ES2552556T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de defectos óseos con poblaciones de células placentarias - Google Patents

Métodos y composiciones para el tratamiento de defectos óseos con poblaciones de células placentarias Download PDF

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ES2552556T3 ES13162390.2T ES13162390T ES2552556T3 ES 2552556 T3 ES2552556 T3 ES 2552556T3 ES 13162390 T ES13162390 T ES 13162390T ES 2552556 T3 ES2552556 T3 ES 2552556T3
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Marian Guelakis
Mohammad A. Heidaran
Kristen Labazzo
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Abstract

Células adherentes placentarias osteogénicas aisladas para uso en un método de tratamiento de defectos óseos en un sujeto por administración de dichas células a dicho sujeto, en donde dichas células se obtienen a partir de corion, y son adherentes a plástico de cultivo de tejidos, y en donde dichas células son negativas para CD200 o son CD200tenue, y positivas para CD105.

Description

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DESCRIPCION
Metodos y composiciones para el tratamiento de defectos oseos con poblaciones de celulas placentarias
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/090.898, presentada el 22 de agosto de 2008, y de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/090.897, presentada el 22 de agosto, 2008.
1. Campo
La invencion se refiere en general a poblaciones aisladas de celulas placentarias adherentes osteogenicas (OPAC, por sus siglas en ingles) y a metodos de uso de OPAC, p.ej. en el tratamiento de mieloma multiple, y disminucion, detencion o inversion de perdia osea asociada con o causada por mieloma multiple.
2. Antecedentes
El mieloma multiple (tambien conocido como MM, mieloma, mieloma de celulas plasmaticas o enfermedad de Kahler) es un tipo de cancer de las celulas plasmaticas, que son celulas del sistema inmune que producen anticuerpos. Los smtomas del mieloma multiple incluyen dolor oseo, infeccion, insuficiencia renal, anemia y lesiones oseas. La enfermedad es considerada incurable y solo unos pocos tratamientos, tales como lenalidomida (REVLIMID®) estan disponibles y parecen prometedores. En este sentido, existe una necesidad de nuevos tratamientos para el mieloma multiple.
3. Compendio
La invencion se refiere a celulas adherentes placentarias osteogenicas (OPAC) aisladas, poblaciones de OPAC y poblaciones de celulas que comprenden OPAC, en donde las OPAC estan presentes en el corion y se afslan del mismo. En ciertas realizaciones, las OPAC no estan aisladas del contorno corionico (liso). Las OPAC exhiben una o mas caractensticas de las celulas madre o celulas multipotentes (por ejemplo, exhiben marcadores asociados con las celulas madre o celulas multipotentes, se replican al menos 10-20 veces en cultivo en un estado no diferenciado, se diferencian en celulas adultas representativas de al menos una de las tres capas germinales, etc.) y pueden adherirse a un sustrato para cultivo tisular (por ejemplo, plastico para cultivo tisular tal como la superficie de un plato o placa de multiples pocillos para cultivo tisular). Concretamente, la invencion proporciona metodos de uso de OPAC en el tratamiento de defectos oseos, y en el tratamiento de cancer relacionado con los huesos, p.ej., mieloma multiple, y metodos de uso de las OPAC para reducir, detener o revertir la perdida osea asociada con mieloma multiple o causada por el mismo.
Una OPAC aislada para uso de acuerdo con la invencion es una celula adherente placentaria osteogenica aislada que es adherente a plastico para cultivo tisular, osteogenica y aislada del corion, excluyendo el contorno corionico (liso). Las OPAC no son trofoblastos, citotrofoblastos, celulas madre embrionarias ni celulas germinales embrionarias, ya que esas celulas son conocidas y se entienden en la tecnica.
De acuerdo con la invencion, una OPAC es una celula CD200" o CD200tenue aislada, por ejemplo, una que esta aislada del corion, pero no del contorno corionico (liso). Ademas, la OPAC es positiva para CD105. En una realizacion espedfica, una OPAC es osteogenica. En una realizacion espedfica, una OPAC es positiva para la secrecion de osteoprotegerina (OPG), por ejemplo, segun se detecta por citometna de flujo. La osteoprotegerina es un receptor senuelo secretado por osteoblastos que se une espedficamente al factor de diferenciacion de osteoclastos (ODF) e inhibe la maduracion de osteoclastos. Por lo tanto, las OPAC promueven la formacion osea y reducen la perdida osea mediada por osteoclastos. En otra realizacion espedfica, una OPAC no expresa RANKL (Receptor activador del ligando del factor nuclear k B; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank AAB86811.1), por ejemplo, segun se detecta por RT-PCR cuantitativa. RANKl es una protema que activa osteoclastos, que participan en la resorcion osea. Por lo tanto, las OPAC no promueven la resorcion osea. Asf, de acuerdo con la invencion, una OPAC es CD200" o CD200tenue y CD105+. En otra realizacion espedfica, una OPAC es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso (ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NP_001604), negativa para RANKL o positiva para la expresion de NG2 (proteoglicano de sulfato de condroitina de celula neuroglial 2), por ejemplo, segun se determina por la tincion de anticuerpos. En ciertas realizaciones, la tincion para dicho NG2 en las OPAC es difusa, en comparacion con celulas madre placentarias adherentes al plastico para cultivo tisular CD200+ (no tenue), en las cuales la tincion de NG2 esta enfocada. En otra realizacion espedfica, una OPAC es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para RANKL, positiva para la expresion de NG2 y positiva para la secrecion de osteoprotegerina. En otra realizacion espedfica, una OPAC exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible, por ejemplo, segun se determina por un ensayo colorimetrico. En una realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200' o CD200tenue, CD105+, segun se detecta mediante citometna de flujo, y es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200- o CD200tenue, CD105+ y es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina y exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible.
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En otra realizacion espedfica, una OPAC es SSEA3+ o SSEA4+. En una realizacion mas espedfica, una OPAC es SSEA3+ y SSEA4+. En otra realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200", CD105+, SSEA3+ y tambien es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200", CD105+, SSEA4+ y tambien es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200-, CD105+, SSEA3+, SSEA4+ y tambien es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible.
En ciertas realizaciones, la OPAC, poblacion de OPAC o poblacion de celulas que comprenden las OPAC facilita la formacion de una matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
La invencion tambien se refiere a poblaciones de celulas que comprenden OPAC, en donde la poblacion de celulas es CD200- o CD200tenue. Por ejemplo, una poblacion aislada de celulas que comprenden OPAC no esta aislada del contorno corionico (liso) y es CD20o- o CD200tenue. La poblacion de celulas puede consistir esencialmente en OPAC y ser osteogenica. Dicha poblacion de celulas puede ser CD200- y CD105+ segun se detecta por citometna de flujo, o CD200tenue y CD105+ segun se detecta por citometna de flujo. Dicha poblacion de celulas puede ser negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, positiva para la expresion de NG2, o positiva para la secrecion de osteoprotegerina. La tincion para dicho NG2 en las OPAC puede ser difusa, en comparacion con celulas madre placentarias adherentes al plastico para cultivo tisular CD2O0+ (no tenue), en las cuales la tincion de NG2 esta enfocada. Dicha poblacion de celulas puede ser negativa para la expresion de RANKL, por ejemplo, segun se detecta por RT-PCR cuantitativa. Dicha poblacion de celulas puede ser negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, positiva para la expresion de NG2 y positiva para la secrecion de osteoprotegerina. Dicha poblacion de celulas puede exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible. Concretamente, dicha poblacion puede ser CD200-, CD105+ o CD200tenue, CD105+ y tambien ser una o mas de negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de nG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible. Mas espedficamente, dicha poblacion de celulas puede ser CD200-, CD105+ o CD200tenue, CD105+; ser negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina y exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible.
Dicha poblacion de celulas puede ser SSEA3+ o SSEA4+. Alternativamente, dicha poblacion de celulas puedee ser SSEA3+ y SSEA4+. Dicha poblacion de celulas puede ser CD200', CD105+ o CD200tenue, CD105+, SSEA3+ y tambien negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible. Mas espedficamente, dicha poblacion de celulas puede ser CD200- o CD200tenue, ser CD105+ y SSEA4+ y tambien ser negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible. Mas espedficamente, dicha poblacion de celulas puede ser CD200- o CD200tenue, ser CD105+, SSEA3+, SSEA4+, negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina y/o exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible.
La poblacion de celulas que comprende OPAC puede expresar una metalopeptidasa de la matriz 9 (MMP9) a un nivel notoriamente mas alto en un medio osteogenico que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes CD200+, no tenues, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
La OPAC para uso de acuerdo con la invencion puede expresar uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes CD200+, no tenues, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP3 (protema morfogenetica osea 3), CDH11 (cadherina tipo II), COL10A1 (colageno tipo X, alfa 1), COL14A1 (colageno, tipo XIV, alfa 1), COL15A1 (colageno, tipo XV, alfa l), DMP1 (fosfoprotema acida de la matriz de la dentina 1), DSPP (sialofosfoprotema de la dentina), ENAM (enamelina), FGFR2 (receptor del factor 2 de crecimiento de fibroblastos), MMP10 (metaloproteasa de la matriz 10 (estromelisina 2)), TGFB3 (factor de transformacion de crecimiento, p3) y/o TGFBR1 (factor de transformacion de crecimiento p, receptor 1) cuando una OPAC y dicha celula madre placentaria CD200+ se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes CD200+, no tenues, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AMBN (ameloblastina (protema de la matriz del esmalte)), BMP2 (protema morfogenetica osea 2), CALCR (receptor de calcitonina), CDH11, COL11A1 (colageno, tipo XI, alfa 1), cOl14A1, COL15A1, COL2A1 (colageno, tipo II, alfa 1), CSF2 (factor 2 de estimulacion de colonias (granulocito-macrofago)), CSF3 (factor 3 de estimulacion de colonias (granulocito)), DMP1, DSPP, ENAM, FGF3 (factor 3 de crecimiento de fibroblastos), GDF10 (factor 10 de diferenciacion de crecimiento), IGF1 (factor 1 de crecimiento similar a la insulina),
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ITGA1 (integrina, alfa 1 (CD49)), ITGA2 (integrina, alfa 2 (CD49B)), MMP8 (metaloproteasa de la matriz 8 (colagenasa de neutrofilos)), MMP9 (metalopeptidasa de la matriz 9 (gelatinasa B, gelatinasa de 92 kDa, colagenasa tipo IV de 92 kDa)), MMP10, PDGFA (factor de crecimiento A derivado de plaquetas), SMAD1 (miembro de la familia SMAD 1), TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 (factor de transformacion de crecimiento beta, receptor 2) cuando las OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CDH11, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si las OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AHSG (glicoprotema alfa-2-HS), ALPL (fosfatasa alcalina de dgado/hueso/rinon), EGF (factor de crecimiento epidermico), FLT1 (tirosina quinasa 1 relacionada con fms (factor de crecimiento endotelial vascular/receptor del factor de permeabilidad vascular)), IGF2, ITGA2, ITGAM (integrina, alfa M (subunidad 3 del receptor del componente 3 del complemento)), SCARB1 (receptor depurador clase B, miembro 1), SOX9 (SRY (region de determinacion sexual Y)-caja 9), TNF (factor de necrosis tumoral), TWIST1 (homologo 1 de Twist; anteriormente blefarofimosis, epicanto inverso y ptosis 3, acrocefalosindactilia 3), VCAM1 (molecula 1 de adhesion celular vascular 1) y/o VDR (receptor de vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3)) cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias, CD200+, no tenues, adherentes, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BGN (biglicano), COL11A1, COMP (protema oligomerica de la matriz del cartflago) FGF1 y/o VCAM1 cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan VCAM1 a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP4, CALCR, CD36, CDH11, COL12A1, COL14A1, COL15A1, COL3A1, COL5A1, DMP1, DSPP, FLT1, MSX1, PDGFA, TGFB3, TGFBR1 y/o TUFT1 (Tuftelina 1), cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AMBN, CALCR, COL14A1, COL15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1, ITGA2, MMP10, MMP9, MSX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CALCR, COL14A1; COL15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL, BGLAP (protema (gla) osea gamma-carboxiglutamato), IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1 y/o SOX1, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, BMP3, BMP5, CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, COL2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR2, IGF2, MMP8, PHEX (homologo de la endopeptidasa reguladora de fosfato, ligada a X), RUNX2 (factor de transcripcion 2 relacionado con Runt), SCARB1, SOX1, VCAM1
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y/o VEGFB, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de pCr cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion espedfica, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL, bGlAP, IGF2, SCARB1 y/o SOX9, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion mas espedfica de cada una de las realizaciones anteriores, las OPAC y dichas celulas madre placentarias CD200+ o celulas madre mesenquimales se han sometido a un numero equivalente de pases o duplicaciones celulares.
En otra realizacion, un gen que codifica metalopeptidasa de la matriz 9 (MMP9) se induce en dichas OPAC en un medio osteogenico, en comparacion con la expresion de MMP9 en un medio de crecimiento, al menos 2, 3, 4 o 5 ordenes de magnitud mas que lo que dicha MMP9 se induce en celulas madre placentarias, por ejemplo, celulas placentarias multipotentes adherentes al cultivo tisular CD34-, CD10+, CD105+, en dicho medio osteogenico, en comparacion con la expresion de MMP9 en dicho medio de crecimiento, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En otra realizacion, un gen que codifica metalopeptidasa de la matriz 9 (MMP9) se induce en dichas OPAC en un medio osteogenico, en comparacion con la expresion de MMP9 en un medio de crecimiento, al menos 2, 3, 4 o 5 ordenes de magnitud mas que lo que dicha MMP9 se induce en celulas madre mesenquimales (MSC) derivadas de medula osea en dicho medio osteogenico, en comparacion con la expresion de MMP9 en dicho medio de crecimiento, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En otra realizacion, un gen que codifica metalopeptidasa de la matriz 9 (MMP9) se induce en dichas OPAC en un medio osteogenico, en comparacion con la expresion de MMP9 en un medio de crecimiento, al menos 2, 3, 4 o 5 ordenes de magnitud mas que lo que dicha MMP9 se induce en fibroblastos en dicho medio osteogenico, en comparacion con la expresion de MMP9 en dicho medio de crecimiento, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las celulas en una poblacion de celulas que comprenden OPAC pueden ser CD200- y/o CD200tenue. Alternativamente, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las OPAC en una poblacion de celulas que comprenden OPAC son CD200- y/o CD200tenue.
Una poblacion aislada de OPAC puede producirse aislando el tejido corionico de una placenta, en donde dicho tejido corionico no es un tejido del contorno corionico (liso); digiriendo el tejido corionico aislado con una enzima que altera el tejido para obtener una poblacion de celulas corionicas que comprenden OPAC; y aislando dichas OPAC de dichas celulas corionicas. La enzima que altera el tejido puede ser tripsina, dispasa o colagenasa. Las OPAC, contenidas dentro de una poblacion de celulas obtenidas de digerir tejido corionico, pueden ser al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99,5% de dicha poblacion de celulas corionicas.
Las OPAC, y poblaciones de celulas que comprenden OPAC, incluyen OPAC y poblaciones de celulas que contienen OPaC que han sido cultivadas, por ejemplo, para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas pases o para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 duplicaciones de poblaciones. Las poblaciones de OPAC tambien incluyen poblaciones de, por ejemplo, dos o mas, OPAC en cultivo y una poblacion en un recipiente, por ejemplo, una bolsa.
En la presente memoria tambien se divulga un metodo para producir celulas osteogenicas con la capacidad de mineralizar una matriz que comprende cultivar una pluralidad de OPAC o una poblacion de OPAC aisladas, en condiciones en las cuales dichas OPAC se diferencian en celulas osteogenicas, llevandose a cabo dicho cultivo por un tiempo suficiente para que dichas celulas osteogenicas produzcan o faciliten la produccion de cantidades detectables de matriz mineralizada que comprende calcio y/o fosfato. De acuerdo con la invencion, las OPAC producen o facilitan la produccion de hueso.
Las OPAC para uso de acuerdo con la invencion se pueden formular como una composicion, por ejemplo, una composicion implantable. En una realizacion espedfica, la composicion implantable comprende una matriz. En una realizacion mas espedfica, dicha matriz es un andamio tridimensional. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende colageno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, oritina o vitronectina. En otra realizacion mas espedfica, la matriz es una membrana amniotica o un biomaterial derivado de una membrana amniotica. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende una protema de membrana extracelular. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto sintetico. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra realizacion mas espedfica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citoquina, anticuerpo o molecula organica de menos de 5.000 daltones. En algunas realizaciones, la matriz es un polfmero degradable sintetico tal como, por ejemplo, acido polilactico o acido poliglicolico. En algunas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de p-fosfato- colageno tricalcico, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno plecentario humano mineralizado, un sustrato de acido hialuronico o un sustrato ceramico. En algunas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico. En algunas realizaciones, el sustrato de andamio
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implantable es un sustrato de p-fosfato-colageno tricalcico. En algunas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de colageno. En algunas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de fosfato de calcio. En algunas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de colageno placentario humano mineralizado.
De acuerdo con la invencion, tratar defectos oseos en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composicion inyectable o implantable que comprende una poblacion de OPAC definidas en la presente anteriormente, tratando asf el defecto oseo en el sujeto. En ciertas realizaciones, el defecto oseo es una lesion osteolttica asociada con un cancer, una fractura osea o una columna vertebral, por ejemplo, que necesita fusion. En ciertas realizaciones, la lesion osteolttica esta asociada con mieloma multiple, cancer oseo o cancer metastasico. En ciertas realizaciones, la fractura osea es una fractura no consolidada. En ciertas realizaciones, una composicion implantable se implanta quirurgicamente, por ejemplo, en el sitio del defecto oseo. En ciertas realizaciones, una composicion inyectable se administra quirurgicamente a la region del defecto oseo. En ciertas realizaciones, la composicion inyectable se administra sistemicamente.
Ademas en la presente se describe un metodo para producir celulas osteogenicas que comprenden cultivar una pluralidad de OPAC o una poblacion de OPAC aisladas en condiciones en las cuales dichas OPAC se diferencian en celulas osteogenicas, llevandose a cabo dicho cultivo por un tiempo suficiente para que dichas celulas osteogenicas produzcan o faciliten la produccion de cantidades detectables de calcio mineralizado, tejido oseo o hueso.
Una composicion inyectable puede formularse combinando una poblacion de OPAC con acido hialuronico o colageno inyectable. La composicion puede comprender acido hialuronico inyectable o colageno inyectable.
Ademas, en la presente se divulgan metodos para tratar individuos que tienen un cancer relacionado con los huesos, por ejemplo, mieloma multiple, cancer oseo, cancer de mama, cancer de pulmon, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, cordoma, histiocitoma maligno fibroso oseo, fibrosarcoma oseo, cancer metastasico, mieloma multiple y cualquier forma de cancer metastasico caracterizado por metastasis oseas. Un metodo de tratamiento de un individuo que tiene un cancer relacionado con los huesos comprende administrar a dicho individuo OPAC aisladas, por ejemplo, una poblacion aislada de celulas que comprende OPAC, en donde dichas OPAC se obtienen del corion y son adherentes al plastico para cultivo tisular y en donde dichas OPAC son negativas para CD200 o son CD200tenue y positivas para CD105 y donde dicha administracion reduce notoriamente el avance, detiene el avance o mejora uno o mas smtomas de dicho mieloma multiple. Dichas OPAC pueden ser SSEA3+ o SSEA4+. Dichas OPAC pueden ser SSEA3+ y SSEA4+. Las OPAC pueden ser CD200-, CD105+, SSEA3+ y tambien ser negativas para la expresion de a-actina de musculo liso, negativas para la expresion de RANKL, positivas para la expresion de NG2, positivas para la expresion de osteoprotegerina o exhiben actividad de fosfatasa alcalina inducible. Mas espedficamente, las OpAC pueden ser CD200" y/o CD200tenue, CD105+, SSEA4+ y tambien ser negativas para la expresion de a-actina de musculo liso, negativas para RANKL, positivas para la expresion de NG2, positivas para la expresion de osteoprotegerina o exhiben actividad de fosfatasa alcalina inducible. Mas espedficamente, las OPAC son CD200- y/o CD200tenue, CD105+, SSEA3+, SSEA4+ y tambien son negativas para la expresion de a-actina de musculo liso, negativas para RANKL, positivas para la expresion de NG2, positivas para la expresion de osteoprotegerina o exhiben actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otras realizaciones espedficas, las OPAC comprenden cualquiera de las caractensticas o combinaciones de caractensticas enumeradas en la Seccion 5.1, mas adelante.
En otra realizacion espedfica de la presente invencion, dichas OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes, CD200+, no tenues, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de bMp3, CDH11, COL10A1, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, FGFR2, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1, cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias CD200+ se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC para uso en los metodos de tratamiento expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AMBN, BMP2, CALCR, CDH11, COL11A1, COL14A1, COL15A1, COL2A1, CSF2, CSF3, DMP1, DSPP, ENAM, FGF3, GDF10, IGF1, ITGA1, ITGA2, MMP10, MMP8, MMP9, PDGFA, SMAD1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Por ejemplo, dichas OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CDH11, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de pCr cuantitativa en tiempo real.
Alternativamente, dichas OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AHSG, ALPL, EGF, FLT1, IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1, SOX9, TNF, TWIST1,
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VCAM1 o VDR cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC pueden expresar uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias, CD200+, no tenues, adherentes, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BGN, COL11A1, COMP, FGF1 y/o VCAM1 cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de pCr cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC pueden expresar VCAM1 a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC pueden expresar uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP4, CALCR, CD36, CDH11, COL12A1, COL14A1, COL15A1, COL3A1, COL5A1, DMP1, DSPP, FLT1, MSX1, PDGFA, TGFB3, TGFBR1 y/o TUFT1, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC pueden expresar uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AMBN, CALCR, COL14A1, COL15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1, ITGA2, MMP10, MMP9, MSX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC pueden expresar uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CALCR, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC pueden expresar uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL, BGLAP (protema (gla) osea gamma-carboxiglutamato), IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1 y/o SOX1, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC pueden expresar uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, BMP3, BMP5, CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, COL2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR2, IGF2, MMP8, PHEX, RUNX2, SCARB1, SOX1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Dichas OPAC pueden expresar uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL, BGLAP, IGF2, SCARB1 y/o SOX9, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Lo que se utiliza para tratar mieloma multiple, dichas OPAC: expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BMP4, BMP6, CD36, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, CSF2, CTSK, FGF2, FGFR1, FLT1, ITGA1, MINPP1, MMP9, MSX1, PDGFA, SERPINH1, TGFB3 y TGFBR1, en donde dichas OPAC y dichas celulas madre mesenquimales se han sometido a un numero equivalente de pases o duplicaciones celulares; o expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas de fibroblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BMP4, BMP6, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, FLT1, IGF1R, ITGA1, MINPP1, PDGFA, SERPINH1, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TNF, TUFT1, VCAM1 y VEGFA y en donde dichas celulas de fibroblastos se han sometido a un numero equivalente de pases o duplicaciones celulares.
Dichas OPAC para tratar mieloma multiple secretan una o mas de las protemas decorina, epirregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, protema de union a TGF-beta latente 1 (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF- beta R1/ALK5 o TIMP-2. Mas espedficamente, dichas OPAC secretan las protemas decorina, epirregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, protema de union a TGF-beta latente 1 (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF- beta R1/ALK5 y TIMP-2.
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Los smtomas del mieloma multiple son dolor oseo, lesiones osteocfticas (por ejemplo, visibles mediante rayos X o imagen de resonancia magnetica (MRI)), osteoporosis, anemia, hipercalcemia o un smtoma debido a hipercalcemia o insuficiencia renal. La administracion de OPAC provoca un aumento detectable o una disminucion de la reduccion de la densidad mineral osea o contenido mineral oseo en dicho individuo. Al menos 1 x 108 OPAC/kg se puede administrar a un individuo, donde dicho individuo nunca ha sido tratado por mieloma multiple; dicho individuo ha sido tratado por mieloma multiple y responde a una terapia sin OPAC; dicho individuo ha sido tratado por mieloma multiple y no ha respondido a una terapia sin OPAC, pero el mieloma multiple en dicho individuo no ha progresado; o dicho individuo tiene mieloma multiple progresivo.
Un metodo para tratar defectos oseos en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composicion inyectable o implantable que comprende una poblacion de OPAC, tratando asf el defecto oseo en el sujeto. En ciertas realizaciones, el defecto oseo es (a) una lesion osteolftica asociada con un cancer, (b) una fractura osea, (c) una columna vertebral que necesita fusion, (d) una fractura no consolidada o (e) osteoporosis. En ciertas realizaciones, la lesion osteolftica esta asociada con mieloma multiple, cancer oseo o cancer metastasico. En ciertas realizaciones, la fractura osea es una fractura no consolidada. En ciertas realizaciones, se administra una composicion implantable que comprende una poblacion de OPAC a un sujeto. En ciertas realizaciones, la composicion implantable se implanta quirurgicamente. En ciertas realizaciones, se administra una composicion inyectable que comprende una poblacion de OPAC a un sujeto. En ciertas realizaciones, la composicion inyectable se administra quirurgicamente a la region del defecto oseo. En ciertas realizaciones, la composicion inyectable se administra sistemicamente.
Un metodo para tratar defectos oseos en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composicion inyectable o implantable que comprende una poblacion de OPAC, en donde dichas OPAC provocan o facilitan la formacion de hueso o tejido oseo en el sujeto, tratando asf el defecto oseo en el sujeto. En ciertas realizaciones, el defecto oseo es (a) una lesion osteolftica asociada con un cancer, (b) una fractura osea, (c) una columna vertebral que necesita fusion, (d) una fractura no consolidada o (e) osteoporosis. En ciertas realizaciones, la lesion osteolftica esta asociada con mieloma multiple, cancer oseo o cancer metastasico. En ciertas realizaciones, la fractura osea es una fractura no consolidada. En ciertas realizaciones, se administra una composicion implantable que comprende una poblacion de OPAC a un sujeto. En ciertas realizaciones, la composicion implantable se implanta quirurgicamente. En ciertas realizaciones, se administra una composicion inyectable que comprende una poblacion de OPAC a un sujeto. En ciertas realizaciones, la composicion inyectable se administra quirurgicamente a la region del defecto oseo. En ciertas realizaciones, la composicion inyectable se administra sistemicamente.
3.1 Definiciones
Tal como se utiliza en la presente, "que consiste esencialmente en", en el contexto de una poblacion de celulas que comprenden OPAC, significa que la poblacion de celulas es, por ejemplo, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 95% o al menos 95,5% OPAC.
Tal como se utiliza en la presente, los terminos "OPAC" y "las OPAC" se refieren a las celulas descritas en la Seccion 5.1, mas adelante.
Tal como se utiliza en la presente, "CD200tenue", cuando se refiere a una celula, significa que la celula exhibe intensidad de fluorescencia para CD200 en citometna de flujo que no es mayor que 20-30% sobre el testigo de isotipo. Tal como se utiliza en la presente, una poblacion de celulas es CD200tenue si al menos 60% de las celulas en la poblacion no expresan CD200 o son CD200tenue y la poblacion de celulas, en su totalidad, en un ensayo citometrico de flujo, exhibe una intensidad de fluorescencia de CD200 que no es mayor que 40-60% sobre el testigo de isotipo. Cabe senalar que una poblacion CD200tenue puede comprender celulas CD200+ (no tenues).
Tal como se utiliza en la presente, el termino "SH2" se refiere a un anticuerpo que se une a un epftopo en el marcador CD105. Por lo tanto, las celulas denominadas SH2+ son CD105+.
Tal como se utiliza en la presente, los terminos "SH3" y "SH4" se refieren a anticuerpos que se unen a epftopos presentes en el marcador CD73. Por lo tanto, las celulas denominadas SH3+ y/o SH4+ son CD73+.
Tal como se utiliza en la presente, la expresion "OPAC aislada" significa una OPAC que esta basicamente separada de otra no OPAC del tejido, por ejemplo, corion, del cual se derivan las OPAC. Una OPAC esta "aislada" si al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o al menos 99% de las no OPAC con las cuales las OPAC estan naturalmente asociadas se retiran de las OPAC, por ejemplo, durante la recoleccion y/o cultivo de las OPAC.
Tal como se utiliza en la presente, la expresion "poblacion de celulas aisladas" significa una poblacion de celulas que esta basicamente separada de otras celulas del tejido, por ejemplo, placenta, de la cual se deriva la poblacion de celulas. Una poblacion de OPAC esta "aislada" si al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o al menos 99% de las celulas con las cuales la poblacion de OPAC, o celulas de las cuales la poblacion de OPAC se deriva, esta asociada naturalmente se retiran de la poblacion de OPAC, por ejemplo, durante la recoleccion y/o cultivo.
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Tal como se utiliza en la presente, la expresion "celula madre placentaria" se refiere a una celula madre o celula progenitora que se deriva de una placenta de mairnfero, independientemente de la morfolog^a, marcadores de superficie celular o el numero de pases despues de un cultivo primario. Sin embargo, la expresion "celula madre placentaria", tal como se utiliza en la presente, no se refiere a trofoblastos. Una celula es considerada una "celula madre" si la celula retiene al menos un atributo de una celula madre, por ejemplo, un perfil de marcador o expresion genica asociado con uno o mas tipos de celulas madre; la capacidad de replicarse al menos 10-40 veces en cultivo, la capacidad de diferenciarse en celulas de las tres capas germinales; la falta de caractensticas de celulas adultas (es decir, diferenciadas) o similares. Las expresiones "celula madre placentaria" y "celula madre derivada de placenta" pueden utilizarse de forma intercambiable.
Tal como se utiliza en la presente, una celula es "positiva" para un marcador particular cuando el marcador es detectable. Por ejemplo, una OPAC es positiva para, por ejemplo, CD105 debido a que CD105 es detectable en celulas madre placentarias en una cantidad notoriamente mayor que el antecedente (en comparacion con, por ejemplo, un testigo de isotipo). Una celula tambien es positiva para un marcador cuando ese marcador puede utilizarse para distinguir la celula de al menos otro tipo de celula o puede utilizarse para seleccionar o aislar la celula cuando este presente o expresada por la celula, de manera similar, una poblacion de celulas es positiva para un marcador cuando, por ejemplo, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de las celulas en la poblacion expresan el marcador.
Tal como se utiliza en la presente, una "celula osteogenica" es una celula que es capaz de depositar hidroxiapatita, el componente principal del hueso, o diferenciarse en una celula que es capaz de depositar hidroxiapatita. Se contempla especialmente que una "celula osteogenica" abarca una celula comunmente denominada osteoblasto u osteocito. Ver la Seccion 5.1.6, mas adelante, para condiciones ejemplares en las cuales una celula adherente placentaria osteogenica puede diferenciarse en una celula que puede depositar hidroxiapatita.
Tal como se utiliza en la presente, una "matriz" se refiere a una sustancia tridimensional que se caracteriza por poros dispersados en toda la sustancia. Los poros son adecuados, por ejemplo, para el crecimiento de celulas, por ejemplo, celulas madre, OPAC y/o celulas osteogenicas, dentro de la matriz. Matrices ejemplares incluyen, a modo no taxativo, un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de p-fosfato-colageno tricalcico, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno placentario humano mineralizado, un sustrato de acido hialuronico y un sustrato ceramico. Preferiblemente, la matriz puede mineralizarse mediante una celula osteogenica presente en los poros de la matriz.
4. Breve descripcion de las figuras
FIG. 1: Expresion genica de OPAC obtenida por adhesion selectiva. Eje X: cuantificacion relativa de logi0 de la expresion genica de fosfatasa alcalina. Eje X: Condiciones experimentales.
FIG. 2: Inmunofenotipo de OPAC obtenidas por adhesion selectiva con respecto a CD34, CD105 y CD200. LN: laminina. VN: vitronectina. FN: fibronectina. COL: colageno. 10:10% de suero bovino fetal. 20:20% de suero bovino fetal. Testigo: cultivo de las OPAC en el recubrimiento de superficie indicado durante 6 dfas.
FIG. 3: Inmunofenotipo de marcadores osteogenicos de las OPAC obtenidas por adhesion selectiva. LN: laminina. VN: vitronectina. FN: fibronectina. COL: colageno. 10:10% de suero bovino fetal. 20:20% de suero bovino fetal. Testigo: cultivo de las OPAC en el recubrimiento de superficie indicado durante 6 dfas. Asteriscos: diferencia sustancial en comparacion con el control de celulas madre placentarias CD10+, CD34", CD105+ (lmea horizontal).
FIG. 4: Inmunofenotipo de marcadores de celulas madre embrionarias de las OPAC obtenidas por adhesion selectiva. LN: laminina. VN: vitronectina. FN: fibronectina. COL: colageno. 10:10% de suero bovino fetal. 20:20% de suero bovino fetal. Testigo: cultivo de las OPAC en el recubrimiento de superficie indicado durante 6 dfas. Lmea horizontal superior: expresion de celula madre placentaria CD10+, CD34", CD105+ de SSEA-3; lmea horizontal inferior: expresion de celula madre placentaria CD10+, CD34", CD105+ de SSEA-4.
FIG. 5: Actividad de fosfatasa alcalina (AP) de las OPAC obtenidas por adhesion selectiva.
FIG. 6: Inmunofenotipo de las OPAC de cultivo expandidas.
FIG. 7: Actividad de fosfatasa alcalina de las OPAC expandidas de cultivo. Basal: medio de crecimiento. OS: medio osteogenico, m1: medio 1 - 20% FBS (Hyclone)/a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina. m2: medio 2 - Medio de crecimiento de celulas madre mesenquimales (MSCGM; Lonza). m3: medio 3 - 10% FBS (FBS calificado de celulas madre mesenquimales, Stem Cell Technologies)/a-MEM que comprende 100 Unidades/mL, 100 pg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina.
FIG. 8: Inmunofenotipo (CD200, CD105) de OPAC despues de clasificacion celular activada magnetica. LN: laminina. VN: vitronectina. FN: fibronectina. m1: medio 1 - 20% FBS (Hyclone)/a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina. m3: medio 3 - 10% FBS (FBS calificado de celulas madre mesenquimales, Stem Cell Technologies)/a-MEM que comprende 100 Unidades/mL, 100 pg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina.
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FIG. 9: Actividad de fosfatasa alcalina de una poblacion CD200+ y una fraccion no retenida (que comprende celulas CD200") despues de clasificacion celular activada magnetica. lN: laminina. VN: vitronectina. FN: fibronectina. ml: medio 1 - 20% FBS (Hyclone)/a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina. m3: medio 3 - 10% FBS (FBS calificado de celulas madre mesenquimales, Stem Cell Technologies)/a-MEM que comprende 100 Unidades/mL, 100 pg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Basal: expresion de AP en un medio de crecimiento. Inducido: expresion de AP en un medio osteogenico.
FIG. 10: Unidad de formacion de colonias - actividad de fosfatasa (CFU-AP) de las poblaciones de celulas madre derivadas del corion despues de una clasificacion celular activada magnetica. LN: laminina. VN: vitronectina. FN: fibronectina. m1: medio 1 - 20% FBS (Hyclone)/a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina. m3: medio 3 -10% FBS (FBS calificado de celulas madre mesenquimales, Stem Cell Technologies)/a-MEM que comprende 100 Unidades/mL, 100 pg/mL de estreptomicina y 2 mM de L- glutamina. La condicion CD200+ es sustancialmente cero para la expresion de AP.
FIG. 11: Formacion de colonias total de fracciones de OPAC despues de una clasificacion celular activada magnetica. FN: fibronectina. m1: medio 1 - 20% FBS (Hyclone)/a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina. m3: medio 3 - 10% fBs (FBS calificado de celulas madre mesenquimales, Stem Cell Technologies)/a-MEM que comprende 100 Unidades/mL, 100 pg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. PDAC: celulas multipotentes placentarias adherentes al plastico para cultivo tisular CD10+, CD34', CD105+, CD200+.
FIG. 12: Secrecion de osteoprotegerina inducible por OPAC despues de estimulacion osteogenica.
FIG. 13: Lista de protemas secretadas identificadas en OPAC, PDAC™, MSC y fibroblastos utilizando el Ensayo de anticuerpos basado en etiquetas de biotina RayBio® de la protema RayBiotech 507. La expresion de protemas se clasifica como + (baja), ++ (media) y +++ (alta) en comparacion con un testigo positivo interno. Se indica la participacion de la protema en la formacion (^) o resorcion (D de huesos.
FIG. 14: Cantidad media de formacion de tejido oseo mediante un grupo de tratamiento; puntuada como 0-4, con 4 como la mayor cantidad.
FIG. 15: Densidad mineral osea del sitio del defecto craneal por grupo de tratamiento.
FIG. 16: Distribucion de animales con >50% de cierre de un defecto segun se determino por una medicion del defecto residual de escaneos de rayos X al momento del sacrificio.
FIG. 17: Efectos de OPAC y MSC en diferenciacion osteoclastica. OC: osteoclasto. testigo: osteoclastos sin OPAC o MSC.
FIG. 18: Efecto de las OPAC y MSC en la proliferacion de celulas de mieloma multiple. OB: osteoblastos o celulas similares a osteoblastos obtenidas de MSC o PDAC en condiciones osteogenicas. MTT OD: densidad optica en ensayo MMT; valores mas altos indican un grado mas alto de supervivencia de celulas de mieloma multiple. Con MM: Celulas de mieloma multiple de 27 pacientes humanos con mieloma multiple.
FIG. 19: Efecto de las OPAC en la densidad mineral osea en ratones SCID-rab mielomatosos primarios. Testigo: solo PBS. Pre-receta: densidad mineral osea (BMD) antes de la administracion de OPAC. Final: Densidad mineral osea despues de 8-16 semanas despues de la inyeccion. Los cambios en la densidad mineral osea (BMD) de los huesos implantados se determinaron utilizando un PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, WI).
FIG. 20: Efecto de las OPAC en niveles de inmunoglobulina humana (hlg) en ratones mielomatosos primarios. Ig: Inmunoglobulina humana en sueros de ratones.
FIG. 21: Efecto de OPAC en la masa osea en ratones SCID-rab mielomatosos primarios. BMD: densidad mineral osea. BMC: contenido mineral oseo.
5. Descripcion detallada
5.1 Celulas adherentes placentarias osteogenicas (OPAC)
5.1.1 Caractensticas
5.1.1.1 Caractensticas ftsicas y morfologicas
Las celulas adherentes placentarias osteogenicas (OPAC) para uso de acuerdo con la invencion, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivos celulares, se adhieren al sustrato de cultivo tisular, por ejemplo, superficie de un recipiente para cultivo tisular (por ejemplo, plastico para el cultivo tisular). Las OPAC en cultivo asumen una apariencia estrellada, generalmente fibroblastoide, con un numero de procesos citoplasmicos que se extienden del cuerpo celular central. Sin embargo, las OPAC son morfologicamente distinguibles de los fibroblastos cultivados en las mismas condiciones, ya que las OPAC generalmente exhiben un numero mayor de dichos procesos que los
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fibroblastos. Morfologicamente, las OPAC tambien son distinguibles de las celulas madre hematopoyeticas, que generalmente asumen una morfolog^a mas redondeada o de adoqum en cultivo.
5.1.1.2 Marcadores de superficie celular, moleculares y geneticos
Una OPAC (celula adherente placentaria osteogenica) aislada para uso de acuerdo con la invencion es una celula aislada que es adherente, osteogenica y esta aislada del corion. En una realizacion, las OPAC no estan aisladas del contorno corionico (liso). Las OPAC proporcionadas en la presente y poblaciones de OPAC expresan una pluralidad de marcadores celulares y geneticos que pueden utilizarse para identificar y/o aislar las OPAC o poblaciones de celulas que comprenden las OPAC. Las OPAC y poblaciones de celulas comprenden las OPAC proporcionadas en la presente, incluyen las OPAC y poblaciones de celulas que contienen OPAC obtenidas directamente del corion, por ejemplo, cultivos primarios. Las poblaciones de OPAC tambien incluyen poblaciones de, por ejemplo, dos o mas OPAC en cultivo, OPAC en una suspension de una sola celula y una poblacion en un recipiente, por ejemplo, una bolsa. En una realizacion espedfica, la poblacion de OPAC es una pluralidad de OPAC en un cultivo celular. Las OPAC no son trofoblastos, citotrofoblastos, celulas madre embrionarias o celulas germinales embrionarias, dado que esas celulas son conocidas y se entienden en la tecnicas.
Una OPAC aislada para uso de acuerdo con la invencion es CD200" o CD200tenue. En una realizacion espedfica, una OPAC es osteogenica. En una realizacion espedfica, una OPAC es positiva para la secrecion de osteoprotegerina (OPG; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank AAB53709). La osteoprotegerina es un receptor senuelo secretado por osteoblastos que se une espedficamente al factor de diferenciacion de osteoclastos e inhibe la maduracion de osteoclastos. Por lo tanto, las OPAC promueven la formacion osea y reducen la perdida osea mediada por osteoclastos. En otra realizacion espedfica, una OPAC es negativa para la expresion de RANKL (Receptor activador del factor nuclear kB). RANKL es una protema que activa osteoclastos, que participan en la resorcion osea. Por lo tanto, las OPAC no promueven la resorcion osea. En otra realizacion espedfica, una OPAC es CD200" o CD200tenue y CD105+. En otra realizacion espedfica, una OPAC es negativa para la expresion de a- actina de musculo liso, por ejemplo, segun se determina por tincion inmunofluorescente. Cabe senalar que otras poblaciones de celulas de placenta, por ejemplo, las celulas descritas en la Publicacion de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2005/0058631, son positivas para la a-actina de musculo liso. En otra realizacion espedfica, una OPAC es una o mas de negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL o positiva para la expresion de NG2 (proteoglicano de sulfato de condroitina de celula neuroglial 2). En otra realizacion espedfica, una OPAC es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2 y positiva para la secrecion de osteoprotegerina. En otra realizacion espedfica, una OPAC exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200- o CD200tenue y CD105+ y es una o mas de negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de nG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200- o CD200tenue y CD105+ y tambien es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina y exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. La falta de expresion o la expresion baja, de CD200 por las OPAC distingue las OPAC de otras celulas multipotentes derivadas de placenta adherentes al plastico para cultivo tisular, por ejemplo, PDACs™, por ejemplo, las celulas multipotentes placentarias descritas en Edinger et al, Publicacion de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2007/0275362.
En otra realizacion espedfica, una OPAC es SSEA3+ o SSEA4+. En una realizacion mas espedfica, una OPAC es SSEA3+ y SSEA4+. En otra realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200- o CD200tenue y CD105+, SSEA3+ y tambien es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina y/o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra realizacion mas espedfica, una OPAC es CD200- o CD200tenue y CD105+, SSEA4+ y tambien es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una realizacion mas espedfica, una OPAC es cD200- o CD200tenue, CD105+, SSEA3+, SSEA4+ y tambien es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. La expresion de SSEA3 y SSEA4 por las OPAC sirven para distinguir las OPAC de otras celulas derivadas de placenta, por ejemplo, celulas madre placentarias adherentes al plastico para el cultivo tisular descritas en Hariri, Patente de los Estados Unidos No. 7.468.276.
En ciertas realizaciones, una OPAC facilita la formacion de una matriz mineralizada en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de una matriz mineralizada.
La invencion tambien se refiere a poblaciones de celulas que comprenden OPAC, en donde la poblacion de celulas es CD200- o CD200tenue. Por ejemplo, una poblacion aislada de celulas que comprende OPAC no esta aislada del contorno corionico (liso) y es CD200- o CD200tenue. La poblacion de celulas puede consistir esencialmente en OPAC, y ser osteogenica. Dicha poblacion de celulas puede ser CD200- y CD105+ segun se detecta por citometna de flujo, o CD200tenue y CD105+ segun se detecta por citometna de flujo. Dicha poblacion de celulas puede ser negativa para
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la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2 y/o positiva para la secrecion de osteoprotegerina. Dicha poblacion de celulas puede ser negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de nG2 y positiva para la secrecion de osteoprotegerina. Dicha poblacion de celulas puede exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible. Espedficamente, dicha poblacion puede ser CD200-, CD105+ o CD200tenue, CD105+ y tambien ser una o mas de negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible. Mas espedficamente, dicha poblacion de celulas puede ser CD200-, CD105+ o CD200tenue, CD105+; ser negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina y exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible.
Dicha poblacion de celulas puede ser SSEA3+ o SSEA4+. Alternativamente, dicha poblacion de celulas puede ser SSEA3+ y SSEA4+. Dicha poblacion de celulas puede ser CD200- y/o CD200tenue, CD105+, SSEA3+ y tambien es negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. Mas espedficamente, dicha poblacion de celulas puede ser CD200- o CD200tenue, ser CD105+ y SSEA4+ y tambien ser negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. Mas espedficamente, dicha poblacion de celulas puede ser CD200- o CD200tenue, ser CD105+, SSEA3+, SSEA4+, negativa para la expresion de a-actina de musculo liso, negativa para la expresion de RANKL, positiva para la expresion de NG2, positiva para la expresion de osteoprotegerina y/o exhibir actividad de fosfatasa alcalina inducible.
En realizaciones espedficas, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las celulas de acuerdo con la invencion son CD200-.
La invencion tambien se refiere a una poblacion aislada de OPAC, en donde dicha poblacion se produce aislando el tejido corionico de una placenta, en donde dicho tejido corionico no es un tejido del contorno corionico (liso); digiriendo el tejido corionico aislado con una enzima que altera el tejido para obtener una poblacion de celulas corionicas que comprenden OPAC; y aislando dichas OPAC de dichas celulas corionicas. En una realizacion espedfica, la enzima que altera el tejido es tripsina, dispasa o colagenasa. En varias realizaciones, las celulas madre corionicas, contenidas dentro de una poblacion de celulas obtenidas de digerir tejido corionico, constituyen al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99,5% de dicha poblacion de celulas corionicas.
Poblaciones aisladas de celulas que comprenden OPAC, por ejemplo, poblaciones de OPAC, son distinguibles de otras celulas, por ejemplo, celulas adherentes derivadas de placenta CD200+, no tenues, (denominadas en la presente PDAC™), segun se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Nos. 7.468,276 y 7.255.879, y en la Publicacion de Patente de los Estados Unidos No. 2007/02753621, por ejemplo, segun se muestra mediante perfiles geneticos. Se identifican PDAC™, por ejemplo, como celulas CD10+, cD34-, CD105+, CD200+, no tenues de la placenta o cordon umbilical, que son adherentes a superficies de cultivo tisular, por ejemplo, plastico para cultivo tisular. PDAC™ pueden caracterizarse ademas como celulas CD1O+, CD34-, CD45', CD90+, CD105+ y CD200+ de la placenta o cordon umbilical, que son adherentes a superficies de cultivo tisular, por ejemplo, plastico para cultivo tisular. En una realizacion espedfica, la poblacion de celulas para uso de acuerdo con la invencion consiste esencialmente en OPAC.
Las OPAC descritas en la presente pueden distinguirse de las PDAC™ en base a la expresion de uno o mas genes, siendo la expresion o el grado de expresion espedficos para las OPAC en comparacion con las PDAC™. Por ejemplo, OPAc expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos (PDAC™) en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP6 (protema morfogenetica osea 6; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 001718), CDH11 (cadherina 11, tipo 2, cadherina de osteoblasto; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001797), COL10A1 (colageno, tipo X, alfa 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000493), COL14A1 (colageno, tipo XIV, alfa 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 0211 10), COL15A1 (colageno, tipo XV, alfa 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001855), COL1A1 (colageno, tipo I, alfa 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000088), COL1A2 (colageno, tipo I, alfa 2; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000089), COL3A1 (colageno, tipo III, alfa 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000090), COL4A3 (colageno, tipo IV, alfa 3; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000091), COL5A1 (colageno, tipo V, alfa 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000093), CSF3 (factor 3 de estimulacion de colonias (granulocito); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000759), CTSK (catepsina K; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000396), IGF1R (receptor 1 del factor de crecimiento similar a la insulina; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000875), MINPP1 (inositol polifosfato histidina fosfatasa 1 multiple; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_004897), MMP2 (metaloproteasa de la matriz 2 (tambien conocida como gelatinasa A, gelatinasa de 72 kDa, colagenasa tipo IV de 72 kDa); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_004530), MMP9 (metalopeptidasa de la matriz 9 (tambien conocida como gelatinasa B, gelatinasa de 92kDa, colagenasa tipo IV de 92kDa); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_004994), MSX1 (msh homeobox 1; ver, por ejemplo, No.
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de acceso de GenBank NM_002448), SMAD1 (miembro de la familia de SMAD 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_00l003688), SMAD3 (miembro de la familia de SMAD 3; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_005902), TGFB3 (factor de transformacion de crecimiento, beta 3; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_003239), TGFBR1 (factor de transformacion de crecimiento, beta receptor 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_004612) y VEGFB (factor de crecimiento endotelial vascular B; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank XM_001128909), cuando las OPAC y celulas madre placentarias se cultivan en condiciones equivalentes, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En otra realizacion, la presente invencion proporciona una poblacion de OPAC, en donde dicha poblacion de celulas expresa uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMp3 (protema morfogenetica osea 3; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001201), CDH11, COL10A1, COL14A1, COL15A1, DMP1 (fosfoprotema acida de la matriz de la dentina 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NG_008988), DSPP (sialofosfoprotema de la dentina; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_014208), ENAM (enamelina; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_031889), FGFR2 (receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000141), MMP10 (metaloproteasa de la matriz 10 (estromelisina 2); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_002425), TGFB3 y/o TGFBR1 cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion espedfica, dicho medio de crecimiento es aMEM/20% de suero bovino fetal que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. En una realizacion espedfica, la poblacion de celulas consiste esencialmente en OPAC.
En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes a nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AMBN (ameloblastina (protema de la matriz del esmalte); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_031889), BMP2 (protema morfogenetica osea 2; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 001200), CALCR (receptor de calcitonina; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001742), CDH11, COL11A1 (colageno tipo XI, alfa 1; NM_00l854), COL14A1, COL15A1, COL2A1 (colageno tipo II, alfa 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_00l844), CSF2 (factor 2 estimulante de la colonia; nM_000758), CSf3, DMP1, DSPP, ENAM, FGF3, GDF10 (factor 10 de diferenciacion de crecimiento; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_004962), IGF1 (factor 1 de crecimiento similar a la insulina; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000618), ITGA1 (integrina, alfa 1 (CD49); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 181501), ITGA2 (integrina, alfa 2 (CD49B); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_002203), MMP10, MMP8 (metaloproteasa de la matriz 8 (colagenasa de neutrofilos); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_002424), MMP9, PDGFA (factor de crecimiento derivado de plaquetas A; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank xM_001126441), SMAD1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 (factor de transformacion de crecimiento beta, receptor 2; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001024847) cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio osteogenico, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion espedfica, dicho medio de crecimiento es aMEM/20% de suero bovino fetal que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 pg/mL de acido ascorbico y 100 nM de dexametasona.
En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CDH11, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas bajo) que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AHSG (glicoprotema alfa-2-HS; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001622), ALPL (fosfatasa alcalina de hngado/hueso/rinon); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000478), EGF (factor de crecimiento epidermico; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001963), FLT1 (tirosina quinasa 1 relacionada con fms (factor de crecimiento endotelial vascular/receptor del factor de permeabilidad vascular); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_002019), IGF2, ITGA2, ITGAM (integrina, alfa M (subunidad 3 del receptor del componente 3 del complemento); ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000632), SCARB1 (receptor depurador clase B, miembro 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_005505), SOX9 (SRY (region de determinacion sexual Y)-caja 9; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM 000346), TNF, TWIST1 (homologo 1 de Twist; anteriormente blefarofimosis, epicanto inverso y ptosis 3, acrocefalosindactilia 3; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000474), VCAM1 (molecula 1 de adhesion celular vascular 1; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001078) y/o VDR cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
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En otra realizacion, lad OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas bajo) que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BGN, COL11A1, COMP (protema oligomerica de la matriz del cartflago), FGF1 y/o vCaMI cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio osteogenico, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion espedfica, dicho medio osteogenico es aMEM/20% de suero bovino fetal que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 pg/mL de acido ascorbico y 100 nM de dexametasona.
En otra realizacion, las OPAC expresan VCAM1 a un nivel notoriamente mas bajo (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas bajo) que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Los perfiles geneticos tambien muestran que las OPAC aisladas son distinguibles de celulas madre mesenquimales, por ejemplo, celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea. En una realizacion las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP4, BMP6, CD36, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, CSF2, CTSK, FGF2, FGFR1, FLT1, ITGA1, MINPP1, MMP9, MSX1, PDGFA, SERPINH1, TGFB3 y TGFBR1, cuando las OPAC y celulas madre se cultivan en condiciones equivalentes, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP4, CAlCr, CD36, CDH11, COL12A1, COL14A1, COL15A1, COL3A1, COL5A1, DMP1, DSPP, FLT1, MSX1, PDGFA, TGFB3, TGFBR1 y/o TUFT1, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion espedfica, dicho medio de crecimiento es aMEM/20% de suero bovino fetal que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina.
En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AMBN, CALCR, COL14A1, COL15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1, ITGA2, MMP10, MMP9, MSX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio osteogenico, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion espedfica, dicho medio osteogenico es aMEM/20% de suero bovino fetal que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 pg/mL de acido ascorbico y 100 nM de dexametasona.
En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CALCR, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas bajo) que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL, BGLAP, IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1 y/o SOX1, cuando las OPAC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio crecimiento, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion espedfica, dicho medio de crecimiento es aMEM/20% de suero bovino fetal que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas bajo) que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, BMP3, BMP5, CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, COL2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR2, IGF2, MMP8, PHEX, RUNX2 (factor de transcripcion 2 relacionado con Runt; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_001015051), ScArB1, SOX1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando las OPaC y celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio osteogenico, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En una realizacion espedfica, dicho medio osteogenico es aMEM/20% de suero bovino fetal que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 pg/mL de acido ascorbico y 100 nM de dexametasona.
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En otra realizacion, la presente invencion proporciona una poblacion de OPAC, en donde dicha poblacion de celulas, por ejemplo, las OPAC, expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas bajo) que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL, BGLAp, IGF2, SCARB1 y/o SOX9, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real. En otra realizacion espedfica, la poblacion de celulas consiste esencialmente en OPAC.
En otra realizacion las OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes y un numero de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de COL14A1, COL14A2, DMP, DSPP, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPAC, celulas madre placentarias y dichas celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
Los perfiles geneticos tambien confirman que las OPAC son distinguibles de celulas de fibroblastos dermicas humanas En una realizacion, OPAC expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto (por ejemplo, un nivel al menos dos veces mas alto) que un numero equivalente de celulas de fibroblastos dermicas, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP4, BMP6, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, FLT1, IGF1R, ITGA1, MINPP1, PDGFA, SERPINH1, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TNF, TUFT1, VCAM1 y VEGFA, en donde la expresion de estos genes es mayor en las OPAC que en celulas de fibroblastos, cuando las OPAC y fibroblastos se cultivan en condiciones equivalentes, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion, un aumento en la expresion en las OPAC, de uno o mas genes en un medio osteogenico, en comparacion con el medio de crecimiento, es al menos diez veces mas alto que un aumento en dicho gen o genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, en un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, en donde dichas celulas madre placentarias CD200+ adherentes no son trofoblastos ni citotrofoblastos y en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP2, CSF3, ITGA2, MMP9, MMP10 y/o TGFB2.
En otra realizacion, un aumento en la expresion en las OPAC, de uno o mas genes en un medio osteogenico, en comparacion con el medio de crecimiento, es al menos diez veces mas alto que un aumento en dicho gen o genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, en un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, en donde dichas celulas madre placentarias CD200+ adherentes no son trofoblastos ni citotrofoblastos y en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de COL1A1, COL11A1, COL4A3, COL5A1, CoMp (protema oligomerica de la matriz del cartflago; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000095), CTSK, FGF1 (factor 1 de crecimiento de fibroblastos; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000800) y/o FGFR2.
En otra realizacion, un aumento en la expresion en las OPAC, de uno o mas genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, es al menos diez veces mas alto que un aumento en dicho gen o genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, en un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, y en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CSF3, IGF2, ITGA2, ITGA3, MMP9, MMP10 y/o TGFB2.
En otra realizacion, un aumento en la expresion en las OPAC, de uno o mas genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, es al menos diez veces mas bajo que un aumento en dicho gen o genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, en un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, y en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL (fosfatasa alcalina, mgado/hueso/rinon), CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, COL1A1, COL4A3, COMP, CTSK, FGF1 y/o FGFR2.
En otra realizacion, un aumento en la expresion en las OPAC, de uno o mas genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, es al menos diez veces mas alto que un aumento en dicho gen o genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, en un numero equivalente de celulas de fibroblastos, y en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP2, CSF2, CSF3, IGF1, ITGA2, MMP9 y/o MMP10.
En otra realizacion, un aumento en la expresion en las OPAC, de uno o mas genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, es al menos diez veces mas bajo que un aumento en dicho gen o genes en un medio osteogenico, en comparacion con un medio de crecimiento, en un numero equivalente de celulas de fibroblastos, y en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP4, COL12A1, COMP, FGF1 y/o MMP8.
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En otra realizacion, un gen que codifica metalopeptidasa de la matriz 9 (MMP9) se induce en dichas OPAC en un medio osteogenico, en comparacion con la expresion de MMP9 en un medio de crecimiento, al menos 2, 3, 4 o 5 ordenes de magnitud mas que lo que dicha MMP9 se induce en dicho medio osteogenico, en comparacion con la expresion de MMP9 en dicho medio de crecimiento, por ejemplo, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
En otra realizacion, las OPAC expresan uno o mas genes al menos diez veces mas que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+, no tenues, adherentes, en donde dicho gen o genes son CHRD (cordina; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_003741), GDF7 (factor 7 de diferenciacion de crecimiento; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_182828), IGFBP3 (protema de union al factor de crecimiento similar a la insulina 3; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_000598) y/o INHA (inhibina alfa; ver, por ejemplo, No. de acceso de GenBank NM_002191). En otra realizacion, las OPAC expresan TGFB2 en un nivel al menos diez veces mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+ (no tenues) adherentes.
En otras realizaciones las OPAC expresan a-actina de musculo liso, segun se detecta mediante tincion inmunofluorescente y expresan un gen de fibronectina 1 (FN1) y/o gen TGF-p2 (TGFB2) a aproximadamente el mismo nivel o un nivel mas alto en comparacion con un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea.
El nivel de expresion de estos genes puede utilizarse para confirmar la identidad de una poblacion de OPAC, para identificar una poblacion de celulas que comprenden al menos una pluralidad de OPAC o similares. La poblacion de OPAC puede ser clonal, por ejemplo, una poblacion de OPAC expandida de una sola OPAC o una poblacion mixta de OPAc, por ejemplo, una poblacion de celulas que comprenden unicamente OPAC que se expanden de multiples OPAC, o una poblacion de celulas que comprenden OPAC y al menos otro tipo de celula.
El nivel de expresion de estos genes puede utilizarse para seleccionar poblaciones de OPAC. Por ejemplo, una poblacion de celulas, por ejemplo, celulas expandidas clonalmente, pueden seleccionarse si la expresion de uno o mas de estos genes es significativamente mas alta en una muestra de la poblacion de celulas que en una poblacion equivalente de celulas madre mesenquimales. Dicha seleccion puede ser de una poblacion de una pluralidad de poblaciones de celulas madre corionicas o celulas madre placentarias, de una pluralidad de poblaciones de celulas, cuya identidad no se conoce, etc.
Las OPAC para uso de acuerdo con la invencion pueden seleccionarse en base al nivel de expresion de uno o mas de dichos genes en comparacion con el nivel de expresion en dicho gen o genes en un control de celulas madre mesenquimales. En una realizacion, el nivel de expresion de dicho gen o genes en una muestra que comprende un numero equivalente de celulas madre mesenquimales se utiliza como un testigo. En otra realizacion, el testigo, para las OPAC evaluadas en determinadas condiciones, es un valor numerico que representa el nivel de expresion de dicho gen o genes en celulas madre mesenquimales en dichas condiciones.
Las OPAC para uso de acuerdo con la invencion tambien pueden seleccionarse en base a la expresion de una o mas protemas secretadas en comparacion con el nivel de expresion en un testigo, por ejemplo una celula madre placentaria, una celula madre mesenquimal o una celula de fibroblasto. En una realizacion, las OPAC puede distinguirse de celulas madre placentarias, celulas madre mesenquimales o celulas de fibroblastos en base a la secrecion de uno o mas de decorina, epirregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, protema de union a TGF-beta latente 1 (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 y TIMP-2, que son unicos de las OPAC en comparacion con celulas madre placentarias CD200+ (no tenues) adherentes, celulas madre mesenquimales o celulas de fibroblastos. En otra realizacion, las protemas secretadas por las OPAC pero no por PDAC™ incluyen uno o mas de Factor tisular, Folistatina tipo 1, IGF-1IR, sFRP-4 y TSG-6.
Las poblaciones aisladas de OPAC y las poblaciones de OPAC en general pueden comprender aproximadamente, al menos, o no mas que, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o mas OPAC.
5.1.1.3 Crecimiento en cultivo
El crecimiento de las OPAC, para cualquier celula de mairnfero, depende en parte del medio particular seleccionado para el crecimiento. En condiciones optimas, las OPAC tfpicamente se duplican en numero en 1-3 dfas. Durante el cultivo, las OPAC proporcionadas en la presente se adhieren a un sustrato en cultivo, por ejemplo, la superficie de un recipiente para cultivo tisular (por ejemplo, plastico de plato para cultivo tisular, plastico recubierto con fibronectina y similares) y forman una monocapa.
5.1.2 Metodos para obtener OPAC
5.1.2.1 Composicion de recoleccion de celulas
En la presente tambien se divulgan metodos para recolectar y aislar OPAC. Generalmente, las OPAC se obtienen del corion utilizando una solucion fisiologicamente aceptable, por ejemplo, una composicion de recoleccion de
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celulas. Una composicion de recoleccion de celulas se describe en detalle en la Publicacion de Solicitud de los Estados Unidos No. 2007-0190042.
La composicion de recoleccion de celulas puede comprender cualquier solucion fisiologicamente aceptable adecuada para la recoleccion y/o cultivo de celulas, por ejemplo, OPAc, por ejemplo, una solucion salina (por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Kreb, solucion de Kreb modificada, solucion de Eagle, 0,9% de NaCl, etc.), un medio de cultivo (por ejemplo, DMEM, H.DMEM, etc.) y similares.
La composicion de recoleccion de celulas puede comprender uno o mas componentes que tienden a preservar las OPAC, es decir, prevenir que las OPAC mueran o retrasar la muerte de las OPAC, reducir el numero de OPAC en una poblacion de celulas que muere, o similar, desde el momento de recoleccion al momento de cultivo. Dichos componentes pueden ser, por ejemplo, un inhibidor de la apoptosis (por ejemplo, un inhibidor de caspasa o inhibidor de JNK); un vasodilatador (por ejemplo, sulfato de magnesio, un farmaco antihipertensivo, peptido natriuretico auricular (ANP), adrenocorticotropina, hormona liberadora de corticotropina, nitroprusiato de sodio, hidralazina, adenosina trifosfato, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc.); un inhibidor de necrosis (por ejemplo, 2-(1H-Indol-3-il)-3-pentilamina-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina o clonazepam); un inhibidor TNF-a; y/o un perfluorocarbono portador de oxfgeno (por ejemplo, bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).
La composicion de recoleccion de celulas puede comprender una o mas enzimas que degradan el tejido, por ejemplo, una metaloproteasa, una proteasa de serina, una proteasa neutral, una RNasa o una DNasa o similar. Dichas enzimas incluyen, a modo no taxativo, colagenasas (por ejemplo, colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASA, hialuronidasa y similares.
La composicion de recoleccion de celulas puede comprender una cantidad bactericidamente o bacterioestaticamente efectiva de un antibiotico. En determinados aspectos no taxativos, el antibiotico es un macrolido (por ejemplo, tobramicina), una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxilo), una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (por ejemplo, penicilina V) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacina, ciprofloxacina o norfloxacina), una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En un aspecto particular, el antibiotico es activo contra bacterias Gram(+) y/o Gram(-), por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y similares.
La composicion de recoleccion de celulas tambien puede comprender uno o mas de los siguientes compuestos: adenosina (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); D-glucosa (aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM); iones magnesio (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); una macromolecula de peso molecular mayor que 20.000 daltones, en un aspecto, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y viabilidad celular (por ejemplo, un coloide natural o sintetico, un polisacarido tal como dextrano o un polietilenglicol presente de aproximadamente 25 g/1 a aproximadamente 100 g/1, o aproximadamente 40 g/1 a aproximadamente 60 g/1); un antioxidante (por ejemplo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutationa, vitamina C o vitamina E presentes de aproximadamente 25 pM a aproximadamente 100 pM); un agente reductor (por ejemplo, N-acetilcistema presente de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM); un agente que previene la entrada de calcio en las celulas (por ejemplo, verapamil presente de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 25 pM); nitroglicerina (por ejemplo, aproximadamente 0.05 g/L a aproximadamente 0,2 g/L); un anticoagulante, en un aspecto, presente en una cantidad suficiente para ayudar a prevenir la coagulacion de sangre residual (por ejemplo, heparina o hirudina presentes a una concentracion de aproximadamente 1000 unidades/1 a aproximadamente 100.000 unidades/1); o un compuesto que contiene amilorida (por ejemplo, amilorida, etil isopropil amilorida, hexametilen amilorida, dimetil amilorida o isobutil amilorida presente de aproximadamente 1,0 pM a aproximadamente 5 pM).
5.1.2.2 Recoleccion y manipulacion de placenta
Generalmente, una placenta humana se recupera poco despues de su expulsion despues del nacimiento. En un aspecto preferido, la placenta se recupera de una paciente despues del consentimiento informado y despues de un historial clmico completo del paciente y de asociarlo con la placenta. Preferiblemente, el historial clmico continua despues del parto. Dicho historial clmico puede utilizarse para coordinar un uso posterior del corion u OPAC aislados de la misma. Por ejemplo, las OPAC pueden utilizarse, a la luz del historial clmico, para medicina personalizada para el bebe asociado con la placenta de la cual se obtiene el corion o para los padres, hermanos u otros familiares del bebe.
En algunos aspectos, antes de recuperar las OPAC, la sangre del cordon umbilical y la sangre de la placenta se retiran de la placenta de la cual se retirara el corion. En algunos aspectos, despues del parto, se recupera la sangre del cordon en la placenta. La placenta puede someterse a un proceso convencional de recuperacion de sangre del cordon. Tfpicamente se utiliza una aguja o canula, con la ayuda de la gravedad, para desangrar la placenta (ver, por ejemplo, Anderson, Patente de los Estados Unidos No. 5.372.581; Hessel et al, Patente de los Estados Unidos No. 5.415.665). La aguja o canula se coloca generalmente en la vena umbilical y la placenta puede masajearse suavemente para ayudar a drenar la sangre del cordon de la placenta. Dicha recuperacion de la sangre del cordon puede realizarse comercialmente, por ejemplo, LifeBank USA, Cedar Knolls, N. J., ViaCord, Cord Blood Registry y
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Cryocell. Preferiblemente, la placenta se drena por gravedad sin manipulacion adicional para minimizar la alteracion del tejido durante la recuperacion de la sangre del cordon.
Tfpicamente, una placenta se transporta de la sala o habitacion de parto a otra ubicacion, por ejemplo, un laboratorio, para la recuperacion de la sangre del cordon y recoleccion de celulas. La placenta preferiblemente se transporta en un dispositivo de transporte termicamente aislado, esteril (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28°C), por ejemplo, mediante la colocacion de la placenta, con el cordon umbilical proximo sujetado, en una bolsa de plastico con cierre esteril, que se coloca entonces en un recipiente aislado. En otro aspecto, la placenta se transporta en un kit de recoleccion de sangre del cordon basicamente como se describe en la Solicitud de Patente de los Estado Unidos pendiente No. 11/230.760, presentada el 19 de septiembre de 2005. Preferiblemente, la placenta se entrega al laboratorio de cuatro a veinticuatro horas despues del parto. En determinados ejemplos, el cordon umbilical proximo se sujeta, preferiblemente dentro de los 4-5 cm (centimetres) de la insercion en el disco placentario antes de la recuperacion de la sangre del cordon. En otro ejemplo, el cordon umbilical proximo se sujeta despues de la recuperacion de la sangre del cordon pero antes de un proceso adicional de la placenta.
La placenta, antes de la recoleccion de las OPAC, puede almacenarse en condiciones esteriles y ya sea a temperatura ambiente o a una temperatura de 5 a 25°C (cenffgrados). La placenta puede almacenarse durante un penodo no mayor a cuarenta y ocho horas, y preferiblemente durante un penodo de cuatro a veinticuatro horas antes de la perfusion de la placenta para retirar toda sangre del cordon residual. La placenta preferiblemente se almacena en una solucion anticoagulante a una temperatura de 5 a 25°C (cenffgrados). Las soluciones anticoagulantes adecuadas se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, puede utilizarse una solucion de heparina o warfarina de sodio. En un aspecto preferido, la solucion anticoagulante comprende una solucion de heparina (por ejemplo, 1% p/p en solucion 1:1000). La placenta desangrada preferiblemente se almacena por no mas de 36 horas antes de recolectar las OPAC.
5.1.2.3 Alteracion ffsica y digestion enzimatica de tejido de corion
En un aspecto, las OPAC para uso de acuerdo con la invencion se pueden recoger de una placenta de mairnfero mediante la alteracion ffsica, por ejemplo, digestion enzimatica del organo. Por ejemplo, el corion o una porcion del mismo puede, por ejemplo, triturarse, cortarse, picarse, cortarse en cubos, trozarse, macerarse o similar mientras esta en contacto con la composicion de recoleccion de celulas divulgada en la presente y el tejido resultante digerirse posteriormente con una o mas enzimas. El corion o una porcion del mismo tambien puede alterarse ffsicamente y digerirse con una o mas enzimas y el material resultante puede sumergirse en, o mezclarse con, la composicion de recoleccion de celulas. Puede utilizarse cualquier metodo de alteracion ffsica, siempre que el metodo de alteracion deje una pluralidad, mas preferiblemente una mayona, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las celulas en dicho organo viable, segun se determina, por ejemplo, por exclusion de azul de tripano. Tfpicamente, las OPAC pueden obtenerse mediante alteracion de un pequeno bloque del corion, por ejemplo, un bloque de tejido placentario que es de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 1000 miffmetros cubicos de volumen.
Una composicion de recoleccion de celulas preferida comprende una o mas enzimas que alteran el tejido. La digestion enzimatica del corion preferiblemente utiliza una combinacion de enzimas, por ejemplo, una combinacion de una metaloproteasa de la matriz y una proteasa neutral, por ejemplo, una combinacion de colagenasa y dispasa. En otros aqspectos, la digestion enzimatica del tejido corionico utiliza una combinacion de una metaloproteasa de la matriz, una proteasa neutral y una enzima mucofftica para la digestion de acido hialurico, tal como una combinacion de colagenasa, dispasa y hialuronidasa o una combinacion de LIBERASA (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) e hialuronidasa. Otras enzimas que pueden utilizarse para alterar el tejido corionico incluyen paparna, desoxirribonucleasa, proteasas de serina, tales como tripsina, quimotripsina o elastasa. Las proteasas de serina pueden ser inhibidas por alfa 2 microglobulina en suero y por lo tanto el medio que se utiliza para la digestion esta generalmente libre de suero. La EDTA y DNasa se utilizan comunmente en los procedimientos de digestion de enzimas para aumentar la eficiencia de la recuperacion de celulas. El digestato (tejido y celulas que resultan de una digestion enzimatica) preferiblemente se diluye para evitar atrapar las OPAC dentro de la digestion viscosa.
Las concentraciones ffpicas para las enzimas de la digestion de tejido incluyen, por ejemplo, 50-200 U/mL para la colagenasa I y colagenasa IV, 1-10 U/mL para la dispasa y 10-100 U/mL para la elastasa. Las proteasas pueden utilizarse en combinacion, es decir, dos o mas proteasas en la misma reaccion de digestion o pueden utilizarse secuencialmente para liberar las OPAC. Por ejemplo, en una realizacion, el tejido corionico se digiere primero con una cantidad apropiada de colagenasa I a 2 mg/ml durante 30 minutos, seguido por la digestion con tripsina, 0,25% durante 10 minutos, a 37°C. Las proteasas de serina preferiblemente se utilizan consecutivamente siguiendo el uso de otras enzimas.
Las OPAC para uso de acuerdo con la invencion se pueden obtener mediante la separacion de amnios del tejido corionico; picando el tejido corionico, por ejemplo, en trozos de aproximadamente 1 mm3; digiriendo el tejido en la dispasa II, por ejemplo, a aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 U/mL, por ejemplo, 2,4 U/mL por un tiempo suficiente, por ejemplo, aproximadamente 1 hora; digiriendo con la colagenasa II a aproximadamente 100, 200, 300, 400 o 500 U/mL, por ejemplo, aproximadamente 270 U/ml por un tiempo suficiente, por ejemplo 1 hora, seguido por la
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neutralizacion de la enzima, recoleccion de celulas solas y cultivo de celulas corionicas en un medio adecuado, por ejemplo, 20% de FBS/aMEM.
En otro ejemplo, el tejido puede alterarse ademas mediante la adicion de un quelante, por ejemplo, acido etilenglicol bis(2-aminoetil eter)-N,N,N'N'-tetraacetico (EGTA) o acido etilendiaminatetraacetico (EDTA) a la composicion de recoleccion de celulas que comprende las celulas madre o a una solucion en la cual el tejido se altera y/o digiere antes del aislamiento de las celulas madre con la composicion de recoleccion de celulas.
Se apreciara que donde un corion entero o porcion de un corion que comprende tanto celulas fetales como maternales, las OPAC recogidas pueden comprender una mezcla de OPAC derivadas tanto de fuentes fetales como maternales. Cuando una porcion del corion que no comprende o comprende un numero insignificante de celulas maternales (por ejemplo, amnios), las OPAC recogidas comprenderan casi exclusivamente celulas placentarias fetales.
Las OPAC para uso de acuerdo con la invencion se pueden aislar del tejido corionico como se describe a continuacion. El tejido corionico se obtiene y se pica, por ejemplo, en trozos de aproximadamente 1-2 mm3. El tejido picado se digiere con la dispasa II a una concentracion de, por ejemplo, aproximadamente 1 U/mL a aproximadamente 10 U/mL, por ejemplo, 2,4 U/mL hasta que la digestion se complete, por ejemplo, durante 1 hora a 37°C. El tejido digerido se digiere con la colagenasa II, por ejemplo, aproximadamente 100 U/mL a aproximadamente 1000 U/mL, por ejemplo, aproximadamente 27 U/mL, hasta que la digestion se complete, por ejemplo, durante aproximadamente 1 hora a 37°C. Las celulas se recogen mediante centrifugacion, se lavan y se cultivan en recipientes para cultivo tisular recubiertos con laminina o recubiertos con vitronectina y se cultivan en 10% de FBS/aMEM o 20% de FBS/aMEM durante aproximadamente 6 dfas. A los 6 dfas de cultivo, las celulas no adherentes se retiran y las celulas adherentes se dejan proliferar. Cuando las celulas logran de aproximadamente 80% a 90% de confluencia, las celulas se retiran, por ejemplo, utilizando tripsina y transfiriendo recipientes para cultivos tisulares recubiertos con vitronectina o recubiertos con laminina. Cuando las celulas se cultivan inicialmente en recipientes recubiertos con laminina, se prefiere que se transfieran a recipientes para cultivo recubiertos con laminina; de manera similar, cuando las celulas se cultivan inicialmente en recipientes recubiertos con vitronectina, se prefiere que se transfieran a recipientes para cultivo recubiertos con vitronectina. Las celulas opcionalmente se criopreservan antes de la transferencia a segundas placas. Las celulas se analizan, por ejemplo, mediante citometna de flujo y se determinan que son, por ejemplo, CD34", CD105+, CD200" y/o CD200tenue, positivas para fosfatasa alcalina (AP), a-actina de musculo liso (a-SMA) y osteoprotegerina (OP)
Por lo tanto, en un aspecto, en la presente se proporciona un metodo para aislar celulas adherentes placentarias osteogenicas (OPAC) que comprende digerir tejido de corion serialmente con dispasa II y luego con colagenasa II para producir una poblacion de celulas; cultivar dicha poblacion de celulas en una primera superficie recubierta con vitronectina o superficie recubierta con laminina durante aproximadamente seis dfas, en donde dicha poblacion de celulas comprende celulas adherentes y celulas no adherentes; y remover celulas no adherentes; y transferir las celulas adherentes a una segunda superficie recubierta con vitronectina o superficie recubierta con laminina, en donde dichas celulas adherentes son OPAC. En realizaciones espedficas, dichas OPAC para uso de acuerdo con la invencion son una o mas de CD34-, CD105+, CD200tenue, AP+, a-SMA+ y OP+. En otras realizaciones, las OPAC tienen cualquiera de las caractensticas celulares o geneticas descritas en otras partes en la presente.
5.1.3 Cultivo de OPAC
5.1.3.1 Medio de cultivo
Las OPAC o poblaciones de OPAC aisladas pueden utilizarse para iniciar o sembrar cultivos celulares. Las celulas se transfieren generalmente a recipientes para cultivo tisular esteriles. Los recipientes preferiblemente se recubren con vitronectina, fibronectina o ambas. En otros ciertos aspectos, los recipientes para cultivo tisular no estan recubiertos o estan recubiertos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (por ejemplo, nativo o desnaturalizado), gelatina, ornitina y/o protema de membrana extracelular (por ejemplo, MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)).
Preferiblemente, las OPAC se obtienen como se describe a continuacion. Celulas corionicas que comprenden las OPAC, obtenidas mediante la digestion de tejido corionico, por ejemplo, con dispasa II y colagenasa II segun se describio anteriormente, se cultivan inicialmente en una superficie de cultivo tisular recubierta con colageno, vitronectina o laminina, por ejemplo, durante aproximadamente 1-6 dfas en 20% de FBS/aMEM, seguido por, o acompanado por, eliminacion de celulas no adherentes; las celulas no adherentes pueden retirarse varias veces, por ejemplo, despues de 3 horas, 1 dfa y 6 dfas del cultivo, o una vez, por ejemplo, despues de 6 dfas de cultivo. Despues de la adhesion selectiva, las OPAC se seleccionan mediante la eliminacion de celulas CD200+ (no tenues), por ejemplo, utilizando un anticuerpo a CD200, dejando una poblacion de celulas CD200tenue/CD200'.
Las OPAC pueden cultivarse en cualquier medio y en cualquier condicion reconocida en la tecnica como aceptable para el cultivo de celulas madre. Preferiblemente, el medio de cultivo comprende suero. Las OPAC pueden cultivarse en, por ejemplo, DMEM-LG (Medio Esencial Modificado por Dulbecco, baja glucosa)/MCDB 201 (medio basal de fibroblasto de pollo) que contiene ITS (insulina-transferrina-selenio), LA+BSA (acido linoleico-albumina de
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suero de bovino), dextrosa, L-acido ascorbico, PDGF, EGF, IGF-1 y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (alta glucosa) que comprende 10% de suero de bovino fetal (FBS); DMEM-HG que comprende 15% de FBS; IMDM (medio Dulbecco con modificacion de Iscove) que comprende 10% de FBS, l0% de suero equino e hidrocortisona; M199 que comprende 10% de FBS, EGF y heparina; a-MEM (medio esencial mmimo) que comprende 10% de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que comprende 10% de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina, etc. Un medio preferido es DMEM-LG/MCDB-201 que comprende 2% de FBS, ITS, LA+BSA, dextrosa, L-acido ascorbico, PDGF, EGF y penicilina/estreptomicina.
Otros medios que pueden utilizarse para cultivar las OPAC incluyen DMEM (alta o baja glucosa), medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F-12 de Ham (F12), medio Dulbecco con modificacion de Iscove, Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimales (MSCGM), medio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) y CELL-GRO LIBRE.
El medio de cultivo puede complementarse con uno o mas componentes incluyendo, por ejemplo, suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), preferiblemente aproximadamente 2-15% (p/p); suero equino (de caballo) (ES); suero humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferiblemente aproximadamente 0,001% (p/p); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor basico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y eritropoyetina (EPO); aminoacidos, incluyendo L-valina; y uno o mas agentes antimicoticos y/o antibioticos para controlar la contaminacion microbial, tal como, por ejemplo, penicilina G, estreptomicina sulfato, anfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sea solos o en combinacion.
Las OPAC pueden cultivarse en condiciones de cultivo tisular estandar, por ejemplo, en platos o placas de multiples pocillos para cultivo tisular. Las OPAC tambien pueden cultivarse utilizando un metodo de gota colgante. En este metodo, las OPAC se suspenden a aproximadamente 1 x 104 de celulas por mL en aproximadamente 5 mL de medio y una o mas gotas del medio se colocan en el interior de la tapa de un recipiente para cultivo tisular, por ejemplo, una placa de Petri de 100 mL. Las gotas pueden ser, por ejemplo, gotas solas o gotas multiples de, por ejemplo, una pipeta multicanal. La tapa se invierte cuidadosamente y se coloca sobre el fondo del plato, que contiene un volumen de lfquido, por ejemplo, PBS esteril suficiente para mantener el contenido de humedad en la atmosfera del plato, y las celulas se cultivan.
5.1.3.2 Expansion y proliferacion de las OPAC
Una vez que se obtiene una OPAC aislada o poblacion de OPAC aisladas (por ejemplo, una OPAC o poblacion de OPAC separada de al menos aproximadamente 50% de las celulas corionicas con las cuales una OPAC o poblacion de OPAC se asocia normalmente in vivo), la OPAC o poblacion de OPAC puede proliferarse y expandirse in vitro. Por ejemplo, una poblacion de OPAC puede cultivarse en recipientes para cultivo tisular, por ejemplo, platos, matraces, placas de multiples pocillos o similares, durante un tiempo suficiente para que las celulas proliferen hasta un 70-90% de confluencia, es decir, hasta que las celulas y su progenie ocupen el 70-90% del area superficial de cultivo del recipiente para cultivo tisular.
Las OPAC pueden sembrarse en recipientes de cultivo a una densidad que permita el crecimiento de celulas. Por ejemplo, las celulas pueden sembrarse desde una densidad baja (por ejemplo, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 5.000 celulas/cm2) a una densidad alta (por ejemplo, aproximadamente 50.000 o mas celulas/cm2). En un aspecto preferido, las celulas se cultivan desde aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento por volumen de CO2 en el aire. En algunos ejemplos preferidos, las celulas se cultivan de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en el aire, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de O2 en el aire. Las celulas se cultivan preferiblemente de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente 37°C. Las celulas preferiblemente se cultivan en una incubadora. El medio de cultivo puede ser estatico o agitado, por ejemplo, utilizando un biorreactor. Las OPAC preferiblemente se cultivan con estres oxidativo bajo (por ejemplo, con adicion de glutationa, acido ascorbico, catalasa, tocoferol, N- acetilcistema o similares).
Una vez que se obtiene una confluencia de 70%-90%, las celulas se pueden pasar. Por ejemplo, las celulas pueden tratarse enzimaticamente, por ejemplo, tripsinizarte utilizando tecnicas bien conocidas en la tecnica, para separarlas de la superficie de cultivo tisular. Despues de retirar las celulas mediante pipeteado y conteo de celulas, aproximadamente 20.000-100.000 celulas, preferiblemente 50.000 celulas, se pasan a un nuevo recipiente para cultivo que contiene un medio de cultivo nuevo. Tfpicamente, el nuevo medio es el mismo tipo de medio del cual las celulas se retiraron. En la presente se proporcionan poblaciones de celulas placentarias que se han pasado al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 veces o mas.
5.1.3.3 Poblaciones de OPAC
Adicionalmente se divulgan aqrn poblaciones de OPAC, las OPAC pueden aislarse directamente de coriones de una o mas placentas. Las OPAC aisladas para uso de acuerdo con la invencion tambien pueden cultivarse y expandirse
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para producir poblaciones de OPAC. Las poblaciones de celulas corionicas que comprenden OPAC tambien pueden cultivarse y expandirse para producir poblaciones de OPAC.
Las poblaciones de OPAC comprenden OPAC, por ejemplo, las OPAC segun se describe en la presente. En varias realizaciones, al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las celulas en una poblacion de celulas aisladas son OPAC. Es decir, una poblacion de OPAC puede comprender, por ejemplo, tanto como 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de celulas no OPAC.
En la presente se divulgan metodos para producir poblaciones aisladas de OPAC mediante, por ejemplo, la seleccion de celulas de corion que expresan marcadores particulares y/o caractensticas de cultivo o morfologicas particulares. Ademas se divulga en la presente un metodo para producir una poblacion de celulas que comprende seleccionar celulas corionicas que se adhieren a un sustrato y expresan CD105 pero no expresan CD200; y aislar dichas celulas de otras celulas corionicas para formar una poblacion de celulas, por ejemplo, una poblacion de OPAC. En una realizacion espedfica, las celulas corionicas CD105+, CD200- que tambien son NG2+, osteoprotegerina+, negativas para alfa actina de musculo liso y/o exhiben actividad de fosfatasa alcalina inducible, estan aisladas de otras celulas corionicas.
En las realizaciones anteriores, el sustrato puede ser cualquier superficie en la cual pueda lograrse el cultivo y/o la seleccion de celulas, por ejemplo, OPAC. Tfpicamente, el sustrato es plastico, por ejemplo, plastico para plato o placa de multiples pocillos para cultivo tisular. El plastico para cultivo tisular puede recubrirse con una biomolecula, por ejemplo, laminina, vitronectina, colageno o fibronectina.
Las OPAC y poblaciones de OPAC pueden seleccionarse mediante cualquier medio conocido en la tecnica de seleccion celular. Por ejemplo, las celulas pueden seleccionarse utilizando un anticuerpo o anticuerpos para uno o mas marcadores de la superficie celular, por ejemplo, en citometna de flujo o FACS. La seleccion puede lograrse utilizando anticuerpos en conjunto con perlas magneticas. Los anticuerpos que son espedficos para determinados marcadores relacionados con las celulas madre son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, CD200 (Abeam) o CD105 (Abeam; BioDesign International, Saco, ME), etc. pueden utilizarse para seleccionar las OPAC o poblaciones de OPAC.
Las poblaciones de OPAC pueden comprender celulas corionicas que no son OPAC o celulas que no son celulas corionicas ni OPAC.
Las poblaciones de OPAC aisladas pueden combinarse con una o mas poblaciones de celulas no OPAC o celulas no corionicas. Por ejemplo, una poblacion aislada de OPAC puede combinarse con sangre (por ejemplo, sangre placentaria o sangre del cordon umbilical), celulas madre derivadas de sangre (por ejemplo, celulas madre derivadas de sangre placentaria o sangre del cordon umbilical), poblaciones de celulas nucleadas derivadas de sangre, celulas mesenquimales derivadas de medula osea, poblaciones de celulas madre derivadas de hueso, medula osea bruta, celulas madre adultas (somaticas), poblaciones de celulas madre contenidas dentro del tejido, celulas madre cultivadas, poblaciones de celulas completamente diferenciadas (por ejemplo, condrocitos, fibroblastos, celulas amnioticas, osteoblastos, celulas de musculo, celulas cardfacas, etc.) y similares. Las celulas en una poblacion de OPAC aislada pueden combinarse con una pluralidad de celulas de otro tipo en relaciones de aproximadamente 100.000.000:1, 50.000.000:1, 20.000.000:1, 10.000.000:1, 5.000.000:1, 2.000.000:1, 1.000.000: 1, 500.000:1, 200.000:1, 100.000:1, 50.000:1, 20.000:1, 10.000:1, 5.000:1, 2.000:1, 1.000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1.000; 1:2.000; 1:5.000; 1:10.000; 1:20.000; 1:50.000; 1:100.000; 1:500.000; 1:1.000.000; 1:2.000.000; 1:5.000.000; 1:10.000.000; 1:20.000.000; 1:50.000.000 o aproximadamente 1:100.000.000, comparando los numeros de celulas nucleadas totales en cada poblacion. Las celulas en una poblacion de OPAC aislada tambien pueden combinarse con una pluralidad de celulas de una pluralidad de tipos de celulas.
Una poblacion aislada de OPAC se combina con una pluralidad de celulas madre hematopoyeticas. Dichas celulas madre hematopoyeticas pueden, por ejemplo, estar contenidas dentro de sangre placentaria no procesada, sangre del cordon umbilical o sangre periferica; en celulas nucleadas totales de sangre placentaria, sangre de cordon umbilical o sangre periferica; en una poblacion aislada de celulas CD34+ de sangre placentaria, sangre del cordon umbilical o sangre periferica; en medula osea no procesada; en celulas nucleadas totales de medula osea; en una poblacion aislada de celulas CD34+ de medula osea o similares.
5.1.4 Combinaciones de OPAC y perfusado placentario o celulas de perfusado placentario
En la presente se divulgan combinaciones de perfusado placentario con celulas de perfusado placentario aisladas y/o las OPAC. En un aspecto, por ejemplo, un volumen de perfusado placentario es complementado con una pluralidad de celulas de perfusado placentario y/o una pluralidad de OPAC. En aspectos espedficos, por ejemplo, cada milfmetro de perfusado placentario se complementa con aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106 o mas celulas de perfusado placentario u OPAc. En otro aspecto, una pluralidad de celulas de perfusado placentario se complementa con un perfusado placentario y/o OPAC. En otro aspecto, una pluralidad de OPAC se complementa con un perfusado placentario y/o una pluralidad de celulas de perfusado placentario. En ciertas realizaciones, cuando el perfusado se utiliza para la complementacion, el volumen del perfusado es
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aproximadamente, mayor que aproximadamente o menor que aproximadamente 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del volumen total de celulas (en solucion) mas perfusado. Cuando las celulas de perfusado placentario se utilizan para complementar una pluralidad de OPAC, las celulas de perfusado placentario generalmente comprenden aproximadamente, mas que aproximadamente o menos que aproximadamente 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del numero total de celulas de perfusado placentario mas OPAC. De manera similar, cuando las OPAC se utilizan para complementar una pluralidad de celulas de perfusado placentario, las OPAC generalmente comprenden aproximadamente, mas que aproximadamente o menos que aproximadamente 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del numero total de celulas de perfusado placentario mas OPAC. Cuando las OPAC o celulas de perfusado placentario se utilizan para complementar el perfusado placentario, el volumen de solucion (por ejemplo, solucion salina, medio de cultivo o similar) en el cual las celulas se suspenden comprende aproximadamente, mas que aproximadamente o menos que aproximadamente 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del volumen total de perfusado mas celulas, donde las OPAC se suspenden a aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o mas celulas por milnrietro antes de la complementacion.
En la presente adicionalmente se divulga un perfusado placentario agrupado que se obtiene de dos o mas fuentes, por ejemplo, dos o mas placentas, y se combina, por ejemplo, agrupa. Dicho perfusado agrupado puede comprender volumenes aproximadamente iguales de perfusado de cada fuente o puede comprender volumenes diferentes de cada fuente. Los volumenes relativos de cada fuente pueden seleccionarse de manera aleatoria o pueden basarse, por ejemplo, en una concentracion o cantidad de uno o mas factores celulares, por ejemplo, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas o similares; el numero de celulas placentarias en perfusado de cada fuente u otra caractenstica de perfusado de cada fuente. El perfusado de perfusiones multiples de la misma placenta puede estar, de manera similar, agrupado.
De manera similar, celulas de perfusado placentario y OPAC se obtienen de dos o mas fuentes, por ejemplo, dos o mas placentas y/o coriones, y se agrupan. Dichas celulas agrupadas pueden comprender cantidades aproximadamente iguales de celulas de dos o mas fuentes o cantidades diferentes de celulas de una o mas de las fuentes agrupadas. Las cantidades relativas de celulas de cada fuente pueden seleccionarse en base, por ejemplo, a la cantidad de uno o mas tipos de celulas espedficos en las celulas a agrupar, por ejemplo, la cantidad de celulas madre CD34-, etc.
Los grupos pueden comprender, por ejemplo, perfusado placentario complementado con celulas de perfusado placentario; perfusado placentario complementado con OPAC; perfusado placentario complementado con celulas de perfusado placentario y OPAC; celulas de perfusado placentario complementadas con perfusado placentario; celulas de perfusado placentario complementadas con OPAC; celulas de perfusado placentario complementadas con perfusado placentario y OPAC; OPAC complementadas con perfusado placentario; OPAC complementadas con celulas de perfusado placentario o OPAC complementadas con celulas de perfusado placentario y perfusado placentario.
En algunos aspectos, el perfusado placentario, las celulas de perfusado placentario y las OPAC se divulgan como unidades administrables de grado farmaceutico. Dichas unidades pueden estar en volumenes discretos, por ejemplo, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 500 mL o similar. Dichas unidades pueden contener un numero especificado de, por ejemplo, celulas de perfusado placentario, celulas destructoras naturales intermedias derivadas de perfusado placentario o ambas, por ejemplo 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x
106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o mas celulas por milfmetro o 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106
1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 10lu, 5 x 10lu, 1 x 10" o mas celulas por unidad. Dichas unidades pueden contener cantidades especificadas de cualesquiera dos o los tres de perfusado placentario, celulas de perfusado placentario y/o OPAC.
En las combinaciones anteriores de perfusado placentario, las celulas de perfusado placentario y/o OPAC, cualquiera, cualesquiera dos o los tres de perfusado placentario, celulas de perfusado placentario y/o OPAC pueden ser autologos con respecto a un receptor (es decir, se obtienen del receptor) u homologos con respecto a un receptor (es decir, se obtienen de al menos otro individuo distinto de dicho receptor).
En la presente tambien se divulgan composiciones que comprenden OPAC en combinacion con celulas de perfusado placentario y/o perfusado placentario. Por lo tanto, en otro aspecto, en la presente se divulga una composicion que comprende OPAC aisladas, en donde dichas celulas madre placentarias se afslan del perfusado placentario y en donde dichas OPAC comprenden al menos 50% de las celulas en la composicion. Dichas OPAC comprenden al menos 80% de las celulas en la composicion. Espedficamente, la composicion comprende un perfusado placentario aislado. Mas espedficamente, dicho perfusado placentario es del mismo individuo que dichas OPAC. Mas espedficamente, dicho perfusado placentario comprende un perfusado placentario de un individuo diferente que dichas OPAC. La composicion puede comprender celulas de perfusado placentario. Dichas celulas de perfusado placentario pueden ser del mismo individuo que dichas OPAC. Alternativamente, dichas celulas de perfusado placentario pueden ser de un individuo diferente que dichas OPAC. Espedficamente, la composicion adicionalmente comprende un perfusado placentario aislado y celulas de perfusado placentario aislado, en donde dicho perfusado aislado y dichas celulas de perfusado placentario aislado son de diferentes individuos. Mas
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espedficamente, dicho perfusado placentario comprende perfusado placentario de al menos dos individuos. Adicionalmente, dichas celulas de perfusado placentario son de al menos dos individuos.
5.1.5 Produccion de un banco de celulas OPAC
Las OPAC de corion postparto pueden cultivarse en una cantidad de diferentes maneras para producir un conjunto de lotes, por ejemplo, un conjunto de dosis administradas individualmente. Los conjuntos de lotes de OPAC obtenidos de una pluralidad de coriones pueden disponerse en un banco de OPAc para, por ejemplo, un almacenamiento a largo plazo. Generalmente, las OPAC se obtienen de un cultivo inicial de material corionico para formar un cultivo seminal, que se expande en condiciones controladas para formar poblaciones a partir de celulas de numeros aproximadamente equivalentes de duplicaciones. Los lotes preferiblemente se derivan del tejido corionico de una sola placenta, pero pueden derivarse del tejido de una pluralidad de placentas.
En un aspecto, los lotes de OPAC se obtienen de la siguiente forma. El tejido corionico primero se altera, por ejemplo, picando, y digiere con una enzima adecuada, por ejemplo, dispasa o dispasa y colageno (ver la Seccion
5.2.3 precedente). El tejido corionico preferiblemente comprende, por ejemplo, el corion entero de una sola placenta, pero puede comprender solo una parte del corion. El tejido digerido se cultiva, por ejemplo, durante aproximadamente 1-3 semanas, preferiblemente aproximadamente 2 semanas. Despues de retirar las celulas no adherentes, las colonias de alta densidad que se forman se recogen, por ejemplo, mediante tripsinizacion. Las celulas se recogen y resuspenden en un volumen conveniente de medio de cultivo y se definen como celulas de Pase 0.
Las celulas de Pase 0 se utilizan entonces para sembrar cultivos de expansion. Los cultivos de expansion pueden ser cualquier arreglo de aparatos de cultivo celular separados, por ejemplo, una Fabrica de Celulas de NUNC™. Las celulas en el cultivo de Pase 0 pueden subdividirse en cualquier grado para sembrar cultivos de expansion con, por ejemplo, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104 o 10 x 104 celulas. Preferiblemente, se utilizan de aproximadamente 2 x 104 a aproximadamente 3 x 104 de celulas de Pase 0 para sembrar dicho cultivo de expansion. El numero de cultivos de expansion puede depender del numero de celulas de Pase 0 y puede ser mayor o menor en numero, dependiendo del corion particular del cual se obtienen las OPAC.
Los cultivos de expansion se cultivan hasta que la densidad de las celulas en el cultivo alcanza un valor determinado, por ejemplo, aproximadamente 1 x 105 de celulas/cm2. Las celulas pueden recogerse y criopreservarse en este momento o pasarse para formar nuevos cultivos de expansion segun se describio anteriormente. Las celulas pueden pasarse, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces antes de su uso. Preferiblemente se mantiene un registro del numero acumulativo de duplicaciones de poblaciones durante el cultivo de expansion. Las celulas de un cultivo de Pase 0 pueden expandirse para 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones o hasta 60 duplicaciones. Sin embargo, preferiblemente, el numero de duplicaciones de poblaciones, antes de dividir la poblacion de celulas en dosis individuales, es de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30, preferiblemente aproximadamente 20 duplicaciones. Las celulas pueden cultivarse continuamente a lo largo del proceso de expansion o pueden congelarse en uno o mas puntos durante la expansion.
Las celulas a utilizar para las dosis individuales pueden congelarse, por ejemplo, criopreservarse para su uso posterior. Las dosis individuales pueden comprender, por ejemplo, de aproximadamente 1 millon a aproximadamente 100 millones de celulas por ml, y pueden comprender de entre aproximadamente 106 y aproximadamente 109 de celulas en total.
Las celulas de Pase 0 se cultivan para aproximadamente 4 duplicaciones y luego se congelan en un primer banco de celulas. Las celulas del primer banco de celulas se congelan y se utilizan para sembrar un segundo banco de celulas, cuyas celulas se expanden para aproximadamente otras ocho duplicaciones. Las celulas en esta etapa se recogen y congelan y se utilizan para sembrar nuevos cultivos de expansion que se dejan desarrollar para aproximadamente ocho duplicaciones adicionales, acercando el numero acumulativo de duplicaciones celulares a aproximadamente 20. Las celulas en los puntos intermedios de los pases pueden congelarse en unidades de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 10 millones de celulas por ml, preferiblemente aproximadamente 1 millon de celulas por ml, para su uso en un cultivo de expansion posterior. Las celulas en aproximadamente 20 duplicaciones pueden congelarse en dosis individuales de entre aproximadamente 1 millon y aproximadamente 100 millones de celulas por ml para la administracion o el uso para preparar una composicion que contiene OPAC.
En un aspecto preferido, el donante del cual se obtiene la placenta (por ejemplo, la madre) se evalua para detectar al menos un patogeno. Si las pruebas de la madre resultan positivas para un patogeno evaluado, el lote completo de la placenta se descarta. Dicha evaluacion puede realizarse en cualquier momento durante la produccion de lotes de celulas OPAC, incluyendo antes o despues de establecer las celulas de Paso 0 o durante el cultivo de expansion. Los patogenos para los cuales la presencia se evalua pueden incluir, a modo no taxativo, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, virus de inmunodeficiencia humana (tipos I y II), citomegalovirus, herpesvirus y similares.
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5.1.6 Diferenciacion de las OPAC
Las OPAC pueden inducirse para diferenciarse, por ejemplo, por una via osteogenica. La diferenciacion osteogenica de las OPAC puede inducirse, por ejemplo, colocando las OPAC en condiciones de cultivo de celulas que inducen la diferenciacion en las celulas osteogenicas. Un medio osteodtico preferido comprende MSCGM (Cambrex) o DMEM complementado con 15% de suero de sangre de cordon, seguido por un Medio de induccion osteogenico (Cambrex) que contiene 0,1 pM de dexametasona, 0,05 mM de acido ascorbico-2-fosfato, 10 mM de beta glicerofosfato. En otra realizacion, las OPAC para uso de acuerdo con la invencion se cultivan en un medio (por ejemplo, DMEM de baja glucosa) que contiene de aproximadamente 10"7 a aproximadamente 10"9 M de dexametasona, aproximadamente 10-50 pM de sal de ascorbato fosfato (por ejemplo, ascorbato-2-fosfato) y aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 mM de p-glicerofosfato. El medio osteogenico tambien puede incluir suero, uno o mas agentes antibioticos/antimicoticos, factor de transformacion de crecimiento beta (por ejemplo, TGF-pl) y/o protema morfogenica osea (por ejemplo, BMP-2, BMP-4 o una combinacion de las mismas).
La diferenciacion puede ensayarse utilizando una tincion espedfica de calcio, por ejemplo tincion de von Kossa y deteccion por RT/PCR de, por ejemplo, fosfatasa alcalina, osteocalcina, sialoprotema osea y/o expresion del gen de la osteopontina.
5.1.7 Preservacion de las OPAC
Las OPAC pueden preservarse, es decir, colocarse en condiciones que permitan un almacenamiento a largo plazo o condiciones que inhiban la muerte celular por, por ejemplo, apoptosis o necrosis.
Las OPAC pueden preservarse utilizando, por ejemplo, una composicion que comprende un inhibidor de la apoptosis, inhibidor de necrosis y/o un perfluorocarbono portador de oxfgeno, segun se describe en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos relacionada No. 60/754.969, titulada "Medio mejorado para recolectar celulas madre placentarias y preservar organos", presentada el 25 de diciembre de 2005. Un metodo para preservar una poblacion de OPAC comprende poner en contacto dicha poblacion de OPAC con una composicion de recoleccion de celulas que comprende un inhibidor de la apoptosis y un perfluorocarbono portador de oxfgeno, en donde dicho inhibidor de la apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficientes para reducir o prevenir apoptosis en la poblacion de las OPAC, en comparacion con una poblacion de OPAC que no esta en contacto con el inhibidor de la apoptosis. Dicho inhibidor de la apoptosis puede ser un inhibidor de caspasa. o ser un inhibidor de JNK. Mas espedficamente, dicho inhibidor de JNK no modula la diferenciacion o proliferacion de dichas OPAC. En otro aspecto, dicha composicion de recoleccion de celulas comprende dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono portador de oxfgeno en fases separadas. En otro aspecto, dicha composicion de recoleccion de celulas comprende dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono portador de oxfgeno en una emulsion. En otro aspecto, la composicion de recoleccion de celulas adicionalmente comprende un emulsionante, por ejemplo, lecitina. En otro aspecto, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono estan entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25°C al momento de ponerse en contacto con las OPAC. En otro aspecto mas espedfico, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono estan entre aproximadamente 2°C y 10°C o entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 5°C al momento de ponerse en contacto con las OPAC. En otro aspecto mas espedfico, dicho contacto se realiza durante el transporte de dicha poblacion de OPAC. En otro aspecto mas espedfico, dicho contacto se realiza durante el congelado y descongelado de dicha poblacion de OPAC.
En otro aspecto, en la presente se divulga un metodo para preservar una poblacion de OPAC que comprende poner en contacto dicha poblacion de OPAC con un inhibidor de la apoptosis y un compuesto que preserve los organos, en donde dicho inhibidor de la apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficientes para reducir o prevenir apoptosis en la poblacion de las OPAC, en comparacion con una poblacion de OPAC que no esta en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una realizacion espedfica, el compuesto que preserva los organos es una solucion UW (descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 4.798.824; tambien conocida como ViaSpan; ver tambien Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990)) o una solucion descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 5.552.267. En otro aspecto, dicho compuesto que preserva los organos es hidroxietil almidon, acido lactobionico, rafinosa o una combinacion de los mismos. En otro aspecto, la composicion de recoleccion de celulas adicionalmente comprende un perfluorocarbono portador de oxfgeno, ya sea en dos fases o como una emulsion.
En otro aspecto del metodo, las OPAC estan en contacto con una composicion de recoleccion de celulas que comprende un inhibidor de la apoptosis y perfluorocarbono portador de oxfgeno, compuesto que preserva los organos o una combinacion de los mismos, durante la perfusion. En otro aspecto, dichas OPAC estan en contacto durante un proceso de alteracion de tejido, por ejemplo, digestion enzimatica. En otro aspecto, las OPAC estan en contacto con dicho compuesto de recoleccion de celulas despues de la recoleccion por perfusion o despues de la recoleccion por alteracion de tejido, por ejemplo, digestion enzimatica.
Tfpicamente, durante la recoleccion, enriquecimiento y aislamiento de las celulas, es preferible minimizar o eliminar el estres celular debido a la hipoxia y estres mecanico. Por lo tanto, las OPAC estan expuestas a una condicion hipoxica durante la recoleccion, enriquecimiento o aislamiento por menos de seis horas durante dicha preservacion, en donde una condicion hipoxica es una concentracion de oxfgeno que es menor que la concentracion normal de oxfgeno en la sangre. Mas espedficamente, dichas OPAC estan expuestas a dicha condicion hipoxica durante
menos de dos horas durante dicha preservacion. Mas espedficamente, las OPAC se exponen a dicha condicion hipoxica durante menos de una hora o menos de treinta minutos o no se exponen a una condicion hipoxica, durante la recoleccion, enriquecimiento o aislamiento. En otro aspecto espedfico, dichas OPAC no se exponen a un estres cortante durante la recoleccion, enriquecimiento o aislamiento.
5 Las OPAC para uso de acuerdo con la invencion pueden criopreservarse, por ejemplo, en un medio de criopreservacion en recipientes pequenos, por ejemplo, ampollas. El medio de criopreservacion adecuado incluye, a modo no taxativo, un medio de cultivo que incluye, por ejemplo, un medio de crecimiento o medio de congelamiento de celulas, por ejemplo un medio de congelamiento de celulas comercialmente disponible, por ejemplo, C2695, C2639 o C6039 (Sigma). El medio de criopreservacion preferiblemente comprende DMSO (dimetilsulfoxido), a una 10 concentracion de, por ejemplo, aproximadamente 10% (v/v). El medio de criopreservacion puede comprender agentes adicionales, por ejemplo, metilcelulosa y/o glicerol. Las OPAC preferiblemente se enfnan a aproximadamente 1°C/min durante la criopreservacion. Una temperatura de criopreservacion preferida es de aproximadamente -80°C a aproximadamente -180°C, preferiblemente de aproximadamente -125°C a aproximadamente -140°C. Las celulas criopreservadas pueden transferirse a nitrogeno lfquido previo a 15 descongelarlas para su uso. Por ejemplo, una vez que las ampollas han alcanzado aproximadamente -90°C, se transfieren a un area de almacenamiento de nitrogeno lfquido. Las celulas criopreservadas preferiblemente se descongelan a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37°C.
5.1.8 Composiciones que comprenden OPAC
20 En la presente se divulgan composiciones que comprenden OPAC o biomoleculas de las mismas. Las OPAC pueden combinarse con cualquier compuesto, composicion o dispositivo fisiologicamente aceptable o medicamente aceptable, para su uso en, por ejemplo, investigacion o tratamiento medico.
5.1.8.1 OPAC criopreservadas
Las poblaciones de OPAC pueden preservarse, por ejemplo, criopreservarse para un uso posterior. Los metodos 25 para la criopreservacion de celulas, tales como las OPAC, son bien conocidos en la tecnica. Las poblaciones de OPAC pueden prepararse en una forma que es facilmente administrable a un individuo. Por ejemplo, una poblacion de OPAc contenida dentro de un recipiente es adecuada para su uso medico. Dicho recipiente puede ser, por ejemplo, una bolsa plastica esteril, matraz, frasco u otro recipiente del cual puede dispensarse facilmente la poblacion de OPAC. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre u otra bolsa plastica medicamente 30 aceptable adecuada para la administracion intravenosa de un lfquido a un receptor. El recipiente es preferiblemente uno que permite la criopreservacion de la poblacion de celulas combinadas.
La poblacion de OPAC criopreservada puede comprender OPAC derivadas de un unico donante o de multiples donantes. La poblacion de OPAC puede ser completamente compatible en HLA para un receptor deseado o parcialmente o completamente incompatible en HLA.
35 Por lo tanto, en un aspecto, en la presente se divulga una composicion que comprende una poblacion de OPAC en un receptor. Espedficamente, la poblacion se criopreserva. Alternativamente, el recipiente es una bolsa, matraz o frasco. Mas espedficamente, dicha bolsa es una bolsa de plastico esteril. Mas espedficamente, dicha bolsa permite, facilita o es adecuada para la administracion intravenosa de una poblacion de OPAC. La bolsa puede comprender multiples lumenes o compartimentos que estan interconectados para permitir el mezclado de las OPAC y una o mas 40 soluciones distintas, por ejemplo, un farmaco, antes o durante la administracion. Espedficamente, la composicion comprende uno o mas compuestos que facilitan la criopreservacion de la poblacion de celulas. Ademas, dicha poblacion de OPAC esta contenida dentro de una solucion acuosa fisiologicamente aceptable. Dicha solucion acuosa fisiologicamente aceptable puede ser una solucion de NaCl al 0,9%. Dicha poblacion de OPAC comprende celulas placentarias que son compatibles en HLA para un receptor de dicha poblacion, o comprende celulas que son 45 al menos parcialmente incompatibles en HLA para un receptor de dicha poblacion. Dichas OPAC pueden proceder de una pluralidad de donantes.
5.1.8.2 Composiciones farmaceuticas
Las poblaciones de OPAC, o poblaciones de celulas que comprenden OPAC, pueden formularse en composiciones farmaceuticas para utilizar in vivo. Dichas composiciones farmaceuticas comprenden una poblacion de OPAC, o una 50 poblacion de celulas que comprende OPAC, en un portador farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, una solucion salina u otra solucion fisiologicamente aceptable para administracion in vivo. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender cualquiera de las poblaciones de OPAC descritas en cualquier otra parte en la presente. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender OPAC fetales, maternales o tanto fetales como maternales. Las composiciones farmaceuticas proporcionadas en la presente pueden comprender ademas OPAC obtenidas de un 55 solo individuo o corion o de una pluralidad de individuos o coriones.
Las composiciones farmaceuticas pueden comprender cualquier numero terapeuticamente util de OPAC. Por ejemplo, una unica dosis de OPAC puede comprender, en varias realizaciones, aproximadamente, al menos o a lo
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mas OPAC.
Las composiciones farmaceuticas pueden comprender poblaciones de celulas que comprenden 50% de celulas viables o mas (es decir, al menos aproximadamente 50% de las celulas en las poblaciones son funcionales o vivas). Preferiblemente, al menos aproximadamente 60% de las celulas en la poblacion son viables. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las celulas en la poblacion en la composicion farmaceutica son viables.
Las composiciones farmaceuticas pueden comprender uno o mas compuestos que, por ejemplo, facilitan la insercion (por ejemplo, anticuerpos del receptor anti-celulas T, un inmunosupresor o similar); estabilizadores tales como albumina, dextrano 40, gelatina, almidon de hidroxietilo y similares.
5.1.8.3 Medios acondicionados con OPAC
Las OPAC para uso de acuerdo con la invencion pueden utilizarse para producir un medio acondicionado, es decir, un medio que comprende una o mas biomoleculas secretadas o excretadas por las celulas. En varios aspectos, el medio acondicionado comprende un medio en el cual las OPAC han crecido durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o mas dfas. En otros aspectos, el medio acondicionado comprende un medio en el que las OPAC han crecido hasta al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de confluencia o hasta 100% de confluencia. Dicho medio acondicionado puede utilizarse como soporte del cultivo de una poblacion separada de OPAC o celulas madre de otro tipo. En otro aspecto, el medio acondicionado comprende un medio en el que las OPAC se han diferenciado en un tipo de celula diferenciado terminalmente o una celula que tiene una o mas caractensticas de una celula terminalmente diferenciada. En otro aspecto, el medio acondicionado comprende un medio en el que las OPAC y no OPAC se han cultivado.
5.1.8.4 Matrices que comprenden OPAC
Se proporcionan tambien en la presente matrices, hidrogeles, andamios y similares que comprenden dichas OPAC. En ciertas realizaciones, la matriz puede ser cualquier sustrato conocido por los expertos en la tecnica util para tratar los defectos oseos. Por ejemplo, la matriz puede ser un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno mineralizado y un sustrato de acido hialuronico. En algunas realizaciones, el colageno en la matriz puede ser colageno placentario. Los metodos y composiciones para aislar y preparar colageno placentario se describen exhaustivamente, por ejemplo, en la Publicacion de Solicitud de Patente No. 2007/0020225.
Las OPAC pueden sembrarse en la matriz para tratar los huesos antes o despues de una etapa de diferenciacion. Por ejemplo, las OPAC pueden cultivarse en, por ejemplo, un medio osteogenico durante, por ejemplo, aproximadamente 1-20 dfas, y luego se siembran en la matriz. Alternativamente, las OPAC pueden aislarse y sembrarse en la matriz, luego cultivarse en un medio osteogenico tal como se describe en la presente durante, por ejemplo, aproximadamente 1-20 dfas. En otra realizacion, las OPAC se cultivan en, por ejemplo, un medio osteogenico durante, por ejemplo, aproximadamente 1-20 dfas, luego se siembran en la matriz, se cultivan en un medio osteogenico tal como se describe en la presente durante, por ejemplo, aproximadamente 1-20 dfas.
Las OPAC pueden sembrarse en una matriz natural, por ejemplo, biomaterial placentario tal como un material de membrana amniotica. Dicho material de membrana amniotica puede ser, por ejemplo, membrana amniotica disecada directamente de una placenta de mairnfero; membrana amniotica fijada o tratada con calor, membrana amniotica basicamente seca (es decir, <20% de H2O), membrana corionica, membrana corionica basicamente seca, membrana amniotica basicamente seca y membrana corionica, y similares. Biomateriales placentarios preferidos en los cuales pueden sembrarse las OPAC se describen en Hariri, Publicacion de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0048796.
Las OPAC pueden suspenderse en una solucion de hidrogel adecuada para, por ejemplo, inyeccion. Hidrogeles adecuados para dichas composiciones incluyen peptidos de autoensamblaje, tales como RAD 16. En una realizacion, una solucion de hidrogel que comprende las celulas puede dejarse endurecer, por ejemplo, en un molde, para formar una matriz que tiene celulas dispersas en la misma para implantacion. Las OPAC en dicha matriz tambien pueden cultivarse de forma tal que las celulas se expandan mediante mitosis antes de la implantacion. El hidrogel es, por ejemplo, un polfmero organico (natural o sintetico) que se reticula mediante enlaces covalentes, ionicos o de hidrogeno para crear una estructura abierta tridimensional que atrapa las moleculas de agua para formar un gel. Materiales de formacion de hidrogeles incluyen polisacaridos tales como alginato y sales de los mismos, peptidos, polifosfazinas y poliacrilatos, que se reticulan ionicamente, o polfmeros de bloque tales como copolfmeros de oxido de polietileno-propilenglicol, que se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. En algunas realizacioness, el hidrogel o matriz es biodegradable.
En algunas realizaciones, la formulacion comprende un gel polimerizable in situ (ver, por ejemplo, la Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2002/0022676; Anseth et al, J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22): 3969-80 (2003).
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En algunas realizaciones, los poKmeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas tamponadas o soluciones de alcohol acuosas, que tienen grupos laterales cargados o una sal ionica monovalente de los mismos. Ejemplos de polfmeros que tienen grupos laterales acidos que pueden reaccionar con cationes son poli(fosfazenos), acido poli(acnlicos), acidos poli(metacnlicos), copoKmeros de acido acnlico y acido metacnlico, acetato poli(vimlico) y poKmeros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado. Copolfmeros que tienen grupos laterales acidos formados por reaccion de acido acnlico o metacnlico y monomeros o polfmero de eter vimlico tambien pueden utilizarse. Ejemplos de grupos acidos son grupos de acido carboxflico, grupos de acido sulfonico, grupos de alcohol halogenados (preferiblemente fluorados), grupo OH fenolicos y grupos OH acidos.
Las OPAC o poblaciones de las mismas pueden sembrarse sobre un marco tridimensional o andamio o implantarse in vivo. Dicho marco puede implantarse en combinacion con cualquiera de uno o mas factores de crecimiento, celulas, farmacos u otros componentes que estimulan la formacion de tejido o de otro modo potencian o mejoran la reparacion del tejido.
Ejemplos de andamios que pueden utilizarse incluyen esteras no tejidas, espumas porosas o peptidos auto- ensamblados. Las esteras no tejidas pueden formarse usando fibras que comprenden un copolfmero absorbible sintetico de acidos glicolicos y lacticos (por ejemplo, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). Espumas, compuestas por, por ejemplo, copolfmero de poli(£-caprolactona)/acido poli(glicolico) (PCL/PGA), formadas por procesos tales como liofilizacion (ver, por ejemplo, la Pat. de los Estados Unidos No. 6.355.699), tambien pueden utilizarse como andamios.
Las OPAC proporcionadas en la presente tambien pueden sembrarse en, o ponerse en contacto con, material de ceramica fisiologicamente aceptable incluido, a modo no taxativo, mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri- y tetra-fosfato de calcio, hidroxiapatita, fluoroapatitas, sulfatos de calcio, fluoruros de calcio, oxidos de calcio, carbonatos de calcio, fosfatos de calcio de magnesio, vidrios biologicamente activos tales como BIOGLASS® y mezclas de los mismos. Materiales de ceramica biocompatibles porosos disponibles actualmente en el mercado incluyen SURGIBONE® (CanMedica Corp., Canada), eNdOBON® (Merck Biomaterial France, Francia), CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Suiza) y productos de injertos oseos de colageno mineralizado tales como HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) y VITOSS®, RHAKOSS™ y CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). El marco puede ser una mezcla, combinacion o compuesto de materiales naturales y/o sinteticos.
En otra realizacion, las OPAC pueden sembrarse en, o ponerse en contacto con, un fieltro, que puede, por ejemplo, estar compuesto por un hilo multifilamento hecho de material bioabsorbible tal como copolfmero o combinaciones de PGA, PLA, PCL o acido hialuronico.
Las OPAC pueden, en otra realizacion, sembrarse en andamios de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Dichos andamios de espuma pueden moldearse en una forma util, tal como la de una porcion de una estructura espedfica en el cuerpo que debe repararse, reemplazarse o aumentarse. En algunos aspectos, el marco se trata, por ejemplo, con 0,1 M de acido acetico mediante incubacion en polilisina, PBS y/o colageno, antes de la inoculacion de las OPAC para mejorar la union celular. Las superficies externas de una matriz pueden modificarse para mejorar la union o crecimiento de celulas y la diferenciacion de tejido, tal como mediante recubrimiento con plasma de la matriz, o adicion de una o mas protemas (por ejemplo, colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glicoprotemas, glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitin-4-sulfato, condroitin-6-sulfato, sulfato de dermatan, sulfato de queratina, etc.), una matriz celular y/u otros materiales tales como, a modo no taxativo, gelatina, alginatos, agar, agarosa y gomas vegetales y similares.
En otra realizacion, el andamio comprende, o se trata con, materiales que lo hacen no trombogenico. Estos tratamientos y materiales tambien pueden promover y sostener el crecimiento endotelial, migracion y deposicion de matriz extracelular. Ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, a modo no taxativo, materiales naturales tales como protemas de membrana base tales como laminina y colageno Tipo IV, materiales sinteticos tales como EPTFE y siliconas de poliuretanourea segmentadas, tales como PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif). El andamio tambien puede comprender agentes antitromboticos tales como heparina; los andamios tambien pueden tratarse para alterar la carga de la superficie (por ejemplo, recubriendo con plasma) antes de sembrar con OPAC. El andamio puede comprender ademas agentes que estimulan el crecimiento oseo y/o inhiben la resorcion osea. Por ejemplo, el andamio puede comprender protemas morfogenicas oseas, por ejemplo, BMP-2 y/o BMP-7, inhibidores de WNT y similares.
5.1.9 Lmeas celulares OPAC inmortalizadas
Las OPAC pueden inmortalizarse de forma acondicionada mediante transfeccion con cualquier vector adecuado que contiene un gen promotor del crecimiento, es decir, un gen que codifica una protema que, en las condiciones apropiadas, promueve el crecimiento de la celula transfectada, de forma tal que la produccion y/o actividad de la protema promotora del crecimiento es regulable mediante un factor externo. En un aspecto preferido el gen promotor del crecimiento es un oncogen tal como, a modo no taxativo, v-myc, N-myc, c-myc, p53, antfgeno T grande de SV40, antfgeno T grande de polioma, adenovirus EIa o protema E7 de papilomavirus humano.
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La regulacion externa de la protema promotora del crecimiento puede logarse colocando el gen promotor del crecimiento bajo el control de un promotor externamente regulable, por ejemplo, un promotor cuya actividad puede controlarse mediante, por ejemplo, modificacion de la temperature de las celulas transfectadas o la composicion del medio en contacto con las celulas. En un aspecto, puede emplearse un sistema de expresion genica controlada por tetraciclina (tet) (ver Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93:1518-1523, 1996). En ausencia de la tet, un transactivador controlado por tet (tTA) dentro de este vector activa fuertemente la transcripcion de phcwv-1, un promotor mmimo del citomegalovirus humano fusionado con secuencias operadoras tet. La tTA es una protema de fusion del represor (tetR) del operon de resistencia a tet derivada de transposon-10 de Escherichia coli y el dominio acido de VP16 del virus del herpes simplex. Concentraciones no toxicas bajas de tet (por ejemplo, 0,01-1,0 pg/mL) suprimen casi completamente la transactivacion mediante tTA.
El vector contiene ademas un gen que codifica un marcador seleccionable, por ejemplo, una protema que confiere resistencia a los farmacos. El gen de resistencia a la neomicina bacteriana (neoR) es un marcador tal que puede emplearse como se describe en la presente. Las celulas que portan neoR pueden seleccionarse por medios conocidos por los expertos en la tecnica, tal como la adicion de, por ejemplo, 100-200 pg/mL de G418 al medio de cultivo.
La transfeccion puede lograrse por cualquiera de una variedad de medios conocidos por los expertos en la tecnica que incluyen, a modo no taxativo, la infeccion retroviral. En general, un cultivo celular puede transfectarse mediante incubacion con una mezcla de medio acondicionado recolectada de la lmea celular del productor para el vector y DMEM/F12 que contiene complementos de N2. Por ejemplo, un cultivo celular placentario preparado como se describio anteriormente puede infectarse despues de, por ejemplo, cinco dfas in vitro mediante incubacion durante aproximadamente 20 horas en un volumen de medio acondicionado y dos volumenes de DMEM/F12 que contiene complementos de N2. Las celulas transfectadas que portan un marcador seleccionable pueden seleccionarse entonces tal como se describio anteriormente.
Tras la transfeccion, los cultivos se pasan sobre una superficie que permite la proliferacion, por ejemplo, permite que al menos aproximadamente 30% de las celulas se dupliquen en un penodo de 24 horas. Preferiblemente, el sustrato es un sustrato de poliornitina/laminina, que consiste en plastico de cultivo tisular recubierto con poliornitina (10 pg/mL) y/o laminina (10 pg/mL), un sustrato de polilisina/laminina o un superficie tratada con fibronectina. Los cultivos se alimentan entonces cada 3-4 dfas con un medio de cultivo, que puede complementarse o no con uno o mas factores que mejoran la proliferacion. Pueden agregarse al medio de cultivo factores que mejoran la proliferacion cuando los cultivos son menos de 50% confluentes.
Las lmeas celulares OPAC inmortalizadas de forma acondicionada pueden pasarse usando tecnicas estandar, tal como mediante tripsinizacion, cuando son 80-95% confluentes. Hasta aproximadamente el vigesimo paso, en algunas realizaciones, es beneficioso mantener la seleccion (mediante, por ejemplo, la adicion de G418 para celulas que contienen un gen de resistencia a la neomicina). Las celulas tambien pueden congelarse en nitrogeno lfquido para almacenamiento a largo plazo.
Las lmeas celulares clonales pueden aislarse de una lmea celular OPAC humana inmortalizada de forma acondicionada tal como se describio anteriormente. En general, dichas lmeas celulares clonales pueden aislarse usando tecnicas estandar, tal como mediante dilucion o usando anillos de clonacion y expandirse. Las lmeas celulares clonales pueden alimentarse en general y pasarse tal como se describio anteriormente.
Las lmeas celulares OPAC humanas inmortalizadas de forma acondicionada, que pueden ser clonales, pero no necesariamente lo son, pueden inducirse en general para diferenciarse mediante supresion de la produccion y/o actividad de la protema promotora de crecimiento en condiciones que facilitan la diferenciacion. Por ejemplo, si el gen que codifica la protema promotora del crecimiento esta bajo el control de un promotor externamente regulable, las condiciones, por ejemplo, temperatura o composicion del medio, pueden modificarse para suprimir la transcripcion del gen promotor del crecimiento. Para el sistema de expresion genica controlada por tetraciclina que se describio anteriormente, la diferenciacion puede lograrse mediante adicion de la tetraciclina para suprimir la transcripcion del gen promotor de crecimiento. En general, 1 pg/mL de tetraciclina durante 4-5 dfas es suficiente para iniciar la diferenciacion. Para promover una mayor diferenciacion, pueden incluirse agentes adicionales en el medio de cultivo.
5.1.10 Ensayos
Las OPAC pueden utilizarse en ensayos para determinar la influencia de las condiciones de cultivo, los factores ambientales, moleculas (por ejemplo, biomoleculas, pequenas moleculas inorganicas, etc.) y similares en la proliferacion, expansion y/o diferenciacion de OPAC, en comparacion con las OPAC no expuestas a dichas condiciones.
En una realizacion preferida, las OPAC se ensayan en busca de cambios en la proliferacion, expansion o diferenciacion tras el contacto con una molecula. Por ejemplo, la diferenciacion osteogenica puede ensayarse monitoreando la actividad de fosfatasa alcalina y/o mineralizacion de calcio.
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Se divulga en la presente un metodo para identificar un compuesto que modula la proliferacion de una pluralidad de OPAC, que comprende poner en contacto dicha pluralidad de OPAC con dicho compuesto en condiciones que permiten la proliferacion, en donde si dicho compuesto provoca un cambio detectable en la proliferacion de dicha pluralidad de OPAC en comparacion con una pluralidad de OPAC que no entran en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto es identificado como un compuesto que modula la proliferacion de OPAC. Dicho compuesto puede identificarse como un inhibidor de proliferacion o como un potenciador de proliferacion.
Ademas se divulga en la presente un metodo para identificar un compuesto que modula la expansion de una pluralidad de OPAC, que comprende poner en contacto dicha pluralidad de OPAC con dicho compuesto en condiciones que permiten la expansion, en donde si dicho compuesto provoca un cambio detectable en la expansion de dicha pluralidad de OPAC en comparacion con una pluralidad de OPAC que no entra en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto es identificado como un compuesto que modula la expansion de OPAC. Dicho compuesto puede identificarse como un inhibidor de expansion, o como un potenciador de expansion.
Ademas se divulga en la presente un metodo para identificar un compuesto que modula la diferenciacion de OPAC, que comprende poner en contacto dichas OPAC con dicho compuesto en condiciones que permiten la diferenciacion, en donde si dicho compuesto provoca un cambio detectable en la diferenciacion de dichas OPAC en comparacion con las OPAC que no entran en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto es identificado como un compuesto que modula la proliferacion de OPAC. Dicho compuesto se puede identificar como un inhibidor de la proliferacion, o como un potenciador de proliferacion.
5.2 USOS DE LAS OPAC
5.2.1 Tratamiento de canceres relacionados con los huesos usando OPAC
Se divulgan en la presente metodos para tratar individuos que tienen cancer relacionado con los huesos que comprenden administrar al individuo una cantidad terapeuticamente efectiva de OPAC. Los canceres relacionados con los huesos incluyen, a modo no taxativo, mieloma multiple, cancer oseo, cancer de mama, cancer de pulmon, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, cordoma, histiocitoma maligno fibroso oseo, fibrosarcoma oseo, cancer metastasico, mieloma multiple y cualquier forma de cancer metastasico caracterizado por metastasis osea. En algunos aspectos, la administracion de OPAC es terapeuticamente efectiva para reducir, mejorar o revertir uno o mas smtomas asociados con el cancer relacionado con los huesos, por ejemplo, un smtoma causado por o relacionado con un efecto del cancer en uno o mas huesos en el individuo. Como lo reconocera un experto en la tecnica, el tratamiento de los defectos oseos causados por cancer puede no necesariamente abatir el cancer en sf mismo. El tratamiento de los defectos oseos relacionados con el cancer tal como los proporcionados en la presente puede ocurrir antes, despues o simultaneamente a las terapias adicionales contra el cancer, tal como se describe mas abajo. Por lo tanto, en una realizacion, los defectos oseos son tratados antes de que el cancer se trate con una terapia anti-cancer. En otra realizacion, los defectos oseos se tratan al mismo tiempo o practicamente al mismo tiempo en que se trate el cancer con la terapia anti-cancer. En otra realizacion, los defectos oseos se tratan despues de que el cancer se trate con una terapia anti-cancer.
En algunos aspectos, el tratamiento de canceres relacionados con los huesos, por ejemplo, mieloma multiple, comprende administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de OPAC a un individuo que tiene celulas de cancer relacionado con los huesos, por ejemplo, celulas de mieloma multiple, en donde al menos algunas de dichas OPAC se ponen en contacto directamente con al menos algunas celulas de mieloma multiple, por ejemplo, hay un contacto directo celula-celula entre al menos algunas de dichas OPAC y algunas de dichas celulas de cancer relacionado con los huesos. En ciertos aspectos, el tratamiento de canceres relacionados con los huesos, por ejemplo, mieloma multiple, comprende administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de OPAC a un individuo que tiene celulas de cancer relacionado con los huesos, por ejemplo, celulas de mieloma multiple, en donde ninguna o basicamente ninguna de dichas OPAC se ponen en contacto directamente con celulas de mieloma multiple, por ejemplo, no hay, o basicamente casi no hay, un contacto directo celula-celula entre al menos algunas de dichas OPAc y celulas de cancer relacionado con los huesos.
En algunos aspectos, las OPAC se administran intralesionalmente, por ejemplo, directamente en, o adyacente a (por ejemplo, dentro de 1-5 cm de) una o mas lesiones causadas por el cancer. En ciertos aspectos, las OPAC se administran en combinacion con una matriz, por ejemplo, una matriz inyectable.
En algunas realizaciones, las OPAC se administran a un individuo que tiene cancer relacionado con los huesos con una matriz solida, por ejemplo, un sustituto de matriz, por ejemplo, un sustituto de hueso, una matriz o un sustituto de hueso descrito en la Seccion 5.2.2 a continuacion.
En ciertas otras realizaciones, las OPAC se administran por via intravenosa al individuo. Las OPAC pueden administrarse de cualquier recipiente, y mediante cualquier sistema de administracion, medicamente adecuado para administracion de fluidos, por ejemplo, fluidos que comprenden celulas, a un individuo. Dichos recipientes pueden ser, por ejemplo, una bolsa de plastico esteril, matraz, frasco u otro recipiente del cual la poblacion de OPAC puede dispensarse facilmente. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre u otra bolsa de plastico medicamente aceptable adecuada para administracion intravenosa de un lfquido a un receptor.
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La administracion intralesional o intravenosa puede comprender, por ejemplo, aproximadamente, al menos, o mas de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106 , 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o mas OPAC en una unica dosis. Las OPAC pueden administrarse una vez, o mas de una vez, durante el transcurso de la terapia. Preferiblemente, las OPAC administradas comprenden 50% de celulas viables o mas (es decir, al menos aproximadamente 50% de las celulas en la poblacion son funcionales o estan vivas). Preferiblemente, al menos aproximadamente 60% de las celulas en la poblacion son viables. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las celulas en la poblacion en la composicion farmaceutica son viables.
5.2.1.1 Tratamiento de Mieloma Multiple
Se describen aqu metodos de tratamiento de un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar a dicho individuo una pluralidad de OPAC, en donde dichas OPAC tienen cualquier combinacion de, o todas, las caractensticas descritas en la Seccion 5.1, anteriormente. En un aspecto espedfico, dicha pluralidad de OPAC es CD105+ y CD200tenue o CD105+ y CD200-. Los metodos de tratamiento proporcionados en la presente comprenden el uso de cualquiera de las OPAC, poblaciones de OPAC o poblaciones de celulas que comprenden OPAC, descritas en la Seccion 5.1, anteriormente.
El mieloma multiple es un cancer de celulas de plasma, que son celulas que producen anticuerpos del sistema inmunitario. La enfermedad normalmente se presenta con cuatro caractensticas principales: calcio elevado, insuficiencia renal, anemia y lesiones oseas. Estos smtomas y otros se describen mas adelante.
Dolor de huesos - Las celulas de mieloma secretan IL-6, tambien conocido como factor activador de osteoclastos (OAF), que es una citoquina que activa los osteoclastos para romper los huesos, creando lesiones oseas dolorosas. Estas lesiones oseas son de naturaleza lftica y son visibles en radiograffas, que pueden mostrar lesiones resortivas "perforadas". El dolor en los huesos por mieloma normalmente involucra a la columna y las costillas y empeora con la actividad. Se puede sentir dolor localizado persistente presente y puede indicar una fractura osea patologica. La implicacion de las vertebras puede provocar la compresion de la medula osea. La rotura de hueso tambien provoca la liberacion de calcio en la sangre, produciendo hipercalcemia y sus smtomas asociados.
Las areas de rotura de hueso, como se ve en un estudio esqueletico, normalmente aparecen como una o mas lesiones ltticas en el hueso, es decir, regiones en las que el hueso parece ausente o "perforado."
Infeccion - Otro smtoma comun del mieloma multiple es la infeccion, en la medida que se altera el sistema inmunitario. El riesgo de infeccion se debe a la deficiencia inmunitaria que resulta de hipogamaglobulinemia difusa, que se debe a una menor produccion o mayor destruccion de anticuerpos normales. Las infecciones mas comunes son las neumomas y pielonefritis. Los patogenos de neumoma comun que provocan enfermedad en pacientes con mieloma multiple incluyen Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae, mientras que los patogenos comunes que causan pielonefritis incluyen Escherichia coli. Normalmente, la infeccion ocurre en los meses iniciales despues del comienzo de la quimioterapia.
Insuficiencia renal - El mieloma multiple tambien tiende a resultar en insuficiencia renal, que puede desarrollarse de forma aguda y cronica. La insuficiencia renal en el mieloma multiple se puede atribuir en gran medida a hipercalcemia, que se desarrolla cuando los osteoclastos desmantelan el hueso existente. La insuficiencia renal tambien es provocada por dano tubular por la excrecion de cadenas livianas, tambien denominadas protemas Bence Jones, que puede manifestarse como el smdrome de Fanconi (acidosis tubular renal tipo II). Otras causas incluyen deposicion glomerular de amiloide, hiperuricemia, infecciones recurrentes (por ejemplo, pielonefritis) e infiltracion local de celulas tumorosas. La insuficiencia renal puede asociarse con niveles elevados de creatinina en suero.
Anemia - La anemia que se encuentra en el mieloma normalmente es normodtica y normocromica, y resulta del reemplazo de medula osea normal por infiltracion de celulas tumorosas y la inhibicion de la produccion de globulos rojos normales (hematopoyesis) mediante citoquinas.
S^ntomas neurologicos - Los smtomas de mieloma multiple incluyen un espectro de afecciones neurologicas, incluidas debilidad, confusion y fatiga debido a dolor de cabeza por hipercalcemia, cambios visuales y retinopatfa, que pueden ser el resultado de hiperviscosidad de la sangre dependiendo de las propiedades de la paraprotema (ver mas adelante). Otros smtomas neurologicos incluyen dolor radicular, perdida de control de los intestinos o la vejiga (por ejemplo, debido al involucramiento de la medula espinal que provoca compresion de la medula), y smdrome de tunel carpiano y otras neuropatfas (por ejemplo, debido a infiltracion de los nervios perifericos por amiloide). El mieloma multiple puede dar lugar a paraplejia en casos de presentacion tardfa.
Presencia de paraprote^na - Un smtoma de diagnostico del mieloma multiple es la presencia en la sangre y/u orina de paraprotema, que es una protema monoclonal (protema M), por ejemplo, una cadena liviana de inmunoglobulina que se produce por la proliferacion clonal de celulas de plasma o fragmentos de inmunoglobulina.
El mieloma multiple sintomatico normalmente se diagnostica cuando estan presentes los siguientes smtomas o signos: celulas de plasma clonales que constituyen mas del 10% de las celulas en la biopsia de la medula osea, en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos (por ejemplo, plasmacitoma); paraprotema en suero u orina;
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pruebas de dano a organos afectados (alteracion del organo o tejido relacionado), por ejemplo, hipercalcemia (por ejemplo, calcio corregido >2,75 mmol/L en la sangre), insuficiencia renal atribuible a mieloma, anemia definida como hemoglobina <10 g/dL de sangre, lesiones oseas (por ejemplo, lesiones ltticas u osteoporosis con fracturas de compresion, infecciones severas frecuentes (>2 por ano), amiloidosis (la deposicion de protema amiloide) de otros organos y smdrome de hiperviscosidad (aumento de la viscosidad de la sangre).
Los individuos que tienen mieloma multiple entran en uno de los siguientes grupos. En un aspecto, el individuo que padece mieloma multiple nunca ha sido tratado por la enfermedad. En otro aspecto, el individuo tiene mieloma sensible; es decir, mieloma multiple que responde a la terapia. En un aspecto espedfico, dicho individuo exhibe una disminucion de la protema M (paraprotema) de al menos 50% como resultado del tratamiento. En otro aspecto espedfico, el individuo exhibe una disminucion de la protema M de entre 25% y 50% como resultado del tratamiento. En otro aspecto, el individuo tiene mieloma multiple estable, que se refiere a mieloma que no ha respondido al tratamiento (por ejemplo, la disminucion de la protema M no llego a 50%), pero no evoluciono ni empeoro. En otro aspecto, el individuo tiene mieloma multiple progresivo, que se refiere a mieloma activo que esta empeorando (por ejemplo, aumentando la protema y empeorando la deficiencia del organo o tejido o dano al organo afectado). En otro aspecto, el individuo tiene recafda de mieloma multiple, que se refiere a enfermedad de mieloma que inicialmente respondio a terapia pero comenzo a progresar nuevamente. En un aspecto espedfico, el individuo ha recafdo despues de terapia inicial o ha recafdo a terapia posterior. En otro aspecto, el individuo tiene mieloma multiple refractario. En un aspecto espedfico, el mieloma multiple refractario es mieloma multiple que no ha respondido a terapia inicial. En un aspecto espedfico, el mieloma multiple refractario es mieloma multiple que ha recafdo que no ha respondido a tratamiento posterior. En otro aspecto espedfico, el mieloma multiple refractario es una enfermedad refractaria que no responde al tratamiento, es decir, enfermedad refractaria que esta progresando. En otro aspecto espedfico, el mieloma multiple refractario es una enfermedad refractaria que no responde al tratamiento y no progresa, es decir, enfermedad refractaria que no empeora.
De esta forma, en la presente se divulga un metodo para tratar a un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar al individuo OPAC, una poblacion de OPAC o una poblacion de celulas que comprenden OPAC, en donde dicha administracion da como resultado la reduccion detectable de la progresion, el cese detectable del empeoramiento y/o la mejora detectable de uno o mas smtomas del mieloma multiple. En aspectos espedficos, dicho smtoma o smtomas comprenden calcio en sangre u orina elevada en comparacion con lo normal, la presencia de lesiones oseas, anemia o insuficiencia renal. En un aspecto mas espedfico, dicho smtoma o smtomas comprenden celulas de plasma clonal que constituyen mas de 10% de celulas en la biopsia de medula osea o en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos (por ejemplo, plasmacitoma); paraprotema en suero u orina y/o pruebas de dano al organo afectado. En un aspecto mas espedfico, dicho smtoma o smtomas son una concentracion de calcio en la sangre de mas de 2,75 mmol/L, insuficiencia renal, menos de 10 g de hemoglobina por decilitro de sangre, la presencia de lesiones oseas o amiloidosis de uno o mas organos que no sea la medula osea.
En otro aspecto espedfico, dicho smtoma es un smtoma neurologico. En aspectos mas espedficos, dichos smtomas neurologicos son debilidad, confusion, fatiga, dolor de cabeza, cambios visuales, retinopatfa, dolor radicular, perdida de control de los intestinos o vejiga, smdrome de tunel carpiano y/o paraplejia.
En un aspecto, en la presente se divulga un metodo para tratar un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar al individuo OPAC, una poblacion de OPAC o una poblacion de celulas que comprenden OPAC, en donde dicha administracion da como resultado la reduccion detectable en el numero de celulas de mieloma multiple, por ejemplo, celulas de mieloma multiple clonales, en uno o mas organos del individuo.
En un aspecto, en la presente se divulga un metodo para tratar un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar al individuo OPAC, una poblacion de OPAC o una poblacion de celulas que comprenden OPAC, en donde dicha administracion da como resultado el aumento detectable de hemoglobina en la sangre del individuo, por ejemplo, un aumento hasta dentro de los lfmites normales. Los niveles de hemoglobina normales vanan segun la edad y el sexo del individuo, tal como se muestra en la Tabla 1, a continuacion:
Tabla 1
Recien nacidos
17-22 gm/dl
Una (1) semana de edad
15-20 gm/dl
Un (1) mes de edad
11-15 gm/dl
Ninos
11-13 gm/dl
Hombres adultos
14-18 gm/dl
Mujeres adultas
12-16 gm/dl
Hombres despues de la edad madura
12,4-14,9 gm/dl
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Mujeres despues de la edad madura
11,7-13,8 gm/dl
De esta forma, en la presente se divulga un metodo para tratar un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar al individuo OPAC, una poblacion de OPAC o una poblacion de celulas que comprenden OPAC, en donde dicha administracion da como resultado el aumento de niveles de hemoglobina en sangre en dicho individuo hasta entre 11 g/dL de sangre y 20 g/dL de sangre. En un aspecto mas espedfico, dicha administracion da como resultado el aumento de los niveles de hemoglobina en sangre en dicho individuo hasta entre 11 g/dL de sangre y 13 g/dL de sangre. En otro aspecto mas espedfico, dicha administracion da como resultado el aumento de los niveles de hemoglobina en sangre en dicho individuo hasta entre 12 g/dL de sangre y 16 g/dL de sangre. En otro aspecto mas espedfico, dicha administracion da como resultado el aumento de los niveles de hemoglobina en sangre en dicho individuo hasta entre 14 g/dL de sangre y 18 g /dL de sangre.
En otro aspecto, en la presente se divulga un metodo para tratar un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar al individuo OPAC, una poblacion de OPAC o una poblacion de celulas que comprenden OPAC, en donde dicha administracion da como resultado una reduccion detectable del nivel de paraprotema en sangre u orina de dicho individuo. En un aspecto espedfico, dicha administracion da como resultado la reduccion de la paraprotema en sangre u orina de dicho individuo hasta un nivel no detectable.
En otro aspecto, en la presente se divulga un metodo para tratar un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar al individuo OPAC, una poblacion de OPAC o una poblacion de celulas que comprenden OPAC, en donde dicha administracion da como resultado una reduccion detectable de la gravedad y/o el numero de lesiones oseas causadas por mieloma multiple en dicho individuo, tal como se determina, por ejemplo, por escaneo de huesos o radiograffa. En otro aspecto, en la presente se divulga un metodo para tratar un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar al individuo OPAC, una poblacion de OPAC o un poblacion de celulas que comprende OPAC, en donde dicha administracion da como resultado una reduccion detectable de la perdida de masa osea o contenido mineral oseo, cese de perdida de masa osea o contenido mineral oseo, o aumento de la masa osea o contenido mineral oseo, en dicho individuo.
Dicho uno o mas smtomas de mieloma multiple son dolor en los huesos, lesiones osteodticas (por ejemplo, visibles mediante rayos X o formacion de imagenes por resonancia magnetica (MRI)), osteoporosis, anemia, hipercalcemia o un smtoma debido a hipercalcemia o insuficiencia renal. En otros aspectos, dicho individuo nunca ha sido tratado por mieloma multiple; dicho individuo ha sido tratado por mieloma multiple y responde a terapia sin OPAC; dicho individuo ha sido tratado contra mieloma multiple y no ha respondido a terapia sin OPAC, pero el mieloma multiple en dicho individuo no ha progresado; o dicho individuo tiene mieloma multiple.
En otro aspecto, se divulga en la presente un metodo para suprimir la proliferacion de celulas de mieloma multiple, que comprende poner en contacto dichas celulas de mieloma multiple con una pluralidad de OPAC, de forma tal que la proliferacion de dichas celulas de mieloma multiple se suprima de forma detectable. En cierto aspecto, se divulga en la presente un metodo para suprimir la proliferacion de celulas de mieloma multiple in vivo, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de OPAC a un individuo que comprende celulas de mieloma multiple, en donde dicha administracion reduce de forma detectable la proliferacion de dichas celulas de mieloma multiple. En un aspecto espedfico, dicha administracion reduce de forma detectable (por ejemplo, mejora) uno o mas smtomas o signos de mieloma multiple, o reduce el empeoramiento de dichos smtomas o signos de mieloma multiple.
Las OPAC, utiles en los metodos divulgados en la presente, son celulas osteogenicas adherentes de corion (pero no de contorno corionico (liso)) que pueden identificarse y seleccionarse mediante las caractensticas morfologicas, de marcador y de cultivo descritas al menos en la Seccion 5.1, anteriormente.
5.2.1.2 Terapias de combinacion
El tratamiento de un cancer relacionado con los huesos, por ejemplo, mieloma multiple, puede comprender la administracion de OPAC, en combinacion con otra terapia, al individuo que tiene el cancer.
De esta forma, en otro aspecto, se divulga en la presente un metodo para tratar a un individuo que tiene cancer relacionado con los huesos, por ejemplo, mieloma multiple, que comprende administrar al individuo OPAC, una poblacion de OPAC o una poblacion de celulas que comprende OPAC, en combinacion con una o mas terapias anticancer, por ejemplo, una o mas quimioterapias o compuestos quimioterapeuticos. Dichas terapias anticancer pueden administrarse al individuo al mismo tiempo que, durante el mismo curso de tratamiento que, o de forma separada de, dicha administracion de OPAC. En un aspecto espedfico, la administracion de dichas otras terapias anticancer se administra de forma secuencial con la administracion de dichas OPAC. En un aspecto mas espedfico, dicha otra terapia anticancer o terapias anticancer se administran a dicho individuo antes de la administracion de dichas OPAC; por ejemplo, un curso de dichas otras terapias anticancer se administra al individuo, y se completa antes de la administracion al individuo de OPAC. En otro aspecto, dichas OPAC se administran al individuo antes de la administracion de dichas otras terapias anticancer; por ejemplo, un curso de OPAC se administra a dicho individuo antes de la administracion de dichas otras terapias anticancer, y se completa, antes de la administracion al individuo de dicha terapia anticancer o terapias anticancer.
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En un aspecto espedfico, el agente anticancer es melfalan (tambien conocido como mostaza de L- fenilalanina o L- PAM; nombre comercial Alkeran). De esta forma, en un aspecto, el metodo para el tratamiento de un individuo que padece mieloma multiple comprende administrar a dicho individuo melfalan, por ejemplo, dosis terapeuticamente efectivas de melfalan. La administracion es normalmente oral o intravenosa. En otro aspecto espedfico, el agente anticancer es talidomida. En otro aspecto espedfico, el agente anticancer es pomalidomida (comercializada con el nombre comercial ACTIMID®); o lenalidomida (comercializada con el nombre comercial REVLIMID®); o lenalidomida en combinacion con dexametasona. En otro aspecto espedfico, el tratamiento anticancer es bortezomib (VELCADE®). En otro aspecto espedfico, el agente anticancer comprende una combinacion de melfalan, prednisona y talidomida (administrados por separado o juntos). En otro aspecto espedfico, el agente anticancer es bortezomib, melfalan y prednisona (administrados por separado o juntos).
Otros agentes anticancer se conocen bien en la tecnica. Los agentes incluyen, a modo no taxativo: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleuquina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sodico; bropirimina; busulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimero; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carcelesina; cedefingol; celecoxib (inhibidor de COX-2); clorambucilo; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifena; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflomitina; elsamitrucina; enloplatina; enpromato; epipropidina; clorhidarto de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; fosfato de estramustina; etanidazol; etoposido; fosfato de etoposido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sodica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; iproplatina; irinotecan; clorhidrato de irinotecan; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sodico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalan; menogarilo; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sodico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; acido micofenolico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatina; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobroman; piposulfano; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porffmero sodico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtraceno; esparfosato sodico; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalano sodico; taxotero; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; teniposido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucaronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatina; zinostatina; y clorhidrato de zorubicina.
Otros farmacos anticancer incluyen, a modo no taxativo: 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleuquina; antagonistas de ALL-TK; altretaminea; ambamustina; amidox; amifostina; acido aminolevulfnico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolido; inhibidores de angiogenesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; protema morfogenetica anti- dorsalizante 1; antiandrogeno, carcinoma prostatico; antiestrogeno; antineoplaston; oligonucleotidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores de genes de apoptosis; reguladores de apoptosis; acido apunnico; ara-CDP- DL-PTBA; desaminasa de arginina; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilestaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; acido betulfnico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; sulfoximina de butionina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; capecitabina; carboxamide-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartflago; carzelesina; inhibidores de la casema quinasa (ICOS); castanoespermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; sulfonamida de cloroquinoxalina; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; analogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; analogos de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolftico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidenmina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxana; dexverapamil; diazicuona; didemnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; espiromustina de difenilo; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; doxorrubicina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristerida; analogos de estramustina; agonistas de estrogeno; antagonistas de estrogeno; etanidazol; fosfato de etoposido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de
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glutationa; hepsulfam; heregulina; hexametileno bisacetamida; hipericina; acido ibandronico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastato; imatinib (por ejemplo, GLEEVEC®), imiquimod; peptidos inmunoestimulantes; inhibidor de los receptores del factor de crecimiento 1 tipo insulina; agonistas de interferon; interferones; interleuquinas; iobenguano; iododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetron; jasplaquinolida; cahalalida F; triacetato de lamelarina-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolestatina; letrozol; factor inhibidor de la leucemia, interferon alfa de leucocitos; leuprolida+estrogeno+progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; analogo de poliamina lineal; peptido disacarido lipofflico; compuestos de platino lipofflicos; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecan; texafirina de lutecio; lisofilina; peptidos ltticos; maitansina; manostatina A; marimastato; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogarilo; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; mitoguazona; mitolactol; analogos de mitomicina; mitonafida; factor del crecimiento de fibroblastos de mitotoxina-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; Erbitux, gonadotrofina corionica humana; lfpido monofosfonlico A+ sk de pared celular miobacteriana; mopidamol; agente anticancer de mostaza; micaperoxido B; extracto de pared celular micobacteriana; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorubicina; acido neridronico; nilutamida; nisamicina; moduladores de oxido mtrico; antioxidante de nitroxido; nitrulina; oblimersen
(GENASENSE®); O6-bencilguanina; octreotida; oquicenona; oligonucleotidos; onapristona; ondansetrona; oracina; inductor de la citoquina oral; ormaplatina; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; analogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrhizoxina; acido pamidronico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; paceliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato de pentosan sodico; pentostatina; pentrozol; perflubron;
perfosfamida; alcohol penlico; fenacinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanilo; clorhidrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inibidor del activador de plasminogeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porffmero sodico; porfiromicina; prednisona; bis- acridona de propilo; prostaglandina J2; inhibidores de proteasoma; modulador inmune en base a protema A; inhibidir de protema quinasa C; inhibidores de protema quinasa C, microalgal; inhibidores de fosfatasa de protema tirosina; inhibidores de fosforilasa de nucleosido de purina; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileno de hemoglobina piridoxilada; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetron; inhibidores de ras farnesil protema transferasa; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rohituquina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; mimeticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de senescencia; oligonucleotidos sentido; inhibidores de transduccion de senales; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato sodico; fenilacetato sodico; solverol; protema de union a somatomedina; sonermina; acido esparfosico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista de los peptidos intestinales vasoactivos superactivo; suradista; suramina; swainsonina; talimustina; metiodida de tamoxifen; tauromustina; tazaroteno; tecogalan sodico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfina; teniposido; tetraclorodecaoxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimetico de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de la timopoyetina; timotrinan; hormona estimuladora de la tiroides; etiopurpruina de etilo de estano; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; inhibidores de la traduccion; tretinoina; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetron; turosterida; inhibidores de tirosina quinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de uroquinasa; vapreotida; variolina B; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y estimalamero de zinostatina.
En otros aspectos, la terapia de combinacion comprende la administracion de OPAC a un individuo en combinacion con un inhibidor de osteoclastos. El inhibidor de osteoclastos puede ser un inhibidor de RANKL, por ejemplo, Denosumab. En otra realizacion espedfica, el inhibidor de osteoclastos o ser un inhibidor de integrina o catepsina K.
En otro aspecto, la terapia de combinacion comprende la administracion de OPAC en combinacion con bifosfonatos. Espedficamente, los bisfosfonatos son clodronato y/o pamidronato.
5.2.2 Tratamiento de defectos oseos usando OPAC
Pueden utilizarse poblaciones de OPAC para tratar defectos oseos, por ejemplo, defectos oseos que derivan de traumatismo, o de enfermedad, por ejemplo, una enfermedad que no sea un cancer relacionado con los huesos. Las OPAC pueden utilizarse tambien para tratar cualquier enfermedad, trastorno o afeccion que resulte en, o se relacione con, la perdida de hueso. Tal como se utiliza en la presente, "tratar" comprende la cura, el remedio, la mejora, la disminucion de la gravedad o la reduccion en el transcurso de tiempo de una enfermedad, trastorno o afeccion o cualquier parametro o smtoma de la misma.
Tambien pueden utilizarse poblaciones aisladas de OPAC para tratar facturas oseas, por ejemplo, facturas oseas no consolidadas. Tambien pueden utilizarse poblaciones aisladas de OPAC para fusionar las vertebras juntas con el fin de, por ejemplo, completar una fusion espinal en un sujeto que lo necesita. Las poblaciones aisladas de OPAC, en combinacion con poblaciones de celulas madre o progenitoras, tambien pueden utilizarse para tratar las anteriores.
Las OPAC pueden combinarse con un sustrato, por ejemplo, una matriz, para formar una composicion implantable. Por ejemplo, se proporciona en la presente una composicion, por ejemplo, una composicion implantable, que
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comprende OPAC. En una realizacion espedfica, la composicion implantable comprende una matriz. En una realizacion mas espedfica, dicha matriz es un andamio tridimensional. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende colageno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina o vitronectina. En otra realizacion espedfica, dicha matriz comprende hidroxiapatita. En una realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende colageno e hidroxiapatita, por ejemplo, la matriz es HEALOS®. En otra realizacion mas espedfica, la matriz es una membrana amniotica o un biomaterial derivado de membrana amniotica. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende una protema de membrana extracelular. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto sintetico. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra realizacion mas espedfica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citoquina, anticuerpo o molecula organica de menos de 5.000 daltones. En ciertas realizaciones, la matriz es un polfmero degradable sintetico tal como, por ejemplo, acido polilactico y acido poliglicolico. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno placentario humano mineralizado, un sustrato de acido hialuronico o un sustrato ceramico. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de p- fosfato tricalcico-colageno. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de colageno. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de fosfato de calcio. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de colageno placentario humano mineralizado.
Las OPAC y poblaciones de OPAC tambien pueden inducirse para diferenciacion en un tipo de celula particular, ya sea ex vivo o in vivo, en preparacion para administracion a un individuo que necesita dichas celulas, o celulas diferenciadas de dichas celulas. Por ejemplo, las OPAC pueden inyectarse en un organo danado, por ejemplo, un hueso danado, para neogenesis de organos y reparacion de lesion in vivo. Dicha lesion puede ser debido a afecciones y trastornos que incluyen, a modo no taxativo, defectos oseos incluidas lesiones que resultan de osteoporosis, cancer, fracturas y afecciones espinales tratables con, por ejemplo, fusion espinal. Las OPAC pueden inyectarse en el hueso danado solas o pueden introducirse con un sustrato implantable tal como se describe en la presente.
Cuando las OPAC se administran como una suspension o inyectable lfquido, las celulas pueden administrarse por via intravenosa o, preferiblemente, en el sitio del defecto oseo, por ejemplo, fractura.
En ciertos aspectos, la presente invencion proporciona OPAC para uso en un metodo para tratar defectos oseos en un sujeto que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composicion implantable o inyectable que comprende una poblacion de OPAC proporcionada en la presente, tratando de ese modo el defecto oseo en el sujeto. En ciertas realizaciones, el defecto es una lesion osteolftica asociada con un cancer, una fractura osea o una columna, por ejemplo, que necesita fusion. En ciertas realizaciones, la lesion osteolftica se asocia con mieloma multiple, cancer oseo o cancer metastasico. En ciertas realizaciones, la fractura osea es una fractura no consolidada. En ciertas realizaciones, una composicion implantable se implanta quirurgicamente, por ejemplo, en el sitio del defecto oseo. En ciertas realizaciones, una composicion inyectable se administra quirurgicamente a la region del defecto oseo. En ciertas realizaciones, la composicion inyectable se administra sistemicamente.
En una realizacion espedfica, la composicion implantable que comprende OPAC comprende una matriz. En una realizacion mas espedfica, dicha matriz es un andamio tridimensional. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende colageno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina o vitronectina. En otra realizacion mas espedfica, la matriz es una membrana amniotica o un biomaterial derivado de membrana amniotica. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende una protema de membrana extracelular. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto sintetico. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra realizacion mas espedfica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citoquina, anticuerpo o molecula organica de menos de 5.000 daltones. En ciertas realizaciones, la matriz es un polfmero degradable sintetico tal como, por ejemplo, acido polilactico y acido poliglicolico. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable se selecciona del grupo que consiste en un sustrato de p-fosfato tricalcico, un sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno, un sustrato de colageno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colageno placentario humano mineralizado, un sustrato de acido hialuronico y un sustrato ceramico. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de p-fosfato tricalcico-colageno. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de colageno. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de fosfato de calcio. En ciertas realizaciones, el sustrato de andamio implantable es un sustrato de colageno placentario humano mineralizado.
En otro aspecto, se proporciona en la presente un metodo para formular una composicion inyectable que comprende combinar una poblacion de OPAC con acido hialuronico o colageno inyectable. En otro aspecto, se proporciona en la presente una composicion inyectable que comprende OPAC y acido hialuronico o colageno.
Las OPAC pueden administrarse sin cultivarse en condiciones que hacen que las OPAC se diferencien. Alternativamente, las OPAC pueden cultivarse en, por ejemplo, un medio osteogenico durante, por ejemplo, aproximadamente 1-20 dfas, antes de la administracion. Alternativamente, las OPAC pueden aislarse y sembrarse en una matriz, luego cultivarse en medio osteogenico durante, por ejemplo, aproximadamente 1-20 dfas. En otra
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realizacion, las OPAC pueden cultivarse en, por ejemplo, un medio osteogenico durante, por ejemplo, aproximadamente 1-20 d^as, luego se siembran en una matriz, se cultivan en medio osteogenico tal como se describe en la presente durante, por ejemplo, aproximadamente 1-20 dfas.
En otras realizaciones, las poblaciones aisladas de OPAC pueden utilizarse en terapias o protocolos para regeneracion o reemplazo de tejido autologo o heterologo, incluido, a modo no taxativo, el tratamiento de los defectos epiteliales corneos, la reparacion de cartflagos, la dermoabrasion facial, las membranas mucosas, membranas timpanicas, revestimientos intestinales, estructuras neurologicas (por ejemplo, retina, neuronas de adicion en membrana basilares, neuronas olfatorias en epitelio olfatorio), reparacion de quemaduras y heridas para lesiones traumaticas de la piel, o para reconstruccion de otros organos o tejidos danados o enfermos.
En ciertas realizaciones, una poblacion aislada de OPAC se utiliza en reconstitucion hematopoyetica en un individuo que ha sufrido una perdida parcial o total de celulas madre hematopoyeticas, por ejemplo, individuos expuestos a dosis letales o subletales de radiacion (ya sea industrial, medica o militar); los individuos que se han sometido a mieloablacion como parte de, por ejemplo, terapia contra el cancer y similares. Las poblaciones aisladas de OPAC pueden utilizarse en lugar de, o para complementar, medula osea o poblaciones de celulas madre derivadas de medula osea. Normalmente, aproximadamente 1 x 108 a 2 x 108 de celulas mononucleares de medula osea por kilogramo de peso del paciente se infusionan para insercion en un trasplante de medula osea (es decir, aproximadamente 70 ml de medula para un donante de 70 kg). Para obtener 70 ml es necesaria una donacion intensiva y perdida considerable de sangre de donante en el proceso de donacion. Una poblacion aislada de OPAC para reconstitucion hematopoyetica puede comprender, en varias realizaciones, aproximadamente, al menos o lo sumo 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 10'" " " "" "" “
mas OPAC.
1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010,
5 x 1010, 1 x 1011 o
Las OPAC proporcionadas en la presente, solas o en combinacion con otra poblacion de celulas madre o celulas progenitoras, pueden utilizarse en la fabricacion de un tejido u organo in vivo. Los metodos proporcionados en la presente comprenden el uso de OPAC para sembrar una matriz y para cultivarse en las condiciones apropiadas para que las celulas se diferencien y pueblen la matriz. Los tejidos y organos obtenidos mediante los metodos proporcionados en la presente pueden utilizarse para una variedad de fines, incluidos fines de investigacion y terapeuticos.
En una realizacion preferida, las OPAC tal como se proporcionan en la presente, y las poblaciones de OPAC, pueden utilizarse para trasplantes autologos y alogenicos, incluidos trasplantes hematopoyeticos tipo HLA compatibles y no compatibles. En una realizacion del uso de OPAC como trasplantes hematopoyeticos alogenicos, el huesped es tratado para reducir el rechazo inmunologico de las celulas donantes o para crear inmunotolerancia (ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.800.539 y 5.806.529). En otra realizaacion, el huesped no es tratado para reducir el rechazo inmunologico o para crear inmunotolerancia.
6. Ejemplos
6.1 Ejemplo 1: Aislamiento y caracterizacion de OPAC
6.1.1 Materiales y metodos
Aislamiento de OPAC: Se recolecto placenta a termino de madres donantes saludables despues de obtener el consentimiento informado. El tejido corionico se separo manualmente del amnion y se extirparon 12g de tejido corionico y se corto en trozos de 1 mm3. El tejido cortado se transfirio luego a una solucion de 240 mL de dispasa II a una concentracion de 2,4 U/mL; se incubo el tejido con dispasa II durante 1 hora (h) a 37°C con agitacion a 80 RPM. Despues de la incubacion con dispasa, los tejidos digeridos se dividieron en alfcuotas en tubos de 50 mL para permitir la centrifugacion; la muestra de tejido digerido se centrifugo a 220 g durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA). Despues de decantar cuidadosamente los sobrenadantes, los tejidos granulados se resuspendieron y se agruparon en una solucion de colagenasa II tibia (270 U/mL en un volumen de 240 mL) y se incubaron durante 1 h a 37C con agitacion a 80 RPM. Los productos digeridos se dividieron en alfcuotas en tubos de 50 mL para permitir la centrifugacion; la muestra de tejido digerido se centrifugo a 220 g durante 5 minutos a TA. La enzima presente en tejidos digeridos se neutralizo con 5% de lavado de FBS/PBS. Las muestras se sometieron nuevamente a centrifugacion (220g durante 5 minutos a TA). Los granulos (que conteman celulas liberadas y tejido) se resuspendieron luego en 20% de FBS (Hyclone)/a-MEM (Invitrogen) que contema 1X penicilina-estreptomicina y 1X 1-glutamina o medios de 10% de FBs(Hyclone)/a-MEM (Invitrogen) que conteman tambien 1X penicilina- estreptomicina y 1X 1-glutamina.
Aislamiento de OPAC por adhesion selectiva
Como parte de la estrategia de adhesion selectiva, las suspensiones celulares (obtenidas tal como se describio anteriormente) se agregaron a los matraces que habfan sido prerecubiertos con fibronectina (FN, Sigma), colageno (COL, StemCell Technologies), vitronectina (VN, Sigma) y laminina (LN, Sigma). Los matraces se recubrieron incubando los matraces con soluciones de 10 pg/mL de cada protema durante 1 h a temperatura ambiente para fibronectina y colageno, 1 h a 37°C para vitronectina y 2 horas a 37°C para laminina; despues de estas incubaciones los m atraces se lavaron 2X con PBS.
Tres horas, 24 horas y 6 d^as despues de sembrar las suspensiones celulares en los matraces recubiertos, las celulas/tejidos no adherentes se quitaron de los cultivos del establecimiento. Las celulas que permanecen en los matraces de cultivo tisular luego se dejaron proliferar. Una vez que los cultivos alcanzaron aproximadamente 8090% de confluencia, las celulas fueron criopreservadas.
5 Las celulas adherentes derivadas de corion (OPAC) se separaron en base a la expresion de la superficie celular de CD200 usando una tecnica de clasificacion celular asistida magnetica (MACs) usando un anticuerpo anti-CD200-PE humano (BD Biosciences, cat 552475), microperlas anti-PE (Miltentyi, cat No. 130-048-801), y columnas de MACs (Miltenyi) de acuerdo con el protocolo de las columnas MACs de Miltenyi.
Cultivo de OPAC
10 Las condiciones de la estrategia de adhesion selectiva que mostraron los niveles mas altos de induccion de fosfatasa alcalina (AP) (recubrimientos de LN o VN, 20% de FBS/a-MEM, 6 dfas de adhesion de establecimiento) se expandieron tambien en condiciones que fomentaron la funcionalidad osteogenica. Estas condiciones inclrnan el subcultivo sobre superficies recubiertas con fibronectina, usando medios de celulas madre mesenquimales disponibles en el mercado, o usando suero bovino fetal calificado como celula madre mesenquimal. Dos lmeas 15 celulares de la matriz de adhesion selectiva original se subcultivaron de acuerdo con la siguiente matriz sobre superficies recubiertas con LN, VN o FN y con los tres medios representados en la Tabla 2.
Tabla 2:
Recubrimiento de establecimiento
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o
TD
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E
3. FBS calificado como MSC (Stem Cell Tech)/aMEM
Las celulas obtenidas usando la matriz de adhesion selectiva que se muestra en la Tabla 2 se analizaron luego 20 mediante citometna de flujo y para actividad de fosfatasa alcalina. Las celulas se caracterizaron usando los siguientes ensayos: citometna de flujo, analisis de expresion genica y actividad de fosfatasa alcalina (AP) y secrecion de protemas.
Expresion genica
Las celulas se tripsinizaron y se realizaron conteos celulares nucleados para determinar un mmimo de 1x106 a 1x107 25 celulas. Las celulas se lisaron usando protocolo para lisis del kit Qiagen RNEasy; luego los lisados se pasaron a traves de una trituradora QIA para maximizar la lisis celular. El aislamiento del ARN se realizo usando un kit Qiagen RNEasy.
La cantidad de ARN se determino usando un espectrofotometro Nanodrop ND1000; un mmimo de 28 ng/pl de ARN analizado mediante Nanodrop ND1000. La calidad del ARN se midio mediante el bioanalizador Agilent 2100; se 30 utilizo una relacion de ARNr entre 28S/18S de 2,0 como determinante de ARN de buena calidad. Las reacciones de ADNc se generaron a partir de ARN usando un protocolo de kit de archivo de ADNc de alta capacidad. Las reacciones por PCR en tiempo real se realizaron usando una mezcla maestra para PCR universal TAQMAN® de Applied Biosystems. La reaccion por PCR utiliza la actividad 5' de ADN polimerasa Amplitaq Gold para escindir una sonda TAQMAN® durante la PCR. La sonda TAQMAN® contiene un tinte reportero en un extremo 5" y un tinte 35 aplacador en el extremo 3" de la sonda. La acumulacion de los productos de PCR se detecta directamente monitoreando el aumento de fluorescencia del tinte reportero.
Se aislo ARN de OPAC, celulas madre placentarias, celulas madre mesenquimales (ScienCell Research Labs., Carlsbad, California) y fibroblastos dermicos humanos (ScienCell Research Labs., Carlsbad, California) para el superarreglo de osteogenesis y de OPAC y celulas madre placentarias (para el arreglo de TGF-BMP). Las celulas se 40 cultivaron en medios basales (condiciones de crecimiento para cada tipo de celula respectivo) durante 3 dfas y se cultivaron en medios osteogenicos (condiciones osteogenicas) durante una semana. Las muestras se aislaron en cuadruplicado usando el RNeasy Plus Mini Kit de Qiagen. Todo el aislamiento de ARN fue de buena calidad y se logro suficiente rendimiento (tal como se midio mediante Nanodrop para concentracion y chip Agilent para pureza).
LN VN
1
LN FN VN FN
2
LN FN VN FN
3
LN FN VN FN
1. FBS Hyclone /aMEM
2. Medios de MSC Lonza
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Los arreglos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante y los resultados se cuantificaron en un ABI 7900.
Actividad de fosfatasa alcalina
Para inducir la osteogenesis, las celulas se sembraron en medio de cultivo a 5 x 103 celulas/cm2 durante aproximadamente 3 dfas, y luego se mantuvieron en un medio de cultivo o se indujeron con medio de OS (10% de FBS/DMEM) que contema acido ascorbico (50 pg/mL), dexametasona (0,1 pM)y a-glicerofosfato (10 mM) por hasta 2 semanas; las celulas se alimentaron cada dos semanas con un medio de crecimiento u osteogenico nuevo.
La actividad de la fosfatasa alcalina (AP) en lisados celulares se determino usando un ensayo colorimetrico (Cell Biolabs, San Diego, CA), que mide la formacion de producto de p-nitrofenol;
La actividad de AP se normalizo hasta pg de ADN (para representar cualquier diferencia de numero de celulas) usando el ensayo fluorescente de ADNdc PicoGreen. La cantidad de p-nitrofenol formada por lisados celulares se determino mediante analisis de regresion lineal de una curva estandar generada usando cantidades conocidas de p- nitrofenol (proporcionado por el kit). La actividad de fosfatasa alcalina tambien se evaluo histoqmmicamente siguiendo las instrucciones del fabricante usando un kit (No. 85) de Sigma.
Ensayo de unidad de formacion de colonias - Actividad de fosfatasa alcalina
OPAC preclasificadas que conteman una mezcla de celulas CD200- y CD200+, poblaciones CD200+ y fracciones no retenidas (que conteman una concentracion relativamente alta de poblaciones CD200 negativas/tenues) se sembraron en medios de diferenciacion osteogenica (10% de FBS/DMEM/ 50 pg/ml de acido ascorbico/0,1 pM de dexametasona) a 22,5 celulas/cm2 en 35 mm de placas con rejillas. Las celulas se alimentaron cada dos semanas con medios osteogenicos y despues de 10 dfas las celulas se evaluaron histoqmmicamente para actividad de fosfatasa alcalina siguiendo las instrucciones del fabricante usando un kit (No. 85) de Sigma. La cantidad de colonias positivas para fosfatasa alcalina se cuantifico visualmente usando un estereomicroscopio.
Tincion inmunofluorescente
Las celulas se cultivaron sobre portaobjetos Labtek a 5000 celulas/cm2 y se cultivaron durante 2-3 dfas. Las celulas se fijaron con 3,7% de formaldeimdo durante 9 minutos, luego se lavaron 3X con PBS. Despues del bloqueo durante 20 minutos a temperatura ambiente con solucion amortiguadora de bloqueo (10% de suero de cabra, 2X de casema, 0,3% de triton), las celulas se tineron para NG2 (sulfato de condroitina) y a-actina de musculo liso usando anticuerpos de conejo anti-NG2 humano (Chemicon, dilucion 1:150), anti-a-actina de musculo liso humana de raton (Dako, dilucion 1:30); las celulas se incubaron con anticuerpos primarios toda la noche a 4°C. Posteriormente, las muestras se lavaron luego con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente, AlexaFluor488 anti-conejo (Invitrogen, dilucion 1:400) o AlexaFluor488 anti-raton (Invitrogen, dilucion 1:400); las celulas se incubaron con anticuerpos secundarios durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las celulas se lavaron 3X con PBS y se montaron usando medios de montaje que conteman DAPI para contratenir para nucleos. Se tomaron imagenes de las celulas usando un microscopio de epifluorescencia.
Ensayo Luminex
Los factores secretados en muestras de medios acondicionados de celulas se analizaron usando el panel de huesos humanos 1B-11plex (cat No. HBN1B-51K-11) de Millipore, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Arreglos de anticuerpos
Se cultivaron OPAC, celulas madre mesenquimales, celulas madre placentarias y fibroblastos en medios basales (condiciones de crecimiento) durante 3 dfas y luego se cambiaron a medios libres de suero durante 24 horas. Las muestras de medios se pasaron sobre un Arreglo de Anticuerpos a base de Etiqueta de Biotina RAYBIO® de RayBiotech segun las instrucciones del fabricante. Se tomaron imagenes de los arreglos de quimioluminiscencia y se analizaron los tamanos de los puntos usando un Sistema de Formacion de Imagenes GelLogic 2200 y un programa de formacion de imagenes Kodak MI, respectivamente.
6.1.2 Resultados
Adhesion selectiva y expresion genica
Todas las condiciones de adhesion de los 6 dfas produjeron numeros suficientes de celulas para analisis, sin embargo, las condiciones de adhesion de 3 h y 24 h en 10% de FBS/DMEM no proliferaron lo suficiente para producir suficiente celulas para analisis. Los genes seleccionados para analisis de expresion de ARNm incluyeron: fosfatasa alcalina (AP), DLX5 (factor de transcripcion), sialoprotema osea, RUNX2 (factor de transcripcion), colagenasa III, osterix (factor de transcripcion) y osteocalcina. De estos genes, las celulas derivadas del 20% de medios de FBS/aMEM, adhesion de 6 dfas, LN, VN y recubrimiento COL mostraron una mayor expresion de los niveles de ARNm de AP en comparacion con las celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea (Figura
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
1). Todos los demas genes analizados demostraron niveles mas bajos de expresion genica en celulas placentarias recientemente aisladas en comparacion con celulas madre mesenquimales.
Los resultados de inmunofenotipificacion mostraron aumentos significativos de las poblaciones CD200tenue/CD200' en las condiciones de adhesion de 6 dfas en comparacion con celulas madre placentarias, aunque los aumentos mas altos se detectaron en condiciones recubiertas con LN, VN, COL en 20% de FBS/aMEM. (Figura 2). La citometna de flujo tambien confirmo que las OPAC son CD34- y CD105+ (Figura 2).
Las permutaciones de cultivo, a saber las condiciones recubiertas de LN, VN, COL en 20% de FBS/aMEM, que produjeron poblaciones mayores de CD200tenue/CD200-, tambien demostraron aumentos significativos de las poblaciones de AP+ y Stro-1 + mediante citometna de flujo (Figura 3); estas condiciones tambien exhibieron niveles altos de expresion del gen AP con respecto a testigos de MSC. Estas mismas condiciones tambien demostraron aumentos significativos de poblaciones positivas para SSEA3 y SSEA4 (Figura 4).
Los analisis funcionales, tal como se determino mediante actividad de AP, demostraron actividad de AP inducible en condiciones de diferenciacion osteogenica (10 dfas de induccion) en los sustratos recubiertos con FN, LN, VN, COL en condiciones de 20% de FBS/aMEM, aunque la condicion recubierta con FN demostro una induccion mas moderada (Figura 5).
Caracterizacion de celulas cultivadas
La inmunofenotipificacion de celulas resultante de la propagacion en varias condiciones de cultivo demostro que, en las poblaciones CD200+, entre 40-60% de las celulas fueron CD200+, con respecto a ~100% para las celulas madre placentarias (PDAC™) descritas, por ejemplo, en la Publicacion de Solicitud de los Estados Unidos No. 2007/0275362. Hubo un leve aumento en el porcentaje de celulas positivas AP con respecto a PDAC™, mientras que el porcentaje de celulas positivas CD105 permanecio igual para PDAC™ (Figura 6).
Para definir mejor las celulas derivadas de corion (OPAC), se realizo una tincion de inmunofluorescencia para tenir los marcadores asociados con las celulas que mostraron actividad osteogenica. Los pericitos, que son celulas asociadas con la vasculatura y conocidas por albergar una mancha de actividad osteogenica positivamente para NG2 y a-actina de musculo liso. Por lo tanto, se realizaron para estos marcadores estudios de tincion de inmunofluorescencia. Las OPAC exhibieron dos diferencias en la tincion en comparacion con PDAC™: (1) una falta de tincion para la a-actina de musculo liso en comparacion con PDACTM positivos para actina y (2) localizacion celular difusa de NG2 en comparacion con la tincion de NG2 localizada de adhesion focal para PDAc™ estandares; la localizacion de NG2 a estructuras subcelulares tales como adhesiones focales trae implicaciones en la actividad de NG2 (los datos no se muestran).
Despues de 10 dfas de induccion en condiciones de diferenciacion osteogenica, las condiciones del medio de LN-LN 1 y el medio de VN-VN 1, tal como se muestra en la Figura 7, mostraron la induccion mas alta (osteogenica/basal) de actividad de AP (flecha negra) mientras que el medio de LN-LN 3 y el medio de VN-FN 1 demostraron una actividad de AP general mas alta (flecha abierta).
Para abordar si la actividad funcional, tal como actividad osteogenica y la supresion de celulas T, derivada de la fraccion baja/negativa para CD200 o en la fraccion CD200+ de estas preparaciones celulares de adhesion selectiva, MACs (separacion de celulas magneticas asistida) usando un anticuerpo anti-CD200 humana se utilizo para separar estas 2 poblaciones celulares. Las 4 lmeas celulares que se identificaron anteriormente que tienen una induccion de AP mas alta o actividad de AP general mas alta se procesaron para separacion magnetica en base a la expresion de CD200 y se analizaron mediante citometna de flujo, actividad de AP y formacion de unidad de formacion de colonias positivas de AP.
La inmunofenotipificacion mostro >85% de poblaciones CD200+ puras para 2 de 4 muestras y que la fraccion de flujo aun conterna celulas CD200+ (Figura 8).
Las celulas resultantes de la separacion se indujeron con medios osteogenicos durante 10 dfas y se analizaron para evaluar la actividad de AP. Los resultados muestran que la fraccion de CD200+ habfa disminuido la inducibilidad de AP en comparacion con las fracciones de CD200tenue/CD200' (Figura 9).
Los ensayos de CFU (ensayo de unidad de formacion de colonias) miden las celulas progenitoras en una poblacion; por ejemplo, comunmente se utilizan ensayos de CFU-F para medir la cantidad de progenitores en el producto aspirado de la medula osea. El ensayo de CFU-AP estima el numero de precursores osteoblasticos potenciales en una poblacion. Las fracciones de CD200 se sembraron en placas con rejillas de 35 mm durante 10 dfas en medios osteogenicos y se tineron para fosfatos alcalinos. Se cuantifico el numero de colonias por placa y el numero de colonias positivas de AP. Las fracciones de CD200+ no mostraron CFU-AP y la actividad de CFU total mas baja, mientras que las pre-clasificadas, que conternan las poblaciones mas altas tenues/negativas para CD200 mostraron el mayor numero de actividad de CFU positivas para AP y actividad de CFU. De manera comparativa, las poblaciones CD200+ tuvieron niveles mucho mas bajos de CFU-AP y actividad total de CFU (Figuras 10 y 11).
5
10
15
20
25
30
35
Un ensayo Luminex 11 X para protemas secretadas relacionadas con los huesos se realizo sobre muestras de medios acondicionados de OPAC, celulas madre placentarias CD200+ (PDAC™) y celulas madre mesenquimales (MSC). Las celulas se cultivaron durante 3 dfas en sus respectivos medios, luego se incubaron con DMEM libre de suero durante 24 horas. Para evaluar el comportamiento de las celulas en condiciones osteogenicas, las celulas se cultivaron durante 3 dfas en condiciones de crecimiento, se sometieron a medios de diferenciacion osteogenica (medios complementados con acido ascorbico y dexametasona) durante 7 dfas, luego se incubaron con DMEM libre de suero durante la noche. Los resultados muestran que de los 3 tipos de celulas, las OPAC secretaron constitutivamente los niveles mas altos de osteoprotegerina. Asimismo, cuando se cultivan los tres tipos celulares en condiciones osteogenicas, solo las OPAC exhibieron una regulacion hacia arriba de la secrecion de osteoprotegerina, mientras que las MSC y PDAC™ mostraron osteoprotegerina regulada hacia abajo. Esto implica que en un microambiente oseo, las OPAC pueden estar mejor adaptadas para inhibir la actividad de los osteoclastos por medio de la liberacion de niveles altos de osteoprotegerina.
El analisis de expresion de 84 genes relativos a osteogenesis en OPAC, PD AC™, MSC y fibroblastos cultivados en medio de cultivo y en medio osteogenico se realizo usando un arreglo de PCR para osteogenesis humana RT2 Profiler (SABiosciences, Frederick, Maryland). El medio de cultivo utilizado en el experimento fue aMEM/20% de Suero Bovino Fetal que comprendfa 1X penicilina-estreptomicina y 1X L-glutamina y un medio osteogenico utilizado en el experimento fue aMEM/20% de Suero Bovino Fetal que comprendfa 1X penicilina-estreptomicina, 1X L- glutamina, 50 pg/mL de acido ascorbico y 100 nM de dexametasona. La expresion de los genes relacionados con la osteogenesis se midio en OPAC, PDAC™, MSC y fibroblastos cultivados en condiciones de cultivo y diferenciacion osteogenica.
La expresion genica (tal como se mide mediante el valor Ct, el ciclo de PCR en el que un aumento estadfsticamente considerable de senal de fluorescencia se detecta primero) se encontro para la mayona de los genes osteogenicos medidos en todos los tipos de celulas. Las OPAc mostraron un unico perfil de expresion genica cuando se compararon con PDAC™, MSC y fibroblastos (Tablas 3A-3C, respectivamente) y un perfil de induccion de expresion genica unico, cuando las celulas se cambiaron de cultivo a un medio osteogenico, cuando se compararon con PDAC™, MSC y fibroblastos (Tablas 3D-3F, respectivamente). Los valores Ct (Tablas 3A-3C) son numeros obtenidos directamente del ciclador de PCR e informados como un rango; de esa forma, estos valores se convirtieron en una, dos, tres o cuatro senales positivas, tal como se explica mas adelante. Para calcular las veces de cambio en la expresion genica en el medio de cultivo en comparacion con el medio osteogenico, se aplica un factor de correccion a los valores Ct en la expresion de los genes domesticos. Este factor de correccion se normaliza para pequenas diferencias en la cantidad de ARN utilizado en la PCR.
Tablas 3A-3C: Expresion de genes osteogenica (valores Ct) de OPAC con respecto a PDAC™ (Tabla 3A), OPAC con respecto a mSc (Tabla 3B) y OPAC con respecto a fibroblastos (Tabla 3C) en medios de cultivo u osteogenicos, tal como definio anteriormente (n=2). El nivel de expresion de los genes se clasifico como ++++ (muy alto, Ct<20). +++ (alto, 20<Ct<25), ++ (medio, 25<Ct<30), + (bajo 30<Ct<35), - (bajo 35<Ct<40) o en blanco (sin senal detectada).
Tabla 3A:
Sfmbolo
OPAC PDACTM
G O G O
AHSG
- +
ALPL
+ + + + +
AMBN
+
AMELY
+ + + +
ANXA5
+ + + + + + + + + + + + + + + +
BGLAP
+ + + + + + + +
BGN
+ + + + + + + + + + +
BMP1
+ + + + + + + + + + + +
BMP2
+ + + + + +
BMP3
+
BMP4
+ + + + + + + + + + + +
BMP5
+ +
BMP6
+ + + + + + + +
S^bolo
OPAC pdactm
G O G O
CALCR
+ + + + +
CD36
+ + + + + +
CDH11
+ + + + + + + + + + + +++
COL10A1
+ + + + +
COL11A1
+ + + + + + +++
COL12A1
+ + + + + + + + + + + +++
COL14A1
+ + + + + + + + + +++
COL15A1
+ + + + + + + + + + ++
COL1A1
+ + + + + + + + + + + + ++++
COL1A2
+ + + + + + + + + + + + ++++
COL2A1
+ + +
COL3A1
+ + + + + + + + + + + + ++++
COL4A3
+ + + +
COL5A1
+ + + + + + + + + + + + ++++
COMP
+ + + + +++
CSF2
+ + +
CSF3
+ + + + -
CTSK
+ + + + + + + + + + ++++
DMP1
-
DSPP
+ +
EGF
+ + + + +
EGFR
+ + + + + + + + + +++
ENAM
+ +
FGF1
+ + + + + ++
FGF2
+ + + + + + + + + +++
FGF3
+
FGFR1
+ + + + + + ++
FGFR2
+ + + + +
FLT1
+ + + + + + + ++
FN1
+ + + + + + + + + + + + ++++
GDF10
-
ICAM1
+ + + + + + + + + +++
IGF1
+ + + + +
IGF1R
+ + + + + + + + + +++
IGF2
+ + + + + ++
ITGA1
+ + + + + + + + + + +++
ITGA2
+ + + + + + + + ++
ITGA3
+ + + + + + + + + +++
Sfmbolo
OPAC pdactm
G O G O
ITGAM
+
ITGB1
+ + + + + + + + + + + + ++++
MINPP1
+ + + + + + + + + +++
MMP10
+ + + - +
MMP2
+ + + + + + + + + + + + ++++
MMP8
+ - +
MMP9
+ + + + + + +
MSX1
+ + + + + + ++
NFKB1
+ + + + + + + + + +++
PDGFA
+ + + + + + + + + ++
PHEX
+ + + +
RUNX2
+ + + + + + + + ++
SCARB1
+ + + + + + + ++
SERPINH1
+ + + + + + + + + + + + ++++
SMAD1
+ + + + + + + + + ++
SMAD2
+ + + + + + + + + +++
SMAD3
+ + + + + + + + + +++
SMAD4
+ + + + + + + + + +++
SOX9
+ + + + +
STATH
+ + + +
TFIP11
+ + + + + + + + + +++
TGFB1
+ + + + + + + + + + +++
TGFB2
+ + + + + + + + + +++
TGFB3
+ + + + + + + + + +++
TGFBR1
+ + + + + + + + ++
TGFBR2
+ + + + + + +
TNF
+ + + + +
TUFT1
+ + + + + + + + ++
TWIST1
+ + + + + + + + + + +++
VCAM1
+ + + + + + + + + +++
VDR
+ + + + + + + + ++
VEGFA
+ + + + + + + + + +++
VEGFB
+ + + + + + + + + +++
G: Expresion relativa con respecto a testigo en medio de cultivo.
O: Expresion relativa con respecto a testigo en medio osteogenico.
Tabla 3B
Sfmbolo
OPAC MSC
G O G O
AHSG
- - + +
ALPL
+ + + + + + +
AMBN
+
AMELY
+ + + +
ANXA5
+ + + + + + + + + + + + + + + +
BGLAP
+ + + + + + + + + +
BGN
+ + + + + + + + + + + +
BMP1
+ + + + + + + + + + + +
BMP2
+ + + + + + + +
BMP3
+ + +
BMP4
+ + + + + + + + + + +
BMP5
+ + +
BMP6
+ + + + + + + +
CALCR
+ + + - +
CD36
+ + + + + +
CDH11
+ + + + + + + + + + + + + + +
COL10A1
+ + + + + + + +
COL11A1
+ + + + + + + + + + +
COL12A1
+ + + + + + + + + + + + + +
COL14A1
+ + + + + + + + + + + +
COL15A1
+ + + + + + + + + + + +
COL1A1
+ + + + + + + + + + + + + + + +
COL1A2
+ + + + + + + + + + + + + + + +
COL2A1
+ + +
COL3A1
+ + + + + + + + + + + + + + +
COL4A3
+ + + + +
COL5A1
+ + + + + + + + + + + + + + +
COMP
+ + + + + + +
CSF2
+ + + +
CSF3
+ + + + -
CTSK
+ + + + + + + + + + + + + +
DMP1
-
DSPP
+ +
EGF
+ + + + +
EGFR
+ + + + + + + + + + + +
ENAM
+ + + +
FGF1
+ + + + + + +
S^bolo
OPAC MSC
G O G O
FGF2
+ + + + + + + + + + + +
FGF3
+ +
FGFR1
+ + + + + + + +
FGFR2
+ + + + + +
FLT1
+ + + + + + +
FN1
+ + + + + + + + + + + + + + + +
GDF10
- -
ICAM1
+ + + + + + + + + + + +
IGF1
+ + + + + +
IGF1R
+ + + + + + + + + + + +
IGF2
+ + + + + + + + +
ITGA1
+ + + + + + + + + + + + +
ITGA2
+ + + + + + + + + +
ITGA3
+ + + + + + + + + + + +
ITGAM
+
ITGB1
+ + + + + + + + + + + + + + + +
MINPP1
+ + + + + + + + + + + +
MMP10
+ + + + +
MMP2
+ + + + + + + + + + + + + + + +
MMP8
+ - + +
MMP9
+ + + + + +
MSX1
+ + + + + +
NFKB1
+ + + + + + + + + + + +
PDGFA
+ + + + + + + + + +
PHEX
+ + + + +
RUNX2
+ + + + + + + + + + +
SCARB1
+ + + + + + + + + +
SERPINH1
+ + + + + + + + + + + + + + + +
SMAD1
+ + + + + + + + + + + +
SMAD2
+ + + + + + + + + + + +
SMAD3
+ + + + + + + + + + + +
SMAD4
+ + + + + + + + + + + +
SOX9
+ + + + + + +
STATH
+ + + +
TFIP11
+ + + + + + + + + + + +
TGFB1
+ + + + + + + + + + + + +
TGFB2
+ + + + + + + + + + + +
TGFB3
+ + + + + + + + + + + +
Sfmbolo
OPAC MSC
G O G O
TGFBR1
+ + + + + + + + + +
TGFBR2
+ + + + + + +
TNF
+ + + +
TUFT1
+ + + + + + + + +
TWIST1
+ + + + + + + + + + + +
VCAM1
+ + + + + + + + + + +
VDR
+ + + + + + + + + +
VEGFA
+ + + + + + + + + + + +
VEGFB
+ + + + + + + + + + + + +
G: Expresion relativa con respecto a testigo en medio de cultivo.
O: Expresion relativa con respecto a testigo en medio osteogenico.
Tabla 3C:
Sfmbolo
OPAC Fibroblasto
G O G O
AHSG
- -
ALPL
+ + + + + +
AMBN
+
AMELY
+ + + +
ANXA5
+ + + + + + + + + + + + + + + +
BGLAP
+ + + + + + + +
BGN
+ + + + + + + + + + +
BMP1
+ + + + + + + + + + + +
BMP2
+ + + + + +
BMP3
+ -
BMP4
+ + + + + + + + +
BMP5
+ +
BMP6
+ + + + + + +
CALCR
+ + + - +
CD36
+ + + + + + +
CDH11
+ + + + + + + + + + + + + + +
COL10A1
+ + + + + + + +
COL11A1
+ + + + + + + + +
COL12A1
+ + + + + + + + + + + + + +
COL14A1
+ + + + + + + + + +
COL15A1
+ + + + + + + + + + +
COL1A1
+ + + + + + + + + + + + + + +
COL1A2
+ + + + + + + + + + + + + + + +
S^bolo
OPAC Fibroblasto
G O G O
COL2A1
+ + +
COL3A1
+ + + + + + + + + + + + + + +
COL4A3
+ + + + +
COL5A1
+ + + + + + + + + + + + + +
COMP
+ + + + + + +
CSF2
+ + + +
CSF3
+ + + + + +
CTSK
+ + + + + + + + + + + + + + +
DMP1
-
DSPP
+ +
EGF
+ + + +
EGFR
+ + + + + + + + + + + +
ENAM
+ + + +
FGF1
+ + + + + + + + +
FGF2
+ + + + + + + + + + + +
FGF3
+
FGFR1
+ + + + + + + +
FGFR2
+ + + +
FLT1
+ + + + + + + +
FN1
+ + + + + + + + + + + + + + + +
GDF10
-
ICAM1
+ + + + + + + + + + + +
IGF1
+ + + +
IGF1R
+ + + + + + + + + + +
IGF2
+ + + + + +
ITGA1
+ + + + + + + + + + + + +
ITGA2
+ + + + + + + + +
ITGA3
+ + + + + + + + + + + +
ITGAM
+ +
ITGB1
+ + + + + + + + + + + + + + + +
MINPP1
+ + + + + + + + + + +
MMP10
+ + + - +
MMP2
+ + + + + + + + + + + + + + +
MMP8
+ - + + +
MMP9
+ + + + + + +
MSX1
+ + + + + + + +
NFKB1
+ + + + + + + + + + + +
PDGFA
+ + + + + + + + + +
Sfmbolo
OPAC Fibroblasto
G O G O
PHEX
+ + + + +
RUNX2
+ + + + + + + + + +
SCARB1
+ + + + + + + +
SERPINH1
+ + + + + + + + + + + + + + + +
SMAD1
+ + + + + + + + + +
SMAD2
+ + + + + + + + + + + +
SMAD3
+ + + + + + + + + + +
SMAD4
+ + + + + + + + + + + +
SOX9
+ + + +
STATH
+ + + +
TFIP11
+ + + + + + + + + + + +
TGFB1
+ + + + + + + + + + + + +
TGFB2
+ + + + + + + + + + +
TGFB3
+ + + + + + + + + + + +
TGFBR1
+ + + + + + + + + +
TGFBR2
+ + + + + + +
TNF
+ + + +
TUFT1
+ + + + + + + + +
TWIST1
+ + + + + + + + + + + + +
VCAM1
+ + + + + + +
VDR
+ + + + + + + + + + +
VEGFA
+ + + + + + + + + + +
VEGFB
+ + + + + + + + + + + +
G: Expresion relativa con respecto a testigo en medio de cultivo.
O: Expresion relativa con respecto a testigo en medio osteogenico.
Tablas 3D-3F: Diferencia en veces en la expresion de OPAC y PDACTM, MSC y fibroblastos de los genes seleccionados en un medio de cultivo en comparacion con un medio osteogenico. Una diferencia en veces de 10 para un gen particular, por ejemplo, indica que el gen se induce diez veces en medio osteogenico en comparacion con un medio de cultivo. Se muestran solo los resultados en los que la induccion en veces del medio osteogenico en 5 OPAC es al menos diez veces mas alta o mas baja que la induccion en veces en PDAC™ (Tabla 3D), MSC (Tabla 3E) o fibroblastos (Tabla 3F) (se asignaron a los resultados en blanco un valor de 0 para seleccion).
Tabla 3D
Sfmbolo
OPAC PDACtm
Diferencia en veces
Diferencia en veces
BMP2
11,65
COL11A1
3,64 84,86
COL1A1
0,38 9,31
COL4A3
1,26 12,91
COL5A1
0,99 6,84
COMP
17,90 4095,78
Sfmbolo
OPAC PDACtm
Diferencia en veces
Diferencia en veces
CSF3
59,08
CTSK
6,88 79,18
FGF1
0,12 1,81
FGFR2
0,27 76,81
MMP10
279,30
MMP9
7079936,55 12,25
TGFB2
15,77 0,72
Diferencia en veces: Diferencia entre la expresion en el medio de cultivo y el medio osteogenico.
En blanco: La diferencia en veces no pudo calcularse porque la fluorescencia de un tipo de celula era demasiado baja.
Tabla 3E:
Sfmbolo
OPAC MSC
Diferencia en veces
Diferencia en veces
ALPL
2,02 29,13
CD36
1,08 84,08
COL10A1
0,08 19,86
COL11A1
3,64 43,73
COL12A1
0,42 5,02
COL1A1
0,38 7,23
COL4A3
1,26 15,62
COMP
17,90 1629,84
CSF3
59,08
CTSK
6,88 148,38
FGF1
0,12 1,93
FGFR2
0,27 88,30
IGF1R
4,21 1,53
IGF2
53,38 0,60
ITGA2
8,10 0,16
ITGA3
2,70 0,24
MMP10
279,30 1,44
MMP9
7079936,55
TGFB2
15,77 0,64
Diferencia en veces: Diferencia entre la expresion en el medio de cultivo y el medio osteogenico.
En blanco: La diferencia en veces no pudo calcularse porque la fluorescencia de un tipo de celula era demasiado baja.
Tabla 3F:
Sfmbolo
OPAC Fibroblasto
Diferencia en veces
Diferencia en veces
BMP2
11,65 0,95
BMP4
0,23 72,12
COL12A1
0,42 6,55
COMP
17,90 431,41
CSF2
2,16 0,12
CSF3
59,08 0,10
FGF1
0,12 3,26
IGF1
31,46
ITGA2
8,10 0,54
MMP10
279,30
MMP8
38,76
MMP9
7079936,55 0,40
Diferencia en veces: Diferencia entre la expresion en el medio de cultivo y el medio osteogenico.
En blanco: La diferencia en veces no pudo calcularse porque la fluorescencia de un tipo de celula era demasiado baja.
Cuando las OPAC y PDAC™ cultivadas en condiciones de cultivo se compararon usando un conjunto de 84 genes en la superfamilia de TGFp/BMP, las OPAC generalmente mostraron una expresion mas alta de genes relacionados con la formacion osea (Tabla 4). Las OPAC tuvieron mayor expresion genica que se relaciono con el soporte trofico 5 de la formacion osea que incluye BMP (especialmente BMP-2) y TGF- p. Las OPAC tambien tuvieron mayor expresion genica que podna relacionarse con el soporte trofico de la inhibicion de la formacion osea o la resorcion osea que incluye inhibinas y TGF-p (TGF-p esta implicado en la formacion y resorcion osea). La superfamilia de TGFp/BMP representa un sistema de respuestas complejo de regulacion de multiples sistemas de organos diferentes. El hecho de que los genes de esta superfamilia se expresan en OPAC a niveles mas altos que en 10 PDAC™ indican que las OPAC tienen mayor capacidad para regular el metabolismo oseo que OPAC™.
Tabla 4:
Sfmbolo
OPAC PDAC
Regulacion hacia arriba/abajo (veces)
CHRD
+ + - 53,25
GDF7
+ + 12,18
IGFBP3
+ + + + + + 1187,56
INHA
+ + + 16,38
TGFB2
+ + + + + + -11,02
Regulacion hacia arriba/abajo: Diferencia en veces entre OPAC/PDAC™
Tabla 4: Expresion genica de los miembros de la superfamilia de TGFp/BMP (valores Ct) de OPAC, PDAC™, MSC y fibroblastos en medios de cultivo (n=3). El nivel de expresion de los genes se clasifica como ++++ (muy alto, Ct<20). +++ (alto, 20<Ct<25), ++ (medio, 25<Ct<30), + (bajo 3o<Ct<35), - (bajo 35<Ct<40) o en blanco (sin senal detectada). La diferencia en veces representa la diferencia del nivel de expresion cuando las OPAC se comparan con PDAC™. Solo se muestran los genes para los cuales la expresion en OPAC excedio la expresion en PDAC™, o para los cuales la expresion en PDAC™ excedio la expresion en OPAC.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Ademas de la expresion genica, tambien se realizo el analisis de la secrecion de protemas (Arreglo de Anticuerpos en base a Etiqueta de Biotina RayBio® de RayBiotech) de OPAC, PDAC™, MsC y fibroblastos cultivados en condiciones de cultivo (Figura 13). Se identifico un total de 46 protemas secretadas entre los 4 tipos de celulas. Las protemas secretadas por OPAC, pero no PDAC™, incluyeron el factor II de coagulacion/factor tisular, decorina, epirregulina, similar a folistatina 1, IGFBP6, IGF-IIR, IL-2Ra (receptor de interleuquina 2 a), IL-12Rp2 (subunidad p2 del receptor de interleuquina 12), IL-17RC (receptor de interleuquina C), IL-27 (interleuquina 27), protema de union beta 1 - TGF latente, NCAM- 1/CD56 (molecula de adhesion celular neural 1), sfRp-4 (protema 4 secretada relacionada con la protema Frizzled), SMAD4, espinesina, TFP1 (inhibidor de la via del factor tisular), TGF-p R1/ALK5 (receptor 1 beta del factor del crecimiento de transformacion), TIMP-2 (inhibidor del tejido de metaloproteasas 2), y TSG-6 (gen 6 estimulado por factor de necrosis tumoral (TNF)). Las protemas secretadas por OPAC pero no por MSC inclman decorina, epirregulina, FGF-7/KGF, IGFBP-3, IL-2Ra (receptor alfa de interleuquina-2), IL-3Ra (receptor alfa de interleuquina 3), IL-5Ra (receptor alfa de interleuquina 5), IL-17RC, IL-27, NCAM-1/CD56, SMAD4, TFPI, TGF-pR1/ALK-5, TGF-pRIII (receptor 3 beta del factor de crecimiento de transformacion) y TIMP2. Las protemas, cuya expresion fue unica para OPAC en comparacion con PDAC™ y MSC, fueron decorina, epirregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, protema 1 de union al TGF-beta (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 y TIMP-2. De estas, la decorina, IGFBP-6 y IL-27 estan implicadas en la regulacion osea. De estas, la protema similar a filistatina 1, sFRP-4 y TSG-6 estan implicadas en la regulacion de los huesos.
Tambien se mostro en un experimento separado que las OPAC no expresaron RANKL, como se evaluo mediante RT-PCR cuantitativa; MSC derivada de medula osea. Sin embargo, produjeron cantidades significativas de ARN para RANKL.
6.2 Ejemplo 2: Capacidad de OPAC de formacion de huesos in vivo
Para evaluar la capacidad de OPAC de formacion de huesos in vivo, se realizo un estudio in vivo usando un modelo de defecto craniano de reparacion osea. De manera experimental, se utilizaron cuarenta y ocho ratas atfmicas macho Hsd:RH-Foxn1rnu (Harlan Laboratories, Indianapolis, Indiana), de aproximadamente 6 semanas de edad al comienzo del estudio. Todas las ratas teman un defecto de 3 mm x 5 mm creado a cada lado de la calvaria. El defecto izquierdo de cada una se trato con un testigo negativo (reemplazo de injerto de hueso HEALOS®, solo) y el defecto derecho de cada uno se trato con un testigo positivo (HEALOS® + BMP-2), un testigo negativo (defecto vado; se quito el hueso y no se reemplazo con nada), o celulas (PDAC™ u OPAC) cargadas sobre la matriz del portador HEALOS®. Se asignaron ocho animales a los grupos de tratamiento celular y se asignaron cuatro animales a grupos de BMP-1 y sin defectos. Los defectos se trataron con Healos que contema las siguientes dosificaciones: 5 |jg de BMP-2, o 3x105 - 4x105 celulas.
Las ratas se sacrificaron siete (7) semanas despues de la implantacion. Con la necropsia, los craneos se recolectaron y se colocaron en 10% de formaldehndo. Las calvarias se escanearon con PIXI, se sometieron a radiograffa y despues se descalcificaron para remojo en parafina y seccionamiento. Las secciones histologicas coronales de las calvarias se tineron con azul de toluidina y tincion de H&E (hematoxilina y eosina). La cantidad de crecimiento hacia el interior del hueso al defecto se evaluo mediante un sistema de clasificacion de 0 a 4, siendo 4 la cantidad mas grande.
Detalles de la dmg^a
Se adquirieron un total de cuarenta y ocho (48) mas cuatro (4) ratas atfmicas macho de reserva Hsd:RH-Foxn1rnu de Harlan, Indianapolis, en Estados Unidos. Los animales estaban libres de patogeno espedfico y teman aproximadamente 6 semanas de edad al momento de la llegada a MDS-PS-Efficacy Pharmacology. Las ratas fueron anestesiadas usando cetamina/xilazina administrada por inyeccion intraperitoneal, segun los procedimientos operativos estandar (SOP). Se logro una anestesia general en aproximadamente 3-5 minutos y se observo mediante una falta de respuesta a un pellizco en el dedo de la pata. La sedacion se mantuvo a lo largo de toda la cirugfa con isoflurano, segun fue necesario.
Se rasuro el area del craneo usando una cortadora electrica y se preparo con alcohol y se restrego con clorhexadina. El animal se posiciono para sujetar con firmeza la cabeza en una posicion estable hacia adelante y se administro una inyeccion anestesica (aproximadamente 0,2 ml de xilocama) por via subcutanea en el area central del craneo entre las orejas. Se realizo una incision de piel transversal en el sitio de la inyeccion de xilocama y un expansor de tejido colocado en la region central del margen rostral de la incision (colgajo de piel). El expansor abrio la incision y se expuso el craneo. La xilocama, que se vuelve similar a un gel, se quito y se realizo una incision transversal en el periostio en la sutura parietal/interparietal usando la hoja del escalpelo. El periostio se quito de los huesos parietales despues de que se realizo la incision. Se utilizo un taladro Dremel a una velocidad media para esculpir cuidadosamente el margen de ambos defectos, aproximadamente 3 mm por un area de 5 mm en cada hueso parietal, hasta que la parte central del hueso estaba completamente libre de union. El area se irrigo con un gotero de solucion salina esteril durante la perforacion para evitar que el hueso se sobrecalentara. Cuando la parte del hueso se separo completamente se quito con forceps Adson. Los bordes del defecto se marcaron con cuadrados y se alisaron cuidadosamente usando forceps cuando fue necesario. Para quitar el polvo y las virutas de hueso, el craneo se enjuago con aproximadamente 3 mL de solucion salina esteril, que se absorbio con una pieza de gasa
esteril. Una vez limpia y que se quito el exceso de fluido, el defecto se trato con el artmulo de prueba asignado. La dermis se tiro hacia atras sobre el craneo y la incision dermica se cerro usando suturas Vicryl 3.0 o 4.0. El personal encargado de las instalaciones para animales hizo chequeos post-operatorios para documentar la recuperacion completa del animal. El D^a 48 post-cirugfa, el resto de los animales fueron sacrificados por asfixia con CO2.
5 Detalles del analisis
Se recolectaron las calvarias y se colocaron en 10% de formaldelmdo. Luego de la fijacion, se utilizo una absorciometna de rayos x de energfa dual Lunar (PIXI) para determinar la densidad mineral osea (BMD) de ambos defectos de la calvaria. Se establecio una ROI mas pequena que los margenes del area de defecto y se utilizo una ROI del mismo tamano para ambos defectos en todas las muestras. El PIXI midio el area mineral osea (BMA) PIXI y 10 el contenido mineral oseo (BMC; g). Luego se dividio el BMC por el BMA (mm2) para determinar la densidad mineral osea por area (BMD; g/mm2). Despues de completarse la densitometna de PIXI, las calvarias se sometieron a radiograffa y se procesaron para Histologfa. Las calvarias se sometieron a radiograffa, se procesaron a traves de procesamiento de tejidos descalcificados y se dividieron en dos piezas. Despues de dividirse, las calvarias se empaparon en parafina. Se cortaron tres secciones coronales a traves de las areas de defecto, cada una de 15 aproximadamente 4-6 pm de espesor y se montaron sobre portaobjetos. Se tino una seccion con azul de toluidina y otra se tino con H&E para evaluacion histopatologica del crecimiento oseo hacia dentro. La determinacion del cierre del defecto usando escaneos de rayos x se realizo designando una region de interes que rodea el efecto craniano, usando umbralizacion para definir el area radiolucente (defecto residual oscuro) de areas radio-opacas, cuantificando estas areas de defecto residual usando un software de formacion de imagenes.
20 Los resultados demostraron un 20% de aumento en la formacion osea, como se observa mediante aumentos de BMC y BMD, y mediante tincion de H&E, para OPAC en comparacion con PDACTM en este modelo. En base al analisis de los datos in vivo, las OPAC exhibieron al menos 20% mas de formacion osea que PDAC™ mediante analisis histologico (Figura 14) y densitometrico (PIXI). Asimismo, el analisis del area de defecto residual usando escaneos de rayos x obtenidos en el momento del sacrificio, indico que el 63% de los animales en el grupo de OPAC 25 mostro mas de 50% de cierre del defecto en comparacion con 38% de los animales en el grupo PDAC (Figura 16).
6.3 Ejemplo 3: Tratamiento de mieloma multiple usando OPAC
6.3.1 Materiales y metodos
6.3.1.1 Establecimiento de OPAC transducidas de forma estable con protena fluorescente verde mejorada (EGFP)
El vector retroviral de pLEGFP que contiene una secuencia de codificacion de la Protema Fluorescente Verde
30 Mejorada (EGFP) (Clontech, Palo Alto, California, Estados Unidos) se utilizo para transfectar transitoriamente la
lmea celular de envasado Phoenix Eco (ecotropica) usando SuperFect (QIAGEN Inc., Valencia, California, Estados Unidos). La EGFP es una variante con desplazamiento hacia el rojo de protema fluorescente verde Aequorea victoria tipo salvaje que ha sido optimizada para una fluorescencia mas brillante y mayor expresion en celulas de mairnfero. Los sobrenadantes que conteman partmulas retrovirales se recolectaron 24-48 horas despues de 35 transfeccion. Las OPAC se infectaron con las paiimulas retrovirales en presencia de 8 pg/ml de polibreno durante 12
horas momento en el cual los medios se reemplazaron con medio de cultivo nuevo. En algunos experimentos, las
celulas se expusieron a los sobrenadantes que conteman las partmulas virales una vez mas antes de que se seleccionaron cultivandolas en presencia de 200-400 pg/ml de G418 durante 2-3 semanas.
6.3.1.2 Insercion de OPAC en ratones SCID-Rab mielomatosos
40 Como alternativa al uso de tejido oseo humano en un modelo SCID-hu de mieloma humano primario, se utilizo un sistema en el que los huesos de conejo se implantaron en ratones SCID (ratones SCID-rab), seguido de la introduccion de celulas de mieloma directamente en el hueso implantado. Los ratones mielomatosos SCID-rab se construyeron como se describio anteriormente. Ver Yata, K. y Yaccoby, S., et al, Leukemia 2004;18:1891-1897. Se obtuvieron los ratones CB.17/Icr-SCID (de 6-8 semanas de edad) en Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN, 45 Estados Unidos) y conejas prenadas de Nueva Zelanda en Myrtle Rabbitry (Thompson Station, tN, Estados Unidos). Los conejos de 3-4 semanas de edad fueron profundamente anestesiados con una alta dosis de sodio pentobarbital y fueron sacrificados por dislocacion cervical. Los femures y las tibias de los conejos se cortaron en dos pedazos, con los extremos proximales y distales cerrados, mientras que las vertebras se cortaron en pequenos fragmentos (1 x 2 cm2).
50 Para implantacion osea, el lado derecho o izquierdo del raton SCID se enjuago con alcohol y se coloco en una botella con una gasa esteril. El hueso del conejo se inserto subcutaneamente a traves de una pequena incision (5 mm). Luego se cerro la incision con grapas quirurgicas esteriles, y se hizo posible la insercion de los huesos durante 6-8 semanas. En algunos ratones experimentales, se implantaron dos huesos simultaneamente contralateralmente en el mismo raton. Para cada experimento, se inyectaron directamente en el hueso de conejo implantado 10-50 x 55 106 celulas de la medula osea de mieloma derivadas de un paciente humano no separadas que conteman 17 +/- 8%
celulas de plasma (PC) o 3,3 +/-1,6 x 106 PC en 50 pl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Se utilizaron al menos dos ratones para cada experimento. Los ratones fueron desangrados periodicamente de la vena de la cola para medir los cambios en el nivel de inmunoglobulina (Ig) humana en circulacion del isotipo de protema M.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
El establecimiento del crecimiento del mieloma se demostro mediante niveles aumentados de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en sueros de raton, tal como se observa mediante ELISA, y mediante evaluacion radiografica de las lesiones oseas ltticas. 5x105 OPAC que expresan EGFP se recolectaron con el uso de tripsina- EDTA y se resuspendieron en 50 pl de PBS. Las OPAC se inyectaron directamente en los huesos implantados en los ratones SClD-rab. Los experimentos continuaron durante 8-16 semanas post-inyeccion. Los cambios en la densidad mineral osea (BMD) de los huesos implantados se determino usando un densitometro PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, Wl).
6.3.1.3 Inmunohistoqumica de tejido cultivado de ratones SCID/Rab
Las secciones de huesos descalcificados de ratones SCID-rab con mieloma primario fueron desparafinizadas en xileno, rehidratadas con etanol, enjugadas en PBS y el antigeno se recupero usando microondas tal como se describio anteriormente (ver Yata, K., supra). Las OPAC cultivadas se tripsinizaron, se prepararon portaobjetos de citospina y se fijaron con 10% de formalina tamponada de fosfato durante 20 min. Despues del aplacamiento de peroxidasa con 3% de peroxido de hidrogeno durante 10 min, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos monoclonales contra EGFP y CD 166 humano, osteocalcina y BMP-2 (5-10 pg/ml) durante 30-60 min y se desarrollaron usando un kit de inmunoperoxidasa de Dako y contratinendo con hematoxilina.
6.3.1.4 Tincion de von Kossa y rojo alizarina
Para deteccion de la deposicion de calcio (tincion von Kossa), las OPAC se fijaron en 10% de formalina tamponada de fosfato durante 10 min. Se agrego 5% de nitrato de plata recien preparado y los espedmenes se dejaron en la oscuridad durante 10 min, se enjuagaron con agua destilada y luego se expusieron a luz UV durante 15 min mientras se cubrieron con agua. La reaccion se detuvo enjuagando por completo con agua destilada.
6.3.1.5 Analisis estad^stico
A menos que se indique lo contrario, todos los valores se expresan como media ± error estandar de la media (EEM). Se utilizo una prueba t apareada de Student para evaluar el efecto de diferentes condiciones de cultivo en los numeros de celulas de mieloma, viabilidad, apoptosis y proliferacion, y para evaluar el efecto de las OPACC en el crecimiento del tumor y en la densidad mineral osea humana (BMD) en ratones SCID-rab.
6.3.1.6 Transduccion de OPAC mediada por lentivirus
Todos los lentivirus recombinantes se produjeron mediante transfeccion transitoria de celulas 293T de acuerdo con un protocolo estandar. Brevemente, las celulas 293T se incubaron toda la noche con un precipitado de transfeccion. Posteriormente, el medio de cultivo se reemplazo y posteriormente se realizo una incubacion durante 2 dfas mas. Los medios de las celulas transfectadas fueron cultivados, centrifugados a 3.000 rmp a 4°C durante 15 minutos y filtrados a traves de un filtro de tamano de poro de 0,22 pm. Con el filtrado se recubrio un cojm de 20% de sacarosa y se centrifugo a 26.000 rpm a 4°C durante 100 minutos en una ultracentrifugadora Beckman usando un rotor SW28. Las partfculas similares a virus granuladas se suspendieron en DMEM y se almacenaron a -80°C. Las titulaciones de las soluciones concentradas de virus (unidades de titulacion [TU]/ml) se determinaron agregando alfcuotas de suspension de virus sobre monocapas de celulas 293T u otros tipos de celulas apropiados y evaluando luego el porcentaje de celulas GFP positivas mediante clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACScan, Becton Dickinson). Se obtuvieron de rutina titulaciones de mas 109 TU/ml.
Las OPAC se transfectaron con las partfculas retrovirales en presencia de 8 pg/ml de polibreno durante 12 horas momento en el cual los medios se reemplazaron con medio de cultivo nuevo. En algunos experimentos, las celulas se expusieron a los sobrenadantes que conteman las partfculas virales una vez mas antes de que se seleccionaron cultivandolas en presencia de 200-400 pg/ml de G418 durante 2-3 semanas.
6.3.2 Resultados
6.3.2.1 Mineralizacion de la matriz mediante OPAC
Las OPAC se cultivaron en presencia o ausencia de medios osteogenicos (alfa MEM complementado con 10% de FBS, dexametasona (100 nM), ascorbato (0,05 mM) y beta GP (10 mM) durante aproximadamente 2 semanas. Para deteccion de deposicion de calcio, las celulas se fijaron en 10% de formalina tamponada de fosfato durante 10 minutos. Las celulas fijadas se tineron con tinte rojo de alizarina. La reaccion se detuvo enjuagando por completo con agua destilada. Las OPAC se cultivaron en medios osteogenicos que mostraron signos de mineralizacion de matriz como se indico mediante la union del rojo de alizarina a calcio que se deposita sobre la matriz extracelular producida por las celulas. La mineralizacion de la matriz es un marcador de diferenciacion osteogenica (no se muestran los datos).
6.3.2.2 Inhibicion de OPAC de la maduracion de osteoclastos
Experimentos de cocultivo: Utilizando dispositivos Transwell, las OPAC o MSC se cultivaron primero en el reverso de la membrana de inserto con medios osteoblasticos; los precursores de osteoclastos se incubaron entonces en la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
camara superior. Para permitir la diferenciacion de osteoblastos y osteoclastos simultaneamente, los insertos se incubaron entonces con a-MEM complementado con 10% de PBS, RANKL (50 ng/ml), M-CSF (25ng/ml), dexametasona (100 nM), ascorbato (0,05 mM) y pGP (10 mM) durante aproximadamente 2 semanas. Este procedimiento resulto en un crecimiento simultaneo de osteoclastos multinucleados que expresan fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) y osteoblastos que expresan fosfato alcalino. Los precursores de osteoclastos cultivados en ausencia de OPAC o celulas madre mesenquimales produjeron un promedio de 120 osteoclastos (ver Figura 17). Por el contrario, los precursores de osteoclastos produjeron un promedio de 40 osteoclastos cuando se cultivaron en presencia de celulas madre placentarias y un promedio de 60 osteoclastos cuando se cultivaron en presencia de MSC. Por lo tanto, las OPAC parecen suprimir la formacion de osteoclastos mas eficazmente que lo hacen las celulas madre mesenquimales.
El efecto de las OPAC en la diferenciacion de osteoclastos se redujo significativamente y se formaron significativamente mas osteoclastos, cuando los osteoclastos y las OPAC se cultivaron en presencia de un anticuerpo contra la osteoprotegerina (anti-OPG; p < 0,04). Adicionalmente, se formaron significativamente (p < 0,004) mas osteoclastos cuando las OPAC, solas, se cultivaron con precursores de osteoclastos que cuando los precursores de osteoclastos se cultivaron en presencia de anti-OPG. Por lo tanto, sin animo de cenirse a un mecanismo o teona en particular, la supresion de la diferenciacion de osteoclastos por OPAC parece estar mediada por la osteoprotegerina que secreta OPAC.
6.3.2.3 Supresion del crecimiento de celulas de mieloma multiple por las OPAC
Las celulas de mieloma multiple se obtuvieron a partir de aspiraciones de medula osea (BM) heparinizadas de 27 pacientes con mieloma activo durante visitas clmicas programadas. Las muestras de medula osea se separaron mediante centrifugacion de densidad utilizando Ficoll-Paque (gravedad espedfica 1,077 g/ml) y la porcion de celulas plasmaticas de mieloma multiple en las fracciones celulares de densidad baja determinada por citometna de flujo CD38/CD45. Las celulas plasmaticas (PC) se aislaron utilizando la seleccion de perlas inmunomagneticas CD138 y el sistema de separacion automatizado autoMAC (Miltenyi- Biotec, Auburn, CA). La pureza de las PC se determino por citometna de flujo CD38/CD45 para ser rutinariamente >94%.
Las OPAC y MSC se trataron bajo condiciones estandar o condiciones osteogenicas y se cocultivaron con celulas de mieloma multiple. Para los experimentos de cocultivo se utilizaron insertos Transwell con poros de 1-pm. En este sistema, los osteoblastos (es decir, las MSC u OPAC cultivadas bajo condiciones osteogenicas), las MSC u OPAC se cultivaron en el reverso de las membranas de insertos y las celulas de mieloma multiple (Con MM) se cultivaron en la camara superior de los insertos. Para el cultivo, los insertos de 6 pocillos se dieron vuelta y colocaron en un plato profundo esteril. Las MSC u OPAC se recogieron con tripsina-EDTA y se resuspendieron en un medio de MSC (aproximadamente 0,5 x 106/ml). Aproximadamente 600 pl de celulas se colocaron en el centro del inserto invertido. El plato se cubrio entonces con Parafilm y se coloco en la incubadora durante 1 hora, permitiendo que las celulas se adhirieran a la membrana. Despues de la incubacion, los insertos se dieron vuelta y se colocaron en pocillos de 6 placas. Cuando las MSC u OPAc fueron aproximadamente 80% confluentes, se cultivaron con un medio de MSC o con un medio osteoblastico durante 2-3 semanas. La viabilidad de las celulas de mieloma multiple se evaluo utilizando un ensayo MTT despues de 72 horas. El ensayo MTT es un ensayo colorimetrico para medir la actividad de enzimas que reducen el mTt a formazan, proporcionando un color purpura. Esta reduccion se lleva a cabo solo cuando las enzimas de reductasa mitocondrial estan activas y por lo tanto la conversion se utiliza a menudo como una medicion de celulas viables.
Los resultados muestran que las OPAC no diferenciadas inhibieron la viabilidad de las celulas Con MM en aproximadamente 70% mientras las MSC solo inhibieron la viabilidad de Con MM en aproximadamente 40% (ver FIG. 18). Bajo condiciones osteogenicas las OPAC inhibieron la viabilidad de las celulas Con MM aun mas que bajo condiciones no osteogenicas; las MSC tambien mostraron mas inhibicion bajo condiciones osteogenicas, aunque no el mismo nivel que las OPAC (ver FIG. 18).
Las OPAC tambien se evaluaron para su capacidad de suprimir la proliferacion de las lmeas celulares de mieloma multiple en comparacion con celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea fetal (FB MSC) en un ambiente de cocultivo que permitio el contacto de celula-celula. Las OPAC (10.000 celulas/pocillo) se cultivaron con lmeas celulares de mieloma multiple BN y JB (ver Li et al, Br. J. Haematology 138(6): 802-811 (2007)), ARP1 (lmea celular derivada de mieloma multiple IgA sensible a dexametasona), U266 (una lmea celular plasmatica que produce IgE), Dn y Hale (10.000 celulas/pocillo), todos los cuales expresaron luciferasa, durante 7 dfas en un medio RPMI que comprende 10% de suero bovino fetal y antibioticos. El crecimiento de celulas de mieloma multiple se evaluo mediante la deteccion de actividad de la luciferasa. Las OPAC suprimieron el crecimiento de las lmeas celulares de mieloma multiple aproximadamente de la siguiente manera: BN (0,4); JB (0,5); ARP1 (0,15); U266 (0,28); Dn (0,32); y hale (0,75), en donde el numero en parentesis indica el crecimiento de las lmeas celulares MM en veces del crecimiento de las lmeas celulares MM cocultivadas con FB-MSC.
En un experimento adicional, las celulas de mieloma multiple de seis pacientes humanos diferentes se obtuvieron y cocultivaron a 400.000 celulas/pocillo con celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea fetal u OPAC durante 6-10 dfas. La viabilidad de las celulas de mieloma multiple se redujo significativamente en presencia de las OPAC en comparacion con MSC fetales (p < 0,03).
6.3.2.4 Biodistribucion de OPAC etiquetadas, administradas intralesionalmente en animales
Este ejemplo demuestra la biodistribucion de OPAC transfectadas en ratones. Las OPAC se transfectaron con un reportero luciferasa. El vector retroviral pLEGFP que contiene el EGFP (Clontech, Palo Alto, California, Estados Unidos) se utilizo para transfectar transitoriamente la lmea celular de envasado Phoenix Eco utilizando SuperFect 5 (QIAGEN Inc., Valencia, California, Estados Unidos). Los supernadantes que contienen partmulas retrovirales se recogieron 24-48 horas despues de la transfeccion. Las OPAc se transfectaron con las partmulas retrovirales en presencia de 8 pg/ml de polibreno durante 12 horas, momento en el cual el medio se reemplazo con un medio de cultivo nuevo. En algunos experimentos, las celulas se expusieron una vez mas a los supernadantes que contienen las partmulas virales antes de seleccionarlos mediante su cultivo en presencia de 200-400 pg/ml de G418 durante 210 3 semanas.
Los animales SCID-rab se implantaron con hueso de conejo como se describio anteriormente. Los animales que tienen un hueso que muestra lesiones progresivas se inyectaron con celulas etiquetadas (1 x 106 celulas) directamente en las lesiones. La biodistribucion de las OPAC en los ratones se monitoreo mediante imagenes de bioluminiscencia, una herramienta en tiempo real, no invasiva, en diferentes puntos de tiempo. Las OPAC que 15 expresan EGFP pudieron detectarse en los ratones a las 2 semanas y 5 semanas despues de la infeccion en areas donde el hueso exogeno se implanto en los animales SCID-rab (los datos no se muestran).
6.3.2.5 Las OPAC aumentan la densidad mineral osea en ratones SCID-rab mielomatosos primarios
Los ratones SCID-rab mielomatosos primarios se construyeron segun se describio anteriormente. Tras el establecimiento del crecimiento del mieloma segun se evaluo mediante el nivel aumentado de inmunoglobulinas 20 monoclonales humanas (Mg) en los sueros de ratones utilizando ELISA y mediante evaluacion radiografica de lesiones oseas ltticas, se recogieron 1 x 106 de OPAC que expresan EGFP con el uso de tripsina-EDTA y resuspendieron en 100 pl de PBS. Las OPAC y PBS se inyectaron directamente en los huesos implantados, que comprenden lesiones mielomatosas. Los cambios en la densidad mineral osea (BMD) de los huesos implantados se determinaron utilizando un PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, WI) en intervalos de 5 semanas 25 durante 8-16 semanas despues de la inyeccion. Se encontro que las OPAC administradas intralesionalmente aumentaron la densidad mineral osea (BMD) del hueso implantado en comparacion con testigos en los cuales solo se inyecto el medio, (p = 0,0006.) (Ver Figura 19).
6.3.2.6 Las OPAC aumentan la masa osea en huesos afectados por mieloma multiple
Los ratones SCID-rab mielomatosos construidos segun se describio anteriormente se inyectaron con celulas de 30 mieloma primario de un paciente humano. Despues del desarrollo de lesiones osteolfticas segun se demostro mediante el nivel aumentado de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en los sueros de ratones, segun se evaluo por ELISA y mediante evaluacion radiografica de lesiones oseas ltticas, se administraron 5 - 10 x 105 de OPAC que expresan EGFP segun se describio en el ejemplo previo. Los experimentos se continuaron durante 8-16 semanas despues de la inyeccion. El nivel de celulas de mieloma humano se determino utilizando inmunoglobulinas 35 monoclonales humanas (hlg) en los sueros de ratones mediante un ensayo ELISA despues de la inyeccion de las OPAC (ver Figura 20). Los cambios en la densidad mineral osea (BMD) de los huesos implantados se determinaron utilizando un PIXImus DEXa (BE Medical Systems LUNAR, Madison, WI). Durante el transcurso del estudio, los huesos implantados en ratones mielomatosos que reciben OPAC administradas intralesionalmente mostraron un aumento significativo (0,10 gm/cm2) en masa osea 35 dfas despues de la inyeccion en comparacion con ratones que 40 recibieron solo solucion amortiguadora (p = 0,006).
6.3.2.7 Las OPAC inhiben la destruccion osea en animales SCID-Rab a los que se les administro una lmea celular de mieloma multiple agresivo
Los ratones SCID-rab mielomatosos se construyeron segun se describio anteriormente. Tras el establecimiento de mieloma utilizando una lmea celular de mieloma BN agresiva (una lmea celular no hiperdiploide aislada de un 45 paciente humano), el efecto de la solucion amortiguadora u OPAC en el crecimiento de las celulas de mieloma se evaluo mediante el nivel aumentado de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en los sueros de ratones utilizando ELISA y mediante una evaluacion radiografica de lesiones oseas ltticas. Se recogieron 0,5x106 de OPAC que expresan EGFP (0,5x106 celulas) con el uso de tripsina-EDTA y resuspendieron en 50 pl de PBS. Las OPAC y PBS se inyectaron directamente en los huesos implantados en ratones SCID-rab. Los experimentos se continuaron 50 durante 8-16 semanas despues de la inyeccion. Los cambios en la densidad mineral osea (BMD) de los huesos implantados se determinaron utilizando un PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, WI). Los datos muestran que las OPAC inhibieron la perdida osea que sena atribuible a esta lmea celular de mieloma multiple agresiva segun se midio mediante densidad mineral osea (BMD) y contenido mineral oseo (BMC). Ver Figura 21.
La reduccion/eliminacion de la perdida de masa osea debido a las OPAC se confirmo mediante radiograffa de rayos 55 X (los datos no se muestran). Los animales tratados con OPAC teman masa osea mas alta en comparacion con animales testigo segun se demostro mediante un aumento significativo en las areas radiodensas del hueso nuevo.
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6.4 Ejemplo 4: Tratamiento del mieloma multiple utilizando OPAC en combinacion con melfalan
Este ejemplo demuestra la eficacia de la administracion de OPAC en combinacion con melfalan para tratar lesiones osteoltticas asociadas con mieloma multiple. Los ratones SCID-rab mielomatosos se implantaron con hueso segun se describio en la Seccion 6.3.1.2 previa. Los ratones se separaron en grupos que reciben OPAC, a una dosis de aproximadamente 1 millon en solucion salina tamponada con fosfato y testigos que reciben no OPAC. Los ratones se inyectaron en la semana cero con una lmea celular de mieloma multiple (BN) que expresa EGFP/Luciferasa, directamente en el hueso implantado y tratado con 10 mg/kg de melfalan subcutaneamente dos veces a la semana durante cuatro semanas, comenzando en la semana 3 (semanas 3-7 despues de la inyeccion de celulas de mieloma). En la semana 7, el tratamiento con melfalan se discontinue y se inyecto aproximadamente 1 millon de celulas/raton OPAC sin etiquetar intralesionalmente en el hueso implantado. La evolucion de la enfermedad se siguio por once semanas adicionales. La formacion de imagenes de animales vivos se realizo en las semanas 3, 7 y 18. Los ratones que recibieron OPAC mostraron una carga de celulas tumorales de mieloma multiple reducido, segun quedo demostrado por EGFP y fluorescencia de luciferasa, en comparacion con testigos. Mas aun, los ratones que recibieron OPAc retuvieron la masa osea mejor que los ratones testigo, mostrando un aumento de aproximadamente 28% en masa osea despues del melfalan en comparacion con una perdida de aproximadamente 4% despues del melfalan para los ratones testigo.
6.5 Ejemplo 5: Produccion del producto de OPAC criopreservadas y banco de celulas Este ejemplo demuestra la produccion de un producto a base de OPAC congeladas.
Criopreservacion: Las OPAC se obtienen segun se describio en el Ejemplo 1. Las celulas a congelar se cosechan del cultivo con Tripsina-EDTA, se extraen con 2% de FBS en PBS y se cuentan en un hemocitometro. Despues de la centrifugacion, las celulas se resuspenden con 10% de DMSO en FBS a una concentracion de aproximadamente 1 millon de celulas/ml para celulas a utilizar para ensamblar un banco de celulas y 10 millones de celulas/ml para dosis de celulas congeladas. La solucion de celulas se transfiere a un recipiente de congelamiento, que se coloca en un bano de alcohol isopropflico en un congelador a -80°C. Al dfa siguiente, las celulas se transfieren a nitrogeno lfquido.
6.5.1 Diseno de un banco de OPAC
Un "lote" se define como todas las dosis de celulas derivadas a partir de un corion de un solo donante. Las celulas mantuvieron un crecimiento normal, cariotipo y fenotipo de marcador de superficie celular para mas de 8 pases y 30 duplicaciones durante el cultivo de expansion. Dada esta limitacion, las dosis comprenden celulas de 5 pases y aproximadamente 20 duplicaciones. Para generara un suministro de celulas equivalentes, un unico lote se expande en cultivo y se almacena en un banco de celulas de dos niveles y dosis congeladas. En particular, las celulas cosechadas del cultivo primario, que se define como celulas de Pase 0 habiendose sometido a 0 duplicaciones, se utilizan para iniciar un cultivo de expansion. Despues del primer pase, ocurren aproximadamente 4 duplicaciones y las celulas se congelan en un banco de celulas primario (MCB). Los viales del MCB se utilizan para sembrar cultivos de expansion adicionales. Despues de que dos pases adicionales de celulas se diluyeron del MCB, las celulas se congelaron en un banco de celulas de trabajo (WCB), aproximadamente 12 duplicaciones acumulativas. Los viales del WCB se utilizan para sembrar un cultivo de expansion para otros 2 pases, resultando en celulas de pase 5 a aproximadamente 20 duplicaciones que se congelan en dosis individuales.
6.5.2 Celulas de descongelamiento para cultivo
Los recipientes congelados de celulas se colocan en una bolsa de plastico sellada y se sumergen en un bano de agua a 37°C. Los recipientes se agitan en drculos suavemente hasta que todos los contenidos se derriten excepto para una pieza pequena de hielo. Los recipientes se retiran de la bolsa de plastico sellada y un volumen de 10X de medio de cultivo se agrega lentamente a las celulas con un mezclado suave. Una muestra se cuenta en el hemocitometro y se siembra en cultivos de expansion.
6.5.3 Celulas de descongelamiento para inyeccion
Los recipientes congelados de celulas se transfieren al sitio de administracion en un transportador de nitrogeno seco. Antes de la administracion, los recipientes se colocan en una bolsa de plastico sellada y se sumergen en un bano de agua a 37°C. Los recipientes se agitan en drculos suavemente hasta que todos los contenidos se derriten excepto para una pieza pequena de hielo. Los recipientes se retiran de la bolsa de plastico sellada y se agrega un volumen igual de 2,5% de HSA/5% de Dextrano. Las celulas se inyectan sin un lavado adicional.
6.5.4 Prueba y especificaciones
Una muestra de sangre maternal acompana la placenta de todos los donantes. La muestra se somete a una prueba para la deteccion del anticuerpo del nucleo de Hepatitis B y antfgeno de superficie, anticuerpo del virus de Hepatitis C y acido nucleico y anticuerpo de VIH I y II y acido nucleico. El procesamiento placentario y de cultivo primario comienza antes de la muestra de los resultados de prueba, pero continua solo para placentas asociadas con muestras de sangre maternal que resultan negativas para todos los virus. Un lote se rechaza si el donante da positivo para cualquier patogeno. Ademas, las pruebas descritas en la Tabla 3 se realizan en el MCB, el WCB y una
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10
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20
25
30
35
40
muestra del material de dosis celular derivado de un vial del WCB. Un lote se libera solo cuando se cumplen todas las especificaciones.
Tabla 3: Prueba y especificaciones de celulas
Prueba
Metodos Resultado requerido
Esterilidad
BD BACTEC PEDS PLUS/F y BACTEC Myco/F Lytic Negativo
Endotoxina
Coagulo de gel LAL < 5 EU/ml*
Viabilidad
Azul de tripano >70% viable
Micoplasma
Cultivo directo, ADN-fluorocromo (FDA PTC 1993) Negativo
Identidad
Citometna de flujo CB105+; CD200tenue CD200-
Pureza celular
Microsatelite No se detecto celula contaminante
Cariotipo
Bandeo cromosomico y conteo de cromosomas en celulas metafase Normal
*Para que el producto disenado sea de 40 ml de celulas congeladas/dosis y un maximo de 5 EU/ml, el producto de celulas se encuentra por debajo del lfmite superior de 5EU/kg/dosis para recipientes mayores que 40 kg en peso corporal.
6.6 Ejemplo 6: Tratamiento de mieloma multiple por la administracion de OPAC
6.6.1 Administracion intralesional de OPAC en solucion
Un individuo presenta mieloma multiple, con smtomas de dolor oseo e hipercalcemia (en este caso, niveles de calcio en sangre de entre 3 y 4 mmol/L). Las imagenes de rayos X confirman la presencia de lesiones multiples en la tibia, perone, radio y cubito. De aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 108 de OPAC en 1,0-2,0 mL de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) por lesion se administran al individuo mediante inyeccion directamente en la lesion. El individuo se evalua cada dos semanas luego de la inyeccion por rayos X para determinar el alcance de las lesiones oseas y niveles de calcio en sangre se evaluan cada semana hasta que las lesiones oseas se reducen visiblemente mediante rayos X o niveles de calcio en sangre se reducen de manera detectable. Las OPAC se vuelven a administrar opcionalmente dentro de las cuatro semanas de la administracion inicial.
6.6.2 Administracion intralesional de OPAC en gel de colageno
Un individuo presenta mieloma multiple, con smtomas de dolor oseo e hipercalcemia (en este caso, niveles de calcio en sangre de entre 3 y 4 mmol/L). Las imagenes de rayos X confirman la presencia de lesiones multiples en la tibia, perone, radio y cubito. De aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 108 de OPAC en 1,0-2,0 mL de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que comprende suficiente colageno para formar un gel inyectable por lesion se administran al individuo mediante inyeccion directamente en la lesion. El individuo se evalua cada dos semanas luego de la inyeccion por rayos X para determinar el alcance de las lesiones oseas y los niveles de calcio en sangre se evaluan cada semana hasta que las lesiones oseas se reducen visiblemente mediante rayos X o los niveles de calcio en sangre se reducen a 3 mmol/L o menos. Las OPAC se vuelven a administrar opcionalmente dentro de las cuatro semanas posteriores a la administracion inicial.
6.6.3 Administracion intralesional de OPAC con reemplazo de injerto oseo
Un individuo presenta mieloma multiple, con smtomas de dolor oseo e hipercalcemia (en este caso, niveles de calcio en sangre de entre 3 y 4 mmol/L). Las imagenes de rayos X confirman la presencia de lesiones multiples en la tibia, perone, radio y cubito. En el consultorio, se premezcla un sustituto de injerto oseo inyectable (por ejemplo, HEALOS®) con aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 108 de OPAc, en 1,0-2,0 mL de solucion salina de fosfato (PBS), luego se inyecta en el individuo en el sitio de las lesiones. El individuo se evalua cada dos semanas luego de la inyeccion por rayos X para determinar el alcance de las lesiones oseas y los niveles de calcio en sangre se evaluan cada semana hasta que las lesiones oseas se reducen visiblemente mediante rayos X o los niveles de calcio en sangre se reducen a 3 mmol/L o menos. Las OPAC se vuelven a administrar opcionalmente dentro de las cuatro semanas posteriores a la administracion inicial.
6.6.4 Administracion intravenosa de OPAC
Un individuo presenta mieloma multiple, con smtomas de dolor oseo e hipercalcemia (en este caso, niveles de calcio en sangre de entre 3 y 4 mmol/L). Las imagenes de rayos X confirman la presencia de lesiones multiples en la tibia, perone, radio y cubito. De aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1010 de OPAC, en aproximadamente 750 mL de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), se administran al individuo mediante infusion intravenosa. El individuo se evalua cada dos semanas luego de la inyeccion por rayos X para determinar el alcance de las lesiones oseas y los niveles de calcio en sangre se evaluan cada semana hasta que las lesiones oseas se reducen
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visiblemente mediante rayos X o los niveles de calcio en sangre se reducen a 3 mmol/L o menos. Las OPAC se vuelven a administrar opcionalmente dentro de las cuatro semanas posteriores a la administracion inicial.
La solicitud divulga entre otros los siguientes ttemes:
1. Un metodo de tratamiento de un individuo que padece mieloma multiple, que comprende administrar a dicho
individuo celulas adherentes placentarias osteogenicas (OPAC) aisladas, en donde dichas OPAC se obtienen de corion y son adherentes al plastico para cultivo tisular, y en donde dichas OPAC son negativas para CD200 o son CD200fenue, y positivas para CD105, y en donde dicha administracion reduce notoriamente el avance, detiene el avance o mejora uno o mas smtomas de dicho mieloma multiple.
2. El metodo del item 1, en donde dichas OPAC son SSEA3+ o SSEA4+.
3. El metodo del item 1, en donde dichas OPAC son SSEA3+ y SSEA4+.
4. El metodo del item 1, en donde dichas OPAC:
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+ adherentes, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BMP3 (protema morfogenetica osea 3) CDH11, COL10A1, COL14A1, COL15A1, DMP1 (fosfoprotema acida de la matriz de la dentina 1), DSPP (sialofosfoprotema de la dentina), ENAM (enamelina), FGFR2 (receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos), MMP10 (metaloproteasa de la matriz 10 (estromelisina 2), TGFB3 y/o TGFBR1 cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias CD200+ se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes CD200+, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de AMBN (ameloblastina (protema de la matriz del esmalte)), BMP2 (protema morfogenetica osea 2), CALCR (receptor de calcitonina), CDH11, COL11A1, COL14A1, COL15A1, COL2A1, CSF2, CSF3, DMP1, DSPP, ENAM, FGF3, GDF10 (factor 10 de diferenciacion de crecimiento), IGF1 (factor 1 de crecimiento similar a la insulina), ITGA1 (integrina, alfa 1 (CD49)), ITGA2 (integrina, alfa 2 (CD49B)), MmP10, MMP8 (metaloproteasa de la matriz 8 (colagenasa de neutrofilos)), MMP9, PDGFA (factor de crecimiento A derivado de plaquetas), SMAD1, TGFB3, TgFbR1 y/o TGFBR2 (factor de transformacion de crecimiento beta, receptor 2) cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+ adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CDH11, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+ adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AHSG (glicoprotema alfa-2-HS), ALPL (fosfatasa alcalina de fugado/hueso/rinon), EGF (factor de crecimiento epidermico), FLT1 (tirosina quinasa 1 relacionada con fms (factor de crecimiento endotelial vascular/receptor del factor de permeabilidad vascular)), IGF2, ITGA2, ITGAM (integrina, alfa M (subunidad 3 del receptor del componente 3 del complemento)), SCARB1 (receptor depurador clase B, miembro 1), SOX9 (SRY (region de determinacion sexual Y)-caja 9), TNF, TWIST1 (homologo 1 de Twist; anteriormente blefarofimosis, epicanto inverso y ptosis 3, acrocefalosindactilia 3), VCAM1 (molecula 1 de adhesion celular vascular 1) y/o VDR (receptor de vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3)) cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+ adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BGN (biglicano), COL11A1, COMP (protema oligomerica de la matriz del cartflago) FGF1 y/o VCAM1 cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan VCAM1 a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes que no son trofoblastos ni citotrofoblastos, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de BMP4, CALCR, CD36, CDH11, COL12A1, COL14A1, COL15A1, COL3A1, COL5A1, DMP1, DSPP, FLT1, MSX1, PDGFA,
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TGFB3, TGFBR1 y/o TUFT1 (Tuftelina 1), cuando las OPAC y las celulas madre se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AMBN, CALCR, COL14A1, COL15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1, ITGA2, MMP10, MMP9, MSX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando las OPAC y las celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de CALCR, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL, BGLAP (protema (gla) osea gamma-carboxiglutamato), IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1 y/o SOXl, cuando las OPAC y las celulas madre mesenquimales se cultivan en un medio de crecimiento, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, BMP3, BMP5, CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, COL2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR2, IGE2, MMP8, PHEX (homologo de la endopeptidasa reguladora de fosfato, ligada a X), RUNX2 (factor de transcripcion 2 relacionado con Runt), SCARB1, SOX1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando las OPAC y las celulas madre se cultivan en un medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real; o
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas bajo que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas o todos de ALPL, BGLAP, IGF2, SCARB1 y/o SOX9, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarioas se cultivan en un medio de crecimiento o medio osteogenico, segun se evalua mediante valores Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.
5. El metodo del item 1, en donde dichas OPAC:
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BMP4, BMP6, CD36, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COLSA1, CSF2, CTSK, FGF2, FGFR1, FLT1, ITGA1, MINPP1, MMP9, MSX1, PDGFA, SERPINH1, TGFB3 y TGFBR1, en donde dichas OPAC y dichas celulas mesenquimales han experimentado un numero equivalentes de pases; o
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas fibroblastos, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BmP4, BMP6, CDHil, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, FLT1, IGF1R, ITGA1, MINPP1, PDGFA, SERPINH1, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TNF, TUFT1, VCAM1 y VEGFA, y en donde dichas celulas fibroblastos han experimentado un numero equivalentes de pases.
6. El metodo del item 1, en donde dichas OPAC secretan una o mas de las protemas decorina, epiregulina, IGFBP- 3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, Protema de union a TGF-beta latente 1 (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 o TIMP-2.
7. El metodo del item 1, en donde dichas OPAC secretan las protemas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL- 2 R alfa, IL-17RC, IL-27, Protema de union a TGF-beta latente 1 (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 and TIMP-2
8. El metodo del item 1, en donde dichos uno o mas smtomas son dolor oseo, lesiones osteocfticas, anemia, o insuficiencia renal.
9. El metodo del item 1, que comprende administrar al menos 1 x 108 OPAC/kg a dicho individuo.
10. Una celula adherente placentaria osteogenica (OPAC) aislada, en donde dicha celula se obtiene a partir de corion, y es adherente a plastico de cultivo de tejidos, y en donde dicha celula es negativa para CD200 o es CD200tenue y positiva para CD105.
11. La celula aislada del item 9 que es SSEA3+ o SSEA4+.
12. La celula aislada del item 9 que es SSEA3+ y SSEA4+.
5
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30
35
40
45
50
13. La celula aislada del ttem 9, en donde dicha celula produce osteoprotegerina.
14. La celula aislada del item 9, en donde dicha celula es adicionalmente negativa para expresion de actina de musculo liso-a, negativa para expresion de RANKL, positiva para expresion de NG2, positiva para expresion de osteoprotegerina, o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible.
15. La celula aislada del item 13, en donde dicha celula es adicionalmente negativa para expresion de actina de musculo liso-a, negativa para expresion de RANKL, positiva para expresion de NG2, positiva para expresion de osteoprotegerina, o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible.
16. La celula aislada del item 9, en donde dicha celula:
expresa uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que una celula madre placentaria adherente CD200+, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BMp6, CDH11, COL10A1, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A3, COL5A1, CSF3, CTSK, IGF1R, MINPP1, MMP2, MMP9, MSX1, SMAD1, SMAD3, TGFB3, TGFBR1 y VEGFB, en donde dicha OPAC y dicha celula madre placentaria adherente CD200+se han sometido a un numero equivalente de pases;
expresa uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que una celula madre mesenquimal derivadas de medula osea, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BMP4, BMP6, CD36, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, CSF2, CTSK, FGF2, FC3FR1, FLT1, ITGA1, MINPP1, MMP9, MSX1, PDGFA, SERPINH1, TGFB3 and TGFBR1, en donde dichas OPAC y dicha celila madre mesenquimal han experimentado un numero equivalentes de pases; y/o
expresa uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que una celula fibroblasto, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BMP4, BMP6, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, FLT1, IGF1R, ITGA1, MINPP1, PDGFA,SERPINH1, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TNF, TUFT1, VCAM1 y VEGFA, en donde dicha celula fibroblasto ha experimentado un numero de pases en cultivo que es equivalente al numero de pases que ha experimentado dicha celula fibroblasto.
17. La celula aislada del item 9, en donde dicha celula secreta una o mas de las protemas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, Protema de union a TGF-beta latente 1 (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 o TIMP-2.
18. La celula aislada del item 16, en donde dicha celula secreta las protemas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBF-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, Protema de union a TGF-beta latente 1 (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF- beta R1/ALK5 y TIMP-2.
19. Una poblacion aislada de celulas que comprende las celulas del item 9.
20. La poblacion aislada de celulas del item 9, en donde dicha celulas:
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes CD200+, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de BMP3 (protema morfogenica osea 3), CDH11, COL10A1, COL14A1, COL15A1, DMP1 (fosfoprotema acida de la matriz de dentina 1), DSPP (sialofosfoprotema de dentina), ENAM (enamelina), FGFR2 (receptor 2 de factor de crecimiento de fibroblastos), MMP10 (metaloproteasa 10 de la matriz (estromelisina 2)), tGfB3, y/o TGFBR1, cuando dichas OPACs y dichas celulas madre placentarias CD200+ se cultivan en medio de crecimiento, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes CD200+, en donde dicho gen o genes comprenden uno o mas de AMBN (ameloblastina (protema de la matriz del esmalte)), BMP2 (protema morfogenica osea 2), CALCR (receptor de calcitonina), CDH11, COL11A1, COL14A1, COL15A1, COL2A1, CSF2, CSF3, DMP1, DSPP, ENAM, FGF3, GDF10 (factor 10 de diferenciacion del crecimiento), IGF1 (factor 1 de crecimiento similar a insulina), ITGA1 (integrina, alfa 1 (CD49)), ITGA2 (integrina, alfa 2 (CD49B)), MMP10, MMP8 (metaloproteasa 8 de la matriz (colagenasa de neutrofilos)), MMP9, PDGFA (factor A de crecimiento derivado de plaquetas), SMAD1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 (receptor 2 del factor beta de crecimiento transformante) cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en medio osteogenico, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes que no son trofoblastos o citotrofoblastos, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas, o todos, de CDH11, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1 independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogenico, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente lower level que un numero equivalente de celulas madre placentarias adherentes CD200+ que no son trofoblastos o citotrofoblastos, en donde dicho uno o mas genes
5
10
15
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35
40
45
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55
comprenden uno o mas, o todos, de AHSG (alfa-2-HS-glicoprotema), ALPL (fosfatasa alcalina hugado/hueso/rinon), EGF (factor de crecimiento epidermico), FLT1 (tirosina quinasa 1 relacionada con fms (receptor de factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular)), IGF2, ITGA2, ITGAM (integrin, alfa M (subunidad del receptor 3 del componente 3 del complemento)), SCARB1 (miembro 1 de la clase B de receptor depurador), SOX9 (SRY (region determinante del sexo Y)-caja 9), TNF, TWIST1 (homologo 1 de Twist; anteriormente blefarofimosis, epicanthus inversus y ptosis 3, acrocefalosindactilia 3), VCAM1 (molecula 1 de adhesion celular vascular) y/o VDR (receptor de vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3)) cuando dichas OPAC y dichas celulas madre plancetarias se cultivan en medio de crecimiento, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente menor que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+ adherentes que no son trofoblastos o citotrofoblastos, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas, o todos, de bGn (biglicano), COL11A1, COMP (protema de la matriz oligomerica del cartflago), FGF1 y/o VCAM1 cuando dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en medio osteogenico, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan VCAM1 a un nivel notoriamente menor que un numero equivalente de celulas madre placentarias CD200+ adherentes que no son trofoblastos o citotrofoblastos, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogenico, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas altop que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas, o todos, de BMP4, CALCR, CD36, CDH11, COL12A1, COL14A1, COL15A1, COL3A1, COL5A1, DMP1, DSPP, FLT1, MSX1, PDGFA, TGFB3, TGFBR1 y/o TUFT1 (Tuftelina 1), cuando las OPAC y las celulas madre se cultivan en medio de crecimiento, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas altop que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas, o todos, de AMBN, CALCR, COL14A1, COL15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1, ITGA2, MMP10, MMP9, MSX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando las OPAC y las celulas madre se cultivan en medio osteogenico, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas altop que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas, o todos, de CALCR, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3 y/o TGFBR1 independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogenico como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente menor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas, o todos, de ALPL, BGLAP (bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein), IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1 y/o SOX1, when the OPACs and mesenchymal stem cells are cultured in growth medium, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real;
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente menor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas, o todos, de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, BMP3, BMP5, CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, COL2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR2, IGF2, MMP8, PHEX (homologo de endopeptidasa que regula el fosfato, X-unido), RUNX2 (factor 2 de transcripcion relacionado con Runt), SCARB1, SOX1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando las OPAC y las celulas madre se cultivan en medio osteogenico, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real; or
expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente menor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas, o todos, de ALPL, BGLAP, IGF2, SCARB1 y/o SOX9, independientemente de si dichas OPAC y dichas celulas madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogenico, como se estima por los valores Ct de la PCR cuantitativa en tiempo real.
21. La poblacion aislada de celulas del item 18, donde las celulas en dicha poblacion de celulas expresan una o mas de las protemas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, Protema de union a TGF-beta latente I (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 o TIMP-2,
22. La poblacion aislada de celulas del item 18, donde las celulas en dicha poblacion de celulas expresan las protemas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, Protema de union a TGF-beta latente 1 (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 y TIMP-2.
23. La poblacion aislada de celulas del ttem 18, en donde al menos 50% de las celulas de dicha poblacion son las celulas del item 9.
24. La poblacion aislada de celulas del item 18, en donde al menos 80% de las celulas de dicha poblacion son las celulas del item 9,
5 25. La poblacion aislada de celulas del item 18, en donde al menos 95% de las celulas de dicha poblacion son las
celulas del item 9.
26. La poblacion aislada de celulas del item 18 que consiste esencialmente en las celulas del item 9.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso en un metodo de tratamiento de defectos oseos en un sujeto por administracion de dichas celulas a dicho sujeto, en donde dichas celulas se obtienen a partir de corion, y son adherentes a plastico de cultivo de tejidos, y en donde dichas celulas son negativas para CD2O0 o son CD200tenue, y positivas para CD105.
  2. 2. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dichas celulas son SSEA3+ o SSEA4+, o en donde dichas celulas son SSEA3+y SSEA4+.
  3. 3. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso segun la reivindicacion 1, en donde dichas celulas:
    expesan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas demedula osea, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas de BMP4, BMP6, CD36, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, CSF2, CTSK, FGF2, FGFR1, FLT1, ITGA1, MINPP1, MMP9, MSX1, PDGFA, SERPINH1, TGFB3 y TGFBR1, en donde dichas celulas y dichas celulas madre mesenquimales han experimentado un numero equivalente de pases; o
    expesan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas alto que un numero equivalente de celulas fibroblastos, en donde dicho uno o mas genes comprenden uno o mas de BMP4, BMP6, CDH11, COL14A1, COL15A1, COL1A1, COL3A1, COL5A1, FLT1, IGF1R, ITGA1, MINPP1, PDGFA, SERPINH1, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TNF, TUFT1, VCAM1 y VEGFA, y en donde dichas celulas y dichas celulas fibroblastos han experimentado un numero equivalente de pases.
  4. 4. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacionl, en donde dichas celulas:
    secretan una o mas de las protemas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, protema 1 de union a TGF-beta latente (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 o TIMP-2; o
    secretan las protemas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, protema 1 de union a TGF-beta latente (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 y TIMP-2.
  5. 5. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho defecto oseo es una lesion osteolftica asociada a un cancer.
  6. 6. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho defecto oseo es una fractura osea.
  7. 7. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho defecto oseo es una columna vertebral que necesita fusion.
  8. 8. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho defecto oseo es una fractura no consolidada.
  9. 9. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho defecto oseo es osteoporosis.
  10. 10. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dichas celulas estan formuladas como una composicion implantable.
  11. 11. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde dicha composicion implantable comprende una matriz.
  12. 12. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en dopnde dicha matriz comprende colageno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina, vitronectina o hidroxiapatita.
  13. 13. Las celulas adherentes placentarias osteogenicas aisladas para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dichas celulas estan formuladas como una composicion inyectable.
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