ES2601431T3 - Fosfolipasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para prepararlas y usarlas - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que codifica un polipéptido que tiene actividad fosfolipasa que comprende (a) un ácido nucleico que tiene un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos WSAEDKHNEGINSHLWIVNRAIDIMSRNTTIVNPNETALLNEWRADLENGIYSADYENPYYDDSTYAS HFYDPDTGTTYIPFAKHAKETGAKYFNLAGQAYQNQDMQQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAASFTD LSYPMGFHSKYENFVDTIKNNYIVSDSNGYWNWKGANPEDWIEGAAVAAKQDYPGVVNDTTKDWF VKAAVSQEYADKWRAEVTPVTGKRLMEAQRVTAGYIHLWFDTYVNR, en el que el aminoácido de la posición 63 es D (ácido aspártico), el aminoácido de la posición 131 es S (serina) y el aminoácido de la posición 134 es D (ácido aspártico), y en el que el primer aminoácido W (triptófano) se cuenta como la posición 1, (b) el ácido nucleico de (a), que comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico o péptido señal heterólogo, (c) el ácido nucleico de (b), en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica: (i) una secuencia señal (líder) heteróloga, una secuencia señal (líder) de fosfolipasa heteróloga o una secuencia señal (líder) no de fosfolipasa heteróloga, o (ii) un dominio catalítico, una secuencia enlazadora, un sitio de reconocimiento de escisión por proteasa, una secuencia de enzima no fosfolipasa o una secuencia de enzima fosfolipasa, o (d) un ácido nucleico que comprende una secuencia completamente (totalmente) complementaria a la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c).

Description

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aspecto, la actividad fosfolipasa comprende una actividad específica de aproximadamente 100 unidades por miligramo a aproximadamente 1000 unidades por miligramo, de aproximadamente 500 unidades por miligramo a aproximadamente 750 unidades por miligramo de proteína. Como alternativa, la actividad fosfolipasa comprende una actividad específica a 37ºC en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 unidades por miligramo de proteína. En un aspecto, la actividad fosfolipasa comprende una actividad específica a 37ºC en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la actividad fosfolipasa comprende una actividad específica a 37ºC en el intervalo de aproximadamente 750 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la termotolerancia comprende la retención de al menos la mitad de la actividad específica de la fosfolipasa a 37ºC después de calentarse a la temperatura elevada. Como alternativa, la termotolerancia puede comprender la retención de actividad específica a 37ºC en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteína después de calentarse a la temperatura elevada.

La invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante de la invención, donde el polipéptido comprende al menos un sitio de glucosilación. En un aspecto, la glucosilación puede ser una glucosilación ligada a N. En un aspecto, el polipéptido puede glucosilarse después de expresarse en P. pastoris o S. combe.

La invención proporciona enzimas fosfolipasa y los ácidos nucleicos que las codifican, que tienen una secuencia de cualquiera de las fosfolipasas ejemplares de la invención con uno o más o todos los sitios de glucosilación alterados, como se ha descrito anteriormente. Por tanto, la invención proporciona métodos de preparación de secuencias codificantes de fosfolipasa variantes que tienen expresión aumentada en una célula hospedadora, donde el método comprende modificar una secuencia codificante de fosfolipasa de la invención de modo que uno, varios o todos los motivos codificantes de sitios de glucosilación ligados a N se modifiquen en un motivo no glucosilado. La invención también proporciona secuencias codificantes de fosfolipasa preparadas por este proceso y las enzimas que codifican.

La invención proporciona métodos para preparar una secuencia codificante de fosfolipasa variante que codifica una fosfolipasa que tiene resistencia aumentada a una proteasa, que comprende modificar un aminoácido equivalente en la posición 131 de la SEQ ID NO: 2 en uno, varios o todos los siguientes restos: lisina (K); serina (S); glicina (G); arginina (R); glutamina (Q); alanina (A); isoleucina (I); histidina (H); fenilalanina (F); treonina (T); metionina (M); leucina (L), incluyendo variantes a la SEQ ID NO: 2 (y el ácido nucleico que las codifica) que tienen estas modificaciones ejemplares. La invención también proporciona fosfolipasas aisladas, sintéticas o recombinantes codificadas por una secuencia preparada por este método.

La invención proporciona métodos para preparar una secuencia codificante de fosfolipasa variante que codifica una fosfolipasa que tiene resistencia disminuida a una proteasa que comprende modificar un aminoácido equivalente en la posición 131 de la SEQ ID NO: 2 en uno, varios o todos los siguientes restos: triptófano (W); glutamato (E); tirosina (Y), incluyendo variantes a SEQ ID NO: 2 (y el ácido nucleico que las codifica) que tienen estas modificaciones ejemplares. La invención también proporciona fosfolipasas aisladas, sintéticas o recombinantes codificadas por una secuencia preparada por este método.

La descripción proporciona preparaciones proteicas que comprenden un polipéptido de la descripción, donde la preparación proteica comprende un líquido, un sólido o un gel.

La descripción proporciona heterodímeros que comprenden un polipéptido de la invención y una segunda proteína o dominio. El segundo miembro del heterodímero puede ser una fosfolipasa diferente, una enzima diferente u otra proteína. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido y el heterodímero puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o una marca. En un aspecto, la descripción proporciona homodímeros que comprenden un polipéptido de la descripción.

La descripción proporciona polipéptidos inmovilizados que tienen una actividad fosfolipasa, donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención o un polipéptido que comprende un polipéptido de la descripción y un segundo dominio (por ejemplo, una proteína de fusión). En un aspecto, un polipéptido de la descripción se inmoviliza sobre una célula, una vesícula, un liposoma, una película, una membrana, un metal, una resina, un polímero, una partícula de cerámica, de vidrio, un microelectrodo, una partícula de grafito, una perla, un gel, una placa, cristales, un comprimido, una píldora, una cápsula, un polvo, un aglomerado, una superficie, una estructura porosa, una serie o un tubo capilar. En un aspecto, un polipéptido de la descripción se inmoviliza sobre materiales tales como granos, cáscaras, corteza, piel, cabello, esmalte, hueso, caparazón y materiales que derivan de los mismos, o materiales de pienso animal o una combinación de los mismos.

Los polipéptidos de la invención (por ejemplo, fosfolipasas) también pueden estar presentes solos o como mezcla de fosfolipasas o fosfolipasas y otras enzimas hidrolíticas tales como celulasas, xilanasas, proteasas, lipasas, amilasas

o enzimas redox tales como lacasas, peroxidasas, catalasas, oxidasas o reductasas. Pueden formularse en una forma sólida tal como un polvo, preparaciones liofilizadas, gránulos, comprimidos, barras, cristales, cápsulas, píldoras, gránulos o en una forma líquida tal como una solución acuosa, un aerosol, un gel, una pasta, una

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suspensión, una emulsión acuosa/oleosa, una crema, una cápsula, suspensión vesicular o micelar. En un aspecto, estas formulaciones de la descripción pueden comprender cualquiera o una combinación de los siguientes ingredientes: polioles tales como polietilenglicoles, alcoholes polivinílicos, glicerol, azúcares tales como sacarosa, sorbitol, trehalosa, glucosa, fructosa, maltosa, agentes gelificantes tales como gomas guar, carrageninas, alginatos, dextranos, derivados celulósicos, pectinas, sales tales como cloruro sódico, sulfato sódico, sulfato de amonio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de zinc, sulfato de zinc, sales de ácidos grasos y sus derivados, queladores de metales tales como EDTA, EGTA, citrato sódico, agentes antimicrobianos tales como ácidos grasos, derivados de los mismos, parabenos, sorbatos, benzoatos, adicionalmente pueden usarse compuestos para bloquear el impacto de las proteasas tales como proteínas de volumen tales como BSA, hidrolizados de trigo, compuestos de borato, emulsionantes tales como detergentes no iónicos e iónicos solos o en combinación, pueden incluirse también fitosteroles, vitaminas, aminoácidos, agentes reductores, tales como cisteína o compuestos antioxidantes tales como ácido ascórbico como dispersantes.

En un aspecto, se usa reticulación y modificación proteica, tal como pegilación, modificación de ácidos grasos y glucosilación para mejorar la estabilidad de un polipéptido de la descripción (por ejemplo, estabilidad enzimática). En un aspecto, los polioles y/o azúcares comprenden de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 60% o más, de la formulación, de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 50% de la formulación, de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 40% de la formulación, o de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 20% de la formulación. En otro aspecto, los agentes gelificantes comprenden de aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 10% de la formulación, de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 8% de la formulación, de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 5% de la formulación, o de aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 3% de la formulación. En otro aspecto, las sales tales como cloruro sódico, sulfato sódico, sulfato de amonio, cloruro de calcio y/o cloruro de magnesio comprenden de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 30% de la formulación, de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 20% de la formulación, de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 15% de la formulación, o de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 10% de la formulación. En otro aspecto, está presente cloruro de zinc en la formulación a concentraciones que comprenden de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM. En otro aspecto más, está presente sulfato de zinc en la formulación a concentraciones que comprenden de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM. En otro aspecto, las sales de ácidos grasos y/o sus derivados comprenden de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 40% de la formulación, de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 30% de la formulación, de aproximadamente un 15% a aproximadamente un 25% de la formulación, o de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 20% de la formulación. En otro aspecto, están presentes queladores de metales tales como EDTA, EGTA, y/o citrato sódico en la formulación a concentraciones que comprenden de 0,1 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 8 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 mM. En otro aspecto, los antimicrobianos tales como parabenos, sorbatos y/o benzoatos comprenden de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 10% de la formulación, de aproximadamente un 0,05% a aproximadamente un 5% de la formulación, de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 1% de la formulación, o de aproximadamente un 0,05% a aproximadamente un 0,5% de la formulación. En otro aspecto más, las proteínas de volumen tales como BSA y/o hidrolizados de trigo comprenden de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 20% de la formulación, de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 15% de la formulación, de aproximadamente un 2,5% a aproximadamente un 7,5% de la formulación, o de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 5% de la formulación. En otro aspecto, están presentes emulsionantes tales como detergentes no iónicos y/o iónicos en la formulación a concentraciones que comprenden de aproximadamente 1X la concentración micelar crítica (CMC) a aproximadamente 10X CMC, de aproximadamente 2,5X CMC a aproximadamente 7,5X CMC, de aproximadamente 1X CMC a aproximadamente 5X CMC, o de aproximadamente 3X CMC a aproximadamente 6X CMC. En otro aspecto, las vitaminas, aminoácidos, agentes reductores y/o compuestos antioxidantes comprenden de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 5% de la formulación, de aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 4% de la formulación, de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 2,5% de la formulación, o de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 1% de la formulación.

La descripción proporciona series que comprenden un polipéptido inmovilizado, donde el polipéptido es una fosfolipasa de la invención o es un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La descripción proporciona series que comprenden un ácido nucleico inmovilizado de la invención. La descripción proporciona una serie que comprende un anticuerpo inmovilizado de la descripción.

La descripción proporciona anticuerpos aislados o recombinantes que se unen específicamente a un polipéptido de la invención o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. La descripción proporciona hibridomas que comprenden un anticuerpo de la descripción.

La descripción proporciona métodos de aislamiento o identificación de un polipéptido con una actividad fosfolipasa,

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representado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedadora, modificando de ese modo el ácido nucleico para aumentar su expresión en una célula hospedadora.

La descripción proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa, comprendiendo el método (a) proporcionar un ácido nucleico de la descripción que codifica una fosfolipasa; y (b) identificar un codón en el ácido nucleico de la etapa (a) y remplazarlo con un codón diferente que codifica el mismo aminoácido que el codón remplazado, modificando de ese modo codones en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa.

La descripción proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa para aumentar su expresión en una célula hospedadora, comprendiendo el método (a) proporcionar un ácido nucleico de la descripción que codifica una fosfolipasa; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico de la etapa (a) y remplazarlo con un codón preferido o usado de forma neutra que codifica el mismo aminoácido que el codón remplazado, donde un codón preferido es un codón sobre-representado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedadora y un codón no preferido o menos preferido es un codón subrepresentado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedadora, modificando de ese modo el ácido nucleico para aumentar su expresión en una célula hospedadora.

La descripción proporciona métodos para modificar un codón en un ácido nucleico que codifica una fosfolipasa para disminuir su expresión en una célula hospedadora, comprendiendo el método (a) proporcionar un ácido nucleico de la descripción que codifica una fosfolipasa; y (b) identificar al menos un codón preferido en el ácido nucleico de la etapa (a) y remplazarlo con un codón no preferido o menos preferido que codifica el mismo aminoácido que el codón remplazado, donde un codón preferido es un codón sobre-representado en secuencias codificantes en genes en una célula hospedadora y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en secuencias codificantes en genes en la célula hospedadora, modificando de ese modo el ácido nucleico para disminuir su expresión en una célula hospedadora. En aspectos alternativos, la célula hospedadora es una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula vegetal, una célula algácea (de algas), un liquen o una célula de mamífero.

La descripción proporciona métodos para producir una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos o sitios de unión a sustrato de fosfolipasa modificados, donde los sitios activos o sitios de unión a sustrato modificados se obtienen de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de unión a sustrato, comprendiendo el método: (a) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica un primer sitio activo o primer sitio de unión a sustrato, donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende un ácido nucleico de la descripción; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifican variantes de aminoácido de origen natural en una pluralidad de codones diana en el primer ácido nucleico; y (c) usar el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de ácidos nucleicos variantes que codifican un sitio activo o codifican un sitio de unión a sustrato, que codifican una gama de variaciones de aminoácidos en cada codón de aminoácido que se mutagenizó, produciendo de ese modo una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos o sitios de unión a sustrato de fosfolipasa modificados. En aspectos alternativos, el método comprende mutagenizar el primer ácido nucleico de la etapa (a) por un método que comprende un sistema de evolución dirigida optimizada, Gene Site Saturation Mutagenesis™ (GSSM™) y reensamblaje por ligamiento sintético (SLR). El método puede comprender adicionalmente mutagenizar el primer ácido nucleico de la etapa (a) o variantes por un método que comprende PCR propensa a errores, reorganización, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis con casete, mutagénesis por ensamblaje reiterado, mutagénesis por ensamblaje exponencial, mutagénesis dirigida al sitio, reensamblaje génico, Gene Site Saturation Mutagenesis™ (GSSM™), reensamblaje por ligamiento sintético (SLR) y una combinación de los mismos. El método puede comprender adicionalmente mutagenizar el primer ácido nucleico de la etapa (a) o variantes por un método que comprende recombinación, recombinación de secuencia reiterada, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis con molde que contiene uracilo, mutagénesis por dúplex con huecos, mutagénesis por reparación de desapareamientos puntuales, mutagénesis con cepa hospedadora deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por deleción, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis por ensamblaje, creación de multímeros quiméricos de ácido nucleico y una combinación de los mismos.

La descripción proporciona métodos para preparar una molécula pequeña, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas biosintéticas capaces de sintetizar o modificar una molécula pequeña, donde una de las enzimas comprende una enzima fosfolipasa codificada por un ácido nucleico de la descripción; (b) proporcionar un sustrato para al menos una de las enzimas de la etapa (a); y (c) hacer reaccionar el sustrato de la etapa (b) con las enzimas en condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocatalíticas para generar una molécula pequeña mediante una serie de reacciones biocatalíticas.

La descripción proporciona métodos para modificar una molécula pequeña, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una enzima fosfolipasa codificada por un ácido nucleico de la descripción; (b) proporcionar una molécula pequeña; y (c) hacer reaccionar la enzima de la etapa (a) con la molécula pequeña de la etapa (b) en

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aproximadamente pH 8 a pH 10. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender un tiempo de reacción de aproximadamente 3 a 10 minutos. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender la hidrólisis de fosfolípidos hidratables y no hidratables en aceite a una temperatura de aproximadamente 50ºC a 60ºC, a un pH de aproximadamente pH 5 a pH 6,5 usando un tiempo de reacción de aproximadamente 30 a 60 minutos. El polipéptido puede unirse a un filtro y la grasa o aceite que contiene fosfolípidos se pasa a través del filtro. El polipéptido puede añadirse a una solución que comprende la grasa o aceite que contiene fosfolípidos y después la solución se pasa a través de un filtro.

La invención proporciona métodos para convertir un fosfolípido no hidratable en una forma hidratable, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad fosfolipasa de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un fosfolípido no hidratable; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) en condiciones donde el polipéptido convierte el fosfolípido no hidratable en una forma hidratable. El polipéptido puede tener una actividad fosfolipasa C. El polipéptido puede tener una actividad fosfolipasa D y se añade también una enzima fosfatasa.

La descripción proporciona métodos para el refinado cáustico de una composición que contiene fosfolípidos, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende una fosfolipasa, que puede ser un polipéptido de la invención que tiene una actividad fosfolipasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un fosfolípido; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) antes, durante o después del refinado cáustico. El polipéptido puede tener una actividad fosfolipasa, por ejemplo, actividad PLC, PLB, PLD y/o PLA. El polipéptido puede añadirse antes del refinado cáustico, es decir, en la "parte inicial" del proceso, antes de añadir el ácido o el agente cáustico, como se ilustra en la Figura 13.

El polipéptido (que puede ser la PLC de la invención) puede añadirse durante el refinado cáustico y pueden añadirse niveles variables de ácido y agente cáustico dependiendo de los niveles de fósforo y los niveles de ácidos grasos libres. El polipéptido (que puede ser una enzima de la invención) puede añadirse antes del refinado cáustico o después del refinado cáustico: en una mezcladora intensa o mezcladora de retención antes de la separación; después de una etapa de calentamiento; en una centrífuga; en una grasa para jabón; en un agua de lavado; y/o durante las etapas de blanqueado o desodorizado. El método puede comprender el uso de soluciones concentradas de agente cáustico, por ejemplo, más concentradas que la norma industrial del 11%, para disminuir la masa de goma. En aspectos alternativos, la solución concentrada de agente cáustico está entre aproximadamente un 12% y un 50% concentrada, por ejemplo, aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50% o 60% o más concentrada.

La composición que comprende el fosfolípido puede comprender una planta. El polipéptido puede expresarse de forma transgénica en la planta. El polipéptido que tiene una actividad fosfolipasa puede añadirse durante la trituración de una semilla u otra parte de la planta, o el polipéptido que tiene una actividad fosfolipasa se añade después de la trituración o antes del refinado.

También se proporciona un proceso de refinado cáustico para hidrolizar fosfolípidos en aceite (por ejemplo, aceite vegetal) usando un polipéptido de la invención para generar diacilglicerol (DAG) y éster de fosfato soluble en agua. En un aspecto, la enzima de la descripción debe funcionar en un proceso de refinado cáustico incluyendo, opcionalmente, bajo contenido de agua y/o en un intervalo de temperatura de aproximadamente 55ºC a aproximadamente 70ºC. El uso de un proceso de refinado cáustico con bajo contenido de agua en este intervalo de temperatura maximizará el rendimiento aumentando el DAG y reduciendo el aceite atrapado. En un aspecto, la enzima usada en este proceso de refinado cáustico de la descripción tiene buena actividad tanto sobre fosfatidilcolina (PC) como sobre fosfatidiletanolamina (PE), es activa entre un pH de aproximadamente pH 6 a pH 9, es activa hasta a 75ºC y es activa en bajo contenido de agua en aceite, por ejemplo, de aproximadamente un 2% a un 5% agua, por ejemplo, la enzima codificada por la secuencia de la SEQ ID NO: 2, codificada, por ejemplo, por la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto del proceso de refinado cáustico de la descripción para hidrolizar fosfolípidos en aceites, se usan dos enzimas: una PLC específica de PI (hidroliza PI) y una PC-PLC que hidroliza PC, PE y PA. Esta realización genera aceite adecuado para refinado químico o físico y maximiza el aumento de rendimiento procedente de DAG y menos aceite atrapado.

La invención proporciona métodos para la purificación de un fitosterol o un triterpeno, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido de la invención que tiene una actividad fosfolipasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un fitosterol o un triterpeno; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones donde el polipéptido puede catalizar la hidrólisis de un fosfolípido en la composición. El polipéptido puede tener una actividad fosfolipasa C. El fitosterol o un triterpeno puede comprender un esterol vegetal. El esterol vegetal puede obtenerse de un aceite vegetal. El aceite vegetal puede comprender un aceite de salvado de arroz, un aceite de coco, aceite de canola, aceite de manteca de cacao, aceite de maíz, aceite de algodón, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite derivado de salvado de arroz,

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aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de soja o un aceite de girasol. El método puede comprender el uso de disolventes no polares para extraer de forma cuantitativa fitosteroles libres y ésteres de ácido graso de fitosterilo. El fitosterol o un triterpeno puede comprender un β-sitosterol, un campesterol, un estigmasterol, un estigmastanol, un β-sitostanol, un sitostanol, un desmosterol, un calinasterol, un poriferasterol, un clionasterol o un brasicasterol.

La descripción proporciona métodos para refinar un aceite crudo, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido de la descripción que tiene una actividad fosfolipasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la descripción; (b) proporcionar una composición que comprende un aceite que comprende un fosfolípido; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones donde el polipéptido puede catalizar la hidrólisis de un fosfolípido en la composición. El polipéptido puede tener una actividad fosfolipasa C. El polipéptido puede tener una actividad fosfolipasa que está en una solución acuosa que se añade a la composición. El nivel de agua puede ser entre aproximadamente un 0,5 a un 5%. El tiempo del proceso puede ser de menos de aproximadamente 2 horas, menos de aproximadamente 60 minutos, menos de aproximadamente 30 minutos, menos de aproximadamente 15 minutos o menos de aproximadamente 5 minutos. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender una temperatura entre aproximadamente 25ºC-70ºC. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender el uso de agentes cáusticos. Pueden usarse soluciones concentradas de agente cáustico, por ejemplo, más concentradas que la norma industrial del 11%, para disminuir la masa de forma. En aspectos alternativos, la solución concentrada de agente cáustico está entre aproximadamente un 12% y un 50% concentrada, por ejemplo, aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50% o 60% o más concentrada.

Las condiciones de hidrólisis pueden comprender un pH entre aproximadamente pH 3 y pH 10, entre aproximadamente pH 4 y pH 9 o entre aproximadamente pH 5 y pH 8. Las condiciones de hidrólisis pueden comprender la adición de emulsionantes y/o mezcla después del contacto de la etapa (c). Los métodos pueden comprender la adición de un triturador de emulsiones y/o calentamiento o enfriamiento (por ejemplo, hasta entre aproximadamente 4ºC a aproximadamente -20ºC, o menos) para promover la separación de una fase acuosa. Los métodos pueden comprender desgomado antes de la etapa de contacto para recoger la lecitina por centrifugación y después la adición una PLC, una PLC y/o una PLA para retirar los fosfolípidos no hidratables. Los métodos pueden comprender desgomado con agua de aceite crudo hasta menos de 10 ppm de fósforo para aceites comestibles y posterior refinado físico hasta menos de aproximadamente 50 ppm de fósforo para aceites biodiesel. Los métodos pueden comprender la adición de ácido para promover la hidratación de los fosfolípidos no hidratables. En un aspecto, la adición de ácido promueve la disminución de contenido de metales calcio y magnesio.

La descripción proporciona un método para mejorar o prevenir la toxicidad mediada por lipopolisacáridos (LPS), que comprende administrar a un paciente una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la descripción. La descripción proporciona un método para destoxificar una endotoxina, que comprende poner en contacto la endotoxina con un polipéptido de la invención. La invención proporciona un método para desacilar una cadena de ácido graso 2' o 3' de un lípido A, que comprende poner en contacto el lípido A con un polipéptido de la invención.

La descripción proporciona un método para refinar un lubricante, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende una enzima de la descripción; (b) proporcionar un lubricante; y (c) tratar el lubricante con una enzima en condiciones donde la enzima puede hidrolizar de forma selectiva los aceites en el lubricante, refinándolo de ese modo. El lubricante puede ser un aceite hidráulico.

La descripción proporciona un método para tratar una tela, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende una enzima de la descripción, (b) proporcionar una tela; y (c) tratar la tela con la enzima. El tratamiento de la tela puede comprender la mejora del tacto y caída de la tela final, el tintado, la obtención de pirorresistencia, obtención de repelencia al agua, obtención de brillo óptico u obtención de acabado en resina. La tela puede comprender algodón, viscosa, rayón, lyocell, lino, hilo, ramio, todas las mezclas de las mismas o mezclas de las mismas con poliésteres, lana, poliamidas, acrílicos o poliacrílicos. La descripción proporciona una tela, hilado

o fibra que comprende una enzima de la descripción. La enzima puede adsorberse, absorberse o inmovilizarse sobre la superficie de la tela, hilado o fibra.

La invención proporciona métodos para expresar fosfolipasa C, que comprenden proporcionar una cepa de Pichia con un fenotipo Mut+; insertar un ácido nucleico que codifica fosfolipasa C heteróloga en la cepa de Pichia; y cultivar la cepa de Pichia en condiciones por las cuales se expresa la fosfolipasa C. El método puede comprender adicionalmente suplementar las condiciones de cultivo con zinc. La invención también proporciona sistemas celulares, células aisladas y líneas celulares para expresar fosfolipasa C, que comprenden una cepa de Pichia de fenotipo Mut+ que comprende un ácido nucleico que codifica fosfolipasa C heteróloga unido de forma funcional a un promotor funcional en la cepa de Pichia.

La invención proporciona sistemas celulares de levadura resistentes a zeocina (por ejemplo, células de levadura, líneas celulares, células individuales) para expresar una proteína heteróloga, que comprende las etapas de proporcionar una célula de especies de Pichia (por ejemplo, P. pastoris) que comprende un ácido nucleico heterólogo capaz de expresar una proteína heteróloga; cultivar la célula en condiciones que comprenden zeocina a

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125, 126 Patatina Desconocida 135, 136 Patatina Desconocida 99, 100 Patatina Desconocida 65, 66 Patatina Desconocida 87, 88 Patatina Desconocida 86, 87 Patatina Desconocida 45, 46 Patatina Desconocida 59, 60 Patatina Desconocida 13, 14 Patatina Desconocida 71,72 Patatina Desconocida 55, 56 Patatina Desconocida 33, 34 Patatina Desconocida 91,92 Patatina Desconocida 103, 104 Patatina Desconocida 11, 12 Patatina Desconocida 17, 18 Patatina Desconocida 95, 96 Patatina Desconocida 43, 44 Patatina Desconocida 27, 28 Patatina Desconocida 131, 132 Patatina Desconocida 127, 128 Patatina Desconocida 133, 134 Patatina Desconocida 137, 138 Patatina Desconocida 165, 166 imagen51Patatina Desconocida 167, 168

AA1-30 MARSWKWRPLLSSFLLVSLAPFSTSVPCFK Desconocida

169, 170 Desconocida

171, 172 Desconocida

173, 174 Desconocida

111, 112 AA1-16 MGAGAILLTGAPTASA Bacteriana

107, 108 AA1-23 MSNKKFILKLFICSTILSTFVFA Desconocida

109, 110 AA1-23 MSNKKFILKLFICSTILSTFVFA Desconocida

113, 114 AA1-23 MSNKKFILKLFICSTILSTFVFA Desconocida

117, 118 AA1-23 MNNKKFILKLFICSMVLSAFVFA Desconocida

119, 120 AA1-23 MNNKKFILKLFICSMVLSAFVFA Desconocida

115, 116 AA1-23 MNNKKFILKLFICSMVLSAFVFA Desconocida

121, 122 AA1-23 MRNKKFILKLLICSTVLSTFVFA Desconocida

141, 142

Desconocida 155, 156

AA1-36 MRTTTTNWRQIVKSLKLFLMGLCLFISASFASSAYA Desconocida 159, 160

Desconocida 145, 146

Desconocida 147, 148

Desconocida

57 5

10

15

20

149, 150

imagen52Desconocida 151, 152

Desconocida 153, 154

Desconocida 157, 158

Desconocida 163, 164

Desconocida 101, 102 PLC AA1-39 LSLVASLRRAPGAALALALAAATLAVTAQGATAAPAA Bacteriana

AAA 1, 2 PLC AA1-24 MKKKVLALAAMVALAAPVQSVVFAQ Desconocida 3, 4 PLC AA1-24 MKRKILAIASVIALTAPIQSVAFAH Desconocida 5, 6 PLC AA1-24 MKRKILAIASVIALTAPIQSVAFAH Desconocida 97, 98 PLC AA1-25 MKRKLCTWALVTAIASSTAVIPTAAE Desconocida 7, 8 PLC AA1-29 MITLIKKCLLVLTMTLLLGVFVPLQPSHAT Desconocida 31, 32 PLC AA1-20 MKKKLCTWALVTAISSGVVAI Desconocida 81, 82 PLC AA1-25 MKKKLCTMALVTAISSGWTIPTEAQ Desconocida 93, 94 PLC AA1-29 MITLIKKCLLVLTMTLLSGVFVPLQPSYAT Desconocida 89, 90 PLC AA1-25 MKKKLCTLAFVTAISSIAITIPTEAQ Desconocida 123, 124 PLC AA1-24 MKKKVLALAAMVALAAPVQSVVFA Desconocida 129, 130 PLC AA1-27 MKKKICTLALVSAITSGWTIPTVASA Desconocida 139, 140 PLC AA1-20 MKlKPLTFSFGLAVTSSVQA Desconocida 105, 106 PLC AA1-30 MNRCRNSLNLQLRAVTVAALVVVASSAALAW Desconocida 9, 10 PLC AA1-20 MKLLRVFVCVFALLSAHSKAD Desconocida 47, 48 PLD Desconocida 15, 16 PLD Desconocida 41,42 PLD Desconocida 23, 24 PLD Desconocida 51, 52 PLD Desconocida 53, 54 PLD Desconocida 19, 20 PLD AA1-19 MKKTTLVLALLMPFGAASAQ Desconocida 75, 76 PLD Desconocida 57, 58 PLD Desconocida 63, 64 PLD AA1-18 MKNTLILAGCILAAPAVAD Desconocida 79, 80 PLD AA1-23 MRNFSKGLTSILLSIATSTSAMAF Desconocida 37, 38 PLD AA1-23 MRNFSKGLTSILLSIATSTSAMAF Desconocida 61,62 PLD AA1-21 MTLKLSLLIASLSAVSPAVLAN Desconocida 67, 68 PLD No Desconocida 83, 84 PLD AA1-21 MKKIVIYSFVAGVMTSGGVFAA Desconocida 49, 50 PLD AA1-23 MNFWSFLLSITLPMGVGVAHAQPD Desconocida 39, 40 PLD Desconocida 73, 74 PLD Desconocida 29, 30 PLD Desconocida 21,22 PLD AA1-28 MQQHKLRNFNKGLTGVVLSVLTSTSAMAF Desconocida 71,72 PLD Desconocida 161, 162 PLD AA1-24 MNRKLLSLCLGATSCIALSLPVHA Desconocida

En un aspecto, la descripción proporciona polipéptidos que tienen secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 y/o SEQ ID NO: 173, y subsecuencias de las mismas, por ejemplo, sus sitios activos ("dominios catalíticos") que tienen una actividad fosfolipasa, por ejemplo, una actividad fosfolipasa C (PLC). En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad fosfolipasa, pero carece de actividad de hidrólisis de aceite neutro (triglicérido). Por ejemplo, en un aspecto, el polipéptido tiene una actividad fosfolipasa, pero carece de cualquier actividad que afecte a una fracción de aceite neutro (triglicérido). En un aspecto, la invención proporciona un proceso de desgomado, que comprende el uso de un polipéptido de la invención que tiene una actividad fosfolipasa, pero no una actividad lipasa.

Los polipéptidos y péptidos de la invención pueden aislarse de fuentes naturales, pueden ser polipéptidos sintéticos

o generados de forma recombinante. Los péptidos y proteínas pueden expresarse de forma recombinante in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos de la invención pueden prepararse y aislarse usando cualquier método conocido en la técnica. Los polipéptidos y péptidos de la invención también pueden sintetizarse, completamente o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co. Lancaster, PA. Por ejemplo, la síntesis de péptidos puede realizarse usando diversas técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo,

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Tasa de OD de Actividad MeOH Proteasa OD

Fuente de C

cosuministro inducción PLC consumido Bodipy final

antes/después de la

(ml/min) (U/ml sup) (L)

inducción

0,5

Glyc/Glyc 100 1 Sí 450

1,5

Glyc/Glyc 1100 1,7 No 680

2

Glyc/Glyc 250-300 1550 1,3 No 860

2,5

Glyc/Glyc 1550 1,4 No 900

3

Glyc/Glyc 1715 1,4 No 820

Estos estudios se hicieron en fermentadores BB de 30 l con DSD-PLC. Se midió la OUR, o tasa de captación de oxígeno ("OUR") en volumen, como un indicador de "salud global del cultivo" o "biomarcador" para una buena expresión. La Figura 19 ilustra los resultados de dicho estudio, una comparación del perfil OUR de cultivos de 30 l de

5 P. pastoris MutS que producen DSD-PLC, usando 1700 U/ml, 1100 U/ml y 100 U/ml de PLC, a 30ºC, cosuministro de glicerol, como se ha analizado anteriormente.

La Figura 20 ilustra una comparación del perfil de consumo de metanol en cultivos de 30 l de P. pastoris MutS que producen DSD-PLC, pH 6,2 (1100 U/ml and 100 U/ml de PLC) o una proteína heteróloga, con cosuministro de

10 glicerol, como se ha analizado anteriormente. Este fue un suministro de MeOH a demanda, y se controló el nivel residual de MeOH a 4 g/l.

Además, el fenotipo Mut+ mejora la expresión de PLC activa y potencia la captación de MeOH, como resume esta tabla de datos:

15 La PLC no parece afectar a las características del crecimiento fisiológico de esta cepa de fenotipo Mut+ -que expresa la PLC recombinante de la SEQ ID NO: 2, en un número de copias 6X, los datos ilustrados en la Figura 21, un perfil OUR como se expone en la descripción de la figura. Este es un suministro de MeOH por abastecimiento sin

Mut

Tasa de cosuministro (ml/min) OD de inducción Actividad PLC (U/ml sup) MeOH consumido (L) Proteasa Bodipy OD Final

0,5

250-300 100 1 Sí 450

1,5

1100 1,7 No 680

2

1550 1,3 No 860

S

2,5 1550 1,4 No 900

3

1715 1,4 No 820

0,5

1001 5,6 Sí 871

0,5

1200 7 No 908

1

1786 5,9 No 988

1

2010 6,8 No 930

1

250-300 1768 7,9 No 700

+

1,5 2669 10 No 701

1,5

2693 7,1 No 818

1,5

2597 8,1 No 804

2

2154 8,3 No 752

20 glucosa o MeOH residual en cultivos Mut+.

Adicionalmente, la calidad de la proteína PLC producida es impredeciblemente variable, por ejemplo, << o >> 50% de la proteína PLC total es activa, como se ilustra por la representación de los resultados de SDS-PAGE, en la Figura 22. Se inserta el resumen gráfico de datos del perfil OUR (analizado anteriormente) en la sección superior de

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Claims (1)

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