ES2606679T3 - Micropartículas para la encapsulación de probióticos, obtención y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

La invención se dirige a unas micropartículas que comprenden una matriz constituida por caseína y quitosano, y unas bacterias probióticas; dicha matriz protege a dichas bacterias probióticas durante su (i) procesamiento, (ii) almacenamiento y (iii) tránsito a través del tracto gastrointestinal, prolongando su vida útil. La presente invención también está dirigida al método de obtención de las micropartículas y a los productos y composiciones que las incorporan.

Description

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Descripcion

Micropartfculas para la encapsulacion de probioticos, obtencion y usos de las mismas Campo de la invencion

La presente invencion se adscribe en el ambito de la tecnolog^a alimentaria, nutraceutica, cosmeceutica y farmaceutica. En particular, se refiere a unas micropartfculas que comprenden una matriz de casema y quitosano y unas bacterias probioticas, a un metodo para su obtencion y a sus aplicaciones.

Antecedentes de la invencion

Generalidades

La microbiota intestinal de un adulto sano es relativamente estable y contiene diversas poblaciones bacterianas beneficiosas, constituidas principalmente por especies de lactobacilos y bifidobacterias, que desempenan un rol importante en la salud del huesped. El desequilibrio de la microbiota colonica beneficiosa puede contribuir al desarrollo de diferentes trastornos, como infecciones del tracto gastrointestinal, constipacion, smdrome de colon irritable, enfermedad inflamatoria del colon, alergias, enfermedades cardfacas y cancer de colon. Para prevenir estos riesgos, la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) ha recomendado explotar el potencial terapeutico y profilactico de microorganismos beneficiosos o probioticos.

Los probioticos se definen como microorganismos vivos que, administrados en cantidades suficientes, proveen efectos fisiologicos beneficiosos sobre el huesped (Perez-Luyo, 2008). En este sentido, se les atribuye: ayuda en la digestion de la lactosa, prevencion de infecciones intestinales, accion inmunomoduladora, prevencion de cancer y enfermedades cardiovasculares. Adicionalmente, se esta investigando el posible papel de los probioticos en la prevencion de las caries dentales.

Existen cuatro formas basicas de consumo de los probioticos: como un cultivo concentrado agregado a alguna bebida (e.g., jugo de frutas, etc.), inoculado dentro de fibras prebioticas, como suplemento dietetico en formas farmaceuticas de celulas liofilizadas (e.g., polvo, capsulas, comprimidos, etc.) e inoculado en alimentos lacteos.

Las bacterias probioticas han sido incorporadas en una amplia gama de alimentos, fundamentalmente en productos lacteos (yogur, queso, helados, postres lacteos, etc.), pero tambien en otros alimentos tales como cereales, zumos, chocolate, etc.

Sin embargo, la tasa de supervivencia de los probioticos en estos productos durante su procesado y/o conservacion es muy baja (de Vos et al., 2010), y para que estos microorganismos produzcan los mencionados efectos beneficiosos deben permanecer viables y en la concentracion adecuada en el momento de su consumo. Existen varios factores responsables de la reduccion de viabilidad de cultivos probioticos, tales como, por ejemplo, acidez al final del procesado/fabricacion del alimento, acidez producida a lo largo de la vida util de este o post-acidificacion, inhibicion por metabolitos de fermentacion, falta de nutrientes, permeabilidad del envase, presion osmotica, temperatura de almacenamiento, interaccion con otras especies microbianas, etc. En general, cuanto mas acido es el producto a lo largo de su vida util, mas baja es la viabilidad de bacterias probioticas como Bifidobacteria y L. acidophilus.

Las estrategias para mejorar la viabilidad de los probioticos incluyen la seleccion de cepas acido-resistentes, el incremento de la concentracion inicial de microorganismos probioticos, o la adicion de un prebiotico adecuado que mantenga un metabolismo activo en vida de estos, un bajo nivel de post-acidificacion, y evitar la formacion de metabolitos de fermentacion no deseados. Teniendo en cuenta que a menudo los concentrados de probioticos son almacenados durante periodos largos de tiempo antes de su utilizacion y despues de su incorporacion en productos alimenticios y/o nutraceuticos, resulta de gran relevancia encontrar un sistema que permita mantener la viabilidad bacteriana a lo largo de todo este tiempo y alargar asf la vida util del producto, a ser posible, sin necesidad de emplear condiciones de temperatura y humedad espedficas para evitar costes economicos adicionales.

Un aspecto relevante a considerar cuando se emplean probioticos es que para que estos produzcan los mencionados efectos beneficiosos para la salud humana, deben alcanzar de forma viable el colon, por lo que necesitan superar la barrera del tracto gastrointestinal superior, es decir, la acidez y las enzimas digestivas del estomago y las sales biliares del intestino delgado.

Ademas, las bacterias probioticas se encuentran expuestas a diversos factores de estres durante su produccion a nivel industrial tales como congelacion, secado, exposicion a oxfgeno, temperaturas, grandes concentraciones de acido lactico en el medio de cultivo, etc.

A la vista de todo ello, actualmente esta cobrando gran interes la posibilidad de encapsular los probioticos vivos como alternativa para mantener su viabilidad ante las condiciones ambientales adversas descritas (Borgogna et al.,

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2010; Ding and Shah, 2008). Estas tecnicas se vienen usando desde hace algunos anos, aunque los beneficios obtenidos a traves de ellas son todavfa mejorables.

La gran mayona de las metodologfas de microencapsulacion de probioticos disenadas hasta el momento se engloban en tres grandes grupos: extrusion, emulsion y spray-drying escalable a nivel industrial (Heidebach et al., 2011). El metodo de extrusion es un procedimiento sencillo y economico que no dana las bacterias aunque no es una tecnica facilmente escalable, lo que dificulta la obtencion de elevadas cantidades de producto. La emulsificacion aunque es la tecnica mas comunmente descrita en literatura para la encapsulacion de bacterias probioticas es una tecnica mas compleja, que requiere el uso de tensioactivos y aceites por lo que resulta economicamente poco viable, puede afectar a la textura y caractensticas organolepticas del producto en el que se incorporen y no es adecuada para el desarrollo de productos alimenticios bajos en grasa. La microencapsulacion mediante spray-drying (“pulverizacion”) es un proceso sencillo y economico aunque da lugar a una elevada tasa de mortalidad bacteriana como consecuencia del proceso simultaneo de deshidratacion e inactivacion termica de los microorganismos.

En terminos generales, las microcapsulas mas adecuadas para la encapsulacion de probioticos debenan cumplir los siguientes requisitos (Heidebach et al., 2011):

-Ser obtenidas mediante un proceso sencillo y economico que no comprometa la viabilidad de las bacterias. -Presentar un tamano y caractensticas adecuados para evitar alterar las caractensticas organolepticas del alimento en el que se incorporen (partmulas con tamanos superiores a 100 pm pueden ser percibidas por el consumidor). -Proteger a los probioticos de las condiciones ambientales adversas (matriz, procesado, almacenamiento, etc.). -Estabilizar a los probioticos y protegerlos del estres derivado de las condiciones del tracto gastrointestinal superior. -Liberar las bacterias vivas en el intestino.

Hasta el momento no se ha desarrollado ninguna formulacion que cumpla todos los requisitos deseados, o al menos los mas relevantes.

Uno de los materiales utilizados para encapsular bacterias probioticas es la casema, una protema conjugada que constituye aproximadamente el 80% del total de protemas de la leche. Se han desarrollado estudios utilizando esta protema, sola o en combinacion con otros polfmeros, incluidos polisacaridos, para encapsular bacterias probioticas (Heidebach et al., 2009, Heidebach et al., 2010, Oliveira et al., 2007), obteniendose buenos resultados de eficacia de encapsulacion sin comprometer la viabilidad bacteriana. De los tres trabajos mencionados, los dos primeros se basan en un sistema de emulsificacion poco escalable, que da lugar a unas microcapsulas de tamanos excesivamente elevados (superiores a 100 pm). Por otra parte, los estudios de resistencia a pH acido realizados en los tres trabajaos identificados ponen de manifiesto que las microcapsulas protegen a las bacterias de la acidez. Sin embargo, en ninguno de dichos trabajos se realiza el estudio empleando pepsina para reproducir las condiciones gastricas reales, mas agresivas que el mero pH acido (la enzima podna degradar la protema e incrementar la exposicion de las bacterias al medio). Asimismo, en esos trabajos se realizan estudios de viabilidad a lo largo del tiempo, observandose que a los 60 - 120 dfas de almacenamiento (en distintas condiciones) hay una perdida muy significativa de los recuentos bacterianos tanto en las formulaciones de bacterias encapsuladas como en las de bacterias libres, siendo menor en el caso de las encapsuladas.

Lactobacillus plantarum es una de las bacterias acido lacticas mas empleadas; esta bacteria es considerada un organismo GRAS (del ingles “Generally Recognized as Safe”) capaz de colonizar de forma saludable el tracto gastrointestinal humano. Muchas cepas de L. plantarum se comercializan en la actualidad como probioticos. Sin embargo, se trata de una bacteria muy sensible a las condiciones del medio gastrointestinal, que puede mantenerse un tiempo muy reducido en almacenamiento, incluso en refrigeracion, ya que en unos pocos dfas se produce una reduccion muy significativa de sus recuentos (Ayub and Brinques, 2011).

Recientemente se han publicado dos trabajos que tratan sobre la encapsulacion de estas bacterias para protegerlas tanto durante su almacenamiento como durante su paso a traves de la barrera gastrointestinal. En el primero de ellos (Ayub and Brinques, 2011), los autores emplean distintos tipos de formulaciones, todas ellas a base de alginato y/o pectina y/o quitosano, para encapsular este tipo de bacterias. Sin embargo, no consiguen mejorar la resistencia gastrointestinal, y, aunque consiguen mejorar el numero de celulas viables durante el almacenamiento a 4°C, sigue habiendo una reduccion significativa de ellas tras 38 dfas de estudio. En otro de los trabajos (Gbassi et al., 2009), se consigue incrementar significativamente la resistencia de las bacterias tras inmovilizarlas en una matriz de alginato recubierta con protemas de lactosuero. Sin embargo, no se trata de micropartmulas sino de partmulas macroscopicas, cuyas caractensticas organolepticas podnan resultar poco deseables y que, ademas, requieren liofilizacion para su conservacion.

Otra de las bacterias acido lacticas mas empleadas es Lactobacillus casei, cuyo potencial beneficioso para la salud ha sido ampliamente reportado. Se puede encontrar en diversos productos distribuidos mundialmente, incluyendo las tradicionales leches fermentadas tales como yakult, kefier, actimel, gefilus y vifit, y en quesos tales como el parmesano y manchego entre otros. No obstante, esta bacteria presenta las mismas limitaciones que la anterior (L. plantarum), es decir, es sensible a las condiciones del tracto gastrointestinal superior y su estabilidad durante los periodos de almacenamiento es muy limitada.

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Adicionalmente, se han descrito sistemas de encapsulacion de bacterias probioticas basados en el empleo de alginato como poKmero encapsulante y en muchos de esos casos se obtienen capsulas con un tamano muy grande (entre 700 pm y 2 mm), o se emplean metodos de emulsificacion poco escalables. Aunque se consigue, en algunos casos, incrementar la resistencia de las bacterias a pH acido cuando se encuentran encapsuladas, la mayona de esos trabajos norealizan los estudios en presencia de enzimas, por lo que no se reproducen fielmente las condiciones gastrointestinales, contemplandose unicamente la resistencia a la acidez. Por otra parte, estos sistemas de encapsulacion tambien consiguen reducir el descenso en los recuentos de bacterias durante el almacenamiento en distintas condiciones, pero a pesar de ello, continua habiendo descensos significativos en plazos cortos de tiempo.

Sigue existiendo, por tanto, la necesidad de desarrollar sistemas que permitan proteger las bacterias probioticas durante su procesamiento, almacenamiento y/o transito a traves del tracto gastrointestinal; ventajosamente dichos sistemas seran unas micropartmulas que contienen las bacterias probioticas, con un tamano uniforme y que no interfiera con las caractensticas organolepticas del producto en el que eventualmente se incorporen, y capaces de proteger las bacterias probioticas tanto durante su procesamiento y almacenamiento en condiciones controladas o ambientales como durante su transito a traves del tracto gastrointestinal.

Compendio de la invencion

Los inventores de la presente invencion han descubierto unas micropartmulas que solucionan los problemas anteriormente mencionados, es decir, unas micropartmulas que tienen la capacidad de encapsular bacterias probioticas para su incorporacion en alimentos y productos nutraceuticos, cosmeceuticos y farmaceuticos. Estas micropartmulas protegen a las bacterias probioticas de su inactivacion por agentes externos, tanto durante el procesado del alimento o producto nutraceutico, cosmeceutico o farmaceutico en el que se incorporan, como durante su almacenamiento a lo largo de penodos prolongados en condiciones ambientales o controladas, incrementando el tiempo de vida util de estos alimentos o nutraceuticos. Ademas, tras ser ingeridas, facilitan la liberacion de las bacterias probioticas en el lugar deseado, protegiendolas de las condiciones “acido-pepticas” del tracto gastrointestinal superior, en particular del estomago.

Estas micropartmulas son estables e inertes en el alimento o en la formulacion nutraceutica, cosmeceutica o farmaceutica en la que se incorporan, evitando que la matriz alimentaria, nutraceutica, cosmeceutica o farmaceutica comprometa la viabilidad de la bacteria.

Ademas, los inventores han desarrollado un metodo de obtencion sencillo de estas micropartmulas que es aplicable a escala industrial. Este metodo no incluye el empleo de tensioactivos o emulgentes, polfmeros sinteticos, ni ningun reactivo que no este aprobado como aditivo alimentario. Este metodo, ademas, permite controlar que el tamano de las micropartmulas obtenidas sea inferior a 100 pm para evitar que sea percibido por el consumidor o que incida de forma negativa en las caractensticas organolepticas del producto en el que se incorporen.

Las micropartmulas se pueden resuspender, que no disolver, con facilidad en medio acuoso, protegiendo del medio a la bacteria probiotica que contienen. Las micropartmulas de la invencion permanecen estables en el producto en el que se incorporan, con lo que se evita un descenso significativo en el recuento de las bacterias viables tras largos periodos de almacenamiento en condiciones ambientales y/o controladas. Ademas, estas micropartmulas son aplicables a distintos tipos de alimentos, desde bebidas y lacteos hasta alimentos solidos, y en productos nutraceuticos. Asimismo, dichas micropartmulas pueden ser formuladas en formulaciones cosmeceuticas y farmaceuticas.

Adicionalmente, se ha observado que dichas micropartmulas tienen un potente efecto inmunomodulador y favorecen la induccion de una respuesta T helper 1 (Th1) y/o desplazan la respuesta inmunitaria hacia Th1, por lo que pueden ser utilizadas en la elaboracion de una composicion moduladora del sistema inmune (inmunomoduladora) para la prevencion y/o tratamiento de una alteracion del sistema inmune, por ejemplo, en la prevencion y/o tratamiento de rechazo a un trasplante mediado por Th2, alergias y enfermedades asociadas a las alergias, inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias, infecciones causadas por patogenos intracelulares y/o infecciones de mucosas.

Las micropartmulas de la invencion proporcionan un nuevo sistema de encapsulacion y estabilizacion de microorganismos probioticos. De acuerdo con la presente invencion, se aprovecha la casema, en combinacion con el quitosano, como vehmulo para proteger las bacterias probioticas de las condiciones ambientales durante largos periodos de almacenamiento y de las condiciones gastricas, incrementando asf su tiempo de vida util y facilitando su liberacion en el intestino, mejorando asf su efecto probiotico. Ademas, la casema per se posee demostradas propiedades nutricionales que complementan los efectos beneficiosos de la propia bacteria probiotica encapsulada.

En resumen, las micropartmulas de la invencion tienen la capacidad de proteger a las bacterias probioticas durante su (i) procesamiento, (ii) almacenamiento y (iii) transito a traves del tracto gastrointestinal.

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Por tanto, en un aspecto, la invencion se relaciona con unas micropartmulas que comprenden una matriz y una bacteria probiotica, en donde dicha matriz esta constituida por casema y quitosano.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con un metodo de obtencion de las micropartmulas proporcionadas por esta invencion, que comprende mezclar una casema o una fuente de casema, bacterias probioticas y quitosano.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con una composicion constituida por una pluralidad de micropartmulas proporcionadas por esta invencion, o que comprende al menos una micropartmula proporcionada por esta invencion y un vehmulo aceptable en alimentacion, nutraceutica, cosmeceutica o farmacia.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con un producto alimenticio, nutraceutico, cosmeceutico o farmaceutico que comprende las micropartmulas proporcionadas por esta invencion.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de dicha micropartmula, composicion o producto proporcionados por esta invencion en la elaboracion de una composicion moduladora del sistema inmune, o, expresado de otra manera, la invencion se relaciona con dicha micropartmula, composicion o producto proporcionados por esta invencion para su empleo en una composicion moduladora del sistema inmune. Dicha composicion inmunomoduladora favorece la induccion de una respuesta Th1 y/o desplaza la respuesta inmunitaria hacia Th1, preferentemente de Th2 hacia Th1, y puede ser utilizada para la prevencion y/o tratamiento de alteraciones del sistema inmune, por ejemplo, en la prevencion y/o tratamiento de (i) rechazo a un trasplante mediado por Th2, (ii) alergias y enfermedades asociadas a las alergias, (iii) inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias, (iv) infecciones causadas por patogenos intracelulares y/o infecciones de mucosas.

La invencion tambien se relaciona con una micropartmula, composicion o producto proporcionados por esta invencion para su empleo en la prevencion y/o el tratamiento de una alteracion del sistema inmune por via oral; asf como con una micropartmula, composicion o producto proporcionados por esta invencion para su empleo en la prevencion y/o el tratamiento por via oral de rechazo a un trasplante mediado por Th2; alergias y enfermedades asociadas a la alergia; inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias; infecciones causadas por patogenos intracelulares, o infecciones de mucosas.

Otros aspectos mas detallados de la presente invencion quedaran aclarados en los siguientes apartados, en los que se incluyen ejemplos espedficos que muestran los resultados mas relevantes, tanto a traves de ilustraciones como de explicaciones mas exhaustivas.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. Imagenes de microscopfa optica de micropartmulas de casema modificadas con quitosano obtenidas mediante spray-drying: A) vadas (x 20); B) con L. plantarum encapsulado (x 20). La lmea horizontal en la parte inferior derecha representa 100 pm.

Figura 2: Imagenes de microscopfa optica de fluorescencia de: A) L. plantarum tenido con marcador fluorescente (x 20); B) micropartmulas de casema modificadas con quitosano obtenidas mediante spray-drying con L. plantarum (tenido con marcador fluorescente) encapsulado (x 20). La lmea horizontal en la parte inferior derecha representa 100 pm.

Figura 3: Imagen de microscopfa optica de fluorescencia de micropartmulas de casema modificadas con quitosano y en presencia de sales calcicas obtenidas mediante spray-drying con L. plantarum (tenido con marcador fluorescente) encapsulado (x 20). La lmea horizontal en la parte inferior derecha representa 100 pm.

Figura 4: Grafica que muestra la supervivencia de L. plantarum en condiciones ambientales (25°C) a lo largo del tiempo: suspension fresca de L. plantarum; L. plantarum liofilizado sin encapsular; L. plantarum encapsulado en micropartmulas de casema modificadas con quitosano (formulacion Ap); L. plantarum encapsulado en micropartmulas de casema modificadas con quitosano en presencia de vainillina (formulacion Bp); L. plantarum encapsulado en micropartmulas de casema modificadas con quitosano en presencia de TPP (formulacion Cp); y L. plantarum encapsulado en micropartmulas de casema modificadas con quitosano en presencia de sales calcicas (formulacion Dp).

Figura 5: Grafica que muestra la supervivencia de L. plantarum en medio gastrointestinal simulado (0 a 2 horas: medio gastrico simulado; 2,1 a 8 horas: medio intestinal simulado): suspension fresca de L. plantarum; L. plantarum liofilizado sin encapsular; L. plantarum encapsulado en micropartmulas de casema modificadas con quitosano (formulacion Ap); L. plantarum encapsulado en micropartmulas de casema modificadas con quitosano en presencia de vainillina (formulacion Bp); L. plantarum encapsulado en micropartmulas de casema modificadas con quitosano en presencia de TPP (formulacion Cp); y L. plantarum encapsulado en micropartmulas de casema modificadas con quitosano en presencia de sales calcicas (formulacion Dp). * Indica diferencias significativas en los recuentos de las micropartmulas con respecto al liofilo (p<0,05).

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Figura 6: Imagenes de microscopfa de barrido electronico que muestran microparffculas de casema modificadas con quitosano en presencia de vainillina (formulacion Bp), en proceso de degradacion, con L. plantarum encapsulado, tras ser sometidas al tratamiento en medio gastrointestinal simulado.

Figura 7: Grafica que muestra la supervivencia de L. casei en condiciones ambientales (25°C) a lo largo del tiempo: suspension fresca de L. casei; L. casei liofilizado sin encapsular; L. casei encapsulado en microparffculas de casema modificadas con quitosano (formulacion Ac); L. casei encapsulado en microparffculas de casema modificadas con quitosano en presencia de vainillina (formulacion Cc); y L. casei encapsulado en microparffculas de casema modificadas con quitosano en presencia de tripolifosfato (TPP) (formulacion Dc).

Figura 8: Grafica que muestra la supervivencia de L. casei en medio gastrointestinal simulado (0 a 2 horas: medio gastrico simulado; 2,1 a 8 horas: medio intestinal simulado): L. casei liofilizado sin encapsular; L. casei encapsulado en microparffculas de casema modificadas con quitosano (formulacion Ac); L. casei encapsulado en microparffculas de casema modificadas con quitosano en presencia de vainillina (formulacion Cc); y L. casei encapsulado en microparffculas de casema modificadas con quitosano en presencia de tripolifosfato (TPP) (formulacion Dc). * Indica diferencias significativas en los recuentos de las microparffculas con respecto al liofilo (p<0,05).

Figura 9: Diagrama de barras que muestra los resultados del analisis inmunofenoffpico de linfocitos perifericos obtenidos de ratones tratados con L. plantarum en su forma no encapsulada (LP libre), L. plantarum encasulados (Bp) o bien con la mezcla ffsica de bacterias (L. plantarum) y parffculas (Mezcla Ffsica). La lmea punteada muestra la ratio obtenida en el grupo control no tratado.

Figura 10: Diagrama de barras que muestra los resultados del mdice de la ratio Th1/Th2 tras estimular in vitro linfocitos perifericos obtenidos de ratones tratados con L. plantarum en su forma no encapsulada (LP libre), L. plantarum encasulados (Bp) o bien con la mezcla ffsica de bacterias y parffculas (Mezcla Ffsica).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se relaciona con la fabricacion de microparffculas para la encapsulacion de bacterias probioticas, con el objetivo de evitar su inactivacion tras su incorporacion en matrices alimentarias, nutraceuticas, farmaceuticas o cosmeceuticas o, protegerlas durante su procesamiento y almacenamiento a lo largo de prolongados peffodos de almacenamiento en condiciones controladas o ambientales y, ademas, protegerlas de las condiciones “acido-pepticas” durante su transito a traves del tracto gastrointestinal una vez ingeridas.

Microparffculas de la invencion

Por tanto, en un aspecto, la invencion se relaciona con unas microparffculas, en adelante “microparffculas de la invencion”, que comprenden una matriz y una bacteria probiotica, en donde dicha matriz esta constituida por casema y quitosano.

Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino "microparffculas" se utiliza para designar sistemas coloidales de tipo esferas o formas similares de tamano inferior a 1 milfmetro (mm), generalmente del orden de 0,5 a 999 micrometros (pm), ffpicamente del orden de 1 a 900 pm. En una realizacion particular, las microparffculas de la invencion tienen un tamano inferior a 1 mm, generalmente comprendido entre 0,1 y 999 pm, ffpicamente entre 0,2 y 900 pm, ventajosamente entre 0,3 y 500 pm, preferentemente entre 0,4 y 250 pm, mas preferentemente entre 0,5 y 125 pm, aun mas preferentemente entre 0,7 y 50 pm, todavfa mas preferentemente entre 1 y 40 pm, todavfa aun mas preferentemente entre 2 y 12 pm aproximadamente.

El termino “matriz” en el ambito de la presente invencion se refiere a la composicion o agente(s) de recubrimiento. De acuerdo con la presente invencion, dicha matriz esta constituida por casema y quitosano y recubre, total o parcialmente, a las bacterias probioticas.

El termino “probiotico” se define como un microorganismo vivo que, al ser administrado en cantidades adecuadas, ejerce una accion fisiologica beneficiosa sobre la salud del hospedador (FAO/WHO 2002. Guidelines for the evaluation of probiotics in food, London). Los probioticos empleados en la presente invencion son “bacterias probioticas”, es decir, bacterias vivas que, al ser administradas en cantidades adecuadas, ejercen una accion fisiologica beneficiosa sobre la salud del hospedador. En una realizacion particular, dicha bacteria probiotica es una bacteria del genero Bifidobacterium o Lactobacillus. En una realizacion mas particular, dicha bacteria probiotica se selecciona entre L. plantarum y L. casei. En una realizacion concreta, las bacterias probioticas son L. plantarum CECT 220 y L. casei CECT 475 T aisladas de forraje de mafz y queso, respectivamente. En otra realizacion particular, dicha bacteria probiotica es una cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, tal como la comercializada con la marca BB-12®.

El termino “casema”, tal como aqrn se utiliza, se refiere a una protema conjugada que constituye aproximadamente el 80% del total de protemas de la leche. Se trata de una protema de tipo fosfoprotema que entra dentro de la

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definicion de las globulinas; es soluble; posee una gran capacidad de retencion de agua y precipita a un pH aproximado de 4,6 a 20°C. Esta constituida por cuatro fracciones fundamentals (as1-casema, as2-casema, p- casema y K-casema) diferenciadas entre sf por su composicion en aminoacidos, su distribucion de cargas y su tendencia a formar agregados en presencia de calcio. En la leche, las casemas se encuentran formando micelas coloidales, estables, de entre 50 y 600 nm de diametro (aproximadamente 150 nm en promedio). El “quitosano” es un poKmero de origen natural derivado de la N-desacetilacion de la quitina (poli-N-acetil-D-glucosamina). El proceso de desacetilacion implica la eliminacion de grupos acetilo de la cadena molecular de la quitina, dejando tras de sf un grupo completo amino (-NH2). El grado de desacetilacion en una muestra de quitosano se refiere por tanto al contenido de grupos amino libres en las subunidades del polisacarido y se puede determinar por ejemplo, segun el metodo descrito por Hidalgo et al. o el estandar ASTM F2260-03(2008) (Standard Test Method for Determining Degree of Deacetylation in Chitosan Salts by Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) entre otros. Generalmente, el grado de desacetilacion del quitosano comercial es igual o superior al 40%, preferentemente igual o mayor del 60%. En una realizacion particular, el grado de desacetilacion del quitosano esta comprendido entre 60% y 100%, tfpicamente entre 75% y 95%, o superior. El quitosano presenta una estructura aminopolisacarida basada en la repeticion de unidades monomericas de formula (I):

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(I)

donde “n” es un numero entero, y, ademas, un numero “m” de unidades donde el grupo amino esta acetilado. La suma de “n+m” representa el grado de polimerizacion, es decir, el numero de unidades monomericas en la cadena de quitosano.

El quitosano a pH acido se encuentra mayoritariamente protonado, por lo que a pH acido es un polisacarido cargado positivamente.

El peso molecular del quitosano puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, el peso molecular del quitosano empleado para la obtencion de las micropartfculas de la invencion esta comprendido entre 5 y 850 kDa, tfpicamente entre 25 y 300, preferentemente entre 40 y 200 kDa, mas preferentemente entre 50 y 150 kDa.

En el ambito de la presente invencion se entiende que como alternativa al quitosano se puede utilizar un derivado del mismo, entendiendose como tal un quitosano en el que se ha modificado uno o mas grupos hidroxilos y/o uno o mas grupos amino. Estos derivados incluyen, entre otros, quitosanos acetilados, alquilados o sulfonatados, asf como derivados tiolados, tal como se describe en Roberts, Chitin Chemistry, Macmillan, 1992, 166. De forma preferente cuando se utiliza un derivado se selecciona entre O-alquileteres de quitosano, O-acilesteres de quitosano, trimetilquitosano, quitosanos modificados con polietilenglicol, etc. Otros derivados posibles incluyen las sales, tales como citrato, nitrato, lactato, fosfato, glutamato, etc. de quitosano. En cualquier caso, el experto en la materia puede identificar las modificaciones que se pueden realizar sobre el quitosano sin afectar a la estabilidad y viabilidad comercial de la formulacion final. En una realizacion particular, el derivado de quitosano es un quitosano hidrofflicamente modificado; tal como aqrn se utiliza un “quitosano hidrofflicamente modificado” es un quitosano modificado con un grupo hidrofilo, tal como un grupo que aumenta la solubilidad del quitosano en un medio acuoso, por ejemplo, un quitosano alquilado (e.g., trimetilquitosano, etc.), un quitosano sulfonado, un quitosano tiolado, una sal de quitosano (e.g., glutamato, cloruro, lactato, acetato, etc.), un quito-oligosacarido, etc. En otra realizacion particular, el derivado de quitosano no es un quitosano hidrofobicamente modificado; tal como aqrn se utiliza, un “quitosano hidrofobicamente modificado”: es un quitosano modificado con un grupo hidrofobo, es decir, con un grupo que reduce la solubilidad del quitosano en un medio acuoso, por ejemplo, un grupo alquilo o arilo con un tamano suficiente como para conferir una hidrofobicidad aumentada al quitosano, por ejemplo, restos de aldetffdos o acidos grasos, preferentemente acidos grasos de a 3 a 18 atomos de carbono, saturados o insaturados, tales como, por ejemplo, acido palmftico, laurico, oleico, linoleico, linolenico, caproico, capnlico, estearico, propionico o buffrico. En otra realizacion particular, cuando la matriz de la microparffcula de la invencion esta constituida por casema y un derivado de quitosano, tal como un quitosano hidrofobicamente modificado, la microparffcula de la invencion carece de un recubrimiento externo de alginato o alginato hidrofobicamente modificado (alginato modificado con un grupo hidrofobo, tal como se ha definido previamente en relacion con el quitosano hidrofobicamente modificado).

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El quitosano y la casema, tal como se ha mencionado previamente, constituyen la matriz que forma parte de las micropartmulas de la invencion. La relacion quitosano:casema, en peso, puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, dicha relacion quitosano:casema, en peso, es de 1:1-150, preferentemente de 1:5-100, mas preferentemente de 1:14-40 aproximadamente.

La cantidad de bacterias probioticas por unidad de peso de la matriz que puede estar presentes en las micropartmulas de la invencion puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, las micropartmulas de la invencion comprenden al menos 106 unidades formadoras de colonia por miligramo (UFC/mg) de matriz, generalmente entre 106 UFC/mg y 5x1013 UFC/mg, preferentemente, entre 108 UFC/mg y 1012 UFC/mg.

En una realizacion particular, las micropartmulas de la invencion comprenden, ademas, un agente reticulante. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos agentes reticulantes incluyen cationes metalicos divalentes farmaceutica o cosmeticamente aceptables, o aptos para su empleo en alimentacion, humana o animal; tripolifosfatos; y, en general, cualquier sustancia capaz de establecer una interaccion qrnmica con la casema y/o el quitosano.

En el sentido utilizado en esta descripcion, un “cation metalico divalente farmaceutica o cosmeticamente aceptable, o apto para su empleo en alimentacion, humana o animal”, es un cation procedente de cualquier elemento metalico cuya valencia es 2, tal como un metal alcalinoterreo, por ejemplo, calcio, magnesio, zinc, etc., o, si tiene varias valencias, una de ellas es 2, por ejemplo, hierro, etc., con la condicion de que sea farmaceutica o cosmeticamente aceptable, o apto para su empleo en alimentacion, en una realizacion particular, dicho cation metalico divalente se selecciona del grupo formado por Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ y combinaciones de los mismos. Como el experto en la materia entendera, el cation metalico divalente util como agente reticulante puede ser proporcionado por una fuente de dicho cation metalico apropiada, tal como un compuesto que en disolucion acuosa origine dicho cation metalico divalente, por ejemplo, cloruro calcico, acetato calcico, gluconato calcico, lactato calcico, sorbato calcico, ascorbato calcico, citrato calcico, propionato calcico, sulfato calcico, etc., o mezclas de dichos compuestos.

En el sentido utilizado en esta descripcion, un “tripolifosfato”, es un compuesto que comprende el pentanion polifosfato, que es la base conjugada del acido trifosforico, por ejemplo, tripolifosfato sodico, habitualmente identificado como STPP (del ingles “sodium tripolyphosphate”) o simplemente como “TPP”.

Ejemplos adicionales de sustancias capaces de establecer una interaccion qrnmica con la casema y/o el quitosano, que pueden ser utilizados como agentes reticulantes dentro de la presente invencion incluyen vainillina [3-metoxi-4- hidroxibenzaldehfdo], genipina [(1R,2R,6S)-2-hidroxi-9-(hidroximetil)-3-oxabiciclo[4.3.0]nona-4,8-dieno-5-carboxilato de metilo], etc.

En una realizacion particular, el agente reticulante es un cation metalico divalente seleccionado del grupo formado por Ca , Mg , Zn , Fe y combinaciones de los mismos; un tripolifosfato; vainillina; genipina; o cualquier combinacion de los mismos. En una realizacion mas particular, el agente reticulante es el cation calcico (Ca2+), TPP o vainillina. En otra realizacion particular, el agente reticulante es Ca2+ y la reticulacion comprende, ademas, someter la mezcla que contiene la matriz de casema y quitosano, las bacterias probioticas y el agente reticulante a un tratamiento a presion, tal como a un ciclo de presion hidrostatica, a una presion comprendida entre 100 y 800 MPa.

En una realizacion particular, las micropartmulas de la invencion comprenden dos o mas agentes reticulantes, preferentemente dos agentes reticulantes diferentes; ejemplos ilustrativos de dichas combinaciones de dos agentes reticulantes diferentes eventualmente presentes en las micropartmulas de la invencion incluyen las combinaciones binarias de:

un tripolifosfato, por ejemplo, TPP, y vainillina; un tripolifosfato, por ejemplo, TPP, y genipina;

un tripolifosfato, por ejemplo, TPP, y un cation metalico divalente farmaceutica o cosmeticamente aceptable, o apto para su empleo en alimentacion, humana o animal, tal como, por ejemplo, un metalico divalente seleccionado del grupo formado por Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ y combinaciones de los mismos; vainillina y genipina;

vainillina y un cation metalico divalente farmaceutica o cosmeticamente aceptable, o apto para su empleo en alimentacion, humana o animal, tal como, por ejemplo, un metalico divalente seleccionado del grupo formado por Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ y combinaciones de los mismos;

genipina y un cation metalico divalente farmaceutica o cosmeticamente aceptable, o apto para su empleo en alimentacion, humana o animal, tal como, por ejemplo, un metalico divalente seleccionado del grupo formado por Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ y combinaciones de los mismos.

En caso de que las micropartmulas de la invencion incluyan al menos, un agente reticulante, la relacion en peso entre el agente reticulante y la matriz de casema y quitosano puede variar dentro de un amplio intervalo, dependiendo del tipo de agente reticulante. En una realizacion particular, cuando el agente reticulante es TPP, la relacion agente reticulante (TPP):matriz (casema y quitosano) es de 1:0,1-800, ventajosamente de 1:1-500,

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preferentemente de alrededor de 1:100-300 aproximadamente. En otra realizacion particular, cuando el agente reticulante es vainillina, la relacion agente reticulante (vainillina):matriz (casema y quitosano) es de 1:0,1-500, ventajosamente de 1:1-250, preferentemente de alrededor de 1:50-100 aproximadamente. En otra realizacion particular, cuando el agente reticulante es Ca2+, la relacion agente reticulante (Ca2+ o fuente de Ca2+:matriz (casema y quitosano) es de 1:0,1-50, ventajosamente de 1:1-25, preferentemente de alrededor de 1:6-16 aproximadamente.

En otra realizacion particular y opcional, las micropartmulas de la invencion comprenden, ademas, un compuesto que protege a la matriz y a las bacterias probioticas durante el proceso de secado de las mismas, o de desecacion de la suspension que contiene las micropartmulas de la invencion, mediante metodos convencionales, por ejemplo, mediante secado por pulverizacion (“spray-drying"), en adelante, “agente protector”. Practicamente cualquier compuesto que cumpla esas caractensticas puede ser utilizado como agente protector. En una realizacion particular, dicho agente protector es un sacarido o, en general, un aditivo alimentario adecuado, que, ademas del papel protector, actua como un prebiotico. El termino “prebiotico”, tal como aqrn se utiliza, se refiere a un ingrediente alimentario no digestible que estimula el crecimiento y/o la actividad de los probioticos. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de agentes protectores que pueden ser utilizados dentro del contexto de la presente invencion incluyen lactosa, manitol, sacarosa, maltodextrina, glucosa, sorbitol, etc., asf como sustancias con caractensticas prebioticas, tales como, por ejemplo, oligofructosa, pectina, inulina, galacto-oligosacaridos, lactulosa, oligosacaridos de la leche materna, fibra alimentaria, etc., y cualquier combinacion de los misms. En una realizacion particular, el agente protector es manitol o sacarosa. En caso de que las micropartmulas de la invencion incluyan un agente protector, la relacion en peso entre la matriz de casema y quitosano y el agente protector puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, la relacion en peso entre la matriz (casema y quitosano):agente protector es de 1:0,1-5, tfpicamente de 1:0,5-4, preferentemente alrededor de 1:1.

Metodo de obtencion de las microparticulas de la invencion

En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo, en adelante “metodo de la invencion”, de obtencion de micropartmulas que comprenden una matriz y una bacteria probiotica, en donde dicha matriz esta constituida por casema y quitosano (micropartmulas de la invencion), que comprende mezclar casema o una fuente de casema, bacterias probioticas y quitosano.

La casema puede incorporarse tal cual o puede ser aportada por una fuente de casema. Por razones de simplicidad, los terminos “casema” y “fuente de casema” se utilizan indistintamente en esta descripcion. Practicamente cualquier fuente de casema puede ser utilizada en la puesta en practica del metodo de la invencion. El origen de la fuente de casema puede ser muy diverso, por ejemplo, leche, judfas, etc. En una realizacion particular, la fuente de casema se encuentra en forma de solucion o suspension acuosa; en este caso, la casema puede encontrarse en forma de acido casemico o caseinato, por ejemplo, caseinato sodico, etc., o cualquier otra forma soluble de casema. Aunque pueden utilizarse otros caseinatos, por ejemplo, caseinato calcico o fosfocalcico, en la practica resulta mas ventajoso utilizar caseinato sodico. La solucion o suspension acuosa que contiene la fuente de casema puede ser obtenida por metodos convencionales conocidos por los tecnicos en la materia, por ejemplo, mediante la adicion de la fuente de casema a un medio acuoso. Tal como aqrn se utiliza, un “medio acuoso”, es un medio que comprende agua, preferentemente, un medio que contiene mayoritariamente agua, mas preferentemente, el medio acuoso consiste esencialmente en agua. La cantidad de casema que puede contener dicha solucion acuosa puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, la cantidad de casema contenida en dicha solucion acuosa esta comprendida entre 0,1% y 10% (p/v), preferentemente entre 0,5% y 5%, mas preferentemente entre 1% y 2%. Preferentemente, dicha solucion acuosa de casema no contiene ningun disolvente organico.

Para la puesta en practica del metodo de la invencion se prepara, ventajosamente, una suspension de bacterias probioticas. Aunque practicamente cualquier bacteria probiotica puede ser utilizada, en una realizacion particular, dicha bacteria probiotica es una bacteria del genero Bifidobacterium o Lactobacillus. En una realizacion mas particular, dicha bacteria probiotica es L. plantarum o L. casei. En una realizacion concreta, las bacterias probioticas son L. plantarum CECT 220 y L. casei CECT 475 T. En otra realizacion particular, dicha bacteria probiotica es una cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, tal como la comercializada con la marca BB-12®. La suspension bacteriana comprende, ademas de las bacterias probioticas, un medio adecuado para las bacterias probioticas correspondientes. Dichos medios son conocidos por los tecnicos en la materia. En una realizacion particular, cuando dichas probioticas son bacterias del genero Lactobacillus, por ejemplo, L. plantarum o L. casei, dicho medio comprende caldo para Lactobacillus segun De Man, Rogosa y Sharpe, tal como el identificado como 110661 Caldo MRS (Merck) [caldo MRS]; dicho medio posibilita un buen crecimiento de lactobacilos y de otras bacterias acido lacticas y se utiliza habitualmente para el cultivo y enriquecimiento de lactobacilos a partir de muestras clmicas y alimentos, especialmente lacteos. En general, el medio MRS comprende (en g/L): polipeptona, 10 g; extracto de carne, 10 g; extracto de levadura, 5 g; glucosa, 20 g; Tween® 80 (monoloelato de sorbitan polietoxilado o polisorbato 80), 1,08 ml; fosfato de potasio, 2 g; acetato de sodio, 5 g; citrato de amonio, 2 g; sulfato de magnesio, 0,2 g; sulfato de manganeso, 0,05 g. El pH del medio a una temperatura de 25°C es de 6,4± 0,2. Este medio de cultivo permite un abundante desarrollo de todas las especies de lactobacilos. La peptona y la glucosa constituyen la fuente de nitrogeno, carbono y otros elementos necesarios para el crecimiento bacteriano. El monoleato de sorbitan polietoxilado, magnesio, manganeso y acetato, aportan cofactores y pueden inhibir el desarrollo de algunos microorganismos. El citrato de amonio actua como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias Gram negativas.

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La cantidad de bacterias probioticas que puede estar presente en la suspension bacteriana puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, la cantidad de bacterias probioticas presente en la suspension bacteriana es de, al menos, 106 UFC/ml, generalmente entre 106 y 5x1012 UFC/ml, preferentemente entre 108 y 1012 UFC/ml. En una realizacion particular y opcional, la suspension bacteriana contiene, ademas, un sacarido, tal como sacarosa u otro disacarido apropiado tal como, por ejemplo, maltosa o trehalosa; estos compuestos juegan, en general, un importante papel durante el proceso de secado de las micropartmulas ya que protegen tanto la membrana celular como las protemas. Los disacaridos forman enlaces de hidrogeno con las protemas cuando se produce la deshidratacion, lo que permite mantener la estructura de la protema y evitar su desnaturalizacion. Por otra parte, parece que los azucares podnan actuar como sustitutos de las moleculas de agua durante la deshidratacion, rodeando los grupos polares tanto de las bicapas fosfolipfdicas como de las membranas, manteniendo la integridad estructural de la membrana y de las protemas. En caso de que dicha suspension bacteriana contenga un disacarido para los fines indicados, por ejemplo, sacarosa, la cantidad de disacarido (e.g., sacarosa) presente en dicha suspension bacteriana estara comprendida entre 0,1% y 10% (p/v) de disacarido (e.g., sacarosa), preferiblemente entre 1% y 3% (p/v).En cuanto al quitosano, practicamente cualquier quitosano, o derivado del mismo apropiado, puede ser utilizado en la puesta en practica del metodo de la invencion; no obstante, en una realizacion particular, dicho quitosano tiene un grado de desacetilacion comprendido entre 60 y 100%, preferentemente entre 75% y 95%, y un peso molecular comprendido entre 5 y 850 kDa, tfpicamente entre 25 y 300 kDa, preferentemente entre 40 y 200 kDa, mas preferentemente entre 50 y 150 kDa. En una realizacion particular, el quitosano se encuentra en forma de solucion o suspension acuosa. La solucion o suspension acuosa que contiene quitosano puede ser obtenida por metodos convencionales conocidos por los tecnicos en la materia, por ejemplo, mediante la adicion de quitosano a un medio acuoso, por ejemplo, agua o un medio que contiene mayoritariamente agua. La cantidad de quitosano que puede contener dicha solucion o suspension acuosa puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, la cantidad de quitosano contenida en dicha solucion o suspension acuosa esta comprendida entre 0,05% y 1% (p/v), preferentemente entre 0,1% y 0,3%, mas preferentemente entre 1% y 2%. Preferentemente, dicha solucion o suspension acuosa de quitosano no contiene ningun disolvente organico.

El orden en que se mezclan la casema, las bacterias probioticas y el quitosano en la etapa de mezcla del metodo de la invencion, es indiferente. En una realizacion particular, se mezclan primero la casema y las bacterias probioticas, y luego se anade el quitosano; en otra realizacion particular, se mezclan primero la casema y el quitosano, y, posteriormente, se anaden las bacterias probioticas; en otra realizacion particular, se mezclan primero las bacterias probioticas y el quitosano, y, posteriormente, se anade la casema; y, en otra realizacion particular, se anaden la casema, las bacterias probioticas y el quitosano y se mezclan. En una realizacion particular, dichos componentes se anaden, como se ha mencionado previamente, en forma de una solucion acuosa de casema, una suspension de bacterias probioticas y una solucion acuosa de quitosano.

La mezcla de casema, bacterias probioticas y quitosano se lleva a cabo, preferentemente a temperatura ambiente, es decir, a una temperatura comprendida entre 18°C y 25°C, preferentemente, entre 20°C y 22°C, con el fin de no afectar a la viabilidad de las bacterias probioticas, ventajosamente con agitacion.

La relacion, en peso, entre la casema y el quitosano presente en la mezcla previa a la formacion de las micropartmulas de la invencion puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, dicha relacion casema:quitosano, en peso, es de 1:0,01-0,5, preferentemente de 1:0,01-0,1, mas preferentemente de alrededor de 1:0,02-0,07, o, expresado de otra manera, la relacion quitosano:casema, en peso, presente en la mezcla previa a la formacion de las micropartmulas de la invencion es de 1:1-150, preferentemente de 1:5-100, mas preferentemente de alrededor de 1:14-40.

La relacion entre bacterias probioticas y los componentes de la matriz (casema y quitosano) presente en la mezcla previa a la formacion de las micropartmulas de la invencion puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, dicha relacion bacterias probioticas/matriz es de, al menos, 106 UFC por mg de matriz, generalmente comprendida entre 106 UFC/mg y 1013 UFC/mg, preferentemente entre 109 UFC/mg y 1012 UFC/mg.

Como se ha mencionado previamente, en una realizacion particular, las micropartmulas de la invencion comprenden, ademas, un agente reticulante, tal como por ejemplo, un tripolifosfato (e.g., tripolifosfato sodico (TPP)); vainillina; genipina; un cation metalico divalente farmaceutica o cosmeticamente aceptable, o apto para su empleo en alimentacion, humana o animal, tal como, por ejemplo, un metalico divalente seleccionado del grupo formado por Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ y combinaciones de los mismos; o cualquier combinacion de los mismos, o cualquier otra sustancia capaz de establecer una interaccion qrnmica con la casema y/o el quitosano. En otra realizacion particular, las micropartmulas de la invencion comprenden dos o mas agentes reticulantes, preferentemente las combinaciones de dos agentes reticulantes diferentes previamente mencionadas en relacion con las micropartmulas de la invencion.

En caso de que las micropartmulas de la invencion comprendan al menos un agente reticulante, el metodo de la invencion comprende la adicion de dicho al menos un agente reticulante a la mezcla de casema, bacterias probioticas y quitosano. El agente (o agentes) reticulante, en una realizacion particular, puede anadirse a dicha mezcla en forma de una solucion acuosa. Cuando el agente reticulante es el cation calcico (Ca2+), este puede ser

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proporcionado por una fuente de dicho cation apropiada, tal como un compuesto que en disolucion acuosa origine dicho cation divalente, por ejemplo, cloruro calcico, acetato calcico, gluconato calcico, lactato calcico, sorbato calcico, ascorbato calcico, citrato calcico, propionato calcico, sulfato calcico, etc., o mezclas de dichos compuestos. En caso de que las micropartmulas de la invencion incluyan un agente reticulante, la cantidad de agente reticulante a anadir depende de la naturaleza del agente reticulante, tal como se ha mencionado previamente en relacion con las micropartmulas de la invencion. En cualquier caso, dicho agente reticulante se anadira en cantidad suficiente como para que, cuando el agente reticulante es TPP, la relacion agente reticulante (TPP):matriz (casema y quitosano) es de 1:0,1-800, ventajosamente de 1:1-500, preferentemente de alrededor de 1:100-300 aproximadamente; cuando el agente reticulante es vainillina, la relacion agente reticulante (vainillina):matriz (casema y quitosano) es de 1:0,1-500, ventajosamente de 1:1-250, preferentemente de alrededor de 1:50-100 aproximadamente; y cuando el agente reticulante es Ca2+, la relacion agente reticulante (Ca2+ o fuente de calcio:matriz (casema y quitosano) es de 1:0,150, ventajosamente de 1:1-25, preferentemente de alrededor de 1:6-16 aproximadamente.

Tras la mezcla de la casema, las bacterias probioticas y el quitosano, en las condiciones mencionadas previamente, es decir, a temperatura ambiente y con agitacion, se forman las micropartmulas de la invencion, que comprenden una matriz constituida por casema y quitosano, y una bacteria probiotica. Dichas micropartmulas de la invencion se encuentran, en una realizacion particular, en suspension en el medio en el que se han formado.

A continuacion, si se desea, la suspension resultante de la mezcla de casema, bacterias probioticas y quitosano, que contiene las micropartmulas de la invencion, se somete a un tratamiento de secado por metodos convencionales, ventajosamente mediante secado por pulverizacion (“spray-drying”) o mediante liofilizacion, con el fin de desecar las micropartmulas de la invencion; este tratamiento de secado permite obtener las micropartmulas de la invencion en forma de un polvo, lo que contribuye a aumentar la estabilidad de las mismas. En una realizacion particular, este tratamiento de secado, en particular, cuando se realiza mediante secado por pulverizacion (“spray-drying”) o mediante liofilizacion, comprende la adicion de un agente protector, tal como se ha mencionado previamente en relacion con las micropartmulas de la invencion, que protege a la matriz y a las bacterias probioticas durante el proceso de secado de las mismas, tal como por ejemplo, un sacarido o, en general, un aditivo alimentario adecuado, que, ademas del papel protector, actua como un prebiotico. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de sacaridos que pueden ser utilizados como agentes protectores dentro del contexto de la presente invencion incluyen lactosa, manitol, sacarosa, maltodextrina, glucosa, sorbitol, etc., asf como polisacaridos con caractensticas prebioticas, tales como, por ejemplo, oligofructosa, pectina, inulina, galacto-oligosacaridos, lactulosa, oligosacaridos de leche materna, fibra alimentaria, etc. En una realizacion particular, el agente protector es manitol. En caso de que las micropartmulas de la invencion incluyan un agente protector, se adiciona este en la cantidad apropiada; aunque la relacion en peso entre la matriz de casema y quitosano y el agente protector puede variar dentro de un amplio intervalo, en una realizacion particular, la relacion en peso entre la matriz (casema y quitosano):agente protector es de 1:0,1-5, tipicamente de 1:0,5-4, preferentemente alrededor de 1:1.

En una realizacion particular, en la que el metodo de la invencion comprende desecar la suspension de micropartmulas de la invencion, la desecacion de dicha suspension y el secado de las micropartmulas de la invencion se realiza mediante secado por pulverizacion (“spray-drying”); para ello, la suspension conteniendo las micropartmulas de la invencion y/o la mezcla de casema, bacterias probioticas y quitosano, y, opcionalmente, un agente reticulante y/o un agente protector, se introduce en un spray-dryer y se controlan las condiciones de procesado [temperatura de entrada de aire (inlet temperature); temperatura salida del aire (outlet temperature); presion de aire (air pressure); velocidad de bombeo de la muestra (pumping rate); aspiracion; y flujo de aire (air flow)]. El experto en la materia puede fijar las condiciones de procesado mas apropiadas para cada caso.

El metodo de la invencion, si se desea, puede incluir alguna etapa adicional para estabilizar las micropartmulas de la invencion. En una realizacion particular, cuando la reticulacion de las micropartmulas de la invencion se realiza mediante adicion de un agente reticulante, por ejemplo, un cation metalico divalente, tal como Ca2+, y tratamiento a presion elevada, el metodo de la invencion comprende introducir la suspension que contiene las micropartmulas de la invencion que comprenden, ademas, un agente reticulante, y/o la mezcla que comprende casema, bacterias probioticas, quitosano y agente reticulante, en un contenedor adecuado, por ejemplo, una bolsa de plastico, que se sella y se somete a, al menos, un ciclo de presion hidrostatica, a una presion comprendida entre 100 y 800 MPa, preferentemente entre 100 y 400 MPa, durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 30 min, preferentemente entre 2 y 10 min. En una realizacion particular, dicho tratamiento a presion hidrostatica elevada comprende la aplicacion sobre dicha mezcla que comprende casema, bacterias probioticas, quitosano y agente reticulante, de 1 ciclo de 5 minutos a 100 MPa, o de 1 ciclo de 2 minutos a 300 MPa. En una realizacion concreta, la mezcla que comprende casema, bacterias probioticas, quitosano y agente reticulante (Ca2+) se somete a 1 ciclo de 5 minutos a 100 MPa. Este tratamiento a presion elevada se aplica sobre la mezcla que comprende casema, bacterias probioticas, quitosano y agente reticulante antes de someterla al proceso de secado mediante spray-drying. Alternativamente, como el experto en la materia conoce, el tratamiento a presion elevada es un tratamiento que permite reticular las micropartmulas per se sin que sea necesaria la incorporacion de un agente reticulante, por lo que, las micropartmulas de la invencion podnan ser reticuladas sometiendolas a un tratamiento con altas presiones, en ausencia de agente reticulante.

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El metodo de la invencion permite obtener las micropartmulas de la invencion en forma de un polvo seco, lo que contribuye a la estabilidad de las micropartmulas de la invencion durante largos periodos de almacenamiento en condiciones controladas o ambientales y, ademas, puede ser incorporado facilmente en los distintos productos (e.g., alimentos, etc.) a los que va destinado, tanto solidos como Kquidos.

Las micropartmulas obtenibles mediante el metodo de la invencion, presentan las caractensticas de las micropartmulas de la invencion, y constituyen un aspecto adicional de la presente invencion.

Aplicaciones

Las micropartmulas de la invencion tienen la capacidad de encapsular bacterias probioticas y protegerlas durante su procesamiento (obtencion de micropartmulas que comprenden una matriz constituida por casema y quitosano, cargadas con dichas bacterias probioticas) y almacenamiento a lo largo de prolongados penodos de almacenamiento en condiciones controladas o ambientales y, ademas, protegerlas de las condiciones “acido- pepticas” durante su transito a traves del tracto gastrointestinal una vez ingeridas; de este modo se evita, o se reduce sustancialmente, la inactivacion de las bacterias probioticas tras su incorporacion en los diferentes productos (e.g., alimenticios, etc.) a los que van destinadas.

Adicionalmente, las micropartmulas de la invencion tienen un potente efecto inmunomodulador por lo que pueden ser utilizadas en la elaboracion de una composicion moduladora del sistema inmune para la prevencion y/o tratamiento de alteraciones del sistema inmune.

Por tanto, en otro aspecto, la invencion se relaciona con una composicion, en adelante “composicion de la invencion”, seleccionada entre:

(i) una composicion constituida por una pluralidad de micropartmulas de la invencion, o por una pluralidad de micropartmulas obtenibles mediante el metodo de la invencion, o por una pluralidad de micropartmulas de la invencion y de micropartmulas obtenibles mediante el metodo de la invencion; y

(ii) una composicion que comprende, al menos, una micropartmula de la invencion, y/o una micropartmula obtenible mediante el metodo de la invencion, y un vehmulo aceptable en alimentacion, nutraceutica, cosmeceutica o farmacia.

Las caractensticas de las micropartmulas de la invencion ya han sido definidas previamente y se incorporan aqu por referencia. En una realizacion particular, el tamano medio de las micropartmulas de la invencion esta comprendido entre 0,5 y 125 pm, preferentemente entre 1 y 40 pm, mas preferentemente, entre 2 y 12 pm. Por “tamano medio” se entiende el diametro promedio de la poblacion de micropartmulas, que se mueve conjuntamente en un medio acuoso. El tamano medio de estos sistemas se puede medir por procedimientos estandar conocidos del experto en la materia, y que se describen, por ejemplo, en la parte experimental descrita mas adelante. En otra realizacion particular, las bacterias probioticas presentes en las micropartmulas de la invencion se seleccionan entre bacterias del genero de Bifidobacterium y Lactobacillus; en una realizacion mas particular, dicha bacteria probiotica se selecciona entre L. plantarum y L. casei. En una realizacion concreta, las bacterias probioticas son L. plantarum CECT 220 y L. casei CECT 475 T. En otra realizacion particular, dicha bacteria probiotica es una cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, tal como la comercializada con la marca BB-12®.

En otra realizacion particular, las micropartmulas de la invencion comprenden un agente reticulante, tal como se ha mencionado previamente, por ejemplo, TPP, vainillina o un cation metalico divalente, por ejemplo, Ca2+. En otra realizacion particular, las micropartmulas de la invencion comprenden dos o mas agentes reticulantes, preferentemente las combinaciones de dos agentes reticulantes diferentes previamente mencionadas en relacion con las micropartmulas de la invencion. En otra realizacion particular, las micropartmulas de la invencion comprenden un agente protector, tal como un sacarido, por ejemplo, manitol. En otra realizacion particular, las micropartmulas de la invencion se encuentran en forma de polvo seco.

En el primer caso, la composicion de la invencion (i) esta constituida unica y exclusivamente por micropartmulas de la invencion y/o por micropartmulas obtenibles mediante el metodo de la invencion. En una realizacion particular, dicha composicion de la invencion (i) se selecciona entre:

una composicion A, que comprende:

casema, entre 40% y 60% en peso, quitosano, entre 0,1% y 3,5% en peso, bacterias probioticas, entre 109 UFC/g y 5 x 1012 UFC/g, tripolifosfato sodico, entre 0% y 0,15% en peso, y agente protector entre 0% y 60% en peso;

donde las proporciones en peso se refieren al total de la composicion;

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una composicion B, que comprende:

casema, entre 40% y 60% en peso,

quitosano, entre 0,1% y 3,5% en peso,

bacterias probioticas, entre 109 UFC/g y 5 x 1012 UFC/g,

vainillina, entre 0% y 0,6% en peso, y

agente protector entre 0% y 60% en peso;

donde las proporciones en peso se refieren al total de la composicion; y

una composicion C, que comprende:

casema, entre 40% y 60% en peso,

quitosano, entre 0,1% y 3,5% en peso,

bacterias probioticas, entre 109 UFC/g y 5 x 1012 UFC/g,

Ca2+, entre 0% y 10% en peso, y agente protector entre 0% y 60% en peso,

donde las proporciones en peso se refieren al total de la composicion.

En el segundo caso, la composicion de la invencion (ii) comprende, al menos, una micropartmula de la invencion y/o una micropartmula obtenible mediante el metodo de la invencion, y un vehmulo aceptable en alimentacion, nutraceutica, cosmeceutica o farmacia.

En una realizacion particular, la composicion de la invencion es un alimento o pienso que comprende, al menos, una micropartmula de la invencion y/o una micropartmula obtenible mediante el metodo de la invencion, o una composicion que comprende una pluralidad de micropartmulas de la invencion y/o de micropartmulas obtenibles mediante el metodo de la invencion. En el sentido utilizado en esta descripcion, el termino "alimento” es cualquier sustancia o producto de cualquier naturaleza, solido o lfquido, natural o transformado, que por sus caractensticas, aplicaciones, componentes, preparacion y estado de conservacion, sea susceptible de ser habitual o idoneamente utilizados en alguno de los fines siguientes: a) para la normal nutricion humana o animal o como fruitivos; o b) como productos dieteticos, en casos especiales de alimentacion humana o animal. El termino “pienso” incluye todas las materias naturales y productos elaborados, de cualquier origen, que, por separado o convenientemente mezclados entre sf, resulten aptos para la alimentacion animal. Un alimento listo para consumir es aquel que no necesita ser diluido mediante, por ejemplo, una solucion acuosa adecuada para el consumo. En principio, los ingredientes presentes en un alimento listo para consumir estan equilibrados y no se necesita anadir ingredientes adicionales al alimento para volverlo listo para el consumo, tal como es considerado por un experto en la materia. Un alimento concentrado es aquel en el que uno o mas ingredientes estan presentes en mayor concentracion que en un alimento listo para consumir, por lo que para su empleo, es necesario diluirlo mediante, por ejemplo, una solucion acuosa adecuada para el consumo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de alimentos proporcionados por esta invencion incluyen tanto productos lacteos y derivados, por ejemplo, leches fermentadas, yogur, kefir, cuajada, quesos, mantequillas, helados, postres lacteos, etc., como productos no lacteos, tales como productos de panadena, bollena y repostena, cereales, chocolates, mermeladas, zumos, otros derivados de frutas, aceites y margarinas, platos preparados, etc.

En otra realizacion particular, la composicion de la invencion es una composicion nutraceutica que comprende, al menos, una micropartmula de la invencion y/o una micropartmula obtenible mediante el metodo de la invencion, o una composicion que comprende una pluralidad de micropartfculas de la invencion y/o de micropartmulas obtenibles mediante el metodo de la invencion. En el sentido utilizado en esta descripcion, el termino “composicion nutraceutica” hace referencia a una composicion adecuada para su empleo en seres humanos o animales, que comprende uno o mas productos naturales con accion terapeutica o que proporcionan un beneficio para la salud o que han sido asociados con la prevencion o disminucion de enfermedades, por ejemplo, bacterias probioticas, etc., e incluye suplementos dieteticos presentados en una matriz no alimenticia (e.g., capsulas, polvo, etc.) de un producto natural bioactivo concentrado presente usualmente (o no) en los alimentos y que, tomado en dosis superior a la existente en esos alimentos ejerce un efecto favorable sobre la salud, mayor que el que podna tener el alimento normal. El termino “composicion nutraceutica” incluye, por tanto, productos aislados o purificados de alimentos asf como aditivos o complementos alimentarios, que, en general, se presentan en unas formas farmaceuticas normalmente empleadas por via oral, por ejemplo, capsulas, comprimidos, sobres, ampollas bebibles, etc.; tales productos proporcionan un beneficio fisiologico o proteccion frente a enfermedades, generalmente, frente a enfermedades cronicas. Si se desea, la composicion nutraceutica proporcionada por la invencion puede contener, ademas de las bacterias probioticas, uno o mas nutraceuticos (productos o sustancias asociados con la prevencion o disminucion de enfermedades), por ejemplo, flavonoides, acidos grasos omega-3, etc., y/o uno o mas prebioticos (ingredientes alimentarios no digestibles que estimulan el crecimiento y/o la actividad de los probioticos), por ejemplo, oligofructosa, pectina, inulina, galacto-oligosacaridos, lactulosa, oligosacaridos de leche materna, fibra alimentaria, etc.

En otra realizacion particular, la composicion de la invencion es una composicion farmaceutica que comprende, al menos, una micropartmula de la invencion y/o una micropartmula obtenible mediante el metodo de la invencion, o

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una composicion que comprende una pluralidad de micropartfculas de la invencion y/o de micropartfculas obtenibles mediante el metodo de la invencion, adecuada para su administracion por v^a oral, topica, rectal o vaginal; para ello, dicha composicion comprende un vetnculo farmaceuticamente aceptable que comprende uno o mas excipientes adecuados para su administracion por via oral, por ejemplo, en forma de capsula, polvo, granulado, comprimido (recubierto o no), sobre, matriz, suspension, etc., o un vetnculo farmaceuticamente aceptable que comprende uno o mas excipientes adecuados para su administracion por via topica, por ejemplo, en forma de crema, pomada, unguento, etc., o un vetnculo farmaceuticamente aceptable que comprende uno o mas excipientes adecuados para su administracion por via rectal, por ejemplo, en forma de supositorio, etc., o un vetnculo farmaceuticamente aceptable que comprende uno o mas excipientes adecuados para su administracion por via vaginal, por ejemplo, en forma de bolo, supositorio, etc. Informacion sobre excipientes adecuados para la formulacion de composiciones farmaceuticas destinadas a su administracion por via oral, topica, rectal o vaginal, asf como sobre la produccion de dichas composiciones farmaceuticas puede encontrarse en el libro “Tratado de Farmacia Galenica”, de C. Faulf i Trillo, 10 Edicion, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones.

En otra realizacion particular, la composicion de la invencion es una composicion cosmetica que comprende, al menos, una micropartfcula de la invencion y/o una micropartfcula obtenible mediante el metodo de la invencion, o una composicion que comprende una pluralidad de micropartfculas de la invencion y/o de micropartfculas obtenibles mediante el metodo de la invencion. En el sentido utilizado en esta descripcion, el termino “composicion cosmetica” hace referencia a una composicion adecuada para su empleo en la higiene corporal de seres humanos o animales, o con el fin de mejorar la belleza, o alterar la apariencia corporal sin afectar a la estructura o funciones del cuerpo humano o animal, que comprende uno o mas productos que proporcionan tales efectos. Si se desea, la composicion cosmetica proporcionada por la invencion puede contener, ademas de las bacterias probioticas, uno o mas productos cosmeticos, es decir, sustancias o mezclas destinada a ser puestas en contacto con las partes superficiales del cuerpo humano o animal (epidermis, sistema piloso y capilar, unas, labios y organos genitales externos) o con los dientes y las mucosas bucales, con el fin exclusivo o principal de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto, protegerlos, mantenerlos en buen estado o corregir los olores corporales. Ejemplos ilustrativos de productos cosmeticos incluyen los productos contenidos en el listado INCI (del ingles “International Nomenclature of Cosmetic Ingredients”).

En otra realizacion particular, la composicion de la invencion es una composicion cosmeceutica que comprende, al menos, una micropartfcula de la invencion y/o una micropartfcula obtenible mediante el metodo de la invencion, o una composicion que comprende una pluralidad de micropartfculas de la invencion y/o de micropartfculas obtenibles mediante el metodo de la invencion. En el sentido utilizado en esta descripcion, el termino “composicion cosmeceutica” hace referencia a una composicion adecuada para su empleo en el cuerpo humano o animal que comprende uno o mas productos cosmeceuticos (“functional cosmetics”, “dermoceuticals” o “active cosmetics”), es decir, productos topicos tnbridos con caractensticas cosmetico-farmaceuticas que contienen ingredientes activos con efecto sobre la piel, el cabello y/o las unas del usuario, en concentraciones mas altas y efectivas, por lo que se situan en un nivel intermedio entre el cosmetico y el farmaco. Ejemplos ilustrativos de productos cosmeceuticos incluyen aceites esenciales, ceramidas, enzimas, minerales, peptidos, vitaminas, etc. El experto en la materia entendera que las micropartfculas de la invencion, o las composiciones que las contienen, pueden formar parte de un alimento o pienso, o de un producto nutraceutico, farmaceutico, o cosmeceutico, los cuales constituyen un aspecto adicional de la presente invencion. Dichos productos pueden estar en forma lfquida, semi-solida o solida.

Adicionalmente, las micropartfculas de la invencion tienen un potente efecto inmunomodulador y favorecen la induccion de una respuesta Th1 y/o desplazan la respuesta inmunitaria hacia Th1, preferentemente de Th2 hacia Th1 (Ejemplo 7), por lo que pueden ser utilizadas en la elaboracion de una composicion moduladora del sistema inmune para la prevencion y/o tratamiento de una alteracion del sistema inmune, por ejemplo, en la prevencion y/o tratamiento de rechazo a un trasplante mediado por Th2, alergias y enfermedades asociadas a las alergias, inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias, infecciones causadas por patogenos intracelulares y/o infecciones de mucosas.

Por tanto, en otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de una micropartfcula de la invencion, o de una composicion de la invencion, o de un producto alimenticio, farmaceutico, cosmeceutico o nutraceutico que comprende al menos una micropartfcula de la invencion o dicha composicion de la invencion, en adelante “producto de la invencion”, en la elaboracion de una composicion moduladora del sistema inmune. Expresado de otra manera, segun este aspecto inventivo, la invencion se relaciona con una micropartfcula de la invencion, o una composicion de la invencion, o un producto de la invencion para su empleo en una composicion moduladora del sistema inmune.

En el sentido utilizado en esta descripcion, una “composicion moduladora del sistema inmune”, en adelante “composicion inmunomoduladora de la invencion”, es una composicion que es capaz de estimular ciertas respuestas del sistema inmune haciendolo mas reactivo, por ejemplo, interviniendo, a traves de la produccion de citoquinas espedficas, en el desarrollo de las celulas implicadas en la respuesta inmune. En el sentido utilizado en esta descripcion, el termino “composicion” incluye cualquier composicion farmaceutica, alimentaria (alimento o pienso), nutraceutica, etc., que comprende las micropartfcula de la invencion, la composicion de la invencion, o el producto de la invencion, anteriormente descritos.

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Los resultados mostrados en el Ejemplo 7 ponen de manifiesto que la administracion oral de micropartfculas de la invencion conteniendo L. plantarum a ratones CD1, por una parte, induce un ligero aumento del numero de linfocitos citotoxicos (puesta de manifiesto por una disminucion de la relacion CD4+/CD8+) (Figura 9), y, por otra parte, provoca un incremento en la smtesis de interferon-gamma (IFN-g), frente a la produccion de interleuquina 6 (IL-6), desplazando de ese modo la respuesta inmunitaria hacia un perfil Th1. Estos resultados parecen indicar, aunque no se desea estar vinculado a ello, una posible interaccion entre las micropartfculas de la invencion y el sistema inmune, modificando el tipo de respuesta inmunitaria y desplazandola hacia una respuesta Th1.

Por tanto, en una realizacion particular, la composicion inmunomoduladora de la invencion es una composicion que induce preferentemente una respuesta Th1 y/o desplaza la respuesta inmunitaria hacia Th1, preferentemente de Th2 hacia Th1. De acuerdo con esta realizacion particular, la composicion inmunomoduladora de la invencion estimula o induce mayoritaria o preferentemente la respuesta Th1 del sistema inmune haciendolo mas reactivo, a traves de la produccion de citoquinas espedficas, tales como, por ejemplo, IFN-g, interferon alfa (IFN-a), interleuquina 12 (IL-12), interleuquina 18 (IL-18), etc., en el desarrollo de las celulas implicadas en la respuesta inmune Th1. El experto en la materia puede determinar facilmente si la administracion de unas micropartfculas de la invencion induce preferentemente una respuesta Th1 y/o desplaza la respuesta inmunitaria de Th2 hacia Th1, mediante metodos convencionales, por ejemplo, mediante metodos basados en la cuantificacion de citoquinas espedficas de la respuesta Th1 y, opcionalmente, Th2, tales como, por ejemplo, el ensayo descrito en el Ejemplo 7.

En una realizacion particular y preferida, la composicion inmunomoduladora de la invencion es una composicion adecuada para su administracion por via oral (en ocasiones referida en esta descripcion, por simplicidad, como “composicion oral”) y se presentara en una forma de administracion solida, liquida o semi-solida. Para ello, dicha composicion inmunomoduladora de la invencion incluira, junto con las micropartfculas de la invencion, o la composicion de la invencion, o el producto de la invencion, un vehnculo farmaceuticamente aceptable; dicho vehnculo famaceuticamente aceptable comprende uno o mas excipientes adecuados para su administracion por via oral, por ejemplo, en forma de capsula, polvo, granulado, suspension, etc. El experto en la materia conoce los excipientes adecuados para la formulacion de composiciones farmaceuticas destinadas a su administracion por via oral asf como los procedimientos para la produccion de dichas composiciones. A modo ilustrativo, puede encontrarse informacion sobre excipientes adecuados para la formulacion de composiciones destinadas a su administracion por via oral, asf como sobre su produccion en el libro “Tratado de Farmacia Galenica”, de C. Faulf i Trillo, 10 Edicion, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones.

En otra realizacion particular, la composicion inmunomoduladora de la invencion es una composicion oral para la prevencion y/o el tratamiento de una alteracion del sistema inmune; dicha alteracion del sistema inmune puede ser una alteracion natural (genetica) o bien una alteracion inducida, tal como una alteracion inducida por un proceso infeccioso, estres, etc.

En otra realizacion particular, la composicion inmunomoduladora de la invencion es una composicion oral para la prevencion y/o el tratamiento de:

- rechazo a un trasplante mediado por una respuesta Th2,

- alergias y enfermedades asociadas a la alergia,

- inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias,

- infecciones causadas por patogenos intracelulares, o

- infecciones de mucosa.

El rechazo a un trasplante es un proceso en el cual el sistema inmunitario del receptor de un trasplante ataca al organo o tejido trasplantado. Por sus caractensticas, la composicion inmunomoduladora de la invencion puede ser particularmente util en la prevencion y/o tratamiento del rechazo al trasplante (e.g., un organo, tejido, etc.) mediado por una respuesta Th2.

Una alergia es un trastorno de hipersensibilidad del sistema inmunitario. Las reacciones alergicas se producen cuando el sistema inmune de una persona reacciona a sustancias normalmente inofensivas en el medio ambiente. Una sustancia que provoca una reaccion inmunitaria (alergica) en un sujeto sensible a dicha sustancia se conoce como “alergeno”. Cuando un alergeno penetra en el organismo de un sujeto que es alergico a el, su sistema inmunitario responde produciendo una gran cantidad de anticuerpos (IgE); la sucesiva exposicion al mismo alergeno produce la liberacion de mediadores qmmicos, en particular la histamina, que produciran los smtomas tfpicos de la reaccion alergica. Existen multitud de alergenos; a modo ilustrativo, no limitativo, dichos alergenos pueden ser extractos alergenicos de polenes, extractos alergenicos de animales, incluyendo animales domesticos, insectos, acaros, etc., extractos alergenicos de alimentos o productos alimenticios, metales, componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reaccion de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en plantas que inducen una reaccion de sensibilidad en un sujeto, etc.

Entre las alergias mas habituales presentes en la poblacion se encuentran:

- alergias a polenes de plantas, por ejemplo, alergias al polen de grammeas (e.g., Lolium perenne, Poa

pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale,

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Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa, etc.), alergias al polen de otras hierbas (e.g., Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica, etc., alergias al polen de arboles (e.g., Olea europea, Platanus sp., Cupresus sp., etc.);

- alergias a animales, incluyendo, alergias a epitelio, caspa o plumas de animales (e.g., perro, gato, caballo,

aves, etc.), alergias a insectos, por ejemplo, alergia a componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reaccion de sensibilidad en un sujeto (e.g., abejas, avispas, mosquitos, tabanos, etc.), alergias a acaros, por ejemplo, acaros del polvo (e.g., Dermatophagoides pteronyssimus, Dermatophagoides farinae, Acaros Siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae, etc.);

- alergias a hongos (e.g., Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, etc.);

- alergias a alimentos o componentes alimenticios presentes en alimentos, por ejemplo, pescado, frutas

(pina, kiwi, etc.);

- alergias a metales (e.g., mquel, etc.).

En general, es bastante habitual que un sujeto que es sensible a un determinado alergeno sea tambien sensible a otros alergenos diferentes.

La composicion inmunomoduladora de la invencion puede ser utilizada para la prevencion y/o el tratamiento por via oral de las alergias en general; en una realizacion particular, dicha alergia se selecciona del grupo de alergias arriba indicado, es decir, del grupo de alergias formado por alergias a polenes de plantas, alergias a insectos, alergias a acaros, alergias a hongos; alergias a animales, alergias a componentes alimenticios presentes en alimentos, alergias a metales, alergias al polvo, etc., y sus combinaciones.

Aunque no parece ser estrictamente necesario, en una realizacion particular, la prevencion y/o el tratamiento de las alergias mediante el empleo de la composicion inmunomoduladora de la invencion puede verse favorecida por la administracion del alergeno causante de la alergia. Para ello, dicho alergeno puede ser administrado al sujeto junto con la composicion inmunomoduladora de la invencion (administracion simultanea de la composicion inmunomoduladora de la invencion y el alergeno) incluyendo el alergeno en la propia formulacion de la composicion inmunomoduladora de la invencion o bien administrando el alergeno en una formulacion independiente pero simultaneamente con la administracion de la composicion inmunomoduladora de la invencion. Alternativamente, el alergeno puede ser administrado al sujeto en un periodo de tiempo anterior a, o posterior a, la administracion de la composicion inmunomoduladora de la invencion (administracion secuencial de la composicion inmunomoduladora de la invencion y el alergeno); en este caso, el alergeno estana formulado en su propia formulacion. Aunque practicamente cualquier alergeno puede ser administrado en esta realizacion particular, en una realizacion concreta, dicho alergeno es un alergeno causante de las alergias a las que se hecho referencia en los parrafos anteriores. Dichos alergenos pueden ser obtenidos por metodos convencionales conocidos por los expertos en la materia o bien pueden ser adquiridos comercialmente.

La composicion inmunomoduladora de la invencion puede ser utilizada para la prevencion y/o el tratamiento por via oral de enfermedades asociadas con las alergias. El experto en la matera conoce las enfermedades generalmente asociadas con las alergias. A modo ilustrativo, no limitativo, las enfermedades asociadas con las alergias mas habituales se seleccionan entre asma y dermatitis atopica.

La inmunodeficiencia es un estado patologico en el que la capacidad del sistema inmune para luchar contra enfermedades infecciosas esta comprometida o ausente; bajo esas condiciones, el sistema inmune no cumple con el papel de proteccion que le corresponde dejando al organismo vulnerable a la infeccion. De hecho, las inmunodeficiencias causan a las personas afectadas una gran susceptibilidad a padecer infecciones. En general, la mayona de las inmunodeficiencias son adquiridas (“inmunodeficiencia secundaria”); no obstante, algunas personas nacen con defectos en su sistema inmunologico (“inmunodeficiencia primaria”). Entre los sujetos que pueden presentar alguna inmunodeficiencia se encuentran los pacientes trasplantados que toman medicamentos para suprimir su sistema inmune como medida anti-rechazo al trasplante, al igual que algunos pacientes que sufren de un sistema inmune demasiado activo. En general, las personas con inmunodeficiencia suelen ser particularmente vulnerables a las infecciones oportunistas, ademas de a las infecciones normales que puedan afectar a todo el mundo.

La inmunodeficiencia puede ser fisiologica, congenita, o adquirida. En general, en una situacion de inmunodeficiencia, las defensas del organismo contra los patogenos se reducen con la consiguiente alteracion del equilibrio Th1/Th2 como, por ejemplo, en inmunodeficiencias fisiologicas (e.g., en bebes recien nacidos, durante el embarazo, etc.), inmunodeficiencias primarias o congenitas (e.g., enfermedades geneticas, por ejemplo, tales como agammaglobulinemia en el smdrome de Di George, etc.), o en inmunodeficiencias adquiridas o secundarias (e.g., inmunodeficiencias adquiridas como consecuencia de una desnutricion, envejecimiento, el tratamiento con ciertos medicamentos, tales como agentes quimioterapeuticos, antirreumaticos, inmunosupresores (administrados despues del trasplante de organos), glucocorticoides, etc.; smdrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedades autoinmunes, etc.).

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La composicion inmunomoduladora de la invencion es util para apoyar las defensas inmunologicas naturales del organismo, por ejemplo en determinados estados de estres tales como el estres psicoffsico que, si es excesivamente intenso o prolongado, puede conducir a una situacion de inmunodeficiencia, clmicamente manifestada por vulnerabilidad a infecciones de intensidad variable.

La composicion inmunomoduladora de la invencion, al modular el sistema inmune, por ejemplo, induciendo preferentemente una respuesta Th1 y/o desplazando la respuesta inmunitaria hacia Th1 (por ejemplo de Th2 hacia Th1), tambien puede ser utilizada para la prevencion y/o el tratamiento por via oral de patologfas derivadas o resultantes de las inmunodeficiencias. El experto en la materia conoce las patologfas derivadas de inmunodeficiencias, por ejemplo, infecciones, etc.

Por tanto, la composicion inmunomoduladora de la invencion puede ser util en la prevencion y/o el tratamiento de las inmunodeficiencias de cualquier origen y patologfas resultantes, por ejemplo, en la prevencion y/o el tratamiento por via oral de infecciones causadas por patogenos intracelulares (e.g., bacterias, protozoos, virus, etc.) asf como infecciones de las mucosas (e.g., infecciones de la cavidad oral, infecciones del aparato respiratorio, infecciones del tracto gastrointestinal, infecciones del aparato genitourinario, infecciones de las membranas de las mucosas, infecciones de la piel, etc.) y, en general, de todas las infecciones que se derivan de los estados de inmunodeficiencia.

En otra realizacion particular, la composicion inmunomoduladora de la invencion puede ser utilizada en el tratamiento y/o prevencion de infecciones causadas por patogenos intracelulares. En una realizacion particular, dicho patogeno intracelular es un patogeno eucariota, tal como, por ejemplo, un protozoo (e.g., Plasmodium vivax (que causa malaria), Leishmania sp. (asociado con Leishmaniasis), Entamoeba sp., Cryptosporidium sp., etc. o un hongo, un patogeno procariota, tal como una bacteria (e.g., Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella sp., Campylobacter sp., Yersinia sp., Vibrio sp., Mycobacterium tuberculosis, M. leprae,, Listeria sp., Brucella sp., clamidias, etc.,), o un virus (e.g., virus ADN bicatenario (dsDNA), por ejemplo, adenovirus, herpesvirus, poxvirus, etc.); virus ADN monocatenario (ssDNA), por ejemplo, parvovirus, etc.; virus ARN bicatenario (dsRNA), por ejemplo, reovirus, etc.; virus ARN monocatenario positivo ((+)ssRNA), por ejemplo, picornavirus, togavirus, etc.; virus ARN monocatenario negativo [(-)ssRNA], por ejemplo, ortomixovirus, rabdovirus, etc.; virus ARN monocatenario retrotranscrito (ssRNA-RT), por ejemplo, retrovirus, etc.; o virus ARN bicatenario retrotranscrito (dsRNA-RT), por ejemplo, hepadnavirus, etc.).

En otra realizacion particular, la composicion inmunomoduladora de la invencion puede ser utilizada en el tratamiento y/o prevencion de infecciones de mucosas; a modo ilustrativo, no limitativo, dicha mucosa puede ser la mucosa de la cavidad oral, la mucosa del tracto gastrointestinal, la mucosa del aparato genitourinario y la mucosa del aparato respiratorio, etc. En general, estas infecciones pueden ser causadas por patogenos intracelulares. En una realizacion particular, las infecciones de la mucosa son causadas por enterobacterias (e.g., Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella sp., Campylobacter sp., Yersinia sp., Vibrio sp., etc.), enterovirus (e.g., calicivirus, rotavirus, adenovirus, astrovirus, etc.) o protozoos (e.g., Entamoeba sp., Cryptosporidium sp., Leishmania sp., etc.).

La composicion inmunomoduladora de la invencion, adecuada preferentemente para su administracion por via oral, puede preparase por metodos conocidos por los tecnicos en la materia teniendo en cuenta la naturaleza particular de los ingredientes activos presentes en la misma, los cuales incluyen material vivo, concretamente, bacterias probioticas, y, preferentemente, por el metodo proporcionado por esta invencion ya que las micropartfculas asf producidas protegen a dichas bacterias probioticas durante su procesamiento, almacenamiento y administracion, en particular, durante su transito a traves del tracto gastrointestinal (administracion por via oral). Adicionalmente, tras ser ingeridas, facilitan la liberacion de las bacterias probioticas en el lugar deseado, protegiendolas de las condiciones “acido-pepticas” del tracto gastrointestinal superior, en particular del estomago.

En una realizacion particular, la composicion inmunomoduladora de la invencion se encuentra en la forma de dosificacion unitaria para su administracion una vez o varias veces al dfa, de acuerdo con el tipo y la gravedad de la patologfa a tratar y la edad y el peso del sujeto.

En una realizacion particular, las micropartfculas de la invencion presentes en la composicion inmunomoduladora de la invencion se encuentran en forma de un polvo seco o de un liofilizado, opcionalmente presente en un vetuculo apropiado para su administracion a un sujeto. En general, los ingredientes activos (micropartfculas, composicion o producto de la invencion) estan incluidos en las composiciones adecuadas.

Por tanto, en una realizacion particular, la composicion imunomoduladora de la invencion comprende un vetuculo aceptable en alimentacion, farmacia o nutraceutica. En una realizacion concreta, las composiciones farmaceuticas, nutraceuticas o productos alimenticios proporcionados por esta invencion proporcionan un vetuculo apropiado para las bacterias probioticas. Asf, en una realizacion concreta, la composicion inmunomoduladora de la invencion comprende una composicion farmaceutica, nutraceutica o esta comprendida en un producto alimenticio. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, incluyen medicamentos, productos dieteticos, productos derivados de la leche, tales como yogur, queso, crema, artfculos de confitena, zumos de frutas, etc., y pueden incluir, si se desea, tal como se ha

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mencionado previamente, otras sustancias beneficiosas para el organismo, tales como, por ejemplo, vitaminas, sales minerales, otros ingredientes activos compatibles, como por ejemplo, agentes prebioticos, fibras, etc.

Como se ha mencionado previamente, este aspecto inventivo puede ser expresado de forma alternativa como una micropartfcula de la invencion, o una composicion de la invencion, o un producto de la invencion para su empleo en una composicion moduladora del sistema inmune (composicion inmunomoduladora de la invencion). Las caractensticas de la composicion inmunomoduladora a las que se ha hecho referencia previamente, son aqrn aplicables mutatis mutandi. En una realizacion particular y preferida dicha composicion moduladora del sistema inmune induce preferentemente una respuesta Th1 y/o desplaza la respuesta inmunitaria hacia Th1; preferentemente de Th2 hacia Th1. Asimismo, en una realizacion particular, dicha composicion moduladora del sistema inmune comprende, ademas de la micropartfcula de la invencion, composicion de la invencion, o producto de la invencion, un vetnculo aceptable en alimentacion, farmacia o nutraceutica. En otra realizacion particular, dicha composicion moduladora del sistema inmune, que comprende micropartfculas de la invencion, una composicion de la invencion, o un producto de la invencion, se encuentra en la forma de una composicion farmaceutica, nutraceutica o, alternativamente, esta comprendida en un producto alimenticio. En otra realizacion particular, las micropartfculas presentes en dicha composicion moduladora del sistema inmune se encuentran en forma de un polvo seco.

La invencion tambien se relaciona con una micropartfcula de la invencion, o una composicion de la invencion, o un producto de la invencion para su empleo en la prevencion y/o el tratamiento de una alteracion del sistema inmune (e.g., una alteracion natural o inducida del sistema inmune) por via oral. En una realizacion particular, dicha micropartfcula de la invencion se encuentra en una composicion farmaceutica formulada para su administracion por via oral. En otra realizacion particular, dicha composicion de la invencion es una composicion farmaceutica formulada para su administracion por via oral. En otra realizacion particular, dicho producto de la invencion es un producto farmaceutico adecuado para su administracion por via oral.

Asimismo, la invencion tambien se relaciona con una micropartfcula de la invencion, composicion de la invencion, o producto de la invencion para su empleo en la prevencion y/o el tratamiento por via oral de rechazo a un trasplante mediado por Th2; alergias y enfermedades asociadas a la alergia; inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias; infecciones causadas por patogenos intracelulares, o infecciones de mucosas [las caractensticas del rechazo a trasplante mediado por Th2, alergias y enfermedades asociadas a la alergia; inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias; infecciones causadas por patogenos intracelulares, o infecciones de mucosas ya han sido mencionadas previamente y se incorporan por referencia]. En una realizacion particular, dicha micropartfcula de la invencion se encuentra en una composicion farmaceutica formulada para su administracion por via oral. En otra realizacion particular, dicha composicion de la invencion es una composicion farmaceutica formulada para su administracion por via oral. En otra realizacion particular, dicho producto de la invencion es un producto farmaceutico adecuado para su administracion por via oral.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con un metodo para la prevencion y el tratamiento de una alteracion o patologfa del sistema inmune de un sujeto, que comprende administrar por via oral a un sujeto en necesidad de tratamiento, una cantidad efectiva de una composicion inmunomoduladora de la invencion, o de micropartfculas de la invencion, o de una composicion de la invencion, o de un producto de la invencion.

En el sentido utilizado en esta descripcion, el termino “alteracion o patologfa del sistema inmune” de un sujeto comprende las alteraciones del sistema inmune, tanto naturales como inducidas del sistema inmune, como enfermedades en las que un tratamiento basado en una respuesta Th1 puede resultar beneficiosa, por ejemplo, rechazo a un trasplante mediado por Th2; alergias y enfermedades asociadas a la alergia; inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias; infecciones causadas por patogenos intracelulares, o infecciones de mucosas. Las caractensticas del rechazo a trasplante.mediado por Th2, alergias y enfermedades asociadas a la alergia; inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias; infecciones causadas por patogenos intracelulares, o infecciones de mucosas ya han sido mencionadas previamente y se incorporan por referencia.

En el sentido utilizado en esta descripcion, el termino “sujeto” incluye cualquier animal mamffero, incluido el ser humano.

Las caractensticas de la composicion inmunomoduladora de la invencion, las micropartfculas de la invencion, la composicion de la invencion, o el producto de la invencion ya han sido definidas previamente y se incorporan aqrn por referencia.

Las caractensticas de la forma de presentacion y administracion de la composicion inmunomoduladora de la invencion, las micropartfculas de la invencion, la composicion de la invencion, o el producto de la invencion ya han sido mencionadas previamente y se incorporan por referencia.

Para su administracion al sujeto en necesidad de tratamiento, la composicion inmunomoduladora de la invencion, las micropartfculas de la invencion, la composicion de la invencion, o el producto de la invencion puede encontrarse en

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un vehmulo aceptable en alimentacion, farmacia o nutraceutica, o puede estar presente en una composicion farmaceutica, nutraceutica o comprendida en un producto alimenticio.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma. Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen la produccion de micropartmulas de casema y quitosano que pueden incorporar bacterias probioticas y que son capaces de proteger dichos microorganismos de los factores anteriormente mencionados (procesamiento, almacenamiento y/o transito a traves del tracto gastrointestinal). A continuacion se describen los metodos generales empleados, salvo indicacion en sentido contrario, en la realizacion de estos ejemplos.

Metodos generales

I. Metodo general de produccion de micropartfculas de casema y quitosano vaaas

El metodo de produccion de micropartmulas de casema y quitosano comprende la disolucion de caseinato sodico (ANVISA, Madrid, Espana) en medio acuoso seguido de la adicion, bajo agitacion magnetica y con flujo constante, de un volumen determinado de una disolucion de quitosano y opcionalmente una cantidad determinada de un agente reticulante. Las micropartmulas formadas se desecan tras el paso de la suspension que las contiene a traves de un spray-dryer previa adicion de un agente protector, tal como manitol.

El quitosano utilizado en estos ejemplos, salvo indicacion contraria, fue Quitosano Caracterizado, con un grado de desacetilacion del 90,2% y un peso molecular de 105 + 0,01 kDa, de Guinama (Valencia, Espana).

El spray-dryer utilizado en estos ejemplos, salvo indicacion contraria, fue el spray dryer Buchi Mini Spray Dryer B- 290 con accesorios Buchi Inert Loop B-295 y Dehumidifier B-296. Buchi Switzerland, Flawil (Suiza).

El manitol utilizado en estos ejemplos fue D-manitol, E-421, riqueza 99,4%, de Guinama (Valencia, Espana), aunque en ocasiones tambien su utilizo D-manitol de Sigma-Aldrich.

II. Caracterizacion de las micropartfculas

El tamano de las micropartmulas fue determinado mediante microscopfa optica utilizando un microscopio Olympus CH40 con Camara Color view-soft imaging Systems.

La morfologfa de las micropartmulas se observo ademas por microscopfa electronica de barrido (Zeiss, DSM 940A Alemania). Para ello, las micropartmulas se cubrieron con una capa de oro molecular de unos 9 nm (Equipo Emitech K550, Sputter-Coater, Reino Unido) y las fotograffas se realizaron con un microscopio Zeiss DMS 940 A (Estados Unidos).

III. Metodo general de preparacion de las suspensiones de bacterias probioticas

Las bacterias probioticas empleadas en la realizacion de estos ejemplos fueron Lactobacillus plantarum CECT 220 y Lactobacillus casei CECT 475 T aisladas de forraje de mafz y queso, respectivamente. Los liofilos de ambos microorganismos se revitalizaron en caldo MRS (Merck, Barcelona) a 37°C en atmosfera anaerobia (85% nitrogeno, 10% hidrogeno, 5% dioxido de carbono) en cabina de anaerobiosis (MACS 500 AIRLOCK, AES Chemunex, Espana). A partir de estos cultivos revitalizados se prepararon las almuotas de 500 pL de suspensiones stock que se mantuvieron en congelacion a -85°C hasta su momento de uso.

Las suspensiones de trabajo se prepararon de la siguiente forma. 100 pL de la almuota del microorganismo correspondiente se transfirieron a 10 mL de caldo MRS. Tras incubacion durante 12 horas/37°C en condiciones de anaerobiosis se realizo el recuento microscopico en camara de Thoma con objeto de calcular el volumen de muestra que era necesario transferir a un matraz de 50 mL de caldo MRS para alcanzar un recuento de 106 UFC/mL (unidades formadoras de colonias por mililitro). Tras inoculacion de ese volumen, los matraces se incubaron en las condiciones anteriormente descritas durante 24 h hasta alcanzar la fase estacionaria temprana de crecimiento. El seguimiento y recuento de la poblacion bacteriana se realizo mediante siembra en agar MRS (Merck, Barcelona) de las correspondientes diluciones decimales (caldo BPW 0,1% (Merck, Barcelona)) a cada uno de los tiempos de muestreo.

IV. Metodo general de produccion de microparticulas de casema y quitosano conteniendo bacterias probioticas encapsuladas

El metodo general de produccion de micropartmulas de casema y quitosano conteniendo bacterias probioticas encapsuladas comprende la disolucion de caseinato sodico (ANVISA, Madrid, Espana) en medio acuoso seguido de

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la adicion, bajo agitacion y con flujo constante de un volumen determinado de suspension bacteriana, obtenida segun el metodo descrito en el apartado III anterior y despues de ser centrifugada y resuspendida en un volumen determinado de solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente se adiciona un volumen determinado de una disolucion de quitosano, y opcionalmente un volumen determinado de un agente reticulante.

V. Procedimiento general de tincion de bacterias probioticas y encapsulacion de las mismas

Este procedimiento fue llevado a cabo para confirmar de forma cualitativa, a traves de microscopfa optica de fluorescencia, que las bacterias quedan atrapadas en el interior de las micropartfculas, es decir, que la matriz de casema y quitosano recubre las bacterias probioticas.

El procedimiento de tincion de las bacterias comprende la preparacion de una solucion saturada de rodamina B isotiocianato en tampon fosfato (pH 7,4), su filtracion a traves de una membrana de 0,2 pm y su adicion sobre un volumen determinado de suspension bacteriana, obtenida segun el metodo descrito en apartados anteriores. Una vez centrifugada la mezcla a 3.000 rpm durante 15 minutos para eliminar el exceso de rodamina en el sobrenadante, las bacterias tenidas se resuspenden en un volumen determinado de solucion de sacarosa al 2% (p/v). La encapsulacion de las bacterias tenidas se realiza segun el metodo descrito en el apartado anterior.

VI. Procedimiento general de cuantificacion de bacterias viables presentes en la formulacion, y determinacion de los ciclos de muerte bacteriana a lo largo del proceso

Para llevar a cabo el recuento de las bacterias encapsuladas, a un peso conocido de microcapsulas (500 pg aproximadamente) se le adiciono 1 mL de una solucion de NaOH 1% (pH 10), y tras agitacion con vortex durante 5 minutos se realizaron las diluciones decimales correspondientes en caldo BPW al 0,1% (Merck, Barcelona, Espana) y la siembra en placa en agar MRS. Tras incubacion a 37°C en condiciones de anaerobiosis (cabina MACS 500 Airlock, AES Chemunex, Espana) durante 24-48 horas se realizaron los recuentos de colonias.

Teniendo en cuenta la cantidad de bacterias inicialmente incluidas en la formulacion antes de su paso por el spray- dryer por cada gramo de formulacion, y los recuentos obtenidos al final del proceso, se determinan los ciclos de muerte bacteriana mediante la siguiente ecuacion:

Ciclos de muerte bacteriana: log (UFC/g iniciales) - log (UFC/g recuperados)

VII. Procedimiento de evaluacion de la resistencia de las bacterias lacticas microencapsuladas en medio gastrointestinal simulado

La resistencia gastrointestinal de L. plantarum y L. casei fue evaluada de acuerdo con el procedimiento descrito por Vinderola et al., 2003.

Para llevar a cabo el estudio, 10 pL del cultivo bacteriano lfquido o 500 pg de formulacion de micropartfculas en forma de polvo se adicionaron a tubos de PVC con 0,99 mL de simulante gastrico a pH 2,5. Se utilizaron tantos tubos como tiempos de tratamiento se planificaron evaluar, concretamente, 5 tubos con simulante gastrico correspondientes a los tiempos: 0 y 2 horas (resistencia a simulante gastrico)) y 0, 3 y 6 horas (resistencia a simulante intestinal).

El simulante gastrico se preparo segun farmacopea y tema la siguiente composicion para 1 litro de solucion:

- NaCl 2 g

- Pepsina 3,2 g (Sigma, Barcelona, Espana)

- HCl 37% (v/v) 7 mL

La pepsina se disolvfa en HCl y posteriormente la mezcla se anadfa en 1 litro de agua tipo I. El pH final se ajusto a 1,2 o 2,5 en funcion de la prueba a realizar con HCl 37% (v/v).

El simulante intestinal, preparado tambien a partir de receta de farmacopea, estaba compuesto por:

- Fosfato potasico monobasico (Panreac, Madrid, Espana) 6,8 g disuelto en 250 mL de agua tipo I y al que se anadfan 77 mL de NaOH 0,2 N

- Agua 500 mL

- Pancreatina 10 g (Sigma, Barcelona, Espana)

El pH se ajusto a 6,8 con NaOH 0,2 N o con HCl 0,2 N.

Los 5 tubos se mantuvieron a 37°C en agitador orbital (150 rpm) hasta el momento de extraccion de la muestra y evaluacion de supervivientes. Transcurrido el tiempo de tratamiento en simulante gastrico (2 horas), los tubos de PVC se centrifugaron (13.000 rpm/10 minutos) y se descarto el sobrenadante. Para evaluar el tiempo 2 horas, el pellet de uno de los tubos se sometio al tratamiento de ruptura de las microcapsulas con NaOH al 1% (pH 10) anteriormente descrito. Los pellets de los tubos restantes se resuspendieron en 0,99 mL de simulante intestinal para

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evaluar la resistencia en este medio a tiempo 0, 3 y 6 horas (2, 5 y 8 horas desde el inicio del estudio). Transcurridos esos tiempos, los tubos se centrifugaron, los sobrenadantes fueron descartados y los pellets se trataron con NaOH al 1% (tratamiento de ruptura de las microcapsulas) para proceder a evaluar los supervivientes restantes.

El recuento de bacterias viables se realizo por el metodo de conteo en placa en agar MRS anteriormente descrito. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 a 48 h en condiciones de anaerobiosis determinando el numero de unidades formadoras de colonias. La fraccion de bacterias supervivientes se calculo de acuerdo con la siguiente ecuacion:

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donde Nt representa el total de bacterias acido lacticas viables despues de cada tiempo de tratamiento, y No representa el numero inicial de Bacterias Acido Lacticas (BAL) inoculadas (Bao et al., 2010).

VIII. Procedimiento de evaluacion de la estabilidad de las bacterias lacticas microencapsuladas a lo largo del tiempo de almacenamiento en condiciones ambientales

El estudio de estabilidad de las bacterias microencapsuladas se realizo mediante la evaluacion de la viabilidad bacteriana a lo largo del tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente (25°C).

Para ello, a partir de las formulaciones de microcapsulas almacenadas en envase de vidrio cerrado hermeticamente, se tomaron muestras de 500 |jg que se somertan al procedimiento de ruptura y evaluacion de supervivientes que anteriormente ha sido descrito. A modo de control, el estudio fue realizado del mismo modo tanto en suspensiones frescas como en liofilos de ambos microorganismos.

EJEMPLO 1

Preparacion y caracterizacion de microparticulas de casema y quitosano conteniendo bacterias probioticas del genero Lactobacillus plantarum encapsuladas

Se prepararon distintos tipos de microparticulas conteniendo bacterias, todas ellas con casema como polfmero base modificado con quitosano. El metodo de preparacion de dichas microparticulas dependio de la presencia o ausencia de reticulante y del tipo de reticulante empleado.

(Ap) Microparticulas de casema modificadas con quitosano, en ausencia de reticulante

Sobre 25 mL de una disolucion acuosa de 10 mg/mL de caseinato sodico se anadieron 1,5 mL de la suspension bacteriana (1,2 x 1012 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 10 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6, mediante la adicion de 400 mg de quitosano a 250 ml de agua purificada bajo agitacion y ajuste del pH con HCl 0,1 N.

Tras cinco minutos de incubacion, se anadieron 100 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron:

- Temperatura de entrada de aire (Inlet temperature): 85°C

- Temperatura salida del aire (Outlet temperature): 40-45°C

- Presion de aire (Air Pressure): 6 bar (6 x 105 Pa)

- Velocidad de bombeo de la muestra (Pumping rate): 3,5 mL/min

- Aspiracion: 100%

- Flujo de aire (Air flow): 600 L/h

Las microparticulas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion. Este mismo estudio fue realizado en ausencia de bacterias para comprobar como afecta la presencia de estos probioticos a las caractensticas fisicoqmmicas de las particulas. La Figura 1 muestra las imagenes de microscopfa optica obtenidas para las particulas, tanto en presencia como en ausencia de los probioticos. En ellas se puede comprobar que el tamano de las particulas no se ve afectado por la presencia de bacterias encapsuladas.

Por otra parte, con el fin de confirmar que las bacterias se encuentran encapsuladas en las microparticulas de casema y quitosano, se repitio el mismo estudio empleando bacterias tenidas con marcador fluorescente segun el metodo descrito en el apartado V de los “Metodos Generales”. La Figura 2 muestra las imagenes de microscopfa optica de fluorescencia tanto de las bacterias tenidas libres (A), como las encapsuladas (B). La fluorescencia observada en las microparticulas (A) es debida exclusivamente a las bacterias. Al no observarse practicamente presencia de bacterias fuera de las microparticulas, se confirma que estas se encuentran encapsuladas.

(Bp) Microparticulas de caseina y quitosano, en presencia de vainillina

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Sobre 25 mL una disolucion acuosa de 10 mg/mL de caseinato sodico se anadieron 0,5 mL de una solucion acuosa de vainillina (5 mg/mL). Tras 15 minutos (mmimo) de incubacion, se anadieron a la mezcla 0,3 mL de la suspension bacteriana (4,7 x 1011 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 10 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6.

Tras cinco minutos de incubacion, se anadieron 250 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron similares a las descritas en el apartado Ap.

Las microparticulas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion.

(Cp) Microparticulas de caseina y quitosano, en presencia de TPP

Sobre 25 mL una disolucion acuosa de 10 mg/ mL de caseinato sodico se anadieron 1,5 mL de la suspension bacteriana (4,7 x 1011 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 10 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6. Pasados cinco minutos de incubacion, se anadieron 0,8 mL de una solucion de TPP 1 mg/mL.

Cinco minutos mas tarde, se anadieron 250 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron similares a las descritas en el apartado Ap.

Las microparticulas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion.

(Dp) Microparticulas de caseina y quitosano, en presencia de sales calcicas

Sobre 25 mL una disolucion acuosa de 10 mg/mL de caseinato sodico se anadieron 4 mL de la suspension bacteriana (1,2 x 1012 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 2 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6. Pasados cinco minutos de incubacion, se anadieron 2 mL de una solucion de de acetato calcico al 2% (p/v) y 2 mL de una solucion de cloruro calcico al 2% (p/v).

Cinco minutos mas tarde, se anadieron 100 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron similares a las descritas en el apartado Ap.

Las microparticulas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion.

La Figura 3 muestra la imagen de microscopfa optica de fluorescencia obtenida para las microparticulas, en la que no se observa presencia de bacterias libres.

La Tabla 1 resume los ciclos de muerte de L. plantarum derivados del proceso de encapsulacion en las microparticulas de caseina y quitosano.

Tabla 1. Influencia del metodo de fabricacion de microparticulas de caseina en la supervivencia de Lactobacillus plantarum_____________________________________________________________________________________

Tipo de Formulacion

Recuento de bacterias antes del secado por SD (UFC/g) Recuento de bacterias despues del secado por SD (UFC/g) Ciclos de muerte bacteriana debidos al proceso de obtencion de las microparticulas (log UFC)

Ap

3,67 x 1012 2,50 x 1010 2,17

Bp

2,42 x 1011 2,50 x 1010 0,99

Cp

1,21 x 1012 7,50 x 1010 1,21

Dp

9,28 x 1012 1,70 x 1010 2,74

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SD: spray-drying.

Los tamanos de las micropartmulas obtenidas son similares en todas las formulaciones y oscilan en torno a 7 ± 4 pm. Sin embargo, los ciclos de muerte bacteriana son inferiores cuando se emplea vainillina o TPP como agentes reticulante.

Segun los resultados obtenidos, las formulaciones Bp y Cp son las que ofrecen mayor proteccion a los probioticos durante el proceso de obtencion. Asf pues se escogieron ambas formulaciones para proceder a realizar los estudios de resistencia gastrointestinal y viabilidad durante el almacenamiento.

EJEMPLO 2

Evaluacion de la estabilidad de Lactobacillus plantarum encapsulado a lo largo del tiempo de almacenamiento en condiciones ambientales

Las formulaciones Ap, Bp, Cp y Dp descritas en el Ejemplo 1 fueron empleadas para evaluar la supervivencia de las bacterias en condiciones ambientales (25°C) a lo largo del tiempo, utilizando tanto suspensiones frescas como liofilos a modo de control comparativo. La Figura 4 recoge los resultados obtenidos.

Los resultados muestran claramente que en el primer mes de estudio hay una perdida de 7 unidades logantmicas en los recuentos de las bacterias frescas en suspension, y en el tercer mes se observaron perdidas de 4,5 unidades logantmicas en el caso de las bacterias en su forma liofilizada. Sin embargo, cuando estos probioticos se encontraban encapsulados en cualquiera de las micropartmulas de casema y quitosano descritas en el Ejemplo 1, sus recuentos se manteman constantes, no observandose perdidas significativas durante los 8 meses de estudio. Estos resultados confirman que las formulaciones descritas en la presente invencion permiten al menos duplicar la viabilidad de las bacterias en condiciones ambientales con respecto a las bacterias liofilizadas.

EJEMPLO 3

Evaluacion de la resistencia a medio gastrointestinal simulado de las bacterias probioticas del genero Lactobacillus plantarum encapsuladas

Las formulaciones Ap, Bp, Cp y Dp descritas en el Ejemplo 1 fueron empleadas para evaluar la resistencia de las bacterias encapsuladas en medio gastrointestinal simulado siguiendo el procedimiento descrito en el apartado VII de los “Metodos Generales”. La Figura 5 muestra los resultados obtenidos a lo largo del proceso para ambas formulaciones, asf como la resistencia obtenida para las bacterias libres, sin encapsular. En el caso de las bacterias en su forma libre (liofilizadas, no encapsuladas), el numero de recuentos viables fue descendiendo gradualmente a lo largo del estudio, que finalizo con una perdida media de 4 unidades logantmicas. En el caso de las formulaciones Ap y Dp, los recuentos se mantuvieron practicamente constantes a lo largo de todo el ensayo, siendo significativamente superiores al liofilo tanto al final del ensayo en simulante gastrico (2 horas) como al final del ensayo en simulante intestinal (8 horas). En las formulaciones Bp y Cp se observo un descenso en la concentracion durante la permanencia en simulante gastrico, siendo los recuentos a tiempo 2 horas significativamente similares al liofilo. Sin embargo, una vez transferidas las micropartmulas a simulante intestinal, se observo un aumento de los recuentos siendo significativamente superiores al liofilo al final del ensayo (8 horas). Este incremento en los recuentos finales ha sido descrito previamente por otros autores en estudios realizados con bifidobacterias, en los que concluyen que el fenomeno es debido a que el dano que han sufrido las bacterias durante el estres a pH bajo es solo de caracter temporal, y no llega a matar definitivamente a las bacterias, lo que permite que estas se recuperen al pasar a medio intestinal (Lacroix and Picot, 2004).

En resumen, tras el estudio en medio simulante gastrico (2 horas) se observaron mayores supervivencias cuando las bacterias se encontraban encapsuladas en las formulaciones Ap y Dp que cuando se encontraban en su forma libre, siendo dichas diferencias significativas. En cambio, estas diferencias no se observaron en las formulaciones Bp y Cp. Sin embargo, tras la finalizacion del estudio (a las 8 horas, despues de su paso por el medio simulante gastrico y posteriormente medio intestinal simulado), las diferencias encontradas fueron superiores y significativas para todas las formulaciones de micropartmulas (Ap, Bp, Cp y Dp), llegando a una diferencia de hasta tres ciclos con respecto el liofilo.

Estos resultados demuestran que las micropartmulas descritas incrementan de forma significativa la tolerancia de las bacterias estudiadas a las condiciones gastrointestinales simuladas.

Por otra parte, las micropartmulas fueron caracterizadas para evaluar su estado durante el proceso de degradacion en el tiempo. La Figura 6 permite observar que las bacterias se encuentran alojadas en el interior de las micropartmulas y son liberadas al medio cuando dichas micropartmulas se degradan en el tiempo.

EJEMPLO 4

Preparacion y caracterizacion de micropartfculas de casema o de casema y quitosano conteniendo bacterias probioticas del genero Lactobacillus casei encapsuladas

Se prepararon distintos tipos de micropartmulas conteniendo bacterias, todas ellas con casema como polfmero base y quitosano. El metodo de preparacion de dichas micropartmulas dependio del tipo de reticulante empleado.

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(Ac) Microparticulas de caseina modificadas con quitosano, en ausencia de reticulante

Sobre 25 mL de una disolucion acuosa de 10 mg/mL de caseinato sodico se anadieron 2 mL de la suspension bacteriana (2,2 x 1010 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 10 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6, mediante la adicion de 400 mg de quitosano a 250 ml de agua purificada bajo agitacion y ajuste del pH con HCl 0,1 N. Tras cinco minutos de incubacion, se anadieron 100 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron:

- Temperatura de entrada de aire (Inlet temperature): 85°C

- Temperatura salida del aire (Outlet temperature): 40-45°C

- Presion de aire (Air Pressure): 6 bar (6 x 105 Pa)

- Velocidad de bombeo de la muestra (Pumping rate): 3,5 mL/min -Aspiracion: 100%

- Flujo de aire (Air flow): 600 L/h

Las microparticulas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion. Este mismo estudio fue realizado en ausencia de bacterias para comprobar como afecta la presencia de estos probioticos a las caractensticas fisicoqmmicas de las particulas.

(Bc) Microparticulas de caseina y quitosano, en presencia de sales calcicas

Sobre 150 ml de una disolucion acuosa de 10 mg/mL de caseinato sodico se anadieron 1,8 mL de la suspension bacteriana (9,4 x 1010 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 25,5 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6. Sobre esta solucion se anadio una mezcla de sales calcicas (12 ml de acetato de calcio 2% p/v y 12 ml de cloruro calcico 0,9% p/v).

Tras cinco minutos de incubacion, se anadieron 1.500 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron las siguientes:

- Temperatura de entrada de aire (Inlet temperature): 75°C

- Temperatura salida del aire (Outlet temperature): 38°C

- Presion de aire (Air Pressure): 6 bar (6 x 105 Pa)

- Velocidad de bombeo de la muestra (Pumping rate): 3,5 mL/min

- Aspiracion: 100%

- Flujo de aire (Air flow): 600 L/h

Las microparticulas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion.

(Cc) Microparticulas de caseina y quitosano reticuladas con vainillina

Sobre 25 ml de una disolucion acuosa de 10 mg/mL de caseinato sodico se anadieron 0,5 mL de una solucion acuosa de vainillina (5 mg/mL). Tras 15 minutos (mmimo) de incubacion, se anadieron a la mezcla 3 mL de la suspension bacteriana (1,2 x 109 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 10 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6.

Tras cinco minutos de incubacion, se anadieron 200 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron similares a las descritas en el apartado Bc.

Las microparticulas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion.

(Dc) Microparticulas de caseina y quitosano reticuladas con tripolifosfato

Sobre 100 ml de una disolucion acuosa de 10 mg/mL de caseinato se anadieron 1,2 mL de la suspension bacteriana (9,4 x 1010 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 20 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6. Sobre ello se anadieron 1,6 mL de TPP (1mg/ml).

Tras cinco minutos de incubacion, se anadieron 1.000 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron similares a las descritas en el apartado Bc.

Las microparticulas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion.

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La Tabla 2 resume las caractensticas fisicoqmmicas de las micropartmulas de casema y quitosano conteniendo L.

casei encapsulado, asf como los ciclos de Tabla 2. Caractensticas ffsico-qmmicas encapsulado.

muerte bacteriana derivados del proceso de fabricacion de las partmulas. de las micropartmulas de casema y quitosano con Lactobacillus casei

Tipo de formulacion

Recuento de bacterias antes del secado por SD (UFC/g) Recuento de bacterias despues del secado por SD (UFC/g) Ciclos de muerte bacteriana debidos al proceso de obtencion de las microparticulas (log UFC)

Bc

4,49 x 1010 3,80 x 109 1,07

Cc

6,82 x 109 7,80 x 109 0,00

Dc

4,89 x 1010 1,30 x 1010 0,58

SD: spray-drying.

Los tamanos de las micropartmulas obtenidas son similares en todos los casos y oscilan en torno a 7 ± 4 pm. En cuanto al proceso de fabricacion, los datos revelan que, en terminos generales, las formulaciones desarrolladas protegen mejor a L. casei que a L. plantarum a lo largo del proceso, y, ademas, las formulaciones Cc y Dc, son las que mas proteccion confieren.

Aunque no existe acuerdo sobre el recuento mmimo de probioticos viables por gramo o mililitro de producto, concentraciones del orden de 107-108 UFC/mL (UFC/g) se han aceptado, en general, como el nivel mmimo y satisfactorio al fin de su vida util. Tambien se ha establecido que los productos probioticos se debenan consumir de forma regular en cantidades de aproximadamente 100 g/dfa para que se liberasen recuentos de 109 UFC en el intestino (Karimi et al., 2011; Mohammadi et al., 2011; Vinderola et al., 2000a). Por tanto, el metodo proporcionado por la presente invencion puede ser considerado como un metodo adecuado ya que mantiene recuentos bacterianos del orden de 109 UFC/g (Tabla 2), lo que permite, por ejemplo, su formulacion en alimentos en proporciones del orden del 1% manteniendo la necesaria concentracion de bacterias probioticas de 107UFC/g.

Con el fin de conocer la resistencia gastrointestinal y viabilidad durante el almacenamiento de las bacterias encapsuladas, se escogieron las formulaciones Cc y Dc, ya que se encuentran entre las que mejores resultados de proteccion han aportado y no requieren el empleo de altas presiones, simplificando el proceso de fabricacion.

EJEMPLO 5

Evaluacion de la estabilidad de Lactobacillus casei encapsulado a lo largo del tiempo de almacenamiento en condiciones ambientales

Las formulaciones Ac, Cc y Dc descritas en el Ejemplo 4 fueron empleadas para evaluar la supervivencia de las bacterias en condiciones ambientales a lo largo del tiempo, utilizando tanto suspensiones frescas como liofilos a modo de control comparativo. La Figura 7 resume los resultados obtenidos.

Los resultados muestran que en el primer mes de estudio hay una perdida de 5 unidades logantmicas en los recuentos de las bacterias frescas en suspension, y, en el tercer mes, se observaron perdidas de 3 unidades logantmicas en el caso de las bacterias en su forma liofilizada, llegando a una perdida de 5 unidades logantmicas al quinto mes. En el caso de las bacterias encapsuladas en las micropartmulas de casema y quitosano segun las formulaciones Ac, Cc y Dc, las perdidas encontradas a los 3 meses son de aproximadamente 0,5 unidades logantmicas, y a los 6 meses son de 3 unidades logantmicas para la formulacion Ac, 2 unidades logantmicas para la formulacion Dc y de 1 unidad logantmica para la formulacion Cc.

Estos resultados confirman que las formulaciones descritas en la presente invencion permiten incrementar la viabilidad de las bacterias en condiciones ambientales con respecto a las bacterias liofilizadas, de forma similar a lo observado en el caso de L. plantarum.

EJEMPLO 6

Evaluacion de la resistencia a medio gastrointestinal simulado de las bacterias probioticas del genero Lactobacillus casei encapsuladas

Las formulaciones Ac, Cc y Dc descritas en el Ejemplo 4 fueron empleadas para evaluar la resistencia de las bacterias encapsuladas en medio gastrointestinal simulado siguiendo el procedimiento descrito en el apartado VII de los “Metodos Generales”. La Figura 8 muestra los resultados obtenidos a lo largo del estudio para las micropartmulas, asf como la resistencia obtenida para las bacterias liofilizadas sin encapsular.

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En el caso de las bacterias en su forma libre (liofilizadas, no encapsuladas), el numero de recuentos viables descendio significativamente (4 unidades logafftmicas) en las dos primeras horas de estudio en medio gastrico, y, a partir de entonces, se mantuvo constante. Sin embargo, los datos revelan que las bacterias encapsuladas son significativamente mas resistentes al tratamiento en medio gastrico, llegando al final del tratamiento a unas perdidas promedio de aproximadamente 1,5 unidades logafftmicas. Ademas, tras su paso por el medio intestinal, la resistencia de las bacterias fue descendiendo, aunque continuo siendo significativamente superior al control liofilizado en el caso de las formulaciones Ac y Cc, efecto que no se observo para la formulacion Dc.

Estos resultados demuestran que las microparffculas descritas incrementan la tolerancia de las bacterias estudiadas a las condiciones gastrointestinales simuladas.

EJEMPLO7

Estudio inmunologico de biocapsulas de caseina asociadas a L. plantarum

Para la realizacion de este ejemplo se utilizaron las microparffculas de caseina modificadas con quitosano, en presencia de vainillina descritas en el Ejemplo 1 (referencia Bp). Para ello, sobre 25 mL una disolucion acuosa de 10 mg/mL de caseinato sodico se anadieron 0,5 mL de vainillina (5 mg/mL). Tras 15 minutos (mmimo) de incubacion, se anadieron a la mezcla 1 mL de la suspension bacteriana (4,6 x 1010 UFC/mL) descrita en el apartado III de los “Metodos Generales”, despues de ser centrifugada y resuspendida en una solucion de sacarosa al 2% (p/v). Posteriormente, sobre la mezcla, se anadieron 2 mL de una solucion de quitosano de concentracion 1,6 mg/mL preparada en medio acuoso con pH 5,5-6.

Cinco minutos mas tarde, se anadieron 100 mg de manitol sobre la mezcla anterior, y se procedio a secar la formulacion empleando la tecnica de spray-drying. Las condiciones de procesado fueron las siguientes:

- Temperatura de entrada de aire (Inlet temperature): 85°C

- Temperatura salida del aire (Outlet temperature): 40-45°C

- Presion de aire (Air Pressure): 6 bar (6 x 105 Pa)

- Velocidad de bombeo de la muestra (Pumping rate): 3,5 mL/min -Aspiracion: 100%

- Flujo de aire (Air flow): 600 L/h.

Las microparffculas obtenidas en forma de polvo fueron recolectadas para su caracterizacion y cuantificacion. El tamano medio de las microparffculas obtenidas fue de 7 ± 4 pm. Por otra parte el recuento de bacterias dio un fftulo de 5,1x1010 UFC por gramo de microparffculas

Los estudios inmunologicos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del comite etico de la Institucion asf como con la legislacion europea en animales de experimentacion (86/609/EU). Para ello se utilizaron 24 ratones macho CD1 (Charles River), de peso medio 20 g, que fueron sometidos a condiciones normales de luz-oscuridad (12 horas - 12 horas). Los animales fueron divididos en 4 grupos diferentes (6 ratones por grupo) y cada grupo recibio un tratamiento diario diferenciado durante 21 dfas seguidos.

Al primer grupo se le administro por via oral 0,1 mL de PBS (bufer fosfato salino pH 7,4) (control). Un segundo grupo fue tratado con una suspension de Lactobacillus plantarum en sacarosa al 2% con una dosis de 107 UFC/raton (Lp libres). El tercer grupo se trato con una mezcla ffsica en forma de suspension formada por L. plantarum en sacarosa al 2% (107 UFC/raton) mezclado con microparffculas vacfas de caseina modificadas con quitosano y reticuladas con vainillina (100 pg/raton) (mezcla ffsica, MF). Finalmente, el cuarto grupo recibio la formulacion descrita anteriormente de L. plantarum incorporada en microparffculas de caseina modificadas con quitosano y reticuladas con vainillina (107 UFC/raton) (Bp).

El dfa 22 se procedio a extraer un volumen de sangre de aproximadamente 250 pL utilizando tubos de separacion del suero (SARSTEDT Microtube 1,1 mL Z-Gel). Posteriormente los animales fueron sacrificados y se extrajeron los bazos, cuyas celulas se disgregaron en medio RPMI 1640 con glicina a 4°C. Los eritrocitos, se lisaron efectuandose el recuento de los esplenocitos, cuya concentracion fue ajustada en medio RPMI completo. Sobre replicas de 100 pL de la suspension celular se adiciono como esffmulo L. plantarum (proporcion 10:1 respecto a los esplenocitos). Tras 48 h de incubacion a 37°C se centrifugaron las suspensiones celulares y se conservo el sobrenadante conteniendo las citoquinas a -80°C. Las citoquinas se capturaron mediante el kit “BD cytometric bead array Th1/Th2/Th17 CBA” (BD, EEUU) y se determinaron empleando un citometro de flujo (Attune® Acoustic Focusing Cytometer).

La Figura 9 muestra como la administracion oral de L. plantarum (en forma libre, encapsulada o con mezcla ffsica) induce un ligero aumento del numero de linfocitos citotoxicos que se manifiesta por una disminucion de la relacion CD4+/CD8+. Este efecto es concordante con los datos previos descritos en la bibliograffa que correlacionan dicho aumento con un efecto colonizador del intestino por las bacterias [Herias et al., 1999; Smelt et al., 2012]. Por otra parte, se observa que la encapsulacion no afecto a la capacidad de las bacterias de alterar la ratio CD4+/CD8+.

La Figura 10 muestra la relacion interferon-gamma/interleuquina 6 (IL-6) en funcion del tratamiento recibido. En todos los casos, la administracion de L. plantarum incremento la smtesis de interferon-gamma (IFN-g). Sin embargo,

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los animales tratados con la bacteria encapsulada en las micropartfculas mostraron una relacion significativamente mayor que la obtenida con el resto de los tratamientos (p< 0,001; ANOVA, post hoc Tukey). Este desplazamiento de la respuesta inmunitaria hacia un perfil Th1 tras la administracion de L. plantarum es concordante con los resultados obtenidos por otros autores [Smelt et al., 2012; Wiese et al., 2012].

REFERENCIAS

AYUB, M. A. Z. & BRINQUES, G. B. 2011. Effect of microencapsulation on survival of Lactobacillus plantarum in simulated gastrointestinal conditions, refrigeration, and yogurt. Journal of Food Engineering, 103, 123-128.

BAO Y, ZHANG Y, ZHANG Y, LIU Y, WANGA Y, DONG X, WANG Y, ZHANG H. 2010. Screening of potential probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from traditional dairy products. Food Control, 21 (5): 695-701.

BORGOGNA, M., BELLICH, B., ZORZIN, L., LAPASIN, R. & CESARO, A. 2010. Food microencapsulation of bioactive compounds: Rheological and thermal characterisation of non-conventional gelling system. Food Chemistry, 122, 416-423.

BURGAIN, J., GAIANI, C., LINDER, M. & SCHER, J. 2011. Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications. Journal of Food Engineering, 104, 467-483.

DE VOS, P., FAAS, M. M., SPASOJEVIC, M. & SIKKEMA, J. 2010. Encapsulation for preservation of functionality and targeted delivery of bioactive food components. International Dairy Journal, 20, 292-302.

DING, W. K. & SHAH, N. P. 2008. Survival of Free and Microencapsulated Probiotic Bacteria

in Orange and Apple Juices. International Food Research Journal, 15, 219-232.

FERRANDINI, E., CASTILLO, M., LOPEZ, M. B. & LAENCINA, J. 2006. Modelos estructurales de la micela de casema. An. Vet. (Murcia), 22, 5-18.

GBASSI, G. K., VANDAMME, T., ENNAHAR, S. & MARCHIONI, E. 2009. Microencapsulation of Lactobacillus plantarum spp in an alginate matrix coated with whey proteins. International Journal of Food Microbiology, 129, 103-105.

HEIDEBACH, T., FORST, P. & KULOZIK, U. 2009. Transglutaminase-induced caseinate gelation for the microencapsulation of probiotic cells. International Dairy Journal, 19, 77-84.

HEIDEBACH, T., FORST, P. & KULOZIK, U. 2010. Influence of casein-based microencapsulation on freeze-drying and storage of probiotic cells. Journal of Food Engineering, 98, 309-316.

HEIDEBACH, T., LEEB, E., FOERST, P. & KULOZIK, U. 2011. Microencapsulation of probiotic cells. In: MONZER FANUN, C.-P. (ed.) Colloids in Biotechnology.

HERIAS M.V., HESSLE C., TELEMO E., MIDTVEDT T., HANSON L.A., WOLD A.E., Immunomodulatory effects of Lactobacillus plantarum colonizing the intestine of gnotobiotic rats. Clin Exp Immunol. 1999 May; 116(2): 283-290.

HIDALGO et al.Ars Pharm 2008; 49 (3):245-257.

KARIMI, R., A. M. MORTAZAVIAN AND A. G. DA CRUZ. 2011. Viability of probiotic microorganisms in cheese during production and storage: a review. Dairy Sci Technol 91:283-308

LACROIX, C. & PICOT, A. 2004. Encapsulation of bifidobacteria in whey protein-based microcapsules and survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt. International Dairy Journal, 14, 505-515.MATTILA- SANDHOLM, T. & SAARELA, M. (eds.) 2003. Functional Dairy Products. , Boca Raton: Woodhead Publishing Limited Abington Cambidge England CRC. Press LLC.

MOHAMMADI R., A. M. MORTAZAVIAN, R. KHOSROKHAVAR AND A.G. CRUZ. 2011. Probiotic ice cream: viability of probiotic bacteria and sensory properties. Ann Microbiol 61:411 424.

MOHAMMADI, R. AND MORTAZAVIAN A. M. 2011. Review Article: Technological Aspects of Prebiotics in Probiotic Fermented Milks. Food Rev Int 27:192-212.

MORTAZAVIAN, A., RAZAVI, S. H., EHSANI, M. R. & SOHRABVANDI, S. 2007. Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms. IRANIAN JOURNAL of BIOTECHNOLOGY, 5, 1-18.

OLIVEIRA, A. C., MORETTI, T. S., BOSCHINI, C., BALIERO, J. C., FREITAS, O. & FAVARO-TRINDADE, C. S. 2007. Stability of microencapsulated B. lactis (BI 01) and L. acidophilus (LAC 4) by complex coacervation followed by spray drying. Journal of Microencapsulation, 24, 673-81.

PEREZ-LUYO, A. 2008. Probioticos: Una alternativa en la prevencion de la caries dental? . Rev Estomatol Herediana, 18, 65-68.

SANDERS, M. E. 1999. Probiotics. Food Technology, 53, 67-77.

SHAH, N. P., DONKOR, O. N., NILMINI, S. L. I., STOLIC, P. & VASILJEVIC, T. 2007. Survival and activity of selected probiotic organisms in set-type yoghurt during cold storage. International Dairy Journal, 17, 657665.

SHAH, N. P. & LANKAPUTHRA, W. E. V. 1997. Improving viability of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. in yogurt. International Dairy Journal, 7, 349-356.

SMELT MJ, DE HAAN BJ, BRON PA, VAN SWAM I, MEIJERINK M, et al. (2012) L. plantarum, L. salivarius, and L. lactis Attenuate Th2 Responses and Increase Treg Frequencies in Healthy Mice in a Strain Dependent Manner. PLoS ONE 7(10): e47244. doi:10.1371/iournal.pone.0047244.

VINDEROLA, C. G., W. PROSELLO, T. D. GHIBERTO AND J. A. REINHEIMER (2000a). Viability of probiotic (Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei) and non probiotic microflora in Argentinean fresco cheese. J Dairy Sci 83:1905-1911.

VINDEROLA, C. G., & REINHEIMER, J. A. (2003). Lactic acid starter and probiotic bacteria: A comparative “in vitro'' study of probiotic characteristics and biological barrier resistance. Food Research International, 36, 895904.

Wiese M., Eljaszewicz A., Andryszczyk M., Gronek S., Gackowska L., Kubiszewska I., Kaszewski W., Helmin-Basa 5 A., Januszewska M., Motyl I., Wieczynska J., Micchalkiewicz, Immunomodulatory effects of Lactobacillus

plantarum and Helicobacter pylori CagA+ on the expression of selected superficial molecules on monocyte and lymphocyte and the synthesis of cytokines in whole blood culture. J Physiol. Pharmacol., 2012, 63, 3 217-224.

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Claims (14)

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    REIVINDICACIONES

    Una micropartmula que comprende una matriz y una bacteria probiotica, en donde dicha matriz esta constituida por casema y quitosano, donde la relacion quitosano:casema en peso es 1:5-150.

    Micropartmula segun la reivindicacion 1, que comprende, ademas, un agente reticulante.

    Micropartmula segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la bacteria probiotica es una bacteria del genero Bifidobacterium o Lactobacillus.

    Un metodo de obtencion de las micropartmulas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende mezclar casema o una fuente de casema, bacterias probioticas y quitosano.

    Metodo segun cualquiera la reivindicacion 4, que comprende, ademas, la adicion de un agente reticulante.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, que comprende, ademas, secar la suspension que contiene las micropartmulas formadas.

    Una micropartmula obtenible mediante un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

    Una composicion que comprende una pluralidad de micropartmulas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o 7.

    Composicion segun la reivindicacion 8, seleccionada entre:

    una composicion A, que comprende:

    casema, entre 40% y 60% en peso, quitosano, entre 0,1% y 3,5% en peso, bacterias probioticas, entre 109 UFC/g y 5 x 1012 UFC/g, tripolifosfato sodico, entre 0% y 0,15% en peso, y agente protector entre 0% y 60% en peso;

    donde las proporciones en peso se refieren al peso total de la composicion;

    una composicion B, que comprende:

    casema, entre 40% y 60% en peso,

    quitosano, entre 0,1% y 3,5% en peso,

    bacterias probioticas, entre 109 UFC/g y 5 x 1012 UFC/g,

    vainillina, entre 0% y 0,6% en peso, y

    agente protector entre 0% y 60% en peso;

    donde las proporciones en peso se refieren al peso total de la composicion; y

    una composicion C, que comprende:

    casema, entre 40% y 60% en peso,

    quitosano, entre 0,1% y 3,5% en peso,

    bacterias probioticas, entre 109 UFC/g y 5 x 1012 UFC/g,

    Ca2+, entre 0% y 10% en peso, y agente protector entre 0% y 60% en peso,

    donde las proporciones en peso se refieren al total de la composicion.

    Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en la que dichas micropartmulas se encuentran en forma de un polvo seco.

    Un producto alimenticio, farmaceutico, cosmeceutico o nutraceutico, que comprende al menos una micropartfcula como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o como se define en la reivindicacion 7, o una composicion como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, y un vehmulo aceptable en alimentacion, farmacia, cosmceutica y nutraceutica, respectivamente.

    Una composicion moduladora del sistema inmune que comprende una micropartfcula como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o como se define en la reivindicacion 7, una composicion como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, o un producto como se define en la reivindicacion 11.

    Una micropartmula como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 7, una composicion como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, un producto como se define en la reivindicacion 11, o una

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    composicion moduladora del sistema inmune como se define en la reivindicacion 12 para su uso oral en la prevencion y/o el tratamiento de una alteracion o patologfa del sistema inmune.
13. 14. Una micropartfcula, una composicion, un producto o una composicion moduladora del sistema inmune para su uso segun la reivindicacion 13, en que la alteracion o patologfa del sistema inmune es:

    - rechazo a un trasplante mediado por Th2,

    - alergias y enfermedades asociadas a la alergia,

    - inmunodeficiencias y patologfas derivadas de dichas inmunodeficiencias,

    - infecciones causadas por patogenos intracelulares, o

    - infecciones de mucosas.
14. 15. Una micropartfcula, una composicion, un producto o una composicion moduladora del sistema inmune para su uso segun la reivindicacion 14, en que la alteracion o patologfa del sistema inmune es una infeccion de mucosas.