manera específica hacia uno de estos segmentos sin dirigirse hacia otros segmentos de alfa-SN.

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Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epítopo dentro de residuos especificados, tal como alfa-SN 1-5, por ejemplo, lo que se quiere decir es que el anticuerpo se une de manera específica a un polipéptido que contiene los residuos especificados (es decir, alfa-SN 1-5 en este ejemplo). Tal anticuerpo no entra en contacto necesariamente con cada residuo dentro de alfa-SN 1-5. Tampoco afecta necesariamente de manera significativa a la afinidad de unión cada sustitución o deleción de un único aminoácido dentro de alfa-SN 1-5. La especificidad por el epítopo de un anticuerpo se puede determinar, por ejemplo, formando una biblioteca de expresión en fagos en la que diferentes miembros expresen diferentes subsecuencias de alfa-SN. La biblioteca de expresión en fagos se selecciona después en función de los miembros que se unen de manera específica a un anticuerpo que se está ensayando. Se aísla una familia de secuencias. En general, tal familia contiene una secuencia central común, y longitudes variables de secuencias flanqueantes en los diferentes miembros. La secuencia central más corta que muestra una unión específica al anticuerpo define el epítopo unido por el anticuerpo. También se pueden ensayar los anticuerpos por su especificidad hacia el epítopo en un ensayo competitivo con un anticuerpo cuya especificidad hacia el epítopo ya se ha determinado.

Algunos anticuerpos de la invención se unen de manera específica a un epítopo de NAC. Algunos anticuerpos se unen de manera específica a un epítopo de una forma glicosilada de 22 kilodaltons de sinucleína, p.ej., P22-sinucleína (H. Shimura et al., Science, julio de 2001 13:293(5528):224-5). Algunos anticuerpos se unen a un epítopo en o cerca del extremo C-terminal de alfa-SN (p.ej., en los aminoácidos 70-140, 100-140, 120-140, 130-140

o 135-140). Algunos anticuerpos se unen a un epítopo en el que el residuo C-terminal del epítopo es el residuo C-terminal de alfa-SN. En algunos métodos, el anticuerpo se une de manera específica a NAC sin unirse a alfa-SN de longitud completa.

Los anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen de manera específica a un segmento preferido de alfa-SN sin unirse a otras regiones de alfa-SN tienen varias ventajas respecto de los anticuerpos monoclonales que se unen a otras regiones o los sueros policlonales hacia alfa-SN intacta. En primer lugar, para dosis de igual masa, las dosis de anticuerpos que se unen de manera específica a segmentos preferidos contienen una dosis molar superior de anticuerpos eficaces para la eliminación de las placas amiloides. En segundo lugar, los anticuerpos que se unen de manera específica a segmentos preferidos pueden inducir una respuesta de eliminación contra los LBs sin inducir una respuesta de eliminación contra la alfa-SN intacta, por lo que se reduce la posibilidad de efectos secundarios.

i. Características generales de las inmunoglobulinas

Se sabe que la unidad estructural básica de los anticuerpos comprende un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, y cada par tiene una cadena "ligera" (alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (alrededor de 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxiterminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. En las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de alrededor de 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de alrededor de 10 o más aminoácidos. (Véase en general, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y., 1989, Cap. 7).

Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman el sitio de unión del anticuerpo. Así, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales. Todas las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones estructurales (FR) relativamente conservadas unidas mediante tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones estructurales, lo que permite la unión a un epítopo específico. De N-terminal a C-terminal, las cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987);

o Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

ii. Producción de anticuerpos no humanos

Los anticuerpos quiméricos y humanizados tienen la misma o similar especificidad y afinidad de unión que un anticuerpo de ratón o de otro animal no humano que proporciona el material de partida para la construcción de un anticuerpo quimérico o humanizado. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de la cadena ligera y pesada se han construido, en general, mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulinas que pertenecen a especies diferentes. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón se pueden unir a segmentos constantes (C) humanos, tales como IgG1 e IgG4. Se prefiere el isotipo IgG1 humano. En ciertos métodos, el isotipo del anticuerpo es el IgG1 humano. También se pueden usar anticuerpos IgM en ciertos métodos. Un anticuerpo quimérico típico es, así, una proteína híbrida que consiste en el dominio V o de unión al antígeno de un anticuerpo de ratón, y el dominio C o efector de un anticuerpo

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humano.

Los anticuerpos humanizados tienen residuos estructurales de la región variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de la complementariedad sustancialmente de un anticuerpo de ratón, (denominado inmunoglobulina donante). Véase, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), los documentos WO 90/07861, US 5.693.762, US 5.693.761, US 5.585.089, US 5.530.101, y Winter, US 5.225.539. La(s) región(es) constante(s), si está(n) presente(s), también son sustancialmente o completamente de una inmunoglobulina humana. Los dominios variables humanos se eligen normalmente de anticuerpos humanos cuyas secuencias estructurales exhiben un grado elevado de identidad de secuencia con los dominios de la región variable murina de la que proceden las CDRs. Los residuos estructurales de la región variable de la cadena pesada y ligera pueden proceder de secuencias de anticuerpos humanos iguales o diferentes.

Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos naturales, o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos humanos. Véase Carter et al., documento WO 92/22653. Ciertos aminoácidos de los residuos estructurales de la región variable humana se seleccionan para su sustitución basándose en su posible influencia sobre la conformación de la CDR y/o la unión al antígeno. La investigación de tales posibles influencias es mediante modelización, examen de las características de los aminoácidos en localizaciones particulares, u observación empírica del efecto de la sustitución o de la mutagénesis de aminoácidos particulares.

Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un residuo estructural de la región variable murina y un residuo estructural de la región variable humana seleccionado, el aminoácido estructural humano se debería sustituir normalmente por el aminoácido estructural equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espere razonablemente que el aminoácido:

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esté adyacente a una región CDR,

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interaccione de otra manera con una región CDR (p.ej., esté dentro de alrededor de 6 A de una región CDR), o

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participe en la interfase VL-VH.

Otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos estructurales humanos aceptores que son poco habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos se pueden sustituir con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo donante de ratón o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos estructurales humanos aceptores que son poco habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Las zonas estructurales de la región variable de inmunoglobulinas humanizadas normalmente muestran al menos un 85% de identidad de secuencia respecto de una secuencia estructural de la región variable humana o consenso de tales secuencias.

iv. Anticuerpos humanos

Se proporcionan anticuerpos humanos contra alfa-SN mediante una diversidad de técnicas descritas más adelante. Algunos anticuerpos humanos se seleccionan mediante experimentos de unión competitiva, o de otra manera, para que tengan la misma especificidad por el epítopo que un anticuerpo de ratón particular, tal como uno de los anticuerpos monoclonales de ratón descritos en el Ejemplo XI. Los anticuerpos humanos también se pueden cribar en función de la especificidad por un epítopo particular mediante el uso de solamente un fragmento de alfa-SN como inmunógeno, y/o cribando los anticuerpos con una colección de mutantes por deleción de alfa-SN. Los anticuerpos humanos tienen preferiblemente especificidad del isotipo IgG1 humano.

(1) Metodología de triomas

Se ha descrito la aproximación básica y un complemento de fusión celular ejemplar, SPAZ-4, para el uso en esta aproximación en Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, patente de EE.UU. nº 4.634.664; y Engleman et al., patente de EE.UU. nº 4.634.666. Las líneas celulares productoras de anticuerpos obtenidas mediante este método se denominan triomas, porque descienden de tres células, dos humanas y una de ratón. Inicialmente, una línea de mieloma de ratón se fusiona con un linfocito B humano para obtener una célula híbrida xenogénica que no produce anticuerpos, tal como la línea celular SPAZ-4 descrita por Oestberg, anteriormente mencionado. La célula xenogénica se fusiona después con un linfocito B humano inmunizado para obtener una línea celular de trioma que produce anticuerpos. Se ha descubierto que los triomas producen anticuerpos de manera más estable que los hibridomas habituales hechos a partir de células humanas.

Los linfocitos B inmunizados se obtienen a partir de la sangre, bazo, nódulos linfáticos o médula ósea de un donante humano. Si se desean anticuerpos contra un antígeno o epítopo específico, es preferible usar ese antígeno o epítopo del mismo para la inmunización. La inmunización puede ser in vivo o in vitro. Para la inmunización in vivo, se aíslan en general las células B a partir de un ser humano inmunizado con alfa-SN, un fragmento de la misma, un polipéptido mayor que contiene alfa-SN o un fragmento, o un anticuerpo anti-idiotípico hacia un anticuerpo hacia

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alfa-SN. En ciertos métodos, las células B se aíslan del mismo paciente al que finalmente se le va a administrar la terapia con anticuerpos. Para la inmunización in vitro, los linfocitos B se exponen en general al antígeno durante un periodo de 7-14 días en un medio tal como RPMI-1640 (véase Engleman, anteriormente mencionado) complementado con un 10% de plasma humano.

Los linfocitos B inmunizados se fusionan a una célula híbrida xenogénica tal como SPAZ-4 mediante métodos bien conocidos. Por ejemplo, las células se tratan con un 40-50% de polietilen glicol de PM 1000-4000, a alrededor de 37 ºC, durante alrededor de 5-10 min. Las células se separan de la mezcla de fusión y se propagan en medios selectivos para los híbridos deseados (p.ej., HAT o AH). Los clones que secretan los anticuerpos que tienen la especificidad de unión necesaria se identifican ensayando el medio de cultivo de triomas por la capacidad de unirse a alfa-SN o un fragmento de la misma. Los triomas que producen anticuerpos humanos que tienen la especificidad deseada se subclonan mediante la técnica de dilución limitante y se cultivan in vitro en medio de cultivo. Las líneas celulares de triomas obtenidas se ensayan después en función de la capacidad de unirse a alfa-SN o a un fragmento de la misma.

Aunque los triomas son genéticamente estables, no producen anticuerpos a niveles muy elevados. Los niveles de expresión se pueden incrementar clonando los genes de anticuerpos del trioma en uno o más vectores de expresión, y transformando el vector en líneas celulares habituales de mamífero, bacterianas o de levadura.

(2) Mamíferos transgénicos no humanos

Los anticuerpos humanos contra alfa-SN se pueden producir también a partir de mamíferos transgénicos no humanos que tienen transgenes que codifican al menos un segmento del locus de inmunoglobulina humana. Normalmente, el locus de inmunoglobulina endógena de tales mamíferos transgénicos está inactivado funcionalmente. Preferiblemente, el segmento del locus de inmunoglobulina humana incluye secuencias sin reordenar de componentes de las cadenas pesadas y ligeras. Tanto la inactivación de genes de inmunoglobulinas endógenas como la introducción de genes de inmunoglobulinas exógenas se puede conseguir mediante recombinación homóloga dirigida, o mediante introducción de cromosomas YAC. Los mamíferos transgénicos que resultan de este proceso son capaces de reordenar funcionalmente las secuencias de los componentes de inmunoglobulinas, y de expresar un repertorio de anticuerpos de diversos isotipos codificados por los genes de inmunoglobulinas humanas, sin expresar los genes de las inmunoglobulinas endógenas. La producción y las propiedades de los mamíferos que tienen estas propiedades se describen con detalle, p.ej., en Lonberg et al., documentos WO93/1222, US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US 5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, documento WO 91/10741. Los ratones transgénicos son especialmente adecuados. Los anticuerpos anti-alfa-SN se obtienen inmunizando a un mamífero no humano transgénico, tal como describieron Lonberg o Kucherlapati, anteriormente mencionados, con alfa-SN o un fragmento de la misma. Los anticuerpos monoclonales se preparan, p.ej., fusionando células B de tales mamíferos con líneas celulares de mieloma adecuadas mediante el uso de la tecnología convencional de Kohler-Milstein. También se pueden proporcionar anticuerpos policlonales humanos en forma de suero a partir de seres humanos inmunizados con un agente inmunógeno. Opcionalmente, tales anticuerpos policlonales se pueden concentrar mediante purificación por afinidad mediante el uso de alfa-SN u otro péptido amiloide como reactivo de afinidad.

(3) Métodos de expresión en fagos

Una aproximación adicional para obtener anticuerpos anti-alfa-SN humanos es cribar una biblioteca de ADN de células B humanas según el protocolo general resumido en Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Como se describió para la metodología de triomas, tales células B se pueden obtener de un ser humano inmunizado con alfa-SN, fragmentos, polipéptidos más largos que contienen alfa-SN o fragmentos o anticuerpos anti-idiotípicos. Opcionalmente, tales células B se obtienen de un paciente que finalmente va a recibir el tratamiento con anticuerpos. Se seleccionan los anticuerpos que se unen a alfa-SN o a un fragmento de la misma. Después se clonan y se amplifican las secuencias que codifican tales anticuerpos (o los fragmentos de unión). El protocolo descrito por Huse se hace más eficaz en combinación con la tecnología de expresión en fagos. Véase, p.ej., Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty et al., documentos WO 92/01047, US 5.877.218, US 5.871.907, US 5.858.657, US 5.837.242, US 5.733.743 y US 5.565.332. En estos métodos, se producen bibliotecas de fagos en las que los miembros expresan diferentes anticuerpos en sus superficies externas. Los anticuerpos se expresan normalmente como fragmentos Fv o Fab. Los fagos que expresan anticuerpos con una especificidad deseada se seleccionan mediante enriquecimiento por afinidad hacia un péptido alfa-SN o un fragmento del mismo.

En una variación del método de expresión en fagos, se pueden producir anticuerpos humanos que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo murino seleccionado. Véase Winter, documento WO 92/20791. En este método, se usa la región variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo murino seleccionado como material de partida. Si, por ejemplo, se selecciona una región variable de la cadena ligera como material de partida, se construye una biblioteca de fagos en la que los miembros expresan la misma región variable de la cadena ligera (es decir, el material de partida murino) y una región variable de la cadena pesada diferente. Las regiones variables de la cadena pesada se obtienen a partir de una biblioteca de regiones variables de la cadena pesada humanas reordenadas. Se selecciona un fago que muestra una unión específica intensa hacia alfa-SN (p.ej., al menos 108 y preferiblemente al

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propionato de N-succinimidilo (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) (si el péptido carece de un grupo sulfhidrilo, este se puede proporcionar mediante la adición de un residuo de cisteína). Estos reactivos crean una unión disulfuro entre ellos y los residuos peptídicos de cisteína de una proteína, y una unión amida a través del épsilon-amino de una lisina, u otro grupo amino libre de otros aminoácidos. Se describe una diversidad de tales agentes formadores de disulfuro/amida en Immun. Rev. 62, 185 (1982). Otros agentes de acoplamiento bifuncionales forman una unión tioéter en vez de una unión disulfuro. Muchos de estos agentes de formación de tio-éteres están disponibles comercialmente, e incluyen los ésteres reactivos de ácido 6-maleimidocaproico, ácido 2-bromoacético, y ácido 2-yodoacético, ácido 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxílico. Los grupos carboxilo se pueden activar combinándolos con succinimida o ácido 1-hidroxil-2-nitro-4-sulfónico, sal sódica.

La inmunogenicidad se puede mejorar por medio de la adición de residuos espaciadores (p.ej., Gly-Gly) entre el epítopo de Th y el inmunógeno peptídico de la invención. Además de separar físicamente el epítopo de Th del epítopo de células B (es decir, el inmunógeno peptídico), los residuos de glicina pueden alterar cualquier estructura secundaria artificial creada por la unión del epítopo de Th con el inmunógeno peptídico, y de ese modo eliminan la interferencia entre las respuestas de las células T y/o B. La separación conformacional entre el epítopo auxiliar y el dominio que genera anticuerpos permite así interacciones más eficaces entre el inmunógeno presentado y las células Th y B adecuadas.

Para aumentar la inducción de la inmunidad de células T en un gran porcentaje de sujetos que expresan diversos tipos de HLA hacia un agente de la presente invención, se puede preparar una mezcla de conjugados con diferentes epítopos de células Th. La mezcla puede contener una mezcla de al menos dos conjugados con diferentes epítopos de células Th, una mezcla de al menos tres conjugados con diferentes epítopos de células Th, o una mezcla de al menos cuatro conjugados con diferentes epítopos de células Th. La mezcla se puede administrar con un adyuvante.

Los péptidos inmunógenos se pueden expresar también en forma de proteínas de fusión con portadores (es decir, péptidos heterólogos). El péptido inmunógeno se puede unir en su extremo aminoterminal, su extremo carboxiterminal, o ambos, a un portador. Opcionalmente, puede haber múltiples repeticiones del péptido inmunógeno en la proteína de fusión. Opcionalmente, se puede unir un péptido inmunógeno a múltiples copias de un péptido heterólogo, por ejemplo, en ambos extremos N y C del péptido. Algunos péptidos portadores sirven para inducir una respuesta de células T auxiliares contra el péptido portador. Las células T auxiliares inducidas a su vez inducen una respuesta de células B contra el péptido inmunógeno unido al péptido portador.

Algunos agentes de la invención comprenden una proteína de fusión en la que un fragmento N-terminal de alfa-SN está unido en su extremo C-terminal a un péptido portador. En tales agentes, el residuo N-terminal del fragmento de alfa-SN constituye el residuo N-terminal de la proteína de fusión. Por lo tanto, tales proteínas de fusión son eficaces para inducir anticuerpos que se unen a un epítopo que requiere que el residuo N-terminal de alfa-SN esté en forma libre. Algunos agentes de la invención comprenden una diversidad de repeticiones de NAC unidas al extremo C-terminal en una o más copias de un péptido portador. Algunas proteínas de fusión comprenden segmentos diferentes de alfa-SN en tándem.

En algunas proteínas de fusión, NAC se fusiona en su extremo N-terminal a un péptido portador heterólogo. Se puede usar NAC con fusiones C-terminales. Algunas proteínas de fusión comprenden un péptido heterólogo unido al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de NAC, que está unido a su vez a uno o más segmentos de NAC adicionales de alfa-SN en tándem.

Algunos ejemplos de las proteínas de fusión adecuadas para el uso en la invención se muestran más adelante. Algunas de estas proteínas de fusión comprenden segmentos de alfa-SN unidos a epítopos de toxoide tetánico tal como se describió en los documentos US 5.196.512, EP 378.881 y EP 427.347. Algunas proteínas de fusión comprenden segmentos de alfa-SN unidos a al menos un PADRE. Algunos péptidos heterólogos son epítopos de células T promiscuos, mientras otros péptidos heterólogos son epítopos de células T universales. En algunos métodos, el agente para la administración es simplemente una única proteína de fusión con un segmento de alfa-SN unido a un segmento heterólogo en una configuración lineal. Los agentes terapéuticos de la invención se pueden representar mediante el uso de una fórmula. Por ejemplo, en ciertos métodos, el agente es un multímero de proteínas de fusión representado mediante la fórmula 2x, en la que x es un número entero de 1-5. Preferiblemente, x es 1, 2, o 3, y 2 es el más preferido. Cuando x es dos, tal multímero tiene cuatro proteínas de fusión unidas en una configuración preferida denominada MAP4 (véase el documento US 5.229.490).

La configuración MAP4 se muestra más adelante, en la que se producen estructuras ramificadas iniciando la síntesis del péptido en las aminas del extremo N-terminal y de las cadenas laterales de lisina. Dependiendo del número de veces que se incorpore la lisina en la secuencia y que se deje ramificar, la estructura resultante presentará múltiples extremos N-terminales. En este ejemplo, se han producido cuatro extremos N-terminales idénticos en el núcleo que contiene la lisina ramificada. Tal multiplicidad aumenta enormemente la sensibilidad de las células B afines.

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Z se refiere al péptido NAC, un fragmento del péptido NAC, u otro fragmento activo de alfa-SN como se describió en

la Sección I.2 anterior. Z puede representar más de un fragmento activo, por ejemplo:

Z = péptido alfa-SN 60-72 (región NAC) = NH2-KEQVTNVCGGAVVT-COOH (SEQ ID Nº: 13)

Z = péptido alfa-SN 73-84 (región NAC) = NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH (SEQ ID Nº: 14)

Z = péptido alfa-SN 102-112 = NH2-C-ácido amino-heptanoico-KNEEGAPCQEG-COOH (SEQ ID Nº: 15)

péptido alfa-SN 128-140

Otros ejemplos de proteínas de fusión incluyen:

Z-Toxoide tetánico 830-844 en una configuración MAP4:

Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID Nº: 16)

Z-Toxoide tetánico 947-967 en una configuración MAP4:

Z-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID Nº: 17)

Z-Toxoide tetánico830-844 en una configuración MAP4:

Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID Nº: 18)

Z-Toxoide tetánico830-844 + toxoide tetánico947-967 en una configuración lineal:

Z-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID Nº: 19) Péptido PADRE (todo en configuraciones lineales), en el que X es preferiblemente ciclohexilalanina, tirosina o fenilalanina, y ciclohexilalanina es el más preferido-Z:

AKXVAAWTLKAAA-Z (SEQ ID Nº: 20)

3Z-péptido PADRE:

Z-Z-Z-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID Nº: 21)

Los ejemplos adicionales de proteínas de fusión incluyen:

AKXVAAWTLKAAA-Z-Z-Z-Z (SEQ ID Nº: 22)

Z-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID Nº: 23)

Z-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID Nº: 24)

PKYVKQNTLKLAT-Z-Z-Z (SEQ ID Nº: 25)

Z-PKYVKQNTLKLAT-Z (SEQ ID Nº: 26)

Z-Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID Nº: 27)

Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID Nº: 28)

Z-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-Z-Z-Z-QYIKAN

SKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID Nº: 29) Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z (SEQ ID Nº: 30)

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DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID Nº: 35) AN90542 (Aβ 1-7-toxoide tetánico 830-844 + 947-967 en una configuración lineal): DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID Nº: 36) AN90576: (Aβ3-9)-toxoide tetánico 830-844 en una configuración MAP4): EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID Nº: 37) Péptido PADRE (todo en configuraciones lineales), en el que X es preferiblemente ciclohexilalanina, tirosina o

fenilalanina, y ciclohexilalanina es el más preferido: AN90562 (PADRE-Aβ1-7): AKXVAAWTLAAA-DAEFRHD (SEQ ID Nº: 38) AN90543 (3 PADRE-Aβ1-7): DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID Nº: 39) Otros ejemplos de proteínas de fusión (epítopo inmunógeno de Aβ en negrita) incluyen: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID Nº: 40) DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID Nº: 41) DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID Nº: 42) FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID Nº: 43) EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID Nº: 44) PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID Nº: 45) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID Nº: 46) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID Nº: 47) DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID Nº: 48) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFR

HD (SEQ ID Nº: 49) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID Nº: 50) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID Nº: 51) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID Nº: 52) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID Nº: 53) en una resina de 2 ramificaciones.

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Los anticuerpos monoclonales preferidos se unen a un epítopo dentro de los residuos 1-10 de Aβ (y el primer residuo N-terminal de Aβ natural se designa 1). Algunos anticuerpos monoclonales preferidos se unen a un epítopo dentro de los aminoácidos 1-5, y algunos a un epítopo dentro de 5-10. Algunos anticuerpos preferidos se unen a epítopos dentro de los aminoácidos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 ó 3-7. Algunos anticuerpos preferidos se unen a un epítopo que comienza en los residuos 1-3 y que termina en los residuos 7-11 de Aβ. Otros anticuerpos incluyen los que se unen a los epítopos con los residuos 13-280 (p.ej., el anticuerpo monoclonal 266). Los anticuerpos preferidos tienen el isotipo IgG1 humano.

IV. Cribado de anticuerpos en función de la actividad de eliminación

La invención proporciona métodos de cribado de un anticuerpo en función de la actividad en la eliminación de un

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ya padecen la enfermedad de Parkinson se pueden reconocer por sus manifestaciones clínicas, que incluyen temblor en reposo, rigidez muscular, bradicinesia e inestabilidad postural.

En ciertos métodos, el paciente no tiene síntomas clínicos, signos y/o factores de riesgo de ninguna enfermedad amiloidogénica, y padece al menos una enfermedad sinucleinopática. En ciertos métodos, el paciente no tiene síntomas clínicos, signos y/o factores de riesgo de ninguna enfermedad caracterizada por depósitos de amiloide extracelulares. En ciertos métodos, el paciente no tiene enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides de péptido Aβ. En ciertos métodos, el paciente no tiene síntomas clínicos, signos y/o factores de riesgo de la enfermedad de Alzheimer. En ciertos métodos, el paciente no tiene síntomas clínicos, signos y/o factores de riesgo de la enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo, deterioro cognitivo leve y síndrome de Down. En ciertos métodos, el paciente tiene una enfermedad de Alzheimer concurrente y una enfermedad caracterizada por cuerpos de Lewy. En ciertos métodos, el paciente tiene una enfermedad de Alzheimer concurrente y una enfermedad caracterizada por la acumulación de sinucleína. En ciertos métodos, el paciente tiene una enfermedad de Alzheimer concurrente y la enfermedad de Parkinson.

En los pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (p.ej., 10, 20, o 30 años). Normalmente, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que el paciente alcanza los 40, 50, 60, o 70 años. El tratamiento implica en general múltiples dosis a lo largo de un periodo de tiempo. El tratamiento se puede monitorizar ensayando el anticuerpo, o activado las respuestas de células T o células B hacia el agente terapéutico (p.ej., péptido alfa-SN o Aβ, o ambos) a lo largo del tiempo. Si la respuesta decae, está indicada una dosis de refuerzo.

Opcionalmente, se determina la presencia o ausencia de síntomas, signos o factores de riesgo de una enfermedad antes de comenzar el tratamiento.

VI. Regímenes de tratamiento

En general, los regímenes de tratamiento implican administrar a un paciente un agente eficaz para inducir una respuesta inmunógena hacia alfa-SN y/o un agente eficaz para inducir una respuesta inmunógena hacia Aβ. En las aplicaciones profilácticas, se administran las composiciones farmacéuticas o medicamentos a un paciente susceptible, o de otra manera en riesgo de padecer una LBD en un régimen que comprende una cantidad y frecuencia de administración de la composición o medicamento suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retrasar el comienzo de la enfermedad, lo que incluye los síntomas fisiológicos, bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente en el que se sospecha, o que ya padece tal enfermedad en un régimen que comprende una cantidad y frecuencia de administración de la composición suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad (fisiológicos, bioquímicos, histológicos y/o conductuales), que incluyen sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Una cantidad adecuada para llevar a cabo un tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis terapéuticamente o profilácticamente eficaz. Una combinación de cantidad y frecuencia de dosis adecuada para llevar a cabo un tratamiento profiláctico o terapéutico se define como un régimen terapéuticamente o profilácticamente eficaz. En los regímenes profilácticos y terapéuticos, los agentes se administran normalmente en varias dosis hasta que se ha alcanzado una respuesta inmunitaria suficiente. En general, se monitoriza la respuesta inmunitaria, y se administran dosis repetidas si la respuesta inmunitaria comienza a decaer.

En ciertos métodos, la administración de un agente da como resultado la reducción de los niveles intracelulares de sinucleína agregada. En ciertos métodos, la administración de un agente da como resultado la mejora de un síntoma clínico de una LBD, tal como la función motora en el caso de la enfermedad de Parkinson. En ciertos métodos, la reducción de los niveles intracelulares de sinucleína agregada o la mejora de un síntoma clínico de la enfermedad se monitoriza a intervalos tras la administración de un agente.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de las afecciones anteriormente descritas, varían dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen el medio de administración, el sitio seleccionado como objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, que incluyen los mamíferos transgénicos. Es necesario titular las dosis de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia. La cantidad de inmunógeno depende de si también se administra un adyuvante, y son necesarias dosis más elevadas en ausencia de adyuvante. La cantidad de un inmunógeno para la administración varía a veces de 1-500 μg por paciente, y más normalmente de 5-500 μg por inyección para la administración a seres humanos. Ocasionalmente, se usa una dosis mayor de 1-2 mg por inyección. En general, se usan alrededor de 10, 20, 50 ó 100 μg para cada inyección a seres humanos. La masa de inmunógeno también depende de la proporción en masa del epítopo inmunógeno en el inmunógeno respecto de la masa de inmunógeno en conjunto. En general, se usan 10−3 a 10−5 micromoles de epítopo inmunógeno por microgramo de inmunógeno. El ritmo de las inyecciones puede variar significativamente de una vez al día, a una vez al año, a una vez por década. En cualquier día determinado que se administra una dosis de inmunógeno, la dosis es mayor de 1 μg/paciente, y normalmente mayor de 10 μg/paciente si además se administra

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un adyuvante, y mayor de 10 μg/paciente y normalmente mayor de 100 μg/paciente en ausencia de adyuvante. Un régimen típico consiste en una inmunización seguida de inyecciones de refuerzo a intervalos de tiempo, tales como intervalos de 6 semanas. Otro régimen consiste en una inmunización seguida de inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses más tarde. Otro régimen implica una inyección cada dos meses de por vida. De manera alternativa, las inyecciones de refuerzo se pueden administrar de manera irregular, tal como se indica mediante la monitorización de la respuesta inmunitaria.

Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosis oscila de alrededor de 0,0001 a 100 mg/kg, y más normalmente 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal, o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg o, en otras palabras, 70 mgs o 700 mgs o dentro del intervalo de 70-700 mgs, respectivamente, para un paciente de 70 kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. En ciertos métodos, se administran de manera simultánea dos o más anticuerpos monoclonales con especificidades de unión diferentes, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado se halla dentro del intervalo indicado. El anticuerpo se administra normalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, tal como se indica midiendo los niveles sanguíneos del anticuerpo hacia alfa-SN en el paciente. En ciertos métodos, la dosis se ajusta para alcanzar una concentración de anticuerpo en plasma de 1-1000 μg/ml, y en ciertos métodos 25-300 μg/ml. De manera alternativa, el anticuerpo se puede administrar en forma de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso es necesaria una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más larga, seguido de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no humanos. La dosis y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes a lo largo de un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapéuticas, a veces es necesaria una dosis relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduce o termina, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

Las dosis para los ácidos nucleicos que codifican los inmunógenos oscilan de alrededor de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 μg a 10 mg, o 30-300 μg de ADN por paciente. Las dosis para los vectores virales infecciosos varían de 10-100, o más, viriones por dosis.

Los agentes para inducir una respuesta inmunitaria se pueden administrar mediante medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales, intracraneales, intratecales, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. La vía más típica de administración de un agente inmunógeno es la subcutánea, aunque las otras vías pueden ser igualmente eficaces. La siguiente vía más habitual es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección se lleva a cabo más generalmente en el brazo o en los músculos de la pierna. En ciertos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular en el que se han acumulado depósitos, por ejemplo mediante inyección intracraneal. Se prefiere la inyección intramuscular o la infusión intravenosa para la administración del anticuerpo. En ciertos métodos, los anticuerpos terapéuticos particulares se inyectan directamente en el cráneo. En ciertos métodos, los anticuerpos se administran en forma de una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como un dispositivo Medipad™.

Como se indicó anteriormente, se pueden administrar agentes que inducen una respuesta inmunógena contra alfa-SN y Aβ, respectivamente, en combinación. Los agentes se pueden combinar en una única preparación o equipo para el uso simultáneo, secuencial o por separado. Los agentes pueden ocupar viales distintos en la preparación o equipo, o se pueden combinar en un único vial. Estos agentes de la invención se pueden administrar opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de LBD. En el caso de la enfermedad de Parkinson y el síndrome de Down, en los que se dan LBs en el cerebro, los agentes de la invención se pueden administrar también junto con otros agentes que incrementan el paso de los agentes de la invención a través de la barrera hematoencefálica.

Los agentes inmunógenos de la invención, tales como los péptidos, a veces se administran en combinación con un adyuvante. Se puede usar una diversidad de adyuvantes en combinación con un péptido, tal como alfa-SN, para generar una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrínseca hacia un inmunógeno sin provocar cambios conformacionales en el inmunógeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, monofosforil lípido A (MPL™) 3 des-O-acilado (véase el documento GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, actualmente parte de Corixa). Stimulon™ QS-21 es un glucósido de triterpeno o saponina aislado de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina hallado en Sudamérica (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell y Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente de EE.UU. nº 5.057.540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Otros adyuvantes son emulsiones aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tales como monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), polímeros de Pluronic, y micobacterias muertas. Otro adyuvante es CpG (documento WO 98/40100). De manera alternativa, se puede acoplar alfa-SN o Aβ a un

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de aminoácidos, y agregados de lípidos (tales como gotículas de aceite o liposomas). Además, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (es decir, adyuvantes).

Para la administración parenteral, los agentes de la invención se puede administrar en forma de dosis inyectables de una disolución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol, o etanol. Además, en las composiciones puede haber presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponadoras del pH, y similares. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son los de petróleo, origen animal, vegetal, o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilen glicol o polietilen glicol son vehículos líquidos preferidos, en particular para las disoluciones inyectables. Los anticuerpos se pueden administrar en forma de una inyección de liberación lenta o una preparación para implante, que se puede formular de tal manera que permita una liberación sostenida del ingrediente activo. Una composición ejemplar comprende el anticuerpo monoclonal a 5 mg/mL, formulado en un tampón acuoso que consiste en L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 6,0 con HCl. Las composiciones para administración parenteral en general son sustancialmente estériles, sustancialmente isotónicas y fabricadas en condiciones GMP de la FDA o de un organismo similar. Por ejemplo, las composiciones que contienen productos biológicos se esterilizan en general mediante esterilización por filtración. Las composiciones se pueden formular para la administración en una única dosis.

En general, las composiciones se preparan en forma de productos inyectables, como disoluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la disolución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicolida, o copolímero para un efecto adyuvante incrementado, tal como se discutió anteriormente (véase Langer, Science 249, 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997)). Los agentes de esta invención se pueden administrar en forma de una inyección de liberación lenta o una preparación para implante, que se puede formular de tal manera que permita una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo.

Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen las formulaciones orales, intranasales y pulmonares, los supositorios, y las aplicaciones transdérmicas.

Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilen glicoles o triglicéridos; tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo del 0,5% al 10%, preferiblemente 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, y carbonato magnésico. Estas composiciones toman la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contienen un 10%-95% de ingrediente activo, preferiblemente un 25%-70%.

La aplicación tópica puede dar como resultado la administración transdérmica o intradérmica. La administración tópica se puede facilitar mediante la co-administración del agente con la toxina del cólera o derivados destoxificados

o subunidades de la misma, u otras toxinas bacterianas similares (véase Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). La co-administración se puede conseguir mediante el uso de los componentes en forma de una mezcla o en forma de moléculas unidas obtenidas mediante entrecruzamiento químico o expresión en forma de una proteína de fusión.

De manera alternativa, la administración transdérmica se puede conseguir mediante el uso de un parche cutáneo o de transferosomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).

VII. Métodos de monitorización y métodos de diagnóstico

La invención proporciona métodos para detectar una respuesta inmunitaria contra un péptido alfa-SN y/o un péptido Aβ en un paciente que padece o que es susceptible a una LBD. Los métodos son especialmente útiles para la monitorización de un curso de tratamiento que se está administrando a un paciente. Los métodos se pueden usar para monitorizar tanto el tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos como el tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos. Los métodos son útiles para monitorizar tanto la inmunización activa (p.ej., el anticuerpo producido en respuesta a la administración de un inmunógeno) como la inmunización pasiva (p.ej., midiendo el nivel del anticuerpo administrado).

1. Inmunización activa

Algunos métodos implican determinar un valor inicial de una respuesta inmunitaria en un paciente antes de administrar una dosis del agente, y comparar esto con un valor para la respuesta inmunitaria después del tratamiento. Un incremento significativo (es decir, mayor que el margen típico de error experimental en las medidas repetidas de la misma muestra, expresado como una desviación estándar de la media de tales medidas) del valor de la respuesta inmunitaria indica un resultado positivo del tratamiento (es decir, esa administración del agente ha alcanzado o aumentado una respuesta inmunitaria). Si el valor de la respuesta inmunitaria no cambia de manera significativa, o disminuye, indica un resultado negativo del tratamiento. En general, se espera que los pacientes que se someten a un curso inicial de tratamiento con un agente inmunógeno muestren un incremento de la respuesta

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menor que la media menos una desviación estándar del valor de referencia en la población de pacientes que se benefician del tratamiento), está indicada la administración de una dosis adicional de anticuerpo.

VIII. Formación de imágenes in vivo

La descripción describe métodos de formación de imágenes in vivo de LBs en un paciente. Tales métodos son útiles para diagnosticar o confirmar el diagnóstico de PD, u otra enfermedad asociada a la presencia de LBs en el cerebro,

o la susceptibilidad a ella. Por ejemplo, se pueden usar los métodos en un paciente que presenta síntomas de demencia. Si el paciente tiene LBs, es probable que el paciente padezca, p.ej., PD. Los métodos también se pueden usar en pacientes asintomáticos. La presencia de depósitos anormales de amiloide indica la susceptibilidad a una futura enfermedad sintomática. Los métodos también son útiles para monitorizar la progresión de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento en pacientes a los que previamente se les ha diagnosticado la enfermedad de Parkinson.

Los métodos funcionan administrando un reactivo, tal como un anticuerpo que se une a alfa-SN en el paciente, y después detectando el agente después de que se haya unido. Los anticuerpos preferidos se unen a los depósitos de alfa-SN en un paciente sin unirse al polipéptido NACP de longitud completa. Se prefieren especialmente los anticuerpos que se unen a un epítopo de alfa-SN en NAC. Si se desea, la respuesta de eliminación se puede evitar mediante el uso de fragmentos del anticuerpo que carecen de una región constante de longitud completa, tal como Fabs. En ciertos métodos, el mismo anticuerpo puede servir como tratamiento y como reactivo de diagnóstico. En general, los anticuerpos que se unen a epítopos N-terminales de alfa-SN no muestran una señal tan fuerte como los anticuerpos que se unen a epítopos C-terminales, supuestamente porque los epítopos N-terminales son inaccesibles en los LBs (Spillantini et al., PNAS, 1998). Por lo tanto, tales anticuerpos se prefieren menos.

Los reactivos de diagnóstico se pueden administrar mediante inyección intravenosa en el cuerpo del paciente, o directamente en el cerebro mediante inyección intracraneal o taladrando un orificio a través del cráneo. La dosis del reactivo debería estar en el mismo intervalo que para los métodos de tratamiento. En general, el reactivo está marcado, aunque en ciertos métodos, el reactivo primario con afinidad hacia alfa-SN está sin marcar, y se usa un agente marcador secundario para que se una al reactivo primario. La elección del marcador depende del medio de detección. Por ejemplo, un marcador fluorescente es adecuado para la detección óptica. El uso de marcadores paramagnéticos es adecuado para la detección tomográfica sin intervención quirúrgica. Los marcadores radiactivos también se pueden detectar mediante el uso de PET o SPECT.

El diagnóstico se lleva a cabo comparando el número, el tamaño y/o la intensidad de los lugares marcados respecto de los valores de referencia correspondientes. Los valores de referencia pueden representar los niveles medios en una población de individuos sin la enfermedad. Los valores de referencia también pueden representar los niveles previos determinados en el mismo paciente. Por ejemplo, los valores de referencia se pueden determinar en un paciente antes de comenzar el tratamiento, y los valores medidos se comparan después con los valores de referencia. Una disminución de los valores respecto de los valores de referencia indica una respuesta positiva al tratamiento.

Ejemplos

I. La inmunización de ratones transgénicos para alfa-sinucleína humana con alfa-sinucleína humana da como resultado la producción de un título elevado de anticuerpos anti-alfa-sinucleína que atraviesan la barrera hematoencefálica

Se resuspendió alfa-SN humana recombinante de longitud completa a una concentración de 1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X. Para cada inyección, se usaron 50 μl de alfa-SN; lo que proporcionó una concentración final de 50 μg por inyección, a la que se le añadieron 150 μl de PBS 1X. Después se añadió adyuvante completo de Freund (CFA) 1:1 a alfa-SN o PBS solo (control), se agitó en vórtex y se sometió a sonicación para resuspender completamente la emulsión. Para las inyecciones iniciales, ocho ratones de 4-7 meses de edad transgénicos (tg) simples para alfa-SN humana de la línea D (Masliah, et al. Science 287:1265-1269 (2000) recibieron inyecciones de alfa-SN humana en CFA y, como control, cuatro ratones tg de alfa-SN humana de la línea D recibieron inyecciones de PBS en CFA. Los ratones recibieron un total de 6 inyecciones. Tres inyecciones se llevaron a cabo a intervalos de dos semanas, y después 3 inyecciones a intervalos de un mes. Los animales se sacrificaron mediante el uso de las directrices del NIH para el tratamiento humano de animales 5 meses después del inicio del experimento. Después de recoger muestras de sangre para la determinación de los títulos de anticuerpos, los cerebros se fijaron mediante inmersión durante 4 días en un 4% de paraformaldehído en PBS. Los niveles de anticuerpos contra alfa-SN humana mediante ELISA se muestran en la Tabla 1. Los ratones tratados se dividen en dos grupos por el título. El primer grupo desarrolló un título moderado de 2-8.000. El segundo grupo desarrolló un título elevado de 12000-30000. No se halló título en los ratones de control. El análisis neuropatológico mostró que los ratones que produjeron títulos elevados tuvieron una disminución notable del tamaño de las inclusiones de sinucleína. Los ratones que produjeron títulos moderados mostraron una disminución más pequeña. La Fig. 2 (paneles a-d) muestra inclusiones de sinucleína en (a) un ratón no transgénico, (b) un ratón transgénico tratado con CFA solamente, (c) un ratón transgénico inmunizado con alfa sinucleína y CFA que desarrolló un título moderado, y

(d) un ratón transgénico inmunizado con alfa sinucleína y CFA que desarrolló un título más elevado. Las muestras se visualizaron mediante inmunotinción con un anticuerpo anti-alfa-SN humana. La Fig. 2 muestra inclusiones de

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sinucleína en el panel (b), pero no en el panel (a). En el panel (c), ratón tratado, títulos moderados, las inclusiones tienen una intensidad un poco reducida. En el panel (d), las inclusiones tienen una intensidad notablemente reducida. Los paneles (e)-(h) muestran los niveles de anti-IgG en los cerebros de los mismos cuatro ratones de los paneles (a) a (d), respectivamente. Se puede observar que IgG está presente en el panel (g), y en un grado mayor en el panel (h). Los datos muestran que los anticuerpos administrados de manera periférica hacia alfa-SN atraviesan la barrera hematoencefálica y alcanzan el cerebro. Los paneles (i) a (l) muestran la tinción para GAP, un marcador de células astrogliales, de nuevo para los mismos cuatro ratones de las dos primeras filas de la figura. Se puede observar que los paneles (k) y (l) muestran una tinción moderadamente incrementada en comparación con (i) y (j). Estos datos muestran que la eliminación de los depósitos de sinucleína va acompañada por una reacción astroglial y microglial moderada.

Tabla 1

Grupo

Genotipo n = Edad al sac. Tratamiento/Duración Títulos Inclusiones de Sin (+)/mm2

I

Tg Sin 4 10-13 meses a-sin + CFA 50 μg/iny. durante 3 meses, sac. 3 meses después 2.000 -8.000 15-29

II

Tg Sin 4 10-13 meses a-sin + CFA 50 μg/iny. durante 3 meses, sac. 3 meses después 12,000 30,000 10-22

III

Tg Sin 4 10-13 meses PBS + CFA durante 3 meses, sac. 3 meses después 0 18-29

II. Cribado in vitro en busca de anticuerpos que eliminan las inclusiones de sinucleína

Se transfectaron neuronas GT1-7 (Hsue et al. Am. J. Pathol. 157:401-410 (2000)) con un vector de expresión pCR3.1-T (Invitrogen, Carlsbad, CA) que expresaba alfa-SN murina y se compararon con las células transfectadas con el vector de expresión solo (Fig. 3, paneles B y A, respectivamente). Las células transfectadas con vector solo (panel A) tienen un aspecto fibroblástico, mientras las células transfectadas con alfa-SN son redondeadas, con cuerpos de inclusión en la superficie celular visibles por medio de microscopía óptica y de barrido confocal. Las células transfectadas se trataron después con suero preinmune de conejo (panel C) o 67-10, un anticuerpo policlonal de conejo purificado mediante afinidad contra los residuos 131-140 C-terminales de alfa-SN murina (Iwai, et al., Neuron 14:467 (1995)) (panel D). Se puede observar que los cuerpos de inclusión se tiñen menos intensamente en el panel D que en el panel C, lo que indica que el anticuerpo contra alfa sinucleína fue eficaz para eliminar o prevenir el desarrollo de las inclusiones. La Fig. 4 muestra un análisis en gel de las fracciones particuladas y citosólicas de las células transfectadas con GT1-7 tratadas con el suero preinmune de conejo y el anticuerpo policlonal 67-10. Se puede observar que los niveles de sinucleína en la fracción citosólica son iguales en gran medida mediante el tratamiento con suero preinmune o anticuerpo hacia alfa-SN. No obstante, la banda de alfa-SN desaparece en la fracción de membrana de las células GT1-7 tratadas con el anticuerpo hacia alfa-SN. Estos datos indican que la actividad del anticuerpo hacia alfa-sinucleína da como resultado la eliminación de la sinucleína asociada a la membrana celular.

Las células GT1-7 transfectadas se pueden usar para cribar anticuerpos en función de la actividad en la eliminación de las inclusiones de sinucleína con detección mediante análisis inmunohistoquímico, microscopía óptica como en la Fig. 3 o mediante análisis en gel como en la Fig. 4.

III. Eficacia profiláctica y terapéutica de la inmunización con alfa-sinucleína

i. Inmunización de ratones tg para alfa-sinucleína humana

Para este estudio, se usan ratones transgénicos (tg) para alfa-SN humana heterocigotos (Línea D) (Masliah et al., Am. J. Pathol (1996) 148:201-10) y controles no transgénicos (no tg). Los animales experimentales se dividen en 3 grupos. Para el grupo I, se ensayan los efectos preventivos de la inmunización temprana inmunizando a los ratones durante 8 meses comenzando a los 2 meses de edad. Para el grupo II, se vacunan ratones adultos jóvenes durante 8 meses comenzando a la edad de 6 meses para determinar si la inmunización puede reducir la progresión de la enfermedad una vez que se ha establecido una patología moderada. Para el grupo III, se inmunizan ratones de mayor edad durante 4 meses comenzando a la edad de 12 meses para determinar si la inmunización puede reducir la gravedad de los síntomas una vez que se ha establecido una patología intensa. Para todos los grupos, los ratones se inmunizan con alfa-SN humana recombinante más CFA o CFA solo, y para cada experimento se usan 20 ratones tg y 10 no tg. De ellos, se inmunizan 10 ratones tg con alfa-SN humana+CFA y otros 10 tg con CFA solo. De forma similar, se inmunizan 5 ratones no tg con alfa-SN humana+CFA y los otros 5 con CFA solo. Brevemente, el protocolo de inmunización consiste en una inyección inicial de alfa-SN humana recombinante purificada (2 mg/ml) en CFA, seguida de una reinyección 1 mes más tarde de alfa-SN humana en combinación con IFA. A los ratones se les reinyecta después esta mezcla una vez al mes. En un pequeño subgrupo de ratones tg para alfa-SN humana (n=3/cada uno; 6 meses de edad) y no tg (n=3/cada uno; 6 meses de edad), se llevan a cabo experimentos

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adicionales que consisten en la inmunización con alfa-SN murina (m), beta sinucleína humana o alfa-SN humana mutante (A53T).

Los niveles de anticuerpos hacia alfa-SN se determinan mediante el uso de placas de microtitulación de 96 pocillos revestidas con 0,4 μg por pocillo de alfa-SN de longitud completa purificada mediante incubación durante la noche a 4 °C en tampón de carbonato sódico, pH 9,6. Los pocillos se lavan 4X con 200 μL cada uno de PBS que contiene un 0,1% de Tween, y se bloquean durante 1 hora en PBS-1% de BSA a 37 °C. Las muestras de suero se diluyen en serie "en el pocillo", 1:3, comenzando en la fila A, oscilando de una dilución 1:150 a 1:328.050. Para los experimentos de control, se analiza una muestra de anticuerpo monoclonal de ratón con alfa-SN, sin proteína, y con blancos de tampón solamente. Las muestras se incuban durante la noche a 4 °C, seguido de una incubación de 2 horas con anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina anti-IgG de ratón de cabra (1:7500, Promega, Madison, WI). El sustrato fluorescente de fosfatasa alcalina Atto-phos® se añade después durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lee a una longitud de onda de excitación de 450 nm y una longitud de onda de emisión de 550 nm. Los resultados se representan en un gráfico semi-logarítmico con las unidades relativas de fluorescencia en el eje de ordenadas y la dilución del suero en el eje de abscisas. El título del anticuerpo se define como la dilución a la que hubo una reducción del 50% desde la unión máxima del anticuerpo.

Para cada grupo, al final del tratamiento, se somete a los ratones a una evaluación motora en Rotarod, como se describió (Masliah, et al. (2000)). Tras el análisis, se sacrifican los ratones y se extraen los cerebros para realizar un análisis neuroquímico y neuropatológico detallado como se describe más adelante. Brevemente, se congela el hemisferio derecho y se homogeneiza para las determinaciones de la inmunorreactividad de alfa-SN humana agregada y sin agregar mediante transferencia de Western (Masliah, et al. (2000)). El hemisferio izquierdo se fija en un 4% de paraformaldehído, se corta en serie en el vibratomo para el análisis inmunocitoquímico y ultraestructural.

ii. Análisis inmunocitoquímico y neuropatológico.

Para determinar si la inmunización disminuye, se inmunotiñen cortes de agregación de alfa-SN humana con un anticuerpo policlonal de conejo contra alfa-SN humana (1:500). Después de una incubación durante la noche a 4 °C, los cortes se incuban con un anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado seguido de complejo avidina D-peroxidasa de rábano (HRP) (1:200, ABC Elite, Vector). Los cortes también se inmunotiñen con anticuerpo secundario anti-conejo, ratón o humano biotinilado solo. Los experimentos con el anticuerpo secundario anti-ratón determinan si los anticuerpos contra alfa-SN humana entran en el cerebro. La reacción se visualiza con un 0,1% de tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina (DAB) en Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) con un 0,001% de H2O2, y después los cortes se montan en portaobjetos con Entellan. Los niveles de inmunorreactividad se estudian de manera semicuantitativa mediante densitometría óptica con el uso del dispositivo Quantimet 570C. Estos cortes se estudian también mediante análisis de imagen para determinar el número de inclusiones inmunorreactivas de alfa-SN, y esta medida fiable de la agregación de alfa-SN actúa como un índice valioso del efecto anti-agregación de la vacunación (Masliah, et al. (2000)).

El análisis de los patrones de la neurodegeneración se realiza analizando las densidades sinápticas y dendríticas en el hipocampo, la corteza frontal, la corteza temporal y los ganglios basales mediante la utilización de cortes de vibratomo inmunomarcados doblemente para sinaptofisina y la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2), y se visualiza con LSCM. El análisis adicional de la neurodegeneración se realiza determinando la inmunorreactividad de tirosina hidroxilasa (TH) en el caudoputamen y la sustancia negra (SN) como se describió previamente (Masliah, et al. (2000)). Se formarán imágenes de los cortes con LSCM, y a cada imagen individual se le aplica un umbral de manera interactiva, de forma que se incluyen las terminaciones inmunorreactivas para TH que exhiben una intensidad de píxeles dentro de un intervalo lineal. Se establece una escala para determinar la proporción píxel/μm. Después, esta información se usa para calcular el % de área de neuropilo cubierto por terminaciones inmunorreactivas para TH. Estos mismos cortes se utilizan también para determinar el número de neuronas TH en la SN.

Para estudiar los patrones de la respuesta inmunitaria a la inmunización, se llevan a cabo análisis inmunocitoquímicos y ultraestructurales con anticuerpos contra GFAP, MHC de clase II, Mac 1, TNF-alfa, IL1-beta e IL6 humanas en los cortes de cerebro de ratones no tg y tg para alfa-SN inmunizados con alfa-SN humana recombinante e inmunógenos de control.

iii. Análisis conductual.

Para la actividad locomotora, los ratones se analizan durante 2 días en el dispositivo Rotarod (San Diego Instruments, San Diego, CA), como se describió previamente (Masliah, et al. (2000)). El primer día, se adiestra a los ratones en 5 ensayos: El primero a 10 rpm, el segundo a 20 rpm y del tercero al quinto a 40 rpm. El segundo día, los ratones se ensayan en 7 ensayos a 40 rpm cada uno. Los ratones se colocan individualmente sobre el cilindro y se incrementa la velocidad de rotación de 0 a 40 rpm a lo largo de un periodo de 240 seg. Se registra el tiempo que los ratones permanecen sobre el rodillo (latencia de caída) y se usa como medida de la función motora.

IV. Inmunización con fragmentos de alfa-sinucleína

Se inmunizan ratones transgénicos para alfa-SN humana de 10-13 meses de edad con 9 regiones diferentes de

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alfa-SN para determinar qué epítopos producen la respuesta eficaz. Se inyectan i.p. los 9 inmunógenos diferentes y un control como se describió anteriormente. Los inmunógenos incluyen cuatro conjugados de péptidos alfa-SN humanos, todos acoplados a anti-IgG de ratón de oveja por medio de un enlace de cistina. Se usa alfa-SN y PBS como controles positivos y negativos, respectivamente. Los títulos se monitorizan como se describió anteriormente, y los ratones se sacrifican al final de los 3-12 meses de inyecciones. Tras la muerte se determina la histoquímica, los niveles de alfa-SN, y el análisis de toxicología.

i. Preparación de inmunógenos

Preparación de péptidos alfa-SN acoplados: Los conjugados de péptido alfa-SN H se preparan acoplando a través de una cisteína artificial añadida al péptido alfa-SN mediante el uso del reactivo de entrecruzamiento sulfo-EMCS. Se sintetizan los derivados de los péptidos alfa-SN con las secuencias de aminoácidos finales siguientes. En cada caso, la localización del residuo de cisteína insertado se indica mediante subrayado.

péptido 60-72 de alfa-sinucleína (región NAC):

NH2-KEQVTNVCGGAVVT-COOH (SEQ ID Nº: 54)

péptido 73-84 de alfa-sinucleína (región NAC):

NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH (SEQ ID Nº: 55)

péptido 102-112 de alfa-sinucleína:

NH2-C-ácido amino-heptanoico-KNEEGAPCQEG-COOH (SEQ ID Nº: 56)

péptido 128-140 de alfa-sinucleína:

Ac-NH-PSEEGYQDYEPECA-COOH (SEQ ID Nº: 57)

Para preparar la reacción de acoplamiento, se dializan diez mg de anticuerpo anti-IgG de ratón de oveja (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante la noche con tampón borato sódico 10 mM, pH 8,5. El anticuerpo dializado se concentra después hasta un volumen de 2 mL mediante el uso de un tubo Amicon Centriprep.

Se disuelven diez mg de sulfo-EMCS [N (ε-maleimidocuproiloxi)succinimida] (Molecular Sciences Co.) en un mL de agua desionizada. Se añade un exceso molar de 40 veces de sulfo-EMCS gota a gota con agitación al anticuerpo anti-IgG de ratón de oveja y después se agita la disolución durante otros diez min. El anticuerpo anti-IgG de ratón de oveja activado se purifica y se intercambia el tampón haciéndolo pasar a través de una columna de filtración en gel de 10 mL (Pierce Presto Column, obtenida de Pierce Chemicals) equilibrada con NaPO4 0,1 M, EDTA 5 mM, pH 6,5. Las fracciones que contienen anticuerpo, identificadas mediante absorbancia a 280 nm, se mezclan y se diluyen hasta una concentración de aproximadamente 1 mg/mL, mediante el uso de 1,4 mg por DO como coeficiente de extinción. Se disuelve un exceso molar de 40 veces de péptido alfa-SN en 20 mL de NaPO4 10 mM, pH 8,0, con la excepción de que se disuelven primero 10 mg del péptido alfa-SN en 0,5 mL de DMSO y después se diluye hasta 20 mL con el tampón de NaPO4 10 mM. Las disoluciones de péptido se añaden cada una a 10 mL de anticuerpo anti-IgG de ratón de oveja activado y se agitan a temperatura ambiente durante 4 hr. Los conjugados resultantes se concentran hasta un volumen final de menos de 10 mL mediante el uso de un tubo Amicon Centriprep, y después se dializan con PBS para intercambiar el tampón y eliminar el péptido libre. Los conjugados se hacen pasar a través de filtros de un tamaño de poro de 0,22 μm para la esterilización, y después se alicuotan en fracciones de 1 mg y se almacenan congelados a -20 °C. Las concentraciones de los conjugados se determinan mediante el uso del ensayo de proteínas BCA (Pierce Chemicals) con IgG de caballo para la curva patrón. La conjugación se documenta mediante el incremento del peso molecular de los péptidos conjugados respecto del anticuerpo anti-IgG de ratón de oveja activado.

V. Inmunización pasiva con anticuerpos hacia alfa-sinucleína

Se inyecta a ratones de alfa-SN humana 0,5 mg de anticuerpos monoclonales anti-alfa-SN en PBS como se muestra más adelante. Todas las preparaciones de anticuerpos se purifican para que tengan niveles bajos de endotoxinas. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales contra un fragmento inyectando el fragmento o la forma más larga de alfa-SN en un ratón, preparando hibridomas y cribando los hibridomas en busca del anticuerpo que se une de manera específica a un fragmento deseado de alfa-SN sin unirse a otros fragmentos no solapantes de alfa-SN.

Se inyecta ip a los ratones según sea necesario a lo largo de un periodo de 4 meses para mantener una concentración de anticuerpos circulantes medida mediante el título de ELISA mayor de 1:1000 definido mediante ELISA hacia alfa-SN u otro inmunógeno. Los títulos se monitorizan como se describió anteriormente, y los ratones se sacrifican al final de los 6 meses de inyecciones. La histoquímica, los niveles de alfa-SN y la toxicología se llevan a cabo tras la muerte.

VI. Inmunización con Aβ de ratones transgénicos Sin/APP

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Este experimento compara los efectos de la inmunización con Aβ sobre tres tipos de ratones transgénicos: ratones transgénicos con un transgén de alfa sinucleína (SIN), ratones APP con un transgén de APP (Games et al.), y ratones SIN/APP doblemente transgénicos producidos cruzando los transgénicos simples. Los ratones doblemente transgénicos se describen en Masliah et al., PNAS USA 98:12245-12250 (2001). Estos ratones representan un 5 modelo de individuos que tienen tanto la enfermedad de Alzheimer como la enfermedad de Parkinson. La Tabla 2 muestra los diferentes grupos, la edad de los ratones usados en el estudio, el procedimiento de tratamiento y el título de anticuerpos hacia Aβ. Se puede observar que se generó un título significativo en los tres tipos de ratones. La Fig. 5 muestra el % de área cubierto por placas amiloides de Aβ en el cerebro determinado mediante el examen de microscopía de los cortes de cerebro de los sujetos tratados. Se acumulan depósitos sustanciales en los ratones 10 APP y SIN/APP, pero no en los ratones SIN o en los controles no transgénicos. Los depósitos son mayores en los ratones doblemente transgénicos SIN/APP. La inmunización con Aβ1-42 reduce los depósitos en los ratones APP y SIN/APP. La Fig. 6 muestra los depósitos de sinucleína en los diversos grupos de ratones tal como se detecta mediante microscopía de barrido láser confocal y microscopía óptica. Se acumulan depósitos de sinucleína en los ratones SIN y SIN/APP tratados con CFA solamente. Sin embargo, en los mismos tipos de ratones tratados con 15 Aβ1-42 y CFA, existe una reducción notable del nivel de depósito de sinucleína. Estos datos indican que el tratamiento con Aβ es eficaz no solamente en la eliminación de los depósitos de Aβ, sino también en la eliminación de los depósitos de sinucleína. Por lo tanto, el tratamiento con Aβ o anticuerpos hacia él es útil para tratar no solamente la enfermedad de Alzheimer, sino también la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson combinadas, y la enfermedad de Parkinson en pacientes sin la enfermedad de Alzheimer. El título de los anticuerpos 20 anti-Aβ en los ratones SIN/APP se correlaciona con la formación disminuida de inclusiones de sinucleína (r=−0,71,

p<0,01).

Tabla 2

Grupo

n= Edad Tratamiento/Duración Títulos de Ab

SIN

4 12-20 meses Ab iny. 50 μg/iny. durante 6 meses 10.000-58.000

SIN

2 12-20 meses Sol. sal. iny. durante 6 meses 0

APP

2 12-20 meses Ab iny. 50 μg/iny. durante 6 meses 25.000

APP

2 12-20 meses Sol. sal. iny. durante 6 meses 0

SIN/APP

4 12-20 meses Ab iny. 50 μg/iny. durante 6 meses 1.000-50.000

SIN/APP

2 12-20 meses Sol. sal. iny. durante 6 meses 0

Claims (1)

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