ES2620288T3

ES2620288T3 - Amilasas y glucoamilasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para formarlas y utilizarlas

Info

Publication number: ES2620288T3
Application number: ES12152662.8T
Authority: ES
Inventors: Malgorzata Slupska; Yan Zhang; Geoff Hazlewood; Cathy Chang; Peter Luginbuhl; Ellen Burke; Michelle Cayouette; Uvini Gunavardena; Majid Ghassemian; Aron Silverstone
Original assignee: Syngenta Participations AG; BASF Enzymes LLC
Current assignee: Syngenta Participations AG; BASF Enzymes LLC
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2017-06-28
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: EP2069490A4; CA2673525C; HUE027892T2; MX2009006782A; US20190032039A1; DK2069490T3; EP3540053B1; CN101646767B; EP2479267A1; WO2008080093A2; DK2069490T4; EP2479266A1; WO2008080093A3; ES2575912T3; HUE033455T2; EP2069490B2; EP2479267B1; CN101646767A; PL2479266T3; ES2531167T3

Abstract

Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que consiste de (a) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 47, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad glucoamilasa (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 48; (c) una secuencia de ácido nucleico completamente complementaria a (a), o (b); o, (d) una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 47

Description

Amilasas y glucoamilasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para formarlas y utilizarlas

Campo técnico

Esta invención se relaciona con biología molecular y celular y bioquímica. En un aspecto, la invención está dirigida a polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa, polinucleótidos que codifican los polipéptidos, y métodos para elaborar y usar estos polinucleótidos y polipéptidos. En un aspecto, los polipéptidos de la invención se pueden usar como las glucoamilasas que actúan en forma exo, por ejemplo, para catalizar la hidrólisis de los polisacáridos que comprenden monómeros de glucosa, tales como almidón (un polímero de monómeros de glucosa unidos por enlaces 1,4-alfa o 1,6-alfa), en azúcares. En un aspecto, la invención está dirigida a polipéptidos que tienen actividad termoestable de glucoamilasa, incluyendo actividad de 1,4-aIfa-D-glucano glucohidrolasa. En un aspecto, los polipéptidos de la invención se pueden usar como glucoamilasas para catalizar la hidrólisis de los polisacáridos tales como almidón en azúcares, tales como glucosa. La invención también está dirigida a constructos de ácido nucleico, vectores y células huésped que comprenden las secuencias de ácido nucleico de la invención así como también métodos recombinantes para la producción de los polipéptidos de la invención. La invención también está dirigida al uso de glucoamilasas de la invención en procesos de conversión de polisacáridos (por ejemplo, almidón), incluyendo la producción de jarabe de maíz con alto contenido de fructosa (HFCS), etanol, dextrosa y jarabes de dextrosa.

Antecedentes

El almidón es un carbohidrato complejo usualmente encontrado en la dieta humana. La estructura del almidón es de polímeros de glucosa enlazados mediante enlaces glucosídicos α-1,4 y β-1,6. A nivel comercial, se usan las glucoamilasas para hidrolizar adicionalmente el almidón de maíz, que ya ha sido parcialmente hidrolizado con una alfa-amilasa. La glucoamilasa más ampliamente utilizada es producida a partir el hongo Aspergillus niger; uno de los problemas con el uso comercial de esta enzima es su termoestabilidad relativamente baja.

En general, el procesamiento del almidón hasta fructosa consiste de cuatro etapas: Iicuefacción del almidón granulado, sacarificación del almidón licuado en dextrosa, purificación e isomerización hasta fructosa. El objetivo de un proceso de licuefacción del almidón es convertir una suspensión concentrada de gránulos de polímero de almidón en una solución de dextrinas solubles con longitud de cadena más corta de baja viscosidad. Esta etapa es esencial para el manejo conveniente con equipamiento estándar y para la conversión eficiente hasta glucosa u otros azúcares. Para licuar el almidón granulado, es necesario gelatinizar los gránulos elevando la temperatura del almidón granulado aproximadamente por encima de 72°C. El proceso de calentamiento rompe instantáneamente los gránulos de almidón insolubles para producir una solución de almidón soluble en agua. La solución de almidón solubilizada es luego licuada por la amilasa. Un gránulo de almidón está compuesto de: 69-74% de amilopectina, 2631% de amilosa, 11-14% de agua, 0,2-0,4% de proteína, 0,5-0,9% de Iípido, 0,05-0,1% de ceniza. 0.02-0,03% de fósforo, 0,1% de pentosano. Aproximadamente el 70% de un gránulo es amorfo y el 30% es cristalino.

El enranciamiento de los productos horneados (tales como pan) ha sido reconocido como un problema que se torna más serio a medida que transcurre más tiempo entre el momento de la preparación del producto panificado y el momento de consumo. El término enranciamiento se utiliza para describir cambios indeseables para el consumidor en las propiedades del producto panificado después de salir del horno, tales como incremento en la firmeza de la miga, una reducción de la elasticidad de la miga y cambios en la corteza, que se torna dura y curtida. La firmeza de la miga del pan se incrementa de manera adicional durante el almacenamiento hasta alcanzar un nivel que se considera negativo. El incremento en la firmeza de la miga, que es considerado el aspecto más importante del enranciamiento, es reconocido por el consumidor mucho antes de que el producto panificado se haya tornado inadecuado para el consumo.

Existe la necesidad en la industria de nuevas amilasas, por ejemplo, amilasas ácidas, útiles para varios usos incluyendo procesos comerciales de Iicuefacción de almidón de maíz o fabricación mejorada que tenga características nuevas o mejoradas de desempeño con respecto a las enzimas estándar de la industria, por ejemplo, de Bacillus licheniformis. También existe la necesidad en la industria de identificar las amilasas y glucoamilasas capaces de hidrolizar de manera eficiente el almidón granulado (por ejemplo almidón granulado sin purificar) a bajas temperaturas sin la necesidad de un etapa de gelatinización del almidón a alta temperatura; la enzimas de la invención, por ejemplo, glucoamilasas, se pueden utilizar para satisfacer esta necesidad.

También existe la necesidad de nuevas amilasas que tengan utilidad en productos para lavadoras automáticas de vajillas (ADW) y detergente para lavandería. En los productos para ADW, la amilasa actuará a pH 10-11 y a 45-60 °C en presencia de agentes quelantes de calcio y condiciones oxidativas. Para lavandería, se requerirá actividad a pH 9-10 y 40°C en la matriz apropiada de detergente. Las amilasas también son útiles en el desencolado textil, procesos de elaboración de cerveza, modificación de almidón en la industria de pulpa y papel y otros procesos descritos en el arte.

La entrada Q0CPK9 en la base de datos muestra la secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa de Aspergillus terreus y la entrada SAU 34822 en la base de datos muestra la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente.

El documento WO 03/012071 A2 describe la identificación de diferentes tipos de enzimas, incluyendo glucoamilasas, de Aspergillus fumigatus.

Resumen

La invención provee ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 98%, 99%, o más, o identidad completa de secuencia (100%) con un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, un ejemplo de ácido nucleico de la invención. En un aspecto, el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa y las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual. En otro aspecto, la divulgación provee ácidos nucleicos para uso como sondas, moléculas inhibidoras (por ejemplo, ARNi antisentido, tales como siARN, microARN o miARN), regulación de transcripción o de traducción y similares.

Los ejemplos de ácidos nucleicos de la invención incluyen ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes, que comprenden una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en la SEQ ID NO: 47.

Los ejemplos de ácidos nucleicos de la invención también incluyen ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes, que codifican un polipéptido de la invención, por ejemplo, un ejemplo de polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ lD NO: 48.

En un aspecto, el polipéptido de la invención tiene actividad de glucoamilasa que actúa en forma exo. En una realización, los polipéptidos de la invención pueden catalizar la hidrólisis de polisacáridos y/o oligosacáridos que comprenden monómeros de glucosa, tales como almidón (un polímero de monómeros de glucosa unido por enlaces 1,4-alfa o 1,6-alfa).

Las glucoamilasas de la invención se pueden usar a nivel comercial en las etapas iniciales (Iicuefacción) del procesamiento de polisacárido, oligosacárido o almidón; en la molienda húmeda de maíz; en la producción de alcohol; como agentes de limpieza en matrices de detergentes; en la industria textil para desencolado del almidón; en aplicaciones de panadería y pastelería; en la industria de las bebidas; en yacimientos petrolíferos en procesos de perforación; en el entintado de papel reciclado y en alimentación animal. Las glucoamilasas de la invención se pueden usar en desencolado textil, en procesos de elaboración de cerveza, en la modificación de polisacáridos, oligosacáridos o almidón en la industria de pulpa y papel y en otros procesos. Por ejemplo, la invención provee métodos para sacarificación por licuefacción como se ilustra en la Figura 5 usando polipéptidos de la invención.

Las glucoamilasas de la invención se pueden usar para catalizar la hidrólisis de polisacáridos, por ejemplo, almidones, en azúcares; o para hidrolizar enlaces α-1,4-glucosídicos internos en almidón para producir maltodextrinas de menor peso molecular. Debido al rompimiento de los polisacáridos y/o oligosacáridos, por ejemplo, almidones, es importante en el sistema digestivo y en procesos de preparación comercial, las glucoamilasas de la invención se usan en alimentos y piensos y en procesos para su preparación, y en o como auxiliares digestivos. Las glucoamilasas de la invención se pueden usar en las etapas iniciales (Iicuefacción) del procesamiento de almidón; en la molienda húmeda de maíz; en la producción de alcohol; como agentes de limpieza en matrices de detergentes; en la industria textil para desencolado del almidón; en aplicaciones de panadería y pastelería; en la industria de las bebidas; en yacimientos petrolíferos en procesos de perforación; en el entintado de papel reciclado; y en la alimentación animal.

Las enzimas de la invención pueden tener actividad de glucoamilasa que actúa en forma exo y se pueden usar para hidrolizar adicionalmente el almidón de maíz que ya ha sido parcialmente hidrolizado con una alfa-amilasa para producir glucosa; y en un aspecto de este proceso de la invención, la glucosa es convertida en una mezcla de glucosa y fructosa por medio de una enzima de glucosa isomerasa. En otro aspecto de este proceso de la invención, se enriquece esta mezcla con fructosa para producir un jarabe de maíz con alto contenido de fructosa. En aspectos alternativos, se usan los polipéptidos de la invención en cualquier etapa del procesamiento de polisacáridos, oligosacáridos o almidón hasta fructosa, por ejemplo, incluyendo las cuatro etapas: licuefacción de almidón granulado, sacarificación del polisacárido, oligosacárido o almidón licuado en dextrosa, purificación e isomerización hasta fructosa. Un aspecto de la invención que usa al menos un polipéptido de la invención comprende un proceso de licuefacción del polisacárido, oligosacárido o almidón para convertir una suspensión concentrada de gránulos de polímero de polisacárido, oligosacárido o almidón en una solución de dextrinas solubles de longitud de cadena más corta de baja viscosidad.

La invención también provee un proceso de licuefacción enzimática usando al menos un polipéptido de la invención que comprende ajustar el pH de una suspensión granulada de polisacárido, oligosacárido o almidón hasta el pH óptimo de una enzima de la invención (por ejemplo, una glucoamilasa de la invención) que va a ser utilizada, por

ejemplo, entre 6,0 y 6,5, o entre aproximadamente 5,5 y 7,0; se puede agregar hidróxido de calcio, hidróxido de sodio o carbonato de sodio para este propósito (la adición de hidróxido de calcio tiene la ventaja de proveer también iones de calcio que son conocidos por estabilizar la alfa-amilasa contra la inactivación). En un aspecto, después de la adición de la amilasa (por ejemplo, una alfa-amilasa) de la divulgación, la suspensión se bombea a través de un chorro de vapor para elevar instantáneamente la temperatura entre 80 °C y 115 °C y el almidón es gelatinizado en forma inmediata y, debido a la presencia de la alfa-amilasa, despolimerizado a través de hidrólisis aleatoria del enlace (1-4) glucosídico por la alfa-amilasa hasta una masa de fluido que es fácilmente bombeada.

En aspectos alternativos a este proceso de licuefacción de polisacáridos y/o oligosacáridos (por ejemplo, almidón), se añade una glucoamilasa de la invención a la suspensión del polisacárido (por ejemplo, almidón), se mantiene la suspensión a una temperatura de 80-100°C para hidrolizar parcialmente los gránulos, por ejemplo, gránulos de almidón y se bombea la suspensión de polisacárido/almidón parcialmente hidrolizada a través de un chorro a temperaturas que exceden aproximadamente 105°C para gelatinizar completamente cualquier estructura granulada remanente. Después de enfriar el polisacárido/almidón gelatinizado, se puede realizar una segunda adición de una glucoamilasa de la invención para hidrolizar de manera adicional el polisacárido/almidón.

En un aspecto, la divulgación también provee ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codifican glucoamilasa con la novedad en común de que son derivados de cultivos mixtos, por ejemplo, de fuentes ambientales. La invención provee ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codifican glucoamilasa aislados de cultivos mixtos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o identidad completa de secuencia (100%) con un ejemplo de ácido nucleico de la invención sobre una región de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más, residuos, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o glucoamilasa, y las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual.

En un aspecto, la divulgación provee ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codifican glucoamilasa aislados de cultivos mixtos, por ejemplo, de fuentes ambientales, que comprenden un acido nucleico de la invención, por ejemplo, un ejemplo de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia como la expuesta en la SEQ lD NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, etc. y subsecuencias de las mismas, por ejemplo, al menos aproximadamente 10, 15, 2.0, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100,1150,1200,1250, 1300,1350,1400,1450, 1500 o más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de un gen o transcripto; o, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención.

En un aspecto, la divulgación también provee ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codifican glucoamilasa con la novedad en común de que se derivan de fuentes ambientales (véase la Tabla 1 a continuación, segunda columna para los ejemplos de las secuencias aisladas de fuentes "desconocidas" o ambientales), por ejemplo, fuentes ambientales mixtas. En un aspecto, la divulgación provee ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codifican glucoamilasa aislados de fuentes ambientales, por ejemplo, fuentes ambientales mixtas, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%. 73%. 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o identidad completa de secuencia (100%) con un ejemplo de ácido nucleico de la invención sobre una región de al menos aproximadamente 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más residuos, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o glucoamilasa y las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual.

En un aspecto, la invención provee ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codifican glucoamilasa aislados de fuentes ambientales, por ejemplo, fuentes ambientales mixtas, que comprenden un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, un ejemplo de una secuencia de ácido nucleico de la invención como se expone en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 11, etc., la SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 585 y subsecuencias de las mismas, por ejemplo, al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650. 700, 750, 800, 850, 900. 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 o más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de un gen o transcripto; o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención.

En un aspecto, la divulgación también provee glucoamilasas y amilasas, y ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codifican glucoamilasa, con la novedad en común de que se derivan de fuentes de arqueas, incluyendo las amilasas y/o glucoamilasas derivadas de arqueas de la divulgación.

En un aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2 donde se establece una configuración de filtración para blasta ll -p blast p-d "nr pataa" -FF, y todas las otras opciones se establecen en forma predeterminada.

Otro aspecto de la divulgación es un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante, que incluye al menos 10 bases consecutivas de una secuencia de ácido nucleico de la divulgación, secuencias sustancialmente idénticas a la misma, y las secuencias complementarias de la misma.

En un aspecto, la actividad de la amilasa comprende una actividad de α-amilasa o de β-amilasa, incluyendo la capacidad para hidrolizar enlaces alfa-1,4-glucosídicos internos en almidón para producir maltodextrinas de menor peso molecular. En un aspecto, la actividad de α-amilasa incluye hidrolizar enlaces alfa-1,4-glucosidicos internos en almidón al azar. La actividad de la glucoamilasa y/o amilasa puede comprender una actividad de α-amilasa, una actividad de β-amilasa, una actividad de 1,4-α-D-glucano glucohidrolasa, una actividad de exoamilasa, una actividad de glucano α-maltotetrahidrolasa, una actividad de maltasa, una actividad de isomaltasa, una actividad de glucano 1,4, α-glucosidasa, una actividad de α-glucosidasa, una actividad de sacarosa o una actividad de agarasa (por ejemplo, una actividad β-agarasa).

La actividad de amilasa puede comprender la hidrólisis de enlaces glucosídicos. En un aspecto, los enlaces glucosídicos comprenden un enlace α-1,4-glucosídico. En otro aspecto, los enlaces glucosídicos comprenden un enlace α-1,6-glucosídico. En un aspecto, la actividad de amilasa comprende la hidrólisis de enlaces glucosídicos en polisacáridos, por ejemplo, almidones, por ejemplo, almidón licuado. La actividad de amilasa puede comprender además la hidrólisis de enlaces glucosídicos en maltodextrinas. En un aspecto, la actividad de amilasa comprende la escisión de una unidad de maltosa o D-glucosa de un extremo no reductor del almidón.

En un aspecto, el ácido nucleico aislado, sintético o recombinante, codifica un polipéptido que tiene una actividad de amilasa y/o glucoamilasa que es termoestable. El polipéptido puede retener una actividad de amilasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperatura cualquiera entre aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 37 °C, o, entre aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 95 °C o más, por ejemplo, 98 ºC, 100 °C o más; entre aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 85 °C, entre aproximadamente 70 °C hasta aproximadamente 95 °C, o, entre aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 95 °C. Por ejemplo, el ejemplo de polipéptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 437 es termoestable, reteniendo 50% de actividad después de 25 minutos a 100 °C en ausencia de calcio agregado.

En otro aspecto, el ácido nucleico aislado, sintético o recombinante, codifica un polipéptido que tiene una actividad de amilasa y/o glucoamilasa que es termotolerante. El polipéptido puede retener una actividad de amilasa y/o glucoamilasa después de exposición a una temperatura en el rango de más de 37 °C hasta aproximadamente 95 °C

o cualquiera en el rango de más de 55 °C hasta aproximadamente 85 °C. En un aspecto, el polipéptido retiene una actividad de amilasa y/o glucoamilasa después de exposición a una temperatura en el rango de más de 90 °C hasta aproximadamente 95 °C a un pH de 4,5.

La divulgación provee ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes, que comprenden una secuencia que híbrida bajo condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, un ejemplo de un ácido nucleico de la invención, un ácido nucleico que comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5. SEQ lD NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, S'EQ ID NO: 35, SEQ ID No: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO; 49, SEQ lD NO: 51, SEQ ID No: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ lD NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ lD NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ lD NO: 75, SEQ lD NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 y/o SEQ ID NO: 82, y/o fragmentos o subsecuencias de las mismas. En un aspecto, el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de amilasa y/o glucoamilasa. El ácido nucleico puede ser de al menos aproximadamente 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500. 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050. 1100, 1150. 1200, 1250, 1300,1350, 1400, 1450, 1500 o más residuos de longitud o la longitud completa del gen o del transcripto. En un aspecto, las condiciones rigurosas incluyen una etapa de lavado que comprende un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 15 minutos. En un aspecto, las condiciones rigurosas comprenden hibridación bajo condiciones que comprenden un regulador que tiene NaCI 0,15 M durante 15 minutos a 72 °C.

La invención provee una sonda de ácido nucleico para la identificación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de amilasa y/o glucoamilasa, en donde la sonda comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200,250,300, 350, 400, 450, 500, 550, 600. 650, 700, 750, 800, 850, 900. 950, 1000 o más, bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma, en donde la sonda identifica al ácido nucleico mediante enlazamiento o hibridación. La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 10 a 50, aproximadamente 20 a 60, aproximadamente 30 a 70,

aproximadamente 40 a 80, o aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma.

La invención provee una sonda de ácido nucleico para la identificación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de amilasa y/o glucoamilasa, en donde la sonda comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300,. 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800. 850, 900, 950, 1000 o más residuos que tiene al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más,

o identidad de secuencia completa (100%) con un ácido nucleico de la invención, en donde las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual.

La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 10 a 50, aproximadamente 20 a 60, aproximadamente 30 a 70, aproximadamente 40 a 80, o aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia de ácido nucleico de la invención, o una subsecuencia de la misma.

La invención provee un par de secuencias de cebadores de amplificación para amplificación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de amilasa y/o glucoamilasa, en donde el par cebador es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprende una secuencia de la invención, o fragmentos o subsecuencias de las mismas. Uno de cada elemento del par de amplificación de la secuencia cebadora puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia.

La invención provee métodos para amplificación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de amilasa y/o glucoamilasa que comprende la amplificación de un ácido nucleico plantilla con un par de amplificación de la secuencia cebadora capaz de amplificar una secuencia de ácido nucleico de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma.

La invención provee casetes de expresión (que incluyen, por ejemplo, vectores y vehículos de clonación) que comprenden un ácido nucleico de la invención o una subsecuencia del mismo. En un aspecto, el casete de expresión puede comprender al ácido nucleico que está operativamente enlazado a un promotor. El promotor puede ser un promotor viral, bacteriano, de mamífero o de una planta. En un aspecto, el promotor de la planta puede ser un promotor de patata, arroz, maíz, trigo, tabaco o cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor específico de tejido o un promotor regulado por el medio ambiente o uno regulado por desarrollo. Por lo tanto, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor específico de semilla, específico de hoja, específico de raíz, específico del tallo o inducido por abscisión. En un aspecto, el casete de expresión puede comprender, además, un vector de expresión de una planta o de un virus de una planta. En las formas de realización alternativas, el promotor de la planta es un promotor de globulina específico del embrión de la semilla de maíz (véase, por ejemplo, Belanger (1991) Molecular basis for allelic polymorphism of the maize GIobulin1 gene. Genetics 129: 863 -872); o un promotor de γ-zeina específico del endospermo de la semilla de maíz: (véase, por ejemplo, Lopes (1995) Identification of two opaque2 modifier loci in Quality Protein Maize. Mol. Gen. Genet. 247: 603 -613); o un promotor GTL1 específico del endospermo de la semilla de arroz (véase, por ejemplo, Takaiwa (1991) Analysis of the 5‘ flanking region responsible for the endosperm-specific expression of a rice glutelin chimeric gene in transgenic tobacco. Plant Mol. Biol. 16: 49 -58).

La invención provee vehículos de clonación que comprenden un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención o un ácido nucleico de la invención. El vehículo de clonación puede ser un vector viral, un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial. El vector viral puede comprender un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adenoasociado. El vehículo de clonación puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un plásmido, un vector derivado del bacteriófago P1 (PAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o un cromosoma artificial de mamífero (MAC).

La invención provee células transformadas (o “células huésped") que comprenden un ácido nucleico de la invención

o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención, o un vehículo de clonación de la invención. En un aspecto, la célula transformada puede ser una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal. En un aspecto, la célula vegetal puede ser de cualquier planta, por ejemplo plantas usadas para forraje y/o pienso para cualquier animal, incluyendo rumiantes, o como fuente de materia prima para producir energía o combustible. Las plantas de interés particular pueden incluir plantas de cultivo y plantas de materia prima, por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, cebada, arroz, coníferas, pastos, por ejemplo, pasto varilla y Miscanthus, cultivos de leguminosas, por ejemplo, guisantes, frijol y soja, raíces/tubérculos almidonosos, por ejemplo, patata, batata, mandioca, taro, canna, remolacha azucarera, caña de azúcar y similares.

La divulgación provee animales no humanos transgénicos que comprenden un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. En un aspecto, el animal es un ratón. La invención provee células o líneas celulares aisladas de estos animales no humanos transgénicos.

La divulgación provee plantas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la divulgación. La planta transgénica puede ser cualquier planta, pero en una forma de realización la planta se sería utilizada para forraje y/o pienso para cualquier animal o como materia prima para producir energía o combustible, tal como, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, cebada, arroz, coníferas, pastos, por ejemplo, pasto varilla y Miscanthus, cultivos de leguminosas, por ejemplo, guisante, frijol y soja, raíces/tubérculos almidonosos, por ejemplo, patata, batata, mandioca, taro, canna, remolacha azucarera, caña de azúcar y similares.

La divulgación provee semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La semilla transgénica puede ser de cualquier planta, pero en una forma de realización la planta se usa para forraje y/o alimento para cualquier animal o como materia prima para producir energía o combustible, tal como, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, cebada, arroz, coníferas, pastos, por ejemplo, pasto varilla y Miscanthus, cultivos de leguminosas, por ejemplo, guisante, frijol y soja, raíz/tubérculo almidonoso, por ejemplo, patata, batata, mandioca, taro, caña, remolacha azucarera, caña de azúcar y similares.

Cualquier planta, parte de la planta, tejido de la planta, semilla de la planta o célula vegetal puede ser usada para la introducción de un nucleótido de la divulgación, ya sea en forma estable (por ejemplo, como una planta transgénica,

o célula o línea celular derivada de la misma) o transitoria; por lo tanto, la divulgación provee plantas, partes de plantas, tejidos de plantas, semillas de plantas y células vegetales que comprenden un ácido nucleico y/o polipéptido de la divulgación, en donde la planta puede ser (pero no se limita a) maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), incluyendo aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semilla, tales como canola, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza saliva), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolo, Sorgum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo poroso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria italica), mijo dedo (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glicine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypíum barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis). banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), nuez de la India (Anacardium occidentele), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta sp., por ejemplo, Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.) andropogoneae (pastos), Chenopodiaceae (plantas que dan flor), avena, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coníferas; y vegetales, por ejemplo, tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías lima (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.) y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melón (C. melo); y plantas ornamentales, incluyendo azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.). petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), flor de Pascua (Euphorbia pulcherrima), canna (Cannaceae spp.) y crisantemo; y las coníferas que pueden ser utilizadas, incluyendo, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino de incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino logdepole (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata), abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); abeto occidental (Tsuga canadensis); pícea Sitka (Picea glauca); secoya (Sequoia sempervirens); abetos reales tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámo (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis); y plantas leguminosas, incluyendo, pero sin limitarse a, frijoles y guisantes; donde en aspectos alternativos los frijoles pueden incluir guar, algarroba, fenogreco, soja, habichuelas, arvejas, frijol mungo, frijol lima, habas, lentejas, garbanzos, etc. y las legumbres pueden incluir, pero sin limitarse a, Arachis, por ejemplo, cacahuetes, Vicia, por ejemplo, veza corona, veza peluda, frijol adzuki, frijol mungo y garbanzos, lupines, por ejemplo, Iupino, trébol rojo, Phaseolus, por ejemplo, frijol común y frijol lima, Pisum, por ejemplo, frijol de campo, meliloto, por ejemplo, trébol, Medicago, por ejemplo, alfalfa, loto, por ejemplo, trébol, lentejas, por ejemplo, lenteja y falso índigo; también se incluye pastos para forraje y pasto césped, tales como alfalfa, pasto varilla (Panicum virgatum), Miscanthus, pasto ovillo, festuca alta, ballico perenne, pasto encorvado rastrero y agróstide.

En aspectos alternativos, plantas, partes de plantas, tejidos de plantas, semillas de plantas y células vegetales que comprenden un ácido nucleico y/o un polipéptido de la divulgación también incluyen plantas de cultivo y plantas utilizadas para producir energía o combustible (por ejemplo, etanol u otros biocombustibles, por ejemplo, bioetanoles, biopropanoles, biobutanoles o biodiesel), por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, cebada, arroz, coníferas, pastos, por ejemplo, pasto varilla y Miscanthus, cultivos de leguminosas, por ejemplo, guisante, frijol y soja, raíces/tubérculos almidonosos, por ejemplo, patata, batata, mandioca, taro, canna, caña de azúcar y/o remolacha azucarera y similares.

La invención provee un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la invención. La divulgación provee métodos para inhibir la traducción de un mensaje de amilasa en una célula que comprende la administración a la célula o la expresión en una célula de un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la divulgación.

La invención provee un polipéptido aislado, sintético o recombinante, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 99%, o más, o identidad de secuencia completa (100%) con un ejemplo de polipéptido o péptido de la invención. Los ejemplos de secuencias de polipéptidos o péptidos de la invención incluyen la SEQ ID NO: 48 y/o subsecuencias de la misma y variantes de la misma, por ejemplo, en al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, o más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de una enzima. Los ejemplos de secuencias de polipéptidos o péptidos de la invención incluyen una secuencia codificada por el ácido nucleico de la invención. Los ejemplos de secuencias de polipéptidos o péptidos de la invención incluyen polipéptidos o péptidos específicamente unidos por un anticuerpo de la invención. En un aspecto, un polipéptido de la invención tiene al menos una actividad de amilasa, por ejemplo, una actividad de alfa amilasa.

En formas de realización alternativas, los polipéptidos de la invención carecen de una secuencia señal (secuencia líder) o una molécula que enlaza un carbohidrato. En formas de realización alternativas, los polipéptidos de la invención comprenden, además, una o más secuencias heterólogas, que pueden comprender una secuencia señal heteróloga (secuencia líder), un dominio catalítico heterólogo (CD) (es decir, sitio activo), o un módulo que enlaza a un carbohidrato heterólogo, o epítopo, etiqueta de purificación o rótulo. En un aspecto, la secuencia señal heteróloga, el módulo de enlazamiento del carbohidrato heterólogo o el dominio catalítico heterólogo (CD) se deriva de otra enzima amilasa (una amilasa diferente de una enzima de esta invención), o se deriva de una enzima que no es amilasa.

En formas de realización alternativas, los polipéptidos de la invención se pueden usar para generar anticuerpos que se enlazan de manera específica con un ejemplo de polipéptido de la invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 48).

En formas de realización alternativas, los polipéptidos de la invención pueden ser sintéticos o en una forma péptido mimética.

Otro aspecto de la invención es un péptido o polipéptido aislado, sintético o recombinante, que incluye al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 o más residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de péptidos o polipéptidos de la invención, secuencias sustancialmente idénticas a la misma y las secuencias complementarias de la misma.

En un aspecto, la actividad de amilasa de un polipéptido o péptido de la invención comprende una actividad de αamilasa, incluyendo la capacidad para hidrolizar enlaces alfa-1,4-glucosídicos internos en almidón para producir maltodextrinas de menor peso molecular. En un aspecto, la actividad de α-amilasa incluye la hidrolisis de enlaces alfa-1,4-glucosidicos internos en almidón al azar. La actividad de amilasa puede comprender una actividad de glucoamilasa, una actividad de 1,4-α-D-glucano glucohidrolasa, una actividad de α-amilasa, una actividad de exoamilasa, o una actividad de β-amilasa. La actividad de amilasa puede comprender la hidrólisis de enlaces glucosídicos. En un aspecto, los enlaces glucosídicos comprenden un enlace α-1,4-glucosídico. En otro aspecto, los enlaces glucosídicos comprenden un enlace α-1,6-glucosídico. En un aspecto, la actividad de amilasa comprende la hidrólisis de enlaces glucosídicos en almidón, por ejemplo, almidón licuado. La actividad de amilasa puede comprender, además, la hidrólisis de enlaces glucosídicos en maltodextrinas. En un aspecto, la actividad de amilasa comprende la escisión de una unidad de maltosa o de D-glucosa del extremo no reductor del almidón.

En un aspecto, la actividad de amilasa de la invención comprende una actividad de glucoamilasa, que puede comprender la catálisis de la hidrólisis de enlaces glucosídicos. La actividad de glucoamilasa de la invención puede comprender la catálisis de la liberación hidrolítica, por etapas, de la D-glucosa de los extremos no reductores del almidón u otras dextrinas relacionadas. La actividad de la glucoamilasa puede comprender una de actividad 1,4-α-Dglucano glucohidrolasa. La actividad de glucoamilasa puede comprender la catálisis de la hidrólisis de maltodextrinas, lo que resulta en la generación de glucosa libre. La actividad de glucoamilasa puede comprender una actividad de exoamilasa. La actividad de glucoamilasa puede comprender una actividad de α-amilasa o βamilasa. Los enlaces glucosídicos hidrolizados pueden comprender enlaces α-1,4-glucosídicos o enlaces (α-1,6glucosídicos. La actividad de glucoamilasa puede comprender la hidrólisis de enlaces glucosídicos en un almidón. La actividad de glucoamilasa puede comprender además la hidrólisis de enlaces glucosídicos en el almidón para producir maltodextrinas. La actividad de glucoamilasa puede comprender la escisión de una unidad de maltosa o Dglucosa del extremo no reductor del almidón.

En un aspecto, la actividad de glucoamilasa puede ser termoestable. El polipéptido puede retener una actividad de glucoamilasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperatura entre aproximadamente 37°C hasta

aproximadamente 95 °C, entre aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 85 °C, entre aproximadamente 70 °C hasta aproximadamente 95 °C, o entre aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 95 °C. En otro aspecto, la actividad de glucoamilasa puede ser termotolerante. El polipéptido puede retener actividad de glucoamilasa después de la exposición a una temperatura en el rango de más de 37 °C hasta aproximadamente 95 °C, o en el rango de más de 55 °C hasta aproximadamente 85 °C. En un aspecto, el polipéptido puede retener actividad de glucoamilasa después de la exposición a una temperatura en el rango de más de 90 °C hasta aproximadamente 95 °C a un pHde 4,5.

En un aspecto, la actividad de glucoamilasa es termoestable, por ejemplo, en donde el polipéptido retiene una actividad de glucoamilasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperatura de aproximadamente -100°C hasta aproximadamente -80°C, aproximadamente -80°C hasta aproximadamente -40°C, aproximadamente -40°C hasta aproximadamente -20°C, aproximadamente -20°C hasta aproximadamente 0°C, aproximadamente 0 °C hasta aproximadamente 5 °C, aproximadamente 5 °C hasta aproximadamente 15 °C, aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 25 °C, aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 37 °C, aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 45°C. aproximadamente 45°C hasta aproximadamente 55°C, aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 70°C, aproximadamente 70 °C hasta aproximadamente 75 °C, aproximadamente 75°C hasta aproximadamente 85°C, aproximadamente 85°C hasta aproximadamente 90 °C, aproximadamente 90°C hasta aproximadamente 95°C, aproximadamente 95°C hasta aproximadamente 100 °C, aproximadamente 100°C hasta aproximadamente 105°C, aproximadamente 105°C hasta aproximadamente 110°C, aproximadamente 110°C hasta aproximadamente 120°C, o 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C, 99 °C, 100°C, 101°C, 102 °C, 103 °C, 104 °C,105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C. 110 °C, 111 °C, 112 °C, 113°C, 114°C, 115°C o más. En algunas formas de realización, el polipéptido termoestable retiene actividad, por ejemplo, una actividad de glucoamilasa, a una temperatura en los rangos descritos anteriormente, hasta aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5,0, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, aproximadamente pH 8,5, aproximadamente pH 9,0, aproximadamente pH 9,5, aproximadamente pH 10,0, aproximadamente pH 10,5, aproximadamente pH 11,0, aproximadamente pH 11,5, aproximadamente pH 12,0 o más.

En un aspecto, la actividad de glucoamilasa es termotolerante, por ejemplo, en donde el polipéptido retiene una actividad de glucoamilasa después de la exposición a una temperatura en el rango de aproximadamente -100°C hasta aproximadamente -80°C, aproximadamente -80°C hasta aproximadamente -40°C, aproximadamente -40°C hasta aproximadamente -20°C, aproximadamente -20°C hasta aproximadamente 0°C, aproximadamente 0 °C hasta aproximadamente 5 °C, aproximadamente 5 °C hasta aproximadamente 15 °C, aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 25 °C, aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 37 °C, aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 45 °C, aproximadamente 45 °C hasta aproximadamente 55 °C, aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 70 °C, aproximadamente 70 °C hasta aproximadamente 75 ºC, aproximadamente 75 “C hasta aproximadamente 85 °C. aproximadamente 85°C hasta aproximadamente 90 °C, aproximadamente 90 °C. hasta aproximadamente 95 °C. aproximadamente 95 °C hasta aproximadamente 100 °C, aproximadamente 100°C hasta aproximadamente 105 °C, aproximadamente 105 °C hasta aproximadamente 110 °C, aproximadamente 110 °C hasta aproximadamente 120 °C, o 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C, 99 °C, 100 °C, 101 °C, 102 °C, 103 °C, 104 °C, 105 °C, 106 °C, 107 °C, 108 °C, 109 °C, 110 °C, 111 °C, 112 °C. 113 °C, 114 °C, 115 °C o más. Los polipéptidos termotolerantes pueden retener actividad, por ejemplo actividad de glucoamilasa, después de la exposición a una temperatura en el rango de aproximadamente -100 °C hasta aproximadamente -80 °C, aproximadamente -80 °C hasta aproximadamente -40 °C, aproximadamente -40 °C hasta aproximadamente -20 °C, aproximadamente -20 °C hasta aproximadamente 0 °C, aproximadamente 0 °C hasta aproximadamente 5 °C, aproximadamente 5 °C hasta aproximadamente 15 °C, aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 25 °C, aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 37 °C, aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 45 °C, aproximadamente 45°C hasta aproximadamente 55°C, aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 70 °C, aproximadamente 70 °C hasta aproximadamente 75 °C, aproximadamente 75 °C hasta aproximadamente 85 °C, aproximadamente 85 °C hasta aproximadamente 90 °C, aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 95 °C, aproximadamente 95 °C hasta aproximadamente 100 °C, aproximadamente 100 °C hasta aproximadamente 105 °C, aproximadamente 105 °C hasta aproximadamente 110 °C, aproximadamente 110 °C hasta aproximadamente 120 °C, o 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C, 99 °C, 100 °C, 101 °C, 102 °C, 103 °C, 104 °C, 105 °C, 106 °C, 107 °C, 108 °C, 109 °C, 110 °C, 111 °C, 112 °C, 113 °C, 114 °C, 115 °C o más. En algunas formas de realización, los polipéptidos termotolerantes de acuerdo con la invención retienen actividad, por ejemplo actividad de amilasa y/o actividad de glucoamilasa, después de la exposición a una temperatura en los rangos descritos anteriormente, hasta aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5,0, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, aproximadamente pH 8,5, aproximadamente pH 9,0, aproximadamente pH 9,5, aproximadamente pH 10,0, aproximadamente pH 10,5, aproximadamente pH 11,0, aproximadamente pH 11,5, aproximadamente pH 12,0 o más.

En un aspecto, la actividad de glucoamilasa de los polipéptidos codificados por ácidos nucleicos de la invención retienen actividad bajo condiciones ácidas que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, ,pH 5,5, pH 5, pH 4,5,

pH 4,0, pH 3,5, pH 3,0 o menos pH (más ácidas), o, retiene una actividad de glucoamilasa después de la exposición a condiciones ácidas que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5, pH 4,0, pH 3,5, pH 3,0

o un pH menor (más ácido); o, retienen actividad bajo condiciones básicas que. comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11, pH 11,5, pH 12, pH 12,5 o más (más básico) o, retienen una actividad de amilasa y/o actividad de glucoamilasa después de exposición a condiciones básicas que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11, pH 11,5, pH 12, pH 12,5 o más (más básico). En un aspecto, las actividad de glucoamilasa de los polipéptidos codificados por ácidos nucleicos de la invención retienen actividad a una temperatura de al menos aproximadamente 80 °C, 81°C, 82 °C, 83 °C, 84 °C, 85 °C, 86 °C, 87 °C, 88 °C, 89 °C, 90 °C, 91 °C , 92 °C , 93 °C , 94 °C, 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C, 99 °C, 100 °C, 101 °C, 102 °C, 103 °C, 103,5 °C, 104 °C, 105 °C, 107 °C, 108 °C, 109 °C o 110 °C, o más y un pH básico de al menos aproximadamente pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11, pH 11,5, pH 12, pH 12,5 o más (más básico).

En un aspecto, el polipéptido aislado, sintético o recombinante, puede comprender al polipéptido de la invención que carece de una secuencia señal. En un aspecto, el polipéptido aislado, sintético o recombinante, puede comprender al polipéptido de la invención que comprende una secuencia señal heteróloga, tal como una secuencia señal de amilasa o no amilasa heteróloga.

En un aspecto, la invención provee una secuencia señal que comprende un péptido como se expone en la Tabla 1. En un aspecto, la invención provee una secuencia señal que consiste de un péptido como se expone en la Tabla 1. En un aspecto, la invención provee proteínas quiméricas que comprenden un primer dominio que comprende una secuencia señal de la invención y al menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser cualquier glucoamilasa (por ejemplo, una glucoamilasa de la invención, u otra amilasa o glucoamilasa).

En un aspecto, la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención comprende una actividad específica hasta aproximadamente 37 °C en el rango desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteína, o, aproximadamente 100 hasta aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención comprende una actividad específica de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína, o, de aproximadamente 500 hasta aproximadamente 750 unidades por miligramo de proteína. En forma alternativa, la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención comprende una actividad específica a 37 °C en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 750 unidades por miligramo de proteína, o, de aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteína. En un aspecto, la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención comprende una actividad específica a 37 °C en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 unidades por miligramo de proteína, o, de aproximadamente 750 hasta aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de está invención comprende una actividad específica a 37 °C en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 250 unidades por miligramo de proteína. En forma alternativa, la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención comprende una actividad específica a 37 °C en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la termotolerancia comprende la retención de al menos la mitad de la actividad específica de la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención a 37 °C después de calentamiento a temperatura elevada, tal como a una temperatura de aproximadamente 0 °C hasta aproximadamente 20 °C, aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 37 °C, aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 50 °C, aproximadamente 50 °C hasta aproximadamente 70 °C, aproximadamente 70 °C hasta aproximadamente 75 °C, aproximadamente 75 °C hasta aproximadamente 80 °C, aproximadamente 80 °C hasta aproximadamente 85 °C, aproximadamente 85 °C hasta aproximadamente 90 °C, aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 95 °C, aproximadamente 95 °C hasta aproximadamente 100 °C, aproximadamente 100 °C hasta aproximadamente 110 °C, o más. En forma alternativa, la termotolerancia puede comprender retención de la actividad específica a 37 °C en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteína, o de aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína, después de calentamiento a una temperatura elevada. En otro aspecto, la termotolerancia puede comprender la retención de actividad específica a 37 °C en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 unidades por miligramo de proteína después de calentamiento a una temperatura elevada, como se describió anteriormente.

La invención provee polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes, de la invención, en donde el polipéptido comprende al menos un sitio de glicosilación. En un aspecto, la glicosilación puede ser una glicosilación ligada a N. En un aspecto, el polipéptido puede ser glicosilado después de ser expresado en P. pastoris o S. pombe. La invención también provee métodos para agregar glicosilación a un polipéptido, ya sea después de la traducción o químicamente, para cambiar la propiedad de los polipéptidos, por ejemplo, su estabilidad térmica, solubilidad, tendencia a agregarse y similares.

En un aspecto, el polipéptido puede retener la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5, pH 4,0, pH 3,5, pH 3,0 o menos pH (más ácido). En otro aspecto, el polipéptido puede retener la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11,0, pH 11,5, pH 12, pH 12,5 o más pH (más básico). En un aspecto, el polipéptido puede retener la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención después de la exposición a condiciones que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5, pH 4,0, pH 3,5, pH 3,0 o menos pH (más ácido). En otro aspecto, el polipéptido puede retener la actividad enzimática (por ejemplo, la actividad de glucoamilasa) de una enzima de esta invención después de la exposición a condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8.5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11,0, pH 11,5, pH 12, pH 12,5 o más pH (más básico).

La divulgación provee preparaciones de proteínas que comprenden un polipéptido de la invención, en donde la preparación de la proteína comprende un líquido, un sólido o un gel.

La divulgación provee heterodímeros que comprenden un polipéptido de la invención y un segundo dominio. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido y el heterodímero puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o una etiqueta. En un aspecto, la divulgación provee homodímeros que comprenden un polipéptido de la invención.

La divulgación provee polipéptidos inmovilizados que tienen actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido que comprende un polipéptido de la invención y un segundo dominio. En un aspecto, el polipéptido puede ser inmovilizado en una célula, un metal, una resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un microelectrodo, una partícula grafítica, una perla, un gel, una placa, una disposición o un tubo capilar.

La divulgación provee arreglos que comprenden un ácido nucleico inmovilizado de la invención. La divulgación provee arreglos que comprenden un anticuerpo de la invención.

La divulgación provee anticuerpos aislados, sintéticos o recombinantes, que se enlazan de manera específica a un polipéptido de la invención o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. La invención provee hibridomas que comprenden un anticuerpo de la invención, por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza de manera específica a un polipéptido de la invención o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención.

La divulgación provee suplementos alimenticios para un animal que comprenden un polipéptido de la invención, por ejemplo, un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la invención. En un aspecto, el polipéptido en el suplemento alimenticio puede ser glicosilado. La invención provee matrices de suministro de enzimas comestibles que comprenden un polipéptido de la invención, por ejemplo, un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la matriz de suministro comprende una pella. En un aspecto, el polipéptido puede ser glicosilado. En un aspecto. la actividad de amilasa es termotolerante. En otro aspecto, la actividad de amilasa es termoestable.

La divulgación provee un método para aislar o identificar un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa que comprende las etapas de: (a) proveer un anticuerpo de la divulgación; (b) proveer una muestra que comprende polipéptidos; y (c) poner en contacto la muestra de la etapa (b) con el anticuerpo de la etapa (a) bajo condiciones en donde el anticuerpo se puede enlazar de manera específica al polipéptido, aislando o identificando de este modo un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa.

La divulgación provee métodos para formar un anticuerpo antiamilasa que comprende administrar a un animal no humano un ácido nucleico de la invención o un polipéptido de la invención o subsecuencias de los mismos en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, elaborando de este modo un anticuerpo antiglucoamilasa. La divulgación provee métodos para elaborar una antiglucoamilasa inmune que comprende administrar a un animal no humano un ácido nucleico de la invención o un polipéptido de la invención o subsecuencias de los mismos en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune.

La invención provee métodos para producir un polipéptido recombinante que comprende las etapas de: (a) proveer un ácido nucleico de la invención operativamente enlazado a un promotor; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido, produciendo de este modo un polipéptido recombinante. El método comprende además transformar una célula huésped con el ácido nucleico de la etapa (a) seguido de expresar el ácido nucleico de la etapa (a), produciendo de este modo un polipéptido recombinante en una célula transformada.

La divulgación provee métodos para identificar un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa que comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proveer un sustrato de amilasa; y (c) poner en contacto el polipéptido o un fragmento o variante del mismo de la etapa (a) con el sustrato de la etapa (b) y detectar una reducción en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, en donde una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción detecta un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa. En un aspecto, el sustrato puede ser un polisacárido, oligosacárido o almidón, por ejemplo, un almidón licuado.

La divulgación provee métodos para identificar un sustrato de glucoamilasa que comprende las siguientes etapas:

(a) proveer un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proveer un sustrato de prueba; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con el sustrato de prueba de la etapa (b) y detectar una reducción en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción, en donde una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción identifica al sustrato de prueba como un sustrato de amilasa o glucoamilasa.

La divulgación provee métodos para determinar si un compuesto de prueba se enlaza de manera específica a un polipéptido que comprende las siguientes etapas: (a) expresar un ácido nucleico o un vector que comprende el ácido nucleico bajo condiciones permisivas para traducción del ácido nucleico en un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende un ácido nucleico de la divulgación, o, proveer un polipéptido de la divulgación; (b) proveer un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de prueba; y (d) determinar si el compuesto de prueba de la etapa (b) se enlaza de manera específica al polipéptido.

La divulgación provee métodos para identificar un modulador de la actividad de amilasa o de glucoamilasa que comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido de la divulgación o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la divulgación; (b) proveer un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con el compuesto de prueba de la etapa (b) y medir la actividad de la amilasa o de la glucoamilasa, en donde un cambio en la actividad de la amilasa o de la glucoamilasa medida en presencia del compuesto de prueba comparado con la actividad en ausencia del compuesto de evaluación provee una determinación de que el compuesto de evaluación modula la actividad de amilasa o glucoamilasa. En un aspecto, la actividad de amilasa o glucoamilasa puede ser medida proveyendo un sustrato de amilasa o de glucoamilasa y detectar una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción, o, un incremento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad del producto de reacción. Una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba en comparación con la cantidad de sustrato o del producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica el compuesto de prueba como activador de la actividad de amilasa o de glucoamilasa. Un incremento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba comparado con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica al compuesto de prueba como un inhibidor de la actividad de amilasa o de glucoamilasa.

La divulgación provee sistemas computarizados que comprenden un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos en donde dicho dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenada una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácido nucleico de la divulgación (por ejemplo, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la divulgación). En un aspecto, el sistema de cómputo puede comprender, además, un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tienen al menos una secuencia de referencia almacenada. En otro aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias comprende un programa de ordenador que indica polimorfismos. En un aspecto, el sistema de cómputo puede comprender, además, un identificador que identifica una o más características en dicha secuencia. La divulgación provee medios legibles para el ordenador que tienen almacenada una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácido nucleico de la invención. La divulgación provee métodos para identificar una característica en una secuencia que comprende las etapas de: (a) leer la secuencia usando un programa de ordenador que identifica una o más características en una secuencia, en donde la secuencia comprende una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácido nucleico de la divulgación; y (b) identificar una o más características en la secuencia con el programa del ordenador. La divulgación provee métodos para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia que comprende las etapas de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia a través del uso de un programa de ordenador que compara secuencias, en donde la primera secuencia comprende una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la divulgación; y (b) determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de ordenador. La etapa de determinar diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia puede comprender, además, la etapa de identificación de polimorfismos. En un aspecto, el método puede comprender, además, un identificador que identifica una o más características en una secuencia. En otro aspecto, el método puede comprender leer la primera secuencia usando un programa de ordenador e identificar una o más características en la secuencia.

La divulgación provee métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa de una muestra del ambiente que comprende las etapas de: (a) proveer un par de secuencias del cebador de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que

tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa, en donde el par cebador es capaz de amplificar un ácido nucleico de la divulgación; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra del ambiente o tratar la muestra del ambiente de manera tal que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación con el par cebador de amplificación; y, (c) combinar el ácido nucleico de la etapa (b) con el par cebador de amplificación de la etapa (a) y amplificar el ácido nucleico de la muestra del ambiente, aislando o recuperando de este modo un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa de una muestra del ambiente. Uno o cada elemento del par de secuencias del cebador de amplificación pueden comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de una secuencia de la divulgación.

La divulgación provee métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa de una muestra del ambiente que comprende las etapas de: (a) proveer una sonda de polinucleótido que comprende un ácido nucleico de la divulgación o una subsecuencia del mismo; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra del ambiente o tratar la muestra del ambiente de manera tal que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación con una sonda de polinucleótido de la etapa (a); (c) combinar el ácido nucleico aislado o la muestra del ambiente tratada de la etapa (b) con la sonda de polinucleótido de la etapa (a); y (d) aislar un ácido nucleico que hibrida de manera específica con la sonda de polinucleótido de la etapa (a), aislando o recuperando de este modo un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa de una muestra del ambiente. La muestra del ambiente puede comprender una muestra acuosa, una muestra líquida, una muestra de suelo, una muestra de aire o una muestra biológica. En un aspecto, la muestra biológica puede derivar de una célula bacteriana, una célula de protozoo, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula vegetal, una célula de hongo o una célula de mamífero.

La divulgación provee métodos para generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa que comprende las etapas de: (a) proveer un ácido nucleico plantilla que comprende un ácido nucleico de la divulgación; y (b) modificar, suprimir o agregar uno o más nucleótidos en la secuencia plantilla, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico plantilla. En un aspecto, el método puede comprender, además, expresar la variante de ácido nucleico para generar una variante de polipéptido de amilasa o glucoamilasa. Las modificaciones, adiciones o supresiones se pueden introducir por medio de un método que comprende PCR propensa a error, arrastre, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casetes, mutagénesis de ensamblaje recursivo, mutagénesis de ensamblaje exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamble de genes, mutagénesis de saturación del sitio génico (GSSM), reensamble del ligamiento sintético (SLR) o una combinación de los mismos. En otro aspecto, las modificaciones, adiciones o supresiones son introducidas por medio de un método que comprende recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de la plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con espacios, mutagénesis de reparación de falta de correlación puntual, mutagénesis de cepa huésped de reparación deficiente, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de selección-restricción, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis génica artificial, mutagénesis de ensamblaje, creación de multímeros de ácido nucleico quimérico y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el método puede repetirse en forma iterativa hasta que se produce una amilasa o glucoamilasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de aquella de un polipéptido codificado por el ácido nucleico plantilla. En un aspecto, la variante del polipéptido de amilasa o glucoamilasa es termotolerante y retiene alguna actividad después de ser expuesta a una temperatura elevada. En otro aspecto, la variante del polipéptido de amilasa o glucoamilasa tiene mayor glicosilación en comparación con la amilasa o glucoamilasa codificada por un ácido nucleico plantilla. En forma alternativa, la variante del polipéptido de amilasa o glucoamilasa tiene actividad de amilasa o glucoamilasa bajo una temperatura alta, en donde la amilasa o glucoamilasa codificada por el ácido nucleico plantilla no es activa a temperatura alta. En un aspecto, el método puede repetirse en forma iterativa hasta que se produce una secuencia codificadora de amilasa o glucoamilasa que tiene un uso de codón alterado con relación al del ácido nucleico plantilla. En otro aspecto, el método puede repetirse en forma iterativa hasta que se produce un gen de amilasa o glucoamilasa que tiene nivel inferior o superior de expresión o estabilidad del mensaje con respecto al del ácido nucleico plantilla.

La divulgación provee métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa para incrementar su expresión en una célula huésped; el método comprende las siguientes etapas: (a) proveer un ácido nucleico de la divulgación que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo con un codón usado en forma neutral o preferida que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón sobrerrepresentado en las secuencias codificadoras en los genes en la célula huésped y un codón no preferido o menos preferido es un codón subrepresentado en las secuencias codificadoras en los genes en la célula huésped, modificando de este modo el ácido nucleico para incrementar su expresión en una célula huésped.

La divulgación provee métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tienen actividad de amilasa y/o de glucoamilasa; el método comprende las siguientes etapas: (a) proveer a ácido nucleico

de la divulgación; y, (b) identificar un codón en el ácido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo con un codón diferente que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, modificando de este modo los codones en un ácido nucleico que codifica una amilasa o glucoamilasa.

La divulgación provee métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa para incrementar su expresión en una célula huésped, el método comprendiendo las siguientes etapas: (a) proveer un ácido nucleico de la divulgación que codifica un polipéptido de amilasa o glucoamilasa; y, (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo con un codón usado en forma preferida o neutra que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón preferido sobrerrepresentado en secuencias codificadoras en genes en la célula huésped y un codón no preferido o menos preferido es un codón subrepresentado en secuencias codificadoras en genes en la célula huésped, modificando de este modo el ácido nucleico para incrementar su expresión en una célula huésped.

La divulgación provee métodos para modificar un codón en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de amilasa y/o de glucoamilasa para reducir su expresión en una célula huésped, el método comprendiendo las siguientes etapas: (a) proveer un ácido nucleico de la divulgación; e (b) identificar al menos un codón preferido en el ácido nucleico de la etapa (a) y reemplazarlo con un codón no preferido o menos preferido que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón sobrerrepresentado en secuencias codificadoras en genes en una célula huésped y un codón no preferido o menos preferido es un codón subrepresentado en secuencias codificadoras en genes en la célula huésped, modificando de este modo el ácido nucleico para reducir su expresión en una célula huésped. En un aspecto, la célula huésped puede ser una célula bacteriana, una célula de hongo, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de mamífero.

La divulgación provee métodos para producir una biblioteca génica de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de amilasa o glucoamilasa modificados o sitios de enlazamiento de sustratos, en donde los sitios activos modificados o sitios de enlazamiento de sustratos se derivan de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de enlazamiento del sustrato, el método comprendiendo las siguientes etapas: (a) proveer un primer ácido nucleico que codifica un primer sitio activo o primer sitio de enlazamiento de sustratos, en donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que se híbrida bajo condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la divulgación y el ácido nucleico codifica un sitio activo de amilasa o glucoamilasa o un sitio de enlazamiento del sustrato de amilasa o glucoamilasa;

(b) proveer un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifican variantes de aminoácidos de ocurrencia natural en una pluralidad de codones objetivo en el primer ácido nucleico; y, (c) usar el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de variantes de ácidos nucleicos que codifican el sitio activo o que codifican el sitio de enlazamiento del sustrato, que codifica un rango de variaciones de aminoácidos en cada codón de aminoácidos que experimentó mutagénesis produciendo de este modo una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de amilasa o glucoamilasa modificados o sitios de enlazamiento de sustratos. En un aspecto, el método comprende provocar mutagénesis del primer ácido nucleico de la etapa (a) por medio de un método que comprende un sistema de evolución dirigida optimizada, mutagénesis de saturación del sitio génico (GSSM), reensamble de ligamiento sintético (SLR), PCR propensa a error, arrastre, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casete, mutagénesis de ensamblaje recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamble génico, mutagénesis de saturación del sitio génico (GSSM), reensamble de ligamiento sintético (SLR) y una combinación de los mismos. En otro aspecto, el método comprende someter a mutagénesis al primer ácido nucleico de la etapa (a) o variantes por medio de un método que comprende recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis del ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de la plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con espacios, mutagénesis de reparación de falta de correlación puntual, mutagénesis de cepa huésped de reparación deficiente, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de selección-restricción, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis génica artificial, mutagénesis de ensamblaje, creación de multímeros de ácido nucleico quimérico y una combinación de los mismos.

La divulgación provee métodos para elaborar una molécula pequeña que comprende las siguientes etapas: (a) proveer una pluralidad de enzimas biosintéticas capaces de sintetizar o modificar una molécula pequeña, en donde una de las enzimas comprende una enzima amilasa o glucoamilasa codificada por un ácido nucleico de la divulgación; (b) proveer un sustrato para al menos una de las enzimas de la etapa (a); y (c) hacer reaccionar el sustrato de la etapa (b) con las enzimas bajo condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocatalíticas para generar una molécula pequeña mediante una serie de reacciones biocatalíticas. La divulgación provee métodos para modificar una molécula pequeña que comprende las siguientes etapas: (a) proveer una enzima amilasa o glucoamilasa, en donde la enzima comprende un polipéptido de la divulgación, o, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la divulgación, o una subsecuencia del mismo; (b) proveer una molécula pequeña; y (c) hacer reaccionar la enzima de la etapa (a) con la molécula pequeña de la etapa (b) bajo condiciones que facilitan una reacción enzimática catalizada por la enzima amilasa o glucoamilasa, modificando de este modo una molécula pequeña mediante una reacción enzimática de amilasa o glucoamilasa. En un aspecto, el método puede

comprender una pluralidad de sustratos de molécula pequeña para la enzima de la etapa (a), generando de este modo una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas por al menos una reacción enzimática catalizada por la enzima amilasa o glucoamilasa. En un aspecto, el método puede comprender una pluralidad de enzimas adicionales bajo condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocatalíticas por la enzimas para formar una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas por la pluralidad de reacciones enzimáticas. En otro aspecto, el método puede comprender, además, la etapa de evaluar la biblioteca para determinar si una molécula pequeña modificada particular que exhibe una actividad deseada está presente en la biblioteca. La etapa de evaluar la biblioteca puede comprender, además, las etapas de eliminar en forma sistemática todas menos una de las reacciones biocatalíticas usadas para producir una porción de la pluralidad de las moléculas pequeñas modificadas en la biblioteca mediante la evaluación de la porción de la molécula pequeña modificada en cuanto a la presencia o ausencia de la molécula pequeña modificada particular con una actividad deseada e identificar al menos una reacción biocatalítica específica que produce la molécula pequeña modificada particular de actividad deseada.

La divulgación provee métodos para determinar un fragmento funcional de una enzima amilasa o glucoamilasa que comprende las etapas de: (a) proveer una enzima amilasa o glucoamilasa, en donde la enzima comprende un polipéptido de la divulgación, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la divulgación, o una subsecuencia del mismo; y (b) suprimir una pluralidad de residuos de aminoácidos de la secuencia de la etapa (a) y evaluar el resto de la subsecuencia en cuanto a la actividad de amilasa o glucoamilasa, determinando de este modo un fragmento funcional de una enzima amilasa o glucoamilasa. En un aspecto, la actividad de amilasa o glucoamilasa se mede al proveer un sustrato de amilasa o glucoamilasa y detectar una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción.

La divulgación provee métodos para manipulación genética de la célula completa de fenotipos nuevos o modificados usando análisis de flujo metabólico en tiempo real; el método comprende las siguientes etapas: (a) elaborar una célula modificada mediante la modificación de la composición genética de una célula, en donde la composición genética es modificada por la adición a la célula de un ácido nucleico de la divulgación; (b) cultivar la célula modificada para generar una pluralidad de células modificadas; (c) medir al menos un parámetro metabólico de las célula mediante el control del cultivo celular de la etapa (b) en tiempo real; y, (d) analizar los datos de la etapa (c) para determinar si el parámetro medido difiere de una medición comparable en una célula no modificada bajo condiciones similares, identificando de este modo un fenotipo modificado por ingeniería genética en la célula usando análisis de flujo metabólico en tiempo real. En un aspecto, la composición genética de las células puede ser modificada por medio de un método que comprende la supresión de una secuencia o modificación de una secuencia en la célula, o inactivación de la expresión de un gen. En un aspecto, el método puede comprender, además, seleccionar una célula que comprende un fenotipo recientemente modificado por ingeniería genética. En otro aspecto, el método puede comprender cultivar la célula seleccionada, generando de este modo una nueva cepa celular que comprende un fenotipo recientemente modificado por ingeniería genética.

La invención provee métodos para hidrolizar un polisacárido, oligosacárido o almidón, que comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tenga actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención; (b) proveer una composición que comprende un polisacárido, oligosacárido o almidón; y

(c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza al polisacárido, oligosacárido o almidón. En un aspecto, la composición que comprende al polisacárido, oligosacárido o almidón, que comprende un enlace α-1,4-glucosídico o un enlace α-1,6-glucosídico.

La invención provee métodos para licuar o remover un polisacárido, oligosacárido o almidón, de una composición que comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención; (b) proveer una composición que comprende un polisacárido, oligosacárido o almidón; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido remueve o licua el polisacárido, oligosacárido o almidón.

La divulgación provee métodos para incrementar la termotolerancia o termoestabilidad de un polipéptido de amilasa, el método comprendiendo la glicosilación de un polipéptido de amilasa o glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende al menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido de la divulgación; o un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico de la divulgación, incrementando de este modo la termotolerancia o termoestabilidad del polipéptido de amilasa o glucoamilasa. En un aspecto, la actividad específica de amilasa o glucoamilasa puede ser termoestable o termotolerante a una temperatura en el rango de más de aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 95 °C.

La divulgación provee métodos para sobreexpresar un polipéptido recombinante de amilasa o glucoamilasa en una célula que comprende expresar un vector que comprende un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de la divulgación o una secuencia de ácido nucleico de la divulgación, en donde las identidades de secuencia se determinan por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual, en donde la sobreexpresión se efectúa mediante el uso de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico o por amplificación génica del vector.

La invención provee composiciones detergentes que comprende un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, en donde el polipéptido comprende actividad de glucoamilasa. En un aspecto, la glucoamilasa puede ser una glucoamilasa de superficie no activa. En otro aspecto, la glucoamilasa puede ser una glucoamilasa de superficie activa.

La invención provee métodos para lavar un objeto que comprende las siguientes etapas: (a) proveer una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende: un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proveer un objeto; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el objeto de la etapa (b) bajo condiciones en donde la composición puede lavar al objeto.

La invención provee métodos para hidrolizar un polisacárido, oligosacárido o almidón, por ejemplo, en un pienso o alimento antes del consumo por parte de un animal, que comprende las siguientes etapas: (a) obtener una composición, por ejemplo, un material para pienso, que comprende un polisacárido, oligosacárido o almidón, en donde el polipéptido comprende: un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; y (b) agregar el polipéptido de la etapa (a) a la composición, por ejemplo, al material alimenticio o del pienso, en una cantidad suficiente durante un período de tiempo suficiente para causar la hidrólisis del polisacárido, oligosacárido o almidón, hidrolizando de este modo al polisacárido, oligosacárido o almidón. En un aspecto, el pienso o el alimento comprenden arroz, maíz, cebada, trigo, legumbres, o patata.

Por ejemplo, en una forma de realización, la divulgación provee composiciones que comprenden una combinación de una amilasa y una glucoamilasa (donde una o amabs de estas enzimas es una enzima de esta divulgación) para la hidrólisis de un polisacárido, oligosacárido o almidón, por ejemplo, almidón de maíz, arroz, cebada, trigo, legumbres, o patata. En un aspecto, la carga de enzima para una combinación de una amilasa y una glucoamilasa comprende una proporción de 1:10 de amilasa:glucoamilasa; en donde en una forma de realización, una carga de enzima total está entre 0,015% -0,0255% de enzima necesaria para hidrolizar completamente 33% de una harina, por ejemplo, una harina de maíz. Los ejemplos de rangos alternativos para carga son de aproximadamente 0,01% (p/p) para hidrólisis de 23% de almidón de maíz purificado y entre 0,015% -0,2% (p/p) para hidrólisis de almidón de maíz en 33% de harina de maíz.

La invención provee métodos para desencolado textil que comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proveer una textil; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el textil de la etapa (b) bajo condiciones en donde la glucoamilasa puede desencolar el textil.

La invención provee métodos para desentintar papel o fibras que comprenden las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención;

(b) proveer una composición que comprende papel o fibra; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido puede desentintar el papel o la fibra.

La invención provee métodos para tratamiento de fibras lignocelulósicas que comprenden las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención; (b) proveer una fibra lignocelulósica; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la fibra de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido puede tratar la fibra, mejorando de este modo las propiedades de la fibra.

La invención provee métodos para producir un jarabe de alto contenido de maltosa o alto contenido de glucosa que comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende una enzima de la invención; (b) proveer una composición que comprende un polisacárido, oligosacárido o almidón; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el textil de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido de la etapa (a) puede licuar la composición de la etapa (b) produciendo de este modo un hidrolizado de polisacárido, oligosacárido o almidón soluble, y hidrolizar y sacarificar el polisacárido, oligosacárido o almidón soluble, y produciendo así el hidrolizado el jarabe. En un aspecto, el almidón puede ser de arroz, maíz, cebada, trigo, legumbres, patata o batata.

La invención provee métodos para mejorar el flujo de los fluidos de producción que comprenden polisacárido, por ejemplo, que contienen almidón, que comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención; (b) proveer fluido de producción; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el fluido de producción de la etapa (b) bajo condiciones en donde la glucoamilasa puede hidrolizar el polisacárido, oligosacárido o almidón, en el fluido de producción y mejorando así su flujo al reducir su densidad. En un aspecto, el fluido de producción puede ser de una formación subterránea.

La invención provee composiciones antienranciamiento que comprenden un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La divulgación provee métodos para prevenir el enranciamiento de los productos horneados que comprenden las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención; (b) proveer una composición que contiene un polisacárido, oligosacárido o almidón, usado para hornear productos; (c) combinar el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido puede hidrolizar el polisacárido, oligosacárido o almidón, en la composición usada para hornear previniendo así el enranciamiento del producto horneado. En un aspecto, el producto horneado puede ser pan.

La invención provee métodos para usar una glucoamilasa en la elaboración de cerveza o producción de alcohol que comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención; (b) proveer una composición que contiene un polisacárido, oligosacárido o almidón y usarlo para elaboración de cerveza o en la producción del alcohol; (c) combinar el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido puede hidrolizar el polisacárido, oligosacárido o almidón, en la composición usada para elaboración de cerveza o en la producción de alcohol. En un aspecto, la composición que contiene un polisacárido, oligosacárido o almidón, puede ser cerveza.

La divulgación provee métodos para la elaboración de una planta transgénica que comprende las siguientes etapas:

(a): introducir una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la célula, en donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga comprende una secuencia de ácido nucleico de la divulgación, produciendo de este modo una célula vegetal trasformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada. En un aspecto, la etapa

(a): puede comprender, además, introducir la secuencia de ácido nucleico heteróloga por electroporación o microinyección de protoplastos de células vegetales. En otro aspecto, la etapa (a) puede comprender además la introducción de la secuencia de ácido nucleico heteróloga directamente al tejido vegetal por bombardeo de partículas de ADN. En forma alternativa, la etapa (a) puede comprender además la introducción de la secuencia de ácido nucleico heteróloga en el ADN de la célula vegetal usando un huésped de Agrobacterium tumefaciens. En un aspecto, la célula vegetal puede ser una célula de patata, maíz, arroz, trigo, tabaco o cebada.

La divulgación provee métodos para expresar una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula vegetal que comprende las siguientes etapas: (a) transformar la célula vegetal con una secuencia de ácido nucleico heteróloga enlazada operativamente a un promotor, en donde la secuencia heteróloga de ácido nucleico comprende un ácido nucleico de la divulgación; (b) cultivar la planta bajo condiciones en donde la secuencia heteróloga de ácido nucleico se expresa en la célula vegetal.

La divulgación también provee un proceso para preparar una masa o un producto horneado preparado a partir de la masa que comprende agregar una amilasa o glucoamilasa de la divulgación a la masa en una cantidad que sea efectiva para retrasar el enranciamiento del pan. La divulgación también provee una masa que comprende dicha amilasa o glucoamilasa y una premezcla que comprende harina junto con dicha amilasa o glucoamilasa. Finalmente, la divulgación provee un aditivo enzimático para horneado, que contiene dicha amilasa o glucoamilasa. El uso de la glucoamilasa de acuerdo con la presente invención provee un efecto antienranciamiento mejorado como el medido, por ejemplo, mediante menos firmeza de la miga, reteniendo la elasticidad de la miga, mejor capacidad de rebanado (por ejemplo, menos migas, miga no gomosa), mejor gusto o sabor.

Las composiciones que comprenden enzimas de la invención (por ejemplo, que comprenden los polipéptidos, ácidos nucleicos de esta invención) se pueden formular en una variedad de formas, por ejemplo, como líquidos, geles, píldoras, tabletas, aerosoles, polvos, alimento, pellas de pienso o formas encapsuladas, que incluyen formas nanoencapsuladas. Cualquiera de estas formas de realización puede ser diseñada o formulada de manera adicional como composiciones de liberación retardada o "liberación controlada".

La invención provee composiciones de liberación retardada ("liberación controlada") que comprenden un ingrediente deseado recubierto por un revestimiento de polímero de látex (o equivalente). En un aspecto, el ingrediente deseado comprende una enzima, por ejemplo, una enzima de la invención. En un aspecto, una composición recubierta comprende un fármaco o composición farmacéutica. En un aspecto, el ingrediente deseado comprende una molécula pequeña, un fármaco, un polisacárido, un Iípido, un ácido nucleico, una vitamina, un antibiótico o un insecticida. En un aspecto, el ingrediente deseado comprende una pella o una matriz, por ejemplo, una pella o una matriz que comprende un material comestible (por ejemplo, como alimento o pienso animal, o suplemento o medicamento). La divulgación también provee métodos para la "liberación controlada" o "liberación retardada" de una composición, en donde la composición es recubierta por un revestimiento de polímero de látex (o equivalente).

En un aspecto, el revestimiento de polímero de látex comprende una pintura de látex, o equivalente. El revestimiento de polímero de látex puede comprender un (met)acrilato, un acetato de vinilo, un estireno, un etileno, un cloruro de vinilo, un butadieno, un cloruro de vinilideno, un versatato de vinilo, un propionato de vinilo, un acrilato de t-butilo, un acrilonitrilo, un neopreno, un maleato, un fumarato, equivalentes de los mismos, combinaciones de los mismos y/o derivados de los mismos.

La divulgación provee métodos para la liberación retardada o liberación controlada de una composición que comprende: (i) (a) proveer una composición y, proveer un revestimiento de polímero de látex; y (b) recubrir la composición con el revestimiento de polímero de látex; (ii) el método de (i), en donde la composición comprende un fármaco o composición farmacéutica; o (iii) el método de (i) o (ii), en donde la composición comprende o consiste del polipéptido de la divulgación, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la divulgación.

La invención provee fluidos para perforación de pozos petrolíferos que comprenden los polipéptidos de la invención. La invención provee métodos para cambiar la viscosidad de una composición que comprenden: (i) (a) proveer una composición y un polipéptido de la invención y, proveer una composición; y (b) tratar la composición con un polipéptido de la invención; o (ii) el método de (i), en donde la composición comprende un suelo o lodo de perforación.

La divulgación provee métodos para ayudar a llevarse el lodo de perforación que comprende: (a) proveer una composición y un polipéptido de la divulgación y un lodo de perforación; y (b) tratar el lodo de perforación con una composición que comprende un polipéptido de la divulgación.

La invención provee soluciones para bioblanqueamiento que comprenden un polipéptido de la invención. La invención provee métodos para bioblanqueamiento de una composición que comprende: (i) (a) proveer una composición y un polipéptido de la invención; y (b) tratar la composición con un polipéptido de la invención; o (ii) el método de (i), en donde la composición es un producto de papel o pulpa.

La invención provee métodos para elaborar un combustible que comprende: (i) (a) proveer un polipéptido de la invención; (b) proveer una composición que comprende un polisacárido, oligosacárido o almidón; y (c) poner en contacto el polipéptido de (a) con la composición de (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza el polisacárido, oligosacárido o almidón; o (ii) el método de (i) en donde el polipéptido es una enzima termoestable; (iii) el método de (i) en donde el combustible está basado en etanol.

La invención provee desinfectantes que comprenden un polipéptido de la invención.

La invención provee agentes de biodefensa o biodesintoxicación que comprenden un polipéptido de la invención.

La invención provee productos lácteos que comprenden un polipéptido de la invención.

La invención provee métodos para procesar un material de biomasa que comprende lignocelulosa que comprenden

(i): (a) proveer una composición que comprende un polipéptido de la invención y, proveer un material de biomasa; y

(b): poner en contacto la composición que comprende un polipéptido de la invención, con el material de biomasa; (ii) el método de (i), en donde el material de biomasa comprende o se deriva de un cultivo agrícola, o es un subproducto de un alimento o de la producción de pienso, o es un producto de desecho Iignocelulósico, o es un residuo vegetal o un papel desechable o un producto de papel desechable; (iii) el método de (i) o (ii), en donde el polipéptido tiene actividad que comprende actividad de glucoamilasa; (iv) el método de cualquiera de (ii), en donde el residuo vegetal comprende tallos, hojas, cáscaras, cortezas, mazorcas, madera, astillas de madera, pulpa de madera y aserrín, o, el residuo de papel comprende papel de fotocopia usado o descartado, papel para impresión por ordenador, papel de cuadernos, papel de anotadores, papel de mecanografía, diarios, revistas, cartulina y materiales de embalaje con base en papel; o (v) el método de (i) a (iv), en donde el procesamiento del material de biomasa genera un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiesel; (vi) el método de (i) a (v), en donde el material de biomasa comprende una lignocelulosa.

La invención provee materiales de biomasa que comprenden un polipéptido de la invención.

La invención provee métodos para elaborar bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiesel que comprenden: (i)

(a) proveer un polipéptido de la invención, y, proveer una composición que comprende un polisacárido o oligosacárido; y (b) poner en contacto la composición que comprende un polisacárido u oligosacárido con un polipéptido de la invención; (ii) el método de (i), en donde la composición que comprende un polisacárido o oligosacárido comprende una planta, producto vegetal o derivado vegetal; (iii) el método de (ii), en donde la planta o producto vegetal comprende plantas o productos vegetales de caña de azúcar, remolacha o remolacha azucarera, trigo, maíz, soja, patata, arroz o cebada; (iv) el método de cualquiera de (i) a (iii), en donde el polipéptido tiene actividad que comprende una actividad de glucoamilasa; o (v) el método de cualquiera de (i) a (iv), en donde el polisacárido u oligosacárido comprende un azúcar fermentable.

La invención provee métodos para elaborar un combustible que comprende (i) (a) proveer un polipéptido de la invención y, proveer una composición que comprende un azúcar fermentable; y (b) poner en contacto la composición que comprende un azúcar fermentable con un polipéptido de la invención; (ii) el método de (i), en donde la composición que comprende un azúcar fermentable comprende una planta, producto vegetal o derivado vegetal; (iii) el método de (ii), en donde la planta o producto vegetal comprende plantas o productos vegetales de caña de

azúcar, remolacha o remolacha azucarera, trigo, maíz, soja, patata, arroz o cebada; (iv) el método de cualquiera de

(i) a (iii), en donde el polipéptido tiene actividad que comprende una actividad de glucoamilasa; o (v) el método de cualquiera de (i) a (iv), en donde el combustible comprende un bioetanol o una mezcla de gasolina-etanol, o comprende un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiesel.

La divulgación provee combustibles que comprenden (a) un polipéptido de la divulgación; (b) el combustible de (a), en donde el polipéptido tiene actividad que comprende amilasa, glucoamilasa, glucosidasa, por ejemplo actividad de alfa-glucosidasa o beta-glucosidasa; (c) el combustible de (a) o (b), en donde el combustible deriva de un material vegetal, o el combustible se deriva de una patata, soja (semilla oleaginosa), cebada, centeno, maíz, avena, trigo, remolacha o caña de azúcar; o (d) el combustible de cualquiera de (a) a (c), en donde el combustible comprende un bioetanol o una mezcla de gasolina-etanol, o comprende un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiesel.

La invención provee métodos para producir un azúcar (por ejemplo, un monosacárido); el método comprendiendo: (i)

(a): proveer al menos un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa; (b) proveer una composición que comprende un polisacárido o un oligosacárido; y (c) poner en contacto la composición de la etapa (b) con el polipéptido de la etapa (a), y así generar azúcares; (ii) el método de (i), en donde la composición que comprende un polisacárido o un oligosacárido comprende un almidón; (iii) el método de cualquiera de (i) o (ii), en donde el polisacárido, oligosacárido y/o azúcar comprende o es un azúcar fermentable; (iv) el método de cualquiera de (i), (ii),

: o (iii), que comprende además fermentar el azúcar para producir un alcohol; o (v) el método de (iv), en donde el alcohol es un etanol, propanol o butanol.

Los detalles de una o más formas de realización de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción que viene a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos y de las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema de cómputo.

La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso para comparar una nueva secuencia de nucleótido o proteína con una base de datos de secuencias a fin de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos.

La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso en un ordenador para determinar si dos secuencias son homólogas.

La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia.

La Figura 5 ilustra un ejemplo de un método de la invención para sacarificación por Iicuefacción, como se discute en detalle a continuación.

La Figura 6 ilustra un ejemplo de un proceso de molienda de maíz en húmedo de la invención usando al menos una enzima de la invención, como se discute en detalle a continuación.

La Figura 7, Figura 8 y Figura 9 ilustran ejemplos de métodos de procesamiento de un polisacárido, por ejemplo, almidón (por ejemplo, procesos industriales), como se discute en detalle a continuación.

La Figura 10 y la Figura 11 ilustran la influencia del pH en el rango de entre aproximadamente pH 3,5 a 6,0 sobre la hidrólisis de almidón para siete (7) glucoamilasas y dos (2) amilasas de esta divulgación, como se discute en detalle a continuación.

La Figura 12 ilustra cómo las enzimas de la invención se pueden usar en la producción de etanol a partir de maíz mediante molienda en seco, incluyendo su uso tanto en "procesos convencionales" como en los "procesos simultáneos de Iicuefacción, sacarificación y fermentación", como se discute en detalle a continuación.

La Figura 13, la Figura 14, la Figura 15, la Figura 16, la Figura 17, la Figura 18, la Figura 19 y la Figura 20, ilustran comparaciones de velocidad de ejemplos de enzimas de la divulgación en diferentes reguladores de almacenamiento, como se discute en detalle en el Ejemplo 1, a continuación.

La Figura 21 ilustra un SDS PAGE que muestra los resultados de proteólisis del ejemplo de la enzima de la SEQ ID NO: 52 mediante pepsina; y la Figura 22 ilustra la caracterización de los péptidos generados en esta digestión con pepsina de la SEQ ID NO: 52; y la Figura 23A ilustra el esquema de aislamiento del péptido pequeño usado para los

péptidos generados por la proteólisis de la SEQ ID NO: 52 mediante pepsina; La Figura 23B ilustra un SDS PAGE de los resultados del esquema de aislamiento del péptido pequeño; la Figura 23C ilustra el perfil de LC/MS de la fracción eluida C18 RP; la Figura 23D ilustra la secuencia de los péptidos identificados por el análisis de LC MS/MS; la Figura 23E y la Figura 23F ilustran los sequins (motivos) “Asn-Xaa-Ser/Thr" en la producción de la secuencia (resaltados en azul); las asparaginas que se predice que están N-glicosiladas están resaltadas en rojo, como se discute en detalle en el Ejemplo 22, a continuación.

La Figura 24 ilustra la Tabla 1, que resume los datos que comparan la velocidades iniciales de hidrólisis del almidón de maíz granulado y del almidón soluble (dextrina) mediante ejemplos de enzimas de la divulgación y una enzima glucoamilasa de A. niger como punto de referencia, como se discute en detalle en el Ejemplo 23, a continuación.

La Figura 25 ilustra el efecto de la temperatura sobre la actividad del ejemplo de glucoamilasa de la SEQ ID NO: 20 y la enzima como "punto de referencia" de A. niger con almidón soluble (dextrina) como sustrato, como se discute en detalle en el Ejemplo 23, a continuación.

La Figura 26 ilustra las tablas que resumen la eficiencia de los protocolos de purificación de la enzima de ejemplo sobre las enzimas seleccionadas de esta divulgación y los correspondientes datos de actividad sobre, entre otros, el almidón sin purificar y almidón soluble comparando la enzima purificada y no purificada, como se discute en detalle en el Ejemplo 18, a continuación.

La Figura 27 ilustra la base teórica del procedimiento de ensayo de α-amilasa CERALFAMR, como se discute en detalle en el Ejemplo 27, a continuación.

La Figura 28A muestra los datos que demuestran el efecto de la temperatura sobre la actividad de por ejemplo, un ejemplo de glucoamilasa de la divulgación con almidón granulado como sustrato, como se discute en detalle en el Ejemplo 29, a continuación.

La Figura 28B muestra los datos que demuestran el efecto de la temperatura sobre la actividad de por ejemplo, un ejemplo de glucoamilasa de la invención con almidón soluble (dextrina) como sustrato, como se discute en detalle en el Ejemplo 29, a continuación.

La Figura 29A muestra los datos que demuestran el efecto del pH sobre la actividad de por ejemplo, un ejemplo de glucoamilasa de la divulgación con almidón granulado como sustrato, como se discute en detalle en el Ejemplo 29, a continuación.

La Figura 29B muestra los datos que demuestran el efecto del pH sobre la actividad de por ejemplo, un ejemplo de glucoamilasa de la invención con almidón soluble (dextrina) como sustrato, como se discute en detalle en el Ejemplo 29, a continuación.

La Figura 30 muestra los datos que demuestran el efecto de la temperatura sobre la hidrólisis de almidón por las αamilasas caracterizadas, como se discute en detalle en el Ejemplo 29, a continuación.

La Figura 31A muestra los datos que demuestran el efecto del pH sobre la actividad de los ejemplos de α-amilasas y/o glucoamilasas de la invención con almidón granulado como sustrato, como se discute en detalle en el Ejemplo 29, a continuación.

La Figura 31B muestra los datos que demuestran el efecto del pH sobre la actividad de los ejemplos de α-amilasas y/o glucoamilasas de la invención con almidón soluble como sustrato, como se discute en detalle en el Ejemplo 29, a continuación.

Símbolos de referencia iguales en las diferentes figuras indican elementos iguales.

Descripción detallada

La divulgación provee enzimas amilasa, por ejemplo alfa amilasas. polinucleótidos que codifican las enzimas, métodos para elaborar y usar estos polinucleótidos y polipéptidos. La invención está dirigida a polipéptidos novedosos que tienen actividad de glucoamilasa, ácidos nucleicos que los codifican. Los polipéptidos de la invención pueden ser usados en una variedad de contextos de diagnóstico, terapéutico, e industriales. Los polipéptidos de la invención se pueden usar, por ejemplo, como un aditivo para un detergente, para procesar alimentos y para síntesis química utilizando una reacción inversa. Adicionalmente, los polipéptidos de la invención pueden ser usados en el tratamiento de textiles, producción de alcohol y como aditivos para alimentos o pienso animal.

En un aspecto, la glucoamilasa de la invención es activa a alta y/o baja temperatura, o en un amplio rango de temperatura. Por ejemplo, puede ser activa en las temperaturas que oscilan entre 20 °C y 90 °C, entre 30 °C y 80 °C, o entre 40 °C y 70 °C. En aspectos alternativos, la glucoamilasa de la invención pueden tener actividad en pH ácidos tan bajos como pH 5,5, pH 5,0, pH 4,5, pH 4,0 y pH 3,5. En aspectos alternativos, la glucoamilasa de la invención pueden tener actividad en pH alcalinos tan altos como pH 8, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 y pH 11. En un aspecto, la glucoamilasa de la invención es activa en el rango de temperatura de entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 70 °C bajo condiciones de baja actividad en agua (bajo contenido de agua). Por ejemplo, la invención provee glucoamilasas, con la capacidad de hidrolizar un polisacárido, oligosacárido o almidón, por ejemplo, un almidón granulado (inclusive almidón granulado sin purificar), a bajas temperaturas, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 30 ºC a 40 ºC; a bajo pH, por ejemplo, en el rango de aproximadamente pH 3,5 a pH 6,0; y, a bajas temperaturas y bajo pH, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 30 ºC a 40 °C y a bajo pH en el rango de aproximadamente pH 3,5 a pH 6,0.

La divulgación también provee métodos para modificar adicionalmente las amilasas y/o glucoamilasas de ejemplo de la divulgación para generar proteínas con propiedades deseables. Por ejemplo, las amilasas generadas por los métodos de la divulgación pueden tener actividad enzimática, estabilidad térmica, pH/ perfil de actividad, pH/perfil de estabilidad (tal como mayor estabilidad a valores de pH bajos, por ejemplo pH<6 o pH<5, o altos, por ejemplo pH>9), estabilidad a la oxidación, dependencia de Ca2+, actividad específica alterados y similares. La divulgación permite alterar cualquier propiedad de interés. Por ejemplo, la alteración puede resultar en una variante que, comparada con una enzima madre, tiene perfiles de actividad enzimática alterada, o de actividad de pH o temperatura alterados.

Generación y manipulación de ácidos nucleicos

En un aspecto, la invención provee ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 98%, 99%, o más, o identidad de secuencia completa (100%) con un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa.

Los ácidos nucleicos (inclusive oligonucleótidos), polipéptidos o proteínas “sintéticos” de la invención incluyen aquellos preparados mediante cualquier síntesis química, por ejemplo, como se describe a continuación. Las frases "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" incluyen oligonucleótidos, nucleótidos, polinucleótidos, o un fragmento de cualquiera de los mismos, ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt) de origen genómico, recombinante o sintético que pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden representar una hebra sentido o antisentido, para el ácido nucleico peptídico (PNA), o para cualquier material del tipo ADN o ARN, de origen natural

o sintético, incluyendo, por ejemplo, ARNi tal como ARNmi o ARNsi, ribonucleoproteínas (por ejemplo, iRNP). El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras del tipo de ácido nucleico con estructuras sintéticas, véase por ejemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189 -197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692 8698; Samstag (1996) Antisense Nucieic Acid Drug Dev 6: 153 -156.

La invención provee ácidos nucleicos “recombinantes” y sintéticos que pueden incluir ácidos nucleicos adyacentes al ácido nucleico "estructural" al cual no es adyacente en su ambiente natural. En un aspecto, los ácidos nucleicos representan el 5% o más del número de insertos de ácido nucleico en una población de "moléculas estructurales" de ácido nucleico. Las “moléculas estructurales" de acuerdo con la invención incluyen ácidos nucleicos tales como vectores de expresión, ácidos nucleicos de autorreplicación, virus, ácidos nucleicos integradores y otros vectores o ácidos nucleicos usados para mantener o manipular un inserto de ácido nucleico de interés. En un aspecto, los ácidos nucleicos enriquecidos representan el 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más del número de insertos de ácido nucleico en la población de moléculas estructurales recombinantes. Los polipéptidos o proteínas "recombinantes" se refieren a los polipéptidos o proteínas producidos por técnicas de ADN recombinante; por ejemplo, producidos a partir de células transformadas por un constructo de ADN exógeno que codifica el polipéptido o proteína deseados.

“Oligonucleótido” incluye ya sea un polidesoxinucleótido monocatenario o dos cadenas de polidesoxinucleótido complementarias, que pueden ser sintetizadas químicamente (es decir, como ácidos nucleicos sintéticos). En formas de realización alternativas, los ácidos nucleicos y oligonucleótidos sintéticos de la invención no tienen fosfato 5' y, por lo tanto, no se ligan a otro oligonucleótido sin agregar un fosfato con ATP en presencia de una quinasa. En formas de realización alternativas, un oligonucleótido sintético se puede ligar a un fragmento que no ha sido desfosforilado.

El término "gen" incluye una secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento de ADN involucrado en la producción de un producto de transcripción (por ejemplo, un mensaje), que a su vez es traducido para producir una cadena de polipéptido, o regula la transcripción, reproducción o estabilidad génica. Los genes pueden incluir regiones precedentes o posteriores a la región codificadora, tales como guías y remolque, promotores y

potenciadores, así como también, donde sea aplicable, secuencias de intervinientes (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones).

La invención provee ácidos nucleicos aislados y recombinantes, incluyendo casetes de expresión tales como vectores de expresión que codifican los polipéptidos de la invención. La divulgación provee sondas que comprenden

o consisten de los ácidos nucleicos de la divulgación. La divulgación también incluye métodos para descubrir nuevas secuencias de amilasa usando los ácidos nucleicos de la divulgación. La divulgación también incluye métodos para inhibir la expresión de genes de amilasa, transcriptos y polipéptidos usando los ácidos nucleicos de la divulgación. También se proveen métodos para modificar los ácidos nucleicos de la divulgación, por ejemplo, mediante reensamblaje de ligación sintética, sistema de evolución dirigida optimizada y/o mutagénesis de saturación del sitio génico (GSSM).

Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser elaborados, aislados y/o manipulados, por ejemplo, mediante clonación y expresión de bibliotecas de ADNc, amplificación de ADN mensajero o genómico por PCR y similares. AI llevar a la práctica los métodos de la divulgación, se pueden modificar los genes homólogos mediante manipulación de un ácido nucleico plantilla, como se describe aquí. La invención se puede llevar a la práctica junto con cualquier método o protocolo o dispositivo conocidos en el arte, que se describen en la literatura científica y de patentes.

Técnicas generales

Los ácidos nucleicos usados para llevar a la práctica esta invención, ya sea ARN, ARNi, ácido nucleico antisentido, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o híbridos de los mismos, pueden ser aislados a partir de una variedad de fuentes, modificadas genéticamente, amplificados, y/o expresados / generados de forma recombinante. Los polipéptidos recombinantes generados a partir de estos ácidos nucleicos pueden ser aislados o clonados en forma individual y evaluados en cuanto a una actividad deseada. Se puede usar cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo sistemas de expresión de células de bacterianas, de mamífero, levadura, insecto o planta.

La divulgación provee métodos para optimizar enzimas de amilasa y secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas, por ejemplo, elaborando “variantes de secuencias", que comprenden el uso de secuencias de la invención usando, por ejemplo, "mutagénesis de saturación" o "GSSM" (incluye un método que usa cebadores de oligonucleótidos degenerados para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido, como se describe en detalle a continuación); "sistema de evolución dirigida optimizada" o “evolución dirigida optimizada" (incluye un método para reensamblar fragmentos de secuencias de ácido nucleico relacionadas, por ejemplo, genes relacionados y que se explican en detalle a continuación) y/o “reensamblaje de ligación sintética" o "SLR" (incluye un método para ligar fragmentos de oligonucleótidos en forma no estocástica y que se explican en detalle, a continuación). “Variante” incluye polinucleótidos o polipéptidos de la divulgación modificados en uno o más pares de bases, codones, intrones, exones, o residuos de aminoácidos (respectivamente) que aún retienen la actividad biológica de una amilasa y/o glucoamilasa de la invención. Las variantes pueden ser producidas por cualquier cantidad de medios, incluyendo métodos tales como, por ejemplo, PCR propensa a error, arrastre, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casetes, mutagénesis de ensamblaje recursivo, mutagénesis de ensamblaje exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje génico, GSSM y cualquier combinación de los mismos. En la presente invención se proveen técnicas para producir variantes de amilasa que tienen actividad a un pH o temperatura, por ejemplo, que es diferente de un ejemplo de enzima de esta divulgación, o una amilasa de tipo silvestre.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser completa o parcialmente sintéticos y, en aspectos alternativos, pueden ser sintetizados in vitro mediante técnicas conocidas de síntesis química, como se describe, por ejemplo, en Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3440 -3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373 -380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886 -7896; Narang (1979) Meth. Enzymol.

68: 90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; patente de los Estados Unidos No. 4.458.066.

Las técnicas para manipulación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, subclonación, sondas de marcación (por ejemplo, marcación aleatoria de cebadores usando polimerasas Klenow, traducción de muesca, amplificación), secuenciación, hibridación y similares, están bien descritas en la literatura científica y de patentes, véase, por ejemplo, Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Current Protocols ln Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, lnc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).

Otros medios útiles para obtener y manipular ácidos nucleicos usados para llevar a la práctica los métodos de la invención consisten en clonar muestras genómicas y, si se desea, cribar y clonar nuevamente los insertos aislados o amplificados, por ejemplo, de clones genómicos o clones de ADNc. Las fuentes de ácido nucleico usadas en los métodos de la invención incluyen bibliotecas genómicas o de ADNc contenidas, por ejemplo, en cromosomas artificiales de mamíferos (MAC), véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.721.118; 6.025.155;

cromosomas artificiales humanos, véase, por ejemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15: 333 -335; cromosomas artificiales de levaduras (YAC); cromosomas artificiales bacterianos (BAC); cromosomas artificiales P1, véase, por ejemplo, Woon (1998) Genomics 50: 306 -316; vectores derivados de P1 (PAC), véase, por ejemplo, Kern (1997) Biotechniques 23: 120 -124; cósmidos, virus recombinantes, fagos o plásmidos.

En un aspecto, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la divulgación es ensamblado en fase apropiada con una secuencia guía capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o un fragmento del mismo.

La divulgación provee proteínas de fusión y ácidos nucleicos que las codifican. Un polipéptido de la divulgación puede ser fusionado con un péptido o polipéptido heterólogo, tal como péptidos de identificación del terminal N que imparten las características deseadas, tales como mayor estabilidad o purificación simplificada. Los péptidos y polipéptidos de la divulgación también pueden ser sintetizados y expresados como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales ligados a los mismos, por ejemplo, para producir un péptido más inmunogénico, para aislar más rápidamente un péptido sintetizado de manera recombinante, para identificar y aislar anticuerpos y células B que expresan anticuerpos, y similares. Los dominio que facilitan la detección y purificación incluyen, por ejemplo, péptidos quelantes de metal tales como tractos de polihistidina y módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión / afinidad FLAGS (lmmunex Corp, Seattle, WA). La inclusión de secuencias de enlace que pueden ser escindidas tales como el Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre un dominio de purificación y el péptido o polipéptido que comprende el motivo para facilitar la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica el epítopo enlazada a seis residuos de histidina seguido por una tiorredoxina y un sitio de escisión de enteroquinasa (véase por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787 -1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404 -414). Los residuos de histidina facilitan la detección y la purificación mientras que el sitio de escisión de enteroquinasa provee un medio para purificar el epítopo del resto de la proteína de fusión. La tecnología relacionada con los vectores que codifican las proteínas de fusión y la aplicación de las proteínas de fusión se describen bien en la literatura científica y de patentes, véase por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell Biol.,12: 441 -53.

Secuencias de control de transcripción y traducción

La invención provee secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) de la invención enlazadas en forma operativa a la(s) secuencia(s) de control de expresión (por ejemplo, de transcripción o de traducción), por ejemplo, promotores

o potenciadores, para dirigir o modular la síntesis/expresión de ARN. Los promotores que se usan para la práctica de estga invención incluyen todas las secuencias capaces de dirigir la transcripción de una secuencia codificadora en una célula, por ejemplo, una célula vegetal. Por lo tanto, los promotores usados en los constructos de esta invención incluyen elementos de control de transcripción que actúan de forma cis y secuencias reguladoras que están implicadas en la regulación o modulación de la duración y/o velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor usado en la práctica de esta invención puede ser un elemento de control de la transcripción que actúa de forma cis, incluyendo un potenciador, un promotor, un terminador de la transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración de cromosomas, regiones no traducidas 5' y 3', o una secuencia intrónica, que participan en la regulación de la transcripción. Estas secuencias que actúan de forma cis por lo general interactúan con las proteínas u otras biomoléculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción. Los promotores "constitutivos" usados en la práctica de esta invención pueden ser aquellos que dirigen la expresión de manera continua bajo la mayoría de las condiciones y estados ambientales de desarrollo o diferenciación celular. Los promotores usados para la práctica de esta invención pueden ser promotores "inducibles" o "regulables" que dirigen la expresión del ácido nucleico de la invención bajo la influencia de condiciones ambientales o condiciones de desarrollo. Los ejemplos de las condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción mediante promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, sequía, o la presencia de luz.

En una forma de realización, una secuencia promotora puede estar “operativamente enlazada a" una secuencia codificadora de la invención, por ejemplo, cuando la ARN polimerasa que inicia la transcripción en el promotor transcribirá la secuencia codificadora en ARNm.

Los promotores usados para la práctica de esta invención incluyen promotores "específicos del tejido", que son elementos de control de la transcripción que solamente son activos en células, tejidos u órganos particulares, por ejemplo, en plantas o animales. La regulación específica del tejido puede ser lograda mediante ciertos factores intrínsecos que aseguran que los genes que codifican proteínas específicas para un determinado tejido sean expresados. Se sabe que dichos factores existen en mamíferos y plantas a fin de permitir que los tejidos específicos se desarrollen.

La(s) secuencia(s) de control de expresión usados para la práctica de esta invención pueden estar en un vector de expresión. Los ejemplos de promotores bacterianos incluyen lacl. lacZ, T3, T7, gpt, Iambda PR, µL y trp. Los ejemplos de promotores eucariotas incluyen al promotor inmediato temprano del CMV, la timidina quinasa del HSV, temprano y tardío del SV40, LTR de retrovirus y metalotioneína l de ratón. Los promotores adecuados para expresar

un polipéptido en las bacterias incluyen los promotores Iac o trp de E. coli, el promotor Iacl, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor lambda PR. el promotor lambda µL, promotores de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), y el promotor de fosfatasa ácida. Los promotores eucariotas incluyen al promotor inmediato temprano del CMV, al promotor de timidina quinasa del HSV, promotores de choque térmico, al promotor temprano y tardío del SV40, LTR de retrovirus y al promotor de metalotioneína-l de ratón. También se pueden usar otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas y eucariotas o sus virus.

Promotores vegetales específicos del tejido

La invención provee casetes de expresión que pueden ser expresados en una forma específica del tejido, por ejemplo, que pueden expresar una glucoamilasa de la invención en una forma específica del tejido. La invención también provee plantas o semillas que expresan una glucoamilasa de la invención en una forma específica del tejido. La especificidad del tejido puede ser específica de la semilla, específica del tallo, específica de la hoja, específica de la raíz, específica del fruto, y similares.

En un aspecto, un promotor constitutivo tal como el promotor 35S del CaMV puede ser usado para expresión en partes específicas de la planta o la semilla, o en toda la planta. Por ejemplo, para sobreexpresión, se puede emplear un fragmento del promotor vegetal que dirigirá la expresión de un ácido nucleico en algunos o en todos los tejidos de una planta, por ejemplo, una planta regenerada. Dichos promotores son denominados aquí promotores "constitutivos" y son activos bajo la mayoría de las condiciones y estados ambientales de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de iniciación de transcripción de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 1' o 2' derivado de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens y otras regiones de iniciación de transcripción de diferentes genes vegetales conocidos para la persona versada en la materia. Dichos genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. BioL. 33: 125 -139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251: 196 -203); el gen que codifica la proteína desaturasa portadora de estearoil-acilo de Brassica napus (GenBank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104: 1167 -1176); GPc1 de maíz (GenBank No. X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208: 551 -565); el Gpc2 de maíz (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33: 97 -112); promotores vegetales descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.962.028 y 5.633.440.

La invención usa promotores específicos del tejido o constitutivos derivados de virus que pueden incluir, por ejemplo, al promotor subgenómico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92: 1679 -1683; el virus baciliforme del tungro del arroz (RTBV), que se replica solamente en células del floema en plantas de arroz infectadas, con su promotor que dirige la expresión fuerte del gen reportero especifico de floema; el promotor del virus del mosaico de la vena de la mandioca (CVMV), con la actividad más alta en elementos vasculares, en células mesófilas de la hoja y en las puntas de las raíces (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129 -1139).

En forma alternativa, los promotores de las plantas pueden dirigir la expresión del ácido nucleico en un tejido, órgano o tipo de célula específico (es decir, promotores específicos del tejido) o, bien puede estar bajo control ambiental o de desarrollo más preciso o bajo el control de un promotor inducible. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, la presencia de luz, o asperjado con compuestos químicos/hormonas. Por ejemplo, la invención incorpora el promotor inducible por sequía del maíz (Busk (1997) ver más arriba); el promotor inducible por frío, sequía y alto contenido de sal de la patata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897 -909).

Los promotores específicos del tejido pueden promover la transcripción únicamente dentro de un cierto marco de tiempo de la etapa de desarrollo en ese tejido. Véase, por ejemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10 : 791 -800, que caracteriza al promotor del gen LEAFY de Arabidopsis. Véase también Cardon (1997) Plant J 12: 367 -77, que describe el factor de transcripción SPL3, que reconoce un motivo de una secuencia conservada en la región promotora del gen AP1 A de identidad del meristemo floral de A. thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29. páginas 995 -1004, que describe al promotor elF4 del meristemo. Se pueden usar los promotores específicos del tejido que son activos durante todo el ciclo de vida de un tejido particular. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención están operativamente enlazados a un promotor activo principalmente únicamente en células de fibra de algodón. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención están operativamente enlazados a un promotor principalmente activo durante las etapas de elongación de las células de fibra de algodón, por ejemplo, como lo describe Rinehart (1996), ver más arriba. Los ácidos nucleicos pueden estar operativamente enlazados al promotor del gen Fb12A que es preferencialmente expresado en células de fibra de algodón (lbídem). Véase también, John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89 : 5769 -5773; John y colaboradores, patentes de los Estados Unidos Nos. 5.608.148 y 5.602.321, que describen promotores específicos de la fibra de algodón y métodos para la construcción de plantas transgénicas de algodón. También se pueden utilizar promotores específicos de la raíz para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Los ejemplos de promotores específicos de la raíz incluyen al promotor del gen para la alcohol deshidrogenasa (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123: 39 -60). Otros promotores que pueden ser usados para expresar los ácidos nucleicos de la invención incluyen, por ejemplo, promotores específicos del óvulo, específico del embrión, específicos del endospermo, específicos del integumento, específicos del

recubrimiento de la semilla, o alguna combinación de los mismos; un promotor específico de la hoja (véase, por ejemplo, Busk (1997) Plant J. 11: 1285 -1295, que describe un promotor especifico de la hoja en maíz); el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (que exhibe alta actividad en raíces, véase, por ejemplo, Hansen (1997) ver más arriba); un promotor específico del polen del maíz (véase, por ejemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 161 -168); se puede utilizar un promotor del tomate activo durante la maduración de la fruta, senescencia y abscisión de las hojas y, en un menor grado, de las flores, (véase, por ejemplo, Blume (1997) Plant J. 12: 731 -746); un promotor específico del pistilo del gen SK2 de la patata (véase, por ejemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425 431); el gen Blec4 del guisante, que es activo en el tejido epidérmico de ápices del brote vegetativo y floral de alfalfa transgénica haciendo que sea una herramienta útil para dirigir la expresión de genes foráneos a la capa epidérmica de las fibras o brotes de crecimiento activo; el gen BEL1 específico del óvulo (véase, por ejemplo, Reiser (1995) Cell

83: 735 -742. GenBank No. U39944); y/o, el promotor en Klee, patente de los Estados Unidos No. 5.589.583, que describe una región promotora de la planta que es capaz de conferir altos niveles de transcripción en tejido meristemático y/o células de rápida división.

En forma alternativa, se utilizan promotores vegetales que son inducibles después de exposición a hormonas de la planta, tales como auxinas, para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, la invención puede utilizar el fragmento del promotor E1 de elementos sensibles a la auxina (AuxRE) en la soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397 -407); el promotor GSTG de Arabidopsis sensible a la auxina (también sensible al ácido salicílico y al peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955 -966); el promotor parC inducible por auxina del tabaco (Sakai (1996) 37: 906 -913); un elemento de respuesta a la biotina de la planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933 -937); y, al promotor sensible al ácido abscísico de la hormona del estrés (Sheen (1996) Science 274: 1900 -1902).

Los ácidos nucleicos de la invención también pueden estar enlazados operativamente a los promotores vegetales que son inducibles después de exposición a reactivos químicos que pueden ser aplicados a la planta, tales como herbicidas o antibióticos. Por ejemplo, se puede usar el promotor ln2-2 del maíz, activado por agentes de seguridad del herbicida bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568 -577); la aplicación de diferentes agentes de seguridad del herbicida induce diferentes patrones de expresión génica, incluyendo expresión en la raíz, hidatodos y el meristema apical del brote. La secuencia codificadora puede estar bajo el control, por ejemplo, de un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como se describe con las plantas transgénicas de tabaco que contienen el gen para la arginina decarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465 -473); o, un elemento sensible al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315 -1324). Utilizando promotores inducidos químicamente (por ejemplo, inducidos por hormonas o por pesticidas) es decir, promotores sensibles a un compuesto químico que puede ser aplicado a la planta transgénica en el campo, se puede inducir la expresión de un polipéptido de la invención en una etapa particular de desarrollo de la planta. Por lo tanto, la invención también provee plantas transgénicas que contienen un gen inducible que codifica para polipéptidos de la invención cuyo rango de huésped se limita a especies vegetales objetivo, tales como maíz, arroz, cebada, trigo, patata, caña de azúcar, remolacha azucarera, u otros cultivos, inducibles en cualquiera etapa del desarrollo del cultivo.

La persona versada en el arte reconoce que un promotor vegetal específico del tejido puede dirigir la expresión de secuencias operativamente enlazadas en tejidos diferentes al tejido objetivo. Por lo tanto, un promotor específico del tejido es uno que dirige la expresión preferentemente en el tejido o tipo de célula objetivo, pero también puede conducir a alguna expresión en otros tejidos.

Los ácidos nucleicos de la invención también pueden estar operativamente enlazados a promotores vegetales que son inducibles después de exposición a reactivos químicos. Estos reactivos incluyen, por ejemplo, herbicidas, auxinas sintéticas, o antibióticos que pueden ser aplicados, por ejemplo, asperjados, sobre plantas transgénicas. La expresión inducible de ácidos nucleicos que producen amilasa de la divulgación le permitirá al agricultor seleccionar plantas con la proporción óptima de almidón / azúcar. De este modo se puede controlar el desarrollo de las partes de la planta. De esta forma, la invención provee los medios para facilitar la cosecha de las plantas y de las partes de la planta. Por ejemplo, en diferentes formas de realización, se usa el promotor ln2-2 del maíz, activado por agentes de seguridad del herbicida bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568 -577); la aplicación de diferentes agentes de seguridad del herbicida induce diferentes patrones de expresión génica, incluyendo la expresión en la raíz, hidatodos y el meristemo apical del brote. Las secuencias codificadoras de la invención también están bajo el control del promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como se describe con las plantas transgénicas de tabaco que contienen el gen para la arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465 -473); o, un elemento sensible al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 315 -1324).

Si se desea una expresión apropiada del polipéptido, una región se debe incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificadora. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes vegetales, o de genes en el T-ADN Agrobacteriano.

La invención provee “casetes de expresión” 'que comprenden cualquier secuencia de la invención “operativamente enlazada" a un regulador de transcripción; por ejemplo, en donde "operativamente enlazada" como se utiliza aquí, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácido nucleico (por ejemplo, ADN). Por Io general, se

refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de la transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor está operativamente enlazado a una secuencia codificadora, tal como un ácido nucleico de la invención, si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificadora en una célula huésped apropiada u otro sistema de expresión. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción del promotor que están operativamente enlazadas a una secuencia transcrita están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, están actuando en forma cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de transcripción, tales como potenciadores, no necesitan estar físicamente contiguas o ubicadas cerca a las secuencias codificadoras cuya transcripción ellas potencian.

Modificación de las secuencias codificadoras y de las secuencias adyacentes

La expresión transgénica en plantas de genes derivados de fuentes heterólogas puede implicar la modificación de aquellos genes para lograr y optimizar su expresión en plantas. En particular, los ORF bacterianos que codifican enzimas separadas pero que son codificados por el mismo transcripto en el microbio nativo son mejor expresados en plantas sobre transcriptos separados. Para lograr esto, cada ORF microbiano se aísla en forma individual y se clona en un casete que provee una secuencia del promotor vegetal en el extremo 5’ del ORF y un terminador de transcripción de la planta en el extremo 3' del ORF. La secuencia del ORF aislada incluye preferiblemente el codón ATG de inicio y el codón de terminación pero puede incluir una secuencia adicional más allá del codón ATG de inicio y el codón STOP. Además, el ORF puede ser truncado pero aún retener la actividad requerida; para los ORF particularmente largos, las versiones truncadas que retienen actividad pueden ser preferibles para la expresión en organismos transgénicos. Por “promotor vegetal" y “terminador de la transcripción de la planta" se pretende hacer referencia a promotores y terminadores de la transcripción que operan en células vegetales. Esto incluye promotores y terminadores de la transcripción que pueden derivarse de fuentes no vegetales tales como virus (un ejemplo es el virus del mosaico de la coliflor).

En algunos casos, no es necesaria la modificación de las secuencias codificadoras del ORF y la secuencia adyacente. Es suficiente con aislar un fragmento que contiene el ORF de interés e insertarlo secuencia abajo de un promotor de la planta. Por ejemplo, Gaffney y colaboradores (Science 261: 754 -756 (1993)) han expresado el gen nahG de Pseudomonas en plantas transgénicas bajo el control del promotor 35S del CaMV y el terminador tml del CaMV exitosamente sin modificación de la secuencia codificadora y con nucleótidos del gen de Pseudomonas secuencia arriba del ATG aún unido y nucleótidos secuencia abajo del codón STOP aún unido al ORF de nahG. Preferiblemente, ya que se debe dejar unida una secuencia microbiana adyacente pequeña secuencia arriba del codón ATG y secuencia abajo del codón STOP. En la práctica, tal construcción puede depender de la disponibilidad de los sitios de restricción.

En otros casos, la expresión de los genes derivados de fuentes microbianas puede causar problemas en la expresión. Estos problemas han sido bien caracterizados en el arte y son particularmente comunes con genes derivados de ciertas fuentes, tales como Bacillus. Estos problemas pueden aplicarse a la secuencia de nucleótidos de esta invención y la modificación de estos genes se puede realizar usando técnicas bien conocidas en el arte. Pueden encontrarse los siguientes problemas:

Uso de codones

El uso preferido de codones en plantas difiere del uso preferido de codones en ciertos microorganismos. La comparación del uso de codones dentro de un ORF microbiano clonado para el uso en genes vegetales (y en particular genes de la planta objetivo) permitirá la identificación de los codones dentro del ORF que preferiblemente deben ser cambiados. Típicamente, la evolución de la planta ha tendido hacia una preferencia fuerte de los nucleótidos C y G en la posición de la tercera base de las monocotiledóneas, mientras que las dicotiledóneas a menudo usan los nucleótidos A o T en esta posición. Mediante la modificación de un gene para incorporar el uso de codones preferidos para una especie transgénica particular objetivo, se superan muchos de los problemas descritos a continuación para el contenido de GC/AT y el empalme ilegítimo.

Contenido de GC/AT

Los genes de las plantas por lo general tienen un contenido de GC de más del 35%. Las secuencias del ORF que son ricas en nucleótidos A y T pueden causar varios problemas en las plantas. En primer lugar, se cree que los motivos de ATTTA causan desestabilización de los mensajes y se encuentran en el extremo 3’ de muchos ARNm de corta vida. En segundo lugar, se cree que la ocurrencia de señales de poliadenilación tales como AATAAA en posiciones inapropiadas dentro del mensaje causan truncamiento prematuro de la transcripción. Además, las monocotiledóneas pueden reconocer secuencias ricas en AT como sitios de empalme (véase a continuación).

Secuencias adyacentes a la metionina de inicio

Las plantas difieren de los microorganismos en que sus mensajes no poseen un sitio de enlazamiento definido del ribosoma. Por el contrario, se cree que los ribosomas se unen al extremo 5' del mensaje y hacen un barrido para el primer ATG disponible en el cual se inicia la traducción. Sin embargo, se cree que existe una preferencia por ciertos nucleótidos adyacentes al ATG y esa expresión de genes microbianos puede ser reforzada por la inclusión de un 5 iniciador de la traducción de consenso en eucariotas en el ATG. Clontech (catálogo 1993/1994, página 210) ha sugerido una secuencia como iniciadora de la traducción de consenso para la expresión del gen uidA de E. coli en plantas. Además, Joshi, N.A,R. 15: 6643 -6653 (1987), ha comparado muchas secuencias de plantas adyacentes al ATG y sugiere otra secuencia de consenso. En situaciones donde se han encontrado dificultados en la expresión de los ORF microbianos en plantas, la inclusión de una de estas secuencias en el ATG de inicio puede mejorar la

10 traducción. En dichos casos, los tres últimos nucleótidos del consenso pueden no ser apropiados para la inclusión en la secuencia modificada debido a su modificación del segundo residuo AA. Las secuencias preferentes adyacentes a la metionina de inicio pueden diferir entre diferentes especies de plantas. Un estudio de 14 genes de maíz localizados en la base de datos de GenBank suministró los siguientes resultados:

Posición antes del ATG de inicio en 14 genes de maíz:

Este análisis se puede realizar para las especies de plantas deseadas dentro de las cuales está siendo incorporada la secuencia de nucleótidos y la secuencia adyacente al ATG modificado para incorporar los nucleótidos preferidos.

Extracción de sitios de empalme ilegítimos

Los genes clonados de fuentes no vegetales y no optimizados para expresión en plantas también pueden contener

20 motivos que pueden ser reconocidos en plantas como sitios de empalme 5’ o 3' y ser escindidos, generando así, mensajes truncados o suprimidos. Estos sitios pueden ser removidos utilizando las técnicas conocidas en el arte.

Las técnicas para la modificación de secuencias codificadoras y de secuencias adyacentes son conocidas en el arte. En casos donde la expresión inicial de un ORF microbiano es baja y se considera apropiada para hacer alteraciones a la secuencia como se describió anteriormente, entonces se puede lograr la construcción de genes sintéticos de

25 acuerdo con los métodos conocidos en el arte. Estos son descritos, por ejemplo, en las divulgaciones de las patentes publicadas EP 0 385 962 (de Monsanto), EP 0 359 472 (de Lubrizol) y la publicación WO 93/07278 (de Ciba-Geigy). En la mayoría de los casos, es preferible evaluar la expresión de las construcciones génicas usando protocolos de ensayos transitorios (que son bien conocidos en el arte) antes de su transferencia a plantas transgénicas.

30 Promotores vegetales

Las composiciones de la divulgación pueden contener secuencias de ácido nucleico para transformación y expresión en una planta de interés. Las secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes en constructos de ADN o casetes de expresión. En formas de realización alternativas, "casete de expresión" como se utiliza aquí significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia particular de nucleótidos en una célula 35 huésped apropiada, que comprende un promotor operativamente enlazado a la secuencia de nucleótidos de interés, que está operativamente enlazada a señales de terminación. También comprende típicamente secuencias requeridas para una traducción apropiada de la secuencia de nucleótidos. La región codificadora usualmente codifica para una proteína de interés pero también puede codificar para un ARN funcional de interés, por ejemplo ARN antisentido o un ARN no traducido, en dirección sentido o antisentido. El casete de expresión que comprende 40 la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también puede ser uno que sea de origen natural pero que ha sido obtenido en una forma recombinante útil para expresión heteróloga. En las formas de realización alternativas. el casete de expresión es heterólogo con respecto al huésped, es decir, la secuencia de ADN particular del casete de expresión no se presenta naturalmente en la célula huésped y debe

45 haber sido introducida en la célula huésped o en un ancestro de la célula huésped mediante un evento de transformación. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción únicamente cuando la célula huésped se expone a algunos estímulos externos particulares. En formas de realización alternativas, el promotor también puede ser específico para un tejido u órgano o estado de desarrollo particular.

La presente divulgación abarca la transformación de plantas con casetes de expresión capaces de expresar polinucleótidos. En formas de realización alternativas, el casete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio de la transcripción y la traducción (es decir, un promotor) y un polinucleótido de interés. El casete de expresión puede comprender opcionalmente una región de terminación de la transcripción y la traducción (es decir, región de terminación) que actúa en las plantas. En algunas formas de realización, el casete de expresión comprende un gen marcador seleccionable para permitir la selección de transformantes estables. Los constructos de expresión de la invención también pueden comprender una secuencia guía y/o una secuencia que permite la expresión inducible del polinucleótido de interés. Véase, Guo y colaboradores (2003) Plant J. 34: 383 -92 y Chen y colaboradores (2003) Plant J. 36: 731 -40 para ejemplos de secuencias que permiten la expresión inducible.

En formas de realización alternativas, las secuencias reguladoras del constructo de expresión están operativamente enlazadas al polinucleótido de interés. Por “operativamente enlazadas" se entiende un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia en donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. En formas de realización alternativas, "operativamente enlazada" significa que las secuencias de nucleótidos que son enlazadas son contiguas.

Cualquier promotor capaz de dirigir la expresión en una planta de interés puede ser usado en la práctica de la invención. El promotor puede ser nativo o análogo o foráneo o heterólogo con respecto al huésped de la planta. En formas de realización alternativas, los términos “heterólogo" y "exógeno" cuando se utilizan aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo una secuencia de ADN o ARN) o un gen, se refiere a una secuencia que se origina a partir de una fuente externa a la célula huésped particular o, si es a partir de la misma fuente, se modifica a partir de su forma original. Por lo tanto, un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno a la célula huésped particular pero que ha sido modificado. Los términos también incluyen copias múltiples de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. Por lo tanto, los términos se refieren a un segmento de ADN que es externo o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped dentro del no se encuentra ordinariamente el elemento. Los segmentos de ADN exógeno se expresan para producir polipéptidos exógenos.

En realizaciones alternativas, una secuencia de ácido nucleico "homóloga" (por ejemplo ADN) es una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo ADN o ARN) naturalmente asociada con una célula huésped dentro de la cual se introduce.

La elección de promotores que van a ser incluidos puede depender de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, eficiencia, capacidad de selección, capacidad de inducción, nivel deseado de expresión y expresión preferencial en el tejido o la célula. Es una cuestión de rutina para la persona capacitada en el arte modular la expresión de una secuencia mediante selección y posicionamiento apropiado de los promotores y otras regiones reguladoras relacionadas con esa secuencia.

En realizaciones alternativas, los promotores adecuados inician la transcripción únicamente, o predominantemente, en ciertos tipos celulares. Por lo tanto, como se utiliza aquí, un promotor preferencial del tipo de célula o tejido es uno que dirige la expresión preferencialmente en el tejido objetivo, pero que puede conducir también a alguna expresión en otros tipos de células o tejidos. Los métodos para identificar y caracterizar regiones promotoras en ADN genómico de plantas incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las siguientes referencias: Jordano, y colaboradores, Plant Cell, 1: 855 -866 (1989); Bustos, y colaboradores, Plant Cell, 1: 839 -854 (1989); Green, y colaboradores, EMBO J., 7, 4035 -4044 (1988); Meier, y colaboradores, Plant Cell, 3, 309 -316 (1991); y Zhang, y colaboradores, Plant Physiology 110: 1069 -1079 (1996).

En realizaciones alternativas, se pueden utilizar promotores y/o genes regulados preferidos del tejido que han sido reportados en plantas. Los genes reportados preferidos del tejido que pueden ser usados en formas de realización alternativas incluyen los genes que codifican las proteínas de almacenamiento de las semillas (tales como napina, cruciferina, beta -conglicinina y faseolina, prolaminas, glutelinas, globulinas y zeinas), zeinas o proteínas de cuerpos oleosos (tales como oleosina), o genes involucrados en la biosíntesis de ácidos grasos (incluyendo la proteína portadora de acilo, estearoiI-ACP desaturasa y desaturasas de ácido graso (fad 2-1)) y otros genes expresados durante el desarrollo del embrión (tales como Bce4, véase, por ejemplo, el documento EP 255378 y Kridl y colobadores, (1991) Seed Science Research, 1: 209). Los ejemplos de promotores específicos del tejido que pueden ser utilizados para la práctica de esta invención, que han sido descritos, incluyen la lectina (Vodkin, Prog. Clin. Biol. Res., 138; 87 (1983); Lindstrom y colaboradores, (1990) Der. Genet., 11: 160), alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (Dennis y colaboradores, Nucleic Acid Res., 12: 3983 (1984)), complejo de cosecha liviano de maíz (véase, por ejemplo, Simpson, (1986) Science, 233: 34; Bansal (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 8923654), proteína de choque térmico de maíz (véase, por ejemplo, Odell y colaboradores, (1985) Nature, 313: 810; subunidad pequeña de la RuBP carboxilasa de guisante (véase, por ejemplo, Poulsen y colaboradores, (1986) Mol. Gen. Genet., 205: 193 200; Cashmore y colaboradores, (1983) Gen. Eng. of Plants, Plenum Press, New York, 29 -38); manopina sintasa de plásmido Ti (véase, por ejemplo, Langridge y colaboradores, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 86: 3219 -3223), nopalina sintasa de plásmido Ti (Langridge y colaboradores, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 86: 3219 -3223),

chalcona isomerasa de petunia (véase, por ejemplo, vanTunen (1988) EMBO J. 7: 1257); proteína 1 rica en glicina de frijol (véase, por ejemplo. Keller (1989) Genes Dev. 3: 1639); 35S truncado del CaMV (véase, por ejemplo, Odell

(1.985) Nature 313: 810); patatina de patata (véase, por ejemplo, Wenzler (1989) Plant Mol. Biol. 13: 347; célula de raíz (véase, por ejemplo, Yamamoto (1990) Nucleic Acid Res., 18: 7449); zeína de maíz (véase. por ejemplo, Reina (1990) Nucleic Acid Res., 18: 6425; Lopes y colaboradores (1995) Mol. Gen. Genet. 247: 603 -613; Kriz (1987) Mol. Gen. Genet. 207: 90; Wandelt (1989) Nucleic Acid Res., 17: 2354; Langridge (1983) Cell, 34: 1015; Reina (1990) Nucleic Acid Res., 18: 7449), promotor gpp de ADP (véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 7.102.057); globulina-1 (véase, por ejemplo, Belanger (1991) Genetics 129: 863); α-globulina (Sunilkumar, y colaboradores (2002). Transgenic Res., 11: 347 -359); α-tubulina; cab (véase, por ejemplo, Sullivan (1989) Mol. Gen. Genet., 215: 431); PEPCasa (véase por ejemplo, Hudspeth & Grula, (1989) Plant Molec. Biol., 12: 579 -589); promotores asociados al complejo del gen R (Chandler y colaboradores, (1989) Plant Cell, 1: 1175); promotor de vicilina de guisante (Czako y colaboradores, (1992) Mol. Gen. Genet., 235: 33; patente de los Estados Unidos No. 5.625.136); promotor GTL1 (Takaiwa y colaboradores (1991) Plant Mol. Biol. 16 (1), 49 -58); promotores de la chalcona sintasa (Franken y colaboradores, (1991) EMBO J., 10: 2605); y/o un promotor GY1 (Sims Goldburg (1989) Nuc. Acid Res. 17(11) 4368) y similares.

En realizaciones alternativas, se utiliza una clase de promotores preferidos del fruto expresados en o durante la antítesis a través del desarrollo del fruto, al menos hasta el comienzo de la maduración, por ejemplo, como se discute en la patente de los Estados Unidos 4.943.674. El promotor para el gen de la poligalacturonasa es activo en la maduración del fruto. También se puede utilizar un gen para la poligalacturonasa, por ejemplo. como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 4.535.060, la patente de los Estados Unidos No. 4.769.061, la patente de los Estados Unidos No. 4.801.590 y la patente de los Estados Unidos No. 5.107.065.

Otros ejemplos de promotores preferidos del tejido que pueden ser usados incluyen aquello que dirigen la expresión en células de la hoja después del daño a la hoja (por ejemplo, por insectos masticadores), en tubérculos (por ejemplo, promotor del gen de la patatina), y en células de fibra (un ejemplo de una proteína de célula de fibra regulada por desarrollo es E6 (John & Crow (1992) PNAS 89: 5769 -5773). El gen E6 es más activo en fibra, aunque se encuentran bajos niveles de transcriptos en la hoja, el óvulo y la flor.

En realizaciones alternativas, se pueden utilizar promotores activos en tejido fotosintético con el fin de dirigir la transcripción en tejidos verdes tales como hojas y vástagos; estos promotores son adecuados cuando dirigen la expresión únicamente o predominantemente en dichos tejidos. En formas de realización alternativa, el promotor puede conferir expresión constitutivamente a través de toda la planta, o diferencialmente con respecto a los tejidos verdes, o diferencialmente con respecto a la etapa de desarrollo del tejido verde en la cual ocurre la expresión, o en respuesta a estímulos externos.

Los ejemplos de promotores que pueden ser usados para llevar a cabo esta invención incluyen los promotores de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (RbcS) tales como el promotor RbcS de alerce oriental (Larix Iaricina), el promotor cab6 de pino (Yamamoto y colaboradores (1994) Plant Cell Physlol. 35: 773 -778), el promotor del gen Cab-1 de trigo (Fejes y colaboradores (1990) Plant Mol. Biol. 15: 921 -932). el promotor CAB-1 de espinaca (Lubberstedt y colaboradores (1994) Plant Physiol. 104: 997 -1006), el promotor cab1R del arroz (Luan y colaboradores (1992) Plant Cell 4: 971 -981), el promotor de la piruvato ortofosfato diquinasa (PPDK) del maíz (Matsuoka y colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 90: 9586 -9590), el promotor Lhcb1*2 del tabaco (Cerdan y colaboradores (1997) Plant Mol. Biol. 33: 245 -255), el promotor de SUC2 sacarosa-H+ symporter de Arabidopsis thaliana (Truernit y colaboradores (1995) Plant 196: 564 -570) y promotores de proteína de membrana tilacoide de la espinaca (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Otros promotores que dirigen la transcripción en tallos, hojas y tejido verde se describen en la publicación de la patente de los Estados Unidos No. 2007/0006346.

La especificidad de tejido de algunos promotores “preferidos del tejido” puede no ser absoluta; en formas de realización alternativas se utilizan genes reporteros tales como Gus o proteína fluorescente verde, proteína ciano fluorescente, proteína fluorescente amarilla o proteína fluorescente roja. En formas de realización alternativas, se puede lograr la expresión preferida del tejido con expresión "defectuosa" por medio de una combinación de diferentes promotores preferidos del tejido. Se pueden utilizar otros promotores preferidos del tejido, y pueden ser aislados, por una persona versada en el arte (véase la patente de los Estados Unidos No. 5.589.379).

En un aspecto, se utilizan los promotores vegetales que son inducibles después de la exposición a hormonas de la planta, tales como auxinas, para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, la invención puede utilizar un fragmento del promotor E1 de elementos de respuesta a la auxina (AuxRE) en la soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397 -407); el promotor GST6 de Arabidopsis sensible a la auxina (también sensible al ácido salicílico y al peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955 -966); el promotor parC inducible por auxina de tabaco (Sakai (1996) 37: 906 -913); un elemento de respuesta a la biotina de la planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933 -937); y el promotor sensible al ácido abscísico de la hormona del estrés (Sheen (1996) Science 274: 1900 -1902).

Los ácidos nucleicos de la invención también pueden estar operativamente enlazados a promotores de la planta que son inducibles ante la exposición a reactivos químicos que pueden ser aplicados a la planta, tales como herbicidas o antibióticos. Por ejemplo, sistemas de expresión génica que son activados en presencia de un ligando químico, incluyendo etanol, tal como se puede encontrar en los documentos WO 96/27673; WO 93/01294; WO 94 /03619; WO 02/061102. Se puede usar el promotor ln2-2 de maíz, activado por agentes de seguridad del herbicida bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568 -577); la aplicación de diferentes agentes de seguridad del herbicida induce distintos patrones de expresión génica, incluyendo la expresión en la raíz, hidatodos y el meristema apical del vástago. La secuencia codificadora puede estar bajo el control, por ejemplo, de un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como se describe con plantas transgénicas de tabaco que contienen el gen para la arginina decarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465 -473); estrógeno, tal como, el receptor de ecdisona (WO 01/52620) o, un elemento sensible al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J.

11: 1315 -1324). Utilizando promotores inducidos químicamente (por ejemplo, inducidos por hormona o pesticida), es decir, promotores sensibles a un compuesto químico que puede ser aplicado a la planta transgénica en el campo, se puede inducir la expresión de un polipéptido de la invención en una etapa particular del desarrollo de la planta.

Los ejemplos de algunos promotores constitutivos que pueden ser usados para la práctica de esta invención y que han sido descritos, incluyen actina 1 de arroz (Wang y colaboradores (1992) Mol. Cell. Biol, 12: 3399; la patente de los estados Unidos No. 5.641.876); otras isoformas de actina (McEiroy y colaboradores (1990) Plant Cell 2: 163 171 y McEiroy y colaboradores (1991) Mol. Gen. Genet. 231: 150 -160); 35S del CaMV (Odell y colaboradores (1985) Nature, 313: 810); 19S del CaMV (Lawton y colaboradores (1987) Plant Mol. Biol. 9: 315 -324; la patente de los Estados Unidos No. 5.639.949); nos (Ebert y colaboradores (1987) PNAS EUA 84: 5745 -5749); Adh (Walker y colaboradores (1987) PNAS EUA 84: 6624 -6628), sacarosa sintasa (Yang & Russell (1990) PNAS EUA 87: 4144 4148); y los promotores de ubiquitina (por ejemplo, girasol Binet y colaboradores (1991) Plant Science 79: 87 -94; maíz Christensen y colaboradores (1989) Plant Molec. Biol. 12: 619 -632; y Arabidopsis -Callis y colaboradores, J. Biol. Chem. (1990) 265: 12486 -12493; y Norris y colaboradores, Plant Mol. Biol. (1993) 21: 895 -906.

Se pueden una variedad de terminadores de la transcripción en casetes de expresión para la realización de esta invención. Estos terminadores de la transcripción son responsables por la terminación de la transcripción más allá del transgén y la correcta poliadenilación del ARNm. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente enlazada de interés, puede ser nativa con el huésped de la planta o se puede derivar de otra fuente (es decir, foránea o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped de la planta o cualquier combinación de los mismos). Los terminadores apropiados de la transcripción son aquellos que se saben que actúan en plantas e incluyen al terminador 35S de CaMV, el terminador tml, el terminador de nopalina sintasa y el terminador E9 rbcs de guisante. Estos pueden ser utilizados tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Además, se puede utilizar un terminador de la transcripción nativo del gen.

Se ha encontrado que numerosas secuencias refuerzan la expresión génica a partir de la unidad de transcripción y estas secuencias se pueden usar junto con los genes de esta invención para incrementar su expresión en plantas transgénicas. Por ejemplo, diferentes secuencias de intrones han mostrado que refuerzan la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen Adhl de maíz refuerzan de manera significativa la expresión del gen de tipo silvestre bajo su promotor cognado cuando se introducen en células de maíz.

En realizaciones alternativas, se pueden utilizar secuencias guía no traducidas derivadas de virus para reforzar la expresión, y estas son particularmente efectivas en células dicotiledóneas. En formas de realización alternativas, se pueden utilizar r secuencias guía del virus del mosaico del tabaco (TMV, la "secuencia W "), el virus del moteado clorótico del maíz (MCMV,) y virus del mosaico de la alfalfa (AMV) y estas han mostrado ser efectivas en el reforzamiento de la expresión (por ejemplo Gallie y colaboradores, Nucl. Acids Res. 15: 8693 -8711 (1987); Skuzeski y colaboradores, Plant Molec. Biol. 15: 65 -79 (1990)).

Direccionamiento del producto génico dentro de la célula

En realizaciones alternativas, se usan diversos mecanismos mecanismos para dirigir los productos génicos; y se sabe que estos existen en plantas; y se han caracterizado en forma detallada las secuencias que controlan el funcionamiento de estos mecanismos. Se han caracterizado secuencias que provocan el direccionamiento de productos génicos a otros compartimientos celulares. Las secuencias amino terminales pueden ser responsables por dirigir una proteína de interés a cualquier compartimiento celular, tal como, una vacuola, mitocondria, peroxisoma, cuerpos proteicos, retículo endoplasmático, cloroplasto, gránulo de almidón, amiloplasto, apoplasto o la pared celular de una planta (por ejemplo, Unger y colaboradores Plant Molec. Biol. 13: 411 -418 (1989); Rogers y colaboradores (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82: 6512 -651; patente de Estados Unidos No. 7.102.057; el documento WO 2005/096704). En realizaciones alternativas, se usan diferentes secuencias señal, por ejemplo, la secuencia señal puede ser una secuencia señal del terminal N de cera, una secuencia señal del terminal N de γ-zeína, un dominio de enlazamiento de almidón, un dominio de enlazamiento de almidón del terminal C, una secuencia de direccionamiento al cloroplasto, que importa la proteína madura al cloroplasto (Comai y colaboradores (1988) J. Biol.

Chem. 263: 15104 -15109; van den Broeck, y colaboradores (1985) Nature 313: 358 -363; patente de los Estados Unidos No. 5.639.949) o una secuencia señal de secreción de las células de aleurona (Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769 -783 (1990)). En realizaciones alternativas, se utilizan secuencias del terminal amino junto con secuencias del terminal carboxilo; éstas son responsables del direccionamiento vacuolar de productos génicos (Shinshi y colaboradores (1990) Plant Molec. Biol. 14: 357 -368).

La secuencia señal seleccionada puede incluir el sitio de escisión conocido, y la fusión construida debe tener en cuenta cualquiera de los aminoácido después del (de los) sitio(s) de escisión, que se requieren para la escisión. En algunos casos, este requerimiento puede ser cumplido por la adición de un pequeño número de aminoácidos entre el sitio de escisión y el ATG del transgén o, en forma alternativa, el reemplazo de algunos aminoácidos dentro de la secuencia del transgén. Estas técnicas de construcción son bien conocidas en el arte y son aplicables de igual forma a cualquier compartimiento celular.

Los mecanismos anteriormente descritos para direccionamiento celular pueden ser utilizados no solo junto con sus promotores cognados, sino también junto con promotores heterólogos para efectuar un objetivo de direccionamiento celular específico bajo la regulación transcripcional de un promotor que tiene un patrón de expresión diferente a aquel del promotor del cual se deriva la señal de direccionamiento.

Vectores de expresión y vehículos de clonación

La invención provee vectores de expresión y vehículos de clonación que comprenden ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, secuencias que codifican la glucoamilasa de la invención. Los vectores de expresión y vehículos de clonación de la invención pueden comprender partículas virales, baculovirus, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN viral (por ejemplo, vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorrabia y derivados del SV40), cromosomas artificiales basados en P1, plásmidos de levadura, cromosoma artificial de levadura y cualquier otro vector específico para los huéspedes específicos de interés (tales como Bacillus, Aspergillus y levadura). Los vectores de la invención pueden incluir secuencias de ADN sintéticas, cromosómicas y no cromosómicas. Aquellos capacitados en el arte conocen un gran número de vectores adecuados, y que se encuentran comercialmente disponibles. Los ejemplos de vectores incluyen: bacterianos: vectores pQE (Qiagen), plásmidos pBLUESCRIPTMR (pBluescript), vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRlT2T (Pharmacia); eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, cualquier otro plásmido o vector puede ser usado siempre que sea replicable y viable en el huésped. Se pueden emplear los vectores de número de copia bajo o número de copia alto con la presente invención. Los “plásmidos” se pueden encontrar comercialmente disponibles, públicamente disponibles en forma restringida, o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Se conocen en el arte plásmidos equivalente a los descritos aquí y serán evidentes para aquellas personas versada en el arte.

La invención provee "casetes de expresión” que comprenden cualquier secuencia de la invención "operativamente enlazada" a un regulador de transcripción; el término "casete de expresión" como se usa aquí puede referirse a una secuencia de nucleótidos que es capaz de afectar la expresión de un gen estructural (por ejemplo, una secuencia que codifica a una proteína, tal como una glucoamilasa de la invención) en un huésped compatible con tales secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos un promotor operativamente enlazado con la secuencia que codifica al polipéptido; y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo, señales de terminación de transcripción. También se pueden utilizar factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, por ejemplo, reforzadores. Por lo tanto, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes, cualquier forma de un vector de "ADN desnudo" recombinante, y similares.

Un "vector" comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir en forma transitoria o permanente una célula. Se reconocerá que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico que forma un complejo con una proteína o un lípido. El vector comprende, opcionalmente, ácidos nucleicos virales o bacterianos, y/o proteínas y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una envoltura de un Iípido viral, etc.). Los vectores usados para la realización de esta invención esta invención incluyen, pero no se limitan a replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los cuales se pueden unir los fragmentos de ADN y replicarse. Los vectores usados para la realización de esta invención incluyen, pero no se limitan a ARN, ADN o ARN lineal o circular que se replica por sí mismo en forma autónoma (por ejemplo, plásmidos, virus y similares, véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.217.879) e incluyen tanto los plásmidos de expresión como los de no expresión. Cuando se describe un microorganismo recombinante o cultivo celular como hospedador de un “vector de expresión", este incluye tanto ADN circular y lineal extracromosómico como ADN que ha sido incorporado en el(los) cromosoma(s) huésped. Cuando un vector es mantenido por una célula huésped, el vector puede o bien ser replicado en forma estable por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o es incorporado en el genoma del huésped.

El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de enlazamiento del ribosoma para inicio de traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para

amplificación de la expresión. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un origen de replicación, cualquiera de los sitios necesarios de enlazamiento del ribosoma, un sitio de poliadenilación, sitios aceptores y donantes de empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcriptas que flanquean a 5'. En algunos aspectos, las secuencias de ADN derivadas de los sitios de empalme y poliadenilación de SV40 pueden ser usadas para proporcionar los elementos genéticos no transcriptos requeridos.

En un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores seleccionables para permitir la selección de células huésped que contienen al vector. Tales marcadores seleccionables incluyen genes que codifican dihidrofolato reductasa o genes que confieren resistencia a la neomicina para el cultivo de células eucariotas, genes que confieren resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae. Las regiones promotoras pueden ser seleccionadas a partir de cualquier gen deseado usando vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables.

Los vectores para expresar el polipéptido o un fragmento del mismo en células eucariotas también pueden contener reforzadores para incrementar los niveles de expresión. Los reforzadores son elementos que actúan de forma cis de ADN, usualmente de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 300 pb de longitud que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen al reforzador de SV4O en el lado tardío del origen de replicación de 100 a 270 pb, el reforzador del promotor temprano de citomegalovirus, el reforzador de polioma sobre el lado tardío del origen de replicación y los reforzadores del adenovirus.

Se puede insertar una secuencia de ácido nucleico en un vector mediante una variedad de procedimientos. En general, se liga la secuencia en la posición deseada en el vector después de la digestión del inserto y del vector con las endonucleasas de restricción apropiadas. En forma alternativa, se pueden ligar los extremos romos tanto del inserto como del vector. Se conocen en el arte una variedad de técnicas de clonación, por ejemplo, como se describe en Ausubel y Sambrook. Tales procedimientos y otros se consideran que están dentro del alcance de las personas versadas en el arte.

El vector puede estar en la forma de un plásmido, una partícula viral o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN, cromosómico y no cromosómico y sintéticas, derivadas de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Se describen una variedad de vectores de expresión y clonación para uso con huéspedes procariotas y eucariotas, por ejemplo, por Sambrook.

Los vectores bacterianos particulares que pueden ser usados incluyen los plásmidos comercialmente disponibles que comprenden los elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EUA), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucariotas particulares incluyen pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector, mientras sea replicable y viable en la célula huésped.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser expresados en casetes de expresión, vectores o virus, y expresados en forma transitoria o estable en células vegetales y semillas. Un ejemplo de un sistema de expresión transitorio utiliza sistemas de expresión episomales, por ejemplo, ARN viral del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) generado en el núcleo mediante transcripción de un minicromosoma episomal que contiene ADN superenrollado, véase, por ejemplo, Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:1633-1637. En forma alternativa, se pueden insertar secuencias codificadoras, es decir, todas las secuencias o sub fragmentos de las secuencias de la invención en un genoma de la célula huésped de la planta que se convierte en parte integral del ADN cromosómico del huésped. Se pueden expresar transcriptos sentido o antisentido en esta forma. Un vector que comprende las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones codificadoras) de ácidos nucleicos de la invención puede comprender un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable sobre una célula o una semilla de una planta. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a los biocidas, particularmente resistencia a los antibióticos, tal como resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicidas, tal como resistencia a la clorosulfurona o Basta.

Los vectores de expresión capaces de expresar ácidos nucleicos y proteínas en plantas son bien conocidos en el arte y pueden incluir, por ejemplo, vectores de Agrobacterium spp., virus X de patata (véase, por ejemplo, Angell (1997) EMBO J. 16: 3675 -3684), virus del mosaico del tabaco (véase, por ejemplo, Casper (1996) Gene 173: 69 73), virus de atrofia arbustiva del tomate (véase, por ejemplo, Hillman (1989) Virology169: 42 -50), virus del grabado del tabaco (véase, por ejemplo, Dolja (1997) Virology 234: 243 -252), virus del mosaico dorado del frijol (véase. por ejemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37: 471 -476), virus del mosaico de la coliflor (véase, por ejemplo, Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 1094 -1101), elemento transponible Ac/Ds del maíz (véase, por ejemplo, Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17: 6294 -6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. lmmunol. 204: 161 -194) y el elemento transponible mutador del supresor (Spm) del maíz (véase, por ejemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol.

32: 717 -725); y derivados de los mismos.

En un aspecto, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación para permitirle que se mantenga en dos organismos, por ejemplo en células de mamífero o de insecto para expresión en un huésped procariota para clonación y amplificación. Además, para integración de los vectores de expresión, el vector de expresión puede contener al menos una secuencia homóloga al genoma de la célula huésped. Puede contener dos secuencias homólogas que flanquean al constructo de expresión. El vector de integración puede ser dirigido a un Iocus específico en la célula huésped mediante la selección de la secuencia homóloga apropiada para inclusión en el vector. Los constructos para vectores de integración son conocidos en el arte.

Los vectores de expresión de la invención también pueden incluir un gen marcador seleccionable para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas, por ejemplo, genes que vuelven a las bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores seleccionables pueden incluir, también, genes biosintéticos, tales como aquellos en las rutas biosintéticas de la histidina, triptófano y leucina.

Células huésped y células transformadas

La invención también provee una célula transformada, que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia que codifica una glucoamilasa de la invención, o un vector, casete de expresión o vehículo de clonación de la invención. La célula huésped puede ser cualquiera de las células huésped familiares para aquellos capacitados en el arte, incluyendo células procariotas, células eucariotas, tales como células bacterianas, células fúngicas, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, o células de plantas. Los ejemplos de células bacterianas incluyen cualquier especie dentro del género de Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas y Staphylococcus, incluyendo, por ejemplo, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Baclllus subtllis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens. Los ejemplos de células de levadura incluyen a cualquiera de especie Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Schwanniomyces, incluyendo Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, o Schizosaccharomyces pombe. Los ejemplos de células de insectos incluyen cualquier especie de Spodoptera o Drosophila, inclusive Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Los ejemplos de células de animales incluyen CHO, COS o melanoma de Bowes o cualquier línea celular humana o de ratón. La selección de un huésped apropiado se encuentra dentro de las habilidades de aquellos capacitados en el arte. Las técnicas para transformación de una variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y están descritas en la literatura técnica y científica. Véase. por ejemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421 477; patente de los Estados Unidos No. 5.750.870.

El vector, casete de expresión. O vehículo de clonación puede ser introducido en las células huésped usando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo transformación, transfección, transducción, infección viral, pistolas génicos, o transferencia génica mediada por Ti. Los métodos particulares incluyen transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, lipofección o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, l., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

En un aspecto, los ácidos nucleicos o vectores de la invención son introducidos en las células para cribado, por lo tanto, los ácidos nucleicos ingresan a las células en una forma adecuada para expresión posterior del ácido nucleico. El método de introducción está grandemente dictado por el tipo de célula objetivo. Los ejemplos de métodos incluyen precipitación de CaPO4, fusión de Iiposomas, lipofección (por ejemplo, LIPOFECTINMR), electroporación, infección viral, etc. Los ácidos nucleicos candidatos pueden integrarse en forma estable en el genoma de la célula huésped (por ejemplo, con introducción retroviral) o puede existir ya sea en forma transitoria o estable en el citoplasma (es decir a través del uso de plásmidos tradicionales, utilizando secuencias reguladoras estándar, marcadores de selección, etc.). Al igual que muchos cribados farmacéuticamente importantes se requieren objetivos celulares de mamíferos humanos o modelo, se prefieren vectores retrovirales capaces de transfectar tales objetivos.

Cuando sea apropiado, las células huésped modificadas por ingeniería genética pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea conveniente para activar los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes de la invención. Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado puede ser inducido por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células pueden ser cultivadas durante un período adicional para permitirles producir el polipéptido deseado o un fragmento del mismo.

Las células pueden ser cosechadas por centrifugación, rotas por medios físicos o químicos, y el extracto sin purificar resultante es retenido para purificación adicional. Las células microbianas empleadas para expresión de proteínas pueden ser rotas mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o el uso de agentes de Iisado celular. Dichos métodos son conocidos para aquellos entrenados en el arte. El polipéptido expresado o un fragmento del mismo puede ser recuperado y purificado a partir de los cultivos celulares recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico. cromatografía de fosfocelulosa,

cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de Iectina. Las etapas de replegamiento de la proteína pueden ser usadas, según sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede emplear cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas finales de purificación.

Se pueden emplear también diferentes sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen líneas celulares COS-7 de fibroblastos de riñón de mono y otras líneas celulares capaces de expresar proteínas de un vector compatible, tales como las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.

Los constructos en las células huésped se pueden usar de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por las células huésped que contienen al vector pueden ser glicosiladas o pueden ser no glicosiladas. Los polipéptidos de la invención pueden o no incluir también un residuo de aminoácido inicial de metionina.

Los sistemas de traducción libres de células también se pueden emplear para producir un polipéptido de la invención. Los sistemas de traducción libres de células pueden usar los ARNm transcritos a partir de un constructo de ADN que comprende un promotor operativamente enlazado a un ácido nucleico que codifica al polipéptido o un fragmento del mismo. En algunos aspectos, el constructo de ADN puede ser alineado antes de llevar a cabo una reacción de transcripción in vitro. El ARNm transcrito es luego incubado con un extracto de traducción apropiado libre de células, tal como un extracto de reticulocito de conejo, para producir el polipéptido deseado o un fragmento del mismo.

Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para selección de las células huésped transformadas tal como resistencia a la dihidrofolato reductasa o a la neomicina para un cultivo células eucariotas, o tal como una resistencia a la tetraciclina o la ampicilina en E. coli.

Amplificación de ácidos nucleicos

En la práctica de la invención, se pueden reproducir mediante amplificación los ácidos nucleicos de la invención y los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención. También se puede utilizar la amplificación para clonar o modificar los ácidos nucleicos de la invención. Por lo tanto, la divulgación provee pares de secuencias de cebadores de amplificación para amplificar ácidos nucleicos de la invención. Alguien capacitado en el arte puede diseñar pares de secuencias del cebador de amplificación para cualquier parte de o la longitud completa de estas secuencias.

También se pueden utilizar reacciones de amplificación para cuantificar la cantidad de ácido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra celular), etiquetar el ácido nucleico (por ejemplo, para aplicarlo a un arreglo o a una transferencia), detectar el ácido nucleico, o cuantificar la cantidad de un ácido nucleico específico en una muestra. En un aspecto, se amplifica el mensaje aislado de una célula o una biblioteca de ADNc.

La persona versada en el arte puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación de oligonucleótidos adecuados. Los métodos de amplificación también son conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR (véase, por ejemplo, PCR Protocols, A Guide To Methods And Applications, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR Strategies (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89: 117); amplificación de la transcripción (véase. por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA

86: 1173); y, replicación autosostenida de la secuencia (véase, por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87: 1874); amplificación de Q Beta replicasa (véase, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477 1491), ensayo de amplificación automatizado de Q-beta replicasa (véase, por ej., Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257 -271) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véase además Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307 -316‘, Sambrook; Ausubel; patentes de los Estados Unidos Nos. 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563 -564.

Determinación del grado de identidad de secuencia

La invención provee ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa que comprende las secuencias que tienen al menos 99%, o más, o identidad de secuencia completa (100%) con el ácido nucleico de ejemplo de la invención. La invención provee polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa que comprende las secuencias que tienen al menos 99% o más, o identidad de secuencia completa (100%) con un polipéptido de ejemplo de la invención. El grado de identidad de secuencia (homología) se puede determinar usando

cualquier programa de ordenador y parámetros asociados, incluyendo aquellos descritos aquí, tales como BLAST

2.2.2 o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros predeterminados.

El texto "sustancialmente idénticos" en el contexto de dos ácidos nucleicos puede referirse a dos o más secuencias que tienen, por ejemplo, al menos 98%, 99%, o más identidad de nucleótidos (secuencia), cuando se comparan y se alinean para máxima correspondencia, cuando se mide usando cualquier algoritmo de comparación de secuencia conocido, como se discute en detalle a continuación, o por medio de inspección visual. En aspectos alternativos, la divulgación provee secuencias de ácido nucleico y de polipéptidos que tienen identidad sustancial con un ejemplo de secuencia de la divulgación sobre una región de al menos aproximadamente 10, 20, 30. 40, 50, 100, 150. 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más residuos, o una región que oscila entre aproximadamente 50 residuos hasta la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. Las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden ser sustancialmente idénticas sobre la longitud completa de una región que codifica al polipéptido.

Las secuencias homólogas también incluyen secuencias de ARN en las cuales las uridinas reemplazan a las timinas en las secuencias de ácido nucleico. Las secuencias homólogas pueden ser obtenidas usando cualquiera de los procedimientos descritos aquí o pueden resultar de la corrección de un error de secuenciación. Se apreciará que las secuencias de ácido nucleico como las expuestas aquí puedan ser representadas en un formato tradicional de carácter individual (véase, por ejemplo, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3ra Ed., W. H Freeman & Co., New York) o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleótidos en una secuencia.

Se utilizan en este aspecto de la invención diferentes programas de comparación de secuencias identificadas aquí. Se pueden evaluar las identidades de las secuencias de proteína y/o de ácido nucleico identificadas (homologías) usando cualquiera entre una variedad de algoritmos y programas de comparación de secuencia conocidos en el arte. Tales algoritmos y programas incluyen, pero no se limitan a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85(8): 2444 -2448, 1988; Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215(3): 403 -410, 1990; Thompson y colaboradores, Nucleic Acid Res. 22(2): 4673 -4680, 1994; Higgins y colaboradores, Methods Enzymol. 266: 383 -402, 1996; Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215(3): 403 -410, 1990; Altschul y colaboradores, Nature Genetics 3: 266 -272, 1993).

La homología o identidad de secuencia se puede medir usando software de análisis de secuencia (por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencia del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal software empareja secuencias similares al asignarles grados de homología a diferentes supresiones, sustituciones y otras modificaciones. Los términos “homología" e “identidad” en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación o región designada como se mide usando cualquier número de algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Para comparación de secuencias, una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia de la invención, para lo cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se ingresan las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan las subsecuencias coordinadas si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar los parámetros de programa predeterminados, o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación", como se usa aquí, incluye la referencia a un segmento de cualquiera de los números de residuos contiguos. Por ejemplo, los residuos contiguos que oscilan desde 20 hasta la longitud completa de un ejemplo de una secuencia de polipéptido o de ácido nucleico de la invención se comparan con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de forma óptima. Si la secuencia de referencia tiene la identidad de secuencia requerida con respecto a un ejemplo de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con una secuencia de la invención, esa secuencia está dentro del alcance de la invención.

Los métodos de alineación de secuencia para comparación son bien conocidos en el arte. En aspectos alternativos, la alineación óptima de secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2444, 1988, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual. Otros algoritmos para determinación homología o identidad incluyen, por ejemplo, además de un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool en el National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Stadistical Evaluation

Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparatlve Analysis Node), BLIMPS (BLocks lMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, el algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package). GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparación), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program). MACAW (Multiple Alignment Construcción & Analysis workbench), MAP (Multiple Alignment Program). MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alígnment), SAGA (Sequence Alígnment by Genetic Algorithm) y WHAT-IF. Tales programas de alineación también se pueden utilizar para la criba de bases de datos genómicas para identificar secuencias de polinucleótidos que tienen secuencias sustancialmente idénticas. Una cantidad de bases de datos de genomas están disponibles, por ejemplo, una parción sustancial del genoma humano está disponible como parte del Human Genome Sequencing Project (Gibbs, 1995). Varios genomas han sido secuenciados. por ejemplo, de M. genitalium (Fraser y colaboradores. 1995). M. jannaschii (Bult y colaboradores, 1996), H. influenzae (Fleischmann y colaboradores. 1995), E. coli (Blattner y colaboradores, 1997) y levadura (S. cerevisiae) (Mewes y colaboradores, 1997) y D. melanogaster (Adams y colaboradores, 2000). También se han hecho progresos significativos en la secuenciación de los genomas del organismo modelo, tal como ratón, C. elegans y Arabadopsis sp. Las bases de datos que contienen información genómica anotada con alguna información funcional son mantenidas por diferentes organizaciones y son accesibles por Internet.

Los algoritmos BLAST, BLAST 2.0 y BLAST 2.2.2 también pueden ser utilizados. Se describen, por ejemplo, en Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389 -3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 -410. El software para realizar el análisis por BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia pregunta, que o bien coincide o satisface algún puntaje T del umbral valorado como positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul (1990) ver más arriba). Estas coincidencias de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar los HSP más largos que las contienen. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como se pueda aumentar el puntaje de alineación acumulado. Los puntajes acumulados se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0). Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular el puntaje acumulado. La extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección se detienen cuando: el puntaje de alineación acumulado cae en una cantidad X de su valor máximo alcanzado; el puntaje acumulado va hasta cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cada secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como parámetros predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como parámetros predeterminados una longitud de palabra de 3 y expectativas (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89: 10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que provee una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos ocurriría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es aproximadamente menor a 0,2, más preferentemente aproximadamente menor a 0,01 y lo más preferible aproximadamente menor a 0,001. En un aspecto, las homologías de secuencia de proteínas y de ácidos nucleicos se evalúan utilizando Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"). Por ejemplo, se pueden utilizar cinco programas BLAST específicos para llevar a cabo la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia pregunta de aminoácidos contra una base de datos de secuencia de proteína; (2) BLASTN compara una secuencia pregunta de nucleótidos contra una base de datos de secuencia de nucleótidos; (3) BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia pregunta de nucleótidos (ambas hebras) contra una base de datos de secuencia de proteína; (4) TBLASTN compara una secuencia pregunta de proteína contra una base de datos de secuencia de nucleótidos traducida en todos los seis marcos de lectura (ambas hebras); y, (5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia pregunta de nucleótidos contra las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos. Los programas BLAST identifican secuencias homólogas mediante la identificación de segmentos similares, que se denominan aquí como “pares de segmentos de alta puntuación", entre una secuencia pregunta de ácido nucleico o aminoácidos y una secuencia de prueba que se obtiene preferiblemente de una base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos. Los pares de segmentos de alta puntuación se identifican preferiblemente (es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntuación, muchos de los cuales son conocidos en el arte. Preferiblemente, la matriz de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet y colaboradores, Science 256: 1443 -1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17: 4961, 1993), Menos preferiblemente, lse pueden utilizar también las matrices PAM o PAM250 (véase, por ejemplo, Schwartz y Díahoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).

En un aspecto de la divulgación, para determinar si un ácido nucleico tiene la identidad de secuencia requerida para estar dentro del alcance de la invención, se utilizan los programas NCBI BLAST 2.2.2, con opciones de parámetros predeterminados para blastp. Existen aproximadamente 38 opciones de configuración en el programa BLAST 2.2.2. En este aspecto de la divulgación que sirve de ejemplo, se usan todos los valores predeterminados excepto para la configuración de filtración predeterminada (es decir, se fijan todos los parámetros predeterminados excepto la filtración, que se fija en OFF); en su lugar, se usa una configuración "-F F", que desactiva la filtración. El uso de la filtración en forma predeterminada a menudo conduce a violaciones de Karlin-Altschul debido a la corta longitud de la secuencia.

Los valores predeterminados usados en este aspecto de la divulgación que sirve como ejemplo y para determinar los valores en la Figura 3, como se discutió anteriormente, incluyen:

“Filtro para baja complejidad: ON

Tamaño de palabra: 3

Matriz: Blosum62

Costos de los espacios: Existencia:11

Extensión: 1"

Otras parámetros predeterminados pueden ser: filtro para baja complejidad OFF, tamaño de palabra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalidad por existencia de espacios de -11 y una penalidad por extensión de espacio de -1. Un ejemplo de configuración del programa NCBI BLAST 2.2.2 tiene el parámetro de opción “-W" en 0. Esto significa que, si no se ajusta, el tamaño de palabra es por defecto 3 para las proteínas y 11 para los nucleótidos.

Sistemas computarizados y productos de programas de cómputo

Para determinar e identificar identidades de secuencia, homologías estructurales, motivos y similares in silico, se puede almacenar, registrar y manipular la secuencia de la invención en cualquier medio que pueda ser leído y accesado por un ordenador. Por lo tanto, la divulgación provee ordenadores, sistemas de cómputo, medios Iegibles por el ordenador, productos de programas de cómputo y similares, registradas o almacenadas con respecto a las secuencias de ácido nucleico y polipéptidos de la invención. Como se utilizan aquí, las palabras "registrado" y “almacenado” se refieren a un proceso para almacenamiento de información en un medio computarizado. Una persona capacitada en la materia puede adoptar cualquiera de los métodos conocidos para registro de la información en un medio legible por el ordenador para generar producciones que comprenden una o más de las secuencias de ácido nucleico y/o de polipéptidos de la invención.

La divulgación también provee ordenadores y procesadores que comprenden productos de programas de computación que comprenden las secuencias de la invención; y como se utiliza aquí, los términos “ordenador”, "programa de cómputo" y “procesador" se utilizan en su contexto general más amplio e incorporan todos esos dispositivos, como se describe en detalle a continuación. Una "secuencia codificadora de" o una “secuencia que codifica" un polipéptido o proteína particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe y traduce en un polipéptido o proteína cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.

Otro aspecto de la divulgación es un medio legible por el ordenador que tiene registrado al respecto al menos una secuencia de ácido nucleico y/o de polipéptido de la invención. Los medios legibles por el ordenador incluyen medios legibles en forma magnética, medios legibles en forma óptica, medios legibles en forma electrónica y medios magnéticos/ópticos. Por ejemplo, los medios legibles por ordenador pueden ser un disco duro, un disco blando, una cinta magnética, CD-ROM, disco digital versátil (DVD), memoria de acceso aleatoria (RAM), o memoria únicamente de lectura (ROM) así como también otros tipos de medios conocidos por personas capacitadas en el arte.

Aspectos de la divulgación incluyen sistemas (por ejemplo, sistemas basados en Internet), particularmente sistemas computarizados, que almacenan y manipulan las secuencias e información de las secuencias descritas aquí. Un ejemplo de un sistema de cómputo 100 se ilustra en forma de un diagrama de bloque de la Figura 1. Como se utiliza aquí, “un sistema de cómputo" se refiere a los componentes del hardware, componentes del software y componentes de almacenamiento de datos usados para analizar una secuencia de nucleótidos o de polipéptidos de la invención. El sistema de cómputo 100 puede incluir un procesador para procesamiento, acceso y manipulación de los datos de la secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo conocido de unidad central de procesamiento, tal como, por ejemplo, el Pentium IIl de Intel Corporation, o un procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD o International Business Machines. El sistema de cómputo 100 es un sistema de propósito general que comprende el procesador 105 y uno o más y componentes internos de almacenamiento de datos 110 para almacenamiento de datos y uno o más dispositivos de recuperación de datos para recuperar los datos almacenados en los componentes

de almacenamiento de datos. Una persona capacitada en la materia puede apreciar fácilmente que cualquiera de los sistemas de computarizados disponibles actualmente es adecuado.

En un aspecto, el sistema de cómputo 100 incluye un procesador 105 conectado a un bus que está conectado a una memoria principal 115 (preferiblemente implementada como RAM) y uno o más dispositivos internos de almacenamiento de datos 110, tal como un disco duro y/o otros medios Iegibles por el ordenador que tiene datos registrados en él. El sistema de cómputo 100 también puede incluir uno o más dispositivos de recuperación de datos 118 para leer los datos almacenados en los dispositivos internos de almacenamiento de datos 110. El dispositivo de recuperación de datos 118 puede representar, por ejemplo, un dispositivo para disco blando, un dispositivo para disco compacto, un dispositivo para disco magnético, o un modem capaz de conectarse a un sistema remoto de almacenamiento de datos (por ejemplo, a través de la Internet) etc. En algunas formas de realización, el dispositivo de almacenamiento interno de datos 110 es un medio removible legible por el ordenador tal como un disco blando, un disco compacto, una cinta magnética. etc. que contiene lógica de control y/o datos registrados en el mismo. El sistema de cómputo 100 puede, incluir convenientemente, o ser programado mediante un software apropiado para leer los datos de lógica de control y/o los datos del componente de almacenamiento de datos una vez insertado en el dispositivo de recuperación de datos. El sistema de cómputo 100 incluye una pantalla 120 que se usa para mostrar el resultado a un usuario del ordenador. También se debe observar que el sistema de cómputo 100 puede estar enlazado a otros sistemas de cómputo 125a-c en una red o red de área ancha para proporcionar acceso centralizado al sistema de cómputo 100. El software para acceder y procesar las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de la invención puede residir en la memoria principal 115 durante la ejecución. En algunos aspectos, el sistema de cómputo 100 puede comprender, además, un algoritmo de comparación de secuencias para comparar una secuencia de ácido nucleico de la invención. El algoritmo y la(s) secuencia(s) se pueden almacenar en un medio legible por el ordenador. Un "algoritmo de comparación de secuencias" se refiere a uno o más programas que se implementan (en forma local o remota) sobre el sistema de cómputo 100 para comparar una secuencia de nucleótidos con otras secuencias de nucleótidos y/o los compuestos almacenados en el medio de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparación de secuencias puede comparar las secuencias de nucleótidos de la invención almacenadas en un medio legible por el ordenador para las secuencias de referencia almacenadas en un medio legible por el ordenador para identificar homologías o motivos estructurales.

Los parámetros usados con los algoritmos anteriores pueden ser adaptados dependiendo de la longitud de la secuencia y del grado de homología estudiado. En algunos aspectos, los parámetros pueden ser los parámetros predeterminados usados por los algoritmos en ausencia de instrucciones del usuario. La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia de nucleótidos o de proteínas con una base de datos de secuencias a fin de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos. La base de datos de las secuencias puede ser una base de datos privada almacenada en el sistema de cómputo 100, o una base de datos pública tal como GENBANK que se encuentra disponible a través de Internet. El proceso 200 comienza en un estado de inicio 201 y luego pasa a un estado 202 en donde la nueva secuencia a ser comparada se almacena en una memoria en un sistema de cómputo 100. Como se discutió anteriormente, la memoria podría ser cualquier tipo de memoria, inclusive RAM o un dispositivo de almacenamiento interno. El proceso 200 luego pasa a un estado 204 en donde una base de datos de secuencias se abre para análisis y comparación. El proceso 200 luego pasa a un estado 206 en donde la primera secuencia almacenada en la base de datos se lee en una memoria en el ordenador. Se realiza luego una comparación en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es igual a la segunda secuencia. Es importante notar que este paso no se limita a realizar una comparación exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia en la base de datos. Los métodos son conocidos por aquellos versados en el arte para comparar dos secuencias de nucleótidos o de proteínas, incluso si no son idénticas. Por ejemplo, se pueden introducir espacios en una secuencia a fin de elevar el nivel de homología entre las dos secuencias evaluadas. Los parámetros que controlan si se introducen espacios u otras características en una secuencia durante la comparación, por lo general son ingresados por el usuario del sistema de cómputo. Una vez que se ha realizado una comparación de las dos secuencias en el estado 210, se hace una determinación en un estado de decisión 210 de si las dos secuencias son iguales. Desde luego, el término "iguales" no se limita a las secuencias que son absolutamente idénticas. Las secuencias que están dentro de los parámetros de homología ingresados por el usuario se marcarán como “iguales” en el proceso 200. Si se determina que las dos secuencias son iguales, el proceso 200 pasa a un estado 214 en donde se muestra al usuario el nombre de la secuencia de la base de datos. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre visualizado cumple con las restricciones de homología que fueron ingresadas. Una vez que el usuario visualiza el nombre de la secuencia almacenada, el proceso 200 pasa a un estado de decisión 218 en donde se determina si existen más secuencias en la base de datos. Si no existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en un estado final 220. Sin embargo, si existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 pasa a un estado 224 en donde un indicador se mueve a la próxima secuencia en la base de datos de manera tal que pueda ser comparada con la nueva secuencia. De esta forma, se alinea y compara la secuencia nueva con cada secuencia en la base de datos. Debe observarse que si se hizo una determinación en el estado de decisión 212 de que las secuencias no eran homólogas, entonces el proceso 200 pasará inmediatamente al estado de decisión 218 a fin de determinar si cualquier otra secuencia estaba disponible en la base de datos para comparación. Por lo tanto, un aspecto de la divulgación es un sistema de cómputo que comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenado en el mismo una secuencia de ácido nucleico de

la invención y un comparador de secuencia para realizar la comparación. El comparador de secuencia puede indicar un nivel de homología entre las secuencias comparadas o identificar los motivos estructurales, o puede identificar los motivos estructurales en las secuencias que se comparan con estos códigos de ácido nucleico y con códigos de polipéptido. La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una realización de un proceso 250 en un ordenador para determinar si dos secuencias son homólogas. El proceso 250 comienza en un estado de inicio 252 y luego pasa a un estado 254 en donde se almacena en una memoria una primera secuencia a ser comparada. Luego se almacena en una memoria una segunda secuencia a ser comparada en un estado 256. El proceso 250 luego pasa a un estado 260 en donde el primer carácter en la primera secuencia es leído y luego pasa a un estado 262 en donde el primer carácter de la segunda secuencia es leído. Debe entenderse que si la secuencia es una secuencia de nucleótidos, entonces el carácter es normalmente A, T, C, G o U. Si la secuencia es una de secuencia de proteína, entonces puede ser un código de aminoácidos de una sola letra de manera tal que la primera y la segunda secuencia puedan ser fácilmente comparadas. Se hace luego una determinación en un estado de decisión 264 de si los dos caracteres son iguales. Si lo son, entonces el proceso 250 pasa a un estado 268 en donde son leídos los próximos caracteres en la primera y segunda secuencias. Se determina entonces si los próximos caracteres son iguales. Si lo son, entonces el proceso 250 continúa este circuito hasta que dos caracteres no son iguales. Si se determina que los próximos dos caracteres no son iguales, el proceso 250 pasa a un estado de decisión 274 para determinar si existen más caracteres en cualquier secuencia para ser leídos. Si no existen más caracteres por ser leídos, entonces el proceso 250 pasa a un estado 276 en donde se muestra al usuario el nivel de homología entre la primera y la segunda secuencia. El nivel de homología se determina al calcular la proporción de caracteres entre las secuencias que no eran iguales del número total de secuencias en la primera secuencia. Por lo tanto, si cada carácter en una primera secuencia de nucleótidos 100 se alinea con cada carácter en una segunda secuencia, el nivel de homología sería del 100%.

En forma alternativa, el programa de computación puede comparar una secuencia de referencia con una secuencia de la invención para determinar si las secuencias difieren en una o más posiciones. El programa puede registrar la longitud e identidad de los residuos de aminoácidos o nucleótidos insertados, suprimidos o sustituidos con respecto a la secuencia ya sea de la referencia o de la invención. El programa de computación puede ser un programa que determina si una secuencia de referencia contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) con respecto a una secuencia de la invención, o, si una secuencia de la invención comprende un SNP de una secuencia conocida. Así, en algunos aspectos, el programa informático es un programa que identifica SNPs. El método puede ser implementado por los sistemas computarizados descritos anteriormente y el método ilustrado en la Figura 3. El método puede ser realizado leyendo una secuencia de la invención y las secuencias de referencia a través del uso del programa de cómputo e identificar las diferencias con el programa de cómputo.

En otros aspectos, el sistema basado en un ordenador comprende un identificador para identificar características en un ácido nucleico o polipéptido de la invención. Un “identificador” se refiere a uno o más programas que identifican ciertas características en una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un identificador puede comprender un programa que identifica un marco de lectura abierto (ORF) en una secuencia de ácido nucleico. La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia. El proceso 300 comienza en un estado de inicio 302 y luego pasa a un estado 304 en donde una primera secuencia que va a ser verificada en cuanto a sus características se almacena en una memoria 115 en el sistema de cómputo 100. El proceso 300 pasa luego a un estado 306 en donde se abre una base de datos de características de secuencia. Dicha base de datos incluiría una lista de cada atributo de la característica junto con el nombre de la característica. Por ejemplo, un nombre de característica podría ser “Codón de inicio" y el atributo sería "ATG". Otro ejemplo sería el nombre de la característica “Caja TAATAA" y el atributo de la característica sería “TAATAA". Un ejemplo de dicha base de datos es producido por la University of Wisconsin Genetics Computer Group. En forma alternativa, las características pueden ser motivos estructurales de polipéptidos tales como hélices alfa, láminas beta, o motivos de polipéptidos funcionales tales como sitios activos enzimáticos, motivos hélice-vuelta-hélice u otros motivos conocidos por aquellos capacitados en el arte. Una vez que se abre la base de datos de las características en el estado 306, el proceso 300 pasa a un estado 308 en donde la primera característica es leída de la base de datos. Luego se realiza una comparación del atributo de la primera característica con la primera secuencia en un estado 310. Luego se determina en un estado de decisión 316 si se encontró el atributo de la característica en la primera secuencia. Si se encontró el atributo, entonces el proceso 300 pasa a un estado 318 en donde se muestra al usuario el nombre de la característica encontrada. El proceso 300 luego pasa a un estado de decisión 320 en donde se determina si existen más características en la base de datos. Si no existen más características, entonces el proceso 300 termina en un estado final 324. Sin embargo, si existen más características en la base de datos, entonces el proceso 300 lee la próxima característica de la secuencia en un estado 326 y regresa al estado 310 en donde el atributo de la próxima característica es comparado contra la primera secuencia. Si el atributo de la característica no se encuentra en la primera secuencia en el estado de decisión 316, el proceso 300 pasa directamente al estado de decisión 320 a fin de determinar si existen más características en la base de datos. Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación provee un programa informático que identifica marcos de lectura abiertos (ORFs).

Una secuencia de polipéptidos o de ácido nucleico de la invención puede ser almacenada y manipulada en una variedad de programas de procesamiento de datos en una variedad de formatos. Por ejemplo, se puede almacenar

una secuencia como texto en un archivo de procesamiento de texto, tal como Microsoft WORD o WORDPERFECT o como un archivo ASCII en una variedad de programas de bases de datos familiares para aquellos capacitados en el arte, tales como DB2MR, SYBASEMR, u ORACLEMR. Asimismo, muchos programas de computación y bases de datos pueden ser usados como algoritmos de comparación de secuencias, identificadores o fuentes de secuencias de nucleótidos de referencia o secuencias de polipéptidos a ser comparadas con una secuencia de ácido nucleico de la invención. Los programas y las bases de datos usados en la práctica de la divulgación incluyen, pero no se limitan a: MACPATTERNMR (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GENEMINEMR (Molecular Applications Group), LOOKMR (Molecular Applications Group), MACLOOKMR (Molecular Applications Group), BLAST y BLAST2 (NCBl), BLASTN y BLASTX (Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 85: 2444, 1988), FASTDBTM (Brutlag y colaboradores. Comp. App. Biosci. 6: 237 -245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), CATALYSTMR / SHAPEMR (Molecular Simulations Inc.), CERIUS2.DB ACCESSMR (Molecular Simulations Inc.), HYPOGENMR (Molecular Simulations Inc.), INSIGHT IIMR , (Molecular Simulations Inc.), DISCOVERMR (Molecular Simulations Inc.), CHARMMMR (CHARMmMR) (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DELPHIMR , (Molecular Simulations Inc.), QUANTEMMMR , (Molecular Simulations Inc.), HOMOLOGYMR (Molecular Simulations lnc.), MODELERMR (Molecular Simulations Inc.), ISISMR (Molecular Simulations Inc.), QUANTAMR / Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WEBLABMR (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB DIVERSITY EXPLORERMR (Molecular Simulations Inc), GENE EXPLORERMR (Molecular Simulations Inc.), SEQFOLDMR (Molecular Simulations Inc.), la base de datos de MDL Available Chemicals Directory, la base de datos de MDL Drug Data Report, la base de datos de Comprehensive Medicinal Chemistry, la base de datos de Derwent's World Drug Index, la base de datos de BioByteMasterFile, la base de datos del GenBank y la base de datos de Genseqn. Muchos otros programas y bases de datos serán evidentes para aquella persona versada en el arte a partir de la presente divulgación.

Los motivos que pueden ser detectados usando los programas anteriormente mencionados incluyen secuencias que codifican cremalleras de leucina, motivos de hélice-vuelta-hélice, sitios de glicosilación, sitios de ubiquitinación, hélices alfa, y láminas beta, secuencias señal que codifican péptidos señal que dirigen secreción de las proteínas codificadas, secuencias implicadas en la regulación de la transcripción tal como cajas homeocajas, tramos ácidos, sitios enzimáticos activos, sitios de enlazamiento de sustratos y sitios de escisión enzimáticos.

Hibridación de ácidos nucleicos

La invención provee ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes, que se hibridan bajo condiciones rigurosas con una secuencia de ejemplo de la invención, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Las condiciones rigurosas pueden ser condiciones rigurosas altas, condiciones rigurosas medias, condiciones rigurosas bajas, incluyendo las condiciones de rigurosidad alta y reducida descritas aquí. En un aspecto, es la rigurosidad de las condiciones de lavado las que establecen las condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención, como se describe a continuación.

Los protocolos de "hibridación" incluyen procesos mediante los cuales una hebra de ácido nucleico se une a una hebra complementaria a través de apareamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas de manera tal que se puede identificar una secuencia de interés particular incluso en muestras en las que está presente en bajas concentraciones. Las condiciones rigurosas pueden ser definidas, por ejemplo, por las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridación e hibridación, o por la temperatura de hibridación y son conocidas en el arte. Por ejemplo, se puede incrementar la rigurosidad al reducir la concentración de la sal, incrementar la concentración de formamida, o elevar la temperatura de hibridación, alterando el tiempo de hibridación, como se describe en detalle, a continuación. En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad de hibridar bajo diversas condiciones de rigurosidad (por ejemplo, alto, medio y bajo), como se expone aquí.

En realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones rigurosas que pueden ser de aproximadamente cinco residuos y la longitud completa de ácido nucleico de la divulgación; por ejemplo, pueden ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, o más residuos de longitud. Los ácidos nucleicos más cortos que la longitud completa también están incluidos. Estos ácidos nucleicos pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas de hibridación, sondas de marcación, sondas de oligonucleótido para la PCR, ARNi, antisentido o secuencias que codifican péptidos de enlazamiento a anticuerpos (epítopos), motivos, sitio activos y similares.

En un aspecto, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de alta rigurosidad que comprenden condiciones de aproximadamente 50% de formamida aproximadamente entre 37 °C y 42 °C. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de rigurosidad reducida que comprenden condiciones de aproximadamente 35% a 25% de formamida aproximadamente entre 30 °C y 35 °C.

En forma alternativa, los ácidos nucleicos de la divulgación se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de alta rigurosidad que comprenden condiciones a 42 °C en 50% de formamida, 5X SSPE, 0,3% de SDS y una secuencia repetitiva que bloquea al ácido nucleico, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmón (por ejemplo, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado). En un aspecto, se definen ácidos nucleicos de la divulgación por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de rigurosidad reducida que comprenden 35% de formamida a una temperatura reducida de 35 °C.

Después de la hibridación, se puede lavar el filtro con 6X SSC, 0,5% de SDS a 50 °C. Estas condiciones son consideradas condiciones “moderadas” por encima de 25% de formamida y condiciones "bajas" por debajo de 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones "moderadas" de hibridación es cuando se realiza la hibridación con 30% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "rigurosidad baja” es cuando la hibridación se realiza con 10% de formamida.

El rango de temperatura correspondiente a un nivel particular de rigurosidad puede hacerse adicionalmente más estrecho calculando la proporción de purina con respecto a la pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando en forma apropiada la temperatura. Los ácidos nucleicos de la divulgación también se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de rigurosidad alta, media y baja, como se expone en Ausubel y Sambrook. Las variaciones en los rangos y condiciones anteriormente mencionados son conocidos en el arte. Las condiciones de hibridación son discutidas de manera adicional a continuación.

El procedimiento anterior puede ser modificado para identificar los ácidos nucleicos que tienen niveles reducidos de homología con respecto a la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos de homología reducida con respecto a la sonda detectable, se pueden utilizar condiciones menos rigurosas. Por ejemplo, se puede reducir la temperatura de hibridación en incrementos de 5 °C, desde 68 °C hasta 42 °C en un regulador de hibridación que tiene una concentración de Na+ de aproximadamente 1 M. Después de la hibridación, se puede lavar el filtro con 2X SSC, 0,5% de SDS a la temperatura de hibridación. Estas condiciones se considera que son condiciones “moderadas” por encima de 50 °C y condiciones "bajas" por debajo de 50 ºC. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación “moderadas” es cuando la hibridación anterior se realiza a 55 ºC. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "rigurosidad baja" es cuando la hibridación se realiza a 45 °C.

En forma alternativa, la hibridación se puede llevar a cabo en reguladores, tales como 6X SSC, que contienen formamida a una temperatura de 42 °C. En este caso, la concentración de formamida en el regulador de hibridación se puede reducir en incrementos del 5% desde 50% hasta 0% para identificar clones que tienen niveles reducidos de homología con respecto a la sonda. Después de la hibridación, se puede lavar el filtro con 6X SSC, 0,5% de SDS a 50°C. Estas condiciones se considera que son condiciones “moderadas” por encima del 25% de formamida y condiciones “bajas” por debajo del 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones "moderadas" de hibridación es cuando la hibridación anterior se realiza con 30% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación “de rigurosidad baja" es cuando la hibridación se realiza con 10% de formamida.

Sin embargo, la selección de un formato de hibridación no es crítica -es la rigurosidad de las condiciones de lavado que establecen las condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance de la divulgación. Las condiciones de lavado usadas para identificar los ácidos nucleicos dentro del alcance de la divulgación incluyen, por ejemplo: una concentración de sal de aproximadamente 0,02 molar a un pH de 7 y una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C o aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 60 ºC; o, una concentración de sal de aproximadamente 0,15 M de NaCl a 72 °C durante aproximadamente 15 minutos; o una concentración de sal de aproximadamente 0,2X SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C o aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20 minutos; o, el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución con una concentración de sal de aproximadamente 2X SSC que contiene 0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se lava dos veces por 0,1X SSC que contiene 0,1% de SDS a 68 °C durante 15 minutos; o condiciones equivalentes. Véase Sambrook, Tijssen y Ausubel para una descripción del regulador de SSC y condiciones equivalentes.

Estos métodos se pueden usar para aislar los ácidos nucleicos de la divulgación.

Sondas de oligonucleótidos y métodos para usarlas

La divulgación también provee sondas de ácido nucleico que se pueden usar, por ejemplo, para identificar ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con actividad de amilasa o fragmentos del mismo, o para identificar genes de amilasa. En un aspecto, la sonda comprende al menos 10 bases consecutivas de un ácido nucleico de la divulgación. De forma alternativa, una sonda de la divulgación puede ser al menos de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 o aproximadamente de 10 a 50, aproximadamente de 20 a 60, aproximadamente de 30 a 70 bases consecutivas de una secuencia como se expone en un ácido nucleico de la divulgación. Las sondas identifican un ácido nucleico por enlazamiento y/o hibridación. Las sondas se pueden usar en los arreglos de la divulgación, véase la discusión a continuación, incluyendo, por

ejemplo, arreglos capilares. Las sondas de la divulgación también se pueden usar para aislar otros ácidos nucleicos

o polipéptidos.

Las sondas de la divulgación se pueden usar para determinar si una muestra biológica, tal como una muestra de suelo, contiene un organismo que tiene una secuencia de ácido nucleico de la invención o un organismo a partir del cual se obtuvo el ácido nucleico. En tales procedimientos, se obtiene una muestra biológica que potencialmente aloja al organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, y se obtienen los ácidos nucleicos de la muestra. Los ácidos nucleicos se ponen en contacto con la sonda bajo condiciones que permiten que la sonda se hibride específicamente con cualquier secuencia complementaria presente en la muestra. Cuando sea necesario, se pueden determinar las condiciones que permiten que la sonda se hibride específicamente con secuencias complementarias al poner la sonda en contacto con las secuencias complementarias de las muestras que se sabe que contienen la secuencia complementaria, así como también secuencias de control que no contienen la secuencia complementaria. Las condiciones de hibridación, tales como la concentración de sal del regulador de hibridación, la concentración de formamida del regulador de hibridación, o la temperatura de hibridación, se pueden variar para identificar las condiciones que permiten que la sonda se hibride específicamente con ácidos nucleicos complementarios (véase discusión sobre las condiciones de hibridación especificas).

Si la muestra contiene el organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, se detecta luego la hibridación específica de la sonda. La hibridación puede ser detectada mediante la marcación de la sonda con un agente detectable tal como un isótopo radioactivo, un colorante fluorescente o una enzima capaz de catalizar la formación de un producto detectable. Muchos métodos para usar las sondas marcadas para detectar la presencia de ácidos nucleicos complementarios en una muestra son familiares para aquellos capacitados en el arte. Estos incluyen transferencias del tipo Southern, transferencias del tipo Northern, procedimientos de hibridación de colonias y transferencias puntuales. Los protocolos para cada uno de estos procedimientos son proporcionados en Ausubel y Sambrook.

En forma alternativa, se puede usar más de una sonda (al menos una que sea capaz de hibridarse en forma específica con cualquier secuencia complementaria presente en la muestra de ácido nucleico), en una reacción de amplificación para determinar si la muestra contiene un organismo que contiene una secuencia de ácido nucleico de la divulgación (por ejemplo, un organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico). En un aspecto, las sondas comprenden oligonucleótidos. En un aspecto, la reacción de amplificación puede comprender una reacción PCR. Los protocolos de PCR se describen en Ausubel y Sambrook (véase la discusión sobre las reacciones de amplificación). En tales procedimientos, los ácidos nucleicos en la muestra se ponen en contacto con las sondas, se realiza la reacción de amplificación y se detecta cualquier producto de amplificación. El producto de amplificación se puede detectar mediante la realización de electroforesis en gel sobre los productos de reacción y tiñendo el gel con un intercalador tal como bromuro de etidio. En forma alternativa, se pueden marcar una o más de las sondas con un isótopo radioactivo y se puede detectar la presencia de un producto de amplificación radioactivo mediante autorradiografía después de la electroforesis de gel.

Las sondas derivadas de las secuencias cerca de los extremos 3' o 5' de una secuencia de ácido nucleico de la invención también se pueden usar en procedimientos de paseo cromosómico para identificar los clones que contienen secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias genómicas. Tales métodos permiten el aislamiento de genes que codifican proteínas adicionales de interés del organismo huésped.

En un aspecto, las secuencias de ácido nucleico de la divulgación se usan como sondas para identificar y aislar ácidos nucleicos relacionados. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos relacionados así identificados pueden ser ADNc o ADN genómicos de organismos diferentes de aquellos a partir de los cuales se aisló primero el ácido nucleico de la invención. En dichos procedimientos, se pone en contacto una muestra de ácido nucleico con la sonda bajo condiciones que permiten que la sonda se hibride en forma específica con las secuencias relacionadas. La hibridación de la sonda con ácidos nucleicos del organismo relacionado se detecta luego usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

En las reacciones de hibridación de ácido nucleico, las condiciones usadas para alcanzar un nivel particular de rigurosidad pueden variar, dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que están siendo hibridados. Por ejemplo, se pueden considerar la longitud, el grado de complementariedad, la composición de las secuencia de nucleótidos (por ejemplo, el contenido de GC versus el de AT) y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN versus ADN) de la regiones de hibridación de los ácidos nucleicos al seleccionar las condiciones de hibridación. Una consideración adicional es si se inmoviliza uno de los ácidos nucleicos, por ejemplo, sobre un filtro. La hibridación se puede llevar a cabo bajo condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad moderada o rigurosidad alta. Como ejemplo de hibridación de ácido nucleico, se hibrida previamente primero una membrana polimérica que contiene ácidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados durante 30 minutos a 45 °C en una solución que consiste de 0,9 M de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, pH 7,0, 5,0 mM de Na2EDTA, 0,5% de SDS, 10X reactivo de Denhardt y 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. Se pueden añadir luego a la solución aproximadamente 2 X 107 cpm (actividad específica 49 X 108 cpm/µg) de una sonda de oligonucleótido marcada en el extremo con 32P. Después de 12-16 horas de incubación, se lava la membrana durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) en 1X SET (150 mM de NaCI, 20

mM de clorhidrato de Tris, pH 7,8, 1 mM de Na2EDTA) que contiene 0,5% de SDS, seguido de un lavado de 30 minutos en 1X SET fresco a Tm-10 °C para la sonda de oligonucleótido. Se expone luego la membrana a una película autorradiográfica para detección de las señales de hibridación.

AI variar la rigurosidad de las condiciones de hibridación usadas para identificar ácidos nucleicos, tales como ADNc

o ADN genómicos, que hibridan con la sonda detectable, los ácidos nucleicos que tienen diferentes niveles de homología con respecto a la sonda pueden ser identificados y aislados. La rigurosidad puede variar al realizarse la hibridación a diferentes temperaturas por debajo de las temperaturas de fusión de las sondas. La temperatura de fusión, Tm, es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la cual 50% del la secuencia objetivo se híbrida con una sonda perfectamente complementaria. Se seleccionan condiciones muy rigurosas para que sean iguales o aproximadamente 5 °C inferiores a la Tm para una sonda particular. La temperatura de fusión de la sonda se puede calcular usando las siguientes fórmulas de ejemplo. Para las sondas entre 14 y 70 nucleótidos de longitud la temperatura de fusión (Tm) se calcula usando la fórmula: Tm = 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41(fracción G+C) (600/N) donde N es la longitud de la sonda. Si la hibridación se lleva a cabo en una solución que contiene formamida, se puede calcular la temperatura de fusión usando la ecuación: Tm = 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41 (fracción G+C) -(0,63% de formamida) -(600/N) donde N es la longitud de la sonda. Se puede llevar a cabo la prehibridación en 6X SSC, 5X reactivo de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado o 6X SSC, 5X reactivo de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, 50% de formamida. Las fórmulas para SSC y el reactivo de Denhardt y otras soluciones se encuentran enlistadas, por ejemplo, en Sambrook.

La hibridación se realiza al agregar la sonda detectable a las soluciones de prehibridación mencionadas anteriormente. Cuando la sonda comprende AND bicatenario, se desnaturalizada antes de la adición a la solución de hibridación. El filtro entra en contacto con la solución de hibridación durante un período de tiempo suficiente para permitir que la sonda se hibride con ADNc o ADN genómicos que contienen secuencias complementarias con los mismos u homólogas a los mismos. Para las sondas de más de 200 nucleótidos de longitud, se puede llevar a cabo la hibridación a 15 -25 °C por debajo de la Tm. Para las sondas más cortas, tales como las sondas de oligonucleótidos, se puede realizar la hibridación a 5 -10 °C por debajo de la Tm. En un aspecto, las hibridaciones en 6X SSC se realizan aproximadamente a 68 °C. En un aspecto, las hibridaciones en soluciones que contienen 50% de formamida se realizan aproximadamente a 42 °C. Todas las hibridaciones anteriores serían consideradas bajo condiciones de alta rigurosidad.

Después de la hibridación, se lava el filtro para remover cualquier sonda detectable no enlazada en forma específica. La rigurosidad usada para lavar los filtros también puede variar dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que están siendo hibridados, la longitud de la ácidos nucleicos que están siendo hibridados, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC versus AT) y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN versus ADN). Los ejemplos de lavados con condiciones de rigurosidad progresivamente superiores son los siguientes: 2X SSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos (rigurosidad baja); 0,1X SSC, 0,5% de SDS a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (rigurosidad moderada); 0,1X SSC, 0,5% de SDS durante 15 a 30 minutos entre la temperatura de hibridación y 68 °C (rigurosidad alta); y 0,15 M de NaCI durante 15 minutos a 72°C (rigurosidad muy alta). Se puede llevar a cabo un lavado final de baja rigurosidad en 0,1X SSC a temperatura ambiente. Los ejemplos anteriores son meramente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se pueden usar para lavar los filtros. Alguien capacitado en el arte sabría que existen numerosas recetas para lavados de diferentes rigurosidad.

Los ácidos nucleicos que se hibridaron con la sonda se pueden identificar por autorradiografía u otras técnicas convencionales. El procedimiento anteriormente mencionado puede ser modificado para identificar los ácidos nucleicos que tienen niveles reducidos de homología con respecto a la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos de homología reducida con respecto a la sonda detectable, se pueden usar condiciones menos rigurosas. Por ejemplo, la temperatura de hibridación puede ser reducida en incrementos de 5 °C desde 68 °C hasta 42 °C en un regulador de hibridación que tiene una concentración de Na+ de aproximadamente 1 M. Después de la hibridación, se puede lavar el filtro con 2X SSC, 0,5% de SDS a la temperatura de hibridación. Estas condiciones se consideran condiciones "moderadas" por sobre los 50 °C y condiciones “bajas” por debajo de los 50 °C. Un ejemplo de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se realiza a 55 °C. Un ejemplo de condiciones de hibridación de "rigurosidad baja" es cuando la hibridación anterior se realiza a 45 °C.

En forma alternativa, los protocolos de hibridación se pueden llevar a cabo en reguladores, tal como 6X SSC, que contienen formamida a una temperatura de 42 °C. En este caso, la concentración de formamida en el regulador de hibridación puede reducirse en incrementos del 5% desde 50% hasta 0% para identificar clones que tienen niveles decrecientes de homología con respecto a la sonda. Después de la hibridación, se puede lavar el filtro con 6X SSC, 0,5% de SDS a 50 °C. Estas condiciones son consideradas como condiciones "moderadas" por encima del 25% de formamida y condiciones "bajas" por debajo del 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se realiza con 30% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de “rigurosidad baja" es cuando la hibridación anterior se realiza con 10% de formamida.

Estas sondas y métodos de la divulgación se pueden usar para aislar ácidos nucleicos que tienen una secuencia con al menos aproximadamente 98% de o 99% de identidad de secuencia (“homología”) con una secuencia de ácido nucleico de la invención que sirve de ejemplo. Se puede medir la homología usando un algoritmo de alineación, como se discute aquí. Por ejemplo, los polinucleótidos homólogos pueden tener una secuencia codificadora que es una variante alélica de ocurrencia natural de una de las secuencias codificadoras descritas aquí. Dichas variantes alélicas pueden tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos cuando se comparan con un ácido nucleico de la invención.

Adicionalmente, se pueden usar las sondas y métodos de la divulgación para aislar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 99%, de identidad de secuencia (homología) con un polipéptido de la invención.

Inhibición de la expresión de amilasa (que sirve de referencia)

La divulgación provee ácidos nucleicos complementarios (por ejemplo, secuencias antisentido) con las secuencias de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden ribozimas, ARNsi, ARNmi antisentido. Las secuencias antisentido son capaces de inhibir el transporte, empalme o transcripción de genes que codifican para amilasa y genes que codifican para glucoamilasa. La inhibición se puede efectuar a través del direccionamiento del ADN genómico o ARN mensajero. La transcripción o función del ácido nucleico objetivo se puede inhibir, por ejemplo, por hibridación y/o escisión. Un conjunto particularmente útil de inhibidores incluye oligonucleótidos que son capaces de enlazar ya sea un gen de amilasa o un mensaje; en cualquier caso, evitando o inhibiendo la producción o la función de la amilasa. La asociación puede ser a través de la hibridación de una secuencia específica. Otra clase útil de inhibidores incluye oligonucleótidos que causen inactivación o escisión de mensaje de amilasa. El oligonucleótido puede tener actividad enzimática, que causa dicha escisión, tal como ribozimas. Los oligonucleótido pueden ser modificado o conjugado químicamente con una enzima o composición capaz de escindir el ácido nucleico complementario. Un conjunto de muchos de tales oligonucleótidos diferentes puede ser cribado para aquellos con la actividad deseada.

Los métodos y composiciones de la invención para inhibir la expresión de amilasa, glucoamilasa, glucosidasa y otras enzimas que hidrolizan polisacáridos pueden tener una variedad de aplicaciones industriales. Por ejemplo, la inhibición de la expresión de glucosidasa puede hacer más lenta o prevenir el deterioro. El deterioro puede ocurrir cuando los polisacáridos, lípidos o polipéptidos, por ejemplo, polisacáridos estructurales, son degradados enzimáticamente. Esto puede conducir a un deterioro, o descomposición de frutas y vegetales. Las composiciones que inhiben la expresión y/o actividad de las glucosidasas, por ejemplo, anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, ribozimas y ARNi, se pueden usar para hacer más lento o prevenir el deterioro. Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación provee métodos y composiciones que comprenden la aplicación sobre un anticuerpo de planta o producto vegetal (por ejemplo, un fruto, semilla, raíz, hoja, etc.), oligonucleótidos antisentido, ribozimas y RNAi de la divulgación, por ejemplo, para demorar o evitar el deterioro, o para otro propósito. Estas composiciones también pueden expresarse por la planta (por ejemplo, una planta transgénica) u otro organismo (por ejemplo, una bacteria u otro microorganismo transformado con un gen de glucosidasa de la divulgación).

Oligonucleótidos antisentido

La divulgación provee oligonucleótidos antisentido capaces de enlazar el mensaje de amilasa que puede inhibir la actividad proteolítica dirigiendo el ARNm. La estrategias para diseñar oligonucleótidos antisentido están bien descritas en la literatura científica y de patentes, y el experto en la técnica puede diseñar tales oligonucleótidos de amilasa utilizando los nuevos reactivos de la divulgación. Por ejemplo, los protocolos de paseo de genes/ mapeo de ARN para cribar los oligonucleótidos antisentido efectivos son conocidos en el arte, véase, por ejemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314: 168 -183, que describe un ensayo de mapeo de ARN que se basa en técnicas moleculares estándar para proveer un método fácil y confiable para selección de una secuencia antisentido potente. Véase también Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191 -198.

Los ácidos nucleicos de ocurrencia natural se usan como oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser de cualquier longitud; por ejemplo, en aspectos alternativos, los oligonucleótidos antisentido están entre aproximadamente 5 a 100, aproximadamente 10 a 80, aproximadamente 15 a 60, aproximadamente 18 a 40. La longitud óptima puede ser determinada por cribado de rutina. Los oligonucleótidos antisentido pueden estar presentes en cualquier concentración. La concentración óptima se puede determinar por cribado de rutina. Se conocen una amplia variedad de análogos de ácidos nucleicos y nucleótidos de origen no natural, sintéticos, que pueden manejar este problema potencial. Por ejemplo, se pueden usar ácidos nucleicos peptídicos (PNA) que contienen estructuras base no iónicas, tales como unidades de N-(2-aminoetil) glicina. También se pueden utilizar oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces fosforotioato, como se describe en los documentos WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144: 189 -197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Los oligonucleótidos antisentido que tienen análogos de la estructura base de ADN sintético provistos por la divulgación también pueden incluir ácidos nucleicos de fosforoditioato, metilfosfonato,

fosforamidato, fosfotriester de alquilo, sulfamato, 3'-tioacetal, metilen(metilimino), 3'-N-carbamato y morfolino carbamato, como se describió anteriormente.

Se puede usar la metodología de química combinatoria para crear un gran número de oligonucleótidos que pueden ser fácilmente cribados para los oligonucleótidos específicos que tienen especificidades y afinidades de enlazamiento apropiadas hacia cualquier objetivo, tal como las secuencias de amilasa sentido y antisentido de la divulgación (véase, por ejemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270: 13581 -13584).

Ribozimas inhibidoras

La divulgación provee ribozimas capaces de enlazar un mensaje de amilasa. Estas ribozimas pueden inhibir la actividad de amilasa, por ejemplo, dirigiendo el ARNm. Las estrategias para diseñar ribozimas y seleccionar la secuencia antisentido específica de amilasa para direccionamiento son descritas en la literatura científica y de patentes, y el experto en la técnica puede diseñar tales oligonucleótidos de amilasa utilizando los nuevos reactivos de la divulgación. Las ribozimas actúan enlazándose a un ARN objetivo a través de la porción de enlazamiento al ARN objetivo de una ribozima que se mantiene muy cerca a una porción enzimática del ARN que escinde el ARN objetivo. Por lo tanto, la ribozima reconoce y enlaza un ARN objetivo a través de apareamiento de base complementarias y, una vez enlazadas al sitio correcto, actúa en forma enzimática para escindir e inactivar el ARN objetivo. La escisión de un ARN objetivo de dicha forma destruirá su habilidad de dirigir la síntesis de una proteína codificada si la escisión ocurre en la secuencia codificadora. Una vez que una ribozima ha enlazado y escindido su ARN objetivo, puede ser liberada de ese ARN para enlazar y escindir nuevos objetivos en forma repetida.

En algunas circunstancias, la naturaleza enzimática de una ribozima puede ser ventajosa sobre otras tecnologías, tales como tecnología antisentido (donde una molécula de ácido nucleico simplemente se enlaza con un ácido nucleico objetivo para bloquear su transcripción, traducción o asociación con otra molécula) ya que la concentración efectiva de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico puede ser menor e aquella de un oligonucleótido antisentido. Esta ventaja potencial refleja la habilidad de la ribozima de actuar enzimáticamente. Por lo tanto, una molécula única de ribozima es capaz de escindir muchas moléculas de ARN objetivo. Además, una ribozima es típicamente un inhibidor altamente especifico, con la especificidad de inhibición de depende no solamente del mecanismo de enlazamiento de apareamiento de bases, sino también del mecanismo mediante el cual la molécula inhibe la expresión del ARN con el cual se enlaza. Es decir, la inhibición es causada por la escisión del ARN objetivo y, por lo tanto se define la especificidad como la relación de la velocidad de escisión del ARN objetivo sobre la velocidad de escisión del ARN no objetivo. Este mecanismo de escisión depende de factores adicionales a aquellos implicados en l apareamiento de bases. Por lo tanto, la especificidad de acción de una ribozima puede ser mayor que aquella del oligonucleótido antisentido que enlaza al mismo sitio del ARN.

La ribozima de la divulgación, por ejemplo, una molécula de ARN de ribozima enzimática, se puede formar en un motivo cabeza de martillo, un motivo de horquilla, tal un motivo del virus de la hepatitis delta, un motivo del intrón del grupo I y/o un ARN del tipo de la ARNasaP junto con una secuencia guía de ARN. Los ejemplos de motivos cabeza de martillo son descritas, por ejemplo, por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; motivos de horquilla por Hampel (1989) Biochemistry 28:4929 y Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299; el motivo del virus de la hepatitis delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; el motivo ARNasaP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; y el intrón del grupo l por Cech, Patente de los Estados Unidos No. 4.987.071. Aquellos capacitados en el arte se darán cuenta que una ribozima de la divulgación, por ejemplo, una de molécula enzimática de ARN de esta divulgación, puede tener un sitio de enlazamiento específico del sustrato complementario a una o más de las regiones de ARN del gen objetivo. Una ribozima de la divulgación puede tener una secuencia de nucleótidos dentro

o alrededor de ese sitio de enlazamiento del sustrato que imparte una actividad de escisión al ARN con la molécula.

ARN de interferencia (ARNi)

Eb un aspecto, la divulgación provee una molécula ARN de inhibición, así llamada molécula de "ARNi", puede comprender una secuencia de una enzima amilasa (que incluye tanto hebras sentido como antisentido). La molécula de ARNi puede comprender una molécula de ARN bicatenaria (ARNbi), por ejemplo, ARNsi y/o ARNmi. La molécula de ARNi comprende una molécula de ARN bicatenario (ARNbi). El ARNi puede inhibir la expresión de un gen de amilasa. El ARNi, por ejemplo, el ARNsi y/o el ARNmi, pueden ser aproximadamente10,11,12,13,14,15,16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de nucleótidos dúplex de longitud. El ARNi puede entrar a una célula y causar la degradación de un ARN monocatenario (ARNmc) de secuencias similares o idénticas, incluyendo ARNm endógeno. Cuando se expone una célula a ARN bicatenario (ARNbi), se degrada selectivamente el ARNm del gen homólogo mediante un proceso llamado ARN de interferencia (ARNi). Un posible mecanismo básico detrás del ARNi s el rompimiento de un ARN bicatenario (ARNbi) que coincide con una secuencia de un gen específico en pequeñas piezas llamadas ARN de interferencia corta, lo que desencadena la degradación del ARNm que coincide con su secuencia. Los ARNi se pueden utilizar en terapias de silenciamiento génico, véase, por ejemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. EN un aspecto, la divulgación provee métodos para degrada selectivamente el ARN utilizando los ARNi de la divulgación. Los procesos se pueden llevar a cabo in vitro, ex vivo o in vivo. En un aspecto, las molécula de ARNi se pueden usar para generar una mutación de pérdida de función en una célula, un órgano o

un animal. Los métodos para elaborar y utilizar moléculas de ARNi, por ejemplo, ARNsi y/o ARNmi, para degradar selectivamente ARN son bien conocidos en el arte, véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos No. 6.506.559; 6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.

Modificación de ácidos nucleicos

La divulgación provee métodos de generación de variantes de los ácidos nucleicos de la divulgación, por ejemplo, aquellos que codifican una amilasa. Estos métodos se pueden repetir o usar en diferentes combinaciones para generar amilasas que tienen una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de aquella de una amilasa codificada por el ácido nucleico plantilla. Estos métodos también se pueden repetir o usar en diferentes combinaciones, por ejemplo, para generar variaciones en la expresión génica/del mensaje, traducción del mensaje o estabilidad del mensaje. En otro aspecto, la composición genética de una célula es alterada, por ejemplo, por modificación de un gen homólogo ex vivo, seguido de su reinserción en la célula.

Un ácido nucleico de la divulgación puede ser alterado por cualquier medio. Por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos, o no estocásticos, o métodos de “evolución dirigida", véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,361,974. Los métodos para mutación aleatoria de genes son bien conocidos en el arte, véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.830.696. Por ejemplo, se puede utilizar mutagénesis para mutar aleatoriamente un gen. La mutagénesis incluyen, por ejemplo, luz ultravioleta o irradiación gamma, o un mutágeno químico, por ejemplo, mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoactivados, solos o en combinación, para inducir rompimientos de ADN susceptibles de reparación por recombinación. Otros mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina o ácido fórmico. Otros mutágenos son análogos de precursores nucleótidos, por ejemplo, nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina o acridina. Estos agentes se pueden añadir a una reacción PCR en lugar de los precursores nucleótidos mutando así la secuencia. También se pueden utilizar agentes intercalación tales como proflavina, acriflavina, quinacrina y similares.

Se puede utilizar cualquier técnica en biología molecular, por ejemplo, mutagénesis por PCR aleatoria, véase, por ejemplo, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:5467 -5471; o mutagénesis combinatoria de múltiples casetes, véase, por ejemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18:194 -196. Alternativamente, se pueden reensamblar ácidos nucleicos, por ejemplo, genes, después de una fragmentación aleatoria, o "estocástica", véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.291.242; 6.287.862; 6.287.861; 5,955.358; 5.830.721; 5.824.514; 5.811.238;

5.605.793. En aspectos alternativos, se introducen modificaciones, adiciones o supresiones mediante PCR propensa a error, arrastre, mutagénesis dirigida a oligonucleótido, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casetes, mutagénesis de ensamblaje recursivo, mutagénesis de ensamblaje exponenciaie, mutagénesis específica de sitio, reensamblaje génico, mutagénesis saturada del sitio génico (GSSM), reensamblaje de ligación sintético (SLR), recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con espacios, mutagénesis de reparación por falta de coincidencia puntual, mutagénesis de hebra huésped de reparación deficiente, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de selección de restricción, mutagénesis de purificación de restricción, síntesis génica artificial, mutagénesis de ensamblaje, creación del multímeros de ácido nucleico quimérico, y/o una combinación de estos y otros métodos.

Las siguientes publicaciones describen una variedad de procedimientos y/o métodos de recombinación recursive que se pueden incorporar en los métodos de la divulgación: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1 -4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893 -896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:793 -797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3:284 -290; Christians (1999) "Directed evolution of timidine kinase for AZT fosforylation using ADN family shuffling" Nature Biotechnology 17:259 264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution” Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling", Nature Biotechnology 15:436 -438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504 -4509; Patten y colaboradores (1997) "Applications of DNA shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinion in Biotechnology 81724 -7313; Crameri y colaboradores (1996) "Construction and evolution of antíbody-phage libraries by DNA suffling" Nature Medicine 2:100 -103; Gates y colaboradores (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ‘headpiece dimer‘" Journal of Molecular Biology 255:373 -386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" En: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York, páginas 447 -457; Crameri y Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagénesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" Biotechniques 18:194 -195; Stemmer y colaboradores (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of olígodeoxyribonucleotides" Gene. 164249 -53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549 -553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389 -391; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassemb/y: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:10747 -10751.

Los métodos mutacionales de generación de diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio (Ling y colaboradores (1997) "Approaches to DNA mutagénesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157 -178; Dale y colaboradores (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagénesis usando the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369 -374; Smith (1985) "ln vitro mutagénesis" Ann. Rev. Genet. 19:423 -462; Botstein & Shortle (1985) Strategies and applications of in vitro mutagénesis" Science 229:1193 -1201; Carter (1986) "Site-directed mutagénesis" Biochem. J. 237z1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagénesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo (Kunkel (1985) Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 -492; Kunkel y colaboradores (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367 -382; y Bass y colaboradores (1988) "Mutant Trp repressors with new ADN-binding specificities" Science 242:240 -245); mutagénesis dirigida al oligonucleótído (Methods' in Enzymol. 100: 468 -500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329 -350 (1987); Zoller Smith (1982) "Oligonucleotide«directed mutagénesis usando M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acid Res. 10:6487 -6500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagénesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 1002468500; y Zoller & Smith (1987) Oligonucleotide-directed mutagénesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329 -350); mutagénesis de ADN modificado por fosforotioato (Taylor y colaboradores (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked ADN" Nucl. Acids Res. 13: 8749 -8764; Taylor y colaboradores (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate -modified ADN" Nucl. Acids Res. 13: 8765 -8787 (1985); Nakamaye (1986) "inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavaje by phosphorothioate groups and ¡ts application to oligonucleotide-directed mutagénesis " Nucl. Acids Res. 14: 96799698; Sayers y colaboradores (1988) "Y-T Exonuc/eases in phosphorothioate-based oiigonucleotide-directed mutagénesis" Nucl. Acids Res. 16:791 -802; y Sayers y colaboradores (1988) "Strand specific cleavaje of phosphorothioate-contaíning ADN by reaction with restrictíon endonucieases in the presence of etidium bromide" Nucl. Acids Res. 16; 803 -814); mutagénesis utilizando ADN dúplex con espacios (Kramer y colaboradores (1984) The gapped duplex DNA approach to oiigonucleotide-directed mutagénesis constructions" Nucl. Acids Res. 12: 9441 -9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. Oligonucleotide-directed mutations constructions via gapped duplex DNA" 1542350-367; Kramer y colaboradores (1988) "lmproved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex ADN approach to oligonuc/eotide-directed mutations constructions " Nucl. Acids Res. 16: 7207; y Fritz y colaboradores (1988) “Oligonucleotide-directed mutatio‘ns constructions: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reaction in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987 -6999).

Los protocolos adicionales que se pueden usar incluyen reparación por falta de coincidencia puntual (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879 -887), mutagénesis que utiliza hebras huésped deficientes en reparación (Carter y colaboradores (1985) "Improved oligonucteotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431 -4443; y Carter (1987) "lmproved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382 -403), mutagenesis por supresión (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides for generating large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), selección por restricción y selección por restricción y purificación por restricción (Wells y colaboradores (1986) "lmportance of hydrogen-bond formation in stabitizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415 -423), mutagénesis mediante síntesis génica total (Nambiar y colaboradores (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299 -1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361 -6372; Wells y colaboradores (1985) Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34:315 -323; y Grundstrom y colaboradores (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun‘ gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305 -3316), reparación por ruptura bicatenaria (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4:450 -455. "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagénesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 8327177 -7181). Los detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriormente pueden encontrarse en Methods in Enzymology Volume 154, que también describe controles útiles para resolución de problemas con diferentes métodos de mutagenesis.

Los protocolos que se pueden usar se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5.605.793 de Stemmer (Feb. 25, 1997), Methods for In Vitro Recombination"; la Patente de los Estados Unidos No. 5.811.238 de Stemmer y colaboradores (Sep. 22, 1998) Methods for Generating Polinucleotides having Desired Characteristics by lterative Selection and Recombination"; la Patente de los Estados Unidos No. 5.830.721 de Stemmer y colaboradores (Nov. 3, 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentatíon and Reassembly"; la Patente de los Estados Unidos No. 5.834.252 de Stemmer, y colaboradores (Nov. 10, 1998) "End-Complementary Polímerase Reaction"; la Patente de los Estados Unidos No. 5.837.458 de Minshull, y colaboradores (Nov. 17. 1998). Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; el documento WO 95/22625, Stemmer y Crameri, Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”; el documento WO 96/33207 de Stemmer y Lipschutz End Complementary Polimerase Chain Reaction"; el documento WO 97/20678 de Stemmer y Crameri "Methods for Generating Polinuc/eotides having Desired Characteristícs by lterative Selection and Recombination”; el documento WO 97/35966 de Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; el

documento WO 99/41402 de Punnonen y colaboradores "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"; el documento WO 99/41383 de Punnonen y colaboradores "Antigen Library Immunization"; el documento WO 99/41369 de Punnonen y colaboradores "Genetic Vaccine Vector Engineering"; el documento WO 99/41368 de Punnonen y colaboradores "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; el documento EP 752008 de Stemmer y Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; el documento EP 0932670 de Stemmer "Evolving Cellular ADN Uptake by Recombinación de secuencia recursiva"; el documento WO 99/23107 de Stemmer y colaboradores, "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"; el documento WO 99/21979 de Apt y colaboradores, "Human Papi/iomavirus Vectors”; el documento WO 98/31837 por del Cardíare y colaboradores Evolution of Whole Cel/s and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; el documento WO 98/27230 de Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Poiipeptide Engineering"; el documento WO 98/27230 de Stemmer y colaboradores. Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection”, el documento WO 00/00632, Methods for Generating Highly Diverse Libraries”, el documento WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucieotide Sequence Banks and Resulting Sequences", el documento WO 98/42832 de Arnold y colaboradores, Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers", el documento WO 99/29902 de Arnold y colaboradores, "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences", el documento WO 98/41653 de Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library”, el documento WO 98/41622 de Borchert y colaboradores, "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffiing”, y el documento WO 98/42727 por Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination".

Los protocolos que se pueen usar se describen (que proporcionan detalles relacionados con difernetes métodos que generan diversidad), por ejemplo, en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos serial No. (USSN) 09/407.800, "Shuffling Of Codon Aitered Genes" por Patten y colaboradores presentada el 28 de septiembre de 1999; "Evolution Of Whole Cel/s And Organisms By Recursive Sequence Recombination" por del Cardíare y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 6.379.964; "O/¡gonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination" por Crameri y colaboradores. Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.319.714; 6.368.861; 6.376.246; 6.423.542; 6,426.224 y el documento PCT/USOO/01203; "Use Of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis For Synthetic Shuffling" por Welch y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 6.436.675; "Methods For Making Character Strings, Polynuc/eolides & Polypeptides Having Desired Characteristics" por Selifonov y colaboradores, presentada el 18 de enero de 2000, (PCT/USOO/O1202) y, por ejemplo "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides Polypeptides Having Desired Characteristics" por Selifonov y colaboradores, presentada el 18 de julio de 2000 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos serial No. 09/618.579); "Methods Of Populating Data Structures For Use ln Evolutionary Simulations" por Selifonov y Stemmer, presentada el 18 de enero de 2000 (PCT/USOO/01138); y "Single-Stranded Nuc/eic Acid Template-Mediated Recombination And Nucleic Acid Fragment Isolation" por Affhoiter, presentada el 6 de septiembre de 2000 (Solicitud Patente de los Estados Unidos serial No. 09/656.549); y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.177.263; 6.153.410.

Se utilizan métodos no estocásticos o de "evolución dirigida" incluyen, por ejemplo, mutagénesis de saturación del sitio génico (GSSM), reensamblaje de ligación sintética (SLR), o una combinación de los mismos para modificar los ácidos nucleicos de la divulgación para generar amilasas con propiedades nuevas o alteradas (por ejemplo, actividad bajo condiciones muy ácidas o alcalinas, temperaturas altas, y similares). Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos modificados e pueden cribar por una actividad antes de analizar por actividad proteolítica u otra actividad. Se puede utilizar cualquier protocolo o modalidad de ensayo, por ejemplo, utilizando una plataforma de arreglo capilar. Véase, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.361.974; 6.280.926; 5.939.250.

Mutagenesis por saturación, o GSSM

La divulgación también provee métodos para elaborar enzimas usando mutagénesis de saturación de sitio génico, o GSSM, como se describe aquí y también en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.171.820 y 6.579.258.

En un aspecto, se utilizan cebadores de codones que contienen una secuencia de N,N,G/T degenerada para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido, por ejemplo, una amilasa o un anticuerpo de la divulgación para generar un conjunto de polipéptidos de progenie en los cuales está representada un rango completo de sustituciones de aminoácidos individuales en cada posición del aminoácidos, por ejemplo, un residuo de aminoácidos en un sitio activo de una enzima o sitio de enlazamiento de un ligando destinado a ser modificado. Estos oligonucleótidos pueden comprender una primera secuencia homóloga contigua, una secuencia de N,N,G/T degenerada y, opcionalmente, una segunda secuencia homóloga. Los productos de la traducción de la progenie secuencia abajo incluyen todos los cambios de aminoácidos posibles en cada sitio de aminoácidos a lo largo del polipéptido, que la degeneración de la secuencia de N,N,G/T incluye codones para todos los 20 aminoácidos. En un aspecto, uno de tales oligonucleótido degenerados (compuesto por ejemplo de, un casete de N,N,G/T degenerado) se utiliza para someter cada codón original en una plantilla de un polinucleótido madre a un rango completo de sustituciones de codones. En otro aspecto, se utilizan al menos dos casetes degenerados, ya sea en el mismo oligonucleótido o no, para someter al menos dos codones originales en una plantilla de polinucleótido madre a un rango completo de sustituciones de codones. Por ejemplo, más de una secuencia de N,N,G/T puede estar contenida en un oligonucleótido para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias

de N,N,G/T puede estar directamente contigua, o separada por una o más secuencias adicionales de nucleótidos. En otro aspecto, los oligonucleótidos útiles para introducción de adiciones y supresiones se pueden utilizar ya sea solos o en combinación con los codones que contienen una secuencia de N,N,G/T, para introducir cualquier combinación o permutación de adiciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos.

En un aspecto, se realiza una mutagénesis simultánea de dos o más posiciones contiguas de aminoácidos utilizando un oligonucleótido que contiene tripletes contiguos de N,N,G/T, es decir una secuencia degenerada de (N,N,G/T)n. En otro aspecto, se utilizan casetes degenerados que tienen menos degeneración que la secuencia de N,N,G/T. Por ejemplo, puede ser deseable en algunos casos utilizar (por ejemplo en un oligonucleótido) una secuencia degenerada de un triplete que comprende únicamente un N, en donde dicho N puede estar en la primera, segunda o tercera posición del triplete. Se puede utilizar cualquier otra base incluyendo cualquier combinación y permutación de la misma en las dos posiciones restantes del triplete. Alternativamente, puede ser deseable en algunos casos utilizar (por ejemplo en un oligo) una secuencia degenerada del triplete N,N,N.

En un aspecto, el uso de tripletes degenerados (por ejemplo, tripletes N,N,G/T) permite una generación sistemática y fácil de un rango completo de posibles aminoácidos naturales (para un total de 20 aminoácidos) en cada uno y cada posición de aminoácidos en un polipéptido (en aspectos alternativos, los métodos también incluyen la generación de menos de todas las sustituciones posibles por residuo de aminoácidos, o codón, posición). Por ejemplo, para un polipéptido de 100 aminoácidos, se pueden generar 2000 especies distintas (es decir 20 posibles aminoácidos por posición X 100 posiciones de aminoácidos). A través del uso de un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos que contienen un triplete degenerado de N,N,G/T, 32 secuencias individuales pueden codificar para todos los 20 posibles aminoácidos naturales. Por lo tanto, en un segundo recipiente de reacción en el cual se somete una secuencia de polinucleótidos madre a mutagénesis por saturación utilizando al menos uno de tales oligonucleótido, se generan 32 distintos polinucleótidos progenie distintos que codifican 20 polipéptidos distintos. En contraste, el uso de un oligonucleótido no degenerado en mutagénesis dirigida al sitio conduce a únicamente un producto del polipéptido descendiente por recipiente de reacción. Se pueden utilizar opcionalmente oligonucleótidos no degenerados en combinación con los cebadores degenerados divulgados; por ejemplo, se pueden utilizar oligonucleótidos no degenerados para generar mutaciones puntuales específicas en un polinucleótido de trabajo. Esto proporciona un medio para generar mutaciones puntuales silenciosas específicas, mutaciones puntuales que conducen a los correspondientes cambios de aminoácidos y mutaciones puntuales que causan la generación de codones de terminación y la correspondiente expresión de fragmentos de polipéptidos.

En un aspecto, cada recipiente de reacción de mutagénesis por saturación contiene polinucleótidos que codifican al menos 20 moléculas de polipéptido descendiente (por ejemplo, amilasas) de tal manera que todos los 20 aminoácidos naturales estén representados en una posición específica del aminoácido correspondiente a la posición del codón sometido a mutagénesis en el polinucleótido madre (otros aspectos utilizan menos de todas las 20 combinaciones naturales). Los polipéptidos progenie degenerados 32 veces generados a partir de cada recipiente de reacción de mutagénesis por saturación pueden ser sometidos a amplificación clonal (por ejemplo clonado en un huésped adecuado, por ejemplo, huésped de E. coli, utilizando por ejemplo, un vector de expresión) y sometidos a cribado de expresión. Cuando un polipéptido descendiente individual se identifica mediante cribado para mostrar un cambio favorable en propiedad (cuando se compara con el polipéptido madre, tal como una actividad proteolítica incrementada bajo condiciones ácidas o alcalinas), puede ser secuenciado para identificar la sustitución de aminoácidos correspondientemente favorable contenida en el mismo.

En un aspecto, después de someter a mutagénesis todas y cada una de las posiciones de aminoácidos en un polipéptido madre utilizando mutagénesis por saturación como se divulgó aquí, se pueden identificar cambios favorables de aminoácidos en más de una posición de aminoácidos. Una o más moléculas progenie nuevas pueden ser generadas, que contienen una combinación de todo o parte de estas sustituciones favorables de aminoácidos. Por ejemplo, si se identifican 2 cambios específicos favorables de aminoácidos en cada una de las 3 posiciones de aminoácidos en un polipéptido, las permutaciones incluyen 3 posibilidades en cada posición (sin cambio en el aminoácido original, y cada uno de los dos cambios favorables) y 3 posiciones. Por lo tanto, existen 3 x 3 x 3 o 27 posibilidades totales, incluyendo 7 que fueron previamente examinadas -6 mutaciones puntuales individuales (es decir, 2 en cada una de las tres posiciones) y sin cambio en ninguna posición.

En otro aspecto, se puede utilizar mutagénesis de saturación del sitio junto con otros medios estocásticos o no estocásticos para variar la secuencia, por ejemplo, reensamblaje de ligación sintética (véase más adelante), arrastre, quimerización, recombinación y otros procesos de mutagénesis y agentes de mutagénesis. Esta divulgación provee el uso de cualquier proceso o procesos mutagénizantes, incluyendo la mutagénesis por saturación, de una manera iterativa.

Reensamblaje de ligación sintética (SLR)

La divulgación provee un sistema de modificación génica no estocástica denominado “reensamblaje de ligación sintética", o simplemente “SLR”, un "proceso de evolución dirigida", para generar polipéptidos, por ejemplo, amilasas

o anticuerpos de la invención, con propiedades nuevas o alteradas. El SLR es un método para ligar en forma

conjunta fragmentos de oligonucleótidos en forma no estocástico. Este método difiere del arrastre estocástico de oligonucleótido en que los bloques de construcción de ácido nucleico no son arrastrados, concatenados o quimerizados al azar, sino que son ensamblados en forma no estocástica. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.773.900, 6.740.506, 6.713.282, 6.635.449, 6.605.449, 6.537.776.

En un aspecto, el SLR comprende las siguientes etapas: (a) proveer un polinucleótido plantilla, en donde el polinucleótido plantilla comprende una secuencia que codifica un gen homólogo; (b) proveer una pluralidad de polinucleótidos de bloques de construcción, en donde los polinucleótidos de bloques de construcción están diseñados para reensamblaje de entrecruzamiento con el polinucleótido plantilla en una secuencia predeterminada y un polinucleótido de bloque de construcción comprende una secuencia que es una variante del gen homólogo y una secuencia homóloga con el polinucleótido plantilla que flanquea la variante de la secuencia; (c) combinar un polinucleótido de bloque de construcción con un polinucleótido plantilla de manera tal que el polinucleótido de bloque de construcción de reensamblajes de entrecruzamiento con el polinucleótido plantilla para generar polinucleótidos que comprenden variaciones de secuencia génica homóloga.

El SLR no depende de la presencia de altos niveles de homología entre los polinucleótidos que van a ser reordenados. Por lo tanto, este método se puede usar para generar bibliotecas en forma no estocástica (o conjuntos) de moléculas progenie que comprenden más de 10100 quimeras diferentes. El SLR se puede usar para generar bibliotecas que comprenden más de 101000 quimeras de progenie diferentes. Así, los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos no estocásticos para producir un conjunto de moléculas de ácido nucleico quimérico finalizado rasurando un orden de montaje global que se elige por diseño. Este método incluye las etapas de generar por diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácido nucleico específicos que tienen extremos ligables compatibles mutuamente útiles y de ensamblar estos bloques de construcción de ácido nucleico, de tal manera que se consigue un orden de montaje global diseñado.

Los extremos que pueden ligarse en forma mutuamente compatible de los bloques de construcción de ácido nucleico que van a ser ensamblados se considera que son “útil” para este tipo de ensamblaje ordenado si permiten que los bloques de construcción se acoplen en órdenes predeterminados. Por lo tanto, el orden de ensamblaje completo en el cual los bloques de construcción de ácido nucleico pueden ser acoplados se específica mediante el diseño de los extremos que pueden ser ligados. Si se va a utilizar más de una etapa de ensamblaje, entonces el orden de ensamblaje completo en el cual los bloques de construcción de ácido nucleico pueden ser acoplados también es especificado por orden secuencial de la(s) etapa(s) de ensamblaje. En un aspecto, las piezas de construcción hibridadas son tratadas con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo ADN ligasa T4), para lograr el enlazamiento covalente de las piezas de construcción.

En un aspecto, el diseño de los bloques de construcción de oligonucleótidos se obtiene mediante el análisis de un conjunto de plantillas de secuencias de ácido nucleico progenitores que sirven como base para producir un conjunto de progenie de polinucleótidos quiméricos finalizados. Estas plantillas de oligonucleótidos madres sirven por lo tanto como fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de bloques de construcción de ácido nucleico que se van a someter a mutagénesis, por ejemplo, quimerizada o de arrastre. En un aspecto de este método, las secuencias de una pluralidad de plantillas progenitoras de ácido nucleico se alinean para seleccionar uno o más puntos de demarcación. Los puntos de demarcación se pueden localizar en un área de homología, y constan de uno

o más nucleótidos. Estos puntos de demarcación son preferentemente compartidos por al menos dos de las plantilla madre. Los puntos de demarcación se pueden utilizar por lo tanto, para delinear los límites de los bloques de construcción de oligonucleótidos para ser generados en orden para reordenar los polinucleótidos madre. Los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras sirven como puntos de quimerización potenciales en el ensamblaje de las moléculas finales de la progenie quiméricas. Un punto de demarcación pueden ser un área de homología (que consta de al menos una base nucleótida homóloga) compartida por al menos dos secuencias madre de polinucleótidos. En forma alternativa, un punto de demarcación puede ser un área de homología que es compartida por al menos la mitad de las secuencias madre de polinucleótidos, o, puede ser un área de homología que es compartida por al menos dos tercios de las secuencias madre de polinucleótidos. Aún más preferentemente, un punto de demarcación útil es un área de homología que es compartida por al menos tres cuartas partes de las secuencias madre de polinucleótidos, o, puede ser compartida por al menos todas las secuencias madre de polinucleótidos. En un aspecto, un punto de demarcación es un área de homología que es compartida por todas las secuencias madre de polinucleótidos.

En un aspecto, se realiza un proceso de reensamblaje de ligación exhaustivamente con el fin de generar una biblioteca exhaustiva de la progenie de polinucleótidos quiméricos. En otras palabras, todas las combinaciones posibles combinaciones ordenadas de los bloques de construcción de ácido nucleico están representadas en el conjunto de moléculas de ácido nucleico quimérico finalizado. AI mismo tiempo, en otro aspecto, el orden de ensamblaje (es decir el orden de ensamblaje de cada bloque de construcción en la secuencia 5' a 3’ de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación se hace por diseño (o en forma no estocástica) como se describió anteriormente. Debido a la naturaleza no estocástica de esta invención, se reduce grandemente la posibilidad de productos secundarios no deseados.

En otro aspecto, el método de reensamblaje de ligación se realiza en forma sistemática. Por ejemplo, el método se realiza a fin de generar una biblioteca sistemáticamente compartimentalizada de moléculas de la progenie, con compartimientos que pueden ser sistemáticamente cribados, por ejemplo uno por uno. En otras palabras, a través del uso selectivo y juicioso de bloques de construcción específicos de ácido nucleico, acoplados con el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamblaje secuencialmente intensificadas, se puede lograr un diseño donde se elaboran conjuntos específicos de productos de la progenie en cada uno de los diferentes recipientes de reacción. Esto permite realizar un procedimiento de examen y cribado sistemático. Por lo tanto, estos métodos permiten examinar sistemáticamente un número potencialmente muy grande de moléculas de la progenie en grupos más pequeños. Debido a esta posibilidad de llevar a cabo quimerizaciones en una forma que sea muy flexible, pero también exhaustiva y sistemática, particularmente cuando existe un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras, estos métodos permiten la generación de una biblioteca (o conjunto) compuesta de un gran número de moléculas de la progenie. Debido a la naturaleza no estocástica del presente reensamblaje de ligación, las moléculas generadas de la progenie comprenden preferentemente una biblioteca de moléculas de ácido nucleico quimérico finalizadas que tienen un orden de ensamblaje total que se escoge por diseño. Los métodos de mutagénesis por saturación y de evolución dirigida optimizada también se pueden utilizar para generar diferentes especies moleculares de la progenie. Se apreciará que la divulgación provee libertad de elección y control con respecto a la selección de los puntos de demarcación, el tamaño y el número de los bloques de construcción de ácido nucleico, y el tamaño y diseño de los acoplamientos. Se observa, adicionalmente, que el requisito de homología intermolecular está altamente relajado para la operatividad de esta divulgación. De hecho, los puntos de demarcación pueden incluso ser elegidos en áreas de poca o ninguna homología intermolecular. Por ejemplo, debido a la oscilación del codón, es decir, la degeneración de los codones, las sustituciones de nucleótidos pueden introducirse en bloques de construcción de ácidos nucleicos sin alterar el aminoácido originalmente codificado en la plantilla progenitora correspondiente.

De forma alternativa, se puede alterar un codón de tal manera que se altera la codificación para un aminoácido original. Esta divulgación provee que tales sustituciones se pueden introducir en el bloque de construcción de ácido nucleico con el fin de incrementar la incidencia de puntos de demarcación homólogos intermoleculares y por lo tanto permitir que se logren un mayor número de acoplamientos entre los bloques de construcción, lo que a su vez permite que se generen un mayor número de moléculas quiméricas de la progenie.

En otro aspecto, la naturaleza sintética de la etapa en la cual se generan los bloques de construcción permite el diseño y la introducción de nucleótidos (por ejemplo, uno o más nucleótidos, que pueden ser, por ejemplo, codones

o intrones o secuencias reguladoras) que pueden ser posteriormente removidos opcional, en un proceso in vitro (por ejemplo por medio de mutagénesis) o en un proceso in vivo (por ejemplo mediante la utilización de la habilidad de empalme génico de un organismo huésped). Se aprecia que en muchos casos la introducción de estos nucleótidos también puede ser deseables por muchas otras razones además del beneficio potencial de crear un punto de demarcación útil.

En un aspecto, se utiliza un bloque de construcción de ácido nucleico para introducir un intrón. Por lo tanto, se introducen intrones funcionales en un gen fabricado por el hombre de acuerdo con los métodos descritos aquí. El(los) intrón(es) introducido(s) artificialmente puede(n) ser funcional(es) en células huésped para empalme génico casi en la misma forma que los intrones de origen natural sirven funcionalmente en empalme génico.

Sistema de evolución dirigido optimizado

La divulgación provee un sistema de modificación génico no estocástica llamado “sistema de evolución dirigido optimizado” para generar polipéptidos, por ejemplo, amilasas o anticuerpos de la divulgación, con propiedades nuevas o alteradas. La evolución dirigida optimizada está dirigida al uso de ciclos repetitivos de reordenamiento reductivo, recombinación y selección que permite la evolución molecular dirigida de ácidos nucleicos a través de recombinación. La evolución dirigida optimizada permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada está significativamente enriquecida por secuencias que tienen un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento.

Un evento de entrecruzamiento es un punto en una secuencia quimérica donde ocurre un cambio en la secuencia de una variante madre por otra variante madre. Tal punto está normalmente en la unión donde los oligonucleótidos de dos progenitores se ligan entre sí para forma una secuencia única. Este método permite el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos de manera que la población quimérica final de secuencias está enriquecida por el número escogido de eventos de entrecruzamiento. Esto permite un mayor control sobre las variantes quiméricas escogidas que tienen un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento.

Además, este método proporciona un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad de posibles variante de empalme de proteína en comparación con otros sistemas. Previamente, si se generan, por ejemplo, 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, sería extremadamente difícil evaluar una cantidad tan grande de variantes quiméricas para una actividad particular. Además, una porción significativa de la población de la progenie tendría un número muy alto de eventos de entrecruzamiento que resultarían en proteínas que probablemente

tendrían mayores niveles de una actividad particular. Mediante el uso de estos métodos, se puede enriquecer la población de moléculas quiméricas con aquellas variantes que tienen un número particular de eventos de entrecruzamiento. Por lo tanto, aunque se pueden generar aún 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas escogidas para análisis adicional probablemente tenga, por ejemplo, únicamente tres eventos de entrecruzamiento. Como la población de la progenie resultante puede ser sesgada para tener un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto permite un número más manejable de variables cuando se calcula qué oligonucleótido de los polinucleótidos madre originales pueden ser responsables por afectar un rasgo particular.

Un método para crear una secuencia de polinucleótidos de la progenie quimérica es crear oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia madre. Cada oligonucleótido incluye preferentemente una región única de superposición ara que la mezcla de los oligonucleótidos entre sí resulte en una nueva variante que tenga cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. En forma alternativa, se pueden encontrar los protocolos para llevar a cabo estos métodos de la invención en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.773.900, 6,740.506, 6.713.282, 6.635.449, 6.605.449, 6.537.776. 6.361.974.

El número de oligonucleótidos generados para cada variante madre guarda relación con el número total de entrecruzamientos resultantes en la molécula quimérica que es creada en última instancia. Por ejemplo, se podrían proveer tres variantes de secuencias de nucleótidos madre para someterse a una reacción de ligación a fin de encontrar una variante quimérica que tenga, por ejemplo, mayor actividad a temperatura alta. A manera de ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleótidos que corresponden a cada una de las porciones de cada variante madre. Por lo tanto, durante el proceso de reensamblaje de ligación, podría haber hasta 50 eventos de entrecruzamiento dentro de cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleótidos quiméricos generados contenga oligonucleótidos de cada variante madre en orden alternante es muy baja. Si cada fragmento de oligonucleótido está presente en la reacción de ligación en la misma cantidad molar, es posible que en algunas posiciones, los oligonucleótidos del mismo polinucleótido madre se liguen en forma próxima entre sí y por lo tanto no generen un evento de entrecruzamiento. Si la concentración de cada oligonucleótido de cada progenitor se mantiene constante durante cualquier etapa de ligación en este ejemplo, existe 1/3 de posibilidad (asumiendo 3 progenitores) de que un oligonucleótido de la misma variante madre se ligue dentro de la secuencia quimérica y no produzca ningún entrecruzamiento.

Por lo tanto, se puede determinar una función de probabilidad de densidad (PDF) para predecir la población de eventos de entrecruzamiento que probablemente ocurrirán durante cada etapa en una reacción de ligación, dado un número determinado de variantes parentales, un número de oligonucleótidos correspondientes a cada variante y las concentraciones de cada variante durante cada etapa en la reacción de ligación. Las estadísticas y matemáticas detrás de la determinación de la PDF se describe más adelante. Mediante la utilización de estos métodos, se puede calcular dicha función de probabilidad de densidad, y por lo tanto, enriquecer la población de la progenie quimérica para un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento que resultan de una reacción particular de ligación. Además, se puede determinar un número objetivo de eventos de entrecruzamiento, y se puede programar luego el sistema y se pueden calcular las cantidades de partida de cada oligonucleótido madre durante cada etapa en la reacción de ligación para obtener una función de probabilidad de densidad que se centre en el número predeterminado de eventos de entrecruzamiento. Estos métodos están dirigidos al uso de ciclos repetidos de reordenamiento reductivo, recombinación y selección que permiten la evolución molecular dirigida de un ácido nucleico que codifica un polipéptido a través de recombinación. Este sistema permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada es significativamente enriquecida por las secuencias que tienen un numero predeterminado de eventos de entrecruzamiento. Un evento de entrecruzamiento es un punto en una secuencia quimérica donde ocurre un cambio en la secuencia de una variante madre a otra variante madre. Dicho punto está normalmente en la unión donde los oligonucleótidos de dos progenitores se ligan entre sí para formar una secuencia única. El método permite el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos para que la población quimérica final de secuencias sea enriquecida para el número elegido de eventos de entrecruzamiento. Esto provee más control al elegir variantes quiméricas que tienen un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento.

Además, estos métodos proporcionan un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del espacio posible de la variante de proteína en comparación con otros sistemas. Usando los método descritos aquí se puede enriquecer la población de moléculas quiméricas por aquellas variantes que tienen un número particular de eventos de entrecruzamiento. Por lo tanto, aunque se puede generar aún 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas elegidas para análisis adicionales tiene más probablemente, por ejemplo, solamente tres eventos de entrecruzamiento. Como la población de la progenie resultante se puede sesgar para tener un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto provee un número más manejable de variables cuando se calcula qué oligonucleótido de los polinucleótidos originales madre puede ser responsables de afectar un rasgo particular.

En un aspecto, el método crea una secuencia de polinucleótidos de progenie quimérica mediante la creación de oligonucleótidos que corresponden a fragmentos o porciones de cada secuencia madre. Cada oligonucleótido

incluye preferentemente una región única de superposición para que la mezcla de los oligonucleótidos entre sí resulte en una nueva variante que tenga cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Véanse también las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.773.900, 6.740.506, 6.713.282, 6.635.449. 6.605.449, 6.537.776, 6.361.974.

Determinación de eventos de entrecruzamiento

Los aspectos de la invención incluyen un sistema y software que recibe una función deseada de probabilidad de densidad de entrecruzamiento (PDF), el número de genes madre que van a ser reensamblados, y el número de fragmentos en el reensamblaje como entradas. La salida de este programa es un “fragmento de PDF " que se puede utilizar para determinar una receta para producir los genes reensamblados y la PDF de entrecruzamiento estimada de esos genes. El procesamiento descrito aquí se realiza preferentemente en MATLABMR (The Mathworks, Natick, Massachusetts) un lenguaje de programación y un ambiente de desarrollo para computación técnica.

Procesos iterativos

En la práctica de la divulgación, estos procesos pueden ser repetidos en forma iterativa. Por ejemplo, se identifica, se aísla nuevamente, se modifica de nuevo, se analiza nuevamente con respecto a la actividad un ácido nucleico (o el ácido nucleico) responsable por un fenotipo alterado o nuevo de amilasa. Este proceso puede ser repetido en forma iterativa hasta que se modifica por ingeniería genética un fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede modificar por ingeniería genética una ruta catabólica o anabólica bioquímica completa en una célula, incluyendo, por ejemplo, la actividad de hidrólisis del almidón.

En forma similar, si se determina que un oligonucleótido particular no tiene ningún efecto sobre el rasgo deseado (por ejemplo, un nuevo fenotipo de amilasa), puede ser removido como una variable al sintetizar oligonucleótidos madre mayores que incluyen la secuencia e va a ser removida. Como la incorporación de la secuencia en una secuencia más larga previene cualquier evento de entrecruzamiento, no habrá ninguna variación de esta secuencia en los polinucleótidos de la progenie. Esta práctica iterativa de determinar cuáles oligonucleótidos están más relacionados con el rasgo deseado y cuáles no están relacionados, permite la exploración más eficiente de todas las posibles variantes de proteína que pueden proveer un rasgo o actividad particulares.

Arrastre in vivo

Se puede utilizar el arrastre in vivo de moléculas en métodos de la divulgación que proveen variantes de polipéptidos de la divulgación, por ejemplo, anticuerpos, amilasas y similares. Se puede realizar el arrastre in vivo utilizando la propiedad natural de las células para recombinar multímeros. Aunque la recombinación in vivo ha proporcionado la principal ruta natural para la diversidad molecular, la recombinación genética sigue siendo un proceso relativamente complejo que involucra 1) el reconocimiento de homologías; 2) etapas de incisión de una hebra, invasión de una hebra y etapas metabólicos que conducen a la producción de quiasma recombinante; y finalmente 3) la resolución del quiasma en moléculas recombinadas discretas. La formación del quiasma requiere el reconocimiento de secuencias homólogas.

En un aspecto, la divulgación provee un método para producir un polinucleótido híbrido a partir al menos un primer polinucleótido (por ejemplo, una glucoamilasa de la invención) y un segundo polinucleótido (por ejemplo, una enzima, tal como una glucoamilasa de la invención o cualquier otra amilasa, o una etiqueta o un epítopo). La divulgación se puede usar para producir un polinucleótido hibrido mediante la introducción de al menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que comparten al menos una región de homología parcial de secuencia en una célula huésped adecuada. Las regiones de homología de secuencia parcial promueven procesos que generan una reorganización de las secuencias produciendo un polinucleótido hibrido. El término "polinucleótido híbrido", como se utiliza aquí, es cualquier secuencia de nucleótidos que se genera a partir del método de la presente divulgación y contiene una secuencia de al menos dos secuencias originales de polinucleótidos. Tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de los eventos de recombinación intermolecular que promueven la integración de secuencia entre moléculas de ADN. Además, tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de procesos de reordenamiento reductivo intramolecular que utilizan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ADN.

Producción de variantes de secuencia

La divulgación también proporciona métodos adicionales para elaborar variantes de secuencias de las secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, amilasa) de la divulgación. La divulgación también proporciona métodos adicionales para aislar amilasas usando los ácidos nucleicos y polipéptidos de la descripción. En un aspecto, la divulgación proporciona variantes de una secuencia codificante de amilasa (por ejemplo, un gen, ADNc o mensaje) de la divulgación, que puede ser alterada por cualquier medio, incluyendo, por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos,

o métodos no estocásticos , o métodos de "evolución dirigida", como se ha descrito anteriormente.

Las variantes aisladas pueden ser de origen natural. Las variantes también se puede crear in vitro. Las variantes pueden ser creadas usando técnicas de manipulación genética tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión de Exonucleasa lll y técnicas de clonación estándar. En forma alternativa, dichas variantes, fragmentos, análogos o derivados pueden ser creados utilizando procedimientos de modificación o síntesis química. Otros métodos para elaborar variantes también son familiares para las personas versadas en el arte. Estos incluyen procedimientos en los cuales las secuencias de ácido nucleico obtenidas a partir de aislados naturales son modificadas para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen características que refuerzan su valor en las aplicaciones de laboratorio o industriales. En tales procedimientos se generan y caracterizan, un gran número de variantes de secuencias que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Estas diferencias de nucleótidos pueden resultar en cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.

Por ejemplo, las variantes pueden ser creadas usando PCR propenso a error. En la PCR propensa a error, se realiza la PCR bajo condiciones donde la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de manera tal que se obtiene un alto índice de mutaciones puntuales lo largo de la longitud total del producto de la PCR. La PCR propensa a error se describe, por ejemplo, en Leung, D.W. y colaboradores, Technical, 1: 11 -15, 1989) y Caldwell,

R. C. Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2: 28 -33, 1992. En resumen, en tales procedimientos, se mezclan los ácidos nucleicos que van a experimentar mutagénesis con cebadores de la PCR, regulador de reacción, MgCl2, MnCI2, Taq polimerasa y una concentración apropiada de los dNTP para lograr un alto índice de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de la PCR. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la reacción utilizando 20 fmoles de ácido nucleico que va a experimentar mutagénesis. 30 pmol de cada cebador de la PCR, un regulador de reacción que comprende 50 mM de KCI, 10 mM de Tris HCI (pH 8,3) y 0,01% de gelatina, 7 mM de MgCl2, 0.5 mM de MnCI2, 5 unidades de Taq polimerasa, 0,2 mM de dGTP, 0.2 mM de dATP, 1 mM de dCTP y 1 mM de dTTP. Se puede realizar la PCR por 30 ciclos de 94 °C durante 1 min, 45 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros pueden ser variados según sea conveniente. Se clonan los ácidos nucleicos e experimentaron la mutación en un vector apropiado y se evalúan las actividad de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos que experimentaron la mutación.

También se pueden crear variantes utilizando mutagénesis dirigida al oligonucleótido para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótidos s descrita, por ejemplo, en Reidhaar-Olson (1988) Science 241: 53 -57. En resumen, en tales procedimientos, se sintetizan una pluralidad de oligonucleótidos bicatenarios que portan una o más mutaciones que son introducidas en el ADN clonado e insertadas en el ADN clonado que va a experimentar la mutagénesis. Se recuperan los clones que contienen el ADN que experimentó la mutación y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifican.

Otro método para generar variantes es la PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR a partir de una mezcla de fragmentos pequeños de ADN. Un gran número de diferentes reacciones de PCR se realizan en paralelo en el mismo vial, con los productos de una reacción cebando a los productos de otra reacción. La PCR de ensamblaje se describe en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5.965.408.

Incluso otro método para generar variantes es la mutagénesis de la PCR sexual. En la mutagénesis de la PCR sexual, se produce una recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de secuencia diferentes pero altamente relacionadas de ADN in vitro, como resultado de una fragmentación aleatoria en la molécula de ADN con base en homología de secuencia, seguido por la fijación del entrecruzamiento mediante la extensión del cebador en una reacción PCR. Se describe la mutagénesis de PCR sexual, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad, Sci. EUA 91: 10747 -10751. En resumen, en tales procedimientos, se digieren una pluralidad de ácidos nucleicos que van a ser recombinados con ADNasa para generar fragmentos que tienen un tamaño promedio de 50 -200 nucleótidos. Los fragmentos del tamaño promedio deseado se purifican y resuspenden en una mezcla de la PCR. Se realiza la PCR bajo condiciones que facilitan la recombinación entre los fragmentos de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede realizar la PCR mediante la resuspensión de los fragmentos purificados a una concentración de 10 -30 ng/µl en una solución de 0,2 mM de cada dNTP, 2,2 mM de MgCI2, 50 mM KCl,10 mM de Tris HCI, pH 9,0 y 0,1% de Triton X-100. Se añaden 2,5 unidades de Taq polimerasa por 100:1 de mezcla de reacción y se lleva a cabo la PCR utilizando el siguiente régimen: 94 °C durante 60 segundos, 94 ºC durante 30 segundos, 50 -55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos (30 -45 veces) y 72 °C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros pueden ser variados según sea conveniente. En algunos aspectos, se pueden incluir oligonucleótidos en las reacciones PCR. En otros aspectos, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa l se puede utilizar en un primer conjuntos de reacciones PCR y se puede utilizar Taq polimerasa en un grupo posterior de reacciones PCR. Las secuencias recombinantes se aíslan y se evalúan las actividades de los polipéptidos que las codifican.

Se pueden crear también variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de interés mediante la propagación de la secuencia de interés en una cepa bacteriana, tal como cepa de E. coli, que porta mutaciones en una o más de las rutas de reparación del ADN. Tales cepas “mutadoras” tienen una mayor tasa de mutación aleatoria que aquellas del progenitor de tipo silvestre. La

propagación del ADN en una de estas cepas generará eventualmente mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para uso en mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la publicación PCT No. WO 91/16427.

También se pueden generar variantes utilizando mutagénesis de casetes. En la mutagénesis de casetes, se reemplaza una pequeña región de una molécula de ADN bicatenaria con un “casete” de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido contiene a menudo una secuencia nativa completamente y/o parcialmente aleatoria.

También se puede utilizar mutagénesis de ensamble recursivo para generar variantes. La mutagénesis de ensamble recursivo es un algoritmo para modificación genética de la proteína (mutagénesis de proteína) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes fenotípicamente relacionados cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método utiliza un mecanismo de retroalimentación para controlar rondas sucesivas de mutagénesis de casete combinatorial. La mutagénesis de ensamble recursivo se describe, por ejemplo, en Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:7811 -7815.

En algunos aspectos, se crean variantes utilizando mutagénesis de ensamblajes exponenciales. La mutagénesis de ensamblajes exponenciales es un proceso para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en donde pequeños grupos de residuos son aleatorizados en paralelo para identificar, en cada posición alterada, los aminoácidos que producen proteínas funcionales. La mutagénesis de ensamble exponencial es descrita, por ejemplo. en Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11: 1548 -1552. Las mutagénesis aleatoria y dirigida a sitio son descritas, por ejemplo, en Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology

4: 450 -455.

En algunos aspectos se crean variantes utilizando variantes de arrastre en donde porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos distintos se fusionan entre sí para crear secuencias de ácido nucleico quimérico que codifican polipéptidos quiméricos como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.965.408, 5.939.250 (véase también la discusión, más arriba).

La divulgación también provee variantes de polipéptidos de la divulgación (por ejemplo, amilasas) que comprenden secuencias en las cuales se sustituyen uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, de un ejemplo de un polipéptido de la invención) con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (por ejemplo, un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético. Sustituciones conservadoras son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Por lo tanto, los polipéptidos de la divulgación incluyen aquéllos con sustituciones conservadoras de secuencias de la invención, por ejemplo, los ejemplos de polipéptidos de la invención, incluyendo, pero no limitándose a los siguientes reemplazos: reemplazos de aminoácidos alifático tales como Alanina, Valina, Leucina e Isoleucina con otro aminoácido alifático; reemplazo de una Serina con una Treonina o vice versa; el reemplazo de un residuo ácido tal como Acido aspártico y Ácido glutámico con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que contiene un grupo amida, tal como Asparagina y Glutamina, con otro residuo que contiene un grupo amida; el intercambio de un residuo básico tal como Lisina y Arginina con otro residuo básico; y el reemplazo de un residuo aromático tal como Fenilalanina, Tirosina con otro residuo aromático. Otras variantes son aquellas en las cuales uno o más de los residuos de aminoácidos de los polipéptidos de la invención incluyen un grupo sustituyente. Una sustitución de conservadora de aminoácido también puede comprender la sustitución de un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o de glutamina por asparagina). Se pueden suprimir uno o más aminoácidos, por ejemplo, de una amilasa, lo que resulta en la modificación de la estructura del polipéptido, sin alterar significativa su actividad biológica. Por ejemplo, se pueden remover aminoácidos del terminal amino o el terminal carboxilo que no se requieren para la actividad de la amilasa.

Otras variantes son aquellas en las cuales el polipéptido se asocia con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido, por ejemplo, polietilenglicol.

Variantes adicionales son aquellas en las cuales se fusionan aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido, tal como una secuencia guía, una secuencia secretoria, una secuencia de proproteína o una secuencia que facilita la purificación, enriquecimiento o estabilización del polipéptido.

En algunos aspectos, las variantes, fragmentos, derivados y análogos de los polipéptidos de la divulgación retienen la misma función o actividad biológica que los polipéptidos de ejemplo (por ejemplo acividad de amilasa) descritos aquí. En otros aspectos, la variante, fragmento, derivado o análogo incluye una proproteína, de tal manera que la variante, fragmento, derivado o análogo pueden ser activados por escisión de la porción proproteína para producir un polipéptido activo.

Optimización de codones para lograr altos niveles de expresión proteína en células huésped

La divulgación provee métodos para modificar los ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codifican glucoamilasa para modificar el uso del codón y los ácidos nucleicos que codifican una amilasa optimizada por el codón y que codifican glucoamilasa, incluyendo la SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, y SEQ ID NO: 82; estos ácidos nucleicos que codifican amilasa y que codificna glucoamilasa de ejemplo fueron generados como se discute en detalle en el Ejemplo 28, más adelante, a partir de la SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, y SEQ ID NO: 25, respectivamente:

Enzima: SEQ ID NO: de tipo silvestre SEQ ID NO: de codón optimizado

Amilasa: 51 79

Amilasa: 3 80

Glucoamilasa: 47 81

Glucoamilasa: 25 82

En un aspecto, la divulgación métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una amilasa para

10 incrementar o reducir su expresión en una célula huésped. La divulgación también provee ácidos nucleicos que codifican una amilasa modificada para incrementar su expresión en una célula huésped, amilasa modificada de este modo y métodos para elaborar las amilasas modificadas. El método comprende identificar un codón “no preferido" o uno "menos preferido" en un ácido nucleico que codifica amilasa y que codifica glucoamilasa y reemplazar uno o más de estos codones no preferidos o menos preferidos con un "codón preferido" que codifica el mismo aminoácido

15 que el codón reemplazado y al menos un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico ha sido reemplazado por un codón preferido que codifica el mismo aminoácido. Un codón preferido es un codón sobrerrepresentado en las secuencias codificadoras en los genes en la célula huésped y un codón no preferido o menos preferido es un codón subrepresentado en secuencias codificadoras en genes en la célula huésped.

Las células huésped para expresar los ácidos nucleicos, casetes de expresión y vectores de la invención incluyen

20 bacterias, levadura, hongos, células vegetales, células de insectos y células de mamíferos. Por lo tanto, la divulgación provee métodos para optimizar el uso de codones en todas estas células, ácidos nucleicos de codón alterado y polipéptidos elaborados por los ácidos nucleicos de codón alterado. Los ejemplos de células huésped incluyen bacterias Gram negativas, tal como cualquier especie del género Escherichia o Pseudomonas, por ejemplo, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens; o bacterias Gram positivas, tal como cualquier especie del género

25 Bacillus, Streptomyces, Lactococcus, Lactobacillus, por ejemplo, Bacillus cereus, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis. Los ejemplos de células huésped también incluyen organismos eucariotas, por ejemplo, diferentes levaduras, tales como Schizosaccharomyces sp., Aspergillus sp., Hansenula sp., Kluyveromyces sp., Pichia sp. y Saccharomyces sp., incluyendo, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris y Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger y

30 células de mamífero y líneas celulares y células de insecto y líneas celulares. Por lo tanto, la divulgación también incluye ácidos nucleicos y polipéptidos optimizados para expresión en estos organismos y especies.

Por ejemplo, los codones de un ácido nucleico que codifica una amilasa aislada de una célula bacteriana se modifican de manera tal que el ácido nucleico sea expresado en forma óptima en una célula bacteriana diferente de la bacteria de la cual se derivó la amilasa, una levadura, un hongo, una célula vegetal, una célula de insecto o una 35 célula de mamífero. Los métodos para optimizar codones son conocidos en el arte, véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30: 113 -118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12: 185 -188; Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250 -7253. Véase también Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250 7253, que describe la optimización de codones en sistemas de ratones; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24: 18 -24, que describe la optimización de codones en levadura; Feng (2000) Biochemistry 39: 15399 -15409, que

40 describe la optimización de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20: 252 -264, que describe la optimización del uso de codones que afecta la secreción en E. coli.

Animales no humanos transgénicos

La divulgación provee animales no humanos transgénicos que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una amilasa), un casete de expresión o un vector o una célula transfectada o transformada de la invención.

45 La divulgación también provee métodos para elaborar y usar estos animales no humanos transgénicos.

Los animales no humanos transgénicos pueden ser, por ejemplo, cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas y ratones, que comprenden los ácidos nucleicos de la divulgación. Estos animales se pueden usar, por ejemplo, como modelos in vivo para estudiar la actividad de la amilasa, o como modelos para cribar agentes que cambian la actividad de la amilasa in vivo. Las secuencias codificadoras para los polipéptidos que van a ser expresados en los animales no humanos transgénicos pueden ser diseñadas para ser constitutivas o para estar bajo el control de factores reguladores de transcripción inducibles o específicos del desarrollo o específicos del tejido. Los animales no humanos transgénicos pueden ser diseñados y generados usando cualquier método conocido en el arte; véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,211.428, 6.187.992, 6.156.952, 6.118.044, 6.111.166, 6.107.541, 5.959.171, 5.922.854, 5.892.070, 5.880.327, 5.891.698, 5.639.940, 5.573.933, 5.387.742, 5.087.571, que describen la elaboración y el uso de células y óvulos transformados, y de ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos y vacas transgénicos. Véase también, por ejemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231: 147 -157, que describe la producción de proteínas recombinantes en la leche de animales lecheros transgénicos; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17: 456 -461, que demuestra la producción de cabras transgénicas. La patente de los Estados Unidos No. 6.211.428, describe la elaboración y el uso de mamíferos no humanos transgénicos que expresan en sus cerebros un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN. La patente de los Estados Unidos No. 5.387.742, describe la inyección de secuencias clonadas de AND recombinante o sintético en óvulos de ratón fertilizados, implantando los óvulos inyectados en hembras pseudopreñadas y permitiendo que se desarrollen hasta término los ratones transgénicos cuyas células expresan proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer. La patente de los Estados Unidos No. 6.187.992, describe la formación y el uso de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una ruptura del gen que codifica la proteína precursora amiloidea (APP).

Se pueden utilizar también "animales nuligénicos". Por ejemplo, en un aspecto, los animales transgénicos o modificados de la divulgación comprenden un “animal nuligénico", por ejemplo, un “ratón nuligénico", manipulado genéticamente para no expresar un gen endógeno, que es reemplazado con un gen que expresa una amilasa y/o glucoamilasa de la invención, o una proteína de fusión que comprende una amilasa y/o una glucoamilasa de la invención.

Plantas y semillas transgénicas

La divulgación provee plantas y semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido, un casete vector de expresión o una célula transformada o transfectada de la invención. La divulgación también provee productos vegetales, por ejemplo, aceites, semillas, hojas, extractos y similares, que comprenden un ácido nucleico y/o un polipéptido de la invención. La planta transgénica puede ser una dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). La divulgación provee plantas transgénicas con un sabor, contenido de sólidos y/o textura modificados, en donde esa modificación es generada al expresar al menos una enzima de la invención ya sea en forma constitutiva o selectiva en la planta transgénica (o semilla, o fruto, etc.), como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20060195940.

La divulgación también provee métodos para la elaboración y el uso de estas plantas y semillas transgénicas. La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención puede ser construida de acuerdo con cualquier método conocido en el arte. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No.

6.309.872.

Los ácidos nucleicos y constructos de expresión de la invención se pueden introducir en una célula vegetal por cualquier medio. El término “introducir” en el contexto de un polinucleótido, por ejemplo, un constructo de nucleótidos de interés, pretende dar a entender que presenta a la planta el polinucleótido de tal manera que el polinucleótido gana acceso al interior de una célula de la planta. Cuando se introduce más de un polinucleótido, estos polinucleótidos pueden ser ensamblados como parte de un único constructo de nucleótidos, o como constructos de nucleótidos separados, y pueden ser ubicados en el mismo o en diferentes vectores de transformación. Por consiguiente, estos polinucleótidos se pueden introducir en la célula huésped de interés en un único evento de transformación, en eventos de transformación separados, o, por ejemplo, en plantas, como parte de un protocolo de fitomejoramiento. Los métodos de la divulgación no dependen de un método particular para introducir uno o más polinucleótidos en una planta, solamente que el(los) polinucleótido(s) gana(n) acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos en las plantas son conocidos en el arte incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación transitoria, métodos de transformación estable y métodos mediados por virus.

La “transformación transitoria" en el contexto de un polinucleótido quiere decir que un polinucleótido es introducido en la planta y no se integra en el genoma de la planta.

Por “introducir de manera estable" o "introducido en forma estable" en el contexto de un polinucleótido introducido en una planta quiere decir que el polinucleótido introducido se incorpora de manera estable en el genoma de la planta y, por lo tanto, la planta es transformada en forma estable con el polinucleótido.

En formas de realización alternativas, "transformación estable" o “transformado en forma estable" quiere decir que un polinucleótido, por ejemplo, un constructo de nucleótido descrito aquí, introducido en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma, más particularmente, por la progenie de múltiples generaciones sucesivas. La introducción en el genoma de una planta deseada puede ser tal que la enzima es regulada por los elementos de control de transcripción o traducción endógenos. Las técnicas de transformación tanto para las monocotiledóneas como para las dicotiledóneas son conocidas en el arte.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar para conferir rasgos deseados esencialmente en cualquier planta. Los ácidos nucleicos de la divulgación puede usarse para manipular vías metabólicas de una planta con el fin de optimizar o alterar la expresión del huésped de glucanasa, mananasa o xilanasa. Pueden cambiar la actividad de amilasa, glucoamilasa, glucanasa, manasa, o xilanasa en una planta. En forma alternativa, una glucoamilasa de la invención puede ser usada en la producción de una planta transgénica para producir un compuesto producido no naturalmente por esa planta. Esto puede reducir los costos de producción o crear un producto novedoso. En una forma de realización, la enzima de la invención puede ser expresada de manera tal que la enzima no entrará en contacto con su sustrato hasta que sea deseado. Por ejemplo, una enzima de la invención puede ser dirigida y retenida en el retículo endoplasmático de una célula vegetal. La retención de la enzima, en el retículo endoplasmático de las célula, evitará que la enzima entre en contacto con su sustrato. La enzima y el sustrato pueden ser luego puestas en contacto a través de cualquier medio capaz de romper la arquitectura subcelular, tal como, trituración, molienda, calentamiento y similares. Véanse, los documentos WO 98/11235, WO 2003/18766 y WO 2005/096704.

Los genes marcadores seleccionables pueden ser agregados al constructo génico a fin de identificar las células vegetales o tejidos que han integrado exitosamente el transgén. Esto puede ser necesario ya que lograr la incorporación y expresión de genes en las células vegetales es un evento raro, que ocurre solamente en un pequeño porcentaje de los tejidos o células objetivo. Los genes marcadores seleccionables codifican proteínas que proveen resistencia a agentes que son normalmente tóxicos para las plantas, tales como antibióticos o herbicidas. Solamente las células vegetales que han integrado el gen marcador seleccionable sobrevivirán cuando se cultiven en un medio que contiene el antibiótico o herbicida apropiados. Los marcadores de selección usados en forma rutinaria en la transformación incluyen el gen nptll, que confiere resistencia a la kanamicina y antibióticos relacionados (Messing & Vierra. Gene 19: 259 -268 (1982); Bevan y colaboradores, Nature 304: 184 -187 (1983)), el gen bar, que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White y colaboradores. Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer y colaboradores Theor. Appl. Genet 79: 625 -631 (1990)), el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929 -2931), el gen dhfr, que confiere resistencia al metatrexato (Bourouis y colaboradores, EMBO J. 2(7): 1099 -1104 (1983)), el gen EPSPS, que confiere resistencia a glifosato (patentes de los Estados Unidos Nos. 4.940.935 y 5.188.642).

En forma alternativa, el material de la planta transgénica puede ser identificado a través de un sistema de selección positiva, tal como el sistema que utiliza el gen para la manosa-6-fosfato isomerasa, que provee la habilidad para metabolizar manosa (patentes de los Estados Unidos Nos. 5.767.778 y 5.994.629).

En un aspecto, la elaboración de plantas o semillas transgénicas comprende incorporar las secuencias de la invención y, en forma opcional, genes marcadores en un constructo de expresión objetivo (por ejemplo, un plásmido), junto con el posicionamiento del promotor y las secuencias terminadoras. Esto puede implicar transferir el gen modificado en la planta a través de un método adecuado. Una o más de las secuencias de la invención pueden ser combinadas con las secuencias que confieren resistencia a insectos, enfermedades, sequía, mayor rendimiento, mayor calidad nutricional del grano, mayor rendimiento de etanol y similares.

Por ejemplo, se puede introducir un constructo directamente en el ADN genómico de la célula vegetal usando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de las células vegetales, o los constructos se pueden introducir directamente en el tejido vegetal usando métodos balísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Por ejemplo, véase, por ejemplo, Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35: 197 -203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6: 17 -30; Klein (1987) Nature 327: 70 -73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72: 63 -69, que discuten el uso del bombardeo de partículas para introducir transgenes en el trigo; y Adam (1997) ver más arriba, para uso del bombardeo de partículas para introducir las YAC en células vegetales. Por ejemplo, Rinehart (1997) ver más arriba, utilizó bombardeo de partículas para generar plantas de algodón transgénicas. Los aparatos para acelerar partículas se describen en la patente de los Estados Unidos No. 5.015.580; y, el instrumento de aceleración de partículas POS-2000a comercialmente disponible de BioRad (Biolistics); véase también, John, patente de los Estados Unidos No. 5.608.148; y Ellis, patente de los Estados Unidos No. 5. 681.730, que describen la transformación mediada por partículas de gimnospermas.

En un aspecto, los protoplastos pueden ser inmovilizados e inyectados con ácidos nucleicos, por ejemplo, un constructo de expresión. Si bien la regeneración de la planta a partir de los protoplastos no es fácil con los cereales, la regeneración de la planta es posible en las legumbres usando embriogénesis somática de los callos derivados del protoplasto. Los tejidos organizados pueden ser transformados con ADN desnudo usando la técnica de pistola de genes, donde se coloca el ADN sobre microproyectiles de tungsteno, que se disparan a razón de 1/100 con respecto

al tamaño de las células, llevando el ADN al interior de las células y organelos. El tejido transformado se induce luego para regeneración, usualmente por embriogénesis somática. Esta técnica ha sido exitosa en varias especies de cereales incluyendo maíz y arroz.

Los ácidos nucleicos, por ejemplo, constructos de expresión, también pueden ser introducidos también en las células vegetales usando virus recombinantes. Las células vegetales pueden ser transformadas usando vectores virales, tales como, por ejemplo, vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:,989,-,999), véase Porta (1996) “Use of viral replicons for the expression of genes in plants” Mol. Biotechnol. 5: 209 -221.

En forma alternativa, los ácidos nucleicos, por ejemplo, un constructo de expresión, pueden ser combinados con regiones flanqueadoras de T-ADN adecuadas e introducidos en un vector huésped de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del huésped de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción del constructo y el marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula es infectada por la bacteria. Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, que incluyen el desarmado y uso de vectores binarios, son descritas en la literatura científica. Véase, por ejemplo, Horsch (1984) Science 233: 496 -98; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80: 4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springerlag, Berlin 1995). El ADN en una célula de A. tumefaciens está contenido en el cromosoma bacteriano así como también en otra estructura conocida como un plásmido Ti (de inducción tumoral). El plásmido Ti contiene una región de ADN denominada T-ADN (~20 kb de longitud) que es transferido a la célula vegetal en el proceso de infección y una serie de genes vir (virulencia) que dirigen el proceso de infección. A. tumefaciens puede infectar únicamente una planta a través de heridas: cuando un tallo o raíz de una planta es herido, emite ciertas señales químicas, en respuesta a Io cual, los genes vir de A. tumefaciens se activan y dirigen una serie de eventos necesarios para la transferencia del T-ADN del plásmido Ti al cromosoma de la planta. El T-ADN luego ingresa en la célula vegetal a través de la herida. Una especulación es que el T-ADN espera hasta que el ADN de la planta esté siendo replicado o transcrito, luego se inserta en el ADN expuesto de la planta. A fin de usar A. tumefaciens como vector transgénico, la sección de inducción tumoral del T-ADN debe ser removida, al tiempo que se retienen las regiones limítrofes del T-ADN y los genes vir. El transgén luego se inserta entre las regiones limítrofes del T-ADN donde es transferido a la célula vegetal y se integra en los cromosomas de la planta.

La divulgación provee la transformación de las plantas monocotiledóneas usando los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo cereales importantes, véase Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35: 205 -218. Véase además, por ejemplo, Horsch, Science (1984) 233: 496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 80: 4803; Thykjaer (1997) ver más arriba; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1135 -1148, que discuten la integración del T-ADN en ADN genómico. Véase también D'Halluin, patente de los Estados Unidos No. 5.712.135, que describe un proceso para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de un cereal u otra planta monocotiledónea.

En un aspecto, el tercer paso puede implicar la selección y regeneración de plantas completas capaces de transmitir el gen objetivo incorporado a la próxima generación. Dichas técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de cultivo tisular, por Io general basándose en un marcador biocida y/o herbicida que ha sido introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de la planta a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans y colaboradores, Protoplasts lsolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas. 124 -176, MacMilIiIan Publishing , Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plantas, Plant Protoplasts, páginas. 21 -73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también puede ser obtenida a partir de callos de la planta, explantes, órganos o partes de la misma. Dichas técnicas de regeneración se describen en general en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486. Para obtener las plantas completas a partir de tejidos transgénicos tales como embriones inmaduros, se pueden cultivar bajo condiciones ambientales controladas en una serie de medios que contienen nutrientes y hormonas, un proceso conocido como cultivo de tejido. Una vez que las plantas completas son generadas y producen semillas, comienza la evaluación de la progenie.

Después de que el casete de expresión es incorporado en forma estable en plantas transgénicas, se puede introducir en otras plantas por cruzamiento sexual. Se puede utilizar cualquiera entre una cantidad de técnicas de estándar de fitomejoramiento, dependiendo de la especie que va a ser cruzada. Véase, por ejemplo, Welsh J. R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981); Crop Breeding, Madera D. R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983); Mayo 0., The Theory of Plant Breeding, Segunda Edición, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D. P., Breeding for Resistance to Diseases and lnsect Pests, Springer-Verlag, NY (1986); y Wricke y Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co. Berlín (1986).

Como la expresión transgénica de los ácidos nucleicos de la invención genera cambios fenotípicos, las plantas que comprenden los ácidos nucleicos recombinantes de la invención pueden ser cruzadas de manera sexual con una segunda planta para obtener un producto final. Por lo tanto, la semilla de la divulgación puede ser derivada a partir de un cruce entre dos plantas transgénicas de la divulgación, o un cruce entre una planta de la divulgación y otra

planta. Los efectos deseados (por ejemplo, expresión de los polipéptidos de la invención para producir una planta en la cual se altera el comportamiento de floración) pueden ser mejorados cuando ambas plantas progenitoras expresan los polipéptidos (por ejemplo, una glucanasa, manasa, o xilanasa) de la divulgación. Los efectos deseados pueden pasar a futuras generaciones de plantas a través de medios de propagación estándares.

Cualquier planta se puede usar para la introducción del nucleótido de interés, incluyendo, pero sin limitarse a, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente las especies Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, tal como canola, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria italica), mijo dedo (Eleusine coracana), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max). tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (lpomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), nuez de la India (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coníferas.

Los vegetales pueden incluir tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías lima (Phaseolus Iimensis). guisantes (Lathyrus spp.) y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. satívus). cantalupo (C. cantalupensis) y melón almizcleño (C. melo). Las plantas ornamentales pueden incluir azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), flor de Pascua (Euphorbia pulcherrima), canna (Cannaceae spp.) y crisantemo. Las coníferas que pueden ser utilizadas, incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino de incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino logdepole (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata), abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); abeto occidental (Tsuga canadensis); pícea Sitka (Picea glauca); secoya (Sequoia sempervirens); abetos reales tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámo (Abies balsantea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis); y plantas leguminosas, incluyendo, pero sin limitarse a, frijoles y guisantes; donde en aspectos alternativos los frijoles pueden incluir guar, algarroba, fenogreco, soja, habichuelas, arvejas, frijol mungo, frijol lima, habas, lentejas, garbanzos, etc. y las legumbres pueden incluir, pero sin limitarse a, Arachis, por ejemplo, cacahuetes, Vicia, por ejemplo, veza corona, veza peluda, frijol adzuki, frijol mungo y garbanzos, lupines, por ejemplo, Iupino, trébol rojo, Phaseolus, por ejemplo, frijol común y frijol lima, Pisum, por ejemplo, frijol de campo, meliloto, por ejemplo, trébol, Medicago, por ejemplo, alfalfa, loto, por ejemplo, trébol, lentejas, por ejemplo, lenteja y falso índigo; también se incluye pastos para forraje y pasto césped, tales como alfalfa, pasto varilla (Panicum virgatum), Miscanthus, pasto ovillo, festuca alta, ballico perenne, pasto encorvado rastrero y agróstide.

Las plantas de interés particular pueden incluir plantas de cultivo y plantas usadas para producir energía o combustible, por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, cebada, arroz, coníferas, pastos, por ejemplo, pasto varilla y Miscanthus, cultivos de leguminosas, por ejemplo, guisante, frijol y soja, raíz/tubérculo almidonoso, por ejemplo, patata, batata, mandioca, taro, canna, remolacha azucarera, caña de azúcar y similares.

En formas de realización alternativas, los ácidos nucleicos de la invención son expresados en plantas que contienen células de fibras, incluyendo, por ejemplo, algodón, árbol de algodón de seda (Kapok, Ceiba pentandra), sauce del desierto, Chaparral, ontina, balsa, ramio, cáñamo de la india, cáñamo común, rosella, yute, sisal, abacá y lino. En formas de realización alternativas, las plantas transgénicas de la divulgación pueden ser miembros del género Gossypium, incluyendo miembros de cualquier especie Gossypium, tal como G. arboreum;. G. herbaceum, G. barbadense y G. hirsutum.

La divulgación también provee plantas transgénicas que se utilizan para producir grandes cantidades de los polipéptidos (por ejemplo, una glucanasa, manasa, o xilanasa o anticuerpo) de la divulgación. Por ejemplo, véase Palmgren (1997) Trends Genet. 13: 348; Chong (1997) Transgenic Res. 6: 289 -296 (que producen proteína betacaseína de la leche humana en plantas de patata transgénicas usando un promotor, manopina sintasa bidireccional inducible por auxina (más 1’,2’) con métodos de transformación de disco de hoja mediados por Agrobacterium tumefaciens).

Usando procedimientos conocidos, una persona versada en el arte puede cribar las plantas de la divulgación detectando el incremento o reducción de ARNm transgénico o proteína en las plantas transgénicas. Los medios para detectar y cuantificar los ARNm o proteínas son bien conocidos en el arte.

Polipéptidos y péptidos

En un aspecto, la invención provee polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes, que tienen actividad de glucoamilasa que tienen una identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 99%, o más, o identidad de secuencia completa (100%)) con la secuencia de la invención, por ejemplo, SEQ ID NO: 48.

En una forma de realización, los polipéptidos de la invención pueden catalizar la hidrólisis de polisacáridos que comprenden monómeros de glucosa, tales como almidón (un polímero de monómero de glucosa unido por enlaces 1,4-alfa o 1,6-alfa). En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de glucoamilasa. Las glucoamilasas de la invención incluyen polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa. Una actividad de amilasa de la invención incluye polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa, tal como la habilidad para hidrolizar polímeros de glucosa enlazados por enlaces α-1,4-y α-1,6-glucosídicos. En un aspecto, los polipéptidos de la invención tienen actividad de glucoamilasa, hidrolizando enlaces α-1,4-glucosídicos internos para obtener maltodextrinas de menor peso molecular. Una actividad de amilasa de la invención también incluye actividad de glucano 1,4-α-glucosidasa, o 1,4-αD-glucano glucohidrolasa, comúnmente denominada glucoamilasa pero también denominada amiloglucosidasa y γamilasa que, en un aspecto, libera β-D-glucosa a partir de glucanos enlazados en forma 1,4-α-, 1,6-α-y 1,3-α-.

En una forma de realización, los polipéptidos de la invención se pueden usar para generar un anticuerpo que se enlaza de manera específica a (es específico de) un polipéptido de la invención, por ejemplo, un ejemplo de enzima de la invención.

En un aspecto, la actividad de glucoamilasa de un polipéptido de la invención comprende la catálisis de la hidrólisis de enlaces glucosídicos. La actividad de glucoamilasa puede comprender catalizar la liberación hidrolítica por etapas de la D-glucosa a partir de los extremos no reductores de almidón u otras dextrinas relacionadas. La actividad de glucoamilasa puede comprender una actividad de 1,4-α-D-glucano glucohidrolasa. La actividad de glucoamilasa puede comprender la catálisis de la hidrólisis de maltodextrinas que resultan en la generación de glucosa libre. La actividad de glucoamilasa puede comprender una actividad de exoamilasa. La actividad de glucoamilasa puede comprender actividad una de α-amilasa o de β-amilasa. Los enlaces glucosídicos hidrolizados pueden comprender enlaces α-1,4-glucosídicos o enlaces α-1,6-glucosídicos. La actividad de glucoamilasa puede comprender hidrolizar enlaces glucosídicos en un polisacárido, oligosacárido o almidón. La actividad de glucoamilasa puede comprender además, hidrolizar enlaces glucosídicos en el almidón para producir maltodextrinas. La actividad de glucoamilasa puede comprender escindir una unidad de maltosa o de D-glucosa del extremo no reductor del polisacárido, oligosacárido o almidón.

En un aspecto, la La divulgación proporciona alfa-amilasas (α-amilasas) que son enzimas que actúan en forma endo que pueden hidrolizar almidón, un polímero de monómeros de glucosa unidos por enlaces 1,4-alfa o 1,6-alfa, a maltodextrinas cortas. En un aspecto, la invención provee glucoamilasas que son hidrolasas que actúan en forma exo que pueden liberar beta-D-glucosa de los extremos no reductores del almidón y sacáridos relacionados. Las glucoamilasas de esta invención se pueden usar a nivel comercial para licuar y sacarificar el almidón durante la producción de etanol usando procesos tales como el proceso de molienda en seco. En un aspecto de un proceso de la invención, el proceso de molienda en seco muele maíz entero (la suspensión) que se somete a una temperatura elevada (para promover la gelatinización de almidón) y es hidrolizada por una o más amilasas termoestables, que incluyen al menos una enzima de la divulgación, lo que resulta en un polisacárido, por ejemplo, almidón, Iicuefacción. En un aspecto, el polisacárido hidrolizado, por ejemplo, almidón, es digerido adicionalmente por una glucoamilasa de la invención, que puede ser agregada una vez que la temperatura de la masa desciende; y en un aspecto, la glucosa liberada del polisacárido, por ejemplo, almidón, es fermentada hasta etanol por levadura agregada a la terminación del polisacárido, por ejemplo, almidón, proceso de hidrólisis, o durante la sacarificación del polisacárido, por ejemplo, almidón.

En un aspecto, las glucoamilasas de la invención hidrolizan los enlaces internos de polisacáridos, por ejemplo, enlaces α-1,4-y α-1,6-glucosídicos en un polisacárido, oligosacárido o almidón, para producir maltodextrinas de menor peso molecular. En un aspecto, esta hidrólisis es muy aleatoria. Por lo tanto, la invención provee métodos para producir maltodextrinas de menor peso molecular. Las glucosidasas de la invención se pueden usar en establecimientos industriales y en laboratorios para hidrolizar un polisacárido, oligosacárido o almidón, o cualquier compuesto que comprenda maltodextrina para una variedad de propósitos. Estas glucosidasas se pueden usar en forma solas para proveer hidrólisis específica o pueden ser combinadas con otras glucosidasas para proveer un "cóctel" con un amplio espectro de actividad. Los ejemplos de usos incluyen la remoción o hidrólisis parcial o completa de un polisacárido, oligosacárido o almidón, o cualquier compuesto que comprenda maltodextrina a partir de muestras biológicas, alimenticias, de pienso animal, o farmacéuticas o industriales.

Por ejemplo, la glucoamilasa de la invención pueden ser formuladas en detergentes para lavandería para ayudar a la remoción de tinturas que comprenden polisacáridos, por ejemplo, que contienen almidón. Las glucosidasas de la divulgación se pueden usar como agentes de limpieza en matrices de detergentes (véase aplicaciones industriales más adelante). Las glucosidasas de la divulgación se pueden usar en las etapas iniciales (Iicuefacción) del polisacárido, por ejemplo, almidón, procesamiento en la molienda de maíz en húmedo, en la producción del alcohol, en la industria textil para desencolado del almidón, en aplicaciones de panadería y pastelería, en la industria de las bebidas, en procesos de perforación en campos petroleros; en el entintado de papel reciclado; y en pienso animal.

Las glucosidasas de la divulgación (por ejemplo, glucoamilasas) pueden tener actividad de glucosidasa bajo diferentes condiciones, por ejemplo, de pH y/o temperatura extremos, agentes de oxidación y similares. La divulgación provee métodos que conducen a preparaciones alternativas de glucosidasa con diferentes eficiencias y estabilidades catalíticas, por ejemplo, en cuanto a temperatura, agentes oxidantes y cambio en las condiciones de lavado. En un aspecto, las variantes de glucosidasa pueden ser producidas usando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria. En un aspecto, la evolución dirigida se puede usar para producir una gran variedad de variantes de glucosidasa con especificidad y estabilidad alternativas.

Las proteínas de la invención también son útiles como reactivos de investigación para identificar moduladores de glucoamilasa, por ejemplo, activadores o inhibidores de la actividad de glucoamilasa. En resumen, se añaden las muestras de prueba (compuestos, caldos, extractos y similares) a los ensayos de glucoamilasa para determinar su habilidad para inhibir la escisión del sustrato. Los inhibidores identificados de este modo se pueden usar en la industria y en investigación para reducir o prevenir la proteólisis indeseada. Como sucede con la glucoamilasa, los inhibidores pueden ser combinados para incrementar el espectro de actividad.

Una actividad de glucoamilasa de la invención también incluye hidrolizar un polisacárido, oligosacárido o almidón, a altas temperaturas, bajas temperaturas, pH alcalino y pH ácido. Por ejemplo, en un aspecto, la invención provee polipéptidos y los ácidos nucleicos que los codifican, que tienen una actividad de glucoamilasa que es termoestable. El polipéptido puede retener actividad de glucoamilasa bajo condiciones que comprenden un rango de temperatura de entre aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 95 °C; entre aproximadamente 55 °C hasta aproximadamente 85 °C, entre aproximadamente 70 °C hasta aproximadamente 95 °C, o, entre aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 95 °C. En otro aspecto, un polipéptido de la invención puede tener actividad de glucoamilasa que es termotolerante. El polipéptido puede retener actividad de glucoamilasa después de la exposición a una temperatura en el rango de más de 37 °C hasta aproximadamente 95 °C o en el rango de más de 55 °C hasta aproximadamente 85 °C.

La invención provee "aminoácidos" o "secuencias de aminoácidos de la invención”, que incluyen una secuencia de oligopéptido, péptido, polipéptido, o proteína, o para un fragmento, porción o subunidad de cualquiera de estas, y para moléculas sintéticas, recombinantes o de origen natural. Los términos “polipéptido” y “proteína” incluyen aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos

o enlaces no peptídicos (enlaces sintéticos, polipéptidos sintéticos) y pueden contener aminoácidos modificados diferente a los 20 aminoácidos codificados por genes. El término "polipéptido" también incluye fragmentos de péptidos y polipéptidos, motivos y similares. El término también incluye polipéptidos glicosilados. Los péptidos y polipéptidos de la invención también incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas" como se describe con mayor detalle, más adelante.

El término "aislado" incluye un material removido de su ambiente original, por ejemplo, el ambiente natural si es de origen natural. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o todo el material coexistente en el sistema natural, es aislado. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición y aún así estar aislados de manera tal que dicho vector o composición no sea parte de su ambiente natural. Como se usa aquí, un material o composición aislados pueden ser también una composición "purificada", es decir, que no requiere pureza absoluta; en cambio, se usa como definición relativa. Los ácidos nucleicos individuales obtenidos de una biblioteca pueden ser purificados en forma convencional hasta homogeneidad electroforética. En aspectos alternativos, la invención provee ácidos nucleicos que han sido purificados de ADN genómico o de otras secuencias en una biblioteca u otro ambiente en al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más órdenes de magnitud.

La divulgación también provee “variantes de amilasa” y "variantes de glucoamilasa" que pueden comprender una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de aminoácidos de una "amilasa precursora", por ejemplo en un aspecto, una secuencia de ejemplo de la divulgación (por ejemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, etc., o cualquier polipéptido de la divulgación). La glucoamilasa o amilasa precursora también puede incluir glucoamilasas o amilasas y amilasas recombinantes de origen natural. La secuencia de aminoácidos de la variante de glucoamilasa se puede "derivar" de la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa o amilasa precursora por sustitución, supresión o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Dicha modificación puede ser de la "secuencia de ADN precursora" que codifica la secuencia de aminoácidos de la amilasa precursora en vez de la manipulación de la enzima amilasa precursora por sí misma. Los métodos adecuados para dicha manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen los métodos divulgados aquí, así como también los métodos conocidos para aquellos capacitados en el arte.

Las actividades de las secuencias que sirven de ejemplo de la divulgación se enlistan en la tabla (“Tabla 1") inmediatamente a continuación. Para ayudar a la lectura de la tabla, por ejemplo, en la primera fila las SEQ ID NO: 1, 2, representan el ejemplo de polipéptido de la divulgación que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2, codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1; y esta secuencia de ejemplo fue aislada inicialmente a partir de Cochliobolus heterostrophus, ATCC 48331; no se predice ninguna secuencia señal (pero bajo ciertas condiciones

celulares in vivo, la secuencia puede tener una secuencia señal); el polipéptido tiene actividad de "glicosidasa", que puede ser designada en forma más específica como actividad de la enzima "amilasa"; y el correspondiente número “EC” para las enzimas amilasa (un número EC es el número asignado a un tipo de enzima de acuerdo con un esquema de nomenclatura de enzimas estandarizada desarrollada por la Enzyme Commission of the Nomenclature 5 Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, o IUBMB); “CMB20” que designa el “dominio de enlazamiento de carbohidratos”; y la última columna indica una “fuente genética", o la fuente de la secuencia de ejemplo tal como se determina por análisis de homología del ARN 18/16S de las célula a partir de la cual se aisló inicialmente. En la segunda fila, la SEQ ID NO: 11, 12, representa el ejemplo de polipéptido de la divulgación, que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 12, codificada por, por ejemplo, la SEQ lD 10 NO: 11; y esta secuencia que sirve de ejemplo se aisló inicialmente de una fuente desconocida; el “sitio SS", designa los residuos amino terminales que son la secuencia señal y para la SEQ ID NO: 12 son los 21 residuos de aminoácidos del terminal amino que forman la secuencia señal (o, MFNQVLYGLAATALWQGQVVA, es decir, los residuos 1 a 21 de la SEQ ID NO: 12); y el polipéptido tiene actividad de “glicosidasa”, que puede ser designada en forma más específica como una actividad de enzima "glicoamilasa"; teniendo esta enzima un número EC de 3.2.1.3; 15 con “dominio de enlazamiento del carbohidrato"; y una coincidencia genética del ARN 18/16S de la célula a partir de

la cual se aisló inicialmente es Fusarium equiseti.

Tabla 1

SEQ ID Fuente Sitio SS Secuencia señal Actividad Un ejemplo de Nú CBM20 Fuente general actividad me

NO: (como se específica ro

determinó

EC

di

Cochliobolus Cochliobolus heterostrophus 1,2 48331 Glicosidasa amilasa 3.2.1.1 CBM20 heterostrophus 11,12 Desconocida AA 1-21 Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 Fusariumequise MFNQVLYGLAATALWQGQVV CBM20

ti 100%

A

Fusarium Fusarium

verticillioide

13, 14 verticillioides AA 1-21 MFTQILYGLTALSALQGQVTA Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 CBM20 GZ3639 Cochliobolus 15, 16 heterostrophus AA 1-20 MLSKILLPVVALAASANAHG Glicosidasa glucoamilasa Cochliobolus CBM20

ATCC heterostrophu Fusarium Fusarium

verticillioide

17, 18 verticillioides Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 CBM20 GZ3639

Penicillium 19, 20 Desconocida AA 1-22 MLTLNVLTALLAPIVLSSALPA Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 no chrysogenum 21, 22 Desconocida AA 1-18 MVLARLAWLAGLVSTAVA amilasa 3.2.1.1 no Penicillium Glicosidasa

expansum 23, 24 Desconocida AA 1-20 MKLSHTLTALLLPLICTVSA amilasa 3.2.1.1 no Penicillium Glicosidasa

chrysogenum Penicillium 25, 26 Desconocida AA 1-21 MTISRLSSVLFALALGQSALA Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 CBM20 verruculosum 27, 28 Desconocida AA 1-20 MYILSSAFLLGSLALQSVLG glucoamilasa 3.2.1.3 Fusarium Glicosidasa CBM20

merismoides 29, 30 Desconocida AA 1-21 glucoamilasa 3.2.1.3 Phoma MLFSSLLRALSASLLAGAVQG Glicosidasa CBM20

herbarum

Cochliobolus 3, 4 heterostrophus AA 1-20 MLLLNIFTTLFFYITCIVSA amilasa 3.2.1.1 Cochliobolus Glicosidasa CBM20

ATCC heterostrophu

31, 32 Desconocida AA1-18 MVLARLAWLAGLVSTAIA amilasa 3.2.1.1 no Penicillium Glicosidasa

chrysogenum 33, 34 Desconocida AA1-18 MVGFNILTLALLAPAALS glucoamilasa 3.2.1.3 no Penicillium Glicosidasa

herquei 99% 35, 36 Desconocida AA 1-20 MAPRFWTTLCALTLGSAALA Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 CBM20 oxysporum 100% Cordyceps ophioglossoide s

37, 38 Desconocida AA 1-19 MAPRFWIALWALTFGQAIA Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 CBM20 99%

Penicillium 39, 40 Desconocida AA1-20 MAPRFWTALWALTLGHAWA Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 CBM20 chrysogenum Cucurbitaria 41, 42 Desconocida Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 no berberidis 98% Cochliobolus

43, 44 heterostrophus AA 1-23 Glicosidasa -Cochliobolus MTHTSFVQASTVLSSLLALTAG glucosidase

ATCC heterostrophu

Q

48332 s

Fusarium equiseti 45, 46 Desconocida AA 1-19 MKLLQLAALVASLSPFTNA Glicosidasa amilasa 3.2.1.1 no 100%

Aspergillus 47, 48 Desconocida AA 1-20 MTRILTLALHGLALVQSVVG Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 CBM20 versicolor 99 49, 50 Aspergillus AA 1-18 MSFFLSCLYLSLCGSALA Glicosidasa amilasa 3.2.1.1 no Aspergillus terreus

Cochliobolus 5,6 heterostrophus Glicosidasa -Cochliobolus glucosidase

ATCC heterostrophu 51, 52 Aspergillus AA 1-20 MKWTFSLLLLLSVFGQATHA Glicosidasa amilasa 3.2.1.1 CBM20 Aspergillus terreus 53, 54 Aspergillus AA 1-20 MKLSRALTVFLLHLTSTALA Glicosidasa amilasa 3.2.1.1 no Aspergillus terreus

terreus 55, 56 Desconocida AA 1-27

Glicosidasa 3.2.1.1

57, 58 Desconocida Glicosidasa 3.2.1.10 59, 60 Desconocida Glicosidasa 3.2.1.10 61, 62 Desconocida AA 1-20 MVAGFGLYGAALLTPMAAQA Glicosidasa 3.2.1.1 63, 64 Desconocida Glicosidasa 3.2.1.20 65, 66 Desconocida AA 1-25 MKLKYLALVLLAVASIGLLSTPV Glicosidasa 3.2.1.1 67, 68 Desconocida AA 1-23 MKKNTISALVAGMVLGFASNAM Glicosidasa 3.2.1.1

69, 70 Desconocida AA1-44 Glicosidasa 3.2.1.1

Cochilobulus Glicosidasa α-glucosidasa Cochliobolus heterostrophus heterostrophus ATCC 5,6 48331

Cochliobolus Glicosidasa glucoamilasa 3.2.1.3 no Cochliobolus heterostrophus heterostrophus ATCC 7, 8 48331

71, 72 Desconocida Glicosidasa 3.2.1.2 0

Thermomyces Glicosidasa 3.2.1.3 lanuginosus ATCC 73, 74 200065

75, 76 Desconocida AA 1-24 Glicosidasa amilasa 3.2.1.1

99%

Los polipéptidos de la invención también pueden ser más cortos que la longitud completa de los polipéptidos que sirven de ejemplo. En aspectos alternativos, la invención provee polipéptidos (péptidos, fragmentos) que oscilan en tamaño entre aproximadamente 5 y la longitud completa de un polipéptido, por ejemplo, una enzima; los ejemplos de tamaños son aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, o más residuos, por ejemplo, residuos contiguos de un ejemplo de glucoamilasa de la invención. Los péptidos de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas de marcación, antígenos, tolerágenos, motivos, sitios activos de amilasa.

Los polipéptidos y péptidos de la invención pueden ser aislados a partir de fuentes naturales, ser polipéptidos sintéticos o generados en forma recombinante. Los péptidos y proteínas pueden ser expresados en forma recombinante in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos de la invención pueden ser elaborados y aislados usando cualquier método conocido en el arte. Los polipéptidos y péptidos de la invención también pueden ser sintetizados, en forma completa o en parte, usando métodos químicos conocidos en el arte. Véase por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acid Res. Symp. Ser. 215 -223; Horn (1980) Nucleic Acid Res. Symp. Ser. 225 -232; Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por ejemplo, la síntesis peptídica puede ser realizada usando varias técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269: 202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289: 3 -13) y se puede lograr una síntesis automatizada, por ejemplo, usando el Peptide Synthesizer ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante.

Los péptidos y polipéptidos de la invención también pueden ser glicosilados. La glicosilación puede ser agregada de manera posterior a la traducción ya sea a nivel químico o por mecanismos biosintéticos celulares, en donde este último incorpora el uso de motivos de glicosilación conocidos, que pueden ser nativos con respecto a la secuencia o pueden ser agregados como un péptido o agregados en la secuencia codificadora del ácido nucleico. La glicosilación puede estar enlazada a O o enlazada a N. La glicosilación puede ser agregada a cualquier polipéptido de la invención para generar una enzima que es más termotolerante o termoestable que la enzima "progenitora" (a la cual se le agregó la glicosilación). La glicosilación puede ser agregada ya sea por mecanismos químicos o por mecanismos biosintéticos celulares.

La divulgación provee amilasas que tienen un amplio rango de actividad específica sobre un amplio rango de temperaturas, por ejemplo, a aproximadamente 37ºC en el rango de aproximadamente 10 a 10,000, o, 100 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína. Las glucoamilasas de la invención pueden tener actividad a temperaturas tan altas como 120ºC. En aspectos alternativos, la amilasa usada en estos métodos es activa a estas temperaturas, por ejemplo, activa a temperaturas en el rango de aproximadamente 80ºC a aproximadamente 115ºC, entre aproximadamente 100ºC a aproximadamente 110ºC, y desde aproximadamente 105°C a aproximadamente 108°C. Sin embargo, las glucoamilasas de la invención también pueden tener actividad a bajas temperaturas, por ejemplo, tan bajas como 4ºC a 5ºC.

La Tm de una enzima de la invención puede ser cambiada (por ejemplo, puede ser cambiada entre aproximadamente 10 °C y 90 °C) mediante activación térmica. Por ejemplo, la Tm de la SEQ ID NO: 336/337 puede ser cambiada aproximadamente a 17°C hasta 87°C mediante activación térmica: por ejemplo, preincubación a 80°C durante 5 minutos.

Los péptidos y polipéptidos de la divulgación, como se definió anteriormente, incluyen todas las formas “miméticas” y “peptidomiméticas". Los términos “mimético" y "peptidomimético" se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos de la invención. El mimético puede estar ya sea completamente compuesto de análogos no naturales, sintéticos, de aminoácidos, o, es una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales y análogos parcialmente no naturales de aminoácidos. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales siempre que dichas sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético. Como sucede con los polipéptidos de la divulgación que son variantes conservadoras, la experimentación de rutina determinará si un mimético tiene una estructura y/o función que no sea sustancialmente alterada.

Las composiciones miméticas de polipéptidos de la divulgación pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales (por ejemplo, pueden ser completamente o parcialmente sintéticos o "miméticos”). En un aspecto alternativo, las composiciones miméticas de la divulgación incluyen uno o todos los siguientes tres grupos estructurales: a) grupos de enlazamiento a un residuo diferentes de los enlaces de amida naturales ("enlace peptídico”); b) residuos no naturales en lugar de residuos de aminoácidos de origen natural; o c) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, por ejemplo, una vuelta beta, una vuelta gamma, una lámina beta, una conformación de hélice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipéptido de la divulgación puede ser caracterizado como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos se unen por medios químicos que no sean los enlaces peptídicos naturales. Los residuos péptido-miméticos individuales pueden estar unidos por enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de enlazamiento que pueden ser una alternativa para el enlazamiento de amida tradicional (“enlace peptídico") incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=O)-CH2-por -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (véase, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Bíochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteíns, Vol. 7, páginas 267 -357, "Peptide Backbone Modifications", Marcell Dekker, NY).

Un polipéptido de la divulgación también puede ser caracterizado como un mimético por contener todos o algunos de los residuos no naturales en lugar de los residuos de aminoácidos de origen natural. Los residuos no naturales se describen en la literatura científica y de patentes; unos pocos ejemplos no naturales de composiciones útiles como miméticos de residuos de aminoácidos naturales y guanidinas se describen a continuación. Los agentes miméticos de los aminoácidos aromáticos pueden ser generados mediante reemplazo por, por ejemplo, D-o L-naftilalanina; D

: o L-fenilglicina; D-o L-2 tieneilalanina; D-o L-1, -2, 3-, o 4-pireneilalanina; D-o L-3 tieneilalanina; D-o L-(2piridiniI)-alanina; D-o L-(3-piridiniI)-alanina; D-o L-(2-piraziniI)-alanina; D-o L-(4-isopropiI)-fenilglicina; D(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometiI)-fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D-o L-p-bifenilfenilalanina; D-o L-p-metoxi-bifenilfenilaIanina; D-o L-2-indol(alquil)alaninas; y, D-o L-alquilalaninas, en donde el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, sec-isotilo, iso-pentilo o aminoácidos no ácidos sustituidos o no sustituidos. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y piridilo.

Los agentes miméticos de aminoácidos ácidos pueden ser generados mediante sustitución, por ejemplo, aminoácidos no carboxilados, mientras que mantienen una carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Los grupos laterales carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) también pueden ser modificados en forma selectiva por reacción con carbodiimidas (R'-N-C-N-R’) tales como, por ejemplo, 1-ciclohexil-3(2-morfoliniI-(4-etil) carbodiimida o 1-etiI-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil) carbodiimida. El aspartilo o glutamilo también pueden ser convertidos en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio. Los agentes miméticos de los aminoácidos básicos pueden ser generados por sustitución con, por ejemplo, (además de lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido (guanidino)-acético, o ácido (guanidino)alquil-acético, donde alquilo se definió anteriormente. El derivado de nitrilo (por ejemplo, que contiene la fracción CN en lugar de COOH) puede ser sustituido por asparagina

: o glutamina. Los residuos de asparaginilo y glutaminilo pueden ser desaminados con los correspondientes residuos de aspartilo o glutamilo. Los agentes miméticos del residuo arginina pueden ser generados por reacción del arginilo por ejemplo con, uno o mas reactivos convencionales, incluyendo, por ejemplo, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2cicIohexanediona, o ninhidrina, preferiblemente bajo condiciones alcalinas. Los agentes miméticos de los residuos de tirosina pueden ser generados por reacción del tirosilo, por ejemplo, con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano. El N-acetilimidizol y tetranitrometano se pueden usar para formar la especie O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los agentes miméticos de los residuos de cisteína pueden ser generados por reacción de residuos de cisteinilo, por ejemplo, con alfa-haloacetatos tales como ácido 2-cloroacético o cloroacetamida y las aminas correspondientes, para producir derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. Los agentes miméticos del residuo de cisteína también pueden ser generados por reacción de residuos de cisteinilo, por ejemplo, con bromo-trifluoroacetona, ácido de alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propiónico; cloroacetil fosfato, Nalquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo; disulfuro de metil 2-piridilo; p-cloromercuribenzoato; 2-cIoromercuri-4 nitrofenol; o, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Los agentes miméticos de lisina pueden ser generados (y residuos amino terminales pueden ser alterados) mediante reacción del Iisinilo, por ejemplo, con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. Los agentes miméticos de los residuos de lisina y otros que contienen alfaamino también pueden ser generados por reacción con imidoésteres, tales como metil picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitro-bencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4,-pentanediona y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Los agentes miméticos de metionina pueden ser generados por reacción por ejemplo, con sulfóxido de metionina. Los agentes miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidin carboxílico, 3-o 4-hidroxi prolina, deshidroprolina, 3-o 4-metilprolina, o 3,3-dimetilprolina. Los agentes miméticos de los residuos de histidina pueden ser generada por reacción del histidilo, por ejemplo, con dietilprocarbonato o bromuro de para-bromofenacilo. Otros miméticos incluyen, por ejemplo, aquellos generados por hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo; metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilación de amina N-terminal, metilación de los residuos amida de la cadena principal o sustitución con N-metil aminoácidos; o amidación de grupos carboxilo del terminal C.

Un residuo, por ejemplo, un aminoácido, de un polipéptido de la divulgación también puede ser reemplazado por un aminoácido (o residuo peptidomimético) de la quiralidad opuesta. Por lo tanto, cualquier aminoácido de origen natural en la configuración L (que también puede denominarse como R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede ser reemplazado con un aminoácido del mismo tipo estructural químico o un peptidomimético, pero de quiralidad opuesta, denominada como el aminoácido D pero que también puede ser denominada como la forma R o S.

La divulgación también provee métodos para modificar los polipéptidos de la divulgación ya sea por medio de procesos naturales, tales como procesamiento post traducción (por ejemplo, fosforilación, acilación, etc.), o por técnicas de modificación químicas y los polipéptidos modificados resultantes. Las modificaciones pueden aparecer en cualquier lado del polipéptido, incluyendo la estructura principal del péptido, las cadenas laterales del aminoácido y los terminales amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en diferentes grados en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de un fosfatidilinositol, ciclización de entrecruzamiento, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación y adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteína tal como arginilación. Véase, por ejemplo, Creighton, T.E., Proteins -Structure and Molecular Properties 2da Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, páginas 1 -12 (1983).

Los métodos de síntesis química peptídica en fase sólida también se pueden usar para sintetizar polipéptidos o fragmentos de la divulgación. Tales métodos se conocen en el arte desde los comienzos de la década de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 -2154, 1963) (Véase también Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2da Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III., página 11 -12)) y han sido recientemente empleados en kits de diseño y síntesis de péptidos de laboratorios, comercialmente disponibles (Cambridge Research Biocnemicals). Tales kits de laboratorio comercialmente disponibles han utilizado generalmente las enseñanzas de H. M. Geysen y colaboradores, Proc. Natl. Acad. SCL, USA, 81: 3998 (1984) y permiten la síntesis los péptidos en las puntas de una multitud de "barras" o “alfileres” todos los cuales están conectados a una sola placa. Cuando se utiliza dicho sistema, se invierte una placa de barras o alfileres y se inserta en una segunda placa de los correspondientes pozos o reservorios, que contienen soluciones para unir o anclar un aminoácido apropiado a las puntas de los alfileres o barras. Mediante la repetición de dicha etapa del proceso, es decir, invertir e insertar las puntas de las alfileres o barras en soluciones apropiadas, se construyen los aminoácidos en los péptidos deseados. Además, se encuentran disponibles una cantidad de sistemas de síntesis peptídica FMOC. Por ejemplo, el ensamblaje de un polipéptido o fragmento se puede llevar a cabo en un soporte sólido usando un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems, Inc. Modelo 431AMR. Dicho equipo provee fácil acceso a los péptidos de la invención, ya sea mediante síntesis directa o por síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar usando otras técnicas conocidas.

La invención provee nuevas glucoamilasas, incluyendo las enzimas de ejemplo de la invención, los ácidos nucleicos que las codifican, y métodos para usarlas. En un aspecto, los polipéptidos de la invención tienen actividad de glucoamilasa, como se describe aquí, incluyendo, por ejemplo, la habilidad de hidrolizar polisacáridos, oligosacáridos y/o almidones, en azúcares. En un aspecto, los polipéptidos de la invención tienen actividad de glucoamilasa. En aspectos alternativos, glucoamilasas de la invención tienen actividades que han sido modificadas a partir de aquellas del ejemplo de glucoamilasas descritas aquí.

La invención incluye glucoamilasas de la invención con y sin secuencias señal (incluyendo secuencias señal de la divulgación, véase por ejemplo, la Tabla 1, u otras secuencias señal). La invención también incluye polipéptidos (por ejemplo, proteínas de fusión) que comprenden una secuencia señal de la divulgación, véase, por ejemplo, la Tabla

1. El polipéptido que comprende una secuencia señal de la divulgación puede ser una amilasa y/o una glucoamilasa de la divulgación u otra amilasa u otra enzima u otro polipéptido.

La divulgación incluye amilasas inmovilizadas, glucoamilasas, anticuerpos de antiglucoamilasa, antiamilasa y fragmentos de los mismos. La divulgación provee métodos para inhibir la actividad de amilasa y/o glucoamilasa, por ejemplo, usando mutantes negativos dominantes o anticuerpos antiamilasa o antiglucoamilasa de la invención. La divulgación se refiere a hetero complejos, por ejemplo, proteínas de fusión, heterodímeros, etc., que comprenden las amilasas y/o glucoamilasas de la divulgación.

En un aspecto, glucoamilasas de la invención hidrolizan los enlaces polisacáridos o oligosacáridos internos, por ejemplo, enlaces α-1,4-y 1,6-glucosídicos en almidón para producir maltodextrinas de menor peso molecular. En un aspecto, esta hidrólisis es altamente aleatoria. Por lo tanto, la divulgación proporciona métodos para producir maltodextrinas de menor peso molecular.

Las glucoamilasas de la invención pueden ser usadas en establecimientos industriales y de laboratorio para hidrolizar polisacáridos, oligosacáridos o almidón o cualquier compuesto que comprende maltodextrina para una variedad de propósitos. Estas glucoamilasas se pueden usar solas para proveer una hidrólisis específica o se pueden combinar con otras amilasas para proveer un "cóctel" con un amplio espectro de actividad. Los ejemplos de usos incluyen la remoción o hidrólisis parcial o completa de polisacáridos, oligosacáridos o almidón o cualquier compuesto que comprenda maltodextrina a partir de muestras biológicas, alimenticias, pienso animal, farmacéuticas

o industriales.

Por ejemplo, las amilasas de la presente divulgación pueden formularse en detergentes para ropa para ayudar en la eliminación de las manchas que comprenden polisacáridos, por ejemplo, que contienen almidón. En un aspecto, la invención provee detergentes que comprenden glucoamilasas de la invención, incluyendo glucoamilasas activas bajo condiciones alcalinas, y métodos para su fabricación y uso. Estas composiciones detergentes incluyen las soluciones y aplicación en lavandería y máquinas para lavado de vajilla (por ejemplo, lavado automático de vajillas). Las glucoamilasas de la invención se pueden usar como agentes de limpieza en cualquier matriz de detergente (véanse las aplicaciones industriales más adelante). Las glucoamilasas de la presente invención se pueden usar en las etapas iniciales de procesamiento (Iicuefacción) del polisacárido, por ejemplo, almidón, en la molienda húmeda de maíz, en la producción del alcohol, en la industria textil para desencolado de polisacáridos, por ejemplo, almidón, en aplicaciones de panadería y pastelería, en la industria de las bebidas, en campos petroleros en procesos de perforación; en el entintado de papel reciclado; y en piensos animales.

Las glucoamilasas de la invención pueden tener una actividad amilasa bajo diferentes condiciones, por ejemplo, bajo pH y/o temperatura extremos, agentes oxidantes y similares. La divulgación provee métodos que conducen a preparaciones de amilasa alternativas con diferentes eficiencias y estabilidades catalíticas, por ejemplo, con respecto a temperatura, agentes oxidantes y cambios en las condiciones de lavado. En un aspecto, se pueden producir variantes de amilasa usando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria. En un aspecto, se puede usar evolución dirigida para producir una gran variedad de variantes de amilasa con especificidades y estabilidad alternativas.

La divulgación también provee métodos para descubrir nuevas amilasas y/o glucoamilasas usando los ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos de la invención. En un aspecto, se criban bibliotecas de fagos lambda para el descubrimiento con base en la expresión de amilasas. En un aspecto, la invención usa bibliotecas de fagos lambda en el cribado para permitir la detección de clones tóxicos; el acceso mejorado al sustrato; menor necesidad de manipular un huésped genéticamente, derivando el potencial para cualquier tendencia generada a partir de la escisión en masa de la biblioteca; y, crecimiento más rápido a densidades clónicas bajas. El cribado de bibliotecas de fagos lambda puede ser en fase líquida o en fase sólida. En un aspecto, la invención provee cribado en fase líquida. Esto permite una mayor flexibilidad en las condiciones del ensayo; flexibilidad adicional de sustrato; mayor sensibilidad para clones débiles; y facilidad de automatización sobre el cribado en fase sólida.

La divulgación provee métodos de cribado que utilizan las proteínas y ácidos nucleicos de la invención y automatización robótica para permitir la ejecución de muchos miles de reacciones biocatalíticas y ensayos de cribado en un corto período de tiempo, por ejemplo, por día, así como también garantizar un alto nivel de precisión y reproducibilidad (véase la discusión de los arreglos, más adelante). Como resultado de esto, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en cuestión de semanas. Para enseñanzas adicionales sobre la modificación de moléculas, incluyendo moléculas pequeñas, véase el documento PCT/U894/09174.

La presente invención incluye enzimas glucoamilasa que son variantes de carbonil hidrolasa que no son de origen no natural (por ejemplo, variantes de glucoamilasa) que tienen actividad, estabilidad, especificidad de sustrato, perfil de pH y/o desempeño proteolítico diferente característico comparado con la carbonil hidrolasa precursora a partir de la cual se deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. Específicamente, tales variantes tienen una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se deriva por sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una glucoamilasa precursora con diferentes aminoácidos. La glucoamilasa precursora puede ser de origen natural o recombinante. Las variantes útiles de glucoamilasa abarcan la sustitución de cualquiera de los Laminoácidos de origen natural en las posiciones designadas de los residuos de aminoácidos.

Secuencias señal de la amilasa y la glucoamilasa

La divulgación provee secuencias señal que consisten de o que comprenden un péptido que tiene una secuencia quecomprendelos residuos1a12,1a13,1a14,1a15,1a16,1a17,1a18,1a19,1a20,1a21,1a22,1a 23,1 a 24,1 a 25,1 a 26,1 a 27,1 a 28,1 a 29,1 a 30 o 1 a 31,1 a 32,1 a 33,1 a 34,1 a 35, 1 a 36, 1 a 37,1 a 38, o 1 a 39, o más largos, de un polipéptido de la invención. Por ejemplo, la divulgación provee una secuencia señal de amilasa (por ejemplo, alfa amilasa) o glucoamilasa y ácidos nucleicos que codifican esta secuencia señal, por ejemplo. ejemplos de péptidos de la invención que tienen secuencias como se expone en la Tabla anterior.

Las secuencias señal de amilasa y/o glucoamilasa de la divulgación pueden ser péptidos aislados, o, secuencias unidas a otro polipéptido de amilasa y/o glucoamilasa o que no es de amilasa o no es de glucoamilasa, por ejemplo, como una proteína de fusión. En un aspecto, la divulgación provee polipéptidos que comprenden secuencias señal de amilasa y/o glucoamilasa de la divulgación. En un aspecto, los polipéptidos que comprenden secuencias señal de amilasa y/o glucoamilasa de la divulgación comprenden secuencias heterólogas a una glucoamilasa de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una secuencia señal de la amilasa de la divulgación y secuencias de otra proteína amilasa o que no es amilasa). En un aspecto, la divulgación provee glucoamilasas de la invención con secuencias señal heterólogas, por ejemplo, secuencias con una secuencia señal de levadura. Por ejemplo, una glucoamilasa de la invención comprende una secuencia señal heteróloga en vectores, por ejemplo, un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).

En un aspecto, las secuencias señal de la divulgación se identifican después de la identificación de nuevos polipéptidos de amilasa y/o glucoamilasa. Las rutas por las cuales se clasifican y transportan las proteínas a su ubicación celular apropiada a menudo se denominan como rutas de direccionamiento de proteína. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de direccionamiento es una secuencia de aminoácidos corta en el terminal amino de un polipéptido recientemente sintetizado, denominada secuencia señal. Esta secuencia señal dirige una proteína a su ubicación apropiada en la célula y se remueve durante el transporte o cuando la proteína alcanza su destino final. La mayoría de las proteínas liposomales, de membrana, o secretadas tienen una secuencia señal en el terminal amino que las marca para translocación en el lumen del retículo endoplasmático. Se han determinado más de 100 secuencias señal para las proteínas en este grupo. Las secuencias señal pueden variar en longitud desde aproximadamente 13 a 36, o entre aproximadamente 10 y 40 residuos de aminoácidos. Varios métodos de reconocimiento de las secuencias señal son conocidos por aquellos entrenados en el arte. Por ejemplo, en un aspecto, se identifican los nuevos péptidos señal de amilasa por medio de un método denominado como SIGNALPMR. SignalPRM utiliza una red neural combinada que reconoce tanto los péptidos señal como sus sitios de escisión; véase, por ejemplo, Nielsen (1997) Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptídes and prediction of their cleavaje sites”, Protein Engineering. vol. 10, no. 1, página 1 -6.

Se entiende que en algunos aspectos, las glucoamilasas de la invención pueden no tener secuencias señal. En un aspecto, la invención provee las glucoamilasas de la invención que carecen totalmente o parte de una secuencia señal, por ejemplo, las secuencias señal de la invención (véase la Tabla 1). En un aspecto, la divulgación provee una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una amilasa operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico de una amilasa diferente o, opcionalmente, se puede desear una secuencia señal de una proteína no amilasa. La Tabla 1 muestra ejemplos de secuencias señal de la divulgación.

Amilasa y glucoamilasa prepro y secuencias señal y dominios catalíticos

Además de las secuencias señal (por ejemplo, péptidos señal (SPS)), como se discutió anteriormente, la divulgación provee dominios prepro y dominios catalíticos (CD). Los SP, dominios prepro y/o los CD de la invención pueden ser péptidos aislados, sintéticos o recombinantes o pueden ser parte de una proteína de fusión, por ejemplo, como dominio heterólogo en una proteína quimérica. La divulgación provee ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (CD) (por ejemplo, “sitio activos”), dominios prepro y secuencias señal (SP, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia que comprende/consiste de residuos amino terminales de un polipéptido de la invención).

Las secuencias señal (SP) de amilasa y/o glucoamilasa, dominios catalíticos (CD) y/o secuencias prepro de la divulgación pueden ser péptidos aislados, o, secuencias unidas a otro polipéptido de amilasa o que no es amilasa o que no es glucoamilasa, por ejemplo, como una proteína de fusión (quimérica). En un aspecto, los polipéptidos que comprenden secuencias señal SP de amilasa y/o prepro comprenden secuencias heterólogas para glucoamilasas de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una SP y/o una prepro de la divulgación y secuencias de otra proteína amilasa y/o glucoamilasa, o una proteína que no es amilasa o una que no es glucoamilasa). En un aspecto, la invención provee glucoamilasas de la invención con secuencias CD, SP y/o prepro heterólogas, por ejemplo, secuencias con una secuencia señal de levadura. Una glucoamilasa de la invención puede comprender un CD, SP y/o prepro heteróloga en un vector, por ejemplo, un vector de la serie pPlC (Invitrogen, Carlsbad, CA).

En un aspecto, las secuencias SP, CD, y/o prepro de la divulgación se identifican después de la identificación de nuevos polipéptidos de amilasa. Las rutas por medio de las cuales se clasifican y transportan las proteínas a sus ubicaciones celulares apropiadas a menudo son denominadas como rutas de direccionamiento de proteínas. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de direccionamiento es una secuencia corta de aminoácidos en el terminal amino de un polipéptido recientemente sintetizado llamado secuencia señal. Esta secuencia señal dirige una proteína a su ubicación apropiada en la célula y es removido durante el transporte o cuando la proteína alcanza su destino final. La mayoría de las proteínas liposomales, de membrana, o secretadas tienen una secuencia señal amino-terminal que las marca para translocación en el lumen del retículo endoplasmático. Las secuencias señal pueden variar en longitud desde 13 a 45 o más residuos de aminoácidos. Diferentes métodos de reconocimiento de las secuencias señal son conocidas por aquellos versados en el arte. Por ejemplo, en un aspecto, se identifican nuevos péptidos señal de hidrolasa por medio de un método denominado como SignalP. SignaIP utiliza una red neural combinada que reconoce tanto los péptidos señal como sus sitios de escisión. (Nielsen, y colaboradores, "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavaje sites." Protein Engineering, vol. 10, no. 1, página 1 -6 (1997).

En algunos aspectos, una glucoamilasa de la invención puede no tener secuencias de SP y/o prepro, y/o dominios catalíticos (CD). En un aspecto, la invención provee glucoamilasas que carecen de todo o parte de un SP, un CD y/o un dominio prepro. En un aspecto, la invención provee una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal (SP), un CD y/o prepro de una glucoamilasa operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico de una amilasa y/o glucoamilasa diferente, o, opcionalmente, pueden desearse una secuencia señal (SP), un CD y/o un dominio prepro de una proteína no amilasa o no glucoamilasa.

La divulgación también provee polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden secuencias señal (SP), un dominio prepro y/o dominios catalíticos (CD) de la divulgación y secuencias heterólogas. Las secuencias heterólogas son secuencias que no asociadas en forma natural (por ejemplo, a una amilasa) con un SP, un dominio prepro y/o un CD. La secuencias a las cuales no están naturalmente asociados el SP, el dominio prepro y/o el CD pueden estar sobre el extremo del terminal amino, el extremo del terminal carboxilo del SP, el dominio prepro y/o del CD, y/o sobre ambos extremos del SP y/o del CD. En un aspecto, la divulgación provee un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende (o consiste de) un polipéptido que comprende una secuencia señal (SP), dominio prepro y/o un dominio catalítico (CD) de la divulgación con la condición de que no este asociado con ninguna secuencia a la cual este asociado naturalmente (por ejemplo, una secuencia de amilasa y/o glucoamilasa). En forma similar, en un aspecto, la divulgación provee ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que codifican estos polipéptidos. Por lo tanto, en un aspecto, el ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la divulgación comprende una secuencia codificadora para una secuencia señal (SP), un dominio prepro y/o un dominio catalítico (CD) de la divulgación y una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia no asociada naturalmente con la secuencia señal (SP), el dominio prepro y/o el dominio catalítico (CD) de la divulgación). La secuencia heteróloga puede estar sobre el extremo terminal 3‘, el extremo terminal 5' y/o sobre ambos extremos de la secuencia del SP, el dominio prepro y/o del CD.

Los polipéptidos de la invención incluyen glucoamilasas en forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención incluyen proproteínas antes de la "maduración" o el procesamiento de secuencias prepro, por ejemplo, por una enzima de procesamiento de proproteínas, tal como una proproteína convertasa para generar una proteína madura "activa". Los polipéptidos de la invención incluyen glucoamilasas inactivas por otras razones, por ejemplo, antes de la "activación" por un evento de procesamiento de post-traducción, por ejemplo, una acción de endo-o exopeptidasa o proteinasa, un evento de fosforilación, una amidación, una glicosilación o una sulfación, un evento de dimerización y similares. Los métodos para identificar secuencias de dominio "prepro", los CD y secuencias señal son conocidos en el arte, véase, por ejemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2): 115 -136. Por ejemplo, para identificar una secuencia prepro, la proteína es purificada a partir de un espacio extracelular y se determina y se compara la secuencia del terminal N de la proteína con la forma no procesada.

Los polipéptidos de la invención incluyen todas las formas activas, incluyendo las subsecuencias activas, por ejemplo, los dominios catalíticos (CD) o los sitios activos, de una enzima de la invención. En un aspecto, la divulgación provee dominios catalíticos o sitios activos como se expone más adelante. En un aspecto, la divulgación provee un péptido o polipéptido que comprende o que consiste de un dominio de un sitio activo como se predice a través del uso de una base de datos tal como Pfam (que es una gran colección de múltiples alineaciones de secuencias y modelos Markov ocultos que cubren muchas familias de proteínas comunes, la base de datos Pfam de las familias de proteína, A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall y E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acid Research. 30(1):276-280. 2002) o equivalente.

Amilasas y/o glucoamilasas híbridas y bibliotecas de péptidos

En un aspecto, la divulgación provee amilasas y/o glucoamilasas híbridas y proteínas de fusión, incluyendo bibliotecas de péptidos, que comprenden secuencias de la invención. Las bibliotecas de péptidos de la divulgación se pueden usar para aislar moduladores de péptidos (por ejemplo, activadores o inhibidores) de objetivos, tales como receptores, enzimas, sustratos de amilasa y/o glucoamilasa. Las bibliotecas de péptidos de la divulgación se pueden usar para identificar los patrones de enlace formales de blancos, tales como ligandos, por ejemplo, citoquinas, hormonas y similares.

En un aspecto, las proteínas de fusión de la divulgación (por ejemplo, la fracción peptídica) están conformacionalmente estabilizadas (con relación a los péptidos lineales) para permitir una mayor afinidad de enlazamiento superior para los objetivos. La divulgación provee fusiones de amilasas y/o glucoamilasas de la divulgación y otros péptidos, incluyendo péptidos conocidos y aleatorios. Se pueden fusionar de tal manera que no se perturbe significativamente la estructura de las glucoamilasas y el péptido está metabólicamente o estructuralmente conformacionalmente estabilizado. Esto permite la creación de una biblioteca de péptidos que sea monitoreada fácilmente por su presencia dentro de las células y su cantidad.

Las variantes de secuencia de aminoácidos de la divulgación pueden ser caracterizadas por una naturaleza predeterminada de la variación, una característica que las fija separadamente de una forma de origen natural, por ejemplo, una variación alélica o entre especies de una secuencia de una amilasa y/o glucoamilasa. En un aspecto, las variantes de la divulgación exhiben la misma actividad cualitativa biológica que el análogo de origen natural. En forma alternativa, las variantes pueden ser seleccionadas por tener características modificadas. En un aspecto, si bien el sitio o región para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la mutación por sí misma no requiere ser predeterminada. Por ejemplo, a fin de optimizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se puede realizar una mutagénesis aleatoria en el codón o región objetivo y se pueden cribar las variantes de amilasa y/o glucoamilasa expresadas para una combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados de ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, como se discute aquí, por ejemplo, mutagénesis por cebador M13 y mutagénesis por PCR. El cribado de los mutantes puede hacerse usando ensayos de actividades proteolíticas. En aspectos alternativos, las sustituciones de aminoácidos pueden ser residuos individuales; las inserciones pueden estar en el orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, si bien se pueden realizar inserciones considerablemente mayores. Las supresiones pueden oscilar desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70 residuos o más. Para obtener un derivado final con propiedades óptimas, se pueden utilizar sustituciones, supresiones, inserciones, o cualquier combinación de las mismas. En general, estos cambios se realizan en pocos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, se pueden tolerar cambios mayores en ciertas circunstancias.

La divulgación provee glucoamilasas donde la estructura de la cadena principal del polipéptido, la estructura secundaria o la terciaria, por ejemplo, una estructura de hélice alfa o de lámina beta, ha sido modificada. En un aspecto, la carga o hidrofobicidad han sido modificados. En un aspecto, el volumen de una cadena lateral ha sido modificado. Se hacen cambios sustanciales en la identidad inmunológica o de la función, seleccionando sustituciones que sean menos conservadoras. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones que afectan en forma más significativa: la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la alteración, por ejemplo una estructura de hélice alfa o una lámina beta; una carga o un sitio hidrófobo de la molécula, que puede estar en un sitio activo; o una cadena lateral. La divulgación provee sustituciones en polipéptidos de la invención en donde (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo, serilo o treonilo, es sustituido por (o mediante) un residuo hidrófobo, por ejemplo, Ieucilo, isoleucilo, fenilalanilo, vaIiIo o alanilo; (b) una cisteína o prolina es sustituida por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena Iateral electropositiva, por ejemplo, Iisilo, arginilo, o histidilo, se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) uno que no tiene cadena lateral, por ejemplo glicina. Las variantes pueden exhibir la misma actividad biológica cualitativa (es decir actividad de glucoamilasa) aunque se pueden seleccionar variantes para modificar las características de las glucoamilasas según sea necesario.

En un aspecto, glucoamilasas de la invención comprenden epítopos o etiquetas de purificación, secuencias señal u otras secuencias de fusión, etc. En un aspecto, las , glucoamilasas de la invención se pueden fusionar con un péptido aleatorio para formar un polipéptido de fusión. Por "fusionado" u "operativamente enlazado" se entiende aaquí, que el péptido aleatorio y la glucoamilasa se enlazan entre sí, de tal forma que se minimiza la ruptura de la estabilidad de la estructura de la glucoamilasa, por ejemplo, ,retiene la actividad de glucoamilasa. El polipéptido de fusión (o el polinucleótido de fusión que codifica el polipéptido de fusión), puede comprender también componentes adicionales, incluyendo múltiples péptidos en múltiples bucles.

En un aspecto, los péptidos y ácidos nucleicos que los codifican son aleatorizados, ya sea completamente aleatorizados o se parcializan en su aleatorización, por ejemplo, generalmente en la frecuencia de nucleótidos/residuos o por posición. "Aleatorizado" significa que cada ácido nucleico y péptido consiste de nucleótidos y aminoácidos esencialmente aleatorios, respectivamente. En un aspecto, los ácidos nucleicos que dan lugar a los péptidos pueden ser químicamente sintetizados y, por lo tanto, pueden incorporar cualquier nucleótido en cualquier posición. Por lo tanto, cuando los ácidos nucleicos se expresan para formar péptidos, cualquier residuo de aminoácido puede ser incorporado en cualquier posición. El proceso de síntesis se puede diseñar para generar ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de todas o de la mayoría de las combinaciones posibles sobre la longitud del ácido nucleico, formando así una biblioteca de ácidos nucleicos aleatorizados. La biblioteca puede proveer una población suficiente y estructuralmente diversa de productos de expresión aleatorizados para afectar un rango probabilísticamente suficiente de respuestas celulares para proveer una o más células que exhiben una respuesta deseada. Por lo tanto, la divulgación provee una biblioteca de interacción Io suficientemente grande para que al menos uno de sus miembros tenga una estructura que le brinde afinidad por alguna molécula, proteína u otro factor.

Metodologías de cribado y dispositivos de monitoreo “en línea"

AI llevar a la práctica los métodos de la divulgación, se pueden utilizar una variedad de aparatos y metodologías para, en conjunto con los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, cribar polipéptidos para actividad de glucoamilasa, cribar compuestos como moduladores potenciales, por ejemplo, activadores o inhibidores, de actividad de glucoamilasa, para anticuerpos que se enlazan a un polipéptido de la invención, para ácidos nucleicos que hibridan con un ácido nucleico de la invención, para cribar células que expresan un polipéptido de la invención y similares.

Arreglos capilares

Los arreglos capilares, tales como la GIGAMATRIXMR, Diversa Corporation, San Diego, CA, pueden ser usados en los métodos de la divulgación. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención pueden ser inmovilizados en o aplicados a un arreglo, incluyendo arreglos capilares. Los arreglos se pueden usar para cribar o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) por su habilidad para enlazarse con o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la invención. Los arreglos capilares proporcionan otro sistema para mantener o cribar muestras. Por ejemplo, un aparato para cribar muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en un arreglo de capilares adyacentes, en donde cada capilar comprende al menos una pared que define un lumen para retener una muestra. El aparato puede incluir, además, material intersticial dispuesto entre capilares adyacentes en un arreglo y uno o más indicios de referencia formados dentro del material intersticial. Un capilar para cribar una muestra, en donde el capilar se adapta para ser enlazado en un arreglo de capilares, puede incluir una primera pared que define un lumen para retener la muestra, y una segunda pared formada de un material de filtración, para filtrar la energía de excitación suministrada al lumen para excitar la muestra.

Un polipéptido o ácido nucleico, por ejemplo, un ligando, puede ser introducido en un primer componente en al menos una porción de un capilar de un arreglo capilar. Cada capilar del arreglo capilar puede comprender al menos una pared que define un lumen para retener al primer componente. Se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detrás del primer componente. Se puede introducir un segundo componente en el capilar, en donde el segundo componente se separa del primer componente mediante la burbuja de aire. Se puede introducir una muestra de interés como un primer líquido marcado con una partícula detectable en un capilar de un arreglo capilar, en donde cada capilar del arreglo capilar comprende al menos una pared que define un lumen para retener el primer liquido y la partícula detectable y en donde al menos una pared es recubierta con un material de enlazamiento para enlazar la partícula detectable con al menos una pared. El método puede incluir, además, remover el primer líquido del tubo capilar, en donde la partícula detectable enlazada se mantiene dentro del capilar y se introduce un segundo liquido en el tubo capilar.

El arreglo capilar puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprenden al menos una pared exterior que define un lumen. La pared exterior del capilar puede ser una o más paredes fusionadas entre sí. En forma similar, la pared puede definir un lumen que es cilíndrico, cuadrado, hexagonal o de cualquier otra forma geométrica siempre que las paredes formen un lumen para la retención de un líquido o muestra. Los capilares del arreglo capilar pueden ser mantenidos juntos en forma próxima para formar una estructura plana. Los capilares se pueden enlazar entre sí, al ser fusionados (por ejemplo” en donde los capilares se hacen de vidrio), pegados, adheridos o unidos lado a lado. El arreglo capilar puede estar formado por cualquier cantidad de capilares individuales. por ejemplo, en el intervalo de 100 a 4000000 capilares. Un arreglo capilar puede formar una placa de microtitulación que tiene aproximadamente 100.000 o más capilares individuales enlazados entre sí.

Arreglos o “biochips”

Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención se pueden inmovilizar a o, aplicar a un arreglo, por ejemplo, un "arreglo" o "microarreglo" o “biochip” o "chip", que en una realización comprende una pluralidad de elementos objetivo, cada elemento objetivo comprendiendo una cantidad definida de uno o más polipéptidos (incluyendo anticuerpos) o ácidos nucleicos inmovilizados sobre un área definida de una superficie de sustrato, en donde al menos uno de los "elementos objetivo" es un polipéptido (por ejemplo, una enzima o un anticuerpo) de la invención,

o un ácido nucleico de la invención.

Los arreglos de la divulgación se pueden utilizar para cribar o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) por su habilidad para unirse a o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la invención. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, un parámetro monitoreado es la expresión de un transcripto de un gen de una amilasa y/o glucoamilasa. Uno o más, o todos los transcriptos de una célula pueden ser medidos mediante hibridación de una muestra que comprende transcriptos de la célula, o ácidos nucleicos representativos de, o complementarios de transcriptos de una célula, mediante hibridación con ácidos nucleicos inmovilizados sobre un arreglo, o “biochip”. Por medio del uso de un "arreglo" de ácidos nucleicos sobre un microchip, algunos o todos los transcriptos de una célula pueden ser simultáneamente cuantificados. En forma alternativa, los arreglos que comprenden ácido nucleico genómico también pueden ser utilizados para determinar el genotipo de una cepa recientemente modificada por ingeniería genética por los métodos de la divulgación. Los "arreglos de polipéptidos" también se pueden usar cuantificar simultáneamente una pluralidad de proteínas. La presente divulgación también se pueden llevar a la práctica con cualquier “arreglo” conocido, también denominado como un “microarreglo” o “arreglo de ácido nucleico" o “arreglo de polipéptido" o "arreglo de anticuerpo" o “biochip”, o variación de los mismos. Los arreglos son genéricamente una pluralidad de "puntos" o "elementos objetivo", cada elemento objetivo comprendiendo una cantidad definida de una o más moléculas biológicas, por ejemplo, oligonucleótidos, inmovilizados sobre una área definida de una superficie de sustrato para enlamiento específico con una molécula de la muestra, por ejemplo, transcriptos de ARNm.

En la realización de los métodos de la divulgación, cualquier arreglo y/o método conocidos para la elaboración y uso de arreglos pueden ser incorporados en su totalidad o en parte, o variaciones de los mismos, como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.277.628, 6.277.489, 6.261.775, 6258506, 6.054.270, 6.048.695, 6.045.996, 6.022.963, 6.013.440, 5.965.452, 5.959.098, 5.856.174, 5.830.645, 5.770.456, 5.632.957, 5.556.752, 5.143.854, 5.807.522, 5.800.992, 5.744.305, 5.700.637, 5.556.752, 5.434.049; véanse también, por ejemplo, los documentos WO 99151773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; véanse también, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 82R171 -R174; Schummer (1997) Bíotechniques 23: 1087 -1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120 -124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399 -407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25 -32. Véanse también las solicitudes de patente de los Estados Unidos publicadas Nos. 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.

Métodos de cribado basados en anticuerpo y anticuerpos

La divulgación provee anticuerpos aislados, sintéticos o recombinantes que se unen específicamente con una glucoamilasa de la divulgación. Estos anticuerpos se pueden utilizar para aislar, identificar o cuantificar la amilasa y/o glucoamilasa de la divulgación o polipéptidos relacionados. Estos anticuerpos se pueden usar para aislar otros polipéptidos dentro del alcance de la invención u otras glucoamilasas relacionadas. Los anticuerpos pueden ser diseñados para enlazarse con un sitio activo de una amilasa y/o glucoamilasa. Por lo tanto, la invención provee métodos para inhibir glucoamilasas usando anticuerpos de la divulgación.

La divulgación provee anticuerpos que comprenden un péptido o polipéptido derivados de, modelados después o sustancialmente codificados por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, capaces de enlazarse específicamente con un antígeno o epítopo, véase, por ejemplo Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267 273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85 -97. El término anticuerpo incluye porciones que se enlazan al antígeno, es decir, “sitios de enlazamiento con el antígeno", (por ejemplo, fragmentos, subsecuencias, regiones determinantes de complementariedad (CDR)), que retienen capacidad para enlazarse con el antígeno, incluyendo (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341: 544 -546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región aislada determinante de complementariedad (CDR). Los anticuerpos de una sola cadena también se incluyen por referencia en el término anticuerpo".

Los anticuerpos se pueden utilizar en inmunoprecipitación, tinción, columnas de inmunoafinidad y similares. Si se desea, las secuencias de ácido nucleico que codifican para antígenos específicos se pueden generar por inmunización seguido de aislamiento del polipéptidos o ácido nucleico, amplificación o clonación e inmovilización del polipéptidos sobre un arreglo de la divulgación. En forma alternativa, los métodos de la divulgación se pueden utilizar para modificar la estructura de un anticuerpo producido por una célula que va a ser modificada, por ejemplo, una afinidad de anticuerpo se puede aumentar o disminuir. Además, la habilidad para elaborar o modificar anticuerpos puede ser un fenotipo modificado por ingeniería genética en una célula por medio de los métodos de la invención.

Los métodos de inmunización, produción y aislamiento de anticuerpos (policlonales y monoclonales) son conocidos por aquellos capacitados en el arte y descritos en la literatura científica y de patentes, véase, por ejemplo, Coligan, Current Protocols In lmmunology, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) Basic And Clinical Immunoiogy (7th ed.) Lange Medical Publicaciones, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles And Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256: 495; Harlow (1988) Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publicaciones, New York. Los anticuerpos también se pueden generar in vitro, por ejemplo, usando sitios de enlazamiento al anticuerpo recombinante que expresan bibliotecas de despliegue en fagos, además de los métodos tradicionales in vivo usando animales. Véase, por ejemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15: 62 -70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27 -45.

Los polipéptidos o péptidos se pueden usar para generar anticuerpos que se enlazan específicamente con los polipéptidos, por ejemplo, las glucoamilasas de la invención. Los anticuerpos resultantes se pueden usar en procedimientos de cromatografía de inmunoafinidad para aislar o purificar el polipéptido o para determinar si el polipéptido está presente en una muestra biológica. En tales procedimientos, se pone en contacto una preparación de proteína, tal como un extracto, o una muestra biológica con un anticuerpo capaz de enlazarse específicamente con uno de los polipéptidos de la invención.

En procedimientos de inmunoafinidad, se une el anticuerpo a un soporte sólido, tal como una perla u otra matriz de columna. La preparación de proteína se pone en contacto con el anticuerpo bajo condiciones en las cuales el anticuerpo se enlaza específicamente con uno de los polipéptidos de la invención. Después de un lavado para remover las proteínas no enlazadas específicamente, se eluyen los polipéptidos enlazados específicamente.

La habilidad de las proteínas en una muestra biológica para enlazarse con el anticuerpo puede ser determinada usando cualquiera entre una variedad de procedimientos familiares para aquellos capacitados en el arte. Por ejemplo, el enlazamiento se puede sr determinar mediante la marcación del anticuerpo con una etiqueta detectable tal como un agente fluorescente, una etiqueta enzimática o un radioisótopo. En forma alternativa, se puede detectar el enlazamiento del anticuerpo con la muestra usando un anticuerpo secundario que tiene dicha etiqueta detectable sobre el mismo. Los ensayos particulares incluyen ensayos de ELIISA, ensayos tipo sándwich, radioinmunoensayos y transferencias tipo Western.

Los anticuerpos policlonales generados contra los polipéptidos de la invención se pueden obtener por inyección directa de los polipéptidos en un animal o administrando los polipéptidos a un animal no humano. El anticuerpo así obtenido se enlazará entonces con el polipéptido en sí mismo. En esta manera, incluso una secuencia que codifica únicamente un fragmento del polipéptido puede ser utilizada para generar anticuerpos que pueden enlazarse con el polipéptido nativo completo. Tales anticuerpos pueden ser usados luego para aislar el polipéptido de las células que expresan ese polipéptido. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que provea anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma, la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas y la técnica de EBV-hibridoma (véase, por ejemplo, Cole (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lnc., páginas 77 -96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4.946.778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos monocatenarios para los polipéptidos de la invención. En forma alternativa, se pueden utilizar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para estos polipéptidos o fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en el cribado para polipéptidos similares (por ejemplo, una glucoamilasa) de otros organismos y muestras. En tales técnicas, los polipéptidos del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y se detectan aquellos polipéptidos que se enlazan específicamente con el anticuerpo son detectados. Cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente se pueden usar para detectar el enlazamiento del anticuerpos.

Kits

La divulgación provee kits que comprende las composiciones, por ejemplo, ácidos nucleicos, casetes de expresión, vectores, células, semillas transgénicas o plantas o partes de plantas, polipéptidos (por ejemplo, amilasas y/o una glucoamilasa) y anticuerpos de la divulgación. Los kits también pueden contener material instructivo que enseña las metodologías y usos industriales de la invención, como se describe aquí.

Medición de parámetro metabólicos

Los métodos de la divulgación proveen evolución de la célula completa o modificación genética de una célula completa, de una célula para desarrollar una nueva cepa celular que tiene un nuevo fenotipo, por ejemplo, una actividad nueva o modificada de amilasa y/o glucoamilasa, mediante la modificación de la composición genética de la célula. La composición genética puede ser modificada mediante la adición a la célula de un ácido nucleico de la invención. Para detectar el nuevo fenotipo, se monitorea al menos un parámetro metabólico de una célula modificada en la célula en “tiempo real” o en un marco de tiempo “en línea". En un aspecto, se monitorean una pluralidad de células, tales como un cultivo de células, en “tiempo real" o “en línea". En un aspecto, se monitorean una pluralidad de parámetros metabólicos en "tiempo real" o “en línea". Los parámetros metabólicos pueden ser monitoreados usando la glucoamilasa de la invención.

Los análisis de flujo metabólico (MFA) se basan en un marco bioquímico conocido. Se construye una matriz metabólica linealmente independiente basada en la ley de conservación de masa y la hipótesis de estado pseudoestable (PSSH) sobre los metabolitos intracelulares. En la realización de los métodos de la divulgación, se establecen redes metabólicas incluyendo la:

•: identidad de todos los sustratos de las rutas, productos y metabolitos intermediarios

•: identidad de todas las reacciones químicas que interconvierten los metabolitos de las rutas, la estequiometría de las reacciones de las rutas.

•: identidad de todas las enzimas que catalizan las reacciones, la cinética de reacción enzimática,

•: las interacciones regulatorias entre los componentes de las rutas, por ejemplo interacciones alostéricas, interacciones enzima-enzima, etc.,

•: compartimentalización intracelular de enzimas o cualquier otra organización supramolecular de las enzimas y,

•: la presencia de cualquier gradiente de concentración de metabolitos, enzimas o moléculas efectoras o barreras de difusión para su movimiento.

Una vez que se construye la red metabólica para una determinada cepa, la presentación matemática por noción de matriz se puede introducir para estimar los flujos metabólicos intracelulares si los datos del metaboloma en línea están disponibles. El fenotipo metabólico se basa en los cambios de la red metabólica completa en una célula. El fenotipo metabólico se basa en el cambio de la utilización de las rutas con respecto a condiciones ambientales, regulación genética, estado de desarrollo y el genotipo, etc. En un aspecto de los métodos de la divulgación, después del cálculo de MFA en línea, el comportamiento dinámico de las células, su fenotipo y otras propiedades son analizados mediante la investigación de la utilización de las rutas. Por ejemplo, si se aumenta el suministro de glucosa y disminuye el de oxígeno durante la fermentación con levadura, la utilización de las rutas respiratorias se reducirá y/o detendrá, y dominará la utilización de las rutas fermentativas. El control del estado fisiológico de los cultivos celulares será posible después del análisis de las rutas. Los métodos de la divulgación pueden ayudar a determinar cómo manipular la fermentación al determinar cómo cambiar el suministro de sustrato, la temperatura, el uso de inductores, etc., para controlar el estado fisiológico de las células para moverse a Io largo de una dirección deseable. AI llevar a la práctica los métodos de la divulgación, los resultados de MFA también se pueden comparar con datos de transcriptoma y proteoma para diseñar experimentos y protocolos para manipulación genética metabólica o arrastre de genes, etc.

AI llevar a la práctica los métodos de la divulgación, cualquier fenotipo modificado o nuevo puede ser conferido y detectado, incluyendo características nuevas o mejoradas en la célula. Cualquier aspecto del metabolismo o del desarrollo puede ser monitoreado.

Monitoreo de expresión de un transcripto de ARNm

En un aspecto de la divulgación, el fenotipo manipulado genéticamente comprende el aumento o la disminución de la expresión de un transcripto de ARNm (por ejemplo, un mensaje de amilasa y/o glucoamilasa) o generar nuevos transcriptos en una célula (por ejemplo, amilasa y/o glucoamilasa). Esta expresión incrementada o reducida puede ser rastreada al evaluar la presencia de una glucoamilasa de la invención o por ensayos de actividad de glucoamilasa. Los transcriptos de ARNm, o mensajes, también pueden ser detectados y cuantificados por cualquier método conocido en el arte, incluyendo, por ejemplo, transferencias tipo Northern, reacciones de amplificación cuantitativa, hibridación con arreglos y similares. Las reacciones de amplificación cuantitativa incluyen, por ejemplo, PCR cuantitativa, incluyendo, por ejemplo, reacción en cada de la polimerasa de transcripción reversa cuantitativa, o RT-PCR; RT-PCR cuantitativa en tiempo real, o “RT-PCR cinética en tiempo real" (véase, por ejemplo, Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114: 313 -318; Xia (2001) Transplantation 72: 907 -914).

En un aspecto de la divulgación, el fenotipo manipulado genéticamente es generado al desactivar la expresión de un gen homólogo. La secuencia codificadora del gen o uno o más elementos de control de transcripción pueden ser desactivados, por ejemplo, promotores o potenciadores. Por lo tanto, la expresión de un transcripto puede ser completamente eliminada o solamente reducida.

En un aspecto de la divulgación, el fenotipo manipulado genéticamente comprende incrementar la expresión de un gen homólogo. Esto se puede efectuar desactivando un elemento de control negativo, incluyendo un elemento regulador de transcripción que actúa en cis o trans, o sometiendo a mutagénesis un elemento de control positivo. Uno o más, o todos los transcriptos de una célula pueden ser medidos por hibridación de una muestra que comprende transcriptos de la célula, o ácidos nucleicos representativos de o complementarios a transcriptos de una célula, por hibridación con ácidos nucleicos inmovilizados sobre un arreglo.

Monitoreo de expresión de polipéptidos, péptidos y aminoácidos

En un aspecto de la divulgación, el fenotipo manipulado genéticamente comprende incrementar o reducir la expresión de un polipéptido (por ejemplo, una amilasa y/o glucoamilasa) o generar nuevos polipéptidos en una célula. Esta expresión incrementada o reducida puede ser rastreada al determinar la cantidad de amilasa y/o glucoamilasa presente o por ensayos de actividad de amilasa y/o glucoamilasa. Los polipéptidos, péptidos y aminoácidos también pueden ser detectados y cuantificados por cualquier método conocido en el arte, incluyendo, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (RMN), espectrofotometría, radiografía (marcación radioactiva de proteína), electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión, diferentes métodos inmunológicos, por ejemplo, inmunoprecipitación, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RlA), ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescencia, electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE), tinción con anticuerpos, clasificador de células activado por fluorescencia (FACS), espectrometría de masas por pirólisis, espectrometría infrarroja por transformadas de Fourier, espectrometría Raman, GC-MS y espectrometrías de masas por LC-electroaspersión y por cap-LC-electroaspersión en tándem y similares. Se pueden cribar nuevas bioactividades utilizando métodos, o variaciones de los mismos, descritos en la patente de los Estados Unidos No. 6.057.103. Además, como se discute más adelante en detalle, uno o más, o, todos los polipéptidos de una célula pueden ser medidos utilizando un arreglo de proteína.

Aplicaciones industriales

La invención provee muchos usos industriales y aplicaciones médicas para las glucoamilasas de la invención. Por ejemplo, la invención provee enzimas y métodos para licuar el polisacárido, por ejemplo, almidón. Muchas amilasas y/o glucoamilasas y glucosidasas usadas en los procesos para convertir polisacárido licuado, por ejemplo, almidón, en glucosa son incapaces de hidrolizar enlaces alfa (1,6), y esta deficiencia deja aproximadamente 5% del azúcar como panosa e isomaltosa. Sin embargo, en un aspecto, las enzimas de la invención pueden convertir un polisacárido, por ejemplo, almidón, en glucosa para maximizar la producción de glucosa, incluyendo la conversión de polisacárido licuado, por ejemplo, almidón, en glucosa. En un aspecto, la invención provee enzimas y métodos para hidrolizar enlaces 1,4-alfa y/o 1,6-alfa (por ejemplo, hidrólisis de almidones), e hidrólisis de panosa e isomaltasa. Las glucosidasas de la divulgación pueden usarse en una variedad de procesos industriales, incluyendo la conversión de la biomasa a combustibles (por ejemplo, biocombustibles, tales como bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiesel) y similares), por ejemplo, incluyendo su uso en las etapas iniciales (licuefacción) de polisacáridos, por ejemplo, procesamiento de almidón, en molienda húmeda de maíz, en la producción de alcohol, en la industria textil para polisacáridos, por ejemplo, desensado de almidón, en aplicaciones de horneado, en la industria de bebidas, en campos petrolíferos en procesos de perforación; en el entintado de papel reciclado; y en la alimentación animal. Por lo tanto, la invención también proporciona un combustible, por ejemplo, un biocombustible (tal como un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiesel), que comprende un polipéptido de la invención.

Composiciones detergentes

La invención provee composiciones detergentes que comprenden uno o más polipéptidos de la invención, por ejemplo, glucoamilasas de la invención, y métodos de utilización de estas composiciones. Para los métodos de elaboración y utilización de composiciones detergentes, véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.413.928, 6.399.561. 6.365.561, 6.380.147. Las composiciones detergentes pueden ser una composición acuosa de una y dos partes, una composición líquida no acuosa, un sólido moldeado, una forma granulada, una forma en partículas, una tableta comprimida, un gel y/o una suspensión y una forma en suspensión. La invención también provee métodos capaces de remoción rápida de manchas gruesas de alimentos, películas de residuos de alimentos y otras composiciones alimenticias menores que usan estas composiciones detergentes. Las glucoamilasas de la invención pueden facilitar la remoción de manchas que comprenden polisacáridos, por ejemplo, manchas de almidón por medio de hidrólisis catalítica de un polisacárido y/o oligosacárido, por ejemplo, almidón. Las glucoamilasas de la invención se pueden usar en detergentes para el lavado de vajilla y en detergentes para el lavado de prendas textiles.

El contenido enzimático activo real depende del método de fabricación de una composición detergente y no es crítico, asumiendo que la solución de detergente tiene la actividad enzimática deseada. En un aspecto, la cantidad de glucoamilasa presente en la solución final está en el intervalo de aproximadamente 0,001 mg hasta 0,5 mg por gramo de la composición detergente. La enzima particular elegida para uso en el proceso y los productos de esta invención depende de las condiciones de utilidad final, que incluyen la forma física del producto, del uso del pH, del uso de la temperatura y de los tipos de mugre que van a ser degradados o alterados. La enzima se puede elegir para proveer actividad y estabilidad óptimas para un determinado conjunto de condiciones de utilidad. En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención son activos en los rangos de pH de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 12 y en el rango de temperatura de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 95 °C. Los detergentes de la invención pueden comprender agentes tensoactivos catiónicos, no iónicos semipolares o zwitteriónicos; o mezclas de los mismos.

Las glucoamilasas de la presente invención pueden ser formuladas en detergentes en polvo o líquidos que tienen pH entre 4,0 y 12,0 a niveles de aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 5% (preferiblemente 0,1% hasta 0,5%) en peso. Estas composiciones detergentes también pueden incluir otras enzimas tales como las proteasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas, así como también conformadores y estabilizadores conocidos. La adición de glucoamilasas de la invención a las composiciones de limpieza convencionales no crea ninguna limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuado para el detergente también es adecuado para las presentes composiciones siempre que el pH se encuentre dentro del rango anteriormente mencionado. y la temperatura esté por debajo de la temperatura de desnaturalización de la enzima descrita. Asimismo, los polipéptidos de la invención se pueden usar en una composición de limpieza sin detergentes, nuevamente, ya sea solos o en combinación con conformadores y estabilizadores.

La presente invención provee composiciones de limpieza que incluyen composiciones detergentes para limpiar superficies duras, composiciones detergentes para limpiar textiles, composiciones para el lavado de vajillas, composiciones de limpieza bucal, composiciones de limpieza de prótesis dentales y soluciones de limpieza de lentes de contacto.

En un aspecto, la invención provee un método para lavar un objeto que comprende poner en contacto el objeto con un polipéptido de la invención bajo condiciones suficientes para el lavado. En un aspecto, se usa un polipéptido de la invención (por ejemplo, una glucoamilasa activa en medio alcalino) en un detergente, es decir, como un aditivo detergente. La composición detergente de la invención puede, por ejemplo, ser formulada como una composición detergente para lavado mecánico o manual que comprende un polipéptido de la invención. Las composiciones detergentes de la invención incluyen soluciones de lavado de prendas textiles y de vajillas (por ejemplo, lavado automático de vajillas) y aplicación. Un aditivo para lavado de prendas adecuado para pretratamiento de textiles manchados puede comprender un polipéptido de la invención. Una composición suavizante de textiles puede comprender un polipéptido de la invención. En forma alternativa, un polipéptido de la invención puede ser formulado como una composición detergente para uso en operaciones generales de limpieza de superficies duras domésticas. En aspectos alternativos, los aditivos detergentes y composiciones detergentes de la invención pueden comprender una o más enzimas tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, otra glucoamilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una Iactasa, y/o una peroxidasa. Las propiedades de la(s) enzima(s) de la invención se eligen para ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir de pH óptimo, compatible con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y la(s) enzima(s) está(n) presente(s) en cantidades efectivas. En un aspecto, las enzimas glucoamilasas de la invención se utilizan para remover materiales malolientes de los textiles. Varias composiciones detergentes y métodos para su elaboración que pueden ser usados en la realización de la invención se describen en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.333.301; 6.329.333; 6.326.341; 6.297.038; 6.309.871; 6.204.232; 6.197.070; 5.856.164.

Tratamiento de textiles

La invención provee métodos para tratar textiles utilizando uno o más polipéptidos de la invención. Los polipéptidos de la invención se pueden usar en cualquier método para tratamiento de textiles, que son conocidos en el arte, véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.077.316. Por ejemplo, en un aspecto, la sensación y apariencia de un textil se mejora por un método que comprende poner en contacto el textil con una glucoamilasa de la invención en una solución. En un aspecto, el textil es tratado con la solución bajo presión.

En un aspecto, las enzimas de la invención se aplican durante o después del tejido de los textiles, o durante la etapa de desencolado, o una o más etapas adicionales de procesamiento del textil. Durante el tejido de los textiles, los hilos se exponen a tensión mecánica considerable. Antes de realizar el tejido sobre telares mecánicos, los hilos trenzados a menudo están recubiertos con almidón para encolado o derivados de almidón a fin de incrementar su resistencia a la tracción y evitar la ruptura. Las enzimas de la invención pueden ser aplicadas para remover este almidón para encolado o los derivados de almidón. Una vez que los textiles han sido tejidos, el textil puede continuar a la etapa de desencolado. Esto puede estar seguido de uno o más etapas adicionales de procesamiento del textil. El desencolado es el acto de remover el encolado del textil. Después del tejido se debe remover el revestimiento de encolado antes del procesamiento del textil a fin de asegurar un resultado homogéneo y a prueba de agua. La invención provee un método de desencolado que comprende la hidrólisis enzimática del encolado mediante la acción de una enzima de la invención.

Las enzimas de la invención se pueden usar para desencolar los textil, incluyendo los textil que contienen algodón, como aditivos detergentes, por ejemplo, en composiciones acuosas. La invención provee métodos para producir una apariencia de lavado a la piedra sobre textiles y prendas de vestir de mezclilla teñidas con índigo. Para la fabricación de vestidos, el textil puede ser cortado y cosido en vestidos o prendas de vestir, que posteriormente se terminan. En particular, para la fabricación de pantalones vaqueros, se han desarrollado diferentes métodos de acabado enzimático. El acabado de la prenda de mezclilla normalmente se inicia con una etapa de desencolado enzimático, durante el cual las prendas se someten a la acción de enzimas amilolíticas a fin de proveer suavidad al textil y volver al algodón más accesible a las etapas posteriores de terminado enzimático. La invención provee métodos para el terminado de prendas de mezclilla (por ejemplo, un "proceso de biolavado a la piedra"), desencolado enzimático y para proveer suavidad a los textiles usando las glucoamilasas de la invención. La invención provee métodos para suavizar rápidamente prendas de mezclilla en un proceso de desencolado y/o terminado.

Alimentos y procesamiento de alimentos: Iicuefacción de polisacáridos, por ejemplo, almidón

La enzimas de la invención tienen numerosas aplicaciones en la industria del procesamiento de alimentos. Las glucoamilasas de la invención se usan para el procesamiento de almidón hasta fructosa. En un aspecto alternativo, los procesos de la invención comprenden un procesamiento de un polisacárido, por ejemplo, almidón, hasta fructosa que comprende cuatro etapas: Iicuefacción de almidón granulado, sacarificación del polisacárido licuado, por ejemplo, almidón, en dextrosa, purificación e isomerización hasta fructosa; y una, varias o todas estas etapas pueden comprender el uso de una o más enzimas de la invención. Las enzimas de la invención se pueden usar en la producción de etanol a partir de una biomasa, por ejemplo, un maíz o un pasto, por molienda en seco o en húmedo; por ejemplo, la Figura 12 ilustra cómo las enzimas de la invención se pueden usar en la producción de etanol a partir del maíz por molienda en seco, incluyendo su uso tanto en "procesos convencionales" como en "procesos simultáneos de sacarificación y fermentación por licuefacción".

La invención provee métodos de Iicuefacción de un polisacárido, por ejemplo, almidón, utilizando las enzimas de la invención. Las suspensiones concentradas de gránulos poliméricos de almidón se convierten en una solución de dextrinas solubles de longitud de cadena más corta de baja viscosidad. Esta etapa es útil para el manejo conveniente con equipo estándar y para una conversión eficiente hasta glucosa u otros azúcares 103. En un aspecto, el almidón granulado es licuado mediante gelatinización de los gránulos elevando la temperatura del almidón granulado aproximadamente por encima de 72°C. El proceso de calentamiento rompe instantánea los gránulos de almidón insolubles para producir una solución de almidón soluble en agua. La solución de almidón solubilizada puede ser luego licuada mediante una glucoamilasa de la invención. Por lo tanto, la invención provee procesos de licuefacción enzimática del almidón utilizando una glucoamilasa de la invención.

La Figura 7, la Figura 8 y la Figura 9 ilustran ejemplos alternativos de procesos del almidón, incluyerndo procesos de licuefacción del almidón, de la invención utilizando al menos una enzima de la invención. Por ejemplo, la Figura 7 ilustra un ejemplo de un proceso de la invención de licuefacción del almidón que comprende el tratamiento de una suspensión de almidón (por ejemplo, que tiene aproximadamente 30% a 35% de sólidos) con vapor para licuefacción primaria (por ejemplo, aproximadamente a 105 °C durante aproximadamente 5 minutos), entrada en un tanque de expansión, seguido por una licuefacción secundaria (por ejemplo, hasta aproximadamente entre 90°C y 95°C durante aproximadamente 90 minutos), involucrando cada una de estas etapas el uso de una enzima de la invención. La Figura 8 ilustra otro ejemplo de un proceso de licuefacción de almidón de la invención que comprende tratar una supensión de almidón aproximadamente entre pH 4 a pH 5, por ejemplo, pH 4,5, ajustando el pH, la adición de calcio, licuefacción aproximadamente a un pH 5 a pH 6, por ejemplo, pH 5,4, a aproximadamente 95°C usando una glucoamilasa de la invención, seguido por otro ajuste de pH y temperatura para sacarificación aproximadamente entre pH 4 y pH 5, por ejemplo, pH 4,5, a una temperatura entre aproximadamente 60°C y 65°C usando una glucoamilasa de la invención. La Figura 9 ilustra otro ejemplo de un proceso del almidón de la invención que comprende tratar una suspensión de almidón aproximadamente entre pH 4 y pH 5, por ejemplo, pH 4,5, (ajustando opcionalmente el pH, y la adición de calcio), combinando la Iicuefacción y sacarificación usando una glucoamilasa de la invención aproximadamente entre pH 4 y pH 5, por ejemplo, pH 4,5, a una temperatura aproximadamente superior a 90°C, o, aproximadamente superior a 95°C, seguido por otro ajuste de pH y temperatura para sacarificación hasta aproximadamente entre pH 4 y pH 5, por ejemplo, pH 4,5, a una temperatura aproximadamente entre 60°C y 65°C usando una glucoamilasa de la invención. En un aspecto, la Iicuefacciónsacarificación combinadas de la invención son un proceso en un único recipiente. En un aspecto, el proceso completo es un proceso en un único recipiente. Cualquiera de estos procesos y cualquiera de estas etapas, puede comprender también, o puede comprender en forma adicional, otra enzima de la divulgación (por ejemplo, una glucosidasa tal como una α-1,6-glucosidasa, una maltasa, etc.), u otra enzima tal como una pululanasa o una isomerasa.

Un ejemplo de un proceso de Iicuefacción enzimático implica el ajuste el pH del de una suspensión de almidón granulado entre 6,0 y 6,5 y la adición de hidróxido de calcio, hidróxido de sodio o carbonato de sodio. En un aspecto, se agrega hidróxido de calcio. Esto provee iones de calcio para estabilizar la glucoamilasa de la invención contra la inactivación. En un aspecto, después de la adición de amilasa, se bombea la suspensión a través de un chorro de vapor para elevar instantáneamente la temperatura entre 80 -115°C. En un aspecto, se gelatiniza inmediatamente el almidón y, debido a la presencia de amilasa, se despolimeriza a través de hidrólisis aleatoria de enlaces α-1,4glucosídicos por medio de amilasa hasta una masa fluida. La masa fluida puede ser bombeada fácilmente.

La invención provee diferentes procesos de Iicuefacción enzimática de polisacáridos, oligosacáridos y/o almidón usando una glucoamilasa de la invención. En un aspecto del proceso de licuefacción, se añade una amilasa a la suspensión de polisacárido, oligosacárido y/o almidón y la suspensión se mantiene a una temperatura entre aproximadamente 80º -100ºC para hidrolizar parcialmente los gránulos de polisacárido, oligosacárido y/o almidón.

En un aspecto, se bombea la suspensión parcialmente hidrolizada de polisacárido, oligosacárido y/o almidón a través de un chorro a temperatura aproximadamente por encima de 105°C hasta gelatinizar completamente cualquier estructura granulada remanente. En un aspecto, después de enfriar el almidón gelatinizado, se realiza una segunda adición de glucoamilasa para hidrolizar adicionalmente el polisacárido, oligosacárido y/o almidón.

La invención provee enzimas y procesos para hidrolizar polisacáridos, oligosacáridos y/o almidón líquido (licuado) y granulado. Dicho almidón se puede derivar de cualquier fuente, por ejemplo, maíz, trigo, milo, sorgo, centeno o bulgher. La invención se aplica a cualquier fuente de almidón en granos que sea útil para la Iicuefacción, por ejemplo, cualquier otra fuente de granos o vegetal conocida para producir almidón adecuado para Iicuefacción. Los métodos de la invención comprenden la Iicuefacción del almidón a partir de cualquier material natural, tal como arroz, arroz germinado, maíz, cebada, milo, trigo, legumbres y batata. El proceso de Iicuefacción puede hidrolizar sustancialmente el almidón para producir un jarabe. El rango de temperatura de la licuefacción puede ser cualquier temperatura de licuefacción que se sepa que es efectivo en la licuefacción del almidón. Por ejemplo, la temperatura del polisacárido, oligosacárido y/o almidón puede estar aproximadamente entre 80°C y aproximadamente 115°C, entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 110 °C entre aproximadamente 105°C y aproximadamente 108°C. En aspectos alternativos, la glucoamilasa usada en estos métodos es activa a estas temperaturas, por ejemplo, activa a temperaturas en un rango de entre aproximadamente 80°C hasta aproximadamente 115°C, entre aproximadamente 100°C hasta aproximadamente 110°C y desde aproximadamente 105°C hasta aproximadamente 108°C.

La invención provee métodos para Iicuefacción y sacarificación como se ilustra en la Figura 5. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención se usan en la etapa de Iicuefacción ilustrada (algunos de los métodos industriales actuales usan α-amilasa de B. Iicheniformis). En un aspecto, el proceso tiene lugar a un pH aproximadamente de 6,0 a una temperatura en cualquier parte en el rango de entre aproximadamente 95°C hasta 105°C, por un período de tiempo entre aproximadamente 0,5 y 5 horas, por ejemplo, 60, 90 o 120 minutos. En un aspecto, en un proceso de maíz fermentado, antes de la licuefacción, se añaden celulasas, proteasas y/o proteína tioreductasas.

En un aspecto de un proceso de licuefacción de la invención, se agrega una glucoamilasa de la invención que tiene actividad a pH de aproximadamente 4,5 (o entre aproximadamente pH 4,5 y pH 5), que puede o no ser dependiente de Ca2+. La eliminación de la adición de sales al comienzo del proceso elimina la necesidad de removerlas al final del proceso. En un aspecto de un proceso de licuefacción, se usa una amilasa que es más activa. Esto puede permitir disminuir la cantidad de enzima necesaria. En un aspecto, se realizan la Iicuefacción y sacarificación en el mismo recipiente, como un “proceso en un solo recipiente”, por ejemplo, bajo condiciones que comprenden aproximadamente 90°C hasta 95°C (o en cualquier punto entre aproximadamente 80°C y 105°C), como aproximadamente un proceso de 3 horas (o como un proceso que dura entre aproximadamente 1 y 5 horas). En este aspecto, la carga de enzima se puede cortar nuevamente a la mitad.

En un aspecto de un proceso de sacarificación de la invención, se usa una glucoamilasa de la invención. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención se usan en un etapa de sacarificación (además o en lugar de una glucoamilasa de A. niger). En un aspecto, el proceso tiene lugar aproximadamente un pH 4,5, en un rango de temperatura de entre aproximadamente 60°C y 62°C (o en cualquier punto en el rango entre aproximadamente 50 °C y 72°C, o, entre aproximadamente 40°C y 80°C) como un proceso que dura aproximadamente entre 12 y 96 o más horas. En un aspecto de un proceso de sacarificación de la invención, se usa una glucoamilasa de la invención para producir un nivel superior de dextrosa en el jarabe. En un aspecto, se agregan otras enzimas, por ejemplo, pululanasas para incrementar la cantidad de glucosa.

En un aspecto, una, algunas o todas las enzimas usadas en los procesos de la invención (incluyendo las enzimas de la invención) se inmovilizan, por ejemplo, se inmovilizan sobre cualquier superficie, por ejemplo, una superficie plana

o una columna de enzimas, por ejemplo, inmovilizadas sobre un arreglo, una perla, fibra, poro, capilar y similares. En un aspecto, al ser inmovilizadas, pueden ser reutilizadas.

En un aspecto, la invención provee “cócteles de enzimas" usando al menos una enzima de la invención. En un aspecto, los “cócteles de enzimas" se usan en los procesos de la invención, por ejemplo, incluyendo los métodos de licuefacción y sacarificación como se ilustran en la Figura 5. Por ejemplo, en un aspecto, se usan enzimas que degradan la pared celular (CWDE), por ejemplo, para textiles, pulpa y papel y procesos de lavado de prendas de la invención, incluyendo, por ejemplo, combinaciones de celulasas, hemicelulasas, xilanasas, galactomananasas, gluco mananasas, arabinofuranosidasas y otras. En un aspecto, los "cócteles de enzimas" usados en los procesos de la invención para bioblanqueamiento (por ejemplo, pulpa y papel, proceso de lavado de prendas), incluye combinaciones de Iacasas, peroxidasas, oxidasas y similares. En un aspecto, las enzimas que degradan la pared celular se combinan con enzimas de bio blanqueamiento y enzimas de la invención para degradar las paredes de las células vegetales para liberar agentes de color.

Otro ejemplo de un cóctel de enzimas de la invención que comprende al menos una glucoamilasa de la invención puede hidrolizar aproximadamente más del 95% del almidón de maíz molido en azúcares fermentables en no más de 60 horas a aproximadamente 30 a 40°C y a aproximadamente pH 3,5 hasta pH 5,5 en presencia de levaduras. En un aspecto, la cantidad total de proteína enzimática requerida no supera los 50 gramos/tonelada de maíz (0,005% p/p).

Las enzimas de la invención se pueden usar para tratar productos lácteos; y la invención provee productos lácteos que comprenden un polipéptido de la invención, en donde opcionalmente el producto lácteo comprende, una Ieche, un helado, un queso o un yogur.

La enzimas de la invención se pueden usar en procesos simultáneos de licuefacción, sacarificación y fermentación (SLSF); y las ventajas de usar las enzimas de esta invención pueden incluir:

•: Menores costes de energía debido a la eliminación de la etapa a alta temperatura;

•: Rendimiento mejorado debido a una fermentación más rápida;

•: Riesgo reducido de contaminación bacteriana;

•: La levadura produce etanol más temprano que en un proceso convencional;

•: Almacenamiento y manejo reducido de la levadura a granel.

Las propiedades de las enzimas de la invención usadas en estos procesos de la invención pueden incluir: actividad para hidrolizar polisacárido, oligosacárido y/o almidón sin purificar; perfiles de actividad de temperatura y pH compatibles con las condiciones de proceso; alta actividad sobre polisacárido, oligosacárido y/o almidón no gelatinizado; y/o activación sobre la fracción “resistente” del almidón sin purificar.

En aspectos alternativos, las enzimas de la invención tienen actividad de glucoamilasa y pueden hidrolizar (parcialmente o completamente) gránulos de polisacárido, oligosacárido y/o almidón que tienen estructuras complejas multinivel, incluyendo regiones amorfas y cristalinas y/o cadenas lineales y ramificadas, por ejemplo, pueden hidrolizar (parcial o completamente) el almidón sin purificar, incluyendo: RS l -almidón físicamente inaccesible; RS II -gránulos de almidón resistentes como en patata y banana sin purificar; RS III -retrogradado como en la patata cocida.

Procesos para producir jarabes de dextrosa de alto peso molecular

La invención provee procesos para producir jarabes de dextrosa de alto peso molecular, usando enzimas de la invención, que incluyen métodos para producir oligosacáridos que tiene grupos estrictamente de alto peso molecular de aproximadamente 20000. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención se pueden usar para licuar una composición que comprende polisacárido, que comprende oligosacárido y/o que comprende almidón, por ejemplo, un almidón de maíz, para producir un patrón de oligosacárido que está estrictamente agrupado en aproximadamente 20000 de peso molecular (Bacillus amylases producirá jarabes que contienen fragmentos de peso molecular mucho mayores y los oligosacáridos de alto peso molecular no se convierten completamente en glucosa por las glucoamilasas, por ejemplo, glucoamilasas de Aspergillus, durante la sacarificación).

En un aspecto, usando las glucoamilasas de la invención para catalizar la hidrólisis de una composición que comprende almidón, por ejemplo, un almidón de maíz, se producen fragmentos de aproximadamente 20000 unidades de peso molecular. Estos fragmentos de aproximadamente 20000 unidades de peso molecular se pueden convertir rápida y completamente en glucosa. Por lo tanto, en un aspecto, los jarabes sacarificados resultantes de la Iicuefacción con amilasas de Bacillus contienen menos dextrosa que los jarabes sacarificados provenientes de la Iicuefacción usando glucoamilasas de la invención.

Procesos para producir maltodextrinas homogéneas

La divulgación provee procesos para producir maltodextrinas homogéneas usando las enzimas de la invención. Las maltodextrinas homogéneas producidas por los métodos de la divulgación se pueden usar en una gran variedad de aplicaciones como alimentos, fármacos y revestimientos. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención se pueden usar para generar una composición de maltodextrina extremadamente uniforme (los procesos de fabricación convencionales que usan hidrólisis ácida o enzimática de almidón resultan en una distribución amplia de peso molecular típicamente bimodal de los oligosacáridos). Las maltodextrinas homogéneas producidas por los métodos de la divulgación tienen una distribución homogénea de peso molecular y se pueden usar en una variedad de productos que comprenden maltodextrina, resultando en soluciones claras (sin turbidez), de menor viscosidad mejores propiedades de revestimiento, mejores propiedades de formación de película y similares.

En un aspecto, las glucoamilasas de la invención se usan para licuar almidón de maíz para producir una composición uniforme que comprende maltodextrina. En un aspecto, la Iicuefacción se realiza a un pH de aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente pH 6,5, por ejemplo, pH 5,0 o 5,5, a temperaturas hasta aproximadamente 105°C. La composición uniforme de maltodextrina puede ser producida en el intervalo de DE de aproximadamente 5 hasta tan alto como aproximadamente 20. Los jarabes producidos por estas glucoamilasas de la invención pueden ser filtrados, tratados con carbón vegetal y/o secados por aspersión para obtener el producto que comprende maltodextrina.

En un aspecto, una o más de otras enzimas se usan junto con una composición que comprende las enzimas de la invención para uso en procesamiento de almidón hasta fructosa, licuefacción de almidón granulado y procesos para producir maltodextrinas homogéneas o jarabes de dextrosa de alto peso molecular, por ejemplo, incluyendo amilasas, beta-galactosidasas, catalasas, Iacasas, celulasas, endoglicosidasas, endo-beta-1,4-lacasas, amiloglucosidasas, glucosidasas, glucosa isomerasas. glucosiltransferasas, Iipasas, fosfolipasas, Iipoxigenasas, beta-Iacasas, endo-beta-1,3(4)-lacasas, cutinasas, peroxidasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, descarboxilasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas. Pectín acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectín liasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas. celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

Procesos enzimáticos de molienda en seco

La invención provee procesos enzimáticos de molienda en seco usando una glucoamilasa de la invención; los ejemplos de procesos se ilustran en la Figura 12. En la molienda en seco, se muele el grano entero y se combina con agua. Se remueve opcionalmente el germen mediante separación por flotación o técnicas equivalentes. La mezcla resultante, que contiene polisacárido, por ejemplo, almidón, fibra, proteína y otros componentes del grano, se Iicúa usando amilasa. En un aspecto, se realiza la Iicuefacción enzimática a temperaturas menores que el polisacárido, por ejemplo, almidón de los procesos de Iicuefacción discutidos anteriormente. En un aspecto, después de la gelatinización del polisacárido, por ejemplo, almidón, se mantiene la solución a una temperatura elevada en presencia de amilasa hasta que se alcanza un DE de 10 -20. En un aspecto, este es un período de aproximadamente 1-3 horas. El equivalente de dextrosa (DE) es el estándar industrial para medir la concentración de los azúcares totales reductores, calculada como D-glucosa sobre peso en base seca. El almidón granulado no hidrolizado tiene un DE de virtualmente cero, mientras que el DE de D-glucosa se define como 100.

Las enzimas de la invención se pueden usar en procesos de molienda húmeda o seca de biomasa. Por ejemplo, en un aspecto de un ejemplo de un proceso de molienda en seco, se muele el grano entero y se combina con agua, y se lo trata con una enzima de la invención. El germen puede ser removido mediante separación por flotación o técnicas equivalentes. En un aspecto, la mezcla resultante, que contiene polisacárido, por ejemplo, almidón, fibra, proteína y otros componentes del grano, se licúa usando una glucoamilasa de la invención. En un aspecto, esta licuefacción enzimática se realiza a una temperatura relativamente inferior cuando se usa el proceso de molienda en seco; sin embargo, se cree que la Iicuefacción a baja temperatura es menos eficiente que la Iicuefacción a alta temperatura en la conversión de polisacárido, por ejemplo, almidón, hasta dextrinas solubles. Por lo tanto, en un aspecto, la invención provee una etapa adicional en donde, después de la gelatinización, la solución de polisacárido, por ejemplo, almidón, se mantiene a una temperatura elevada en presencia de una glucoamilasa de la invención, que en un aspecto se logra un DE de aproximadamente 10 a 20, usualmente un período de aproximadamente 1 a 3 horas (el equivalente de dextrosa (DE) es el estándar industrial para medir la concentración de los azúcares reductores totales, calculada como D-glucosa con base en el peso seco; el almidón granulado no hidrolizado tiene un DE de virtualmente cero, mientras que el DE de D-glucosa se define como 100).

En aspectos alternativos, el uso de glucoamilasas de la invención en procesos para producción de etanol mediante molienda en seco pueden proveer ventajas operacionales, por ejemplo: reducción rápida de viscosidad de la harina de maíz en suspensión, logrando un incremento en sólidos disueltos y de rendimiento posible sin inversión adicional de capital; estabilidad térmica superior para competir mejor, lo que elimina la dosificación dividida; algunas glucoamilasas de la invención son enzimas termoestables -y esto elimina la necesidad de dosificar antes y después de la cocción a chorro; se obtienen viscosidades menores con temperaturas de proceso superiores y permite un control microbiano mejorado en el tanque de la suspensión (el proceso se realiza a una temperatura superior, de manera tal que se matan los microbios indeseados); menor pH de Iicuefacción, que elimina la necesidad de ajuste del pH, disminuye la formación de escamas (el precipitado de oxalato de calcio se forma sobre los equipos, etc.; si la licuefacción se realiza a un pH bajo, existe una mayor probabilidad de formación de escamas) y se reduce la formación de subproductos.

En resumen, en aspectos alternativos, las glucoamilasas de la invención pueden ser enzimas termoestables que pueden satisfacer las necesidades claves de la industria, por ejemplo, bajo ciertas condiciones, se reduce rápidamente la viscosidad de la suspensión de harina de maíz de sólidos muy secos, pueden ser termoestables (temperatura óptima de 95°C), pueden ser independientes del calcio, pueden ser activas a bajo pH óptimo, y pueden tolerar hasta un 30% de reciclados en contracorriente. En un aspecto, la dosis recomendada está en el rango entre aproximadamente 0,4 y 0,6 kg/ MT de almidón.

Procesos enzimáticos de molienda en húmedo

La invención provee procesos de molienda en húmedo, por ejemplo, molienda en húmedo de maíz, usando una enzima, por ejemplo, una glucoamilasa, de la invención. La molienda en húmedo de maíz es un proceso que produce aceite de maíz, harina de gluten, pienso de gluten y polisacárido, por ejemplo, almidón. Por lo tanto, la invención provee métodos para elaborar aceite de maíz, harina de gluten, pienso de gluten y polisacárido, por ejemplo, almidón, usando una enzima de la invención. En un aspecto, se usa una glucoamilasa alcalina de la invención en la licuefacción del polisacárido, por ejemplo, almidón. En un aspecto, se usa una glucoamilasa de la invención en la sacarificación para producir glucosa. Un ejemplo de un proceso de molienda en húmedo de maíz de la invención (usando al menos una enzima de la invención), se ilustra en la Figura 6. La Figura 6 ilustra un ejemplo de un proceso de aceite de maíz de la invención que comprende remojar, desgerminar, desfibrar y separar el gluten, seguido por licuefacción usando una enzima de la divulgación (por ejemplo, una alfaamilasa), y sacarificación usando una enzima de la invención (por ejemplo, glucoamilasa).

En un aspecto, se somete maíz (un grano que consiste de un revestimiento de semilla exterior (fibra), polisacárido, por ejemplo, almidón, una combinación de almidón y glucosa y el germen interior), a un proceso de cuatro etapas, que resulta en la producción de almidón. En un aspecto, se remoja, se desgermina, se desfibra y se separa el gluten el maíz. En un proceso de remojo, se retiran los solubles. El producto restante después de la extracción de los solubles se desgermina, lo que resulta en la producción de aceite de maíz y en producción de una torta oleosa, que se añade a los solubles de la etapa de remojo. El producto remanente se desfibra, y se añaden los sólidos de la fibra a la mezcla de torta oleosa/solubles. Esta mezcla de sólidos de fibra, torta oleosa y solubles forma un pienso de gluten. Después del desfibrado, se somete el resto del producto a la separación del gluten. Esta separación genera harina de gluten y almidón. Se somete luego el almidón a licuefacción y sacarificación usando polipéptidos de la invención para producir glucosa.

La Figura 6 ilustra un ejemplo de un proceso de molienda en húmedo de maíz de la invención (usando al menos una enzima de la invención). La Figura 7, la Figura 8 y la Figura 9 ilustran ejemplos alternativos de métodos de procesamiento del almidón (por ejemplo, procesos industriales), incluyendo procesos de Iicuefacción de almidón, de la invención (usando al menos una enzima de la invención).

Las enzimas de la invención se pueden usar en procesos de molienda en seco/húmedo de la biomasa; por ejemplo, una molienda en húmedo de maíz, produce un aceite vegetal (por ejemplo, de maíz), una harina de gluten, un pienso de gluten y/o un almidón. En un aspecto, se usa una amilasa alcalina de la divulgación en la Iicuefacción del almidón y se usa una glucoamilasa de la invención en la sacarificación, produciendo glucosa. En un aspecto, se somete la biomasa (por ejemplo, un grano de maíz, que consiste de un revestimiento exterior de la semilla exterior (fibra), almidón, una combinación de almidón y glucosa y el germen interno) a un proceso de cuatro etapas para producir almidón. La biomasa (por ejemplo, maíz) se remoja, se desgermina, se desfibra y, finalmente, se separa el gluten. En el proceso de remojo, se retiran los solubles. El producto restante después de la remoción de los solubles se desgermina, lo que resulta en la producción de un aceite vegetal (por ejemplo, un aceite de maíz) y la producción de una torta oleosa, que se añade a los solubles de la etapa de remojo. El producto restante se desfibra y se añaden los sólidos de la fibra a la mezcla de torta oleosa/solubles. Esta mezcla de sólidos de fibra, torta oleosa y solubles forma un pienso de gluten. Después del desfibrado, se somete el resto del producto a separación del gluten. Esta separación da como resultado una harina de gluten y almidón. En un aspecto, el almidón se somete luego a licuefacción y sacarificación (por ejemplo, usando enzimas de la invención) para producir glucosa.

La invención también provee un proceso de alto rendimiento para producir goma de fibra de maíz de alta calidad mediante el tratamiento de la fibra de maíz con una enzima de la invención seguido por tratamiento con peróxido de hidrógeno para obtener un extracto de fibra de maíz molida. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.147.206.

En un aspecto, se utilizan una o más de otras enzimas junto con una composición que comprende enzimas de la invención para uso con estos procesos de molienda en seco o en húmedo, por ejemplo, incluyendo amilasas, betagalactosidasas, catalasas, Iacasas, celulasas, endoglicosidasas, endo-beta-1,4-Iacasas, amiloglucosidasas, glucosidasas. glucosa isomerasas, glucosiltransferasas, Iipasas, fosfolipasas, Iipooxigenasas, beta-Iacasas, endobeta-1,3(4)-lacasas, cutinasas, peroxidasas, amilasas, otras glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, decarboxilasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas, pectín acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas. proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectín Iiasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

Procesos anti-enranciamiento

La divulgación provee procesos anti-enranciamiento (por ejemplo, de productos horneados tales como pan) usando una glucoamilasa de la invención. La divulgación provee métodos para disminuir el incremento de la firmeza de la miga (del producto horneado) y una disminución de la elasticidad de la miga usando una glucoamilasa de la invención. El enranciamiento de los productos horneados (tales como pan) es más serio a medida que pasa el tiempo entre el momento de la preparación del producto horneado y el momento de consumo. El término "enranciamiento" se usa para describir cambios indeseables para al consumidor en las propiedades del producto horneado después de salir del horno, tal como un incremento de la firmeza de la miga, una reducción de la elasticidad de la miga y cambios en la corteza, que se torna dura y correosa. La firmeza de la miga del pan se incrementa de manera adicional durante el almacenamiento hasta un nivel que se considera negativo. Las glucoamilasas de la invención se usan para retardar el enranciamiento del pan como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.197.352, 2.615.810, 3.026.205; Silberstein (1964) Baker's Digest 38: 66

72.

En un aspecto, una enzima de la invención se usa para retardar el enranciamiento de los productos horneados mientras que no se hidrolice el almidón en dextrinas ramificadas. Las dextrinas ramificadas se forman por escisión de las cadenas ramificadas de las dextrinas generadas por hidrólisis de α-amilasa que no puede ser degradada adicionalmente por la α-amilasa. Esto puede producir una miga gomosa en el pan resultante. Por consiguiente, la divulgación provee un proceso para retardar el enranciamiento de los productos horneados (por ejemplo, productos horneados con levadura) que comprende agregar una enzima de la invención que comprende actividad de exoamilasa a una harina o una masa usada para producir un producto horneado. Las glucoamilasas de la invención pueden tener actividad glucoamilasa

La divulgación también provee un proceso para preparar una masa o un producto horneado preparado a partir de una masa que comprende agregar una glucoamilasa de la invención a la masa en una cantidad que sea efectiva para retardar el enranciamiento del pan. La divulgación también provee una masa que comprende una amilasa y una premezcla que comprende harina junto con dicha amilasa. Finalmente, la divulgación provee un aditivo de horneado enzimático, que contiene dicha amilasa.

Pienso y aditivos para animales La invención provee piensos, alimentos, aditivos para alimentos, aditivos para piensos, suplementos nutricionales y/o suplementos dietarios que comprenden un polipéptido de esta invención para humanos y animales; y la invención provee métodos para tratar humanos y animales que utilizan piensos, alimentos, aditivos para alimentos, aditivos para piensos, suplementos nutricionales y/o suplementos dietarios que comprenden un polipéptido de esta invención; y/o el uso de una enzima glucoamilasa de la invención. La invención provee alimentos para humanos y/o piensos para animales, alimentos, aditivos para alimentos, aditivos para piensos, suplementos nutricionales y/o suplementos dietarios que comprende glucoamilasas de la invención. En un aspecto, el tratamiento de alimentos para humanos y/o piensos para animales, alimentos, aditivos para alimentos, aditivos para piensos, suplementos nutricionales y/o suplementos dietarios usando las enzimas glucoamilasas de la invención puede ayudar en la disponibilidad del polisacárido, por ejemplo, almidón, alimentos para humanos y/o piensos para animales, alimentos, aditivos para alimentos, aditivos para piensos, suplementos nutricionales y/o suplementos dietarios. Esto puede resultar en la liberación de azúcares rápidamente digeribles y fácilmente absorbidos.

El uso de una glucoamilasa de la invención puede incrementar la capacidad digestiva de aves y animales. El uso de una glucoamilasa de la invención puede garantizar la disponibilidad de un suministro de nutrientes adecuado para mejor crecimiento y funcionamiento. En un aspecto, las enzimas de la invención pueden ser añadidas como aditivos para piensos, o en piensos, alimentos, aditivos para alimentos, aditivos para alimentos, suplementos nutricionales y/o suplementos dietarios, para animales. En otro aspecto, los piensos, alimentos, aditivos, aditivos para alimenticios, aditivos para piensos, suplementos nutricionales y/o suplementos dietarios, por ejemplo, para pienso animal, pueden ser tratados con una glucoamilasa de la invención antes del consumo por el animal. En otro aspecto, se puede suministrar una glucoamilasa de la invención mediante la expresión de las enzimas directamente en los cultivos de piensos transgénicos (tal como, por ejemplo, plantas, semillas transgénicas, y similares), tal como maíz. Como se discutió anteriormente, la divulgación provee plantas transgénicas, partes de plantas y células vegetales que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. En un aspecto, el ácido nucleico se expresa de manera tal que una glucoamilasa de la invención sea producida en cantidades recuperables. La glucoamilasa de la invención puede ser recuperada de cualquier planta o parte de la planta. En forma alternativa, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido recombinante se pueden usar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, aditivo para pienso, suplemento nutricional y/o suplemento dietario, y similares, por ejemplo, mejorando el valor nutricional, el sabor y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

Tratamiento del papel o de la pulpa

La enzimas de la invención pueden estar en el tratamiento del papel o de la pulpa o para desentintar papel. Por ejemplo, en un aspecto, la invención provee un proceso de tratamiento de papel que utiliza glucoamilasas de la invención. En un aspecto, la enzima de la invención se puede usar para modificar el polisacárido, por ejemplo, almidón, en el papel, convirtiéndolo así en una forma licuada. En otro aspecto, se pueden usar los componentes del papel del papel fotocopiado reciclado durante un proceso químico y de desentintado enzimático. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención se pueden usar en combinación con celulasas. El papel puede ser tratado por medio de los siguientes tres procesos: 1) desintegración en presencia de una enzima de la invención, 2) desintegración con un compuesto químico para desentintado y una enzima de la invención, y/o 3) desintegración después del remojo con una enzima de la invención. El papel reciclado tratado con amilasa puede tener un mayor brillo debido a la remoción de las partículas de tóner comparado con el papel tratado solo con celulasa. Si bien la invención no está limitada por ningún mecanismo particular, el efecto de una glucoamilasa de la invención puede ser debido a su comportamiento como agente activo de superficie en la suspensión de la pulpa.

La invención provee métodos para tamiento del papel y de la pulpa de papel usando uno o más polipeptidos de la invención. Los polipéptidos de la invención se pueden usar en cualquier método de tratamiento del papel o de la pulpa, que son bien conocidos en el arte, véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos No. 6.241.849, 6.066.233, 5.582.681. Por ejemplo, en un aspecto, la invención provee un método para desentintar y decolorar un papel impreso que contiene una tinta, que comprende formar una pulpa con un papel impreso para obtener una suspensión de pulpa y quitar una tinta de la suspensión de la pulpa en presencia de una enzima de la invención (también se pueden agregar otras enzimas). En otro aspecto, la invención provee un método para mejorar la permeabilidad de la pulpa, por ejemplo, pulpa hecha de fibra secundaria, al agregar una mezcla enzimática que comprende una enzima de la invención (también puede incluir otras enzimas, por ejemplo, enzimas pectinasas) a la pulpa y tratar bajo condiciones que causen una reacción para producir una pulpa tratada enzimáticamente. La permeabilidad de la pulpa tratada enzimáticamente se incrementa a partir de la permeabilidad inicial de la pulpa de fibra secundaria sin pérdida de brillo.

En un aspecto, una o más de otras enzimas se usan junto con una composición que comprende las enzimas de la invención para uso con estos métodos de tratamiento de pulpa y/o papel, por ejemplo, incluyendo amilasas, betagalactosidasas, catalasas, Iacasas, celulasas, endoglucosidasas, endo-beta-1,4-Iacasas, amiloglucosidasas, glucosidasas, glucosa isomerasas, glucosiltransferasas, Iipasas, fosfolipasas, Iipooxigenasas, beta-lacasas, endobeta-1,3(4)-lacasas, cutinasas, peroxidasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, decarboxilasas, fenoloxidasas, Iigninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas, pectín, acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectín Iiasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

Redespulpado: tratamiento de los materiales Iignocelulósicos

La invención también provee un método para el tratamiento de fibras Iignocelulósicas, en donde las fibras son tratadas con un polipéptido de la invención, en una cantidad que es eficiente para mejorar las propiedades de las fibras; Las glucoamilasas de la invención también se pueden usar en la producción de materiales Iignocelulósicos tales como pulpa, papel y cartón, a partir del polisacárido, por ejemplo, almidón, papel y cartón residuales reforzados, especialmente cuando ocurre redespulpado a un pH porp encima de 7 y donde las amilasas pueden facilitar la desintegración del material de desecho mediante la degradación del polisacárido de refuerzo, por ejemplo, almidón. Las glucoamilasas de la invención pueden ser útiles en un proceso para producir una pulpa para fabricación de papel a partir del papel impreso revestido de almidón. El proceso puede ser realizado como se describe, por ejemplo, en el documento WO 95/14807.

Un ejemplo de un proceso comprende desintegrar el papel para producir una pulpa, mediante tratamiento con una enzima que degrada polisacárido, por ejemplo, que degrada almidón, antes, durante o después de desintegrar y separar las partículas de tinta de la pulpa después de la desintegración, y tratamiento con enzima. Véase también la patente de los Estados Unidos No. 6.309.871 y otras patentes de los Estados Unidos citadas aquí. Por lo tanto, la invención incluye un método para el desentintado enzimático de pulpa de papel reciclado, en donde el polipéptido se aplica en una cantidad que es eficiente para el desentintado efectivo de la superficie de la fibra.

Tratamiento de desechos

Las enzimas de la invención se pueden usar en una variedad de otras aplicaciones industriales, por ejemplo, en tratamiento de desechos. Por ejemplo, en un aspecto, la invención provee un proceso de digestión de desecho sólido que usa las enzimas de la invención. Los métodos pueden comprender reducir la masa y el volumen del desecho sólido sustancialmente no tratado. El desecho sólido se puede tratar con un proceso digestivo enzimático en presencia de una solución enzimática (incluyendo una enzima de la invención) a una temperatura controlada. Esto traduce en una reacción sin fermentación bacteriana apreciable a partir de los microorganismos añadidos. El desecho sólido es convertido en un desecho licuado y cualquier desecho sólido residual. El desecho licuado resultante puede ser separado de dicho desecho solidificado residual. Véase por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.709.796.

En un aspecto, una o más de otras enzimas se usan junto con una composición que comprende las enzimas de la invención para uso con estos métodos de tratamiento de desechos, por ejemplo, incluyendo amilasas, betagalactosidasas, catalasas, lacasas, celulasas, endoglicosidasas, endo-beta-1,4-Iacasas, amiloglucosidasas, glucosidasas, glucosa, isomerasas, glucosiltransferasas, Iipasas, fosfolipasas, Iipooxigenasas, beta-Iacasas, endobeta-1,3(4)-Iacasas, cutinasas, peroxidasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, decarboxilasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas. pectín acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectín Iiasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas. celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

Productos para el cuidado oral

La invención provee productos para el cuidado oral que comprenden una glucoamilasa de la invención. Los ejemplos de productos para el cuidado oral incluyen pastas dentales, cremas dentales, geles o polvos dentales, lavados bucales y dentales, formulaciones para enjuague pre y post cepillado, gomas de mascar, pastillas o caramelos. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.264.925.

En un aspecto, una o más de otras enzimas se usan junto con una composición para el cuidado oral que comprende enzimas de la invención y para uso con estos métodos, por ejemplo, incluyendo amilasas, beta-galactosidasas, catalasas, Iacasas, celulasas, endoglucosidasas, endo-beta-1,4-lacasas, amiloglucosidasas, other glucosidasas, glucosa somerasas, glucosiltransferasas, Iipasas, fosfolipasas, Iipooxigenasas, beta-Iacasas, endo-beta-1,3(4)-Iacasas, cutinasas, peroxidasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, decarboxilasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas, pectín acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectín Iiasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

Elaboración de cerveza y fermentaciones La invención provee métodos de elaboración de cerveza (por ejemplo, fermentación) que comprenden una glucoamilasa de la invención. En un ejemplo de un proceso, los materiales sin purificar que contienen almidón se desintegran y se procesan para formar una malta. Una glucoamilasa de la invención se puede usar en cualquier punto del proceso de fermentación. Por ejemplo, las glucoamilasas de la invención se pueden usar en el procesamiento de malta de cebada. El principal material sin purificar de la elaboración de cerveza es la malta de cebada. Este puede ser un proceso de tres etapas. Primero, los granos de cebada pueden ser remojados para incrementar el contenido de agua, por ejemplo, hasta aproximadamentel 40%. Segundo, el grano puede ser germinado por incubación a 15 -25 °C durante 3 a 6 dias cuando la síntesis enzimática es estimulada bajo el control de giberelinas. Durante este tiempo, los niveles de amilasa se elevan en forma significativa. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención se añaden en esta etapa del proceso (o en cualquier otro). La acción de la amilasa da como resultado un incremento en los azúcares reductores fermentables. Esto se puede expresar como la potencia diastática, DP, que se puede elevar desde alrededor de 80 hasta 190 en 5 días a 12°C.

Las glucoamilasas de la invención se pueden usar en cualquier proceso de producción de cerveza, como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.762.991. 5.536.650. 5.405.624. 5.021.246.

4.788.066.

En un aspecto, una o más de otras enzimas se usan junto con un alimento, pienso o bebida que comprende enzimas de la invención, por ejemplo, incluyendo amilasas, beta-galactosídasas, catalasas, Iacasas, celulasas, endoglucosidasas, endo-beta-1,4-Iacasas, amiloglucosidasas, otras glucosidasas, glucosa isomerasas, glucosiltransferasas, lipasas, fosfolipasas, Iipooxigenasas, beta-Iacasas, endo-beta-1,3(4)-lacasas, cutinasas, peroxidasas, amiiasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, decarboxilasas. fenoloxidasas, Iignínasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas, pectín acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectín Iiasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

Uso en perforación de pozos y operaciones mineras

La invención también incluye métodos que utilizan enzimas de la invención en pozos y en operaciones de perforación, por ejemplo, gas, petróleo u otras operaciones de minería o perforación. Por ejemplo, en un aspecto, las enzimas de la invención se utilizan para incrementar el flujo de los fluidos de producción a partir de una formación subterránea, por ejemplo, un pozo o una mina. En un aspecto, las enzimas de la invención se utilizan para remover fluidos viscosos que contienen polisacáridos y/o que contienen almidón que pueden ser nocivos, por ejemplo, fluidos formados durante las operaciones de producción. Estos fluidos que contienen polisacáridos y/o que contienen almidón pueden ser encontrados dentro de una formación subterránea que rodea un orificio de pozo completo. En un aspecto, una glucoamilasa de la invención se usa en un fluido de perforación de pozo de petróleo para ayudar a extraer el lodo de perforación.

La invención provee métodos para cambiar la viscosidad de una composición que comprende: proveer una composición y el polipéptido de la invención y una composición; y tratar la composición con el polipéptido de la invención; y en un aspecto del método, la composición comprende un suelo o un lodo de perforación.

En un aspecto, el uso de estos métodos de la invención permite que los fluidos de producción (que comprenden las enzimas de la invención), fluyan desde el orificio del pozo o una mina. Los métodos pueden comprender la reducción del flujo de los fluidos de producción de la formación por debajo de los índices de flujo esperados y la formulación de un tratamiento enzimático al mezclar un fluido acuoso y un polipéptido de la invención. Los métodos pueden comprender bombear el tratamiento enzimático a un sitio deseado dentro del orificio del pozo u otro conducto perforado y permitir que el tratamiento enzimático degrade el fluido nocivo viscoso que contiene almidón. Los métodos pueden comprender la remoción del fluido desde la formación subterránea hasta el pozo o superficie del conducto. En un aspecto, el tratamiento enzimático es efectivo para atacar los enlaces alfa glucosídicos en el fluido que contiene almidón. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención se utilizan en la perforación minera, perforación de pozos (por ejemplo, perforación de pozos de petróleo o gas) y similares, para trasladar el lodo de perforación, por ejemplo, mientras se perfora el agujero (orificio o conducto del pozo).

La enzimas de la invención se pueden usar en cualquier operación de perforación de pozo, conducto o mina, muchos de los cuales son conocidos en el arte. Por ejemplo, la invención provee métodos para introducir una enzima de la invención, que en un aspecto también puede comprender la producción de un compuesto químico de un campo petrolero o de gas, en una formación rocosa que comprende petróleo y/o gas, que comprende pasar una microemulsión que comprende la enzima (y, en un aspecto, el compuesto químico) dentro de un pozo de producción y luego en la formación. En un aspecto, se somete un pozo de producción a un tratamiento de "cierre" por el cual una composición acuosa que comprende una enzima de la invención es inyectada en el pozo de producción bajo presión y "presionada" en la formación y mantenerla allí. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.581,687.

En un aspecto, las glucoamilasas de la invención usadas en otras operaciones de perforación de gas, petróleo u otros operaciones de perforación o minería son activas a alto o bajo pH y/o altas o bajas temperaturas, por ejemplo, las glucoamilasas de la invención usadas en estos procesos son activas bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4.5 o pH 4, o menores, o, bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7.5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 o pH 11 o superior. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención usadas en estos procesos son activas bajo condiciones que comprenden un rango de temperatura en cualquier punto entre aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 37°C, o entre aproximadamente 37°C hasta aproximadamente 95°C o más, o entre aproximadamente 80°C hasta aproximadamente 120°C, por ejemplo, 85°C, 90°C, 95ºC, 98°C, 100°C, 105°C, 110°C, 115°C, 120°C o más.

En un aspecto, una o más de otras enzimas se usan junto con una composición que comprende enzimas de la invención para uso con estos métodos, por ejemplo, incluyendo amilasas. beta-galactosidasas, catalasas. Iacasas, celulasas, endoglicosidasas. endo-beta-1,4-lacasas, amiloglucosidasas, glucosidasas, glucosa isomerasas, glucosiltransferasas, Iipasas, fosfolipasas, Iipooxigenasas. beta-Iacasas, endo-beta-1,3(4)-lacasas, cutinasas, peroxidasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, decarboxilasas, fenoloxidasas, Iigninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas, pectín acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas. galactanasas, pectín Iiasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

En un aspecto, las enzimas o cócteles de enzimas de la invención que se usan en estas operaciones de excavación

o perforación de gas, petróleo u otros, o que incluyen cualquier otro proceso de fractura y/o lavado de pozos de gas y petróleo, son activas a alto o bajo pH y/o altas o bajas temperaturas, por ejemplo, enzimas que degradan al polímero o que degradan al polisacárido (“rompedor del polímero") de esta invención, que incluyen el uso de "cócteles" de estas y otras enzimas tales como las enzimas amilasa, glucoamilasa. xantanasa, glucosidasa y/o celulasa, o una enzima degradante de Iignina, alfa amilasa, beta amilasa, glucoamilasa, dextrinasa, celulasa, celobiohidrolasa, avicelasa, carboximetilcelulasa, beta-glucanasa, glucosidasa, xilanasa, mananasa, arabinofuranosidasa, Iacasa, lignina peroxidasa, pectinasa, pectato Iiasa, xantanasa, xantana Iiasa, xantana de polimerasa, pululanasa, liquenasa, paquimanasa, lipasa, proteasa, proteinasa, fitasa, peptidasa y catalasa, que incluyen el uso de “cócteles” de estas y otras enzimas, que se utilizan estos procesos son activas bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5, pH 4,0, pH 3,5, pH 3,0 o menos (más ácido), o, bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11,0, pH 11,5, pH 12, pH 12,5 o más (más básico). En un aspecto, las enzimas o cócteles de enzimas de la invención usados en estos procesos son activos bajo condiciones que comprenden una rango de temperatura de cualquier punto entre aproximadamente -100°C hasta aproximadamente -80°C, aproximadamente -80°C hasta aproximadamente -40°C, aproximadamente -4O°C hasta aproximadamente 20°C, aproximadamente -20°C hasta aproximadamente 0°C, aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 37°C, aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 5°C, aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 15°C, aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 25°C, aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 37°C, aproximadamente 37°C hasta aproximadamente 45°C, aproximadamente 45°C hasta aproximadamente 55°C, aproximadamente 55°C hasta aproximadamente 70°C, aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 75°C, aproximadamente 75ºC hasta aproximadamente 85°C, aproximadamente 85°C hasta aproximadamente 90°C, aproximadamente 90°C hasta aproximadamente 95°C, aproximadamente 95°C hasta aproximadamente 100°C, aproximadamente 100°C hasta aproximadamente 105°C, aproximadamente 105°C hasta aproximadamente 110°C, aproximadamente 110°C hasta aproximadamente 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107 °C, 108°C. 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C, 120°C o más.

En una forma de realización, el “mecanismo de desencadenamiento del pH" comprende el uso de enzimas termofílicas, por ejemplo, una “pirolasa” tal como el polipéptido de la SEQ ID NO: 4 y/o de la SEQ ID NO: 6 (codificada por ejemplo, por la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 5, respectivamente). En un aspecto, la divulgación provee un sistema que comprende una o más enzimas atrapadas en un lodo o sus ingredientes en una forma seca, por ejemplo, un polvo de goma guar, arena o sal reguladora. En un aspecto, la enzima permanece inactiva o “menos activa" a causa de la baja temperatura del lodo, o permanece inactiva o “menos activa" debido a que la cantidad de carga enzimática se ajusta para que no ocurra degradación, u ocurra menos degradación (no deseada) (de sustrato) en forma "prematura" hasta que se caliente el lodo a una temperatura más alta que conduce a la activación de la(s) enzima(s). Esta forma de realización se puede referenciar como "un sistema enzimático atrapado con un mecanismo de desencadenamiento de temperatura".

En un aspecto, la composición y métodos de la invención se usan para degradar los polímeros en un “lodo” que, en formas de realización alternativas, comprende un medio que contiene agua en el cual la enzima, polisacárido y otros componentes se mezclan. En un aspecto, la composición y métodos de la invención se usan como una solución o polvo seco, que se puede mezclar con un ingrediente o componente del “lodo”. En un aspecto, la enzima se incorpora/arrastra en los ingredientes del lodo antes de la preparación del lodo real. Por ejemplo, un ejemplo de formulación o mezcla usada para realizar esta invención comprenden un polvo de almidón, xantana o celulosa mezclada con una o más enzimas, o una mezcla de sales reguladoras y enzima(s), en donde cada uno de dichos ingredientes que contienen enzimas se pueden usar luego para preparar el lodo.

Uso de enzimas libres e inmovilizadas en operaciones de perforación y fracturamiento hidráulico:

La divulgación provee composiciones y métodos que comprenden la inclusión de enzimas de rompimiento de polímeros (degradación de polímeros), por ejemplo, degradación de polisacáridos, en una forma libre o en una forma inmovilizada, por ejemplo, en una forma inmovilizada sobre un revestimiento, por ejemplo, de una partícula, por ejemplo, de un grano de arena o un material cerámico tal como una bauxita sinterizada.

En un aspecto, las composiciones y métodos que comprenden la inclusión de enzimas de rompimiento de polímeros (degradación de polímeros), por ejemplo, degradación de polisacáridos en o sobre una resina o material similar que reviste partículas, por ejemplo, granos de arena o un material cerámico tal como una bauxita sinterizada; estas partículas (por ejemplo, granos de arena) se pueden usar como el agente de consolidación o con un agente de consolidación (por ejemplo, una arena revestida con resina o materiales cerámicos de alta resistencia) en un fluido de fracturamiento hidráulico. En un aspecto, un agente de consolidación son partículas de un cierto tamaño mezcladas con un fluido de fracturamiento para mantener las fracturas abiertas después de un tratamiento de fracturamiento hidráulico. Además de los granos de arena de origen natural, los agentes de consolidación sintéticos

o diseñados especialmente, tales como arena revestida con resina o materiales cerámicos de alta resistencia como bauxita sinterizada, también se pueden usar. Los materiales de agente de consolidación pueden ser clasificados por tamaño y esfericidad para proveer un conducto eficiente para la producción de fluidos desde el depósito hasta el orificio del pozo. Después del asentamiento de la arena en las fracturas y fisuras del pozo, las enzimas enlazadas a resina pueden difundirse y trabajar sobre el polímero concentrado y no quebrado que a menudo se deposita sobre la superficie de la formación en la terminación de las operaciones de fracturamiento. Por lo tanto, este aspecto de la divulgación puede remover, eficientemente un polisacárido, una goma xantana o guar, por ejemplo, una torta de filtración guar, de los pozos de petróleo y gas fracturados, y/o pueden mejorar la permeabilidad de la zona fracturada.

En una forma de realización, durante las operaciones de fracturamiento hidráulico, los grandes volúmenes de agua, arena, compuestos quimicos auxiliares (incluyendo enzimas y las mezclas de enzimas de esta invención) y un polímero basado en polisacáridos (por ejemplo, guar y/o sus derivados) son mezclados e inyectados bajo presión en los pozos de petróleo y/o gas para "fracturar" la formación circundante y mejorar el flujo de gas o de petróleo en el orificio del pozo. Las enzimas y mezclas de enzimas como se describe aquí pueden ser usadas para hidrolizar estos polímeros de polisacáridos y reducir la viscosidad del fluido (usados en operaciones de fracturamiento hidráulico) para la mejor penetración y retorno más efectivo más efectivo del fluido al final de la operación.

En una forma de realización, las composiciones y métodos de esta divulgación son usados en la hidrólisis enzimática de los polímeros base (por ejemplo, polímeros basados en polisacáridos, tales como goma guar, xantana y/o sus derivados); con la práctica de esta divulgación se puede solucionar el problema donde la hidrólisis enzimática de estos polímeros base puede ser incompleta para dejar algún polímero "no quebrado" en el fluido usado en las operaciones de fracturamiento hidráulico. Como el contenido de agua en el fluido se pierde en la formación, el fluido se torna más concentrado y los polímeros no quebrados forman una torta de filtro gruesa; esta torta de filtro impide la formación de poros y reduce el flujo de petróleo o gas en el orificio del pozo. En una realización, las composiciones y métodos de esta divulgación se usan para romper estos tapones de la torta de filtro.

Los fluidos de fracturamiento contienen grandes cantidades de arena, por lo general denominados como el agente de consolidación. A medida que se bombea el fluido en el pozo, el agente de consolidación se asienta en las fisuras y fracturas y evita que las mismas se cierren. Esto ayuda a mejorar la porosidad y permeabilidad de la formación para un mejor flujo del gas/petróleo. Los granos de arena a menudo se revisten con diferentes resinas industriales para incrementar su resistencia mecánica y evitar que choquen bajo la presión de la formación. Por lo tanto, en una forma de realización, la invención provee composiciones y métodos que usan enzimas que degradan polímeros libres o inmovilizados ("ruptura de polímeros”) aproximadamente, en o sobre el material de revestimiento de la arena. En un aspecto, esto se realiza atrapando la enzima en la resina o por inmovilización sobre la superficie de revestimiento. Por lo tanto, en este aspecto, la(s) enzima(s) usadas pueden permanecer en contacto con la torta de filtro proveyendo así una hidrólisis continua del polímero concentrado, removiendo la torta de las fracturas y mejorando la permeabilidad de la formación fracturada.

En un aspecto, la divulgación provee métodos que usan estas enzimas descritas en operaciones de perforación, por ejemplo, una operación de perforación típica, donde un pozo es creado perforando un orificio de 5 a 30 pulgadas (13 -76 cm) de diámetro en la tierra con una torre de perforación petrolera, que gira una broca. Una vez que el orificio es perforado, una tubería de acero (cubierta) ligeramente menor que el orificio se coloca en el orificio y se asegura con cemento. La cubierta proporciona integridad estructural al orificio del pozo recientemente perforado además de aislar zonas potencialmente peligrosas de alta presión una de otra y de la superficie.

Con estas zonas aisladas en forma segura y la formación protegida por la cubierta, el pozo puede ser perforado más profundamente (en formaciones potencialmente más inestables y violentas) con una broca más pequeña y también revestido con una tubería de tamaño menor. Un pozo puede tener 2 a 5 conjuntos de orificios de menor tamaño perforados uno dentro de otro, cada uno cementado con una cubierta.

A fin de perforar el pozo, la broca, ayudada por un esfuerzo de torsión y el peso de compresión de los anillos de perforación por encima de ella, rompe la tierra. El fluido de perforación, o “lodo”, que comprende la inclusión de enzimas y mezclas de enzimas que rompen polímeros (que degradan polímeros), por ejemplo, que degradan polisacáridos, de esta invención, en una forma libre o en una forma inmovilizada, es bombeado por el interior del tubo de perforación. El fluido sale de la broca y ayuda a romper la roca, manteniendo presión en la parte superior de la broca, así como también la limpieza, enfriamiento y Iubricación de la broca.

Los “cortes” generados en la roca son barridos por el fluido de perforación a medida que circulan nuevamente hacia la superficie exterior de la tubería de perforación. El fluido que comprende las enzimas y mezclas de enzimas que quiebran polímeros (degradan polímeros), por ejemplo, degradan polisacáridos, de esta invención, en una forma libre o en una forma inmovilizada, también pueden ser añadidos en esta etapa.

Los fluidos luego atraviesan "agitadores" que agitan los recortes sobre cribas permitiendo que el fluido bueno retorne a los pozos. El fluido que comprende enzimas y mezclas de enzimas que quiebran polímeros (degradan polímeros), por ejemplo, degradan polisacáridos, de esta invención, en una forma libre o en una forma inmovilizada, también pueden ser agregados en esta etapa.

Estos procesos de la divulgación pueden ser facilitados por adición de enzimas y mezclas de enzimas que quiebran polímeros (degradan polímeros), por ejemplo, degradan polisacáridos, de esta invención, en una forma libre o en una forma inmovilizada. La plataforma de perforación puede contener todo el equipamiento necesario para circular el fluido de perforación, elevar y voltear el tubo, controlar las presiones descendentes del orificio, extraer los recortes del fluido de perforación y generar energía en el sitio para estas operaciones.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención pueden ser realizados con cualquier lodo de perforación o fluido de perforación (algunos prefieren reservar el término "fluido de perforación" para “lodos" más sofisticados y bien definidos), o cualquier fluido usado en operaciones para perforar orificios de perforación en la tierra. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden realizar al tiempo que se perforalos pozos de petróleo y/o gas natural y en plataformas de perforación de exploración, incluyendo el uso con orificios más simples.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclarse con y/o llevar a cabo junto con cualquier pozo u operación de perforación, por ejemplo, cuando se usa cualquier lodo, incluyendo el uso de cualquiera de los tres esquemas principales de clasificación de lodo, en donde "lodo" se usa en forma amplia y se separa en 3 categorías con base en el componente principal que forma el lodo: (1) "lodo con base en agua" (WBM), que puede subdividirse en lodos dispersos y no dispersos; (2) lodo “no acuoso" o más comúnmente "lodo con base en aceite" (OBM), incluyendo aceites sintéticos (SBM); y/o (3) lodo gaseoso o neumático.

La enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclarse con y/o llevar a cabo junto con cualquier pozo u operación de perforación, por ejemplo, también se pueden usar en o con:

•: Pozos de producción cuando se perforan principalmente para producir petróleo o gas, una vez que se establecen la estructura y características de producción,

•: pozos de aforo cuando se usan para evaluar las características (tal como tasa de flujo) de una acumulación probada de hidrocarburos,

•: pozos de exploración cuando se perforan simplemente para propósitos exploratorios (reunión de información) en una área nueva,

•: pozos de prueba cuando se perfora un pozo, con base en un gran elemento de expectativa, en un área de frontera donde se conoce muy poco sobre la subsuperficie.

La enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclar con y/o llevar a cabo junto con cualquier pozo u operación de perforación, por ejemplo, también se pueden usar junto con los métodos, equipos y/o operaciones de perforación como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070089910, Hewson, y colaboradores, que describe, por ejemplo, métodos para formar un orificio perforado subterráneo soportado y usa, por ejemplo, un motor de lodo de desplazamiento positivo.

La enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclarse con y/o llevar a cabo junto con métodos, equipos y/o operaciones de perforación como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070084638, Bohnsack; C., y colaboradores, que describe, por ejemplo, un sistema para facilitar el flujo de los sólidos asentados con fluido de perforación desde un contenedor; el sistema incluye un aparato de boquilla a presión con al menos una boquilla desde la cual el fluido que puede fluir bajo presión, el aparato energizado de rotación para hacer girar selectivamente el aparato de boquilla a presión para que al menos una boquilla pueda moverse dentro del contenedor a medida que se bombea el fluido através de al menos una boquilla dentro del contenedor; y, en un aspecto, el aparato de traslado para mover el aparato de boquilla a presión con respecto al contenedor a medida que se bombea fluido bajo presión hasta al menos una boquilla de rotación. También se describen los tanques de lodos y los pozos de lodo, y se pueden usar las enzimas, mezclas de enzimas y los métodos de la invención en o con cualquiera de estos fluidos, y/o en cualquiera de los tanques de lodo y pozos de lodo utilizados en estos tipos de operación.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden utilizar en, mezclar con y/o llevar a cabo junto con los métodos, equipo y/o operaciones de perforación como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070081157, Csutak; S., y colaboradores, que describe, por ejemplo, un aparato para estimar una propiedad de un fluido descendiente del orificio que comprende una fuente de luz ultravioleta (UV) para inducir luz en el fluido a una longitud de onda que produce luz de dispersión Raman a longitudes de onda que son más cortas que las longitudes de onda de fluorescencia sustancial reflejada desde el fluido en respuesta a la luz inducida; un detector que detecta un espectro de la luz de dispersión Raman y provee señales en respuesta al espectro detectado; y un procesador que procesa las señales para proveer un estimado de una propiedad del fluido. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en o con cualquiera de estos fluidos, y/o en operaciones para estimar la contaminación filtrada en un fluido de formación. Por ejemplo, estos métodos incluyen detectar dispersiones Raman a una pluralidad de longitudes de onda de al menos un componente presente en un lodo con base en aceite que no está presente en forma natural en la formación y las enzimas, mezclas de enzimas y los métodos de la invención pueden ser utilizados para ayudar en la precisión de esta detección.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclar con y/o llevar a cabo junto con los métodos, equipo y/o operaciones de perforación como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070075706, Chen, S., y colaboradores, que describe, por ejemplo, métodos para evaluar una formación terrestre que comprende hacer mediciones con una herramienta de orificio descendente en un orificio de perforación en la formación terrestre; medir un factor de calidad de una antena de la herramienta de orificio descendente a profundidades donde se realizan las mediciones; y usar la Q medida y una resistividad de un un lodo en el orificio de perforación y una resistividad de formación, y/o un indicador de tamaño de orificio de perforación (BSI), para estimar la resistividad de formación y BSI, que incluye medir la resistividad del lodo en el orificio de perforación. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en o junto con cualquiera de estos fluidos y/o en operaciones para evaluar una formación terrestre.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclar con y/o llevar a la práctica junto con los métodos, equipo y/o operaciones de perforación como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070068675, Barry, M., y colaboradores, que describe, por ejemplo, métodos para perforar y completar un orificio relleno con grava, que comprende perforar un orificio del pozo con un fluido de perforación, acondicionar el fluido de perforación, llevar las herramientas de ensamblado de relleno con grava a la profundidad en el orificio del pozo con el fluido de perforación acondicionado y rellenar con grava un intervalo del orificio del pozo con un fluido de terminación. El fluido de terminación puede ser el mismo que el fluido de perforación. Este método puede ser combinado con tecnología de cribado de arena de ruta alterna para asegurar la distribución apropiada del relleno con grava. Los fluidos apropiados para perforar, rellenar con grava e instalación de cribas de arena son esenciales para el éxito de la terminación del pozo. La planificación cuidadosa, buena preparación y ejecución de terminación son necesarias para incrementar la longevidad y productividad de terminación. Usualmente, un mínimo de tres fluidos han sido usados para perforar y completar los pozos rellenos con grava. El primer fluido es un fluido de perforación cargado de sólidos usado para perforar el intervalo de terminación. El segundo fluido es un fluido de terminación libre de sólidos usados para desplazar el fluido de perforación cargado de sólidos y activar el equipo de exclusión de arena y herramientas de relleno con grava en un ambiente generalmente libre de sólidos. El tercer fluido es un fluido portador para la grava durante el relleno con grava del intervalo de terminación. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en

: o con cualquiera de estos fluidos (incluyendo fluidos de perforación cargados de sólidos, fluidos de terminación libres de sólidos y/o fluidos portadores) y/o en operaciones para perforar y finalizar un pozo relleno con grava.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclar con ylo llevar a la práctica junto con los métodos, equipo y/o operaciones de perforación como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070066491, Bicerano; J., y colaboradores, uso de partículas en la construcción, perforación, terminación y/o estimulación de fractura de pozos de petróleo y gas natural; por ejemplo, como una monocapa parcial del agente de consolidación, un relleno de agente de consolidación, un componente integral de terminación de relleno con grava, un cojinete de bolas, un lubricante sólido, un constituyente de lodo de perforación, y/o un aditivo de cemento, incluyendo el uso de partículas de polímero termoendurecibles para uso en las aplicaciones que requieren partículas de peso liviano que poseen alta rigidez, fuerza, resistencia a temperatura, y/o resistencia a medios agresivos. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en

: o con cualquiera de estos rellenos con grava, cojinetes de bolas, lubricantes sólidos, constituyentes de lodo de perforación, aditivos de cemento y/o las partículas de polímero termoendurecibles descritas. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en o con nanorellenadores y/o nanocompuestos, que incluyen morfologías de nanocompuestos heterogéneas.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclar con y/o llevar a la práctica junto con los métodos, equipo y/o operaciones de perforación como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070039735, Robertson; B., y colaboradores, que describe, por ejemplo, métodos para sellar una zona permeable en una formación subterránea, que comprende: preparar una composición de taponamiento que comprende petróleo, arcilla, cloruro de magnesio y polvo de óxido de magnesio; y poner en contacto la composición de taponamiento con agua en la formación subterránea de manera tal que la composición de taponamiento forme una masa selladora, sellando sustancialmente, de este modo, una zona permeable en la formación subterránea.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en, mezclar con y/o llevar a la práctica junto con lodos de perforación de densidad variable que comprenden materiales de partículas comprimibles, por ejemplo, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070027036, Polizzotti; R., y colaboradores. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en o con, por ejemplo, lodos de perforación que comprenden un material partículado comprimible en el lodo de perforación, en donde la densidad del lodo de perforación cambia debido al cambio de volumen del material partículado comprimible en respuesta a los cambios de presión o temperatura y en donde el material partículado comprimible se configura para mantener la densidad del lodo de perforación entre un gradiente de presión de poro y un gradiente de fractura basados en el cambio de volumen del material particulado comprimible en respuesta a cambios de presión a ciertas profundidades.

Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar para modificar la viscosidad del lodo de perforación solo o junto con los materiales comprimibles descritos (véase Polizzotti; R.. y colaboradores), por ejemplo, para ubicar la viscosidad del fluido dentro de los requisitos de capacidad de bombeo, y/o ajustar el gradiente de presión de poro y gradiente de fractura. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar para efectuar un cambio de volumen en el lodo de perforación, por ejemplo, donde la reologia del lodo de perforación se configura para lograe una reología deseada de lodo de perforación compuesto.

En un aspecto, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se usan para alterar las propiedades del lodo de perforación para proveer un punto deseado de gel de lodo compuesto, por ejemplo, un punto de gel de lodo que puede suspender los recortes de rocas en una corona circular de un orificio del pozo durante las operaciones de perforación; y/o alterar la viscosidad del lodo de perforación junto con, o solamente (sin), objetos huecos comprimibles (véase Polizzotti; R., y colaboradores) para alterar los requisitos de capacidad de bombeo.

En un aspecto, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se usan para alterar las propiedades de los fluidos del pozo que comprenden lodos de perforación, fluidos de limpieza del pozo, fluidos de reacondicionamiento, fluidos espaciadores, fluidos de relleno con grava, fluidos de acidificación y/o fluidos de fracturamiento. En un aspecto, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se usan para facilitar la perforación, terminación y/o estimulación de una formación subterránea usando un fluido de densidad variable y para modificar el fluido de densidad variable.

En un aspecto, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se usan en los métodos de perforación, terminación y/o estimulación de las formaciones subterráneas usando un fluido de densidad variable, por ejemplo, al modificar y/o "ajustar" la densidad del fluido; por ejemplo, un método (véase Polizzotti; R., y colaboradores) que comprende las etapas de: introducir un fluido que tiene una densidad que varía en función de la presión en la formación subterránea, donde el fluido comprende un fluido base y una porción de partículas elásticas; y perforar, finalizar y/o estimular una formación subterránea usando el fluido de densidad variable (que puede comprender las enzimas, mezclas de enzimas de la invención, o que han sido modificadas por los métodos de la invención).

En un aspecto, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención son usadas con los métodos y composiciones como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 4.099.583, que describe, por ejemplo, un sistema de perforación de gradiente dual, donde un fluido más liviano se inyecta en el anillo de retorno del lodo (por lo general en el tubo de subida) u otra vía para reducir la densidad del lodo del punto de inyección en forma ascendente y las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención pueden modificar y/o "ajustar" la densidad de este fluido.

En un aspecto, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se usan con los métodos y composiciones como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6.530.437 y la patente de los Estados Unidos No. 6.588.501, que describen un método de perforación multigradiente y un aparato para la reducción de presión hidrostática en los tubos de subida submarinos; y la patente de los Estados Unidos No. 6.422.326, la patente de los Estados Unidos No. 6.156.708, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.910.467 y 5.881.826, que describen la adición de varios afrones fluidos para las formulaciones del lodo de perforación.

En un aspecto, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se usan con los métodos y composiciones como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6.497.289, que describe el uso de caños expandibles sólidos, por ejemplo, como sistemas tubulares que funcionan en un pozo y se expanden.

En formas de realización alternativas, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se usan para adecuar la densidad del lodo de perforación con la profundidad de manera tal que el peso efectivo del lodo permanezca entre el gradiente de presión de poro y de fractura en todas las profundidades. La variación requerida en la densidad del lodo se puede lograr al cambiar las propiedades de los fluidos con las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención para modificar/cambiar el volumen y densidad, para efectuar un cambio en respuesta a la presión. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar con cualquier componente particulado, por ejemplo, diferentes formas, tales como esferas, cubos, pirámides, esferoides oblados o prolados, cilindros, cojinetes y/u otras formas o estructuras. Las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar con cualquier componente particulado, por ejemplo, objetos huecos comprimibles que se Ilenan con gas presurizado, o materiales sólidos comprimibles u objetos como se describe en Polizzotti; R., y colaboradores, ver más arriba.

En aspectos alternativos, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar en o con cualquier pozo u operación de perforación, por ejemplo, que incluye perforación direccional, a menudo conocida como perforación inclinada, para perforar pozos no verticales, incluyendo los tres grupos principales usados en cualquiera de las perforaciones direccionales; Perforación Direccional de Campo Petrolífero, Perforación Direccional de Instalación de Utilidades (comúnmente conocida como H.D.D./ perforación direccional horizontal/taladrado direccional); y/o perforación direccional dentro de la beta (metano en lecho de carbón).

En un aspecto, las enzimas, mezclas de enzimas y métodos de la invención se pueden usar junto con el sondeo de pozo, una técnica usada en la industria del petróleo y gas para registrar las propiedades de la roca y del fluido para encontrar zonas de hidrocarburos en las formaciones geológicas dentro de la corteza terrestre. El sondeo se puede realizar para medir el efecto de llevar a la práctica los métodos de esta invención, por ejemplo, bombear fluidos que comprenden las enzimas o mezclas de enzimas de esta invención en un pozo. Un procedimiento de sondeo puede consistir en descender una “herramienta de sondeo" sobre el extremo de un cable en un pozo petrolero (u orificio) para medir las propiedades de la roca y de los fluidos de la formación. Luego se realiza una interpretación de estas mediciones para localizar y cuantificar las zonas de profundidad potenciales que contienen petróleo y gas (hidrocarburos). Las herramientas de sondeo desarrolladas con el paso de los años miden propiedades eléctricas. acústicas, radioactivas, electromagnéticas y otras propiedades de las rocas y sus fluidos contenidos. El sondeo es usualmente realizado a medida que las herramientas de sondeo se retiran del orificio. Este dato se registra en un registro impreso llamado "sondeo de pozo” y se transmite normalmente en forma digital a las oficinas. El sondeo de pozos se realiza en diferentes intervalos durante la perforación del pozo y cuando se hace la perforación total, que podría estar en un intervalo de profundidades de 300 m hasta 8000 m (1000 pies a 25,000 pies) o más.

Además de los métodos, enzimas o mezclas de enzimas descritas aquí, los métodos, los lodos de enzimas u otros fluidos de perforación utilizados para la práctica de esta invención pueden comprender (el uso de) un lodo de perforación con base en agua que puede comprender una arcilla bentonita (gel) y en algunos aspectos, y también comprende aditivos tales como sulfato de bario (barita), carbonato de calcio (tiza) o hematita. Varios espesantes también pueden ser usados para influenciar la viscosidad del fluido, por ejemplo, lignosulfonatos, goma xantana, goma guar, glicol, carboximetilcelulosa, celulosa polianiónica (PAC), o almidón. Las enzimas o mezclas de enzimas descritas aquí, usadas para llevar a la práctica esta invención se pueden usar para modificar las propiedades de (por ejemplo, la viscosidad de) los fluidos, por ejemplo, para modificar las propiedades de los lignosulfonatos, goma xantana, goma guar, glicol, carboximetilcelulosa, celulosa políaniónica (PAC), o almidón.

Los métodos, enzimas o mezclas de enzimas descritos aquí, usados para llevar a la práctica esta invención se pueden usar para modificar las propiedades de los defloculantes, que se usan para reducir la viscosidad de lodos con base en arcilla; los polielectrolitos aniónicos, por ejemplo, acrilatos, polifosfatos, lignosulfonatos (Lig) o derivados de ácido tánico tales como Quebracho ("lodo rojo" fue el nombre para una mezcla a base de Quebracho, denominada por el color de las sales rojas de ácido tánico; se usaba comúnmente en 1940 a 1950, luego se tornó obsoleto cuando entraron en uso los lignosulfatos).

Los métodos, enzimas o mezclas de enzimas descritas aquí, usados para llevar a la práctica esta invención se pueden usar en (por ejemplo. añadir a) inyectores de agua para inyectar agua en una formación, ya sea para mantener la presión del reservorio o simplemente descartar el agua producida con un hidrocarburo (por ejemplo, porque incluso después del tratamiento, sería demasiado oleoso y demasiado salino como para ser considerado limpio para vertmiento, por ejemplo, vertimiento al agua o en una fuente de agua fresca en el caso de pozos en tierra). Por lo tanto, los métodos y composiciones (por ejemplo, mezclas de enzimas, enzimas inmovilizadas) de esta invención se usan con inyección de agua como elemento de manejo de reservorio y descarte de agua producida.

Los métodos, enzimas o mezclas de enzimas descritos aquí, usados para llevar a la práctica esta invención se pueden usar en (por ejemplo, agregarse a) productores de acuíferos, por ejemplo, como en reservorios de agua producido en forma intencional para reinyección (por ejemplo, en una perforación de pozo) para manejar presión, esto es, en efecto, mover agua del reservorio desde donde no es tan útil hasta donde es más útil. Estos pozos por lo general se usan solamente si el agua producida desde el productor de petróleo o gas es insuficiente para los fines de manejo del reservorio. Por lo tanto, en un aspecto, los métodos y composiciones (por ejemplo, mezclas de enzimas, enzimas inmovilizadas) de esta invención se usan con agua producida de acuífaro y/o agua de mar.

Composicíones de liberación retardada

La invención provee composiciones de liberación retardada o "liberación controlada" que comprende una composición deseada recubierto por un polímero de látex, por ejemplo, una pintura de látex, o equivalente. Las composiciones de liberación retardada/ liberación controlada de la invención pueden comprender cualquier composición deseada, que incluye enzimas y cualquier ingrediente activo, incluyendo moléculas pequeñas, fármacos, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, vitaminas, antibióticos, insecticidas y similares. En un aspecto, el revestimiento no se disolverá con rapidez a una temperatura relativamente baja pero se descompondrá para liberar la composición deseada (por ejemplo, enzima) a una temperatura relativamente superior.

La divulgación provee métodos para la liberación retardada/ liberación controlada de las composiciones en donde la composición es recubierta por un polímero de látex, por ejemplo, una pintura de látex, o equivalente.

Las composiciones de liberación retardada / liberación controlada y métodos de la invención pueden ser usadas para una variedad de aplicaciones médicas e industriales, por ejemplo, en un aspecto, las composiciones enzimáticas de liberación retardada / liberación controlada de la invención comprenden enzimas implicadas en fluidos de fracturamiento de goma guar en operaciones mejoradas de recuperación de petróleo. La aplicación degradante de goma guar en un campo petrolífero de la invención se facilita por un recubrimiento que no se disolverá fácilmente a baja temperatura pero se descompondrá para liberar la enzima a temperaturas superiores.

En otro aspecto, las composiciones enzimáticas de liberación retardada/ liberación controlada de la invención comprenden piensos para animales o suplementos nutricionales que comprenden, por ejemplo, enzimas, vitaminas, antibióticos y/u otros alimentos, fármaco o suplementos nutricionales. Estos compuestos activos en los piensos animales o suplementos nutricionales están protegidos de las condiciones de granulación o digestión gástrica por medio del recubrimiento sobre una composición de liberación retardada/ liberación controlada de la invención.

En un aspecto, la liberación es una liberación activada por temperatura, por ejemplo, la composición deseada (por ejemplo, enzimática) se libera a una temperatura elevada, por ejemplo, entre aproximadamente 37°C hasta aproximadamente 95°C o más, por ejemplo, 85°C, 90°C, 95°C, 98°C, 100°C o más. La velocidad de liberación puede ser controlada por el espesor o la cantidad de polímero de látex o “barrera”, aplicada a la composición deseada, por ejemplo, una pella o matriz que comprende la composición deseada. Por lo tanto, la divulgación provee pellas o matrices que tienen un rango de espesor de polímero de látex o equivalente y métodos para usarlas.

La invención provee composiciones enzimáticas de liberación retardada/ liberación controlada, por ejempo, en un aspecto, que comprende una enzima de la invención. En un aspecto, la invención provee una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención), o una composición en pellas que comprende una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención), recubierta con un polímero de látex, por ejemplo, una pintura de látex, o equivalente. En un aspecto, la divulgación provee métodos para elaborar composiciones enzimáticas de liberación retardada que comprende el recubrimiento de una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención), o una composición en pellas que comprende una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención), con un polímero de látex, por ejemplo, una pintura de látex, o equivalente. En un aspecto, la divulgación provee métodos para elaborar composiciones de liberación retardada/ liberación controlada que comprenden el revestimiento de un compuesto deseado con un polímero de látex, por ejemplo, una pintura de látex, o equivalente.

Los polímeros de látex que se usan en las composiciones de liberación retardada/ liberación controlada (por ejemplo, composiciones enzimáticas de liberación relardada/ liberación controlada) de la invención incluyen, pero no se limitan a, diferentes tipos tales como los siguientes: acrílicos; alquidicos; celulosas; indenos de cumarona; epoxidos; ésteres; hidrocarburos; maleicos; melaminas; resinas naturales; resinas oleosas; fenólicos; poliamidas; poliésteres; rosinas; siliconas; estirenos; terpenos; ureas; uretanos; vinilos; y similares. Los polímeros de látex que se usan en las composiciones de liberación retardada y métodos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, uno o más homo o copolímeros que contienen uno o más de los siguientes monómeros: (met)actilatos; acetato de vinilo; estireno; etileno; cloruro de vinilo; butadieno; cloruro de vinilideno; versatato de vinilo; propionato de vinilo; acrilato de t-butilo; acrilonitrilo; neopreno; maleatos; fumaratos; y similares, incluyendo derivados plastificados u otros derivados de los mismos.

La cantidad de polímeros de látex usados en la composición de látex de la invención no es crítica, pero puede ser cualquier cantidad después de los procedimientos bien establecidos usando polímeros de látex. En aspectos alternativos, la cantidad de polímero de látex seco es al menos de aproximadamente 1, o, de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50, o, de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 40 por ciento en peso de la composición de látex total. La composición de látex de la invención puede contener en forma opcional otros componentes tal como aquellos generalmente usados en las composiciones de látex. Estos componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: solventes tales como hidrocarburos alifáticos

o aromáticos, alcoholes, ésteres, cetonas, glicoles, éteres de glicol, nitroparafinas o similares; pigmentos; agentes de relleno, secadores; agentes de aplanamiento; plastificantes; estabilizantes; dispersantes; agentes tensoactivos; agentes de viscosidad incluyendo espesantes asociativos poliméricos, espesantes con base en polisacáridos y así sucesivamente; agentes de suspensión; agentes de control de flujo; desespumantes; agentes antidescascaramiento; y conservantes; extensores; agentes de formación de película; entrecruzadores; mejoradores de superficie; inhibidores de corrosión; y otros ingredientes útiles en las composiciones de látex. En un aspecto, se provee composiciones de látex de la invención que tienen reología y estabilidad mejoradas mediante la combinación del polímero de látex y un polisacárido con agua después de los procedimientos establecidos. Véase, por ejemplo las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.372.901 y 5.610.225.

En un aspecto, en la elaboración de una composición que comprende pellas o matrices de la invención que comprende una composición activa, (por ejemplo, una enzima de la invención, recubierta con un polímero de látex, por ejemplo, una pintura de látex, o equivalente, la composición activa (por ejemplo, enzima) se embebe en el cuerpo de la pella (en un aspecto, una mayoría o toda la composición activa (por ejemplo, enzima)) se embebe en la pella. Por lo tanto, se pueden usar compuestos químicos duros, por ejemplo, el recubrimiento de látex, que puede ser un inactivador del ingrediente activo deseado, para recubrir la superficie de la pella o matriz. La composición del recubrimiento puede ser descompuesta por agentes tales como calor, ácido, base, presión, enzimas, otros compuestos químicos y similares, para tener una liberación controlada de la actividad enzimática deseada desencadenada por la exposición al agente de degradación del recubrimiento.

En un aspecto, una composición activa, por ejemplo, una enzima (por ejemplo, una enzima de la invención, u otra enzima, por ejemplo, una manasa), se dispersa en una matriz de harina de maíz y/o almidón de maíz (por ejemplo, como una pella). Esta mezcla (por ejemplo, una pella) se desintegra en un lapso diez minutos a temperatura ambiente en agua (por ejemplo, aproximadamente a 22 °C) para liberar toda la composición activa, (100%) por ejemplo, libera toda la actividad enzimática. A temperaturas superiores, se incrementa la velocidad de liberación. Esta no es una velocidad aceptable de desintegración para muchos usos.

Sin embargo, como una composición de liberación retardada/ liberación controlada de la invención, es decir, cuando esta mezcla se recubre con un polímero de látex, por ejemplo, una pintura de látex, o equivalente, la desintegración de la mezcla (por ejemplo, una pella, una matriz) se retardada. La velocidad y el grado de liberación se pueden controlar mediante el espesor del recubrimiento (barrera) aplicado a la pella o matriz. Por ejemplo, una partícula recubierta liberará solamente 30% de la actividad después de seis horas en agua a 22°C. A 60°C, 50% de la enzima se libera en 90 minutos. A 80°C, 80% de la enzima se libera durante una hora.

En un aspecto, una o más de otras enzimas se añaden a una composición de liberación retardada/ liberación controlada de la invención, por ejemplo, que incluye amilasas, beta-galactosidasas, catalasas, Iacasas, celulasas, endoglucosidasas, endo-beta-1,4-lacasas, amiloglucosidasas, glucosidasas, glucosa isomerasas, glucosiltransferasas, Iipasas, fosfolipasas, Iipooxigenasas, beta-Iacasas, endo-beta-1,3(4)-Iacasas, cutinasas, peroxidasas, amilasas glucoamilasas,. pectinasas, reductasas, oxidasas, decarboxilasas. fenoloxidasas, Iigninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas, pectín acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectín Iiasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

Conversión de biomasa y producción de biocombustibles limpios

La invención provee enzimas y métodos para la conversión de biomasa en combustibles (por ejemplo, bioetanol, biopropanol, biobutanol, o biodiésel) y compuestos químicos. Por lo tanto, las composiciones y métodos de la invención proveen alternativas efectivas y sostenibles para el uso de productos a base de petróleo. La invención provee organismos que expresan enzimas de la invención para la participación en ciclos químicos que implican la conversión de biomasa natural. En un aspecto, las enzimas y métodos para la conversión se usan en los ensamblajes enzimáticos para la despolimerización eficiente de polímeros de biomasa en fracciones de carbono metabolizables. Como se discutió anteriormente, la invención provee métodos para descubrir e implementar lo más efectivo de las enzimas para permitir estos nuevos procesos de "conversión de biomasa" y procesos industriales de energía alternativos.

En un aspecto, los polipéptidos de la invención se usan en procesos para convertir biomasa Ilgnocelulósica y/o de almidón en etanol. La invención también provee procesos para elaborar etanol ("bioetanol"), propanol (“biopropanol"), butanol (“biobutanol”), o combustible diesel ("biodiésel"), a partir de las composiciones que comprenden biomasa lignocelulósica y/o de almidón. El material de biomasa de Iignocelulosa y/o almidón puede ser obtenido a partir de cultivos agrícolas, como subproducto de la producción de alimentos o piensos, o como producto de desechos Iignocelulósicos, tales como residuos vegetales y residuos de papel. Los ejemplos de residuos vegetales adecuados para tratamiento con los polipéptidos de la invención incluyen tallos, hojas, cáscaras, cortezas, mazorcas y similares, asi como también madera, astillas de madera, pulpa de madera y aserrin. Los ejemplos de residuos de papel adecuados para tratamiento con los polipéptidos de la invención incluyen residuos papel de fotocopia, papel para impresión por ordenador, papel de cuadernos, papel de anotadores, papel de mecanografia y similares, asi como también diarios, revistas, cartón y materiales de embalaje basados en papel.

En un aspecto, las enzimas y métodos de la invención se pueden usar junto con medios más "tradicionales" para elaborar etanol a partir de biomasa, por ejemplo, como métodos que comprenden hidrolizar materiales lignocelulósicos aI someter el material Iignocelulósico seco en un reactor a un catalizador incluido en una solución diluida de un ácido fuerte y una sal metálica; esto puede disminuir la energia de activación o la temperatura, de hidrólisis de celulosa para obtener mayores rendimientos de azúcar; véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.660.506; 6.423.145.

Otro ejemplo de un método que incorpora el uso de las enzimas de la invención comprende catalizar la hidrólisis de polisacáridos que comprende monómeros de glucosa, tales como almidón (un polímero de monómeros de glucosa unido por enlaces 1,4-alfa o 1,6-alfa), en azúcares; esto se puede usar junto con la enzima para hidrolizar material Iignocelulósico que contiene hemicelulosa, celulosa y Iignina. En un aspecto, la biomasa se somete a una primera etapa de hidrólisis en un medio acuoso a una temperatura y una presión escogidos para efectuar la despolimerización primaria de hemicelulosa sin una despolimerización importante de celulosa a glucosa. Este etapa genera una suspensión en la cual la fase acuosa líquida contiene monosacáridos disueltos generados a partir de la despolimerización de hemicelulosa y una fase sólida que contiene celulosa y Iignina. Una segundo paso de la etapa de hidrólisis puede comprender condiciones de manera tal que al menos una parte principal de la celulosa se despolimerice, resultando dicha etapa en una fase acuosa líquida que contiene productos de despolimerización disueltos/ solubles de celulosa, que pueden ser hidrolizados con las enzimas de esta invención. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.536.325. Las enzimas de la invención pueden ser agregadas en cualquier etapa de este proceso que sirve como ejemplo.

Otro ejemplo de un método que incorpora las enzimas de la invención comprende procesar un material de biomasa que contiene Iignocelulosa por una o más etapas de hidrólisis con ácido diluido con aproximadamente 0,4% a 2% de ácido fuerte; y tratar un componente lignocelulósico sólido no reaccionado del material de biomasa hidrolizado de ácido por delignificación alcalina para producir precursores para termoplásticos biodegradables y derivados. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.409.841. Las enzimas de la invención pueden ser agregadas en cualquier etapa de este proceso que sirve como ejemplo.

Otro ejemplo de un método que incorpora el uso de las enzimas de la invención comprende prehidrolizar material lignocelulósico en un reactor de prehidrólisis; agregar un liquido ácido al material lignocelulósico sólido para formar una mezcla; calentar la mezcla a una temperatura de reacción; mantener la temperatura de reacción durante un tiempo suficiente para fraccionar el material lignocelulósico en una porción soluble que contiene al menos aproximadamentel 20% de la Iignina del material Iignocelulósico y una fracción sólida que contiene celulosa; remover una porción solubilizada de la fracción sólida cuando esté en o cerca de la temperatura de reacción, en donde la celulosa en la fracción sólida se hace más propensa a la digestión enzimática; y recuperar una porción solubilizada. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.705.369. Las enzimas de la invención pueden ser agregadas a cualquier etapa de este proceso que sirve como ejemplo.

La invención provee métodos para elaborar composiciones de combustible para motores (por ejemplo, para motores de ignición por chispa) basadas en hidrocarburos líquidos mezclados con un alcohol de grado combustible elaborado usando una enzima o un método de la invención. En un aspecto, los combustibles elaborados mediante el uso de una enzima de la invención comprenden, por ejemplo, mezclas de etanol con gas de carbón líquido o gas natural líquido. En un aspecto, un cosolvente es un 2-metiltetrahidrofurano (MTHF) derivado de biomasa. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.712.866.

Los métodos de la invención para la degradación enzimática de Iignocelulosa, por ejemplo, para la producción de etanol a partir del material lignocelulósico, también pueden comprender el uso de tratamiento ultrasónico del material de biomasa; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.333.181.

Otro ejemplo de un proceso para la elaboración de un biocombustible que comprende, por ejemplo, un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiésel, usando las enzimas de la invención comprende pretratar un material de partida que comprende una materia prima Iignocelulósica que comprende al menos hemicelulosa y celulosa. En un aspecto, el material de partida comprende papatas, soja (semilla oleaginosa), cebada, centeno, maíz, avena, trigo, remolacha o caña de azúcar o un componente o residuo o subproductos de la producción de alimentos o piensos. El material de partida (“materia prima") reacciona bajo condiciones que rompen la estructura de las fibras de la planta para efectuar al menos una hidrólisis parcial de la hemicelulosa y celulosa. Las condiciones de ruptura pueden comprender, por ejemplo, someter el material de partida a una temperatura promedio de 180°C a 270°C a pH de 0,5 a 2,5 durante un período de aproximadamente 5 segundos a 60 minutos; o, temperatura de 220°C a 270°C, a un pH de 0,5 a 2,5 durante un período de 5 segundos a 120 segundos, o equivalente. Esto genera una materia prima con mayor accesibilidad para ser digerida por una enzima, por ejemplo, una glucoamilasa, de esta invención. Patente de los Estados Unidos No. 6.090.595.

Los Ejemplos de condiciones para hidrólisis enzimática de material Iignocelulósico incluyen reacciones a temperaturas entre aproximadamente 30°C y 48°C, y/o un pH entre aproximadamente 4,0 y 6,0. Otros ejemplos de condiciones incluyen una temperatura entre aproximadamente 30°C y 60°C y un pH entre aproximadamente 4,0 y 8,0.

En un aspecto de estos procesos para generación de biocombustibles (tal como un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiésel) de la invención usando al menos una enzima de la invención, se añaden una o más de otras enzimas, por ejemplo, amilasas, beta-galactosidasas, catalasas, lacasas, celulasas, endoglucosidasas, endobeta-1,4-Iacasas. amiloglucosidasas, glucosidasas, glucosa isomerasas, glucosiltransferasas. Iipasas, fosfolipasas, Iipooxigenasas, beta-Iacasas, endo-beta-1,3(4)-Iacasas, cutinasas, peroxidasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, decarboxilasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xilolacasas, xilanasas, pectín acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, proteasas, peptidasas, proteinasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectín Iiasas, transglutaminasas, pectín metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas.

Por lo tanto, la invención provee métodos para procesar un material de biomasa que comprende Iignocelulosa que comprende poner en contacto una composición que comprende un polipéptido de la invención, en donde el material de biomasa comprende en forma opcional o se deriva de un cultivo agrícola, o es un subproducto de la producción de un alimento o un pienso, o es un producto de desecho Iignocelulósico, o es un residuo vegetal o un residuo de papel o producto residual de papel, y el polipéptido tiene actividad que comprende actividad glucoamilasa y, opcionalmente, el residuo de la planta comprende tallos, hojas, cáscaras, certezas, mazorcas, madera, astillas de madera, pulpa de madera y aserrín y, en opcionalmente, el residuo de papel comprende papel para fotocopias usado o descartado, papel para impresión por ordenador, papel de cuadernos, papel de anotadores, papel de mecanografía, diarios, revistas, cartón y materiales de embalaje basados en papel y, en opcionalmente, el procesamiento del material de biomasa genera un bioetanol. La invención provee material de biomasa que comprende un polipéptido de la invención.

La invención provee métodos para elaborar biocombustible (tal como un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiésel) que comprende poner en contacto una composición que comprende un azúcar fermentable con un polipéptido de la invención, en donde, opcionalmente, la composición que comprende un azúcar fermentable comprende una planta, producto vegetal o derivado vegetal y, opcionalmente, la planta o producto vegetal comprende plantas o productos vegetales de caña de azúcar, remolacha o remolacha azucarera, trigo, maíz, soja, patata, arroz o cebada, y el polipéptido tiene actividad que comprende actividad glucoamilasa.

La invención provee métodos para elaborar un combustible (tal como un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiésel) que comprende poner en contacto una composición que comprende un azúcar fermentable con un polipéptido de la invención, en donde, opcionalmente, la composición que comprende un azúcar fermentable comprende una planta, producto vegetal o derivado vegetal y, en forma opcional, la planta o producto vegetal comprende plantas o productos vegetales de caña de azúcar, remolacha o remolacha azucarera, trigo, maíz, soja, patata, arroz o cebada y y el polipéptido tiene actividad que comprende actividad glucoamilasa y, opcionalmente, el combustible comprende un bioetanol o una mezcla de gasolina-etanol. La invención provee combustibles que comprenden un polipéptido de la invención en donde y el polipéptido tiene actividad que comprende actividad glucoamilasa, en donde, opcionalmente, el combustible deriva de un material vegetal que, opcionalmente, comprende patata, soja (semilla oleaginosa), cebada, centeno, maíz, avena, trigo, remolacha o caña de azúcar y, opcionalmente, el combustible comprende un bioetanol, biopropanol, biobutanol, biodiésel y/o una mezcla de gasolina-etanol.

En otro aspecto, el material vegetal que comprende la enzima como se describe aquí se puede usar en un proceso industrial para producir combustible o energía. Las enzimas expresadas en las plantas se pueden agregar a, mezclar en o asperjar sobre la materia prima. En forma alternativa, las enzimas podrían ser expresadas directamente en la materia prima. En una forma de realización, el material vegetal que expresa las enzimas podría ser triturado, molido, calentado, etc., a fin de romper la integridad física de las células u órganos vegetales que contienen la enzima, liberando de este modo la enzima que entra en contacto con el sustrato. Los ejemplos de fuentes de material vegetal incluyen, perono se limitan a, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, cebada, arroz, coníferas, pastos, por ejemplo, pasto varilla y Miscanthus, cultivos de leguminosas, por ejemplo, guisante, frijol y soja, raíz/tubérculo almidonoso, por ejemplo, patata, batata, mandioca, taro, canna, y remolacha azucarera y similares.

La invención provee polipéptidos, que incluyen glucoamilasas de la invención y métodos para la conversión de una biomasa o cualquier material lignocelulósico (por ejemplo, cualquier composición que comprende celulosa, hemicelulosa y Iignina), en un combustible (por ejemplo, bioetanol, biopropanol, biobutanol, biopropanol, biometanol, biodiésel), además de piensos, alimentos y compuestos químicos. Por ejemplo, en un aspecto, una enzima de la divulgación tiene actividad de ß-glucosidasa para liberar D-glucosa a partir de dímeros de celobiosa. En un aspecto, las enzimas tienen actividad exo o endo-beta-glucanasa.

Por lo tanto, las composiciones y métodos de la invención proveen alternativas o adjuntos efectivos y sostenibles para el uso de productos basados en petróleo, por ejemplo, como una mezcla de un biocombustible tal como biometanol, bioetanol, biopropanol, biobutanol y similares, como combustible diésel, gasolina, querosén y similares. La invención provee organismos que expresan las enzimas de la invención para participación en ciclos químicos que implican conversión de biomasa natural. En un aspecto, las enzimas y métodos para la conversión se usan en ensamblajes enzimáticos para la despolimerización eficiente de polisacáridos, polímeros celulósicos y/o hemicelulósicos hasta fracciones de carbono metabolizables (por ejemplo, fermentables). La invención provee métodos para descubrir e implementar lo más efectivo de las enzimas para permitir estos nuevos procesos de "conversión de biomasa" y procesos industriales de energía alternativos.

Las composiciones y métodos de la invención se pueden usar para proveer alternativas o adjuntos efectivos y sostenibles para uso de productos basados en petróleo, por ejemplo, como una mezcla de bioetanol, biopropanol, biobutanol, biopropanol, biometanol y/o biodiésel y gasolina. La invención provee organismos que expresan enzimas de la invención para participación en ciclos quimicos que implican conversión de biomasa natural. La invención provee métodos para descubrir e implementar lo más efectivo de las enzimas para permitir estos nuevos e importantes procesos de “conversión de biomasa" y procesos industriales de energía alternativos.

La invención provee métodos, enzimas y mezclas de enzimas o "cócteles" de la invención, para procesar un material, por ejemplo un material de biomasa, que comprende un celooligosacárido, un oligómero de arabinoxilano, una Iignina, una lignocelulosa, un xilano, un glucano, una celulosa y/o un azúcar fermentable que comprende poner en contacto la composición con un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, en donde, en forma opcional, el material se deriva de un cultivo agrícola (por ejemplo, trigo, cebada, patatas, pasto varilla, madera de álamo), es un subproducto de la producción de un alimento o un pienso, es un producto de desecho Iignocelulósico, o es un residuo vegetal o un residuo de papel o producto residual de papel y, en forma opcional, el residuo vegetal comprende tallos, hojas, cáscaras, cortezas, maíz o mazorcas de maíz, maíz de forraje, fibra de maíz, heno, rastrojo (por ejemplo rastrojo de arroz o rastrojo de trigo), bagazo de la caña de azúcar, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítrico y cáscaras de cítricos, madera, aclarados de madera, astillas de madera, pulpa de madera, desechos de pulpa, desechos de madera, virutas de madera y aserrín, desechos de construcción y/o demolición y escombros (por ejemplo madera, virutas de madera y aserrín) y, en forma opcional, el residuo de papel comprende papel para fotocopias usado o descartado, papel para impresión por ordenador, papel de cuadernos, papel de anotadores, papel de mecanografía, diarios, revistas, cartón y materiales de embalaje basados en papel y materiales de papel reciclado. Asimismo, se pueden usar los desechos urbanos, por ejemplo la fracción de papel de desecho sólido municipal, desecho de madera municipal y desecho orgánico municipal, junto con otros materiales que contienen azúcar, almidón, y/o celulosa. En forma opcional, el procesamiento del material, por ejemplo el material de biomasa, genera un bioalcohol, por ejemplo, un bioetanol, biometanol, biobutanol o biopropanol.

En forma alternativa, el polipéptido de la invención puede ser expresado en el material vegetal de biomasa o materia prima en sí misma.

Los métodos de la invención también incluyen tomar el material lignocelulósico convertido (procesado por las enzimas de la invención) y convertirlo en un combustible (por ejemplo un bioalcohol, por ejemplo, un bioetanol, biometanol, biobutanol o biopropanol, o biodiésel) por fermentación y/o por síntesis química. En un aspecto, los azúcares producidos se fermentan y/o los productos no fermentables se gasifican.

Los métodos de la invención también incluyen convertir algas, aceites vegetales vírgenes, aceites vegetales de desecho, grasas animales y grasas (por ejemplo cebo, manteca de cerdo y grasa amarilla), o aguas residuales, usando enzimas de la invención y convirtiéndolos en combustible (por ejemplo un bioalcohol, por ejemplo, un bioetanol, biometanol, biobutanol o biopropanol, o biodiésel) por fermentación y/o por síntesis química o conversión.

Las enzimas de la invención (incluyendo, por ejemplo, organismos, tales como microorganismos, por ejemplo, levadura o bacterias, que elboran y, en algunos aspectos, secretan enzimas recombinantes de la invención) se pueden usar en o incluir/ integrar en cualquier etapa de cualquier proceso de conversión de biomasa, por ejemplo, en cualquier etapa, o diferentes etapas o incluir en todos las etapas, o todos los siguientes métodos de procesos de conversión de biomasa, o todas estas alternativas de biocombustible:

Combustión directa: la incineración de material por calor directo y es la tecnología de biomasa más simple; puede ser muy económica si la fuente de biomasa está cerca.

Pirólisis: es la degradación térmica de biomasa por calor en ausencia de oxigeno. En un aspecto, la biomasa se calienta a una temperatura entre aproximadamente 800 y 1400 grados Fahrenheit, pero no se introduce oxígeno para sustentar la combustión lo que resulta en la creación de gas, aceite combustible y carbón vegetal.

Gasificación: la biomasa se puede usar para producir metano a través de calentamiento o digestión anaeróbica. El Sintegas, una mezcla de monóxido de carbono e hidrógeno, se puede derivar de la biomasa.

Gas de basurero: se genera por la descomposición (digestión anaeróbica) de basura incinerada en los basureros. Cuando los residuos orgánicos se descomponen, generan gas que consiste de aproximadamente 50% de metano, el principal componente del gas natural.

Digestión anaeróbica: convierte la materia orgánica en una mezcla de metano, el componente principal del gas natural y dióxido de carbono. En un aspecto, la biomasa tal como agua residual (aguas de albañal), estiércol, o desechos del procesamiento de alimentos, se mezcla con agua y se alimenta en un tanque de digestión sin aire.

Fermentación

Fermentación de alcohol: el alcohol combustible es producido al convertir masa celulósica y/o almidón en azúcar, fermentación del azúcar en alcohol, luego separar la mezcla de agua y alcohol por destilación. Las materias primas tales como cultivos dedicados (por ejemplo, trigo, cebada, patata, pasto varilla, madera de álamo), residuos y desechos agrícolas (por ejemplo rastrojo de arroz, forraje de maíz, rastrojo de trigo, bagazo de la caña de azúcar, cáscaras de arroz, fibra de maíz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítrico y cáscaras de cítrico), desechos forestales (por ejemplo aclarados de madera dura y madera blanda, residuos de madera dura y madera blanda de las operaciones de madereras, virutas de madera y aserrín), desechos urbanos (por ejemplo fracción de papeles de desecho sólido municipal, residuos de madera municipales, residuos orgánicos municipales), desechos de madera (por ejemplo, desechos de aserrin, desechos del molido de pulpa, desechos de construcción, desechos de demolición, virutas de madera y aserrín) y residuos de papel u otros materiales que contienen azúcar, almidón, y/o celulosa se pueden convertir en azúcares y luego en alcohol por fermentación con levadura. En forma alternativa, los materiales que contienen azúcares se pueden convertir directamente en alcohol por fermentación.

Transesterificación: Una ejemplo de reacción para convertir aceite en biodiésel se denomina transesterificación. El proceso de transesterificación hace reaccionar un alcohol (como metanol) con los aceites triglicéridos contenidos en aceites vegetales, grasas animales o grasas recicladas, formando alquil ésteres de ácido graso (biodiésel) y glicerina. La reacción requiere calor y un catalizador básico fuerte, tal como hidróxido de sodio o hidróxido de potasio.

Biodiesel: el biodiésel es una mezcla de alquil ésteres de ácido graso elaborados a partir de aceites vegetales, grasas animales o grasas recicladas. El biodiésel se puede usar como un combustible para vehículos en su forma pura, pero por lo general se usa como un aditivo del diésel petróleo para reducir los niveles de partículas, monóxido de carbono, hidrocarburos y los tóxicos del aire de los vehículos que funcionan con diésel.

Hidrólisis: incluye hidrólisis de un compuesto, por ejemplo, una biomasa, tal como un material Iignocelulósico, catalizado usando una enzima de la presente invención.

Cogeneración: es la producción simultánea de más de una forma de energía utilizando un solo combustible y una sola instalación. En un aspecto, la cogeneración de biomasa tiene crecimiento más potencial que la generación de biomasa sola porque la cogeneración produce tanto calor como electricidad.

En un aspecto, los polipéptidos de la invención tienen actividad enzimática (actividad de glucoamilasa) para generar un combustible (por ejemplo un bioalcohol, por ejemplo, un bioetanol, biometanol, biobutanol o biopropanol, o biodiésel) a partir de un material orgánico, por ejemplo, una biomasa, tal como composiciones derivadas de plantas y animales, incluyendo cualquier cultivo agrícola u otra materia prima renovable, un residuo agrícola o un desecho animal, los componentes orgánicos de los residuos municipales e industriales, o residuos o escombros de construcción o demolición, o microorganismos tales como algas o levaduras.

En un aspecto, los polipéptidos de la invención se usan en procesos para convertir biomasa Iignocelulósica en un combustible (por ejemplo un bioalcohol, por ejemplo, un bioetanol, biometanol, biobutanol o biopropanol, o biodiésel) o, bien se usan en procesos para hidrolizar o digerir biomateriales de manera tal que se pueden usar como un combustible (por ejemplo un bioalcohol, por ejemplo, un bioetanol, biometanol, biobutanol o biopropanol, o biodiesel), o para hacer más fácil que la biomasa sea procesada en un combustible.

En un aspecto alternativo, los polipéptidos de la invención, incluyendo la mezcla de enzimas o "cócteles" de la invención, se usan en procesos para un proceso de transesterificación que hace reaccionar un alcohol (como etanol, propanol, butanol, propanol, metanol) con un aceite triglicérido contenido en un aceite vegetal, grasa animal o grasas recicladas, formando alquil ésteres de ácido graso (biodiésel) y glicerina. En un aspecto, el biodiésel se elabora a partir de aceite de soja o aceites de cocina reciclados. Las grasas de animales, otros aceites vegetales y otros aceites reciclados también se pueden usar para producir biodiesel, dependiendo de sus costos y disponibilidad. En otro aspecto, las mezclas de todas las clases de grasas y aceites se usan para producir un combustible biodiésel de la invención.

Las enzimas de la invención, incluyendo la mezcla de enzimas o "cócteles" de la invención, también se pueden usar en el refinamiento de glicerina. El subproducto de glicerina contiene un catalizador no reaccionado y jabones que se neutralizan con un ácido. El agua y alcohol se remueven para producir 50% a 80% de glicerina cruda. Los contaminante restantes incluyen grasas y aceites no reaccionados, que pueden ser procesos usando los polipéptidos de la invención. En grandes plantas de biodiésel de la invención, la glicerina puede ser purificada en forma adicional, por ejemplo, hasta un 99% o más de pureza, para las industrias cosméticas y farmacéuticas.

Los combustibles (que incluyen bioalcoholes tales como bioetanoles, biometanoles, biobutanoles o biopropanoles, o biodiéseles) elaborados usando los polipéptidos de la invención, que incluyen la mezcla de enzimas o “cócteles” de la invención, se pueden usar con oxigenatos combustibles para mejorar las características de combustión. Agregar oxígeno genera combustión más completa, que reduce emisiones de monóxido de carbono. Este es otro beneficio ambiental de reemplazar combustibles de petróleo con biocombustibles (por ejemplo, un combustible de la invención). Un biocombustible elaborado usando las composiciones y/o métodos de esta invención se pueden combinar con gasolina para formar una mezcla E10 (aproximadamente 5% a 10% de etanol y aproximadamente 90% a 95% de gasolina), pero se pueden usar en concentraciones superiores tal como E85 o en su forma pura. Un biocombustible elaborado usando las composiciones y/o métodos de esta invención se puede mezclar con diésel de petróleo para formar una mezcla B20 (20% de biodiésel y 80% de diésel de petróleo), si bien los niveles de la mezcla se pueden usar hasta B100 (biodiésel puro).

La invención también provee procesos para elaborar biocombustibles (incluyendo bioalcoholes tales como bioetanoles, biometanoles, biobutanoles o biopropanoles, o biodiéseles) a partir de las composiciones que comprenden biomasa lignocelulósica. El material de biomasa de lignocelulosa puede ser obtenido a partir de cultivos agrícolas, como un subproducto de la producción de alimentos o piensos, o como productos de desechos lignocelulósicos, tales como residuos vegetales, residuos de papel o residuos o escombros de construcción y/o demolición. Los ejemplos de fuentes vegetales o residuos vegetales adecuados para tratamiento con los polipéptidos de la invención incluyen algas marinas, algas, granos, semillas, tallos, hojas, cáscaras, cortezas, mazorcas de maíz, forraje de maíz, rastrojo, pastos (por ejemplo, pasto de la India, tal como Sorghastrum nutans; o, pasto varilla, por ejemplo, Panicum species, tales como Panicum virgatum) y similares, asi como también madera, astillas de madera, pulpa de madera y aserrin. Los ejemplos de residuos de papel adecuados para tratamiento con los polipéptidos de la invención incluyen papel de fotocopia desechado, papel para impresión por ordenador, papel de cuadernos, papel de anotadores, papel de mecanografia y similares, así como también diarios, revistas, cartón y materiales de embalaje basados en papel. Los ejemplos de residuos y escombros de construcción y demolición incluyen madera, trozos de madera, virutas de madera y aserrin.

En una forma de realización, las enzimas, que incluyen la mezcla de enzimas o “cócteles” de la invención y métodos de la invención se pueden usar junto con medios más "tradicionales" para elaborar etanol, metanol, propanol, butanol, propanol y/o diésel a partir de la biomasa, por ejemplo, como métodos que comprenden hidrolizar materiales Iignocelulósicos al someter material lignocelulósico seco en un reactor a un catalizador que comprende por una solución diluida de un ácido fuerte y una sal metálica; esto puede disminuir la energía de activación, o la temperatura, de hidrólisis de celulosa para obtener mayores rendimientos de azúcar; véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.660.506 y 6.423.145.

Otro ejemplo de un método que incorpora el uso de enzimas de la invención, incluyendo las mezclas de enzimas o "cócteles" de la invención, comprende hidrolizar material lignocelulósico que contiene hemicelulosa, celulosa y lignina, o cualquier otro polisacárido que puede ser hidrolizado por una enzima de esta invención, al someter el material a un primer paso de la etapa de hidrólisis en un medio acuoso a una temperatura y una presión elegida para efectuar la despolimerización primaria de la hemicelulosa sin una despolimerización importante de celulosa en glucosa. Este etapa resulta en una suspensión en la cual la fase acuosa líquida contiene monosacaridos disueltos resultantes de la despolimerización de la hemicelulosa y una fase sólida que contiene celulosa y lignina. Un segundo paso de la etapa de hidrólisis puede comprender condiciones de tal manera queal menos una porción importante de la celulosa se despolimeriza, dicho etapa resultando en una fase acuosa líquida que contiene productos de despolimerización disueltos/solubles de celulosa. Véase, por ejemplo. la patente de los Estados Unidos No.

5.536.325. Las enzimas de la invención (que incluyen las mezclas o “cócteles” de enzimas de la invención) se pueden agregar en cualquier etapa de este proceso que sirve como ejemplo.

Otro ejemplo de un método que incorpora el uso de las enzimas de la invención, incluyendo la mezcla de enzimas o “cócteles” de la invención, comprende procesar un material de biomasa que contiene lignocelulosa por una o más etapas de hidrólisis con ácido diluido con aproximadamente 0,4% a 2% de ácido fuerte; y tratar un componente Iignocelulósico sólido no reaccionado del material de biomasa hidrolizado con ácido por delignificación alcalina para producir precursores para termoplásticos biodegradables y derivados. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.409.841. Las enzimas de la invención se pueden agregar en cualquier etapa de este proceso que sirve como ejemplo.

Otro ejemplo de unmétodo que incorpora el uso de enzimas de la invención, incluyendo la mezcla de enzimas o “cócteles” de la invención, comprende prehidrolizar material Iignocelulósico en un reactor de prehidrólisis; añadir un líquido ácido al material Iignocelulósico sólido para formar una mezcla; calentar la mezcla a temperatura de reacción; mantener la temperatura de reacción durante tiempo suficiente para fraccionar el material Iignocelulósico en una porción solubilizada que contiene al menos aproximadamente 20% de la Iignina del material Iignocelulósico y una fracción sólida que contiene celulosa; remover una porción solubilizada de la fracción sólida mientras esté en o cerca de la temperatura de reacción en donde la celulosa en la fracción sólida se torna más propensa a digestión enzimática; y recuperar una porción solubilizada. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No.

5.705.369. Las enzimas de la invención pueden ser agregadas en cualquier etapa de este proceso que sirve como ejemplo.

La invención provee métodos para elaborar composiciones de combustible para motores (por ejemplo, para motores de ignición por chispa) basadas en hidrocarburos líquidos mezclados con un alcohol de grado combustible elaborado usando una enzima o un método de la invención. En un aspecto, los combustibles elaborados por el uso de una enzima de la invención comprenden, por ejemplo, mezclas de etanol con gas de carbón líquido o gas natural líquido. En un aspecto, un cosolvente es un 2-metiltetrahidrofurano (MTHF) derivado de biomasa. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.712.866

En un aspecto, los métodos de la invención para la degradación enzimática de Iignocelulosa, por ejemplo, para la producción de biocombustibles (incluyendo bioalcoholes tales como bioetanoles, biometanoles, biobutanoles o biopropanoles, o biodiéseles) a partir de material lignocelulósico, también pueden comprender el uso de tratamiento ultrasónico del material de biomasa; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.333.181.

En otro aspecto, los métodos de la invención para producir biocombustibles (incluyendo bioalcoholes tales como bioetanoles, biometanoles, biobutanoles o biopropanoles, o biodiéseles) a partir de un sustrato celulósico comprende proveer una mezcla de reacción en la forma de una suspensión que comprende sustrato celulósico, una enzima de esta invención y un agente de fermentación (por ejemplo, en un recipiente de reacción, tal como un bioreactor de alimentación de sólidos semicontinua), y la mezcla de reacción se hace reaccionar bajo condiciones suficientes para iniciar y mantener una reacción de fermentación (como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20060014260). En un aspecto, los cálculos experimentales o teóricos pueden determinar una frecuencia de alimentación óptima. En un aspecto, las cantidades adicionales del sustrato celulósico y la enzima se provee en el recipiente de reacción a un intervalo(s) de acuerdo con la frecuencia de alimentación optimizada.

Un un ejemplo de un proceso para elaboración de biocombustibles (incluyendo bioalcoholes tales como bioetanoles, biometanoles, biobutanoles o biopropanoles, o biodiéseles) de la invención se describe en las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. 20050069998; 20020164730; y en un aspecto comprende las etapas de triturar la biomasa lignocelulósica (por ejemplo, a un tamaño de 15 -30 mm), someter el producto obtenido a pretratamiento por explosión de vapor (por ejemplo, a una temperatura de 190 -230°C) entre 1 y 10 minutos en un reactor; recolectar el material pretratado en un ciclón o producto de fabricación relacionado; y separar las fracciones líquidas y sólidas por filtración en un filtro prensa, introduciendo la fracción sólida en un depósito de fermentación y agregando una o más enzimas de la invención por ejemplo, enzima aglucoamilasa (por ejemplo, disueltas en regulador de citrato, pH 4,8).

Otro ejemplo de un proceso para elaborar biocombustibles (incluyendo bioalcoholes tales como bioetanoles, biometanoles, biobutanoles o biopropanoles, o, biodiéseles) de la invención que comprende bioetanoles. biometanoles, biobutanoles o biopropanoles usando enzimas de la invención comprende pretratar un material de partida que comprende una materia prima lignocelulósica que comprende al menos hemicelulosa y celulosa. En un aspecto, el material de partida comprende patata, soja (semilla oleaginosa), cebada, centeno, maíz, avena, trigo, remolacha o caña de azúcar o un componente o desecho o subproducto de la producción de alimentos o piensos. El material de partida (“materia prima") se hace reaccionar a condiciones que rompen la estructura de las fibras de la planta para efectuar al menos una hidrólisis parcial de la hemicelulosa y celulosa. Las condiciones de ruptura pueden comprender, por ejemplo, someter el material de partida a una temperatura promedio de 180°C a 270°C a pH de 0,5 a 2,5 durante un período de aproximadamente 5 segundos a 60 minutos; o, temperatura de 220°C a 270 °C, a pH de 0,5 a 2,5 durante un periodo de 5 segundos a 120 segundos, o equivalente. Esto genera una materia prima con mayor accesibilidad para ser digerida por una enzima, por ejemplo, una enzima celulasa de la invención. Patente de los Estados Unidos No. 6.090.595.

Las los ejemplos de condiciones para usar las enzimas de la invención en la hidrólisis de material Iignocelulósico incluyen reacciones a temperaturas entre aproximadamente 30°C y 48°C, y/o un pH entre aproximadamente 4,0 y 6,0. Otros ejemplos de condiciones incluyen una temperatura entre aproximadamente 30°C y 60°C y un pH entre aproximadamente 4,0 y 8,0.

Las glucoamilasas de la invención se pueden usar en la conversión de biomasa en combustibles y en la producción de etanol, por ejemplo, como se describe en las solicitud de patente PCT Nos. WO0043496 y WO8100857. Las glucoamilasas de la invención se pueden usar para producir azúcares fermentables y biomasa que contiene glucano que puede ser convertidos en etanol de combustible.

Composiciones farmacéuticas, desinfectantes y suplementos dietarios.

La invención también provee composiciones farmacéuticas, desinfectantes y suplementos dietarios (por ejemplo, auxiliares dietarios) que comprenden enzimas de la invención (por ejemplo, enzimas que tienen actividad glucoamilasa). En un aspecto, las composiciones farmacéuticas y suplementos dietarios (por ejemplo, auxiliares dietarios) son formuladas para ingestión oral, por ejemplo, para mejorar la digestibilidad de alimentos pienso que tengan un alto contenido de almidón, celulosa o un componente Iignocelulósico.

Los compuestos de tratamientos periodontal pueden comprender una enzima de la invención, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6.776.979. Las composiciones y métodos para el tratamiento o la profilaxis del síndrome de intestino ácido pueden comprender una enzima de la invención, por ejemplo, como se describe enla patente de los Estados Unidos No. 6.468.964.

En otro aspecto, los vendajes para heridas, implantes y similares comprenden enzimas antimicrobianas (por ejemplo, que actúan como antibióticos), que incluyen una enzima de la invención. Las enzimas de la invención también se pueden usar en vendajes de alginato, vendajes de barrera antimicrobiana, vendajes para quemaduras, vendas de compresión, herramientas de diagnóstico, vendajes en gel, vendajes hidroselectivos, vendajes hidrocelulares (espuma), vendajes hidrocoloides, vendajes l.V, cubiertas para incisiones, vendajes de baja adherencia, vendajes de absorción de olores. vendas en suspensión, vendajes postoperatorios, control de cicatrices, cuidados de la piel, vendajes de película transparente y/o torniquete de heridas. Las enzimas de la invención se pueden usar en limpieza de heridas, preparación de la superficie de la herida, para tratar úlceras de presión, úlceras en piernas, quemaduras, úlceras de pies diabéticos, cicatrices, fijación lV, heridas quirúrgicas y heridas menores. Las enzimas de la invención se pueden usar en composiciones estériles de desbridamiento enzimático, por ejemplo, ungüentos. En varios aspectos, la celulasa es formulada como una tableta, gel, píldora, implante, líquido, atomizador, polvo, alimento, pellas de piensos o como una formulación encapsulada.

Aplicaciones de biodefensa

En otros aspectos, las enzimas de la invención, por ejemplo, glucoamilasas, se pueden usar en biodefensa, por ejemplo, destrucción de esporas o bacterias. El uso de las enzimas de la invención en aplicaciones de biodefensa ofrecen un beneficio significativo, ya que pueden ser desarrolladas muy rápidamente contra cualquier agente biológico potencialmente nocivo actualmente desconocido o del futuro. Asimismo, las enzimas de la invención se pueden usar para la descontaminación de los ambientes afectados. En un aspecto, la invención provee un agente de biodefensa o biodesintoxicante que comprende un polipéptido de la invención que tiene actividad de glucoamilasa.

La invención se describirá además con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a dichos ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación y caracterización de α-amilasas termoestables

Se pueden llevar a cabo programas de cribado bajo condiciones de pH bajo y neutro. Los análisis bioinformáticos y de secuencia de ADN pueden clasificar las amilasas.

Estudios bioquímicos

El análisis bioquímico de clones genómicos de amilasa se puede usar para determinar si cualquiera tiene un pH óptimo menor a pH 6. Los lisados de estos clones genómicos pueden ser evaluados en cuanto a la tolerancia térmica por incubación a 70°C, 80°C, 90°C o 100°C durante 10 minutos y la medición de actividad residual a un pH de 4,5. Aquellos clones que retienen > 50% de actividad después del tratamiento térmico a 80°C son elegidos para análisis adicional. Estos clones se pueden incubar a 90°C durante 10 minutos a un pH de 6,0 y 4,5 y se analizan su actividad residual a un pH de 4,5. La actividad térmica de los clones con actividad residual después del tratamiento térmico a 90°C a pH 4,5 se puede medir a temperatura ambiente, 70°C y 90°C a pH 4,5.

En un aspecto, las enzimas degradantes de almidón se criban en cuanto a la actividad sobre almidón sin purificar y almidón “resistente” para cualquier forma de actividad de hidrolasa, incluyendo actividad de amilasa, pululanasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, glucoamilasa o cualquier otra actividad de glucosidasa. En un aspecto, las enzimas activas identificadas se caracterizan, por ejemplo, por actividad específica y especificidad por azúcares ramificados y/o oligosacáridos más largos.

En un aspecto, los aislados de hongos se investigan en cuanto a las enzimas novedosas usando, por ejemplo, sondas y/o procesos de descubrimiento de la divulgación, por ejemplo, cribando bibliotecas de ADNg y/o ADNc obtenidas de animales, microorganismos o insectos, por ejemplo, los contenidos de las tripas de insectos que atacan y consumen granos almacenados, incluyendo el cribado de bibliotecas ambientales para las enzimas subrepresentadas. Las combinaciones de enzimas se pueden evaluar.

En un aspecto, se realizan ensayos de estabilidad: por ejemplo, las enzimas purificadas en su propio regulador de almacenamiento, comparado con la actividad de enzima fresca, si se analiza; por ejemplo, alícuotas de 20 µl almacenadas a temperaturas inferiores, por ejemplo, entre aproximadamente 4°C a -20°C a -80°C; y en un aspecto, la actividad es analizada nuevamente en almidón granulado y soluble en forma mensual.

Las amilasas se pueden evaluar bajo una variedad de condiciones. En los siguientes protocolos se puede usar maíz dentado amarillo N°2 como una fuente de almidón.

Ejemplo de un ensayo de Iicuefacción

Una suspensión de almidón que comprende 35% de sólidos secos ("DS”) se somete a Iicuefacción primaria durante cinco minutos bajo diferentes temperaturas en el rango de 95°C a 119°C (por ejemplo, hasta aproximadamente 110°C), con una concentración enzimática de entre 0,2 a 0,8 gramo/kilogramo (g/kg) de DS de almidón, con adición de calcio en el rango de entre cero y 30 partes por millón (ppm), a un pH 4,0 a pH 5,6. La Iicuefacción secundaria comprende condiciones de 120 minutos a 95°C.

Ejemplo de ensayo de sacarificación

La sacarificación se analiza inicialmente usando 35% de sólidos secos ("DS") (suspensión de almidón) y glucoamilasa AMG 300 L (Novozymes A/S, Dinamarca) a razón de 0,225 AGU/gramo de DS (AGU= unidades de amiloglucosidasa o glucoamilasa), pH 4,3, a 60°C durante 44 horas.

En un aspecto, los ejemplos de glucoamilasas de la invención se usan en un rango de dosificación entre 0,5 a 0,7 kg / MT de DS de almidón.

La invención provee métodos para elaborar endulzantes nutritivos usando las enzimas de la invención, por ejemplo, procesos que comprenden los protocolos de Iicuefacción y sacarificación anteriormente descritos usando cualquier glucoamilasa de la invención. En un aspecto, el rango de dosificación para una enzima de la invención en estos procesos es entre aproximadamente 0,5 y 0,7 gramos por kg de DS de almidón, una temperatura de chorro (por ejemplo, usando un quemador a chorro) de aproximadamente 110°C, pH 4,5, sin adición de calcio.

Producción de etanol por molienda seca

La invención provee métodos para producción de etanol por molienda seca usando las enzimas de la invención. AI evaluar las enzimas de la invención para uso en la producción de etanol por molienda seca, particularmente, la Iicuefacción de harina de maíz molido en seco, se puede usar un reactor a escala de laboratorio con harina de maíz obtenido de una molienda seca comercial. La amilasa TERMAMYLMR SC (Novozymes A/S, Dinamarca) se puede usar como punto de referencia competitivo. En aspectos alternativos, las condiciones óptimas son 85°C, pH 5,7. Se pueden estudiar cinco variables independientes: temperatura (en un rango entre 80°C y 100°C), dosis enzimática entre 0,2 y 1,0 g/kg de almidón, pH 4,4 a 6,0, calcio en un rango entre 0 ppm a 200 ppm y una contracorriente reciclada entre aproximadamente 0% y 40%.

A 95°C, en algunas formas de realización, las glucoamilasas de la invención pueden reducir la viscosidad de una harina de maíz molida en seco más rápidamente que la amilasa TERMAMYLMR SC (Novozymes A/S, Dinamarca) en sus condiciones óptimas, inclusive a 85°C. La tasa de reducción de la viscosidad por las amilasas puede ser influenciada principalmente por la dosis y la temperatura de la enzima. Los intervalos óptimos alternativos pueden estar en el rango de 0.4 a 0,6 g/kg de almidón, con una temperatura óptima a 95°C.

En algunas formas de realización, las glucoamilasas de la invención pueden ser efectivas a un pH menor y una temperatura mayor que la de la amilasa TERMAMYLMR SC (Novozymes A/S, Dinamarca) a un pH en el rango entre pH 4,4 y pH 5,6. La adición de calcio puede tener un efecto mínimo sobre la reducción de la tasa de viscosidad a 95°C.

Las actividades de las enzimas purificadas se compararon en diferentes reguladores de almacenamiento, como se enlista a continuación, después de 1 semana de incubación a 37°C. El regulador con la menor pérdida de actividad comparada con la actividad de la misma enzima mantenida a +4°C se seleccionó como el regulador de almacenamiento de elección. Los ejemplos de las condiciones de ensayo para evaluar la actividad de amilasa, por ejemplo, para determinar si un polipéptido de la invención retiene actividad bajo condiciones particulares, incluyen (MPB: Metilparabeno):

•: 20% de Glucosa, 0,1% de MPB en PBS. pH 7,2 a 37°C

•: 20% de Glucosa, 0,1% de MPB en regulador de acetato, pH 5 a 37°C

•: 20% de Sacarosa, 0,1% de MPB en PBS, pH 7,2 a 37°C

•: 20% de Sacarosa, 0,1% de MPB en regulador de acetato, pH 5 a 37°C

•: 0,1% de MPB en PBS, pH 7,2 a 37°C

•: 0,1% de MPB en regulador de acetato, pH 5 a 37°C

•: PBS, pH 7,2 a 37°C

•: Regulador de acetato, pH 5 a 37°C

•: 20% de Glucosa, 0,1% de MPB en PBS, pH 7,2 a 4°C

•: 20% de Glucosa, 0,1% de MPB en regulador de acetato, pH 5 a 4°C

•: 20% de Sacarosa, 0.1% de MPB en PBS, pH 7,2 a 4°C

•: 20% de Sacarosa. 0,1% de MPB en Regulador de acetato, pH 5 a 4°C

•: 20% de Maltosa en PBS (fosfato de sodio 50 mM pH 7,5; NaCI 100 mM)

•: 0,1% de MPB en PBS, pH 7,2 a 4°C

•: 0,1% de MPB en regulador de acetato, pH 5 a 4°C

•: PBS, pH 7,2 a 4°C

•: Regulador de acetato, pH 5 a 4°C

Los ejemplos de enzimas que han sido analizadas bajo estos ejemplos de condiciones de ensayo incluyen: la SEQ ID NO: 26; EQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 76; SEQ lD NO: 52; SEQ ID NO: 70; SEQ ID No: 66. Para la SEQ ID NO: 26 y SEQ lD NO: 4, se seleccionó 20% de sacarosa en 1X PBS, pH 7 con 0,1% de metil parabeno (SMP*) y para la SEQ ID NO: 18, se seleccionó 20% de sacarosa en acetato de sodio 50 mM con cloruro de sodio 150 mM y 0,1% de metil parabeno (SMA**). La Figura 13 ilustra una comparación de la velocidad inicial (usando Vmax) del ejemplo de la enzima de la SEQ ID NO: 70 en diferentes reguladores de almacenamiento (como se indica en la figura); 0,15 µg de proteína total por reacción; la Figura 14 ilustra una comparación de la velocidad inicial (usando Vmax) del ejemplo de la enzima de la SEQ ID No: 76 en diferentes reguladores de almacenamiento (como se indica en la figura); 0,5 µg de proteína total por reacción; la Figura 15 ilustra una comparación de la velocidad inicial (usando Vmax) del ejemplo de la enzima de la SEQ ID No: 4 en diferentes reguladores de almacenamiento (como se indica enla Figura); la Figura 16 ilustra una comparación de velocidad inicial (usando Vmax) del ejemplo de la enzima de la SEQ lD NO: 66 en diferentes reguladores de almacenamiento (como se indica enla figura); 0,03 µg de proteína total por reacción; la Figura 17 ilustra una comparación de velocidad inicial (usando Vmax) del ejemplo de la enzima de la SEQ lD NO: 52 en diferentes reguladores de almacenamiento (como se indica en la figura); 0,025 µg de proteína total por reacción; la Figura 18 ilustra una comparación de velocidad inicial (usando nmoles de glucosa por min por µg de enzima) del ejemplo de la enzima de ejemplo SEO ID No: 28 en diferentes tampones de almacenamiento (como se indica en la figura); la Figura 19 ilustra una comparación de velocidad inicial (usando nmoles de glucosa por min por µg de enzima) de la enzima de la SEQ ID NO: 26 en diferentes reguladores de almacenamiento (como se indica enla figura); la Figura 20 ilustra una comparación de velocidad inicial (usando nmoles de glucosa por min por µg de enzima) del ejemplo de la enzima de la SEQ lD NO: 18 en diferentes reguladores de almacenamiento (como se indica enla figura).

Los ensayos Bradford y BCA así como también SDS PAGE y Absorbancia a A280 se usaron para determinar la concentración de las proteínas purificadas. La solución de amilasa estandarizada (Sigma A6211) se usó como referencia en estos ensayos y BSA. La concentración por BCA y A280 fue similar, pero no por Bradford usando BSA como estándar.

En estos ensayos, la proteína (enzima) se purificó por precipitación; interacción hidrófoba; exclusión por tamaño; intercambio de iones; afinidad; y en un protocolo de ejemplo, la proteína (enzima) se purificó por precipitación, interacción hidrófoba, intercambio iónico y en una etapa final, afinidad (cromatografía).

Las SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4 y SEQ lD NO: 26 de ejemplo se purificaron ya sea por precipitación con sulfato de amonio (SEQ ID NO: 26) o etanol (SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 4). Los sobrenadantes Iiofilizados a partir de cultivos que expresan las enzimas de interés se resuspendieron en agua a una concentración de aproximadamente 1 µg / 5ml. Las SEQ ID NO: 18 y SEQ lD NO: 4 se precipitaron por adición de etanol frío (2 volúmenes de solución de proteína). La SEQ ID NO: 26 se precipitó en 80% de solución de sulfato de amonio. Después de la precipitación, las suspensiones de proteína se dializaron una vez contra agua y posteriormente contra regulador de almacenamiento.

Los ejemplos de estabilidad de las enzimas purificadas de esta divulgación se analizaron ya sea en PBS a pH 7 o PBS a pH 7,5 (en este caso, los parámetros fueron fosfato de sodio 50 mM; NaCl100 mM) o en acetato de sodio 50 mM, a pH 5,2 con adición de NaCl 150 mM. Se añadió glucosa (20%) o sacarosa (20%) a los reguladores así como un antimicrobiano, 0,1% de metil parabeno (Sigma). Las enzimas se incubaron en sus respectivos reguladores a 37°C durante 1 semana y la actividad de la enzima se analizó y comparó con la actividad de la misma enzima almacenada a +4°C.

La concentración de cada enzima purificada se estimó usando 4 métodos diferentes: ensayo Bradford con amilasa Sigma A-6211 como estándar, ensayo BCA con Sigma A-6211 como estándar, absorbancia a 280 nm en urea 8M y medición densitométrica de proteína teñida después de SDS PAGE, usando amilasa Sigma A-6211 como referencia. Los números obtenidos con estos métodos diferentes para cada una de las proteínas purificadas se presentan en la Tabla 3.1. Para la cuantificación final, se usó la concentración obtenida al medir la absorbancia a 280 nm en urea 8M.

Un resumen de purificación a gran escala para estos ensayos es:

Resumen de la cantidad recuperada con base en el valor de absorbancia

mg/ml: Volumen (ml) Total en mg

SEQ ID NO:18: 53,94 111 5987,34

SEQ ID NO:26: 39,23 86,8 3405,164

SEQ ID NO:4: 70,01 55,4 3878,554

Resumen de pureza

Antes de purificación: Después de purificación

A260/A280: Relación de expresión A260/A280 Relación de expresión

SEQ ID NO:18: 0,52 91% 0,59 92%

SEQ ID NO:26: 0,56 85% 0,65 86%

SEQ ID NO:4: 0,67 91% 0,73 85%

Resumen de actividad

Almidon sin purificar: Soluble

Purificado: Sin purificar Purificado Sin purificar

SEQ ID NO:18: 10,7228 ± 0,7925 6,4828 ± 0,5681 40,6725 ± 1,7016 24,7354 ± 3,821

SEQ ID NO:26: 5,7837 ± 0,2271 4,0691 ± 0,2864 17,4833 ± 0,7831 14,1849 ± 0,3761

SEQ ID NO:4: 6,47 ± 0,34 4,074 ± 0,35 127,37 ± 1,78 116,52 ± 1,27

Estimación de la concentración enzimática por diferentes métodos

Bradford: BCA (A6211) Absorbancia (Urea)

SEQ ID NO: 18: 71,10 57,64 53,94

SEQ ID NO: 26: 43,98 57,64 39,29

Ejemplo 2: Amilasas termoestables activas a pH alcalino

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de método para determinar si un polipéptido es una amilasa termoestable.

Las formulaciones comerciales para lavado automático de vajillas (ADW) se pueden usar para determinar si un polipéptido es una amilasa termoestable. Los estudios pueden incluir la identificación de amilasas de pH alto; y las enzimas que tienen la habilidad para degradar almidón. Los análisis de secuencia de ADN y bioinformáticos pueden clasificar muchos de estos genes como amilasas, o tener otras especificidades enzimáticas, por ejemplo, neopululanasas, amilopululanasas y amilomaltasas.

Estudios bioquímicos

Un ejemplo de un método para determinar si un polipéptido es una amilasa termoestable, es analizar la actividad donde la enzima puede hidrolizar almidón a pH alcalino, por ejemplo, hasta un pH 10 y aproximadamente 50°C.

La proteína soluble se purifica hasta homogeneidad y se mide la actividad específica (unidades/mg, donde 1 unidad = µmol azúcares reductores/min) a pH 8 y pH 10 (40°C y 50°C) usando 2% de almidón en regulador. La actividad específica se puede determinar removiendo las muestras en diferentes momentos durante una reacción de 30 minutos y analizando los azúcares reductores. La velocidad inicial se puede determinar ajustando las curvas de progreso a una ecuación lineal.

Estudios de estabilidad

La estabilidad en presencia de la formulación ADW se puede medir mediante análisis bioquímico. El punto de referencia para estos estudios puede ser una enzima comercial en la matriz de formulación. La actividad medida después de la incubación se puede expresar como porcentaje de la actividad original.

Pruebas de lavado

Las pruebas de lavado usando portaobjetos recubiertos con almidón se pueden llevar a cabo para medir el desempeño de una enzima purificada de la divulgación comparada con una amilasa comercial. Los portaobjetos recubiertos con almidón de espagueti se pueden preparar de acuerdo con el siguiente protocolo: se colocan dos portaobjetos previamente pesados recubiertos con almidón uno sobre otro en un tubo cónico de 50 mL y se añaden 25 mL de solución ADW, +/enzima por tubo. Los tubos se incuban durante 20 minutos a 50°C con rotación suave en un carrusel vertical. Después del período de incubación, se enjuagan inmediatamente los portaobjetos en agua se secan toda la noche en horno. Todas las ensayos se realizan por duplicado y se corre la enzima comercial como control positivo. Los resultados se pueden expresar como % neto de almidón removido, por ejemplo, el % de almidón removido en ADW con enzima, menos el % de almidón removido solo en ADW.

Ejemplo 3: Optimización génica

El siguiente ejemplo describe un método que sirve de ejemplo para evaluar el desempeño de la enzima en presencia del desempeño de ADW.

Las propiedades de las enzimas pueden ser mejoradas por varias estrategias de evolución, incluyendo tecnologías de Gene Site Saturation MutagenesisMR (GSSMMR) y GeneReassemblyMR (Diversa Corporation, San Diego, CA). Tales técnicas se aplicarán a los ácidos nucleicos de amilasa de la divulgación con el fin de generar conjuntos de variantes que se pueden cribar para mejorar el desempeño. En un aspecto, las moléculas progenitoras para evolución incluyen cualquier ácido nuclelco de la divulgación, por ejemplo, secuencias que codifican las SEQ lD NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, etc.

Se puede usar un cribado de alto rendimiento (HTS) para evaluar el desempeño de la enzima en presencia del desempeño de ADW. HTS se puede automatizar y ha mostrado resultados consistentes para las amilasas progenitoras.

Ejemplo 4: Caracterización de α-amilasas gue tienen actividad a pH alcalino

El siguiente ejemplo describe métodos de ejemplo para determinar si un polipéptido tiene actividad de alfa-amilasa a pH alcalino.

Las glucoamilasas de la invención que tienen actividad a pH alcalino pueden ser caracterizadas usando cinéticas sobre 2% de almidón a un pH de 8 y 10 (40°C y 50°C). Se puede definir 1 unidad de actividad como liberación de 1 µmol de azúcares reductores por minuto.

Ejemplo 5: Ensayo de actividad de amilasa; ensayos de extremos reductores de BCA

El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para un ensayo de extremos reductores de BCA. La actividad de amilasa de los clones de interés se puede determinar usando la siguiente metodología.

1. Preparar 2 soluciones de sustrato, de la siguiente manera:

a) 2% de almidón soluble (almidón patata o de maíz granulado) solución a pH 8 por disolución de 2 g de almidón de patata en 100 ml de fosfato de sodio 100 mM, pH 8.

b) 2% de almidón soluble (patata), pH 10, disolviendo 2 g de almidón de patata en 100 mI de carbonato de sodio100 mM.

Calentar ambas soluciones en un baño de agua en ebullición, mientras se mezcla, durante 30 -40 minutos hasta que se disuelva el almidón.

2.: Preparar la Solución A de 64 mg/mL de carbonato de sodio monohidratado, 24 mg/ml de bicarbonato de sodio y 1,95 mg/ml de BCA (sal disódica de 4,4’-dicarboxi-2,2’-biquinolina (Sigma Chemical cat # D-8284)). Agregar dH2O.

3.: Preparar una Solución B por combinación de 1,24 mg/ml de sulfato cúprico pentahidratado y 1,26 mg/ml de Lserina. Añadir la mezcla a dH2O.

4.: Preparar un reactivo de trabajo en una proporción 1:1 de soluciones A y B.

5.: Preparar una solución estándar de maltosa de maltosa 10 mM en dH2O, en donde la maltosa 10 mM se combina con 2% de almidón soluble a pH deseado a una concentración final de 0, 100, 200, 300, 400, 600 µM. La curva estándar se generará para cada conjunto de puntos de tiempo. Como la curva se determina al agregar 10 µl de los estándares al reactivo de trabajo, elaborará a 0, 1, 2, 3, 4, 6 nmoles de maltosa.

6.: Tomar una alícuota de 1 ml de solución de sustrato en tubos de microcentrífuga, equilibrar a la temperatura deseada (5 min) en un bloque de calor o baño de agua caliente. Agregar 50 µl de solución enzimática al interior de la tapa del tubo.

7.: Mientras la solución se equilibra, mezclar 5 mI tanto de solución A como de solución B. Colocar una alícuota de 100 µl en una placa de PCR de 96 pozos. Colocar la placa en hielo.

8.: Después de 5 minutos de equilibrar la temperatura, cerrar la tapa de los tubos, invertir y agitar en forma de vórtice 3 veces. En forma inmediata, colocar una alícuota de 10 µl en la placa a t=0 (punto de tiempo cero). Dejar la mezcla enzimática en un bloque de calor y colocar una alícuota de 10 µl en cada punto tiempo deseado (por ejemplo 0, 5, 10,15, 20, 30 minutos).

9.: Asegurar que 12 pozos queden vacios (únicamente para ccolocar alícuotas del reativo de trabajo) para la adición de 10 µl de estándares, para la curva estándar.

10.: Cuando todos los puntos tiempo se reúnen y se añaden los estándares, cubrir la placa y calentar a 80°C durante 35 min. Enfriar la placa sobre hielo durante 10 min. Agregar 100 µl de H2O a todos los pozos. Mezclar y colocar alícuotas de 100 µl en una placa de 96 pozos de fondo plano y leer la absorbancia a 560 nm.

11.: Dejar los puntos de tiempo de cada muestra en cero contra su propio t=0 (restar el valor promedio de t=0 a A560 de los otros valores promedio de A560). Convertir el A560(experimental) a µmoles (Dividir A560(experimental) por la pendiente de la curva estándar (A560/µmoles). Generar una pendiente de los puntos de tiempo y los µmoles (en µmole/min), multiplicar por 100 (ya que el valor en µmoles solamente da cuenta de los 10 µl usados en el ensayo y no de la cantidad elaborada en el rxn de un 1ml). Para obtener la actividad específica, se divide la pendiente (en µmoles/min) por los mg de proteína. Todos los puntos deben medirse minimo por duplicado, siendo mejor por triplicado.

Dividir la concentración de proteína (mg/ml) por cualquier dilución para obtener mg ustilizados en ensayo.

Dividir la pendiente anterior por mg utilizados en el ensayo para obtener la actividad específica.

Actividad específica =24,93 µmoles/min/mg

Véase por ejemplo, Dominic W.S. Wong. Sarah B. Batt y George H. Robertson (2000) J. Agric. Food Chem. 48: 4540 -4543; Jeffrey D. Fox y John F. Robyt, (1991) Anal. Biochem. 195, 93 -96. Ejemplo 6: Cribado para la actividad de α-amilasa

La actividad de amilasa de los clones se puede evaluar por una cantidad de métodos conocidos en el arte. La siguiente es una metodología de ejemplo. El número de plaquetas cribados, por placa, puede ser de aproximadamente 10000 pfu. Para cada biblioteca de ADN: se deben cribar al menos 50000 plaquetas por biblioteca aislada y 200000 plaquetas por biblioteca no aislada dependiendo del título pfu para el Iisado amplificado λ Zap Express.

Determinación de títulos de la biblioteca Iambda

1) Se añadieron µL del patrón de la biblioteca amplificada Lambda Zap Express a 600 µL de células MRF’ de E. coli (OD600 = 1,0). Para diluir el patrón de MRF’, se usa MgSO4 10 mM.

2) Incubar a 37°C durante 15 minutos. 3) Transferir la suspensión a 5 -6mL de agar de superficie NZY a 50°C y mezclar suavemente. 4)Verter inmediatamente la solución de agar sobre una placa grande (150 mm) con medio NZY. 5) Permitir que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la

placa. 6) Incubar la placa a 39°C durante 8 -12 hora. 7) El número de plaquetas es aproximado. Se determino que el título de fago produjo 10000 pfu/placa. Diluir una

alícuota de la biblioteca fagos con regulador SM de ser necesario. Cribado del sustrato 1) Agregar Lambda Zap Express (50000 pfu) de la biblioteca amplificada a 600 µL de células MRF’ de E. coli

(OD600=1,0). Para bibliotecas no ambientales, preparar 4 tubos (50000 pfu por tubo).

2) Incubar a 37°C durante 15 minutos. 3) Mientras se incuban las suspensiones de fago/célula, se añade 1,0 mL de sustrato de almidón rojo (1,2% p/v) a

6,0 mL de agar de superficie NZY a 50°C y se mezcla completamente. Se mantiene la solución a 50°C hasta que se necesite. 4) Transferir 1/5 (10000 pfu) de la suspensión de células a la solución de sustrato/agar de superficie y mezclar

suavemente. 5) Se vierte inmediatamente la solución en una placa grande (150 mm) de medio NZY. 6) Permitir que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la

placa.

7) Repetir los procedimientos 4 -6 cuatro veces para el resto de la suspensión de células (1/5 de la suspensión cada vez). 8) Incubar las placas a 39°C durante 8 -12 horas. 9) Se observan las zonas de aclaramiento (halos) de la placa alrededor de las plaquetas. 10) Las plaquetas con halos se separan del agar y se transfieren a un micro tubo esterilizado. Una punta de pipeta

de orificio grande de 200 µL funciona bien para remover (separar) el tapón de agar que contiene la plaqueta deseada.

11) Los fagos se resuspenden 500 µl de regulador SM. Se añaden 20 µL de cloroformo para inhibir cualquier

crecimiento adicional de células. 12) Se incuba la suspensión pura de fagos a temperatura ambiente durante 4 horas o toda la noche antes de la siguiente etapa.

Aislamiento de clones puros 1) Se añaden 10uL de la suspensión de fagos resuspendida en 500 µL de células MRF’ de E. coli (OD600 = 1,0).

2) lncubar a 37°C durante 15 minutos. 3) Mientras se incuban las suspensión de fagos/células, se añade 1,0 mL de sustrato de almidón rojo (1,2% p/v) a

6,0 mL de agar de superficie NZY a 50°C y se mezcla completamente. Se mantiene la solución a 50°C hasta que se necesite. 4) Se transfiere la suspensión de células a la solución de sustrato/agar de superficie y se mezcla suavemente. 5) Se vierte inmediatamente la solución en una placa grande (150 mm) de medio NZY. 6) Permitir que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego invertir la

placa. 7) Incubar las placas a 39°C durante 8 -12 horas. 8) Se observan las zonas de aclaramiento (halo) alrededor de una sola plaqueta (clon puro). Si no se puede aislar

una sola plaqueta, se ajusta el título y se siembra en placa nuevamente la suspensión del fago 9) Las plaquetas unitarias con halo se separan del agar y se transfieren a un micro tubo esterilizado. Una punta de

pipeta de orificio grande de 200 µL funciona bien para remover (separar) el tapón de agar que contiene la plaqueta deseada. Para amplificar el título, se separan plaquetas activas individuales en un microtubo. 10) Los fagos se resuspenden en 500 µL de regulador SM. Se añaden 20 µL de cloroformo para inhibir cualquier

crecimiento adicional de células. 11) Se incuba la suspensión pura de fagos a temperatura ambiente durante 4 horas o toda la noche antes de la

siguiente etapa. Se almacena la suspensión del fago puro a -80ºC mediante la adición de DMSO en la suspensión del fago (7% v/v) Escisión de un clon puro 1) Se añaden 100 µl de la suspensión pura de fagos a 200 µl de células MRF de E. coli (OD600 = 1,0). A esta

suspensión, se le añade 1,0 µL del fago auxiliar EXASSIST (>1 x 106 pfu/mL; Stratagene). Usar tubos Falcon 2059 para la escisión. 2) Se incuba la suspensión a 37°C durante 15 minutos. 3) Se añaden 3,0 mL de medio YT 2 veces a la suspensión de células.

4) Se incuba a 30°C durante al menos 6 horas o durante la noche con agitación. 5) Se transfiere el tubo a 70°C durante 20 minutos. La suspensión de fagos se puede almacenar a 4°C durante 1 a 2 meses.

6) Se transfieren 100 µl de la suspensión del fagémido a un micro tubo que contiene 200 µL de células Exp 505 de

E. coli (OD600 = 1,0).

7) Se incuba la suspensión a 37°C durante 15 minutos. 8) Se añaden 300 µL de SOB a la suspensión. 9) Se incuba la suspensión a 37°C durante 30 a 45 minutos.

10) Se transfieren 00uL de la suspensión a una placa pequeña (90 mm) de medio LB) que contiene Kanamicina (medio LB con Kanamicina a razón de 50 µg/mL) para bibliotecas de ADN Zap Express o Ampicilina (medio LB con Kanamicina a razón de 100 µg/mL) para bibliotecas de ADN Zap Il.

11) Se transfiere el resto de la suspensión a otra placa pequeña de medio LB.

12) Se usan perlas estériles de vidrio para distribuir uniformemente la suspensión sobre la placa.

13) Se incuban as placas a 30°C durante 12 a 24 horas,

14) Se observan las colonias en las placas.

15) Se inocula una sola colonia en medio liquido LB que contiene un antibiótico adecuado e se incuba a 30°C

durante 12 a 24 horas.

16) Se puede preparar un patrón de glicerol mediante la adición de 80% de glicerol en medio de cultivo liquido (15% v/v) y se almacena a -80°C. Verificación de la actividad 1) Se transfieren 50 µL de cultivo líquido a un microtubo. Se añaden 500 µL de 8% de Amilopectina Azure pH7 en el

mismo tubo. Se preparan 2 tubos para cada clon. 2) Se analiza la actividad a 50°C durante 3 horas y durante la noche. Se utiliza regulador de pH 7 como control. 3) Se enfria el espécimen de prueba en un baño de agua helada durante 5 minutos. 4) Se añaden 750 µL de etanol y se mezcla completamente. 5) SE centrifuga a 13000 rpm (16000 g) durante 5 minutos. 6) Se mide la OD del sobrenadante a 595 nm. Análisis RFLP 1) Se transfiere un 1,0 mL de cultivo líquido a un microtubo esterilizado. 2) Se centrifugar a 13200 rpm (16000 g) durante 1 minuto. 3) Se descarta el sobrenadante. Se añade otro 1,0 mL de cultivo líquido en el mismo microtubo esterilizado. 4) Se centrifuga a 13200 rpm (16000 g) durante 1 minuto. 5) Se dscarta el sobrenadante. 6) Se sigue el protocolo del mini kit de centrifugación QIAPREPMR para el aislamiento del plásmido. 7) Se revisa la concentración de ADN usando BioPhotometer. 8) Se usa Sac I y Kpn I para la primera digestión doble. Se incuba a 37°C durante 1 hora. 9) Se usa Pst i y Xho I para la segunda digestión doble. Se incuba a 37°C durante 1 hora. 10) Se añade colorante de carga en la muestra digerida. 11) Se corre la muestra digerida en un gel de agarosa al 1,0% durante 1 -1,5 hora a 120 voltios. 12) Se observa el gel con un visualizador. Se pueden analizar las secuencias de todos los clones con un patrón

diferente de digestión. Ejemplo 7: Ensayo para amilasas

Preparación de cultivos huésped

1.: Se parte de un cultivo durante la noche de células huésped MRF’ XL1-BLUEMR. Se usa una sola colonia de una placa estriada para inocular 10 mL de LB suplementado con 20 µg/mL de tetraciclina. Se desarrolla el cultivo durante la noche agitando a 37°C durante al menos 16 horas.

2.: Usando una técnica aséptica, se inoculan 100 mL de cultivo LBTet fresco el día del cultivo con el huésped MRF’ XL1-BLUEMR a partir del cultivo LBTet durante la noche.

3.: Se cultiva en un agitador a 37°C hasta que la OD alcance 0,75 -1,0.

4.: Se sedimentan las células huésped 1000 x g durante 10 minutos y se resuspenden suavemente en MgSO4 10 mM a OD 5.

5.: Se diluye una pequeña cantidad de células huésped a OD 1 para uso en titulación y para pipetear con agujas.

6.: Se pueden usar preparaciones huésped hasta para 1 semana cuando se almacenan en hielo o a 4°C.

−Para acortar el tiempo de crecimiento para el día del cultivo, se usa la concentración Tet usual de 1/2X en LB (1/2X =10 µg/mL), o se omite también el antibiótico.

−No se utiliza el NZY cuando se selecciona con tetraciclina. La alta concentración de Mg++ en medio NZY vuelve a Tet inactivo.

Titulación de bibliotecas Iambda

7.: Se colocan tres tubos esteriles de microcentrífuga en una gradilla.

8.: Se toma una alícuota de 995 µL de células huésped preparadas en un tubo y 45 µL de células huésped preparadas a OD 1 en cada uno de los dos tubos restantes.

9.: Se añaden 5 µL de una biblioteca Iambda al tubo que contiene 995 µL de células huésped y se mezcla mediante agitación tipo vórtice. Esto da como resultado un factor de dilución de 200.

10.: Se preparan diluciones 1/2000 y 1/20000 mediante la adición consecutiva de 5 µL de una dilución previa a los dos tubos restantes que contienen 45 µL de células huésped preparadas. Se mezcla mediante agitación tipo vórtice después de hacer cada dilución.

11.: Se permite que el fago se adsorba al huésped mediante incubación a 37°C durante 15 minutos.

12.: Mientras tanto, se pipetean 100 µL de células huésped preparadas OD1 a cada uno de los tres tubos Falcon 2059.

13.: Se añaden 5 µL de cada dilución a un tubo 2059 separado que contiene células huésped.

14.: Se siembra en placa cada una mediante la adición de 3 mL de agar de superficie a cada tubo y se vierte rápidamente sobre placas de 90 mm de NZY. Se asegura una distribución plana y uniforme antes de que el agar de superficie se endurezca.

15.: Se invierten las placas y se incuba a 37°C durante la noche.

16.: Se hace recuento de la placas y se calcula el título del patrón de la biblioteca (en unidades formadores de placas (pfu) por µL).

Cribado de microtítulos lambda para amilasas Preparación

1.: Se prepara una cantidad suficiente de cultivo de huésped MRF' XL1-Blue, como se describió anteriormente, para la cantidad de cribado planificado. Un cultivo de 100 mL por Io general es suficiente para cribar 2 -3 bibliotecas.

2.: Se autoclavan varias botellas compatibles con el dispensador QFiII2. Estas son las botellas Corning de boca ancha de 250 mL que contiene un anillo sellador alrededor de la tapa.

3.: Se asegura que hayan uan cantidad suficiente de placas, agar de superficie, almidón BODIPY, solución de almidón rojo, etc., disponible para el cribado.

4.: Se programa la corrida con un robot el día 2 con un representante de Automation. Día 1

1.: Se etiquetan las placas de 1536 pozos (negras) con cribado de biblioteca y el número de placa. Los adhesivos para tubos Tough-TagsMR, cortados a la mitad, son ideales para etiquetar las placas de 1536 pozos.

2.: Se calculan los volúmenes de biblioteca, células huésped y medio NZY necesarios para el cribado. Esto se hace fácilmente con una hoja de cálculos de Excel.

3.: Se combinan los volúmenes calculados de biblioteca lambda y células huésped OD5 en una botella Corning de 250 mL de boca ancha esterilizada (que contiene un anillo sellador).

4.: Se permite que se realice la adsorción a 37°C durante 15 minutos.

5.: Se añade el volumen calculado de medio NZY y se mezcla bien. Esto se denomina como la suspensión de célulafago-medio.

6.: Se realiza un título en forma concomitante al combinar 50 µL de la suspensión de célula-fago-medio con 250 µL de células huésped OD1 en un tubo Falcon 2059, luego se siembra en placa con 9 mL de agar de superficie sobre una placa de 150 mm de NZY. Se incuba titulo concomitante de la placa a 37°C durante la noche.

7.: Se carga el dispensador con el resto de la suspensión y se arregla cada placa etiquetada de 1536 pozos con 4 µL por pozo. Si el dispensador deja burbujas de aire en algunos pozos, se pueden remover centrífugando las placas a 200 x g durante 1 minuto.

8.: Se añaden 0,5 µL de fago de control positivo a la posición del pozo AD46 de al menos dos de las placas de ensayo. Se utilizar un clon Iambda fuerte positivo para amilasa para este propósito.

9.: Se incuban las placas de ensayo a 37°C durante la noche en una incubadora humidificada (≥95%). Día 2

1.: Se recuentan las pfu la placa de título concomitante y se determina la densidad promedio de semillas por pozo (en pfu por pozo).

2.: Se pipetean con aguja al menos 2 placas de cada cribado de biblioteca (preferentemente las 2 que contienen controles positivos) de la siguiente manera:

a) Se preparan 2 placas base para que actúen como superficie sobre la cual se pueda pipetear con aguja: se combinan 250 µL de células huésped OD1 con 2 mL de almidón rojo al 2% y se se siembra en placa con 9 mL de agar de superficie sobre placas de 150 mm de NZY. Se Mantiene el nivel de cada placa en la medida de lo posible a medida que el agar de superficie se solidifica a fin de producir un tono rojo uniforme en la placa.

b) Se utiliza una pipeta con aguja en la posición 1536 esterilizada dos veces sobre llama, se replican al menos 2 de las placas de cribado sobre las placas base del huésped.

c) Se colocan las placas que fueron pipeteadas con aguja en una cabina de flujo laminar sin las tapas durante aproximadamente 15-30 minutos (para ventilar el exceso de humedad).

d) Se reemplazan las tapas y se incuba de forma invertida a 37ºC toda la noche.

3. Se prepara el regulador de sustrato de almidón 2X BODIPY de la siguiente manera:

a) Se calcula el volumen total de solución reguladora de sustrato 2X necesario para todas las placas de cribado a razón de 4 µl por pozo (incluyendo cualquier volumen extra de espacio muerto requerido por el dispensador) y se meder esta cantidad de CAPS 100 mM de pH 10,4 en un recipiente apropiado para el dispensador usado.

b) Se retiran suficientes tubos 0,5 mg de almidón BODIPY para producir el volumen requerido de regulador de sustrato 2X [calculado en la etapa a) anterior] a una concentración final de 20 -30 µg/mL.

c) Se disuelve cada tubo de 0,5 mg en 50 µL de DMSO a temperatura ambiente, protegido de la luz, agitación frecuente tipo vórtice. Esto toma más de 15 minutos; algunos lotes de producción de almidón BODIPY disuelven mejor que otros.

d) Se agregan 50 µL de regulador CAPS 100 mM de pH 10,4 a cada tubo y se mezcla mediante agitación tipo vórtice.

e) Se reúnen los contenidos de todos los tubos y se remueve cualquiera de los agregados no disueltos por centrifugación durante 1 minuto a velocidad máxima en una microcentrífuga.

f) Se agrega el sobrenadante al resto del regulador CAPS 100 mM medido en la etapa a) anterior.

g) Se protege el regulador del sustrato 2X de la luz envolviéndolo en una lámina de aluminio.

4. Se llevan las placas y el regulador de sustrato a la sala de automatización y se programa el robot con los siguientes parámetros:

a) se dispensan 4 µL de regulador de sustrato por pozo

b) Se hace la primera lectura 1 hora después del sustrato, la segunda lectura a las 9 horas y la tercera lectura a las 17 horas; con incubación a 37°C entre lecturas

c) Filtro de excitación: 485 nm; filtro de emisión: 535 nm

d) Se fija la ganancia por Spectrafluor en 70, o se prepara la ganancia óptima para el lote del regulador de sustrato 2X.

e) Se asegura que la incubadora utilizada proteja las placas de ensayo de la luz.

Día 3

1.: Se revisan las placas pipeteadas con aguja para los aclaramientos en la base bacteriana en todas las posiciones correspondientes a los pozos en la placa de ensayo asociada. También se revisan los aclaramientos en el almidón rojo en cualquiera de las posiciones de la aguja. Si las placas que contienen controles positivos se usaron para pipeteado con agujas, se debe poder observar una gran zona de aclaramiento en el fondo rojo. Se debe tener cuidado con los contaminantes que también forman zonas de aclaramiento en el almidón rojo (véase comentario "Contaminantes que forman zonas de aclaramiento en almidón rojo” al final del Ejemplo 7).

2.: Se identifican las coincidencias putativas del archivo de datos producido por ordenador del robot. El programa KANAL producido por Engineering simplifica el análisis de datos. Como regla, un acierto putativo se caracteriza como un pozo que tiene una intensidad de señal que se eleva al menos 1,5 veces por sobre el entorno.

3.: Para cada coincidencia putativa, se remueven 2 µL del pozo y se agregan a un tubo que contiene 500 µL del regulador SM y 50 µL de CHCI3. Se realiza una agitación tipo vórtice para mezclar y almacenar a 4°C. Esta solución será denominará en lo sucesivo como el patrón 4e-3. Las placas de cribado originales deben almacenarse a 4°C, protegidas de la luz, al menos hasta que se completen los desbloqueos.

Este es un ejemplo de un método de desbloquear los aciertos putativos. Es un ensayo de fase líquida que confía en la confirmación de actividad sobre el almidón BODIPY. En forma alternativa, los aciertos putativos pueden ser desarrollados directamente en placas de fase sólida que contienen almidón rojo de manera tal que 2000 -3000 pfu por acierto son examinadas para zonas de aclaramiento. Sin embargo, la incapacidad para observar zonas de aclaramiento en almidón rojo no es necesariamente un indicio de que un acierto putativo era un falso positivo. Posteriormente sería necesario evaluarlo usando el formato en el cual fue identificado originalmente (es decir, fase líquida usando almidón BODlPY como sustrato). Asimismo, los positivos más débiles son más fácilmente identificados usando el método detallado a continuación.

Día 1

1.: En un tubo cónico esterilizado de 50 mL, se combinan 0,5 mL de células huésped OD5 con 45,5 mL de NZY. Esto será denominado la suspensión huésped-medio.

2.: Para cada acierto putativo que se analiza, se toma una alícuota de 1 mL de la suspensión huésped-medio en cada uno de los 3 tubos de microcentrífuga estériles.

3.: Se fija la pipeta Pipetman de 12 canales en modo multidispensador con un tamaño de alícuota de 20 µL y un número de alícuota de 2x. Se monta la pipeta Pipetman con un conjunto limpio de puntas estériles.

4.: Se vierte aproximadamente 1 mL de suspensión huésped-medio en una nueva tina de solución estéril y se carga la pipeta Pipetman multicanal.

5.: Se dispensan 20 µL por pozo en la última fila (fila P) de una placa negra de 384 pozos (12 canales x 2 = 24 pozos). Esta fila se usa posteriormente para los controles.

6.: Se expele el líquido restante en las puntas al tocar las puntas contra la superficie de la tina y se presiona el botón RESETEAR en la pipeta Pipetman. Se deja la pipeta Pipetman hacia abajo a fin de evitar la contaminación de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este momento.

7.: Se vierte el resto del fluido en la tina en un contenedor de desechos (como un cubo) teniendo cuidado de evitar contaminación por salpicaduras.

8.: Para que se analice el primer acierto putativo, se toman 111 µL del patrón 4e-3 (véase Día 2 en Críbado de microtítulo lambda para amilasas) y se agregan al primero en un conjunto de tres tubos que contiene 1 mL de suspensión huésped-medio (etapa 2). Se realiza agitación tipo vórtice para mezclar. Esta es la Dilución A.

9.: Se toman 111 µL de la Dilución A y se añaden al próximo tubo en el conjunto. Se realiza agitación tipo vórtice para mezclar. Esta es la Dilución B.

10.: Se toman 111 µL de la Dilución B y se añaden al último tubo en el conjunto. Se realiza agitación tipo vórtice para mezclar. Esta es la Dilución C. Se deben tener ahora tres diluciones de fagos, donde las concentraciones de cada una difieren por un factor de 10.

11.: Se vierten los contenidos de la Dilución C (la más diluida de las 3 muestras) en la tina de solución y se carga la pipeta Pipetman multicanal.

12.: Se dispensan 20 µL por pozo en la primera fila de la placa de 384 pozos (12 canales x 2 = 24 pozos).

13.: Se expele el líquido restante en las puntas al tocar las puntas contra la superficie de la tina y se presiona el botón RESETEAR en la pipeta Pipetman. Se deja la pipeta Pipetman hacia abajo afin de evitar la contaminación de las puntas. No hay necesidad de cambiar las puntas en este momento

14.: Se vacia la tina como se describió anteriormente.

15.: Se vierten los contenidos de la Dilución B en la misma tina y se carga la pipeta Pipetman multicanal.

16.: Se dispensan 20 µL por pozo en la segunda fila de la placa de 384 pozos.

17.: Se realizan las etapas 13 -16 en forma similar para dispensar la Dilución A en la tercera fila de la placa.

18.: Una vez que todas las tres diluciones han sido arregladas en las primeras 3 filas de la placa, se descartan todas las puntas y la solución de la tina en el contenedor de desechos biotóxicos.

19.: Se monta la pipeta Pipetman con un conjunto limpio de puntas esterilizadas y se abre una nueva tina de solución estéril.

20.: Se repiten las etapas 8 -19 para cada acierto putativo restante, usando las filas restantes sobre la placa hasta la fila O. Se pueden analizar cinco aciertos putativos sobre una placa de 384 pozos, guardando la última fila (fila P) para los controles.

21.: Se agregan 0,5 µL de cada control a un pozo separado, Se usan al menos 2 -3 controles separados, preferiblemente cubriendo un rango de actividad.

22.: Se incuban las placas de ensayo a 37°C durante la noche en una incubadora humidificada (≥95%).

Día 2

1.: Se pipetean con aguja todas las placas desbloqueadas sobre una placa base con almidón rojo usando el mismo método descrito para el Día 2 en Cribado de microtítulo lambda para amilasas, salvo que se utilice una pipeta con aguja de 384 posiciones.

2.: Se prepara el regulador del sustrato de almidón BODIPY 2X de la siguiente manera:

3.: Se dispensan 20 µL por pozo en todas las placas desbloqueadas.

4.: Se envuelven todas las placas en lámina de aluminio y se incuban a temperatura ambiente durante 2-6 horas.

5.: Se lee cada placa en el Spectrafluor con la siguiente configuración: a) lectura de fluorescencia (filtro de excitación: 485 nm; filtro de emisión: 535 nm) b) definición de placa: 384 pozos, negra c) lectura desde la parte superior d) ganancia óptima e) número de destellos: 3

6.: En las hojas de cálculo de Excel resultantes, se traza un mapa de cada una de las 3 filas putativas en un gráfico separado y se revisa la actividad. Se asegura que todos los controles positivos produzcan señales por sobre el fondo.

7.: Para cada acierto putativo que parece tener una señal real entre los pozos, se recoge una muestra de un pozo positivo de la siguiente manera:

a) Se selecciona un pozo positivo de una fila que representa la dilución inicial más alta. b) Se transfieren 2 µL de ese pozo a un tubo que contiene 500 µL de SM y 50 µL de CHCI3. Este se denomina como el patrón de desbloqueo.

c) Se almacena a 4°C.

8. Usando los métodos descritos anteriormente, se siembran en placa aproximadamente 10 µL de cada patrón de desbloqueo sobre placas de 150 mm de NZY usando almidón rojo. El objetivo es obtener varias placas de pozos separados (al menos 20) de las cuales se aísla el núcleo.

Día 3

1.: Se revisan las placas pipeteadas con aguja para una incidencia aceptable de los aclaramientos en la base bacteriana correspondiente a los pozos en la placa de ensayo asociada. También se revisan los aclaramientos en el almidón rojo en los controles positivos y en cualquier acierto putativo evaluado. Debe tenerse cuidado de los contaminantes que también forman zonas de aclaramiento en almidón rojo (véase a continuación).

2.: De las placas en fase sólida que contienen diluciones de patrones de desbloqueo, se separan varias placas aisladas, cada una en 500 µl de SM con 50 µl de CHCI3. Esto se denomina como el patrón aislado.

3.: Los patrones aislados se pueden evaluar en forma individual en almidón BODIPY usando los métodos descritos anteriormente. Esta etapa puede ser omitida si la plaqueta que fue separada en la etapa 2 produjo una zona de aclaramiento en el fondo de almidón rojo. Los patrones aisladas fueron luego analizados individualmente en almidón BODIPY usando los métodos descritos anteriormente. Sin embargo, esta etapa puede ser omitida si la plaqueta que fue separada en la etapa 2 produjo una zona de aclaramiento en el fondo del almidón rojo.

Escisiones

Día 1

1.: En un tubo Falcon 2059, se mezclan 200 µL de huésped OD1 MRF' XL1-Blue, 100 µl de patrón aislado Iambda y 1 µL de patrón de fagos EXASSISTMR .

2.: Se incuban en agitador a 37°C durante 15 minutos.

3.: Se agregan 3 mL de medio NZY.

4.: Se incuban en agitador a 30°C durante la noche. Día 2

1.: Se calienta tubo de escisión a 70°C durante 20 minutos.

2.: Se centrifuga a 1000 x g durante 10 minutos.

3.: En un tubo Falcon 2059, se combinan 50 µL de sobrenadante con 200 µL de huésped OD1 EXP505MR .

4.: Se incuba en un agitador a 37°C durante 15 minutos.

5.: Se añaden 300 µL de medio SOB.

6.: Se incuba en agitador a 37°C durante 30 -45 minutos.

7.: Se siembran en placa 50 µL sobre una placa grande LBKan50 usando perlas de vidrio estériles. Si las placas están "secas", se puede añadir medio SOB extra para ayudar a separar las células.

8.: Se incuba la placa a 30°C durante al menos 24 horas.

9.: se cultiva un aislado para secuenciación y/o RFLP.

El cultivo a 30°C reduce el número de copias de plásmido y se usa para mitigar la toxicidad aparente de algunos clones de amilasa

Contaminantes que forman zonas de aclaramiento en almidón rojo

Al usar almidón rojo en medio sólido para evaluar fagos en cuanto a su actividad de amilasa, es común ver unidades formadoras de colonias (cfu) contaminantes que forman zonas de aclaramiento en el almidón rojo. Para las placas pipeteadas con aguja, es importante distinguir los clones de fagos positivos para amilasaa partir de estos contaminantes siempre que se alineen con una posición particular de un pozo. La fuente de los microbios contaminantes es presumiblemente del 2% de solución patrón de almidón rojo, que no puede ser esterilizada por autoclavado o por filtración después de la preparación. Se cree que son organismos oportunistas que sobreviven metabolizando el almidón rojo. A fin de reducir estos contaminantes, se pueden usar técnicas estériles al elaborar soluciones de almidón rojo al 2% y almacenar los patrones ya sea a 4°C o sobre hielo.

Ejemplo 8: Caracterización de alfa amilasa, pH óptimo y determinación de la actividad específica

El siguiente ejemplo describe un ejemplo de un método para la determinación de la actividad de alfa amilasa, el pH óptimo y la actividad específica.

Las enzimas de esta invención se pueden usar, por ejemplo, tanto para Iicuefacción de almidón como para molienda húmeda de maíz y para desencolado de textiles; por ejemplo, en algunas formas de realización, las enzimas de la invención tienen un pH óptimo de 4,5 a 5,0; a este pH inferior, es posible usar poco o nada de calcio lo cual disminuye los costos totales de operación y la formación de menos subproductos. Además, a este pH bajo, existe un menor uso de productos quimico y de carga de intercambio iónico. La amilasa de B. licheníformis estándar de la industria está por debajo del nivel óptimo tanto en la termoestabilidad como en el pH óptimo. En algunas formas de realización, las enzimas de la invención tienen actividad específica de aplicación superior comparada con la amilasa de B. licheniformis y, por lo tanto, se requiere mucha menos enzima para hidrolizar una tonelada de almidón (por ejemplo, en algunas formas de realización, se puede usar tanto como 20 veces menos enzima).

El pH óptimo para la hidrólisis de almidón se puede determinar al hacer reaccionar 50 µL de enzima, 0,35 U/ml, con 100 ml de una solución de almidón soluble al 1% (0,0175 U/g de almidón) durante 30 minutos a 95°C. Los extremos freudtores generados en la solución de almidón licuado se pueden medir por ensayo de neocupronina descrito aquí. La hidrólisis porcentual de almidón de maíz se puede determinar al medir el número de extremos reductores del azúcar producidos con el ensayo de neocupronina. Se pesaron 70 gramos de solución regulador (pH 4-7) y se pueden añadir 100 ppm de calcio. Se pueden mezclar 30 gramos de almidón de maíz en la solución reguladora para formar una suspensión de almidón. La enzima se puede agregar y los recipientes se sellan y se incuban a 95°C durante 30 minutos con una velocidad inicial de calentamiento de 6°C por minuto. Una muestra de 1 ml puede ser extraída de los recipientes de reacción y analizada por ensayo de neocupronina. En algunas formas de realización, las enzimas de la invención tienen un pH óptimo entre 4,5 y 5, mientras que la amilasa de B. Iícheniformís comercial actúa en forma óptima hasta aproximadamente pH 6,0.

Ejemplo 9: Ensayos de actividad de amilasa

Ensayo que usa almidón en RBB

Se agregan 75 µI de sustrato de almidón en RBB (1% de almidón de maíz insoluble en RBB en regulador de NaAc 50 mM, pH = 4,5) en cada pozo de una nueva placa de 96 pozos (fondo V). Se transfieren 5 microlitros de lisado enzimático en cada pozo con sustrato usando BIOMEKMR o ZYMARKMR. Las placas se sellan con cinta de sellado de aluminio y se agitan brevemente en el agitador. Las placas se incuban a 90°C durante 30 minutos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 a 10 minutos. Se agregan 100 microlitros de etanol al 100% en cada pozo, las placas se sellan y agitan brevemente en el agitador. Las placas luego se centrifugan a 4000 rpm durante 20 minutos usando una centrífuga de mesa. Se transfieren 100 µl del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos (fondo plano) de BIOMEKMR y se lee la OD595. Se deben utilizar controles.

Ensayo que usa almidón con FlTC

Se agregan 50 µl de sustrato (almidón con FITC al 0,01% en regulador de NaAc 100 mM, pH = 4.5) en cada pozo de una nueva placa de 384 pozos. Se transfieren 5 µl de Iisado enzimático en cada pozo con sustrato y se incuba la placa a temperatura ambiente durante la noche. El cambio de polarización del sustrato, excitación a 485 nm, emisión 535 nm, se lee para cada pozo. Se deben usar controles. Se pueden utilizar placas de 96 pozos para todos los ensayos.

Confirmación de nuevos clones activos

Cada clon positivo del cribado es cultivado e inducido usando un protocolo estándar. Cada clon es examinado para cultivo (es decir, densidad celular con el paso del tiempo), actividad a nivel celular (ensayo de almidón en RBB y ensayo de Iicuefacción), expresión (gel de proteína) y solubilidad de proteína (por análisis al microscopio). Los nuevos clones elevados confirmados se transfieren para fermentación.

Ejemplo 10: Ejemplo de protocolo para licuefacción de almidón y medición de resultados

El siguiente ejemplo descrito y un protocolo de ejemplo para licuar el almidón utilizando glucoamilasas de la invención. Un ensayo de ejemplo usa almidón licuado a pH 4,5 o 6,5 usando las condiciones de reacción que se muestran a continuación:

Condiciones de reacción: PO4 100 mM pH 6,5, almidón licuado al 1% (p/p), DE 12 a 55°C. Se hicieron ensayos tanto de TLC como de HPLC para verificar la actividad. Los perfiles de pH para las amilasas a ser evaluadas se realizan usando regulador de fosfato a un pH de 3,0 -6,5, a 55°C. A partir de la cantidad de hidrólisis observable, se puede demostrar visualmente que algunos clones son más (o menos) activos a ciertos valores de pH que los otros valores en las condiciones de reacción indicadas anteriormente.

Un ejemplo de un protocolo para la sacarificación de almidón licuado a pH de 6,5:

•: Se ajusta el pH del almidón licuado al pH al cual se realiza(n) la(s) sacarificación(es). Se licúa el almidón en regulador de acetato de sodio100 mM, pH 4,5 con sales de fosfato de sodio 100 mM agregados de manera tal que antes de la sacarificación, el pH se ajusta a pH 6,5.

•: Se pesan muestras de 5 gramos de almidón licuado en botellas taradas.

•: Se usan 0,04% (p/p) de OPTIDEX L-400MR o aproximadamente 400 mL del patrón diluido 1-10 de OPTIDEX L400MR por 100 gramos de almidón licuado.

•: Se calculan los miligramos de OPTIDEX L-400MR contenidos en los 400 mL del patrón diluido 1-10 de OPTIDEX L400MR . A continuación, se calcula el volumen de Iisados necesarios para brindar la misma concentración de enzima que de OPTIDEX L-400MR .

•: Se añaden enzimas a las muestras de almidón licuado e se incuban a temperatura deseada (50°C). Después de 18 horas, se determina DE y se prepara una muestra para análisis de HPLC.

Un ejemplo de una determinación de DE:

Ejemplo de un ensayo de neocuproina:

Se agrega una muestra de 100 ml a 2,0 ml de solución A de neocuproina (40 g/L de carbonato de sodio, 16 g/L de glicina, 0,45 g/L de sulfato de cobre). A esta solución se le agrega 2,0 ml de solución B de neocruproína B (1,2 g/L de clorhidrato de neocuproína Sigma N-1626). Los tubos se mezclan y calientan en un baño de agua en ebullición durante 12 minutos; se enfrían, se diluyen hasta un volumen de 10 ml con agua DI y se lee la OD a 450 nm en el espectrofotómetro. El equivalente de glucosa en la muestra se extrapola a partir de la respuesta de 0,2 mg/ml de glucosa estándar que se corre en forma simultánea.

Ejemplo de análisis por HPLC:

Los perfiles de sacarificación de un carbohidrato se miden por HPLC (Bio-Rad Aminex HPX-87A columna de plata, 80°C) usando un detector de índice de refracción. La fase móvil se filtra con agua Millipore a una velocidad de flujo de 0,7 mI/min. Las muestras de sacarificación se diluyen 1-10 con agua DI acidificada (5 gotas de HCI 6 M en 200 mL de agua DI) luego se filtran a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm. El volumen de inyección es 20 µL.

Ejemplo de TLC:

Los productos de reacción fueron w/d en puntos de tiempo cada hora y luego se colocaron y secaron en una placa de TLC. La placa luego se desarrolló en una proporción 10:90 de agua:isopropanol y se visualizó con una mancha de vanilina o una mancha de CAM y luego se calentó para mostrar los azúcares reducibles. El almidón licuado fue parcialmente hidrolizado hasta glucosa en los casos en que se observó actividad.

Ejemglo 11: Licuefacción de almidón usando glucoamilasas de la invención

Este ejemplo descrito y un método de ejemplo de la invención para licuar el almidón utilizando glucoamilasas de la invención.

Un ejemplo de ensayo usa almidón licuado a pH 4,5 ó 6,5 usando las condiciones de reacción que se muestran a continuación:

El concentrado de amilasa se puede preparar a partir de los caldos de fermentación por tratamiento térmico, lavado celular, extracción alcalina usando microfiltración y ultrafiltración (48% de rendimiento total). El concentrado de UF puede neutralizarse con ácido acético y formularse con 30% de glicerol a un pH de 4,5. El nivel de actividad de la formulación en la suspensión puede ser representativo de un producto comercial (120 U1/g 0,5 kg/tonelada de almidón).

Ensayo de actividad de amilasa estándar

Una cubeta de 1 mL que contiene 950 µL de MOPS 50 mM pH 7,0 que contiene pNP-α-D-hexa-(1->4)glucopiranosido 5 mM se coloca en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotómetro Beckman DU-7400 precalentado a 80°C. El espectrofotómetro queda en cero a 405 nm y se agregan 50 µL de la solución enzimática a la cubeta, se mezcla bien y se monitorea el aumento en la OD405 nm en un intervalo de un minuto. La velocidad de ∆OD405 nm/min se convierte a una unidad estándar de µmoI/minuto a partir de la respuesta de OD405 nm de 50 µL de 1 µmol/mL de PNP en 950 mL de MOPS 50 mM a pH de 7,0, -80°C. Una unidad estándar de alfa amilasa termoestable (DTAA) es igual a la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 µmoI/mL/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo.

Ensayo de actividad de glucoamilasa estándar

Una cubeta de 1 mL que contiene 950 µL de MOPS 50 mM pH 7,0 que contiene pNP-α-D-glucopiranosido 5 mM se coloca en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotómetro DU-7400MR (Beckman) precalentado a 60°C. El espectrofotómetro queda en cero a 405 nm y se agregan 50 µL de la solución enzimática a la cubeta, se mezcla bien y se monitorea el aumento en la OD405 nm en un intervalo de un minuto. La velocidad de ∆OD405 nm/min se convierte a una unidad estándar de µmoI/minuto a partir de la respuesta de OD405 nm de 50 µL de 1 µmol/mL de pNP en 950 mL de MOPS 50 mM a pH 7,0, -60°C. Una unidad estándar de glucoamilasa (DGA) es igual a la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 µmoI/mL/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo.

Determinación de equivalente de dextrosa

El método de ensayo de neocruproína se puede usar para medir el DE. Las muestras seleccionadas se pueden medir por un procedimiento que se describe aquí, y/o mediante análisis GPC usando el procedimiento de Fehlings de GPC.

Ensayo de neocuproína

Se agrega una muestra de 100 ml a 2,0 ml de solución A de neocuproina (40 g/L de carbonato de sodio, 16 g/L de glicina, 0,45 g/L de sulfato de cobre). A esta solución se le agrega 2,0 ml de solución B de neocuproína B (1,2 g/L de clorhidrato de neocuproína Sigma N-1626). Los tubos se mezclan y calientan en un baño de agua en ebullición durante 12 minutos; se enfrían, se diluyen hasta un volumen de 10 ml con agua DI y se lee la OD a 450 nm en el espectrofotómetro. El equivalente de glucosa en la muestra se extrapola a partir de la respuesta de 0,2 mg/ml de glucosa estándar que se corre en forma simultánea.

La muestra de almidón se diluye ~1 a 16 con agua DI con la dilución exacta registrada. Se agregan 10 mililitros de la muestra diluida a 20 ml de agua DI. Se agregan 10 mililitros de solución A y B de Fehling al almidón diluido. La muestra ebulle durante 3 minutos y se enfría sobre hielo. Se agrega 10 mililitros de KI al 30% y 10 ml de H2SO4 6 N. La solución se titula contra tiosulfato de sodio 0,1 N. El volumen de la solución de titulación se registra y se usa para calcular el DE.

Determinación de almidón residual

Las muestras de post-sacarificación se pueden chequear para almidón residual usando el procedimiento de yodo de Staley. Se pesan 20 gramos de muestra en un plato de pesaje grande. Se agregan 45 µL de solución de yodo al plato de pesaje y la solución de almidón se mezcla bien. El azul oscuro indica la presencia de almidón, un azul claro -verde indica almidón leve, verde claro indica un rastro de almidón y amarillo -rojo, ausencia de almidón. La solución de yodo se prepara al disolver 21,25 gramos de yodo y 40,0 gramos de yoduro de potasio en un litro de agua.

Perfil del oligosacárido

Los perfiles de Iicuefacción y sacarificación de carbohidratos se pueden medir por HPLC (por ejemplo, una columna AMINEX HPX-87CMR (Bio-Rad) en forma de calcio -80°C) usando un detector de índice de refracción.

Cromatografía de permeación de gel

La distribución del peso molecular se puede determinar por cromatografía, por ejemplo, en una columna µL AQUAGEL-OHMR con detección de masas por índice de refracciòn (Waters Model 2410). Un detector modelo T60MR (Viscotek) se puede usar para mediciones continuas de viscosidad y de dispersión de luz.

Electroforesis capilar Se puede usar un sistema de glucoproteínas Beckman Coulter P/ACE MDQMR para separación de oligosacáridos derivados de APTS en un capilar de sílice fundida; en un aspecto, se puede usar detección por fluorescencia inducida por láser.

Licuefacción primaria

El almidón de línea directamente del proceso GPC es bombeado a un tanque de alimentación de 60 litros donde el pH, DS (sólidos secos) y el nivel de calcio se pueden ajustar antes de la licuefacción. La amilasa se agrega a la suspensión. La suspensión de DS al 32% se bombea a razón de 0,7 litros/minuto mediante una bomba de desplazamiento positivo al chorro -una cámara de mezcla presurizado donde se calienta instantáneamente la suspensión de almidón a más de 100°C mediante inyección de vapor. El almidón licuado parcialmente gelatinizado se bombea a través de una red de tuberias (aún bajo presión) para obtener el tiempo de residencia deseado (5 minutos) a temperatura. La presión se libera en un tanque de expansión y se pueden tomar muestras. Las muestras se toman por duplicado.

Licuefacción secundaria

El almidón licuado se recoje en botellas de vidrio de un litro y se mantiene en un baño de agua a 95°C durante 90 minutos.

Sacarificación

El almidón licuado se enfría a 60°C, el pH se ajusta a 4,5 y las muestras se tratan con glucoamilasa. El progreso de la sacarificación se puede monitorear en el tiempo, por ejemplo, por HPLC.

Los jarabes licuados producidos con cada amilasa se ajustan a aproximadamente pH 2,5 con HCI 6N en forma inmediata después de Iicuefacción secundaria de 90 minutos para inactivar cualquier amilasa residual. Los jarabes se ajustan luego a pH 4,5, se colocan en un baño de agua de 60°C y se sacarifican con tres niveles de glucoamilasa.

El grado de sacarificación se monitorea por HPLC en puntos de tiempo de 18 -88 horas.

Los jarabes licuados se sacarifican con la dosificación estándar -0,04% de una glucoamilasa de doble fuerza y dos dosis menores (50% y 25%) para monitorear cualquier diferencia en el progreso de sacarificación.

Los datos del progreso de la sacarificación se pueden analizar por % de desarrollo de dextrosa vs tiempo, por ejemplo, con 0,04% de glucoamilasas; o % de desarrollo de dextrosa vs tiempo, por ejemplo, con 0,02% de glucoamilasas.

Perfil de azúcar después de la sacarificación

Distribución del peso molecular

La distribución del peso molecular de jarabes licuados a DE de 12 y 18 mediante glucoamilasas de la invención, y en algunos aspectos, usando controles, por ejemplo, enzimas comerciales, por ejemplo, Bacillus licheniformis o Bacíllus stearothermophilus comercial, se pueden medir por cromatografia de permeación de gel usando detección por índice de refracción, dispersión de luz y viscosidad. Tanto las amilasas de B. lícheniformis como de B. stearothermophilus generan una distribución bimodal, el pico primario centrado a 2000, un pico secundario en 32000 con un hombro que se extiende más alla del rango de 160000. El pico de peso molecular más bajo representa aproximadamente 60% de la masa total de la muestra. En algunas rtealizaciones, las glucoamilasas de la invención pueden exhibir un solo pico en 2000 con muy poco por encima de 30000.

HPLC

Los jarabes de DE 12 y 18 producidos por glucoamilasas de la invención (y las enzimas comerciales de control, por ejemplo, amilasas de Bacillus licheníformis y/o amilasas de Bacillus stearothermophilus comerciales) se pueden analizar por HPLC. Ambas técnicas producen huellas digitales características de cada clase de amilasa; también se espera que los patrones de oligosacáridos sean diferentes para la amilasa de B. Iicheniformis vs amilasa de B. stearothermophilus y glucoamilasas de la invención produzcan huellas digitales características de sus clases enzimáticas. Los jarabes Iicuados de la invención (por ejemplo, jarabes elaborados por los métodos de la invención y/o elaborados por enzimas de la invención) exhiben evidencia de mayor ramificación en los oligosacáridos. La HPLC solamente resuelve los oligosacáridos en un rango < de DP15 -los fragmentos más grandes no son visibles en estas técnicas. Las amilasas de Bacillus son conocidas por licuar almidón de manera tal que la fracción de amilopectina se hidroliza en forma menos extensiva que la fracción de amilosa. Estos fragmentos de amilopectina >DP30 están contenidos en la fracción de alto peso molecular centrada en 32000 y en consecuencia, se ve poca evidencia de ramificación en los análisis de HPLC de los jarabes Iicuados de Bacillus. En un aspecto, los oligosacáridos <DP15 en jarabes Iicuados elaborados usando las glucoamilasas de la invención contienen fragmentos tanto de amilosa como de amilopectina.

Ejemplo 12: Licuefacción de almidón en condiciones ácidas usando glucoamilasas de la invención

La inenvción provee métodos para licuefacción de almidón usando glucoamilasas, de la invención. En una realización, la conversión de almidón en glucosa puede ser catalizada por la acción de la secuencia de dos enzimas: una endoamilasa de la divulgación, por ejemplo, una amilasa, tal como alfaamilasas y una exoamilasa, por ejemplo, una glucoamilasa de la invención, para licuar el almidón (por ejemplo, la hidrólisis de polímeros de glucosa de alto peso molecular en oligosacáridos que consisten de 2 a 20 unidades de glucosa, por lo general un equivalente de dextrosa de 10 a 12, por una amilasa de la divulgación), seguido por sacarificación con una exoamilasa, por ejemplo, una glucoamilasa (que puede ser una glucoamilasa de la invención).

En un aspecto, el procesamiento se realiza en una planta de molienda húmeda de maíz que produce una suspensión de almidón que tiene un pH de aproximadamente 4,0 a 4,5. En un aspecto, el pH se eleva, por ejemplo, de 5,8 hasta 6,0 antes de la Iicuefacción para acomodar una alfa amilasa con una actividad de pH y estabilidad bajas. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención pueden licuar almidón a un pH de 4,5 hasta equivalentes de dextrosa que oscilan entre 12 y 18; en un aspecto, usando glucoamilasas de la invención en niveles de aproximadamente 3 a 6 gramos por tonelada de almidón. En este aspecto, el uso de glucoamilasas de la invención permite que la licuefacción de almidón se realice a pH 4,5.

En un aspecto, la Iicuefacción de almidón se realiza a un pH de 4,5 durante 5 minutos a 105°C hasta 90 minutos a 95°C usando glucoamilasas de la invención. La cantidad de enzima se puede ajustar a fin de ajustar un DE objetivo de 12 a 15 después de la Iicuefacción. En un aspecto, el almidón licuado se sacarifica luego con una glucoamilasa, por ejemplo una glucoamilasa de Aspergillus, durante aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente pH 4,5 y 60 °C. Si el jarabe sacarificado no contiene al menos 95% de glucosa, el DE de Iicuefacción objetivo se eleva y se repite la sacarificación hasta que la Iicuefacción eventualmente no produzca un jarabe sacarificado que contiene más del 95% de glucosa. La proteína amilasa necesaria para producir una materia prima licuada adecuada para sacarificación se puede determinar, por ejemplo, por PAGE o HPLC.

Ejemplo 13: Licuefacción de almidón usando glucoamilasas de la invención

Este ejemplo describe un ejemplo de un método para licuar almidón usando glucoamilasas de la invención; y describe uso de amilasas de Bacillus lícheniformis y Bacillus stearothermophilus comerciales como controles. Estos ensayos pueden comparar los niveles del progreso de la sacarificación y los niveles finales de dextrosa a partir de los jarabes generados por las enzimas de la invención y amilasas comerciales.

El equivalente de dextrosa (DE) es el estándar industrial para medir la concentración de azúcares reductores totales, calculado como D-glucosa sobre una base de peso seco. El almidón granulaso no hidrolizado tiene un DE de casi cero, mientras que el DE de la D-glucosa se define como 100. Un ejemplo de un proceso de la invención usa una dosificación de enzimas de aproximadamente 60 a 70 Unidades/kilo de almidón a un pH de 4,5 para alcanzar un DE

19.

Los patrones de oligosacáridos generados por las glucoamilasas de la invención y amilasas comerciales se pueden analizar por distribución de peso molecular (PM) usando, por ejemplo, cromatografía de permeación de gel con detección por dispersión de luz y viscosidad. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención pueden generar un DE de 18 y una distribución uniforme de PM de oligosacáridos, no mayor a 20.000. Esto es consistente con la viscosidad menor para los jarabes de la invención (por ejemplo, los jarabes elaborados por métodos de la invención,

o elaborados usando las enzimas de la invención). Los perfiles de DP (grados de polimerización) medidos por HPLC también se pueden usar para analizar las diferencias en el patrón de acción.

Los concentrados de amilasa se preparan a partir de caldos de fermentación por tratamiento térmico, lavado celular, extracción alcalina usando microfiltración y ultrafiltración (UF). El concentrado de UF se neutraliza con ácido acético y se formula con 30% de glicerol a pH 4,5. El nivel de actividad de la formulación de la suspensión se puede analizar, por ejemplo, 120 U1/g -0,5 kg/tonelada de almidón es representativo de un producto comercial.

Ejemplo 14: Amilasas alcalinas para aplicaciones de lavandería y lavado automático de vajillas

En un aspecto, la invención proporciona detergentes que comprenden glucoamilasas de la invención, incluyendo glucoamilasas activas bajo condiciones alcalinas, y métodos para prepararlas y usarlas

La invneción provee enzimas glucoamilasa estables en medio alcalino, que pueden ser comparadas con una enzima(s) comercial de referencia en cuanto a las características importantes en aplicaciones de lavandería y lavado automático de vajillas (ADW):

: o Una prueba de lavado ADW en portaobjetos revestidos con almidón.

: o Ensayo de actividad de la enzima amilasa y/o glucoamilasa en presencia de una formulación lavandería / ADW usando un sustrato soluble.

: o Ensayo de actividad de la enzima amilasa y/o glucoamilasa, en presencia de agentes quelantes.

: o Ensayo de actividad de la enzima amilasa y/o glucoamilasa y determinación de rangos óptimos de pH alcalino (por ejemplo, de pH 10 a 11).

: o Ensayo de actividad de la enzima amilasa y/o glucoamilasa de las propiedades termofílicas, por ejemplo, desempeño hasta aproximadamente 65 °C a 70 °C.

La actividad de amilasa y/o glucoamilasa se puede medir ya sea mediante un ensayo de reducción de azúcar o al monitorear la fluorescencia a 520 nm (excitación a 485 nm) cuando se usó almidón BODIPY. Las velocidades iniciales se pueden calcular y convertir en un porcentaje de la velocidad máxima.

Ensayo de aplicación

Los experimentos pueden ser diseñados para evaluar la actividad y estabilidad glucoamilasas alcalinas de la invención en formulaciones de lavandería/ADW y con los componentes en forma individual. La actividad de amilasa y/o glucoamilasa se puede evaluar bajo condiciones que comprenden el agente quelante EDTA y/o peróxido de hidrógeno; las enzimas de punto de referencia comerciales pueden ser los controles.

Por ejemplo, las proteínas purificadas se incuban a 50 °C en presencia o en ausencia de EDTA 5 mM durante un tiempo(s) deseado(s), después del cual se mide la actividad de amilasa residual usando un sustrato soluble. La actividad en presencia de EDTA se expresa como el % de actividad en ausencia de agente quelante. En forma alternativa, la actividad enzimática en presencia de hidróxido de peróxido puede ser evaluada. Las proteínas purificadas se incuban a 50 °C en presencia o en ausencia de H2O2 1 M durante un tiempo deseado, después del cual se mide la actividad de amilasa usando almidón soluble. La actividad en presencia de hidróxido de peróxido se presenta como el % de actividad en ausencia de H2O2. La actividad enzimática puede ser analizada en solución de ADW (agua destilada, solución endurecedora, lejía, agentes quelantes, tensioactivos) con sustrato soluble (almidón BODIPY). Las proteínas purificadas pueden reaccionar con almidón soluble a 40 °C en presencia de una formulación de lavandería / ADW. Las velocidades iniciales se calculan sobre 5 minutos y se expresan como unidades fluorescentes (FU)/s por ng de proteína.

Los ensayos de lavado con portaobjetos revestidos de almidón se pueden realizar de la siguiente manera: las proteínas purificadas se incuban con portaobjetos a 50°C durante 30 min en presencia de solución de ADW (agua destilada, solución de endurecimiento acuosa, lejía, agentes quelantes, tensioactivos). La remoción de almidón se mide comparando la pérdida de peso después del tratamiento enzimático con el peso inicial del portaobjetos.

Caracterización de ejemplos de amilasas

El gen que codifica la amilasa puede ser modificado para comprender un dominio de enlazamiento de carbohidrato / almidón. Las proteínas se pueden expresar con y sin una etiqueta de histidina en el terminal C y en un huésped de glicosilación y no glicosilación. Las enzimas se pueden expresar en combinaciones de etiqueta His / Huésped y pH y temperatura óptimos determinados. Las enzimas expresadas en un huésped de glicosilación con una etiqueta His se pueden usar para analizar los experimentos. La presencia de la etiqueta His no debe afectar la actividad específica, sin embargo, la glicosilación puede dar como resultado una actividad específica ligeramente inferior que aquella sin glicosilación.

Ejemplo 15: identificación y caracterización de una amilasa termoestable

El siguiente ejemplo describe ejemplos de protocolos para la identificación y caracterización de amilasas termoestables.

En un estudio, se cribaron 350 aislados de hongos en medio sólido que contenía almidón granulado como la única fuente de carbono. Las cepas que hidrolizaron completamente el almidón o que mostraron crecimiento significativo se sometieron a aislamiento del ADNc y análisis proteómico de sus proteínas segregadas. Se empleó una combinación de descubrimiento basado en la secuencia y análisis proteómico para recuperar las secuencias de ADN que codifican amilasas, glucoamilasas y glucosidasas que se demostró por medio de análisis proteómico que eran segregadas durante el crecimiento en almidón granulado.

Las secuencias recuperadas de ADNc de longitud completa se subclonaron para expresión en Pichia pastoris y las proteínas expresadas se caracterizaron en forma adicional con el ensayo BCA (que se usó para determinar el incremento en la concentración de los extremos reductores durante la hidrólisis del almidón por las amilasas) y el ensayo de Glucosa Oxidasa (GO) (que fue usado para detectar la glucosa liberada del almidón por las glucoamilasas); los ejemplos de protocolos para ambos ensayos se describen aquí.

Tabla 1

SEQ ID NOs:: Clase de actividad de la enzima CBM20 Fuente (omo se determina mediante ARN 18S)

SEQ ID NO: 50 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 49): amilasa no Aspergillus terreus

SEQ ID NO: 52 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 51): amilasa CBM20 Aspergillus terreus

SEQ ID NO: 54 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 53): amilasa no Aspergillus terreus

SEQ ID NO: 4 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3): amilasa CBM20 Cochliobolus heterostrophus

SEQ ID NO: 2 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1): amilasa CBM20 Cochliobolus heterostrophus

SEQ ID NO: 32 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 31): amilasa no Penicillium chrysogenum 100%

SEQ ID NO: 46 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 45): amilasa no Fusarium equiseti 100%

SEQ ID NO: 22 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 21): amilasa no Penicillium expansum 99%

SEQ ID NO: 24 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 23): amilasa no Penicillium chrysogenum 100%

SEQ ID NO: 8 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 7): glucoamilasa no Cochliobolus heterostrophus

SEQ ID NO: 16 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 15): glucoamilasa CBM20 Cochliobolus heterostrophus

SEQ ID NO: 14 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 13): glucoamilasa CBM20 Fusarium verticillioides GZ3639

SEQ ID NO: 18 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 17): glucoamilasa CBM20 Fusarium verticillioides GZ3639

SEQ ID NO: 10 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 9): glucoamilasa no Penicillium expansum 99%

SEQ ID NO: 12 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 11): glucoamilasa CBM20 Fusarium equiseti 100%

SEQ ID NO: 26 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 25): glucoamilasa CBM20 Penicillium verruculosum 100%

SEQ ID NO: 20 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 19): glucoamilasa no Penicillium chrysogenum 100%

SEQ ID NO: 28 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 27): glucoamilasa CBM20 Fusarium merismoides 99%

SEQ ID NO: 30 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 29): glucoamilasa CBM20 Phoma herbarum 99

SEQ ID NO: 34 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 33): glucoamilasa no Penicillium herquei 99%

SEQ ID NO: 36 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 35): glucoamilasa CBM20 Fusarium oxysporum 100%

SEQ ID NO: 38 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 37): glucoamilasa CBM20 Cordyceps ophioglossoides 99%

SEQ ID NO: 40 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 39): glucoamilasa CBM20 Penicillium chrysogenum 100%

SEQ ID NO: 42 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 41): glucoamilasa no Cucurbitaria berberidis 98%

SEQ ID NO: 48 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 47): glucoamilasa CBM20 Aspergillus versicolor 99

SEQ ID NO: 44 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43): α-glucosidasa Cochliobolus heterostrophus

SEQ ID NO: 6 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 5): α-glucosidasa Cochliobolus heterostrophus

Los aislados fúngicos se cribaron sobre medio sólido modificado de acuerdo con Marlida (2000) World J. Microbiol. Biotechnol. 16: 573 -578. El medio contenía sales Czapek Dox y 1% de almidón resistente MIMAIZE260MR

5 (HiMaize260 , National Starch & Chemical, Bridgewater, NJ) como la única fuente de carbono. El almidón MlMAlZE260MR se agregó al agar frío sin esterilización a fin de conservar la estructura granulada el almidón. En forma adicional, se cribaron las mismas cepas fúngicas en un medio con 0,5% de almidón rojo (Megazyme, Irlanda) a fin de identificar las cepas que segregaron enzimas amilolíticas.

Después de 5 días de cultivo, los aislados que se crecieron bien en el almidón resistente y segregaron enzimas

10 degradantes de almidón, se visualizaron mediante una zona de aclaramiento en el medio de almidón rojo, se eligieron como “aciertos primarios". En la segunda etapa, se cultivaron los aciertos primarios en medio líquido con sales Czapek Dox y 1% de almidón resistente (MlMAIZE260MR) como la única fuente de carbono durante aproximadamente 2 semanas. Las cepas que aclararon completamente la solución de almidón o que mostraron un crecimiento significativo en este medio se sometieron a aislamiento del ADNc y análisis proteómico de los sobrenadantes del cultivo. La combinación de descubrimiento basado en la secuencia y análisis proteómico se empleó para recuperar las secuencias que codifican amilasas y glucoamilasas.

El descubrimiento basado en secuencia se realizó usando dos enfoques. En uno, los cebadores degenerados universales para la recuperación por PCR de los genes de amilasa y glucoamilasa se diseñaron sobre la base de la alineación de secuencias proteicas conocidas de hongos. En otro enfoque, los cebadores degenerados universales se combinaron en PCR con cebadores basados en las secuencias peptídicas obtenidas del análisis proteómico de los sobrenadantes del cultivo a partir de los aislados de hongos cultivados en almidón granulado. En ambos casos, los cebadores se usaron para PCR con ADN plantilla que comprendía ADNc elaborado de las mismas cepas de hongos que digieren el almidón. Por este medio, las secuencias génicas parciales fueron recuperadas. Los datos de los péptidos también se usaron para facilitar la recuperación de versiones de longitud completa de las secuencias parciales usando PCR RACE 5' y 3'.

Para las especies de hongos conocidas con genomas pre-secuenciados, se usó análisis proteómico para determinar las secuencias de péptidos derivadas de amilasas putativas usando el siguiente enfoque: 1) Después del análisis SDS-PAGE de las muestras derivadas de los extractos de hongos cultivados en almidón resistente como la única fuente de carbono, se sometieron las bandas individuales a digestión de proteasa; 2) El análisis de espectroscopia de masas de los péptidos recuperados se llevó a cabo en un instrumento LCQ; 3) Las secuencias peptidicas se determinaron por búsquedas en base de datos SEQUESTMR (Sage-N Research, Inc. y Thermo Scientific).

Para las especies de hongos desconocidas, las secuencias peptidicas se determinaron por medio de un método similar al descrito con antelación con excepción de que las masas precisas de los péptidos y sus aminoácidos constituyentes se determinaron usando un instrumento QTOF. Las secuencias de los péptidos recuperados se usaron como plantilla para producir cebadores de oligonucleótidos degenerados para amplificación por PCR de los genes de ADNc elaborados a partir de la especie de hongos relevante cultivada en almidón granulado MlMAlZEZ260MR .

Las secuencias de ADNc de longitud completa recuperadas que codifican amilasas y glucoamilasas se subclonaron para expresión en Pichia pastoris y las proteínas expresadas fueron caracterizadas adicionalmente usando el ensayo BCA para medir el incremento en la concentración de los extremos reductores durante hidrólisis de almidón por amilasas y el ensayo GO para la detección de glucosa liberada durante la hidrólisis de almidón por glucoamilasas.

Para determinar la actividad tanto de las amilasas como de las glucoamilasas, las reacciones de hidrólisis de almidón se realizaron de la siguiente manera: Los ensayos se realizaron por triplicado en una incubadora de mesa Eppendorf con agitación constante (800 rpm), a 37 °C y pH 5,0 en regulador de acetato de sodio 50 mM que contenía 1% de almidón granulado sin purificar. Las reacciones comenzaron al agregar la enzima a la mezcla de reacción. En diferentes puntos de tiempo, se retiraron alícuotas de las reacciones y se neutralizaron ya sea con adición de Tris 1M pH 7,5 (glucoamilasas) o reactivo BCA (amilasas).

Ensayo BCA para medir el incremento en la concentración de extremos reductores.

Las actividad de las alfa-amilasas se midió por la aparición de grupos reductores formados durante la hidrólisis del almidón. Se utilizó ensayo de ácido bicincoquínico o BCA (Cobre-BCA) de los azúcares reductores realizado de acuerdo con Wong (2000) Microassay for rapid screening of alpha-amylase activity, J. Agric. Food Chem. 48: 4540 4543; y, Fox (1991) Miniaturizatíon of three carbohydrate analyses using a micro sample plate reader, Anal. Blochem. 195: 93 -96.

Una alícuota de 10 µl de reacción de hidrólisis de almidón de la amilasa se neutralizó en 100 µl del reactivo BCA (que consiste de 64 mg/mL de carbonato de sodio monohidrato, 24 mg/mL de bicarbonato de sodio, 1,95 mg/mL de BCA, 1,24 mg/mL de sultafo cúprico pentahidrato, 1,26 mg/mL de L-serina). El desarrollo del color ocurrió durante la incubación de la reacción neutralizada a 80°C durante 35 minutos y fue seguido por la determinación de la absorbancia a 560 nm. Las velocidades iniciales se calcularon en un tiempo de reacción de 50 min. Se construyó una curva estándar usando maltosa para correlacionar A560 nm con la concentración de los azúcares reductores generados (nmoles). La actividad específica se expresó como nmoles/min/µg de enzima.

Ensayo de glucosa oxidasa/geroxidasa (GO) para la cuantificación de glucosa liberada durante la hidrólisis de almidón:

La actividad de las glucoamilasas se midió por el ensayo modificado GO (glucosa oxidasa acoplada) de acuerdo con Bergmeyer, En Determination with Glucose Oxidase and Peroxidase; Bergmeyer, H. U., Ed.; Methods of. Enzvmatic Analysis, 2da Ed.; 1974; páginas 1205 -1212).

Las reacciones GO comenzaron mediante la adición de 10 µl de la reacción de hidrólisis de almidón neutralizada a 90 µl de PBS que contenía glucosa oxidasa (0,1 U/ml), peroxidasa (0,25 U/ml) y Amplex Red 0,05 mM, en placas negras Nunc de 96 pozos. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min antes de la lectura en un lector de placas de fluorescencia con Ex/Em 545/590 nm. Se usó una curva estándar construida con glucosa para evaluar la cantidad de glucosa producida en las reacciones de hidrólisis. Las velocidades iniciales de hidrólisis de almidón (nmols de glucosa liberada de 1% de almidón granulado / min/ µg de glucoamilasa) se determinaron al graficar la cantidad de glucosa liberada en el tiempo y calcular la pendiente de la línea de mejor ajuste a través de los puntos de datos.

La influencia del pH en el rango de entre aproximadamente pH 3,5 y 6,0 sobre la hidrólisis de almidón por siete (7) glucoamilasas que sirven de ejemplo y dos amilasas que sirven de ejemplo de esta divulgación, se ilustra en la Figura 10 y en la Figura 11. La Figura 10 ilustra datos que muestran la influencia del pH sobre la hidrólisis de almidón granulado por siete (7) glucoamilasas que sirven de ejemplo de esta divulgación a 37°C; las velocidades iniciales se calcularon en 15 min y se convirtieron al porcentaje de la máxima velocidad observada. La Figura 11 ilustra los datos que muestran la influencia de pH sobre la hidrólisis de almidón granulado por la SEQ lD NO: 4 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3) y la SEQ ID NO: 52 (codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 51) amilasas a 37 ºC; las velocidades iniciales se calcularon en 50 min y se convirtieron al porcentaje de la máxima velocidad observada.

Otros ensayos también se pueden utilizar para caracterizar una enzima de la invención, y se describen algunos ejemplos de protocolos, a continuación:

Ejemplo de protocolo de extracción de ácido nucleico: los microorganismos, por ejemplo, hongos filamentosos, son cultivados en medio de cultivo líquido. La biomasa se recolecta y el ADN genómico de alto peso molecular se aísla usando DNEASYMR (DNeasy) Plant Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA) que usa protocolos estándares. El ARN total puede ser aislado usando RNEASYMR (RNeasy) Plant Mini Kit (Qiagen) utilizando protocolos estándar.

Ejemplo de protocolo de construcción de biblioteca: El ADN genómico puede ser parcialmente digerido con enzimas de restricción y los fragmentos entre 1-10 kb pueden ser purificados para la construcción de una biblioteca genómica. Los fragmentos pueden ser ligados en el vector Lambda Zap ExpressMR (Stratagene, San Diego, CA) y empacados en un fago infectable de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo de protocolo de cribado de bibliotecas: Las bibliotecas Lambda se pueden usar para infectar células XL1 Blue MRFMR (Stratagene) en agar de superficie. Aproximadamente 50000 pfu de fago se pueden agregar a 600 µl de células OD600 = 1. La mezcla se incuba a 37 °C durante 15 minutos en un baño de agua y luego se agrega a 6 ml de 0.7% de agar de superficie fundido y se siembra en placas de agar NZY. La placa se incuba luego durante la noche a 39 °C. Un círculo de nylon (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel Suiza) puede ser dispuesta encima de la superficie de la plaqueta resultante y se levanta con parte de los fagos adheridos al nylon. El nylon puede ser sumergido en NaCI 1.5 M, NaOH 0,5 M durante 2 minutos, NaCI 1,5 M, TrÍs 0,5 M pH 7,6 durante 5 minutos y 2X SSC, Tris 0,2 M pH 7,6 durante 30 segundos. El filtro de nylon luego se entrecruza mediante UV, por ejemplo, en un entrecruzador Stratagene.

Los fragmentos de PCR de los genes de amilasa, por ejemplo, glucoamilasas, pueden usar sondas, por ejemplo, usando Expand High Fidelity PCR KitMR (Roche) que usa 30 ciclos de 95 °C durante 20 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto en un termociclador. El fragmento de PCR aislado se puede preparar como una sonda radioactiva usando el Prime lt KitMR (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los elementos de la biblioteca extraídos con el filtro se lavan en una solución de prehibridación (por ejemplo, DIG EASY HYBMR, Roche) durante 2 horas a 42 °C en un horno de hibridación (Robbins). La sonda se puede agregar a 15 ml de DIG EASY HYBMR fresco y se usa para reemplazar la solución de prehibridación. El filtro se lava con sonda durante la noche, por ejemplo a 45 °C. La sonda puede ser removida, y el filtro lavado una vez con 2X SSC, 0,1% de SDS durante 15 minutos y dos veces con 0,1X SSC, 0,1% de SDS durante 15 minutos cada vez. El filtro de nylon puede ser expuesto a película de rayos X durante la noche a -80 °C. Después del desarrollo, las manchas de hibridación sobre la película de rayos X se pueden usar para identificar los clones de la placa original. Un tapón de agar puede ser tomado de la placa donde se alinean las manchas y se suspende en regulador SM para liberar el fago en la solución. Varias plaquetas aisladas correspondientes a los fragmentos genómicos que contienen todo o parte de un gen de amilasa pueden ser aisladas.

100 µI del patrón de fago aislado pueden ser agregados a 200 µl de células XL-1 BLUE MRFMR (Stratagene) y 1 µl de fago auxiliar de EXASSISTMR (Stratagene). La mezcla se puede incubar a 37 °C durante 15 minutos y se pueden añadir 3 mI de medio 2X YT. Esta se puede incubar a 37 °C con agitación durante 2.5 horas. La mezcla se puede calentar durante 20 minutos a 70 °C y se enfría sobre hielo. 100 µl de la mezcla se puede remover y agregar a 200 µl de células SOLR (Stratagene) y se incuban a 37 °C durante 15 minutos. 50 µl se pueden cultivar en placas de LB de kanamicina (50 µg/ml) e incubarse durante la noche a 37 °C. Las colonias resultantes pueden contener fragmentos genómicos clonados en el plásmido pBK-CMV.

Ejemplo de protocolo de secuenciación: El secuenciamiento de ADN sobre los clones candidatos se pueden realizar con el secuenciamiento de ciclo BIGDYE TERMINATORMR KitMR VERSION 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un analizador de ADN 3700MR (Applied Biosystems) usando los protocolos del fabricante. Los intrones potenciales pueden ser identificados al comparar esta secuencia con secuencias consenso para intrones en amilasas conocidas.

Ejemplo de protocolo de síntesis de ADNc: Los cebadores de PCT se usan en una reacción de síntesis de ADNc usando un Kit rtPCRMR THERMOSCRIPTMR (lnvitrogen) usando los protocolos del fabricante.

Ejemplo de protocolo de clonación de expresión: Los cebadores PCT se usan para generar un fragmento de PCR usando el clon de ADNc como una plantilla utilizando 30 ciclos de 95 °C durante 20 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 2 minutos, usando el Kit de PCR EXPAND HIGH FlDELlTYMR (Roche) y los protocolos del fabricante. Los fragmentos de PCR son digeridos con las enzimas de restricción y ligados en los sitios de restricción correspondientes de un plásmido, por ejemplo, pPIC ZMR alfa (lnvitrogen). El constructo puede ser transformado en una levadura, por ejemplo, cepa X-33MR de Pichía pastoris (lnvitrogen) donde el constructo se integra de manera estable en el cromosoma de Pichia. La selección puede basarse en la resistencia a la zeocina. El constructo se puede diseñar de manera tal que el clon de Pichia puede ser inducido con metanol para secretar la amilasa madura en el medio. Un cultivo de 1 litro del clon de expresión puede ser inoculado con un cultivo inicial de levadura durante la noche en BMGY y cultivado durante la noche a 30°C en un termo de agitación. Las células de levadura se recolectan por centrifugación al siguiente día y se resuspenden en 1 litro de BMMY. Las células se cultivan a 30 °C en el termo de agitación durante 3 días con metanol agregado a 0,5% final cada 24 horas. El medio que contiene la enzima de glucoamilasa expresada se recolecta luego y se analiza en un ensayo de actividad de glucoamilasa y se somete a electroforesis SDS PAGE usando protocolos estándares para determinar el tamaño de la proteína.

Los cebadores también pueden estar diseñados para la sobreexpresión en Escherichia coli. Los cebadores PCR se usan para generar un producto de PCR como antes, a partir de la plantilla de ADNc. El fragmento de PCR puede ser digerido con las enzimas de restricción y ligado en los correspondientes sitios de restricción del plásmido, por ejemplo, un pSE420 (Invitrogen). El constructo puede ser transformado en Escherichia coli, por ejemplo, la cepa XL1 Blue MR (Stratagene). La selección para el plásmido se puede basar en la resistencia a la ampicilina. El gen de amilasa puede estar bajo el control de un promotor lac-z y puede ser inducido con IPTG (isopropiI-tio galactopiranosido). El constructo puede ser diseñado de manera tal que el gen de glucoamilasa maduro sea expresado en la célula de Escherichia y contendrá un residuo extra de metionina como en el terminal N.

Ejemplo de ensayo "estándar": se pueden agregar alícuotas de enzima a una solución de 5 mM de regulador, 3 mM de malto-oligosacáridos (Sigma, M-3639) en un baño de agua. Las alícuotas de 100 µl se pueden remover en los puntos de tiempo con 200 µl del reactivo glucosa oxidasa (Sigma, GAGO-20) y se incuba a 37 °C, 30 min. La reacción puede ser detenida con adición de ácido sulfúrico 12 N y se determina la absorbancia a 540 nm. La versión de longitud completa de la enzima puede ser analizada para utilización del pH, temperatura y utilización de sustrato.

Ejemplo de ensayo de “actividad”: la actividad de las enzimas se puede medir por la liberación de glucosa libre a partir de un sustrato de oligo-dextrina. La glucosa liberada puede ser oxidada en una reacción de acoplamiento que genera un producto coloreado. Una alícuota de enzima se puede agregar a la solución de regulador 5 mM, maltooligosacáridos 3 mM (Sigma, M-3639) en un baño de agua. 100 µl de alícuotas pueden ser removidos en puntos de tiempo con 200 µl de reactivo de glucosa oxidasa (Sigma, GAGO-20) y se incuba a 37 °C, 30 min. La reacción se detiene con la adición de ácido sulfúrico 12 N y se determina la absorbancia a 540 nm. Los puntos de tiempo son luego graficados para determinar la velocidad relativa para la reacción. Perfil de pH: se puede usar regulador de acetato (pH 4,0, 4,5, 5,0 y 5,4) así como también regulador de fosfato (pH 6,2, 7,0, 8,1) en un ensayo de actividad para determinar la velocidad relativa para la glucoamilasa a cada pH.

Perfil de temperatura: la velocidad relativa de la enzima a varias temperaturas (por ejemplo, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C y 85 °C) se puede determinar en regulador de acetato, pH 5,3.

Datos de estabilidad de temperatura: La enzima puede ser agregada a regulador de acetato 5 mM a una temperatura indicada deseada. Las alícuotas de enzimas se pueden ser removidas colocadas sobre hielo en intervalos de 4 minutos. Las alícuotas luego se analizan en cuanto a la actividad sobre el sustrato durante 20 minutos a 70 °C.

Utilización del sustrato: Las dextrinas maltosa, maltotriosa, panosa, maltotetraosa y maltoheptaosa se pueden sustituir por los malto-oligosacáridos en el ensayo de actividad para evaluar la utilización del sustrato de una amilasa, por ejemplo, una glucoamilasa. La velocidad de liberación de glucosa para varios sustratos se puede analizar en regulador de acetato 5 mM, 70 ºC.

Ejemplo 16: ensayo de actividad de amilasa: ensayos de extremos reductores de BCA El siguiente ejemplo describe un ejemplo de un método para un ensayo de extremos reductores de BCA. La actividad de amilasa (incluyendo, por ejemplo, glucoamilasa) se puede determinar usando la siguiente metodología.

1. Preparación de 2 soluciones de sustrato de la siguiente manera:

a) 2% de solución de almidón soluble (almidón de maíz granulado o patata) de pH 8, mediante la disolución de 2 g de almidón de patata en 100 ml de fosfato de sodio 100 mM, pH 8).

b) 2% de solución de almidón soluble (patata) pH 10, mediante la disolución de 2 g de almidón de patata en 100 ml de carbonato de sodio 100 mM.

Se calientan ambas soluciones en un baño de agua en ebullición, mientras se mezcla, durante 30 -40 minutos hasta que el almidón de disuelva.

2.: Se prepara una Solución A de 64 mg/ml de carbonato de sodio monohidrato, 24 mg/ml de bicarbonato de sodio y 1,95 mg/ml de sal disódica de BCA (4,4'-‘dicarboxi-2,2'-biquinolina) disódica (Sigma Chemical cat. # D-8284). Se añaden por encima a dH2O.

3.: Se prepara una Solución B mediante la combinación de 1,24 mg/ml de sulfato cúprico pentahidrato y 1,26 mg/ml de L-serina. Se añade la mezcla a dH2O.

4.: Se prepara un reactivo de trabajo en una proporción 1:1 de soluciones A y B.

5.: Se prepara una solución estándar de maltosa 10 mM en dH2O donde la maltosa 10 mM se combina en 2% de almidón soluble a pH deseado hasta una concentración final de 0, 100, 200, 300, 400, 600 µM. Se genera una curva estándar para cada conjunto de puntos de tiempo. Como la curva se determina al agregar 10 µl de los estándares al reactivo de trabajo, que funciona a 0, 1, 2, 3, 4, 6 nmole de maltosa.

6.: Se toma una alícuota de 1 ml de la solución del sustrato en tubos de microcentrífuga, equilibrar a temperatura deseada (5 min) en bloque de calor o baño de agua caliente. Se añaden 50 µl de solución enzimática al interior de la tapa del tubo.

7.: Mientras la solución se equilibra, se mezclan 5 mI de ambas soluciones A & B. Se colocan alícuotas de 100 µl en una placa de PCR de 96 pozos. Se coloca la placa sobre hielo.

8.: Después de 5 min de equilibrio de la temperatura, se cierra la tapa de los tubos, invirtiéndolos y agitándolos en forma de vórtice 3 veces. Inmediatamente se coloca una alícuota de 10 µl en la placa que se toma como t=0 (punto de tiempo cero). Se deja la mezcla de la enzima en un bloque de calor y se toman alícuotas de 10 µl en cada punto de tiempo deseado (por ejemplo, 0, 5, 10,15, 20, 30 minutos).

9.: Se asegurar que 12 pozos queden vacíos (únicamente para alícuotas del reactivo de trabajo) durante la adición de 10 µI de estándares, para la curva estándar.

10.: Cuando todos los puntos de tiempo se recolectan y se agregan los estándares, se cubre la placa y se calienta a 8O °C durante 35 min. Se enfría la placa sobre hielo durante 10 min. Se agregan 100 µI de H2O a todos los pozos. Se mezclan y se colocan alícuotas de 100 µl en una placa de 96 pozos de fondo plano y se lee la absorbancia a 560 nm.

11.: Fijar en cero los puntos de tiempo de cada muestra contra su propio t=0 (restar el valor promedio t=0 de A560 de los otros valores promedios de A560). Convertir la A560(experimental) en µmol (Dividir A560(experimental), por la pendiente de la curva estándar (A560/µmol). Se genera una pendiente de los puntos de tiempo y el µmol (en µmoles/min), se multiplica por 100 (ya que el valor µmol solamente representa 10 µl usados en el ensayo, no la cantidad preparada en 1 ml rxn). Para obtener la actividad específica, se divide la pendiente (en µmol/min) por los mg de proteína. Todos los puntos deben ser hechos como mínimo por duplicado, referiblemente por triplicado. Se divide la concentración de proteína (mg/ml) por cualquier dilución para obtener los mg utilizados en el ensayo. Se divide la pendiente anterior por los mg usados en el ensayo para obtener la actividad específica. Véase, por ejemplo, Wong (2000) J. Agric. Food Chem. 48: 4540 -4543; Fox (1991) Anal. Biochem. 195, 93 -96.

Ejemplo17: Cribado para actividad de amilasa

La actividad de amilasa (por ejemplo de glucoamilasa) de los clones se puede evaluar mediante una cantidad de métodos conocidos en el arte. El siguiente es un ejemplo de metodología que puede ser utilizada.

El número de plaquetas cribadas, por placa, puede ser aproximadamente de 10000 pfu. Para cada biblioteca de ADN: aproximadamente 50000 plaquetas por biblioteca aislada y 200000 plaquetas por biblioteca no aislada se pueden cribar dependiendo del título de pfu para el lisado amplificado λ Zap Express.

Determinación del título de biblioteca Lambda

1) Se añadieron µL del patrón de la biblioteca Lambda Zap Express amplificada a 600 µL de células MRF’ de E. coli (OD600 = 1,0). Para diluir el patrón de MRF’, se usó MgSO4 10 mM.

2) Se incuba a 37 °C durante 15 minutos.

3) Se transfiere la suspensión a 5 -6 mL de agar de superficie NZY a 50 °C y se mezcla suavemente.

Se vierte inmediatamente la solución de agar sobre placas grandes (150 mm) de medio NZY.

4) Se permite que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego se

invierte la placa. 5) Se incuba la placa a 39 °C durante 8 -12 horas. 6) El número de plaquetas es aproximado. Se determina el título de fagos para obtener 10000 pfu/placa. 7) Se diluye una alícuota de fagos de la biblioteca con regulador SM si se requiere. Cribado del sustrato -Se añade Lambda Zap Express (50000 pfu) de la biblioteca amplificada a 600 µl de células MRF de E. coli (OD600 =

1,0). Para las bibliotecas no ambientales, se preparar 4 tubos (50,000 pfu por tubo). -Se incuba a 37 °C durante 15 minutos. -Mientras se incuba la suspensión de fagos/células, se añade 1,0 mL de sustrato de almidón rojo (1,2% p/v) a 6,0

mL de agar de superficie NZY a 50 °C y se mezcla completamente. Se mantiene la solución a 50°C hasta que se

necesite. -Se transfiere 1/5 (10000 pfu) de la suspensión celular a la solución de sustrato/agar de superficie y se mezcla suavemente.

-Se vierte inmediatamente a solución sobre placa de medio NZY grande (150 mm).

-Se permite que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego se invierte la placa. -Se repiten los procedimientos 4 -6 cuatro veces para el resto de la suspensión celular (1/5 de la suspensión cada

vez). -Se incuban las placas a 39 °C durante 8 -12 horas. -Se observa la placa por las zonas de aclaramiento (halos) alrededor de las plaquetas. -Las plaquetas con halos se separan del agar y se transfieren a un micro tubo estéril. Una punta de pipeta de 200

µl de orificio grande funciona bien para remover (separar) el tapón de agar que contiene la plaqueta deseada.

-: Se resuspenden los fagos en 500 µL de regulador SM. Se añaden 20 µL de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional. -Se incuba la suspensión pura de fagos a temperatura ambiente durante 4 horas o durante la noche antes de la

siguiente etapa. Aislamiento de clones puros -Se añaden10 µL de la suspensión de fagos re-suspendida en 500 µL de células MRF’ de E. coli (OD600 = 1,0).

-Se incuba a 37 °C durante 15 minutos. -Mientras se incuba la suspensión de fagos/células, se añade 1 mL de sustrato de almidón rojo (1,2% p/v) a 6,0 mL

de agar de superficie NZY a 50 °C y se mezcla completamente. Se mantiene la solución a 50 °C hasta que se necesite. -Se transfiere la suspensión de células a la solución de sustrato/agar de superficie y se mezcla suavemente. -Se vierte inmediatamente la solución sobre una placa grande (150 mm) de medio NZY. -Se permite que el agar de superficie se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos), luego se invierte

la placa. -Se incuba la placa a 39°C durante 8 -12 horas. -Se observa la placa para una zona de clarificación (halo) alrededor de a sola plaqueta (clon puro). Si no se puede

aislar una sola plaqueta, se ajusta el título y se siembra en placa nuevamente la suspensión de fagos. -Se separa una sola plaqueta con halo de agar y se la transfiere a un micro tubo estéril. Una punta de pipeta de 200

µl de orificio grande funciona bien para remover (separar) el tapón de agar que contiene la plaqueta deseada. Para amplificar el título, se separan 5 plaquetas activas individuales en un micro tubo. -Se resuspenden los fagos en 500 µL de regulador SM. Se añaden 20 µL de cloroformo para inhibir cualquier

crecimiento celular adicional. -Se incuba la suspensión pura de fagos a temperatura ambiente durante 4 horas o durante la noche antes de la

siguiente etapa. La suspensión de fagos puro se almacena a -80 °C mediante la adición de DMSO en la suspensión de fagos (7% v/v). Escisión de clones puros -Se añaden 100 µl de la suspensión pura de fagos a 200 µl de células MRF de E. coli (OD600 = 1,0). A esta

suspensión, se le añade 1,0 µL del fago auxiliar EXASSIST (>1 x 106 pfu/mL; Stratagene). Usar tubos Falcon 2059 para la escisión. -Se incuba la suspensión a 37°C durante 15 minutos. -Se añaden 3,0 mL de medio YT 2 veces a la suspensión de células.

-Se incuba a 30°C durante al menos 6 horas o durante la noche con agitación. -Se transfiere el tubo a 70°C durante 20 minutos. La suspensión de fagos se puede almacenar a 4°C durante 1 a 2 meses.

-: Se transfieren 100 µl de la suspensión del fagémido a un micro tubo que contiene 200 µL de células Exp 505 de E. coli (OD600 = 1,0).

-Se incuba la suspensión a 37°C durante 15 minutos. -Se añaden 300 µL de SOB a la suspensión. -Se incuba la suspensión a 37°C durante 30 a 45 minutos. -Se transfieren 100 uL de la suspensión a una placa pequeña (90 mm) de medio LB) que contiene Kanamicina

(medio LB con Kanamicina a razón de 50 µg/mL) para bibliotecas de ADN Zap Express o Ampicilina (medio LB con Kanamicina a razón de 100 µg/mL) para bibliotecas de ADN Zap Il. -Se transfiere el resto de la suspensión a otra placa pequeña de medio LB. -Se usan perlas estériles de vidrio para distribuir uniformemente la suspensión sobre la placa. -Se incuban as placas a 30°C durante 12 a 24 horas,

-Se observan las colonias en las placas.

-Se inocula una sola colonia en medio liquido LB que contiene un antibiótico adecuado e se incuba a 30°C durante 12 a 24 horas. -Se puede preparar un patrón de glicerol mediante la adición de 80% de glicerol en medio de cultivo liquido (15%

v/v) y se almacena a -80°C. Verificación de la actividad -Se transfieren 50 µL de cultivo líquido a un microtubo. Se añaden 500 µL de 8% de Amilopectina Azure pH7 en el

mismo tubo. Se preparan 2 tubos para cada clon.

-: Se analiza la actividad a 50°C durante 3 horas y durante la noche. Se utiliza regulador de pH 7 como control.

-: Se enfría el espécimen de prueba en un baño de agua helada durante 5 minutos.

-: Se añaden 750 µL de etanol y se mezcla completamente.

-: Se centrifuga a 13000 rpm (16000 g) durante 5 minutos.

-: Se mide la OD del sobrenadante a 595 nm.

Análisis RFLP

-: Se transfiere un 1,0 mL de cultivo líquido a un microtubo esterilizado.

-: Se centrifugar a 13200 rpm (16000 g) durante 1 minuto.

-: Se descarta el sobrenadante. Se añade otro 1,0 mL de cultivo líquido en el mismo microtubo esterilizado.

-: Se centrifuga a 13200 rpm (16000 g) durante 1 minuto.

-: Se descarta el sobrenadante.

-: Se sigue el protocolo del mini kit de centrifugación QIAPREPMR para el aislamiento del plásmido.

-: Se revisa la concentración de ADN usando BioPhotometer.

-: Se usa Sac I y Kpn I para la primera digestión doble. Se incuba a 37°C durante 1 hora.

-: Se usa Pst i y Xho I para la segunda digestión doble. Se incuba a 37°C durante 1 hora.

-: Se añade colorante de carga en la muestra digerida.

-: Se corre la muestra digerida en un gel de agarosa al 1,0% durante 1 -1,5 hora a 120 voltios.

-: Se observa el gel con un visualizador. Se pueden analizar las secuencias de todos los clones con un patrón

diferente de digestión.

Ejemplo 18: Ejemplo de protocolos para purificación de enzimas

El siguiente ejemplo describe protocolos de ejemplo para purificar enzimas de esta invención.

SEQ lD NO: 52: 6 g de sobrenadante Iiofilizado de cultivo de P. pastoris (véase discusión en el Ejemplo 25, a

continuación) que expresa la SEQ ID No: 52 se suspendió en 24 mL de H2O y se precipitó con etanol frío. El

producto precipitado se re-suspendió en aproximadamente 40 mL de H2O y se dializó O/N contra agua. Después de

la diálisis, se agregó un regulador de acetato concentrado a pH 6.0 a la muestra para obtener una concentración

final de 50 mM. La proteína unida a la columna (Q SEPHAROSEMR; resina Amersham Pharmacia vertida en una 35 columna XK 50MR) en acetato de Na 50 mM pHv6,0 y se eluyó durante un gradiente entre 0 y 400 mM de NaCI en

acetato de Na de pH 6,0. Se removieron las proteínas contaminantes de la columna con NaCl 1 M en acetato de Na

pH 6,0. La elusión de amilasa de Q SEPHAROSEMR se rastreó con SDS PAGE y los ensayos de actividad usando almidón BODIPY como sustrato. Se realizaron múltiples purificaciones para obtener suficiente proteína para cumplir con el requisito de aproximadamente 1 g. Las fracciones purificadas a partir de estas tandas se reunieron y se concentraron por concentrador de células de agitación.

SEQ ID NO: 48: 24 g de sobrenadante liofilizado de cultivo P. pastoris que expresa la SEQ ID NO: 48 se suspendió

5 en 20 mL de regulador de carbonato 50 mM pH 10,0; NaCI 100 mM y se precipitó con etanol frio. El producto precipitado se re-suspendió en aproximadamente 20 mL de regulador de acetato 50 mM pH 5,2; NaCl 500 mM y se dializó O/N contra regulador málico 50 mM pH 3,5; NaCI 500 mM. La proteína se unió a la columna de agarosa amilosa (NEB) de 100 mL en regulador málico 50 mM pH 3,5; NaCl 500 mM y se eluyó con 0,5% de dextrina de maíz en regulador de carbonato 50 mM pH 10,0; NaCl 50 mM. Las proteínas contaminantes se extrajeron de la

10 columna con regulador de fosfato de sodio 50 mM pH 7,5; NaCI 100 mM. La elusión de glucoamilasa de la agarosaamilosa se rastreó con SDS PAGE.

Otras enzimas de la invención, pueden ser purificadas usando estos protocolos o variaciones de los mismos o protocolos análogos.

La Figura 26 ilustra tablas que resumen la eficiencia de estos protocolos de purificación para las SEQ ID NO: 4, SEQ

15 ID NO: 18, SEQ ID NO: 26 que sirven de ejemplo y datos de actividad correspondientes, entre otros, almidón sin purificar y almidón soluble comparando la enzima purificada y la no purificada.

Las preparaciones de enzimas purificadas de las SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 26 que sirven de ejemplo se analizaron en cuanto a la actividad (la capacidad para hidrolizar) en fermentaciones de almidón sin purificar; estos datos sobre la pureza (determinados mediante análisis densitométrico), concentración, cantidad y regulador de

20 almacenamiento se resumen:

SEQ ID NO: 52: SEQ ID NO: 48

Clase: Alfa-Amilasa Glucoamilasa

Regulador de almacenamiento: GMP* GMA**

Concentración: 25 mg/mL 25 mg/mL

Volumen enviado: 40 mL 20 mL

Cantidad Total: 1,0 g 0,5 g

Pureza: > 90% > 95%

* GMP -20% de glucosa; 0,1% de metil parabeno, PBS pH 7,0 ** GMA -20% de glucosa; 0,1% de metil parabeno; acetato de sodio 50 mM pH. 5,2; NaCl 100 mM.

Ejemplo 19: Ejemplo de protocolo para Iicuefacción de almidón y medición de resultados

El siguiente ejemplo describe ejemplos de protocolos para Iicuefacción de almidón usando, por ejemplo, enzimas de esta invención. Condiciones de Rreacción: PO4 100 mM pH 6,5, 1% (p/p) de almidón licuado DE 12 a 55°C. Tanto

25 los ensayos TLC como HPLC se pueden realizar para verificar la actividad.

Un ejemplo de protocolo para la sacarificación de almidón licuado a un pH de 6,5:

-: Se ajusta el pH del almidón licuado al pH al cual la(s) sacarificación(es) se va a realizar. Se licua el almidón en regulador de acetato de sodio 100 mM, pH 4,5 con sales de fosfato de sodio 100 mM agregadas de manera tal que, antes de la sacarificación, el pH pudiera ser ajustado a pH 6,5.

30 -Se pesan muestras de 5 gramos de almidón licuado en botellas taradas.

-: Se usa 0,04% (p/p) de OPTIDEX L-400MR o aproximadamente 400 mL de un patrón diluido 1 -10 veces de OPTIDEX L-400MR por 100 gramos de almidón licuado.

-: Se calculan los miligramos de OPTIDEX L-400MR contenidos en 400 mL de reserva diluida 1 -10 de OPTIDEX L400MR . A continuación, se calcula el volumen de los lisados requeridos para formar la misma concentración de enzimas que el OPTIDEX L-400MR .

-: Se añaden enzimas a las muestras de almidón licuado y se incuban a temperatura deseada (50 °C). Después de 18 horas se determina DE y se prepara una muestra para análisis por HPLC.

Un ejemplo para la determinación de DE:

Ejemplo de ensayo de neocruproína:

Ejemplo de análisis por HPLC:

Los perfiles de sacarificación de un carbohidrato se miden por HPLC (Bio-Rad Aminex HPX-87A columna de plata, 80°C) usando un detector de índice de refracción. La fase móvil se filtra con agua Millipore a una velocidad de flujo de 0,7 mI/min. Las muestras de sacarificación se diluyen 1 -10 con agua DI acidificada (5 gotas de HCI 6 M en 200 mL de agua DI) luego se filtran a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm. El volumen de inyección es 20 µL.

Ejemplo de TLC:

Ejemplo 20: Licuefacción de almidón usando glucoamilasas

Este ejemplo describe un método de ejemplo de la invención para licuefacción de almidón usando glucoamilasas de la invención. El concentrado de glucoamilasa se puede preparar a partir de los caldos de fermentación por tratamiento térmico, lavado celular, extracción alcalina usando microfiltración y ultrafiltración (48% de rendimiento total). El concentrado de UF puede neutralizarse con ácido acético y formularse con 30% de glicerol a un pH de 4,5. El nivel de actividad de un producto comercial puede ser aproximadamente de 120 U1/g 0,5 kg/tonelada de almidón.

Ejemplo de un ensayo de actividad de glucoamilasa

Una cubeta de 1 mL que contiene 950 µL de MOPS 50 mM pH 7,0 que contiene pNP-α-D-hexa-(1->4)glucopiranosido 5 mM se coloca en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotómetro Beckman DU-7400 precalentado a 80°C. El espectrofotómetro queda en cero a 405 nm y se agregan 50 µL de la solución enzimática a la cubeta, se mezcla bien y se monitorea el aumento en la OD405 nm en un intervalo de un minuto. La velocidad de ∆OD405 nm/min se convierte a una unidad estándar de µmoI/minuto a partir de la respuesta de OD405 nm de 50 µL de 1 µmol/mL de PNP en 950 mL de MOPS 50 mM a pH de 7,0, -80°C. Una unidad estándar de alfa glucoamilasa termoestable (DTAA) es igual a la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 µmoI/mL/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo.

Ensayo de actividad de glucoamilasa estándar

Una cubeta de 1 mL que contiene 950 µL de MOPS 50 mM pH 7,0 que contiene pNP-α-D-glucopiranosido 5 mM se coloca en el controlador de temperatura Peltier del espectrofotómetro DU-7400MR (Beckman) precalentado a 60°C. El espectrofotómetro queda en cero a 405 nm y se agregan 50 µL de la solución enzimática a la cubeta, se mezcla bien y se monitorea el aumento en la OD405 nm en un intervalo de un minuto. La velocidad de ∆OD405 nm/min se convierte a una unidad estándar de µmoI/minuto a partir de la respuesta de OD405 nm de 50 µL de 1 µmol/mL de pNP en 950 mL de MOPS 50 mM a pH 7,0, -60°C. Una unidad Diversa estándar de glucoamilasa (DGA) es igual a la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 µmoI/mL/minuto de pNP bajo las condiciones definidas del ensayo.

Determinación del equivalente de dextrosa El método de ensayo de neocruproína se puede usar para medir el DE. Las muestras seleccionadas se pueden medir por un procedimiento que se describe aquí, y mediante un análisis GPC usando el procedimiento de Fehlings de GPC.

Ensayo de neocuproína

Determinación de almidón residual

Las muestras de post-sacarificación se pueden chequear para almidón residual usando el procedimiento de yodo de Staley.

Se pesan 20 gramos de muestra en un plato de pesaje grande. Se agregan 45 µL de solución de yodo al plato de pesaje y la solución de almidón se mezcla bien. El azul oscuro indica la presencia de almidón, un azul claro -verde indica almidón leve, verde claro indica un rastro de almidón y amarillo -rojo, ausencia de almidón. La solución de yodo se prepara al disolver 21,25 gramos de yodo y 40,0 gramos de yoduro de potasio en un litro de agua.

Perfil del oligosacárido

Cromatografía de permeación de gel

La distribución del peso molecular se puede determinar por cromatografía, por ejemplo, en una columna µL AQUAGEL-OHMR con detección de masas por índice de refracción (Waters Model 2410). Un detector Viscotek modelo T60MR se usa para mediciones continuas de viscosidad y de dispersión de luz.

Electroforesis capilar

Sistema de glucoproteínas Beckman Coulter P/ACE MDQMR -separación de oligosacáridos derivados de APTS en un capilar de sílice fundida -detección por fluorescencia inducida por láser.

Licuefacción primaria

El almidón de línea directamente del proceso GPC es bombeado a un tanque de alimentación de 60 litros donde el pH, DS (sólidos secos) y el nivel de calcio se pueden ajustar antes de la licuefacción. La amilasa se agrega a la suspensión. La suspensión de DS al 32% se bombea a razón de 0,7 litros/minuto mediante una bomba de desplazamiento positivo al chorro -una cámara de mezcla presurizado donde se calienta instantáneamente la suspensión de almidón a más de 100°C mediante inyección de vapor. El almidón licuado parcialmente gelatinizado se bombea a través de una red de tuberías (aún bajo presión) para obtener el tiempo de residencia deseado (5 minutos) a temperatura. La presión se libera en un tanque de expansión y se pueden tomar muestras. Las muestras se toman por duplicado.

Licuefacción secundaria

El almidón licuado se recoge en botellas de vidrio de un litro y se mantiene en un baño de agua a 95°C durante 90 minutos.

Sacarificación El almidón licuado se enfría a 60°C, el pH se ajusta a 4,5 y las muestras se tratan con glucoamilasa. El progreso de la sacarificación se monitorear en el tiempo, mediante HPLC.

Sacarificación

Los jarabes licuados producidos con cada glucoamilasa se ajustaron hasta aproximadamente pH 2,5 con HCI 6 N en forma inmediata después de Iicuefacción secundaria de 90 minutos para inactivar cualquier glucoamilasa residual. Los jarabes se ajustan luego a pH 4,5, se colocan en un baño de agua de 60°C y se sacarifican con tres niveles de glucoamilasa. El grado de sacarificación se monitorea por HPLC en puntos de tiempo de 18 -88 horas.

Progreso de la sacarificación -desarrollo del % de dextrosa vs tiempo -0,04% de glucoamilasas.

Ejemplo 21: Ejemplo de un proceso de licuefacción de Almidón

Este ejemplo describe un ejemplo de un proceso de Iicuefacción de almidón de la invención que comprende el uso de enzimas de la invención. La conversión de almidón a glucosa puede ser catalizada por la acción de la secuencia de dos enzimas: amilasas (por ejemplo, alfa-amilasas), para licuar el almidón (por ejemplo, la hidrólisis de polímeros de glucosa de alto peso molecular a oligosacáridos que consisten de 2 a 20 unidades de glucosa, por lo general un equivalente de dextrosa de 10 a 12, por una glucoamilasa de la invención), seguido de sacarificación con una glucoamilasa (que puede ser una glucoamilasa de la invención). En un aspecto, el procesamiento está en la planta de molienda húmeda de maíz que produce una suspensión de almidón que tiene un pH de alrededor de 4,0 a 4,5. En un aspecto, el pH se eleva, por ejemplo, hasta 5,8, hasta 6,0 antes de licuefacción para acomodar una glucoamilasa con actividad y estabilidad de pH bajo. En un aspecto, las glucoamilasas de la invención pueden licuar almidón a un pH de 4,5 a equivalentes de dextrosa que van de 12 a 18; en un aspecto, usando glucoamilasas de la invención a niveles de alrededor de 3 a 6 gramos por tonelada de almidón. En este aspecto, el uso de las glucoamilasas de la invención permite que la licuefacción de almidón sea realizada a un pH de 4,5.

En un aspecto, la licuefacción de almidón se realiza a un pH de 4,5 durante 5 minutos a 105 °C hasta 90 minutos a 95°C usando las glucoamilasas de la invención. La cantidad de enzima se ajusta a fin de ajustar un DE objetivo de 12 a 15 después de la licuefacción. En un aspecto, el almidón licuado se sacarifica luego con una glucoamilasa, por ejemplo, una glucoamilasa de Aspergillis, durante aproximadamente 48 horas aproximadamente a pH 4,5 y 60 °C. Si el jarabe sacarificado no contiene al menos 95% de glucosa, el DE de la Iicuefacción objetivo se eleva y se repite la sacarificación hasta que la licuefacción eventualmente produjo un jarabe sacarificado que contenía más de 95% de glucosa. La proteína glucoamilasa requerida para producir un materia prima licuada adecuada para sacarificación se determina por PAGE.

Ejemplo 22: Identificación de péptidos generados de proteólisis de proteasa en prueba de fluido gástrico simulado (SGF)

Este ejemplo describe la identificación de pequeños péptidos resultantes de la proteólisis con pepsina de la SEQ ID NO: 52 (codificada, por ejemplo, por la SEQ lD NO: 51). Este ejemplo también describe la evaluación de la actividad de los ejemplos de enzimas en pruebas de “Fluido gástrico simulado" (SGF) in vitro. Las pruebas de SGF mostraron que todas las enzimas fueron digeridas rápidamente por la pepsina proteasa gástrica. En un caso, un fragmento pequeño resistente a pepsina fue observado después de 60 minutos de tratamiento.

La Figura 21 ilustra un SDS PAGE que muestra los resultados de proteólisis (digestibilidad in vitro, la prueba de SGF) de la SEQ ID NO: 52 por pepsina a un pH de 1,3; la pepsina corta en el terminal C de los residuos de Lys (K) y Phe (F) (la flecha superior indica una banda de 36.5 K, la flecha del medio una banda de 5 K (véase discusión, a continuación) y la flecha inferior una banda de 3 K). Se usó estándar preteñido SEEBLUE PLUSZMR de Invitrogen y MARKER12MR de Invitrogen. Todas las muestras se corrieron sobre geles de Tricina al 16%. Una banda común presente en todas las pruebas es pepsina.

La Figura 22 ilustra la caracterización de los péptidos generados en esta digestión de la SEQ ID No: 52, como se identifica usando análisis por LC MS/MS (cromatografía líquida / espectrometría de masa / espectrometría de masa); se identifica un sitio de glicosilación ligado a N.

La Figura 23A ilustra el esquema de aislamiento de péptido pequeño usado (para los péptidos generados por la proteólisis de la SEQ ID NO: 52 por pepsina). La Figura 23B se discute a continuación e ilustra un SDS PAGE de los resultados del esquema de aislamiento de péptido pequeño, donde el carril 1 es solamente pepsina, el carril 2 es amilasa no digerida de SEQ ID NO: 52, el carril 3 es la amilasa de la SEQ ID NO: 52 digerida por pepsina, el carril 4 es el corte superior de 30 kd como se ilustra en la Figura 23A, el carril 5 es la que fluye de 30 kd como se ilustra en la Figura 23A, el carril 6 es la muestra capturada por C18 RP (cromatografía en columna de fase reversa C18) como se ilustra en la Figura 23A.

La Figura 23C ilustra el perfil de LC/MS de la fracción eluida por C18 RP y se discute a continuación.

La Figura 23D ilustra la secuencia de los péptidos identificados por el análisis de LC MS/MS; la Figura 23E y la Figura 23F ilustran los sequins “Asn-Xaa-Ser/Thr" en la secuencia producida (resaltada en azul); las asparaginas que se predice son N-glicosiladas se resaltan en rojo.

Ensayos de digestibilidad in vitro: No se detectaron versiones de longitud completa de ninguna de las enzimas evaluadas por SDS-PAGE después de tratamiento con SGF, lo que indica que la pepsina había digerido cada una de las proteínas de longitud completa; después de 60 minutos de tratamiento con SGF, los fragmentos proteolíticos pequeños, alrededor de 6 kDa en tamaño, fueron observados en las digestiones de α-amilasa de la SEQ ID NO: 52 (véase discusión en el Ejemplo 22).

Prueba de actividad después del tratamiento con pepsina: Para determinar si existe actividad residual después del tratamiento con pepsina, se modificó la prueba con SGF y se realizaron pruebas de actividad con dextrina como sustrato para las glucoamilasas y almidón BODIPY como substrato para las α-amilasas. No se observó actividad residual para cualquiera de las enzimas evaluadas, después de tratamiento con SGF durante 60 minutos. La pérdida de actividad fue causada ya sea por digestión con pepsina de las proteínas de prueba (por ejemplo la SEQ ID NO: 4, SEQ lD NO: 76 y SEQ ID No: 2), por la inactivación de la enzima bajo las condiciones de reacción de pH bajo, o ambos.

Para identificar la banda de péptido resistente a pepsina, que migran en un rango de 5 kDa en un SDS-PAGE, se enriqueció con péptidos pequeños mediante filtración de la muestra sobre una membrana filtrante de 30 kDa. El flujo fue purificado de manera adicional usando una columna de extracción de fase sólida C18. Los péptidos recuperados fueron luego analizados por secuenciamiento del terminal N con degradación de Edmond, LC-MS y espectroscopía de masa en tandem LC para determinar la secuencia peptídica. Las muestras analizadas por espectroscopía de masa en tandem LC fueron tratadas primero con proteasa de tripsina.

Purificación de péptidos: Para determinar la secuencia de la banda de péptidos de 5 kDa, se enriqueció el péptido pasando primero la reacción de la SEQ ID NO: 52 tratada de pepsina por una membrana de filtro de 30 KDa. El flujo fue luego purificado usando una columna de extracción de fase sólida C18. Los péptidos recuperados formaron una banda en el rango de 5 kDa en un SDS-PAGE. La Figura 23B ilustra un análisis SDS-PAGE del péptido de alfaamilasa resistente a pepsina de la SEQ ID NO: 52. Este gel se tiñó con Coomassie. El carril 1 es la pepsina proteasa. El carril 2 es la amilasa de SEQ ID NO: 52. El carril 3 es la amilasa de la SEQ ID NO: 52 tratada con pepsina proteasa. El carril 4 es la misma que la muestra 3 que no fluyó a través de una membrana filtrante de 30 kDa. El carril 5 es el flujo a través de la muestra en el carril 3 una vez que atravesó la membrana filtrante de 30 kDa. El carril 6 es la muestra 5 después de la recuperación de una columna de extracción de fase sólida C18.

Para determinar las masas peptídicas en la muestra recuperada, los péptidos se analizaron mediante análisis LC-MS en una columna de fase reversa C18. El perfil m/z de esta muestra mostró que existen múltiples masas de varios valores m/z que están presentes en esta muestra, como se ilustran en la Figura 23C, un análisis LC-MS de los péptidos pequeños de amilasa de SEQ ID NO: 52. La fase sólida era un material RP C18. Un gradiente de 5% -80% de ACN (15 -90 minutos) fue usado como la fase móvil en el experimento.

Secuenciamiento del terminal N por degradación de Edmond: Para determinar la secuencia de los péptidos pequeños de la SEQ ID NO: 52, los péptidos purificados se enviaron a secuenciamiento del terminal N usando el método de degradación de Edmond. Los resultados para este análisis quedaron inconclusos ya que un número de diferentes aminoácidos fue liberado en cada etapa de la escisión. Este resultado fue consistente con el análisis LC/MS que mostró que existe más de una especie prominente de péptidos presentes en esta muestra.

Análisis por espectroscopia de masa en tándem LC: Para determinar la secuencia de péptidos presente en la fracción de péptido purificado de amilasa de la SEQ ID NO: 52, estos fueron tratados con tripsina proteasa y analizados por LC MS/MS. Este análisis resultó en la identificación de los siguientes siete péptidos; estas secuencias peptídicas fueron identificadas por las búsquedas SEQUESTMR del análisis de LC MS/MS de los péptidos trípticos pequeños de amilasa de la SEQ ID NO: 52.

Péptido: Secuencia del péptido Ubicación del residuo dentro de la SEQ ID NO: 52

1: AGQEQHYSGGSDPANR 349 -364

2: VFSGDPAYTCPYQN 251 -264

3: SGDPAYTCPYQN 253 -264

4: SLLLLLSVFGQATHA 6 -20

5: YENTGDGTSYHG 90 -101

6: VYCGGSWQGIINHLD 56 -70

7: GYSAGATLVETYTCT 448 -462

También se determina que existe una cantidad de picos de péptidos en el espectro de LC-MS que su perfil de MS/MS no coincidió ni con la SEQ ID No: 52 ni con los otros péptidos en la base de datos. Una posible razón para esto podría ser la modificación compleja de glicosilación ligada a N de la proteína progenitora que tiene lugar en el organismo huésped, Pichia pastoris. Para probar esta hipótesis, los péptidos extraídos se trataron primero con PNGasa F para remover sus grupos glucosilo ligados a N. Los péptidos resultantes se trataron después con tripsina y se sometieron a análisis de LC MS/MS para determinar su composición peptídica. Este análisis determinó que existían al menos 6 especies de péptidos diferentes presentes en la muestra (véase resumen de la Tabla anterior). La resolución de estos péptidos, después del tratamiento de desglicosilación, sugiere que estos péptidos eran parte de otros péptidos que fueron glicosilados en la muestra.

En conclusión, el secuenciamiento del terminal N y el análisis LC-MS mostró que la banda de péptidos de 5 KDa resultante de la digestión con pepsina proteasa de la amilasa de la SEQ ID NO: 52 está compuesta por muchas especies de péptidos diferentes. Esto se debe posiblemente a la digestión incompleta de la amilasa de la SEQ ID NO: 52 por la pepsina proteasa en parte debido al estado de glicosilación de estos péptidos. Por lo tanto, no existe una especie de péptido prominente en los espectros de MS -están presentes múltiples péptidos; múltiples especies de péptidos diferentes fueron secuenciadas en la muestra; el secuenciamiento químico del terminal N también brindó evidencia de la presencia de péptidos múltiples; existe una especie de péptidos que solamente aparece después de la desglicosilación con PNGasa F de la muestra, lo que sugiere un evento relacionado con glicosilación es el responsable por la aparición de este péptido.

Esta serie de ejemplos de protocolos se puede usar en cualquier polipéptido de la invención, por ejemplo, un ejemplo de secuencia de la invención, para determinar la secuencia, motivos, incluyendo motivos de glicosilación, sitios activos y similares.

Ejemplo 23: Amilasas activas a baja temperatura

Este ejemplo describe elaboración y caracterización de las enzimas de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 70, que son activas a bajas temperaturas, incluyendo las que tienen habilidad para hidrolizar almidón a bajas temperaturas. Este ejemplo también describe el desarrollo de un cóctel de enzimas que puede hidrolizar > 95% del almidón en el maíz molido en azúcares fermentables en no más de 60 horas a alrededor de 30 a 40 °C y alrededor de pH 3,5 a pH 5,5 en presencia de levadura. En un aspecto, la cantidad total de proteína enzimática requerida no es mayor a 50 gramos/toneladas de maíz, por ejemplo, en realizaciones alternativas 0,05% p/p, o 0,005% p/p, o cualquier parte en el rango entre 0,05% p/p a 0,005% p/p.

Las velocidades de reacción iniciales para hidrólisis de almidón fueron determinadas; y se estudiaron la influencia del pH en diferentes rangos, por ejemplos, en el rango de alrededor de pH 3,5 -7,0 y las temperaturas en diferentes rangos, por ejemplo, en el rango de alrededor de 30 -40°C, sobre la actividad de las enzimas; también se determinó la especificidad del tipo de enlace de glucoamilasas.

Métodos:

1.: Determinación de la concentración de proteínas

Los sobrenadantes liofilizados de los cultivos de P. pastoris que expresan glucoamilasas y α-amilasas se suspendieron en agua a una concentración de ~10 mg de polvo / ml. Después de la determinación del contenido de proteína por el protocolo Bradford, 5 µg de una muestra de proteínas y solución BSA estandarizada se corrieron sobre un gel de gradiente de 4 -20% de Tris-Glicina. El gen se escaneó en un escáner de gel BioRad GS800MR después de tinción con azul Coomassie. El software Bio-Rad QUANTITY ONEMR se usó para la cuantificación de las bandas de BSA y glucoamilasa (o α-amilasas) y se calculó luego la concentración real de enzimas. La concentración de proteínas se ajustó en consecuencia y se confirmó por SDS PAGE adicional.

2.: Determinación de velocidades de reacción iniciales.

A menos que se indique lo contrario, los ensayos se realizaron por triplicado a 37 °C y pH 5,0 en regulador (NaCH3Co2 50 mM, CaCl2 10 mM; NaN3 10 mM y 0,01% de Triton X-100) que contiene 1% de almidón sin purificar, o 0,5% de dextrina o 1% de "almidón de maíz soluble". Los ensayos se realizaron a una escala de 0,5 ml para glucoamilasa y 0,25 ml para alfa-ami-asa (α-amilasa) en una incubadora de mesa Eppendorf con agitación constante (800 rpm).

Para las glucoamilasas, las reacciones comenzaron al agregar la enzima (concentración final de 0,25 µg/ml) a la mezcla de reacción. A 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20 y 30 min, se retiraron alícuotas de 50 µl de alícuotas de las reacciones y se neutralizaron por adición a 100 µl de regulador Tris 1 M, pH 7,5. Para las alfa-amilasas (α-amilasas), las reacciones comenzaron al agregar la enzima (concentración final de 0,4 µg de proteína total/ml para la SEQ ID No: 56, 13434 y SEQ ID NO: 52; 2 µg/ml para la SEQ ID NO: 62; 4 µg/ml para la SEQ ID NO: 70) a la mezcla de reacción y se retiraron alícuotas de 10 µl de las reacciones y se neutralizaron en reactivo de BCA a 2,5, 10, 15, 20, 25, 30 y 40 min. Para la determinación de los perfiles de temperatura, los ensayos se realizaron a 30, 34, 37 y 40 ºC.

El efecto de pH sobre las actividades de glucoamilasa y amilasa se evaluaron a pH de 3,5, 4, 5, 6 y 7, usando el regulador de rango amplio de pH de Britton -Robinson (CH3COOH 50 mM; H3PO4; H3Bo3). Las reacciones paralelas a un pH de 4, 5 y 6 se realizaron también en presencia de regulador de acetato 50 mM para asegurar que el regulador usado no influyó en los resultados. Para la determinación del perfil de pH de dos alfa-amilasas (αamilasas) que dependen de calcio de la SEQ ID NO: 56 y SEQ lD NO: 62, se usaron reguladores de ácido málico / acetato / MES en vez del de Britton-Robinson.

Preparación de “almidón de maíz soluble" para la reacción con alfa-amilasas. La dextrina (Sigma D2006) no se pudo usar como sustrato en las reacciones de alfa-amilasa BCA debido al medio con alto contenido de extremos reductores. Por lo tanto, se empleó almidón de maíz calentado (material de Syngenta) como sustrato. Se disolvió 2% de almidón de maíz en agua desionizada y se calentó mezclando en un baño de agua en ebullición durante 30 -40 minutos, hasta que el almidón se disolvió y la solución tomó aspecto lechoso, pero traslúcido. La solución de almidón calentado se usó durante 2 días, después de lo cual se observaron algunos signos de degradación (apariencia de grumos de almidón) y se descartó la solución.

3.: Ensayo de glucosa oxidasa / peroxidasa (GO) para la cuantificación de glucosa liberada durante la hidrólisis de almidón.

Se usó un ensayo de glucosa oxidasa/ peroxidasa (GO) acoplada para determinar la cantidad de glucosa liberada por la glucoamilasa durante la hidrólisis de almidón. Las reacciones de GO comenzaron al agregar 10 µl de la reacción de hidrólisis de almidón neutralizada a 90 µl de PBS que contenía glucosa oxidasa (0,1 U/ml), peroxidasa (0,25 U/ml) y Amplex Red 0,05 mM, en placas Nunc negras de 96 pozos. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 min antes de la lectura en un lector de placas fluorescentes con Ex/Em 545/590 nm. Una curva estándar con concentraciones de glucosa de 0 a 100 µM se usó para evaluar la cantidad de glucosa producida en las reacciones de hidrólisis. Las velocidades iniciales de hidrólisis de almidón (nmoles de glucosa liberada de 1% de almidón granular / min / µg de glucoamilasa) se determinaron al graficar la cantidad de glucosa liberada en el tiempo y calculando la pendiente de la línea de mejor ajuste a través de los puntos de datos.

4.: Ensayo de BCA para determinar el incremento en la concentración de extremos reductores durante la hidrólisis de almidón.

Una alícuota de 10 µl de reacción de hidrólisis de almidón de amilasa se neutralizó en 100 µl de reactivo BCA (que consistía de 64 mg/mL de carbonato de sodio monohidrato, 24 mg/mL de bicarbonato de sodio, 1,95 mg/mL de BCA, 1,24 mg/mL de sulfato cúprico pentahidrato, 1,26 mg/mL de L-serina). El desarrollo de color se produjo durante la incubación de la reacción neutralizada a 80 °C durante 35 minutos y fue seguido por la determinación de la absorbancia a 560 nm. Las velocidades iniciales se calcularon durante un período de reacción de 40 min. Se construyó una curva estándar usando maltosa (0 -54 µM) fue construida para correlacionar A560 nm con la concentración de los azúcares reductores generados (nmoles). La actividad específica se expresó como nmoles/min/µg de enzima.

5.: Especificidad del tipo de enlace de glucoamilasas con maltosa e isomaltosa como sustratos

Las reacciones comenzaron al agregar la enzima (concentración final de 5 µg/ml para maltosa y 30 µg/ml para isomaltosa) a la mezcla de reacción. A los 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 40 min, se retiraron alícuotas de 5 µl de las reacciones y se neutralizaron mediante la adición a 10 µl del regulador Tris 1 M, pH 7,5. Se usaron 9 concentraciones de sustrato en los estudios, oscilando de 0 a 12 mM para maltosa y 2,5 a 120 mM para isomaltosa. Las reacciones se realizaron por triplicado a 37 °C y pH 5,0 en regulador (NaCH3CO2 50 mM, CaCl2 10 mM), a escala de 50 µl en una incubadora de mesa Eppendorf con agitación constante (800 rpm). La producción de glucosa se midió al final de la reacción usando el ensayo de glucosa oxidasa / peroxidasa (GO).

Resultados

1. Caracterización de las glucoamilasas:

1.1 Velocidades de reacción iniciales: Las velocidades iniciales para hidrólisis de almidón granulado y soluble se presentan en la Tabla 2, ilustradas en la Figura 24. Como se puede observar a partir de la Tabla 2, las amilasas y/o glucoamilasas mostraron hasta 3 veces mejor actividad (SEQ ID NO: 48) contra el almidón granulado, con similar o ligeramente mejor actividad sobre el almidón soluble cuando se compara con la enzima de punto de referencia A. niger. La SEQ ID NO: 20 no pareció mostrar actividad contra el almidón granulado bajo las condiciones ensayadas (probablemente debido a la falta de un dominio de enlace a almidón). La Tabla 2 (Figura 24) resume los datos que comparan las velocidades iniciales de la hidrólisis de almidón de maíz granulado y soluble (dextrina) por las enzimas que sirven de ejemplo (incluyendo aquellas con actividad de glucoamilasa) y una enzima glucoamilasa de A. niger que sirve como referencia a 37 °C, pH 5,0; las velocidades iniciales se expresan como nmoles de glucosa/min/µg de proteína glucoamilasa liberada de 1% de almidón granulado o de 0,5% de dextrina. Cada número es el valor promedio de 6 -10 puntos de datos.

1.2 Perfil de temperatura: se determinó el efecto de temperatura sobre la actividad de las enzimas que sirven de ejemplo, incluyendo glucoamilasas, sobre almidón granulado como sustrato; se usó una enzima como "punto de referencia", la glucoamilasa de A. niger comercialmente disponible. La liberación de glucosa se midió a 30, 32, 34, 36, 38 y 40 °C a un pH 5.0. Las actividades de las glucoamilasas aumentaron con la temperatura; fueron más activas a 40 ºC pero retuvieron aproximadamente 50% de actividad pico a 30 ºC.

La Figura 25 ilustra el efecto de la temperatura sobre la actividad del ejemplo de la glucoamilasa de la SEQ ID NO: 20 y el punto de referencia” de A. niger con almidón soluble (dextrina) como sustrato. La liberación de glucosa se midió a una temperatura indicada a pH 5,0.

1.3 Perfil de pH: La influencia de pH sobre la hidrólisis de almidón se evaluó tanto con almidón granular como con almidón soluble, respectivamente. Todas las glucoamilasas hidrolizaron ambos substratos mejor a pH inferior, siendo la SEQ ID NO: 26 la de carácter más ácido. Para ambos sustratos, se midió la liberación de glucosa al pH indicado a 37 °C. Las velocidades iniciales se calcularon por encima de los 20 min y se convirtieron a un porcentaje de la velocidad máxima.

1.4 Especificidad de escisión del tipo de enlace: Los parámetros cinéticos para la hidrólisis de maltosa (enlace α-1,4) e isomaltosa (enlace α-1,6) se determinaron para 7 glucoamilasas seleccionadas y la glucoamilasa de A. niger como "punto de referencia". Los experimentos se realizaron con Iisados de P. pastoris Iiofilizados y las proteínas no se purificaron; por lo tanto, únicamente se reportan aquí los datos independientes de concentración de proteínas. La Tabla 3, a continuación, resume los valores de KM para maltosa e isomaltosa y la relación de kcat/KM para maltosa comparado con kcat/KM para isomaltosa. Estos parámetros determinados para glucoamilasa de A. niger están en concordancia con los datos publicados; por ejemplo, KM para maltosa se reporta que es 1,2 -2,1 mM; KM para isomaltosa se reporta que es 19,8 -42.0 y kcat/KM para maltosa sobre kcat/KM para isomaltosa se reporta que está entre 300 -600, de acuerdo con Frandesen (1995) Biochemistry 34: 10162 -10169; Sierks y Svensson (1996) Biochemistry 35: 1865 -1871; Fagerstrom y Kalkkinen (1995) Biotechnol. Appl. Biochem. 21: 223 -231.

La Tabla 3, resume los parámetros cinéticos para hidrólisis de maltosa e isomaltosa por siete ejemplos de glucoamilasas y una glucoamilasas de A. niger como “punto de referencia" A. niger; cada número es el valor promedio de 5 experimentos diferentes:

Tabla 3

Maltosa: Isomaltosa kcat/KM (maltosa) /kcat/KM (isomaltosa)

KM (mM)
KM (mM)

SEQ ID NO: 28: 0.61 ± 0.06 11.94 ± 4.99 750

SEQ ID NO: 74: 1.87 ± 0.17 11.55 ± 2.92 481

SEQ ID NO: 20: 2.62 ± 0.19 53.97 ± 23.17 897

SEQ ID NO: 14: 2.67 ± 0.15 41.5 ± 5.05 116

SEQ ID NO: 26: 0.98 ± 0.33 12.18 ± 0.64 456

SEQ ID NO: 48: 2.26 ± 0.12 21.69 ± 3 565

SEQ ID NO: 18: 1.01 ± 0.09 11.74 ± 7.74 415

Glucoamilasa de A. niger: 0.93 ± 0.1 18.72 ± 3.95 249

Como puede observarse a partir de la Tabla 3, el ejemplo de la glucoamilasa de la SEQ lD NO: 20 fue la más fuertemente selectiva para maltosa y tuvo casi 900 veces mayor especificidad hacia los enlaces α-1,4 con relación a 5 los enlaces α-1,6. La glucoamilasa menos selectiva fue la SEQ ID NO: 14 con especificidad ~100 veces mayor hacia los enlaces α-1,4 con relación a los enlaces α-1,6.

Ejemplo 24: Caracterización de alfa-amilasas y/o glucoamilasas

Este ejemplo describe la caracterización de alfa-amilasas y/o glucoamilasas.

Velocidades iniciales de reacción: Las velocidades iniciales de hidrólisis de almidón granulado y soluble para ocho

10 (8) ejemplos de α-amilasas se compararon con una α-amilasa como "punto de referencia" de A. oryzae y los resultados se resumen en la Tabla 4, a continuación. Debido al entorno relativamente alto observado en los ensayos de BCA con α-amilasa de A. oryzae de Sigma (A6211), se evaluó también una segunda preparación de la misma amilasa de Megazyme (E-ANAAMMR . Los resultados obtenidos con ambas preparaciones fueron muy similares. Como se puede observar a partir de la Tabla 4, todas las amilasas evaluadas mostraron una actividad

15 significativamente mayor contra almidón soluble cuando se comparó con almidón granulado. Sin embargo, esta diferencia fue menos marcada para las amilasas y/o glucoamilasas de ejemplo que para la enzima de A. oryzae que sirve como “punto de referencia".

La Tabla 4 muestra los datos que comparan las velocidades iniciales de hidrólisis de almidón de maíz granulado y almidón de maíz soluble para ocho (8) α-amilasas y/o glucoamilasas de ejemplo y la α-amilasa que sirve como

20 “punto de referencia” de A. oryzae a 37 °C y pH 5 (nota: *Las velocidades iniciales se expresan como nmoles de los extremos reductores liberados a partir de 1% de almidón/min/µg de proteína α-amilasa para las SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 62, SEQ ID No: 2 y SEQ lD NO: 52; **Las velocidades iniciales para las SEQ lD NO: 70, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 76 se expresan como nmoles ara los extremos ductores liberados a partir de 1% de almidón/min/µg de proteína total; cada número es un valor promedio de 5 puntos de datos:

25 Tabla 4

Enzima: Velocidad inicial* ± SD de almidón granulado Velocidad inicial* ± SD de almidón soluble

SEQ ID NO: 56: 15.7 ± 1.67 1607.9 ± 518.22

SEQ ID NO: 70**: 2.1 ± 0.24 28.4 ± 3.81

SEQ ID NO: 62: 3.5 ± 0.37 139.6 ± 55.96

SEQ ID NO: 66**: 0.8 ± 0.09 81.3 ± 31.11

SEQ ID NO: 2: 7 ± 0.75 381.2 ± 74.15

SEQ ID NO: 52: 10.3 ± 1.75 248.2 ± 28.46

SEQ ID NO: 76**: 2.6 ± 0.41 160.3 ± 42.62

Amilasa de A. oryzae (MegazymeE-ANAAM): 0.4 ± 0.07 498.7 ± 64.78

Perfil de temperatura: Se determinó el efecto de temperatura sobre hidrólisis de almidón por las α-amilasas caracterizadas. Se midió la actividad a un pH 5,0 durante 40 min de incubación a la temperatura indicada y las velocidades iniciales se calcularon y se graficaron contra el tiempo. Las actividades de las amilasas fueron afectadas por la temperatura en un grado diferente. Cinco de las amilasas y/o glucoamilasas de ejemplo, las SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 70, SEQ ID No: 76 y SEQ ID NO: 66, fueron más activas a 40 °C y retuvieron aproximadamente 30% de actividad a 30 °C. Las actividades de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 62 fueron afectadas solamente marginalmente por los cambios en la temperatura en el rango investigado.

Perfil de pH: La influencia de pH sobre las amilasas y/o glucoamilasas de ejemplo sobre la hidrólisis de almidón se evaluó tanto con sustratos de almidón granulado como los de almidón soluble y se determinaron los resultados fueron. El incremento en los extremos reductores se midió en el pH indicado a 37 °C. Las velocidades iniciales se calcularon sobre 40 min y se convirtieron a un porcentaje de la velocidad máxima. La SEQ ID NO: 52 de ejemplo (originalmente de origen fúngico) tuvo el menor pH óptimo (aproximadamente pH 4). Otra enzima de ejemplo, SEQ ID NO: 2 (también originalmente de origen fúngico) también mostró preferencia por pH ácido, con un pH aparente óptimo aproximadamente a pH 4,5 -5. La amilasa de ejemplo la SEQ ID NO: 66 (originalmente de origen arqueal) tuvo un pH aparente óptimo de aproximadamente pH 5,0, reteniendo aproximadamente 70% de la actividad pico a un pH 4,0. Las enzimas restantes de ejemplo tuvieron un pH óptimo entre 5,0 y 6,0 y fueron casi inactivas a un pH de 4,0 y 3,5.

Ejemplo 25: Expresión de las amilasas y/o glucoamilasas de la divulgación en células huésped

Este ejemplo describe la evaluación de expresión de enzimas de ejemplo de la divulgación en diferentes células huésped; en particular, la expresión de tres (3) amilasas de ejemplo en diferentes huéspedes de expresión: se estudiaron Pichia pastoris, Hansenula polymorpha y Cochilobolus heterostrophus.

H. polymorpha: se usaron dos vectores de expresión (Artes Biotechnology GmbH. Erkrath, Alemania); pFPMT-MfaMR con un promotor de formato deshidrogenasa y pTPS1-MfaMR con un promotor de trehalosa-6-fosfato sintasa. En ambos vectores, la señal de secreción usada fue la pre-prosecuencia del factor de apareamiento MFa1 de Saccharomyces cerevisiae.

Se introdujeron plásmidos con genes subclonados de amilasa introducidos en células competentes de H. polymorpha por electroporación. Se seleccionaron 96 colonias de cada transformación y se cultivaron durante aproximadamente 30 (3 pasadas) hasta 80 (8 pasadas) generaciones mediante diferentes etapas de sub-cultivo, bajo condiciones selectivas en medio líquido (YNB-Glucosa). Estas etapas permiten incrementar el número de copia y facilitan la integración del plásmido en el cromosoma. Después de estos 3 u 8 de pasadas, los transformantes se cultivaron bajo condiciones no selectivas (medio YPD) para evaluar la estabilización del plásmido (pérdida de cualquier plásmido no integrado). El cribado para clones positivos se realizó sobre placas de agar con almidón rojo. Los clones con una zona de aclaramiento más grande que el control (mismo gen expresado en P. pastoris) se seleccionaron como aciertos primarios. La expresión de amilasa por los clones seleccionados se confirmó evaluando los sobrenadantes del cultivo en sustrato de almidón BODIPY y se usó SDS PAGE para visualización de la proteína producida. Se preparó 1 L de cultivos para evaluación adicional.

Cochilobolus heterostrophus. Se subclonaron ADNc y ADNg de amilasa de C. heterostrophus en pCh-ubi (promotor de ubiquitina) y pCh-GPD (promotor de GPD) y dirigieron al locus PKS18 de la cepa C5 de C. heterostrophus por transformación de protoplasto mediada por PEG, usando un constructo linealizado de ADN. Uno de los constructos, una versión genómica bajo un promotor ubi (ubiquitina), fue también introducido en la cepa JMD3 a partir de la cual el gen que codifica amilasa había sido suprimido. En forma similar, como en el caso de P. pastoris, el cribado de los transformantes se realizó en placas de almidón rojo y se confirmó mediante ensayos de almidón BODIPY y SDS PAGE con sobrenadantes de cultivo. No se observó diferencia en la expresión entre el ADNc y las versiones genómicas. En forma similar, no se observó diferencia significativa con los dos promotores diferentes.

5 Resultados: Se construyeron cepas de: H. polymorpha y C. heterostrophus que expresan, para comparación, 3 genes que codifican amilasa y genes que codifican glucoamilasa de ejemplo. Además de 3 cepas originales de P. pastorís. Todas las cepas usadas para comparación y fermentación preliminar obtenidos con estas cepas se presentan en la Tabla 5, los resultados de expresión estimada (g/L) de las amilasas y/o glucoamilasas de ejemplo de la divulgación producidas en Pichia:

10 Tabla 5

Origen del gen de amilasa: Pichia pastoris

Fúngico: SEQ ID NO: 2 0.01*

bacteriano: SEQ ID NO: 70 0.07*

arqueal: SEQ ID NO: 66 0.13*

*rendimiento de la fermentación

Después de la evaluación de la expresión, se compararon la pureza, actividad específica y desempeño de la proteína en ensayos de hidrólisis de almidón granulado. Estas comparaciones arrojaron las siguientes conclusiones:

-: No se observaron diferencias bioquímicas significativas entre las enzimas expresadas en los diferentes huéspedes.

15 -La expresión en Hansenula no pareció generar una mejora en la expresión observada en P. pastoris. Además, las proteínas expresadas parecieron ser altamente glicosiladas.

Ejemplo 26: Fermentación de almidón sin purificar usando amilasas de esta divulgación

Este ejemplo describe métodos de ejemplo para fermentación de almidón sin purificar usando amilasas de esta divulgación.

20 Se identificaron inicialmente quince (15) enzimas de ejemplo que consistían de ocho (8) alfa-amilasas y siete (7) glucoamilasas. Los ejemplos de enzimas "principales" se determinaron sobre la base de la actividad a temperaturas de 30° a 40 °C un rango de pH de 3.5 -7,0 e hidrólisis de 1% de almidón in purificar. No se analizó primero la enzima microbiana purificada para la cantidad de proteínas y proporciones de expresión; y luego se evaluaron en fermentaciones de almidón sin purificar. Se determinaron luego la carga de enzima total y las proporciones de alfa

25 amilasas con respecto a las glucoamilasas.

Nota: para el trabajo de fermentación del almidón sin purificar, se obtuvieron todas las enzimas por expresión en Pichia pastoris, excepto por la SEQ ID NO: 78 (codificada por ejemplo, la SEQ ID NO: 77), que se expresó en Pseudomonas fluorescens (por ejemplo, como se describe en JBC. 2002, 277(29):26501-26507).

Tabla 1.1. Expresión enzimática y pureza relativa de las alfa-amilasas y glucoamilasas “principales” de ejemplo Métodos experimentales

Enzima***: proteína/polvo (g/g)* Relación de expresión**

SEQ ID NO: 56: 0,12 ± 0,42 0,6

Enzima***: proteína/polvo (g/g)* Relación de expresión**

SEQ ID NO: 52: 0,09 ± 0,003 0,6

SEQ ID NO: 66: 0,05 ± 0,005 0,1 (0,5****)

SEQ ID NO: 66: 0,05 0,1 (0,5****)

SEQ ID NO: 66: 0,059 ± 0,002 0,5****

SEQ ID NO: 66: 0,085 0,5****

SEQ ID NO: 2: 0,03 ± 0,005 0,3

SEQ ID NO: 2: 0,03 ± 0,002 0,3

SEQ ID NO: 70: 0,09 ± 0,003 0,05 (0,25****)

SEQ ID NO: 70: 0,126 ± 0,002 0,25****

SEQ ID NO: 70: 0,131 0,25****

SEQ ID NO: 62: 0,2 ± 0,03 0,75

SEQ ID NO: 78: 10 (mgs/ml) 0,25

SEQ ID NO: 76: 0,1 ± 0,01 0,2

SEQ ID NO: 26: 0,2 ± 0,026 0,8

SEQ ID NO: 28: 0,15 ± 0,076 0,45

SEQ ID NO: 28: 0,36 ± 0,042 0,45

SEQ ID NO: 18: 0,24 ± 0,096 0,8

SEQ ID NO: 74: 0,21 ± 0,016 0,8

SEQ ID NO: 48: 0,28 ± 0,098 0,5

SEQ ID NO: 20: 0,28 ± 0,066 0,7

SEQ ID NO: 14: 0,21 ± 0,155 0,2

Control (vector vacio): 0,0063

* Contenido de proteína se determinó usando protocolo de Bradford. ** expresado como porcentaje de proteína total en Iisado clarificado; se determinó por SDS PAGE usando cargas de proteína de 5 µg y un software Quantity One de Bio-Rad. *** donde una enzima aparece varias veces en este listado, se usaron diferentes lotes. **** valor después de la desglicosilación.

Fermentación de almidón sin purificar

Todas las fermentaciones se realizaron usando maíz Yellow Dent Il, molido en el molino Ultra Centrifugo por Glen Mill a 12000 rpm a través de un tamiz de 0,5 mm. La harina de maíz fue analizada en un equilibrador de humedad de Mettler HB-43TM para determinar el contenido de humedad y luego se midieron 10 g en peso seco de harina de maíz en un recipiente de 50 ml con barra de agitación. Se agregó luego agua seguido por la adición de tetraciclina (0,5 mg), H2SO4 (175 µl de solución 0,9 M), patrones de enzima purificado/no purificados y levadura para llevar la suspensión total a 33% de sólidos totales. Se colocaron los frascos en una placa de agitación a 30 °C durante 72 horas. Se tomaron muestras a las 50 o 72 horas de fermentación para análisis. Se usó glucoamilasa Sigma de Aspergillus niger (A-7095) como punto de referencia añadida a razón de 2,065 Unidades (aproximadamente 0,707 mg de proteína total, o 0,07% de carga de proteína total) /g en peso seco de harina y la carga total de enzima de ensayo (%) se basa en el peso total de la enzima expresada (g) / peso seco de harina de maíz en fermentación (g).

Para el análisis del contenido de etanol y los perfiles de azúcar, se tomaron 1,5 ml de suspensión de la fermentación de cada frasco a las 50 o 72 horas, se colocaron en un tubo de micrófuga de 1,8 mI y se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos. Se vertió el sobrenadante en una columna spin x de 0,45 µm, se centrifugó a 7000 rpm durante 5 minutos y se tomaron alícuotas de 200 µl del centrifugado en un vial de HPLC y se analizó por HPLC. Se utilizó HPLC Waters equipado con un detector de índice de refracción. La columna utilizada fue la Bio-Rad AMINEX HPX87HMR (Cat. #2 125-0140). La fase móvil utilizada fue de H2SO4 0,005 M a razón de 0,6 mL/minuto.

Preparación de los estándares

Los estándares usados para el análisis que se describen aquí contienen glucosa, maltosa, maltotriosa, maltodextrina, fructosa, glicerol, ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, etanol y metanol. Se prepara un estándar compuesto y posteriormente se lo diluye para producir las diferentes concentraciones necesarias para establecer las curvas estándares para cada compuesto. Todos los reactivos usados para la preparación estándar deben ser almacenados en una cabina de desecación, refrigerada o almacenada de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se deben emplear los medios más precisos de medición de los componentes. En un frasco volumétrico limpio y seco de 100 ml se añaden todos los reactivos secos.

-: Se añaden aproximadamente 35 mL de agua y se forma un remolino para disolver los sólidos.

-: Se coloca un tubo Falcon de 50 mL y se equilibra añadiendo 25 mL de agua y luego tara.

-: Se añaden al agua agregar glicerol, etanol, metanol, ácidos lácticos y acéticos.

-: Se agita suavemente con agitación tipo vórtice para mezclar y se añaden los contenidos al frasco volumétrico con solución de azúcar. Se enjuaga el tubo Falcon de 50 ml 3 veces con aproximadamente 5 mL de agua cada vez y se añade el enjuague al frasco volumétrico.

-: Se lleva el volumen del frasco hasta 100 mL. Esta solución representa la mezcla estándar de etanol al 20% La solución es esterilizada usando un filtro de 0,22 o 0,45 µm Millipore STERIFLIPMR .

-: Se utilizan diluciones de este estándar para crear los estándares mezclados de 5, 10 y 15% de etanol

-: Un estándar mezclado al 5% consiste de 1 parte de 20% de estándar mezclado y 3 partes de agua

-: Un estándar mezclado al 10% es una dilución simple 1:1 del estándar mezclado al 20%.

-: Una mezcla de 3 partes de 20% de estándar mezclado y 1 parte de agua crearan el estándar mezclado al 15%

-: Se debe correr un estándar certificado de etanol al 10,3% v/v (Sigma Cat.# E2385) cada vez que se prepara un nuevo estándar o mensualmente para verificar la precisión del conjunto estándar mezclado.

Resultados

Se analizaron varias alfa-amilasas y glucoamilasas en combinaciones en fermentaciones de almidón sin purificar a diferentes cargas totales de enzima de 0,001, 0,01 y 0,1% (p/p). Las alfa-amilasas analizadas fueron las SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 62, SEQ ID No: 66 y SEQ ID NO: 76. Las glucoamilasas analizadas fueron las SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 74, SEQ lD NO: 28, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 20. Todas las combinaciones tenían un número de identificación para ser utilizadas en el proceso experimental. Se calcularon todas las cargas de enzimas con base en la información de la velocidad de expresión ministrada aquí. La relación de alfa-amilasa con respecto a la glucoamilasa se determinó con base en los datos anteriores. El rendimiento de etanol se midió después de 50 o 72 horas de fermentación por análisis de HPLC. Los resultados indicaron que todas las combinaciones enzimáticas produjeron diferentes niveles de etanol y algunas combinaciones superaron al punto de referencia de GA Sigma (Tabla 1.2).

Tabla 1.2. Rendimiento de etanol en fermentaciones de almidón sin purificar de ejemplos de alfa-amilasas y glucoamilasas “principales” después de 50 horas de fermentacióna.

Alfa-amilasa (AA): glucoamilasa (GA) relación AA:GA Rendimiento de etanol (% v/v)

0,001% de carga total de enzima: 0,01% de carga total de enzima 0,1% de carga total de enzima

Combo 1: SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 26 2:1 6,12 11,60 15,56

Combo 2: SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 18 1:2 6,97 12,53 15,69

Combo 3: SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 28 1:2 5,96 11,06 16,42

Combo 4: SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 74 1:2 6,83 11,49 14,29

Combo 5: SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 20 1:2 4,28 5,61 7,55

Combo 6: SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 48 1:2 6,40 12,58 15,86

Combo 7: SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 26 1:2 7,39 15,38 N/A

Combo 8: SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 18 1:2 5,84 12,81 N/A

Combo 9: SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 28 1:2 6,12 12,62 N/A

Combo 10: SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 74 1:2 7,02 12,29 N/A

Combo 11: SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 20 1:2 4,48 5,72 N/A

Combo 12: SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 48 1:2 6,54 14,16 N/A

Combo 13: SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 26 1:2 9,08 15,04 16,76

Combo 14: SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 18 1:2 7,86 13,00 14,71

Combo 15: SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 74 1:2 8,18 13,27 16,40

Combo 16: SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 48 1:2 8,36 13,80 15,90

Combo 17: SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 26 1:2 7,92 12,67 15,15

Combo 18: SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 18 2:1 10,66 16,10 14,92

Combo 19: SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 48 1:2 10,88 15,97 14,87

Combo 20: SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 26 1:2 7,30 12,67 15,68

Combo 21: SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 48 1:2 7,24 11,13 14,84

Combo 22: SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 26 2:1 9,20 14,56 15,36

Combo 23: SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 48 1:2 9,81 15,42 15,61

Combo 24: SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 14 1:2 5,46 7,86 13,67

Combo 25: SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 14 2:1 6,99 10,85 15,72

Combo 26: SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 48 1:2 N/A N/A 16,13a

Combo 27: SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 26 1:2 N/A N/A 16,88a

Combo 28: SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 48 1:2 N/A N/A 17,15a

Control de GA de Sigma: N/A N/A 16,82b

a Rendimiento de etanol después de 72 horas de fermentación. b Carga total de enzimas se estimó que era aproximadamente de 0,07%.

Ejemplo 27: Expresión de enzimas en plantas; fermentación de almidón sin purificar

Este ejemplo describe la expresión en una planta de nueve ejemplos de enzimas (enzimas que no tiene optimización de codón) y fermentación de almidón sin purificar utilizando material vegetal.

5 Se escogieron cinco (5) alfa-amilasas, las SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 76 y 4 glucoamilasas, las SEQ lD NO: 48. SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 28 para la expresión con base en un rendimiento alto de etanol de las enzimas microbianas en fermentación de almidón sin purificar. Esta expresión en maíz se llevó a cabo con las secuencias génicas sin optimización del codón. Los objetivos de este estudio fueron evaluar los niveles potenciales de expresión de estas enzimas y evaluar si la expresión de estas

10 enzimas tendría efectos nocivos sobre las características agronómicas del maíz a través de sus etapas de desarrollo.

Métodos experimentales

Construcción de vector

La Tabla 2.1 resume las abreviatura utilizadas para los elementos de ADN en los mapas que se muestran 15 continuación.

Tabla 2.1. Abreviaturas usadas en los mapas del constructo

Nombre: Función Descripción

cAMY(SEQ ID NO: 66)-02: CDS Alfa-amilasa, SEQ ID NO: 66, menos la secuencia guía nativa, unida a una secuencia señal de Gamma Zeina dirigida al apoplasto

cAmy(SEQ ID NO: 18)-02: CDS Glucoamilasa, SEQ ID NO: 18, menos la secuencia guía nativa, unida a una secuencia señal de Gamma Zeina dirigida al apoplasto

cAmy(SEQ ID NO: 52)-02: CDS Alfa-amilasa, SEQ ID NO: 52, menos la secuencia guía nativa, unida a una secuencia señal de Gamma Zeina dirigida al apoplasto

cAmy(SEQ ID NO: 28)-02: CDS Glucoamilasa, SEQ ID NO: 28, menos la secuencia guía nativa, unida a una secuencia señal de Gamma Zeina dirigida al apoplasto

Nombre: Función Descripción

cAmy(SEQ ID NO: 26)-02: CDS Glucoamilasa, SEQ ID NO: 26, menos la secuencia guía nativa, unida a una secuencia señal de Gamma Zeina dirigida al apoplasto

cAmy(SEQ ID NO: 48)-02: CDS Glucoamilasa, SEQ ID NO: 48, menos la secuencia guía nativa, unida a una secuencia señal de Gamma Zeina dirigida al apoplasto

cAmy(SEQ ID NO: 76)-02: CDS Alfa-amilasa, SEQ ID NO: 76, menos la secuencia guía nativa, unida a una secuencia señal de Gamma Zeina dirigida al apoplasto

cAmy(SEQ ID NO: 70)-02: CDS Alfa-amilasa, SEQ ID NO: 70, menos la secuencia guía nativa, unida a una secuencia señal de Gamma Zeina dirigida al apoplasto

El ejemplo de vector denominado como “15745”, a continuación, es un vector binario que contiene una alfa-amilasa SEQ ID NO: 70 de ejemplo menos su secuencia guía nativa. La secuencia guía nativa fue reemplazada por la secuencia señal de Gamma Zeina para dirigirla al apoplasto. La fusión de Gamma Zeina-SEQ ID NO: 70 se expresa utilizando el promotor de Gamma Zeina. El vector binario también contiene un casete Ubi-PMI-Nos para la selección de manosa.

Un fragmento de cAmy(SEQ ID NO: 70)-01 que contiene aminoácidos 86 -525 (más el codón de terminación), se amplificó por PCR a partir del plásmido 15649. La amplificación por PCR introdujo un sitio Afel en el extremo 5’ y un sitio Bglll en el extremo 3' del fragmento. La adición del sitio Afel agregó un aminoácido de alanina en frente del fragmento de cAmy(SEQ ID NO: 70) (SY1709: 92 -93). Este amplicón de PCR se clonó en pCR2,1-TOPO y se secuenció para verificar la presencia de los nuevos sitios de enzimas de restricción (SY17092111-112,122-124). Una vez que se verificó, se digirió cAmy(SEQ ID NO: 70) fuera de la estructura de TOPO a través de Afel/BgllI. En forma similar, el constructo 15460ZeinAmyVN fue digerido con AfeI/Bglll. Esta estructura y cAmy(SEQ ID NO: 70) se ligaron en forma conjunta. Cuando se ligaron, cAmy(SEQ ID NO: 70) permaneció en la estructura con el péptido señal xGZein27ss-01, solamente con la adición de un residuo de alanina en la unión de clonación. Los transformantes se cribaron para la presencia del gen de amilasa usando cebadores ZeinAmy1199F y prGTL-03R. Los clones positivos produjeron un amplicón de aproximadamente 1,6 kB (SY1709:130). Cinco clones fueron seleccionados y fueron digeridos con SanDI y Rsrll para remover prGZein-01:cAmy(SEQ ID No: 70):t35s-08. El constructo 15468 fue alineado con Rsrll. La estructura binaria y el casete digerido de uno de los clones positivos (SanDl/Rsrll) fueron ligados en forma conjunta en el sitio de restricción de Rsrll. Después de la transformación en células Top10, se cribaron los transformantes por la presencia del casete usando cebadores ZeinAmy1199F y Mubi5(SY1709:146,150). Tres transformantes positivos fueron seleccionados y chequeados a través de una digestión diagnóstica con BamHl. Estos clones fueron secuenciados (SY1709:162; ambas uniones de clonación así como también toda la secuencia codificadora cAmy(SEQ ID NO: 70)), se confirmó que todos los tres fueron correctos en la secuencia.

El vector de ejemplo designado como "15750", como se ilustra en la Figura 28, a continuación, es un vector binario que contiene una glucoamilasa, la SEQ ID NO: 18 de ejemplo, menos su secuencia guía nativa. La secuencia guía nativa se reemplazó con la secuencia señal de Gamma Zeina para dirigirse al apoplasto. La fusión de Gamma Zeina-SEG ID NO: 18 es expresada usando el promotor de Gamma Zeina. El vector binario contiene también un casete de Ubi-PMi-Nos para selección de manosa.

Un fragmento de cAmy(SEQ ID NO: 18)-01, que contiene los aminoácidos 88 -712 (más el codón de terminación), fue amplificado por PCR a partir del plásmido 15652. La amplificación por PCR introdujo un sitio Afel en el extremo 5’ y un sitio BgIIl en el extremo 3’ del fragmento. La adición del sitio Afel resulto en el cambio del aminoácido 88 de una serina por una alanina (SY1709: 113-114,116). Este amplicón de PCR fue clonado en pCR2.1-TOPO y secuenciado para verificar la presencia de los nuevos sitios de la enzima de restricción (SY1709:116,131). Una vez verificado, el fragmento de cAmy(SEQ ID NO: 18) fue digerido fuera de la estructura TOPO a través de AfeI/BgIll. En forma similar, el constructo 154602einAmyVN fue digerido con AfeI/Bglll. Esta estructura y el fragmento de cAmy(SEQ ID NO: 18) fueron ligados en forma conjunta. Cuando se ligaron, cAmy(SEQ ID NO: 18) permaneció en la estructura con el péptido señal xGZein27ss-O1, con la adición de un residuo de alanina en la unión de clonación. Seis clones fueron seleccionados y fueron digeridos con SanDI y Rsrll para remover prGZein-01:cAmy(SEQ ID NO: 18):t35s-08. El constructo 15468 fue alineado con Rsrll. La estructura binaria y el casete digerido de uno de los clones positivos (SanDI/Rsrll) fueron ligados en forma conjunta en el sitio de restricción de Rsrll. Después de la transformación en células Top10, los transformantes se cribaron por la presencia del casete usando cebadores ZeinAmy1199F y Mubi-5 (SY17092181). Adicionalmente, todos los 6 transformantes fueron seleccionados y chequeados a través de una digestión de diagnóstica con Sacl. Tres de los clones positivos fueron secuenciados (SY17092189-190) (ambas uniones de clonación así como también toda la secuencia codificadora cAmy(SEQ ID NO: 18)); se confirmó que todos los tres eran correctos en secuencia.

El vector de ejemplo designado como "15751", como se ilustra en la Figura 29, a continuación, es un vector binario que contiene una giucoamilasa, la SEQ ID NO: 48 de ejemplo, menos su secuencia guía nativa. La secuencia guía nativa se reemplazó con la secuencia señal de Gamma Zeina para dirigirse al apoplasto. La fusión de Gamma Zeina-SEQ ID NO: 48 es expresada usando el promotor de Gamma Zeina. El vector binario contiene también un casete de Ubi-PMl-Nos para selección de manosa.

Usando 15651 como plantilla, se usaron los cebadores de mutagenesis en una reacción de mutagénesis de sitios múltiples (QUICKCHANGEMR, Stratagene) para remover un sitio Afel interno. introducir un sitio Afel en el extremo 5’(la mutación estaba en la secuencia señal, sin cambio de péptido) e introducir un sitio BgIlI en el extremo 3' externo para la clonación. Se llevo a cabo el análisis de la enzima de restricción y se seleccionaron los clones que fueron positivos por tener el sitio AfeI interno removido y el sitio de BglIl introducido. Un clon positivo fue enviado para análisis de secuencia que fue confirmada. Este clon de ADN fue luego usado como plantilla para amplificación por PCR para introducir un sitio AfeI en el extremo 5' del dominio de glucoamilasa. La mutación estaba en la secuencia señal nativa y no cambió la secuencia del péptido glucoamilasa. El producto de PCR fue digerido de manera secuencial con AfeI y luego con BgIII. El producto digerido fue purificado por gel y ligado a la estructura de 15460AmyZeinVN, creando cAmy(SEQ ID NO: 48) con una secuencia señal de gamma zeina que se dirige al apopIasto. Se verificó la secuencia de este vector intermedio y luego se digirió con SanDI y RsrIl en forma secuencial. Este fragmento fue purificado por gel y luego ligado en el corte binario 15468 con RsrII y tratado por CIP. Los clones positivos se cribaron por tamaño por PCR y luego uno de los clones positivos se envió para análisis de secuencia del fragmento entero ligado en el binario. Se confirmó la secuencia.

El vector de ejemplo designado como “15761”, como se ilustra en la Figura 30, a continuación, es un vector binario que contiene una alfa amilasa, la SEQ ID NO: 66 de ejemplo, menos su secuencia guía nativa. La secuencia guía nativa fue reemplazada con la secuencia señal de Gamma Zeina para dirigirse al apoplasto. La fusión de Gamma Zeina-SEQ ID NO: 66 fue expresada usando el promotor de Gamma Zeina. El vector binario contiene también un casete de Ubi-PMl-Nos para selección de manosa.

Un fragmento de cAmy(SEQ ID NO: 66)-01, que contiene los aminoácidos 86 -521 fue mutagenizado usando mutagénesis dirigida a sitio de acuerdo con el protocolo Quick Change de Stratagene. La mutagenesis requirió 3 cebadores individuales (todos amplificándose en la dirección hacia adelante) e introdujeron tres mutaciones: un sitio Afel en el extremo 5', un sitio Bglll en el extremo 3' (externo al gen) y la remoción de un sitio Afel interno de (SY1709:174). El constructo mutagenizado fue transformado en células Top10 por cribado para determinar si alguna/todas las mutaciones deseadas estaban presentes. Quince transformantes fueron seleccionados para cribado y fueron digeridos en forma separada con Afel y Bglll (SY17092185-186). Se determinó a partir de las digestiones de restricción que existían 6 clones posibles con todas las tres mutaciones deseadas; tres de estos clones se enviaron a secuenciamiento (SY1709:190; SY1777:11). Para todos los tres clones, un sitio de Afel se había introducido en el extremo 5' y el sitio interno había sido removido. Además, el sitio Bglll en el extremo 3’ había sido introducido. Después de la confirmación, la alfa amilasa fue digerida fuera del constructo mutagenizado con Afel/Bglll y ligada a la estructura de 154602einAmyVN que había sido digerida con Afel y Bglll. Cuando se ligaron, cAmy(SEQ ID NO: 66) permaneció en la estructura con el péptido señal xGZein27ss sin cambios de aminoácidos en la unión de clonación. Los transformantes se cribaron para la presencia del gen de amilasa usando cebadores ZeinAmy1199F y prGTL-03R. Los clones positivos produjeron un amplicón de aproximadamente 1,6 kB (SY1777:24), Tres clones fueron seleccionados y digeridos con SanDl/Rsrll para remover prGZein-01:cAmy(SEQ ID NO: 66):t35s-08. El constructo 15468 fue alineado con Rsrll. La estructura binaria y el casete digerido de uno de los clones positivos (SanDI/RsrII) fueron ligados en forma conjunta en el sitio de restricción de Rsrll. Después de la transformación en células Top10, los transformantes se cribaron para la presencia del casete usando cebadores ZeinAmy1199F y prGTL-03R (SY1777:47-48). Seis transformantes positivos fueron seleccionados y chequeados a través de una digestión diagnóstica con Hindlll. Tres de estos clones fueron secuenciados (SY1777:56, 62) tanto en las uniones de clonación como también la secuencia codificadora completa; se confirmó que todos los tres eran correctos en secuencia.

El vector de ejemplo designado como “15756”, como se ilustra en la Figura 31, a continuación, es un vector binario que contiene una glucoamilasa, la SEQ ID NO: 26 de ejemplo, menos su secuencia guía nativa. La secuencia guía nativa fue reemplazda con la secuencia señal Gamma Zeina para dirigirse al apoplasto. La fusión de Gamma Zeina-SEQ ID NO: 26 es expresada usando el promotor de Gamma Zeina. El vector binario contiene también un casete Ubi-PMI-Nos para selección de manosa.

Usando el vector de ejemplo 15653 como plantilla, los cebadores de mutagenesis se usaron en una reacción de mutagenesis de sitios múltiples (QUICKCHANGEMR, Stratagene) para remover un sitio Afel interno, introducir un sitio Afel en el extremo 5' (la mutación estaba en la secuencia señal, sin cambio de péptido) e introducir un sitio Sacl en el extremo 3’ externo para clonación. La reacción se transformó en las células competentes Top10. Las colonias fueron seleccionadas y cribadas por análisis de enzimas de restricción. Los clones que fueron positivos por tener un sitio interno Afel removido, el sitio AfeI en el extremo 5’ insertado y el sitio Sacl introducido, fueron seleccionados. Se envió un clon positivo para análisis de secuencia, que fue confirmada. Este clon de ADN fue luego digerido con Sacl y Afel. La digestión fue luego purificada por gel y ligada a la estructura de 15460AmyZeinVN creando cAmy(SEQ ID NO: 26) con una secuencia señal de gamma zeina que se dirige al apoplasto. Este vector intermedio fue verificado en secuencia, luego digerido con SanDI y Rsrll. Este fragmento fue purificado en gel y ligado en el corte del vector binario 15468 con RsrlI y tratado con CIP. Los clones positivos fueron cribados por tamaño por PCR y luego uno de los clones positivos fue enviado a análisis de secuencia de todo el fragmento ligado en el binario. Se confirmó la secuencia.

El vector de ejemplo designado como “15742”, como se ilustra en la Figura 32, a continuación, es un vector binario que aloja (que comprende) los 616 aminoácidos del terminal C de una glucoamilasa, la SEQ ID NO: 28 de ejemplo (cAmy(SEQ ID No: 28)-01) fusionada en la estructura con la secuencia señal de Gamma Zeina (xGZein27ss-01), que dirige la glucoamilasa al apoplasto para crear (cAmy(SEQ ID NO: 28)-02). La expresión es dirigida por la región 5' de Gamma Zeina A (prGZein-01), que es un promotor específico de la semilla.

El vector 15654 que aloja cAmy(SEQ ID NO: 28)-01 sirvió como plantilla de ADN por PCR modificado por la adición de un sitio Ncol (extremo 5 prima) y un sitio BgIII (extremo 3 prima). El producto de PCR fue TOPO-clonado y el Clon #1 fue secuenciado para validación (SY1533:181). El nuevo componente, alias “cAmy(SEQ ID NO: 28)" fue digerido con NcoI/Bglll y purificado en gel. El fragmento fue ligado en a la estructura al sitio Ncol/Bglll de un vector de clonación, alias “154602einAmyVN” de esta manera generando un casete que aloja prGZein-01:xGZein27ss-01:cAmy(SEQ ID NO: 28):iPEPC9-01:t35s-08 (SY1533:183). El casete génico fue digerido de manera secuencial con SanDi/RsrIl, purificado en gel y ligado en el sitio de Rsrll del vector binario 15468. El ligamiento exitoso fue confirmado por PCR y la secuencia de ADN (SY1533:185 -187).

El vector de ejemplo designado como "15749", como se ilustra en la Figura 33, a continuación, es un vector binario que contiene una alfa amilasa, la SEQ ID NO: 52 de ejemplo, menos la secuencia guía nativa. La secuencia guía nativa fue reemplazada con la secuencia señal de Gamma Zeina para dirigirse al apoplasto (cAmy(SEQ ID NO: 52)02). La fusión de Gamma zeina-SEQ ID NO: 52 es expresada usando el promotor de Gamma Zeina. El vector binario contiene también un casete de Ubi-PMl-Nos para selección de manosa.

Un fragmento de cAmy(SEQ ID NO: 52)-01, que contiene los aminoácidos 88 -674 (más el codón de terminación), fue amplificado por PCR a partir del plásmido 15648. La amplificación por PCR introdujo un sitio Afel en el extremo 5’ y un sitio Sacl en el extremo 3' del fragmento. La adición del sitio AfeI provocó que el aminoácido 88 cambiara de serina a una alanina (SY1709:95-96). El amplicón de PCR fue clonado en pCR2.1-TOPO y secuenciado para verificar la presencia de los nuevos sitios de la enzima de estricción (SY1709:103,111-112). Una vez verificado, se digirió cAmy(SEQ ID NO: 52) fuera de la estructura TOPO a través de AfeI/Sacl. En forma similar se digirió el constructo 15460ZeinAmyVN con AFeI/Sacl. Esta estructura y cAmy(SEQ ID NO: 52) fueron ligados en forma en conjunta. Cuando se ligaron cAmy(SEQ ID NO: 52) permaneció en el marco con el péptido señal xGZein27ss-01, con únicamente el primer residuo de aminoácido cambiado de una Leucina por una Alanina. Los transformantes se cribaron para la presencia del gen amilasa usando cebadores ZeinAmy1199F y prGTL-03R. Los clones positivos produjeron un amplicón de aproximadamente 2,1kB (SY1709:130). Cinco clones fueron seleccionados y fueron digeridos con SanDl y Rsrll para remover prGZein-01:cAmy(SEQ ID NO: 52):t35s08. El constructo 15468 fue alineado con Rsrll. La estructura binaria y casete digerido de uno de los clones positivos (SanDl/Rsrll) fueron ligados en forma conjunta en el sitio de restricción de Rsrll. Después de la transformación en las células Top10, los transformantes se cribaron para la presencia del casete usando cebadores ZeinAmy1199F y Mubi-5 (SY1709: 146, 150). Tres transformantes positivos fueron seleccionados y chequeados por medio de digestión diagnóstica con BamHI. Estos clones fueron secuenciados (SY1709:162; ambas uniones de clonación así como la secuencia codificadora cAmy(SEQ ID NO: 52) entera) y se determinó que había una mutación puntual en la secuencia de prGZein. Esta mutación es un cambio de un par de bases individuales, T por C en el nucleótido 340. El promotor en la estructura de 15460ZeinAmy original fue secuenciado nuevamente para chequear la mutación y no estaba presente en la fuente estructural. Sin embargo, estaba presente cuando los clones positivos fueron secuenciados una segunda vez (SY1709:182,189). Esta mutación pudo haber ocurrido durante la replicación bacteriana.

El vector de ejemplo designado como “15718”, como se ilustra en la Figura 34, a continuación, es un vector binario que contiene una alfa amilasa, la SEQ ID NO: 76 de ejemplo, menos su secuencia guía nativa. La secuencia guía nativa fue reemplazada con la secuencia señal de Gamma Zeina para dirigirse al apoplasto. La fusión de Gamma Zeina-SEQ ID NO: 76 (cAmy(SEQ lD NO: 76)-02) es expresada usando el promotor de Gamma Zeina. El vector binario contiene también un casete de Ubi-PMl-Nos para selección de manosa.

Un fragmento de cAmy(SEQ ID NO: 76)-01, que contiene los aminoácidos 87-508 (más el codón de terminación), fue amplificado por PCR a partir del plásmido 15650. La amplificación por PCR introdujo un sitio de Afel en el extremo 5' y un sitio de Bglll en el extremo 3’ del fragmento. La adición del sitio Afel cambió un aminoácido de glicina por una alanina. El producto de PCR fue digerido con Afel y Bglll y clonado en el corte de la estructura de 15460AmyZeinVN con Afel y Bglll, creando cAmy(SEQ ID NO: 76) fusionada con la secuencia señal de gamma zeina. Este vector intermedio fue luego digerido con SanDl y Rsrll en forma secuencial. Este fragmento fue purificado en gel y luego ligado en el corte de vector binario 15468 con Rsrll y tratado por CIP. Los clones positivos fueron cribados por tamaño por PCR y luego uno de los clones positivos fue enviado para análisis de secuencia del inserto entero. Se confirmó la secuencia.

Análisis de actividad enzimática

Veinte semillas de los eventos seleccionados fueron seleccionadas al azar y reunidas. Las semillas fueron luego trituradas y evaluadas usando el ensayo Megazyme CERALFA HRMR para alfa-amilasas o el ensayo de glucoamilasa de Megazyme para glucoamilasas.

Cálculos de actividad

Una unidad CERALPHAMR de actividad de α-amilasa se define como la cantidad de enzima, en presencia de exceso de α-glucosidasa termoestable, requerida para liberar un micromol de p-nitrofenol en un minuto bajo las condiciones de ensayo definidas. Nuestra condición de ensayo es un pH de 5,5 (NaOAc 100 mM, regulador de pH 5,5 con 1mg/ml de BSA), 60 °C. Nótese que la actividad calculada es una unidad de CERALPHAMR .

De acuerdo con Megazyme, PNP 1 mM en 1% de fosfato trisódico produce una absorbancia de 18,1 a 400 nm. Por lo tanto, 1 M de PNP en fosfato trisódico produce una absorbancia de 18.100 a 400 nm.

∆A400 / 18,100 = [PNP] (mol/l o M ) en la placa final.

[PNP] en placa (mol/I x 8 x 100 x 10-6 1 x 1 x 106 (µmol/mol) = PNP (µmoI/rxn)

PNP (µmoI/rxn) / (0,05 ml x 20 min) = unidades / ml de α-amilasa diluida

unidades / ml en enzima diluida x dilución = Unidades Ceralfa / ml en muestra de α-amilasa.

∆A400 x 0,0442 x dilución de enzima = Unidades Ceralfa / ml en muestra de α-amilasa.

Este SOP es adaptado de un método de ensayo SOP CERALPHA HRMR y un procedimiento de ensayo de αamilasa Megazyme (método CERALPHAMR) usando Reactivo HRMR de amilasa, ICC Estándar No. 303.

La Figura 27 ilustra la base teórica del procedimiento de ensayo de α-amilasa CERALPHAMR; a partir del procedimiento de ensayo de alfa-amilasa de Megazyme (Método CERALPHAMR) usando reactivo HRMR de amilasa: la figura ilustra el esquema de reacción total: una vez que la alfa-amilasa escinde un enlace en el substrato pnitrofenil maltosacárido bloqueado, el producto de reacción no bloqueado que contiene el constituyente p-nitrofenilo es instantáneamente escindido en glucosa y p-nitrofenilo libres por las cantidades en exceso de alfa-glucosidasa termoestable, que son partes integrales de la mezcla de substrato y se libera el p-nitrofenilo libre. Se termina la reacción y se desarrolla el color del fenolato por la adición de fosfato trisódico, pH alrededor de 11,0.

Extracción de glucoamilasa a partir de harina de maíz y ensayo de actividad para la hidrólisis de almidón: Extracción de glucoamilasa y ensayo de semilla individual de maíz

Para describir el procedimiento para la extracción de glucoamilasa y el ensayo de harina de maíz:

Preparación del regulador de extracción:

Borato de sodio 25 mM, 01% de Tween 20, regulador de pH 10

Procedimiento:

Trituración de semillas reunida:

Se reúnen 20 semillas. Se agregan las semillas a un vaso de trituración Kelco. Se coloca una bola de acero en cada vaso por encima de las semillas. Se coloca un anillo de goma alrededor del vaso y se coloca encima la tapa. Se tritura en el Kelco durante 45 segundos. Usando una espátula, se transfiere la harina del vaso a la plataforma de pesaje y luego se vierte en un tubo cónico de 15 mL. Se lava el vaso, anillo y la bola de acero con agua y jabón.

Extracción

1.: Se añaden 3 ml del regulador de extracción a las muestras.

2.: Se sellan los tubos con las tapas usando un martillo.

3.: Se agita vigorosamente hasta que la harina se suspende en el regulador.

4.: Se agita por rotación a temperatura ambiente en un rotor Rugged al 70% durante 5 minutos.

5.: Se incuba a 45 °C en un baño de agua durante 30 minutos

6.: Se agitan por rotación las muestras durante otros 5 minutos a temperatura ambiente después de la incubación.

7.: Se centrifugan las muestras a 3000 rpm durante 5 minutos. Ensayo GA (la información del reactivo viene después del procedimiento de ensayo)

1.: Se diluyen muestras en el regulador de dilución para obtener un ensayo en el rango de 0,5 a 1,5 de OD400.

2.: Se enciende la máquina de PCR. Se fija el programa para incubar a 40 °C durante 10 min y luego una rampa descendente hasta a 4 °C.

3.: Sobre hielo, se agregan 50 µl de cada muestra de glucoamilasa diluida a una placa de PCR.

4.: Se agregan 150 µl de solución de terminación a cada pozo de una placa de microtitulación. Deben haber dos pozos de solución de terminación para cada muestra analizada.

5.: Se mezclan 50 µl de reactivo de substrato con la muestra. Se pipetea dos veces. Se prepara el substrato como se indica en las instrucciones de Megazyme (10 ml de agua / botella).

6.: Inmediatamente, se extraen 20 µl de la mezcla y se mezclan con 150 µl de solución de terminación. Se pipetea tres veces formando remolino. Este es el punto de tiempo 0.

7.: Se coloca la placa en la incubadora y se presiona el botón de inicio. Asegurarse de que las muestras estén en la máquina cuando se inicia el ciclo ascendente. Se incuba la placa de PCR durante 10 min a 40 °C.

8.: Permitir que la máquina realice el ciclo descendente hasta 4 °C mientras las muestras están en la máquina.

9.: Esperar 2 minutos.

10.: Se remueven 20 µl del producto y se mezcla con 150 µl de solución de terminación en una placa de microtitulación. Este es el punto de tiempo de 10 min.

11.: Se deja reposar la placa durante 15 min.

12.: Se lee la OD400 en el lector de placas. Fijar Pathcheck en ON (encendido) (esto normalizará la lectura de la absorbancia de la muestra en una longitud de trayectoria de 1 cm).

13.: Se calcula ∆A400, el cambio en A400 entre el punto de tiempo a 0 y 10 min.

Preparación de soluciones patrón:

Substrato (Megazyme catalog #: R-AMGR3) p-nitrofenil-α-maltósido (4 mM) α-glucosidasa termoestable (5 U/ml)

Se disuelven los contenidos totales de un vial en 10,0 mI de agua MilliQ. Se divide en alícuotas y se almacenan congeladas. Se almacena sobre hielo durante el uso. Solución de terminación: 2% de solución base trizma 2,0 g de base trizma (Sigma T-1503)

Se añade agua MilliQ hasta un volumen final de 100 ml

Regulador de dilución: regulador de acetato de sodio 200 mM (pH 4,5)

Cálculos de actividad

Se define una unidad de actividad de α-glucoamilasa como la cantidad de enzima, en presencia de un exceso de α5 glucosidasa termoestable, necesaria para liberar un micromol de p-nitrofenol en un minuto bajo las condiciones de ensayo definidas.

De acuerdo con Megazyme, PNP 1 mM en 2% de base trizma produce una absorbancia de 18,1 a 400 nm.

Actividad de GA en muestras (U/ml) = (A400/10) x (170/10) x (1/18,1) x Dilución = A400 x 0,0939 x Dilución

Este SOP es adaptado del ensayo de Megazyme de amiloglucosidasa usando p-nilrofenil-α-maltósido más α10 glucosidasa termoestable.

Fermentación de almidón sin purificar: llevada a cabo como se describió anteriormente.

Resultados

Ensayo TAQMANMR y ensayo de actividad enzimática

Los números de copia de los transgenes se determinaron mediante ensayos TAQMANMR primarios y secundarios.

15 Los cebadores específicos para el gen marcador seleccionable usados en todos los vectores de transformación de maíz descritos anteriormente, pmi, se usaron en los ensayos TAQMANMR primarios. Los cebadores específicos tanto para el gen pmi como para el gen marcador seleccionable bacteriano, spec, se usaron en los ensayos TAQMANMR secundarios.

La expresión de alfa-amilasas o glucoamilasas en semillas transgénicas T1 maduras secadas de constructos

20 seleccionados también se analizó mediante ensayos de actividad enzimática. Los resultados de los números de copias génicas en eventos generados a partir del constructo 15749 y la expresión de la alfa-amilasa SEQ ID NO: 52 de ejemplo en estos eventos, fueron resumidos en la Tabla 2.2.

Tabla 2.2. Números de copias transgénicas y actividad de α-amilasa en eventos generados a partir del constructo 15749

Número de la planta: Actividad de α-amilasa en semillas reunidas (U/g)

1: 25,6

2: 23,5

3: 21,3

4: 21,2

5: 20,2

6: 18,4

7: 15,0

8: 14,3

9: 14,0

10: 12,7

11: 12,2

Número de la planta: Actividad de α-amilasa en semillas reunidas (U/g)

12: 11,1

13: 10,2

14: 9,9

15: 9,6

16: 7,6

17: 6,9

18: 6,8

19: 6,4

20: 6,4

21: 6,0

22: 5,4

23: 5,3

24: 5,3

25: 4,7

26: 4,7

27: 4,5

28: 4,2

29: 4,0

30: 3,9

31: 3,7

32: 3,6

34: 3,1

35: 3,0

36: 2,8

37: 2,5

38: 2,4

39: 2,0

40: 1,5

Número de la planta: Actividad de α-amilasa en semillas reunidas (U/g)

41: 0,4

42: 0,4

43: 0,3

44: 0,2

45: 0,1

Los resultados de los números de copias génicas en los eventos generados a partir del constructo 15751 y la expresión de la glucoamilasa SEQ ID NO: 48 en estos eventos se resumen en la Tabla 2.3:

Tabla 2.3. Números de copias transgénicas y actividad de glucoamilasa en eventos generados a partir del constructo 15751

Planta: Actividad de glucoamilasa en semillas reunidas (U/g)

1: 4,86

2: 4,48

3: 4,47

4: 4,22

5: 4,20

6: 4,08

7: 4,05

8: 3,94

9: 3,88

10: 3,84

11: 3,82

12: 3,68

13: 3,65

14: 3,57

15: 3,50

16: 3,47

17: 3,43

18: 3,33

19: 2,91

Planta: Actividad de glucoamilasa en semillas reunidas (U/g)

20: 1,13

21: 0,73

La Tabla 2.4 resume los resultados de los números de copias génicas en eventos generados a partir del constructo 15756 y la expresión de la glucoamilasa SEQ ID NO: 26 en estos eventos. Las semillas de los múltiples eventos de los constructos 15761 y 15718 que expresan las alfa-amilasas de las SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 76,

5 respectivamente, se reunieron y trituraron para formar muestras compuestas. Las dos muestras compuestas se evaluaron para las actividades de α-amilasa. En forma similar, las semillas de los múltiples eventos de los constructos 15742 y 15750 que expresan las glucoamilasas de las SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 18, respectivamente, también se reunieron y trituraron para formar muestras compuestas. Las dos muestras compuestas fueron evaluadas para las actividades de glucoamilasa. Los resultados se resumen en la Tabla 2.5.

10 Tabla 2.4 Números de copias transgénicas y actividad de glucoamilasa en eventos generados a partir del constructo 15756

Número de la planta: Actividad de glucoamilasa en semillas reunidas (U/g)

1: 4,41

2: 4,31

3: 4,18

4: 4,15

5: 3,95

6: 3,94

7: 3,88

8: 3,83

9: 3,78

10: 3,68

11: 3,67

12: 3,64

13: 3,60

14: 3,58

15: 3,45

16: 3,27

17: 3,18

18: 3,16

19: 3,14

Número de la planta: Actividad de glucoamilasa en semillas reunidas (U/g)

20: 3,10

21: 3,07

22: 3,00

23: 2,75

Tabla 2.5. Actividad de α-amilasa o glucoamilasa en semillas generadas a partir de los constructos 15718, 15761, 15742 y 15750

Constructo: Variedad Enzima expresada Tipo de enzima Actividad de la semilla reunida (U/g)

15718: JHAX707 SEQ ID NO: 76 α-amilasa 0,033

15761: JHAX708 SEQ ID NO: 66 α-amilasa 0,085

15742: JHAX709 SEQ ID NO: 28 Glucoamilasa 3,399

15750: JHAX710 SEQ ID NO: 18 Glucoamilasa 3,55

5 Fermentación de almidón sin purificar usando enzimas expresadas en maíz

Las semillas de los múltiples eventos de constructos seleccionados que expresan α-amilasas o glucoamilasas se reunieron y trituraron para formar muestras compuestas para fermentación de almidón sin purificar. En todos los experimentos, se usó la harina de maíz que contiene α-amilasas a la tasa de inclusión de 20% (p/p) y harina de maíz que contenía glucoamilasas a la tasa de inclusión de 50% (p/p). La harina de maíz diente amarillo II constituyó 30%

10 (p/p) restante de la harina de maíz. Las fermentaciones de almidón sin purificar se llevaron a cabo siguiendo el SOP estándar descrito anteriormente (Sección I). La capacidad de estas combinaciones de α-amilasa y glucoamilasa expresadas en maíz para producir etanol en la fermentación de almidón sin purificar se resume en la Tabla 2.6.

Tabla 2.6. Rendimiento de etanol después de 72 horas de fermentación de almidón sin purificar usando enzimas de ejemplo “principales” expresadas en maíz sin optimización de codones*

Constructo (α-amilasa): Constructo (Glucoamilasa) Tasa de inclusión (α-amilasa) (% p/p) Tasa de inclusión (Glucoamilasa) (% p/p) Tasa de inclusión (Producto) (% p/p) Rendimiento de etanol (% v/v)

15749 (SEQ ID NO: 52): 15756 (SEQ ID NO: 26) 20 50 30 6.96

15749 (SEQ ID NO: 52): 15742 (SEQ ID NO: 28) 20 50 30 8.90

15761 (SEQ ID NO: 66): 15751 (SEQ ID NO: 48) 20 50 30 7.30

15718 (SEQ ID NO: 76): 15750 (SEQ ID NO: 18) 20 50 30 8.33

N/A
N/A: 0 0 100 2.25

Ejemplo 28: Expresión en plantas de ejemplos de enzimas usando genes optimizados de codones de maíz sintético y fermentación de almidón sin purificar usando material vegetal

5 Los genes sintéticos con codones optimizados para expresión en maíz fueron generados para 2 α-amilasas, la SEQ ID NO: 52 (codificada, por ejemplo, por la SEQ ID NO: 51) y la SEQ lD NO: 4 (codificada, por ejemplo, por la SEQ ID NO: 3) y 2 glucoamilasas, las SEQ ID NO: 48 (codificada, por ejemplo, por la SEQ ID NO: 47) y la SEQ ID NO: 26 (codificada, por ejemplo, por la SEQ ID NO: 25). La Tabla a continuación correlaciona la SEQ ID NO: de tipo silvestre con la SEQ lD NO: asignada a la secuencia optimizada por codones. Las enzimas escogidas para

10 optimización de codones se seleccionaron con el fin de obtener el mayor rendimiento de etanol en la fermentación de almidón sin purificar. Los objetivos de este estudio eran generar eventos comerciales para el desarrollo del producto y generar suficiente material para evaluar el desempeño de la fermentación de almidón sin purificar a partir de las enzimas expresadas en maíz.

Enzima: SEQ ID NO: de tipo silvestre SEQ ID NO: de codón optimizado

Amilasa: 51 79

Amilasa: 3 80

Glucoamilasa: 47 81

Glucoamilasa: 25 82

15 Métodos experimentales Genes sintéticos

Los genes sintéticos fueron elaborados por GENEARTMR. Las secuencias fueron optimizadas por codones usando tecnología GENEOPTIMIZERMR de propiedad de GENEARTMR. Las secuencias de los genes sintéticos se enlistan a continuación. El uso de codones se adaptó al codón de tendencia de genes de Zea mays.

20 Construcción del vector La Tabla 3.1 resume las abreviaturas usadas para los elementos de ADN en los mapas mostrados a continuación. Tabla 3.1. Abreviaturas usadas en los mapas de constructos comerciales

Nombre: Función Descripción

cAmy (SEQ ID NO: 79)Apo-01: CDS Gen que codifica la enzima de la SEQ ID NO: 52 de alfa-amilasa sintética de codón optimizado de maíz dirigido al apoplasto

Nombre: Función Descripción

cAmy (SEQ ID NO: 79)ER-01: CDS Gen de alfa-amilasa de codón optimizado de maíz sintético dirigido al RE con secuencia señal de Gamma Zeina y secuencia KDEL que codifica la enzima de la SEQ ID NO: 52

cAmy (SEQ ID NO: 80)Apo-01: CDS Gen de alfa-amilasa de codón optimizado de maíz sintético dirigido al apoplasto que codifica la enzima de la SEQ ID NO: 4

cAmy (SEQ ID NO: 80)ER-01: CDS Gen de alfa-amilasa de codón optimizado de maíz sintético dirigido al RE con secuencia señal de Gamma Zeina y secuencia KDEL que codifica la enzima de la SEQ ID NO: 4

cGAmy (SEQ ID NO: 82)Apo-01: CDS Gen de glucoamilasa de codón optimizado de maíz sintético dirigido al apoplasto que codifica la enzima de la SEQ ID NO: 26

cGAmy (SEQ ID NO: 82)ER-01: CDS Gen de glucoamilasa de codón optimizado de maíz sintético dirigido al RE con secuencia señal de Gamma Zeina y secuencia KDEL que codifica la enzima de la SEQ ID NO: 26

cGAmy (SEQ ID NO: 81)Apo-01: CDS Gen de glucoamilasa de codón optimizado de maíz sintético dirigido al apoplasto que codifica la enzima de la SEQ ID NO: 48

cGAmy (SEQ ID NO: 81)ER-01: CDS Gen de glucoamilasa de codón optimizado de maíz sintético (con adición de retención en el RE de KDEL) dirigido al RE que codifica la enzima de la SEQ ID NO: 48

El vector de ejemplo designado como "15740", a continuación, es un vector binario para transformación de maíz que aloja al promotor especifico de semillas prGTL-03 que dirige la versión optimizada de maíz sintético dirigida al apoplasto de la alfa-amilasa de la SEQ ID NO: 51 de ejemplo, la versión optimizada es la SEQ ID NO: 79 de ejemplo o, cAmy(SEQ ID NO: 79)Apo-01. Este binario contiene también un casete de Ubi-PMI-Nos para selección.

Vector de clonación: El constructo alias 15460ZeinAmyVN fue digerido con Sacl y RsrIl para extraer iPEPC9-01 y t35s-08. Asimismo, el constructo 15460 fue digerido con Sacl y RsrIl para remover tNOS-03-01. El terminador t35s08/iPEPC9-01 se ligó en 15460 usando estos sitios (SY1709:6). La reacción de ligación fue transformada en células DH5-alfa; los transformantes se cribaron con PCR de colonia. Cuatro clones positivos fueron secuenciados y a partir de estas secuencias tanto las uniones de clonación como los sitios de enzimas de restricción fueron determinados corno correctos (SY1709215-16). Para insertar el promotor prGTL-03, 15460 que contenía t35s-08/iPEPC9-01 fue digerido con BamHI y HindIl y se purificó en gel (SY1709:14). El constructo 11267 que contenía prGTL-03 también fue digerido con BamHI y HindlIl y el promotor fue purificado en gel (SY171023-4). Luego fue ligado en la estructura de 15460 usando estos sitios y transformado en células competentes DH5-alfa. Diez transformantes se cribaron usando HindIII y BamHI para determinar si estaba presente prGTL-03 en el vector; todos los diez tenían patrón de banda correcto (SY1709225). Dos clones fueron secuenciados para confirmar uniones de clonación y sitios de enzimas de restricción y ambos fueron correctos sin diferencias en las secuencias (SY1709:34-35). Los patrones de glicerol fueron preparados a partir del clon #1 y se almacenaron a -80 grados Celsius. El vector de clonación fue digerido con BamHI/Sacl y tratado con CIP. La versión de codón optimizado de maíz sintético de alfa-amilasa de SEQ ID NO: 51, conocida como SEQ ID NO: 79 (también conocida como cAmy(SEQ ID NO: 79)) fue digerida con BamHI y Sacl y ligada en el sitio BamHI/SacI de vector de clonación prGTL-03 para crear el alias GTL+SYN(SEQ ID NO: 79) (SY1773:48). Vector binario: un fragmento de AscI/BamHI del vector 15468 fue ligado en el sitio AscI/BamHI del vector binario 12678 para crear el alias “12678 RsrIl" (SY1533:189). Este clon fue luego digerido con RsrIl y tratado con CIP. El vector de clonación “GTL+SYN(SEQ ID NO: 79)" se digirió con SanDI/RsrIl y se ligó en el sitio de RsrIl para crear B-prGTL:(SEQ ID NO: 79):t35S:PMI (SY1773:56). Los clones positivos se identificaron por PCR y confirmaron por secuenciación de ADN.

El vector de ejemplo designado como “15741”, como se ilustra en la Figura 37, a continuación, es un vector binario para transformación de maíz que aloja al promotor especifico de semilla prGTL-03 que dirige la versión optimizada de maíz sintético dirigida al apoplasto de la glucoamilasa de SEQ ID NO: 25 de ejemplo, la versión optimizada es la SEQ ID NO: 82 de ejemplo o cGAmy(SEQ ID NO: 82)Apo-01. Este binario también contiene un casete de Ubi-PMl-Nos para selección.

Vector de clonación: El constructo, alias 15460ZeinAmyVN fue digerido con Sacl y Rsrll para remover iPEPC9-01 y t35s-08. Igualmente, el constructo 15460 fue digerido con SacI y Rsrll para extraer tNOS-03-01. El terminador t35s08/iPEPC9-01 se ligó en 15460 usando estos sitios (SY1709:6). La reacción de ligamiento fue transformada en células DH5-alfa; los transformantes se cribaron con PCR de colonias. Se secuenciaron cuatro clones positivos y a partir de estas secuencias se determinó que tanto las uniones de clonación como los sitios de la enzimas de restricción eran correctos (SY1709:15-16). Para insertar al promotor prGTL-03, se digirió 15460 que contenía t35s08/iPEPC9-01 se digirió con BamHl y Hindlll y se purificó en gel (SY1709:14). El constructo 11267 que contenía prGTL-03 también se digirió con BamHI y HindIII y el promotor se purificó en gel (SY1710:3-4). Luego se lo ligó en la estructura 15460 usando estos sitios y se transformó en células DH5-alfa competentes. Diez transformantes fueron cribaos usando Hindlll y BamHl para determinar si prGTL-03 estaba presente en el vector; todos los diez tuvieron patrón de banda correcto (SY1709:25). Dos clones se secuenciaron para confirmar las uniones de clonación y los sitios de enzimas de restricción y ambos eran correctos sin ninguna diferencia de secuencia (SY1709:34-35). Los patrones de glicerol fueron preparados a partir del clon #1 y almacenados a -80 grados Celsius. El vector de clonación se digirió con BamHI/Sacl y tratado con CIP. La versión de codón optimizado de maíz sintético de glucoamilasa de la SEQ ID NO: 25, conocida como SEQ ID NO: 82 (también conocida como cAmy(SEQ ID NO: 82 o SYN(SEQ ID NO: 82)) se digirió con BamHI y Sacl y se ligó en el sitio de BamHl/Sacl del vector de clonación prGTL03 para crear el alias GTL+SYN(SEQ ID NO: 82) (SY1773:48). Vector binario: Un fragmento de AscI/BamHI del vector 15468 se ligó en el sitio de AscI/BamHl del vector binario 12678 para crear el alias “12678 Rsrll" (SY1533:189). Este clon fue luego digerido con Rsrll y tratado con CIP. El vector de clonación "GTL+SYN(SEQ ID NO: 82)" se digirió con SanDl/Rsrll y se ligó en el sitio Rsrll para crear B-prGTL:(SEQ ID NO: 82):t35S:PMI (SY1773:66). Los clones positivos fueron identificados por PCR y confirmados por ADN.

El vector de ejemplo designado como "15742", como se ilustra en la Figura 38, a continuación, es un vector binario que aloja (que comprende) al promotor específico de semillas prGTL-03 que dirige la versión optimizada de maíz sintético dirigida al apoplasto de la glucoamilasa de SEQ ID NO: 47 de ejemplo, la versión optimizada es la SEQ ID NO: 81 de ejemplo. Este binario también contiene un casete de Ubi:PMl:NOS para selección.

Vector de clonación: El constructo alias15460ZeinAmyVN se digirió con Sacl y Rsrll para remover iPEPC9-01 y t35s

08. Igualmente, el constructo 15460 se digirió con Sacl y Rsrll para remover tNOS-03-01. El terminador t35s08/iPEPC9-01 se ligó en 15460 usando estos sitios (SY1709:6). La reacción de ligación fue transformada en células DH5-alfa; los transformantes se cribaron con PCR de colonias. Se secuenciaron cuatro clones positivos y a partir de estas secuencias se determinó que tanto las uniones de clonación como los sitios de enzimas de restricción eran correctos (SY1709:15-16). Para insertar al promotor prGTL-O3, 15460 que contiene t35s-08/iPEPC9-01 se digirió con BamHI y Hindlll y se purificó en gel (SY1709:14). El constructo 11267 que contenía prGTL-03 también se digirió con BamHI y Hindlll y el promotor fue purificado en gel (SY1710:3-4). Luego se ligó a la estructura 15460 usando estos sitios y transformado en las células DH5-alfa competentes. Se cribaron diez transformantes usando Hindlll y BamHl para determinar si prGTL-03 estaba presente en el vector; todos los diez tuvieron patrón de banda correcto (SY1709:25). Se secuenciaron dos clones para confirmar las uniones de clonación y los sitios de enzimas de restricción y ambos fueron correctos sin ninguna diferencia de secuencias (SY1709:34-35). Las patrones de glicerol se prepararon a partir del clon #1 y se almacenaron a -80 grados Celsius. El vector de clonación se digirió con BamHl/Sacl y tratado por CIP. La versión de codón optimizado de maíz sintético de glucoamilasa de la SEQ ID NO: 47, conocida como SEQ ID NO: 81 (también conocida como cAmy(SEQ ID NO: 81) se digirió con BamHI y Sacl y se ligó en el sitio de BamHI/Sacl del vector de clonación prGTL-03 para crear el alias GTL+SYN(SEQ ID NO: 81)) (SY1773:48). Vector binario: Un fragmento de Ascl/BamHl del vector 15468 se ligó en el sitio de AscI/BamHI del vector binario 12678 para crear el alias "12678 Rsrll" (SY1533:189). Este clon luego fue digerido con Rsrll y tratado con CIP. El vector de clonación “GTL+SYN(SEQ ID NO: 81)” se digirió con SanDI/Rsrll y se ligó en el sitio de Rsrll para crear B-prGTL:(SEQ ID NO: 81):t35S:PMI (SY1773:56). Los clones positivos se identificaron por PCR y se confirmaron mediante secuenciación de ADN (SY1773:58).

El vector de ejemplo designado como "15743", como se ilustra en Figura 39 a continuación, es un vector binario que aloja (que comprende) al promotor especifico de la semilla prGTL-03 que dirige la versión optimizada de maíz sintético dirigida al apoplasto del ejemplo de la alfa-amilasa de la SEQ ID NO: 3 de ejemplo, la versión optimizada es la SEQ ID NO: 80. Este binario también contiene un casete de Ubi:PMl:NOS para selección.

Vector de clonación: El constructo alia515460ZeinAmyVN se digirió con Sacl y Rsrll para remover iPEPC9-01 y t35s

08. Igualmente, el constructo 15460 se digirió con Sacl y Rsrll para remover tNOS-03-01. El terminador t35s08/iPEPC9-01 se ligó en 15460 usando estos sitios (SY1709:6). La reacción de ligación fue transformada en células DH5-alfa; los transformantes se cribaron con PCR de colonias. Se secuenciaron cuatro clones positivos y a partir de estas secuencias se determinó que tanto las uniones de clonación como los sitios de enzimas de restricción eran correctos (SY1709:15-16). Para insertar el promotor prGTL-03, se digirió 15460 que contiene t35s-08/iPEPC9-01 con BamHI y Hindlll y se purificó en gel (SY1709:14). El constructo 11267 que contenía prGTL-03 también se digirió con BamHI y Hindlll y el promotor se purificó en gel (SY1710:3-4). Luego se lo ligó en la estructura de 15460 usando estos sitios y se lo transformó en células DH5-alfa competentes. Se cribaron diez transformantes usando Hindlll y BamHI para determinar si prGTL-03 estaba presente en el vector; todos los diez tenían un patrón de bandas correcto (SY1709:25). Se secuenciaron dos clones para confirmar uniones de clonación como los sitios de enzimas de restricción y ambos eran correctos sin diferencias de secuencia (SY1709:34-35). Los patrones de glicerol se prepararon a partir del clon #1 y se almacenaron a -80 grados Celsius. El vector de clonación se digirió con BamHl/Sacl y se lo trató con CIP. La versión de codón optimizado de maíz sintético de alfa-amilasa SEQ ID NO: 3, conocida como SEQ ID NO: 80 (también conocida como cAmy(SEQ ID NO: 80) se digirió con BamHI y Sacl y se ligó en el sitio de BamHI/Sacl del vector de clonación prGTL-03 para crear el alias GTL+SYN(SEQ ID NO: 80) (SY1773:48). Vector binario: Un fragmento de AscI/BamHI del vector 15468 se ligó en el sitio de AscI/BamHI del vector binario 12678 para crear el alias "12678 Rsrll" (SY1533I189). Este clon luego fue digerido con Rsrll y tratado por CIP. El vector de clonación “GTL+SYN(SEQ ID NO: 80)" se digirió con SanDl/Rsrll y se ligó en el sitio de Rsrll para crear B-prGTL:(SEQ ID NO: 80):t35S:PMI (SY1773:56). Los clones positivos se identificaron por PCR y confirmaron por ADN secuenciamiento.

El vector de ejemplo designado "15862", como se ilustra en la Figura 40 a continuación, es un vector binario para transformación de maíz que aloja (que comprende) el promotor específico de semillas prGTL-03 que maneja la versión optimizada por maíz sintético de la glucoamilasa de SEQ ID NO: 47 de ejemplo, la versión optimizada es la SEQ ID NO: 81 de ejemplo o cGAmy(SEQ ID NO: 81)ER-01 que es dirigida al ER por la señal de retención en ER KDEL. Este binario también contiene un casete Ubi-PMI-Nos para selección.

La versión de codón optimizado de maíz de la SEQ ID NO: 47, conocida como SYN(SEQ ID NO: 81) (cAMY(SEQ ID NO: 81)-03) fue replicada por PCR y clonada con TOPO con cebadores de manera tal que se agregó una señal de retención en ER KDEL al extremo 3 prima (SY1773253). La presencia de KDEL se confirmó por secuenciamiento de ADN (SY1773254 & 60). Los datos de la secuencia de ADN no confirmaron discrepancias (SY1773:63). El clon #1 se digirió con BamHl/Bglli. purificado por gel de agarosa y se ligó en un vector de clonación que aloja el promotor prGTL-03 y t35s-08 para crear el alias "GTL+SYN(SEQ ID NO: 81) kdel v2" (SY1773266). Un casete génico prGTL-O3:cAmy(SEQ ID NO: 81)kdel:t353-08 fue ligado como un fragmento de SanDI/Rsrll en el sitio de Rsrli de una versión modificada de vector binario 12678 para crear B-prGTL-(SEQ lD NO: 81)KDEL:PMI (SY1773:83). La integridad del vector binario se confirmó por PCR y secuenciamiento de ADN (SY1773:88).

El vector ejemplificativo designado "15880", como se ilustra en la Figura 41 a continuación. es un vector binario que contiene (que comprende) la versión de codón optimizado de maíz de la alfa amilasa de SEQ ID No: 51 de ejemplo, la versión de codón optimizado es la SEQ ID NO: 79 de ejemplo, se expresó usando el promotor de glutelina de arroz (prGTL-03). La alfa amilasa también contiene una secuencia señal de Gamma Zeina y secuencia de KDEL para retención en ER. Este vector contiene un casete de Ubi-PMl-Nos para selección de manosa.

La alfa amilasa de SEQ ID NO: 51 optimizada por codones de maíz. conocida como SEQ ID NO: 79 o cAmy(SEQ ID NO: 79) fue replicada por PCR con cebadores de manera tal que una señal de retención en ER (KDEL) se agregó al extremo 3 prima (SY1777:180). El producto de PCR fue luego purificado por gel, clonado por TOPO y transformado en células competentes TOP10. La presencia del KDEL sin discrepancias se confirmó por secuenciamiento (SY1773173). Los clones TOPO se digirieron con BamHl y Bglll para obtener el gen de amilasa modificado que fue luego purificado por gel. El producto purificado por gel se ligó en 15460 que contiene prGTL-03 (promotor de glutelina de arroz) y t35s-08 para crear el alias "GTL + syn(SEQ ID NO: 79) KDEL v2" (SY1773280; SY1777:180). Después de la transformación en células competentes DHSa, los clones se cribaron para orientación de inserto por PCR. Asimismo, tanto CDS como también las uniones de clonación se secuenciaron antes de la construcción de vector binario (SY1777:189, 191). El casete génico prGTL:cAmy(SEQ ID NO: 79):t35s-08 se digirió con SanDi/Rsrli y se ligó en una versión modificada del constructo 12678 en el sitio de Rsrll (SY1818112). Este constructo se modificó ligando un fragmento de AscI/BamHI del vector 15468 en el sitio de AscI/BamHI del vector binario 12678 para crear el alias 12678 Rsrll" (SY1533:189). La reacción de ligamiento se transformó en células competentes TOP10 y los transformantes se cribaron en forma posterior por PCR de colonias, Dos de los transformantes cribados fueron positivos para el casete génico y se digirieron con BamHI para confirmar su presencia. Después de la confirmación de digestión, el casete completo a partir del clon # 5 fue secuenciado (SY1818:34). Los datos confirmaron que todo el casete, inclusive todas las uniones, está presente sin discrepancias en la secuencia (SY1818:37-38).

El vector ejemplificativo designado “15884”, como se ilustra en la Figura 42 a continuación, es un vector binario que contiene (que comprende) la versión optimizada por codones de maíz de la SEQ ID NO: 25 de ejemplo, la versión de codón optimizado de maíz es la SEQ ID NO: 82 de ejemplo, se expresó usando el promotor glutelina de arroz (prGTL-OS). La glucoamilasa también contiene una secuencia señal de Gamma Zeina y señal de retención en ER (KDEL). Este vector contiene un casete de Ubi-PMl-Nos para selección de manosa.

La versión de codón optimizado de maíz de glucoamilasa de SEQ iD NO: 25, conocida como SEQ ID NO: 82 o cAmy(SEQ ID NO: 82) fue replicada por PCR con cebadores de manera tal que una señal de retención en ER (KDEL) se agregó al extremo 3 prima (SY1777:184). El producto de PCR fue luego purificado por gel, clonado por TOPO y transformado en células competentes TOP10. La presencia del KDEL sin discrepancias se confirmó por secuenciamiento (SY1777:190). Los clones TOPO se digirieron con BamHI y Bglll para obtener el gen de amilasa modificado que fue luego purificada por gel. El producto purificado por gel se ligó en 15460 que contenía prGTL-03 (promotor de glutelina de arroz) y t355-08 para crear el alias “GTL syn(SEQ ID NO: 82) KDEL v2" (SY1818; 1-3). Después de la transformación en las células competentes Top10, los clones se cribaron para la orientación del inserto por PCR. Asimismo, tanto CDS como también las uniones de clonación se secuenciaron antes de la construcción del vector binario (SY1818229-30). Se determinó a partir del secuenciamiento que existe un cambio en el par de bases simple en la secuencia codificadora de cAmy(SEQ ID NO: 82) en el par de bases 156. Es un cambio de T a C que no cambia la secuencia de aminoácido de la proteína (SY1818: 39-40). El casete génico prGTL: syn(SEQ ID NO: 82) KDEL: t35s-08 se digirió con SanDi/Rsrll y se ligó en una versión modificada del constructo 12678 en el sitio de Rsrll (SY1818:31). Este constructo se modificó ligando un fragmento de Ascl/BamHl del vector 15468 en el sitio de Ascl/BamHl del vector binario 12678 para crear el alias “12678 Rsrll" (SY1533:189). La reacción de ligamiento se transformó en células competentes TOP10 y los transformantes se cribaron en forma posterior usando digestiones de enzimas de restricción. Dos de los transformantes se digirieron con varias combinaciones de las enzimas de restricción inclusive Noti, Sacl, EcoRV y Psti para confirmar la presencia -del casete génico (SY1818:45). Después de la confirmación de digestión, todo el casete a partir del clon #7 fue secuenciado (SY1818246-47). Los datos confirmaron que todo el casete, inclusive todas las uniones, está presente y solamente contiene el cambio de par de bases simple descrito anteriormente (SY1818:50).

El vector ejemplificativo designado "15890", como se ilustra en la Figura 43 a continuación, es un vector binario para transformación de maíz que contiene la versión optimizada por codones de maíz de la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 3 de ejemplo, la versión de codón optimizado de maíz es la SEQ ID NO: 80 de ejemplo o cAmy(SEQ ID NO: 80) se expresó usando el promotor de glutelina de arroz (prGTL-03). La glucoamilasa también contiene una secuencia señal de Gamma Zeina y señal de retención en ER (KDEL). Este vector contiene un casete de Ubi-PMI-Nos para selección de manosa.

La versión de codón optimizado de maíz de la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 3 de ejemplo, conocida como cAmy(SEQ ID NO: 80) fue replicada por PCR con cebadores de manera tal que una señal de retención en ER (KDEL) se agregó al extremo 3 prima (SY1777:184). El producto de PCR fue luego purificado por gel, clonado por TOPO y transformado en células competentes TOP10. La presencia del KDEL sin discrepancias se confirmó por secuenciamiento (SY1777:190). Los clones TOPO se digirieron con BamHl y Bglll para obtener el gen de amilasa modificado que fue luego purificado por gel. El producto purificado por gel se ligó en 15460 que contiene prGTL-03 (promotor de glutelina de arroz) y t355-08 para crear el alias “GTL + syn(SEQ lD NO: 80) KDEL v2" (SY1818; 1-3). Después de la transformación en células competentes TOP10, los clones se cribaron para la orientación del inserto por PCR. Asimismo, tanto CDS como también las uniones de clonación se secuenciaron antes de la construcción del vector binario (SY1818:51). El casete génico prGTL: syn(SEQ ID NO: 80) KDEL: t35s-08 se digirió con SanDl/Rsrll y se ligó en una versión modificada del constructo 12678 en el sitio de Rsrll (SY1818:52). Este constructo se modificó ligando un fragmento de AscllBamHI del vector 15468 en el sitio de Ascl/BamHl del vector binario 12678 para crear el alias 12678 Rsrll" (SY1533:189). La reacción de ligamiento se transformó en' células competentes TOP10 y los transformantes se cribaron en forma posterior usando PCR y digestiones de enzimas de restricción. Dos de los transformantes que tuvieron resultados de PCR positivos se digirieron con varias combinaciones de enzimas de restricción inclusive Ncol, Kpnl, EcoRV, Xbal y Bglll para confirmar la presencia del casete génico (SY1818:65-66). Después de la confirmación de digestión, todo el casete a partir del clon #2 fue secuenciado (SY1818:67). Los datos confirmaron que todo el casete, inclusive todas las uniones, está presente sin diferencias de secuencia (SY1818:6970).

El vector ejemplificativo designado "15889",como se ilustra en la Figura 44 a continuación. es un vector binario para transformación de maíz que contiene una pila (stack) molecular de la versión optimizada por codones de glucoamilasa la de SEQ ID NO: 25 de ejemplo, la versión de codón optimizado es la SEQ iD NO: 82 o la cGAmy(SEQ ID NO: 82) de ejemplo fue expresada por dos promotores diferentes. En el primer casete, el cAmy(SEQ ID NO: 82) es dirigido por el promotor de glutelina de arroz y tiene una secuencia señal de Gamma Zeina y señal KDEL para retención en el ER. En el segundo casete, la glucoamilasa es manejada por el promotor de inhibidor de alfa tripsina y es dirigida al apoplasto con la secuencia señal de Gamma Zeina. Este constructo también contiene un casete de Ubi-PMI-Nos para selección de manosa.

El promotor de arroz, prATl-01 fue mutagenizado a través de mutagénesis dirigida a sitio para extraer un sitio de Rsrll interno y fue sometido como un nuevo componente en el constructo #15882. Después de la confirmación en secuencia de la extracción de este sitio, el vector de clonación "15460+prATI+t35508" se digirió con BamHI/Sacl, tratado por CIP y se extrajo con gel (SY1777:162). La glucoamilasa sintética optimizada por codones Syn(SEQ ID NO: 82) (BamHI/Sacl) se ligó en la estructura digerida y el constructo resultante se conoce como "15460prATlm.syn(SEQ ID NO: 82)” (SY1777:170). Los transformantes se cribaron para la presencia del gen, usando tanto PCR de colonias como una digestión de diagnóstico de Ncol/Bglll. Tres clones positivos se secuenciaron; se confirmaron las uniones de clonación para los tres clones (SY1777:177-179). Después de la confirmación de secuencia. “15460prATlm.syn(SEQ ID NO: 82)” se digirió con SanDl/Rsrll y el casete de ATI: syn(SEQ ID NO: 82);t35s-08 se ligó en la estructura binaria y se transformó en células competentes TOP10 (SY1818:53). Diez transformantes fueron seleccionados para cribado, por PCR, uno de los cuales confirmó tener el casete que contiene el promotor de ATI (SY1818:56). El clon positivo fue luego cribado con digestiones de enzima de restricción de diagnóstico usando las siguientes enzimas: EcoRI. BgIII, Ncol y Hindlll (SY1818260, 66). Se determinó que el clon #9 era correcto analizando el patrón de banda de varias digestiones. Asimismo, las uniones de clonación del clon 9 se secuenciaron y también se confirmaron como correctas (SY1818:65).

El vector ejemplificativo designado "15934", como se ilustra en la Figura 45 a continuación. es un vector binario para transformación de planta que contiene una pila molecular de la versión de codón optimizado de la glucoamilasa de SEQ lD NO: 47 de ejemplo. la versión optimizada por codones es la SEQ ID NO: 81 o la cGAmy(SEQ ID NO: 81) de ejemplo fue expresada por dos promotores diferentes. En el primer casete. El GAmy(SEQ ID NO: 81) es manejado por el promotor de glutelina de arroz y tiene una señal KDEL para retención en ER (el componente es cGAmy(SEQ ID NO: 81)ER-01). En el segundo casete, el GAmy(SEQ ID NO: 81) es manejado por el promotor de inhibidor de alfa tripsina y es dirigido al apoplasto (el componente es cGAmy(SEQ ID NO: 81)Apo-01). Este constructo también contiene un casete de Ubi-PMI-Nos para de selección manosa. NOTA: Se determinó por digestión de restricción y secuenciamiento que una de las inserciones de limite izquierdo había desparecido. El proyecto eligió proceder con el vector.

El vector de clonación “15460+prATI+t35508" se digirió con BamHI/Sacl. se trató por CIP y se extrajo con gel (SY1777:162). La glucoamilasa sintética optimizada por codones cGAmy(SEQ ID NO: 81)Apo-01 (BamHI/Sacl) se ligó la estructura digerida y el constructo resultante se conoce como "15460 prATlm.syn(SEQ ID NO: 81)" (SY1777:170). Los transformantes se cribaron para la presencia del gen, usando tanto PCR de colonias como una digestión de Ncol/Bglll de diagnóstico. Tres clones positivos se secuenciaron; y se confirmaron las uniones de clonación para los tres clones (SY1777:177-179). Después de la confirmación de secuencia, 15460prATIm.syn(SEQ ID NO: 81) se digirió con SanDl/Rsrll y el casete de ATI: cGAmy(SEQ ID NO: 81)Apo-01:t35s-08 se purificó con gel (SY1773:72). El vector binario "B-prGTL: (SEQ lD NO: 81)KDEL: PMI" fue construido y etiquetado como constructo #15862 (SY17773:92). Fue alineado con Rsrll. tratado por CIP y extraído con gel. Después de la purificación, el casete de ATI: cGAmy(SEQ ID NO: 81)Apo-01:t35s-08 se ligó en la estructura binaria y se transformó en células competentes TOP10 (SY1818:22-23). Los transformantes se cribaron inicialmente con PCR de colonias usando cebadores que solamente se anillaban en el promotor de ATI. Se seleccionaron diez transformantes y se confirmó que tenían el casete que contenía el promotor de ATI. El clon 8 fue seleccionado para análisis de restricción para confirmar de manera adicional la presencia del casete en el vector binario. Dos enzimas que se cortan en el promotor de ATI en forma específica así como también la estructura fueron seleccionadas para descartar la posibilidad de un casete doble. Cuando el clon #8 se digirió con Avrll y Ncol, se determinó que solamente existía una copia de cada casete presente (SY1818: 93 -94).

Análisis de actividad enzimática

Se usó análisis de semillas individuales o análisis de semillas reunidas para medir la actividad de alfa-amilasa o glucoamilasa en semillas transgénicas. Para el análisis de semillas individuales, se seleccionaron al azar 12 semillas de cada evento y se las trituró en forma individual. Para el análisis de semillas reunidas, se seleccionaron al azar 20 semillas de eventos seleccionados, se las acopió y molió. Las harinas fueron luego evaluadas usando el ensayo CERALPHA HRMR de Megazyme para las alfa-amilasas o el ensayo de glucoamilasa de Megazyme para las glucoamilasas. Los procedimientos de operación estándares del ensayo (SOP) se describieron con antelación, inclusive el “análisis de actividad enzimática", la extracción de alfa-amilasa de la harina de maíz y el ensayo de actividad, la extracción de glucoamilasa de la harina de maíz y el ensayo de actividad y el protocolo de fermentación de almidón sin purificar.

Resultados

Ensayo Taqman y ensayos de actividad enzimática

Los números de copias de los transgenes se determinaron por ensayos primarios y secundarios de Taqman. Los cebadores específicos para el gen marcador seleccionable usados en los vectores de transformación de maíz descritos con antelación, pmi, se usaron en los ensayos primarios de Taqman. Los cebadores específicos para el gen pmi, el gen marcador seleccionable bacteriano, spec y genes que codifican las alfa-amilasas o glucoamilasas se usaron en los ensayos secundarios de Taqman.

La expresión de alfa-amilasas o glucoamilasas en las semillas transgénicas T1 secas maduras de constructos seleccionados también fue analizada mediante ensayos de actividad enzimática. Los resultados de los números de copias de genes en los eventos seleccionados generados a partir del constructo 15840 se resumieron en la Tabla

3.2. La expresión de la alfa-amilasa de codón optimizado de la SEQ ID NO: 79 de ejemplo fue medida en estos eventos mediante análisis de actividad enzimática en 12 semillas seleccionadas al azar en forma individual. La actividad promedio de las 12 semillas para cada evento también se muestra en la Tabla 3.2, a continuación.

En forma similar, la Tabla 3.3 muestra los números de copias de genes de los eventos seleccionados generados del constructo 15841. La expresión de la glucoamilasa de codón optimizad de la SEQ ID NO: 82 de ejemplo fue también medida en estos eventos mediante análisis de actividad enzimática en 12 semillas seleccionadas al azar en forma individual, y la actividad promedio de las 12 semillas para cada evento se resume en la Tabla 3.3, a continuación.

Veinte (20) semillas de cada uno de los eventos seleccionados generadas a partir de los constructos 15842 y 15843, por otro lado, fueron reunidas para ensayos enzimáticos para determinar los niveles de expresión de la glucoamilasa de la SEQ ID NO: 81 de codón optimizado y la alfa-amilasa de codón optimizado de la SEQ ID NO: 80 de ejemplos en estos eventos, respectivamente. Los resultados se resumen en las Tablas 3.4 y 3.5, respectivamente, a continuación. Los números de copias transgénicas también son ilustrados.

Tabla 3.2. Números de copias transgénicas y actividad de alfa-amilasa en los eventos seleccionados generados a partir del constructo 15840

Número de la planta: Actividad promedio de 12 semillas (U/g)

1: 377,3

2: 291,9

3: 95,1

4: 119,4

5: 155,4

6: 129,4

7: 125,3

8: 539,4

9: 1362,4

10: 195,1

11: 88,4

12: 458,2

13: 722,9

14: 151,7

15: 164,8

Tabla 3.3. Números de copias transgénicas y actividad de glucoamilasa en eventos seleccionados generados a partir del constructo 15841

Número de la planta: Actividad promedio de 12 semillas (U/g)

1: 2,5

2: 3,5

3: 2,6

4: 2,8

5: 2,4

6: 3,0

Número de la planta: Actividad promedio de 12 semillas (U/g)

7: 2,6

8: 2,5

9: 2,6

10: 2,8

11: 3,0

12: 3,0

13: 2,9

14: 3,4

15: 2,3

16: 2,5

17: 2,6

18: 3,3

19: 2,4

20: 2,9

21: 3,5

22: 2,3

23: 2,5

24: 2,3

Tabla 3.4. Números de copias transgénicas y actividad de glucoamilasa en eventos seleccionados generados a partir del constructo 15842

Número de la planta: Actividad de las semillas reunidas (U/g)

1: 1,5

2: 1,3

3: 1,3

4: 1,2

5: 1,3

6: 1,6

7: 1,4

Número de la planta: Actividad de las semillas reunidas (U/g)

8: 1,4

9: 1,3

10: 1,2

11: 1,4

12: 1,6

13: 1,7

14: 1,2

15: 1,3

16: 1,6

17: 1,4

18: 1,6

19: 1,6

20: 1,6

Tabla 3.5. Números de copias transgénicas y actividad de alfa-amilasa en eventos seleccionados generados a partir del constructo 15843

Número de la planta: Actividad de las semillas reunidas (U/g)

1: 116,14

2: 107,07

3: 105,02

4: 277,65

5: 240,90

6: 165,25

7: 425,17

8: 151,02

9: 139,74

10: 245,27

11: 197,68

12: 179,77

Número de la planta: Actividad de las semillas reunidas (U/g)

13: 368,59

14: 350,91

15: 225,03

16: 233,18

17: 366,24

18: 220,36

Tabla 3.6 Producción de etanol después de 72 horas de fermentación de almidón crudo utilizando enzimas “principales” de ejemplo expresadas en maíz utilizando genes sintéticos de codón optimizado de maíz

15840 (SEQ ID NO: 79): 15841 (SEQ ID NO: 82) 20 50 30 16,77

15840 (SEQ ID NO: 79): 15842 (SEQ ID NO: 81) 20 50 30 17,08

15843 (SEQ ID NO: 80): 15841 (SEQ ID NO: 82) 20 50 30 7,30

15843 (SEQ ID NO: 80): 15842 (SEQ ID NO: 81) 20 50 30 10,60

N/A
N/A: 0 0 100 2,25

5 Fermentación de almidón sin purificar usando enzimas expresadas en maíz

Las semillas de los eventos mostradas anteriormente que expresan alfa-amilasas y glucoamilasas fueron reunidas y trituradas para elaboración de muestras compuestas para fermentaciones de almidón sin purificar. En todos los experimentos, la harina de maíz que contenía alfa-amilasas fue usada en la tasa de inclusión de 20% (p/p) y la harina de maíz que contenía glucoamilasas a la velocidad de inclusión de 50% (p/p). La harina de de maíz del

10 producto Yellow Dent II laborada a partir del 30% (p/p) restante de la harina de maíz. Las fermentaciones de almidón sin procesar se llevaron a cabo siguiendo el SOP estándar descrito anteriormente (Sección I). La capacidad de estas combinaciones de alfa-amilasa y glucoamilasa expresadas en maíz que utiliza genes sintéticos de codón optimizado de maíz para producir etanol en una fermentación de almidón sin purificar se resume en la Tabla 3.6, a continuación.

15 Ejemplo 29: Constructos de expresión de Pichia pastoris

Este ejemplo describe la expresión de enzimas en levadura utilizando, por ejemplo, sistemas de expresión de Pichia de ejemplo.

Para la construcción de constructos de expresión en vectores pPICZaIfa y pAO815 (ambos de Invitrogen, Carlsbad, CA), se utilizó tecnología de clonación Xi. Se digirió pPICZaIfa con EcoRI, y se lo trató con cócteles de clonación Xi 20 (de acuerdo con el protocolo del fabricante de Genlantis, una división del Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA). Los genes fueron amplificados por reacciones PCR haciendo coincidir el extremo con las secuencias de vector. Para la transformación de huéspedes Pichia se digirió el ADN del plásmido verificado para volver al ADN lineal y

transformarlo en huéspedes Pichia. Los transformantes se seleccionaron bajo placas deficientes en Zeocina (pPICZaIfa) o en histidina.

Todas las enzimas se obtuvieron por expresión en Pichia pastoris, excepto para la SEQ ID NO: 78 (codificada por SEQ ID No: 77), que fue expresada en Pseudomonas fluorescens (véase JBC, 2002, 277(29): 26501 -26507).

I.Caracterización de glucoamilasas y amilasas.

Métodos:

6.: Determinación de la concentración de proteínas

Los sobrenadantes liofilizados de los cultivos de P. pastoris que expresan glucoamilasas y α-amilasas se suspendieron en agua a una concentración de ~10 mg de polvo / ml. Después de la determinación del contenido de proteína por el protocolo Bradford, 5 µg de una muestra de proteína y solución BSA estandarizada se corrieron sobre un gel de gradiente de 4 -20% de Tris-Glicina. El gen se escaneó en un escáner de gel BioRad GS800 después de tinción con azul de Coomassie. El software Bio-Rad QUANTITY ONE se usó para la cuantificación de las bandas de BSA y glucoamilasa (o α-amilasas) y se calculó luego la concentración real de enzimas. La concentración de proteínas se ajustó en consecuencia y se confirmó por SDS PAGE adicional.

7.: Determinación de velocidades de reacción iniciales.

A menos que se indique lo contrario, los ensayos se realizaron por triplicado a 37 °C y pH 5,0 en regulador (NaCH3CO2 50 mM, CaCl2 10 mM; NaN3 10 mM y 0,01% de Triton X-100) que contiene 1% de almidón sin purificar,

o 0,5% de dextrina o 1% de "almidón de maíz soluble" (véase la nota más abajo sobre la preparación de “almidón soluble”). Los ensayos se realizaron a una escala de 0,5 ml para glucoamilasa y a escala de 0,25 ml para alfaamilasa en una incubadora de mesa Eppendorf con agitación constante (800 rpm).

Para las glucoamilasas, las reacciones comenzaron al agregar la enzima (concentración final de 0,25 µg/ml) a la mezcla de reacción. A 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20 y 30 min, se retiraron alícuotas de 50 µl de alícuotas de las reacciones y se neutralizaron por adición a 100 µl de regulador Tris 1 M, pH 7,5.

Para las alfa-amilasas, las reacciones comenzaron al agregar la enzima (concentración final de 0,4 µg de proteína total/ml para la SEQ ID No: 56, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 52; 2 µg/ml para la SEQ ID NO: 62; 4 µg/ml para la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 66) a la mezcla de reacción y se retiraron alícuotas de 10 µl de las reacciones y se neutralizaron en reactivo de BCA a 2,5, 10, 15, 20, 25, 30 y 40 min.

Para la determinación de los perfiles de temperatura, los ensayos se realizaron a 30, 34, 37 y 40 ºC.

El efecto de pH sobre las actividades de glucoamilasa y amilasa se evaluaron a pH de 3,5, 4, 5, 6 y 7, usando el regulador de rango amplio de pH de Britton -Robinson (CH3COOH 50 mM; H3PO4; H3Bo3). Las reacciones paralelas a un pH de 4, 5 y 6 se realizaron también en presencia de regulador de acetato 50 mM para asegurar que el regulador usado no influyó en los resultados. Para la determinación del perfil de pH de dos alfa-amilasas que dependen de calcio (SEQ ID NO: 56 y SEQ lD NO: 62), se usaron reguladores de ácido málico / acetato / MES en vez del de Britton-Robinson.

Preparación de “almidón de maíz soluble" para la reacción con alfa-amilasas. La dextrina (Sigma D2006) no se pudo usar como sustrato en las reacciones de alfa-amilasa BCA debido al medio con alto contenido de extremos reductores. Por lo tanto, se empleó almidón de maíz calentado como sustrato. Específicamente, se disolvió 2% de almidón de maíz en agua desionizada y se calentó mezclando en un baño de agua en ebullición durante 30 -40 minutos, hasta que el almidón se disolvió y la solución tomó aspecto lechoso, pero traslúcido. La solución de almidón calentado se usó durante 2 días, después de lo cual se observaron algunos signos de degradación (apariencia de grumos de almidón) y se descartó la solución.

8. Ensayo de glucosa oxidasa / peroxidasa (GO) para la cuantificación de glucosa liberada durante la hidrólisis de almidón.

Se usó un ensayo de glucosa oxidasa/ peroxidasa (GO) acoplada para determinar la cantidad de glucosa liberada por la glucoamilasa durante la hidrólisis de almidón. Las reacciones de GO comenzaron al agregar 10 µl de la reacción de hidrólisis de almidón neutralizada a 90 µl de PBS que contenía glucosa oxidasa (0,1 U/ml), peroxidasa (0,25 U/ml) y Amplex Red 0,05 mM, en placas Nunc negras de 96 pozos. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 min antes de la lectura en un lector de placas fluorescentes con Ex/Em 545/590 nm. Una curva estándar con concentraciones de glucosa de 0 a 100 µM se usó para evaluar la cantidad de glucosa producida en las reacciones de hidrólisis. Las velocidades iniciales de hidrólisis de almidón (nmoles de glucosa

liberada de 1% de almidón granulado / min / µg de glucoamilasa) se determinaron al graficar la cantidad de glucosa liberada en el tiempo y calculando la pendiente de la línea de mejor ajuste a través de los puntos de datos.

9.: Ensayo de BCA para determinar el incremento en la concentración de extremos reductores durante la hidrólisis de almidón.

10.: Especificidad del tipo de enlace de glucoamilasas con maltosa e isomaltosa como sustratos

Resultados

2. Caracterización de glucoamilasas

1.1 Velocidades iniciales de reacción:

Las velocidades iniciales para hidrólisis de almidón granulado y soluble se presentan en la Tabla 1. Como se puede observar a partir de la Tabla 1, las glucoamilasas de ejemplo de esta divulgación mostraron hasta 3 veces mejor actividad (SEQ ID NO: 48) contra el almidón granulado, con similar o ligeramente mejor actividad en el almidón soluble al compararse con la enzima de punto de referencia de A. niger. La SEQ ID NO: 48 también fue expresada en E. coli (véase la sección anterior sobre los constructos de expresión de Picha) -esta enzima expresada en E. coli se etiqueta como SEQ ID NO: 48 (Ec) en la Tabla a continuación. La SEQ lD NO: 48 (Ec) no mostró actividad contra almidón granulado bajo las condiciones evaluadas (probablemente debido a la falta de un dominio de enlace a almidón).

Tabla 1: Comparación de las velocidades iniciales de hidrólisis de almidón de maíz granulado y almidón soluble (dextrina) por amilasas y/o glucoamilasas de ejemplo "principales" y una enzima glucoamilasa de punto de referencia de A. niger (Sigma A7095) a 37 °C. pH 5,0:

Tabla 1

Enzima: Velocidad inicial* ± SD del almidón granulado Velocidad inicial* ± SD del almidón soluble

SEQ ID NO: 48: 35,6 ± 3,8 60,7 ± 5,1

SEQ ID NO: 26: 28,8 ± 3,4 51,8 ± 7,4

SEQ ID NO: 74: 25,1 ± 2,5 84,3 ± 3,5

SEQ ID NO: 18: 24,3 ± 4,3 58,3 ± 3,0

SEQ ID NO: 28: 17,8 ± 4,3 33,8 ± 4,0

SEQ ID NO: 14: 6,6 ± 1,2 53,9 ± 4,1

SEQ ID NO: 48(Ec): 0 59,3 ± 8,5

Glucoamilas de A. niger (Sigma A7095): 11,3 ± 2,7 43,3 ± 7,4

*Las velocidades iniciales se expresan como nmoles de de glucosa/min/µg de proteína glucoamilasa libreada del 1% de almidón granular o a partir de 0,5% de dextrina. Cada número es el valor promedio de 6 -10 puntos de datos.

1.2 Perfil de temperatura:

El efecto de la temperatura (30 °C -40 °C) sobre la hidrólisis de almidón por las glucoamilasas caracterizadas se presenta en las Figuras 1A y 1B. Las actividades de las glucoamilasas se incrementaron con la temperatura; fueron más activas a 40 °C pero retuvieron aproximadamente 50% de la actividad pico a 30°C.

Figura 28A: Efecto de la temperatura sobre la actividad de las amilasas y/o glucoamilasas de ejemplo y la glucoamilasa de A. niger con almidón granulado como substrato (glucoamilasa de A. niger como punto de referencia (Sigma A7095)). La liberación de glucosa se midió a la temperatura indicada a un pH de 5,0. La SEQ ID NO: 20 de ejemplo o está incluido en el gráfico ya que no mostró ninguna actividad contra almidón granulado bajo estas condiciones particulares de ensayo.

Figura 28B: Efecto de la temperatura sobre la actividad de la glucoamilasa de la SEQ ID NO: 20 de ejemplo y la glucoamilasa de A. niger (Sigma A7095) con almidón soluble (Dextrina) como substrato. La liberación de glucosa se midió a la temperatura indicada a pH de 5,0.

1.3 Perfil de pH:

La influencia del pH sobre la hidrólisis de almidón se evaluó tanto en el almidón granulado como en el soluble y los resultados se presentan en la Figura 2A y en la Figura 2B, respectivamente. Todas las glucoamilasas hidrolizaron mejor ambos sustratos a pH inferior, siendo la SEQ ID NO: 26 de carácter más ácido.

Figura 29A: Efecto del pH sobre la actividad de las glucoamilasas con almidón granulado como sustrato. La liberación de glucosa se midió en el pH indicado a 37 ºC. Las velocidades iniciales se calcularon sobre 20 min y se convirtieron a un porcentaje de la velocidad máxima. La SEQ ID NO: 20 de ejemplo no se incluyó en el gráfico porque no mostró actividad contra almidón granulado, bajo las condiciones particulares aquí evaluadas.

Figura 29B: Efecto del pH sobre la actividad de de las glucoamilasas con almidón soluble como sustrato. La liberación de glucosa se midió en el pH indicado a 37 ºC. Las velocidades iniciales se calcularon sobre 20 min y se convirtieron a un porcentaje de la velocidad máxima.

1.4 Especificidad de escisión del tipo de enlace:

Los parámetros cinéticos para la hidrólisis de maltosa (enlace α-1,4) (la maltosa es 2 alfa -D-glucosas) e isomaltosa (enlace α-1,6) se determinaron para 7 glucoamilasas seleccionadas y la glucoamilasa de A. niger como punto de referencia (Sigma A7095). Los experimentos se realizaron con Iisados de P. pastoris Iiofilizados y las proteínas no se purificaron; por lo tanto, únicamente se reportaron en este documento los datos independientes de concentración de proteínas. La Tabla 2, a continuación, resume los valores de KM para maltosa e isomaltosa y la relación de kcat/KM

o para maltosa comparado con kcat/KM para isomaltosa. Estos parámetros determinados para glucoamilasa de A. niger (Sigma A7095) están en concordancia con los datos publicados (KM para maltosa se reporta que es 1,2 -2,1 mM; KM para isomaltosa se reporta que es 19,8 – 42,0 y kcat/KM para maltosa sobre kcat/KM para isomaltosa se reporta que está entre 300 -600, de acuerdo con Frandesen y colaboradores. (1995); Sierks y Svensson;1996; Fagerstrom y Kalkkinen; 1995).

Como puede observarse a partir de la Tabla 2, el ejemplo de la glucoamilasa de la SEQ lD NO: 20 fue la más fuertemente selectiva para maltosa y tuvo casi 900 veces mayor especificidad hacia los enlaces α-1,4 con relación a los enlaces α-1,6. La glucoamilasa menos selectiva fue la SEQ ID NO: 14 con especificidad ~100 veces mayor superior hacia los enlaces α-1,4 con relación a los enlaces α-1,6.

Tabla 2. Parámetros cinéticos para hidrólisis de maltosa e isomaltosa mediante 7 glucoamilasas de ejemplo de esta divulgación y una como punto de referencia (glucoamilasa de A. niger (Sigma A7095)).

Enzima: Maltosa Isomaltosa Kcat/KM (maltosa) /kcat/KM (isomaltosa)

KM(mM)
KM(mM)

SEQ ID NO: 29: 0,61 ± 0,06 11,94 ± 4,99 750

SEQ ID NO: 74: 1,87 ± 0,17 11,55 ± 2,92 481

SEQ ID NO: 20: 2,62 ± 0,19 53,97 ± 23,17 897

SEQ ID NO: 14: 2,67 ± 0,15 41,5 ± 5,05 116

SEQ ID NO: 26: 0,98 ± 0,33 12,18 ± 0,64 456

SEQ ID NO: 48: 2,26 ± 0,12 21,69 ± 3 565

SEQ ID NO: 18: 1,01 ± 0,09 11,74 ± 7,74 415

Glucoamilasa A. niger (Sigma A7095): 0,93 ± 0,1 18,72 ± 3,95 249

Cada número es un valor promedio de 5 experimentos diferentes

5 Caracterización de amilasas

Velocidades iniciales de reacción: Las velocidades iniciales de hidrólisis de almidón granulado y almidón soluble se presentan en la Tabla 3. Se compararon ocho alfa-amilasas de ejemplos con una alfa -amilasa de punto de referencia de A. oryzae. Como se puede observar a partir de la Tabla 3 a continuación todas las amilasas evaluadas mostraron actividad significativamente superior contra almidón soluble cuando se compara con almidón granulado.

10 Sin embargo, esta diferencia fue menos marcada para las amilasas y/o glucoamilasas que para la enzima como punto de referencia.

Tabla 3: Comparación de las velocidades iniciales de hidrólisis del almidón de maíz de granulado y el almidón de maíz soluble por medio de 8 α-amilasas y una alfa-amilasa como punto de referencia de A. oryzae a 37 °C y pH5:

Tabla 3

Ejemplo de enzima: Velocidad inicial* ± SD de almidón granulado Velocidad inicial* ± SD de almidón soluble

SEQ ID NO: 56: 15,7 ± 1,67 1607,9 ± 518,22

SEQ ID NO: 70**: 20,5 109,1

SEQ ID NO: 62: 3,5 ± 0,37 139,6 ± 55,96

SEQ ID NO: 66**: 2,1 70,8

SEQ ID NO: 2: 7 ± 0,75 381,2 ± 74,15

SEQ ID NO: 52: 10,3 ± 1,75 248,2 ± 28,46

SEQ ID NO: 78: 0,4 ± 0,06 232 ± 52,63

SEQ ID NO: 76**: 25,2 809,1

Amilasa de A. oryzae (MegazymeE-ANAAM): 0,4 ± 0,07 498,7 ± 64,78

*Las velocidades iniciales se expresan como nmoles de los extremos reductores liberados a partir de 1% de almidón /min/µg de proteína alfa-amilasa. **Datos obtenidos utilizando enzima purificada.

-: Cada número es un valor promedio de 5 puntos de datos.

Perfil de temperatura: El efecto de la temperatura sobre la hidrólisis de almidón por las α-amilasas caracterizadas se presenta en la Figura 30. Las actividades de las amilasas fueron afectadas por la temperatura en un grado diferente. Cinco de las amilasas de ejemplo de esta divulgación (SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 78, SEQ iD NO: 76 y SEQ ID NO: 66) fueron más activas a 40 ºC y retuvieron aproximadamente 30% de la actividad a 30 ºC. Las actividades de la SEQ ID NO: 2, SEQ lD No: 52 y SEQ ID NO: 62 de ejemplo fueron afectadas sólo marginalmente por los cambios en temperatura en el rango investigado.

La Figura 30 ilustra: la influencia de la temperatura sobre la hidrólisis de almidón por 9 α-amilasas. La actividad se midió a un pH de 5,0 durante 40 min de incubación a la temperatura indicada y las velocidades iniciales fueron calculadas y graficadas contra tiempo. En la Figura 30:

*: Las velocidades para las SEQ ID NO: 56, SEQ lD NO: 2 y SEQ ID NO: 52 de ejemplos se presentan en el eje izquierdo; las velocidades para el resto de las enzimas se presentan en el eje derecho.

*: Las velocidades iniciales se expresan como nmoles de extremos reductores liberados a partir de 1% de almidón de maíz granulado/min/µg de enzima en 250 µl de reacción.

-: Las actividades de las SEQ ID NO: 70, SEQ lD NO: 66 y SEQ ID NO: 76 de ejemplo se expresan en nmoles/min/µg de proteína total en sobrenadante de Pichia pastoris.

Perfil de pH: La influencia del pH sobre la hidrólisis de almidón se evaluó con sustratos tanto de almidón granulado como de almidón soluble y los resultados se presentan en la Figura 31A y en la Figura 31B, respectivamente. La SEQ ID NO: 52 de ejemplo (de origen fúngico) tuvo el pH menos óptimo (~pH 4). Otra enzima de ejemplo (SEQ ID NO: 2) (de origen fúngico) también mostró preferencia por el pH ácido, con un pH óptimo aparente de ~pH 4,5 -5. La amilasa de la SEQ ID NO: 66 de ejemplo (de origen arqueal) tuvo un pH óptimo aparente de ~pH 5,0, reteniendo ~70% de actividad pico a un pH de 4,0. Las enzimas restantes tuvieron un pH óptimo aparente entre 5,0 y 6,0 y fueron casi inactivas a un pH de 4,0 y 3,5.

Figura 31A: Efecto del pH sobre las actividades de α-amilasas con almidón granulado como sustrato. El incremento en los extremos reductores se midió al pH indicado a 37 °C. Las velocidades iniciales se calcularon sobre 40 min y se convirtieron a un porcentaje de la velocidad máxima.

Figura 31B: Efecto del pH sobre las actividades de α-amilasas con almidón soluble como substrato. El incremento en los extremos reductores se midió al pH indicado a 37 °C. Las velocidades iniciales se calcularon sobre 40 min y se convirtieron a un porcentaje de la velocidad máxima.

Se han descrito una cantidad de formas de realización. Sin embargo, se entiende que varias modificaciones pueden ser realizadas sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención. Por consiguiente, otras formas de realización se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Listado de secuencias

<110> VERENIUM CORPORATION SYNGENTA PARTICIPATIONS AG <120> AMILASAS Y GLUCOAMILASAS, ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN Y MÉTODOS PARA FORMARLAS Y UTILIZARLAS

<130> V 574/MH

<140> 12 152 662.8 5 <141> 21.12.2007

<150> US 60/892,823

<151> 2007-03-02

<150> US 60/877,068

<151> 2006-12-21 10 <160> 82

<170> PatentIn 3.3

<210> 1

<211> 1710

<212> ADN 15 <213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331

<400> 1

<210> 2

<211> 569

<212> PRT

<213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331

<220> <221> DOMINIO

<222> (13)...(353)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

5 <221> DOMINIO

<222> (469)...(564)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

10 <222> (22)...(25)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (148)...(151) 15 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (558)...(561)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

20 <400> 2

<210> 3

<211> 1770

<212> ADN

<213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331

<400> 3 <210> 4

<211> 589

<212> PRT

<213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20)

<220>

5 <221> DOMINIO

<222> (33)...(373)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> DOMINIO

10 <222> (489)...(586)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (42)...(45) 15 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (168)...(171)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

20 <220>

<221> SITIO

<222> (578)...(581)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 4

<210> 5

<211> 2541

<212> ADN

<213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331

<400> 5

<210> 6

<211> 846

<212> PRT 5 <213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331

<220>

<221> DOMINIO

<222> (169)...(710)

<223> Glicosil hidrolasas familia 31

10 <220>

<221> SITIO

<222> (53)...(56)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

15 <221> SITIO

<222> (97)...(100)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

20 <222> (134)...(137)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (222)...(225)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (303)...(306)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (349)...(356)

<223> Glicosil hidrolasas familia 31 active site. Prosite id = PS00129

<220>

<221> SITIO

<222> (405)...(408)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (554)...(584)

<223> Glicosil hidrolasas familia 31 signature 2. Prosite id = PS00707

<220>

<221> SITIO

<222> (563)...(566)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (671)...(674)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (701)...(704)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO <222> (729)...(732)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

5 <222> (746)...(749)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (772)...(775) 10 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (797)...(800)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

15 <400> 6

<210> 7

<211> 1572

<212> ADN

<213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331

<400> 7

<210> 8

<211> 524

<212> PRT

<213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48331

<220>

<221> DOMINIO <222> (54)...(518)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> SITIO

5 <222> (194)...(197)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (237)...(240) 10 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (239)...(249)

<223> Signatura de la región del sitio activo de la glucoamilasa. ID de Prositio= PS00820

15 <220>

<221> SITIO

<222> (433)...(436)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 8

<210> 9

<211> 1467

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 9 <210> 10

<211> 488

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL <222> (1)...(22)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (33)...(449) 5 <223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> SITIO

<222> (194)...(197)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

10 <400> 10

<210> 11

<211> 1746

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 11 <210> 12

<211> 581

<212> PRT <213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(21)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (38)...(454)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (483)...(576)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (139)...(142)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (199)...(202)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (201)...(211)

<220>

<221> SITIO

<222> (210)...(213)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 12

<210> 13

<211> 1749

<212> ADN

<213> Fusarium verticillioides GZ3639

<400> 13 <210> 14

<211> 582

<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides GZ3639

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(21)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (37)...(453)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (482)...(577)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (138)...(141)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (200)...(210)

<220>

<221> SITIO

<222> (209)...(212)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (570)...(573)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 14

<210> 15

<211> 1188

<212> ADN

<213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48332

<400> 15 <210> 16

<211> 395

<212> PRT 5 <213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48332

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20)

<220>

10 <221> DOMINIO

<222> (294)...(390)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO <222> (222)...(225)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (226)...(229)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 16

<210> 17

<211> 1938

<212> ADN

<213> Fusarium verticillioides GZ3639

<400> 17 <210> 18

<211> 645

<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides GZ3639

<220>

<221> DOMINIO

<222> (46)...(465)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (543)...(639)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (209)...(212)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (211)...(221)

<220>

<221> SITIO

<222> (250)...(253)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (633)...(636)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 18

<210> 19

<211> 1467

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 19 <210> 20

<211> 488

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL <222> (1)...(22)

<220>

<221> DOMINIO

<222>: (33)...(449) 5 <223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> SITIO

<222> (194)...(197)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<210> 21

<211> 1488

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 21

<210> 22

<211> 495

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(18)

<220>

<221> DOMINIO

<222>: (31)...(387) 5 <223> Alfa amilasa, dominio catalítico

10 <400> 20

<220>

<221> SITIO

<222> (197)...(200)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

10 <220>

<221> SITIO

<222> (218)...(221)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

15 <221> SITIO

<222> (402)...(405)

<223> N-glycosylationsite. Prosite id = PS00001

<400> 22

<210> 23

<211> 1389

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 23 <210> 24

<211> 462

<212> PRT 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

10 <222> (1)...(20)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (33)...(373)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> SITIO

<222> (379)...(382)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 24

<210> 25

<211> 1923

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 25

<210> 26

<211> 640

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(21)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (42)...(457)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (538)...(634)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (206)...(216)

<220>

<221> SITIO

<222> (431)...(434)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (628)...(631)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 26

<210> 27

<211> 1911 <212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 27 <210> 28 <211> 636

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (42)...(461)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (534)...(630)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (207)...(217)

<220>

<221> SITIO

<222> (624)...(627)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 28

<210> 29

<211> 1767

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 29 <210> 30

<211> 588

<212> PRT

<213> Desconocido <220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(21)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (42)...(458)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (487)...(583)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (203)...(206)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (205)...(215)

<220>

<221> SITIO

<222> (214)...(217)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 30

<210> 31

<211> 1479 <212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 31

<210> 32

<211> 493

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

5 <221> SEÑAL

<222> (1)...(18)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (31)...(387) 10 <223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> SITIO

<222> (197)...(200)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

15 <220>

<221> SITIO

<222> (218)...(221)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

20 <221> SITIO

<222> (402)...(405)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 32

<210> 33

<211> 1485

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 33 <210> 34

<211> 494

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> DOMINIO <222> (39)...(455)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> SITIO

5 <222> (52)...(55)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (201)...(204) 10 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (203)...(213)

15 <400> 34

<210> 35

<211> 1914

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 35 <210> 36 <211> 637

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (41)...(455)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (535)...(631)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (202)...(205)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (204)...(214)

<220>

<221> SITIO

<222> (429)...(432)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (625)...(628)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 36

<210> 37

<211> 1923

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 37 <210> 38 <211> 640

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(19)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (42)...(456)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (538)...(634)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (203)...(206)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (205)...(215)

<220>

<221> SITIO

<222> (430)...(433)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (628)...(631)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 38

<210> 39 <211> 1896

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 39 <210> 40

<211> 631

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (42)...(457)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (529)...(625)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (204)...(207)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (206)...(216)

<220> <221> SITIO

<222> (619)...(622)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 40

<210> 41

<211> 1563

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 41 <210> 42

<211> 520

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220> <221> DOMINIO

<222> (53)...(512)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

5 <221> SITIO

<222> (193)...(195)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

10 <222> (236)...(239)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (427)...(430) 15 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 42

<210> 43

<211> 3030

<212> ADN

<213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48332

<400> 43

<210> 44

<211> 1009

<212> PRT 5 <213> Cochliobolus heterostrophus ATCC 48332

<220>

<221> DOMINIO

<222> (323)...(879)

<223> Glicosil hidrolasas familia 31

10 <220>

<221> SITIO

<222> (139)...(142)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

15 <221> SITIO

<222> (230)...(233)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

20 <222> (267)...(270)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220> <221> SITIO

<222> (369)...(372)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (445)...(448)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (457)...(460)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (531)...(534)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (559)...(562)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (635)...(638)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (657)...(660)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (695)...(698)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (872)...(875)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

5 <220>

<221> SITIO

<222> (967)...(970)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

10 <221> SITIO

<222> (995) ... (998)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 44

<210> 45

<211> 1380

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 45 <210> 46

<211> 459

<212> PRT 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

10 <222> (1)...(19)

<220> <221> DOMINIO

<222> (32)...(371)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

5 <221> SITIO

<222> (358)...(361)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

10 <222> (393)... (396)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (430)...(433) 15 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 46

<210> 47

<211> 1905

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 47 <210> 48 <211> 634

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (41)...(455)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (532)...(628)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (202)...(205)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (204)...(214)

<220>

<221> SITIO

<222> (213)...(216)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (429)...(432)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (622)...(625)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 48

<210> 49

<211> 1620

<212> ADN

<213> Aspergillus terreus

<400> 49

<210> 50

<211> 539

<212> PRT

<213> Aspergillus terreus

295

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(18)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (31)...(390)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> SITIO

<222> (20)...(23)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (49)... (52)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (181)...(184)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (293)...(296)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (469)...(472)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (508)...(511)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 50

<210> 51

<211> 1824

<212> ADN

<213> Aspergillus terreus

<400> 51

<210> 52

<211> 607

<212> PRT <213> Aspergillus terreus

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (33)...(389)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> DOMINIO

<222> (505)...(602)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (44)...(47)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (179) ... (182)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (220)...(223)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (498)...(501)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (595)...(598)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 52

<210> 53

<211> 1389

<212> ADN

<213> Aspergillus terreus

<400> 53

<210> 54

<211> 462

<212>: PRT 5 <213> Aspergillus terreus

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(20)

<220>

<222> (33)...(373)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> SITIO

<222> (436)...(439)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 54

<210> 55

<211> 1269

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 55

<210> 56

<211> 422

<212>: PRT 5 <213> Desconocido

10 <221> DOMINIO

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

10 <222> (1)...(27)

<220>

<221> DOMINIO <222> (36)...(361)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> DOMINIO

5 <222> (362)...(422)

<223> Dominio hoja beta C-terminal Alfa-amilasa

<220>

<221> SITIO

<222> (33)...(36) 10 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (188)...(191)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

15 <400> 56

<210> 57

<211> 1581

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 57 <210> 58

<211> 526

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220> <221> DOMINIO

<222> (12)...(434)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

5 <221> SITIO

<222> (170)...(173)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

10 <222> (222)...(225)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (431)...(434) 15 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 58

<210> 59

<211> 1572

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 59

<210> 60

<211> 523

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220>

<221> DOMINIO

<222> (12)...(435)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<400> 60

<210> 61

<211> 2061

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 61

<210> 62

<211> 686

<212> PRT 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

10 <222> (1)...(20)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (25)...(340)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

15 <220>

<221> DOMINIO

<222> (341)...(398)

<223> Dominio hoja beta C-terminal Alfa-amilasa

<220>

<221> DOMINIO

<222> (547)...(680)

<223> Dominio de lectina beta-trébol de tipo ricina

<220>

<221> SITIO

<222> (34)...(37)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (90)...(93)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (234)...(237)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (436)...(439)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (474)...(477)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (488)...(491)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO <222> (498)...(501)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

5 <222> (504)...(507)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (513)...(516) 10 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (620)...(623)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

15 <400> 62

<210> 63

<211> 1611

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 63 <210> 64

<211> 536

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220>

<221> DOMINIO

<222> (12)...(449)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<400> 64

<210> 65

<211> 1386

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 65 <210> 66

<211> 461

<212> PRT 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

10 <222> (1)...(25)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (35)...(368)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

5 <220>

<221> SITIO

<222> (152)...(155)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

10 <221> SITIO

<222> (208)...(211)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 66

<210> 67

<211> 2022

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 67

337

<210> 68

<211> 673

<212> PRT

<213> Desconocido <220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1) ... (23)

<220>

<221> DOMINIO

<222> (27) ... (359)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> DOMINIO

<222> (372)...(463)

<223> Alfa-amilasa, dominio C-terminal todo-beta

<220>

<221> SITIO

<222> (88)...(91)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (365)...(368)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (402)...(405)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (406)...(409)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO <222> (561)...(564)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

5 <222> (646)...(649)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222>: (664)...(667) 10 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 68

<210> 69

<211> 1455

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 69

<210> 70

<211> 484

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(44)

<220>

<221> DOMINIO

<222>: (45)...(399) 5 <223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> SITIO

<222> (381)...(384)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

10 <220>

<221> SITIO

<222> (443)...(446)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

15 <221> SITIO

<222> (449)...(452)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 70

<210> 71

<211> 1719

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<400> 71

<210> 72

<211> 572

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido de muestgra ambiental

<220>

<221> DOMINIO

5 <222> (14)...(405)

<223> Alfa amilasa, dominio catalítico

<220>

<221> SITIO

<222> (104)...(107) 10 <223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (525)...(528)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

15 <400> 72

<210> 73

<211> 1836

<212> ADN

<213> Thermomyces lanuginosus ATCC 200065

<400> 73 <210> 74

<211> 611

<212> PRT <213> Thermomyces lanuginosus ATCC 200065

<220>

<221> DOMINIO

<222> (39)...(453)

<223> Glicosil hidrolasas familia 15

<220>

<221> DOMINIO

<222> (508)...(605)

<223> Dominio de enlazamiento de almidón

<220>

<221> SITIO

<222> (99)...(102)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (200)...(203)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (473)...(476)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<220>

<221> SITIO

<222> (599)...(602)

<223> Sitio de N-glicosilación. Id del prositio= PS00001

<400> 74

<210> 75

<211> 1344

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<400> 75 <210> 76

<211> 447

<212> PRT 5 <213> Desconocido

<220>

<223> Obtenido a partir de una muestra ambiental

<220>

<221> SEÑAL

10 <222> (1)...(24)

<400> 76

<210> 77

<211> 1311

<212> ADN

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polinucleótido generado sintéticamente

<400> 77

10 <210> 78

<211> 436

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220> 15 <223> Synthetically generated polypeptide

<400> 78 <210> 79 <211> 1764

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido generado sintéticamente

<400> 79 <210> 80

<211> 1710

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido generado sintéticamente

<400> 80 <210> 81

<211> 1851

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Polinucleótido generado sintéticamente

<400> 81

366

<210> 82

<211> 1860

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polinucleótido generado sintéticamente

<400> 82

368

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que consiste de

(a)

una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 47, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad glucoamilasa

(b)

una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 48;

(c)

una secuencia de ácido nucleico completamente complementaria a (a), o (b); o,

(d)

una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 47
2.

El ácido nucleico aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 1,

en donde la actividad de la glucoamilasa comprende hidrolizar enlaces glucosídicos, y opcionalmente hidrolizar enlaces glucosídico en un polisacárido, un oligosacárido, o un almidón, u opcionalmente los enlaces glucosídicos comprenden un enlace α-1,4-glucosídico y/o un enlace α-1,6-glucosídico, o en donde la actividad de glucoamilasa comprende escindir un maltosa o una unidad de D-glucosa de un extremo no reductor de un polisacárido, un oligosacárido, o un almidón.
3.

Un vector, un casete de expresión o un vehículo de clonación que comprende un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1;

en donde opcionalmente el ácido nucleico está enlazado operativamente a una promotor;

en donde opcionalmente el promotor es un promotor de una planta o un promotor viral;

en donde opcionalmente el promotor es un promotor inducible o un promotor específico de tejido; o

en donde opcionalmente el promotor específico de tejido es opcionalmente específico de la semilla, específico del endospermo, específico de la hoja, específico de la raíz, específico del tallo o un promotor inducido por absición.
4.

Una célula transformada que comprende un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1, o un vector, casete de expresión, o vehículo de clonación como se establece en la reivindicación 3 en donde la célula es opcionalmente una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de una planta, en donde la célula de la planta es opcionalmente una célula de patata, arroz, maíz, trigo, tabaco, o cebada.
5.

Un polipéptido aislado, sintético o recombinante que tiene actividad de glucoamilasa, que comprende

(i)

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% o completa de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 48 sobre la longitud completa del polipéptido;

(ii)

una secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1;

(iii) el polipéptido de cualquiera de (i) a (ii) en donde el polipéptido tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 48 o fragmentos enzimáticamente activos de los mismos que tienen actividad de glucoamilasa.
6.

El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 5 en donde la actividad de glucoamilasa comprende hidrolizar enlaces glucosídicos, y opcionalmente los enlaces glucosídicos comprenden un enlace α-1,4glucosídico o un enlace α-1,6-glucosídico, y / o en donde opcionalmente la actividad de glucoamilasa comprende hidrolizar enlaces glucosídicos en un polisacárido, oligosacárido o almidón, o y/o la actividad de glucoamilasa comprende la escisión de un maltosa o una unidad de D-glucosa de extremo no reductor de un polisacárido, oligosacárido, o almidón.
7.

Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico enlazado operativamente a un promotor, en donde el ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido, produciendo de este modo un polipéptido recombinante, que comprende además transformar una célula huésped con el ácido nucleico de la etapa (a) seguido por la expresión del ácido nucleico de etapa (a), produciendo de este modo un polipéptido recombinante en una célula transformada.
8.

Un método para hidrolizar un polisacárido, oligosacárido o almidón que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5;

(b)

proporcionar una composición que comprende un polisacárido, oligosacárido, o almidón; en donde la composición comprende opcionalmente un enlace α-1,4-glucosídico o un enlace α-1,6-glucosídico y

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza el polisacárido, oligosacárido, o almidón.
9. Un método para licuar o eliminar un polisacárido, oligosacárido o almidón que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5;

(b)

proporcionar una composición que comprende un polisacárido, oligosacárido o almidón; y

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido licúa o elimina el polisacárido, oligosacárido o almidón.
10. Un método para el lavado de un objeto que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 5,

(b)

proporcionar un objeto; y

(c)

poner en contacto la composición de la etapa (a) y el objeto de la etapa (b) bajo condiciones en donde la composición puede lavar el objeto.
11. Un método para hidrolizar un polisacárido, oligosacárido o almidón en un pienso o un alimento antes del consumo por un animal que comprende las siguientes etapas:

(a)

la obtención de un material alimenticio que comprende un almidón, en donde un polisacárido, oligosacárido o almidón en el polisacárido, oligosacárido o almidón puede ser hidrolizado por el polipéptido de la reivindicación 5, y

(b)

la adición del polipéptido de la etapa (a), al material del pienso o alimento en cantidades suficientes durante un periodo de tiempo suficiente para causar la hidrólisis del polisacárido, oligosacárido o almidón y la formación de un alimento o pienso tratado, hidrolizando de ese modo el polisacárido, oligosacárido o almidón en el alimento o el pienso antes del consumo por el animal, en donde el alimento o el pienso opcionalmente comprende arroz, maíz, cebada, trigo, legumbres, o patata.
12. Un método para el desencolado textil que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5;

(b)

proporcionar una tela; y

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la tela de la etapa (b) bajo condiciones en las que la glucoamilasa puede desencolar la tela.
13. Un método para el tratamiento de fibras lignocelulósicas que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5;

(b)

proporcionar una fibra lignocelulósica; y

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la fibra de la etapa (b) bajo condiciones en las que el polipéptido puede tratar la fibra mejorando así las propiedades de la fibra.
14. Un método para producir un jarabe con alto contenido de maltosa o con alto contenido de glucosa que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5;

(b)

proporcionar una composición que comprende un polisacárido, oligosacárido o almidón; opcionalmente en donde el polisacárido, oligosacárido, o almidón es de arroz, maíz, cebada, trigo, legumbres, patata o batata y

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) bajo condiciones en las que el polipéptido de la etapa (a) puede hidrolizar la composición de la etapa (b), produciendo de este modo un jarabe con alto contenido de maltosa o alto contenido de glucosa.
15. Un método para mejorar el flujo de los fluidos de producción que contienen al polisacárido, oligosacárido, o almidón, que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5;

(b)

proporcionar la producción del fluido que comprende un polisacárido, oligosacárido, o almidón; opcionalmente en donde el fluido de producción es de una formación subterránea; y

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el fluido de producción de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido puede hidrolizar el polisacárido, oligosacárido o almidón en el fluido de producción, mejorando así su flujo por la disminución de su densidad.
16. Un método para cambiar la viscosidad de una composición, que comprende las siguientes etapas:

(i)

(a) proporcionar una composición y el polipéptido de la reivindicación 5, y (b) tratar la composición con el polipéptido de la reivindicación 5, o

(ii)

el método de (i), en el que la composición comprende un suelo o un lodo de perforación.
17. Un método para el uso de una glucoamilasa en la elaboración de cerveza o en la producción de alcohol que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5;

(b)

proporcionar una composición utilizada para la elaboración de cerveza o en la producción de alcohol que comprende un polisacárido, oligosacárido, o almidón; en donde la composición que comprende un polisacárido, oligosacárido, o almidón es opcionalmente una cerveza;

(c)

combinar el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en las que el polipéptido puede hidrolizar el polisacárido, oligosacárido, o almidón en la composición utilizada para la elaboración de cerveza o la producción de alcohol.
18. Un método para bioblanquear una composición que comprende:

(i)

proporcionar una composición en donde la composición es un papel o un producto de pulpa, y el polipéptido de la reivindicación 5;

(ii)

tratar la composición con el polipéptido de la reivindicación 5;
19. Un método para el destintado de papel y fibras que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido como se establece en la reivindicación 5;

(b)

proporcionar una composición que comprende papel o fibra;

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido puede destintar el papel o la fibra.
20. Un método para la fabricación de un combustible que comprende:

(i)

(a) proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5; (b) proporcionar una composición que comprende un polisacárido, oligosacárido, o almidón; y (c) poner en contacto el polipéptido de (a) con la composición de (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza el polisacárido, oligosacárido, o almidón; o

(ii)

el método de (i) en el que el polipéptido es una enzima termoestable;

(iii) el método de (i) en el que el combustible es a base de etanol.
21. Un método para procesar un material de biomasa que comprende lignocelulosa que comprende

(i)

(a) proporcionar una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 5, y proporcionar un material de biomasa; y

(b)

poner en contacto la composición con el material de biomasa;

(ii)

el método de (i), en el que el material de biomasa comprende o se deriva de un cultivo agrícola, o es un subproducto de un alimento o una producción de piensos, o es un producto de desecho lignocelulósico, o es un residuo de una planta o un residuo de papel o un producto de residuo de papel,

y opcionalmente el material de biomasa comprende patatas, soja, cebada, centeno, maíz, avena, trigo, remolacha, o caña de azúcar;

(iii) el método de (i) o (ii), en el que el polipéptido tiene la actividad que comprende una actividad de glucoamilasa;

(iv)

el método de cualquiera de (ii), en el que el residuo de la planta comprende tallos, hojas, cáscaras, vainas, mazorcas, madera, astillas de madera, pulpa de madera y aserrín y, o, el residuo de papel comprende papel de fotocopiadora usado o descartado, papel de la impresora de ordenador, papel de cuaderno, papel de notas, papel de máquina de escribir, periódicos, revistas, cartón y materiales de embalaje a base de papel; o

(v)

el método de (i) a (iv), en el que el procesamiento del material de biomasa genera un bioetanol, biopropanol, biobutanol, o un biodiesel;

(vi)

el método de (i) a (v), en el que el material de biomasa comprende un lignocelulosa.
22. Un método para preparar bioetanol, biopropanol, biobutanol o un biodiesel, que comprende

(i)

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5, y proporcionar una composición que comprende un polisacárido u oligosacárido; y

(b)

poner en contacto la composición que comprende un polisacárido u oligosacárido con el polipéptido de la reivindicación 5;

(ii)

el método de (i), en el que la composición que comprende un polisacárido u oligosacárido comprende una planta, producto vegetal o derivado de planta;

(iii) el método de (ii), en el que la planta o producto vegetal comprende plantas de caña de azúcar o productos vegetales, remolachas o remolacha de azúcar, trigo, maíz, soja, patata, arroz o cebada;

(iv)

el método de cualquiera de (i) a (iii), en el que el polipéptido tiene actividad que comprende una actividad glucoamilasa; o

(v)

el método de cualquiera de (i) a (iv), en el que el polisacárido u oligosacárido comprende un azúcar fermentable.
23. Un método para preparar un combustible que comprende

(i)

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5, y proporcionar una composición que comprende un azúcar fermentable; y

(b)

poner en contacto la composición que comprende un azúcar fermentable con el polipéptido de la reivindicación 5;

(ii)

el método de (i), en el que la composición que comprende un azúcar fermentable comprende una planta, producto vegetal o derivado de planta;

(iii) el método de (ii), en el que la planta o producto vegetal comprende plantas de caña de azúcar o productos vegetales, remolachas o remolacha de azúcar, trigo, maíz, soja, patata, arroz o cebada;

(iv)

el método de cualquiera de (i) a (iii), en el que el polipéptido tiene actividad que comprende una actividad glucoamilasa; o

(v)

el método de cualquiera de (i) a (iv), en el que el combustible comprende un bioetanol o una mezcla de gasolinaetanol, o comprende un bioetanol, biopropanol, biobutanol o un biodiesel.
24. Un método para producir un azúcar, comprendiendo el método:

(i)

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 5;

(b)

proporcionar una composición que comprende un polisacárido o un oligosacárido; y

(c)

poner en contacto la composición de la etapa (b) con el polipéptido de la etapa (a), generando así azúcares;

(ii)

el método de (i), en el que la composición que comprende un polisacárido comprende un almidón;

(iii) el método de cualquiera de (i) o (ii), en el que el azúcar es un azúcar fermentable;
25. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 5,

en donde la composición se selecciona de: un detergente, un pienso o un alimento, un material textil o tela, un papel

o un producto de papel o pulpa de papel, un líquido o jarabe con alto contenido de maltosa o con alto contenido de glucosa, una composición antienranciamiento, una bebida alcohólica, una cerveza, una composición farmacéutica, un producto para el cuidado oral, una pasta de dientes, una crema dental, un gel o un polvo de dientes, un odontic, un enjuague bucal, una formulación de enjuague para antes o después del cepillado, una goma de mascar, una pastilla o un caramelo, un aceite fluido para perforación de pozos, una solución de bioblanqueamiento, un desinfectante, un biodefensa o un agente biodesintoxicante, un producto lácteo, o un material de biomasa.
26. Una composición de liberación controlada o liberación retrasada que comprende el polipéptido de la reivindicación 5, que comprende

(a)

un ingrediente deseado recubierto por un revestimiento de polímero de látex;

(b)

la composición de liberación controlada o liberación retardada de (a), en la que el ingrediente deseado comprende una enzima;

(c)

la composición de liberación controlada o liberación retardada de (a) o (b), en la que el ingrediente deseado comprende una molécula pequeña, un fármaco, un polisacárido, un lípido, un ácido nucleico, una vitamina, un antibiótico, o un insecticida;

(d)

la composición de liberación controlada o liberación retardada de (a), (b), o (c), en la que el ingrediente deseado comprende una pella o una matriz;

(e)

la composición de liberación controlada o liberación retardada de cualquiera de (a) a (d), en la que la pella o matriz comprende material comestible;

(f)

la composición de liberación controlada o liberación retardada de cualquiera de (a) a (e), en la que el revestimiento de polímero de látex comprende una pintura de látex; o

(g)

la composición de liberación controlada o liberación retardada de cualquiera de (a) a (f), en la que el revestimiento de polímero de látex comprende un (met)acrilato, un acetato de vinilo, un estireno, un etileno, un cloruro de vinilo, un butadieno, un cloruro de vinilideno, un versatato de vinilo, un propionato de vinilo, un acrilato de t-butilo, un acrilonitrilo, un neopreno, un maleato, un fumarato o una combinación de los mismos o un derivado de los mismos.

378

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