ES2578478T3 - Coformulación estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y métodos de uso de la misma - Google Patents

Coformulación estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y métodos de uso de la misma Download PDF

Info

Publication number
ES2578478T3
ES2578478T3 ES10760140.3T ES10760140T ES2578478T3 ES 2578478 T3 ES2578478 T3 ES 2578478T3 ES 10760140 T ES10760140 T ES 10760140T ES 2578478 T3 ES2578478 T3 ES 2578478T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
stable
formulation
liquid
hyaluronidase
immunoglobulin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10760140.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Wolfgang Teschner
Sonja Svatos
Leopold Bruckschwaiger
Alfred Weber
Hans-Peter Schwarz
Laura Lei
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxalta GmbH
Baxalta Inc
Original Assignee
Baxalta GmbH
Baxalta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxalta GmbH, Baxalta Inc filed Critical Baxalta GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2578478T3 publication Critical patent/ES2578478T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays or needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Composición estable formulada para administración subcutánea, en la que: la composición estable es una coformulación líquida; la composición tiene un pH de entre 4 y 5, incluidos; y la composición comprende: inmunoglobulina (IG) a una concentración que es de al menos el 10% p/v; una hialuronidasa soluble a una concentración que es de al menos 50 U/ml y está presente en una cantidad suficiente para permitir la administración subcutánea de la composición en un único sitio de inyección a una velocidad de infusión igual a o mayor que la velocidad de infusión intravenosa para inmunoglobulina intravenosa; y una sal de cloruro de metal alcalino a una concentración de al menos 0,05 M, mediante lo cual la coformulación es estable a temperaturas de hasta 32ºC durante al menos 6 meses.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Coformulación estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y métodos de uso de la misma Campo de la invención
Se proporcionan en el presente documento coformulaciones estables de inmunoglobulina y hialuronidasa que son estables frente al almacenamiento en forma líquida a temperatura ambiente durante al menos 6 meses y a temperaturas de nevera convencionales durante 1-2 años. Tales coformulaciones pueden usarse en métodos de tratamiento de enfermedades o estados que pueden tratarse con IG mediante administración subcutánea.
Antecedentes
Los productos de inmunoglobulina (IG) a partir de plasma humano se usaron por primera vez en 1952 para tratar la inmunodeficiencia. Inicialmente, administraciones intramusculares o subcutáneas de IG fueron los métodos de elección. Sin embargo, para inyectar mayores cantidades de IG necesarias para el tratamiento eficaz de diversas enfermedades, se desarrollaron productos administrables por vía intravenosa con IG de concentración inferior (50 mg/ml). La administración intravenosa (i.v.) de inmunoglobulina (IGIV) es el tratamiento primario de individuos con inmunodeficiencias. Aunque las preparaciones de IGIV iniciales provocaban efectos secundarios graves, las preparaciones de IGIV disponibles en la actualidad se toleran bien en la mayoría de los pacientes inmunodeficientes. No obstante, una pequeña proporción de pacientes sigue teniendo reacciones desagradables, incluso incapacitantes, tales como cefalea, fatiga y mialgia. La fiebre y los escalofríos siguen siendo un problema, especialmente cuando los pacientes tienen infecciones intercurrentes. Las reacciones persisten a menudo a pesar de probar otras preparaciones de IGIV o premedicar con paracetamol, difenhidramina y corticosteroides. Además, debido al requisito de la administración i.v., hay problemas con el cumplimiento de los pacientes.
La administración subcutánea (s.c.) de inmunoglobulina es una alternativa a la administración intravenosa. En comparación con infusiones i.v., la administración s.c. de inmunoglobulina tiene varias ventajas. Por ejemplo, reduce la incidencia de reacciones sistémicas, no requiere el acceso i.v. algunas veces difícil, mejora los niveles valle y proporciona a los pacientes más independencia.
Para el uso terapéutico de cualquier preparación de IG, otra consideración importante en los productos de IG es su estabilidad durante el almacenamiento. La manipulación y administración seguras de formulaciones que contienen proteínas representan desafíos significativos para los formuladores farmacéuticos. Las proteínas tienen propiedades físicas y químicas únicas que presentan problemas de estabilidad: existen una variedad de rutas de degradación para las proteínas, lo que implica inestabilidad tanto química como física. La inestabilidad química incluye desaminación, agregación, corte de la estructura principal peptídica y oxidación de residuos de metionina. La inestabilidad física engloba muchos fenómenos, incluyendo, por ejemplo, agregación. Por tanto, hay una necesidad de formulaciones estables de preparaciones de inmunoglobulina.
Sumario
Se proporcionan en el presente documento composiciones, métodos y kits para la administración subcutánea de coformulaciones líquidas, estables para tratar enfermedades y estados que pueden tratarse con IG. Se proporcionan composiciones de coformulaciones líquidas, estables formuladas para administración subcutánea, que contienen inmunoglobulina (IG) a una concentración que es de al menos el 10% p/v, una hialuronidasa soluble a una concentración que es de al menos 50 U/ml y está presente a una razón de al menos 100 unidades/gramo (U/g) de IG, NaCI a una concentración de al menos 50 mM y un pH de entre 4 y 5. La coformulación es estable a 28°C-32°C durante al menos 6 meses.
Además, puede estar presente un estabilizador de aminoácido, por ejemplo, alanina, histidina, arginina, Usina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina o prolina. En algunos ejemplos, el aminoácido está presente en una cantidad que es de al menos 100 mM. En un ejemplo, el aminoácido es glicina y está presente en una cantidad que es o es de al menos 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM o más. En otro ejemplo, la glicina está en una cantidad que es de 250 mM.
Las coformulaciones líquidas, estables proporcionadas en el presente documento contienen IG a al menos el 10% al 22%, por ejemplo el 10% p/v, el 11% p/v, el 12% p/v, el 13% p/v, el 14% p/v, el 15% p/v, el 16% p/v, el 17% p/v, el 18% p/v, el 19% p/v, el 20% p/v, el 21% p/v, el 22% p/v o más. En algunos ejemplos, la IG es el 10% p/v o el 20% p/v. La IG usada en las coformulaciones es de plasma humano, por ejemplo, puede purificarse a partir de plasma humano tal como mediante fraccionamiento con alcohol. En algunos ejemplos, la IG se purifica adicionalmente mediante una cualquiera o más de una modificación química, incubación a pH 4,0 con o sin pepsina, precipitación con polietilenglicol (PEG), cromatografía de intercambio iónico, escisión enzimática, tratamiento con dlsolvente/detergente, diafiltración o ultrafiItración. Las coformulaciones proporcionadas en el presente documento pueden emplear IG que contiene IgG, IgA e IgM. En algunos ejemplos, la IG contiene más del 95% de IgG.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Además, las coformulaciones pueden contener NaCI. En algunos ejemplos, el NaCI está a una concentración de 50 mM a 220 mM, por ejemplo, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 210 mM, 220 mM o más. En un ejemplo, el NaCI está a una concentración de 150 mM.
Las coformulaciones proporcionadas en el presente documento contienen una hlaluronidasa soluble que puede ser PH20, o una forma truncada de la misma. Por ejemplo, la hialuronidasa soluble puede ser una PH20 ovina, bovina o humana truncada. En algunos ejemplos cuando la PH20 es una PH20 humana truncada, la PH20 humana truncada puede seleccionarse de entre polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 4-9, o variantes alélicas u otras variantes de las mismas. En un ejemplo, la hialuronidasa soluble es rHuPH20.
Además, la hialuronidasa soluble puede estar a una concentración que es de 50 U/ml a 500 U/ml, por ejemplo 50 U/ml, 100 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ mi o más. Por ejemplo, la hialuronidasa soluble puede estar a una concentración que es de 100 U/ml o 300 U/ml. En las coformulaciones proporcionadas en el presente documento, la hialuronidasa soluble puede estar presente a una razón de 100 U/g de IG a 5000 U/g de IG, por ejemplo, 100 U/g de IG, 150 U/g de IG, 200 U/g de IG, 250 U/g de IG, 300 U/g de IG, 400 U/g de IG, 500 U/g de IG, 600 U/g de IG, 700 U/g de IG, 800 U/g de IG, 900 U/g de IG, 1000 U/g de IG, 1200 U/g de IG, 1500 U/g de IG, 1800 U/g de IG, 2000 U/g de IG, 3000 U/g de IG, 4000 U/g de IG, 5000 U/g de IG o más. En algunos ejemplos la hialuronidasa soluble está a una razón de 500 U/g de IG, 1000 U/g de IG, 1500 U/g de IG o 3000 U/g de IG. El pH de las coformulaciones puede ser de 4,4 a 4,9 en forma concentrada.
Las coformulaciones proporcionadas en el presente documento pueden formularse para administración de dosificación múltiple o administración de dosificación Individual. Además, en ejemplos en los que la coformulación es para administración de dosificación individual, la IG está en una cantidad suficiente para tratar una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG. La IG puede administrarse diariamente, semanalmente, bisemanalmente, cada 2- 3 semanas, cada 3-4 semanas o mensualmente para el tratamiento de una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG. La administración de la coformulación se efectúa de manera que la cantidad de IG administrada es sustancialmente igual que la cantidad en una administración de dosificación individual cuando se administra por via intravenosa para el tratamiento de una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG. En algunos ejemplos la cantidad de IG en la coformulación puede ser de aproximadamente 1 gramo (g) a 200 g, por ejemplo, 1 gramo (g), 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g o 200 g. Además, la cantidad de hialuronidasa en la composición puede ser de aproximadamente 500 unidades a 100.000 unidades, por ejemplo, 500 unidades, 1000 unidades, 2000 unidades, 5000 unidades, 10.000 unidades, 30.000 unidades, 40.000 unidades, 50.000 unidades, 60.000 unidades, 70.000 unidades, 80.000 unidades, 90.000 unidades, 100.000 unidades o más.
Las coformulaciones líquidas proporcionadas en el presente documento son estables a 28°C-32°C durante de al menos 6 meses a un año, por ejemplo, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses o más. Las coformulaciones líquidas son estables adicionalmente a 0°C-10°C durante de al menos 6 meses a 2 años, por ejemplo, 6 meses, 1 año, 2 años o más.
También se proporciona en el presente documento un kit que contiene cualquiera de las coformulaciones líquidas, estables proporcionadas en el presente documento, y opcionalmente instrucciones para su uso.
Se proporcionan en el presente documento recipientes que contienen las coformulaciones líquidas, estables proporcionadas en el presente documento. El recipiente puede ser un tubo, una botella, un vial o una jeringa. En ejemplos en los que el recipiente es una jeringa, el recipiente comprende además una aguja para inyección. Por tanto, los recipientes proporcionados en el presente documento contienen las coformulaciones líquidas, estables para administración de dosificación individual o administración de dosificación múltiple.
Se proporcionan en el presente documento métodos de tratamiento de enfermedades o estados que pueden tratarse con IG, mediante administración subcutánea a un sujeto de una coformulación líquida, estable que contiene una hialuronidasa soluble e IG. La coformulación se administra de manera que la cantidad de IG administrada es sustancialmente igual que la cantidad cuando se administra por vía intravenosa para el tratamiento de una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG.
Además, los métodos proporcionados en el presente documento son para tratar una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG, seleccionado de entre enfermedades de inmunodeficiencia primaria, enfermedades de inmunodeficiencia secundaria, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias e infecciones agudas.
En algunos ejemplos, las coformulaciones pueden administrarse usando los métodos proporcionados en el presente documento para tratar una enfermedad de inmunodeficiencia primaria. La enfermedad de inmunodeficiencia primaria puede ser inmunodeficiencia variable común (CVID), deficiencia de IgA selectiva, deficiencia de subclases de IgG, deficiencia de anticuerpos específicos, trastornos del complemento, agammaglobulinemia congénita, ataxia telangiectasia, hiper-lgM, síndrome de Wiskott-Aldrich, inmunodeficiencia combinada grave (SCID), hipogammaglobulinemia primaria, enfermedades de inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA) o hipogammaglobulinemia de la infancia.
En otros ejemplos, la enfermedad o el estado que puede tratarse con IG es una enfermedad de inmunodeficiencia adquirida secundaria a tumores malignos hematológicos. El tumor maligno hematológico puede seleccionarse de entre leucemia llnfocítica crónica (CLL), mieloma múltiple (MM) y linfoma no Hodgkln (NHL).
En casos en los que la enfermedad o el estado que puede tratarse con IG es una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria, la enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria puede seleccionarse de entre enfermedad de Kawasaki, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, polimiositis, dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, neuropatía motora multifocal, miastenia grave y síndrome de Moersch-Woltman.
En algunos ejemplos la coformulación se administra para tratar una infección bacteriana, viral o fúngica aguda, tal como, por ejemplo, Haemophilus influenzae de tipo B; Pseudomonas aeruginosa de tipos A y B; Staphylococcus aureus; estreptococos del grupo B; Streptococcus pneumoniae de tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 y 23; adenovirus de tipos 2 y 5; citomegalovirus; virus de Epstein-Barr VCA; virus de la hepatitis A; virus de la hepatitis B; virus del herpes simple 1; virus del herpes simple 2; influenza A; sarampión; parainfluenza de tipos 1, 2 y 3; polio; virus de la varicela zóster; Aspergillus; y Candida albicans.
Además, la enfermedad o el estado que puede tratarse con IG puede seleccionarse de entre inmunodeficiencia iatrogénica; encefalomielitis diseminada aguda; vasculitis necrotizante sistémica positiva para ANCA; anemia hemolítica autoinmunitaria; penfigoide ampolloso; penfigoide cicatricial; síndrome de Evans (incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria con trombocitopenia inmunitaria); trombocitopenia aloinmunitaria feto-materna/neonatal (FMAIT/NAIT); síndrome hemofagocítico; trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas de alto riesgo; neuropatía paraproteinémica de IgM; trasplante de riñón; esclerosis múltiple; ataxia mioclónica opsoclónica; pénfigo foliáceo; pénfigo vulgar; púrpura tras transfusión; necrólisis epidérmica tóxica/Síndrome de Steven Johnson (DIEZ/SJS); síndrome de choque tóxico; enfermedad de Alzheimer; lupus eritematoso sistémico; mieloma múltiple; septicemia; tumores de células B; degeneración cerebelosa paraneoplásica sin anticuerpos; y trasplante de médula ósea.
Descripción detallada
Visión general
A. Definiciones
B. Coformulaciones estables de inmunoglobulina (IG) y hialuronidasa
1. Terapia con ¡nmunoglobulinas
2. Administración subcutánea de formulaciones de inmunoglobulina y hialuronidasa
3. Coformulaciones estables
C. Inmunoglobulina y preparación de inmunoglobulina
1. Preparación y purificación
a. Método de Cohn-Oncley
b. Procedimientos de Cohn-Oncley modificados
c. Procesamiento viral
d. Concentración de proteínas
e. Preparaciones de IG a modo de ejemplo
i. IG al 10%
ii. Preparaciones de IG de alta concentración (por ejemplo IG al 20%)
2. Estabilidad en almacenamiento
a. Excipientes de estabilización de proteínas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
b. pH
D. Hialuronidasa
1. PH20
2. Hialuronidasa soluble
a. PH20 humana soluble
b. PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20)
3. Gllcosllaclón
4. Modificación de hialuronidasas para mejorar sus propiedades farmacocinéticas
E. Métodos de producción de ácidos nucleicos que codifican para una hialuronidasa soluble y polipéptidos de la misma
1. Vectores y células
2. Expresión
a. Células procariotas
b. Células de levadura
c. Células de insecto
d. Células de mamífero
e. Plantas
3. Técnicas de purificación
F. Preparación, formulación y administración de inmunoglobulinas y polipéptidos de hialuronidasa solubles
1. Formulaciones y dosificaciones
a. Inmunoglobulina
b. Hialuronidasa
c. Cloruro de sodio
d. Estabilizador de aminoácido
e. Otros agentes
2. Formas de dosificación
3. Administración
G. Métodos de evaluación de la actividad, estabilidad, biodisponibilidad y farmacocinética
1. Tamaño molecular
2. Actividad biológica
a. Inmunoglobulina
b. Hialuronidasa
1. Farmacocinética y tolerabilidad
H. Métodos de tratamiento y usos terapéuticos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
1. Inmunodeficiencia primaria y secundaria
a. Inmunodeficiencia primaria
b. Inmunodeficiencia secundaria
2. Enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias
a. Enfermedad de Kawasaki
b. Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica
c. Síndrome de Guillain-Barre
d. Púrpura trombocitopénica idiopática
e. Miopatías inflamatorias
i. Dermatomiositis
ii. Polimiositis
iii. Miositis por cuerpos de inclusión
f. Síndrome miasténico de Lambert-Eaton
g. Neuropatía motora multifocal
h. Miastenia grave
i. Síndrome de Moersch-Woltmann
3. Infecciones agudas
4. Otras enfermedades y estados
I. Artículos de fabricación y kits
J. Ejemplos
A. DEFINICIONES
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la(s) invención/invenciones. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias de Genbank, bases de datos, sitios web y otros materiales publicados a los que se hace referencia a lo largo de toda la divulgación en el presente documento, a menos que se Indique otra cosa, se incorporan como referencia en su totalidad. En el caso en el que haya una pluralidad de definiciones para términos en el presente documento, prevalecen las de esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección de este tipo, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y la Información particular en Internet puede Ir y venir, pero puede encontrarse información equivalente buscando en Internet. La referencia a la misma demuestra la disponibilidad y diseminación pública de tal información.
Tal como se usa en el presente documento, “¡nmunoglobulina,” “globulina ¡nmunltaria”, “gammaglobulina” se refieren a preparaciones de proteínas plasmáticas derivadas del plasma reunido de donantes adultos. Predominan anticuerpos IgG; están presentes otras subclases de anticuerpos, tales como IgA e IgM. La ¡nmunoglobulina terapéutica puede proporcionar inmunización pasiva aumentando los niveles en suero de anticuerpos circulantes. Los anticuerpos IgG, por ejemplo, pueden unirse a y neutralizar toxinas bacterianas; opsonizar patógenos; activar el complemento; y suprimir citocinas patógenas y fagocitos a través de la interacción con citocinas y receptores de las mismas, tales como CD5, interleucina-1a (IL-1 a), interleucina 6 (IL-6), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa) y receptores de células T. La ¡nmunoglobulina terapéutica puede inhibir la actividad de autoanticuerpos. Las preparaciones de ¡nmunoglobulina también incluyen, pero no se limitan a, ¡nmunoglobulina intravenosa (IGIV), ¡nmunoglobulina i.v., ¡nmunoglobulina terapéutica. Se conocen bien preparaciones de ¡nmunoglobulina, e incluyen nombres comerciales, tales como BayGam® Gamimune® N, Gammagard® S/D, Gammar-P, Iveegam® EN, Panglobulin®, Polygam® S/D, Sandoglobulln®, Venoglobulin®-!, Venoglobulin®-S, WlnRho® SDF y otros. Las
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
preparaciones de inmunoglobulina pueden derivarse de plasma humano, o se producen de manera recombinante.
Tal como se usa en el presente documento, tratamiento de “IgG intravenosa” o “IGIV” se refiere generalmente a un método terapéutico de administración por vía intravenosa de una composición de inmunoglobulinas IgG a un paciente para tratar varios estados tales como ¡nmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias. Las inmunoglobulinas IgG se reúnen y preparan normalmente a partir de plasma. Pueden usarse anticuerpos completos o fragmentos.
Tal como se usa en el presente documento, enfermedades o estados que pueden tratarse con IG se refieren a cualquier enfermedad o estado para el que se usan preparaciones de inmunoglobulina. Tales enfermedades y estados, incluyen, pero no se limitan a, cualquier enfermedad en la que un aumento en anticuerpos circulantes es paliativo, tal como, por ejemplo, ¡nmunodeflclencla; hlpogammaglobulinemia adquirida secundaria a tumores malignos hematológicos; enfermedad de Kawasakl; pollneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP); síndrome de Gulllaln-Barre; púrpura trombocltopénlca ¡dlopática; miopatías inflamatorias; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; neuropatía motora multlfocal; mlastenia grave; síndrome de Moersch-Woltmann; hlpogammaglobulinemia secundaria (Incluyendo ¡nmunodeficiencia iatrogénica); deficiencia de anticuerpos específicos; encefalomielitis diseminada aguda; vasculltls necrotizante sistémica positiva para ANCA; anemia hemolítlca autolnmunltaria; penfigoide ampolloso; penflgolde cicatricial; síndrome de Evans (incluyendo anemia hemolítlca autolnmunltaria con trombocltopenla ¡nmunltarla); trombocitopenia aloinmunitaria feto-materna/neonatal (FMAIT/NAIT); síndrome hemofagocítico; trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas de alto riesgo; neuropatía paraprotelnémica de IgM; trasplante de riñón; esclerosis múltiple; ataxia mioclónica opsoclónica; pénfigo foliáceo; pénfigo vulgar; púrpura tras transfusión; necrólisis epidérmica tóxica/síndrome de Steven Johnson (DIEZ/SJS); síndrome de choque tóxico; enfermedad de Alzheimer; lupus eritematoso sistémico; mieloma múltiple; septicemia; tumores de células B; traumatismo; y una Infección bacteriana, viral o fúngica.
Tal como se usa en el presente documento, temperatura ambiente se refiere a un intervalo generalmente de desde aproximadamente o a 18°C hasta aproximadamente o a 32°C. Los expertos en la técnica aprecian que la temperatura ambiente varía según la ubicación y las condiciones prevalentes. Por ejemplo, las temperaturas ambiente pueden ser superiores en climas más cálidos tales como Italia o Texas.
Tal como se usa en el presente documento, “estable” o “estabilidad” con referencia a una coformulación proporcionada en el presente documento se refiere a una en la que la(s) proteína(s) (IG y hialuronidasa) en la misma conservan esencialmente su integridad y estabilidad física y química tras el almacenamiento durante al menos seis meses a temperaturas de hasta 32°C. Para los fines en el presente documento, “estabilidad a temperatura ambiente” significa estabilidad en el intervalo superior de temperaturas ambiente típicas para lugares más cálidos (es decir 28- 32°C para Italia o Texas). Las formulaciones son estables a lo largo del intervalo de temperaturas ambiente y refrigeradas, es decir, 0 - 32°C, o hasta 32°C durante al menos seis meses. Cada una de las IG y hialuronidasa presenta estabilidad en la coformulación tras el almacenamiento durante al menos seis meses a temperatura ambiente, incluyendo temperaturas hasta o aproximadamente 32°C. Un experto en la técnica conoce bien ensayos para evaluar la estabilidad de cada una y se describen en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, estabilidad de IG significa que la IG no se agrega, desnaturaliza o fragmenta sustanclalmente de manera que al menos el 90% de la IG está presente como monómeros u oligo- /dímeros, con un peso molecular de IG de entre o aproximadamente mayor de 70 kDa y menos de < 450 kDa. Por tanto, menos de aproximadamente el 10%, por ejemplo, menos de aproximadamente el 5%, menos de aproximadamente el 4%, menos de aproximadamente el 3%, menos de aproximadamente el 2%, menos de aproximadamente el 1% de la proteína IG está presente como agregado (es decir tiene un tamaño molecular mayor de o Igual a 450 kDa de tamaño) en la formulación. De manera similar, no más del 5% al 7%, por ejemplo, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1% o el 0,5% o menos de la IG en la coformulación está fragmentada (es decir, tiene un tamaño molecular menor de 70 kDa).
Tal como se usa en el presente documento, estabilidad de la hialuronidasa significa que conserva al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o más de la actividad hialuronidasa original antes del almacenamiento. Un experto en la técnica conoce ensayos para evaluar la actividad hialuronidasa y se describen en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, “almacenamiento” significa que una formulación no se administra inmediatamente a un sujeto una vez preparada, sino que se mantiene durante un periodo de tiempo en condiciones particulares (por ejemplo temperatura particular; forma líquida o liofilizada) antes de su uso. Por ejemplo, una formulación líquida puede mantenerse durante días, semanas, meses o años, generalmente al menos seis meses, antes de su administración a un sujeto a temperaturas variadas tales como refrigerada (de 0o a 10°C) o temperatura ambiente (por ejemplo temperatura hasta 32°C).
Tal como se usa en el presente documento, régimen de dosificación se refiere a la cantidad de Inmunoglobulina administrada y la frecuencia de administración. El régimen de dosificación es una función de la enfermedad o el estado que va a tratarse, y por tanto puede variar.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tal como se usa en el presente documento, “sustancialmente igual que un régimen de dosificación de IG intravenosa (IGIV)” se refiere a un régimen en el que la dosis y/o frecuencia está dentro de una cantidad que es eficaz para tratar una enfermedad o un estado particular, normalmente es de aproximadamente el o del 10%, de la dosis o frecuencia i.v. Las cantidades de IGIV que son eficaces para tratar una enfermedad o un estado particular se conocen o pueden determinarse empíricamente por un experto en la técnica. Por ejemplo, tal como se ejemplifica más adelante, de 300 mg/kg (es decir 21 gramos suponiendo que el adulto promedio pesa 70 kg) a 600 mg/kg (es decir 42 gramos) es la dosis mensual típica de IGIV administrada a pacientes que tienen enfermedades de inmunodeficiencia primaria. Por tanto, IG, cuando se administra en combinación con hialuronidasa, se administra por vía subcutánea a dosis que son o son aproximadamente de 300 mg/kg a 600 mg/kg para el tratamiento de enfermedades de inmunodeficiencia primaria.
Tal como se usa en el presente documento, frecuencia de administración se refiere al tiempo entre dosis sucesivas de inmunoglobulina. Por ejemplo, la frecuencia puede ser una, dos, tres, cuatro semanas, y es una función de la enfermedad o el estado particular tratado. Generalmente, la frecuencia es de al menos cada dos o tres semanas, y normalmente no más de una vez al mes.
Tal como se usa en el presente documento, hialuronidasa se refiere a una enzima que degrada ácido hialurónico. Las hialuronidasas incluyen hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36), y hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35). Las hialuronidasas también incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero sin limitarse a, murina, canina, felina, leporina, aviar, bovina, ovina, porcina, equina, de peces, de ranas, bacteriana, y cualquier forma de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas no humanas a modo de ejemplo incluyen hialuronidasas de vacas (SEQ ID NO: 10 y 11), avispa de chaqueta amarilla (SEQ ID NO: 12 y 13), abeja melífera (SEQ ID NO: 14), avispón de cara blanca (SEQ ID NO: 15), avispa del papel (SEQ ID NO: 16), ratón (SEQ ID NO: 17-19, 32), cerdo (SEQ ID NO: 20-21), rata (SEQ ID NO: 22-24, 31), conejo (SEQ ID NO: 25), oveja (SEQ ID NO: 26 y 27), orangután (SEQ ID NO: 28), mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), cobaya (SEQ ID NO: 30), Staphylococcus aureus (SEQ ID NO: 33), Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 34) y Clostrídium perfringens (SEQ ID NO: 35). Las hialuronidasas también incluyen las de origen humano. Las hialuronidasas humanas a modo de ejemplo incluyen HYAL1 (SEQ ID NO: 36), HYAL2 (SEQ ID NO: 37), HYAL3 (SEQ ID NO: 38), HYAL4 (SEQ ID NO: 39) y PH20 (SEQ ID NO: 1). También se incluyen entre las hialuronidasas solubles, Incluyendo, PH20 ovina y bovina, PH20 humana soluble y rHuPH20 soluble.
La referencia a hialuronidasas incluye polipéptidos de hialuronidasa precursores y polipéptidos de hialuronidasa maduros (tal como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad, e Incluyen variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más con los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NO: 1 y 10-39, o la forma madura de los mismos. Por ejemplo, la referencia a hialuronidasa también incluye las variantes de polipéptidos precursores de PH20 humana expuestas en SEQ ID NO: 50-51. Las hialuronidasas también incluyen las que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y las que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, pegilación, albuminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, una hialuronidasa soluble se refiere a un polipéptido caracterizado por su solubilidad en condiciones fisiológicas. Generalmente, una hialuronidasa soluble carece de toda o una parte del anclaje de gllcofosfatidilo (GPI), o por lo demás no se ancla suficientemente a la membrana celular. Por tanto, tras la expresión a partir de una célula, se secreta una hialuronidasa soluble al medio. Las hialuronidasas solubles pueden distinguirse, por ejemplo, por su reparto en la fase acuosa de una disolución de Tritón X-114 calentada hasta 37°C (Bordier et al., (1981) J. Blol. Chem., 256: 1604-7). Las hialuronidasas ancladas a la membrana, tales como hialuronidasas ancladas a lípidos, se repartirán en la fase rica en detergente, pero se repartirán en la fase acuosa o pobre en detergente tras el tratamiento con fosfolipasa C. Se incluyen entre las hialuronidasas solubles hialuronidasas ancladas a la membrana en las que una o más regiones asociadas con el anclaje de la hialuronidasa a la membrana se han retirado o modificado, en donde la forma soluble conserva la actividad hialuronidasa. Las hialuronidasas solubles incluyen hialuronidasas solubles recombinantes y las contenidas en o purificadas a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testículos de ovejas o vacas. A modo de ejemplo de tales hialuronidasas solubles son PH20 humanas solubles. Otras hialuronidasas solubles incluyen PH20 ovina (SEQ ID NO: 27) y bovina (SEQ ID NO: 11).
Tal como se usa en el presente documento, PH20 humana soluble o sHuPH20 incluye polipéptidos maduros que carecen de todo o una parte del sitio de unión a gllcosilfosfatidllinosltol (GPI) en el extremo C-terminal de manera que tras la expresión, los polipéptidos son solubles. Los polipéptidos de sHuPH20 a modo de ejemplo incluyen polipéptidos maduros que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 4-9 y 47-48. Los polipéptidos precursores para tales polipéptidos de sHuPH20 a modo de ejemplo incluyen una secuencia señal. A modo de ejemplo de los precursores son los expuestos en SEQ ID NO: 3 y 40-46, cada uno de los cuales contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en las posiciones de aminoácido 1-35. Los polipéptidos de HuPH20 soluble también incluyen los que degradan durante o después de los métodos de producción y purificación
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
descritos en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, PH20 humana recomblnante soluble (rHuPH20) se refiere a una forma soluble de PH20 humana que se expresa de manera recomblnante en células de ovario de hámster chino (CHO). rHuPH20 soluble está codificada por ácido nucleico que incluye la secuencia señal y se expone en SEQ ID NO: 49. También se incluyen moléculas de ADN que son variantes alélicas de la misma y otras variantes solubles. El ácido nucleico que codifica para rHuPH20 soluble se expresa en células CHO que secretan el polipéptido maduro. Tal como se produce en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en el extremo C-terminal de modo que el producto incluye una mezcla de especies que pueden incluir una cualquiera o más de SEQ ID NO: 4-9 en abundancia variable. También se incluyen vahantes alélicas y otras variantes correspondientes, incluyendo las que corresponden a los polipéptidos de PH20 humana precursores expuestos en SEQ ID NO: 50-51. Otras variantes pueden tener una identidad de secuencia del 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más con cualquiera de SEQ ID NO: 4-9 y 47-48 siempre que conserven la actividad hialuronidasa y sean solubles.
Tal como se usa en el presente documento, actividad se refiere a una actividad o actividades funcionales de un polipéptido o una parte del mismo asociado con una proteína de longitud total (completa). Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad para unirse a o competir con un polipéptido por la unión a un anticuerpo anti-polipéptido), inmunogenicidad, capacidad para formar multímeros, y la capacidad para unirse específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido.
Tal como se usa en el presente documento, actividad hialuronidasa se refiere a la capacidad de la hialuronidasa para escindir ácido hialurónico. Se conocen en la técnica ensayos in vitro para determinar la actividad hialuronidasa de hialuronidasas, tales como rHuPH20 soluble, y se describen en el presente documento. Los ensayos a modo de ejemplo incluyen el ensayo de microturbidez descrito más adelante (véase por ejemplo el ejemplo 3) que mide la escisión de ácido hialurónico por hialuronidasa indirectamente detectando el precipitado insoluble formado cuando el ácido hialurónico no escindido se une a albúmina sérica.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ultrafiltración (UF)” engloba una variedad de métodos de filtración por membrana en los que la presión hidrostática empuja un líquido contra una membrana semipermeable. Se retienen los solutos y sólidos suspendidos de alto peso molecular, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular pasan a través de la membrana. Este proceso de separación se usa a menudo para purificar y concentrar disoluciones macromoleculares (103 -10® Da), especialmente disoluciones de proteína. Están disponibles varias membranas de ultrafiltración dependiendo del tamaño de las moléculas que retienen. La ultrafiltración se caracteriza normalmente por un tamaño de poro de membrana de entre 1 y 1000 kDa y presiones de funcionamiento de entre 0,01 y 10 bar, y es particularmente útil para separar coloides como proteínas de moléculas pequeñas como azúcares y sales.
Tal como se usa en el presente documento, el término “diafiltración” se realiza con las mismas membranas que la ultrafiltración y es una filtración de flujo tangencial. Durante la diafiltración, se introduce tampón en el tanque de recirculación al tiempo que se retira el filtrado de la operación unitaria. En procesos en los que el producto está en el material retenido (por ejemplo IgG), la diafiltración extrae por lavado componentes del conjunto de productos al filtrado, intercambiando de ese modo los tampones y reduciendo la concentración de especies no deseadas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “mezclado” describe un acto de producir una distribución igual de dos o más compuestos o sustancias distintas en una disolución o suspensión mediante cualquier forma de agitación. No se requiere una distribución igual por completo de todos los componentes en una disolución o suspensión como resultado del “mezclado” tal como se usa el término en esta solicitud.
Tal como se usa en el presente documento, el término “disolvente” engloba cualquier sustancia líquida que pueda disolver o dispersar una o más otras sustancias. Un disolvente puede ser de naturaleza inorgánica, tal como agua, o pude ser un líquido orgánico, tal como etanol, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, hexano; éter de petróleo, etc. Tal como se usa en el término “tratamiento con detergente disolvente”, disolvente incida un disolvente orgánico (por ejemplo, fosfato de tri-N-butilo), que es parte de la mezcla de detergentes disolventes usada para inactivar virus con envuelta lipídica en disolución.
Tal como se usa en el presente documento, el término “detergente” se usa en esta solicitud de manera intercambiable con el término “tensioactivo” o “agente que actúa en la superficie”. Los tensioactivos son normalmente compuestos orgánicos que son anfífilos, es decir, que contienen tanto grupos hidrófobos (“colas”) como grupos hidrófilos (“cabezas”), que hacen que los tensioactivos sean solubles tanto en disolventes orgánicos como en agua. Un tensioactivo puede clasificarse por la presencia de grupos formalmente cargados en su cabeza. Un tensioactivo no iónico no tiene grupos de carga en su cabeza, mientras que un tensioactivo iónico porta una carga neta en su cabeza. Un tensioactivo zwitteriónico contiene una cabeza con dos grupos cargados de manera opuesta. Algunos ejemplos de tensioactivos comunes incluyen: aniónicos (basados en aniones sulfato, sulfonato o carboxilato): perfluorooctanoato (PFOA o PFO), perfluorooctanosulfonato (PFOS), dodecilsulfato de sodio (SDS),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
laurilsulfato de amonio, y otras sales de alquilsulfato, laureth sulfato de sodio (también conocido como lauril éter sulfato de sodio, o SLES), alquilbencenosulfonato; catiónicos (basados en cationes de amonio cuaternario): bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) también conocido como bromuro de hexadeciltrimetilamonio, y otras sales de alquiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio (CPC), amina de sebo polietoxilado (POEA), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de benzetonio (BZT); zwitteriónicos (anfóteros): dodecilbetaina; cocamidopropilbetaína; cocoamfoglicinato; no iónicos: alquilpoli(óxido de etileno), alquilfenolpoli(óxido de etileno), copolímeros de poli(óxido de etileno) y poli(óxido de propileno) (disponibles comercialmente poloxámeros o poloxaminas), poliglucósidos de alquilo, incluyendo glucósido de octilo, maltósido de decilo, alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetílico y alcohol oleílico), cocamida MEA, cocamida DEA, polisorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes de Tritón, y óxido de dodecildimetilamina.
Tal como se usa en el presente documento, los residuos de a-aminoácidos que se producen de manera natural son los residuos de los 20 a-aminoácidos encontrados en la naturaleza que se incorporan en proteínas mediante el reconocimiento específico de la molécula de ARNt cargada con su codón de ARNm relacionado en humanos.
Tal como se usa en el presente documento, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser mono o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están marcados opcionalmente, tal como con un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente o radiomarcador, se contemplan moléculas monocatenarias. Tales moléculas tienen normalmente una longitud tal que su diana es estadísticamente única o de bajo número de copias (normalmente menos de 5, generalmente menos de 3) para estudiar con sonda o cebar una biblioteca. Generalmente, una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 ó 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria a o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores pueden tener 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de longitud.
Tal como se usa en el presente documento, un péptido se refiere a un polipéptido que tiene de desde 2 hasta 40
aminoácidos de longitud.
Tal como se usa en el presente documento, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento se identifican según sus abreviaturas conocidas de tres letras o una letra (Tabla 1). Los nucleótidos que aparecen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones convencionales de una única letra usadas de manera rutinaria en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, un “aminoácido” es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para fines en el presente documento, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos que se producen de manera natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácido (es decir, aminoácidos en los que el carbono atiene una cadena lateral).
Tal como se usa en el presente documento, “residuo de aminoácido” se refiere a un aminoácido formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Se supone que los residuos de aminoácido descritos en el presente documento están en la forma isomérica “L”. Los residuos en la forma isomérica “D”, que se designan así, pueden sustituirse por cualquier residuo de L-aminoácido siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo terminal de un polipéptido. Conforme con la nomenclatura de polipéptidos convencional descrita en J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), y adoptada en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, en la tabla 1 se muestran las abreviaturas para residuos de aminoácido:
Tabla 1 - Tabla de correspondencia
SÍMBOLO
1 letra
3 letras AMINOÁCIDO
Y
Tyr Tirosina
G
Gly Glicina
F
Phe Fenilalanina
M
Met Metionina
A
Ala Alanina
S
Ser Serina
I
lie Isoleucina
L
Leu Leucina
T
Thr Treonina
V
Val Valina
P
Pro Prolina
K
Lys Lisina
H
His Histidina
5
10
15
20
25
30
35
Q
Gln Glutamina
E
Glu Ácido glutámico
Z
Glx Glu y/o Gln
W
Trp Triptófano
R
Arq Arqinina
D
Asp Ácido aspártico
N
Asn Asparaqina
B
Asx Asn y/o Asp
C
Cys Cisterna
X
Xaa Desconocido u otro
Debe indicarse que todas las secuencias de residuos de aminoácido representadas en el presente documento por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de extremo amino-terminal a carboxilo-terminal. Además, se define que la frase “residuo de aminoácido” incluye los aminoácidos enumerados en la tabla de correspondencia (tabla 1) y aminoácidos modificados y poco comunes, tales como a los que se hace referencia en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, y que se incorpora en el presente documento como referencia. Además, debe indicarse que un guión al comienzo o al final de una secuencia de residuos de aminoácido indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido, con un grupo amino-terminal tal como NH2 o con un grupo carboxilo-terminal tal como COOH.
Tal como se usa en el presente documento, “aminoácidos que se producen de manera natural” se refieren a los 20 L-aminoácidos que aparecen en polipéptidos.
Tal como se usa en el presente documento, “aminoácido no natural” se refiere a un compuesto orgánico que tiene una estructura similar a un aminoácido natural pero que se ha modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos que no se producen de manera natural incluyen por tanto, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural e incluyen, pero no se limitan a, los isoestereómeros D de aminoácidos. Se describen aminoácidos no naturales a modo de ejemplo en el presente documento y los conocen los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, una mezcla isocinética es una en la que las razones molares de aminoácidos se han ajustado basándose en sus tasas de reacción notificadas (véase, por ejemplo, Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34: 1681).
Tal como se usa en el presente documento, modificación es en referencia a una modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones y sustituciones de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Los métodos de modificación de un polipéptido son rutinarios para los expertos en la técnica, tal como usando metodologías de ADN recombinante.
Tal como se usa en el presente documento, los expertos en esta técnica conocen sustituciones conservativas adecuadas de aminoácidos y pueden hacerse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. Molecular Blology of the Gene, 4a edición, 1987, The Benjamln/Cummlngs Pub. co., p. 224). Tales sustituciones pueden hacerse de acuerdo con lo expuesto en la tabla 1Atal como sigue:
TABLA 1A
Residuo original
Sustitución conservativa a modo de ejemplo
Ala (A)
Gly; Ser
Arg (R)
Lys
Asn(N)
Gln; His
Cys (C)
Ser
Gln (Q)
Asn
Glu (E)
Asp
Gly(G)
Ala; Pro
Hls(H)
Asn; Gln
He (I)
Leu; Val
Leu (L)
lie; Val
Lys (K)
Arg; Gln; Glu
Met(M)
Leu; Tyr; lie
Phe(F)
Met; Leu; Tyr
Ser (S)
Thr
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Thr(T)
Ser
Trp (W)
Tyr
Tyr(Y)
Trp; Phe
Val (V)
lie; Leu
Otras sustituciones también son permisibles y pueden determinarse empíricamente o según sustituciones conservativas conocidas.
Tal como se usa en el presente documento, un constructo de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, mono o blcatenarla que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no encontrada en la naturaleza. Los constructos de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras coplas de moléculas manipuladas.
Tal como se usa en el presente documento, un segmento de ADN es una parte de una molécula de ADN mayor que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica para un polipéptido especificado es una parte de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido, que, cuando se lee en el sentido de 5’ a 3’, codifica para la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado.
Tal como se usa en el presente documento, el término polinucleótido significa un polímero mono o bicatenario de bases de desoxlrrlbonucleótidos o ribonucleótldo leídas desde el extremo 5’ al 3’. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótido se proporciona en el presente documento en cuanto a nucleótidos (abreviado “nt”) o pares de bases (abreviado “pb”). El término nucleótidos se usa para moléculas mono o bicatenarias cuando el contexto lo permite. Cuando el término se aplica a moléculas blcatenarlas, se usa para indicar la longitud global y se entenderá que es equivalente al término pares de bases. Los expertos en la técnica reconocerán que las dos hebras de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos del mismo pueden estar en bisel; por tanto todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido bicatenaria pueden no estar apareados. Tales extremos no apareados, en general, no superarán 20 nucleótidos de longitud.
Tal como se usa en el presente documento, “similitud” entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de secuencias de residuos y los residuos contenidos en las mismas. Los expertos en la técnica conocen métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método de evaluación de la similitud de secuencia, dos aminoácidos o secuencias de nucleótidos se alinean de una manera que produce un nivel máximo de identidad entre las secuencias. “Identidad” se refiere al grado en el que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariantes. La alineación de secuencias de aminoácidos, y en algún grado secuencias de nucleótidos, también puede explicar diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en aminoácidos (o nucleótidos). Diferencias conservativas son las que conservan las propiedades fisicoquímicas de los residuos implicados. La alineaciones pueden ser globales (alineación de las secuencias comparadas a lo largo de la longitud completa de las secuencias e incluyendo todos los residuos) o locales (la alineación de una parte de las secuencias que incluyen sólo la región o regiones más similares).
“Identidad” per se tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. (Véase, por ejemplo Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término “identidad” lo conocen bien los expertos en la técnica (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
Tal como se usa en el presente documento, homólogo (con respecto a secuencias de ácido nucleico y/o de aminoácidos) significa una homología de secuencia aproximadamente mayor de o igual al 25%, normalmente una homología de secuencia mayor de o igual al 25%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95%; el porcentaje preciso puede especificarse si es necesario. Para fines en el presente documento, los términos “homología” e “identidad” se usan a menudo de manera intercambiable, a menos que se indique lo contrario. En general, para la determinación del porcentaje de homología o identidad, se alinean secuencias de modo que se obtenga la coincidencia de orden más alto (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Mediante la homología de secuencia, se determina el número de aminoácidos conservados mediante programas de algoritmos de alineación convencionales, y pueden usarse con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
penalizaciones por hueco por defecto establecidas por cada proveedor. Moléculas de ácido nucleico sustancialmente homologas hlbridarían normalmente con rigurosidad moderada o con alta rigurosidad a lo largo de toda la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico de hibridación.
Si dos cualesquiera moléculas tienen secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son “idénticas” u “homologas” al 60%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% puede determinarse usando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa “FASTA”, usando por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson ef al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (otros programas incluyen el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., NucleicAcids Research 12(l):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Mol Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por ejemplo, puede usare la función BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information para determinar la identidad. Otros programas disponibles comercial o públicamente incluyen el programa DNAStar “MegAlign” (Madison, Wl) y el programa “Gap” del University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison Wl). El porcentaje de homología o identidad de moléculas de proteínas y/o ácido nucleico puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de secuencia usando un programa informático GAP (por ejemplo, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, tal como se revisa por Smith y Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos), que son similares, dividido entre el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucí. Acids Res. 14:6745, tal como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización de 0,10 adicional para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos terminales.
Por tanto, tal como se usa en el presente documento, el término “identidad” u “homología” representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de prueba y uno de referencia. Tal como se usa en el presente documento, el término al menos “idéntico al 90%” se refiere a porcentajes de identidad de desde el 90 hasta el 99,99 en relación con el ácido nucleico de referencia o secuencia de aminoácidos del polipéptido. La identidad a un nivel del 90% o más es indicativa del hecho que, suponiendo para fines de ejemplificación, se comparan una longitud de polipéptido de prueba y de referencia de 100 aminoácidos. No más del 10% (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de prueba difieren de los del polipéptido de referencia. Pueden hacerse comparaciones similares entre polinucleótidos de prueba y de referencia. Tales diferencias pueden representarse como mutaciones puntuales distribuidas al azar a lo largo de toda la longitud de un polipéptido o pueden agruparse en una o más ubicaciones de longitud variable hasta el máximo permisible, por ejemplo una diferencia de aminoácidos de 10/100 (identidad de aproximadamente el 90%). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácido nucleico o aminoácidos. Al nivel de homologías o identidades anteriores por encima de aproximadamente el 85-90%, el resultado debe ser independiente de los parámetros del programa y huecos fijados; tales niveles altos de identidad pueden evaluarse fácilmente, a menudo mediante alineación manual sin basarse en el software.
Tal como se usa en el presente documento, una secuencia alineada se refiere al uso de la homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Normalmente, se alinean dos o más secuencias que están relacionadas en un 50% o más de identidad. Un conjunto alineado de secuencias se refiere a 2 o más secuencias que están alineadas en posiciones correspondientes y puede incluir la alineación de secuencias derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineados con secuencias de ADN genómico.
Tal como se usa en el presente documento, “cebador” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN dirigida por molde en condiciones apropiadas (por ejemplo, en presencia de cuatro trifosfatos de nucleósido diferentes y un agente de polimerización, tal como ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que determinadas moléculas de ácido nucleico pueden servir como “sonda” y como “cebador”. Un cebador, sin embargo, tiene un grupo hidroxilo en 3’ para la extensión. Un cebador puede usarse en una variedad de métodos, incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT), PCR de ARN, LCR, PCR múltiplex, PCR panhandle, PCR de captura, PCR de expresión, RACE en 3’ y 5’, PCR in situ, PCR mediada por ligación y otros protocolos de amplificación.
Tal como se usa en el presente documento, “par de cebadores” se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador en 5’ (en el sentido de 5 ') que se híbrida con el extremo 5’ de una secuencia que va a amplificarse (por ejemplo mediante PCR) y un cebador en 3’ (en el sentido de 3’) que se híbrida con el complemento del extremo 3’ de la secuencia que va a amplificarse.
Tal como se usa en el presente documento, “se híbrida específicamente” se refiere al apareamiento, mediante apareamiento de bases complementarias, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo un oligonucleótido) con una molécula de ácido nucleico diana. Los expertos en la técnica están familiarizados con parámetros in vitro e in
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
vivo que afectan a la hibridación específica, tal como la longitud y composición de la molécula particular. Los parámetros particularmente relevantes para la hibridación in vitro incluyen además la temperatura de apareamiento y lavado, la composición del tampón y la concentración de sal. Condiciones de lavado a modo de ejemplo para eliminar moléculas de ácido nucleico no unidas específicamente con alta rigurosidad son 0,1 x SSPE, SDS al 0,1%, 65°C, y con rigurosidad media son 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%, 50°C. Se conocen en la técnica condiciones de rigurosidad equivalentes. El experto puede ajustar fácilmente estos parámetros para lograr la hibridización específica de una molécula de ácido nucleico con una molécula de ácido nucleico diana apropiada para una aplicación particular. Complementarias, cuando se refiere a dos secuencias de nucleótidos, significa que las dos secuencias de nucleótidos pueden hibridarse, normalmente con menos del 25%, el 15% o el 5% de apareamientos erróneos entre nucleótidos opuestos. Si es necesario, se especificará el porcentaje de complementariedad. Normalmente las dos moléculas se seleccionan de manera que hibridarán en condiciones de alta rigurosidad.
Tal como se usa en el presente documento, sustancialmente idéntico a un producto significa suficientemente similar de modo que la propiedad de interés esté suficientemente no cambiada de modo que el producto sustancialmente idéntico pueda usarse en lugar del producto.
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que los términos “sustancialmente idéntico” o “similar” varían con el contexto tal como entienden los expertos en la técnica relevante.
Tal como se usa en el presente documento, una variante alélica o variación alélica hace referencia a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural a través de mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término “variante alélica” también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Normalmente la forma de referencia del gen codifica para una forma de tipo natural y/o forma predominante de un polipéptido de una población o un único miembro de referencia de una especie. Normalmente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre especies tienen normalmente una identidad de aminoácidos de al menos el 80%, el 90% o mayor con una forma de tipo natural y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y si la comparación es entre especies o dentro de la especie. Generalmente, las variantes alélicas dentro de la especie tienen una identidad de al menos aproximadamente el 80%, el 85%, el 90% o el 95% o mayor con una forma de tipo natural y/o predominante, incluyendo una identidad del 96%, el 97%, el 98%, el 99% o mayor con una forma de tipo natural y/o predominante de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en el presente documento se refiere generalmente a variaciones en proteínas entre miembros de la misma especie.
Tal como se usa en el presente documento, “alelo”, que se usa de manera intercambiable en el presente documento con “variante alélica” se refiere a formas alternativas de un gen o partes del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigoto para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un único nucleótido o varios nucleótidos, y pueden incluir sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.
Tal como se usa en el presente documento, variantes de especie se refiere a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies de mamífero, tales como ratón y humano.
Tal como se usa en el presente documento, una variante de corte y empalme se refiere a una variante producida mediante procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.
Tal como se usa en el presente documento, el término promotor significa una parte de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias de promotor se encuentran comúnmente, pero no siempre, en la región no codificante en 5’ de los genes.
Tal como se usa en el presente documento, proteína o polipéptido purificado o aislado o parte biológicamente activa del mismo está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido del que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Puede determinarse que las preparaciones están sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables tal como se determina mediante métodos de análisis convencionales, tales como cromatografía en capa fina (CCF), electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), usados por los expertos en la técnica para evaluar tal pureza, o que son suficientemente puras de manera que la purificación adicional no alteraría de manera detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los expertos en la técnica conocen métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente puros químicamente. Sin embargo, un compuesto sustancialmente puro químicamente, puede ser una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las que la proteína está separada de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de manera recomblnante. En una realización, el término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzlmátlcas que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también denominadas en el presente documento proteínas contaminantes), generalmente menos de aproximadamente el 20% de proteínas no enzimáticas o el 10% de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente el 5% de proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce de manera recombinante, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente o el 20%, el 10% o el 5% del volumen de la preparación de proteína enzimática.
Tal como se usa en el presente documento, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que la proteína está separada de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco), el 20%, el 10%, el 5% o menos de precursores químicos o componentes o productos químicos no enzimáticos.
Tal como se usa en el presente documento, sintético, con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintético o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que se produce por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química.
Tal como se usa en el presente documento, la producción por medios recombinantes usando métodos de ADN recombinante significa el uso de los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.
Tal como se usa en el presente documento, vector (o plásmido) se refiere a elementos diferenciados que se usan para introducir un ácido nucleico heterólogo en células para o bien la expresión o bien la replicación del mismo. Los vectores permanecen normalmente episomales, pero pueden diseñarse para efectuar la integración de un gen o parte del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. La selección y el uso de tales vehículos los conocen bien los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, un vector de expresión incluye vectores que pueden expresar ADN que está operativamente unido a secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que pueden efectuar la expresión de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias de promotor y termlnador, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionares, un potenciador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente de ADN de plásmido o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por tanto, un vector de expresión se refiere a un constructo de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recomblnante u otro vector que, tras su introducción en una célula huésped apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los expertos en la técnica conocen bien vectores de expresión apropiados e incluyen los que pueden replicarse en células eucariotas y/o células procariotas y los que permanecen episomales o los que se integran en el genoma de la célula huésped.
Tal como se usa en el presente documento, vector también incluye “vectores de virus” o “vectores virales”. Vectores virales son virus modificados por ingeniería genética que están operativamente unidos a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos al interior de células.
Tal como se usa en el presente documento, operablemente u operativamente unido cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan en concierto para sus fines previstos, por ejemplo, inicio de la transcripción en el promotor y avanza a través del segmento codificante hasta el terminador.
Tal como se usa en el presente documento, el término evaluar pretende incluir la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteína, tal como una enzima o proteasa, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también de obtener un índice, una razón, un porcentaje, un valor visual u otro valor indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta y por supuesto no es necesario que la especie química realmente detectada sea el producto final de una reacción, tal como un producto de proteólisis de la misma, sino que puede ser por ejemplo un derivado de la misma o alguna sustancia adicional. Por ejemplo, la evaluación puede ser detección de un producto de escisión de una proteína, tal como mediante SDS-PAGE y tinción de proteínas con azul de Coomasie.
Tal como se usa en el presente documento, actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un compuesto o a las respuestas fisiológicas que resultan tras la administración in vivo de un compuesto, una composición u otra mezcla. La actividad biológica, por tanto, engloba efectos terapéuticos y actividad farmacéutica de tales compuestos, composiciones y mezclas. Pueden observarse actividades biológicas en sistemas in vitro diseñados para someter a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
prueba o usar tales actividades. Por tanto, para fines en el presente documento, una actividad biológica de una proteasa es su actividad catalítica en la que se hidroliza un polipéptido.
Tal como se usa en el presente documento equivalente, cuando se hace referencia a dos secuencias de ácidos nucleicos, significa que las dos secuencias en cuestión codifican para la misma secuencia de aminoácidos o proteínas equivalentes. Cuando se usa equivalente en referencia a dos proteínas o péptidos, significa que las dos proteínas o péptidos tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos con sólo sustituciones de aminoácidos que no alteran sustancialmente la actividad o función de la proteína o el péptido. Cuando equivalente se refiere a una propiedad, no es necesario que la propiedad esté presente en el mismo grado (por ejemplo, dos péptidos pueden presentar diferentes tasas del mismo tipo de actividad enzimática), sino que las actividades son habitualmente las mismas sustancialmente.
Tal como se usa en el presente documento, “modular” y “modulación” o “alterar” se refieren a un cambio de una actividad de una molécula, tal como una proteína. Las actividades a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, actividades biológicas, tales como transducción de señales. La modulación puede incluir un aumento en la actividad (es decir, regulación por incremento o actividad agonista), una disminución en la actividad (es decir, regulación por disminución o inhibición) o cualquier otra alteración en una actividad (tal como un cambio en periodicidad, frecuencia, duración, cinética u otro parámetro). La modulación puede ser dependiente del contexto y normalmente se compara la modulación con un estado designado, por ejemplo, la proteína de tipo natural, la proteína en un estado constitutivo o la proteína tal como se expresa en una condición o tipo de célula designado.
Tal como se usa en el presente documento, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una disolución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, una disolución acuosa, no acuosa o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más artículos. La combinación puede ser dos o más artículos separados, tales como dos composiciones o dos colecciones, puede ser una mezcla de los mismos, tal como una única mezcla de los dos o más artículos, o cualquier variación de los mismos. Los elementos de una combinación están generalmente asociados o relacionados funcionalmente.
Tal como se usa en el presente documento, un kit es una combinación envasada que incluye opcionalmente otros elementos, tales como reactivos adicionales e instrucciones para el uso de la combinación o elementos de la misma.
Tal como se usa en el presente documento, “enfermedad o trastorno” se refiere a un estado patológico en un organismo que resulta de una causa o un estado que incluye, pero no se limita a, infecciones, estados adquiridos, estados genéticos, y caracterizado por síntomas identificables. Las enfermedades y los trastornos de interés en el presente documento son los que pueden tratarse mediante inmunoglobulina.
Tal como se usa en el presente documento, “tratar” un sujeto con una enfermedad o un estado significa que los síntomas del sujeto se alivian parcial o totalmente, o permanecen estáticos tras el tratamiento. Por tanto tratamiento engloba profilaxis, terapia y/o cura. Profilaxis se refiere a la prevención de una posible enfermedad y/o a una prevención del empeoramiento de síntomas o la progresión de una enfermedad. Tratamiento también engloba cualquier uso farmacéutico de una preparación de inmunoglobulina y composiciones proporcionadas en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, un agente farmacéuticamente eficaz incluye cualquier agente terapéutico o agente bioactivo, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, anestésicos, vasoconstrictores, agentes de dispersión, agentes terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos de molécula pequeña y proteínas terapéuticas.
Tal como se usa en el presente documento, tratamiento significa cualquier manera en la que los síntomas de un estado, trastorno o enfermedad u otra indicación, mejoran o se alteran de manera beneficiosa de otra forma.
Tal como se usa en el presente documento, efecto terapéutico significa un efecto que resulta del tratamiento de un sujeto que altera, normalmente alivia o mejora los síntomas de una enfermedad o un estado o que cura una enfermedad o un estado. Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de una composición, una molécula o un compuesto que da como resultado un efecto terapéutico tras su administración a un sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un humano.
Tal como se usa en el presente documento, un paciente se refiere a un sujeto humano.
Tal como se usa en el presente documento, mejora de los síntomas de una enfermedad o un trastorno particular mediante un tratamiento, tal como mediante administración de una composición farmacéutica u otro producto
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
terapéutico, se refiere a cualquier reducción, ya sea permanente o temporal, duradera o transitoria, de los síntomas que puede atribuirse a o asociarse con la administración de la composición o producto terapéutico.
Tal como se usa en el presente documento, prevención o profilaxis se refiere a métodos en los que se reduce el riesgo de desarrollar una enfermedad o un estado.
Tal como se usa en el presente documento, una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “dosis terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de un agente, un compuesto, un material o una composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por tanto, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o un trastorno.
Tal como se usa en el presente documento, forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas para sujetos humanos y animales y envasadas individualmente tal como se conoce en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, una formulación de una única dosificación se refiere a una formulación para administración directa.
Tal como se usa en el presente documento, un “artículo de fabricación” es un producto que se fabrica y se vende. Tal como se usa a lo largo de esta solicitud, el término pretende englobar composiciones de IG y hialuronidasa contenidas en artículos de envasado.
Tal como se usa en el presente documento, fluido se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Los fluidos engloban por tanto composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, disoluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras de tales composiciones.
Tal como se usa en el presente documento, un “kit” se refiere a una combinación de composiciones proporcionadas en el presente documento y otro artículo para un fin incluyendo, pero sin limitarse a, la activación, la administración, el diagnóstico y la evaluación de una actividad biológica o propiedad. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones para su uso.
Tal como se usa en el presente documento, un Usado o extracto celular se refiere a una preparación o fracción que se prepara a partir de una célula rota o lisada.
Tal como se usa en el presente documento, animal incluye cualquier animal, tal como, pero sin limitarse a primates incluyendo humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves, tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; ovinos, tales como cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen humanos como el animal contemplado. Las enzimas proporcionadas en el presente documento proceden de cualquier fuente, animal, planta, organismo procariota y fúnglco. La mayoría de las enzimas son de origen animal, Incluyendo origen de mamífero.
Tal como se usa en el presente documento, un control se refiere a una muestra que es sustanclalmente Idéntica a la muestra de prueba, excepto porque no se trata con un parámetro de prueba, o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado por el estado de Interés. Un control también puede ser un control Interno.
Tal como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un compuesto que comprende “un dominio extracelular” incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.
Tal como se usa en el presente documento, los Intervalos y las cantidades pueden expresarse como “aproximadamente” un intervalo o valor particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por “aproximadamente 5 bases” significa “aproximadamente 5 bases” y también “5 bases”.
Tal como se usa en el presente documento, “opcional” u “opclonalmente” significa que la circunstancia o el acontecimiento descrito posteriormente se produce o no se produce, y que la descripción incluye casos en los que dicho acontecimiento o circunstancia se produce y casos en los que no. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo no está sustituido o está sustituido.
Tal como se usa en el presente documento, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácido y otros compuestos, a menos que se indique lo contrario, están de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas o la Comisión de la IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica (véase, (1972) Biochem. 11:1726).
B. COFORMULACIONES ESTABLES DE INMUNOGLOBULINA (IG) Y HIALURONIDASA
Se proporcionan en el presente documento coformulaciones estables que contienen inmunoglobulina (IG) y hialuronidasa. Las coformulaciones conservan la distribución de tamaño molecular de IG y la actividad hialuronidasa tras el almacenamiento prolongado en forma líquida a temperatura ambiente (por ejemplo de 28 a 32°C) durante al
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
menos seis meses. Generalmente, las coformulaclones también conservan la distribución de tamaño molecular de IG y la actividad hialuronidasa a temperaturas de nevera convencionales durante al menos 1-2 años. Las coformulaciones pueden usarse para tratar enfermedades y estados que pueden tratarse con IG. En particular, las coformulaciones estables proporcionadas en el presente documento se formulan para administración subcutánea.
1. Terapia con inmunoglobulina
La inmunoglobulina es un producto terapéutico que se administra principalmente para tratar individuos con inmunodeficiencias. Los trastornos de deficiencia de inmunoglobulina son un subconjunto de enfermedades de inmunodeficiencia caracterizadas por niveles ausentes o reducidos de inmunoglobulinas séricas, que conducen a un aumento de la susceptibilidad a infecciones bacterianas, especialmente del tracto sinopulmonar. Las enfermedades de inmunodeficiencia son o bien primarias (genéticas) o bien secundarias (adquiridas). Las enfermedades de inmunodeficiencia primaria son poco comunes e incluyen agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, deleción de cadena pesada de inmunoglobulina, deficiencia de subclase de inmunoglobulina G (IgG) selectiva, inmunodeficiencia variable común o síndrome de hiperinmunoglobulina M ligado al cromosoma X. También se han encontrado niveles de inmunoglobulina disminuidos en individuos que tienen inmunodeficiencias combinadas debidas a defectos en células T y B, tales como, pero sin limitarse a, inmunodeficiencia combinada grave o síndrome de Wiskott Aldrich (IUIS Scientific Committee, 1999). Más comunes son inmunodeficiencias secundarias, inducidas por factores que incluyen, pero no se limitan a, malnutrición, virus, envejecimiento y leucemia. Los individuos con estas enfermedades requieren terapia de sustitución con productos de inmunoglobulina para prevenir o reducir la gravedad de las infecciones.
La terapia de sustitución con inmunoglobulina se usó por primera vez en 1952 y se administró por vía intramuscular y por vía subcutánea. Sin embargo, para tratar eficazmente la enfermedad, son necesarias mayores cantidades de IG, lo que condujo al desarrollo de productos administrables por vía intravenosa con menores concentraciones de IG (50-100 mg/ml). Desde 1981, la mayoría de los productos de inmunoglobulina disponibles en los Estados Unidos se administran por vía intravenosa. Generalmente, las preparaciones de IG son productos estériles, purificados que contienen inmunoglobulina G (IgG, IgM, IgA o una combinación de esas). Normalmente, los productos de IG contienen el 95-99% de IgG y sólo cantidades traza de inmunoglobulinas A (IgA), M (IgM), D (IgD) y E (IgE). Las preparaciones de IG para administración i.v. se formulan generalmente a del 3 al 12% de IG.
Más recientemente, se han desarrollado preparaciones de inmunoglobulina para administración subcutánea (Gardulf et al. (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 6: 434-42; Gardulf et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26: 177-85; Ochs et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26: 265-73), y al menos un producto, Vivaglobin®, se autorizó para administración subcutánea en los Estados Unidos. Una vía de administración subcutánea de IG tiene varias ventajas en comparación con la vía i.v. tales como mejor tolerabilidad y la posibilidad de tratamiento de atención domiciliaria.
La biodisponibilidad de la inmunoglobulina administrada por vía subcutánea generalmente es inferior a la de la infundida por vía intravenosa. Tras la administración i.v., la inmunoglobulina está inmediatamente disponible en la sangre, y se equilibra lentamente con el compartimento extravascular a lo largo de 3 a 5 días (Schiff et al. (1986) J. Clin. Immunol. 6: 256-64). La inmunoglobulina administrada por vía subcutánea se absorbe lentamente desde el espacio subcutáneo a la sangre y al mismo tiempo se equilibra con el compartimento extravascular; no hay un pico i.v. alto. La biodisponibilidad no se ha estudiado de manera extensa, pero en un ensayo reciente de la preparación ZLB-Behring (es decir, Vivaglobin®), se determinó midiendo el área bajo la curva (AUC) que sólo se absorbía el 67% de la inmunoglobulina, y por tanto, la dosis recomendada era el 137% de la dosis i.v. (Ochs et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26: 265-73). A pesar de las dificultades técnicas de comparar la AUC para dos vías y frecuencia de administración diferentes, los estudios de inmunoglobulina administrada por vía intradérmica en conejos sugieren que hay una disminución de la biodisponibilidad a través de la vía subcutánea. Esto puede deberse al modo de absorción de moléculas de proteína grandes, que no pueden difundir fácilmente a través de las paredes capilares y deben absorberse por medio del sistema linfático (Supersaxo et al. (1990) Pharm. Res. 7: 167-9).
Todas las preparaciones de inmunoglobulina usadas actualmente para administración subcutánea se formulan al 16% de IG, en comparación con preparaciones de IGIV formuladas a del 5 al 12% de IG. La mayor concentración de IG en preparaciones subcutáneas en relación con preparaciones i.v. permite volúmenes de infusión más pequeños; tales preparaciones no pueden infundirse por vía intravenosa. Se considera que tales métodos subcutáneos de terapia de sustitución con inmunoglobulina son eficaces, seguros y también altamente apreciados por los pacientes, ya que tienen un bajo riesgo de reacciones adversas sistémicas y conducen a concentraciones de IgG en suero valle superiores en comparación con infusiones i.v. mensuales (Gardulf et al. (1995) J. Adv. Nurs., 21: 917-27; Gardulf et al. (1993) Clin. Exp. Immunol., 92: 200-4; Gardulf ef al. (1991) Lancet, 338: 162-6).
Además de la disminución de biodisponibilidad asociada con la administración subcutánea de IG, otra distinción entre administración s.c. e i.v. es que sólo pueden infundirse pequeños volúmenes por vía subcutánea en cada sitio, necesitándose el uso de múltiples sitios en una base semanal o bisemanal (cada dos semanas). En general, sin embargo, a los adultos sólo puede infundírseles 20-40 mi en un único sitio subcutáneo, con volúmenes inferiores por sitio para niños. Actualmente, la práctica aceptada para la administración de IG es de 300-600 mg/kg por vía intravenosa una vez cada 3-4 semanas o 100-200 mg/kg/semana por vía subcutánea (Berger (2008) Immunol.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Allergy Clin. North Am. 28(2): 413-438). Por tanto, se administran hasta 15 g de IG por semana por vía subcutánea. Esto significa que se requiere la administración de una preparación del 16-20% de IG al menos en 3 sitios por semana. Aun cuando la administración semanal o bisemanal tiene la ventaja añadida de mantener mejores niveles valle que infusiones i.v. mensuales, el requisito de múltiples inserciones de agujas ha disuadido a muchos pacientes.
No obstante, los métodos subcutáneos de terapia de sustitución con inmunoglobulina están convirtiéndose en una alternativa cada vez más popular para la terapia con IGIV. Los pacientes que tienen reacciones graves frente a infusiones de IGIV pueden tolerar a menudo IG administrada por vía subcutánea. Se considera que la administración subcutánea es eficaz, segura y altamente apreciada por los pacientes, ya que tiene un bajo riesgo de reacciones adversas sistémicas y pueden administrarse en el hogar o en el hospital (Gardulf et al. (1995) J. Adv. Nurs. 21: 917- 27; Gardulf et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 92: 200-4; Gardulf et al. (1991) Lancet 338: 162-6).
2. Administración subcutánea de formulaciones de inmunoglobulina y hialuronidasa
La biodisponibilidad de IG administrada por vía subcutánea aumenta en combinación con la administración de hialuronidasa, permitiendo de ese modo la administración subcutánea de inmunoglobulina a dosificaciones y frecuencias similares al tratamiento con IGIV (véase por ejemplo la solicitud de patente estadounidense n.° 2010- 0074885 y el documento PCT internacional n.° WO 2009-117085, cada uno incorporado como referencia en el presente documento). El espacio subcutáneo (s.c.), formado por una red de colágeno llena de ácido hialurónico, una sustancia similar a un gel, es en gran medida responsable de la resistencia al flujo de fluido a través de los tejidos. La hialuronidasa es una familia de enzimas que se producen de manera natural que descomponen el ácido hialurónico, que es una sustancia similar a un “gel” que llena el espacio que se encuentra en la matriz extracelular y en tejidos por todo el cuerpo tal como la piel y el ojo. La hialuronidasa actúa dividiendo el enlace glucosamlnídlco en el ácido hialurónico entre el Ci de un resto N-acetilglucosamina y C4 de un resto glucurónico. Esto disminuye temporalmente la viscosidad del cemento celular y promueve la difusión de fluidos inyectados, facilitando así su absorción. Después de eso, el ácido hialurónico se regenera de manera natural en el plazo de 24 horas. Por consiguiente, las características de biodisponibilidad, farmacocinética y/o farmacodinámica de coformulaciones que contienen hialuronidasa mejoran. Basándose en experimentos en animales, el aumento de la dispersión de fluido permite la administración de hasta 1 I por hora por medio de la vía subcutánea, que es una velocidad de flujo similar a la vía i.v.
En presencia de hialuronidasa, la biodisponibilidad de IG administrada por vía subcutánea aumenta, normalmente hasta más del 90% de la biodisponibilidad de IG tras el tratamiento con IGIV. Además, la coadministración con una hialuronidasa soluble permite la infusión de grandes volúmenes en un único sitio subcutáneo. Por ejemplo, pueden administrarse volúmenes de hasta 600 mi o mayores de IG en un único sitio en una única sesión, por ejemplo pueden administrarse 200 mi, 300 mi, 400 mi, 500 mi, 600 mi o más en un único sitio en una única administración. Por ejemplo, una preparación de IG formulada a o entre el 5-12%, por ejemplo al 10% de proteína, que normalmente se usa sólo para terapia con IGIV puede coadministrarse por vía subcutánea con una hialuronidasa soluble a dosificaciones equivalentes a dosis de IGIV de una vez al mes, por ejemplo, a o aproximadamente 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg o más. Preparaciones de IG a concentraciones superiores de proteína, por ejemplo, el 12-25% de IG tal como el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22% o más también pueden administrarse por vía subcutánea en presencia de hialuronidasa. Las dosificaciones pueden administrarse como una dosis individual o pueden dividirse en múltiples dosis administradas diaria o semanalmente, tal como una vez a la semana o cada dos, tres o cuatro semanas o combinaciones de las mismas. Por tanto, la IG, cuando se administra por vía subcutánea en presencia de hialuronidasa, puede administrarse una vez al mes a dosis de IGIV prevalentes para la indicación particular. Además, debido a que la hialuronidasa actúa abriendo canales de flujo en la piel, puede acelerar las velocidades de infusión. Por tanto, la administración por vía subcutánea de IG administrada con hialuronidasa aumenta las velocidades de infusión y disminuye de ese modo el tiempo de administración de la terapia con IG.
Administrando IG por vía subcutánea en presencia de una hialuronidasa, se abordan una o todas las consideraciones y los problemas asociados con la administración subcutánea de IG. Por tanto, en virtud de las propiedades de dispersión de la hialuronidasa, la administración por vía subcutánea de IG en presencia de una hialuronidasa soluble permite la administración de dosis de IGIV a frecuencias de IGIV de una vez al mes, al tiempo que se mantiene la biodisponibilidad de IGIV.
3. Coformulaciones estables
Puesto que las preparaciones de inmunoglobulina administrares por vía subcutánea tienen las ventajas de tratamiento de atención domiciliaria, se contempla una preparación estable, lista para usar de IG y hialuronidasa. Las proteínas usadas para la terapia se someten normalmente a una variedad de condiciones durante el procesamiento y almacenamiento, Incluyendo bajo pH, fluctuaciones en temperatura, diversos componentes de tampón y fuerzas iónicas y, a menudo, alta concentración de proteína en la preparación final. Sin embargo, para que sea eficaz, la coformulación debe conservar suficiente actividad de la IG y hialuronidasa. Por tanto, una coformulación de IG y hialuronidasa debe proporcionarse como una disolución estable para su almacenamiento como una disolución acuosa sin deteriorarse durante periodos de tiempo prolongados. Por tanto, se proporciona en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
el presente documento una coformulación líquida estable de IG y hialuronldasa. La coformulación es tal que se proporciona como una forma de dosificación que puede usarse para inyección directa, es decir sin diluirse antes de su uso.
Se encontró en el presente documento que un producto coformulado preparado mediante la adición de una hialuronidasa designada rHuPH20 a una preparación de IG antes de su administración no era estable a temperatura ambiente. La adición de sal mejora la estabilidad de la formulación, en particular, manteniendo la actividad de la hialuronidasa en la formulación. Por tanto, además de contener una cantidad eficaz de IG y hialuronidasa, las coformulaciones estables proporcionadas en el presente documento también contienen al menos 50 mM de una sal de cloruro de metal alcalino, por ejemplo, NaCI o KCI. Normalmente, las coformulaciones estables también contienen un aminoácido, por ejemplo glicina, como estabilizador y se proporcionan a un pH de aproximadamente o a de 4 a 5. En general, la razón de hialuronidasa con respecto a IG en un producto coformulado es mayor que la razón cuando los mismos productos (IG y hialuronidasa) y la misma cantidad de IG se administran por vía subcutánea por separado, por ejemplo, en una administración de vanguardia.
Generalmente, la coformulación estable es una formulación líquida. El almacenamiento de la coformulación directamente en una forma líquida se aprovecha de la conveniencia de tener estabilidad en almacenamiento en forma líquida, facilidad de administración sin reconstitución y capacidad para suministrar la formulación en jeringas precargadas, listas para usar o como preparaciones de múltiples dosis. Por tanto las coformulaciones líquidas proporcionan una preparación lista para usar de IG y hialuronidasa para administración subcutánea a un sujeto sin tener que reconstituir la preparación de manera precisa y aséptica y esperar durante un periodo de tiempo hasta que la disolución se clarifique antes de administrar la formulación al sujeto. Se simplifica el procedimiento de administración de la formulación a un sujeto para un profesional sanitario. Además, el procedimiento de fabricación de las formulaciones líquidas se simplifica y es más eficaz que el procedimiento de fabricación para la versión lloflllzada porque todas las fases de la fabricación de las formulaciones líquidas se llevan a cabo en una disolución acuosa, sin Implicar un procedimiento de secado, tal como liofilización y secado por congelación. Por consiguiente, también es más rentable. La coformulación estable puede proporcionarse como una disolución líquida en un recipiente o jeringa. Una coformulación de este tipo puede dispensarse convenientemente a humanos u otras especies de mamífero como un producto farmacéutico sin reconstitución adicional por el médico o paciente.
Además, debido a su alta estabilidad durante el almacenamiento, las coformulaciones pueden contener altas concentraciones de proteína en el intervalo de aproximadamente el 10% al 22% de IG, tal como del 10% al 20% de IG sin provocar ningún efecto adverso sobre la(s) actividad(es) blológica(s) de IG debido a agregación y/o fragmentación de proteínas durante un almacenamiento prolongado. Tal estabilidad no sólo garantiza la eficacia de la coformulación de IG, sino que también reduce posibles riesgos de provocar efectos adversos en un sujeto. Por tanto, las coformulaciones estables proporcionadas en el presente documento conservan la actividad enzimática hialuronidasa y la actividad de IG al tiempo que minimizan la autoasociación y agregación de IG. Generalmente, la actividad se conserva a una temperatura que es de hasta 32°C, por ejemplo a o de aproximadamente 0°C a 32°C, generalmente a o de aproximadamente 28°C a 32°C. La estabilidad de la coformulación se mantiene a lo largo de periodos de tiempo prolongados, por ejemplo, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente o más. Las coformulaciones tienen la ventaja de que son estables en forma líquida durante el almacenamiento durante periodos de tiempo prolongados de al menos 6 meses. En un ejemplo, las coformulaciones estables son estables en líquido durante al menos 1 año o más, por ejemplo, de 1 año a 2 años, tal como 1 año, 2 años, o más a temperaturas de nevera convencionales (aproximadamente 4+2°C, o aproximadamente 2-8°C o, más generalmente, que oscilan entre aproximadamente 0-10°C). En otro ejemplo, las coformulaciones son estables en forma líquida durante el almacenamiento a temperatura ambiente (en el intervalo de 18-32°C, por ejemplo, de 28°C a 32°C) durante al menos seis meses. Por ejemplo, las coformulaciones estables tienen generalmente una semivida de al menos o de aproximadamente 6 meses a 18 meses, por ejemplo 6 meses, 12 meses, 18 meses, o más cuando se almacenan a temperatura ambiente.
Las siguientes secciones describen las formulaciones proporcionadas en el presente documento, incluyendo inmunoglobulinas y hialuronidasas a modo de ejemplo en las formulaciones, métodos de prepararlas, y métodos de usar las coformulaciones estables para tratar enfermedades y estados que pueden tratarse con IG.
C. INMUNOGLOBULINA Y PREPARACIÓN DE INMUNOGLOBULINA
Se proporcionan en el presente documento inmunoglobulinas (IG, también denominadas inmunoglobulina, gammaglobulina o IgG) que pueden formularse en composiciones estables con hialuronidasa. Las coformulaciones estables pueden usarse para su uso en el tratamiento de enfermedades y estados que pueden tratarse con IG.
Las inmunoglobulinas son proteínas gammaglobulina producidas por el sistema inmunitario humoral y que se encuentran en el plasma de animales superiores. La IG actúa fortaleciendo el sistema inmunitario modulando la actividad del complemento, suprimiendo la producción de anticuerpos, saturando o bloqueando receptores de Fe en macrófagos y linfocitos B, y suprimiendo la producción de mediadores inflamatorios tales como citocinas, quimiocinas y metaloproteinasas. Las IG se componen de cinco clases, o isotipos, de anticuerpos (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE) y diversas subclases, cada una con especificidades variables. IgG es la clase más predominante de IG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
encontrada en la sangre y es importante en respuestas ¡nmunitarias secundarias y en la protección de tejidos frente a la infección. La tabla 2 ilustra cantidades típicas de inmunoglobulinas encontradas en el suero, aunque las preparaciones de IG para tratamiento pueden emplear etapas de purificación para alterar las razones de una clase o subclase de inmunoglobulina particular. Por ejemplo, puede usarse cromatografía con proteína A, proteína G o proteína H Sepharose para enriquecer una mezcla de inmunoglobulinas en IgG, o en subtipos de IgG específicos (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe (1999) Using Antibodies, Coid Spring Harbor Laboratory Press; Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press; patente estadounidense n.° 5.180.810).
Tabla 2. Inmunoglobulina sérica
Clase de Iq
Nivel en suero mg/ml (%) Función
IgG
1200 (77) Clase de IG principal en humanos; respuesta inmunitaria secundaria; proteqe frente a la infección
IqA
200 (13) Protege la mucosa
IqM
150 (9) IG principal para las respuestas ¡nmunitarias primarias
IqD
2(<1) Regula las células B
Jai______
<1 (traza) IG principal en respuestas alérgicas
1. Preparación y purificación
Las preparaciones de inmunoglobulina proporcionadas en el presente documento pueden prepararse a partir de cualquier material de partida adecuado. Por ejemplo, pueden aislarse inmunoglobulinas de sangre humana o animal, por ejemplo, de suero de donantes humanos, o producirse por otros medios, por ejemplo, mediante tecnología de ADN recombinante o tecnología de hlbrldoma. Por tanto, las preparaciones de inmunoglobulina pueden incluir inmunoglobulinas monoclonales o recomblnantes. Por ejemplo, pueden obtenerse inmunoglobulinas de tejidos, cultivos de hibridoma de linfocitos, suero o plasma sanguíneo, o cultivos celulares recombinantes usando cualquier procedimiento adecuado, tal como, por ejemplo, precipitación (fraccionamiento con alcohol de Cohn o fraccionamiento con polietilenglicol); métodos cromatográficos (cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad); ultracentrifugación; o preparación electroforética (véanse, por ejemplo, Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68: 459-75; Oncley et al. (1949) J. Am. Chem. Soc., 71: 541-50; Barandern ef al. (1962) Vox Sang., 7: 157-74; Koblet et al. (1967) Vox Sang., 13: 93-102; las patentes estadounidenses n.°s 5.122.373 y 5.177.194). Normalmente, se prepara una inmunoglobulina a partir de productos que contienen gammaglobullna producidos mediante métodos de fraccionamiento con alcohol y/o cromatografía de intercambio Iónico y afinidad bien conocidos por los expertos en la técnica.
Pueden usarse etapas preparativas para enriquecer un isotipo o subtipo particular de inmunoglobulina. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de proteína A, proteína G o proteína H Sepharose para enriquecer una mezcla de inmunoglobulinas en IgG, o en subtipos de IgG específicos. (Véanse en general Harlow y Lañe, Using Antibodies, Coid Spring Harbor Laboratory Press (1999); Harlow y Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press (1988); patente estadounidense n.° 5.180.810).
a. Método de Cohn-Oncley
Los métodos industriales convencionales de purificación de inmunoglobulinas a partir de plasma sanguíneo se basan en fraccionamiento con etanol frío, que coprecipita grupos de proteínas basándose en sus puntos isoeléctricos a concentraciones de alcohol dadas a temperaturas por debajo de cero, empleados originalmente por Cohn y modificados por Oncley (véanse, por ejemplo, Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68: 459-75; Oncley et al. (1949) J. Am. Chem. Soc. 71: 541-50). El uso de alcohol en el procedimiento de purificación puede inactivar potencialmente virus contaminantes, sin embargo, con el aumento de la temperatura y la concentración de alcohol, el método de Cohn-Oncley puede dar como resultado proteínas desnaturalizadas y agregadas. Estas formas de peso molecular alto pueden actuar como complejos anticuerpo-antígeno que tienen la capacidad de fijar libremente el complemento.
b. Procedimientos de Cohn-Oncley modificados
Para evitar los efectos no deseados del método de Cohn-Oncley, se han desarrollado métodos de Cohn-Oncley modificados para la preparación y purificación de IG. Se conocen diversos procedimientos de este tipo y pueden adaptarse y modificarse para producir las preparaciones de IG en el presente documento. Está dentro del conocimiento de la técnica preparar preparaciones de IG en vista de los métodos detallados conocidos y disponibles en la técnica.
Normalmente, se fabrica IG usando un fraccionamiento primario en etanol frío y un fraccionamiento secundario que puede incluir, por ejemplo, una cualquiera o más de las siguientes etapas para obtener un producto que tiene una baja actividad anti-complementaria (ACA): separación de agregados de IG mediante técnicas convencionales, tales
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
como ultracentrifugación o cromatografía de exclusión; modificación química de las moléculas de IG mediante alcoholización, alquilación, sulfonación y tratamiento con agentes reductores (véase por ejemplo, la patente estadounidense 6.875.848); incubación a un pH moderadamente ácido (pH 4,0) con o sin pepsina, plasmina y tripsina inmovilizada; fraccionamiento de plasma humano por medio de polímeros de etilenglicol (Polson et al. (1964) Biochim. Biophys. Acta. 82: 463-475), incorporación de polietilenglocol (PEG) como agente de purificación para material separado del fraccionamiento de Cohn (fracción II o II + III, véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.093.606 y 4.165.370), métodos de fraccionamiento que usan polietilenglicol como agente de precipitación, y otras técnicas descritas en las patentes estadounidenses n.os 4.093.606, 4.126.605, 3.966.906 y 4.124.576, y otros métodos similares de procedimientos de purificación con polietilenglicol (documento EP 0246579); tratamiento con B-propiolactona; cromatografía de intercambio iónico para eliminar contaminantes no deseados de los materiales de partida usados para obtener las preparaciones de IG (véanse por ejemplo, la patente estadounidense n.° 3.869.436, documentos EP 91300790 yWO 94/29334). El documento EP 0440483 describe una combinación de técnicas útiles para facilitar la preparación intravenosa del producto basándose en cromatografía de intercambio iónico y diafiltración a un pH débilmente ácido; escisión enzimática; tratamiento con disolvente/detergente; y diafiltración y ultrafiltración. También se describen en la técnica otros métodos y los conoce un experto en la técnica (véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.177.194 y 6.875.848).
Se usa comúnmente la fracción II de Cohn purificada. La pasta de fracción II de Cohn de partida normalmente tiene aproximadamente el 95 por ciento de IgG y también contiene los cuatro subtipos de IG. Los diferentes subtipos están presentes en la fracción II en aproximadamente la misma razón en la que se encuentran en el plasma humano reunido del que se obtienen. La fracción II se purifica adicionalmente antes de la formulación para dar un producto administrable. Por ejemplo, la fracción II puede disolverse en disolución de alcohol acuosa purificada fría y eliminarse las impurezas por medio de precipitación y filtración. Tras la filtración final, la suspensión de inmunoglobulina puede dializarse o diafiltrarse (por ejemplo usando membranas de ultrafiltración que tienen un límite de peso molecular nominal de menos de o igual a 100.000 daltons) para eliminar el alcohol. La disolución puede concentrarse o diluirse para obtener la concentración de proteína deseada y puede purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica.
c. Procesamiento viral
Las preparaciones de IG deben tratarse para eliminar la carga viral. Hay dos métodos de procesamiento viral: inactivación viral y reparto o eliminación viral. La inactivación viral hace que los virus sean inactivos, por ejemplo, alterando químicamente el recubrimiento de lípido o proteína, o desnaturalizando completamente el virus. A modo de ejemplo de métodos de inactivación viral se incluyen, pero sin limitarse a, calentamiento (pasteurización), tratamiento con disolvente/detergente (S/D) y exposición a un entorno ácido (bajo pH). El procedimiento de S/D es el método de inactivación viral más ampliamente usado en la industria del plasma sanguíneo, usado para inactivar virus que contienen un recubrimiento lipídico. Por ejemplo, se ha demostrado que el procedimiento de S/D tiene acción viricida contra VSV (virus de la estomatitis vesicular), virus Sindbis, VIH, VHB (virus de la hepatitis B) y VHC (virus de la hepatitis C).
La eliminación viral es un método que elimina completamente todos los virus de la muestra. A modo de ejemplo del reparto o eliminación viral se incluyen, pero sin limitarse a, fraccionamiento con etanol frío, reparto en fases o precipitación con PEG, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico o exclusión en gel y nanofilt ración.
d. Concentración de proteína
Pueden prepararse inmunoglobulinas a concentraciones variables. Por ejemplo, puede prepararse IG a concentraciones de proteína que oscilan entre el o aproximadamente el 3-25% de IG, normalmente entre el o aproximadamente el 10% y el 22%, tal como el 10% - 20% p/v. Por ejemplo, las preparaciones de IG pueden estar a o de aproximadamente el 18% al 22% de IG p/v. Las preparaciones de IG proporcionadas en el presente documento generalmente se preparan a concentraciones de IG de a o aproximadamente el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22% o más. La concentración de proteína final depende en gran medida del método de generación y purificación. Se contempla en el presente documento que pueda usarse cualquier preparación de inmunoglobulina en el presente documento para coformulaciones estables con hialuronidasa. Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar empíricamente la concentración apropiada de IG para su inclusión en las coformulaciones estables en el presente documento. La elección de la preparación de IG dependerá de una variedad de factores tales como la vía de administración, el paciente que va a tratarse y el tipo de estado que va a tratarse.
Por ejemplo, puede usarse cualquier preparación de IG conocida o existente. Éstas incluyen preparaciones de IG normalmente usadas para administración i.v. (IGIV). En general, las preparaciones de IG finales para administración intravenosa tienen una concentración de proteína de aproximadamente el 3 al 12% p/v, o normalmente el 10% p/v. Por ejemplo, IGIV está disponible comercialmente como Carimune® NF, Flebogamma® 5%, Gammagard® Liquid, Gammagard® S/D, Gamunex®, Iveegam® EN, Octagam® y Poligam® S/D. Normalmente, tales preparaciones usan un método de fraccionamiento con alcohol frío, pero difieren en los métodos usados para aislar y purificar la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
inmunoglobulina y los métodos para reducirla posible contaminación por virus.
Además, pueden usarse otras preparaciones formuladas actualmente para administración subcutánea o intramuscular en las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, preparaciones de IG para administración intramuscular y administración subcutánea están disponibles comercialmente como GamaSTAN® S/D y Vivaglobin®, respectivamente. Normalmente, tales preparaciones usan fraccionamiento con etanol frío de plasma humano y tienen una concentración de IgG de aproximadamente el 15 al 18% o del 10 al 22%, respectivamente. La solicitud estadounidense provisional n.° 61/181.606 describe la generación de una composición de inmunoglobulina altamente purificada y concentrada a partir de plasma reunido para administración subcutánea.
e. Preparaciones de IG a modo de ejemplo
i. 10% de IG
A modo de ejemplo de una preparación de IG es inmunoglobulina intravenosa (humana), 10% (IGIV, 10%, comercializada como Gammagard® Liquid, Baxter Healthcare Corporation), que es una preparación de IgG no modificada líquida, con una distribución de subclases de IgG similar a la del plasma normal. La preparación contiene regiones de fragmento cristalizable (Fe) intacto y fragmento de unión a antígeno (Fab). Las preparaciones contienen proteína 100 mg/ml, siendo al menos el 98% IgG; está presente IgA a una concentración de 37 pg/ml, y está presente IgM sólo en cantidades traza. Tiene una osmolalidad que es similar a la osmolalidad fisiológica, y no contiene azúcares añadidos, sodio o conservantes. Se formula con glicina para la estabilización a un pH de 4,6 a 5,1. El procedimiento de fabricación emplea un procedimiento de fraccionamiento con alcohol frío de Cohn-Oncley modificado y purificaciones adicionales mediante un procedimiento continuo a través del uso de cromatografía de intercambio catiónico débil y cromatografía de intercambio aniónico débil. El procedimiento de fabricación también incluye 3 etapas de eliminación o inactivación viral independientes: tratamiento con disolvente/detergente (S/D), nanofiltración e incubación a un pH bajo y temperatura elevada. La preparación de una preparación del 10% de IGIV se describe en el ejemplo 1.
ii. Preparaciones de IG de alta concentración (por ejemplo el 20% de IG)
La generación de preparaciones de inmunoglobulina de alta concentración se describe en la solicitud estadounidense provisional n.° 61/181.606. A modo de ejemplo de preparaciones que contienen el 18-22% de IG son formulaciones de inmunoglobulina líquidas altamente purificadas, isotónicas (al menos el 95% de IgG) formuladas en glicina 0,25 mM a pH de 4,4 a 4,9, representadas en los ejemplos más adelante.
Los productos de IgG de alta concentración descritos en el presente documento se producen mediante un procedimiento que tiene muchas de las mismas etapas o similares que el procedimiento de producción de preparaciones de IGIV tradicionales (por ejemplo el 10% de IG). Las etapas adicionales, ultrafiltración/diafiltración usando membranas de canales abiertos con un lavado posterior diseñado específicamente y formulación casi al final del procedimiento de producción, hacen que las composiciones de IG resultantes tengan una concentración aproximadamente dos veces más alta (200 mg/ml) en comparación con las IGIV del estado de la técnica (por ejemplo, Gammagard Liquid), sin afectar al rendimiento y la estabilidad en almacenamiento. Con la mayoría de las membranas de ultrafiltración disponibles comercialmente, no puede alcanzarse una concentración de IgG de 200 mg/ml sin pérdidas de proteína importantes. Estas membranas se bloquean pronto, en consecuencia el lavado posterior es difícil de lograr. Por tanto, tienen que usarse configuraciones de membrana de canales abiertos. Además, se emplea un procedimiento de lavado posterior específicamente diseñado para obtener la concentración de IG requerida sin pérdida de proteína significativa (pérdida de menos del 2%); la concentración de proteína superior de 200 mg/ml no afecta a la capacidad de inactivación de virus de la etapa de almacenamiento a bajo pH.
El procedimiento general de producción de la composición de IG de alta concentración incluye las siguientes etapas que se describen en detalle adicional en el ejemplo 2. En primer lugar, los crioprecipitados se separan del plasma previamente congelado para producir un “plasma crioempobrecido” líquido, que se procesa en la siguiente etapa para obtener el sobrenadante (o fraccionamiento I). El ajuste del pH y la concentración de etanol, normalmente a 7 y del 20 al 25% v/v, respectivamente, seguido por centrifugación posterior mientras se disminuye la temperatura, separa el líquido y el sólido. El precipitado de esta etapa se extrae entonces, se mezcla con sílice pirogénica, y se filtra, realizándose todas las etapas a bajas temperaturas, normalmente de 2 a 8°C. Entonces se mezcla el filtrado con polisorbato 80 y citrato de sodio deshidratado mientras se agita a de 2 a 8°C. Se obtiene entonces el precipitado G, de una manera similar a la etapa de precipitación de Cohn II, en la que se ajustan el pH y la concentración de alcohol. El precipitado G se disuelve y se filtra con un filtro de profundidad de un tamaño de poro nominal de 0,2 pm (por ejemplo, filtro Cuno VR06 o equivalente) para obtener un filtrado transparente. Tratamiento con disolvente/detergente posterior, normalmente usando Tritón X-100 al 1,0% (v/v), Tween-80 al 0,3% (v/v) y TNBP al 0,3% (v/v), a de 18 a 25°C durante al menos 60 minutos, seguido por cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico y nanofiltración usando, por ejemplo, un filtro Asahi Planova 35N o equivalente. Posterior a la nanofiltración, se concentra el filtrado hasta una concentración de proteína del 5 + 1% p/v mediante ultrafiltración. En algunos ejemplos, la ultrafiltración se lleva a cabo en un casete con un tamiz de canales
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
abiertos y la membrana de ultrafiltración tiene un punto de corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 50 kDa o menos. Tras la finalización de la etapa de ultrafiltración, el concentrado se somete a diafiltración frente a disolución de glicina 0,25 M con un pH bajo. Normalmente, el volumen de intercambio mínimo es 6 veces el volumen de concentrado original, y la disolución se concentra hasta una concentración de proteína de más del 20% p/v. Al final del procedimiento de diafiltración y concentración, el pH de la disolución es normalmente de entre 4,4 y 4,9. Para la formulación, la concentración de proteína de la disolución se ajusta entonces a justo por encima del 20% p/v, por ejemplo, el 20,4 + 0,4% p/v, con el tampón de diafiltración. La disolución a granel formulada se esteriliza adicionalmente filtrando en primer lugar a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro absoluto de 0,2 micrómetros o menos. Entonces se dispersa la disolución de manera aséptica en los recipientes finales para un sellado apropiado, tomándose muestras para pruebas. La etapa final es el almacenamiento de los recipientes sellados a de 30 a 32°C durante un periodo de tiempo prolongado, por ejemplo, de 21 a 22 días.
La incorporación de etapas de ultrafiltración y formulaciones en el procedimiento de fabricación es una mejora con respecto a los métodos de purificación y concentración de IG anteriormente usados, dando como resultado preparaciones con concentraciones de IG superiores sin pérdidas significativas de actividad de IG al tiempo que se mantiene un bajo pH en la formulación final. Normalmente, los productos tienen una concentración de proteína de al menos el 18% peso/volumen (p/v), de la cual la gran mayoría (normalmente no menos del 95%) es IgG, y un pH en el intervalo de pH 3-6, que facilita la inactivación de patógenos tales como virus que pueden estar presentes en el plasma. Debido a la alta concentración de IG y por tanto volumen reducido en la administración, las preparaciones de alta concentración son adecuadas para la administración subcutánea. En algunas realizaciones, los productos de IG tienen una viscosidad no mayor de 18 mPascalessegundo y por tanto pueden ser adecuados para administración intravenosa también. Una simple dilución puede permitir también la administración intravenosa.
2. Estabilidad en almacenamiento
Las formulaciones de IG purificadas, finales deben prepararse para que conserven la actividad de la IG y evitar una agregación excesiva. Tras el almacenamiento de las preparaciones de IG, la agregación puede minimizarse y mejorarse la estabilidad, por ejemplo, mediante la adición de excipientes estabilizantes de proteínas o ajustando el pH de la disolución.
a. Excipientes estabilizantes de proteínas
Un modo de aumentar la estabilidad de preparaciones de IG que se conoce bien en la técnica es añadir excipientes estabilizantes de proteínas a la preparación de IG. Los excipientes conocidos incluyen, pero no se limitan a, azúcares, polioles, aminoácidos, aminas, sales, polímeros y tensioactivos. Por ejemplo, la patente estadounidense 4.499.073 describe la estabilización como resultado de la fuerza iónica y el pH de la disolución en almacenamiento; la patente japonesa 54020124 da a conocer la adición de un aminoácido a una preparación intramuscular para hacer que la preparación sea estable y segura para el almacenamiento; los documentos JP 57031623 y JP 57128635 divulgan el uso de arginina y/o lisina con NaCI en preparaciones del 5 al 15% de IG para lograr estabilidad a largo plazo en una preparación intramuscular; el documento JP 4346934 da a conocer el uso de baja conductividad (menos de 1 mmho), pH de 5,3 a 5,7 y opcionalmente uno o más estabilizadores, incluyendo PEG, albúmina sérica humana y manitol; el documento US 4.439.421 enseña la adición de una macromolécula hidrófila, un poliol y otra proteína para estabilizar frente a la generación de anticomplemento; el documento US 5.945.098 da a conocer la estabilización de disoluciones isotónicas mediante la adición de aminoácidos (glicina de 0,1 a 0,3 M) y detergentes no iónicos (polisorbato y PEG); el documento US 4.186.192 da a conocer diversos aditivos, incluyendo aminoácidos; el documento WO 2005/049078 da a conocer la estabilización con maltosa, y adicionalmente, glicina hasta 0,1 M; el documento US 4.362.661 da a conocer el uso de aminoácidos neutros y básicos para conferir estabilidad en una preparación del 5% de IG. También pueden prepararse formulaciones líquidas estables usando hidratos de carbono en un medio acuoso con fuerza iónica muy baja y un pH de 4,25 (patente estadounidense n.° 4.396.608) o un pH débilmente ácido de 5-6 (documento EP 0278422).
También puede controlarse la formación de dímeros de preparaciones de IG. Por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.871.736 da a conocer preparaciones de IG, particularmente preparaciones líquidas, que contienen uno o más estabilizadores anfífilos frente a la formación de dímeros. Los estabilizadores anfífilos incluyen ácido nicotínico y sus derivados, en particular nicotinamida, y principalmente en conjunto con aminoácidos que tienen cadenas laterales lipófilas no cargadas, por ejemplo, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, prolina y valina.
b. pH
Las preparaciones de IG pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como cualquiera descrito en el presente documento. Generalmente, sin embargo, el pH de la preparación final se ajusta a un pH relativamente alto, concretamente en el intervalo de aproximadamente pH 4,0 a 7,4. Se ha encontrado que el pH de la preparación de inmunoglobulina es un factor importante en relación con el contenido en monómero de IgG del producto final. Generalmente, una preparación del 5 por ciento de inmunoglobulina tiene un pH de 4,2 + 0,5. Preparaciones del diez por ciento son lo más estables a un pH de 5,2 + 0,2. El pH óptimo se obtiene mediante
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
técnicas de formulación bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el pH óptimo puede determinarse a partir de determinaciones de cromatografía de exclusión molecular así como datos de estabilidad térmica y títulos anticomplemento de las diversas preparaciones en condiciones de pH diferentes.
D. Hialuronidasa
Se proporcionan en el presente documento coformulaciones estables que contienen inmunoglobulina y una hialuronidasa, normalmente una hialuronidasa soluble. Las hialuronidasas son miembros de una gran familia de enzimas que degradan ácido hialurónico, que es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente principal de la barrera intersticial. Catalizando la hidrólisis de ácido hialurónico, un constituyente principal de la barrera intersticial, la hialuronidasa disminuye la viscosidad del ácido hialurónico, aumentando de ese modo la permeabilidad tisular. Como tales, se han usado hialuronidasas, por ejemplo, como agente de extensión o dispersión conjuntamente con otros agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y administración. A modo de ejemplo de hialuronidasas en las coformulaciones proporcionadas en el presente documento son hialuronidasas solubles.
Hay tres clases generales de hialuronidasas; hialuronidasa de mamífero, hialuronidasa bacteriana y hialuronidasa de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos.
Las hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35) son endo-p-A/-acetil-hexosaminidasas que hidrolizan el enlace glicosídico pi—>4 del hialuronano para dar diversas longitudes de oligosacárido tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. Tienen actividades tanto hidrolítica como transglicosidasa, y pueden degradar hialuronano y sulfatas de condroitina (CS), generalmente C4-S y C6-S. Las hialuronidasas de este tipo incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas de vacas (bovinas) (SEQ ID NO: 10 y 11), ratón (SEQ ID NO: 17-19, 32), cerdo (SEQ ID NO: 20-21), rata (SEQ ID NO: 22-24, 31), conejo (SEQ ID NO: 25), oveja (ovinas) (SEQ ID NO: 26 y 27), orangután (SEQ ID NO: 28), mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), cobaya (SEQ ID NO: 30), y hialuronidasas humanas.
Las hialuronidasas de mamífero pueden subdividirse adicionalmente en las que son activas neutras, predominantemente encontradas en extractos de testículos, y activas ácidas, predominantemente encontradas en órganos tales como el hígado. Las hialuronidasas activas neutras a modo de ejemplo incluyen PH20, Incluyendo pero sin limitarse a, PH20 derivada de diferentes especies tales como ovina (SEQ ID NO: 27), bovina (SEQ ID NO: 11) y humana (SEQ ID NO: 1). PH20 humana (también conocida como SPAM1 o proteína de superficie de espermatozoide PH20), está unida generalmente a la membrana plasmática por medio de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Está implicada de manera natural en la adhesión espermatozoide-óvulo y ayuda en la penetración del espermatozoide en la capa de células del cúmulo digiriendo ácido hialurónico.
Además de PH20 humana (también denominada SPAM1), se han identificado cinco genes de tipo hialuronidasa en el genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 y HYALP1. HYALP1 es un pseudogen, y no se ha mostrado que HYAL3 (SEQ ID NO: 38) presente actividad enzlmátlca hacia ningún sustrato conocido. HYAL4 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 39) es una condroltlnasa y presenta poca actividad hacia hialuronano. HYAL1 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 36) es la enzima activa áclda prototíplca y PH20 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1) es la enzima activa neutra prototíplca. Las hialuronidasas activas ácidas, tales como HYAL1 y HYAL2 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 37) carecen generalmente de actividad catalítica a pH neutro (es decir pH 7). Por ejemplo, HYAL1 tiene poca actividad catalítica in vitro por encima de pH 4,5 (Frost et al. (1997) Anal. Biochemistry, 251: 263-269). HYAL2 es una enzima activa áclda con una actividad específica muy baja in vitro. Las enzimas de tipo hialuronidasa también pueden caracterizarse por las que se unen generalmente a la membrana plasmática por medio de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol tal como HYAL2 humana y PH20 humana (Danllkovltch-Miagkova et al. (2003) Proc Nati Acad Sel USA. 100(8): 4580-5), y las que son generalmente solubles tales como HYAL1 humana (Frost et al., (1997) Biochem Blophys Res Commun. 236(1): 10- 5).
1. PH20
PH20, como otras hialuronidasas de mamífero, es una endo-p-N-acetil-hexosamlnldasa que hldrollza el enlace glicosídico pi—>4 del ácido hialurónico para dar diversas longitudes de oligosacárido tales como tetrasacáridos y hexasacáridos. Tienen actividades tanto hidrolítica como transglicosidasa y pueden degradar ácido hialurónico y sulfatas de condroitina, tales como C4-S y C6-S. PH20 está implicada de manera natural en la adhesión espermatozoide-óvulo y ayuda en la penetración del espermatozoide en la capa de células del cúmulo digiriendo el ácido hialurónico. PH20 se ubica en la superficie del espermatozoide, y en el acrosoma derivado de lisosomas, en donde está unida a la membrana acrosómica interna. La PH20 de la membrana plasmática tiene actividad hialuronidasa sólo a pH neutro, mientras que la PH20 de la membrana acrosómica tiene actividad a pH tanto neutro como ácido. Además de ser una hialuronidasa, PH20 también parece ser un receptor para la señalización celular inducida por HA, y un receptor para la zona pelúcida que rodea al ovocito.
Las proteínas PH20 a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de PH20 humana (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2), bovina (SEQ ID NO: 11), de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
conejo (SEQ ID NO: 25), PH20 ovina (SEQ ID NO: 27), de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), de cobaya (SEQ ID NO: 30), de rata (SEQ ID NO: 31) y de ratón (SEQ ID NO: 32).
La PH20 bovina es un polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEQ ID NO: 11). La alineación de PH20 bovina con la PH20 humana muestra sólo una homología débil, existiendo múltiples huecos desde el aminoácido 470 hasta el extremo carboxilo-termlnal respectivo debido a la ausencia de un anclaje de GPI en el polipéptido bovino (véase por ejemplo, Frost Gl (2007) Expert Opin. Drug. Dellv. 4: 427-440). De hecho, no se predicen anclajes de GPI claros en muchas otras especies de PH20 además de humanos. Por tanto, los polipéptidos de PH20 producidos a partir de ovinos y bovinos existen de manera natural como formas solubles. Aunque PH20 bovina existe unida de manera muy suelta a la membrana plasmática, no está anclada por medio de un anclaje sensible a fosfollpasa (Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2): 628-36). Esta característica única de hlaluronidasa bovina ha permitido el uso de enzima hialuronidasa de testículos bovinos soluble como extracto para uso clínico (Wydase®, Hyalase®).
El transcrito de ARNm de PH20 humana se traduce normalmente para generar un polipéptido precursor de 509 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) que contiene una secuencia señal de 35 aminoácidos en el extremo N-termlnal (posiciones de residuo de aminoácido 1-35) y una secuencia señal de unión a anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de 19 aminoácidos en el extremo C-terminal (posiciones de residuo de aminoácido 491-509). La PH20 madura es, por tanto, un polipéptido de 474 aminoácidos expuesto en SEQ ID NO: 2. Tras el transporte del polipéptido precursor al ER y la eliminación del péptido señal, se escinde el péptido señal de unión a GPI C-terminal para facilitar la unión covalente de un anclaje de GPI al aminoácido C-terminal recién formado en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 490 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1. Por tanto, se produce un polipéptido maduro con anclaje de GPI de 474 aminoácidos con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.
En comparación con otras hialuronidasas, incluyendo hialuronidasa de veneno de abejas y miel y PH20 de ratón, mono y cobaya, PH20 humana contiene una región común de 340 aminoácidos con 57 aminoácidos conservados (véase por ejemplo Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247: 810-814). Los aminoácidos conservados incluyen cuatro residuos de cisterna que forman puentes disulfuro en los residuos de aminoácido 25, 189, 203 y 316 en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 (correspondientes a los residuos 60, 224, 238 y 351 en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1). Se forman enlaces disulfuro entre los residuos de cisterna C60 y C351 y entre C224 y C238 para formar el dominio de hialuronidasa central. Sin embargo, se requieren cisteínas adicionales en el extremo carboxilo-terminal para la actividad catalítica de la enzima neutra de manera que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 1 contengan el dominio de hialuronidasa PH20 humana mínimamente activo. Se forman cuatro enlaces disulfuro adicionales entre los residuos de cisterna C376 y C387; entre C381 y C435; entre C437 y C443; y entre C458 y C464 del polipéptido ejemplificado en SEQ ID NO: 1 (correspondientes a los residuos C341 y C352; entre C346 y C400; entre C402 y C408; y entre C423 y C429 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2, respectivamente).
Además, otros residuos conservados están implicados probablemente en la unión al sustrato y la catálisis. Los residuos de aminoácido en las posiciones de aminoácido 111, 113, 176, 249 y 252 correspondientes a los residuos en SEQ ID NO: 2 parecen estar implicados en la actividad de PH20, puesto que la mutación en esta posición hace que la enzima carezca de actividad enzimática o deja una actividad sólo residual en comparación con PH20 de tipo natural que no contiene las mutaciones (véase por ejemplo Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247: 810-814).
Hay siete posibles sitios de glicosilación con unión a N en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana ejemplificada en SEQ ID NO: 1. Se forman enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína C60 y C351 y entre C224 y C238 para formar el dominio de hialuronidasa central. Puesto que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 1 contienen el dominio de hialuronidasa PH20 humana mínimamente activo, no se requiere sitio de glicosilación con unión a N N-490 para lograr una actividad hialuronidasa apropiada.
2. Hialuronidasa soluble
Generalmente, la hialuronidasa en las coformulaciones estables proporcionadas en el presente documento son hialuronidasas solubles. Las hialuronidasas solubles, cuando se expresan en células, se secretan al medio. La solubilidad puede demostrarse mediante reparto de la proteína en la fase acuosa de una disolución de Tritón X-114. Por consiguiente, se entiende que una hialuronidasa soluble no incluye ninguna hialuronidasa que contenga un anclaje de GPI, que hace que el polipéptido se una a la membrana celular. Por ejemplo, PH20 humana de longitud completa (expuesta en su forma madura como SEQ ID NO: 2) contiene un anclaje de GPI y no es soluble. En cambio, polipéptidos de PH20 ovina y bovina no contienen un anclaje de GPI que sea suficiente para la unión al anclaje de GPI, y por tanto se considera que son proteínas solubles. Además, las hialuronidasas solubles que se incluyen en las coformulaciones proporcionadas en el presente documento generalmente son proteínas sustancialmente purificadas. Además, las hialuronidasas solubles conservan la actividad hialuronidasa. Por ejemplo, PH20 humana soluble conserva la actividad neutra.
Las hialuronidasas solubles incluyen hialuronidasas que no incluyen de manera natural un anclaje de GPI o un anclaje suficiente para la unión a la membrana, incluyendo, pero sin limitarse a, Hyall, PH20 bovina y PH20 ovina,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
variantes alélicas de las mismas y otras variantes. También se incluyen entre la hlaluronldasa soluble cualquier hialuronidasa que se haya modificado para que sea soluble. Por ejemplo, PH20 humana, que normalmente está anclada a la membrana por medio de un anclaje de GPI, puede hacerse soluble mediante truncamiento de y eliminación de todo o una parte del anclaje de GPI en el extremo C-terminal. Las hialuronidasas solubles también Incluyen hialuronidasas activas neutras y activas ácidas, sin embargo, se contemplan hialuronidasas activas neutras para su uso en el presente documento para fines de administración subcutánea.
Por tanto, a modo de ejemplo de una hialuronidasa soluble es PH20 de cualquier especie, tal como cualquiera expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 11, 25, 27, 30, 31 y 32, o formas truncadas de las mismas que carecen de todo o una parte del anclaje de GPI C-terminal, siempre que la hialuronidasa sea soluble y conserve la actividad hialuronidasa. También se incluyen entre las hialuronidasas solubles variantes alélicas u otras variantes de formas solubles de cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 11, 25, 27, 30, 31 y 32, tales como formas truncadas de las mismas. Un experto en la técnica conoce variantes alélicas y otras variantes, e incluyen polipéptldos que tienen una identidad de secuencia del 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95% o más con cualquiera de SEQ ID NO: 1,2, 11, 25, 27, 30 y 31, o formas truncadas de las mismas.
Normalmente, las coformulaciones en el presente documento contienen una PH20 humana soluble. Aunque pueden utilizarse PH20 de otros animales, tales preparaciones son potencialmente ¡nmunogénlcas, puesto que son proteínas animales. Por ejemplo, una proporción significativa de pacientes demuestran sensibilización previa secundaria a alimentos ingeridos, y puesto que éstas son proteínas animales, todos los pacientes tienen un riesgo de sensibilización posterior. Por tanto, preparaciones no humanas pueden no ser adecuadas para uso crónico. Si se desean preparaciones no humanas, se contempla en el presente documento que tales pollpéptidos pueden prepararse para que tengan ¡nmunogenicidad reducida. Tales modificaciones están dentro del nivel de un experto en la técnica.
a. PH20 humana soluble
A modo de ejemplo de una hialuronidasa soluble es PH20 humana soluble. Se han producido formas solubles de PH20 humana recombinante y pueden incluirse en las coformulaciones descritas en el presente documento. La producción de tales formas solubles de PH20 se describe en las solicitudes de patente estadounidense n.os 2005- 0260186 y 2006-0104968. Las formas solubles incluyen, pero no se limitan a, cualquiera que tenga truncamientos C- terminales para generar polipéptidos que contienen del aminoácido 1 al aminoácido 464 o de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO 1. Por ejemplo, las formas solubles incluyen, pero no se limitan a, cualquiera que tenga truncamientos C-terminales para generar polipéptidos que contienen del aminoácido 1 al aminoácido 467 a 483, por ejemplo, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483. Cuando se expresan en células de mamífero, la secuencia señal N-terminal de 35 aminoácidos se escinde durante el procesamiento, y la forma madura de la proteína se secreta. Por tanto, los polipéptidos solubles maduros contienen al menos los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, los polipéptidos solubles maduros contienen los aminoácidos 36 a 467 a 36 a 483 de SEQ ID NO: 1, por ejemplo 36 a 467, 477, 478, 479, 480,481, 482 y 483 de SEQ ID NO: 1. Los mutantes de deleción que terminan en la posición de aminoácido 477 a 483 (correspondientes al polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1) presentan actividad hialuronidasa secretada superior que la forma con anclaje de GPI de longitud o completa. Por tanto, a modo de ejemplo de hialuronidasas solubles son las que tienen 442, 443, 444, 445, 446 ó 447 aminoácidos de longitud, tal como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 4-9, o variantes alélicas o de especie u otras variantes de las mismas.
b. PH20 humana soluble recombinante (rHuPH20)
Se han generado formas solubles recombinantes de PH20 humana designadas como rHuPH20 y pueden producirse y purificarse usando los métodos descritos en el presente documento. La generación de tales formas solubles de rHuPH20 se describen en las solicitudes de patente estadounidense con n.° de serie 11/065.716 y 11/238.171 (publicadas como solicitudes de patente estadounidense publicada n.os US20050260186 y US 20060104968), y en los ejemplos 3 más adelante. A modo de ejemplo de tales polipéptidos son los generados a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica para los aminoácidos 1-482 expuestos en SEQ ID NO: 3. El procesamiento postraduccional elimina la secuencia señal de 35 aminoácidos, dando como resultado la secreción de una rHuPH20 soluble de 447 aminoácidos (SEQ ID NO: 4). La rHuPH20 purificada resultante puede ser heterogénea debido a peptidasas presentes en el medio de cultivo tras la producción y purificación. Normalmente, rHuPH20 se produce en células que facilitan la N-glicosilación correcta para conservar la actividad, tales como células CHO (por ejemplo células DG44 CHO).
3. Gllcosllación
La gllcosllación, incluyendo glicosilación con unión a N y O, de algunas hialuronidasas puede ser muy importante para su actividad catalíltica y estabilidad. Aunque alterar el tipo de glicano que modifica una gllcoproteína puede tener efectos drásticos sobre la antlgenicidad, plegamlento estructural, solubilidad y estabilidad de una proteína, no se cree que la mayoría de las enzimas requieran glicosilación para lograr una actividad enzimática óptima. Tales hialuronidasas son únicas en este sentido, ya que la eliminación de la glicosilación con unión a N puede dar como
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
resultado una inactivación casi completa de la actividad hialuronidasa. Para tales hialuronidasas, la presencia de glicanos con unión a N es crítica para la generación de una enzima activa.
Los oligosacáridos con unión a N pertenecen a varios tipos principales (de oligomanosa, complejos, híbridos, sulfatados), todos los cuales tienen núcleos de (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc unidos por medio del nitrógeno de amida de residuos de Asn que se encuentran dentro de secuencias de Asn-Xaa-Thr/Ser (donde Xaa no es Pro). Se ha notificado la glicosilación en un sitio Asn-Xaa-Cys para la proteína de coagulación C. En algunos casos, la hialuronidasa puede contener enlaces tanto N-glicosídicos como O-glicosídicos. Por ejemplo, PH20 tiene oligosacáridos con unión a O así como oligosacáridos con unión a N. Hay siete posibles sitios de glicosilación con unión a N en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana ejemplificada en SEQ ID NO: 1. Tal como se indicó anteriormente, no se requiere la glicosilación con unión a N en N490 para la actividad hialuronidasa.
4. Modificaciones de hialuronidasas para mejorar sus propiedades farmacocinéticas
Las hialuronidasas proporcionadas en las coformulaciones pueden modificarse para mejorar sus propiedades farmacocinéticas, tal como aumentar su semivida in vivo y/o actividades. La modificación de hialuronidasas para su uso en coformulaciones proporcionadas en el presente documento puede incluir unir, directa o indirectamente por medio de un ligador, tal como covalentemente o mediante otro enlace estable, un polímero, tal como dextrano, un polietilenglicol (pegilación (PEG)) o resto sialilo, u otro de tales polímeros, tales como polímeros naturales o de azúcar.
Se sabe que la pegilación de productos terapéuticos aumenta la resistencia a la proteólisis, aumenta la semivida plasmática y disminuye la antigenicidad e inmunogenicidad. La unión covalente u otra unión estable (conjugación) de moléculas poliméricas, tales como resto polietilenglicol (PEG), a la hialuronidasa puede conferir por tanto propiedades beneficiosas a la composición de enzima-polímero resultante. Tales propiedades incluyen biocompatibilidad mejorada, extensión de la semivida de la proteína (y actividad enzimática) en la sangre, células y/o en otros tejidos dentro de un sujeto, protección eficaz de la proteína frente a proteasas e hidrólisis, biodistribución mejorada, farmacocinética y/o farmacodinámica potenciadas, y solubilidad en agua aumentada.
Los polímeros a modo de ejemplo que pueden conjugarse con la hialuronidasa incluyen homopolímeros naturales y sintéticos, tales como polioles (es decir poli-OH), poliaminas (es decir P0N-NH2) y ácidos policarboxílicos (es decir poli-COOH), y heteropolímeros adicionales, es decir polímeros que contienen uno o más grupos de acoplamiento diferentes por ejemplo un grupo hidroxilo y grupos amina. Los ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas incluyen moléculas poliméricas seleccionadas de entre poli(óxidos de alquileno) (PAO), tales como polialquilenglicoles (PAG), incluyendo polietilenglicoles (PEG), metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, PEG-glicidil éteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), polietilenglicoles ramificados (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D,L-aminoácidos, polietileno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico, dextranos incluyendo carboximetil-dextranos, heparina, albúmina homologa, celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa, hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietil-almidones e hidroxipropil-almidones, glucógeno, agarosas y derivados de los mismos, goma guar, pululano, inulina, goma xantana, carragenanos, pectina, hidrolizados de ácido algínico y biopolímeros.
Normalmente, los polímeros son poli(óxidos de alquileno) (PAO), tales como poli(óxidos de etileno), tales como PEG, normalmente mPEG, que, en comparación con polisacáridos tales como dextrano, pululano y similares, tienen pocos grupos reactivos que puedan reticularse. Normalmente, los polímeros son moléculas poliméricas no tóxicas tales como (m)polietilenglicol (mPEG) que pueden conjugarse covalentemente con la enzima que degrada hialuronano (por ejemplo, con grupos de unión en la superficie de la proteína) usando una química relativamente sencilla.
Las moléculas poliméricas adecuadas para la unión a la enzima que degrada hialuronano incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) y derivados de PEG tales como metoxipolietilenglicoles (mPEG), PEG-glicidil éteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), PEG ramificados y poli(óxido de etileno) (PEO) (véanse por ejemplo Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris y Zalipsky (eds.) “Poly(ethylen glycol), Chemistry and Biological Applications” ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1): 125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003); y Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004). La molécula polimérica puede ser de un peso molecular que oscila normalmente entre aproximadamente 3 kDa y aproximadamente 60 kDa. En algunas realizaciones la molécula polimérica que se conjuga con una proteína, tal como rHuPH20, tiene un peso molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más de 60 kDa.
Se conocen en la técnica diversos métodos de modificación de polipéptidos uniendo covalentemente (conjugando) un PEG o derivado de PEG (es decir “pegilación”) (véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 2006/0104968; U.S. 5.672.662; U.S. 6.737.505; y U.S. 2004/0235734). Las técnicas para la pegilación incluyen, pero no se limitan a, ligadores especializados y químicas de acoplamiento (véase, por ejemplo, Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), unión de múltiples restos de PEG a un único sitio de conjugación (tal como mediante el uso de PEG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ramificados; véase, por ejemplo, Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), monopegilación y/o pegilación específica de sitio (véase, por ejemplo, Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y pegllaclón enzimática dirigida al sitio (véase, por ejemplo, Sato, Adv. Drug Dellv. Rev., 54:487-504, 2002) (véanse también, por ejemplo, Lu y Félix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu y Félix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Félix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95; véanse también, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). Los métodos y las técnicas descritos en la técnica pueden producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 PEG o derivados de PEG unidos a una única molécula de proteína (véase, por ejemplo, el documento U.S. 2006/0104968).
Se han descrito en la técnica numerosos reactivos para la pegllaclón. Tales reactivos incluyen, pero no se limitan a, PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS), succinimidil-mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, alfa- metilbutanoato de mPEG-succinimidilo, propionato de mPEG-succinimidilo, butanoato de mPEG-succinimidilo, éster succinimidílico del ácido mPEG-carboximetil-3-hidroxibutanoico, propionato de PEG-succinimidilo homobifuncional, PEG-propionaldehído homobifuncional, PEG-butlraldehído homobifuncional, PEG-malelmlda, PEG-hldrazida, p- nitrofenil-carbonato-PEG, carbonato de mPEG-benzotrlazol, proplonaldehído-PEG, mPEG-butlraldehfdo, mPEG2- butiraldehído ramificado, mPEG-acetilo, mPEG-piperidona, mPEG-metilcetona, mPEG-maleimida “sin ligador”, mPEG-vinilsulfona, mPEG-tiol, mPEG-ortopiridiltioéster, mPEG-ortopiridildisulfuro, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona-PEG-NHS, acrilato-PEG-NHS, fluorescefna-PEG-NHS y biotina-PEG-NHS (véanse, por ejemplo, Monfardini ef al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; los documentos U.S. 5.672.662; U.S. 5.932.462; U.S. 6.495.659; U.S. 6.737.505; U.S. 4.002.531; U.S. 4.179.337; U.S. 5.122.614; U.S. 5.183.550; U.S. 5.324.844; U.S. 5.446.090; U.S. 5.612.460; U.S. 5.643.575; U.S.

5.766.581; U.S. 5.795.569; U.S. 5.808.096; U.S. 5.900.461; U.S. 5.919.455; U.S. 5.985.263; U.S. 5.990.237; U.S.

6.113.906; U.S. 6.214.966; U.S. 6.258.351; U.S. 6.340.742; U.S. 6.413.507; U.S. 6.420.339; U.S. 6.437.025; U.S.

6.448.369; U.S. 6.461.802; U.S. 6.828.401; U.S. 6.858.736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S.
2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; U.S. 2005/000360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; y WO 0187925).
E. Métodos de producción de ácidos nucleicos que codifican para una hialuronidasa soluble y polipéptidos de la misma
Pueden obtenerse polipéptidos de una hialuronidasa soluble expuestos en el presente documento mediante métodos bien conocidos en la técnica para la purificación de proteínas y la expresión de proteínas recombinantes. Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la técnica para la identificación de ácidos nucleicos que codifican para genes deseados. Puede usarse cualquier método disponible en la técnica para obtener un ADNc de longitud completa (es decir, que engloba toda la región codificante) o clon de ADN genómico que codifica para una hialuronidasa, tal como de una fuente de células o tejido. Pueden modificarse por ingeniería genética hialuronidasas solubles modificadas o variantes, a partir de un polipéptido de tipo natural, tal como mediante mutagénesls dirigida al sitio. Normalmente, las hialuronidasas, incluyendo hialuronidasas solubles tales como rHuPH20, usadas en las coformulaclones proporcionadas en el presente documento pueden producirse de manera recomblnante o pueden purificarse o purificarse parcialmente de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, de extractos de testículos.
Los polipéptidos pueden clonarse o aislarse usando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Tales métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y examen de bibliotecas, incluyendo examen de hibridación de ácido nucleico, examen basado en anticuerpos y examen basado en actividad.
Pueden usarse métodos para la amplificación de ácidos nucleicos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido deseado, incluyendo por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la pollmerasa (PCR). Puede usarse un material que contiene ácido nucleico como material de partida a partir del cual puede aislarse una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido deseado. Por ejemplo, pueden usarse preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos tlsulares, muestras de fluido (por ejemplo sangre, suero, saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos en los métodos de amplificación. Pueden usarse también bibliotecas de ácido nucleico como fuente de material de partida. Pueden diseñarse cebadores para amplificar un polipéptido deseado. Por ejemplo, pueden diseñarse cebadores basándose en secuencias expresadas a partir de las cuales se genera un polipéptido deseado. Pueden diseñarse cebadores basándose en la traducción inversa de una secuencia de aminoácidos de polipéptido. Pueden secuenciarse las moléculas de ácido nucleico generadas mediante amplificación y confirmarse para codificar un polipéptido deseado.
Pueden unirse secuencias de nucleótidos adicionales a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido, incluyendo secuencias de ligador que contienen sitios de endonucleasas de restricción para el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN que codifican para la proteína de núcleo. Además, pueden unirse
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
operativamente secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido. Los ejemplos de tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias de promotor diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelulares, y secuencias de secreción, por ejemplo secuencias señal heterólogas, diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Tales secuencias las conocen los expertos en la técnica. Pueden unirse también secuencias de residuos de nucleótido adicionales tales como secuencias de bases que especifican regiones de unión a proteínas a moléculas de ácido nucleico que codifican para una enzima. Tales regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias de residuos que facilitan o codifican para proteínas que facilitan la captación de una enzima dentro de células diana específicas, o de lo contrario alteran la farmacocinética de un producto de un gen sintético. Por ejemplo, pueden unirse enzimas a restos de PEG.
Además, pueden añadirse etiquetas u otros restos, por ejemplo, para ayudar en la detección o purificación por afinidad del polipéptido. Por ejemplo, pueden unirse también secuencias de residuos de nucleótido adicionales tales como secuencias de bases que especifican para una etiqueta epitópica u otro marcador detectable a moléculas de ácido nucleico que codifican para una enzima. A modo de ejemplo de tales secuencias se incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican para una etiqueta de His (por ejemplo, 6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO: 54) o etiqueta Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 55).
Los ácidos nucleicos identificados y aislados pueden insertarse entonces en un vector de clonación apropiado. Puede usarse un gran número de sistemas de vector-huésped conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula huésped usada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como derivados de plásmido pCMV4, pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión HZ24 ejemplificado en el presente documento. La inserción en un vector de clonación puede lograrse, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos terminales cohesivos complementarios. La inserción puede efectuarse usando vectores de clonación TOPO (INVITROGEN, Carlsbad, CA). Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Alternativamente, puede producirse cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (ligadores) en los extremos terminales del ADN; estos ligadores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican para secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de la proteína pueden modificarse mediante prolongación homopolimérica. Pueden introducirse moléculas recombinantes en células huésped por medio de, por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generan muchas copias de la secuencia génica.
En realizaciones específicas, la transformación de células huésped con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de la proteína aislado, ADNc o secuencia de ADN sintetizada, permite la generación de múltiples copias del gen. Por tanto, el gen puede obtenerse en grandes cantidades haciendo crecer transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado. Generalmente, se producen hialuronidasas, incluyendo formas solubles de PH20, usando sistemas de expresión de proteínas que facilitan la N-glicosilación correcta para garantizar que el polipéptido conserva la actividad, puesto que la glicosilación es importante para la actividad catalítica y estabilidad de hialuronidasas. Tales células incluyen, por ejemplo células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo células DG44 CHO).
1. Vectores y células
Para la expresión recombinante de una o más de las proteínas deseadas, tales como cualquiera descrita en el presente documento, el ácido nucleico que contiene toda o una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia que codifica para la proteína insertada. Las señales de transcripción y traducción necesarias pueden suministrarse también por el promotor nativo para genes de enzimas, y/o sus regiones flanqueantes.
Se proporcionan también vectores que contienen un ácido nucleico que codifica para la enzima. Se proporcionan también células que contienen los vectores. Las células incluyen células eucariotas y procariotas, y los vectores son cualquiera adecuado para su uso en las mismas.
Se proporcionan células procariotas y eucariotas, incluyendo células endoteliales, que contienen los vectores. Tales células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células vegetales, células de insecto y células animales. Las células se usan para producir una proteína de las mismas haciendo crecer las células descritas anteriormente en condiciones mediante las cuales la proteína codificada se expresa por la célula, y recuperando la proteína expresada. Para fines en el presente documento, por ejemplo, la enzima puede secretarse al medio.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de hialuronidasa soluble acoplados a la secuencia señal nativa o heteróloga, así como múltiples copias de los mismos. Los vectores pueden seleccionarse para la expresión de la proteína enzimática en la célula o de manera que la proteína enzimática se exprese como una proteína secretada.
Puede usarse una variedad de sistemas de huésped-vector para expresar la secuencia que codifica para la proteína. Estos incluyen pero no se limitan a sistemas de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo virus vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN de plásmido o ADN de cósmido. Los elementos de expresión de vectores varían en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema de huésped-vector usado, puede usarse uno cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados.
Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que contiene señales de control de la transcripción/traducción apropiadas y secuencias que codifican para la proteína. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas de síntesis y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican para la proteína, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de la misma, puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de la misma se expresan en un huésped transformado con la(s) molécula(s) de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede controlarse mediante cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. En una realización específica, el promotor no es nativo para los genes para lograr una proteína deseada. Los promotores que pueden usarse incluyen pero no se limitan a el promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga en 3’ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), el promotor de timidina cinasa de herpes (Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expresión procariotas tales como el promotor de p-lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:5543) o el promotor tac (DeBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); véase también “Useful Proteins from Recombinant Bacteria”: en Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expresión de plantas que contienen el promotor de nopalina sintetasa (Herrara-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) o el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella etal., Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de levadura y otros hongos tal como el promotor de Gal4, el promotor de alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol cinasa, el promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional de animales que presentan especificidad de tejido y se han usado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Coid Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); la región de control del gel de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), la región de control del virus del tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), la región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinckert et al., Genes y Devel. 1:268-276 (1987)), la región de control del gen de alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf ef al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), la región de control del gen de alfa-1 antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., Genes y Devel. 1: 161-171 (1987)), la región de control del gen de beta globina que es activa en células mieloides (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), la región de control del gen la proteína básica de la mielina que es activa en células de oligodendrocitos del cerebro (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), la región de control del gen de cadena ligera 2 de la miosina que es activa en el músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), y la región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que es activa en gonadotrofos del hipotálamo (Masón et al., Science 234:1372-1378 (1986)).
En una realización específica, se usa un vector que contiene un promotor operativamente unido a ácidos nucleicos que codifican para una proteína deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo de la misma, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibiótico). Los vectores de plásmido a modo de ejemplo para la transformación de células E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA; véase también la bibliografía publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tienen un promotor de fago T5 (reconocido por la ARN polimerasa de E. coli) y un módulo de represión de operador lac doble para proporcionar expresión de alto nivel, estrechamente regulada de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de unión al ribosoma sintético (RBS II) para lograr una traducción eficaz, una secuencia que codifica para etiqueta de 6XHis, terminadores de la transcripción t0 y T1, origen de replicación ColE1 y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de una etiqueta de 6xHis en el extremo o bien N- o bien C-terminal de la proteína recombinante. Tales plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30 y pQE 31 que proporcionan múltiples sitios de clonación para los tres marcos de lectura y proporcionan la expresión de proteínas etiquetadas con 6xHis en el extremo N-terminal. Otros vectores de plásmido a modo de ejemplo para la transformación de células £. coli
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase la patente estadounidense 4.952.496; disponible de NOVAGEN, Madison, Wl; véase también la bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema). Tales plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T71ac, terminador T7, el operador lac de E. coli inducible y el gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor T7, terminador T7, y la señal de secreción ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (NOVAGEN, Madison, Wl), que contienen una secuencia líder His-Tag™ para su uso en la purificación con una columna His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión tras la purificación sobre la columna, la región promotora T7-lac y el terminador T7.
Un vector a modo de ejemplo para la expresión en células de mamífero es el vector de expresión HZ24. El vector de expresión HZ24 se derivó de la estructura principal del vector pCI (Promega). Contiene ADN que codifica para el gen de resistencia a beta-lactamasa (AmpR), un origen de replicación F1, una región potenciadora/promotora temprana inmediata de citomegalovirus (CMV) y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El vector de expresión tiene también un sitio interno de entrada al ribosma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) de ratón.
2. Expresión
Pueden producirse polipéptidos de hialuronidasa soluble mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica incluyendo métodos in vivo e in vitro. Pueden expresarse proteínas deseadas en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de las proteínas, tales como por ejemplo, necesarias para la administración y el tratamiento. Los huéspedes de expresión incluyen organismos procariotas y eucariotas tales como E. coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero, incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los huéspedes de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas así como los tipos de modificación postraduccional que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del huésped de expresión puede hacerse basándose en estos y otros factores, tales como consideraciones regulatorias y de seguridad, los costes de producción y la necesidad y los métodos para la purificación.
Están disponibles muchos vectores de expresión y los conocen los expertos en la técnica y pueden usarse para la expresión de proteínas. La elección del vector de expresión estará influida por la elección del sistema de expresión del huésped. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores de la transcripción y opcionalmente potenciadores, señales de traducción, y señales de terminación de la transcripción y traducción. Los vectores de expresión que se usan para la transformación estable tienen normalmente un marcador selecclonable que permite la selección y el mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, puede usarse un origen de replicación para amplificar el número de copias del vector.
Pueden utilizarse también o expresarse como fusiones de proteínas polipéptidos de hialuronidasa soluble. Por ejemplo, puede generarse una fusión enzimática para añadir funcionalidad adicional a una enzima. Los ejemplos de proteínas de fusión enzimáticas incluyen, pero no se limitan a, fusiones de una secuencia señal, una etiqueta tal como para la localización, por ejemplo una etiqueta de h¡S6 o una etiqueta myc, o una etiqueta para la purificación, por ejemplo, una fusión con GST, una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o la asociación a la membrana.
a. Células procariotas
Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. La transformación de E. coli es una técnica sencilla y rápida bien conocida por los expertos en la técnica. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles, tales promotores son útiles para inducir altos niveles de expresión de proteína y para expresar proteínas que presentan alguna toxicidad para las células huésped. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6 y el promotor XPL regulado por temperatura.
Pueden expresarse proteínas, tales como cualquiera proporcionada en el presente documento, en el entorno citoplasmático de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y, para algunas moléculas, esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Pueden usarse agentes reductores tales como ditiotreitol y P-mercaptoetanol y desnaturalizantes, tales como guanidina-HCI y urea para resolubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo es la expresión de proteínas en el espacio periplásmico de bacterias, lo que proporciona un entorno oxidante y de tipo chaperonina y disulfuro isomerasas y puede conducir a la producción de proteína soluble. Normalmente, se fusiona una secuencia líder con la proteína que va a expresarse que dirige la proteína al periplasma. El líder se elimina entonces mediante peptidasas señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias líder de direccionamiento periplasmático incluyen el líder pelB del gen de pectato Nasa y el líder derivado del gen de fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplasmática permite el escape de la proteína expresada al medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y sencilla a partir del sobrenadante de cultivo. Pueden obtenerse proteínas que no se secretan a partir del periplasma mediante lisis osmótica. Similar a la expresión citoplasmática, en algunos casos las proteínas pueden volverse insolubles y pueden usarse desnaturalizantes y agentes de reducción para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de inducción y el crecimiento pueden influir también en los niveles de expresión y solubilidad, se usan normalmente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
temperaturas de entre 25°C y 37°C. Normalmente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas. Por tanto, si las proteínas requieren glicosilaclón para su función, puede añadirse glicosilación in vitro tras la purificación a partir de las células huésped.
b. Células de levadura
Levaduras tales como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolítica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son huéspedes de expresión de levaduras bien conocidos que pueden usarse para la producción de proteínas, tales como cualquiera descrita en el presente documento. La levadura puede transformarse con vectores de replicación episomales o mediante integración cromosómica estable mediante recombinación homologa. Normalmente, se usan promotores inducibles para regular la expresión génica. Los ejemplos de tales promotores incluyen promotores de GAL1, GAL7 y GAL5 y metalotioneína, tales como CUP1, AOX1 u otro promotor de Pichia u otro de levadura. Los vectores de expresión incluyen a menudo un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para la selección y el mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en levadura son a menudo solubles. La coexpresión con chaperoninas tales como Bip y proteína disulfuro isomerasa puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en levadura pueden dirigirse a la secreción usando fusiones con péptidos señal de secreción tales como la señal de secreción factor alfa de tipo acoplamiento de levadura de Saccharomyces cerevisae y fusiones con proteínas de superficie celular de levadura tales como el receptor de adhesión de acoplamiento Aga2p o la glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Puede introducirse por ingeniería genética un sitio de escisión de proteasa tal como para la proteasa Kex-2 para eliminar las secuencias fusionadas a partir de los polipéptidos expresados a medida que salen de la ruta de secreción. La levadura puede glicosilar también en motivos Asn-X-Ser/Thr.
c. Células de insecto
Las células de insecto, particularmente usando expresión de baculovirus, son útiles para expresar polipéptidos tales como polipéptidos de hialuronidasa. Las células de insecto expresan altos niveles de proteína y pueden realizar la mayoría de las modificaciones postraduccionales usadas por eucariotas superiores. Los baculovirus tienen una gama de huéspedes restringida que mejora la seguridad y reduce los problemas regulatorios de la expresión en eucariotas. Los vectores de expresión típicos usan un promotor para la expresión a alto nivel tal como el promotor de polihedrina de baculovirus. Los sistemas de baculovirus comúnmente usados incluyen los baculovirus tales como el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), y el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx morí (BmNPV) y una línea celular de insectos tal como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para la expresión a alto nivel, la secuencia de nucleótidos de la molécula que va a expresarse se fusiona inmediatamente en el sentido de 3’ del codón de iniciación de polihedrina del virus. Se procesan de manera precisa señales de secreción de mamíferos en células de insecto y pueden usarse para secretar la proteína expresada al medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a sistemas de células de mamíferos.
Un sistema de expresión alternativo en células de insecto es el uso de células transformadas de manera estable. Pueden usarse para la expresión líneas celulares tales como las células Schneider 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y células C7 (Aedes albopictus). El promotor de metalotioneína de Drosophila puede usarse para inducir altos niveles de expresión en presencia de inducción con metales pesados con cadmio o cobre. Los vectores de expresión se mantienen normalmente mediante el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.
d. Células de mamífero
Pueden usarse sistemas de expresión de mamíferos para expresar proteínas incluyendo polipéptidos de hialuronidasa soluble. Pueden transferirse constructos de expresión a células de mamífero mediante infección viral tal como adenovirus o mediante transferencia de ADN directa tal como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación y microinyección. Los vectores de expresión para células de mamífero incluyen normalmente un sitio de caperuza de ARNm, una caja TATA, una secuencia de inicio de la traducción (secuencia consenso Kozak) y elementos de poliadenilación. Pueden añadirse también elementos IRES para permitir la expresión bicistrónica con otro gen, tal como un marcador seleccionable. Tales vectores incluyen a menudo promotores-potenciadores de la transcripción para la expresión de alto nivel, por ejemplo el promotor- potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus (CMV) humano y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (VSR). Estos promotores-potenciadores son activos en muchos tipos de células. Pueden usarse también para la expresión regiones potenciadoras y promotores de tipo tisular y celular. Las regiones promotoras/potenciadoras a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, las de genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus de tumor mamario de ratón, albúmina, alfa fetoproteína, alfa 1 antitripsina, beta globina, proteína básica de la mielina, cadena ligera 2 de miosina y control del gen de hormona liberadora gonadotrópica. Pueden usarse marcadores seleccionables para seleccionar y mantener células con el constructo de expresión. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforibosil transferasa, aminoglicósido fosfotransferasa,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina cinasa. Por ejemplo, la expresión puede realizarse en presencia de metotrexato para seleccionar sólo las células que expresan el gen de DHFR. La fusión con moléculas de señalización de la superficie celular tales como TCR-2, y FceRI-y puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo sobre la superficie celular.
Están disponibles muchas líneas celulares para la expresión en mamíferos incluyendo células de ratón, rata, humano, mono, pollo y hámster. Las líneas celulares a modo de ejemplo Incluyen pero no se limita a células CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretora) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 y HKB. También están disponibles líneas celulares adaptadas a medios libres de suero que facilita la purificación de proteínas secretadas a partir del medio de cultivo celular. Los ejemplos incluyen células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, n.° de cat. 11619-012) y la línea celular EBNA-1 libre de suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.). También están disponibles líneas celulares que están adaptadas a crecer en medios especiales optimizados para lograr una expresión máxima. Por ejemplo, las células DG44 CHO están adaptadas a crecer en cultivo en suspensión en un medio químicamente definido, libre de productos animales.
e. Plantas
Pueden usarse plantas y células vegetales transgénicas para expresar proteínas tales como cualquiera descrita en el presente documento. Normalmente se transfieren constructos de expresión a plantas usando transferencia de ADN directa tal como bombardeo con microproyectiles y transferencia mediada por PEG al interior de protoplastos, y con transformación mediada por Agrobacteríum. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias de promotor y potenciador, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y las técnicas de transformación se dividen habitualmente entre huéspedes dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco, y huéspedes monocotiledóneos, tales como maíz y arroz. Los ejemplos de promotores de plantas usados para la expresión incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Se usan a menudo marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa para facilitar la selección y el mantenimiento de células transformadas. Pueden mantenerse células vegetales transformadas en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerarse para dar células completas. Las células de plantas transgénicas pueden incluir también algas modificadas por ingeniería genética para producir polipéptidos de hlaluronldasa. Debido a que las plantas tienen patrones de glicosilación diferentes de las células de mamífero, esto puede Influir en la elección de la proteína producida en estos huéspedes.
3. Técnicas de purificación
El método para la purificación de polipéptidos, incluyendo polipéptidos de hialuronidasa soluble u otras proteínas, a partir de células huésped dependerá de las células huésped y los sistemas de expresión elegidos. Para moléculas secretadas, las proteínas se purifican generalmente a partir de los medios de cultivo tras retirar las células. Para la expresión intracelular, las células pueden lisarse y las proteínas purificarse a partir del extracto. Cuando se usan para la expresión organismos transgénicos tales como plantas y animales transgénicos, pueden usarse tejidos u órganos como material de partida para preparar un extracto celular lisado. Adicionalmente, la producción en animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que pueden recogerse, y si es necesario, las proteínas pueden extraerse y purificarse adicionalmente usando métodos convencionales en la técnica.
Pueden purificarse proteínas, tales como polipéptidos de hialuronidasa soluble, usando técnicas de purificación de proteínas convencionales conocidas en la técnica incluyendo pero sin limitarse a, SDS-PAGE, fraccionamiento por tamaño y cromatografía de exclusión molecular, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio ionico, tal como intercambio aniónico. Pueden utilizarse también técnicas de purificación por afinidad para mejorar la eficacia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos, receptores y otras moléculas que se unen a enzimas hialuronidasa en la purificación por afinidad. Pueden modificarse también por ingeniería genética constructos de expresión para añadir una etiqueta de afinidad a una proteína tal como un epítopo myc, fusión con GST o H¡S6 y purificarse por afinidad con anticuerpo frente a myc, resina de glutatión y resina de Ni, respectivamente. La pureza puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo electroforesis en gel y técnicas de tinción y espectrofotométricas.
F. Preparación, formulación y administración de inmunoglobulinas y polipéptidos de hialuronidasa soluble
Se proporcionan en el presente documento coformulaciones de IG y hialuronidasa que son estables como una formulación líquida durante periodos de tiempo prolongados de al menos 6 meses a temperaturas de hasta 32°C, por ejemplo, que oscilan entre o aproximadamente 0°C y 32°C. El aumento de estabilidad se caracteriza por un tiempo de almacenamiento mejorado, fragmentación disminuida, formación de agregados disminuida, formación de dímeros disminuida o/y alteración del color disminuida, al tiempo que se conserva la actividad de la IG y hialuronidasa. Tales coformulaciones pueden proporcionarse como una formulación líquida “lista para usar” sin reconstitución adicional y/o sin ningún requisito de dilución adicional. Las coformulaciones estables resultantes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
pueden dispensarse convenientemente a médicos o pacientes en formas de dosificación para inyección o administración directa. Por ejemplo, las coformulaciones pueden infundirse o inyectarse en el hogar o en cualquier lugar.
Las hialuronidasas solubles que se formulan conjuntamente con ¡nmunoglobulina permiten la administración potenciada de ¡nmunoglobulina a sitios deseados dentro del cuerpo aumentando la biodisponibilidad de la ¡nmunoglobulina. Por tanto, las coformulaciones logran concentraciones elevadas y/o más rápidamente logradas de la ¡nmunoglobulina tras la administración subcutánea en comparación con métodos de administración subcutánea convencionales, para proporcionar, por ejemplo, una respuesta más potente y/o más rápida para una dosis dada. Además, las coformulaciones de IG que contienen hialuronidasas solubles también permiten que se administren dosis inferiores de IG logrando una respuesta dada con una dosis inferior de IG administrada. Finalmente, la capacidad de una hialuronidasa soluble para potenciar el flujo de fluido a granel en y cerca de un sitio de inyección o infusión también puede mejorar otros aspectos de la administración farmacológica asociada. Por ejemplo, el aumento en el flujo de fluido a granel puede ayudar a permitir que el volumen de fluido inyectado se disperse más rápidamente desde el sitio de inyección (reduciendo potencialmente el dolor u otras consecuencias adversas de la inyección). Esto es particularmente importante para infusiones subcutáneas para permitir que se administren dosis superiores. Además de la biodisponibilidad aumentada, la coformulación de IG con hialuronidasa proporciona una vía de administración más segura o más conveniente en comparación con vías de administración intravenosas convencionales.
Las coformulaciones proporcionadas en el presente documento son estables durante periodos de tiempo prolongados, incluyendo a temperaturas variables. Por ejemplo, las coformulaciones proporcionadas en el presente documento son estables y conservan la actividad de la IG y hialuronidasa a temperaturas de hasta 32°C durante al menos 6 meses. Por ejemplo, las coformulaciones son estables a temperaturas de “nevera”, por ejemplo de 2°C a 8°C, tal como a o aproximadamente 4°C, durante al menos de 6 meses a 4 años, tal como de 1 año a 2 años, por ejemplo 6 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 3 años o al menos 4 años o más. En otro ejemplo, las coformulaciones son estables y conservan la actividad a temperatura ambiente, por ejemplo de 18°C a 32°C, generalmente de 20°C a 32°C, tal como de 28°C a 32°C, durante al menos de 6 meses a 1 año, por ejemplo 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, o al menos 1 año o más.
En particular, las coformulaciones estables presentan niveles de bajos a indetectables de agregación y/o fragmentación de IG tras el almacenamiento durante periodos de tiempo definidos. Un experto en la técnica conoce métodos para evaluar la agregación y fragmentación, y se ejemplifican en la sección G más adelante. Generalmente, no más del 0,5% al 5% de IG, por ejemplo, no más del 5%, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2%, no más del 1% y generalmente no más del 0,5% de IG en la coformulación forma un agregado, tal como se mide mediante HPSEC u otros métodos, tras el almacenamiento durante los periodos de tiempo definidos tal como se expuso anteriormente.
Además, la IG y hialuronidasa en las coformulaciones estables proporcionadas en el presente documento conservan una o más actividades de la actividad inicial de la IG y hialuronidasa antes del almacenamiento. Un experto en la técnica está familiarizado con las actividades de IG y hialuronidasa y puede evaluar tales actividades. La sección G proporciona actividades y ensayos a modo de ejemplo para evaluar la actividad. Normalmente, las coformulaciones líquidas estables proporcionadas en el presente documento conservan tras el almacenamiento al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 100%, o más de la actividad inicial de la proteína antes del almacenamiento, generalmente al menos del 70% al 95% de la actividad inicial. Por ejemplo las coformulaciones líquidas estables conservan tras el almacenamiento más del 70%, más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, más del 98%, más del 99%, o más del 99,5% de la actividad inicial de la proteína respectiva antes del almacenamiento.
1. Formulaciones y dosificaciones
Las coformulaciones proporcionadas en el presente documento se formulan como líquidos. Las coformulaciones contienen ¡nmunoglobulina, hialuronidasa, al menos 0,05 M de una sal de cloruro de metal alcalino, por ejemplo, al menos cloruro de sodio 0,05 M (NaCI o sal) o cloruro de potasio 0,05 M (KCI). Las coformulaciones también se ajustan en el pH para limitar la agregación y conservar la actividad de la IG y hialuronidasa. En algunos ejemplos, las coformulaciones no contienen otros componentes excepto agua o disolventes adecuados. En otros ejemplos, las coformulaciones contienen además diluyentes, portadores u otros excipientes.
Normalmente, los compuestos se formulan para dar composiciones farmacéuticas usando técnicas y procedimientos bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, cuarta edición, 1985, 126). Se preparan composiciones farmacéuticamente aceptables en vista de su aprobación por una agencia reguladora u otra agencia preparándose según una farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y en humanos. La formulación debe adecuarse al modo de administración.
Las coformulaciones pueden proporcionarse como una preparación farmacéutica en forma líquida como disoluciones, jarabes o suspensiones. En forma líquida, las preparaciones farmacéuticas pueden proporcionarse como una preparación concentrada que va a diluirse hasta una concentración terapéuticamente eficaz antes de su
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
uso. Generalmente, las preparaciones se proporcionan en una forma de dosificación que no requiere dilución para su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ásteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). En otro ejemplo, pueden presentarse preparaciones farmacéuticas en forma liofilizada para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.
El pH de las coformulaciones estables proporcionadas en el presente documento es tal que la IG en la coformulación no se agrega y/o la IG y hialuronidasa conservan la actividad tal como se describe en la sección G. El pH óptimo puede obtenerse mediante técnicas de formulación conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el pH óptimo puede determinarse evaluando la agregación y actividad en condiciones de pH diferentes usando diversos métodos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la sección G. Tales ensayos o evaluación incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión molecular, determinaciones de HSPEC, datos de estabilidad térmica, títulos anticomplemento de las preparaciones y/o ensayos de actividad hialuronidasa. Normalmente, en las coformulaciones proporcionadas en el presente documento el pH puede oscilar entre 4,0 y 8,0 tal como se mide en la disolución concentrada de la coformulación. Generalmente, dentro de este intervalo, sin embargo, se desea un pH inferior para garantizar un contenido en monómero máximo. Por consiguiente, las coformulaciones proporcionadas en el presente documento tienen normalmente un pH que es de al menos o aproximadamente 4,0 a 7,4, generalmente de al menos o aproximadamente 4,0 a 6,0, y normalmente de 4,4 a 4,9. Tal como se indica, el pH indicado se mide en la disolución concentrada de la formulación. El pH puede ajustarse usando agentes de acidificación para disminuir el pH o agentes de alcalinización para aumentar el pH. Los agentes de acidificación a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, disolución de fosfato de sodio monobásica y ácido fosfórico. Los agentes de alcalinización a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, disolución de fosfato de sodio dibásico, carbonato de sodio o hidróxido de sodio.
Puede usarse cualquier tampón en la preparación de la formulación líquida proporcionada en el presente documento siempre que no afecte de manera adversa a la estabilidad de la coformulación, y soporte el intervalo de pH requisito requerido. Los ejemplos de tampones particularmente adecuados incluyen tampones succinato, acetato, fosfato, citrato, aconitato, malato y carbonato. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que las formulaciones proporcionadas en el presente documento no se limitan a un tampón particular, siempre que el tampón proporcione un grado aceptable de estabilidad del pH, o “capacidad de tamponamiento” en el intervalo indicado. Generalmente, un tampón tiene una capacidad de tamponamiento adecuada dentro de aproximadamente 1 unidad de pH de su pK (Lachman et al. 1986). La idoneidad del tampón puede estimarse basándose en las tabulaciones de pK publicadas o puede determinarse empíricamente mediante métodos bien conocidos en la técnica. El pH de la disolución puede ajustarse al punto final deseado dentro del intervalo tal como se describió anteriormente, por ejemplo, usando cualquier ácido o base aceptable.
a. Inmunoglobulina
La IG en las coformulaciones se proporciona a una concentración que es o es de aproximadamente el 5% al 22% p/v, por ejemplo, que es o es de aproximadamente 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 120 mg/ml, 150 mg/ml, 180 mg/ml, 200 mg/ml, 220 mg/ml, 250 mg/ml o más. Generalmente, la IG en la coformulación se proporciona en una cantidad que es de al menos el 10% (100 mg/ml) al 20% (200 mg/ml), por ejemplo, el 10%, el 11 %, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20% o más.
Las preparaciones de inmunoglobulina proporcionadas en el presente documento pueden formularse como composiciones farmacéuticas para uso de dosificación individual o múltiple. Normalmente, tal como se indica en otra parte en el presente documento, la IG en la coformulación se formula en una cantidad tal que está lista para su uso y no es necesaria una dilución adicional. Dependiendo de si la coformulación se proporciona como una formulación de dosificación individual o múltiple, un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad exacta de IG en la coformulación.
Generalmente, la inmunoglobulina se proporciona en una cantidad terapéuticamente eficaz para el régimen de dosificación particular. La concentración terapéuticamente eficaz puede determinarse empíricamente sometiendo a prueba los compuestos en sistemas in vitro e in vivo conocidos, tales como los ensayos proporcionados en el presente documento. La concentración de una inmunoglobulina seleccionada en la composición depende de las tasas de absorción, inactivación y excreción del complejo, las características fisicoquímicas del complejo, el programa de dosificación y la cantidad administrada así como otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se entiende que la dosificación y duración del tratamiento precisas es una función del tejido que está tratándose y puede determinarse empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o mediante extrapolación a partir de datos de prueba in vivo o in vitro. Se indica que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la edad del individuo tratado. Se entiende además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse a lo largo del tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las formulaciones, y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
que los intervalos de concentración expuestos en el presente documento son a modo de ejemplo sólo y no pretenden limitar el alcance del mismo. La cantidad de una preparación de ¡nmunoglobullna seleccionada que va a administrarse para el tratamiento de una enfermedad o un estado, por ejemplo una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG, puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, pueden emplearse ensayos in vitro y modelos animales para ayudar a Identificar Intervalos de dosificación óptimos. Por tanto, la dosificación precisa, que puede determinarse empíricamente, puede depender de la preparación de ¡nmunoglobullna particular, el régimen y programa de dosificación con la hlaluronldasa soluble, la vía de administración, el tipo de enfermedad que va a tratarse y la gravedad de la enfermedad.
Por ejemplo, pueden formularse preparaciones de IG en composiciones farmacéuticas para lograr regímenes de dosificación (dosis y frecuencias) para las que se preparan preparaciones Intravenosas (IGIV) actuales y se administran para enfermedades o estados particulares que pueden tratarse con IG. Un experto en la técnica está familiarizado con regímenes de dosificación para administración de IGIV de enfermedades o estados particulares. Por ejemplo, la sección H más adelante proporciona regímenes de dosificación (dosis y frecuencias) a modo de ejemplo de IG para enfermedades y estados particulares. Los expertos en la técnica conocen bien otros regímenes de dosificación. Si es necesario, puede determinarse empíricamente o extrapolarse un protocolo de de dosificación y duración y tratamiento particular.
Por ejemplo, pueden usarse dosis a modo de ejemplo de inmunoglobulina administrada por vía intravenosa como punto de partida para determinar dosificaciones apropiadas. Pueden determinarse niveles de dosificación basándose en una variedad de factores, tales como el peso corporal del individuo, la salud general, la edad, la actividad del compuesto específico empleado, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y el transcurso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y el juicio del médico encargado. Generalmente, las dosificaciones de inmunoglobulina son de desde o aproximadamente 100mg por kg peso corporal (es decir 100 mg/kg de PC) hasta 2 g/kg de PC. Se entiende que la cantidad que va a administrarse será una función de la indicación tratada, y que se tolerarán posiblemente los efectos secundarios. Las dosificaciones pueden determinarse empíricamente usando modelos reconocidos para cada trastorno.
En un ejemplo, se proporciona IG en una cantidad que permite la administración subcutánea de una dosis equivalente a una dosis i.v. de una vez al mes para la indicación particular que está tratándose. En un ejemplo de este tipo, pueden formularse preparaciones de inmunoglobulina para la administración de dosis individual en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de una vez al mes, pero puede proporcionarse en cantidades menores para administraciones de dosificaciones múltiples. Por ejemplo, pueden administrarse dosis de una vez al mes de preparaciones de IG diariamente, semanalmente, bisemanalmente o una vez al mes. Los regímenes de dosificación pueden continuar durante meses o años. La dosis i.v. de una vez al mes particular es una función de la enfermedad que va a tratarse, y por tanto puede variar.
Los intervalos de dosificaciones individuales a modo de ejemplo, en particular para administración subcutánea de IG, son de desde o aproximadamente 1 gramo (g) hasta 200 g, por ejemplo, 1 gramo (g), 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g o 200 g. La dosificación particular y formulación de la misma depende de la indicación y el individuo. Por ejemplo, las dosificaciones pueden administrar sede 50 mg/kg de peso corporal (PC) a 600 mg/kg, PC, por ejemplo 50 mg/kg de peso corporal (PC), 100 mg/kg de PC, 200 mg/kg de PC, 300 mg/kg de PC, 400 mg/kg de PC, 500 mg/kg de PC, 600 mg/kg de PC, o más. Si es necesario, la dosificación puede determinarse empíricamente. Para lograr tales dosificaciones, los volúmenes de coformulaciones que contienen IG administradas por vía subcutánea pueden ser de o aproximadamente 10 mi a 700 mi, por ejemplo, de 100 mi a 500ml, tal como de 200 mi a 400 mi. Por ejemplo, los volúmenes de cofomulaciones que contienen IG administradas por vía subcutánea pueden ser de o aproximadamente 10 mi, 20 mi, 30 mi, 40 mi, 50 mi, 100 mi, 200ml, 300 mi, 400 mi, 500 mi, 600 mi, 700 mi o más para administración de dosificación individual. Por ejemplo, una formulación de IG líquida del 10% (100 mg/ml) para indicaciones descritas en el presente documento puede administrarse en un volumen de 200 mi a 700 mi para lograr una dosificación individual de 20 g a 70 g de IG. En otro ejemplo, una formulación de IG líquida del 20% (200 mg/ml) para indicaciones descritas en el presente documento puede administrarse en un volumen de 100 mi a 350 mi para lograr una dosificación individual similar de 20 g a 70 g de IG. Tal como se indica, puede proporcionarse la IG en menores cantidades en la coformulación para administraciones de dosificación múltiple.
b. Hialuronidasa
La hialuronidasa seleccionada, en particular una hialuronidasa soluble, por ejemplo, rHuPH20, se incluye en la coformulación a una concentración que es de o aproximadamente 50 U/ml a 300 U/ml, por ejemplo 50 U/ml, 75 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml o 500 U/ml, normalmente de al menos 100 U/ml a 300 U/ml, generalmente a una concentración que es de 75 U/ml a 350 U/ml. Si se desea, la hialuronidasa puede proporcionarse en una forma más concentrada, por ejemplo de o aproximadamente 1000 U/ml a 5000 U/ml, tal como 1000 U/ml, 1500 unidades/ml, 2000 U/ml, 4000 U/ml o 5000 U/ml.
La hialuronidasa en la coformulación puede formularse como composiciones farmacéuticas para administración de dosificación individual o múltiple. Tal como se indicó anteriormente para IG, la hialuronidasa en la coformulación
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
normalmente se formula en una cantidad que está lista para usar de manera que no es necesaria una dilución adicional. Dependiendo de si la formulación se proporciona como una forma de dosificación individual o múltiple, un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad exacta de hialuronidasa que va a incluirse en la coformulación.
Generalmente, la hialuronidasa seleccionada, en particular una hialuronidasa soluble, por ejemplo, rHuPH20, se incluye en la coformulación en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil de la IG en ausencia de efectos secundarios no deseados en el paciente tratado. La concentración terapéuticamente eficaz puede determinarse empíricamente sometiendo a prueba los polipéptidos en sistemas in vitro e in vivo conocidos tal como usando los ensayos proporcionados en el presente documento o conocidos en la técnica (véanse por ejemplo, Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D’Souza et al.
(1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem. 247:242-246; véanse también por ejemplo, Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani et al.
(1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1997) J. Virol. Met. 65:201-207 y luego extrapolarse a partir de los mismos para dosificaciones para humanos.
Por ejemplo, una dosis terapéuticamente eficaz de hialuronidasa para administración de dosificación individual es de o aproximadamente 500 unidades a 500.000 unidades, por ejemplo, de 1000 unidades a 100.000 unidades de hialuronidasa. Por ejemplo, la hialuronidasa puede administrarse, en particular para administración subcutánea, a o aproximadamente 500 unidades, 1000 unidades, 2000 unidades, 5000 unidades, 10.000 unidades, 30.000 unidades, 40.000 unidades, 50.000 unidades, 60.000 unidades, 70.000 unidades, 80.000 unidades, 90.000 unidades, 100.000 unidades o más. Tal como se indica, la hialuronidasa puede proporcionarse en cantidades menores en la coformulación para administraciones de dosificación múltiple.
En algunos ejemplos, las dosificaciones pueden proporcionarse como una razón de IG administrada. Por ejemplo, la hialuronidasa puede administrar sede 10 U/gramo (g) a 2000 U/g o más de IG, por ejemplo, a o aproximadamente 10 U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 250 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g, 1000 U/g, 1500 U/g, 2000 U/g, 3000 U/g de IG o más. En general, la razón de hialuronidasa con respecto a IG en un producto coformulado es mayor que la razón cuando los mismos productos (IG y hialuronidasa) y la misma cantidad de IG se administran por vía subcutánea por separado, por ejemplo, en una administración de vanguardia. Por tanto, generalmente la razón es de al menos 100 U/g, y generalmente 250 U/g o más, por ejemplo de 100 U/g a 3000 U/g de IG, tal como de 250 U/g a 1000 U/g, y en particular de 250 U/g a 750 U/g, tal como 500U/g de IG. Por ejemplo, una coformulación que contiene hialuronidasa 100 U/ml, cuando se coformula con un 20% de IG (200 mg/ml), se proporciona a una razón que es o es de aproximadamente 500 U/g de IG. Normalmente, los volúmenes administrados por vía subcutánea pueden ser de o aproximadamente 10 mi a 700 mi, tal como de 50ml a 500 mi, por ejemplo de 100 mi a 400 mi para una administración de dosificación individual. Por ejemplo, los volúmenes administrados por vía subcutánea pueden ser de o aproximadamente 10 mi, 20 mi, 30 mi, 40 mi, 50 mi, 100 mi, 200 mi, 300 mi, 400 mi, 500 mi, 600 mi, 700 mi o más para administración de dosificación individual.
c. Sal de cloruro de metal alcalino
La coformulación proporcionada en el presente documento contiene una sal de cloruro de metal alcalino que es al menos 0,05 M. La sal de cloruro de metal alcalino incluye, pero no se limita a, cloruro de sodio (NaCI) o cloruro de
potasio (KCI). Normalmente, la sal de cloruro de metal alcalino, por ejemplo NaCI o KCI, se proporciona para
conservar la estabilidad y actividad de la hialuronidasa. La cantidad exacta de sal puede determinarse
empíricamente por un experto en la técnica. Por ejemplo, la cantidad de sal en las formulaciones puede
determinarse evaluando la agregación y actividad en condiciones de sal diferentes usando diversos métodos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la sección G. Normalmente, en las coformulaciones proporcionadas en el presente documento, se proporciona cloruro de sodio en una cantidad que es de o aproximadamente 0,05 M a 0,3 M, por ejemplo, a o aproximadamente 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M o más. Normalmente, la cantidad de sal es de entre 0,05 M y 0,25 M, por ejemplo 0,15M.
d. Estabilizador de aminoácido
La coformulación proporcionada en el presente documento contiene un estabilizador de aminoácido, que contribuye a la estabilidad de la preparación. El estabilizador puede ser un aminoácido no polar y básico. Los aminoácidos no polares y básicos incluyen, pero no se limitan a, alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina y prolina. Por ejemplo, el estabilizador de aminoácido es glicina o prolina, normalmente glicina. El estabilizador puede ser un aminoácido individual o pude ser una combinación de 2 o más de tales aminoácidos. Los estabilizadores de aminoácido pueden ser aminoácidos naturales, análogos de aminoácido, aminoácidos modificados o equivalentes de aminoácido. Generalmente, el aminoácido es un L-aminoácido. Por ejemplo, cuando
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
se usa prolina como estabilizador, es generalmente L-prolina. También es posible usar equivalentes de aminoácido, por ejemplo, análogos de prolina.
Generalmente, se añade a la disolución una cantidad de uno o más aminoácidos eficaz para mantener la inmunoglobulina en forma monomérica. La concentración de estabilizador de aminoácido, por ejemplo glicina, incluida en la coformulación líquida oscila entre aminoácido 0,1 M y 1 M, normalmente 0,1 M y 0,75 M, generalmente 0,2 M y 0,5 M, por ejemplo, al menos a o aproximadamente 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,75 M o más. El aminoácido, por ejemplo glicina, puede usarse en una forma de una sal farmacéuticamente aceptable, tal como clorhidrato, bromhidrato, sulfato, acetato, etc. La pureza del aminoácido, por ejemplo glicina, debe ser de al menos el 98%, al menos el 99%, o al menos el 99,5% o más.
e. Otros agentes
Opcionalmente, las coformulaciones pueden incluir portadores tales como un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra una hialuronidasa o IG. Se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, generalmente en forma purificada o forma parcialmente purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintéticos, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un portador típico cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y disoluciones de dextrosa acuosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para disoluciones inyectables.
Por ejemplo, los portadores farmacéuticamente aceptables usados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa isotónica, inyección de agua estéril, inyección de Ringer con dextrosa y lactato. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Pueden añadirse agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistátlcas a preparaciones parenterales envasadas en recipientes de múltiples dosis, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres metílicos y propílicos del ácido p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconlo y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones Incluyen fosfato y cltrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboxlmetilceluosa de sodio, hidroxipropllmetllcelulosa y pollvlnllplrrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen pollsorbato 80 (TWEENs 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilengllcol y propilenglicol para vehículos miscibles en agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.
Las composiciones pueden contener junto con un principio activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melazas, pollvlnllplrrolidona, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes de este tipo conocidos por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, puede añadirse una proteína excipiente a la coformulación que puede ser cualesquiera varias proteínas o péptidos farmacéuticamente aceptables. Generalmente, la proteína excipiente se selecciona por su capacidad para administrarse a un sujeto mamífero sin provocar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la albúmina sérica humana es muy adecuada para su uso en formulaciones farmacéuticas. Otros excipientes proteicos farmacéuticos conocidos incluyen, pero no se limitan a, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche en polvo desnatada, glicerol, propileno, glicol, agua, y etanol. El excipiente se incluye en la formulación a una concentración suficiente para prevenir la adsorción de la proteína al vial o recipiente de contención. La concentración del excipiente variará según la naturaleza del excipiente y la concentración de la proteína en la coformulación.
Una composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina, y otros de tales agentes.
2. Formas de dosificación
Las coformulaciones proporcionadas en el presente documento pueden formularse como formas de dosificación individuales o múltiples. Por ejemplo, puesto que la coformulación proporcionada en el presente documento es
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
estable a lo largo de periodos de tiempo prolongados, la coformulación puede proporcionarse en forma de dosificación múltiple para su administración a lo largo de un intervalo de días, semanas, meses o años. Por tanto, la coformulación líquida puede prepararse como formas de dosificación unitarias. La concentración del compuesto farmacéuticamente activo se ajusta de modo que una inyección proporciona una cantidad eficaz para producir el efecto farmacológico deseado. Por ejemplo, cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. La dosis exacta depende de la edad, el peso y el estado del paciente o animal tal como se conoce en la técnica.
Pueden administrarse formas de dosis unitarias en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un único recipiente que van a administrarse en forma de dosis unitaria separada. Por tanto, una forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no se separan en el envasado.
Las preparaciones parenterales de dosis unitaria se envasan en una ampolla, un vial o una jeringa con una aguja. El volumen de disolución líquida que contiene el compuesto farmacéuticamente activo es una función de la enfermedad que va a tratarse y el artículo de fabricación particular elegido para el envase. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles, tal como se conoce y se pone en práctica en la técnica. Cuando se proporciona como una preparación de múltiples dosis, la formulación puede contener un agente bacteriostático.
3. Administración
Las composiciones coformuladas proporcionadas en el presente documento se formulan normalmente para administración parenteral, por ejemplo, por la vía subcutánea. Debido al aumento de biodisponibilidad de IG en coformulaciones con hialuronidasa, las inmunoglobulinas pueden administrarse por vía subcutánea a dosificaciones y frecuencias para las que se preparan y administran preparaciones intravenosas actuales (IGIV). Las ventajas con respecto a las formulaciones subcutáneas actuales de IG es que la hialuronidasa/IG coformulada puede dar como resultado regímenes de dosificación más favorables, por ejemplo, dosificación menos frecuente. Mediante una dosificación inferior o menos frecuente, pueden reducirse efectos secundarios asociados con toxicidad. Generalmente, la farmacocinética y/o farmacodinámica de la terapia con IG subcutánea mejoran. Además, las administraciones subcutáneas de IG tienen también ventajas con respecto a las infusiones intravenosas actuales. Por ejemplo, una infusión subcutánea permite la infusión por el paciente o la familia en contraposición a una enfermera con experiencia; la infusión puede lograrse a velocidades superiores de manera que la IG se infunde en 1-3 horas en comparación con 5-10 horas para terapias con IGIV convencionales; no hay ningún requisito de venas funcionales; no ha ningún efecto secundario relacionado con la infusión tal como trombosis, cefalea, tromboflebitis y náuseas y menos probabilidad de acontecimientos adversos; y la infusión puede realizarse en el hogar o en cualquier lugar.
También se desea la administración subcutánea para garantizar que las hialuronidasas se administren de modo que alcancen el intersticio de la piel o los tejidos, degradando de ese modo el espacio intersticial para la administración posterior de la inmunoglobulina. Por tanto, se contempla la administración directa bajo la piel, tal como mediante métodos de administración subcutánea.
La administración puede ser local, tópica o sistémica dependiendo del lugar de tratamiento. La administración local a una zona que necesita tratamiento puede lograrse mediante, por ejemplo, pero sin limitarse a, infusión local, aplicación tópica, por ejemplo, conjuntamente con un apósito para heridas tras cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante. Generalmente, la administración local se logra mediante inyección, tal como a partir de una jeringa u otro artículo de fabricación que contiene un dispositivo de inyección tal como una aguja. En otro ejemplo, la administración local puede lograrse mediante infusión, que puede facilitarse mediante el uso de una bomba u otro dispositivo similar.
También se contemplan otros modos de administración. La composición farmacéutica puede formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración. La vía más adecuada en cualquier caso dado depende de una variedad de factores, tales como la naturaleza de la enfermedad, el progreso de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad, la composición particular que se usa. Otras vías de administración, tales como cualquier vía conocida por los expertos en la técnica, incluyen pero no se limitan a inyección intramuscular, intravenosa, intradérmica, intralesional, intraperitoneal, epidural, administración nasal, oral, vaginal, rectal, tópica, local, ótica, por inhalación, bucal (por ejemplo, sublingual) y transdérmica o cualquier vía. Un experto en la técnica conoce formulaciones adecuadas para tales vías.
Las composiciones también pueden administrarse con otros agentes biológicamente activos, o bien secuencialmente, de manera intermitente o en la misma composición. La administración también puede incluir sistemas de liberación controlada que incluyen formulaciones de liberación controlada y liberación controlada por dispositivo, tal como por medio de una bomba.
Se contempla en el presente documento administración subcutánea, generalmente caracterizada por inyección o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
infusión. Pueden prepararse productos inyectables en formas convencionales, o bien como disoluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Generalmente, las coformulaciones proporcionadas en el presente documento se preparan como líquidos. Los productos inyectables se diseñan para administración local y sistémica. Para fines en el presente documento, se desea administración local para la administración directa al intersticio afectado. Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para combinarse con un disolvente justo antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para combinarse con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles. Las disoluciones pueden ser o bien acuosas o bien no acuosas. Si se administran por vía intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS), y disoluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
Pueden emplearse métodos de administración para disminuir la exposición de compuestos seleccionados a procesos de degradación, tales como degradación proteolítica e intervención inmunológica por medio de respuestas antigénicas e inmunogénicas. Los ejemplos de tales métodos incluyen administración local en el sitio de tratamiento. Se ha notificado que la pegilación de compuestos terapéuticos aumenta la resistencia a la proteólisis, aumenta la semivida plasmática y disminuye la antigenicidad e inmunogenicidad. Se conocen en la técnica ejemplos de metodologías de pegilación (véanse por ejemplo, Lu y Félix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu y Félix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Félix et al., Int. J. Peptide Res., 46: 253-64, 1995; Benhar et al., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154:3088-95, 1995; véanse también, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55( 10): 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23(8 Pt 2):3S-8S). La pegilación también puede usarse en la administración de moléculas de ácido nucleico in vivo. Por ejemplo, la pegilación de adenovirus puede aumentar la estabilidad y la transferencia génica (véase, por ejemplo, Cheng et al. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51).
Cuando se administran volúmenes grandes, la administración es normalmente mediante infusión. Pueden dosificarse sujetos a velocidades de infusión a o de aproximadamente 0,5 ml/kg/PC/h a 5 ml/kg/PC/h, por ejemplo a o de aproximadamente 0,5 ml/kg/PC/h, 1 ml/kg/PC/h, 2 ml/kg/PC/h, 3 ml/kg/PC/h, 4 ml/kg/PC/h o 5 ml/kg/PC/h. La velocidad de infusión puede determinarse empíricamente, y normalmente es una función de la tolerabilidad del sujeto. Si se produce una reacción adversa durante la infusión, la velocidad puede ralentizarse hasta la velocidad inmediatamente por debajo de a la que se produjo el acontecimiento adverso. Si el acontecimiento adverso se resuelve en respuesta a la reducción de la velocidad, la velocidad de infusión puede aumentarse lentamente a criterio del médico. La infusión subcutánea de coformulaciones de IG puede facilitarse mediante gravedad, infusión con bomba o inyección de una dosis deseada, por ejemplo, una dosis de 20-30 gramos completa. Generalmente, para las infusiones pueden emplearse bombas de infusión intravenosa. Las coformulaciones de IG/hialuronidasa pueden infundirse a velocidades a o de aproximadamente 5 ml/h, 10 ml/h, 30 ml/h, 60 ml/h, 120 ml/h, 240 ml/h o 300ml/h. Las velocidades de infusión pueden aumentarse durante el transcurso del tratamiento siempre que la infusión se tolere por el paciente. Generalmente, el tiempo de administración de la infusión es de o aproximadamente 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h o más. Debido a la alta velocidad de infusión lograda mediante la administración subcutánea de IG coformulada con hialuronidasa, el tiempo de infusión es significativamente menor que para terapias con IGIV convencionales. Cuando el tiempo de infusión supera el límite deseado, puede iniciarse un segundo sitio de infusión al criterio del médico y el sujeto. El segundo sitio se inicia normalmente al menos 10 cm separado del sitio inicial.
Un experto en la técnica conoce técnicas para la infusión, y están dentro del conocimiento de un médico encargado. Generalmente, la dosis apropiada de coformulación de IG/hialuronidasa puede reunirse en una bolsa i.v. convencional. Por ejemplo, puede usarse un conjunto de infusión sin ventilación que tiene un orificio en Y cerca de su extremo. Puede insertarse una aguja de infusión subcutánea de calibre 24 en un sitio de preferencia del sujeto, aunque se recomiendan el abdomen y secundariamente los muslos debido al volumen de disolución que va a infundirse. La hialuronidasa e IG pueden proporcionarse en el mismo aparato de orificio en Y. También pueden usarse otros artículos de fabricación en el presente documento para fines de infusión por gravedad o una bomba, e incluyen, pero no se limitan a tubos, frascos, jeringas u otros recipientes.
En el caso de que una infusión no se tolere (por ejemplo, provoca reacciones locales de moderadas a graves), puede iniciarse un segundo sitio de infusión de modo que el sujeto reciba la dosificación completa.
Además, se entiende que las coformulaciones estables proporcionadas en el presente documento son propensas a regímenes de dosificación que implican una frecuencia de administración periódica. Por ejemplo, la frecuencia de dosificación puede ser diaria a lo largo de un intervalo de tiempo dado a lo largo de días consecutivos o alternos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días. En otros ejemplos, el régimen de dosificación es semanal, por ejemplo, una vez cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas o más. Por tanto, una preparación de IG/hialuronidasa puede administrarse de una vez, o puede dividirse en varias dosis más pequeñas que van a administrarse a intervalos de tiempo. Las preparaciones de IG/hialuronidasa seleccionadas pueden administrarse en una o más dosis a lo largo del transcurso de un tiempo de tratamiento por ejemplo a lo largo de varias horas, días, semanas o meses. En algunos casos, la administración
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
continua es útil. Se entiende que la dosificación precisa y el transcurso de la administración depende de la indicación y la tolerabilidad del paciente.
Además, se entiende que la dosificación y la duración del tratamiento precisas es una función de la enfermedad que está tratándose y puede determinarse empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o mediante extrapolación a partir de datos de prueba in vivo o in vitro. Debe indicarse que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la gravedad del estado que va a aliviarse. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse a lo largo del tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de la composiciones, y que los intervalos de concentración expuestos en el presente documento son a modo de ejemplo sólo y no pretenden limitar el alcance o uso de composiciones y combinaciones que los contienen. Las composiciones pueden administrarse cada hora, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente o una vez. Generalmente, los regímenes de dosificación se eligen para limitar la toxicidad. Debe indicarse que el médico encargado sabría cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la terapia para disminuir la dosificación debido a toxicidad, o disfunciones de la médula ósea, el hígado o el riñón u otro tejido. A la inversa, el médico encargado sabría también cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clínica no es adecuada (excluyendo efectos secundarios tóxicos).
G. Métodos de evaluación de la estabilidad, actividad, biodisponibilidad y farmacocinética
La estabilidad y actividad de IG y hialuronidasa en las formulaciones puede evaluarse usando diversos ensayos in vitro e in vivo que conoce un experto en la técnica. Están disponibles en la técnica diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteínas y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993). La estabilidad puede mediarse a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado.
Los ensayos para evaluar el tamaño molecular (por ejemplo provocado por agregación, desnaturalización y/o fragmentación) de la IG son una consideración importante para evaluar la estabilidad de la coformulación. Además, la estabilidad de las formulaciones líquidas también puede evaluarse mediante cualquier ensayo que mida la actividad biológica de IG y hialuronidasa en la formulación. Tales ensayos se conocen bien en la técnica. Además de evaluar la estabilidad de la coformulación, tales ensayos pueden usarse, por ejemplo, para determinar las dosificaciones apropiadas de inmunoglobulina y hialuronidasa, y la frecuencia de dosificación, para el tratamiento. Además, también pueden realizarse ensayos conocidos por un experto en la técnica para evaluar las propiedades farmacocinéticas de inmunoglobulina administrada por vía subcutánea, incluyendo biodisponibilidad y tolerabilidad.
1. Tamaño molecular
El principal parámetro que indica estabilidad es el tamaño molecular, y un cambio en el tamaño puede ser el resultado de degradación por desnaturalización, agregación o fragmentación. La agregación de IG es un problema común durante el almacenamiento de productos de IG. Los agregados son problemáticos porque pueden combinarse con el complemento en la sangre del paciente y producir una reacción anticomplemento. La capacidad de IG para unirse al complemento aumenta en gran medida como resultado de la desnaturalización, en particular por agregación con especies de alto peso molecular. El mecanismo de unión al complemento de estos agregados parece ser idéntico al de complejos antígeno-anticuerpo. Marcus, D. M., (1960) J. Immunol. 84:273-284. En el caso de IgG, se sabe que el sitio de unión al complemento requiere dos moléculas próximas entre sí. Por tanto es posible que se requiera un empaquetamiento crítico de las moléculas, en vez de cualquier cambio conformacional adecuado.
Están disponibles en la técnica métodos para monitorizar la estabilidad de IG, incluyendo los métodos descritos en el presente documento y en los ejemplos dados a conocer en el presente documento. Hay diversos métodos disponibles para evaluar la estabilidad de formulaciones de proteína, incluyendo formulaciones de anticuerpo o inmunoglobulina, basándose en las estructuras físicas y químicas de las proteínas así como en sus actividades biológicas. Por ejemplo, para estudiar la agregación, fragmentación y desnaturalización de proteínas, están disponibles métodos tales como absorción de transferencia de carga, análisis térmico, espectroscopia de fluorescenica, dicroismo circular, RMN, electroforesis en gel capilar reducida (rCGE) y cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento (HPSEC). Véase, por ejemplo, Wang et al., 1988, J. of Parenteral Science & Technology 42(supp.):S4-S26. La rCGE y HPSEC son los métodos más comunes y más sencillos para evaluar el tamaño molecular debido a la formación de agregados proteicos, degradación de proteínas y fragmentación de proteínas. Además, la actividad anticomplemento (ACA) puede determinarse directamente.
Por ejemplo, la estabilidad de las formulaciones líquidas puede evaluarse mediante HPSEC o rCGE, cuando el porcentaje de área de los picos representa la proteína no degradada. En un ejemplo, se inyecta proteína en una columna TosoH Biosep TSK G3000 SW 600 x 7,5 mm. Se eluye la proteína. Se detecta la proteína eluida usando absorbancia UV a 280 nm. Se procesa un patrón de referencia en el ensayo como control, y los resultados se notifican como el tanto por ciento de área del pico de monómero de producto en comparación con todos los otros picos excluyendo el pico de volumen incluido. Los picos que eluyen más temprano que el pico de monómero se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
registran como porcentaje de agregado.
El título de ACA también puede determinarse tal como se describe en la farmacopea europea (European Pharmacopeia, 1997, 2a ed. Part II. Maisonneuve, S.A., Saint Ruffine, Francia). Generalmente, el título de ACA es un indicador de especificación de administración intravenosa (i.v.) y no es relevante para la administración subcutánea de las coformulaciones. Por tanto, para fines en el presente documento, el título de ACA no es generalmente un indicador determinante para coformulaciones que se formulan para administración subcutánea.
Generalmente, el ensayo de ACA mide la cantidad de complemento a la que se une la mezcla de cantidades normalizadas de complemento y proteína (véase por ejemplo, Palmer, D. F. y Whaley, S. D., Complement Fixation Test, en Manual of Clinical Laboratory Immunology (Ed. N. R. Rose, et al., American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1986) págs. 57-66.; Mayer, M. M., Quantitative C’ Fixación Analysis, Complement and Complement Fixation, en Experimental Immunochemistry (Ed. E. A. Kabat y M. M. Meyer, Thomas, Springfield, III., 1961), págs. 214-216, 227-228). En resumen, se añaden glóbulos rojos que se han sensibilizado mediante preincubación con anticuerpos frente a glóbulos rojos a la mezcla de complemento/proteína. En presencia de complemento libre (al que no se ha unido todavía la proteína) estas células sensibilizadas se lisarán, liberando hemoglobina que puede cuantificarse como una medida del grado de lisis. En paralelo, también se añaden glóbulos rojos sensibilizados a una mezcla de control de tampón-complemento, cuyo grado de lisis se define como el 100%. La diferencia entre la cantidad real de complemento necesaria para proporcionar el 100% de lisis y la cantidad de complemento que queda sin unir en presencia de proteína es igual a la cantidad de complemento a la que realmente se une la proteína, o actividad anticomplemento. Una unidad de actividad ACA (una unidad de CH50) es la cantidad de proteína que puede activar el 50% del complemento en un sistema de complemento titulado de manera óptima y glóbulos rojos/hemolisina. Generalmente, un título de ACA aceptable es inferior al 50% de unidades de CH50 consumidas por mg de proteína.
En otro ejemplo, la distribución de tamaño molecular, por ejemplo debido a formación de agregados, durante el almacenamiento de una coformulación líquida puede determinarse fácilmente midiendo el cambio en la proteína soluble en disolución a lo largo del tiempo. La cantidad de polipéptido soluble en disolución puede cuantificarse mediante varios ensayos analíticos. Tales ensayos pueden incluir, por ejemplo, HPLC de fase inversa (RP) y espectroscopia de absorción UV. La determinación de agregados tanto solubles como insolubles durante el almacenamiento en formulaciones líquidas puede lograrse, por ejemplo, usando ultracentrifugación analítica para distinguir entre la porción del polipéptido soluble que está presente como agregados solubles y la porción que está presente en la forma molecular no agregada, biológicamente activa.
En un ejemplo adicional, la estabilidad de coformulaciones puede evaluarse calentando el producto terminado hasta una temperatura de 57°C y manteniéndolo a esa temperatura durante cuatro horas mientras se examina el producto para detectar precipitados visuales. (Véase por ejemplo, Code of Federal Regulations 21, Food and Drugs, 640. 101a (revisado en abril de 1978)). En una modificación del método (véase por ejemplo, Fernandes y Lundblad, Vox Sang 39:101-112 (1980)), se calientan aproximadamente 2 mililitros del producto de prueba a 57°C durante cuatro horas y luego se evalúa el porcentaje de cambio en el grado de opalescencia tal como se mide registrando la transmitancia a 580 nm con un espectrofotómetro de laboratorio (véase también la patente estadounidense n.° 4.597.966).
También puede usarse SDS-PAGE para evaluar la agregación y/o fragmentación. Puede medirse la densidad o la radioactividad de cada banda teñida o marcada con radioisótopo y puede obtenerse el % de densidad o % de radioactividad de la banda que representa proteína no degradada.
Generalmente, las coformulaciones presentan niveles de bajos a indetectables de agregación tal como se mide mediante cualquiera de los ensayos anteriores, por ejemplo HPSEC o rCGE. Por ejemplo, la agregación no es mayor del 5%, no mayor del 4%, no mayor del 3%, no mayor del 2%, no mayor del 1%, y generalmente no mayor del 0,5% de agregado por peso de proteína, y niveles de bajos a indetectables de fragmentación, es decir, el 80% o más, el 85% o más, el 90% o más, el 95% o más, el 98% o más, o el 99% o más, o el 99,5% o más del área de pico total en el/los pico(s) que representan anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, normalmente, una agregación aceptable incluye > 90% de monómeros y oligo-/dímeros; <5% de agregados y < 5% de fragmentos.
2. Actividad biológica
a. Inmunoglobulina
La capacidad de la inmunoglobulina para actuar como agente terapéutico puede evaluarse in vitro o in vivo. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos in vitro para evaluar la capacidad de la inmunoglobulina para neutralizar la inefectividad viral o bacteriana (Hiemstra et al., (1994) J Lab Clin Med 123:241-6). Pueden utilizarse otros ensayos in vitro para evaluar otras actividades biológicas de la inmunoglobulina. Por ejemplo, la capacidad de preparaciones de inmunoglobulina para interaccionar con y modular productos de activación del complemento, unirse a un anticuerpo idiotípico, unirse a receptores de Fe en macrófagos y suprimir diversos mediadores inflamatorios incluyendo citocinas, quimiocinas y metaloproteinasas, puede evaluarse usando cualquier método conocido en la técnica,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
incluyendo, pero sin limitarse a, ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, transferencia de tipo Northern y citometría de flujo para evaluar la expresión de marcadores. Por ejemplo, el efecto de la inmunoglobulina sobre la expresión de receptores de quimiocina en células mononucleares de sangre periférica puede evaluarse usando citometría de flujo (Trebst et al., (2006) Eur J Neurology 13(12): 1359-63). En otro ejemplo, el efecto de la inmunoglobulina sobre la expresión de metaloproteinasas en macrófagos puede evaluarse usando análisis de transferencia de tipo Northern (Shapiro et al., (2002) Cáncer 95:2032-2037).
También pueden realizarse estudios in vivo usando modelos animales para evaluar la actividad terapéutica de la inmunoglobulina. La inmunoglobulina puede administrarse a modelos animales infectados con uno o más microorganismos y el efecto sobre la progresión de la infección puede evaluarse, tal como midiendo el número de microorganismos o midiendo el peso como marcador de morbilidad. El efecto terapéutico de la inmunoglobulina también puede evaluarse usando modelos animales de las enfermedades y los estados para los que se considera la terapia usando inmunoglobulina. Tales modelos animales se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, modelos animales pequeños para agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA), SCID, síndrome de Wiskott- Aldrich, enfermedad de Kawasaki, síndrome de Guillain-Barré, ITP, polimiositis, síndrome miasténico de Lambert- Eaton, miastenia grave y síndrome de Moersch-Woltmann (Czitrom et al. (1985) J Immunol 134:2276-2280, Ellmeier et al., (2000) J Exp Med. 192: 1611-1624, Ohno (2006) Drug Discovery Today: Disease Models 3:83-89, Oyaizu et al. (1988) J Exp Med 2017-2022, Hansen et al., (2002) Blood 100:2087-2093, Strongwater et al., (1984) Arthritis Rheum. 27:433-42, Kim et al. (1998) Annals NY Acad Sci 841:670-676, Christadoss et al. (2000) Clin. Immunol. 94:75-87, Sommerefa/., (2005) Lancet 365:1406-1411 y la patente estadounidense n.° 7.309.810).
b. Hialuronidasa
La actividad hialuronidasa puede evaluarse usando métodos bien conocidos en la técnica. En un ejemplo, la actividad se mide usando un ensayo de microturbidez. Esto se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con albúmina sérica. La actividad se mide incubando hialuronidasa con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo fijado (por ejemplo 10 minutos) y luego precipitando el hialuronato de sodio no digerido con la adición de albúmina sérica acidificada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm tras un periodo de revelado adicional. La disminución en la turbidez resultante de la actividad hialuronidasa sobre el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad enzimática hialuronidasa. En otro ejemplo, la actividad hialuronidasa se mide usando un ensayo de microtitulación en el que se mide el ácido hialurónico biotinilado residual tras la incubación con hialuronidasa (véase por ejemplo Frost y Stem (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, publicación de patente estadounidense n.° 20050260186). Los grupos carboxilo libres en los residuos de ácido glucurónico del ácido hialurónico están biotinilados, y el sustrato de ácido hialurónico biotinilado se acopla covalentemente a una placa de microtitulación. Tras la incubación con hialuronidasa, se detecta el sustrato de ácido hialurónico biotinilado residual usando una reacción de avidina-peroxidasa, y se compara con el obtenido tras la reacción con patrones de hialuronidasa de actividad conocida. También se conocen en la técnica otros ensayos para medir la actividad hialuronidasa y pueden usarse en los métodos en el presente documento (véase por ejemplo Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
También puede evaluarse la capacidad de la hialuronidasa para actuar como agente de extensión o difusión. Por ejemplo, puede inyectarse colorante azul trípano por vía subcutánea con o sin hialuronidasa en la piel lateral de cada costado de ratones desnudos. Entonces se mide el área con colorante, tal como con un microcalibre, para determinar la capacidad de la hialuronidasa para actuar como agente de extensión (patente estadounidense n.° 20060104968).
3. Farmacocinética y tolerabilidad
Pueden realizarse estudios de farmacocinética y tolerabilidad usando modelos animales o pueden realizarse durante estudios clínicos con pacientes. Los modelos animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, perros, cobayas y modelos de primates no humanos, tales como monos cynomolgus o macacos rhesus. En algunos casos, se realizan estudios de farmacocinética y tolerabilidad usando animales sanos. En otros ejemplos, los estudios se realizan usando modelos animales de una enfermedad para la que se considera la terapia con inmunoglobulina, tales como modelos animales de cualquiera de las enfermedades y los estados descritos más adelante.
La farmacocinética de la inmunoglobulina administrada por vía subcutánea puede evaluarse midiendo parámetros tales como la concentración de inmunoglobulina en plasma máxima (pico) (Cmáx), el tiempo pico (es decir cuándo se produce la concentración de inmunoglobulina en plasma máxima; Tmáx), la concentración de inmunoglobulina en plasma mínima (es decir la concentración en plasma mínima entre dosis de inmunoglobulina; Cmin), la semivida de eliminación (T1/2) y el área bajo la curva (es decir el área bajo la curva generada representando gráficamente el tiempo frente a la concentración de inmunoglobulina en plasma; AUC), tras la administración. La biodisponibilidad absoluta de la inmunoglobulina administrada por vía subcutánea se determina comparando el área bajo la curva de inmunoglobulina tras la administración subcutánea (AUCsc) con el AUC de inmunoglobulina tras administración intravenosa (AUC¡V). La biodisponibilidad absoluta (F) puede calcularse usando la fórmula: F = ([AUCjsc x dosiSsc)/([AUC]jV x dosiSjv). La concentración de inmunoglobulina en el plasma tras la administración subcutánea
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
puede medirse usando cualquier método conocido en la técnica adecuado para evaluar concentraciones de inmunoglobulina en muestras de sangre. Los métodos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ELISA y nefelometría.
Puede administrarse un intervalo de dosis y frecuencia de dosificación diferente de dosificación en los estudios farmacocinéticos para evaluar el efecto de aumentar o disminuir las concentraciones de inmunoglobulina y/o hialuronidasa en la dosis. Las propiedades farmacocinéticas de inmunoglobulina administrada por vía subcutánea, tal como la biodisponibilidad, también puede evaluarse con o sin coadministración de hialuronidasa. Por ejemplo, puede administrarse a perros, tales como perros beagle, inmunoglobulina administrada por vía subcutánea en combinación con hialuronidasa, o sola. Las dosis intravenosas de inmunoglobulina también se administran a otro grupo de perros beagle. Entonces se toman muestras de sangre a diversos puntos de tiempo y se determina la cantidad de inmunoglobulina en el plasma, tal como mediante nefelometría. Puede medirse entonces el AUC y puede determinarse la biodisponibilidad de inmunoglobulina administrada por vía subcutánea administrada con o sin hialuronidasa. Tales estudios pueden realizarse para evaluar el efecto de la coadministración con hialuronidasa sobre las propiedades farmacocinéticas, tales como biodisponibilidad, de inmunoglobulina administrada por vía subcutánea.
También se conocen en la técnica estudios para evaluar la seguridad y tolerabilidad y pueden usarse en el presente documento. Tras la administración subcutánea de inmunoglobulina, con o sin coadministración de hialuronidasa, puede monitorizarse el desarrollo de cualquier reacción adversa. Las reacciones adversas pueden incluir, pero sin limitarse a, reacciones en el sitio de inyección, tales como edema o hinchazón, cefalea, fiebre, fatiga, tiritonas, enrojecimiento, mareo, urticaria, sibilancia u opresión en el pecho, náuseas, vómitos, escalofríos, dolor de espalda, dolor de pecho, calambres musculares, temblores o convulsiones, cambios en la tensión arterial y respuestas de hipersensibilidad anafilácticas o graves. Normalmente, se administra un intervalo de dosis y frecuencias de dosificación diferentes en los estudios de seguridad y tolerabilidad para evaluar el efecto de aumentar o disminuir las concentraciones de inmunoglobulina y/o hialuronidasa en la dosis.
H. MÉTODOS DE TRATAMIENTO Y USOS TERAPÉUTICOS
Las coformulaciones de IG/hialuronidasa descritas en el presente documento pueden usarse para tratamiento de cualquier estado para el que se emplea la inmunoglobulina. La inmunoglobulina (IG) puede administrarse por vía subcutánea en coformulaciones con hialuronidasa, para tratar cualquier estado que sea propenso al tratamiento con inmunoglobulina. Esta sección proporciona usos terapéuticos a modo de ejemplo de coformulaciones de IG/hialuronidasa. Se entiende que las coformulaciones de IG/hialuronidasa proporcionadas en el presente documento pueden usarse en métodos, procedimientos o usos para tratar cualquiera de las enfermedades y los estados descritos más adelante y otras enfermedades y estados conocidos por un experto en la técnica que pueden tratarse con IG. En particular, se contempla la administración subcutánea de las coformulaciones. Las dosificaciones de IG administradas son iguales o similares a la dosificación administrada por vía intravenosa y conocida por un experto en la técnica. El régimen y frecuencia de dosificación puede variar con respecto a regímenes intravenosos tal como se describe en otra parte en el presente documento. Los usos terapéuticos descritos a continuación son a modo de ejemplo y no limitan las aplicaciones de los métodos descritos en el presente documento.
Por ejemplo, pueden usarse coformulaciones proporcionadas en el presente documento para tratar inmunodeflclenclas tales como inmunodeficiencias primarias, tales como agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, hlpogammaglobullnemia y estados de inmunidad comprometida adquirida (inmunodeficiencias secundarias), tales como las que se caracterizan por bajos niveles de anticuerpos; enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias; e infecciones agudas. Los usos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, terapia de sustitución con inmunoglobulina y terapia de ¡nmunomodulación para diversas enfermedades y estados inmunológicos, hematológicos, neurológicos, inflamatorios, dermatológicos y/o infecciosos. En algunos ejemplos, la Inmunoglobulina se administra para aumentar la respuesta ¡nmumtaria en pacientes sanos, tal como tras una posible exposición a una enfermedad infecciosa (por ejemplo lesión por pinchazo accidental con una aguja). Las coformulaciones de IG proporcionadas en el presente documento también pueden usarse para tratar esclerosis múltiple (especialmente esclerosis múltiple remitente- recidivante o RRMS), enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parklnson. Está dentro del conocimiento de un médico encargado Identificar tales enfermedades o estados.
Las coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa pueden administrarse en combinación con otros agentes usados en el tratamiento de estas enfermedades y estados. Por ejemplo, otros agentes que pueden administrarse incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, agentes quimioterápicos, agentes antiinflamatorios esteroideos, agentes antiinflamatorios no esteroideos y otros agentes inmunomoduladores tales como atocinas, quimiocinas y factores de crecimiento.
SI es necesario, un protocolo de dosificación y duración y tratamiento particular puede determinarse empíricamente o extrapolarse. Por ejemplo, pueden usarse dosis a modo de ejemplo de Inmunoglobulina administrada por vía intravenosa como punto de partida para determinar las dosificaciones apropiadas. Los niveles de dosificación pueden determinarse basándose en una variedad de factores, tales como peso corporal del individuo, salud general, edad, la actividad del compuesto específico empleado, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y el transcurso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y el juicio del médico encargado. Se proporcionan en otra parte en el presente documento dosificaciones a modo de ejemplo de inmunoglobulina y hialuronidasa. Se entiende que la cantidad que va a administrarse será una función de la indicación tratada, y que se tolerarán posiblemente los efectos secundarios. Las dosificaciones pueden determinarse empíricamente usando modelos reconocidos para cada trastorno.
Tras la mejora del estado de un paciente, puede administrarse una dosis de mantenimiento de inmunoglobulina por vía subcutánea en combinación con hialuronidasa, si es necesario, y pueden modificarse la dosificación, la forma de dosificación o la frecuencia de administración, o una combinación de las mismas. En algunos casos, un sujeto puede requerir tratamiento intermitente en una base a largo plazo tras cualquier reaparición de los síntomas de la enfermedad.
1. Inmunodeficiencia primaria y secundaria
a. Inmunodeficiencia primaria
La Organización Mundial de la Salud reconoce más de 80 enfermedades de inmunodeficiencia primaria y se producen en aproximadamente 1 de cada 10.000 individuos. Estas enfermedades se caracterizan por un defecto intrínseco en el sistema inmunitario en el que, en algunos casos, el cuerpo no puede producir ninguno o suficientes anticuerpos contra la infección. En otros casos, las defensas celulares para combatir la infección no funcionan apropiadamente. La inmunoglobulina puede usarse para tratar la inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos. Por tanto, la inmunoglobulina puede administrarse como terapia de sustitución con inmunoglobulina para pacientes que presentan tales enfermedades.
Normalmente, las inmunodeficiencias primarias son trastornos heredados. A modo de ejemplo de inmunodeficiencias primarias se incluyen, pero sin limitarse a, inmunodeficiencia variable común (CVID), deficiencia de IgA selectiva, deficiencia de subclases de IgG, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA), inmunodeficiencia combinada grave (SCID), trastornos del complemento, ataxia telangiectasia, hiper-lgM y síndrome de Wiskott-Aldridge. Pueden administrarse coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa por vía subcutánea a pacientes con enfermedades de inmunodeficiencia primaria con deficiencia de anticuerpos a dosis similares a las dosis usadas para la administración intravenosa de inmunoglobulina. Las dosis a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, entre 100 mg/kg de PC y 800 mg/kg de PC de inmunoglobulina, a intervalos de cuatro semanas. La dosis puede aumentarse o disminuirse, así como la frecuencia de las dosis, dependiendo de la respuesta clínica.
b. Inmunodeficiencia secundaria
La inmunodeficiencia secundaria, o adquirida, no es el resultado de anomalías genéticas heredadas, sino que más bien se produce en individuos en los que el sistema inmunitario está comprometido por factores fuera del sistema inmunitario. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, traumatismo, virus, quimioterapia, toxinas y contaminación. El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un ejemplo de un trastorno de inmunodeficiencia secundaria provocado por un virus, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), en el que un agotamiento de linfocitos T hace que el cuerpo no pueda combatir la infección.
Otro ejemplo, hipogammaglobulinemia, está provocada por una falta de linfocitos B, se caracteriza por bajos niveles de anticuerpos en la sangre y puede producirse en pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL), mieloma múltiple (MM), linfoma no Hodgkin (NHL) y otros tumores malignos relevantes como resultado de tanto disfunción ¡nmunitaria relacionada con leucemia como inmunosupresión relacionada con la terapia. Los pacientes con hipogammaglobulinemia adquirida secundaria a tales tumores malignos hematológicos, y los pacientes que reciben trasplante de células madre poshematopoyéticas son susceptibles a infecciones bacterianas. La deficiencia en inmunidad humoral es en gran medida responsable del aumento del riesgo de morbimortalidad relacionada con infección en estos pacientes, especialmente por microorganismos encapsulados. Por ejemplo, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus, así como Legionella y Nocardia spp. son patógenos bacterianos frecuentes que provocan neumonía en pacientes con CLL. También se han observado infecciones oportunistas como Pneumocystis carinii, hongos, virus y micobacterias. El número y la gravedad de las infecciones en estos pacientes pueden reducirse significativamente mediante la administración de inmunoglobulina (Griffiths et al. (1989) Blood 73:366-368; Chapel et al. (1994) Lancet 343:1059-1063).
Por tanto, pueden administrarse coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa por vía subcutánea en tales pacientes para prevenir infecciones recurrentes. Las dosificaciones a modo de ejemplo incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina a pacientes con hipogammaglobulinemia adquirida secundaria a tumores malignos hematológicos. Por ejemplo, pueden administrarse coformulaciones que contienen aproximadamente 400 mg/kg de PC de inmunoglobulina por vía subcutánea cada de 3 a 4 semanas. En un ejemplo adicional, puede administrarse una dosis adicional de 400 mg/kg de PC en el primer mes de terapia en casos en los que la IG sérica del paciente es inferior a 4 g/l. La cantidad de inmunoglobulina administrada, y la frecuencia de las dosis, puede aumentarse o disminuirse según sea apropiado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
a. Enfermedad de Kawasaki
La enfermedad de Kawasaki es una enfermedad aguda, febril, multisistémica de niños y lactantes jóvenes, que implica a menudo las arterias coronarias. También se conoce como síndrome de ganglios linfáticos, enfermedad de ganglios monocutáneos, poliarteritis infantil y síndrome de Kawasaki. La enfermedad de Kawasaki es una vasculitis auto limitada, mal entendida que afecta a muchos órganos, incluyendo la piel, las membranas mucosas, los ganglios linfáticos, las paredes de los vasos sanguíneos, y el corazón. Puede producirse aneurisma de arterias coronarias a partir de la segunda semana de enfermedad durante la fase convaleciente. Aunque la causa del estado se desconoce, hay evidencias de que la vasculitis característica resulta de una reacción inmunitaria caracterizada por activación de células T y macrófagos frente a un antígeno desconocido, secreción de citocinas, hiperactividad de células B policlonales, y la formación de autoanticuerpos frente a células endoteliales y células del músculo liso. En individuos genéticamente susceptibles, uno o más agentes infecciosos comunes no caracterizados, posiblemente actividad de superantígeno, pueden desencadenar la enfermedad.
La inmunoglobulina administrada de manera temprana en la enfermedad de Kawasaki puede prevenir la patología de arterias coronarias. La administración subcutánea de coformulaciones de ¡nmunoglobulina/hialuronidasa a pacientes con inflamación en curso asociada con enfermedad de Kawasaki puede mejorar los síntomas. Las dosificaciones a modo de ejemplo incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina a pacientes con enfermedad de Kawasaki. Por ejemplo, a un paciente con enfermedad de Kawasaki pueden administrársele aproximadamente 1-2 g/kg de peso corporal del paciente de inmunoglobulina. Esto puede administrarse, por ejemplo, en cuatro dosis de 400 mg/kg de PC durante cuatro días consecutivos. En otro ejemplo, se administra 1 g/kg de PC de inmunoglobulina como una única dosis a lo largo de un periodo de 10 horas. La cantidad de inmunoglobulina administrada puede aumentarse o disminuirse según sea apropiado.
b. Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica
La polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) es un trastorno neurológico caracterizado por debilidad progresiva y función sensorial alterada en las piernas y los brazos. El trastorno, que se denomina algunas veces polineuropatía recidivante crónica, está provocada por daño a la vaina de mielina de los nervios periféricos. Aunque puede producirse a cualquier edad y en ambos géneros, la CIDP es más común en adultos jóvenes, y en hombres más que en mujeres. A menudo se presenta con síntomas que incluyen cosquilleo o entumecimiento (que comienza en los dedos de los piel y de las manos), debilidad de los brazos y las piernas, pérdida de reflejos de tendones profundos (areflexia), fatiga y sensaciones anómalas. La CIDP está estrechamente relacionada con el síndrome de Guillain-Barré y se considera el homólogo crónico de esa enfermedad aguda. No hay una prueba de diagnóstico específica, pero hallazgos clínicos y de laboratorio característicos ayudan a distinguir este trastorno de otros síndromes neuropáticos mediados por el sistema inmunitario.
Los estudios indican que el tratamiento con inmunoglobulina reduce los síntomas (van Schaik et al. (2002) Lancet Neurol. 1:497-498). Por tanto, pueden administrarse coformulaciones de ¡nmunoglobulina/hialuronidasa por vía subcutánea a pacientes que presentan CIDP usando los métodos descritos en el presente documento. Las dosificaciones a modo de ejemplo incluyen las usadas para administración intravenosa de inmunoglobulina a pacientes con CIDP. En un ejemplo, se le administran a un paciente con CIDP aproximadamente 2 g/kg de PC de inmunoglobulina por vía subcutánea, en combinación con hialuronidasa. Esto puede administrarse, por ejemplo, en cinco dosis de 400 mg/kg de PC durante cinco días consecutivos. La cantidad de inmunoglobulina administrada puede aumentarse o disminuirse según sea apropiado.
c. Síndrome de Guillain-Barré
El síndrome de Guillain-Barré es un trastorno autoinmunitario neurológico que implica desmielinización inflamatoria de nervios periféricos. Los primeros síntomas incluyen grados variables de debilidad o sensaciones de cosquilleo en las piernas, que pueden extenderse a los brazos y la parte superior del cuerpo. Estos síntomas pueden aumentar de intensidad hasta que los músculos no pueden usarse en absoluto y el paciente queda casi totalmente paralizado, dando como resultado un estado potencialmente mortal. Aunque la recuperación es generalmente buena o completa en la mayoría de los pacientes, se ha notificado incapacidad persistente en aproximadamente el 20% de todos los pacientes y muerte en el 4 al 15% de los pacientes. El síndrome de Guillain-Barré puede producirse unos pocos días o semanas tras los síntomas de una infección viral respiratoria o gastrointestinal. En algunos casos, la cirugía o las vacunaciones pueden desencadenar el síndrome. El trastorno puede desarrollarse a lo largo del transcurso de horas o días, o puede durar hasta de 3 a 4 semanas. Una prueba de velocidad de conducción nerviosa (NCV) puede proporcionar a un doctor claves para ayudar en el diagnóstico. En algunos casos, puede usarse una punción lumbar en el diagnóstico, ya que el líquido cefalorraquídeo en pacientes con síndrome de Guillain-Barré contiene normalmente más proteína que los sujetos normales.
Aunque no hay cura conocida para el síndrome de Guillain-Barré, el tratamiento con inmunoglobulina puede reducir la gravedad de la enfermedad y acelerar la recuperación. Pueden administrarse coformulaciones de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
inmunoglobulina/hialuronidasa por vía subcutánea a pacientes a una dosis apropiada de IG, tal como, por ejemplo, una dosis similar a la dosis usada para administrar ¡nmunoglobulina por vía intravenosa a pacientes con síndrome de Guillain-Barré. Por ejemplo, se le administran a un paciente con síndrome de Guillain-Barré aproximadamente 2 g/kg de PC de ¡nmunoglobulina, en combinación con hialuronidasa, por vía subcutánea. Esto puede administrarse, por ejemplo, en cinco dosis de 400 mg/kg de PC durante cinco días consecutivos. La cantidad de ¡nmunoglobulina administrada puede aumentarse o disminuirse dependiendo de, por ejemplo, la gravedad de la enfermedad y la respuesta clínica a la terapia, que puede evaluarse fácilmente por un experto en la técnica.
d. Púrpura trombocitopénica idiopática
La púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), también conocida como púrpura trombocitopénica inmunitaria primaria y púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, es una reducción en el recuento de plaquetas (trombocitopenia) que resulta del acortamiento de la supervivencia de las plaquetas debido a anticuerpos anti-plaquetas. Cuando los recuentos de plaquetas son muy bajos (por ejemplo, <30 x 109/l), pueden producirse hemorragias en la piel (púrpura) y las membranas mucosas. La producción de plaquetas en la médula ósea (megacariopoyesis) en pacientes con ITP es morfológicamente normal. En algunos casos, hay una alteración adicional de la función de las plaquetas relacionada con la unión de anticuerpos a glicoproteínas en la superficie de las plaquetas. La ITP puede presentarse como formas crónicas y agudas. Aproximadamente el 80% de los adultos con ITP tienen la forma crónica de la enfermedad. La mayor incidencia de ITP crónica es en mujeres con edades de 15-50 años, aunque algunos informes sugieren una incidencia creciente con la edad. La ITP es relativamente común en pacientes con VIH. Aunque la ITP puede encontrarse en cualquier fase de la infección, su prevalencia aumenta a medida que avanza la enfermedad de VIH.
Los estudios han demostrado que puede usarse ¡nmunoglobulina para tratar pacientes con ITP (Godeau et al. (1993) Blood 82(5): 1415-21; Godeau etal. (1999) Br. J. Haematol. 107(4):716-9). Pueden administrarse coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa por vía subcutánea a pacientes a una dosis de IG similar a la dosis usada para administrar ¡nmunoglobulina por vía intravenosa para tratar pacientes con ITP. Por ejemplo, a un paciente con ITP pueden administrársele de aproximadamente 1 a 2 g/kg de PC de ¡nmunoglobulina, en combinación con hialuronidasa, por vía subcutánea. Esto puede administrarse a lo largo de varios días, o puede administrarse en una dosis. En algunos ejemplos, se administran cinco dosis de 400 mg/kg de PC de ¡nmunoglobulina en días consecutivos. En otro ejemplo, se administra 1 g/kg de PC durante 1-2 días consecutivos, dependiendo del recuento de plaquetas y la respuesta clínica. La cantidad de ¡nmunoglobulina administrada, y la frecuencia de las dosis, pueden aumentarse o disminuirse dependiendo de, por ejemplo, el recuento de plaquetas y la respuesta clínica a la terapia, lo que puede evaluar fácilmente un experto en la técnica.
e. Miopatías inflamatorias
Las miopatías inflamatorias son un grupo de enfermedades musculares que implican la inflamación y degeneración de tejidos de músculo esquelético. Estos trastornos adquiridos se presentan todos con debilidad muscular significativa y la presencia de una respuesta inflamatoria dentro del músculo.
i. Dermatomiositis
La dermatomiositis (DM) es la más fácilmente reconocida de las miopatías inflamatorias debido a su erupción distintiva, que se produce como una erupción en parches, oscura, rojiza o lila en los párpados, las mejillas y el puente de la nariz, y en la espalda o la parte superior del pecho, los codos, las rodillas y los nudillos. En algunos pacientes, se desarrollan bajo la piel nodulos calcificados o bultos endurecidos. La erupción precede a menudo a la debilidad muscular, que normalmente se desarrolla a lo largo de un periodo de semanas, pero puede desarrollarse a lo largo de meses o incluso días. Puede producirse dermatomiositis en cualquier edad desde la infancia hasta la edad adulta, y es más común en mujeres que en hombres. Aproximadamente un tercio de los pacientes con DM notifican dificultad para tragar. Más del 50% de los niños con DM se quejan de dolor muscular y sensibilidad, mientras que esto se produce generalmente en menos del 25% de los adultos con DM.
ii. Polimiositis
La polimiositis (PM) no tiene la erupción característica de la dermatomiositis, y el comienzo de la debilidad muscular progresa habitualmente más lentamente que en DM. Muchos pacientes con PM presentan dificultad para tragar. En algunos casos, los pacientes tienen también dificultad para respirar debido a insuficiencia muscular. Tantos como un tercio de los pacientes con PM tienen dolor muscular. La enfermedad afecta a más mujeres que hombres, y raramente afecta a personas por debajo de 20 años de edad, aunque se han notificado casos de polimiositis en niños y lactantes.
¡ii. Miositis por cuerpos de inclusión
La miositis por cuerpos de inclusión (IBM) es muy similar a la polimiositis. El comienzo de la debilidad muscular en la IBM es habitualmente muy gradual, teniendo lugar a lo largo de meses o años. Difiere de la PM en que se ven
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
afectados músculos tanto proximales como distales, mientras que generalmente sólo los músculos proximales se ven afectados en PM. Los hallazgos típicos incluyen debilidad de los músculos flexores de las muñecas y los músculos flexores de los dedos. La atrofia de los antebrazos y el músculo cuádriceps es característica de la enfermedad, con grados variables de debilidad en otros músculos. Aproximadamente la mitad de los pacientes aquejados de IBM tienen dificultad para tragar. Los síntomas de IBM comienzan habitualmente tras la edad de 50, aunque no se excluye ningún grupo de edad. Se produce IBM más frecuentemente en hombres que en mujeres. Aproximadamente uno de diez casos de IBM puede ser hereditario.
Los estudios indican que la administración de ¡nmunoglobulina puede beneficiar a pacientes con estas miopatías Inflamatorias. La ¡nmunoglobulina puede mejorar la fuerza muscular, reducir la inflamación y reducir la progresión y gravedad de la enfermedad (Dalakas et al. (1993) N. Engl. J. Med. 329(27): 1993-2000; Dalakas et al. (2001) Neurology 56(3):323-7; Dalakas (2004) Pharmacol. Ther. 102(3): 177-93; Walter et al. (2000) J. Neurol. 247(1 ):22-8). Pueden administrarse coformulaciones de ¡nmunoglobullna/hialuronidasa por vía subcutánea a pacientes con DM, PM o IBM a una dosis de IG similar a la dosis usada para administrar ¡nmunoglobulina por vía intravenosa. Por ejemplo, pueden administrarse 2 g/kg de PC de ¡nmunoglobulina, normalmente a lo largo de varios días, tal como, por ejemplo, cinco dosis de 400 mg/kg de PC en días consecutivos.
f. Síndrome miasténico de Lambert-Eaton
El síndrome miasténico de Lambert-Eaton (LEMS) es un trastorno autoinmunitario poco común de la transmisión neuromuscular reconocido clínicamente por primera vez en asociación con cáncer de pulmón, y posteriormente en casos en los que no se detectó neoplasia. Los pacientes con LEMS tienen un defecto de la unión neuromuscular presináptica. La enfermedad se caracteriza clínicamente por debilidad muscular proximal, con aumento de la fuerza tras el ejercicio, signos oculomotores leves, reflejos de tendones profundos deprimidos y disfunción autónoma (boca seca, estreñimiento, disfunción eréctil).
La administración subcutánea de coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa a pacientes con LEMS puede mejorar los síntomas. Las dosificaciones a modo de ejemplo de IG en las coformulaciones incluyen las usadas para la administración intravenosa de ¡nmunoglobulina a pacientes con LEMS. Por ejemplo, a un paciente con LEMS pueden administrársele 2 g/kg de PC de ¡nmunoglobulina a lo largo de varias dosis. Por ejemplo, pueden administrarse cinco dosis de 400 mg/kg de PC de ¡nmunoglobulina en cinco días consecutivos. La cantidad de ¡nmunoglobulina administrada puede aumentarse o disminuirse según sea apropiado.
g. Neuropatía motora multifocal
La neuropatía motora multifocal (MMN) con bloqueo de la conducción es una neuropatía desmielinizante mediada por el sistema inmunitario adquirida con debilidad lentamente progresiva, fasciculaciones y calambres, sin implicación sensorial significativa. La duración de la enfermedad antes del diagnóstico oscila entre varios meses y más de 15 años. La causa precisa de MMN se desconoce. Los estudios histopatológicos y de electrodiagnóstico demuestran la presencia de lesión tanto desmielinizante como axonal. Se ven afectados principalmente los nervios motores, aunque se ha demostrado desmielinización leve en nervios sensoriales también. La eficacia del tratamiento inmunomodulador e inmunosupresor apoya adicionalmente la naturaleza inmunitaria de MMN. Los títulos de anticuerpos anti-GM1 están elevados en más de la mitad de los pacientes con MMN. Aunque el papel de los anticuerpos anti-GM1 en la enfermedad se desconoce, su presencia puede usarse como marcador de diagnóstico para MMN.
La administración subcutánea de coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa a pacientes con MMN puede mejorar los síntomas. Las dosificaciones a modo de ejemplo de IG en las coformulaciones incluyen las usadas para administración intravenosa de ¡nmunoglobulina a pacientes con MMN. Por ejemplo, a un paciente con MMN pueden administrársele 2 g/kg de PC de ¡nmunoglobulina a lo largo de varias dosis. Por ejemplo, pueden administrarse cinco dosis de 400 mg/kg de PC de ¡nmunoglobulina en cinco días consecutivos. En otro ejemplo, puede administrarse 1g/kg de PC en 2 días consecutivos. A algunos pacientes puede administrárseles terapia de mantenimiento, que puede incluir, por ejemplo, dosis de 400 mg/kg de PC a 2 g/kg de PC, administradas cada 2-6 semanas. La cantidad de ¡nmunoglobulina administrada puede aumentarse o disminuirse según sea apropiado, teniendo en cuenta la respuesta del paciente.
h. Miastenia grave
La miastenia grave (MG) es una enfermedad neuromuscular autoinmunitaria crónica caracterizada por grados variables de debilidad de los músculos esqueléticos del cuerpo. Está asociada con la presencia de anticuerpos frente a receptores de acetilcolina (AChR) o tirosina cinasa específica de músculo (MuSK) en la unión neuromuscular, aunque algunos pacientes son negativos para anticuerpos. Las características clínicas de la MG incluyen debilidad y fatiga fluctuante de músculos voluntarios, particularmente los músculos palpebral elevador, extraocular, bulbar, de extremidades y respiratorios. Los pacientes presentan habitualmente parálisis unilateral o bilateral de los párpados (ptosis), visión doble (diplopia), dificultad para tragar (disfagia) y debilidad de músculos proximales. La debilidad de músculos respiratorios puede dar como resultado insuficiencia respiratoria en varios
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
casos, o en exacerbaciones graves agudas (crisis miasténica). La miastenia grave se produce en todos los grupos étnicos y en ambos géneros. Afecta más comúnmente a mujeres adultas jóvenes por debajo de 40 años y hombres más mayores por encima de 60 años, pero puede producirse a cualquier edad. En algunos casos, se realiza timectomia para reducir los síntomas.
Puede usarse ¡nmunoglobulina, por ejemplo, como terapia de mantenimiento para pacientes con MG de moderada a grave, normalmente cuando otros tratamientos han sido ineficaces o provocado efectos secundarios graves, y también puede administrarse antes de la timectomia o durante una exacerbación aguda de la enfermedad (crisis miasténica). Pueden administrarse coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa por vía subcutánea a pacientes con MG usando los métodos descritos en el presente documento. Las dosificaciones a modo de ejemplo de IG en las coformulaciones incluyen las usadas para administración intravenosa de ¡nmunoglobulina a pacientes con MG. Por ejemplo, a un paciente con MG pueden administrársele dosis de 400 mg/kg de PC a 2 g/kg de PC cada 4-6 semanas para terapia de mantenimiento. Antes de la timectomia o durante la crisis miasténica, pueden administrarse 1-2 g/kg de PC a lo largo de varias dosis, tal como, por ejemplo, cinco dosis de 400 mg/kg de PC en cinco días consecutivos. En otro ejemplo, puede administrarse 1 g/kg de PC en 2 días consecutivos.
i. Síndrome de Moersch-Woltmann
El síndrome de Moersch-Woltmann, también conocido como síndrome de la persona rígida (SPS) o síndrome del hombre rígido, es un trastorno neurológico poco común con características de una enfermedad autoinmunitaria. Los pacientes presentan síntomas relacionados con rigidez muscular y espasmos episódicos superpuestos. La rigidez muscular se extiende implicando músculos axiales, principalmente abdominal y toracolumbar, así como músculos de extremidades proximales. Normalmente, la contracción conjunta de músculos agonistas y antagonistas del tronco conduce a un aspecto similar a una tabla con hiperlordosis. Menos frecuentemente, la implicación de músculos respiratorios conduce a dificultad para respirar y la implicación de músculos faciales a un rostro similar a una máscara.
El tratamiento con ¡nmunoglobulina puede efectuar una disminución de la rigidez y un aumento de las puntuaciones de sensibilidad en pacientes con síndrome de Moersch-Woltmann (Dalakas ef al. (2001) N. Engl. J. Med. 345(26): 1870-6). Pueden administrarse coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa por vía subcutánea a pacientes con síndrome de Moersch-Woltmann usando los métodos descritos en el presente documento. Las dosificaciones a modo de ejemplo de IG en las coformulaciones incluyen las usadas para administración intravenosa de ¡nmunoglobulina a pacientes con síndrome de Moersch-Woltmann. Por ejemplo, puede administrarse ¡nmunoglobulina a dosis de 400 mg/kg de PC en cinco días consecutivos. A algunos pacientes puede administrárseles terapia de mantenimiento, que puede incluir, por ejemplo, 1-2 g/kg de PC de ¡nmunoglobulina cada 4-6 semanas. La cantidad de ¡nmunoglobulina administrada puede aumentarse o disminuirse según sea apropiado.
3. Infecciones agudas
También se ha mostrado que la ¡nmunoglobulina tiene actividad antimicrobiana contra varias infecciones bacterianas, virales y fúngicas, incluyendo, pero sin limitarse a, Haemophilus intiuenzae tipo B; Pseudomonas aeruginosa tipos A y B; Staphylococcus aureus; estreptococos del grupo B; Streptococcus pneumoniae tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 y 23; adenovirus tipos 2 y 5; citomegalovirus; virus de Epstein-Barr VCA; virus de la hepatitis A; virus de la hepatitis B; virus del herpes simple-1; virus del herpes simple-2; influenza A; sarampión; parainfluenza tipos 1, 2 y 3; polio; virus de la varicela zóster; Aspergillus; y Candida albicans. Por tanto, pueden administrarse coformulaciones de inmunoglobulina/hialuronidasa por vía subcutánea a pacientes con infecciones bacterianas, virales y fúngicas para aumentar el sistema inmunitario del paciente y tratar la enfermedad. En algunos ejemplos, también se administran antibióticos u otros agentes antimicrobianos.
4. Otras enfermedades y estados
A modo de ejemplo de otras enfermedades y estados que pueden tratarse mediante terapia con IG y no descritos anteriormente se incluyen, pero sin limitarse a, inmunodeficiencia iatrogénica; deficiencia de anticuerpos específicos; encefalomielitis diseminada aguda; vasculitis necrotizante sistémica positiva para ANCA; anemia hemolítica autoinmunitaria; penfigoide ampolloso; penfigoide cicatricial; síndrome de Evans (incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria con trombocitopenia inmunitaria); trombocitopenia aloinmunitaria feto-materna/neonatal (FMAIT/NAIT); síndrome hemofagocítico; trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas de alto riesgo; neuropatía paraproteinémica de IgM; trasplante de riñón; esclerosis múltiple; ataxia mioclónica opsoclónica; pénfigo foliáceo; pénfigo vulgar; púrpura tras transfusión; necrólisis epidérmica tóxica/síndrome de Steven Johnson (DIEZ/SJS); síndrome de choque tóxico; lupus eritematoso sistémico; mieloma múltiple; septicemia; trasplante de médula ósea; tumores de células B; y enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, incluye tratamiento con ¡nmunoglobulina intravenosa (véanse por ejemplo, Dodel et al. (2004) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 75:1472-4; Solomon et al. (2007) Curr. Opin. Mol. Ther. 9:79-85; Relkin et al. (2008) Neurobiol Aging). La IG contiene anticuerpos que se unen a amiloide beta (AB), que es un componente central de la placa en los cerebros de pacientes con Alzheimer. Por tanto, la IG puede ayudar a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
promover el aclaramiento de AB del cerebro y bloquear los efectos tóxicos de AB en células cerebrales. Por tanto, pueden administrarse coformulaciones de inmunoglobullna/hlaluronldasa por vía subcutánea a pacientes con enfermedad de Alzhelmer usando los métodos descritos en el presente documento. Los sujetos que van a tratarse incluyen pacientes que tienen enfermedad de Alzhelmer leve, moderada o avanzada. Está dentro del nivel de conocimiento de un médico encargado Identificar pacientes para el tratamiento. Pueden administrase coformulaciones de ¡nmunoglobullna/hialuronidasa cada semana, cada dos semanas o una vez al mes. El tratamiento puede continuar a lo largo del transcurso de meses o años. Las coformulaciones pueden administrarse a dosis de IG a o entre 200 mg/kg de PC y 2 g/kg de PC cada semana o cada dos semanas, y generalmente de al menos 200 mg/kg a 2 g/kg de PC al menos una vez al mes. El tratamiento con ¡nmunoglobulina puede efectuar un aumento en los niveles de anticuerpo antl-amllolde beta del paciente en comparación con los niveles antes del tratamiento.
I. Artículos de fabricación y kits
Las composiciones farmacéuticas de coformulaciones de ¡nmunoglobulina y hlaluronldasa pueden envasarse como artículos de fabricación que contienen material de envasado, una composición farmacéutica que es eficaz para tratar una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG, y una etiqueta que Indica que la composición va a usarse para tratar enfermedades y estados que pueden tratarse con IG. A modo de ejemplo de artículos de fabricación son recipientes de una única cámara y recipientes de doble cámara. Los recipientes Incluyen, pero no se limitan a, tubos, frascos y jeringas. Los recipientes pueden Incluir además una aguja para administración subcutánea.
Los artículos de fabricación proporcionados en el presente documento contienen materiales de envasado. Los expertos en la técnica conocen bien materiales de envasado para su uso en productos farmacéuticos de envasado. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.°s 5.323.907, 5.033.252 y 5.052.558, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento en su totalidad. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéutico incluyen, pero no se limitan a, envases de tipo blíster, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, frascos, y cualquier material de envasado adecuado para una formulación seleccionada y modo de administración y tratamiento previsto. Se contempla una amplia gama de formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionados en el presente documento ya que hay una variedad de tratamientos para cualquier enfermedad o un estado que puede tratarse con IG.
Las composiciones de coformulaciones de ¡nmunoglobulina y una hialuronidasa soluble también pueden proporcionarse como kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un elemento para su administración. Por ejemplo las composiciones pueden suministrarse con un dispositivo para su administración, tal como una jeringa, un inhalador, una copa de dosificación, un cuentagotas o un aplicador. El kit puede incluir, opcionalmente, instrucciones para su aplicación incluyendo dosificaciones, regímenes de dosificación e instrucciones para modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un elemento para el diagnóstico. Por ejemplo, tales kits pueden incluir un elemento para medir la concentración, cantidad o actividad de IG.
j. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para fines ilustrativos sólo y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Preparación de Gammaaard Liauid (formulaciones del 10% de ¡nmunoglobulina (IG))
Se fabricó Gammagard Liquid (el 10% de IG) a partir de grandes conjuntos de plasma humano, examinados meticulosamente para detectar agentes infecciosos. Se purificaron inmunoglobulinas a partir de conjuntos de plasma usando un procedimiento de fraccionamiento de Cohn-Oncley modificado con etanol frío (Cohn et al. (1946) J Am. Chem. Soc. 68:459-467), así como cromatografía de intercambio aniónico y catiónico (Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55). Se sometió además la proteína purificada a tres etapas de inactivación/eliminación viral independientes: tratamiento con disolvente/detergente (S/D) (Horowitz et al. (1994) Blood Coagul. Fibrin. 5(3):S21- 528; Kreil et al. (2003) Transfusión 43:1023-1038), nanofiltración por 35 nm (Hamamoto et al. (1989) Vox Sang. 56:230-236; Yuasa et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:2021-2024), y una incubación a pH bajo a temperaturas elevadas (Kempf ef al. (1991) Transfusión 31:423-427; Louie et al. (1994) Biologicals 22:13-19). El procedimiento de S/D incluyó tratamiento con una mezcla orgánica de fosfato de tri-n-butilo, octoxinol-9 y polisorbato-80de 18 a 25°C durante un mínimo de 60 minutos (Pólsler etal., (2008) Vox Sang. 94:184-192).
Las preparaciones finales usadas en los estudios fueron preparaciones líquidas del 10% de anticuerpos de ¡nmunoglobulina G (IG) altamente purificada y concentrada formuladas en glicina 0,25 mM a pH de 4,6 a 5,1 (tal como se mide en la disolución concentrada). La glicina sirve como agente estabilizante y de tamponamiento, y no hay azúcares añadidos, sodio o conservantes. Todos los lotes del 10% de IG (por ejemplo los lotes LE12H020, LE12H062, LE12H173, LE12F047) eran sustancialmente similares. La osmolalidad era de 240 a 300 mOsmol/kg, que es similar a la osmolalidad fisiológica. La distribución de las subclases de IG del producto fabricado según el procedimiento descrito anteriormente era similar a la del plasma normal: siendo al menos el 98% de la preparación de proteína IgG, la concentración de IgA promedio era de 37 pg/ml (ninguno de estos lotes tenía una concentración
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
de IgA de >140 pg/ml) y estaba presente IgM sólo en cantidades traza. Las funciones de Fe y Fab se mantuvieron. No era detectable actividad de activador de precalicreína.
Ejemplo 2
Preparación de SUBQ NG 20% (el 20% de IG)
A. Producción de una composición de IG concentrada, purificada
a. Sumario
Se separó plasma reunido previamente congelado de donantes de sangre en una muestra de plasma crioempobrecido para el aislamiento de diversos inhibidores y factores de coagulación en bruto antes del fraccionamiento posterior con alcohol frío usando un procedimiento de fraccionamiento de Cohn modificado tal como se describe por Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55. El procedimiento de fraccionamiento con alcohol proporcionó una fracción de IG intermedia principal, denominada precipitado G, que se procesó adicionalmente para dar el producto final usando purificación cromatográfica. La fabricación posterior implicó intercambio catiónico (CM- Sepharose Fast Flow) y cromatografía de intercambio aniónico (ANX-Sepharose Fast Flow). Para proporcionar un alto margen de seguridad con respecto a la posible transmisión de virus, se integraron en el procedimiento de fabricación tres etapas de inactivación/eliminación de virus especializadas, que se complementan entre sí en su modo de acción, concretamente: tratamiento con disolvente/detergente (mezcla de Tritón X-100 al 1%, fosfato de tri- n-butllo al 0,3% y pollsorbato-80 al 0,3%), nanofiltración (Asahl Planova 35 nm) y almacenamiento a pH bajo (4,7) durante 3 semanas a temperatura elevada.
b. Separación de crioprecipitados
Se descongeló plasma previamente congelado de donantes de sangre, en el que ya se comprobaron las consideraciones de seguridad y calidad, a una temperatura no superior a 6°C. Se realizó centrifugación en frío para separar el sólido y el líquido, que se formó tras la descongelación del plasma. La parte líquida (también denominada “plasma crioempobrecido”, tras eliminarse las proteínas insolubles en frío mediante centrifugación a partir de plasma recién descongelado) se enfrió entonces hasta 0 ± 1°C, y se ajustó su pH a 7. Se usó el plasma crioempobrecido para el aislamiento de diversos inhibidores y factores de coagulación en bruto antes del fraccionamiento posterior con alcohol frío. Se eligieron siete rutas para la adsorción discontinua de inhibidores y factores de coagulación en bruto a partir del plasma crioempobrecido antes de la purificación de SUBQ NG 20% y se denominan rutas 1 a 7 en la tabla 3.
Tabla 3. Rutas para la adsorción discontinua de inhibidores y factores de coagulación a partir de plasma crioempobrecido
Etapa
Gel Heparina Rutas de adsorción
1
2 3 4 5 6 7
Crioprecipitación
- - X X X X X X X
FEIBA
0,5 g de DEAE-Sephadex/I - X X
Factor IX
0,5 q de DEAE-Sephadex/I 2000 Ul/ml X X X X
Factor Vil
120 mg de AI(OH)3/l 750 Ul/ml X X
Antltrombina
1 g de DEAE-Sephadex/I 80000 Ul/ml X X X
Para la producción de SUBQ NG 20% preclínica, se eligieron materiales de partida de Cohn derivados de la ruta 1 (plasma de una fuente estadounidense sin etapas de adsorción), 3 (plasma de una fuente estadounidense tras adsorción de FEIBA, AT-III) y 6 (plasma de una fuente estadounidense tras adsorción de F-IX, FVII, AT-lll) para cubrir una amplia variedad de diferentes etapas de adsorción antes del fraccionamiento con alcohol. Se describen diversos procedimientos de adsorción en Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55; Polsler et al. (2008) Vox Sang. 94:184-192; las patentes estadounidenses n.°s 6.395.880 y 5.409.990; y Prothrombin complex: Brummelhuis in Methods of Plasma Protein Fractionation (J.M. Curling Editor, Academic Press, 1980).
c. Fraccionamiento
i. Obtención de sobrenadante del fraccionamiento I
Mientras estaba agitándose el plasma, se añadió etanol preenfriado, hasta una concentración objetivo de etanol al 8% v/v, y se redujo adicionalmente la temperatura entre -2 y 0°C para permitir la precipitación. Se recogió el sobrenadante (o fraccionamiento I) tras la centrifugación.
ii. Precipitado de los fraccionamientos II y III
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se ajustó el fraccionamiento I a pH 7 y a una concentración de etanol del 20 al 25% v/v, mientras se redujo adicionalmente la temperatura. Posteriormente, se realizó la centrifugación para separar el liquido (sobrenadante del fraccionamiento II + III) y el sólido.
¡II. Extracción del precipitado de los fraccionamientos II y III
Se usó un tampón de extracción frío (fosfato de sodio monobásico 5 mM, acetato 5 mM, pH 4,5 + 0,2, conductividad de 0,7 a 0,9 mS/cm) para resuspender los fraccionamientos II + III a una razón de precipitado: tampón de extracción de 1:15. Se realizó el procedimiento de extracción de 2 a 8°C.
¡v. Tratamiento con sílice pirogénica y filtración
Se añadió sílice pirogénica (por ejemplo, Aerosil 380 o equivalente) a la suspensión hasta una concentración de aproximadamente 40 g/kg de suspensión (o equivalente a 1,8 g/l de plasma crloempobrecido) y se mezcló de 2 a 8°C durante 50 a 70 minutos. Se separaron los líquidos y sólidos mediante filtración de 2 a 8°C usando un agente auxiliar de filtración (Hyflo Super-Cel, World Minerals Inc., 0,5 kg/kg de suspensión), seguido por lavado posterior de la prensa de filtro con tampón de extracción.
v. Fraccionamiento del precipitado G
Se mezcló el filtrado con polisorbato-80 hasta una concentración de aproximadamente el 0,2% p/v con agitación durante al menos 30 minutos de 2 a 8°C. Entonces se mezcló citrato de sodio deshidratado en la disolución a 8 g/l durante otros 30 minutos de agitación de 2 a 8°C. Entonces se ajustó el pH a 7,0 +0,1 con o bien hidróxido de sodio 1 M o bien ácido acético 1 M. Entonces se añadió alcohol frío a la disolución hasta una concentración de aproximadamente el 25% v/v, y se realizó una etapa de precipitación similar a Cohn II (Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-467).
vi. Suspensión el precipitado G y tratamiento con dlsolvente/detergente
Se disolvió el precipitado y se filtró con un filtro de profundidad de un tamaño de poro nominal de 0,2 pm (por ejemplo, filtro Cuno VR06 o equivalente) para obtener un filtrado transparente que se usó para el tratamiento con
disolvente/detergente (S/D).
La primera de las etapas en la inactivación viral es tratamiento con S/D del precipitado G resuspendido. La mezcla de tratamiento con S/D contenía Tritón X-100 al 1,0% (v/v), Tween-80 al 0,3% (v/v) y fosfato de tri-n-butilo al 0,3% (v/v), y se mantuvo la mezcla de 18 a 25°C durante al menos 60 minutos.
d. Cromatografía de intercambio catiónico
Entonces se hizo pasar la disolución de proteína que contenía S/D a través de una columna de intercambio catiónico (Carboximetil (CM)-Sepharose Fast Flow) para eliminar el disolvente y el detergente. Tras eliminar por lavado los reactivos de S/D, se eluyeron entonces las proteínas absorbidas con tampón de elución de pH alto (pH 8,5 ±0,1).
e. Cromatografía de intercambio aniónico
Entonces se ajustó el eluato a pH 6 y se diluyó hasta la conductividad apropiada antes de hacerse pasar la disolución a través de la columna de intercambio aniónico equilibrada (ANX-Sepharose Fast Flow). Se recogió la fracción no retenida de la columna durante la carga y el lavado para su procesamiento adicional.
f. Nanofiltraclón
En la segunda de las tres etapas de Inactivación de virus, se sometió a nanofiltración el efluente de la columna de la última etapa (filtro Asahi Planova de 35 nm) para generar un nanofiltrado.
g. Ultrafiltraclón y diafiltración
Se ajustó la concentración de glicina del nanofiltrado a 0,25 M y se concentró adlclonalmente el nanofiltrado hasta una concentración de proteína del 5 + 1% p/v mediante ultrafiltración y se ajustó el pH a 5,2 + 0,2. Con el fin de alcanzar una concentración de proteína superior para aplicación subcutánea, se llevó a cabo la ultrafiltración en un casete con un tamiz de canales abiertos y una membrana de ultrafiltración (Millipore Pellicon Biomax) con un punto de corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 50 kDa o menos que se diseñó especialmente para productos de alta viscosidad.
Se sometió a diafiltración el concentrado frente a una disolución de glicina 0,25 M con un pH de 4,2 ± 0,2. El volumen de Intercambio mínimo era 10x el volumen de concentrado original. A lo largo de toda la operación de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ultrafiltración/diafiltración, se mantuvo la disolución de 4 a 20°C. Tras la diafiltración, se concentró la disolución hasta una concentración de proteína del 22% p/v como mínimo y se ajustó de 2 a 8°C.
Con el fin de recuperar la proteína residual completa en el sistema, aumentando de ese modo la concentración de proteína, se realizó un lavado posterior del primer sistema de ultrafiItración más grande con al menos 2x el volumen muerto en modo de reclrculaclón para garantizar que se retiraba por lavado toda la proteína. Entonces se concentró el lavado posterior del primer sistema de ultraflltraclón hasta una concentración de proteína de al menos el 22% p/v con un segundo sistema de ultra-/dlaflltrac¡ón equipado con el mismo tipo de membrana que se dimensionó a una décima o menos de la primera. Se añadió el concentrado del lavado posterior a la disolución a granel. Entonces se sometió a lavado posterior el segundo sistema de ultrafiltración y se ajustó la temperatura de la disolución de 2 a 8°C.
h. Formulación
Para la formulación, se ajustó la concentración de proteína de la disolución al 20,4 + 0,4% p/v con lavado posterior del segundo sistema de ultraflltraclón más pequeño y/o con tampón de diafiltración. Se ajustó el pH de 4,4 a 4,9, si era necesario.
i. Esterilización adicional
Se esterilizó adlclonalmente la disolución a granel formulada filtrando en primer lugar a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro absoluto de 0,2 mlcrómetros o menos, entonces se dispensó de manera aséptica en recipientes finales para su sellado apropiado, tomándose muestras para las pruebas. Se realizó la etapa de ¡nactlvaclón/ellmlnaclón de virus final almacenando los recipientes sellados de 30 a 32°C durante 21 a 22 días.
Por tanto, las formulaciones del 20% de IG resultantes eran formulaciones líquidas altamente purificadas, isotónicas de ¡nmunoglobullna (al menos el 95% de gammaglobulina) formuladas en glicina 0,25 mM a pH de 4,4 a 4,9. Las preparaciones finales usadas en los estudios fueron los lotes SC00107NG, SC00207NG y SC00307NG.
B. Caracterización de lotes preclínicos
Se fabricaron los lotes preclínicos SC00107NG, SC00207NG y SC00307NG en la escala de 200 I y se caracterizaron según la tabla 4. Al nivel a granel final, se ¡lustró la pureza de la preparación mediante los bajos niveles de las impurezas principales, que estaban muy por debajo del 0,1% de la IgG total. La distribución de tamaño molecular (MSD) en el producto del 20% de IG en la fase final del procedimiento era similar a la MSD de un recipiente final del 10% de IG (Gammagard Liquid). Esto Indicó que el aumento de la concentración hasta el 20% de proteína no tuvo un impacto negativo sobre la integridad de la molécula de IgG.
Tabla 4. Caracterización de lotes de SUBQ NG 20%
A granel estéril
Prueba / método
Lote SC00107NG SC00207NG SC00307NG
Proteína total / UV
g/l de plasma 3,4 3,7 3,7
IgG / nefelométrico
g/l de plasma 3,0 3,0 3,0
IgA/ELISA
g/l de plasma <0,001 <0,001 <0,001
IqM / ELISA
q/l de plasma <0,001 <0,001 <0,001
MSD (HPLC)
% de agregados 0,1 0,1 0,1
% de oligo/dímeros 4,6 4,5 3,2
% de monómeros 95,2 95,4 96,6
% de fragmentos 0,1 0 0,1
Número de lote del
Precipitado G Precipitado G Precipitado G
material de partida
VNELG171 VNELG173 LB0790301
Los criterios de liberación de recipientes finales preliminares se definieron basándose en los requisitos de las autoridades estadounidenses y europeas (FDA y EMEA) para ¡nmunoglobullnas humanas subcutáneas, las especificaciones del recipiente final del producto actual para administración subcutánea (SUBCUVIA, autorizado para administración subcutánea en Europa) y las especificaciones de Gammagard Liquid. Se completó la caracterización del espectro de anticuerpos relevante de los tres recipientes finales y se comparó con los resultados de los lotes triplemente reducidos en virus (TVR) del 10% de IG preclínicos. La tabla 5 compara los resultados de los títulos de anticuerpo y los factores de enriquecimiento de los tres recipientes finales de SUBQ NG 20% preclínicos y los lotes de Gammagard Liquid preclínicos. Los resultados están en el mismo orden de magnitud para ambos lotes.
Tabla 5. Comparación de los datos de liberación de SUBQ NG 20% y el 10% de IG TVR
SUBQ NG 20 % 10% IG TVR
SC00107NG SC00207NG SC00307NG P00101G P00201NG P00301NG
01C21AN11 01C21AN21 01D05AN11
Sistema de prueba Uni dad
Bacterias:
Coryne- bacterium diphtheriae EUR
Cobayas Ul/ml 6,0 6,0 6,0 5,0 5,0 5,0
Virus
VHA
ELISA Ul/ml 14,0 14,0 27,0 14 9 16
VHB (anticuerpos frente a Ag de hep B)
ELISA IU/ mg de TP 40,0 47,0 43,0 35,9 40,1 40,0
Factor de enri. de virus del sarampión EUR
Hemaglut. 41,0 41,0 24,0 n/a n/a n/a
Virus del sarampión EE.UU.
Hemaglut. NIH 176 0,8 0,8 0 1,001 1,0 1,001
Parvo 619
ELISA Ul/ml 718 78 71 567 442 36
Virus de poliomielitis virus tipo I
N1H U/ml 1,4 1,711 1,5 1,01 1,11 1,21
Se realizaron pruebas de control de calidad adicionales para evaluar el nivel de producto y/o impurezas relacionadas con el procedimiento. La tabla 6 muestra los datos de control de calidad de los tres recipientes finales de SUBQ NG 20%. La eliminación de impurezas relacionadas con el procedimiento y producto es satisfactoria, y se cumplen todas 5 las especificaciones preliminares relacionadas con el producto para los tres lotes.
Tabla 6. Pruebas de control de calidad del recipiente final de SUBQ NG 20%
SC00107NG SC00207NG SC00307NG
Sistema de prueba Unidad
Integridad funcional de Fe
Unión a Bc- binding % de BPR del lote 3 15,8 138 164
Actividad anticomplementaria
Método de EP % 41,1 41,5 41,2
Actividad anticomplementaria
Método de EP CH50 U/mg 41,4 41,8 41,6
Actividad de activador de precalicreína, EUR
cromogénico Ul/ml <0,6 1,004 1,237
Hemaglutininas anti-A, pH. Eur.
hemaglut. Dilución: 1 8 16 8
Hemaglutininas anti-B, pH. Eur.
hemaglut. Dilución: 1 4 4 2
Ant¡-D
hemaglut. cumple cumple cumple
Exclusión de pirogenicidad, pH. Eur.
conejo Elevación de °C libre de pirógenos libre de pirógenos libre de pirógenos
y CFR
Endotoxinas bacterianas Pureza mediante electroforesis en acetato de celulosa
CAE cromogéneico Ul/ml % <1,2 99,6 1,8 99,8 <1,2 99,5
Distribución de tamaño molecular (monómero + dimeros)
SE-HPLC % 99,2 99,3 99,2
Distribución de tamaño molecular (polímeros)
SE-HPLC % 0,2 0,2 0,3
Distribución de tamaño molecular (fragmentos)
SE-HPLC % 0,6 0,5 0,5
IgA-EUR
ELISA gg/ml 20 20 30
IdM
ELISA ua/ml 1,1 1,0 1,2
IflG
Nefelometría mq/ml 177 165 163
Proteína (a granel)
UV mg/ml 201 203 202
Proteína
Autom.N2 mg/ml 202 208 203
Glicina
HPLC mq/ml 14,7 14,5 14,7
Polisorbato 80
Espectrofot. Mg/ml <250 <250 <250
TNBP
Cromat. de gases Mg/ml <0,3 <0,3 <0,3
Octoxinol 9
Cromat. iónica Mg/ml <3 <3 <3
Esterilidad
Filtr. por membrana n/a estéril estéril estéril
Osmolalidad
mOsmol/kg 298 298 299
pH, no diluido
Potenciaometría 5,1 5,2 5,3
Aspecto
Inspec. visual satisfactorio satisfactorio satisfactorio
Etanol
Cromat. de gases Mg/ml <20 <20 <20
Isopropanol
Cromat. de gases Md/ml <20 <20 <20
AAS de aluminio
Fotometría Mg/i <50 <50 <50
ICP OES de silicio
Electr. iónica Mg/i 3466 17270 21180
Heparina
Ul/ml <0,0075 <0,0075 <0,0075
Los parámetros monitorizados en procedimiento durante la producción preclínica y la caracterización de productos intermedios y el producto final mostraron que no había diferencias obvias detectables entre los tres lotes. Todos los recipientes finales cumplieron las especificaciones preliminares relacionadas con el producto independientemente de 5 la clase de material de partida que (precipitado G VNELG171, VNELG173 o LB0790301) se eligió.
C. Estudio de almacenamiento de formulaciones del 20% de IG
Con el fin de evaluar la estabilidad en almacenamiento de los recipientes finales del 20% de IG, se almacenaron los 10 3 lotes preclínicos descritos anteriormente (SC00107NG, SC00207NG, SC00307NG) y un lote de viabilidad (IgGSC
62/1 )de 2 a 8°C y de 28 a 30°C (lote de viabilidad sólo) hasta 18 meses. Se usó cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento para determinar la distribución de tamaño molecular (MSD) y la estabilidad de las muestras. El principal parámetro que indica estabilidad es el tamaño molecular, y un cambio en el tamaño puede ser el resultado de degradación por desnaturalización, agregación o fragmentación.
15
En la tabla 7 se muestra la MSD de los recipientes finales preclínicos tras almacenamiento de 2 a 8°C hasta 12 meses. La tabla 8 proporciona la MSD del lote de viabilidad, IgGSC 62/1,de 2 a 8°C y de 28 a 30°C, tras almacenamiento hasta 18 meses. Los datos confirmaron que el producto cumple las especificaciones definidas anteriormente para los parámetros investigados durante hasta 18 meses de almacenamiento de 2 a 8°C y de 28 a 20 30°C.
Tabla 7. MSD de lotes del 20% de IG preclínicos de 2 a 8°C
MSD (HP-SEC) (%)
Lote
Mes Aqreqados (>450 KDa) Olig/dímeros + monómeros Fraqmentos (<70Kda)
SC00107NG
0 0,3 99,5 0,2
3
0,4 99,5 0,2
4
0,5 99,4 0,2
6
0,5 99,3 0,2
12
0,7 99,1 0,3
SC00207NG
0 0,3 99,5 0,2
3
0,4 99,5 0,1
4
0,5 99,3 0,2
6
0,6 99,2 0,2
12
0,8 99,0 0,2
SC00307NG
0 0,3 99,6 0,1
3
0,5 99,3 0,2
4
0,6 99,2 0,1
6
0,7 99,1 0,2
12
0,9 98,8 0,2
Criterios de liberación
<5 >90 <5
25 Tabla 8. MSD del lote de viabilidad IgGSC 62/1 de 2 a 8°C y de 28 a 30°C
| | MSD (HP-SEC) (%)
5
10
15
20
25
30
35
Lote
°C Mes Agregados (>450 KDa) Olig/dímeros + monómeros Fragmentos (<70Kda)
IgGSC 62/1
de 2 a 8 0 0,2 99,5 0,3
1
0,1 99,7 0,2
3
0,2 99,6 0,2
6
0,3 99,4 0,3
12
0,4 99,3 0,3
18
0,4 99,2 0,4
de 28 a 30
0 0,2 99,5 0,3
1
0,2 99,2 0,6
3
0,3 98,7 1,0
6
0,6 98,0 1,4
12
1,2 95,6 3,2
18
1,9 93,5 3,8
Criterios de liberación
<5 >90 <5
D. Estudio de estabilidad de diversas formulaciones y concentraciones de IG
Se comparó la estabilidad en almacenamiento de formulaciones de alta concentración de proteína (del 14-20%) con bajo pH (glicina 0,25 M pH 4,4 - 4,9) con formulaciones de alta concentración de proteína con pH neutro (glicina 22,5 g/l, NaCI 3 g/l, pH 7,0), que se usan para ¡nmunoglobullnas inyectables por vía subcutánea y por vía intramuscular.
Todas las ejecuciones comenzaron con la concentración del nanofiltrado hasta el 5% de proteína. Se realizó un intercambio de tampón 10x frente a glicina 0,15 M (la menor concentración de glicina investigada), seguido por la concentración final hasta un valor objetivo por encima del 20% de proteína usando una membrana de polietersulfona de 0,5 m2 de Millipore con un corte molecular de 30 K (tamiz convencional). Los recipientes finales o bien se formularon y almacenaron a pH bajo (4,7) o bien el almacenamiento a pH bajo se realizó a granel y después de eso se formularon a pH neutro (7,0) antes del almacenamiento a o bien de 2 a 8°C o bien de 28 a 30°C durante 3 meses. Tras 3 meses, se determinó la distribución de tamaño molecular mediante cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento con el fin de determinar el contenido en agregados y fragmentos. Se definieron criterios de aceptación como: monómeros y oligo-/dímeros, > 90%; agregados, < 5%, fragmentos, < 5%. Se sometió a prueba el título de ACA tal como se describe en la Farmacopea Europea. Se definió un título de ACA aceptable como menos del 50% de unidades de CHso consumidas por mg de proteína.
Las tablas 9 y 10 muestran el contenido en agregados y fragmentos así como el título de ACA tras 3 meses de almacenamiento a de 28 a 30°C y de 2 a 8°C, respectivamente, para las formulaciones convencionales (pH 4,7, glicina 0,25 M; o pH 7,0, glicina 22,5 g/l, NaCI 3 g/l) a diferentes concentraciones de proteína. Los datos muestran claramente que la formulación de pH bajo tenía menos agregados y un título de ACA inferior tras 3 meses de almacenamiento a de 28 a 30°C. Todos los títulos de ACA de las formulaciones de pH 7,0 estaban por encima del criterio de aceptación definido para esta prueba.
Los resultados a de 2 a 8°C confirman la tendencia observada a de 28 a 30°C. Los títulos de ACA estaban todos por debajo del límite definido como criterio de aceptación, aunque las formulaciones de pH 7,0 parecían tener valores superiores. El valor de proteína no influye en los resultados de los parámetros sometidos a prueba.
Tabla 9. Valores de fragmentos, agregados y ACA tras 3 meses de almacenamiento a de 28 a 30°C a pH 4,7 y pH 7,0 a diferentes concentraciones de proteína
Fragmentos, % Agregados, % Título de ACA, %
Proteína
pH 4,7 pH 7,0 pH 4,7 pH 7,0 pH 4,7 pH 7,0
14%
1,35 1,50 0,10 0,92 44,1 52,0
16%
1,24 1,38 0,08 0,91 40,5 53,1
18%
1,24 1,60 0,11 0,93 40,3 52,4
20%
1,35 1,52 0,12 0,93 37,5 62,7
Tabla 10. Valores de fragmentos, agregados y ACA tras 3 meses de almacenamiento a de 2 a 8°C a pH 4,7 y pH 7,0 a diferentes concentraciones de proteína
Fragmentos, % Agregados, % Título de ACA, %
Proteína
pH 4,7 PH 7,0 pH 4,7 pH 7,0 pH 4,7 pH 7,0
14%
0,36 1,80 0,16 1,09 38,3 46,5
16%
0,30 0,51 0,11 1,01 37,4 44,7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
18%
0,33 1,10 0,17 0,86 35,8 39,8
20%
0,33 1,98 0,20 1,06 36,1 46,0
Se investigó la influencia de diferentes procedimientos de concentración sobre la MSD y el título de ACA. El primer procedimiento usó una membrana de polietersulfona de 0,5 m2 de Mllllpore con un corte molecular de 30 K (tamiz convencional), tal como se describió anteriormente, y el segundo procedimiento usó una membrana de polietersulfona de 0,5 m2 de Millipore con un tamiz abierto, adecuado para disoluciones con mayor viscosidad. Se concentraron las fracciones del lavado posterior mediante un segundo dispositivo de ultra-/diafiltración con una superficie de membrana Inferior (0,1 m2, tamiz abierto) con el fin de reducir las pérdidas de rendimiento.
Las tablas 11 y 12 muestran la MSD y el título de ACA tras 3 meses de almacenamiento a de 28 a 30°C o de 2 a 8°C, respectivamente, para las formulaciones de pH bajo (4,7) a diversas concentraciones de proteína. Los datos mostraron resultados similares tras 3 meses de almacenamiento para ambos modos de concentración. Los valores obtenidos a de 2 a 8°C confirmaron los resultados obtenidos a de 28 a 30°C. El método de concentración no influye en la estabilidad del producto, aunque un lavado posterior adecuado sólo puede obtenerse con membranas de tamiz abierto.
Tabla 11. Valores de fragmentos, agregados y ACA tras 3 meses de almacenamiento a de 28 a 30°C a pH 4,7 con diferentes métodos de concentración de proteína
Fraqmentos (%) Aqreqados(%) Título de ACA
Proteína
tamiz convencional tamiz abierto tamiz convencional tamiz abierto tamiz convencional tamiz abierto
14%
1,35 0,92 0,10 0,21 44,1 42,6
16%
1,24 1,09 0,08 0,20 40,5 40,9
18%
1,24 0,96 0,11 0,23 40,3 40,7
20%
1,35 0,98 0,12 0,30 37,5 41,6
Tabla 12. Valores de fragmentos, agregados y ACA tras 3 meses de almacenamiento a de 2 a 8°C a pH 4,7 con diferentes métodos de concentración de proteína
Fragmentos (%) Agregados (%) Título de ACA (%)
Proteína
tamiz convencional tamiz abierto tamiz convencional tamiz abierto tamiz convencional tamiz abierto
14%
0,36 0,27 0,16 0,17 38,3 39,6
16%
0,30 0,22 0,11 0,14 37,4 38,3
18%
0,33 0,23 0,17 0,18 35,8 39,6
20%
0,33 0,22 0,20 0,20 36,1 39,9
Ejemplo 3
Preparación de PH20 humana recombinante soluble írHuPH201 A. Generación de una línea celular que expresa rHuPH20 soluble
Se usó el plásmido HZ24 (expuesto en SEQ ID NO: 52) para transfectar células de ovarlo de hámster chino (células CHO) (véanse por ejemplo las solicitudes n.os 10.795.095, 11/065.716 y 11/238.171). El vector de plásmido HZ24 para la expresión de rHuPH20 soluble contiene una estructura principal de vector pCI (Promega), ADN que codifica para los aminoácidos 1-482 de hialuronidasa PH20 humana (SEQ ID NO: 110), un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de dlhldrofolato reductasa (DHFR) de ratón. La estructura principal de vector pCI incluye también ADN que codifica para el gen de resistencia a Beta-lactamasa (AmpR), un origen de replicación f 1, una región potenciadora/promotora temprana inmediata de citomegalovirus (CMV), un intrón quimérico, y una señal de poliadenilaclón tardía de SV40 (SV40). El ADN que codifica para el constructo de rHuPH20 soluble contiene un sitio Nhel y una secuencia consenso Kozak antes del ADN que codifica para la metionina en la posición de aminoácido 1 de la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa de PH20 humana, y un codón de terminación tras el ADN que codifica para la tlroslna correspondiente a la posición de aminoácido 482 de la hialuronidasa PH20 humana (expuesta en SEQ ID NO: 1), seguido por un sitio de restricción BamHI. El constructo pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24), por tanto, da como resultado una única especie de ARNm dirigida por el promotor de CMV que codifica para los aminoácidos 1-482 de PH20 humana (expuesta en SEQ ID NO: 3 y los aminoácidos 1-186 de dihidrofolato reductasa de ratón (expuesta en SEQ ID NO: 53), separado por el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
Se sembraron células DG44 CHO no transfectadas en medio CD-CHO modificado de GIBCO para células DHFR(-), complementado con glutamina 4 mM y Plurionic F68/L 18 ml/l (Gibco), a 0,5 x 10® células/ml en un frasco agitador en la preparación para la transfección. Se hicieron crecer las células a 37°C en el 5% de CO2 en un incubador
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
humidificado, agitando a 120 rpm. Se sometieron a prueba células DG44 CHO no transfectadas que crecían exponenclalmente antes de la transfección.
Se sedimentaron sesenta millones de células viables del cultivo de células DG44 CHO no transfectadas y se resuspendieron hasta una densidad de 2 x 107 células en 0,7 mi de tampón de transfección 2x (2x HeBS: Hepes 40 mM, pH 7,0, NaCI 274 mM, KCI 10 mM, Na2HP04 1,4 mM, dextrosa 12 mM). A cada alícuota de células resuspendidas, se le añadieron 0,09 mi (250 pg) del plásmido HZ24 lineal (linealizado mediante digestión durante la noche con Cía I (New England Biolabs), y se transfirieron las disoluciones de células/ADN a cubetas de electroporaclón BTX (Gentronlcs) de 0,4 cm de hueco a temperatura ambiente. Se realizó una electroporaclón control negativo sin ADN de plásmido mezclado con las células. Se sometieron a electroporaclón las mezclas de células/plásmidos con una descarga de capacitador de 330 V y 960 pF o a 350 V y 960 pF.
Se retiraron las células de las cubetas tras la electroporaclón y se transfirieron a 5 mi de medio CD-CHO modificado para células DHFR(-), complementado con glutamina 4 mM y Plurionic F68/L 18 ml/l (Gibco), y se permitió que crecieran en una placa de cultivo tisular de 6 pocilios sin selección durante 2 días a 37°C en el 5% de CO2 en un incubador humidificado.
Dos días tras la electroporación, se retiraron 0,5 mi de medio de cultivo tisular de cada pocilio y se sometió a prueba para detectar la presencia de actividad hlaluronidasa, usando el ensayo de microturbidez descrito en el ejemplo 4.
Tabla 13. Actividad hialuronidasa Inicial de células DG44 CHO transfectadas a las 40 horas tras la transfección
Dilución Actividad unidades/ml
Transfección 1 330 V
De 1 a 10 0,25
Transfección 2 350 V
De 1 a 10 0,52
Control negativo
De 1 a 10 0,015
Se recogieron células de la transfección 2 (350V) del pocilio de cultivo celular, se contaron y se diluyeron hasta de 1 x 104 a 2 x 104 células viables por mi. Se transfirió una alícuota de 0,1 mi de la suspensión celular a cada pocilio de cinco placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocilios. Se añadieron a los pocilios que contenían células cien microlitros de medio CD-CHO (GIBCO) que contenía complemento de GlutaMAX™-1 4 mM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) y sin complementos de hipoxantina y timidina (volumen final de 0,2 mi).
Se identificaron diez clones de las 5 placas hechos crecer sin metotrexato.
Tabla 14. Actividad hialuronidasa de clones identificados
Placa/ID de pocilio
Hialuronidasa relativa
1C3
261
2C2
261
3D3
261
3E5
243
3C6
174
2G8
103
1B9
304
2D9
273
4D10
302
Se expandieron seis clones de HZ24 en cultivo y se transfirieron a frascos agitadores como suspensiones de células individuales. Se sembraron en placa los clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 y 4D10 en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocilios usando una estrategia de dilución infinita bidimensional en la que se diluyeron células 1:2 hacia abajo de la placa, y 1:3 a lo largo de la placa, comenzando a 5000 células en el pocilio en la parte superior izquierda. Se hicieron crecer los clones diluidos en un fondo de 500 células DG44 CHO no transfectadas por pocilio, para proporcionar factores de crecimiento necesarios para los días iniciales en cultivo. Se prepararon diez placas por subclón, conteniendo 5 placas metotrexato 50 nM y 5 placas sin metotrexato.
El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 del tratamiento sin metotrexato, y 11 del tratamiento con metotrexato 50 nM). Se midió la actividad hialuronidasa significativa en los sobrenadantes de 8 de los 24 subclones (>50 unidades/ml), y se expandieron estos 8 subclones en frascos de cultivo tisular T-25. Se expandieron clones aislados del protocolo de tratamiento con metotrexato en presencia de metotrexato 50 nM. Se expandió adicionalmente el clon 3D35M en metotrexato 500 nM dando lugar a clones que producían en exceso de 1.000 unidades/ml en frascos agitadores (clon 3D35M; o 3D35M Geni). Entonces se preparó un banco de células maestras (MCB) de las células 3D35M.
B. Producción y purificación de PH20 humana Geni
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
a. Procedimiento en biorreactor de 5 I
Se descongeló un vial de 3D35M y se expandió a partir de frascos agitadores a través de frascos centrifugadores de 1 I en medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad Calif.) complementado con metotrexato 100 nM y GlutaMAX™-1 (Invitrogen). Se transfirieron las células desde frascos centrifugadores hasta un biorreactor de 5 I (Braun) a una densidad de inoculación de 4 x 105 células viables por mi. Los parámetros fueron: punto de ajuste de temperatura: 37°C, pH 7,2 (punto de ajuste inicial); punto de ajuste de oxígeno disuelto: 25% y recubrimiento de aire: 0- 100 cc/min. A las 168 h, se añadieron 250 mi de medio de alimentación n.° 1 (CD CHO con glucosa 50 g/l). A las 216 horas, se añadieron 250 mi de medio de alimentación n.° 2 (CD CHO con glucosa 50 g/l y butirato de sodio 10 mM), y a las 264 horas se añadieron 250 mi de medio de alimentación n.° 2. Este procedimiento dio como resultado una productividad final de 1600 unidades por mi con una densidad celular máxima de 6 x 10® células/ml. La adición de butirato de sodio era para potenciar drásticamente la producción de rHuPH20 soluble en las fases de producción finales.
Se clarificó el medio condicionado del clon 3D35M mediante filtración profunda y diafiltración de flujo tangencial en Hepes 10 mM pH 7,0. Entonces se purificó rHuPH20 soluble mediante cromatografía secuencial en intercambio iónico de Q Sepharose (Pharmacia), cromatografía de interacción hidrófoba de Phenyl Sepharose (Pharmacia), boronato de fenilo (Prometics) y cromatografía de hidroxiapatita (Biorad, Richmond, CA).
rHuPH20 soluble se unió a Q Sepharose y se eluyó a NaCI 400 mM en el mismo tampón. Se diluyó el eluato con sulfato de amonio 2 M hasta una concentración final de sulfato de amonio 500 mM y se hizo pasar a través de una columna de Phenyl Sepharose (Low Sub), seguido por unión en las mismas condiciones a una resina de boronato de fenilo. Se eluyó la rHuPH20 soluble de la resina de Phenyl Sepharose en Hepes pH 6,9 tras lavar a pH 9,0 en bicina 50 mM sin sulfato de amonio. Se cargó el eluato sobre una resina de hidroxiapatita cerámica a pH 6,9 en fosfato de potasio 5 mM y CaCI2 1 mM y se eluyó con fosfato de potasio 80 mM, pH 7,4 con CaCI2 0,1 mM.
La rHuPH20 soluble purificada resultante presentaba una actividad específica en exceso de 65.000 unidades USP/mg de proteína por medio del ensayo de microturbidez (ejemplo 4) usando el patrón de referencia de la USP. rHuPH20 soluble purificada se eluyó como un único pico desde 24 hasta 26 minutos a partir de una columna de estireno-divinilbenceno 5RPC de Pharmacia con un gradiente entre TFA al 0,1%/H2O y TFA al 0,1%/90% de acetonitrilo/10% de H20 y se resolvió como una única banda de 61 kDa ancha mediante electroforesis en SDS que se redujo hasta una banda de 51 kDa estrecha tras el tratamiento con PNGASE-F. La secuenciaclón de aminoácidos N-terminales reveló que el péptido líder se había eliminado eficazmente.
b. Procedimiento de expansión de cultivo celular anterior al cultivo celular en biorreactor de 100 I
Se usó un procedimiento de aumento de escala para purificar por separado rHuPH20 soluble de cuatro viales diferentes de células 3D35M para producir 4 lotes separados de rHuPH20; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C y HUA0420C. Cada vial se expandió por separado y se cultivó a través de un biorreactor de 125 I, luego se purificó usando cromatografía en columna. Se tomaron muestras a lo largo de todo el procedimiento para evaluar parámetros tales como rendimiento enzimático. La descripción del procedimiento proporcionada a continuación expone especificaciones representativas para cosas tales como volúmenes de medios de alimentación e iniciación del biorreactor, densidades celulares de transferencia y volúmenes de elución y lavado. Los numerosos exactos varían ligeramente con cada lote, y se detallan en las tablas 15 a 22.
Se descongelaron cuatro viales de células 3D35M en un baño de agua de 37°C, se añadió CD CHO que contenía metotrexato 100 nM y GlutaMAX™-1 40 ml/l y se centrifugaron las células. Se resuspendieron las células en un frasco de agitación de 125 mi con 20 mi de medio nuevo y se colocó en un incubador a 37°C, el 7% de C02. Se expandieron las células hasta 40 mi en el frasco de agitación de 125 mi. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5 - 2,5 x 106 células/ml, se expandió el cultivo a un frasco centrifugador de 125 mi en un volumen de cultivo de 100 mi. Se incubó el frasco a 37°C, el 7% de C02. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5 - 2,5 x 10® células/ml, se expandió el cultivo a un frasco centrifugador de 250 mi en un volumen de cultivo de 200 mi, y se incubó el frasco a 37°C, el 7% de C02. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5-2,5x10® células/ml, se expandió el cultivo aun frasco centrifugador de 1 I en un volumen de cultivo de 800 mi y se incubó a 37°C, el 7% de C02. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5 - 2,5 x 10® células/ml, se expandió el cultivo a un frasco centrifugador de 6 I en un volumen de cultivo de 5 I y se incubó a 37°C, el 7% de C02. Cuando la densidad celular alcanzó 1,5 - 2,5 x 10® células/ml, se expandió el cultivo a un frasco centrifugador de 36 I en un volumen de cultivo de 20 I y se incubó a 37°C, el 7% de C02.
Se esterilizó un reactor de 125 I con vapor a 121°C, 20 psi y se añadieron 65 I de medio CD CHO. Antes de su uso, se comprobó si el reactor presentaba contaminación. Cuando la densidad celular en los frascos centrifugadores de 36 I alcanzó 1,8 - 2,5 x 10® células/ml, se transfirieron 20 I de cultivo celular desde los frascos centrifugadores de 36 I hasta el biorreactor de 125 I (Braun), dando como resultado un volumen final de 85 I y una densidad de siembra de aproximadamente 4x10® células/ml. Los parámetros fueron: punto de ajuste de temperatura: 37°C; pH: 7,2; oxígeno disuelto: 25% ± 10%; velocidad del impulsor: 50 rpm; presión del recipiente: 3 psi; rociado de aire: 1 l/min; recubrimiento de aire: 1 l/min. Se tomaron muestras del reactor diariamente para los recuentos celulares, la
5
10
15
20
25
30
35
40
verificación del pH, el análisis del medio, la producción y retención de protema. Se añadieron alimentaciones de nutrientes durante la ejecución. En el día 6, se añadieron 3,4 I de medio de alimentación n.° 1 (CD CHO + glucosa 50 g/l + GlutaMAX™-1 40 ml/l), y se cambió la temperatura de cultivo a 36,5°C. En el día 9, se añadieron 3,5 I de alimentación n.° 2 (CD CHO + glucosa 50 g/l + GlutaMAX™-1 40 ml/l + butirato de sodio 1,1 g/l), y se cambió la temperatura de cultivo a 36°C. En el día 11, se añadieron 3,7 I de alimentación n.° 3 (CD CHO + glucosa 50 g/l + GlutaMAX™-1 40 ml/l + butirato de sodio 1,1 g/l), y se cambió la temperatura de cultivo a 35,5°C. Se cosechó el reactor a los 14 días o cuando la viabilidad de las células descendió por debajo del 50%. El procedimiento dio como resultado la producción de rHuPH20 soluble con una actividad enzimática de 1600 unidades/ml con una densidad celular máxima de 8 millones de células/ml. En la cosecha, se tomaron muestras del cultivo para la detección de micoplasmas, carga biológica, endotoxinas y virus in vitro e in vivo, microscopía electrónica de transmisión (TEM) para detectar partículas virales, y actividad enzimática.
Se filtró la cosecha de cultivo celular de birreactor de 100 I a través de una serie de filtros de cápsulas desechables que tenían un medio de polietersulfona (Sartorius): en primer lugar a través de una cápsula de 8,0 pm de profundidad, una cápsula de 0,65 pm de profundidad, una cápsula de 0,22 pm, y finalmente a través de un filtro de 2000 cm2 de Sartopore de 0,22 pm y dentro de una bolsa de almacenamiento estéril de 100 I. Se concentró el cultivo 10x usando dos filtros de MWCO de 30 kDa de TFF con polietersulfona espiral (Millipore), seguido por un intercambio de tampón 6x con HEPES 10 mM, Na2SÜ4 25 mM, pH 7,0 en un filtro final de 0,22 pm dentro de una bolsa de almacenamiento estéril de 20 I. La tabla 15 proporciona datos de monitorización relacionados con las etapas de cultivo celular, cosecha, concentración e intercambio de tampón.
Tabla 15. Datos de monitorización para las etapas de cultivo celular, cosecha, concentración e intercambio de tampón.
Parámetro
HUA0406C HUA04010C HUA0415C HUA0420C
Tiempo desde la descongelación hasta inocular el biorreactor de 100 I (días)
21 19 17 18
Densidad de inoculación de 100 I (x 10° células/ml)
0,45 0,33 0,44 0,46
Tiempo de duplicación en crecimiento logarítmico (h)
29,8 27,3 29,2 23,5
Densidad celular máxima (x 10° células/ml)
5,65 8,70 6,07 9,70
Viabilidad de la cosecha (%)
41 48 41 41
Título de la cosecha (U/ml)
1964 1670 991 1319
Tiempo en biorreactor de 100 I (días)
13 13 12 13
Volumen de cosecha clarificada (mi)
81800 93300 91800 89100
Ensayo enzimático de cosecha clarificada (U/ml)
2385 1768 1039 1425
Ensayo enzimático de concentrado (U/ml)
22954 17091 8561 17785
Ensayo enzimático de concentrado con intercambio de tampón (U/ml)
15829 11649 9915 8679
Ensayo enzimático de concentrado con intercambio de tampón filtrado (U/ml)
21550 10882 9471 8527
Volumen de concentrado con intercambio de tampón (mi)
10699 13578 12727 20500
Razón concentración/cosecha en unidades enzimáticas
0,87 0,96 1,32 1,4
Se preparó una columna de intercambio iónico Q Sepharose (Pharmacia) (3 I de resina, altura = 20 cm, diámetro = 14 cm). Se recogieron muestras de lavado para la determinación del pH, la conductividad y el ensayo de endotoxinas (LAL). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SÜ4 20 mM, pH 7,5. Se cargó la cosecha concentrada, diafiltrada sobre la columna Q a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SÜ4 20 mM, pH 7,5 y Hepes 10 mM, NaCI 50 mM, pH 7,0. Se eluyó la proteína con Hepes 10 mM, NaCI 400 mM, pH 7,0 y se filtró a través de un filtro final de 0,22 pm dentro de una bolsa estéril.
A continuación se realizó cromatografía de interacción hidrófoba de Phenyl-Sepharose (Pharmacia). Se preparó una columna de Phenyl-Sepharose (PS) (9,1 I de resina, altura = 29 cm, diámetro = 20 cm). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCI2 0,1 mM, pH 7,0. Se complementó el eluato de proteína de lo anterior con disoluciones madre de sulfato de amonio 2 M, fosfato de potasio 1 M y CaCh 1 M hasta concentraciones finales de 5 mM, 0,5 M y 0,1 mM, respectivamente. Se cargó la proteína sobre la columna PS a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se añadieron fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCh 0,1 mM pH 7,0 a 100 cm/h. Se hizo pasar el flujo a través de un filtro final de 0,22 pm dentro de una bolsa estéril.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Se cargó la proteína purificada en PS sobre una columna de boronato de aminofenilo (ProMedics) (6,3 I de resina, altura = 20 cm, diámetro = 20 cm) que se había equilibrado con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Se hizo pasar la proteína a través de la columna a una velocidad de flujo de 100 cm/h, y se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. Entonces se lavó la columna con biclna 20 mM, NaCI 100 mM, pH 9,0 y se eluyó la protema con Hepes 50 mM, NaCI 100 mM pH 6,9 a través de un filtro estéril y dentro de una bolsa estéril de 20 I. Se sometió a prueba el eluato para determinar la carga biológica, la concentración de protelna y la actividad enzimática.
Se equilibró una columna de hidroxiapatita (HAP) (Bio-Rad) (1,6 I de resina, altura = 10 cm, diámetro = 14 cm) con fosfato de potasio 5 mM, NaCI 100 mM, CaCI2 0,1 mM pH 7,0. Se recogieron muestras de lavado y se sometieron a prueba para determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). Se complementó la proteína purificada en boronato de aminofenilo con fosfato de potasio y CaCh para producir concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCh 0,1 mM y se cargó sobre la columna de HAP a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM pH 7,0, NaCI 100 mM, CaCh 0,1 mM, luego fosfato de potasio 10 mM pH 7,0, NaCI 100 mM, CaCh 0,1 mM pH. Se eluyó la proteína con fosfato de potasio 70 mM pH 7,0 y se filtró a través de un filtro de 0,22 gm dentro de una bolsa estéril de 5 I. Se sometió a prueba el eluato para determinar la carga biológica, la concentración de proteína y la actividad enzimática.
Entonces se bombeó la proteína purificada en HAP a través de un filtro de eliminación de virus 20 nM por medio de un tanque de presión. Se añadió la proteína al tanque de presión DV20 y filtro (Pall Corporation), haciéndola pasar a través de un filtro Ultipor DV20 con poros de 20 nm (Pall Corporation) dentro de una bolsa de almacenamiento estéril de 20 I. Se sometió a prueba el filtrado para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, el perfil de oligosacáridos, monosacáridos y ácidos siálicos, e impurezas relacionadas con el procedimiento. Entonces se concentró la proteína en el filtrado hasta 1 mg/ml usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) (Sartorius) Sartocon Slice de punto de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa. Se preparó en primer lugar el filtro lavando con una disolución de Hepes/solución salina (Hepes 10 mM, NaCI 130 mM, pH 7,0) y se tomaron muestras del permeado para determinar el pH y la conductividad. Tras la concentración, se tomaron muestras de la proteína concentrada y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína y la actividad enzimática. Se realizó un intercambio de tampón 6x sobre la proteína concentrada en el tampón final: Hepes 10 mM, NaC1130 mM, pH 7,0. Se hizo pasar la proteína concentrada a través de un filtro de 0,22 gm dentro de una bolsa de almacenamiento estéril de 20 I. Se tomaron muestras de la proteína y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, los grupos sulfhldrllo libres, el perfil de oligosacáridos y la osmolaridad.
Las tablas 16 a 22 proporcionan datos de monltorlzaclón relacionados con cada una de las etapas de purificación descritas anteriormente, para cada lote de células 3D35M.
Tabla 16. Datos de columna de Q sepharose
Parámetro
HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
Volumen de carga (mi)
10647 13524 12852 20418
Razón de volumen de carqa/volumen de resina
3,1 4,9 4,5 7,3
Volumen de columna (mi)
2770 3840 2850 2880
Volumen de eluato (mi)
6108 5923 5759 6284
Conc. de proteína del eluato (mg/ml)
2,8 3,05 2,80 2,86
Ensayo enzimático del eluato (U/ml)
24493 26683 18321 21052
Rendimiento enzimático (%)
65 107 87 76
Tabla 17. Datos de columna de Phenyl Sepharose
Parámetro
HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
Volumen antes de la adición de disolución madre (mi)
5670 5015 5694 6251
Volumen de carga (mi)
7599 6693 7631 8360
Volumen de columna (mi)
9106 9420 9340 9420
Razón de volumen de carga/volumen de resina
0,8 0,71 0,82 0,89
Volumen de eluato (mi)
16144 18010 16960 17328
Conc. de proteína del eluato (mg/ml)
0,4 0,33 0,33 0,38
Ensayo enzimático del eluato (U/ml)
8806 6585 4472 7509
Rendimiento de proteína (%)
41 40 36 37
Rendimiento enzimático (%)
102 88 82 96
Tabla 18. Datos de columna de boronato de aminofenilo
Parámetro
HUA0406C
HUA0410C HUA0415C HUA0420C
Volumen de carqa (mi)
16136 17958 16931 17884
Razón de volumen de carga/volumen de resina
2,99 3,15 3,08 2,98
Volumen de columna (mi)
5400 5700 5500 5300
Volumen de eluato (mi)
17595 22084 20686 19145
Conc. de proteína del eluato (mq/ml)
0,0 0,03 0,03 0,04
Conc. de proteína del eluato filtrado (mg/ml)
no sometido a prueba 0,03 0,00 0,04
Ensayo enzlmátlco del eluato (U/ml)
4050 2410 1523 4721
Rendimiento de proteína (%)
0 11 11 12
Rendimiento enzlmátlco (%)
no determinado 41 40 69
Tabla 19. Datos de columna de hidroxiapatlta
Parámetro
HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
Volumen antes de la adición de disolución madre (mi)
16345 20799 20640 19103
Razón de volumen de carqa/volumen de resina
10,95 13,58 14,19 12,81
Volumen de columna (mi)
1500 1540 1462 1500
Volumen de carqa (mi)
16429 20917 20746 19213
Volumen de eluato (mi)
4100 2415 1936 2419
Conc. de proteína del eluato (mg/ml)
no sometido a prueba 0,24 0,17 0,23
Conc. de proteína del eluato filtrado (mg/ml)
NA NA 0,17 NA
Ensayo enzlmátlco del eluato (U/ml)
14051 29089 20424 29826
Rendimiento de proteína (%)
no sometido a prueba 93 53 73
Rendimiento enzlmátlco (%)
87 118 140 104
5 Tabla 20. Datos de filtración de DV20
Parámetro
HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
Volumen inicial (mi)
4077 2233 1917 2419
Volumen de filtrado (mi)
4602 3334 2963 3504
Conc. de proteína del filtrado (mg/ml)
0,1 NA 0,09 NA
Conc. de proteína del eluato filtrado (mg/ml)
NA 0,15 0,09 0,16
Rendimiento de proteína (%)
no sometido a prueba 93 82 101
Tabla 21. Datos de concentración final
Parámetro
HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
Volumen inicial (mi)
4575 3298 2963 3492
Volumen de concentrado (mi)
562 407 237 316
Conc. de proteína del concentrado (mg/ml)
0,9 1,24 1,16 1,73
Rendimiento de proteína (%)
111 102 103 98
10
Tabla 22. Datos del intercambio de tampón para dar la formulación final
Parámetro
HUA0406C HUA0410C HUA0415C HUA0420C
Volumen inicial (mi)
562 407 237 316
Volumen final de concentrado con intercambio de tampón (mi)
594 516 310 554
Conc. de proteína del concentrado (mg/ml)
1,00 0,97 0,98 1,00
Conc. de proteína del concentrado filtrado (mg/ml)
0,95 0,92 0,95 1,02
Rendimiento de proteína (%)
118 99 110 101
Se llenaron viales estériles de manera aséptica con volúmenes de llenado de 5 mi y 1 mi con proteína rHuPH20 15 soluble purificada y concentrada. Se hizo pasar la proteína a través de un filtro de 0,22 pm hasta una bomba controlada por operario que se usó para llenar los viales usando una lectura gravimétrica. Se cerraron los viales con tapones y se sujetaron con tapones engarzados. Se inspeccionaron visualmente los viales cerrados para detectar partículas foráneas y luego se marcaron. Tras el mareaje, se congelaron instantáneamente los viales mediante inmersión en nitrógeno líquido durante no más de 1 minuto y se almacenaron a <-15°C (-20 ± 5°C).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
C. Producción de células Gen2 que contienen PH20 humana soluble (rHuPH20)
Se adaptó la línea celular 3D35M Geni descrita anteriormente a niveles de metotrexato superiores para producir clones de generación 2 (Gen2). Se sembraron células 3D35M a partir de cultivos que contenían metotrexato establecidos en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1 ™ 4 mM y metotrexato 1,0 pM. Se adaptaron las células a un nivel de metotrexato superior haciéndolas crecer y pasándolas 9 veces a lo largo de un periodo de 46 días en un incubador humidificado a 37°C, el 7% de C02. Se clonó la población de células amplificada mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocilios que contenían medio con metotrexato 2,0 pM. Tras aproximadamente 4 semanas, se identificaron los clones y se seleccionó el clon 3E10B para la expansión. Se hicieron crecer células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 2,0 pM durante 20 pases. Se creó un banco de células maestras (MCB) de la línea celular 3E10B y se congeló y usó para estudios posteriores.
La amplificación de la línea celular continuó cultivando células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX- 1™ 4 mM y metotrexato 4,0 pM. Tras el pase 12, se congelaron las células en viales como banco de células de investigación (RCB). Se descongeló un vial del RCB y se cultivó en un medio que contenía metotrexato 8,0 pM. Tras 5 días, se aumentó la concentración de metotrexato en el medio hasta 16,0 pM, luego 20,0 pM 18 días más tarde. Se clonaron células del pase 8 en un medio que contenía metotrexato 20,0 pM mediante dilución limitante en placas de cultivo tisular de 96 pocilios que contenían medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 20,0 pM. Se identificaron los clones 5-6 semanas más tarde y se seleccionó el clon 2B2 para la expansión en un medio que contenía metotrexato 20,0 pM. Tras el pase 11, se congelaron las células 2B2 en viales como banco de células de investigación (RCB).
Las células 2B2 resultantes son células DG44 CHO deficientes en dlhidrofolato reductasa (dhfr-) que expresan PH20 humana recombinante (rHuPH20) soluble. La rHuPH20 soluble está presente en células 2B2 a un número de copias de aproximadamente 206 copias/célula. El análisis de transferencia de tipo Southern de ADN de células 2B2 genómico digerido con Spe I, Xba I y BamH l/Hind III usando una sonda específica de rHuPH20 reveló el siguiente perfil de digestos de restricción: una banda de hibridación principal de —7,7 kb y cuatro bandas de hibridación minoritarias (-13,9, -6,6, -5,7 y -4,6 kb) con ADN digerido con Spe I; una banda de hibridación principal de -5,0 kb y dos bandas de hibridación minoritarias (-13,9 y -6,5 kb) con ADN digerido con Xba I; y una banda de hibridación individual de -1,4 kb observada usando ADN de 2B2 digerido con BamH l/Hind III. El análisis de secuencia del transcrito de ARNm indicó que el ADNc derivado (SEQ ID NO: 139) era idéntico a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 110) excepto por una diferencia de un par de bases en la posición 1131, que se observó que era timidina (T) en lugar de la citosina esperada (C). Esta es una mutación silenciosa, sin efecto sobre la secuencia de aminoácidos.
D. Producción de rHuPH20 soluble Gen2 en cultivo celular en biorreactor de 300 I
Se descongeló un vial de HZ24-2B2 y se expandió a partir de frascos agitadores a través de frascos centrifugadores de 36 I en medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con metotrexato 20 pM y GlutaMAX-1™ (Invltrogen). En resumen, se descongeló el vial de células en un baño de agua a 37°C, se añadió medio y se centrifugaron las células. Se resuspendieron las células en un frasco de agitación de 125 mi con 20 mi de medio nuevo y se colocó en un Incubador a 37°C, el 7% de C02. Se expandieron las células hasta 40 mi en el frasco de agitación de 125 mi. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 10® células/ml, se expandió el cultivo a un frasco centrifugador de 125 mi en un volumen de cultivo de 100 mi. Se incubó el frasco a 37°C, el 7% de C02. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 10® células/ml, se expandió el cultivo a un frasco centrifugador de 250 mi en un volumen de cultivo de 200 mi, y se incubó el frasco a 37°C, el 7% de C02. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 10® células/ml, se expandió el cultivo a un frasco centrifugador de 1 I en un volumen de cultivo de 800 mi y se incubó a 37°C, el 7% de C02. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 10® células/ml, se expandió el cultivo a un frasco agitador de 6 I en un volumen de cultivo de 5000 mi y se incubó a 37°C, el 7% de C02. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 10® células/ml, se expandió el cultivo a un frasco centrifugador de 36 I en un volumen de cultivo de 32 I y se incubó a 37°C, el 7% de C02.
Se esterilizó un reactor de 400 I y se añadieron 230 mi de medio CD-CHO. Antes de su uso, se comprobó si el reactor presentaba contaminación. Se transfirieron aproximadamente 30 I de células de los frascos centrifugadores de 36 I al biorreactor de 400 I (Braun) a una densidad de inoculación de 4,0 x 105 células viables por mi y un volumen total de 260 I. Los parámetros fueron punto de ajuste de temperatura: 37°C; velocidad del impulsor 40-55 rpm; presión del recipiente: 3 psi; rociado de aire: 0,5-1,5 l/min; recubrimiento de aire: 3 l/min. Se tomaron muestras del reactor diariamente para los recuentos celulares, la verificación del pH, el análisis del medio, la producción y retención de proteína. Además, durante la ejecución se añadieron alimentaciones de nutrientes. A las 120 h (día 5), se añadieron 10,4 I de medio de alimentación n.° 1 (4x CD-CHO + glucosa 33 g/l + Glutamax-1™ 160 ml/l + Yeastolate 83 ml/l + Insulina humana recombinante 33 mg/l). A las 168 horas (día 7), se añadieron 10,8 I de alimentación n.° 2 (2x CD-CHO + glucosa 33 g/l + Glutamax-1™ 80 ml/l + Yeastolate 167 ml/l + butirato de sodio 0,92 g/l), y se cambió la temperatura de cultivo a 36,5°C. A las 216 horas (día 9), se añadieron 10,8 I de alimentación n.° 3 (1x CD-CHO + glucosa 50 g/l + Glutamax-1™ 50 ml/l + Yeastolate 250 ml/l + butirato de sodio 1,80 g/l), y se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cambió la temperatura de cultivo a 36° C. A las 264 horas (día 11), se añadieron 10,8 I de alimentación n.° 4 (1x CD- CHO + glucosa 33 g/l + Glutamax-1™ 33 ml/l + Yeastolate 250 ml/l + butirato de sodio 0,92 g/l), y se cambió la temperatura de cultivo a 35,5°C. Se observó que la adición de los medios de alimentación potenciaba drásticamente la producción de rHuPH20 soluble en las fases de producción finales. Se cosechó el reactor a los 14 ó 15 días o cuando la viabilidad de las células descendió por debajo del 40%. El procedimiento dio como resultado una productividad final de 17.000 unidades por mi con una densidad celular máxima de 12 millones de células/ml. En la cosecha, se tomaron muestras del cultivo para detectar micoplasmas, carga biológica, endotoxinas y virus in vitro e ¡n vivo, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y actividad enzimática.
Se bombeó el cultivo mediante una bomba peristáltica a través de cuatro módulos del sistema de filtración Millistak (Millipore) en paralelo, conteniendo cada uno una capa de tierra de diatomeas graduada hasta 4-8 pm y una capa de tierra de diatomeas graduada hasta 1,4-1,1 pm, seguido por una membrana de celulosa, luego a través de un segundo sistema de filtración Millistak individual (Millipore) que contenía una capa de tierra de diatomeas graduada a 0,4-0,11 pm y una capa de tierra de diatomeas graduada a <0,1 pm, seguido poruña membrana de celulosa, y luego a través de un filtro final de 0,22 pm dentro de una bolsa flexible de uso único estéril con una capacidad de 350 I. Se complementó el fluido de cultivo celular cosechado con EDTA 10 mM y Tris 10 mM hasta un pH de 7,5. Se concentró el cultivo 10x con un aparato de filtración de flujo tangencial (TFF) usando cuatro filtros de polietersulfona (PES) (Sartorious) con un punto de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa Sartoslice TFF, seguido por un intercambio de tampón 10x con Tris 10 mM, Na2S04 20mM, pH 7,5 en un filtro final de 0,22 pm dentro de una bolsa de almacenamiento estéril de 50 I.
Se inactivaron los virus de la cosecha concentrada, diafiltrada. Antes de la inactivación viral, se preparó una disolución de Tritón® X-100 al 10%, fosfato de tri(n-butilo) (TNBP) al 3%. Se expuso la cosecha concentrada, diafiltrada a Tritón® X-100 al 1%, TNBP al 0,3% durante 1 hora en un recipiente de reacción de vidrio de 36 I inmediatamente antes de la purificación en la columna Q.
E. Purificación de rHuPH20 soluble Gen2
Se preparó una columna de intercambio iónico de Q Sepharose (Pharmacia) (9 I de resina, Fl= 29 cm, D= 20 cm). Se recogieron muestras de lavado para la determinación del pH, la conductividad y el ensayo de endotoxinas (LAL). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SÜ4 20 mM, pH 7,5. Tras la inactivación viral, se cargó la cosecha concentrada, diafiltrada sobre la columna Q a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2S04 20 mM, pH 7,5 y Flepes 10 mM, NaCI 50 mM, pH 7,0. Se eluyó la proteína con Hepes 10 mM, NaCI 400 mM, pH 7,0 en un filtro final de 0,22 pm dentro de una bolsa estéril. Se sometió a prueba la muestra de eluato para determinar la carga biológica, concentración de proteína y actividad hialuronidasa. Se tomaron lecturas de absorbancia de A2so al comienzo y al final del intercambio.
A continuación se realizó cromatografía de interacción hidrófoba de Phenil-Sepharose (Pharmacia). Se preparó una columna de phenyl sepharose (PS) (19-21 I de resina, H=29 cm, D= 30 cm). Se recogió el lavado y se tomaron muestras para determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCI2 0,1 mM, pH 7,0. Se complementó el eluato de proteína de la columna de Q sepharose con disoluciones madre de sulfato de amonio 2 M, fosfato de potasio 1 M y CaCI2 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0,5 M y 0,1 mM, respectivamente. Se cargó la proteína sobre la columna de PS a una velocidad de flujo de 100 cm/h y se recogió la fracción no retenida de la columna. Se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCI2 0,1 mM pH 7,0 a 100 cm/h y se añadió el lavado a la fracción no retenida recogida. Combinado con el lavado de la columna, se hizo pasar la fracción no retenida a través de un filtro final de 0,22 pm dentro de una bolsa estéril. Se tomaron muestras de la fracción no retenida para determinar la carga biológica, concentración de proteína y actividad enzimática.
Se preparó una columna de boronato de aminofenilo (ProMetic). Se recogió el lavado y se tomaron muestras para determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). Se equilibró la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. Se cargó la fracción no retenida de PS que contenía proteína purificada sobre la columna de boronato de aminofenilo a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. Se lavó la columna con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0. Se lavó la columna con bicina 20 mM, NaCI 100 mM, pH 9,0. Se eluyó la proteína con Hepes 50 mM, NaCI 100 mM, pH 6,9 y se hizo pasar a través de un filtro estéril dentro de una bolsa estéril. Se sometió a prueba la muestra eluida para determinar la carga biológica, proteína concentración y actividad enzimática.
Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (Bio-rad). Se recogió el lavado y se sometió a prueba para determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). Se equilibró la columna con fosfato de potasio 5 mM, NaCI 100 mM, CaCI2 0,1 mM, pH 7,0. Se complementó la proteína purificada en boronato de aminofenilo hasta concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCI2 0,1 mM y se cargó sobre la columna de HAP a una velocidad de flujo de 100 cm/h. Se lavó la columna con fosfato de potasio 5 mM, pH 7,0, NaCI 100 mM, CaCI2
5
10
15
20
25
30
35
0,1 mM. A continuación se lavó la columna con fosfato de potasio 10 mM, pH 7,0, NaCI 100 mM, CaCh 0,1 mM. Se eluyó la protelna con fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 y se hizo pasar a través de un filtro estéril de 0,22 pm dentro de una bolsa estéril. Se sometió a prueba la muestra elulda para determinar la carga biológica, concentración de proteína y actividad enzimática.
Entonces se hizo pasar la protelna purificada en HAP a través de un filtro de eliminación de virus. Se preparó el filtro Viosart esterilizado (Sartorius) en primer lugar lavando con 2 I de fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0. Antes de su uso, se tomaron muestras del tampón filtrado para determinar el pH y la conductividad. Se bombeó la protelna purificada en HAP por medio de una bomba peristáltica a través del filtro de eliminación de virus 20 nM. Se hizo pasar la protelna filtrada en fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 a través de un filtro final de 0,22 pm dentro de una bolsa estéril. Se sometió a prueba la muestra con virus filtrados para determinar la concentración de protelna, actividad enzimática, perfil de oligosacáridos, monosacáridos y ácidos siálicos. También se sometió a prueba la muestra para determinar impurezas relacionadas con el procedimiento.
Entonces se concentró la proteína en el filtrado hasta 10 mg/ml usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) (Sartorius) de punto de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kD Sartocon Slice. Se preparó el filtro en primer lugar lavando con hlstldlna 10 mM, NaCI 130 mM, pH 6,0 y se tomaron muestras del permeado para determinar el pH y la conductividad. Tras la concentración, se tomaron muestras de la proteína concentrada y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína y la actividad enzimática. Se realiza un intercambio de tampón 6x sobre la proteína concentrada en el tampón final: hlstldlna 10 mM, NaCI 130 mM, pH 6,0. Tras el intercambio de tampón, se hizo pasar la proteína concentrada a través de un filtro de 0,22 pm dentro de una bolsa de almacenamiento estéril de 20 I. Se tomaron muestras de la proteína y se sometieron a prueba para determinar la concentración de proteína, la actividad enzimática, los grupos sulfhldrllo libres, el perfil de oligosacáridos y la osmolaridad.
Entonces se dispensó de manera estéril la proteína a granel filtrada estéril a 20 mi en viales de teflón estériles de 30 mi (Nalgene). Entonces se congelaron instantáneamente los viales y se almacenaron a -20 ± 5°C.
F. Comparación de la producción y purificación de rHuPH20 soluble Geni y rHuPH20 soluble Gen2
La producción y purificación de rHuPH20 soluble Gen2 en un cultivo celular en blorreactor de 300 I contenía algunos cambios en los protocolos en comparación con la producción y purificación rHuPH20 soluble Geni en un cultivo celular en biorreactor de 100 I. La tabla 23 expone diferencias a modo de ejemplo, además de cambios de aumento a escala sencillos, entre los métodos.
Tabla 23. Comparación de los métodos de Geni y Gen2
Diferencia de procedimiento
rHuPH20 soluble Geni rHuPH20 soluble Gen2
Línea celular
3D35M 2B2
Medio usado para expandir el inoculo celular
Contiene metotrexato 0,10 pM (0,045 mg/l) Contiene metotrexato 20 pM (9 mg/l)
Medio en cultivos de 6 1 en adelante
Contiene metotrexato 0,10 pM No contiene metotrexato
Frasco centrifugador de 36 1
Sin instrumentación Volumen de funcionamiento de 20 I. Equipado con instrumentación que monitoriza y controla el pH, el oxígeno disuelto, el rociado y la velocidad de flujo de gas de rociado y recubrimiento. Volumen de funcionamiento de 32 I
Volumen de funcionamiento final en el biorreactor
Aproximadamente 100 I en un biorreactor de 125 I (volumen de cultivo inicial + 65 I) Aproximadamente 300 I en un biorreactor de 400 I (volumen de cultivo inicial + 260 I)
Medio de cultivo en el biorreactor final
Sin insulina humana recombinante Insulina humana recombinante 5,0 mg/l
Volumen de alimentación de medios
Aumentado de escala al 4% del volumen de cultivo celular del biorreactor, es decir 3,4, 3,5 y 3,7 I, dando como resultado un volumen de biorreactor diana de ~92 I. Aumentado de escala al 4% del volumen de cultivo celular del biorreactor, es decir 10,4, 10,8, 11,2 y 11,7 I, dando como resultado un volumen de biorreactor diana de -303 I.
Alimentación de medios
Medio de alimentación n.° 1: CD CHO + glucosa 50 g/l + GlutaMAX™-1 8 mM Alimentación n.° 2 (CD CHO + Medio de alimentación n.° 1: 4x CD CHO + glucosa 33 g/l + Glutamax 32 mM + Yeastolate 16,6 g/l + Insulina humana recombinante 33 mg/l
glucosa 50 g/l + GlutaMAX 8 mM + butirato de sodio 1,1 g/l Alimentación n.° 3: CD CHO + glucosa 50 g/l + GlutaMAX 8 mM + butirato de sodio 1,1 g/l Alimentación n.° 2: 2x CD CHO + glucosa 33 g/l + Glutamax 16 mM + Yeastolate 33,4 g/l + butirato de sodio 0,92 g/l Alimentación n.° 3: 1x CD CHO + glucosa 50 g/l + Glutamax 10 mM + Yeastolate 50 g/l + butirato de sodio 1,80 g/l Alimentación n.° 4: 1x CD CHO + glucosa 33 g/l + Glutamax 6,6 mM + Yeastolate 50 g/l + butirato de sodio 0,92 g/l
Filtración de cultivo celular en biorreactor
Cuatro filtros de polietersulfona (8,0 pm, 0,65 pm, 0,22 pm y 0,22 pm) en serie Bolsa de almacenamiento de 100 I 1a fase - Cuatro módulos en paralelo, cada uno con una capa de tierra de diatomeas graduada a 4-8 pm y una capa de tierra de diatomeas graduada a 1,4-1,1 pm, seguido por una membrana de celulosa. 2a fase - Módulo individual que contiene una capa de tierra de diatomeas graduada a 0,4-0,11 pm y una capa de tierra de diatomeas graduada a <0,1 pm, seguido por una membrana de celulosa. 3a fase - Filtro de polietersulfona de 0,22 pm Bolsa de almacenamiento de 300 I El cultivo celular recogido se complementa con EDTA 10 mM, Tris 10 mM a un pH de 7,5
Concentración e intercambio de
Concentrado con 2 TFF con filtro de Concentrado usando cuatro filtros
tampón antes de la cromatografía
MWCO de 30 K de polietersulfona Millipore Spiral Intercambio de tampón del concentrado 6x con Hepes 10 mM, NaCI 25 mM, pH 7,0 Bolsa de almacenamiento estéril de 20 I de MWCO de 30 K Sartorius Sartoslice TFF Intercambio de tampón del concentrado 10x con Tris 10 mM, Na2S04 20 mM, pH 7,5 Bolsa de almacenamiento estéril de 50 I
Inactivación viral antes de la cromatografía
Ninguna Inactivación viral realizada con la adición de un Tritón® X-100 al 1%, fosfato de tributilo al 0,3%, pH 7,5,
1a etapa de purificación (Q sepharose)
Sin lectura de absorbancia Mediciones a A280 al comienzo y al final
Filtración viral tras la cromatografía
Filtro Pall DV-20 (20 nm) Filtro Sartorius Virosart (20 nm)
Concentración e intercambio e tampón tras cromatografía
Tampón Hepes/solución salina pH 7,0 Proteína concentrada hasta 1 mg/ml Tampón histidina/solución salina pH 6,0 Proteína concentrada hasta 10 mg/ml
Ejemplo 4
Determinación de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble usando un ensayo de microturbidez 5
Se determinó la actividad hialuronidasa de PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20) en muestras tales como cultivos celulares, fracciones de purificación y disoluciones purificadas usando un ensayo turbidimétrico, que se basa en la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con albúmina sérica. Se mide la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
actividad incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un periodo de tiempo fijo (10 minutos) y luego precipitando el hialuronato de sodio no digerido con la adición de albúmina sérica acidificada. Se mide la turbidez de la muestra resultante a 640 nm tras un periodo de revelado de 30 minutos. La disminución en la turbidez resultante de la actividad enzimática sobre el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble. El método se realiza usando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo de rHuPH20 soluble, y se realizan mediciones de la actividad de la muestra en relación con esta curva de calibración.
Se prepararon diluciones de la muestra en disolución de diluyente enzimático (EDS). Se preparó la disolución de diluyente enzimático disolviendo 33,0 ± 0,05 mg de gelatina hidrolizada en 25,0 mi del tampón de reacción PIPES 50 mM (NaCI 140 mM, PIPES 50 mM, pH 5,5) y 25,0 mi de agua estéril para Irrigación (SWFI), y diluyendo 0,2 mi de disolución de albúmina sérica humana al 25% en la mezcla y agitando con vértex durante 30 segundos. Se realizó esto en el plazo de 2 horas del uso y se almacenó en hielo hasta que se necesitara. Se diluyeron las muestras hasta una estimación de 1-2 U/ml. Generalmente, la dilución máxima por etapa no superó 1:100 y el tamaño de muestra inicial para la primera dilución no era Inferior a 20 pl. Los volúmenes de muestra mínimos para realizar el ensayo fueron: muestras en proceso, fracciones de FPLC: 80 pl; sobrenadantes de cultivo tlsular: 1 mi; material concentrado 80 pl; material de etapa final o purificado: 80 pl. Se prepararon las diluciones por triplicado en una placa de 96 pocilios de baja unión de proteína, y se transfirieron 30 pl de cada dilución a placas de fondo negro/transparente Optilux (BD BloSclences).
Se prepararon diluciones de rHuPH20 soluble conocida con una concentración de 2,5 U/ml en disolución de diluyente enzimático para generar una curva patrón y se añadió a la placa Optilux por triplicado. Las diluciones incluían 0 U/ml, 0,25 U/ml, 0,5 U/ml, 1,0 U/ml, 1,5 U/ml, 2,0 U/ml y 2,5 U/ml. Se Incluyeron pocilios de “blanco de reactivo” que contenían 60 pl de disolución de diluyente enzimático en la placa como control negativo. Entonces se cubrió la placa y se calentó en un bloque térmico durante 5 minutos a 37°C. Se retiró la cubierta y se agitó la placa durante 10 segundos. Tras agitar, se devolvió la placa al bloque térmico y se cebó el dispositivo de manipulación de líquidos MULTIDROP 384 con la disolución de hialuronato de sodio 0,25 mg/ml caliente (preparada disolviendo 100 mg de hialuronato de sodio (LlfeCore Blomedlcal) en 20,0 mi de SWFI. Se mezcló esto girando y/o moviendo suavemente a 2-8°C durante 2-4 horas, o hasta la disolución completa. Se preparó la disolución de sustrato mezclando 9 mi de SWFI, 10 mi de PIPES y 1 mi de hialuronato 5 mg/ml). Se transfirió la placa de reacción al MULTIDROP 384 y se Inició la reacción pulsando la clave de inicio para dispensar 30 pl de hialuronato de sodio en cada pocilio. Entonces se retiró la placa del MULTIDROP 384 y se agitó durante 10 segundos antes de transferirse a un bloque térmico con la cubierta de placa colocada de nuevo. Se Incubó la placa a 37°C durante 10 minutos
Se preparó el MULTIDROP 384 para detener la reacción cebando la máquina con disolución de trabajo de suero (25 mi de disolución madre de suero [se diluyó 1 volumen de suero de caballo (Sigma) con 9 volúmenes de disolución tampón de acetato 500 mM, pH 4,3, y se ajustó el pH a 3,1 con ácido clorhídrico] en 75 mi de disolución tampón de acetato 500 mM, pH 4,3) y cambiando el parámetro de volumen a 240 pl. Se retiró la placa del bloque térmico y se colocó sobre el MULTIDROP 384 y se dispensaron 240 pl de disoluciones de trabajo de suero en los pocilios. Se retiró la placa y se agitó en un lector de placas durante 10 segundos. Tras 15 minutos adicionales, se midió la turbidez de las muestras a 640 nm y se determinó la actividad hialuronidasa (en U/ml) de cada muestra mediante ajuste a la curva patrón.
Se calculó la actividad específica (unidades/mg) dividiendo la actividad hialuronidasa (U/ml) entre la concentración de proteína (mg/ml).
Ejemplo 5
Efecto del cloruro de sodio sobre la estabilidad de rHuPH20
La rHuPH20 estaba en una disolución a pH 6,5 que contenía 10 mg/ml en histidina/HCI y cloruro de sodio (NaCI) 130 mM. Tal como se muestra en la tabla 24, se preparó un total de 6 formulaciones diferentes que contenían los siguientes componentes: Tris 25 mM, pH 7,3, rHuPH20 100 pg/ml, Tween 80 al 0,01% y NaCI (0, 50, 100, 150, 200 ó 250 mM). Se alicuotaron las disoluciones en viales de vidrio de tipo I de 2 mi con tapones de caucho y se sellaron con tapas de aluminio. Se almacenó un conjunto de viales a 40°C durante cuatro días, y se mantuvo el otro conjunto en la nevera de 2 a 8°C.
Tabla 24. Formulación de rHuPH20 con NaCI
Formulación n.°
NaCI
1
0 mM
2
50 mM
3
100 mM
4
150 mM
5
200 mM
5
10
15
20
25
30
35
40
45
DE
250 mM
Tras 4 días de almacenamiento, se sometió a prueba cada una de las formulaciones mencionadas en la tabla 24 para detectar la actividad enzimática hialuronidasa usando el ensayo de microturbidez descrito en el ejemplo 4. Se realizó cromatografía de exclusión molecular (SEC) para evaluar el nivel de agregados usando las siguientes condiciones: 1X PBS, columna Toso BioScience G2000 SWXL columna, velocidad de flujo = 1 ml/min.
La tabla 25 muestra los resultados del estudio, incluyendo actividad hialuronidasa (U/ml), % de área de pico principal (porcentaje de la rHuPH20 que estaba contenida en el área de pico principal) y % de área de pico de agregado (porcentaje de rHuPH20 que estaba contenida en el área de pico atribuida a agregados) para cada formulación. Los resultados indican que la estabilidad de rHuPH20, cuando se incubó a 40°C, era dependiente de la concentración de NaCI: un aumento en la concentración de NaCI condujo a una actividad enzimática aumentada de rHuPH20. Las muestras almacenadas de 2 a 8°C conservaron niveles similares de actividad enzimática de rHuPH20 a lo largo del todo el transcurso del estudio, independientemente de la formulación. En ausencia de NaCI a temperaturas elevadas (40°C), se perdió toda la actividad enzimática de rHuPH20.
Los resultados en la tabla 25 también muestran el efecto de la concentración de NaCI sobre los niveles de agregados de rHuPH20. Los niveles de agregados aumentaron con la concentración decreciente de NaCI en muestras almacenadas a 40°C. No hubo esencialmente ningún cambio en las muestras almacenadas de 2 a 8°C.
Por tanto, los resultados muestran que dentro de la concentración de intervalo de NaCI sometido a prueba (0-250 nM), había una relación directa entre la concentración de NaCI y el aumento de la estabilidad de rHuPH20, lo que sugiere que la concentración de NaCI debe mantenerse tan alta como sea posible dentro de los límites de solubilidad y tonicidad con el fin de aumentar la estabilidad de rHuPH20 a temperatura elevada.
Tabla 25. Actividades enzimátlcas y resultados de SEC de las muestras almacenadas 4 días a 40°C y 28°C.
Actividad enzimática % de pico principal % de pico de agregados
Formulación
2-8°C 40°C 2-8°C 40°C 2-8°C 40°C
NaCI 0 mM
10430 <LOD 99,40 0,00 0,60 100,00
NaCI 50 mM
12370 3070 99,34 22,05 0,66 77,95
NaC1100 mM
12580 9930 99,47 72,81 0,53 27,19
NaC1150 mM
12750 11180 99,48 88,16 0,52 11,84
NaCI 200 mM
13660 13340 99,64 96,22 0,36 3,78
NaCI 250 mM
11370 11090 100,00 98,05 0,00 1,95
Ejemplo 6
Estabilidad de rHuPH20 e IG coformuladas
A. Estabilidad del 10% de IG o el 20% de IG coformulada con rHuPH20
Se formuló rHuPH20 tal como sigue: 1 mi contenía 1048071 unidades de hialuronidasa humana recombinante del lote HUB0702CA (generado usando la producción Gen2 descrita en el ejemplo 3) en histidina 10 mM y cloruro de sodio 130 mM (NaCI) a pH 6,0. Se diluyó rHuPH20 hasta 100000 U/ml usando histidina 10 mM + NaCI 130 mM, pH 6,0, antes de mezclar con la inmunoglobulina. Para este fin, se diluyeron 200 pl de disolución madre de rHuPH20 con 1896 mi de tampón histidina/NaCI, pH 6,0.
Se añadió la rHuPH20 prediluida a diferentes formulaciones de IG formuladas en glicina 0,25 M a pH de 4,4 a 4,9 para dar concentraciones finales de 100 U/ml o 300 U/ml en la disolución. Se utilizó de tres lotes del 10% de IG diferentes a partir de la fabricación a gran escala (LE12H020, LE12H062 y LE12H173) o uno de tres lotes del 20% de IG preclínicos diferentes (SC00107NG, SC00207NG y SC00307NG) según la tabla 26. Se filtraron las disoluciones a través de un filtro de 0,2 pm y se transfirieron en porciones de 1 mi a viales de vidrio de 5 mi estériles. Se almacenaron los viales de 2 a 8°C o de 28 a 32°C. Por tanto, se formularon las coformulaciones resultantes de rHuPH20 e IG en glicina 0,25 M a pH de 4,4 a 4,9.
Tabla 26. Coformulaciones de rHuPH20 y el 10% de IG o el 20% de IG
Nombre de la muestra
Cantidad del 10% de IG o el 20% de IG Cantidad de rHuPH20 diluida hasta 100000 U/ml
10% de IG
50,00 mi 0
10% de IG + rHuPH20 100 U/ml
49,95 mi 50 pl
10% de IG + rHuPH20 300 U/ml
49,85 mi 150 pl
20% de IG
50,00 mi 0
20% de IG + rHuPH20 100 U/ml
49,95 mi 50 pl
5
10
15
20
25
Tras 0 (inicio), 1, 3, 6, 12, 24 y 36 semanas (de 2 a 8°C sólo) de almacenamiento, se retiró una muestra de cada una de las 6 formulaciones mencionadas en la tabla 26 y de cada una de las cámaras de almacenamiento (de 2 a 8°C y de 28 a 32°C) de la incubación y se analizó para determinar la actividad hialuronidasa usando el ensayo de microturbidez descrito en el ejemplo 4. Para evaluar los efectos sobre IG, se determinó la distribución de tamaño molecular de la IG en formulaciones que contenían el 20% de IG a 0 (inicio) y 6 meses mediante cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento (HP-SEC) usando una columna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm (Tosoh Bioscience) y un sistema de tampón que contenía DMSO (Kolarich et al. (2006) Transfusión, 46:1959-1977).
La tabla 27 muestra la actividad hialuronidasa (U/ml) a 7 puntos de tiempo (0, 1, 3, 6, 12, 24 y 36 semanas) para cada coformulación almacenada de 2 a 8°C. La tabla 28 muestra la actividad hialuronidasa (U/ml) a 6 puntos de tiempo (0, 1, 3, 6, 12 y 2 semanas) para las coformulaclones almacenadas de 28 a 32°C. Se observó una pérdida significativa, estable de actividad hialuronidasa en presencia de coformulaciones del 10% y el 20% de IG almacenadas de 28 a 32°C tras 24 semanas, indicando inestabilidad de rHuPH20. Las coformulaciones del 10% de IG eran estables tras 9 meses de almacenamiento de 2 a 8°C, mientras que la actividad de rHuPH20 disminuyó ligeramente en las coformulaciones del 20% de IG. La distribución de tamaño molecular de la IG en formulaciones que contenían el 20% de IG no cambió a ambas temperaturas tras 6 meses de almacenamiento (tablas 29 y 30).
Tabla 27. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaclones tras almacenamiento a 2-8°C
Muestra
Semanas
0 (inicio)
1 3 6 12 24 36
LE12H020+100 U/ml
99,2 95,4 97,3 101 93 92 98
LE12H020+300 U/ml
298,5 321,7 285,9 299 283 271 291
LE12H062+100 U/ml
108,5 97,5 99,6 103 99 92 102
LE12H062+300 U/ml
325 306,8 297,9 302 273 279 300
LE12H173+100 U/ml
103,1 95,9 97,3 107 98 99 106
LE12H173+300 U/ml
295,0 291,2 281,8 293 282 296 292
SC00107NG+100 U/ml
94,0 97,8 81,4 85 87 78 66
SC00107NG+300 U/ml
284,3 280,2 264,0 261 245 223 210
SC00207NG+100 U/ml
99,7 93,1 91,0 86 83 84 69
SC00207NG+300 U/ml
286 277 266,2 244 263 227 197
SC00307NG+100 U/ml
92,8 95,0 82,7 87 83 82 68
SC00307NG+300 U/ml
254,3 281,4 274,3 245 247 230 256
Tabla 28. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaclones tras almacenamiento a 28-32°C
Muestra
Semanas
0 (Inicio)
1 3 6 12 24
LE12H020+100 U/ml
99,2 84,9 59,6 36 22 5
LE12H020+300 U/ml
298,5 259,3 185,4 104 57 19
LE12H062+100 U/ml
108,5 88,2 60,1 43 29 10
LE12H062+300 U/ml
325 266,2 185,6 129 76 28
LE12H173+100 U/ml
103,1 70,5 39,6 24 13 1
LE12H173+300 U/ml
295,0 210,1 122,0 60 31 9
SC00107NG+100 U/ml
94,0 83,1 57,4 43 49 32
SC00107NG+300 U/ml
284,3 242,2 182,0 124 148 96
SC00207NG+100 U/ml
99,7 84,5 61,1 46 51 35
SC00207NG+300 U/ml
286 251 198,1 131 145 106
SC00307NG+100 U/ml
92,8 82,7 67,9 48 52 34
SC00307NG+300 U/ml
254,3 253,6 209,7 140 157 106
Tabla 29. Distribución de tamaño molecular de IG en el 20% de IG coformulada con rHuPH20 tras almacenamiento a 2-8°C
Muestra
0 (¡nielo) 6 meses
>450 —350 -160 <60 >450 -350 -160 <60
kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa
SC00107NG
0,67 12,56 86,50 0,27 0,70 13,50 85,50 0,30
SC00107NG + rHuPH20 100 U/ml
0,62 12,39 86,75 0,24 0,70 13,59 85,43 0,28
SC00107NG + rHuPH20 300 U/ml
0,65 12,38 86,70 0,26 0,69 13,80 85,19 0,32
SC00207NG
0,73 13,25 85,76 0,26 0,86 14,52 84,34 0,28
5
10
15
20
25
30
35
SC002071NG + rHuPH20 100 U/ml
0,75 13,22 85,74 0,29 0,86 14,61 84,21 0,32
SC00207NG + rHuPH20 300 U/ml
0,77 13,39 85,63 0,21 0,83 14,57 84,30 0,30
SC00307NG
0,93 11,76 87,06 0,25 1,01 12,78 85,96 0,25
SC00307NG + rHuPH20 100 U/ml
0,96 11,91 86,94 0,20 1,03 13,04 85,62 0,31
SC00307NG + rHuPH20 300 U/ml
0,91 12,00 86,86 0,23 0,99 12,88 85,85 0,27
Tabla 30. Distribución de tamaño molecular de IG en el 20% de IG coformulada con rHuPH20 tras almacenamiento a 28-32°C
Muestra
0 (Inicio) 6 meses
>450 kDa
-350 kDa -160 kDa <60 kDa >450 kDa -350 kDa -160 kDa <60 kDa
SC00107NG
0,67 12,56 86,50 0,27 0,50 12,53 85,94 1,02
SC00107NG + rHuPH20 100 U/ml
0,62 12,39 86,75 0,24 0,47 12,41 86,10 1,02
SC00107NG + rHuPH20 300 U/ml
0,65 12,38 86,70 0,26 0,52 12,41 85,97 1,09
SC00207NG
0,73 13,25 85,76 0,26 0,44 13,21 85,42 0,94
SC00207NG + rHuPH20 100 U/ml
0,75 13,22 85,74 0,29 0,42 13,15 85,52 0,91
SC00207NG + rHuPH20 300 U/ml
0,77 13,39 85,63 0,21 0,47 13,01 85,62 0,90
SC00307NG
0,93 11,76 87,06 0,25 0,47 11,91 86,78 0,84
SC00307NG + rHuPH20 100 U/ml
0,96 11,91 86,94 0,20 0,50 11,85 86,78 0,87
SC00307NG + rHuPH20 300 U/ml
0,91 12,00 86,86 0,23 0,40 11,50 87,21 0,89
B. Estabilidad del 10% de IG con rHuPH20 y cloruro de sodio (0-150 mM)
Para mejorar la estabilidad de rHuPH20 en las coformulaciones, se investigó el efecto de la adición de cloruro de sodio (NaCI). Se prepararon coformulaciones de rHuPH20 300 U/ml (lote HUB0702CA; generado usando la producción Gen2 descrita en el ejemplo 3) en el 10% de IG (lote LE12F047) tal como se describió en el ejemplo 7A anteriormente, con la adición de NaCI a 4 concentraciones diferentes (0, 50, 100 y 150 mM). Se almacenaron las coformulaciones de 2 a 8°C o de 28 a 32°C. Por tanto, se formularon las coformulaciones resultantes de rHuPH20 y IG en glicina 0,25 M a pH de 4,6 a 5,1 (tal como se mide en la disolución diluida) en presencia de cantidades variables de NaCI.
Tras 0 (¡nielo), 1, 3, 6, 12, 18 y 24 semanas de almacenamiento, se retiró una muestra de cada una de las coformulaciones (con concentraciones de NaCI de 0,50, 100 y 150 mM) y de cada una de las cámaras de almacenamiento (de 2 a 8°C y de 28 a 32°C) de la Incubación y se analizó para determinar la actividad hlaluronldasa usando el ensayo de mlcroturbldez descrito en el ejemplo 4. Se determinó la agregación de IG mediante la distribución de tamaño molecular (MSD) mediante cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento (HP- SEC) usando una columna TSK G 3000 SW 600 x 7,5mm y un sistema de tampón que contenía DMSO (Kolañch ef al. (2006) Transfusión, 46:1959-1977).
Las tablas 31 y 32 muestran la actividad hialuronldasa (U/ml) a 7 puntos de tiempo (0, 1, 3, 6, 12, 18 y 24 semanas) para cada coformulaclón. Los resultados muestran que la estabilidad de rHuPH20 coformulada con el 10% de IG en presencia de NaCI 50, 100 ó 150 mM permaneció sin cambios hasta 24 semanas de almacenamiento de 2 a 8°C, mientras que la estabilidad de rHuPH20 mejoró para las muestras almacenadas de 28 a 32°C. Sin embargo, la actividad hlaluronldasa disminuyó rápidamente en las coformulaciones que tenían una concentración de NaCI de 0 mM cuando se almacenaron de 28 a 32°C.
Las tablas 33 y 34 muestran que NaCI potenció ligeramente la dimerización de IG (~350 kDa) a ambas temperaturas de almacenamiento y la agregación de IG (>450 kDa)de 28 a 32°C, y todos los valores permanecieron dentro de los límites de especificación de MSD (>90% de monómero/dímeros, < 5% de agregados, < 5% de fragmentos) tras 6 meses.
Aunque la adición de NaCI tuvo un impacto negativo (aumentó) el título de actividad anticomplementaria (ACA) de formulaciones de IG almacenadas de 28 a 32°C, el título de ACA es un indicador de especificación para administración Intravenosa (I.v.) y no es relevante para la administración subcutánea de las coformulaciones.
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 31. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaciones del 10% de IG/rHuPH20 con NaCI tras almacenamiento a 2-8°C
Conc. de sal
Semanas
0 (inicio)
1 2 3 6 12 18 24
NaCI 0 mM
276 288 269 289 317 264 276 274
50 mM
292 286 296 306 320 287 276 295
100 mM
285 295 273 315 319 287 281 288
150 mM
294 280 301 305 327 294 277 298
Tabla 32. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaciones del 10% de IG/rHuPH20 con NaCI tras almacenamiento a 28-32°C
Conc. de sal
Semanas
0 (inicio)
1 2 3 6 12 18 24
0 mM
276 232 237 216 201 121 109 81
50 mM
292 288 280 301 302 247 225 223
100 mM
285 286 280 292 315 277 253 258
150 mM
294 314 272 298 323 221 253 276
Tabla 33. Distribución de tamaño molecular de IG en coformulaciones del 10% de IG/rHuPH20 con NaCI tras almacenamiento a 2-8°C
Muestra
0 (inicio) 6 meses
>450 kDa
-350 kDa -160 kDa <60 kDa >450 kDa -350 kDa -160 kDa <60 kDa
NaCI 0 mM
0,16 8,21 91,01 0,61 0,16 11,29 87,98 0,58
NaCI 50 mM
0,17 8,99 90,24 0,60 0,22 12,54 86,62 0,62
NaC1100 mM
0,19 9,03 90,13 0,64 0,23 12,97 86,17 0,63
NaC1150 mM
0,19 9,08 90,13 0,61 0,24 12,93 86,30 0,53
Tabla 34. Distribución de tamaño molecular de IG en coformulaciones del 10% de IG/rHuPH20 con NaCI tras almacenamiento a 28-32°C
Muestra
0 (inicio) 6 meses
>450 -350 -160 <60 >450 -350 -160 <60
kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa
NaCI 0 mM
0,16 8,21 91,01 0,61 0,35 9,37 88,77 1,51
NaCI 50 mM
0,17 8,99 90,24 0,60 0,75 10,83 86,85 1,57
NaC1100 mM
0,19 9,03 90,13 0,64 0,87 11,20 86,38 1,55
NaC1150 mM
0,19 9,08 90,13 0,61 1,02 11,15 86,18 1,66
C. Estabilidad del 10% de IG o el 20% de IG coformulada con rHuPH20 y cloruro de sodio (0-50 mM)
Se investigó el efecto de la adición de cloruro de sodio a coformulaciones del 10% de IG o el 20% de IG con rHuPH20 almacenadas de 28 a 32°C. Se prepararon coformulaciones de rHuPH20 300 U/ml (lote HUB0702CA; generado usando la producción Gen2 descrita en el ejemplo 1) en el 10% de IG (lote LE12F047) y rHuPH20 300 U/ml (lote HUB0702CA; generado usando la producción Gen2 descrita en el ejemplo 1) en el 20% de IG (lote SC00108NG) tal como se describió en el ejemplo 6B anteriormente, usando concentraciones de NaCI de 0,5, 10, 20, 30, 40 y 50 mM. Por tanto, se formularon las coformulaciones resultantes de rHuPH20 y IG en glicina 0,25 M a pH de 4,6 a 5,1 (tal como se mide en la disolución diluida) en presencia de cantidades variables de NaCI.
Tras 0 (inicio), 1, 3, 6, 12 y 24 semanas de almacenamiento se retiró una muestra de cada una de las coformulaciones (con concentraciones de NaCI de 0, 5, 10, 20, 30, 40 y 50 mM) de la incubación y se analizó para determinar la actividad hialuronidasa usando el ensayo de microturbidez descrito en el ejemplo 4. Se determinó la agregación de IG mediante la distribución de tamaño molecular mediante cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento (HP-SEC) usando una columna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm y un sistema de tampón que contenía DMSO.
Las tablas 35 y 36 muestran la actividad hialuronidasa (U/ml) a diversos puntos de tiempo (0, 1, 3, 6 y 12 y 24 semanas) para cada coformulación. Los resultados muestran que la estabilidad de rHuPH20 coformulada con el 10% de IG en presencia de concentraciones superiores de NaCI (20, 30,40 y 50 mM) permaneció relativamente sin cambios a lo largo de 24 semanas de almacenamiento de 28 a 32°C. La actividad hialuronidasa disminuyó
rápidamente en las coformulaciones que tenían una concentración de NaCI de menos de 20 mM cuando se almacenaron de 28 a 32°C. La estabilidad de rHuPH20 coformulada con el 20% de IG permaneció relativamente sin cambios a lo largo de 24 semanas de almacenamiento de 28 a 32°C a todas las concentraciones de NaCI.
5 El cloruro de sodio potenció ligeramente la dimerización (-350 kDa) y la agregación de IG en coformulaciones del 10% y el 20% de IGde 28 a 32°C. El efecto es menos pronunciado en el 20% de IG (es decir, concentración de IG superior) sobre la agregación de IG (tablas 37 y 38).
Tabla 35. Actividad hialuronidasa (U/ml) de Coformulaciones del 10% de IG/rHuPH20 con NaCI tras almacenamiento 10 a 28-32°C
Conc. de sal
Semanas
0
1 3 6 12 24
0 mM
292 260 225 211 135 <87
5 mM
294 247 242 225 162 <87
10 mM
272 255 242 240 177 91
20 mM
281 302 261 259 232 154
30 mM
279 273 256 261 229 180
40 mM
274 254 266 275 246 196
50 mM
275 254 278 281 252 200
Tabla 36. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaciones del 20% de IG/rHuPH20 con NaCI tras almacenamiento
a 28-32°C _______________
Conc. de sal
Semanas
0
1 3 6 12 24
0 mM
267 264 251 238 212 138
5 mM
290 261 249 242 214 143
10 mM
276 264 262 232 207 141
20 mM
314 249 274 239 222 155
30 mM
252 253 276 241 211 162
40 mM
273 240 275 242 216 170
50 mM
289 238 266 234 232 165
Tabla 37. Distribución de tamaño molecular de IG en coformulaciones del 10% de IG/rHuPH20 con NaCI tras almacenamiento a 28-32°C
Muestra
0 (inicio) 6 meses
>450 -350 -160 <60 >450 -350 -160 <60
kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa
NaCI 0 mM
0,16 9,35 90,01 0,48 0,19 7,08 91,69 1,04
NaCI 5 mM
0,16 9,53 89,71 0,60 0,21 7,66 91,11 1,02
NaC110 mM
0,16 9,77 89,52 0,56 0,22 8,20 90,52 1,05
NaCI 20 mM
0,17 9,96 89,27 0,60 0,26 8,42 90,27 1,05
NaCI 30 mM
0,17 10,25 89,06 0,53 0,30 9,07 89,59 1,04
NaCI 40 mM
0,17 10,48 88,82 0,53 0,34 9,06 89,56 1,05
NaCI 50 mM
0,18 10,55 88,72 0,54 0,39 9,22 89,33 1,07
20 Tabla 38. Distribución de tamaño molecular de IG en coformulaciones del 20% de IG/rHuPH20 con NaCI tras almacenamiento a 28-32°C
Muestra
0 (inicio) 6 meses
>450 -350 -160 <60 >450 -350 -160 <60
kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa
NaCI 0 mM
0,32 14,65 84,72 0,31 0,34 11,77 87,18 0,71
NaCI 5 mM
0,32 14,70 84,70 0,27 0,34 11,57 87,35 0,74
NaCI 10 mM
0,35 14,86 84,48 0,31 0,35 12,05 86,94 0,67
NaCI 20 mM
0,30 14,95 84,48 0,27 0,37 12,17 86,76 0,69
NaCI 30 mM
0,32 15,12 84,29 0,27 0,40 12,60 86,32 0,68
NaCI 40 mM
0,32 14,92 84,48 0,27 0,47 12,68 86,16 0,69
NaCI 50 mM
0,33 15,00 84,36 0,30 0,45 12,56 86,34 0,65
D. Estabilidad de rHuPH20 en coformulaciones con el 10% de IG o el 20% de IG en presencia de cloruro de sodio 25 (100-250 mM) o aminoácidos (500 mM)
5
10
15
20
25
30
35
40
Se estudió el efecto sobre la estabilidad de rHuPH20 de coformulaciones que contenían el 10% de IG o el 20% de IG con rHuPH20 y cloruro de sodio o estabilizador de aminoácidos. Se prepararon coformulaciones de rHuPH20 100 U/ml o 300 U/ml (lote HUB0702CA; generado usando la producción Gen2 descrita en el ejemplo 3) en el 10% de IG (con glicina 0,25 M a pH 4,4) (lote LE12F047) o el 20% de IG (lote SC00108NG) tal como se describió en el ejemplo 6A anteriormente. Las muestras contenían o bien NaCI (concentraciones de 100, 150 o 250 mM), glicina (500 mM) o bien prolina (500 mM). Se almacenaron las coformulaciones de 2 a 8°C o de 28 a 32°C. Por tanto, se formularon las coformulaciones resultantes de rHuPH20 e IG en glicina 0,25 M a pH de 4,6 a 5,1 en presencia de cantidades variables de NaCI, glicina o prolina.
Tras 0 (inicio), 1, 2, 3, 6 y 12 (300 U/ml sólo) semanas de almacenamiento, se retiró una muestra de cada una de las coformulaciones (con o bien concentraciones de NaCI de 100, 150 o 250 mM, concentración de glicina de 500 mM o bien concentración de prolina de 500 mM) de la Incubación y se analizó para determinar la actividad hialuronidasa usando el ensayo de microturbidez descrito en el ejemplo 4. Se determinó la agregación de IG mediante la distribución de tamaño molecular a 0 (Inicio) y 12 semanas mediante cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento (HP-SEC) usando una columna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm y un sistema de tampón que contenía DMSO (Kolarich et al. (2006) Transfusión, 46:1959-1977).
Las tablas 39 y 41 muestran la actividad hialuronidasa (U/ml) a 5 puntos de tiempo (0, 1, 2, 3 y 6 semanas) para coformulaciones que contenían rHuPH20 100 U/ml y el 10% o el 20% de IG, respectivamente. Las tablas 40 y 42 muestran la actividad hialuronidasa (U/ml) a 6 puntos de tiempo (0, 1, 2, 3, 6 y 12 semanas) para coformulaciones que contienen rHuPH20 300 U/ml y el 10% o el 20% de IG, respectivamente. Los resultados muestran que altas concentraciones de aminoácido (glicina 500 mM o prolina 500 mM) eran menos eficaces que NaCI en la estabilización de rHuPH20 en coformulaciones del 10% de IG o el 20% de IG con rHuPH20.
El cloruro de sodio, a todas las concentraciones estudiadas, potenció la agregación de (>450 kDa) tras almacenamiento de 28 a 32°C en todas las coformulaciones. Todas las coformulaciones que contenían prollna 500 mM tienen un contenido reducido en dímeros de IG (~350 kDa) y un contenido aumentado en monómero (~160 kDa) tras 6 semanas de almacenamiento de 28 a 32°C. El contenido en dímeros de IG también se redujo en coformulaciones con glicina, aunque no tan pronunciado como en las coformulaciones con prollna (tablas 43 y 44). Altas concentraciones de prolina han demostrado ser eficaces en la inhibición de la agregación de proteínas durante el replegamiento bloqueando eficazmente interacciones hidrófobas no específicas entre proteínas (Kumar et al. (1998) Biochem. Mol. Biol. Int. 4:59-517).
Tabla 39. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaciones del 10% de IG y rHuPH20 100 U/ml con estabilizadores tras almacenamiento a 28-32°C
Concentración de estabilizador
Semanas
0 (inicio)
1 2 3 6 12
NaCI 100mM
97 97 88 99 85 84
NaCI 150mM
99 91 102 93 94 85
NaCI 250mM
89 105 93 88 91 89
Glicina 500mM
94 105 85 84 77 56
Prolina 500mM
88 96 83 80 88 59
Tabla 40. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaciones del 10% de IG y rHuPH20 300 U/ml con estabilizadores tras almacenamiento a 28-32°C
Concentración de estabilizador
Semanas
0 (inicio)
1 2 3 6 12
NaCI 100mM
294 303 284 266 260 233
NaCI 150mM
301 282 280 272 288 246
NaCI 250mM
280 290 275 278 255 250
Glicina 500mM
254 296 246 256 229 194
Prolina 500mM
242 304 266 244 226 204
Tabla 41. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaciones del 20% de IG y rHuPH20 100 U/ml con estabilizadores tras almacenamiento a 28-32°C
Concentración de estabilizador
Semanas
0 (inicio)
1 2 3 6 12
NaCI 100mM
268 313 262 256 223 214
NaCI 150mM
252 292 249 260 232 202
NaCI 250mM
262 302 270 254 236 213
Glicina 500mM
285 286 291 244 221 191
Prolina 500mM
308 303 242 248 230 197
Tabla 42. Actividad hialuronidasa (U/ml) de coformulaciones del 20% de IG y rHuPH20 300 U/ml con estabilizadores tras almacenamiento a 28-32°C
Concentración de estabilizador
Semanas
0 (inicio)
1 2 3 6 12
NaCI 100mM
268 266 264 226 237 255
NaCI 150mM
252 256 270 220 231 261
NaCI 250mM
262 243 273 246 243 273
Glicina 500mM
285 257 289 211 230 267
Prolina 500mM
308 257 268 231 229 259
Tabla 43. Distribución de tamaño molecular de IG en coformulaciones del 10% de IG/rHuPH20 con NaCI, glicina o prolina tras almacenamiento a 28-32°C
Muestra
0 (inicio) 6 meses
>450 kDa
-350 kDa -160 kDa <60 kDa >450 kDa -350 kDa -160 kDa <60 kDa
10% de IG + rHuPH20 100 U/ml + NaCI 250 mM
0,15 10,92 88,35 0,59 0,50 9,58 89,13 0,80
10% de IG + 300 U/ml rHuPH20 +NaCI 250 mM
0,14 11,05 88,27 0,54 0,46 9,59 89,11 0,84
10% de IG + rHuPH20 100 U/ml + NaCI 150 mM
0,14 11,07 88,15 0,65 0,45 9,71 88,97 0,87
10% de IG + rHuPH20 300 U/ml + NaCI 150 mM
0,14 11,42 87,82 0,62 0,45 9,76 89,09 0,70
10% de IG + rHuPH20 100 U/ml + NaCI 100 mM
0,18 11,29 87,91 0,63 0,38 9,36 89,53 0,74
10% de IG + rHuPH20 300 U/ml + NaCI 100 mM
0,13 11,43 87,89 0,55 0,38 9,32 89,52 0,78
10% de IG + rHuPH20 100 U/ml + qlicina 500 mM
0,16 10,67 88,55 0,62 0,12 8,12 90,92 0,84
10% de IG + rHuPH20 300 U/ml + qlicina 100 mM
0,16 10,80 88,43 0,61 0,16 8,17 90,95 0,73
10% de IG + rHuPH20 100 U/ml + prolina 500 mM
0,14 9,55 89,75 0,56 0,11 5,53 93,58 0,78
10% de IG + rHuPH20 300 U/ml + prolina 100 mM
0,14 9,43 89,86 0,57 0,12 5,65 93,52 0,71
10 Tabla 44. Distribución de tamaño molecular de IG en coformulaciones del 20% de IG/rHuPH20 con NaCI, glicina o prolina tras almacenamiento a 28-32°C
Muestra
0 (inicio) 6 meses
>450 kDa
-350 kDa -160 kDa <60 kDa >450 kDa -350 kDa -160 kDa <60 kDa
20% de IG + rHuPH20 100 U/ml + NaCI 250 mM
0,25 15,03 84,28 0,44 0,48 12,55 86,37 0,60
20% de IG + 300 U/ml rHuPH20 + NaCI 250 mM
0,26 15,12 84,16 0,46 0,51 12,53 86,36 0,59
20% de IG + rHuPH20 100 U/ml + NaC1150 mM
0,26 15,32 83,97 0,45 0,45 12,74 86,12 0,69
20% de IG + rHuPH20 300 U/ml + NaC1150 mM
0,25 15,21 84,08 0,46 0,47 12,78 86,13 0,61
20% de IG + rHuPH20 100 U/ml + NaC1100 mM
0,24 15,40 83,87 0,50 0,43 12,69 86,24 0,65
20% de IG + rHuPH20 300 U/ml + NaC1100 mM
0,25 15,53 83,81 0,42 0,48 12,72 86,17 0,63
20% de IG + rHuPH20 100 U/ml + qlicina 500 mM
0,21 14,40 84,99 0,39 0,22 12,31 86,90 0,56
10% de IG + rHuPH20 300 U/ml + qlicina 100 mM
0,21 14,38 85,00 0,41 0,22 12,47 86,73 0,58
20% de IG + rHuPH20 100 U/ml + prolina 500 mM
0,25 15,47 83,83 0,45 0,24 10,18 88,92 0,66
20% de IG + rHuPH20 300
0,25 15,72 83,54 0,49 0,24 10,35 88,81 0,61
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
| U/ml + prolina 100 mM |________|________|________|_______________________________|________|
Ejemplo 7
Efectos de rHuPH20 y el 10% de IG o el 20% de IG coformuladas en mlnlcerdos del Yucatán
A. Diseño experimental
Se determinó la viabilidad de la dosificación de rHuPH20 coformulada con disolución del 10% o el 20% de inmunoglobulina (IG) (NaCI 130 mM, histidina 10 mM, pH 6,6) por vía subcutánea en mlnlcerdos del Yucatán y se comparó con la dosificación de vanguardia (dosificación sucesiva de rHuPH20 seguida por disolución de IG). También se evaluó una respuesta a la dosis utilizando varias concentraciones de rHuPH20 para cada disolución de IG.
Se asignaron dieciocho minicerdos del Yucatán macho que pesaban 18,4 - 23,2 kg (SNS Farms) a uno o dos de once grupos de tratamiento tal como se muestran en la tabla 45 de modo que cada grupo utilizó tres cerdos. Se administraron todas las formulaciones por vía subcutánea con agujas Huber de ángulo suave a 90 grados de calibre 10 en los lomos de cerdos macho anestesiados. Para la dosificación de vanguardia, se inyectó rHuPH20 seguida por IgG consecutivamente usando la misma aguja en la ubicación exacta, empleando un cambio de jeringa sencillo. No se requirió ni se empleó retardo entre la dosificación de rHuPH20 e IgG. Se sometieron a prueba hasta dos formulaciones diferentes, cada una de un grupo de tratamiento diferente, en cada cerdo a un valor máximo de 110 mi por sitio de inyección. Las infusiones duraron aproximadamente 20 minutos para las coformulaclones y 22-28 minutos para las formulaciones de vanguardia.
Tabla 45. Resumen de diseño experimental
Grupo
Tratamiento Tipo de dosis Volumen de dosis total (ml)
1
100 mi del 10% de IG Coformulación 100
2
100 ml del 10% de IG / rHuPH20 (50 U/ml) Coformulación 100
3
100 ml del 10% de IG / rHuPH20 (100 U/ml) Coformulación 100
4
100 ml del 10% de IG / rHuPH20 (300 U/ml) Coformulación 100
5
50 ml del 20% de IG Coformulación 50
6
50 ml del 20% de IG / rHuPH20 (50 U/ml) Coformulación 50
7
50 ml del 20% de IG / rHuPH20 (100 U/ml) Coformulación 50
8
50 ml del 20% de IG / rHuPH20 (300 U/ml) Coformulación 50
9
10 ml de rHuPH20 (150 U/ml)+ 100 ml del 10% de IG De vanguardia 110
10
20 ml de rHuPH20 (150 U/ml) + 50 ml del 20% de IG De vanguardia 60
11
20 ml de rHuPH20 (150 U/ml) + 50 ml del 20% de IG De vanguardia 70
Se evaluaron las observaciones en el sitio de inyección tras la dosificación. Se utilizaron transductores para medir la presión continua (mmHg) ejercida para administrar cada formulación, y se recogió sangre para recuento de sangre completa (CBC) y análisis de inmunoglobulina gamma (IgG). A la terminación del estudio, 3 días tras la dosificación, se sacrificaron todos los animales y se recogieron dos secciones de muestra (A y B) de cada de sitio de inyección 1, sitio de inyección 2 y control (recogido de un sitio distante de los dos sitios de inyección) y se conservaron en formalina tamponada neutra al 10%, y se evaluaron mediante microscopía óptica (Nova Pathology, PC, San Diego, CA). El sitio A era una sección de 2-3 mm de grosor a través del centro del sitio de inyección y el sitio B era una sección de 2-3 mm de grosor tomada del extremo del sitio de inyección recogido.
B. Observaciones del sitio de inyección
En el plazo de 5 minutos de la dosificación del 10% de IG sola (~ 25 mi en infusión; grupo 1), era visible una “ampolla” distinta en los tres cerdos. Aproximadamente 10 minutos tras la dosificación del 20% de IG sola (~ 25 mi en infusión; grupo 5), era visible una ampolla distinta. El área de formación de ampollas observada aumentó con todas las formulaciones que contenían rHuPH20 (incluyendo la de vanguardia) en comparación con la dosificación de IG sola, lo que significa mayor dispersión de fluidos cuando se utiliza rHuPH20 (tabla 46).
Coformulaciones de rHuPH20 con el 10% y el 20% de IG dieron como resultado un endurecimiento significativamente reducido de la piel a todas las concentraciones de rHuPH20 (los sitios permanecieron blandos), y color rosa/enrojecimiento reducido de la piel en todos las concentraciones de rHuPH20. La dosificación de comparación de vanguardia dio como resultado observaciones de color rosa/enrojecimiento similares como coformulaciones. Las apariciones de color rosa/enrojecimiento en sitios de inyección observadas tras la dosificación mostraron una recuperación completa en el plazo de 24 horas para todos los grupos (tabla 46).
Tabla 46. Aspecto del sitio de inyección y análisis
Grupo
Tratamiento Área de ampolla media (cm2) Observación de ampollas media
1
100 mi del 10% de IG 97,5 Ligeramente rosa; duro
2
100 mi del 10% de IG / rHuPH20 (50 U/ml) 91,7 Ligeramente rosa; blando
3
100 mi del 10% de IG / rHuPH20 (100 U/ml) 180,3 Ligeramente rosa/rosa; blando
4
100 mi del 10% de IG / rHuPH20 (300 U/ml) 178,0 Ligeramente rosa/rosa; blando
5
50 mi del 20% de IG 95,2 Rosa/roio; duro
6
50 mi del 20% de IG / rHuPH20 (50 U/ml) 102,6 Rosa/roio; blando
7
50 mi del 20% de IG / rHuPH20 (100 U/ml) 111,9 Ligeramente rosa/rosa; blando
8
50 mi del 20% de IG / rHuPH20 (300 U/ml) 111,1 Normal; blando
9
10 mi de rHuPH20 (150 U/ml) + 100 mi del 10% de IG 173,5 Normal; blando
10
20 mi de rHuPH20 (150 U/ml) + 50 mi del 20% de IG 116,8 Normal/ligeramente rosa; blando
11
20 mi de rHuPH20 (150 U/ml) + 50 mi del 20% de IG 131,4 Normal/ligeramente rosa; blando
C. Observaciones de medición de la presión
5 La tabla 47 resume las mediciones de presión media. A los 2,5 minutos o más pronto tras la dosificación del 20% de IG sola (grupo 5), las presiones estaban fuera del Intervalo medlble (>460 mmHg) para los tres cerdos. Dos de tres cerdos estaban fuera del intervalo de presión medible en el grupo 6, y un cerdo estaba fuera para cada uno de los grupos 7 y 8. Los grupos 1 y 2 tenían cada uno un cerdo fuera del intervalo. Los resultados muestran que la presión necesaria para lograr las inyecciones disminuyó con todas las coformulaciones que contenían rHuPH20.
10
Tabla 47. Análisis de medición de presión media
Grupo
N Presión media (mmHg) Presión máx. de elevación (mmHg) Presión máx. (mmHg) Tiempo máx. de elevación (min) Tiempo máx. (min)
1
2 242 266 281 2,7 5,1
2
2
209 N/A* 223 N/A* 4,0
3
3
164 0,3 223 0,3 4,1
4
3 289 0,5 255 0,5 2,3
5
0 N/A N/A N/A N/A N/A
6
1 164 250 250 1,6 1,6
7
2 179 215 215 0,7 0,7
8
2 194 188 203 1,6 4,6
9
3 117 119 125 1,9 4,9
10
3 241 232 261 3,8 12,9
11
3 241 281 264 4,7 15,2
N/A = No disponible, >460 mmHg 15
N/A* = Curva de elevación del registro de presión poco clara de interpretar
D. Recuento de sangre completa y análisis de plasma de IgG
20 Se recogió sangre en tubos K3EDTA antes de la dosis (~2,0 mi) y a los 30 minutos tras la dosificación (~2,0 mi) para el análisis de recuento de sangre completa (CBC). Se almacenaron las muestras a 4°C hasta el análisis (Bloquant, Inc., San Diego, CA). Los resultados de CBC no dan ningún problema de seguridad relacionado con el producto. La mayoría de los cerdos permanecen dentro de niveles de CBC normales (intervalo de CBC normal al que se hace referencia de SNS farms). Cinco de dieciocho cerdos tenían coágulos no visibles en las muestras y no pudieron 25 evaluarse.
Se recogió sangre para el análisis de inmunoglobulina gamma (IgG) en tubos con citrato de sodio antes de la dosis (~2,0 mi) y a la terminación del estudio (~4,0 mi) para confirmar la disponibilidad sistémica tras la administración subcutánea de IgG humana. Se centrifugaron las muestras a 4°C durante 10 minutos a 3000 rpm, se alicuotó el
plasma y se almacenaron las muestras a -20°C hasta su análisis. Se observó un aumento general en IgG en los todos los animales tras 3 días de la administración, tal como se muestra en la tabla 48. Los niveles en plasma de IgG para cada cerdo reflejan la media de los dos tratamientos diferentes que se administraron a cada cerdo (con la excepción de los cerdos 7-9 que recibieron solamente un único tratamiento).
5
Tabla 48. Análisis de IgG
N.° de cerdo
Grupo(s) de tratamiento ____________IgG (g/l)____________
Predosis
Terminación
1
1 y 2 3,46 8,53
2
1 y 2 2,97 9,27
3
1 y 2 4,35 9,03
4
3 y 4 6,67 10,51
5
3 y 4 3,81 10,15
6
3 y 4 4,79 9,83
7
5 4,96 6,06
8
5 3,50 5,94
9
5 3,73 6,86
10
6 y 7 2,83 8,19
11
6 y 7 3,47 10,08
12
6 y 7 4,08 11,12
13
8 y 9 5,07 9,62
14
8 y 9 4,02 8,82
15
8 y 9 3,94 8,63
16
10 y 11 3,97 9,25
17
10 y 11 4,60 9,68
18
10 y 11 4,76 9,51
E. Resultados de hlstopatología
10
Estaban presentes hallazgos hlstopatológicos en la epidermis, dermis y tejido subcutáneo, y contenían una mezcla de Inflamación de leucocitos, edema y hemorragia. Se asignó cada hallazgo histopatológico a un grado de gravedad basándose en el siguiente esquema: No presente: 0; presente, no graduado: 0; mínimo: 1; leve: 2; moderado: 3; marcado: 4. Los hallazgos histopatológicos se resumen por la incidencia y la puntuación de gravedad de grupo 15 media en las tablas 49-51.
Tabla 49. Resumen de hallazgos histológicos: el 10% de IG + rHuPH20
Hallazgos histológicos
Grupo de tratamiento
1
2 3 4
Inflamación, leucocitos mixtos, subcutánea
6/6* 6/6 5/6 6/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
1,83 1,00 1,00 1,17
Edema, subcutáneo
6/6 5/6 6/6 5/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
2,00 0,83 1,00 1,17
Hemorragia, subcutánea
3/6 3/6 2/6 1/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
0,67 0,50 0,33 0,33
Suma de puntuaciones de gravedad de grupo medias
4,50 2,33 2,33 2,67
20 * Número de secciones afectadas / número de secciones evaluadas
** Suma de puntuaciones de gravedad en el grupo dividida entre el número de secciones evaluadas en el grupo
Tabla 50. Sumario de hallazgos histológicos: el 20% de IG + rHuPH20 25 __________ ____________
Hallazgos histológicos
Grupo de tratamiento
5
6 7 8
Inflamación, leucocitos mixtos, subcutánea
6/6* 6/6 5/6 6/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
1,00 1,17 1,00 2,17
Edema, subcutáneo
6/6 6/6 5/6 5/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
1,17 1,17 1,17 2,00
5
10
15
20
25
30
Hemorragia, subcutánea
0/6 2/6 0/6 1/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
0,00 0,33 0,00 0,17
Suma de puntuaciones de gravedad de grupo medias
2,17 2,67 2,17 4,34
* Número de secciones afectadas / número de secciones evaluadas
** Suma de puntuaciones de gravedad en el grupo dividida entre el número de secciones evaluadas en el grupo Tabla 51. Sumario de hallazgos histológicos: Dosificación de vanguardia
Hallazgos histológicos
Grupo de tratamiento
9
10 11
Inflamación, leucocitos mixtos, subcutánea
6/6* 6/6 6/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
1,17 1,17 1,17
Edema, subcutáneo
5/6 6/6 6/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
1,50 1,67 1,83
Hemorragia, subcutánea
1/6 3/6 1/6
Puntuación de gravedad de grupo media**
0,17 0,67 0,17
Suma de puntuaciones de gravedad de grupo medias
2,84 3,51 3,17
* Número de secciones afectadas / número de secciones evaluadas
** Suma de puntuaciones de gravedad en el grupo dividida entre el número de secciones evaluadas en el grupo
La respuesta a la administración de IG y rHuPH20 era cualitativamente similar en cada grupo de dosis en este estudio. Se caracterizaron estas respuestas mediante inflamación de leucocitos mixta, edema y hemorragia en el tejido subcutáneo en los sitios de inyección. La tabla 52 compara la puntuación gravedad de grupos media en todos los grupos de dosis.
Tabla 52. Resumen de las puntuaciones de gravedad de grupos media
Grupo
Tratamiento Tipo de dosis Volumen de dosis total (mi)
1
100 mi del 10% de IG Coformulación 4,50
2
100 mi del 10% de IG / rHuPH20 (50 U/ml) Coformulación 2,33
3
100 mi del 10% de IG / rHuPH20 (100 U/ml) Coformulación 2,33
4
100 mi del 10% de IG / rHuPH20 (300 U/ml) Coformulación 2,67
5
50 mi del 20% de IG Coformulación 2,17
6
50 mi del 20% de IG / rHuPH20 (50 U/ml) Coformulación 2,67
7
50 mi del 20% de IG / rHuPH20 (100 U/ml) Coformulación 2,17
8
50 mi del 20% de IG / rHuPH20 (300 U/ml) Coformulación 4,34
9
10 mi de rHuPH20 (150 U/ml) + 100 mi del 10% de IG De vanguardia 2,84
10
20 mi de rHuPH20 (150 U/ml) + 50 mi del 20% de IG De vanguardia 3,51
11
20 mi de rHuPH20 (150 U/ml) + 50 mi del 20% de IG De vanguardia 3,17
Basándose en las puntuaciones de gravedad de grupos media, las respuestas en el sitio de inyección más graves estaban asociadas con la administración de 100 mi del 10% de IG sola (grupo 1) y con la administración de 50 mi del 20% de IG coformulada con rHuPH20 300 U/ml (grupo 8). La respuesta a la administración de 100 mi del 10% de IG coformulada con rHuPH20 a 50, 100 y 300 U/ml del 10% de IG (grupos 2-4) era similar a la respuesta a la administración de 50 mi del 20% de IG sola (grupo 5), coformulada con rHuPH20 a 50 y 100 U/ml del 20% de IG (grupos 6 y 7), y dosificación de vanguardia con 10 mí de rHuPH20 (150 U/ml) seguido por 100 mi del 10% de IG (grupo 9). Sin embargo, la dosificación de vanguardia con 10 ó 20 mi de rHuPH20 (150 U/ml) seguido por 50 mi del 20% de IG (grupos 10 y 11) dio como resultado una respuesta más grave que coformulaciones similares (grupos 6 y 7). Secciones de piel control contenían pocos hallazgos histológicos, lo que puede atribuirse a la difusión de las formulaciones inyectadas desde los sitios de inyección de artículo de prueba, y hallazgos incidentales no relacionados con las formulaciones.
F. Resumen

Claims (18)

10
15
20
2.
25
30
35
40
3.
45 4.
50
5.
55
6.
60 7.
Composición estable formulada para administración subcutánea, en la que: la composición estable es una coformulación liquida; la composición tiene un pH de entre 4 y 5, incluidos; y la composición comprende:
inmunoglobulina (IG) a una concentración que es de al menos el 10% p/v;
una hialuronidasa soluble a una concentración que es de al menos 50 U/ml y está presente en una cantidad suficiente para permitir la administración subcutánea de la composición en un único sitio de inyección a una velocidad de infusión igual a o mayor que la velocidad de infusión intravenosa para inmunoglobulina intravenosa; y
una sal de cloruro de metal alcalino a una concentración de al menos 0,05 M,
mediante lo cual la coformulación es estable a temperaturas de hasta 32°C durante al menos 6 meses. Composición estable formulada para administración subcutánea, en la que: la composición estable es una coformulación líquida; la composición tiene un pH de entre 4 y 5, incluidos; y la composición comprende:
inmunoglobulina (IG) a una concentración que es de al menos el 10% p/v;
una hialuronidasa soluble a una concentración que es de al menos 50 U/ml y está presente a una razón de al menos 100 unidades/gramo (U/g) de IG; y
una sal de cloruro de metal alcalino a una concentración de al menos 0,05 M,
mediante lo cual la coformulación es estable a temperaturas de hasta 32°C durante al menos 6 meses.
Coformulación líquida, estable según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además un estabilizador de aminoácido en una cantidad que es de al menos 0,1 M, preferiblemente en la que el estabilizador de aminoácido se selecciona de entre alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina y prolina, más preferiblemente, en la que el estabilizador de aminoácido es glicina o prolina.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el estabilizador de aminoácido es al menos 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M o 0,75 M, preferiblemente en la que el estabilizador de aminoácido es 0,25 M.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la IG es al menos el 10% p/v, el 11% p/v, el 12% p/v, el 13% p/v, el 14% p/v, el 15% p/v, el 16% p/v, el 17% p/v, el 18% p/v, el 19% p/v, el 20% p/v, el 21% p/v, el 22% p/v o más, preferiblemente en la que la IG es de entre el 10% p/v y el 20% p/v.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la IG es de plasma humano, preferiblemente en la que la IG se purifica a partir de plasma humano mediante un método de purificación que comprende fraccionamiento con alcohol, más preferiblemente en la que la IG se purifica adicionalmente mediante uno cualquiera o más de una precipitación con polietilenglicol (PEG), cromatografía de intercambio iónico, escisión enzimática, diafiltración o ultrafiltración.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la IG se somete a una etapa de reducción viral seleccionada de entre incubación a pH 4,0 con o sin pepsina, tratamiento con detergente disolvente y nanofiltración.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la IG contiene IgG, IgA e IgM, preferiblemente en la que la IG contiene más del 95% de IgG.
9.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la sal de cloruro de metal alcalino se selecciona de entre KCI y NaCI, preferiblemente en la que la sal de cloruro de metal alcalino es NaCI y el NaCI es 0,025 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, o 0,25 M, más preferiblemente en la que el NaCI es 0,15 M.
5 10.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la hialuronidasa soluble es una PH20, o una forma truncada de la misma, preferiblemente en la que la PH20 selecciona de una PH20 ovina, bovina o humana truncada, más preferiblemente en la que PH20 es una PH20 humana truncada y la PH20 humana truncada se selecciona de entre polipéptidos que tienen una secuencia de
10
aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 4-9, o variantes alélicas u otras variantes de las mismas.
11.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la hialuronidasa soluble se designa rHuPH20.
15 12.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que la hialuronidasa soluble está a una concentración de 50 U/ml, 100 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ mi o más, preferiblemente en la que la hialuronidasa soluble está a una concentración de 75 U/ml a 350 U/ml.
20 13.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que la hialuronidasa soluble está a una razón de 100 U/g de IG, 150 U/g de IG, 200 U/g de IG, 250 U/g de IG, 300 U/g de IG, 400 U/g de IG, 500 U/g de IG, 600 U/g de IG, 700 U/g de IG, 800 U/g de IG, 900 U/g de IG, 1000 U/g de IG, 1200 U/g de IG, 1500 U/g de IG, 1800 U/g de IG, 2000 U/g de IG, 3000 U/g de IG, 4000 U/g de IG o 5000 U/g de IG, preferiblemente en la que la hialuronidasa soluble está a una razón de 250 U/g de IG,
25
500 U/g de IG, 1000 U/g de IG, 1500 U/g de IG o 3000 U/g de IG.
14.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 que tiene un pH de 4,4 a 4,9 en forma concentrada.
30 15.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que la coformulación es para administración de dosificación múltiple o para administración de dosificación individual.
16.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en la que la IG está en una cantidad suficiente para administración de dosificación individual para tratar una enfermedad o un estado
35
que puede tratarse con IG, preferiblemente en la que la cantidad de IG está en una cantidad suficiente para administración de dosificación individual diariamente, semanalmente, bisemanalmente, cada 2-3 semanas, cada 3-4 semanas o mensualmente para el tratamiento de una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG.
40 17.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en la que la cantidad de IG en la coformulación es sustancialmente igual que la cantidad en una administración de dosificación individual cuando se administra por vía intravenosa para el tratamiento de una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG.
45 18.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en la que la coformulación es para administración de dosificación individual y la cantidad de IG es de al menos 1 gramo (g), 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g o 200 g o es 1-200 g, 1-100 g, 10-100 g, 5- 50 g, 6-50 g o 5-100 g.
50 19.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en la que la coformulación es para administración de dosificación individual y la cantidad de hialuronidasa en la composición es de al menos 500 unidades, 1000 unidades, 2000 unidades, 5000 unidades, 10.000 unidades, 30.000 unidades, 40.000 unidades, 50.000 unidades, 60.000 unidades, 70.000 unidades, 80.000 unidades, 90.000 unidades, 100.000 unidades o más.
55 20.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, que es estable a 28°C-32°C durante 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses o más.
21. 60
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-20, que es estable además a 0°C- 10°C durante 6 meses, 1 año, 2 años o más.
22.
Kit, que comprende la coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, y opcionalmente instrucciones para su uso.
65 23.
Recipiente, que comprende la coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, preferiblemente en el que el recipiente es un tubo, un frasco, un vial o una jeringa.
24.
25.
26.
10 27.
15
28.
20
Recipiente según la reivindicación 23, que comprende además una aguja para inyección.
Recipiente según la reivindicación 23 ó 24, en el que se proporciona la coformulación líquida, estable para administración de dosificación individual o administración de dosificación múltiple.
Kit, que comprende el recipiente según cualquiera de las reivindicaciones 23-25, y un medio para infundir la composición.
Uso de una coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-21 para formulación de un medicamento para tratar una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG, preferiblemente en el que la enfermedad o el estado que puede tratarse con IG se selecciona de entre enfermedades de inmunodeficiencia primaria, enfermedades de inmunodeficiencia secundaria, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias e infecciones agudas.
Coformulación líquida, estable según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un estado que puede tratarse con IG, preferiblemente en el que la enfermedad o el estado que puede tratarse con IG se selecciona de entre enfermedades de inmunodeficiencia primaria, enfermedades de inmunodeficiencia secundaria, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias e infecciones agudas.
ES10760140.3T 2009-09-17 2010-09-16 Coformulación estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y métodos de uso de la misma Active ES2578478T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27704509P 2009-09-17 2009-09-17
US277045P 2009-09-17
PCT/US2010/002545 WO2011034604A2 (en) 2009-09-17 2010-09-16 Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2578478T3 true ES2578478T3 (es) 2016-07-27

Family

ID=43034406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10760140.3T Active ES2578478T3 (es) 2009-09-17 2010-09-16 Coformulación estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y métodos de uso de la misma

Country Status (19)

Country Link
US (1) US9084743B2 (es)
EP (1) EP2477603B1 (es)
JP (1) JP5734985B2 (es)
KR (1) KR101441768B1 (es)
CN (1) CN102655853B (es)
AU (1) AU2010296017C1 (es)
BR (1) BR112012005890B1 (es)
CA (1) CA2774053C (es)
CO (1) CO6460736A2 (es)
DK (1) DK2477603T3 (es)
EA (1) EA026112B1 (es)
ES (1) ES2578478T3 (es)
HR (1) HRP20160530T1 (es)
HU (1) HUE028832T2 (es)
IN (1) IN2012DN03219A (es)
MX (1) MX2012003282A (es)
PL (1) PL2477603T3 (es)
PT (1) PT2477603E (es)
WO (1) WO2011034604A2 (es)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2330213A1 (en) 2003-03-05 2011-06-08 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CN101970650B (zh) 2008-03-06 2017-07-25 哈洛齐梅公司 可溶性透明质酸酶的大规模生产
TWI489994B (zh) 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
WO2009128917A2 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
CA2736141C (en) * 2008-09-23 2018-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Purification of erythropoietin
PT2477603E (pt) 2009-09-17 2016-06-16 Baxalta Inc Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos para a sua utilização
DK2531218T3 (en) 2010-02-04 2019-04-01 Csl Behring Ag immunoglobulin
US10420923B1 (en) 2010-08-10 2019-09-24 Amiram Katz Method and device for intrathecal administering of immunoglobulin
EP2720712B1 (en) 2011-06-17 2016-03-02 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
CA2853358A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
US9186295B2 (en) 2011-10-25 2015-11-17 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
SG11201403714TA (en) 2011-12-30 2014-07-30 Halozyme Inc Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
US9664671B2 (en) 2012-07-24 2017-05-30 Nissan Chemical Industries, Ltd. Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof
TWI719468B (zh) * 2012-07-24 2021-02-21 日商日產化學股份有限公司 培養基組成物、其用途、細胞或組織之培養方法及細胞或組織培養物
US10017805B2 (en) 2012-08-23 2018-07-10 Nissan Chemical Industries, Ltd. Enhancing ingredients for protein production from various cells
JP2015532919A (ja) * 2012-09-26 2015-11-16 ボーン セラピューティクス エス．アー． 溶剤／界面活性剤処理された血漿（ｓ／ｄ血漿）を含む製剤及びその使用
KR101454646B1 (ko) 2012-11-05 2014-10-27 (주)한국비엠아이 히알루로니다아제의 안정화 제제 및 이를 포함하는 액상제제
US9717649B2 (en) 2013-04-24 2017-08-01 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9707153B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9839579B2 (en) 2013-04-24 2017-12-12 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9713572B2 (en) 2013-04-24 2017-07-25 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9707155B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9707154B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9717648B2 (en) 2013-04-24 2017-08-01 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9849066B2 (en) 2013-04-24 2017-12-26 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9700485B2 (en) 2013-04-24 2017-07-11 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9700486B2 (en) * 2013-04-24 2017-07-11 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
HUE044737T2 (hu) 2013-05-06 2019-11-28 Baxalta Inc Alzheimer-kór szubpopulációk kezelése egyesített immunglubulin G-vel
IL312865B2 (en) 2013-09-11 2025-06-01 Eagle Biologics Inc Liquid protein formulations containing viscosity-lowering agents
US9603927B2 (en) 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
WO2015196091A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Reform Biologics, Llc Viscosity-reducing excipient compounds for protein formulations
US11357857B2 (en) 2014-06-20 2022-06-14 Comera Life Sciences, Inc. Excipient compounds for protein processing
US10478498B2 (en) 2014-06-20 2019-11-19 Reform Biologics, Llc Excipient compounds for biopolymer formulations
JP6629325B2 (ja) 2014-08-22 2020-01-15 ネクタジェン，インコーポレーテッド 親和性タンパク質及びその使用
WO2016040294A2 (en) 2014-09-09 2016-03-17 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-cd38 antibodies
SG11201702614SA (en) 2014-10-01 2017-04-27 Eagle Biolog Inc Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
CN121371151A (zh) 2014-12-03 2026-01-23 瑞士杰特贝林生物制品有限公司 具有增加的稳定性的包含免疫球蛋白的药物产品
PE20171094A1 (es) 2014-12-04 2017-08-07 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-cd38 para el tratamiento de la leucemia linfoblastica aguda
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
CR20170526A (es) * 2015-05-20 2018-04-03 Janssen Biotech Inc ANTICUERPOS ANTI-CD38 PARA EL TRATAMIENTO DE AMILOIDOSIS DE CADENA LIGERA y OTRAS ENFERMEDADES MALIGNAS HEMATOLÓGICAS POSITIVAS PARA CD38
CN107708734B (zh) 2015-06-22 2022-01-11 詹森生物科技公司 用抗cd38抗体和生存素抑制剂联合治疗血红素恶性肿瘤
US20170044265A1 (en) 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
JP7027321B2 (ja) 2015-11-03 2022-03-01 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３８抗体の皮下製剤及びその使用
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
KR20240011868A (ko) * 2016-04-29 2024-01-26 이노비오 파마수티컬즈, 인크. 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도
WO2018002181A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Umc Utrecht Holding B.V. TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASES WITH ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND CD38
EP3612221A1 (en) * 2017-04-21 2020-02-26 CSL Behring AG Immunoglobulin products for use in the treatment of chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma
MA51032A (fr) 2017-12-08 2021-03-17 Argenx Bvba Utilisation d'antagonistes de fcrn pour le traitement de la myasthénie grave généralisée
KR20200140799A (ko) * 2018-01-31 2020-12-16 더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지 호흡기 세포융합 바이러스에 대하여 사용하기 위한 핵산 항체 작제물
JP7486437B2 (ja) 2018-06-08 2024-05-17 アルジェニクス ビーブイ 免疫性血小板減少症を治療する組成物及び方法
MX2020009824A (es) 2018-07-25 2021-01-15 Alteogen Inc Nuevas variantes de hialuronidasa y composicion farmaceutica que comprende la misma.
MY204234A (en) 2018-08-27 2024-08-16 Regeneron Pharma Use of raman spectroscopy in downstream purification
US20200206132A1 (en) * 2018-12-31 2020-07-02 Incube Labs, Llc Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
CN112203642B (zh) 2019-03-25 2025-03-07 阿特根公司 用于皮下注射的包含人透明质酸酶ph20变体和药物的药物组合物
CN110728044B (zh) * 2019-09-30 2022-08-02 哈尔滨工程大学 一种针对于活塞环槽内气体压力状态的集成计算方法
ES2992247T3 (es) 2020-01-08 2024-12-11 argenx BV Antagonistas del receptor de Fc neonatal humano (FcRn) para el tratamiento de trastornos del pénfigo
TW202615652A (zh) 2020-01-23 2026-04-16 南韓商阿特根公司 新穎的具有改善的穩定性的玻尿酸酶變異體及含有其的醫藥組合物
WO2022031093A1 (ko) 2020-08-07 2022-02-10 (주)알테오젠 재조합 히알루로니다제의 생산 방법
KR102265730B1 (ko) * 2020-11-06 2021-06-17 주식회사 본에스티스 피부 주름 개선 및 미백용 화장료 조성물
MX2023005760A (es) * 2020-11-17 2023-07-31 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno.
WO2023012515A2 (en) * 2021-08-02 2023-02-09 argenx BV Subcutaneous unit dosage forms
WO2023042096A1 (en) * 2021-09-14 2023-03-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Facilitated delivery of concentrated antibody formulations using hyaluronidase
CA3236277A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Soon Jae Park Pharmaceutical composition comprising human hyaluronidase ph20 and drug
EP4490042A4 (en) 2022-03-08 2026-03-04 Equashield Medical Ltd FLUID TRANSFER STATION IN A ROBOTIC PHARMACEUTICAL PREPARATION SYSTEM
KR20250037789A (ko) 2022-06-15 2025-03-18 아르젠엑스 비브이 Fcrn/항원-결합 분자 및 사용 방법
CN119894932A (zh) * 2022-07-28 2025-04-25 默沙东有限责任公司 程序性死亡受体1（PD-1）抗体和rHuPH20或其变体或片段的药物组合物
CN115957332B (zh) * 2022-11-01 2023-10-10 北京华睿鼎信科技有限公司 透明质酸酶稳定的布瑞诺龙纳米晶及其制备方法与应用
KR20250134732A (ko) 2022-12-22 2025-09-11 할로자임, 아이엔씨 대용량 투여를 위한 히알루로니다아제 효소 제형
KR102554775B1 (ko) * 2023-02-07 2023-07-12 한국코러스 주식회사 히알루로니다제의 안정화제 및 이를 포함하는 히알루로니다제 제형
KR20260015262A (ko) 2023-05-25 2026-02-02 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 암 치료를 위한 클라우딘-6 접합체의 투여량
WO2026151297A1 (ko) * 2025-01-10 2026-07-16 삼성바이오에피스 주식회사 안정한 히알루로니다제 액상 제형
WO2026151298A1 (ko) * 2025-01-10 2026-07-16 삼성바이오에피스 주식회사 안정한 히알루로니다제 액상 제형

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3966906A (en) 1961-10-11 1976-06-29 Behringwerke Aktiengesellschaft Disaggregated gamma globulin and process for preparing it
US3869436A (en) 1971-06-01 1975-03-04 Statens Bakteriologiska Lab Method for fractionating plasma proteins using peg and ion-exchangers
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5420124B2 (es) 1974-01-16 1979-07-20
CA1064396A (en) 1975-02-18 1979-10-16 Myer L. Coval Fractional precipitation of gamma globulin with polyethylene glycol
JPS5731623B2 (es) 1975-02-19 1982-07-06
US4126605A (en) 1975-12-29 1978-11-21 Plasmesco Ag Process of improving the compatibility of gamma globulins
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4165370A (en) 1976-05-21 1979-08-21 Coval M L Injectable gamma globulin
US4124576A (en) 1976-12-03 1978-11-07 Coval M L Method of producing intravenously injectable gamma globulin
JPS5420124A (en) 1977-07-14 1979-02-15 Green Cross Corp:The Preparation of gamma-globulin intravenous injection
US4186192A (en) 1978-12-18 1980-01-29 Cutter Laboratories, Inc. Stabilized immune serum globulin
US4362661A (en) 1979-08-09 1982-12-07 Teijin Limited Immunoglobulin composition having a high monomer content, and process for production thereof
US4374763A (en) 1979-09-17 1983-02-22 Morishita Pharmaceutical Co., Ltd. Method for producing gamma-globulin for use in intravenous administration and method for producing a pharmaceutical preparation thereof
JPS5731623A (en) 1980-07-30 1982-02-20 Morishita Seiyaku Kk Production of gamma-globulin for intravenous injection
JPS57128635A (en) 1981-01-30 1982-08-10 Morishita Seiyaku Kk Pharmaceutical preparation of gamma-globulin for venoclysis
US4499073A (en) 1981-08-24 1985-02-12 Cutter Laboratories, Inc. Intravenously injectable immune serum globulin
US4396608A (en) 1981-08-24 1983-08-02 Cutter Laboratories Intravenously injectable immune serum globulin
US4439421A (en) 1982-08-30 1984-03-27 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Stabilized gamma globulin concentrate
DK166763B1 (da) 1983-03-16 1993-07-12 Immuno Ag Immunoglobulin-g-holdig fraktion
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
JPH0669961B2 (ja) 1984-09-25 1994-09-07 株式会社ミドリ十字 免疫グロブリンの加熱処理方法
US4597966A (en) 1985-01-09 1986-07-01 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Histidine stabilized immunoglobulin and method of preparation
JPH0662436B2 (ja) 1986-05-19 1994-08-17 株式会社ミドリ十字 静注用免疫グロブリン製剤の製造方法
JP2547556B2 (ja) 1987-02-06 1996-10-23 株式会社 ミドリ十字 ｒ−グロブリンの液状製剤
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
JP2871709B2 (ja) 1988-11-21 1999-03-17 住友製薬株式会社 免疫グロブリンｇ結合活性を有する新規な蛋白質プロテインｈ、該蛋白質をコードする遺伝子及び該蛋白質の製造法
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE3921528A1 (de) 1989-06-30 1991-01-10 Draegerwerk Ag Messzelle fuer den elektrochemischen gasnachweis
US5945098A (en) 1990-02-01 1999-08-31 Baxter International Inc. Stable intravenously-administrable immune globulin preparation
US5177194A (en) 1990-02-01 1993-01-05 Baxter International, Inc. Process for purifying immune serum globulins
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5721348A (en) 1990-12-14 1998-02-24 University Of Connecticut DNA encoding PH-20 proteins
AT402261B (de) 1991-01-25 1997-03-25 Immuno Ag Komplex enthaltend den gerinnungsfaktor ix
JPH04346934A (ja) 1991-05-24 1992-12-02 Green Cross Corp:The γ−グロブリンの液状製剤
CH684164A5 (de) 1992-01-10 1994-07-29 Rotkreuzstiftung Zentrallab Intravenös anwendbare Immunglobulinlösung.
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
FR2706466B1 (fr) 1993-06-14 1995-08-25 Aetsrn Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré.
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
DE4344824C1 (de) 1993-12-28 1995-08-31 Immuno Ag Hochkonzentriertes Immunglobulin-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
US5795569A (en) 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
EE9600121A (et) 1994-03-31 1997-04-15 Amgen Inc. Megakarüotsüütide kasvu ja diferentseerumist stimuleerivad kompositsioonid ja meetodid
GB9418092D0 (en) 1994-09-08 1994-10-26 Red Cross Found Cent Lab Blood Organic compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5747027A (en) 1995-04-07 1998-05-05 The Regents Of The University Of California BH55 hyaluronidase
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6828431B1 (en) 1999-04-09 2004-12-07 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US5958750A (en) 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase
US5665069A (en) 1996-07-19 1997-09-09 Cumer; Patricia Lynn Pressure-directed peribulbar anesthesia delivery device
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6123938A (en) 1996-10-17 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Human urinary hyaluronidase
US6193963B1 (en) 1996-10-17 2001-02-27 The Regents Of The University Of California Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
JP4270590B2 (ja) * 1997-03-19 2009-06-03 田辺三菱製薬株式会社 免疫グロブリン製剤
GB9705810D0 (en) 1997-03-20 1997-05-07 Common Services Agency Intravenous immune globulin
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
AT405739B (de) 1997-09-19 1999-11-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von antithrombin iii
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
CA2323048C (en) 1998-03-12 2006-10-10 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
WO2000002017A2 (en) 1998-07-03 2000-01-13 Neles Field Controls Oy Method and arrangement for measuring fluid
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
CA2394980C (en) 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US20030212021A1 (en) * 2001-01-25 2003-11-13 Frost Gregory I. Myeloid colony stimulating factor and uses thereof
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
NZ522847A (en) 2000-05-16 2004-11-26 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
EP1345628B1 (en) 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
ES2184594B1 (es) 2001-01-17 2004-01-01 Probitas Pharma Sa Procedimiento para la produccion de gammaglobulina g humana inactivada de virus.
US6571605B2 (en) 2001-01-19 2003-06-03 Larry Keith Johnson Constant-head soil permeameter for determining the hydraulic conductivity of earthen materials
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
EP1446438A2 (en) 2001-11-07 2004-08-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
JP2005510229A (ja) 2001-11-28 2005-04-21 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド アミダーゼを用いる糖タンパク質のリモデリング
US7192468B2 (en) 2002-04-15 2007-03-20 Fluor Technologies Corporation Configurations and method for improved gas removal
JP2004147535A (ja) 2002-10-29 2004-05-27 Japan Science & Technology Agency ギラン・バレー症候群及び／又はフィッシャー症候群発症モデル非ヒト動物
KR20040040782A (ko) 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
HUE035898T2 (en) 2002-12-16 2018-05-28 Genentech Inc Immunoglobulin variants and their applications
US7544499B2 (en) 2002-12-16 2009-06-09 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (CHASEGP), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
JP2004238392A (ja) * 2003-01-14 2004-08-26 Nipro Corp 安定化された蛋白質性製剤
CN103040732B (zh) * 2003-02-10 2015-04-01 伊兰药品公司 免疫球蛋白制剂及其制备方法
EP1596887B1 (en) 2003-02-26 2022-03-23 Nektar Therapeutics Polymer-factor viii moiety conjugates
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
EP2330213A1 (en) * 2003-03-05 2011-06-08 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
JP4346934B2 (ja) 2003-03-25 2009-10-21 日本碍子株式会社 セラミックス構造体の製造方法
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
PT2644206T (pt) 2003-05-23 2019-07-10 Nektar Therapeutics Derivados de peg contendo duas cadeias de peg
EP1532983A1 (en) * 2003-11-18 2005-05-25 ZLB Bioplasma AG Immunoglobulin preparations having increased stability
US7572613B2 (en) * 2004-06-25 2009-08-11 Klein Jeffrey A Drug delivery system for accelerated subcutaneous absorption
HUE052220T2 (hu) * 2006-09-08 2021-04-28 Abbvie Bahamas Ltd Interleukin-13 kötõfehérjék
WO2009037566A2 (en) * 2007-06-19 2009-03-26 Uvarkina Tamara P Hyaluronidase and method of use thereof
CN101970650B (zh) 2008-03-06 2017-07-25 哈洛齐梅公司 可溶性透明质酸酶的大规模生产
TWI489994B (zh) 2008-03-17 2015-07-01 Baxter Healthcare Sa 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
WO2009128917A2 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Halozyme, Inc. Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
US20090311237A1 (en) 2008-04-14 2009-12-17 Frost Gregory I Combination therapy using a soluble hyaluronidase and a bisphosphonate
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
CN102307993B (zh) 2008-12-09 2014-06-25 哈洛齐梅公司 延长的可溶性ph20多肽及其用途
US8546548B2 (en) * 2009-05-27 2013-10-01 Baxter International Inc. Method to produce a highly concentrated immunoglobulin preparation for subcutaneous use
AU2010202125B1 (en) * 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
PT2477603E (pt) 2009-09-17 2016-06-16 Baxalta Inc Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos para a sua utilização
US8796430B2 (en) * 2010-05-26 2014-08-05 Baxter International Inc. Method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
DK2595624T3 (en) * 2010-07-20 2018-03-26 Halozyme Inc Methods of treating or preventing adverse side effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent
PL2616090T3 (pl) * 2010-09-17 2023-12-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Stabilizowanie immunoglobulin poprzez wodną formulację z histydyną o ph od słabo kwaśnego do obojętnego
EP2907504B1 (en) 2011-02-08 2017-06-28 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
SG11201403714TA (en) 2011-12-30 2014-07-30 Halozyme Inc Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
EP2833905B1 (en) 2012-04-04 2018-05-02 Halozyme, Inc. Combination therapy with hyaluronidase and a tumor-targeted taxane

Also Published As

Publication number Publication date
US20110066111A1 (en) 2011-03-17
HUE028832T2 (en) 2017-01-30
CA2774053C (en) 2015-04-28
EP2477603B1 (en) 2016-03-30
JP2013505237A (ja) 2013-02-14
EA201200490A1 (ru) 2012-12-28
MX2012003282A (es) 2012-04-30
CA2774053A1 (en) 2011-03-24
BR112012005890B1 (pt) 2023-01-17
JP5734985B2 (ja) 2015-06-17
IN2012DN03219A (es) 2015-10-23
EP2477603A2 (en) 2012-07-25
PL2477603T3 (pl) 2016-10-31
CN102655853B (zh) 2015-07-29
BR112012005890A2 (pt) 2019-09-24
KR101441768B1 (ko) 2014-09-17
DK2477603T3 (en) 2016-06-13
HK1173652A1 (zh) 2013-05-24
WO2011034604A3 (en) 2011-12-01
KR20120105426A (ko) 2012-09-25
EA026112B1 (ru) 2017-03-31
CO6460736A2 (es) 2012-06-15
AU2010296017A1 (en) 2012-05-03
WO2011034604A9 (en) 2012-01-19
US9084743B2 (en) 2015-07-21
HRP20160530T1 (hr) 2016-07-29
AU2010296017C1 (en) 2013-09-19
AU2010296017B2 (en) 2013-06-06
CN102655853A (zh) 2012-09-05
PT2477603E (pt) 2016-06-16
WO2011034604A2 (en) 2011-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2010296017B2 (en) Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, and methods of use thereof
USRE49967E1 (en) Combinations and methods for subcutaneous administration of immune globulin and hyaluronidase
US20240026328A1 (en) Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
HK1173652B (en) Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, and methods of use thereof
HK1148699A (en) Combinations and methods for subcutaneous administration of immune globulin and hyaluronidase
HK1148699B (en) Combinations and methods for subcutaneous administration of immune globulin and hyaluronidase
NZ626126B2 (en) Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
NZ720075B2 (en) Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof