ES2600254T3

ES2600254T3 - Procedimiento para la modulación de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal

Info

Publication number: ES2600254T3
Application number: ES09768518.4T
Authority: ES
Inventors: Liliane Goetsch; Thierry Wurch
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2029-12-02
Also published as: US20130109839A1; TWI631341B; CN102232086B; KR20110091519A; EP3048113A1; AR074438A1; CA2744065A1; CN102232086A; BRPI0923228A2; JP2012510281A; KR101971806B1; US20110263830A1; GEP20135931B; RU2011124749A; IL213272A; DK2370464T3; EP2370464B1; US9676839B2; NZ592830A; MA32838B1

Abstract

Procedimiento para mejorar la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula diana específica, o un fragmento funcional divalente del mismo, pudiendo dicho anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo inhibir una o más de las actividades biológicas de dicha molécula diana, en el que dicho procedimiento comprende una etapa de reconfiguración de la región bisagra que consiste en una modificación de la secuencia de aminoácidos de dicha región bisagra mediante la eliminación, la adición o la sustitución de por lo menos un aminoácido, y en el que dicha región bisagra reconfigurada obtenida por la modificación de su secuencia de aminoácidos da como resultado una región bisagra que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 4, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 23 a SEC ID nº 27, SEC ID nº 36 y SEC ID nº 42 a SEC ID nº 49.

Description

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Como una forma de realización particular de la invención, se prefiere el uso de un IgG que incluye, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Las respectivas secuencias de aminoácidos que corresponden a los diferentes isotipos de regiones de bisagra de IgG son:

PKSCDKTHTCPPCP (SEC. ID. nº 11) para un IgG1,

RKCCVECPPCP (SEC. ID. nº 7) para un IgG2,

LKTPLFTGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (SEC. ID. nº 12) para un IgG3, y

SKYGPPCPSCP (SEC. ID. nº 13) para un IgG4.

Aun más en particular, se prefiere el uso de un IgG1. En realidad, en el campo de los anticuerpos terapéuticos, y más en particular, en el tratamiento del cáncer, se prefiere la generación de IgG1 a fin de lograr funciones efectoras tales como ADCC y CDC, además de funciones ligadas a la unión específica al antígeno diana.

El procedimiento de la invención se caracteriza por que dicho anticuerpo monoclonal es un IgG1.

Una “molécula diana”, en el contexto de la invención, se refiere a cualquier molécula a la cual el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente, o de modular su actividad. En general, dicha molécula diana puede denominarse "antígeno".

Como ejemplos no limitativos de molécula diana que puede ser dianizada por un anticuerpo monoclonal pueden mencionarse ligandos solubles, receptores tales como receptores de transmembrana, marcadores tumorales de membrana, etc.

En una forma de realización preferida, dicha molécula diana es un receptor transmembranario.

El término “receptor transmembranario” se refiere a una proteína que abarca la membrana plasmática de una célula, donde el dominio extracelular de la proteína tiene la capacidad de unirse a un ligando, y el dominio intracelular tiene una actividad (tal como una proteína cinasa) que puede ser alterada (aumentada o disminuida) con la unión de ligando. En otras palabras, los receptores transmembranarios son proteínas de membrana integrales que residen y funcionan típicamente dentro de la membrana plasmática de una célula, aunque también, en las membranas de algunos orgánulos y compartimientos subcelulares. Con la unión a una molécula de señalización, o a veces, a un par de dichas moléculas, en un lateral de la membrana, los receptores transmembranarios inician una respuesta en el otro lado. De este modo, cumplen una función única importante en las comunicaciones celulares y en la transducción de señal.

Muchos receptores transmembranarios están compuestos por dos o más subunidades de proteína que funcionan en forma colectiva y pueden disociarse cuando los ligandos se ligan, se caen, o en otra etapa de sus ciclos de "activación". A menudo se clasifican sobre la base de su estructura molecular, o si la estructura es desconocida en detalle para casi la totalidad de los receptores, excepto algunos, sobre la base de su hipotética (y a veces, experimentalmente verificada) topología de membrana. Se predice que las cadenas de polipéptido de los más simples cruzan la bicapa lípida solo una vez, mientras que otros la cruzan tanto como siete veces (los así denominados receptores acoplados a proteína G, o GPCR) o más.

Como cualquier proteína membranaria integral, un receptor transmembranario puede subdividirse en tres partes o dominios, un dominio extracelular, un dominio transmembranario y un dominio intracelular.

El dominio extracelular es la parte del receptor que sobresale de la membrana al exterior de la célula o del orgánulo. Si la cadena de polipéptido del receptor cruza la bicapa varias veces, el dominio externo puede comprender varias “anillas” que sobresalen de la membrana. Por definición, la principal función del receptor es reconocer y responder a un ligando específico, por ejemplo, un neurotransmisor o una hormona (si bien ciertos receptores también responden a cambios en el potencial de transmembrana), y en muchos receptores, estos ligandos se unen al dominio extracelular.

En la mayoría de los receptores para los cuales existe evidencia estructural, las alfa hélices de transmembrana forman la mayor parte del dominio de transmembrana. En ciertos receptores, tales como el receptor de acetilcolina nicotínico, el dominio de transmembrana forma un poro alineado con la proteína a través de la membrana, o un canal iónico. Con la activación de un dominio extracelular mediante la unión del ligando apropiado, el poro se torna accesible para los iones, que entonces pasan a través de este. En otros receptores, se presume que los dominios de transmembrana sufren un cambio de conformación con la unión, lo que ejerce un efecto en forma intracelular. En

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es un anticuerpo IgG1.

Es divulgado asimismo un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo monoclonal como se describe con anterioridad, es decir, que comprende una secuencia de aminoácidos de región bisagra seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. nº 1 (PRDCGCKPCICT), SEC. ID. nº 2 (PKSCGCKPCICT), SEC. ID. nº 3 (PKSCGCKPCICP), SEC. ID. nº 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEC. ID. nº 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEC. ID. nº 6 (PKSCDCHCPPCP), SEC. ID. nº 7 (RKCCVECPPCP), SEC. ID. nº 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. nº 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. nº 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEC. ID. nº 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEC. ID. nº 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEC. ID. nº 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEC. ID. nº 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEC. ID. nº 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEC. ID. nº 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEC. ID. nº 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEC. ID. nº 32 (PKSCDKTHTCPPCC), SEC. ID. nº 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. nº 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEC. ID. nº 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEC. ID. nº 36 (KCDKTHTCPPCP), SEC. ID. nº 37 (PSCKTHTCPPCP), SEC. ID. nº 38 (PKSCDTHCPPCP), SEC. ID. nº 39 (PKSCTHTCPPCP), SEC. ID. nº 40 (PKSCDKTTCPCP), SEC. ID. nº 41 (PKSCDKTHCPPC), SEC. ID. nº 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEC. ID. nº 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEC. ID. nº 44 (PCSCKHTCPPCP), SEC. ID. nº 45 (PSCCTHTCPPCP), SEC. ID. nº 46 (PSCDKHCCPPCP), SEC. ID. nº 47 (PKSTHTCPPCP), SEC. ID. nº 48 (PKSCTCPPCP) o SEC. ID. nº 49 (PKSCDKCVECPPCP).

Es divulgado un ácido nucleico aislado, caracterizado por que se selecciona de los siguientes ácidos nucleicos:

a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica una región bisagra artificial de acuerdo con la invención, su correspondiente ácido nucleico de ARN o su secuencia complementaria;

b) una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. nº 15 a SEC. ID. nº 21, SEC. ID. nº 50 a SEC. ID. nº 77, su correspondiente ácido nucleico de ARN y su secuencia complementaria; y

c) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos, capaz de hibridar en condiciones de alta rigurosidad, con por lo menos una de las secuencias de SEC. ID. nº 15 a 21 y 50 a 77.

Forma parte asimismo de la invención un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. nº 15 a SEC. ID. nº 21, y SEC. ID. nº 50 a SEC. ID. nº 77.

Es divulgado asimismo un vector de expresión o una célula huésped transformada que comprende un ácido nucleico aislado como se describe con anterioridad, más en particular, un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. nº 15 a SEC. ID. nº 21 y SEC. ID. nº 50 a SEC. ID. nº 77, su correspondiente ácido nucleico de ARN y su secuencia complementaria.

Los términos ácido nucleico, secuencia de ácido nucleico o nucleica, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia de polinucleótido, secuencia de nucleótido, que se emplean de modo indistinto en la presente invención, tienen la intención de indicar una unión precisa de nucleótidos, modificados o no modificados, que permite la definición de un fragmento o de una región de un ácido nucleico, que contiene o no contiene nucleótidos no naturales, y que es capaz de corresponder tanto a un ADN de doble filamento, a un ADN de filamento simple, como a los productos de transcripción de dichos ADN.

Además, debe entenderse en la presente memoria que la presente invención no se refiere a las secuencias de nucleótidos en su entorno cromosómico natural, es decir, en el estado natural. Se refiere a secuencias que han sido aisladas o purificadas, es decir, que se han seleccionado directa o indirectamente, por ejemplo, por medio de la copia, donde su entorno ha sido al menos parcialmente modificado. Por lo tanto, tiene la intención de indicar, asimismo, los ácidos nucleicos aislados obtenidos mediante la recombinación genética, por medio de, por ejemplo, las células huéspedes, u obtenidos por medio de la síntesis química.

Una hibridación en condiciones de alta rigurosidad significa que las condiciones de temperatura y concentración iónica se seleccionan de modo tal que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementario. A modo de ilustración, convenientemente, las condiciones de alta rigurosidad de la etapa de hibridación para los propósitos de definición de los fragmentos de polinucleótidos descritos con anterioridad son las siguientes.

La hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) la prehibridación a 42°C durant e 3 horas en regulador de fosfato (20 mM, pH 7,5) que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una solución de NaCl, 0,15 M, + citrato de sodio, 0,015 M), 50% de formamida, 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 10 x solución de Denhardt, 5% de sulfato de dextrano y 1% de ADN de esperma de salmón; (2) La hibridación real durante 20 horas a una temperatura que depende del tamaño de la sonda (es decir: 42°C, para un tamaño de sonda de > 100 nucleótidos), seguida de 2 lavados de 20 minutos a 20°C en 2 x SSC + 2 % de SDS, 1 lavado de 20 minuto s a 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % de SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0,1 x SSC + 0,1 % de SDS durante 30 minutos a 60°C, para un tamaño de sonda de > 100 nucleótidos. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad que se describen anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido pueden ser adaptadas por el experto en la

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síntesis de genes global (Genecust, LU). Todas las nuevas mutantes de bisagra se construyeron sobre la misma base.

Todas las etapas de clonación se efectuaron de acuerdo con técnicas de biología molecular convencionales, como se describe en el manual de laboratorio (Sambrook y Russel, 2001), o de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada construcción genética fue completamente validada por el secuenciamiento de nucleótidos usando el equipo de secuenciamiento de ciclos de terminador Big Dye (Applied Biosystems, US), y se analizó empleando un equipo 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US).

Las células HEK293 EBNA adaptadas a la suspensión (InVitrogen, US) se cultivaron en forma rutinaria en matraces de 250 ml en 50 ml de medio libre de suero Excell 293 (SAFC Biosciences) suplementado con glutamina, 6 mM, en una agitadora orbital (110 rpm velocidad de rotación). Se efectuó la transfección transiente con 2·106 células/ml, usando polietilenimina lineal, 25 kDa (PEI) (Polysciences), preparada en agua, en una concentración final de 1 mg/ml, ADN plásmido y mixto (concentración final de 1,25 µg/ml, para una relación de plásmido de cadena pesada a liviana de 1:1). A las 4 horas posteriores a la transfección, el cultivo se diluyó con un volumen de medio de cultivo fresco, a fin de lograr una densidad celular final de 106 células/ml. El procedimiento de cultivo se controló sobre la base de la viabilidad celular y la producción de Mab. Típicamente, los cultivos se mantuvieron durante 4 a 5 días. Los Mab se purificaron empleando un enfoque de cromatografía convencional en una resina de Proteína A (GE Healthcare, US).

Todas las formas diferentes de Mab se produjeron en niveles adecuados, con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad típicamente variaron entre 15 y 30 mg/l de Mab purificados.

Ejemplo 3: Evaluación de los Mab genomanipulados en un ensayo ELISA específico de fosfo-c-Met.

Se sembraron células A549 en una placa de multirpocillos (MW) 12, en medio de crecimiento completo [F12K + 10% FCS]. Las células se privaron durante 16 horas antes de la estimulación con HGF [100 ng/ml], y cada Mab para ser ensayado se agregó en su concentración final de 30 µg/ml, 15 minutos antes de la estimulación de ligando. Se agregó regulador de lisis helado 15 minutos después de la adición de HGF, a fin de detener la reacción de fosforilación. Las células se rasparon mecánicamente, y se recogieron los lisados celulares mediante la centrifugación a 13000 rpm durante 10 minutos a 4°C , que correspondieron a la fase de sobrenadante. Se cuantificó el contenido de proteína empleando un equipo BCA kit (Pierce), y se realizó el almacenamiento a -20°C hasta el uso. Se cuantificó el estado de fosforilación de c-Met por ELISA. Se usó un Mab de cabra anti-c-Met (R&D, ref. AF276) como un anticuerpo de captura (revestimiento durante la noche a 4°C), y después de una etapa de satura ción con un regulador al 5% de TBS-BSA (1 hora a temperatura ambiente (TA)), se agregaron 25 µg de lisados de proteína a cada pocillo de la placa 96MW revestida. Luego de una incubación de 90 minutos a TA, las placas se lavaron cuatro veces, y se agregó el anticuerpo de detección (Mab anti-fosfo-c-Met, dirigido contra los residuos Tyr fosforilados en las posiciones 1230, 1234 y 1235). Luego de una incubación adicional de 1 hora y de 4 lavados, se agregó un anticuerpo anticonejo acoplado a HRP (Biosource) durante un período de tiempo de 1 hora a TA, y se efectuó la detección de luminiscencia mediante la adición de Luminol. Las lecturas de luminiscencia se realizaron en un lector de placa de multimodo Mithras LB920 (Berthold).

Se construyó una serie de versiones genomanipuladas del dominio de bisagra de cadena pesada, y se ensayó en el ensayo de fosforilación de receptor c-Met. Como se muestra en la Figura 2A, en comparación con 224G11[IgG1-Quim], se observó una importante reducción del efecto agonista asociado con el isotipo hIgG1/kappa, tanto para la construcción sobre la base de IgG2 como para algunas construcciones genomanipuladas IgG1/kappa [MH, MUP9H y TH7, Figura 2A]. Se obtuvieron actividades de agonismo más débiles y comparables, con 224G11[MH-IgG1], que contenía una región bisagra IgG1 completamente murina, y con 224G11[TH7], que contenía la región bisagra IgG1 genomanipulada más humana. Se obtuvo además un incremento concomitante en la eficacia antagonista [Figura 2B]. En consecuencia, tanto la mutante de bisagra TH7 sobre la base de IgG2 como aquella sobre la base de hlgG1/kapa genomanipulada asociada con el dominio variable 224G11 murino lograron actividades funcionales casi similares a aquella del Mab de ratón 224G11. Sin embargo, la comparación de las actividades agonistas/antagonistas de 224G11[MMCH-IgG1-quim] con 224G11[IgG1-quim] demostró que pudo obtenerse una actividad antagonista mayor por medio de la genomanipulación de anticuerpo, sin consideración de las propiedades agonistas intrínsecas de dicho anticuerpo.

Se construyó una segunda serie de versiones genomanipuladas del dominio de bisagra de cadena pesada, y se ensayó en el ensayo de fosforilación de receptor c-Met. Como se muestra en la Figura 11A, la sustitución de aminoácidos en el dominio de bisagra de cadena pesada para la introducción de residuo cisteína modificó el efecto agonista de los anticuerpos. De hecho, por una parte, algunas versiones mutadas exhibieron efecto agonista más débil que c224G11, por ejemplo, c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6] o c224G11[C7], mientras que otras incrementaron el efecto agonista, como c224G11[C11], c224G11[C12] y c224G11[C14]. Asimismo, las deleciones de aminoácidos en el dominio de bisagra de cadena pesada, asociadas o no con sustituciones de aminoácidos, modificaron también las propiedades agonistas de los anticuerpos [Figura 11B]. Por ejemplo, c224G11[∆1-3], c224G11[∆4-5-6], c224G11[∆5-6-7-8], c224G11[C7∆6], c224G11[C6∆9], c224G11[C2∆5-7], c224G11[C5∆2-6] o c224G11[C9∆2-7] mostraron un efecto agonista más débil que c224G11, mientras que

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