BRPI1012340B1 - Anticorpo anti-receptor do fator de crescimento epidérmico (egfr) isolado e imunoconjugado compreendendo um agente citotóxico e o dito anticorpo - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA E USOS DAS MESMAS. A presente invenção relaciona-se a membros de ligação especlficos, particularmente anticorpos e fragmentos dos mesmos, que se ligam ao receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) amplificado e ao truncamento de 2-7 EGFR do EGFR. Em particular, o epltopo reconhecido pelos membros de ligação específicos, particularmente anticorpos e fragmentos dos mesmos, é aumentado ou evidente sob modificação póstraducional aberrante. Esses membros de ligação específicos são úteis no diagnóstico e tratamento de câncer. Os membros ligantes da presente invenção podem também ser úteis na terapia em combinação com quimioterápicos ou agentes anti-câncer e/ou com outros anticorpos ou fragmentos dos mesmos.

Description

DADOS RELACIONADOS AO PEDIDO

[001]O presente Pedido de Patente PCT reivindica prioridade ao Pedido de Patente dos EUA No. 12/388.504, depositado em 18 de Fevereiro de 2009, a revelação do qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. O presente Pedido de Patente PCT também incorpora por referência em sua totalidade a revelação de cada do Pedido de Patente dos EUA No. 10/145.598, depositado em 13 de Maio de 2002 (agora Patente dos EUA No. 7.589.180, emitido em 15 de Setembro de 2009); Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 60/290.410, depositado em 11 de Maio de 2001; Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 60/326.019, depositado em 28 de Setembro de 2001; Pedido de Patente Provisório de EUA No. 60/342.258, depositado em 21 de Dezembro de 2001; Pedido de Patente PCT Internacional No. PCT/US02/15185, depositado em 13 de Maio de 2002 (Publicado como WO 02/092771 em 21 de Novembro de 2002); Pedido de Patente PCT Internacional No. PCT/US2008/009771, depositado em 14 de Augusto de 2008 (Publicado como WO 2009/023265 em 19 de Fevereiro de 2009); e Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 60/964.715, depositado em 14 de Agosto de 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002]A presente invenção relaciona-se a membros de ligação específicos, particularmente anticorpos e fragmento os dos mesmos, que se ligam para amplificar o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e para a deleção in-frame dos éxons 2 a 7 de EGFR, resultando em um receptor EGFR truncado faltando 267 ami- noácidos a partir do domínio extracelular (de2-7 EGFR). Em particular, o epítopo reconhecido pelos membros de ligação específicos, particularmente anticorpos e fragmento os dos mesmos, é aumentado ou evidente sob modificação pós- traducional aberrante. Esses membros de ligação específicos são úteis no diagnóstico e tratamento de câncer. Os membros de ligação da presente invenção podem também ser utilizados na terapia em combinação com agentes quimioterápicos ou anticâncer e/ou com outros anticorpos ou fragmento os dos mesmos.

ANTECEDENTE DA TECNOLOGIA RELATADA

[003]O tratamento de doença proliferativa, particularmente câncer, por meios quimioterápicos sempre contam com diferenças de exploração em células proliferan- tes alvos e outras células normais no corpo humano ou animal. Por exemplo, muitos agentes químicos são designados para serem iniciados por rápida replicação de DNA de forma que o processo de replicação de DNA e divisão celular é interrompido. Outra abordagem é identificar antígenos na superfície das células tumorais ou outras células anormais que não são normalmente expressas em tecido humano desenvolvido, tais como antígenos tumorais ou antígenos embriônicos. Tais antíge- nos podem ser alvos com proteínas de ligação tais como anticorpos que pode bloquear ou neutralizar o antígeno. Em adição, as proteínas de ligação, incluindo anticorpos e fragmento os dos mesmos, podem distribuir um agente tóxico ou outra substância que é capaz de diretamente ou indiretamente ativar um agente tóxico no sítio de um tumor.

[004]O EGFR é um alvo atrativo para terapia de anticorpo com alvo em tumor porque ele é super expresso em muitos tipos de tumores epiteliais Voldborg et al. (1997). Epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR mutations, function and possible role in clinical trials. Ann Oncol. 8, 1197-206; den Eynde, B. and Scott, A. M. Tumor Antigens. In: P. J. Delves and I. M. Roitt (eds.), Encyclopedia of Immunology, Second Edition, pp. 2424-31. Londres: Academic Press (1998)). Além disso, expressão de EGFR é associada com pobre prognóstico em um número de tipos de tumores incluindo estômago, cólon, bexiga urinária, de mama, próstata, endométrio, rim e cérebro (por exemplo, glioma). Consequentemente, um número de anticorpos EGFR têm sido reportado na literatura com várias avaliações clínicas submetidas (Baselga et al. (2000) Phase I Studies of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Chimeric Antibody C225 Alone and in Combination With Cisplatin. J. Clin. Oncol. 18, 904; Faillot et al. (1996): A phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas. Neurosurgery. 39, 47883; Seymour, L. (1999) Novel anti-cancer agents in development: exciting prospects and new challenges. Cancer Treat. Rev. 25, 301-12)).

[005]Resultados a partir de estudos usando mAbs EGFR em pacientes com câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão de célula escamosa, gliomas de cérebro e astrocitomas malignas têm sido animadores. A atividade anti-tumor da maioria dos anticorpos EGFR é aumentada por sua habilidade de bloquear a ligação do ligante (Sturgis et al. (1994) Effects of antiepidermal growth factor receptor antibody 528 on the proliferation and differentiation of head and neck cancer. Otolaryngol. Head Neck. Surg. 111, 633-43; Goldstein et al. (1995) Biological efficacy of a chimeric antibody to the epidermal growth factor receptor in a human tumor xenotransplante model. Clin. Cancer Res. 1, 1311-8). Tais anticorpos podem mediar sua eficácia através de ambos, modulação de proliferação celular e funções imunes dependentes de anticorpo (por exemplo, ativação de complemento). O uso desses anticorpos, entretanto, pode ser limitado por captação em órgãos que têm altos níveis endógenos de EGFR tal como o fígado e pele (Baselga et al., 2000; Faillot et al., 1996).

[006]Uma proporção significante de tumores contendo amplificações do gene EGFR (isto é, múltiplas cópias do gene EGFR) também co-expressa uma versão truncada do receptor (Wikstrand et al. (1998) The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFR): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4, 148-158) known as de2-7 EGFR, ΔEGFR, or Δ2-7 (termos utilizados aqui de modo passível de mudança) (Olapade-Olaopa et al. (2000) Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br. J. Cancer. 82, 186-94). O rearranjo visto em de2-7 EGFR resulta em um mRNA in-frame maduro faltando 801 nucleotídeos transpondo éxons 2-7 (Wong et al. (1992) Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 89, 2965-9; Yamazaki et al. (1990) A deletion mutation within the ligand binding domain is responsible for activation of epidermal growth factor receptor gene in human brain tumors. Jpn. J. Cancer Res. 81, 773-9; Yamazaki et al. (1988) Amplification of the structurally and functionally altered epidermal growth factor receptor gene (c-erbB) in human brain tumors. Mol. Cell Biol. 8, 1816-20; Sugawa et al. (1990) Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 8602-6). A proteína EGFR correspondente tem uma deleção de 267 aminoácidos compreendendo resíduos 6-273 do domínio extracelular e um novo resíduo de glicina na fusão da junção (Sugawa et al, 1990). Esta deleção, junto com a inserção de um resíduo de glicina, produz um único peptídeo juncional na interface da deleção (Sugawa et al, 1990).

[007]O de2-7 EGFR tem sido relatado em um número de tipos de tumores incluindo glioma, de mama, de pulmão, ovário e próstata (Wikstrand et al. (1997) Cell surface localization and density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor, EGFRvIII. Cancer Res. 57, 4130-40; Olapade-Olaopa et al. (2000) Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br. J. Cancer. 82, 186-94; Wikstrand, et al. (1995) Monoclonal antibodies against EGFRvIII in are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55, 3140-8; Garcia de Palazzo et al. (1993) Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas. Cancer Res. 53, 3217-20). Enquanto este receptor truncado não liga o ligante, ele possui baixa atividade constitutiva e dá uma significante vantagem de crescimento para células glioma crescidas como tumor xenográfico em camundon- gos nude (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-31) e é capaz de transformer células NIH3T3 (Batra et al. (1995) Epidermal growth factor ligand independent, unregulated, cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene. Cell Growth Differ. 6, 1251-9) e células MCF-7. Os mecanismos utilizados por de2-7 EGFR em células de glioma não são completamente definidas, mas são relatadas para incluir uma diminuição em apop- tose (Nagane et al. (1996) A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis. Cancer Res. 56, 5079-86) e um pequeno aumento da proliferação (Nagane et al., 1996).

[008]Como a expressão deste receptor truncado é restrita às células de tumor ela representa um alvo altamente específico para a terapia de anticorpo. Consequentemente, um número de laboratórios têm relatado a geração de ambos, anticorpo policlonal (Humphrey et al. (1990) Anti-synthetic peptide antibody reacting at the fusion junction of deletion mutant epidermal growth factor receptors in human glioblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 4207-11) e monoclonal (Wikstrand et al. (1995) Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas; Okamoto et al. (1996) Monoclonal antibody against the fusion junction of a deletion-mutant epidermal growth factor receptor. Br. J. Cancer. 73, 1366-72; Hills et al. (1995) Specific targeting of a mutant, activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody. Int. J. Cancer. 63, 537-43) específicos ao peptídeo único de de2-7 EGFR. Uma série de Abs de camundongos, isolados seguindo imunização com o peptídeo de2-7 único, todos mostraram seletividade e especificidade para o receptor truncado e ter alvo em crescimento xenográfico positivo para de2-7 EGFR em camundongos nude (Wikstrand et al. (1995); Reist et al. (1997) Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenotransplantes after labeling using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 57, 1510-5; Reist et al. (1995) Tumor-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies: use of the tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumor xenotransplantes. Cancer Res. 55, 4375-82).

[009]Entretanto, uma potencial desvantagem de anticorpo de2-7 EGFR é que somente uma proporção de tumores exibem amplificação do gene EGFR também expressa o de2-7EGFR (Ekstrand et al. (1992) Amplified and rearranged epidermal growth factor receptor genes in human glioblastomas reveal deletions of sequences encoding portions of the N-and/or C-terminal tails. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 89, 4309-13). A porcentagem exata de tumores contendo o de2-7 EGFR não é completamente estabelecida, porque o uso de diferentes técnicas (isto é, PCR versus imunohistoquímica) e vários anticorpos, tem produzido uma ampla variedade de valores reportados para a frequência de sua presença. Dados publicados indicam que aproximadamente 25-30% de gliomas expressam de2-7 EGFR com expressão sendo menor em astrocitomas anaplástico e mais alta em glioblastoma multiforme (Wong et al. (1992); Wikstrand et al. (1998) The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFR): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4, 148-58; Moscatello et al. (1995) Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors. Cancer Res. 55, 5536-9). A proporção de células positivas dentro de gliomas expressando de2-7 EGFR tem sido relatada ser na variação de 37-86% (Wikstrand et al. (1997)). 27% de carcinomas de mama e 17% de cânceres de pulmão foram encontrados serem positivos para o de2-7 EGFR (Wikstrand et al. (1997); Wikstrand et al. (1995); Wiks- trand et al.(1998); and Hills et al., 1995). Então, anticorpos de2-7 EGFR específicos podem ser esperados serem úteis em somente uma porcentagem de tumores EGFR positivos.

[010]Então, enquanto a evidência existente da atividade de anticorpos EGFR é encorajadora, as limitações observadas na variação de aplicabilidade e eficácia refletida acima permanece. Consequentemente, pode ser desejável desenvolver anticorpos e tipos de agentes que demonstram a eficácia com uma ampla variedade de tumores, e é para a realização deste objetivo que a presente invenção é direcionada.

[011]A citação de referências aqui não deve ser construída como uma admissão que tal é anterior a técnica da presente invenção.

RESUMO DA INVENÇÃO

[012]A presente invenção provê membros de ligação específica isolados, particularmente anticorpos ou fragmento os dos mesmos, que reconhecem um epí- topo EGFR que não demonstram quaisquer alterações de sequência de aminoáci- dos ou substituições a partir de EGFR selvagem e que são encontrados em células tumorigênicas, hiperproliferativas ou anormais e não detectam geralmente em células normais ou selvagens (o termo ”célula selvagem” como aqui utilizado contempla uma célula que expressa EGFR endógeno mas não o de2-7 EGFR e o termo especificamente exclui uma célula que super expressa o gene EGFR; o termo ”selvagem” refere-se a um genótipo ou fenótico ou outra característica presente em uma célula normal ao invés de em uma célula anormal ou tumorigênica). Em um aspecto adicional, a presente invenção provê membros de ligação específicos, particularmente anticorpos ou fragmento os dos mesmos, que reconhecem um epítopo EGFR que é encontrado em células tumorigênicas, hiperproliferativas ou anormais e não é geralmente detectável em células normais ou selvagens, em que o epítopo é aumentado ou evidente sob modificação pós-traducional aberrante ou expressão aberrante. Em um exempo não limitante particular provido aqui, o epítopo EGFR é aumentado ou evidente em que a modificação pós-traducional não é completa ou total para a extensão vista com expressão normal de EGFR em células selvagens. Em um aspecto, o epítopo EGFR é aumentado ou evidente sob modificação de carboidrato inicial ou simples ou glicosilação precoce, particularmente alta modificação de manose, e é reduzida ou não evidente em presença da modificação de carboidrato complexo.

[013]Os membros de ligação específicos, que podem ser anticorpos ou fra-gmento os dos mesmos, tais como fragmento os imunogênicos dos mesmos, não se ligam substancialmente a ou reconhecem células normais ou selvagens contendo epítopos tipo EGFR normais ou selvagens em ausência de expressão aberrante e em presença de modificação pós-traducional de EGFR.

[014]Mais particularmente, o membro de ligação específico da invenção, pode ser anticorpos ou fragmento os dos mesmos, que reconhecem um epítopo EGFR que está presente em células super expressando EGFR (por exemplo, gene EGFR é amplificado) ou expressando o de2-7 EGFR, particularmente em presença de modi-ficação pós-traducional aberrante, e que não é geralmente detectável em células expressando EGFR sob condições normais, particularmente em presença de modifi-cação pós-traducional normal.

[015]Os presentes inventores têm descoberto novos anticorpos monoclonais, exemplificados aqui por anticorpos designados mAb806, hu806, mAb175, mAb124 e mAb1133, que especificamente reconhecem EGFR aberrantemente expressos. Em particular, os anticorpos da presente invenção reconhecem um epítopo EGFR que é encontrado em células tumorigênicas, hiperproliferativas ou anormais. E não é ge-ralmente detectado em células nomais ou selvagens, em que o epítopo é aumentado ou evidente sob modificação pós-traducional aberrante. Os novos anticorpos da invenção também reconhecem EGFR selvagem amplificado e o de2-7 EGFR, ainda ligado a um epítopo distinto a partir do único peptídeo juncional da mutação de2-7 EGFR. Os anticorpos da presente invenção especificamente reconhecem EGFR aberrantemente expresso, incluindo EGFR amplificado e EGFR mutante (exemplificado aqui por mutação de2-7), particularmente sob modificação pós-traducional aberrante. Adicionalmente, enquanto esses anticorpos não reconhecem o EGFR quando expressos na superfície celular de uma linhagem de célula de glioma expressando quantidades normais de EGFR, eles se ligam ao domínio extracelular do EGFR (sEGFR) imobilizado na superfície de placas de ELISA, indicando o reconhecimento de um epítopo conformacional. Esses anticorpos se ligam a superfície de células A431, que têm uma amplificação do gene EGFR mas não expressam o de2- 7 EGFR. Importantemente, esses anticorpos não se ligam significantemente a tecidos normais tais como fígado e pele, que expressam altos níveis de EGFR selvagem (”wild-type”(wt)) endógeno que são maiores que na maioria de outros tecidos normais, mas em que EGFR não é aberrantemente expresso ou amplificado.

[016]Os anticorpos da presente invenção podem especificamente categorizar a natureza dos tumores ou células tumorigênicas EGFR, corando ou de outra forma reconhecendo esses tumores ou células em que a expressão EGFR aberrante, incluindo amplificação de EGFR e/ou mutação de EGFR, particularmente de2-7 EGFR, está presente. Ainda, os anticorpos da presente invenção demonstram signi- ficante atividade anti-tumor in vivo contra tumores contendo EGFR amplificado e contra xenotransplantes de2-7 EGFR positivos.

[017]A especificidade ímpar desses anticorpos de ligação ao de2-7 EGFR e EGFR amplificado, mas não ao normal, EGFR selvagem, provê usos diagnóstico e terapêuticos para identificar, caracterizar e ter como alvo um número de tipos de tumores, por exemplo, tumores de cabeça e pescoço, mama, ou próstata e glioma, sem os problemas associados com captação de tecido normal que pode ser visto com anticorpos EGFR previamente conhecido.

[018]Consequentemente, a invenção provê proteínas de ligação específicas, tais como anticorpos, que se ligam ao de2-7 EGFR em um epítopo que é distinto do peptídeo juncional mas que não se ligam substancialmente a EGFR em células normais em ausência de amplificação do gene EGFR. Por amplificação, é tencionado incluir que a célula compreende múltiplas cópias do gene EGFR.

[019]Preferivelmente o epítopo reconhecido pelos anticorpos inventivos é lo-calizado dentro da região compreendendo resíduos 273-501 na sequência EGFR madura normal ou selvagem, e preferivelmente compreende resíduos 287-302 (SEQ ID NO:14) da sequência EGFR tipo normal ou selvagem madura. Assim, também provido são proteínas de ligação específicas, tal como anticorpos, que se ligam a de2-7 EGFR em um epítopo localizado dentro da região compreendendo resíduos 273-501 e/ou 287-302 (SEQ ID NO:14) da sequência EGFR. O epítopo pode ser determinado por qualquer técnica de mapeamento de epítopo convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica. Alternativamente, a sequência de DNA codificandoresíduos 273-501 e/ou 287-302 (SEQ ID NO:14) pode ser digerida, e fragmento os resultantes expressos em um hospedeiro adequado. Ligação de anticorpo pode ser determinada como mencionado acima.

[020]Em um aspecto preferido, os anticorpos são uns dos quais têm caracte-rísticas dos anticorpos que os inventores têm identificado e caracterizado, em particular reconhecimento de EGFR aberrantemente expresso, como encontrado em EGFR amplificado e de2-7EGFR.

[021]Em outro aspecto, a invenção provê anticorpos capazes de competir com os anticorpos inventivos, sob condições em que pelo menos 10% de um anticorpo tendo as sequências de cadeia CP e CL dos anticorpos inventivos são bloqueados a partir da ligação ao de2-7EGFR por competição com tal anticorpo em um ensaio de ELISA. Em particular, anticorpos anti-idiotípicos são contemplados e são aqui exemplificados. Os anticorpos anti-idiotípicos LMH-11, LMH-12 e LMH-13 são aqui providos.

[022]A ligação de um anticorpo ao seu antígeno alvo é mediada através das regiões determinantes de complementariedade (CDRs) de suas cadeias pesadas e leves, com o papel do CDR3 sendo de particular importância. Consequentemente, membros de ligação específica baseados nas regiões CDR3 da cadeia pesada e leve, e preferivelmente ambos, dos anticorpos inventivos serão membros de ligação específica úteis para terapia in vivo.

[023]Consequentemente, proteínas ligadoras específicas tais como anticorpos que são baseadas em CDRs dos anticorpos inventivos identificados, particularmente as regiões CDR3, serão úteis para tumores alvos com EGFR amplificados do seu status de 2-7 EGFR. Como os anticorpos inventivos não se ligam significante- mente ao receptor normal, selvagem, pode não haver captação significante no tecido normal, uma limitação de anticorpos EGFR correntemente sendo desenvolvida.

[024]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo não se liga ao peptídeo jun- cional de2-7 EGFR consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, em que o anticorpo se liga a um epítopo dentro da sequência de resíduos 287-302 (SEQ ID NO:14) do EGFR selvagem humano, e em que o anticorpo não compreende uma sequência de região de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2 e não compreende uma sequência de região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4.

[025]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:42, e a cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:47.

[026]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:129, e a cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:134.

[027]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:22, e a cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:27.

[028]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:32, e a cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:37.

[029]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação de polipeptídeo tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 44, 45 e 46.

[030]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 49, 50 e 51.

[031]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 130, 131 e 132.

[032]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas das sequências de aminoácidos apresen- tadas nas SEQ ID NOS: 135, 136 e 137.

[033]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 23, 24 e 25.

[034]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 28, 29 e 30.

[035]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 33, 34 e 35.

[036]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 38, 39 e 40.

[037]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo isolado é a forma de um anticorpo F(ab’)2, fragmento o scFv, dianticorpo, trianticor- po ou tetraanticorpo.

[038]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado ainda compreendendo um marcador detectável ou funcional.

[039]Em outro aspecto, o marcador detectável ou funcional é uma droga co- valentemente ligada.

[040]Em outro aspecto, o marcador é um radiomarcador.

[041]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado, em que o anticorpo isolado é peguilado.

[042]Em outro aspecto, é provido um ácido nucléico isolado que compreende uma sequência codificando um anticorpo isolado citado aqui.

[043]Em outro aspecto, é provido um método de preparar um anticorpo isolado, compreendendo expressão de um ácido nucléico como citado acima e aqui sob condições para produzir a expressão do anticorpo, e recuperação do anticorpo.

[044]Em outro aspecto, é provido um método de tratamento de um tumor em um paciente humano que compreende a administração ao paciente de uma quantidade efetiva de um anticorpo isolado aqui citado.

[045]Em outro aspecto, é provido um kit para o diagnóstico de um tumor em que EGFR é aberrantemente expresso ou em que EGFR é expresso na forma de uma proteína truncada, compreendendo um anticorpo isolado aqui citado.

[046]Em outro aspecto, o kit ainda compreende reagente e/ou instruções para uso.

[047]Em outro aspecto, é provida uma composição farmacêutica compreen-dendo um anticorpo isolado como aqui citado.

[048]Em outro aspecto, a composição farmacêutica ainda compreende um veículo, transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[049]Em outro aspecto, a composição farmacêutica ainda compreende um agente anticâncer selecionado a partir do grupo consistindo de agentes quimioterá- picos, anticirpos anti-EGFR, agentes radioimunoterapêuticos, e combinações dos mesmos.

[050]Em outro aspecto, os agentes quimioterápicos são selecionados a partir do grupo consistindo de inibidores de tirosina quinase, inibidores da cascata de fos- forilação, moduladores pós-traducionais, inibidores do crescimento ou dividão celular (por exemplo, anti-mitóticos), inibidores da transdução de sinal, e combinações dos mesmos.

[051]Em outro aspecto, os inibidores da tirosina quinse são selecionados a partir do grupo consistindo de AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668, e combinações dos mesmos.

[052]Em outro aspecto, os anticorpos anti-EGFR são selecionados a partir do grupo consistindo dos anticorpos anti-EGFR 528,255, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF, e combinações dos mesmos.

[053]Em outro aspecto, é provido um método de prevenir e/ou tratar câncer em mamíferos, compreendendo administração a um mamífero de quantidade tera- peuticamente efetiva de uma composição farmacêutica como aqui citada.

[054]Em outro aspecto, é provido um método para o tratamento de cânceres resistentes de cérebro que produzem EGFR aberrantemente expressos em mamíferos, compreendendo administração a um mamífero de uma quantidade terapeutica- mente efetiva de uma composição farmacêutica como aqui citada.

[055]Em outro aspecto, cânceres resistentes de cérebro são selecionados a partir do grupo consistindo de glioblastomas, meduloblastomas, meningiomas, astro- citomas neoplásticos e má-formações arteriovenosas neoplásicas.

[056]Em outro aspecto, é provido um hospedeiro unicelular transformado com uma molécula de DNA recombinante que codifica um anticorpo isolado aqui citado.

[057]Em outro aspecto, o hospedeiro unicelular é selecionado a partir do grupo consistindo de E. Coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, leveduras, células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 e BMT10, células de planta, células de inseto, e células humanas na cultura de tecido.

[058]Em outro aspecto, é provido um método para detectar a presença de EGFR amplificado, de2-7 EGFR ou EGFR com alta glicosilação com manose em que o EGFR é medido por: (a) contato com uma amostra biológica a partir de um mamífero em que a presença do EGFR amplificado, de2-7 EGFR ou EGFR com alta glicosilação de manose é suspeito com um anticorpo isolado da reivindicação 1 sob condições que permitam a ligação do EGFR ao anticorpo isolado ocorrer; e (b) detectar se a ligação ocorreu entre o EGFR a partir da amostra e o anticorpo isolado; em que a detecção da ligação indica a presença ou atividade do EGFR na amostra.

[059]Em outro aspecto do método de detecção a presença do EGFR amplificado, de2-7 EGFR ou EGFR com alta glicosilação de manose, a detecção da presença do EGFR indica a existência de um tumor ou câncer no mamífero.

[060]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:42, e a cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmentehomóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:47.

[061]Em outro aspecto, a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:42, e em que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:47.

[062]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos alta- mente homólogas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 44, 45 e 46, e em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogasàs sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 49, 50 e 51.

[063]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NO: 129, e em que a a cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 134.

[064]Em outro aspecto, a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:129, e em que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:134.

[065]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamentehomólogas às sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NOS: 130, 131 e 132, e em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogasàs sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NOS: 135, 136 e 137.

[066]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:22, e a cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmentehomóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:27.

[067]Em outro aspecto, a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:22, e em que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:27.

[068]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamentehomólogas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 23, 24 e 25, e em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogasàs sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 28, 29 e 30.

[069]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:32, e a cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmen-tehomóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:37.

[070]Em outro aspecto, a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:32, e em que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:37.

[071]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamentehomólogas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 33, 34 e 35, e em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogasàs sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 38, 39 e 40.

[072]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo não se liga ao peptídeo jun- cional de-27 EGFR consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, em que o anticorpo se liga a um epítopo dentro da sequência de resíduos 287-302 do EGFR selvagem humano, o anticorpo compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a região variável da cadeia leve compreende uma primeira região de domínio de ligação polipeptídica tendo uma sequência de aminoácidos correspondendoà sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula I:

em que Xaa1 é um resíduo aminoácido tendo um grupo R polar não carrega- do (SEQ ID NO:151); uma segunda região de domínio de ligação polipeptídica tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo à sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula II:

em que Xaa2 é um resíduo aminoácido tendo um grupo R polar carregado (SEQ ID NO:152); e uma terceira região de domínio de ligação polipeptídica tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo à sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula III:

em que Xaa3 é selecionado a partir do grupo consistindo de A, G, e um resí-duoaminoácido que é substituído de forma conservadora por A ou G (SEQ ID NO:153); e em que a região variável da cadeia pesada compreende uma região de domínio de ligação polipeptídica tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo a sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula IV:

em que Xaa4 é selecionado a partir do grupo consistindo de F, Y, e um resí-duoaminoácido que é substituído de forma conservada por F ou Y (SEQ ID NO:154); uma segunda região de domínio de ligação polipeptídica tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo a sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula V, Fórmula VI ou Fórmula VII:

em que Xaa5 é um resíduo aminoácido tendo um grupo R polar não carregado (SEQ ID NO:155),

em que Xaa6 é selecionado a partir do grupo consistindo de G, A e um resí-duoaminoácido que é substituído de forma conservadora por G ou A (SEQ ID NO:156),

e Xaa7 é um resíduo aminoácido básico (SEQ ID NO:157); e uma terceira região de domínio de ligação polipeptídica tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo a sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula VIII:

em que Xaa8 é selecionado a partir do grupo consistindo de V, A e um resíduoaminoácido que é substituído de forma conservadora por V ou A (SEQ ID NO:158), e em que o anticorpo não compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2 e não compreende uma sequência da região variável da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4.

[073]Em outro aspecto, Xaa1 é N; Xaa2 é D; Xaa3 é A; Xaa4 é F; Xaa5 é um resí-duoaminoácido tendo um grupo R polar não carregado; Xaa6 é G; Xaa7 é K; e Xaa8 é V.

[074]Em outro aspecto, Xaa5 é N ou Q.

[075]Em outro aspecto, , Xaa1 é N ou S.

[076]Em outro aspecto, , Xaa2 é D ou E.

[077]Em outro aspecto, , Xaa3 é A ou G.

[078]Em outro aspecto, , Xaa4 é F ou Y.

[079]Em outro aspecto, , Xaa5 é N ou Q.

[080]Em outro aspecto, , Xaa6 é G ou A, e , Xaa7 é independentemente K ou R.

[081]Em outro aspecto, Xaa8 é V ou A.

[082]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo não se liga ao peptídeo jun- cional de-27 EGFR consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, em que o anticorpo se liga a um epítopo dentro da sequência de resíduos 273-501 do EGFR selvagem humano, o anticorpo compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a região variável da cadeia leve compreende uma primeira região de domínio de ligação polipeptídica tendo a sequência de aminoácidos HSSQDINSNIG (SEQ ID NO:18); uma segunda região de domínio de ligação poli- peptídica tendo a sequência de aminoácidos HGTNLDD (SEQ ID NO:19); e uma terceiraregião de domínio de ligação polipeptídica tendo a sequência de aminoácidos VQYAQFPWT (SEQ ID NO:20), em que a região variável de cadeia pesada compreende um primeiro região de domínio de ligação polipeptídica tendo a sequência de aminoácidos SDFAWN (SEQ ID NO:15); uma segunda região de domínio de ligação polipeptídica tendo uma sequência de aminoácidos correspondente da sequência de aminoácidos apresentada na Fórmula IX:

em que Xaa9 é um resíduo aminoácido tendo um grupo R polar não carregado (SEQ ID NO: 159); e uma terceira região de domínio de ligação polipeptídica tendo a sequência de aminoácidos VTAGRGFPY (SEQ ID NO:17).

[001]Em outro aspecto, o anticorpo se liga a um epítopo dentro da sequência de resíduos 287-302 (SEQ ID NO:14) da EGFR selvagem humano.

[002]Em outro aspecto, Xaa9 é N ou Q.

[003]Em outro aspecto, as regiões de domínio de ligação são carreadas por uma estrutura de anticorpo humano.

[004]Em outro aspecto, a estrutura de anticorpo humano é uma estrutura de anticorpo humano IgG1.

[005]Em outro aspecto, é provido um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2, e a cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é substancialmente homóloga à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4.

[006]Em outro aspecto, a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2, e em que a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4.

[007]Em outro aspecto, é provido, um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores contendo amplificações do gene EGFR, em que células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do receptor de2-7 EGFR, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamentehomólogas às sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NOS: 15, 16 e 17, e em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínio de ligação polipeptídica tendo sequências de aminoácidos altamente homólogas às sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 18, 19 e 20.

[008]Outros objetos e vantagens se tornarão aparente aos versados na téc- nica a partir de uma revisão da descrição detalhada seguinte, que procede com referência aos seguintes desenhos ilustrativos, e as reivindicações presentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009]FIG. 1 apresenta os resultados da análise citômetrica de fluxo das linhagens de célula de glioma. Células U87MG (histogramas cinza claro) e U87MG.Δ2-7 (histogramas cinza escuro) foram coradas com um de: anticorpo IgG2b irrelevante (histogramas abertos), DH8.3 (específico para de2-7 EGFR), mAb806 ou 528 (liga ambos, selvagem e de2-7 EGFR) como indicado.

[010]FIGS.2A-D apresenta os resultados de ELISA of mAb806, mAbDH8.3 e mAb528. (A) ligação de concentrações aumentadas de anticorpos mAb806 (A) DH8.3 (•) ou 528 a placas de ELISA revestidas com sEGFR. (B) inibição da ligação de mAb806 e mAb528 a placas de ELISA revestidas com sEGFR por concentrações aumentadas de EGFR solúvel (sEGFR) em solução. (C) ligação de concentrações aumentadas de DH8.3 ao peptídeo juncional de2-7 ilustra curvas de ligação para mAb806 e mAb528 ao sEGFR selvagem imobilizado (D).

[011]FIGS. 2E e 2F graficamente apresentam os resultados dos estudos de ligação BIAcore usando peptídeo com C-terminal biotinilado e incluindo um anticorpo monoclonal da invenção, junto com outros anticorpos conhecidos, entre eles o anticorpo L8A4 que reconhecem o peptídeo juncional do mutante de2-7 EGFR, e controles.

[012]FIG. 3 descreve a internalização do anticorpo mAb806 e o DH8.3. Célu-lasU87MG.Δ2-7 foram pré-incubadas com Ab806 (A) ou DH8.3 (•) a 4°C, transferidas para 37°C e internalização determinada por FACS. Dados representam média da internalização em cada ponto de tempo ± EP de experimentos separados de 3 (DH8.3) ou 4 (mAb806).

[013]FIGS. 4A e 4B ilustram biodistribuição (% ID/g de tecido de tumor) de (a) 125I-mAb806 e (b) 131I-DH8.3 em camundongos nude tendo xenotransplantes U87MG e U87MG.Δ2-7. Cada ponto representa a media de 5 camundongos ± EP exceto para for 1 hr onde n = 4.

[014]FIGS.5A e 5B ilustram a biodistribuição de anticorpos 125I-mAb806 (barras claras) e 131I-DH8.3 (barra preenchida) expressos como (a) tumor:sangue ou (b) tumor: proporções fígado em camundongos nude tendo xenotransplantes U87MG.Δ2-7. Cada barra representa a média de 5 camundongos ± EP exceto para 1 hr onde n=4.

[015]FIGS.6A-C ilustram análises citômetricas de fluxo de linhagens celulares contendo amplificação do gene EGFR. Células A431 foram coradas com um anticorpo de Ab806, DH8.3 ou 528 (histogramas prretos) e comparados a um anticorpo IgG2 irrelevante (histograma aberto).

[016]FIGS. 7A e 7B ilustram biodistribuição (% ID/g de tecido tumoral) de (a) 125I-mAb806 e (b) 131I-DH8.3 em camundongos nude tendo xenotransplantes U87MG.Δ2-7 e A431.

[017]FIGS.8A-D ilustram biodistribuição de 125I-mAb806 (barra clara) e 131I528 (barra preenchida) e anticorpos expressos como proporções (A, B) tu- mor:sangue ou (C, D) tumor:fígado em camundongos nude tendo (A, C) xenotrans- plantes U87MG.Δ2-7 e (B,D) A431.

[018]FIGS. 9A e 9B ilustram efeito anti-tumor de mAb806 na taxa de crescimento xenotransplante em (A) U87MG e (B) U87MG.Δ2-7 em um modelo preventivo. 3 x 106 células U87MG ou U87MG.Δ2-7 foram injetadas s.c. em ambos os flancos de camundongos BALB/c nude de 4 - 6 semanas de idade, (n = 5) no dia 0. Camun-dongosforam injetados i.p. com 1 mg de mAb806 (•); 0,1 mg de mAb806 (A) ; ou veículo (o) iniciando no dia um antes da inoculação do tumor celular. Injeções foram dadas três vezes por semana por duas semanas como indicado pelas setas. Dados são expressos como médias de volume de tumor ± EP.

[019]FIGS. 10A, 10B e 10C ilustram o efeito anti-tumor de mAb806 em xeno- transplantes em (A) U87MG, (B) U87MG.Δ2-7 e (C) U87MG.wtEGFR em um modelo estabelecido. 3 x 106 células U87MG, U87MG.Δ2-7, ou U87MG.wtEGFR, foram injetados s.c. em ambos flancos de camundongos BALB/c nude de 4 - 6 semanas de idade, (n = 5). Camundongos foram injetados i.p. com 1 mg doses de mAb806 (•); 0,1 mg doses de mAb806 (A); ou veículo (o) começando quando tumores alcançaram um média de volume de tumor de 65-80 mm3. Injeções foram dadas três vezes por semana por duas semanas como indicado pelas setas. Dados são expressos como média de volume de tumor ± EP.

[020]FIGS. 11A e 11B ilustram o efeito anti-tumor de mAb806 em xenotrans- plantes em A431 em modelos (A) preventivos e (B) estabelecidos. 3 x 106células A431, foram injetadas s.c. em ambos os flancos de camundongos BALB/c nude de 4 - 6 semanas de idade, (n = 5). Camundongos foram injetados i.p. com doses de 1 mg de mAb806 (•); ou veículo (o) começando um dia antes da inoculação da célula tumoral no modelo preventivo, ou quando tumores alcançaram um média de volume de tumor de 200 mm3. Injeções foram dadas três vezes por semana por duas semanas como indicado pelas setas. Dados são expressos como média de volume de tumor ± EP.

[021]FIG. 12 ilustra o efeito anti-tumor do tratamento com mAb806 combinado com tratamento com AG1478 em xenotransplantes A431 em um modelo preventivo. Dados são expressos como média do volume de tumor ± EP.

[022]FIGS. 14A e 14B ilustram a (A) sequência de ácido nucléico e a (B) tra-dução de aminoácido da mesma do gene de cadeia 806 VH (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente).

[023]FIGS. 15A e 15B ilustram a (A) sequência de ácido nucléico e a (B) tra-dução de aminoácidos da mesma do gene de cadeia 806 VL (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, respectivamente).

[024]FIG. 16 mostra a sequência de cadeia VP (SEQ ID NO:2) numerada de acordo com Kabat, com as CDRs (SEQ ID NOS: 15, 16 e 17) sublinhada. Resíduos chaves da sequência de cadeia VP (SEQ ID NO:2) são 24, 37, 48, 67 e 78.

[025]FIG. 17 mostra a sequência de cadeia VL (SEQ ID NO: 4) numerada de acordo com Kabat, com os CDRs (SEQ ID NOS: 18, 19 e 20) sublinhada. Resíduos chaves da sequência de cadeia VL (SEQ ID NO:4) são 36, 46, 57 e 71.

[026]FIGS. 18A-18D mostram os resultados do estudos in vivo desenhados para determinar o efeito terapêutico da combinação da terapia de anticorpo, particularmente anticorpo mAb806 e o 528. Camundongos receberam inoculações de células U87MG.D2-7 (A e B), U87MG.DK (C), ou A431 (D).

[027]FIGS. 19 A-D mostram análises de internalização por microscopia ele-trônica. Células U87MG.Δ2-7 foram pré-incubadas com mAb806 ou DH8.3 seguida por anti-camundongo IgG conjugado com ouro a 4oC, transferias para 37oC e inter- nalização examinadas em vários pontos de tempo por microscopia eletrônica. (A) localização do anticorpo DH8.3 a um poço revestido (seta) após 5 min; (B) internali- zação de mAb806 por macropinocitose (seta) após 2 min; (C) localização de DH8.3 para lisossomos (seta) após 20 min; (D) localização de mAb806 para lisossomos (seta) após 30 min. Magnificação original para todas as imagens é X30.000.

[028]FIG. 20 mostra auto-radiografia de uma seção xenotransplante U87MG.Δ2-7 coletada 8 h após injeção de 125I-mAb806.

[029]FIG. 21 mostra análise citômetrica de fluxo das linhagens celulares contendo amplificação do gene EGFR. Células HN5 e MDA-468 foram coradas com um anticorpo IgG2b irrelevante (histogramas abertos com linha pontilhada), mAb806 (histograma preto) ou 528 (histograma aberto com linhas fechadas). O anticorpo DH8.3 foi completamente negativo em ambas linhagens de células (dados não mostrados).

[030]FIG. 22 mostra imunoprecipitação de EGFR a partir de linhagens celulares. O EGFR foi imunoprecipitação a partir de células U87MG.Δ2-7 ou A431 mar- cados com 35S com mAb806, anticorpo sc-03 ou um isotipo IgG2b controle. Setas no lado indicam a posição do de2-7 e wt EGFR. Padrões de fitas idênticas foram obtidos em 3 experimentos independentes.

[031]FIG. 23 mostra auto-radiografia em uma seção xenotransplante A431 coletada 24 h após injeção de 125I-mAb806, áreas da localização para tecido viável são indicadas (setas).

[032]FIGS. 24A e 24B mostra sobrevivência estendida de camundongos nu-desofrendo xenotransplantes intracraniais U87MG.ΔEGFR (A) e LN-Z308.ΔEGFR (B) com tratamento mAb806 sistêmico. Células U87MG.EGFR (1x105) ou células LN-Z308.ΔEGFR (5x105) foram implantadas em cérebros de camundongos nude, e os animais foram tratados com ou mAb806, PBS, ou isotipo IgG a partir dos dias 0 a 14 no pós-implante.

[033]FIGS. 24C e 24D mostram inibição do crescimento de tumores intracra-nianos por tratamento dom mAb806. Camundongos nude (cinco por grupo), tratados com ou mAb806 ou o isotipo IgG controle, foram eutanaziados no dia 9 para U87MG.EGFR (C) e no dia 15 para LN-Z308.ΔEGFR (D), e seus cérebros foram coletados, fixados e seccionados. Dados foram calculados por tomar o volume do tumor do controle como 100%. Valores são médias ± DP. ***, P < 0,001; controle versus mAb806. Pontas das setas, tecido tumoral.

[034]FIG. 24E mostra sobrevivência estendida de camundongos nude tendo xenotransplantes U87MG.ΔEGFR intracranianos com tratamento mAb806 intratumo- ral. Células U87MG.ΔEGFR foram implantadas como descrito. 10 mg de mAb806 ou isotipo IgG controle em um volume de 5 μL foram injetadas no local de injeção do tumor dia sim dia não, começando no dia 1 por cinco vezes.

[035]FIGS. 25A, 25B e 25C mostram que mAb806 estende a sobrevivência de camundongos com tumores cerebrais U87MG.wtEGFR mas não com tumores cerebrais U87<G.DK. ou U87MG. Células U87MG (A), U87MG.DK (B) ou U87MG.wtEGFR (C) (5x105) foram implantadas em cérebros de camundongos nude, e os animais foram tratados com mAb806 a partir dos dias 0 a 14 pós-implante seguidos por observação após descontinuação da terapia.

[036]FIG. 26A mostra análise de FACS da reatividade de mAb806 com linhagens de célula U87MG. Células U87MG, U87MG.ΔEGFR, U87MG,DK, e U87MG.wtEGFR foram coradas com anticorpo mAbs 528 anti-EGFR, EGFR.1, e anti-ΔEGFR, mAb806. EGFR monoclonal. 1 anticorpo reconheceu wtEGFR exclusivamente e anticorpo 528 monoclonal reagiu com ambos, wtEGFR e ΔEGFR. mAb806 reagiu intensivamente com U87MG. ΔEGFR e U87MG.DK e fracamente com U87MG.wtEGFR. Barras na abcissa, máximo de coloração de células na ausência de anticorpo primário. Resultados foram reproduzidos em três experimentos independentes.

[037]FIG. 26B mostra imumoprecipitação mAb806 das formas EGFR. Mutante e wtEGFR foram imunoisolados com anticorpos anti-EGFR, 528, EGFR.1, ou anticorpo anti-ΔEGFR, mAb806, a partir de células (Linha 1) U87MG, (Linha 2) U87Δ.EGFR, (Linha 3) U87MG.DK, e (Linha 4) U87MG.wtEGFR, e foram então detectados por Western blotting com anticorpo anti-pan EGFR, C13.

[038]FIGS. 27A e 27B mostram que tratamento sistêmico com mAb806 diminui a fosforilação de ΔEGFR e expressão de Bel-XL em tumores cerebrais U87MG. ΔEGFR. Tumores U87MG. ΔEGFR foram operados no dia 9 do tratamento mAb806, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e estocados a -80oC antes da preparação do lisado tumoral. (A)Análise de Western blot da expressão e o grau de auto-fosforilação de ΔEGFR. Trinta μg de lisados de tumor foram sujeitos a géis SDS-poliacrilamida, transferidos para membranas de nitrocelulose, e incubados com mAb anti- fosfotirosina, então foram retirados e re-incubados com anticorpo anti-EGFR C13. (B)Western blotting de Bcl-KL por uso do mesmo lisado tumoral como em (A). Membranas foram incubadas com anticorpo anti-humano Bcl-X policlonal. Li-nhas 1 e 2, tumores cerebrais U87MG. ΔEGFR tratados com controle isotipo; Linhas 3 e 4, tumores cerebrais U87MG. ΔEGFR tratados com mAb806.

[039]FIG. 28 mostra que tratamento mAb806 leva a uma diminuição no cres-cimento e vasculogênese e ao aumento em apoptose e acúmulo de macrófagos em tumores U87MG. ΔAGFR. Cortes de tumor foram coradas por Ki-67. Índice prolifera- tivo celular foi ensaiado pela porcentagem de células totais que foram Ki-67 positivas a partir de quatro campos de alta força aleatoriamente selecionados (X400) em tumores intracranianos a partir de quatro camundongos de cada grupo. Dados são a média ± EP. Células apoptóticas foram detectadas por ensaio TUNEL. Índice apop- tótico foi feito pela proporção de células TUNEL-positiva: número total de células a partir de quatro campos de alta-força aleatoriamente selecionados (X400) em tumores intracranianos a partir de quatro camundongos de cada grupo. Dados são a média ± EP. Cortes do tumor foram Imunocorados com anticorpo anti-CD31. MV As foram analisados por análise de imagem computadorizada a partir de quatro campos selecionados aleatoriamente (X200) a partir de tumores intracranianos a partir de quatro camundongos de cada grupo. Infiltrados peritumorais de macrófagos em tumores U87MG. ΔAGFR tratados com mAb806. Cortes de tumor foram corados com anticorpo anti-F4/80.

[040]FIG. 29 mostra a análise citômetrica de fluxo de linhagens de célula de glioma U87MG parentais e U87MG transfectadas. Células foram coradas com ou um anticorpo IgG2b irrelevante (histogramas abertos) ou o anticorpo 528 ou mAb806 (histogramas preenchidos) como indicado.

[041]FIG. 30 mostra imunoprecipitação de EGFR a partir de linhagens celulares. O EGFR foi imunoprecipitado a partir de células U87MG.wtEGFR marcado com 35S, U87MG. Δ2-7, e A431 com mAb806 (806), anticorpo sc-03 (c-term), ou um isotipo controle IgG2b (con). Setas, posição de de2-7 e wtEGFR.

[042]FIG. 31 mostra cortes de parafina corados com H&E de xenotransplan- tes U87MG. Δ2-7 e U87MG.wtEGFR. Xenotransplantes U87MG. Δ2-7 (coletado 24 dias após a inoculação do tumor) e U87MG.wtEGFR (coletado 42 dias após a inoculação do tumor) foram retirados a partir de camundongos tratados como descrito na FIG. 10 acima, e corados com H&E. Xenotransplantes U87MG.Δ2-7 tratados com veículo (coletado 18 dias após a inoculação do tumor) e U87MG.wtEGFR (coletado 37 dias após a inoculação do tumor) mostrou muito poucas áreas de necrose (painel esquerdo), embora necrose extensiva (setas) foi observada em ambos xenotrans- plantes U87MG. Δ2-7 e U87MG.wtEGFR com mAb806 (painel direito).

[043]FIG. 32 mostra análise imunohistoquímica da expressão EGFR em cortes congelados derivados a partir de xenotransplantes U87MG, U87MG. Δ2-7 e U87MG.wtEGFR. Cortes foram coletados nos pontos de tempo descritos na FIG. 31 acima. Cortes de xenotransplantes foram imunocorados com o anticorpo 528 (painel esquerdo) e mAb806 (painel direito). Nenhuma imunoreatividade diminuída para ou wtEGFR, EGFR amplificado, ou de2-7 EGFR foi observada em xenotransplantes tratados com mAb806. Consistente com os dados in vitro, xenotransplantes U87MG parentais foram positivos para coloração do anticorpo 528, mas foram negativos para mAb806.

[044]FIG. 33 mostra uma representação esquemática de construções de ex-pressão bicistrônica. Transcrição da cadeia de anticorpo quimérico é iniciada por promotor do Fator de Alongamento-1 e terminado por forte sequência de terminação artificial. Sequências IRES foram introduzidas entre as regiões codificantes da cadeia leve e NeoR e cadeia pesada e gene dhfr.

[045]FIGS. 34A e 34B mostram análise de biodistribuição da ch806 radio- marcada com ou (A) 125I ou (B) 111In foi feita em camundongos BALB/c nude tendo tumores xenotransplantes U87MG-de2-7. Camundongos foram injetados com 5 μg de anticorpo radiomarcado e em grupos de 4 camundongos por ponto de tempo, sa- crificado em 8, 28, 48 ou 74 horas. Órgãos foram coletados, pesados e sua radioatividade foi medida em um contado gama.

[046]FIGS. 35A e 35B descrevem (A) a % ID grama de tecido tumoral e (B) a proporção tumor para sangue. Anticorpo Índio-111 mostra aproximadamente 30% ID/grama de tecido e uma proporção tumor para sangue de 4,0.

[047]FIG. 36 descreve a eficácia terapêutica do anticorpo quimérico ch806 em um modelo de tumor estabelecido. Células 3x106 U87MG. Δ2-7 em 100 μL de PBS foram inoculados s.c. em ambos os flancos de camundongos nude fêmeas de 406 semanas de idade. mAb806 foi incluído como um controle positivo. Tratamento foi iniciado quando tumores alcançaram um volume médio de 50 mm3e consistiu de 1 mg de ch806 ou mAb806 dado i.p. por um total de 5 injeções nos dias indicados. Dados foram expressos como média de volume de tumor ± EP para cada grupo de tratamento.

[048]FIG. 37 mostra atividade CDC no nas células alvo (A) U87MG.de207 e (B) A431 para anticorpos IgG quiméricos EGFR ch806 e controle cG250. Média (barras; ± DP) porcentagem de citotoxidade de determinações em triplicata são apresentadas.

[049]FIG. 38 mostra ADCC nas células alvo (A) U87MG.de2-7 e (B) A431 na proporção célula Efetora:Alvo de 50:1 mediada por ch806 e isotipo controle cG250 (0-10 μg/mL). Resultados são expressos como média (barras; ±DP) da porcentagem de citotoxidade de triplicata de determinações.

[050]FIG. 39 mostra ADCC mediada por 1 μg/mL de mAb806 parental e ch806 nas células U87MG.de2-7 alvos por uma variação de proporções Efetor:Alvo. Média (barras; ±DP) de triplicata de determinações são apresentadas.

[051]FIG 40 mostra vinte e cinco hibridomas produzindo anticorpos que ligam ch806, mas não huIgG foram incialmente selecionados. Quatro desses hibri- domas anti-ch806 com alta afinidade de ligação (clones 3E3, 5B8, 9D6 e 4D8) foram subsequentemente procuradas para expansão clonal a partir de células únicas por diluição limitante e designadas Hibridoma Ludwig Institute for Cancer Research Mel-bourne (LMH)-11, -12, -13 e -14, respectivamente. Em adição, dois hibridomas que produziram mAbs específicos para huIgG foram também clonados e caracterizados ainda: clones 2C10 (LMH-15) e 2B8 (LMH-16).

[052]FIGS. 41A, 41B e 41C mostram que após a expansão clonal, os sobre- nadantes da cultura de hibridoma foram examinados em triplicata por ELISA para a habilidade de neutralizar a atividade de ligação do antígeno ch806 ou mAb806 com sEGFR621. Resultados de média (±DP) demonstraram a atividade antagonista de mAbs anti-idiotipos LMH-11, -12, -13 e -14 com o bloqueio na solução de ambos ch806 e mAb806 murino se ligarem a placas revestidas com sEGFR (LMH-14 não mostrado).

[053]FIGS. 42A, 42B e 42C mostram placas de microtitulação que foram re-vestidascom 10 μg/mL de (A) LMH-11, (B) LMH-12 e (C) LMH-13 purificados. Os três clones purificados foram comparados para sua habilidade de capturar ch806 ou mAb806 no soro ou 1% de FCS/Meio e então detectar ch806 ou mAb806 ligado. Anticorpos isotipo controles hu193 e m3S193 no soro e 1% FCS.Meio foram incluídos em adição aos controles para conjugado secundário avidina-HRP e substrato ABTS. Resultados são apresentados como média (±DP) de triplicatas de amostras usando LMH-12 biotinilado (10 μg/mL) para detecção e indicar que LMH-12 usado para captura e detecção tiveram a sensibilidade mais alta para ch806 no soro (3 ng/mL) com ligação de background insignificante.

[054]FIG. 43 mostra validação das condições ótimas da farmacocinética por ELISA usando 1 μg/mL de LMH-12 anti-idiotipo e 1 μg/mL de LMH-12 biotinilado para captura e detecção, respectivamente. Três ELISAs separados foram feitos em quadruplicada para medir ch808 no soro doador (•) a partir de três doadores saudáveis ou 1% de MSA/méio (■) com isotipo controle hu3S193 no soro (A) ou 1% BSA/meio (▼). Controles para conjugado secundário avidina-HRP (♦) e substrato ABTS (hexágono) sozinho foram também inclusos com cada ELISA. Média (± DP) dos resultados demonstram curvas de ligação altamente reprodutíveis para medir ch806 (2 μg/mL - 1,6 ng/mL) nos soros com um limite de detecção de 3 ng/mL. (n- 12; 1-100 ng/mL, Coeficiente de Variação < 25%; 100 ng/mL - 5 μg/mL, Coeficiente de Variação < 15%). Nenhuma ligação background foi evidente com quaisquer dos três soros testados e ligação insignificante foi observada com isotipo controle hu3S193.

[055]FIG. 44 descreve um imunoblot de sEGFR recombinante expresso em células CHO, “manchado” (blotted) com mAb806. sEGFR recombinante foi tratado com PNGaseF para remover glicosilação ligada a N (deglicosilação), ou não tratado (não tratado), a proteína foi corrida em SDS-PAGE, transferida para membrana e “imunoblotted” com mAb806.

[056]FIG. 45 descreve imunoprecipitação de EGFR a partir de linhagens ce-lulares marcadas com 35S (U87MG.Δ2-7, U87<G-wtEGFR, e A431) com diferentes anticorpos (anticorpos SC-03, 806 e 528).

[057]FIG. 46 descreve imunoprecipitação de EGFR a partir de células diferentes (A431 e U87MG. Δ2-7) em diferentes pontos de tempo (tempo 0 a 240 minutos) após pulse-labeling com 35S metionina/cisteína. Anticorpos 528 e 806 são utilizados para imunoprecipitação.

[058]FIG. 47 descreve imunoprecipitação de EGFR a partir de várias linhagens celulares (U87MGΔ2-7, U87MG-wtEGFR e A431) com vários anticorpos (SC- 03, 806 e 528) em ausência de (-) e após digestão Endo H (+) para remover carboidratos tipo alta manose.

[059]FIG. 48 descreve iodinação de superfície celular das linhagens celulares A431 e U87MG. Δ2-7 seguida por imunoprecipitação com o anticorpo 806, e com ou sem digestão Endo H, confirmando que o EGFR ligado por mAb806 na superfície celular das células A431 é uma forma sensível EndoH.

[060]FIG. 49 mostra o Vetor pREN ch806 LC Neo (SEQ ID NO:7).

[061]FIG. 50 mostra o Vetor pREN ch806 HC DHFR (SEQ ID NO:8).

[062]FIGS. 51 A-D mostram as sequências de aminoácidos de cadeia VP e VL de mAb124 (SEQ ID NO:21 e 26, respectivamente) e sequências de aminoácidos (SEQ ID NOS:22 e 27, respectivamente).

[063]FIGS. 52 A-D mostram as sequências de aminoácidos de cadeia VP e VL de mAb1133 (SEQ ID NO:31 e 36, respectivamente) e sequências de aminoáci- dos (SEQ ID NOS: 32 e 37, respectivamente).

[064]FIG. 53 mostra um gráfico de plasmídeo DNA do plasmídeo Lonza do gene duplo combinado incluindo pEE12.4 contendo o cartucho de expressão hu80 (VP + CP), e pEE6.4 contendo o cartucho de expressão hu806L (VP + CP).

[065]FIG. 54 mostra a sequência de DNA (SEQ ID NO:41; complemento SEQ ID NO: 162) do plasmídeo Lonza combinado descrito na FIG. 53. Esta sequênciatambém mostra todas as traduções (SEQ ID NOS: 42-51 e 163-166) relevantes ao anticorpo hu806. O plasmídeo tem tido a sequência verificada, e a sequência co- dificante e tradução checada. Seções da sequência têm sido sombreadas para identificarregiões de interesse; as regiões sombreadas correspondem as junções splice atuais. O código de cor é como segue:

[066](cinza): região de sinal, sequências codificantes iniciais encontradas em ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e leve;

[067](lavanda): cadeia VP hu806, região variável de cadeia pesada revestida;

[068](rosa): cadeia CP hu806, região constante de cadeia-pesada códon- otimizado;

[069](verde): cadeia VL hu806, região variável de cadeia leve revestida; e

[070](amarelo): cadeia CL hu806, região constante de cadeia leve códon- otimizado.

[071]FIGS. 55A e 55B mostram as sequências de aminoácidos traduzidas de hu806 (cadeias VP e VL das SEQ ID NOS: 164 e 166 e seus respectivos peptídeos sinais das SEQ ID NOS: 163 e 165; cadeias CP e CL das SEQ ID NOS: 43 e 48), e dá os números Kabat para as cadeias VP e VL (SEQ ID NOS: 164 e 165, respectivamente), com CDRs (SEQ ID NOS: 44-46 e 49-51) sublinhadas.

[072]FIGS. 56A, 56B, 56C, 57A, 57B e 57C mostram o passo inicial de re-vestimento no desenho, a graduação dos resíduos aminoácidos na sequência mAb806 (cadeia VP da SEQ ID NO: 167 e cadeia VL da SEQ ID NO:12) para exposição na superfície. Graus são dados no número de asteriscos (*) acima de cada resíduo, com os resíduos mais expostos tendo três asteriscos. Essas figuras incluem um desenho indicando os oligonucleotídeos iniciais (cadeia VP: FIG.56C e SEQ ID NOS: 52 e 169-177; cadeia VL: FIG. 57C e SEQ ID NOS: 62, 66, 68 e 181-187) sobreposto para formar o primeiro produto revestido (cadeia VP da SEQ ID NO: 168 e cadeia VL da SEQ ID NO:180).

[073]FIG. 58 mostra um mapa de códon otimizado da sequência de DNA da cadeia pesada huIgG1 (SEQ ID NO:80; complemento SEQ ID NO: 178) e tradução de aminoácidos (SEQ ID NO:43).

[074]FIG. 59 mostra o alinhamento de proteína comparando a sequência de aminoácidos VP + CP hu806 (8C65AAG hu806 VP + CP; SEQ ID NO:81) para o arquivo de referência original para a cadeia VP mAb806 (SEQ ID NO:167). Regiões destacadas indicam sequências de aminoácidos conservadas na cadeia VP. Os CDRs são sublinhados. Asteriscos refletem mudanças que foram planejadas e realizadas no processo de revestimento inicial. Os locais numerados são referências para as modificações adiante.

[075]FIG. 60 mostra o alinhamento correspondente para a sequência de aminoácidos VL + CL hu806 (sinal 8C65AAG hu806 + VL + CL; SEQ ID NO: 83) pa ra o arquivo de referência original para a cadeia VL mAb806 (SEQ ID NO:179). Ele contém um arquivo adicional (sinal r2vk1 hu806 + VL + CL; SEQ ID NO:82), uma construção precursora, que foi incluída para ilustrar a mudança feita na modificação #7.

[076]FIG. 61 mostra um nucleotídeo e alinhamento aminoácido do sinal hu806 + VL e sequências CL (8C5AAG hu806 Vl + Cl; SEQ ID NOS: 190 e 188) com as correspondentes sequências ch806 (pREN ch806 LC Neo; LICR; SEQ ID NO:189). Ele foi modificado e anotado como descrito na FIG. 62.

[077]FIG. 62 mostra o alinhamento nucleotídico da sequência hu806 sinal + VP (cadeia 8C65AAG hu806 VP; SEQ ID NO:192) com a sequência mAb806 cor-respondente [cadeia mAb806 VP antes da mudança de códon (cc) e revestimento (ven); SEQ ID NO:191]. As mudanças nucleotídicas atrás das mudanças de aminoá- cidos das FIGS. 59 e 60 são ilustradas, bem como mostrando mudanças de ácido nuclécicos conservadas que levam a nenhuma mudança no aminoácido. O íntron entre o sinal e a cadeia VP em hu806 tem sido removido para mais fácil visualização. A sequência sinal e CDRs são sublinhadas. A sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:42) tem sido sobreposta no alinhamento.

[078]FIG. 63 mostra ligação do anticorpo hu806 purificado obtido a partir de células 293 transfectante transiente para EGFR-ECD recombinante como determinado por Biacore. Nenhuma ligação ap EGFR-ECD foi observada com anticorpo IgG1 humano controle purificado.

[079]FIG. 64 mostra o documento em texto formatado GenBank da sequência (SEQ ID NO:41) e anotações do plasmídeo 8C65AAG codificando o IgG1 hu806.

[080]FIG. 65 mostra o alinhamento de sequências de aminoácidos para CDRs a partir de mAb806 (SEQ ID NOS: 15-18, 20 e 193) e mAb175 (SEQ ID NOS: 130-132, 135 e 194-195). Diferenças de sequências entre os dois anticorpos são negritadas.

[081]FIGS. 66A e 66B mostram coloração imunohistoquímica de linhagens celulares e fígado humano normal com mAb175. (A) mAb175 biotinilado foi utilizado para corar cortes preparados a partir de blocos contendo células A431 (super expressa o wtEGFR), células U87MG. Δ2-7 (expressa o Δ2-7EGFR) e células U87MG (expressa o wEGFR em níveis modestos). (B) Coloração de fígado humano normal (400x) com mAb175 (painel esquerdo), isotipo controle (painel central) e anticorpo secundário controle (painel direito). Nenhuma coloração sinusoidal ou hepatócito específica foi observada.

[082]FIGS. 67A, 67B e 67C mostram a reatividade de mAb806 e mAb175 com fragmento os de EGFR exposto em levedura. (A) Histrogramas de citometria de fluxo representativos descrevendo a média do sinal de fluorescência de marcação com mAb175 e mAb806 de fragmento os EGFR exposto em levedura. Com exposição em levedura uma porcentagem de células não expressam proteína em sua superfície resultando em 2 picos no histograma. O anticorpo 9R10 é utilizado como um controle positivo como todos fragmento os contêm um C-terminal linear c-myc tag. (B) Resumo da ligação de anticorpo a vários fragmento os EGFR. (C) Os fragmento os EGFR foram desnaturados por concentrados de levedura aquecida a 800 oC por 30 min. O c-myc tag foi ainda reconhecido pelo anticorpo 9E10 anti-myc em todos os casos, demonstrando que tratamento de calor não compromete a proteína exposta na superfície de levedura. O anticorpo EGFR de conformação sensível mAb225 foi usado para confirmar a desnaturação.

[083]FIGS. 68A, 68B, 68C e 68D mostram os efeitos anti-tumor de mAb175 nos xenotransplantes câncer de cérebro e próstata . (A) Camundongos (n=5) tendo xenotransplantes U87MG. Δ2-7 foram injetados i.p. com PBS, 1 mg de mAb175 ou mAb806 (controle positivo), três vezes por semana por duas semanas nos dias 6, 8, 10, 13, 15 e 17 quanto o volume de tumor inicial foi 100 mm3. Dados são expressos como média de volume de tumor ± EP. (B) Células foram coradas com dois anticor- pos irrelevantes (azul, sólido e verde, vazio), mAb 528 para EGFR total (rosa, sólido), mAb806 (azul claro, vazio) e mAb 175 (laranja, vazio) e então analisadas por FACS. (C) células DU145 foram lisadas, sujeitas a IP com mAb 528, mAb 806, mAb175 ou dois anticorpos independentes irrelevantes e então imunotransferidos para EGFR. (D) Camundongos (n=5) tendo xenotransplantes DU145 foram injetados i.p. com PBS, 1 mg de mAb175 ou mAb806, diariamente nos dias 18-22, 25-29 e 3943 quando o volume do tumor inicial foi 85 mm3. Dados são expressos como média de volume de tumor ± EP.

[084]FIG. 69A, 69B, 69C, 69E, e 69F mostram as estruturas de cristal do peptídeo EGFR 287-302 ligadas aos fragmento os Fab (A) Cartoon de Fab 806, com a cadeia leve, vermelha; cadeia pesada, azul; peptídeo ligado, amarelo; e o EGFR287-302 sobreposto a partir de EGFR, violeta. (B) Cartoon de Fab 175 com a cadeia leve, amarelo; cadeia pesada, verde; peptídeo ligado, lilás; e EGFR287-302 a partir de EGFR (DI-3), violeta. (C) Detalhe de (B) mostrando a similaridade de EGFR287- 302 no receptor do peptídeo ligado a Fab 175. Estruturas de peptídeos são mostradas como traços Cα e as cadeias laterais interagindo como pregas. Os átomos são coloridos de vermelho; N, azul; S, laranja e C, como para a cadeia principal. (D) Sobreposição do EGFR com o complexo Fab175:peptídeo mostrando sobreposição espacial.Coloração como em (C) com a superfície de EGFR187-286 coloridos de turquesa. (E) Visão ortogonal de (D) com EGFR187-286 mostrado em azul opaco e a superfície das cadeias leve (laranja) e pesada (verde) transparentes. (F) Estereoscopia detalhada do complexo 175 Fab olhando no sítio de ligação de antígeno. Coloração como em (C) e ligações de hidrogênio de cadeia lateral pontilhada em preto. Moléculas de água encobertas sob o complexo

[085]Formação são mostradas como esferas vermelhas.

[086]FIGS. 70A, 70B, 70C e 70D mostram a influência da ligação cisteína 271-283 na ligação de mAb806 ao EGFR. (A) Células transfectadas com wtEGFR, EGFR-C271A, EGFR-C283A ou o mutante C271A/C283A foram coradas com mAb528 (histograma rosa sólido), mAb806 (linha azul) ou somente o anticorpo secundário (violeta) e então analisadas por FACS. O ganho foi estabelecido usando um anticorpo irrelevante de classe compatível. (B) Células BaF3 expressando o EGFR-C271A ou C271/283A EGFR foram examinadas para sua resposta ao EGF em um ensaio MTT como descrito. EC50S foram derivados usando o ajuste Bolzman dos pontos de dados. Dados representam médias e DP de medidas de triplicatas. (C) Células BaF3 expressando o selvagem ou o EGFR-C271A/C283A foram IL-3 e soro privado de alimentação, então exposto ao EGF ou veículo controle. Lisados de células totais foram separados por SDS-PAGE e imunotransferidos com anticorpo anti-fosfotirosina (painel superior) ou anticorpo anti-EGFR (painel inferior). (D) Células BaF3 expressando o selvagem (painel esquerdo) ou o C271A/C283A (painel direito) EGFR foram estimulados com concentrações crescentes de EGF na presença de nenhum anticorpo (símbolos abertos), mAb 528 (círculos cinzas) ou mAb 806 (triângulos pretos), ambos a 10 μg/mL. Dados são expressos como média e DP de medidas de triplicatas.

[087]FIGS. 71A, 71B, e 71C mostram: (A) imagem de câmera gama de corpo inteiro da biodistribuição de 111In ch806 em um paciente com carcinoma celular escamoso metastático da corda vocal, mostrando alta captação quantitativa em tumor no pescoço direito (seta). Atividade de pool de sangue e menor catabolismo de 111In livre no fígado, é também visto. (B) imagem de Tomografia Computadorizada de Emissão de Fótons Simples (SPECT) do pescoço deste paciente, mostrando captação de 111In-ch806 em tumor viável (seta), com captação central reduzida indicando necrose. (C) CT scan correspondente do pescoço demonstrando uma grande massa de tumor a direita do pescoço (seta) com necrose central.

[088]FIGS. 72A e 72B mostram um modelo estereo da estrutura do EGFR1- 621 livre. A estrutura do receptor é traçada em azul e o ligante TNF-α em vermelho. O epítopo mAb806/175 é desenhado em turquesa e as ligações dissulfeto em amarelo. Os átomos da ligação dissulfeto que é ligam o apítopo ao receptor são mostrados no formato enchimento de espaço. O modelo foi construído por ancoragem do domínio EGFR-ECD CR2 a partir da conformação unida na estrutura de um monô- mero EGFR livre em presença de seus ligantes.

[089]FIG. 72 mostra a reatividade do mAb806 com fragmento os do EGFR. Lisados a partir de células 293T transfectadas com vetores expressando o fragmento o EGFR 1-501 solúvel ou fragmento o de proteínas de fusão GH/EGFR (GH-274- 501, GH-282-501, GH-290-501 e GH-298-501) foram resolvidas por SDS-PAGE, transferidas para membrana e imunotransferidas com mAb806 (painel esquerdo) ou o anticorpo anti-myc 9B11 (painel direito).

[090]FIGS. 74A e 74B mostram a sequência de ácido nucléico de cadeia VP mAb175 (SEQ ID NO:128) e sequência de aminoácidos [[s]] (SEQ ID NO:129), res-pectivamente.

[091]FIGS. 75A e 75B mostram a sequência de ácido nucléico de cadeia VL de mAb175 (SEQ ID NO:133) e sequências de aminoácidos [[s]] (SEQ ID NO:134), respectivamente.

[092]FIGS. 76A, 76B e 76C mostram: (A) concentração do produto volumétrico e (B) concentração de célula viável de transfectantes GS-CHO (14D8, 15B2 e 40A1'0) e GS-NS0 (36) hu806 em culturas de frascos de agitação de pequena escala (100 mL). Concentração do produto foi estimada por ELISA usando anti-idiotipo 806 como anticorpo re revestimento e ch806 Clinical Lot: J6024 com padrão; (C) crescimento de célula transfectante GS-CHO 40A10 e produção volumétrica em um bioreator de tanque agitado de 15 L. Densidade de célula viável (♦ x 105cell/mL), viabilidade celular (■) e produção (^mg/L).

[093]FIGS. 77A, 77B, 77C, 77D e 77E mostram Análise de Cromatografia de Exclusão por Tamanho (Biosep SEC-S3000) das construções de anticorpo hu806 Proteína-A purificado produzido por pequena escala de cultura e controle ch806 e mAb 806. Cromatogramas em A214 nm são apresentados nos painéis superiores e em A280 nm no painel mais inferior de cada Figura.

[094]FIG. 78 mostra Análise de Cromatografia de Exclusão de Tamanho (Biosep SEC-S3000) da construção de anticorpo hu806 Proteína A purificada 40A10 seguindo produção em grande escala e purificação de Proteína A. Cromatograma em A214 nm é apresentado indicando 98,8% de pureza com 1,2% do presente agregado.

[095]FIG. 79 mostra que Géis de Tris/Glicina 4-20% pré-moldados da Novex, EUA foram utilizados sob condições padrões de SDS-PAGE para analisar preparações hu806 transfectantes purificadas (5 μg) GS CHO (14D8, 15B2 e 40A10) e GS- NS0 (36) hu806 sob condições reduzidas. Proteínas detectadas por Corante Coo- massie Blue.

[096]FIG. 80 mostra que Géis de Tris/Glicina 4-20% pré-moldados foram uti-lizados sob condições padrões de SDS-PAGE para analisar preparações hu806 transfectantes purificadas (5 μg) GS CHO (14D8, 15B2 e 40A10) e GS-NS0 (36) hu806 sob condições reduzidas. Proteínas detectadas por Corante Coomassie Blue.

[097]FIG. 81 mostra que Géis de Tris/Glicina 4-20% pré-moldados foram uti-lizados sob condições padrões de SDS-PAGE para analisar transfectantes purificadas hu806 GS CHO 40A10 (5 μg) seguindo produção em larga escala. Proteínas detectadas por Corante Coomassie Blue.

[098]FIG. 82 mostra análise de gel Foco Isoelétrico do transfectante purificado hu806 GS CHO 40A10 (5 μg) seguindo 15 L de produção. Proteínas detectadas por Corante Coomassie Blue. Linha 1, marcadores pI; Linha 2, hu806 (três isoformas, pI 8,66 a 8,82); Linha 3, marcadores pI.

[099]FIG. 83 mostra ligação a células A431: análise citômetrica de Fluxo de preparações de anticorpo hu806 Proteína A purificada (20 μg/mL), controle isotipo huA33 (20 μg/mL). Controles incluem anticorpo secundário sozinho (verde) e ch806 (vermelho). Contruções hu806 foram produzidos por cultura em pequena escala.

[0100]FIG. 84 mostra ligação a células A431: análise citômetrica de Fluxo de preparações de anticorpo mAb806, ch806 e hu806 40A10 purificadas (20 μg/mL) que ligam ~10% de selvagem EGFR na superfície celular, 528 (ligação em ambos, selvagem e de2-7 EGFR) e anticorpo controle irrelevante (20 μg/mL) como indicado.

[0101]FIG. 85 mostra ligação às células de glioma U87MG.de2-7. Análise ci- tômetrica de Fluxo das preparações de anticorpo mAb806, ch806 e hu806 40A10 purificados (20 μg/mL) e 528 anti-EGFR e anticorpo controle irrelevante (20 μg/mL).

[0102]FIG. 86 mostra ligação específica de construções de anticorpo 125I- radiomarcado 806 a: (A) células glioma U87MG.de2-7 e (B) células de carcinoma A431.

[0103]FIG. 87 mostra Análises Scatchard: construções de anticorpo 125I- radiomarcado (A) ch806 e (B) hu806 ligando a células U87MG.de2-7.

[0104]FIG. 88 mostra Análises Scatchard: construções de anticorpo 125I- radiomarcado (A) ch806 e (B) hu806 ligando a células A431.

[0105]FIGS. 89A e 89B mostram análise BIAcore de ligação a epítopo de peptídeo 287-302 EGFR 806 por (A) hu806 e (B) ch806 passando sobre o peptídeo imobilizado nas concentrações crescentes de 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM e 300 nM.

[0106]FIGS. 90A e 90B mostram Citotoxidade Celular Dependente de Anticorpo mediada por ch806- e hu806- nas células A431 alvos determinadas a (A) 1 μg/mL cada anticorpo sob uma variação do efetor para proporções de célula alvo (E:A= 0,78:1 para 100:1) a E:A=50:1 sob uma variação de concentração de cada anticorpo (3,15 ng/mL - 10 μg/mL).a no alvo A431.

[0107]FIG. 91 mostra tratamento de xenotransplantes A431 estabelecidos em camundongos BALB/c nude. Grupos de 5 camundongos receberam 6x1 mg de dose por 2 semanas de terapia de anticorpo como indicado (setas). Média ± EPM do volume de tumor é apresentado até terminação do estudo.

[0108]FIG. 92 mostra tratamento de xenotransplantes U87MG.de2-7 estabe-lecidos em camundongos BALB/c nude. Grupos de 5 camundongos receberam 6x1 mg de dose por 2 semanas de terapia de anticorpo como indicado (setas). Média ± SEM do volume de tumor é apresentado até a terminação do estudo.

[0109]FIG. 93 mostra desvios a partir de valores de mudança química em espiral aleatórios para o peptídeo mAb806 (A) N, (B) HN e (C) HA. Peptídeo foi preparado na solução H2O contendo 5% de H2O, 70 mM de NaCl e 50 mM de NaPO4 em pH 6.8. Todos os espectros utilizados para indicação sequencial foram adquiridos a 298 K em um Bruker Avance500.

[0110]FIGS. 94A, 94B, 94C, 94D, 94E e 94F mostram imagens de câmera gama de corpo inteiro do Paciente 7 A) Anterior, e B) Posterior, Dia 5 pós infusão de 111In-ch806. Alta captação de 111In-ch806 nas lesões metastáticas nos pulmões (setas)é evidente. C) e D) mostram lesões metastáticas (setas) no scan CT. E) imagens 3D SPECT do tórax, e F) imagens transaxial co-registradas de SPECT e CT mostrando captação específica de 111In-ch806 nas lesões metastáticas.

[0111]FIGS. 95A, 95B, 95C, 95D, 95E, e 95F mostram imagens planares da cabeça e pescoço do Paciente 8 obtidas A) Dia 0, B) Dia 3 e C) Dia 7 pós infusão de 111In-ch806. Atividade de pool sanguíneo inicial é visto no Dia 0, e captação de 111In- ch806 em um astrocitoma anaplástico no lóbulo frontal direito é evidente pelo Dia 3 (seta), e aumenta pelo Dia 7. Captação específica de 111In-ch806 é confirmada em D) imagem SPECT do cérebro (seta), no local do tumor (seta) evidente em E) 18F- FDG PET, e F) MRI.

[0112]FIGS. 96A, 96B, 96C e 96D mostram captação similar de 111In-ch806 em tumor é evidente no Paciente 3 comparado ao Paciente 4, a despeito de diferenças na expressão de antígeno 806 nas amostras de tumor classificados. A) 111In ch806 localização em metástases de pulmão (seta) na imagem transaxial SPECT no Paciente 4, com atividade de pool sanguíneo cardíaco (B) evidente. B) CT scan cor-respondente. Tumor arquivado foi mostrado ter <10% de positividade para expressão. C) 111In-ch806 localização na metástase do pulmão (seta) em Paciente 3, com atividade de pool sanguíneo cardíaco (B) evidente. D)CT scan correspondente. Tumor arquivado foi mostrado ter 50-75% de positividade para expressão 806.

[0113]FIG. 97 mostram farmacocinética da população total da proteína ch806 medida por ELISA. Observado e predito ch806 (%ID/L) vs. tempo pós-infusão (h).

[0114]FIGS. 98A e 98B mostra resultados de pacientes individuais para A) Depuração do Corpo Inteiro Normalizada e B) Depuração Hepática de 111In-ch806 a 5 mg/m2(■), 10 mg/m2(Δ), 20 mg/m2(V), e 40 mg/m2(♦) níveis de dose. Regressão linear para grupos de dados indicados em cada painel [A) r2= 0.9595; B) r2= 0.9415].

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0115]De acordo com a presente invenção podem ser empregadas técnicas de biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante convencionais dentro da técnica. Tais técnicas são explicadas complemente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-E [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

[0116]Como aqui utilizado, os seguintes termos são considerados ter, sem limitação, as definições providas.

[0117]O termo “membro de ligação específica” descreve um membro de um par de moléculas que têm especificidade de ligação para uma outra. Os membros de um par de ligação específica podem ser naturalmente derivados ou completamente ou parcialmente produzidos sinteticamente. Um membro do par de moléculas tem uma área em sua superfície, ou uma cavidade, que se liga especificamente a e é assim complementar a uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Então, os membros do par têm a propriedade de ligar especificamente a cada outra. Exemplos de tipos de pares de ligação específicos são, antí- geno-anticorpo, biotina-avidina, hormônio-receptor de hormônio, receptor-ligante, enzima-substrato. Este pedido é relacionado com reações do tipo antígeno- anticorpo.

[0118]O termo “expressão aberrante” em suas várias formas gramaticais pode significar e incluir qualquer expressão ou super-expressão salientada ou alterada de uma proteína em um tecido, por exemplo, um aumento na quantidade de uma proteína, causada por quaisquer meios incluindo expressão ou tradução aumentada, modulação do promotor ou um regulador da proteína, amplificação de um gene para uma proteína, ou meia-vida ou estabilidade aumentada, tal que mais das proteínas existentes ou podem ser detectadas em um tempo, em contraste a um estado não super-expresso. Expressão aberrante inclui e contempla qualquer cenário ou alteração em que a expressão de proteína ou maquinaria de modificação pós-traducional em uma célula é carregada ou de outra forma interrompida devido ao aumento da expressão ou níveis aumentados ou quantidades de uma proteína, incluindo em que uma proteína alterada, como em proteína mutada ou variante devido a alteração, deleção ou inserção de sequência, ou prega alterada é expressa.

[0119]É importante apreciar que o termo “expressão aberrante” tem sido es-pecificamente escolhido aqui para compreender o estado onde quantidades/níveis anormais (usualmente aumentados) da proteína são presentes, independente da causa eficiente da quantidade ou nível anormal. Então, quantidades anormais de proteína podem resultar a partir da super expressão da proteína na ausência da amplificação gênica, que é o caso, por exemplo, em muitas amostras celula- res/tissulares tomadas a partir da cabeça e pescoço de pacientes com câncer, enquanto outras amostras exibem níveis de proteína anormais atribuíveis a amplificação gênica.

[0120]Nesta conexão mais tardia, certo do trabalho dos inventores que é aqui apresentado para ilustrar a invenção inclui a análise de certas amostras de que exibem níveis de proteína anormal resultados a partir da amplificação de EGFR. Isto assim leva em conta a apresentação aqui de descobrimentos experimentais onde referência é feita para amplificação e para o uso dos termos “amplifica- ção/amplificado” e semelhantes em descrever níveis anormais de EGFR. Entretanto, é a observação de quantidades anormais ou níveis de proteína que definem o ambiente ou circunstância onde a intervenção clínica como por uso de membros de ligação da invenção é contemplado, e por esta razão, a presenta especificação considera que o termo “expressão aberrante” mais amplamente captura o ambiente causal que produz a anormalidade correspondente nos níveis de EGFR.

[0121]Consequentemente, enquanto os termo “super-expressão” e “amplificação” em suas várias formas gramaticais são entendidos para ter significados técnicos distintos, eles são para ser considerados equivalentes um ao outro, enquanto eles representam o estado onde níveis de proteína EGFR anormais estão presentes no contexto da presente invenção. Logo, o termo “expressão aberrante” tem sido escolhido como é acreditado incluir os termos “super expressão” e “amplificação” dentro do objetivo para os propósitos aqui, de forma que os termos podem ser considerados equivalentes a cada outro como aqui utilizado.

[0122]O termo “anticorpo” descreve uma imunoglobulina ou natural ou parci- almente ou inteiramente sinteticamente produzido. O termo também cobre qualquer polipeptídeo ou proteína tendo um domínio de ligação que é, ou é homólogo a, um domínio de ligação de anticorpo. Anticorpos enxertados CDR são também contemplados por este termo.

[0123]Como anticorpos podem ser modificados em um número de formas, o termo “anticorpo” deve ser construído como cobrindo qualquer membro de ligação específica ou substância tendo um domínio de ligação com a especificidade requeri-da.Então, este termo cobre fragmento os de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, se natural ou inteiramente ou parcialmente sintético. Moléculas quiméricas compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fusionado a outro polipeptídeo são assim incluídos. Clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritos em EP-A- 0120694 e EP-A-0125023 e Patente dos EUA Nos. 4.816.397 e 4.816.567.

[0124]Tem sido mostrado que fragmento os de um anticorpo inteiro podem desempenhar a função de ligação a antígenos. Exemplos de fragmento os de ligação são (i) o fragmento o Fab consistindo de domínios VL, VP, CL e CP1; (ii) o fragmento o Fd consistindo dos domínios VP e CP1; (iii) o fragmento o Fv consistindo dos domínios VL e VP do anticorpo único; (iv) o fragmento o dAb (Ward, E.S. et al (1989) Nature 341, 544-546) que consiste de um domínio VP; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmento os F(ab’)2, um fragmento o bivalente compreendendo dois fragmento os Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VP e um domínio VL são ligados por um peptídeo ligador que permite os dois domínios associarem para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird et al. (1988) Science. 242,423-426; Huston et al. (1988) PNAS USA. 85,5879-5883); (viii) fragmento os de anticorpo multivalente (dímeros scFv, trímeros e/ou tetrâmeros (Power and Hudson (2000) J. Immunol. Methods 242, 193-204) (ix) dímeros Fv de cadeia simples biespecíficas (PCT/US92/09965) e (x) “dianticorpos”, fragmento os multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão gênica (W094/13804; P. Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,6444-6448).

[0125]Um “sítio de combinação de anticorpo” é que a porção estrutural de uma molécula de anticorpo compreendida de cadeia leve ou cadeia variável pesada e leve e regiões hipervariáveis que especificamente se liga a antígeno.

[0126]A frase “molécula de anticorpo” em suas várias formas gramaticais como aqui utilizado contempla ambos, uma molécula de imunoglobulina intacta e uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina.

[0127]Moléculas de anticorpo exemplares são moléculas de imunoglobulinas intactas, moléculas de imunoglobulinas substancialmente intactas e aquelas porções de uma molécula de imunoglobulina que contêm a região Fab, incluindo aquelas porções conhecidas na técnica como Fab, Fab', F (ab') Z e F (v), cujas porções são preferidas para uso nos métodos terapêuticos aqui descritos.

[0128]Anticorpos podem também ser biespecíficos, em que um domínio de ligação do anticorpo é um membro de ligação específico da invenção, e o outro domínio de ligação tem uma especificidade diferente, por exemplo, para recrutar uma função efetora ou semelhante. Anticorpos biespecíficos da presente invenção incluem em que um domínio de ligação do anticorpo é um membro de ligação específico da presente invenção, incluindo um fragmento o do mesmo, e o outro domínio de ligação é um anticorpo distinto ou fragmento o do mesmo, incluindo aquele de um anticorpo anti-EGFR distinto, por exemplo, anticorpo 528 (Patente dos EUA No. 4.943.533), o anticorpo 225 quimérico e humanizado (Patente dos EUA No. 4.943.533 e WO/9640210), um anticorpo anti-de2-7 tal como DH8.3 (Hills, D. et al (1995) Int. J. Cancer. 63(4), 537-543), anticorpo L8A4 e Y10 (Reist, CJ et al. (1995) Cancer Res. 55 (19):4375-4382; Foulon CF et al. (2000) Cancer Res. 60 (16):44534460), ICR62 (Modjtahedi H et al. (1993) Cell Biophys. Jan-Jun; 22 (1- 3):129-46; Modjtahedi et al. (2002) P. A. A. C. R. 55 (14):3140-3148, ou o anticorpo de Wikstrand et al (Wikstrand C. et al (1995) Cancer Res. 55 (14):3140-3148). O outrodomínio de ligação pode ser um anticorpo que reconhece ou tem com alvo um tipo de célula particular, como em um anticorpo específico neural ou de célula da glia. Nos anticorpos biespecíficos da presenta invenção o um domínio de ligação do anticorpo da invenção pode ser combinado com outros domínios de ligação ou moléculas que reconhecem receptores celulares particulares e/ou células moduladas em uma forma particular, como por exemplo, um modulador imune (por exemplo, interleucinas (s)), um modulador de crescimento ou citocina (por exemplo, fator de necrose tumoral (TNF), e particularmente, a modalidade biespecífica de TNF demonstrada em U.S.S.N. 60/355.838 depositada em 13 de Fevereiro de 2002, incorporada aqui em sua totalidade) ou uma toxina (por exemplo, ricina) ou um agente ou fator anti-mitótico ou apoptótico.

[0129]Porções Fab e F(ab’)2 de moléculas de anticorpo podem ser preparadas pela reação proteolítica de papaína e pepsina, respectivamente, em moléculas de anticorpo substancialmente por métodos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 4.342.566 para Theofilopolous et al. Porções de moléculas de anticorpo Fab’ são também bem-conhecidas e são produzidas a partir de porções F(ab’)2 seguidas por redução das ligações dissulfeto ligadas as duas porções da cadeia pesada como com mercaptoetanol, e seguidas por alquilação da proteína mercaptan resultante com um reagente tal como iodoacetamida. Um anticorpo contendo moléculas de anticorpo intacta é aqui preferida.

[0130]A frase «anticorpo monoclonal » em suas várias formas gramaticais refere-se a um anticorpo tendo somente uma espécie de sítio de combinação de anticorpo capaz de imunoreagir com um antígeno em particular. Um anticorpo monoclonal então tipicamente revela uma afinidade de ligação únida para qualquer antí- geno com o qual ele imunoreage. Um anticorpo monoclonal pode também conter uma molécula de anticorpo tendo uma pluralidade de sítios de combinação de anticorpo, cada imunoespecífico para um antígeno diferente ; por exemplo, um anticorpo monoclonal biespecífico (quimérico).

[0131]O termo « "domínio de ligação de antígeno » descreve a parte de um anticorpo que compreende a área que especificamente se liga a e é complementar a parte ou todo de um antígeno. Onde o antígeno é grande, um anticorpo pode se ligar a uma parte particular do antígeno somente, cuja parte é denominada epítopo. Um domínio de ligação de antígeno pode ser provido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. Preferivelmente, um domínio de ligação de antígeno compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo (CP).

[0132]« Modificação pós-traducional» pode compreender qualquer uma de, ou combinação de modificação(ões), incluindo modificação covalente, em que uma proteína passa após tradução ser completa e após ser liberada a partir do ribossoma ou no peptídeo em nascimento co-traducionalmente. Modificação pós-traducional inclui mas não é limitada a fosforilação, miristilação, ubiquitinação, glicosilação, ligação de coenzima, metilação e acetilação. Modificação pós-traducional pode modular ou influenciar a atividade de uma proteína, seu destino intracelular ou extracelular, sua estabilidade ou meia-vida, e/ou ser reconhecimento por ligantes, receptores ou outras proteínas. Modificação pós-traducional pode ocorrer em organelas celulares, no núcleo ou citoplasma ou extracelularmente.

[0133]O termo « específico » pode ser utilizado para referir a situação em que um membro de um par de ligação específica não mostrará qualquer ligação sig- nificante para moléculas outras que seu(s) parceiro(s) de ligação específica. O termo é também aplicável onde, por exemplo, um domínio de ligação de antígeno é específico para um epítopo particular que é carregado por um número de antígenos, em cujo caso o membro de ligação específico carreando o domínio de ligação do antí- geno será capaz de ligar a vários antígenos carreanco o epítopo.

[0134]O termo « compreende » geralmente usado no senso de incluso, que é para dizer premitir a presença de uma ou mais características ou componentes.

[0135]O termo «consistindo essencialmente de » refere-se a um produto, particularmente uma sequência peptídica, de um número definido de resíduos que não é covalentemente ligado a um grande produto. No caso do peptídeo da invenção referida acima, aqueles versados na técnica apreciam que modificações menores no N- ou C-terminal do peptídeo podem entretanto ser contemplados, tal como a modificação química do terminal para adicionar um grupo protetor ou semelhante, por exemplo, a amidação do C-terminal.

[0136]O termo «isolado » refere-se ao estado em que os membros de ligação específicos da invenção, ou ácido nucléico codificando tais membros de ligação serão, de acordo com a presente invenção. Membros e ácido nucléico serão livres ou substancialmente livres de material com os quais eles são naturalmente associados tais como outros polipeptídeos ou ácidos nucléicos com os quais eles são encontrados em seu ambiente natural, ou o ambiente em que eles são preparados (por exemplo, cultura celular) quando tal preparação é por tecnologia de DNA recombi- nante praticada in vitro e in vivo. Membros e ácido nucléico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda para propósitos práticos de serem isolados- por exemplo os membros serão normalmente misturados com gelatina ou outros veículos se utilizados para revestir as placas de microtitulação para uso em imunoensai- os, ou serão misturados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando utilizados no diagnóstico ou terapia. Membros de ligação específica podem ser glicosilados, ou naturalmente ou por sistemas de células eucarióticas heterólo- gas, ou eles podem ser (por exemplo, se produzido pela expressão em uma célula procariótica) não glicosilada.

[0137]Também, como aqui utilizado, os termos «glicosilação » e « glicosila- do » incluem e compreendem a modificação pós-traducional de proteínas, denomi-nadasglicoproteínas, por adição de oligossacarídeos. Oligossacarídeos são adicionados aos sítios de glicosilação em glicoproteínas, particularmente incluindo oligos- sacarídeos N-ligados e oligossacarídeos 0-ligados. Oligossacarídeos N-ligados são adicionados a um resíduo Asn, particularmente em que o resíduo Asn está na sequência N-X-S/T, onde X não pode ser Pro ou Asp, e são os mais comuns encontrados em glicoproteínas. Na biossíntese de glicoproteínas N-ligadas, um oligossacarí- deo tipo alta manose (geralmente compreendido de dolicol, N-Acetilglucosamina, manose e glicose é primeiro formado no retículo endoplasmático (RE). As glicoprote- ínas tipo alta manose são então transportadas a partir do RE para o Golgi, onde processamento e modificação adicionais dos oligossacarídeos ocorrem. Oligossacarí- deos 0-ligados são adicionados ao grupo hidroxila dos resíduos Ser ou Thr. Oligos- sacarídeos 0-ligados, N-Acetilglucosamina é primeiro transferida ao resíduo Ser ou Thr por N-Acetilglicosaminiltransferase no RE. A proteína então move para o Golgi onde modificação adicional e alongamento da cadeia ocorrem. Modificações O- ligadas podem ocorrer com a adição simples do monossacarídeo OglcNAc sozinho naqueles sítios Ser ou Thr que podem também, sob condições diferentes serem fos- foriladas ao invéis de glicosiladas.

[0138]Como aqui utilizado, « pg » significa picograma, « ng » significa na- nograma, « ug » ou « μg » significam micrograma, « mg » significa miligrama, « uL » ou « μL » significam microlitri, « mL » significa mililitro, « L » significa litro.

[0139]Os termos “anticorpo 806”, “mAb806”, “ch806”, e quaisquer variantes não especificamente listadas, podem ser utilizados aqui de forma passível de mudança, e como utilizados através do presente pedido e reivindicações referem-se a material proteináceo incluindo proteínas simples ou múltiplas, e estendem-se àquelas proteínas tendo dados da sequência de aminoácidos aqui descritos e apresenta- dos na SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4, e o anticorpo quimérico ch806 que é incorporado em e forma uma parte das SEQ ID NOS: 7 e 8, e o perfil de atividades revelados aqui e nas Reivindicações. Consequentemente, proteínas revelando atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente contempladas. Essas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tais como modificações obtidas através de mutangênese sítio-direcionada, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações em hospedeiros que são produtores do complexo ou de suas denominadas subunidades. Também, os termos “anticorpo 806”, “mAb806” e “ch806” são tencionados incluir dentro do seu objetivo de proteínas especificamente recitadas aqui, bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas.

[0140]Os termos “anticorpo 806 humanizado”, “hu806”, e “anticorpo 806 re-vestido” e quaisquer variantes não especificamente listados, podem ser utilizados aqui de forma passível de mudança, e como utilizado através do presente pedido e reivindicações referem-se a material proteináceo incluindo proteínas simples ou múltiplas, e se estendem àquelas proteínas tendo os dados da sequência de aminoáci- dos descritos aqui e apresentados na SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:47, e o perfil de atividades revelados aqui e nas Reivindicações. Consequentemente, proteínas mostrando atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente contempladas. Essas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tais como modificações obtidas através de mutegênese sítio-direcionada, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações em hospedeiros que são produtores do complexo ou suas subunidades denominadas. Também, os termos, “anticorpo 806 humanizado”, “hu806” e “anticorpo 806 revestido” são intencionados incluir dentro das de seu objetivo de proteínas especificamente recitadas aqui, bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas.

[0141]Os termos “anticorpo 175” e “mAb175”, e quaisquer variantes não es- pecificamente listados, podem ser utilizados aqui de forma passível de troca, e como utilizados através do presente pedido e reivindicações, referem-se a material protei- náceo incluindo proteínas simples ou múltiplas, e estendem-se àquelas proteínas tendo os dados da sequência de aminoácidos descritos aqui e apresentados na SEQ ID NO:129 e SEQ ID NO:134, e o perfil das atividades reveladas aqui e nas Reivindicações. Consequentemente, proteínas apresentando atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente contempladas. Essas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tais como modificações obtidas através de mutagêne- se sítio-direcionada, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações nos hospedeiros que são produtores do complexo ou de suas subunida- des denominadas. Também, os termos “anticorpo 175” e “mAb175” são tencionados incluir dentro de seus objetivos proteínas especificamente recitadas aqui, bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas.

[0142]Os termos “anticorpo 124” e “mAb124”, e quaisquer variantes não es-pecificamente listados, podem ser utilizados aqui de forma passível de troca, e como utilizados através do presente pedido e reivindicações, referem-se a material protei- náceo incluindo proteínas simples ou múltiplas, e estendem-se àquelas proteínas tendo os dados da sequência de aminoácidos descritos aqui e apresentados na SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:27, e o perfil das atividades reveladas aqui e nas Reivindicações. Consequentemente, proteínas apresentando atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente contempladas. Essas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tais como modificações obtidas através de mutagêne- se sítio-direcionada, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações nos hospedeiros que são produtores do complexo ou de suas subunida- des denominadas. Também, os termos “anticorpo 124” e “mAb124” são tencionados incluir dentro de seus objetivos proteínas especificamente recitadas aqui, bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas.

[0143]Os termos “anticorpo 1133” e “mAb1133”, e quaisquer variantes não especificamente listados, podem ser utilizados aqui de forma passível de troca, e como utilizados através do presente pedido e reivindicações, referem-se a material proteináceo incluindo proteínas simples ou múltiplas, e estendem-se àquelas proteínas tendo os dados da sequência de aminoácidos descritos aqui e apresentados na SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:37, e o perfil das atividades reveladas aqui e nas Reivindicações. Consequentemente, proteínas apresentando atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente contempladas. Essas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tais como modificações obtidas através de muta- gênese sítio-direcionada, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações nos hospedeiros que são produtores do complexo ou de suas su- bunidades denominadas. Também, os termos “anticorpo 1133” e “mAb1133” são tencionados incluir dentro de seus objetivos proteínas especificamente recitadas aqui, bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações aléli- cas.

[0144]Os resíduos aminoácidos descritos aqui são preferidos ser na forma isomérica “L”. Entretando, resíduos na forma isomérica “D” podem ser substituídos por qualquer resíduo aminoácido L, desde que a propriedade funcional desejada de ligação de imunoglobulina é retida pelo polipeptídeo. NH2 refere-se ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipeptídeo. COOH refere-se ao grupo car- bóxi livre presente no terminal carbóxi de um polipeptídeo. Mantendo com a nomenclaturapolipeptídica padrão. J. Biol. Chem. 243:3552-59 (1969), abreviações para resíduos aminoácidos são mostrados na seguinte Tabela de Correspondência: Tabela de Correspondência

[0145]Deve ser notado que todas as sequências de resíduo aminoácido são representadas aqui por fórmulas cuja orientação esquerda e direita é na direção convencional do terminal amino para o terminal carbóxi. Além disso, deve ser notado que uma linha de separação no início ou final de uma sequência de resíduo aminoá- cido indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resí-duosaminoácidos. A Tabela acima é apresentada para correlacionar as notações de três letras e uma letra que podem aparecer alternativamente aqui.

[0146]Um “replicon” é qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, cromossomo, vírus) que funciona como uma unidade autônoma de replicação de DNA in vivo; isto é, capaz de replicação sob seu próprio controle.

[0147]Um “vetor” é um replicon, tal como plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outro segmento de DNA pode ser ligado de forma a produzir a replicação do segmento ligado.

[0148]Uma “molécula de DNA” refere-se a forma polimérica de deoxiribonu- cleotídeos (adenina, guanina, timina ou citocina) em sua forma ou de fita simples, ou uma hélice de fita dupla. Este termo refere-se somente a estrutura primária e secundária da molécula, e não limita a mesma a qualquer forma terciária particular. Então, este termo inclui DNA de fita dupla encontrado, entre outras coisas, nas moléculas de DNA lineares (por exemplo, fragmento os de restrição), vírus, plasmídeos, e cromossomos. Na discussão da estrutura de moléculas de DNA de fita dupla particular, sequências podem ser descritas aqui de acordo com a convenção normal de dar somente a sequência na direção 5’ a 3’ junto com a fita não transcrita de DNA (isto é, a fita tendo uma sequência homóloga ao mRNA).

[0149]Uma “replicação de origem” refere-se àquelas sequências de DNA que participam na síntese de DNA.

[0150]Uma “sequência codificante” de DNA é uma sequência de DNA de dupla fita que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vivo quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. Os limites da sequência codificadorasão determinados por um códon de partida na terminação 5’ (amino) e um có- don de parada traduzido no terminal 3’ (carbóxi). Uma sequência codificante pode incluir, mas não é limitada a, sequências procarióticas, cDNA a partir de mRNA, sequências de DNA genômico a partir de DNA eucariótico (por exemplo, mamífero), e ainda sequências de DNA sintético. Um sinal de poliadenilação e transcrição de sequências de terminação serão usualmente localizadas em 3’ para a sequência codi- ficante.

[0151]Sequências controle transcricional e traducional são sequências regu- latórias de DNA, tais como promotoras, aumentadoras, sinais de poliadenilação, terminadoras, e semelhantes, que provêem para a expressão de uma sequência co- dificante em uma célula hospedeira.

[0152]Uma “sequência promotora” é uma região regulatória de DNA capaz de se ligar a RNA polimerase em uma célula e iniciando a transcrição de uma sequência codiifcante a jusante (direção 3’). Para propósitos de definição da presente invenção, a sequência promotora é ligada em sua terminação 3’ pelo sítio de iniciação de transcrição e estende acima (direção 5’) para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do background. Dentro da sequência promotora será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido por mapeamento com nuclease S1), bem como domínios de ligação de proteína (sequências consenso) responsáveis pela ligação da RNA polimerase. Promotores eucarióticos conterão muitas vezes, mas não sempre, boxes “TATA” e boxes “CAT”. Promotores procarióticos contêm sequência Shine Dalgarno em adição às sequências consensos -10 e -35.

[0153]Uma “sequência controle de expressão” é uma sequência de DNA que controla e regula a transcrição e tradução de outra sequência de DNA. Uma sequência codificante está “sob controle” de sequências controle transcricional e traducional em uma célula quando RNA polimerase transcreve a sequência codificante em mRNA, que é então traduzida na proteína codificada pela sequência codificante.

[0154]Uma “sequência sinal” pode ser incluída antes da sequência codifican- te. Esta sequência codifica um peptídeo sinal, N-terminal para o polipeptídeo, que comunica a célula hospedeira para direcionar o polipeptídeo à superfície celular ou secretar o polipeptídeo no meio, e este peptídeo sinal é retirado pela célula hospedeira antes da proteína deixar a célula. Sequências sinais podem ser encontradas associadas com uma variedade de proteínas nativas a procariotos e eucariotos.

[0155]O termo “oligonucleotídeo”, como aqui utilizado em referência ao padrão da presente invenção, é definido como uma molécula compreendida de dois ou mais ribonucleotídeos, preferivelmente mais que três. Seu tamanho exato dependerá de muitos fatores que, por sua vez, dependerão da função final e uso do oligonu- cleotídeo.

[0156]O termo “iniciador” como aqui utilizado refere-se a um oligonucletídeo, ou de ocorrência natural como em uma digestão de restrição purificada ou produzido sinteticamente, que é capaz de agir como um ponto de iniciação de síntese quando colocado sob condições em que a síntese de um produto de extensão iniciador, que é complementar a uma fita de ácido nucléico, é induzida, isto é, em presença de nu- cleotídeos e um agente indutor tal como uma DNA polimerase e em uma temperatura adequada e pH. O iniciador pode ser ou de fita simples ou de fita dupla e deve ser suficientemente longo para iniciar a síntese do produto de extensão desejada na presença do agente indutor. O comprimento exato do iniciador dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, fonte do iniciador e uso do método. Por exemplo, para aplicações diagnósticas, dependendo da complexidade da sequência alvo, o oli- gonucleotídeo iniciador tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ele possa conter menos nucleotídeos.

[0157]Os iniciadores aqui são selecionados para serem “substancialmente” complementares a fitas diferentes de uma sequência de DNA alvo particular. Isto significa que os iniciadores devem ser suficientemente complementares para hibridi- zar com suas respectivas fitas. Assim, a sequência iniciadora não precisa refletir a sequência exata do padrão. Por exemplo, fragmento o de nucleotídeo não complementar pode ser ligado a terminação 5’do iniciador, com o resíduo da sequência iniciadora sendo complementar à fita. Alternativamente, bases não complementares ou sequências mais longas podem ser espalhadas no iniciador, provido que a sequência iniciadora tem complementariedade suficiente com a sequência da fita para hibri- dizar com e através desta forma o padrão para a síntese do produto de extensão.

[0158]Como aqui utilizado, os termos “endonucleases de restrição” e “enzimas de restrição” referem-se a enzimas bacterianas, cada uma das quais cortam DNA de fita-dupla em ou perto da sequência nucleotídica específica.

[0159]Cada célula tem sido “transformada” por DNA exógeno ou heterólogo quando tal DNA tem sido introduzido dentro da célula. O DNA transformante pode ou não ser integrado (covalentemente ligado) no DNA cromossomal ajustando o geno- ma da célula. Em procariotos, levedura, e células mamíferas, por exemplo, o DNA transformante pode ser mantido em um elemento episomal tal como um plasmídeo. Com respeito às células eucarióticas, uma célula estavelmente transformada é uma em que o DNA transformante se tornou integrado em um cromossomo de forma que ele é herdado pelas células filhas através da replicação cromossomal. Esta estabilidadeé demonstrada pela habilidade da célula eucariótica estabelecer linhagens celulares ou clones compreendidos de uma população de células filhas contendo o DNA transformante. Um “clone” é uma população de células derivadas a partir de uma célula única ou ancestral comum por mitose. Uma “linhagem celular” é um clone de uma célula primária que é capaz de crescer estavelmente in vitro por muitas gerações.

[0160]Duas sequências de DNA são “substancialmente homólogas” quando pelo menos cerca de 75% (preferivelmente pelo menos cerca de 80%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 ou 95%) dos nucleotídeos combinam em um comprimento definido das sequências de DNA. Sequências que são substancialmentehomólogas podem ser identificadas por comparação das sequências usando programapadrão disponível em bancos de dados de sequências, ou em um experimento de hibridização Southern sob, por exemplo, condições severas como definido para este sistema particular. Definir condições de hibridização apropriadas está dentro da técnica. Ver, por exemplo, Maniatis et ao, acima; DNA Cloning, Vols. I & II, acima; Nucleic Acid Hybridization, acima.

[0161]Deve ser apreciado que também dentro do objetivo da presente invenção são sequências DNA codificando membros de ligação específica (anticorpos) da invenção que codificam para anticorpos tendo as sequências reveladas, mas que são degeneradas para tais sequências. Por “degenerado a” é entendido que um có- don de três-letras diferente é utilizado para especificar um aminoácido particular. É bem conhecido na técnica que os seguintes códons podem ser utilizados de forma passível de mudança para codificar para cada aminoácido específico:

[0162]Deve ser entendido que os códons especificados acima são para se-quências RNA. Os códons correspondentes para DNA têm uma T substituído por U.

[0163]Mutações podem ser feitas em, por exemplo, as sequências reveladas de anticorpos da presente invenção, tal que um códon particular é mudado para um códon que codifica para um aminoácido diferente. Tal uma mutação é geralmente feita por fazer poucas mudanças nucleotídicas possíveis. Uma mutação de substituição deste tipo pode ser feita para mudar um aminoácido na proteína resultante em uma forma não conservada (isto é, por mudar o códon a partir de aminoácido pertencendo a um grupo de aminoácidos tendo um tamanho particular ou característica a um aminoácido pertencendo a outro grupo) ou em uma forma conservada (isto é, por mudança do códon a partir de um aminoácido pertencendo a um grupo de ami- noácidos tendo um tamanho ou característica particular a um aminoácido pertencendo ao mesmo grupo). Tal mudança conservada geralmente leva a menos mudança na estrutura e função da proteína resultante. Uma mudança não conservada é mais provavelmente para alterar a estrutura, atividade ou função da proteína resultante. A presente invenção deve ser considerada para incluir sequências contendo mudanças conservadas que não alteram significantemente a atividade ou ligação características da proteína resultante.

[0164]O seguinte é um exemplo de vários grupos de aminoácidos:

[0165]Aminoácidos com grupos R não polares Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptofano, Metio- nina

[0166]Aminoácidos com grupos R polares não carregados Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina, Glutamina

[0167]Aminoácidos com grupos R polares carregados (negativamente carregados a pH 6.0) Ácido aspártico, ácido glutâmico

[0168]Aminoácidos básicos (positivamente carregado a pH 6.0) Lisina, Arginina, Histidina (no pH 6.0)

[0169]Outro grupo pode ser aqueles aminoácidos com grupos fenila: Fenilalanna, Triptofano, Tirosina

[0170]Outro grupo pode ser de acordo com o peso molecular (isto é, tamanho dos grupos R): Glicina75 Alanina89 Serina105 Prolina115 Valina117 Treonina119 Cisteína121 Leucina131 Isoleucina131 Asparagina 132 Ácido aspártico133 Glutamina146 Lisina146 Ácido glutâmico 147 Metionina149 Histidina 155 Fenilalanina165 Arginina174 Tirosina181 Triptofano204 Substituições particularmente preferidas são: - Lys para Arg e vice versa tal que uma carga positiva pode ser mantida; - Glu para Asp e vice versa tal que uma carga negativa pode ser mantida; - Ser para Thr tal que uma -OH livre pode ser mantida; e - Gin para Asn tal que um NH2 livre pode ser mantido.

[0171]Substituições de aminoácidos podem também ser introduzidas para substituir um aminoácido com uma propriedade particularmente preferida. Por exemplo, um Cys pode ser introduzido em um sítio potencial para pontes dissulfeto com outro Cys. Uma His pode ser introduzida como um sítio particularmente “catalítico” (isto é, His pode atuar como um ácido ou base e é o mais comum aminoácido na catálise bioquímica). Pro pode ser introduzida por causa de sua estrutura particularmente planar, a qual induz 3-voltas na estrutura da proteína.

[0172]Duas sequências de aminoácidos são “substancialmente homólogas” quando pelo menos 70% dos resíduos aminoácidos (preferivelmente pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 90 ou 95%) são idênticos, ou representam substituições conservadas.

[0173]Uma região “heteróloga” da construção de DNA é um segmento identi-ficável de DNA dentro de uma molécula de DNA maior que não é encontrada em associação com a molecula maior na natureza. Então, quando a região heteróloga codifica um gene mamífero, o gene será usualmente flanqueado por DNA que não flanqueia o DNA genômico mamífero no genoma do organismo fonte. Outros exemplos de uma sequência heteróloga codificante é uma construção onde a sequência codificante por si não é encontrada na natureza (por exemplo, um cDNA onde a se- quência codificante genômica contém íntrons, ou sequências sintéticas tendo có- dons diferentes que o gene nativo). Variações alélicas ou eventos mutacionais de ocorrência natural não dão aumento a uma região heteróloga de DNA como aqui definido.

[0174]A frase “farmaceuticamente aceitável” refere-se a uma entidade molecular e composições que são fisiologicamente toleráveis e não produzem tipicamente uma reação alérgica ou desagradável similar, tal como distúrbio gástrico, vertigem e semelhantes, quando administrado a um humano.

[0175]A frase “quantidade terapeuticamente efetiva” é usada aqui para significar uma quantidade suficiente para prevenir, e preferivelmente reduzir por pelo menos cerca de 30 por cento, preferivelmente por pelo menos 50 por cento, preferivelmente por pelo menos 70 por cento, preferivelmente por pelo menos 80 por cento, preferivelmente por pelo menos 90%, uma mudança clinicamente significante no crescimento ou progressão ou atividade mitótica de uma massa celular alvo, grupo de células cancerosas ou tumor, ou outra característica da patologia. Por exemplo, o grau de ativação EGFR ou atividade ou quantidade ou número de células EGFR positivas, particularmente do anticorpo ou membro de ligação reativo ou células positivas podem ser reduzidas.

[0176]A sequência de DNA é “operativamente ligada” a uma expressão de sequência controle quando a expressão da sequência controle controla e regula a transcrição e tradução desta sequência de DNA. O termo “operativamente ligado” inclui ter um sinal de partida apropriado (por exemplo, ATG) na frente da sequência de DNA a ser expressa e mantendo a estrutura de leitura correta para permitir a expressão da sequência de DNA sob o controle da expressão da sequência controle e produção do produto desejado codificado pela sequência de DNA. Se um gene que um deseja inserir em uma molécula de DNA recombinante não contém um sinal de partida apropriado, tal sinal de partida pode ser inserido na frente do gene.

[0177]O termo “condições de hibridização padrão” refere-se ao sal e condições de temperatura substancialmente equivalentes a 5x SSC e 65 oC para ambos, hibridização e lavagem. Entretanto, um versado na técnica apreciará que tais “condições de hibridização padrões” são dependentes de condições particulares incluindo a concentração de sódio e magnésio no tampão, comprimento e concentração da sequência nucleotídica, porcentagem de má combinação, porcentagem de formami- da, e semelhantes. Também importante na determinação de “condições de hibridi- zação padrões” é se as duas sequências hibridizadas são RNA-RNA, DNA-DNA ou RNA-DNA. Tais condições de hibridização padrões são facilmente determinadas por um versado na técnica de acordo com fórmulas bem conhecidas, em que a hibridi- zação é tipicamente 10-20 oC abaixo da predita ou Tm determinada com lavagens de alto rigor, se desejado.

[0178]A presente invenção provê um novo membro de ligação específico, particularmente um anticorpo ou fragmento o do mesmo, incluindo fragmento os imunogênicos, que reconhecem um epítopo EGFR que é encontrado em células tu- morigênicas, hiperproliferativas ou anormais em que o epítopo é aumentado ou evidente sob modificação pós-traducional aberrante e não detectável em células normais ou selvagens. Em uma particular, mas não limitante modalidade, o membro ligante, tal como o anticorpo, reconhece um epítopo EGFR que é aumentado ou evidente sob modificação de carboidrato simples ou glicosilação precoce e é reduzido ou não evidente em presença da modificação ou glicosilação de carboidrato complexo. O membro de ligação específica, tal como o anticorpo ou fragmento o do mesmo, não se liga ou reconhece células normais ou selvagens contendo epítopo EGFR normal ou selvagem em ausência de super expressão e em presença de modificação pós-traducional de EGFR.

[0179]A presente invenção ainda provê novos anticorpos 806, 175, 124, 1133, ch806 e hu806 e fragmento os dos mesmos, incluindo fragmento os imunogê- nicos, que reconhecem um epítopo EGFR, particularmente o peptídeo EGFR (287CGADSYEMEEDGVRKC302 (SEQ ID NO:14)), que é exposto em células tumori- gênicas, hiperproliferativas ou anormais, em que o epítopo é aumentado, revelado, ou evidente e não detectável em células normais ou selvagens. Em uma modalidade particular não limitante, o anticorpo reconhece um epítopo EGFR que é aumentada ou evidente sob modificação de carboidrato simples ou glicosilação precoce e é reduzida ou não evidente na presença da modificação ou glicosilação de carboidrato complexo. O anticorpo ou fragmento o do mesmo não liga ou reconhece células normais ou selvagens contendo epítopo EGFR normal ou selvagem em ausência de super expressão, amplificação, ou um evento tumorigênico.

[0180]Em um aspecto particular da invenção e como declarado acima, os presentes inventores têm descoberto os novos anticorpos monoclonais 806, 175, 124, 1133, ch806 e hu806 que reconhecem especificamente EGFR selvagem amplificado e o de2-7 EGFR, ainda se liga a um epítopo distinto a partir do peptídeo jun- cional único da mutação de2-7 EGFR. Adicionalmente, enquanto mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, e hu806 não reconhecem EGFR selvagem expresso na superfície celular de células de glioma, eles ligam ao domínio extracelular de EGFR imobilizado na superfície de placas de ELISA, indicando um epítopo conformacional com um aspecto polipeptídico.

[0181]Importantemente, mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, ch806 e hu806 não se ligam significantemente aos tecidos normais tais como fígado e pele, que expressam níveis de wtEGFR endógenos que são mais altos que na maioria dos tecidos normais, mas em que EGFR não é super expresso ou amplificado. Então, mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, e hu806 demonstram nova e útil especificidade, reconhecendo de2-7 EGFR e EGFR amplificado, enquanto Não reconhecem EGFR normal, selvagem ou o peptídeo juncional único que é característico de de2-7 EGFR. Em um aspecto preferido mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, e hu806 da presente invenção compreende sequências de aminoácidos de domínio CDR de cadeia VP e VL descritas nas FIGS. 14B e 15B; 74B e 75B; 51B e 51D; 52B e 52D; e 55A e 55B, respectivamente (SEQ ID NOS:2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respectivamente; SEQ ID NO:42 incluindo o peptídeo sinal de cadeia VP e sequências de cadeia VP de SEQ ID NOS:163 e 164, respectivamente, e SEQ ID NO:47 incluindo o peptídeo sinal de cadeia VL hu806 e sequências de cadeia VL de SEQ ID NOS: 165 e 166, respectivamente).

[0182]Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo capaz de competir com o anticorpo 175, sob condições em que pelo menos 10% de um anticorpo tendo as sequências de cadeia VP e VL do anticorpo 175 (SEQ ID NOS: 129 e 134, res-pectivamente)é bloqueado a partir da ligação ao de2-7 EGFR por competição com tal um anticorpo em um ensaio ELISA. Como revelado acima, anticorpos anti- idiotipos são aqui contemplados.

[0183]A presente invenção relaciona-se a membros de ligação específica, particularmente anticorpos ou fragmento os dos mesmos, que reconhecem um epí- topo EGFR que está presente em células expressando EGFR amplificado ou expressando o de2-7 EGFR e não detectável em células expressando EGFR normal ou selvagem, particularmente em presença de modificação pós-traducional normal.

[0184]É ainda notado e aqui demonstrado que uma observação não limitante adicional ou característica dos anticorpos da presente invenção é seu reconhecimento do seu epítopo em presença de grupos de alta manose, que é uma característica de glicosilação precoce ou modificação de carboidrato simples. Então, glicosi- lação alterada ou aberrante facilita a presença e/ou reconhecimento do anticorpo epítopo ou compreende uma porção do anticorpo epítopo.

[0185]Glicosilação inclui e compreende a modificação pós-traducional de proteínas, glicoproteínas denominadas pela adição de oligossacarídeos. Oligossaca- rídeos são adicionados à sítios de glicosilação em glicoproteínas, particularmente incluindo oligossacarídeos N-ligados e oligossacarídeos 0-ligados. Oligossacarídeos N-ligados são adicionados a um resíduo Asn, particularmente em que o resíduo Asn está na sequência N-X-S/T, onde X não pode ser Pro ou Asp, e são os mais comuns encontrados em glicoproteínas. Na biossíntese de glicoproteínas N-ligadas, um oli- gossacarídeo tipo alta manose (geralmente compreendido de dolicol, N- acetilglicosamina, manose e glicose é primeiro formado no retículo endoplasmático (RE). As glicoproteínas tipo alta manose são então transportadas a partir do RE para o Golgi, onde processamento e modificação adicional dos oligossacarídeos normalmente ocorrem. Oligossacarídeos 0-ligados são adicionados ao grupo hidroxila de resíduos Ser ou Thr. Em oligossacarídeos 0-ligados, N Acetilglicosamina é primeiro transferida ao resíduo Ser ou Thr por N Acetilglicosaminiltransferase no RE. A proteína então move o Golgi onde modificação e alongamento de cadeia adicional ocorre.

[0186]Em um aspecto particular da invenção e como declarado acima, os presentes inventores têm descoberto novos anticorpos monoclonais, exemplificados aqui pelos anticorpos designados mAb806 (e seu ch806 quimérico), mAb175, mAb124, mAb1133 e hu806 que reconhecem especificamente EGFR selvagem amplificado e o de2-7 EGFR, ainda se liga a um epítopo distinto a partir do peptídeo juncional único da mutação de2-7 EGFR. Os anticorpos da presente invenção especificamente reconhecem EGFR super expresso, incluindo EGFR amplificado e EGFR mutante (exemplificado aqui pela mutação de2-7), particularmente sob modificação pós-traducional aberrante. Adicionalmente, enquanto esses anticorpos não reconhecem o EGFR normal, selvagem expresso na superfície da célula de células de glioma, eles se ligam ao domínio extracelular do EGFR imobilizado na superfície de placas de ELISA, indicando um epítopo conformacional com um aspecto polipeptídico. Importantemente, esses anticorpos não se ligam significantemente a tecidos normais tais como fígado e pele, que expressam níveis de wtEGFR endógenos que são maiores que na maioria de outros tecidos normais, mas em que EGFR não é super ex- presso ou amplificado. Então, esses anticorpos demonstram nova e útil especificidade, reconhecendo de2-7 EGFR e EGFR amplificado, enquanto não reconhecendo EGFR normal, selvagem ou o peptídeo juncional único que é característico de de2-7 EGFR.

[0187]Em um aspecto preferido, os anticorpos são uns que têm as características dos anticorpos que os inventores têm identificado e caracterizado, em particular reconhecendo EGFR amplificado e de2-7 EGFR. Em aspectos particularmente preferidos, os anticorpos são mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, e hu806 ou fragmento os ativos dos mesmos. Em um aspecto ainda preferido o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos de cadeia VP e VL descritas nas FIGS. 16 e 17; 74B e 75B; 51B e 51D; 52B e 52D; e 55A e 55B, respectivamente.

[0188]Preferivelmente o epítopo do membro de ligação específico ou anticorpoé localizado dentro da região compreendendo de resíduos 273-501 da sequência EGFR normal ou selvagem madura, e preferivelmente o epítopo compreenderesíduos 287-302 da sequência EGFR normal ou selvagem madura (SEQ ID NO:14). Assim, também provido são proteínas de ligação específica, tal como anticorpos, que se ligam ao de2-7 EGFR em um epítopo localizado dentro da região compreendendo resíduos 273-501 da sequência EGFR, e compreendendo resíduos 287-302 da sequência EGFR (SEQ ID NO:14). O epítopo pode ser determinado por qualquer epítopo convencional mapeando técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Alternativamente, as sequências de DNA codificando resíduos 273-501 e 287-302 (SEQ ID NO:14) podem ser digeridos, e os fragmento os resultantes expressos em um hospedeiro adequado. Ligação de anticorpo pode ser determinada como mencionado acima.

[0189]Em particular, o membro se ligará a um epítopo compreendendo resíduos 273-501, e mais especificamente compreendendo resíduos 287-302 (SEQ ID NO:14), do EGFR normal ou selvagem maduro. Entretanto outros anticorpos que mostram o mesmo ou um padrão substancialmente similar de reatividade também formam um aspecto da invenção. Isto pode ser determinada por comparação de tais membros com um anticorpo compreendendo os domínios de cadeia VP e VL mostrados nas SEQ ID NOS: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respectivamente. A comparação será tipicamente feita usando Western blot em que membros de ligação são ligados às duplicatas dos blots preparadas a partir de uma preparação nuclear de células de forma que o padrão de ligação pode ser diretamente comparado.

[0190]Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo capaz de competir com mAb806 sob condições em que pelo menos 10% de um anticorpo tendo sequências de cadeia VP e VL de um de tais anticorpos é bloqueado a partir da ligação a de2-7 EGFR por competição com tal um anticorpo em um ensaio de ELISA. Como revelado acima, anticorpos anti-idiotipo são contemplados e são ilustrados aqui.

[0191]Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo capaz de competir com mAb175, mAb124, e/ou mAb1133 sob condições em que pelo menos 10% de um anticorpo tendo as sequências de cadeia VP e VL de um de tais anticorpos é bloqueado a partir da ligação ao de2-7 EGFR por competição com tal um anticorpo em um ensaio de ELISA. Como revelado acima, anticorpos anti-idiotipo são contemplados e são aqui ilustrados.

[0192]Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo capaz de competir com mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 e/ou hu806, sob condições em que pelo menos 10% de um anticorpo tendo sequências de cadeia VP e VL de um de tais anticorposé bloqueado a partir da ligação ao de2-7 EGFR por competição com um tal anticorpo em um ensaio de ELISA. Como revelado acima, anticorpos anti-idiotipo são contemplados e são aqui ilustrados.

[0193]Um polipeptídeo isolado consistindo essencialmente do epítopo com- preendendo resíduos 273-501 e mais especificamente compreendendo resíduos 287-302 (SEQ ID NO:14) do EGFR selvagem maduro forma outro aspecto da presente invenção. O peptídeo da invenção é particularmente útil em ensaios ou kits de diagnóstico ou terapeuticamente ou profilaticamente, incluindo como uma vacina antitumor ou anticâncer. Então, composições do peptídeo da presente invenção incluemcomposição farmacêutica e composições imunogênicas.

Usos Diagnósticos e Terapêuticos

[0194]A especificidade única dos membros de ligação específica, particularmente anticorpos ou fragmento os dos mesmos, da presente invenção, segundo a qual o(s) membro(s) de ligação reconhece um epítopo EGFR que é encontrado em células tumorigênicas, hiperproliferativas ou anormais e não detectáveis em células normais ou selvagens e em que o epítopo é aumentado ou evidente sob modificação pós-traducional aberrante e em que o(s) membro(s) se ligam ao de2-7 EGFR e EGFR amplificado, mas não ao wtEGFR, provê usos diagnósticos e terapêuticos para identificar, caracterizar, alvejar e tratar, reduzir ou eliminar um número de tipos de células tumorigênicas e tipos de tumores, por exemplo, tumores de cabeça e pescoço, mama, pulmão, bexiga ou próstata e glioma, sem os problemas associados com captação de tecido normal que podem ser vistos com anticorpos EGFR previamente conhecidos. Então, células super expressando EGFR (por exemplo, por amplificação ou expressão de um mutante ou variante EGFR), particularmente aquelas demonstrando modificação pós-traducional aberrante podem ser reconhecidas, isoladas, caracterizadas, alvejadas e tratadas ou eliminadas utilizando o(s) membro(s) de ligação, particularmente anticorpo(s) ou fragmento os dos mesmos da presente invenção.

[0195]Em um aspecto adicional da invenção, é provido um método de tratamento de um tumor, uma condição cancerosa, uma condição pré-cancerosa, e qualquer condição relacionada a ou resultante a partir do crescimento de célula hiperpro- liferativa compreendendo administração de mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, e/ou hu806.

[0196]Os anticorpos da presente invenção podem então especificamente ca-tegorizar a natureza de tumores EGFR ou células tumorigênicas, por coloração ou de outra forma reconhecimento daqueles tumores ou células em que super expressão de EGFR, particularmente amplificação e/ou mutação EGFR, particularmente de2-7EGFR, está presente. Ainda, os anticorpos da presente invenção, como exemplificado por mAb806 (e anticorpo quimérico ch806), mAb175, mAb124, mAb1133, e hu806, demonstram significante atividade anti-tumor in vivo contra tumores contendo EGFR amplificado e contra xenotransplantes de2-7 EGFR positivos.

[0197]Como ressaltado acima, os inventores têm encontrado que o membro de ligação específica da invenção reconhece formas associadas a tumor de EGFR (de2-7 EGFR e EGFR amplificado), mas não o receptor normal, selvagem quando expresso em células normais. É acreditado que reconhecimento de anticorpo é dependente sob uma modificação pós-traducional aberrante (por exemplo, uma glicosi- lação única, acetilação ou fosforilação variante) do EGFR expresso em células exibindo super expressão do gene EGFR.

[0198]Como descrito abaixo, anticorpos da presente invenção têm sido utilizados nos estudos terapêuticos e mostrados inibir crescimento de xenotransplantes com EGFR super expressos (por exemplo, amplificados) e xenotransplantes expressando de2-7 EGFR humano de tumores humanos e para induzir necrose significante dentro de tais tumores.

[0199]Além disso, os anticorpos da presente invenção inibem o crescimento de tumores intracranianos em um modelo preventivo. Este modelo envolve injeção de células de glioma expressando de2-7 EGFR em camundongos nude e então injetando o anticorpo intracranialmente ou no mesmo dia ou dentro de 1 a 3 dias, opcionalmente com doses repetidas. As doses de anticorpo são adequadamente cerca de 10 μg. Camundongos injetados com anticorpo são comparados aos controles, e tem sido encontrado que a sobrevivência dos camundongos tratados é significantemente aumentada.

[0200]Além disso, em um aspecto adicional da invenção, é provido um método de tratamento de um tumor, uma condição cancerosa, uma condição pré- cancerosa, e qualquer condição relacionada a ou resultante a partir de crescimento hiperproliferativo celular compreendendo administração de um membro de ligação específico da invenção.

[0201]Anticorpos da presente invenção são desenhados para serem utilizados em métodos de diagnóstico e tratamento de tumores em pacientes humanos ou animais, particularmente tumores epiteliais. Esses tumores podem ser tumores sólidos primários ou secundários de qualquer tipo, incluindo, mas não limitados a, glioma, tumores de mama, pulmão, próstata, cabeça ou pescoço.

Geração de Membro de Ligação e Anticorpo

[0202]A metodologia geral para fazer anticorpos monoclonais pode hibrido- mas é bem conhecida. Linhagens celulares produtoras de anticorpo imortais podem também ser criadas por técnicas outras que fusão, tais como transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammering et al., "Monoclonal Antibodies And T cell Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980); ver também Patente dos EUA Nos. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.32; e 4.493.890.

[0203]Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra EGFR podem ser selecionados por várias propriedades; isto é, isotipo, epítopo, afinidade etc. De interesse particular são anticorpos monoclonais que mimetizam a atividade de EGFR ou suas subunidades. Tais monoclonais podem ser facilmente identificados em ensaios de atividade de membro de ligação específica. Anticorpos de alta afinidade são também úteis quando purificação de imunoafinidade do membro de ligação específica nativo ou recombinante é possível.

[0204]Métodos para produzir anticorpos anti-EGFR policlonais são bem co-nhecidos na técnica. Ver, Patente dos EUA No. 4.493.795 para Nestor et al. A monoclonal antibody, typically containing Fab and/or F (ab') 2 portions of useful antibody molecules, can be prepared using the hybridoma technology described in Antibodies- A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1988), é aqui incorporado por referência. Brevemente, para formar o hibri- doma a partir do qual a composição de anticorpo monoclonal é produzida, um mi- eloma ou outra linhagem celular auto-perpertuante é fusionada com linfócitos obtidos a partir de baço de um mamífero hiper imunizado com um EGFR apropriado.

[0205]Esplenócitos são tipicamente fusionados com células de mieloma usando polietileno glicol (PEG) 6000. Híbridos fusionados são selecionados por sua sensibilidade a HAT. Hibridomas produzindo um anticorpo monoclonal útil na preparação desta invenção são identificados por sua habilidade de imunoreagir com o presente anticorpo ou por ligar membros e sua habilidade de inibir atividade tumori- gênica ou hiper proliferativa especificada em células alvos.

[0206]Um anticorpo monoclonal útil na prática da presente invenção pode ser produzido por iniciar uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que secreta moléculas de anticorpo de espe-cificidadeantigênica apropriada. A cultura é mantida sob condições e por um período de tempo suficiente para o hibridoma secretar as moléculas de anticorpo no meio. O meio contendo anticorpo é então coletado. As moléculas de anticorpo podem então ainda serem isoladas por técnicas bem conhecidas.

[0207]Meios úteis para a preparação dessas composições são ambos bem conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis e incluem meio de cultura sintético, camundongos isogênicos e semelhantes. Um medio sintético exemplar é o meio essencial mínimo da Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al, Virol. 8:396 (1959)) suplementado com 4,5 gm/1 glicose, 20 mm glutamina, e 20% de soro fetal bovino. Uma cepa de camundongo isogênico exemplar é o Balb/c.

[0208]Métodos para produção de anticorpos anti-EGFR monoclonais são também bem conhecidos na técnica. Ver, Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983). Tipicamente, o EGFR ou um peptídeo análogo é usado ou sozinho ou conjugado a um veículo imunogênico, como o imunógeno no procedimento descrito antes para produção de anticorpos monoclonais anti-EGFR. Os hibri- domas são selecionados pela habilidade de produzir um anticorpo que imunoreage com o presente EGFR nas células tumorigênicas, anormais ou hiperproliferativas. Outros anticorpos anti-EGFR incluem, mas não são limitados a anticorpo Hu-MAX- EGFr de Genmab/Medarex, o anticorpo 108 (ATCC HB9764) e Patente dos EUA No. 6.217.866, e anticorpo 14E1 a partir de Schering AG (Patente dos EUA No. 5.942.602).

Membros de Ligação Recombinantes, Quiméricos, Biespecíficos e Fragmento os

[0209]Em geral, regiões CDR1, compreendendo sequências de aminoácidos substancialmente como mostrado como as regiões CDR1 das SEQ ID NOS: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respectivamente, serão carreadas em uma estrutura que permite a ligação das regiões CDR1 ao antígeno tumoral. No caso da região CDR1 da SEQ ID NO:4, por exemplo, é preferivelmente carreada pela região de cadeia VL da SEQ ID NO:4 (e similarmente para outras sequências recitadas).

[0210]Em geral, regiões CDR2, compreendendo sequências de aminoácidos substancialmente como mostrado como as regiões CDR2 das SEQ ID NOS: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respectivamente, serão carreadas em uma estrutura que permite a ligação das regiões CDR2 ao antígeno tumoral. No caso da região CDR2 da SEQ ID NO:4, por exemplo, é preferivelmente carreada pela região de cadeia VL da SEQ ID NO:4 (e similarmente para outras sequências recitadas).

[0211]Em geral, regiões CDR3, compreendendo sequências de aminoácidos substancialmente como mostrado como as regiões CDR3 das SEQ ID NOS: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respectivamente, serão carreadas em uma estrutura que permite a ligação das regiões CDR3 ao antígeno tumoral. No caso da região CDR3 da SEQ ID NO:4, por exemplo, é preferivelmente carreada pela região de cadeia VL da SEQ ID NO:4 (e similarmente para outras sequências recitadas).

[0212]Por “substancialmente mostrado” é significado que as regiões CDR, por exemplo, regiões CD3, da invenção serão ou idênticas ou altamente homólogas para as regiões especificadas das SEQ ID NOS: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respectivamente. Por “altamente homóloga” é contemplado que somente umas poucas substituições, preferivelmente a partir de 1 a 8, preferivelmente a partir de 1 a 5, preferivelmente a partir de 1 a 4, ou a partir de 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas em um ou mais dos CDRs. É também contemplado que tais termos incluem truncações dos CDRs, enquanto o anticorpo resultante exibe as propriedadesúnicas da classe de anticorpos aqui discutida, como exibido por mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 e hu806.

[0213]A estrutura para carrear os CDRs da invenção, em particular CDR3, será geralmente de uma sequência de cadeia pesada ou leve de anticorpo ou porção substancial da mesma em que as regiões CDR são localizadas em locações correspondendo a região CDR de domínios variáveis de anticorpo de cadeia VP e VL de ocorrência natural codificados por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e localizações dos domínios variáveis de imunoglobulinas podem ser determinadas por referência a Kabat, E. A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987, e atualizações do mesmo, agora diponível na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)). Além disso, como são conhecidas por aqueles versados na técnica, determinações CDR podem ser feitas em de várias formas. Por exemplo, Kabat, Chothia e análises de determinação de domínio combinado podem ser utilizadas. Neste respeito, ver, por exemplo, http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid.

[0214]Preferivelmente, as sequências de aminoácidos substancialmente como iniciadas como resíduos CDR de cadeia VP nos anticorpos inventivos estão em um domínio variável da cadeia pesada humana ou uma porção substancial do mesmo, e as sequências aminoiácidas substancialmente iniciadas como os resíduos CDR de cadeia VL nos anticorpos inventivos estão em um domínio variável de cadeia leve humana ou uma porção substancial do mesmo.

[0215]Os domínios variáveis podem ser derivados a partir de qualquer domí-niovariável humano de linha germinativa ou rearranjado, ou podem ser um domínio variável sintético baseado nas sequências consenso dos domínios variáveis humanos conhecidos. As sequências derivadsa de CDR3 da invenção, por exemplo, como definido no parágrafo precedente, podem ser introduzidas em um repertório de domínios variáveis faltando regiões CDR3, usando tecnologia de DNA recombinante.

[0216]Por exemplo, Marks et al (Bio/Technology, 1992,10:779-783) descreve métodos de produzir repertórios de domínios variáveis de anticorpo em que os iniciadores consensus direcionados a ou adjacentes a terminação 5’ da área de domínio variável são utilizados em conjunção com iniciadores consensus para a terceira região estrutural dos genes VP humanos para prover um repertório de domínios variáveis VP faltando um CDR3. Marks et al ainda descrevem como este repertório pode ser combinado com um CDR3 de um anticorpo particular. Usando técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser misturadas com repertórios de domínios VP e VL faltando um CDR3, e a mistura completa de domínios VP ou VL combinados com um domínio VL ou VP cognato provê membros de ligação específica da invenção. O repertório pode então ser mostrado em um sistema hospedeiro adequado tal como o sistema revelado fago de WO092/01047 de forma que membros de ligação específica adequados podem ser selecionados. Um repertório pode consistir a partir de qualqur um a partir de 104de membros individuais ou mais, por exemplo, a partir de 106a 108ou 1010membros.

[0217]Análogos misturados ou técnicas combinatoriais são também revelados por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), que descreve a técnica em relação a um gene p-lactamase, mas observa que a abordagem pode ser utilizada para a geração de anticorpos.

[0218]Uma alternativa adicional é para gerar regiões VP ou VL carreando as sequências detivadas de CDR3 da invenção utilizando mutagênese aleatória de, por exemplo, os genes mAb806 VP ou VL para gerar mutações dentro do domínio variável inteiro. Tal técnica é descrita por Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580), que usou PCR mutagênico.

[0219]Outro método que pode ser utilizado é para direcionar mutagênese para regiões CDR de genes VP ou VL. Tais técnicas são reveladas por Barbas et al, (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) e Schier et al. (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).

[0220]Todas as técnicas descritas acima são conhecidas como tais na técnica e por elas mesmas não fazem parte da presente invenção. Os versados na técnicaserão capazes de usar tais técnicas para prover membros de ligação específicos da invenção usando metodologia de rotina na técnica.

[0221]Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina compreenderá pelo menos três regiões CDR, junto com suas regiões estruturais se-paradas. Preferivelmente, a porção também incluirá pelo menos 50% de uma ou ambas da primeira e quarta região estrutural, o 50% sendo 50% C-terminal da primeiraregião estrutural e 50% N-terminal da quarta região estrutural. Resíduos adicionais na terminação N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável pode ser aquele não normalmente associado com regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, construção de membros de ligação específica da presente invenção feitos por técnicas de DNA recombinante podem resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais por ligadores introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Outros passos de manipulação incluem a introdução de ligadores para juntar domínios variáveis da invenção para sequências protêicas adicionais incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de anticorpos bivalentes) ou proteínas marcadas como discutido em mais detalhes abaixo.

[0222]Embora em um aspecto preferido da invenção membros de ligação específica compreendendo um par de domínios de ligação baseados em sequências substancialmente demonstrado nas SEQ ID NOS: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respectivamente, são preferidos, domínios de ligação única baseados nas sequências formam aspectos adicionais da invenção. No caso de domínios de ligação baseados na sequência substancialmente apresentada nas cadeias VP, tais domínios de ligação podem ser usados como agentes alvo para antígenos tumorais, desde que é conhecido que domínios VP de imunoglobulina são capazes de ligar antígenos alvo de ligação em uma forma específica.

[0223]No caso de cada um dos domínios de ligação específica de cadeia única, esses domínios podem ser utilizados para selecionar domínios complementares capazes de formar um membro de ligação específica de dois domínios que tem propriedades in vivo tão boas como ou iguais aos anticorpos mAb806, ch806, mAb175, mAb124, mAb1133 e hu806 aqui revelados.

[0224]Isto pode ser alcançado por métodos de seleção de exibição de fago usando a assim chamada abordagem combinatorial dupla hierárquica como revelado na Patente dos EUA 5.969.108 em que a colônia individual contendo ou um clone de cadeia P ou L é utilizado para infectar uma biblioteca completa de clones codificando a outra cadeia (L ou P) e o membro de ligação de duas cadeias resultante é selecio- nado de acordo com técnicas de exibição de fago tais como aquelas descritas nesta referência. Esta técnica é também revelada em Marks et al, ibidem.

[0225]Membros de ligação específica da presente invenção podem ainda compreender regiões constantes de anticorpo ou partes dos mesmos. Por exemplo, membros de ligação específica baseados nas sequências de cadeia VL podem ser ligados a sua terminação C-terminal para domínios constantes de cadeia leve incluindo cadeias CK de CÀ, preferivelmente cadeias CÁ. Similarmente, membros de ligação específica baseados em sequências de cadeia VP podem ser ligados a sua terminação C-terminal a toda ou parte de uma cadeia pesada de imumoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM e qualquer das sub-classes de isotipos, particularmente IgG1, IgG2, e IgG4. IgG1 é preferida.

[0226]O advento da tecnologia do anticorpo monoclonal (mAb) 25 anos atrás tem provido um enorme repertório de reagentes de pesquisa úteis e criaram a oportunidade de usar anticorpos como reagentes farmacêuticos aprovados em terapia de câncer, distúrbios autoimunes, rejeição de transplante, profilaxia antiviral e anti- trombóticos (Glennie e Johnson, 2000). A aplicação de engenharia molecular para converter mAbs murinos em mAbs quiméricos (região V de camundongo, região C humana) e reagentes humanizados onde somente as regiões determinantes de complementariedade de mAb (CDR) são de origem murina tem sido críticas para o sucesso clínico da terapia de mAb. A engenharia de mAbs têm acentuadamente imunogenicidade reduzida ou ausente, meia vida sérica aumentada e a porção Fc humana do mAb aumenta o potencial de recrutar os efetores imunes do complemento e células citotóxicas (Clark 2000). Investigações em biodistribuição, farmacocinéti- ca e qualquer indução de uma resposta imune para mAbs clinicamente administrados requerem o desenvolvimento de análises para discriminar entre as proteínas farmacêuticas e endógenas.

[0227]Os anticorpos, ou quaisquer fragmento os dos mesmos, podem também ser conjugados ou recombinantemente fusionados a qualquer toxina celular, bactéria ou outro, por exemplo, exotoxina de pseudomonas, ricina, ou toxina diftéri- ca. A parte da toxina utilizada pode ser a toxina inteira, ou qualquer domínio particular da toxina. Tais moléculas de anticorpo-toxina têm sido de forma bem sucedida utilizada para alvo e terapia de diferentes tipos de câncer, ver, por exemplo, Pastan, Biochim Biophys Acta. 1997 Oct 24; 1333 (2):C1-6; Kreitman et al., N. Engl. J. Med. 2001 Jul 26; 345 (4):241-7; Schnell et al., Leukemia. 2000 Jan; 14 (1):129-35; Ghetie et al., Mol. Biotechnol. 2001 Jul; 18 (3):251-68.

[0228]Multímeros bi- e tri-específicos podem ser formados por associação de diferentes moléculas scFv e têm sido desenhados como reagentes de ligação cruzada para recrutamento de célula T em tumores (imunoterapia), redirecionamento viral (terapia viral) e como reagentes de aglutinação de hemácias (imunodiagnósticos), ver por exemplo, Todorovska et al., J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1; 248 (1-2):47- 66; Tomlinson et al., Methods Enzymol. 2000; 326:461-79; McCall et al., J. Immunol. 2001 May 15; 166 (10):6112-7.

[0229]Anticorpos completamente humanos podem ser preparados por imunização de camundongos trangênicos carreando uma grande porção das cadeias pesada e leve da imunoglobulina humana. Esses camundongos, exemplos de tais camundongossão o Xenomouse®(Abgenix, Inc.) (Patente dos EUA Nos. 6.075.181 e 6.150.584), o HuMAb-Mouse®(Medarex, Inc./GenPharm) (Patente dos EUA 5.545.806 e 5.569.825), o Camundongo TransChromo (Kirin) e o Camundongo KM (Medarex/Kirin), são bem conhecidos dentro da técnica.

[0230]Anticorpos podem então ser preparados por, por exemplo, técnica de hibridoma padrão ou por exibição de fago. Esses anticorpos conterão somente sequências de aminoácidos completamente humanas.

[0231]Anticorpos completamente humanos podem também ser gerados usando exibição fago a partir de bibliotecas humanas. Exibição de fago pode ser feita usando métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, como em Hoogen- boom et al. and Marks et al. (Hoogenboom HR e Winter G. (1992) J. Mol. Biol. 227 (2):381-8; Marks JD et al. (1991) J. Mol. Biol. 222 (3):581-97; e também Patentes dos EUA 5.885.793 e 5.969.108).

Anticorpos Terapêuticos e Usos

[0232]As propriedades in vivo, particularmente com respeito a proporção tu- mor:sangue e taxa de depuração, de membros de ligação específica da invenção será pelo menos comparável a mAb806. Seguindo administração a um paciente humano ou animal tal como um membro de ligação específica mostrará um pico da proporção tumor para sangue de > 1:1. Preferivelmente em tal proporção o membro de ligação específica também terá uma proporção de tumor para órgão maior que 1:1, preferivelmente maior que 2:1, mais preferivelmente maior que 5:1. Preferivelmente em tal uma proporção o membro de ligação específica também terá uma proporção órgão para sangue de <1:1 em vias de órgãos a partir do sítio do tumor. Essas proporções excluem órgãos de catabolismo e secreção do membro de ligação específica administrado. Então, no caso de scFvs e Fabs (como mostrado nos exemplos acompanhantes), os membros de ligação são secretados através dos rins e existe uma presença maior aqui que em outros órgãos. No caso das IgGs inteiras, depuração será pelo menos em parte, através do fígado. A proporção da localização do pico do anticorpo intacto será normalmente alcançada entre 10 e 200 horas seguindo a administração do membro de ligação específica. Mais particularmente, a proporção pode ser medida em um tumor xenotransplante de cerca de 0,2-1,0 g formado subcutaneamente em um flanco de um camundongo nude atímico.

[0233]Anticorpos da invenção podem ser marcados com um marcador detec- tável ou funcional. Marcadores detectáveis incluem, mas não são limitados a, radio- marcadores tais como isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, 111In, 211At, 198Au, 67CU, 225Ac, 213Bi, 99Tc e 186Re, que podem ser ligados a anticorpos da invenção usando química convencional conhecida na técnica de imagem de anticorpo. Marcadores também incluem marcadores fluorescentes e marcadores utilizados convencionalmente na técnica para imagem MRI-CT. Eles também incluem marcadores de enzima tal como peroxidase de rábamo silvestre. Marcadores ainda incluem frações químicas tal como biotina que podem detectar através da ligação a uma fração detectável cognata específica, por exemplo, avidina marcada.

[0234]Marcadores funcionais incluem substâncias que são desenhadas para ser alvo no sítio de um tumor para causar destruição do tecido tumoral. Tais marcadores funcionais incluem drogas citotóxicas tais como 5-fluoruracil e enzimas tais como carboxipeptidase bacteriana ou nitroredutase, que são capazes de converter pró-drogas em drogas ativas no sítio de um tumor.

[0235]Também, anticorpos incluindo ambos os anticorpos policlonais e mo- noclonais, e drogas que modulam a produção ou atividade dos membros de ligação específicos, anticorpos e/ou suas subunidades podem possuir certas aplicações di-agnósticase podem, por exemplo, serem utilizados para o propósito de detectar e/ou medir condições tais como câncer, lesões pré-cancerosas, condições relacionadas a ou resultantes a partir de crescimento de célula hiperproliferatica ou semelhantes. Por exemplo, os membros de ligação específica, anticorpos ou suas subu- nidades podem ser utilizados para produzir ambos, anticorpos policlonais e mono- clonais para eles mesmos em uma variedade de meio celular, por técnicas conhecidas tal como utilização de técnica de hibridoma, por exemplo, linfócitos de baço de camundongos fusionados e células de mieloma. Da mesma forma, pequenas moléculas que mimetizam ou antagonizam a atividade(s) dos membros de ligação específica da invenção podem ser descobertos ou sintetizados, e podem ser utilizados nos protocolos de diagnóstico e/ou terapêutico.

[0236]Os membros de ligação específica radiomarcados, particularmente an-ticorpos e fragmento os dos mesmos, são úteis em técnicas de diagnóstico in vitro e em técnicas de radioimagem in vivo e em radioimunoterapia. No exemplo de imagemin vivo, os membros de ligação específica da presente invenção podem ser conjugados a um agente de imagem ao invés de um radioisótipo(s), incluindo, mas não limitado a um agente de aprimoramento da imagem de ressonância magnética, em que, por exemplo, uma molécula de anticorpo é carregada com um número grande de íons paramagnéticos através de grupos quelantes. Exemplos de grupos quelantes incluem EDTA, porfirina, éteres “de coroa” poliaminas e polioximas. Exemplos de íons paramagnéticos incluem gadolínio, ferro, manganês, rênio, euró- pio, lantânio, hólmio e érbio. Em um aspecto adicional da invenção, membros de ligação específica radiomarcada, particularmente anticorpos e fragmento os dos mesmos, particularmente radioimunoconjugados, são úteis em radioimunoterapia, particularmente como anticorpos radiomarcados para terapia de câncer. Em um aspecto ainda adicional, os membros de ligação específica radiomarcados, particularmente anticorpos e fragmento os dos mesmos, são úteis em técnicas de cirurgia ra- dioimuno-guiadas, em que eles podem identificar a presença e/ou localização de células cancerosas, células pré-cancerosas, células tumorais, e células hiperprolife- rativas, antes de, durante ou seguindo cirurgia para remover tais células.

[0237]Imunoconjugados ou proteínas de fusão de anticorpo da presente invenção, em que os membros de ligação específicos, particularmente anticorpos e fragmento os dos mesmos, da presente invenção são conjugados ou ligados a outrasmoléculas ou agentes adicionais incluem, mas não são limitados a, membros de ligação conjugados a um agente de ablação química, toxina, imunomodulador, cito- cina, agente citotóxico, agente quimioterápico ou droga.

[0238]Radioimunoterapia (RAIT) tem entrado na clínica e demonstrado eficácia usando vários anticorpos imunoconjugados. Anticorpo hMN-14 do antígeno anti-carcinoembriônico humanizado (anti-CEA) marcado com 131I tem sido avaliado em câncer cólon-retal (Behr TM et al (2002) Cancer 94 (4 supl): 1373-81) e o mesmo anticorpo com marcador 90Y tem sido avaliado em carcinoma medular da tireóide (Stein R et al (2002) Cancer 94(1):51-61). Radioimunoterapia usando anticorpos monoclonais tem também sido avaliada e relatada para linfoma não Hodgkin e câncerpancreático (Goldenberg DM (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39 (1-2):195-201; Gold DV et al. (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39 (1-2) 147-54). Métodos ra- dioimunoterápicos com anticorpos particulares são também descritos na Patente dos EUA Nos. 6.306.393 e 6.331.175. Cirurgia radioimunoguiada (RIGS) tem também entrado na clínica e demonstrado eficácia e utilidade, incluindo usando anticorpos anti-CEA e anticorpos direcionados contra antígenos tumor-associados (Kim JC et al (2002) Jut. J. Cancer 97(4):542-7; Schneebaum, S. et al. (2001) World J. Surg. 25(12):1495-8; Avital, S. et al. (2000) Cancer 89(8):1692-8; McIntosh DG et al (1997) Cancer Biother. Radiopharm. 12 (4):287-94).

[0239]Anticorpos da presente invenção podem ser administrados a um paciente em necessidade de tratamento através de qualquer via adequada, usualmente por injeção na corrente sanguínea ou CSF, ou diretamente no local do tumor. A dose precisa dependerá do número de fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico ou para tratamento, o tamanho e localização do tumor, a natureza precisa do anticorpo (se anticorpo inteiro, fragmento o, anticorpo bivalente etc), e a natureza do marcador detectável ou funcional ligado ao anticorpo. Onde um radionúcleo é utilizado para terapia, uma dose única máxima adequada é cerca de 45 mCi/m2, a um máximo de cerca de 250 mCi/m2. Dose preferível está na variação de 15 a 40 mCi, com uma variação de dose preferida adicional de 20 a 30 mCi, ou 10 a 30 mCi. Tal terapia pode requerer medula óssea ou substituição de céula tronco. Uma dose de anticorpo típica para ou imagem de tumor ou tratamento de tumor será na variação de cerca de 0,5 a 40 mg, preferivelmente de 1 a 4 mg de anticorpo na forma F(ab’)2. Anticorpos expostos são preferivelmente administrados em doses de 20 a 1000 mg de proteína por dose, ou 20 a 500 mg de proteína por dose, ou 20 a 100 mg de proteína por dose. Esta é uma dose para um tratamento único de um paciente adulto que pode ser proporcionalmente ajustada para crianças e infantes, e também ajustado para outros formatos de anticorpo em proporção ao peso molecular. Tratamentos podem ser repetidos diariamente, duas vezes por semana, semanalmente, ou em intervalos mensais, no entendimento do médico.

[0240]Essas formulações podem incluir uma segunda proteína de ligação, tal como as proteínas de ligação EGFR descritas acima. Em uma forma especialmente preferida, esta segunda proteína de ligação é um anticorpo monoclonal tal como 528 ou 225, discutido abaixo.

Composições Farmacêuticas e Terapêuticas

[0241]Membros de ligação específica da presente invenção serão administrados na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente em adição ao membro de ligação específica.

[0242]Então, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para uso de acordo com a presente invenção, podem compreender, em adição ao ingrediente ativo, um excipiente, veículo, tampão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos pelos versados na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outro material dependerá da rota de administração, que pode ser oral, ou por injeção, por exemplo, intravenosa.

[0243]Composições farmacêuticas para administração oral podem ser na forma de comprimido, cápsula, pó ou líquida. Um comprimido pode compreender um veículo sólido tal como gelatina ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas geralmente compreendem um veículo líquido tal com água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução sacarídea ou glicóis tais como etileno glicol, propileno glicol ou po- lietileno glicol podem ser incluídos.

[0244]Para injeção intravenosa ou injeção no local de aflição, o ingrediente ativo será na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirogênio e tem um pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Aqueles versados relevantes na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactada. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxi- dantes e/ou outros aditivos podem ser inclusos, como requerido.

[0245]Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, terapêuticos ou agentes, ou simultaneamente ou sequencialmente dependente da condição a ser tratada. Em adição, a presente invenção contempla e inclui composições compreendendo o membro ligante, particularmente anticorpo ou fragmento o do mesmo, aqui descrito e outros agentes ou terapêuticos tais como agentes anticâncer ou terapêuticos, hormônios, agentes ou anticorpos an- ti-EGFR, ou moduladores imunes. Mais geralmente esses agentes anticâncer podem ser inibidores da tirosina quinase ou inibidores da cascata de fosforilação, modulado- res pós-traducionais, inibidores do crescimento ou divisão celular (por exemplo, anti- mitóticos), ou inibidores da transdução de sinal. Outros tratamentos ou terapêuticos podem incluir a administração de doses adequadas de drogas de alívio de dor tais como drogas antiinflamatórias não esteroidais (por exemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno ou cetoprofeno) ou opiáceos tal como morfina, ou anti-eméticos. A composição pode ser administrada em conbinação (ou sequencialmente (isto é, antes ou depois) ou simultaneamente) com inibidores da tirosina quinase (incluindo, mas não limitado a AG1478 e ZA1839, STI1571, OSI-774, SU-6668), doxorubicina, temozoli- mida, cisplatina, carboplatina, nitrosouréias, procarbazina, vincristina, hidroxiuréia, 5- fluoruracil, citosina arabinosídeo, ciclofosfamida, epipodofilotoxina, carmustina, lo- mustina, e/ou outros agentes quimioterápicos. Então, esses agentes podem ser agentes específicos anti-EGFR, ou inibidores da tirosina quinase tais como AG1478, ZA1839, STI1571, OSI-774, ou SU-6668 ou podem ser agentes anti-neoplásicos e anti-cancerígenos mais gerais tais como doxorubicina, cisplatina, temozolomida, ni- trosouréias, pró-carbazina, vincristina, hidroxiuréia, 5-fluoruracil, citosina arabinosí- deo, ciclofosfamida, epipodofilotoxina, carmustina ou lomustina. Em adição, a composição pode ser administrada com hormônios tal como dexametasona, modulado- res imunes, tais como interleucinas, fator de necrose tumoral (TNF) ou outros fatores de crescimento, ou citocinas que estimulam a resposta imune e redução ou eliminação de células cancerosas ou tumores.

[0246]Um modulador imune tal como TNF pode ser combinado junto com um membro da invenção na forma de um anticorpo bi-específico reconhecendo o epíto- po EGFR reconhecido pelos anticorpos inventivos, bem como ligando a receptores TNF. A composição pode também ser administrada com, ou pode incluir combinações junto com outros anticorpos anti-EGFR, incluindo, mas não limitados aos anticorpos anti-EGFR 528, 225, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR 62 e ABX-EGF.

[0247]Previamente o uso de agentes tais como doxorubicina e cisplatina em conjunção com anticorpos anti-EGFR têm produzido atividade anti-tumor aumentada (Fan et al, 1993; Baselga et al, 1993). A combinação de doxorubicina e mAb 528 resultou em erradicação total de xenotransplantes A431 estabelecidos, embora tratamento com um agente sozinho causou somente inibição do crescimento in vivo temporário (Baselga et al, 1993). Da mesma forma, a combinação de cisplatina e ou mAb528 ou 225 também levam a erradicação de xenotransplantes A431 bem estabelecidos, que não foi observado quando o tratamento com um agente foi usado (Fan et al, 1993).

Radioterapia Convencional

[0248]Em adição, a presente invenção contempla e inclui composições tera- pêuticas para o uso do membro de ligação em combinação com radioterapia con-vencional. Tem sido indicado que o tratamento com anticorpos alvejando receptores EGF podem aumentar os efeitos da radioterapia convencional (Milas et al., Clin. Cancer Res. 2000 Feb:6 (2):701, Huang et al., Clin. Cancer Res. 2000 Jun:6 (6):2166).

[0249]Como aqui demonstrado, combinações do membro de ligação da presente invenção, particularmente um anticorpo ou fragmento o do mesmo, preferivelmente o mAb806, ch806, mAb175, mAb124, mAb1133 ou hu806 ou um fragmento o do mesmo e terapêuticos anticâncer, particularmente terapêuticos anti-EGFR, incluindo outros anticorpos anti-EGFR, demonstram terapia efetiva, e particularmente sinergia, contra tumores xenotransplantados. Nos Exemplos, é demonstrado, por exemplo, que a combinação de AG1478 e mAb806 resulta em redução significante- mente aumentada do volume do tumor xenotransplante A431 em comparação com tratamento com um agente sozinho. Ag1478 (4-(3-cloroanilino)-6,7- dimetoxiquinazolina) é um inibidor potente e seletivo do receptor quinase EGF e é particularmente descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5.457.105, incorporada aqui por referência em sua totalidade (ver também, Liu, W. et al (1999) J. Cell Sci. 112:2409; Eguchi, S. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:8890; Levitsky, A. e Gazit, A. (1995) Science 267:1782). A Especificação dos Exemplos ainda demonstram sinergiaterapêutica de anticorpos da presente invenção com outros anticorpos anti- EGFR, particularmente com o anticorpo anti-EGFR 528.

[0250]A presente invenção ainda contempla composições terapêuticas úteis na prática de métodos terapêuticos desta invenção. Uma composição terapêutica sujeita inclui, em mistura, um excipiente (veículo) farmaceuticamente aceitável e um ou mais de um membro de ligação específico, análogo polipeptídico do mesmo ou fragmento o do mesmo, como aqui descrito como um ingrediente ativo. Em uma modalidade preferida, a composição compreende um antígeno capaz de modular a li- gação específica do membro/anticorpo de ligação presente com uma célula alvo.

[0251]A preparação de composições terapêuticas que contém polipeptídeos, análogos ou fragmento os ativos como ingredientes ativos é bem entendido na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, ou como soluções líquidas ou suspensões. Entretanto, formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsificada. O ingrediente terapêutico ativo é sempre misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, salina, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes e combinações dos mesmos. Em adição, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substânicas auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH que aumentam a efetividade do ingrediente ativo.

[0252]Um polipeptídeo, análogo ou fragmento o ativo pode ser formulado na composição terapêutica como formas de sal farmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos aminos livres do polipeptídeo ou molécula de anticorpo) e que são formadas com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Sais formados a partir dos grupos carboxila livres pode também ser derivados a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio, ou férrico, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2- etilamino etanol, histidina, procaína e semelhantes.

[0253]As composições contendo polipeptídeo terapêutico-, análogo- ou fragmento o ativo são convencionalmente administradas intravenosamente, como por injeção de uma dose única, por exemplo. O termo “dose única” quando utilizado em referência a uma composição terapêutica da presente invenção refere-se a uma uni dade fisicamente discreta adequada como dose única para humanos, cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada do material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido; isto é, carre- ador, ou veículo.

[0254]As composições são administradas de uma maneira compatível com a dosagem da formulação, e em uma quantidade terapeuticamente efetiva. A quantidade a ser administrada depende do paciente a ser tratado, capacidade do sistema imune do paciente para utilizar o ingrediente ativo, e grau de capacidade de ligação do EFGR desejado. Quantidades precisas do ingrediente ativo requeridas para serem administradas dependem do julgamento do prático e são peculiares a cada indí- viduo.

[0255]Entretanto, dosagens adequadas podem variar de cerca de 0,1 a 20, preferivelmente cerca de 0,5 a cerca de 10, e mais preferivelmente um a vários mili-gramas de ingrediente ativo por quilograma do peso corporal do indivíduo por dia e depende da via de administração. Regimes adequados para administração inicial e reforços são também variáveis, mas são representados por uma administração inicial seguida por doses repetidas em uma ou mais horas de intervalos por uma injeção subsequente ou outra administração. Alternativamente, infusão intravenosa contínua suficiente para manter concentrações de dez nanomolar para dez micromolar no sangue são contemplados.

[0256]Composições farmacêuticas para administração oral podem ser na forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode compreender um veículo sódio tal como gelatina ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas geralmente compreendem um veículo líquido tais como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução sacarídea ou glicóis tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol podem ser incluídos.

[0257]Para injeção intravenosa ou injeção no sítio de aflição, o ingrediente ativo será na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirogênio e tem um pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Aqueles versados na técnica são bem conhecidos para preparar soluções adequadas usando, por exemplo,veículos isotônicos tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactada. Conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outro aditivos podem ser incluídos, como requerido.

Ensaios Diagnósticos

[0258]A presente invenção também se relaciona a uma variedade de aplicações diagnósticas, incluindo métodos para detectar a presença de estímulos tal como EGFR aberrantemente expresso, por referência a sua habilidade para ser reconhecido pelo membro de ligação específica presente. Como mencionado mais cedo, o EGFR pode ser usado para produzir anticorpos por si mesmo por uma variedade de técnicas conhecidas, e tais anticorpos podem então ser isolados e utilizados como em testes para a presença de atividade EGFR nas células alvo suspeitas.

[0259]Aplicações diagnósticas dos membros de ligação específica da presente invenção, particularmente anticorpos e fragmento os dos mesmos, incluem aplicações in vitro e in vivo bem conhecidas e padrões para os versados na técnica e baseados na presente descrição. Ensaios diagnósticos e kits para avaliação in vitroe avaliação do estado EGFR, particularmente com respeito a expressão aberrante de EGFR, podem ser utilizados para diagnóstico, avaliação e monitoramento de amostras de pacientes incluindo aquelas conhecidas por ter ou suspeitas de ter câncer, uma condição pré-cancerosa, uma condição relacionada a crescimento celular hiperproliferativa ou a partir de amostra de tumor. A avaliação e estimação do estado EGFR é também útil na determinação da adequação de um paciente para uma triagem clínica de uma droga ou para a administração de um agente quimioterápico particular ou membro de ligação específica, particularmente um anticorpo, da presente invenção, incluindo combinações dos mesmos, versus um agente diferente ou membro de ligação. Este tipo de monitoramento e avaliação diagnóstico já está na prática utilizando anticorpos contra a proteína HER2 no câncer de mama (Hercep Test, Da- ko Corporation), onde o ensaio é também utilizado para avaliar pacientes para terapia de anticorpo usando Herceptina. Aplicações in vivo incluem imagem de tumores ou avaliação do estado do câncer de indivíduos, incluindo radioimagem.

[0260]Como previamente sugerido, o método diagnóstico da presente invenção compreende exame de uma amostra ou meio celular por meio de um ensaio incluindo uma quantidade efetiva de um antagonista a um EGFR/proteína, tal como um anticorpo anti-EGFR, preferivelmente um anticorpo policlonal purificado por afinidade, e mais preferivelmente um mAb. Em adição, é preferível para as moléculas de anticorpo anti-EFGR utilizadas aqui estejam na forma de porções Fab, Fab’, F(ab’)2 ou F(v) ou moléculas de anticorpos inteiros. Como previamente discutido, pacientes capazes de beneficiar a partir deste método incluem aqueles sofrendo de câncer, uma lesão pré-cancerosa, uma infecção viral, patologias envolvendo ou resultando a partir de crescimento de célula hiperproliferativa ou outro tipo de desordem patológica.Métodos para isolar EFGR e induzir anticorpos anti-EFGR e para determinar e aperfeiçoar a habilidade de anticorpos anti-EFGR para assistir na examinação das células alvos são bem conhecidas na técnica.

[0261]Preferivelmente, o anticorpo anti-EFGR utilizado nos métodos diagnósticos desta invenção é um anticorpo policlonal purificado por afinidade. Mais preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal (mAb). Em adição, as moléculas de anticorpo anti-EFGR utilizadas aqui podem ser na forma de porções Fab, Fab’, F(ab’)2 ou F(v) das moléculas de anticorpo inteiras.

[0262]Como descrito em detalhes acima, anticorpo(s) para o EGFR pode(m) ser produzidos e isolados por métodos padrões incluindo as técnicas de hibridoma bem conhecidas. Para conveniência, o(s) anticorpo(s) para o EGFR serão referidos aqui como Ab1 e anticorpo(s) feitos em outras espécies como Ab2.

[0263]A presença de EGFR nas células pode ser confirmada pelos procedi-mentosimunológicos in vitro ou in vivo aplicáveis para tais determinações. Um número de procedimentos úteis é conhecido. Três tais procedimentos que são especialmenteúteis utilizam o EGFR marcado com um marcador detectável, anticorpo Ab marcado com um marcador detectável, ou anticorpo Ab2 marcado com um marcador detectável. Os procedimentos podem ser resumidos pelas seguintes equações em que os asteriscos indicam que a partícula é marcada, e “R” sustentam para o EGFR:

[0264]Os procedimentos e suas aplicações são todas familiares àqueles versados na técnica e consequentemente podem ser utilizadas dentro do objetivo da presente invenção. O procedimento "competitivo", Procedimento A, é descrito na Patente dos EUA Nos. 3.654.090 e 3.850.752. Procedimento C, o procedimento "sanduíche", é descrito na Patente dos EUA Nos. Re32.006 e 4.016.043. Ainda outros procedimentos são conhecidos tal como o "anticorpo duplo”, ou procedimento “DASP”.

[0265]Em cada exemplo acima, EGFR forma complexos com um ou mais anticorpos ou parceiros de ligação e um membro do complexo é marcado com um marcador detectável. O fato de um complexo ter formado e, se desejado, a quantidade do mesmo, pode ser determinada por métodos conhecidos aplicáveis a detecção dos marcadores.

[0266]Será visto a partir do acima, que uma propriedade característica do Ab2 é que ele reagirá com Ab1. Isto é porque Ab1 feito em uma espécie mamífera tem sido usada em outras espécies como um antígeno para dar o anticorpo Ab2. Por exemplo, Ab2 pode ser feito em cabras usando anticorpos de coelho como antíge- nos. Ab2 pode ser anticorpo anti-coelho em cabras. Para propósitos desta descrição e reivindicações, Ab1 será referido como um anticorpo primário ou anti-EGFR, e Ab2 será referido como um anticorpo secundário ou anti-Ab1.

[0267]Os marcadores mais comuns empregados para esses estudos são elementos radioativos, enzimas, químicos cuja fluorescência quando expostos a luz ultravioleta, e outros.

[0268]Um número de materiais fluorescentes é conhecido e podem ser utilizados como marcadores. Esses incluem, por exemplo, fluoresceína, rodamina, au- ramina, Texas Red, AMCA blue e Lucifer Yellow. Um material de detecção particular é anticorpo anti-coelho preparado em cabras e conjugado com fluoresceína através de um isotiocianato.

[0269]O EGFR ou seu(s) parceiro(s) ligante(s) tal como o presente membro de ligação específica, pode também ser marcado com um elemento radioativo ou com uma enzima. O marcador radioativo pode ser detectado por qualquer um dos procedimentos contadores correntemente disponíveis. O isótopo preferido pode ser selecionado a partir de 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, 111In, 211At, 198Au, 67Cu 225Ac, 213Bi, 99Tc e 186Re.

[0270]Marcadores enzimáticos são igualmente úteis, e podem ser detectados por qualquer das presentes técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluo- rospectrofotométrica, amperométrica ou gasométrica utilizadas. A enzima é conjugada a partícula selecionada por reação com moléculas de ligação tais como carbo- diimidas, diisocianatos, glutaraldeído e semelhantes. Muitas enzimas que podem ser usadas nesses procedimentos são conhecidas e podem ser utilizadas. As preferidas são peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, glicose oxidase mais peroxidase e fosfatase alcalina. Patente dos EUA Nos. 3.654.090; 3.850.752 e 4.016.043 são referidas por meio de exemplo para esta revelação de material e métodos de marcação alternativa.

[0271]Um sistema de ensaio particular que pode ser vantajosamente utilizado de acordo com a presente invenção é conhecido como um ensaio de receptor. Em um ensaio de receptor, o material a ser avaliado tal como o membro de ligação específica é apropriadamente marcado, e então certas colônias de teste celular são inoculadas com uma quantidade de ambos, material marcado e não marcado após o qual estudos de ligação são conduzidos para determinar a extensão em que o material marcado se liga aos receptores celulares. Desta forma, diferenças na afinidade entre materiais podem ser verificadas.

[0272]Consequentemente, uma quantidade purificada do membro de ligação específica pode ser radiomarcada e combinada, por exemplo, com anticorpos ou outros inibidores do mesmo, após o que estudos de ligação podem ser realizados. Soluções podem então ser preparadas, que contêm várias quantidades de membro de ligação específica marcados e não marcados, e amostras celulares podem então ser inoculadas e depois incubadas. As monocamadas celulares resultantes são então lavadas, solubilizadas e então contadas em contador gama para um comprimento de temo suficiente para produzir um erro padrão de <5%. Esses dados são então sujeitos a análise de Scatchard após a qual observações e conclusões em relação à atividade do material podem ser descritas. Enquanto a precedente é exemplar, ela ilustra a maneira em que um ensaio de receptor pode ser feito e utilizado, no exemplo onde a habilidade de ligação celular do material avaliado pode servir como uma característica diferenciada.

[0273]Um ensaio útil e contemplado de acordo com a presente invenção é conhecido como um ensaio “cis/trans”. Brevemente, este ensaio emprega duas construções genéticas, uma das quais é tipicamente um plasmídeo que continuamente expressa um receptor particular de interesse quando transfectado em uma linhagem celular apropriada, e a segunda das quais é um plasmídeo que expressa um repórter tal como luciferase, sob o controle de um complexo receptor/ligante. En- tão, por exemplo, se é desejado avaliar um composto como um ligante para um receptor particular, um dos plasmídeos pode ser uma construção que resulta na expressão do receptor na linhagem celular escolhida, enquanto o segundo plasmídeo pode possuir um promotor ligado ao gene luciferase em que o elemento resposta ao receptor particular é inserido. Se o composto sob teste é um agonista para o receptor, o ligante complexará com o receptor, e o complexo resultante ligará ao elemento resposta e iniciará transcrição do gene da luciferase. A quimioluminescência resultanteé então medida fotometricamente, e curvas dose-resposta são obtidas e comparadasàqueles ligantes conhecidos. O protocolo precedente é descrito em detalhe na Patente dos EUA No. 4.981.784 e Publicação Internacional PCT No. WO 88/03168, para a qual propósito a técnica é referida.

[0274]Em uma modalidade adicional desta invenção, kits de teste comercial adequados para uso pelo especialista médico podem ser preparados para determinar a presença ou ausência da expressão aberrante de EGFR, incluindo, mas não limitado ao EGFR amplificado e/ou mutação EGFR, em células alvo suspeitas. De acordo com as técnicas testes discutidas acima, uma classe de tais kits conterá pelo menos o EGFR marcado ou seu parceiro ligante, por exemplo, um anticorpo específico do mesmo, e direções, claro, dependente do método selecionado, por exemplo, “competitivo”, “sanduíche”, “DASP” e semelhantes. Os kits podem também conter reagentes periféricos tais como tampões, estabilizadores etc.

[0275]Consequentemente, um kit teste pode ser preparado para a demonstração da presença ou capacidade de células para expressão aberrante ou modificação pós-traducional de EGFR, compreendendo: (a) uma quantidade pré-determinada de pelo menos um componente imuno- quimicamente reativo marcado obtido pela ligação direta ou indireta do membro de ligação específica presente ou um parceiro ligante específico do mesmo, a um mar-cadordetectável; (b) outros reagentes; e (c) direções para uso do referido kit. Mais especificamente, o kit de teste diagnóstico pode compreender: (a) uma quantidade conhecida do membro de ligação específica como descrito acima (ou um parceiro de ligação) geralmente ligado a uma fase sólida para formar um imunoabsorvente, ou na alternativa, ligada a um marcador adequado, ou plurais tal como produtos terminais etc (ou seus paceiros de ligação), um de cada; (b) se necessário, outros reagentes; e (c) direções para uso do referido kit teste.

[0276]Em uma variação adicional, o kit teste pode ser preparado e usado para propósitos declarados acima, que operam de acordo com um protocolo pré- determinado (por exemplo, “competitivo”, “sanduíche”, “anticorpo duplo” etc), e compreende: (a) um componente marcado que tem sido obtido por acoplamento do membro de ligação específica a um marcador detectável; (b) um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais dos quais pelo menos um reagente é um ligante ou um ligante imobilizado, cujo ligante é selecionado a partir do grupo consistindo de: (i) um ligante capaz de ligar com o componente marcado (a); (ii) um ligante capaz de ligar com um parceiro ligante do componente marcado (a); (iii) um ligante capaz de ligar com pelo menos um do(s) componente(s) a ser (em) determinados; e (iv) um ligante capaz de ligar com pelo menos um dos parceiros ligantes de pelo menos um do(s) componente(s) a ser(em) determinado(s); e (c) direções para o desempenho de um protocolo para a detecção e/ou de-terminação de um ou mais componentes de uma reação imunoquímica entre o EFGR, o membro de ligação específica, e um parceiro de ligação específica do mesmo.

[0277]De acordo com o acima, um sistema de ensaio para seleção de drogas potenciais efetivas para modular a atividade do EFGR, a expressão aberrante ou modificação pós-traducional do EGFR, e/ou a atividade ou ligação do membro de ligação específica pode ser preparada. O receptor ou o membro de ligação pode ser introduzido em um sistema teste, e a droga prospectiva pode também ser introduzida na cultura celular resultante, e a cultura depois disso é examinada para observar qualquer mudança na atividade da fase S das células, devido ou a adição da droga prospectiva sozinha, ou devido ao efeito das quantidades adicionadas do(s) agen- te(s) conhecido(s).

Ácidos Nucléicos

[0278]A presente invenção ainda provê um ácido nucléico isolado codificando um membro de ligação específica da presente invenção. Ácido nucléico inclui DNA e RNA. Em um aspecto preferido, a presente invenção provê um ácido nucléico que codifica para um polipeptídeo da invenção como definido acima, incluindo um polipeptídeo como exibido para resíduos CDR das cadeias VP e VL dos anticorpos inventivos.

[0279]A presente invenção também provê construções na forma de plasmí- deos, vetores, transcrição ou cassetes de expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima.

[0280]A presente invenção também provê uma célula hospedeira recombi- nante que compreende uma ou mais construções acima. Um ácido nucléico codificando qualquer membro de ligação específica como provido por ele mesmo forma um aspecto da presente invenção, e faz um método de produção do membro de ligação específica cujo método compreende expressão a partir do ácido nucléico co- dificante. Por essa razão, expressão pode convenientemente ser alcançada por cul- tura sob condições apropriadas em células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucléico. Seguindo, produção por expressão de um membro de ligação específica pode ser isolada e/ou purificada usando qualquer técnica adequada, então usada como apropriado.

[0281]Membros de ligação específica e moléculas codificando ácido nucléico e vetores de acordo com a presente invenção podem ser isolados providos e/ou purificados, por exemplo, a partir do ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogênea, ou, no caso do ácido nucléico, livre ou substancialmente livre de ácido nucléico ou genes de origem outra que a sequência codificando um polipeptí- deo com a função requerida. Ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser inteiro ou parcialmente sintético.

[0282]Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem sistemas de bactéria, células mamíferas, levedura e baculovírus. Linhagens celulares mamíferas disponíveis na técnica para expressão de um poli- peptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês, células HeLa, células de rim de hamster recém-nascido, células de melanoma de camundongo NSO e muitas outras. Uma bactéria hospedeira comum preferida é E. coli.

[0283]A expressão de anticorpos e fragmento os do anticorpo em células procarióticas tal como E. coli é bem estabelecido na técnica. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pluckthun, A. Bio.Technology 9:545-551 (1991). Expressão em células eucarióticas na cultura é também disponível por aqueles versados na técnica como uma opção para produção de um membro de ligação específico, ver para revisões recentes, por exemplo, Raff, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4:573-576; Trill J. J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6:553-560.

[0284]Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências regulátorias apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências aumentadoras, genes mar-cadores e outras sequências como apropriada. Vetores podem ser plasmídeos virais, por exemplo, fago ou fagomídeo, como apropriado. Para detalhes adicionais ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas conhecidas e protocolos para manipulação de ácido nucléico, por exemplo, em preparação de construções de ácido nucléico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão gênica, e análise de proteínas, são descritas em detalhes em Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. As revelações de Sambrook et al. e Ausubel et al são aqui incorporadas por referência.

[0285]Então, um aspecto adicional da presente invenção provê uma célula hospedeira contendo ácido nucléico como aqui revelado. Um aspecto adicional ain-daprovê um método compreendendo introdução tal como ácido nucléico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas adequadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextran, eletroporação, transfecção mediada por lipossoma e transdu- ção usando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de inseto, baculovírus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófago.

[0286]A introdução pode ser seguida por causar ou permitir expressão a partir de ácido nucléico, por exemplo, por cultura de células hospedeiras sob condições para expressão do gene.

[0287]Em uma modalidade, o ácido nucléico da invenção é integrado no ge- noma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. Integração pode ser promovida por inclusão se sequências que promovem recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrões.

[0288]A presente invenção também provê um método que compreende uso de uma construção como descrito acima em um sistema de expressão a fim de expressar um membro ou polipeptídeo de ligação específica como acima.

[0289]Como descrito acima, a presente invenção também se relaciona a uma molécula de DNA recombinante ou gene clonado, ou uma variante degenerada do mesmo, que codifica um membro de ligação específica, particularmente anticorpo ou um fragmento o do mesmo, que possui uma sequência de aminoácidos revelada nas SEQ ID NOS: 2 e 4, 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e/ou 42 e 47, preferivelmente uma molécula de ácido nucléico, em particular uma molécula de DNA recombinante ou gene clonado, codificando o membro ou anticorpo ligante tem uma sequência nucleotídica ou é complementar a uma sequência de DNA codificante de tais sequências.

[0290]Outra característica desta invenção é a expressão das sequências de DNA reveladas aqui. Como é bem conhecido na técnica, sequências de DNA podem ser expressas por operacionalmente ligá-las a uma sequência de controle de expressão em um vetor de expressão apropriado e empregando este vetor de expressão a transformar um hospedeiro unicelular apropriado.

[0291]Tal ligação operante de uma sequência de DNA desta invenção a uma sequência de controle de expressão, claro, inclui se já não for parte da sequência de DNA, a provisão de um códon de iniciação, ATG, na leitura correta da estrutura acima da sequência de DNA.

[0292]Uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregada na expressando de sequências de DNA desta invenção. Vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir de segmentos de sequências cromossomais, não cromossomais e de DNA sintético. Vetores adequados incluem derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli col El, pCR1, pBR322, pMB9, e deus derivados, plasmídeos tal como RP4; fago DNAs, por exemplo, os numerosos derivados do fago X, por exemplo, NM989, e outro fago DNA, por exemplo, M13 e fago DNA de fita simples filamentoso; plasmídeos de levedura tal como o plasmídeo 2u ou derivados do mesmo; vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores úteis em células de inseto ou mamíferos; vetores derivados a partir de combinações de plasmídeos e fago DNAs, tais como plasmídeos que têm sido modificados para empregar fago DNA ou outras sequências de controle de expressão; e semelhantes.

[0293]Qualquer de uma ampla variedade de sequências controle de expressão - sequências que controlam a expressão de uma sequência de DNA operacionalmente ligada a ela - podem ser usadas nesses vetores para expressar as sequências de DNA desta invenção. Tais sequências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores precoces ou tardios de SV40, CMV, vaccinia, polioma ou adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TCR, o sistema LTR, o operador principal e regiões promotoras do fago À, as regiões controle da proteína revestida fd, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores unidos a levedura, e outras sequências conhecidas para controlar a expressão de genes de células procariotas ou eucariotas ou seus vírus, e várias combinações dos mesmos.

[0294]Uma ampla variedade de células hospedeiras unicelulares é também útil na expressão de sequências de DNA desta invenção. Esses hospedeiros podem incluir hospedeiros eucariotos e procariotos bem conhecidos, tais como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos tais como leveduras, e células animais, tais como CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W e células L-M, células de rim de Macaco Verde Africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, e BMT10), células de inseto (por exemplo, Sf9), e células humanas e células de planta em cultura de tecido.

[0295]Será entendido que nem todos os vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros funcionarão igualmente bem para expressar as sequências de DNA desta invenção. Nem todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. Entretanto, um versado na técnica será capaz de selecionar os vetores próprios, sequências controle de expressão, e hospedeiros sem experimentação indevida para realizar a expressão desejada sem sair do objetivo desta invenção. Por exemplo, em selecionando um vetor, o hospedeiro deve ser considerado porque o vetor deve funcionar no mesmo. O número de cópia do vetor, a habilidade de controlar que o número de cópia, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores antibióticos, serão também considerados.

[0296]Em selecionar uma sequência de controle de expressão, uma variedade de fatores será normalmente considerada. Esses incluem, por exemplo, a força relativa do sistema, sua controlabilidade, e sua compatibilidade com o vetor escolhido, suas secreções características, suas habilidades de dobramento de proteínas corretamente, e seus requerimentos de fermentação, bem como a toxidade para o hospedeiro do produto codificado pelas sequências de DNA a serem expressas, e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.

[0297]Considerando esses e outros fatores, um versado na técnica será capaz de construir uma variedade de combinações vetor/sequência controle de expressão do hospedeiro que expressam as sequências de DNA desta invenção na fermentação ou em cultura animal de larga escala.

[0298]É adicionalmente tencionado que análogos do membro de ligação es-pecífica podem ser preparados a partir de sequências nucleotídicas do comple- xo/subunidade de proteína dentro do objetivo da presente invenção. Análogos, tais como fragmento os, podem ser produzidos, por exemplo, por digestão de pepsina de material membro de ligação específica. Outros análogos tais como muteínas, podem ser produzidos por mutagênese sítio-direcionada padrão de sequências codificantes de membro de ligação específica. Análogos exibindo “atividade de membro de ligação específica” tal como pequenas moléculas, se funcionando como promotores ou inibidores, podem ser identificadas por ensaios in vivo e/ou in vitro conhecidos.

[0299]Como mencionado acima, uma sequência de DNA codificando um membro de ligação específica pode ser preparado sinteticamente ao invés de clona- do. A sequência de DNA pode ser desenhada com os códons apropriados para a sequência de aminoácidos do membro de ligação específica. Em geral, um selecionará códons preferidos para o hospedeiro tencionado se a sequência será usada para expressão. A sequência completa é unida a partir de sobreposição de oligonu- cleotídeos preparados por métodos padrões e unidos em uma sequência codificante completa. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

[0300]Sequências de DNA sintéticas permitem construção conveniente de genes que expressarão análogos de membros de ligação específica ou “muteínas”. Alternativamente, muteínas codificando DNA podem ser feitas por mutagêneses sí- tio-direcionadas de genes ou cDNAs de genes de membro de ligação específica, e muteínas podem ser feitas diretamente usando síntese de polipeptídeo convencional.

[0301]Um método geral para incorporação sítio-específica de aminoácidos não naturais em proteínas é descrito em Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony- Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (April 1989). Este método pode ser usado para criar análogos com aminoácidos não naturais.

[0302]A presente invenção estende-se a preparação de oligonucleotídeos anti-senso e ribozimas que podem ser usadas para interferir com a expressão do EGFR em nível traducional. Esta abordagem utiliza ácido nucléico anti-senso e ribo- zima para bloquear a traduçao de um mRNA específico, ou por mascarar este mRNA com um ácido nucléico anti-senso ou quebrá-lo com uma ribozima.

[0303]Ácidos nucléicos anti-senso são moléculas de DNA ou RNA que são complementares a pelo menos uma porção de uma molécula de mRNA específica (Ver Weintraub, 1990; Marcus-Sekura, 1988.). Na célula, eles hibridizam ao mRNA, formando uma molécula de fita dupla. A célula não traduz um mRNA nesta forma de dupla fita. Assim, ácidos nuclécidos anti-senso interferem com a expressão de mRNA em proteína. Oligômeros de cerca de quinze nucleotídeos e moléculas que hibridizam ao códon de iniciação AUG serão particularmente eficientes, desde que eles são fáceis de sintetizar e provavelmente têm menos problemas que moléculas grandes quando introduzindo as mesmas em células produtoras. Métodos anti-senso têm sido usados para inibir a expressão de muitos genes in vitro (Marcus-Sekura, 1998; Hambor et al, 1988).

[0304]Ribozinas são moléculas de RNA possuindo a habilidade de especifi-camente quebrar outras moléculas de RNA de fita simples de uma forma um pouco análoga a endonucleases de restrição a DNA. Ribozimas foram descobertas a partir da observação que certos mRNAs têm a habilidade de cortar seus próprios íntrons. Modificando a sequência nucleotídica desses RNAs, pesquisadores têm sido capazes de construir moléculas que reconhecem sequências nucleotídicas específicas em uma molécula de RNA e quebrá-la (Cech, 1988). Porque eles são sequência- específica, somente mRNAs com sequências particulares são inativadas.

[0305]Investigadores têm identificados dois tipos de ribozimas, tipo- tetraimena e tipo-“cabeça de martelo” (Hasselhoff e Gerlach, 1988). Ribozimas tipo- tetraimena reconhecem sequências de quatro bases, enquanto o tipo “cabeça de martelo” reconhece sequências de onze a dezoito bases. Quanto mais longa a sequência de reconhecimento, mais provavelmente ela ocorre exclusivamente as espécies de mRNA alvos. Dessa forma, ribozimas tipo-cabeça de martelo são preferíveisàs rebozimas tipo-tetraimena para inativar uma espécie de mRNA, e sequências de reconhecimento de dezoito bases são preferíveis a sequências de reconhecimento mais curtas.

[0306]As sequências de DNA descritas aqui podem então ser usadas para preparar moléculas anti-senso contra, e ribozimas que clivam mRNAs para EGFRs e seus ligantes.

[0307]A invenção pode ser melhor entendida por referência aos seguintes Exemplos não limitantes, que são providos como exemplares da invenção. Os exemplos seguintes são apresentados a fim de mais completamente ilustrarem as modalidades preferidas da invenção e não devem ser construídos em nenhuma forma, entretanto, como limitante do amplo objetivo da invenção.

Exemplo 1 Geração e Isolamento de Anticorpos Linhagens Celulares

[0308]Para imunização e especificidade de análises, várias linhagens celulares, nativas ou transfectadas com ou o gene normal, selvagem ou “wtEGFR” ou o gene ΔEGFR carreando a mutação de deleção Δ2-7 foram utilizados: linhagem celular de fibroblasto murino NR6, NR6ΔEGFR(transfectada com ΔEGFR) e NR6wtEGFR (transfectado com etEGFR), linhagem celular de glioblastoma humano U87MG (expressando baixos níveis de wtEGFR endógeno), U87MGwtEGFR ou “U87MG.wtEGFR” (transfectado com wtEGFR), U87MGΔEGFRou “U87MG. Δ 2-7”(transfectado com ΔEGFR), e linhagem celular de carcinoma de célula escamosa humana A431 (expressando altos níveis de wtEGFR). O NR6, NR6ΔEGFR,,e linhagens celulares NR6 wtEGFR foram previamente descritas (Batra et al. (1995) Epidermal Growth Factor Ligand-independent, Unregulated, Cell-Transforming Potential of a Naturally Occurring Human Mutant EGFRvIII Gene. Cell Growth Differ. 6(10): 1251-1259). A linhagem celular NR6 tem ausência de EGFR endógena normal (Batra et al, 1995). Linhagens celulares U87MG e transfecções foram descritas previamente (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-7731).

[0309]A linhagem celular de astrocitoma U87MG (Ponten, J. and Macintyre, E. H. (1968) Long term culture of normal and neoplastic human glia. Acta. Pathol. Microbiol. Scand. 74, 465-86) que expressa endogenamente baixos níveis de wtEGFR, foi infectada com um retrovírus contendo o de2-7 EGFR para produzir a linhagem celular U87MG,Δ2-7 (Nishikawa et al, 1994). A linhagem celular transfec- tada U87MG.wtEGFR foi produzida como descrito em Nagane et al. (1996) Cancer Res. 56, 5079-5086. Embora células U87MG expressam aproximadamente 1x105 EGFR, células U87MG.wtEGFR expressam aproximadamente 1x106EGFR, e então mimetizam a situação vista com amplificação gênica. A linhagem celular pró-B muri- na BaF/3, que não expressa qualquer molécula relacionada a EGFR, foi também transfectada com de2-7 EGFR, resultando na linhagem celular BaF/3.Δ2-7 (Luwor et al. (2004) The tumor-specific de2-7 epidermal growth factor receptor (EGFR) promotes cells survival and heterodimerizes with the wild-type EGFR, Oncogene 23: 6095-6104). Células A431 de carcinoma escamoso humano foram obtidas a partir de ATCC (Rockville, MD). A linhagem celular de carcinoma epidermóide A431 tem sido descrita previamente (Sato et al. (1987) Derivation and assay of biological effects of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptors. Methods Enzymol. 146, 63-81).

[0310]Todas as linhagens celulares foram cultivadas em DMEM/F-12 com GlutaMAX® (Life Technologies, Inc. Melbourne, Austrália e Grand Island, NI) suple-mentado com 10% de SFB (CSL, Melbourne, Austrália); 2 mM de glutamina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), e penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Inc., Grand Island, NI). Em adição, as linhagens celulares U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR foram mantidas em 400 mg/mL de geneticina (Life Technologies, Inc., Melbourne, Victoria, Austrália). Linhagens celulares foram crescidas a 37oC em uma atmosfera não modificada de 5% CO2.

Reagentes

[0311]O peptídeo juncional único de2-7 EGFR tem a sequência de aminoá- cidos: LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID NO:13). Peptídeos juncionais únicos biotinilados (Biotina-LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID NO:5) e LEEKKGNYVVTDH-Biotina (SEQ ID NO:6)) a partir de de2-7 EGFR foram sintetizados por química e pureza Fmoc padrão (>96%) determinada por HPLC de fase reversa e análise de espectro de massa (Auspep, Melbourne, Austrália).

Anticorpos usados em estudos

[0312]A fim de comparar nossas descobertas com outros reagentes, mAbs adicionais foram incluídos em nossos estudos. Esses reagentes foram mAb528 para o wtEGFR (Sato et al. (1983) Mol. Biol. Med. 1(5), 511-529) e DH8.3, que foi gerada contra um peptídeo sintético atravessando a sequência juncional da mutação de de- leção Δ2-7 EGFR. O anticorpo DH8.3 (IgG1), que é específico para o de2-7 EGFR, tem sido descrito previamente (Hills et al. (1995) Specific targeting of a mutant, activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody. Int. J. Cancer. 63, 537-43,1995) e foi obtido seguindo imunização de camundongos com o pep- tídeo juncional único encontrado em de2-7 EGFR (Hill et al, 1995).

[0313]O anticorpo 528, que reconhece ambos, EGFR de2-7 e selvagem, tem sido descrito previamente (Masui et al. (1984) Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies. Cancer Res. 44, 1002-7) e foi produzido em Biological Production Facility, Ludwig Institute for Cancer Research (Melbourne, Australia) usando um hibridoma (ATCC HB-8509) obtido a partir de Coleção de Cultura Tipo Americana (Rockville, MD). O anticorpo policlonal SC-03 é um anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade feito contra um peptídeo carbóxi-terminal do EGFR (Santa Cruz Biotechnology Inc.).

Geração de Anticorpo

[0314]A linhagem de fibroblasto murina NR6AEGFR foi usada como imunóge- no. Hibridomas de camundongos foram geradas por imunização de camundongos BALC/c cinco vezes, subcutaneamente com 2- a 3-semanas de intervalos, com 5x105- 2x106células em adjuvante. Adjuvante de Freund completo foi usado para a primeira injeção. Depois, adjuvante de Freund incompleto (Difco®, Voigt Global Dis- tribuition, Lawrence, KS) foi usado. Células do baço a partir de camundongos imunizados foram fusionados com linhagem celular de mieloma de camundongo SP2/0 (Shulman et al. (1978) Nature 276:269-270). Sobrenadantes de clones recentemente gerados foram selecionados nos ensaios de hemadsorção para reatividade com linhagem celular NR6, NR6wtEGFR, and NR6aEGFR e então analisados por ensaios de hemadsorção com linhagens celulares de glioblastoma humano U87MG, U87MGwtEGFR, e U87aEGFR. Sobrenadantes de hibridomas selecionadas foram subsequentemente testadas por western blotting e analisados ainda por imunohistoquí- mica. mAbs recentemetne gerados mostrando o padrão de reatividade esperado foram purificados.

[0315]Cinco hibridomas foram estabelecidos e três clones, 124 (IgG2a), 806 (IgG2b) e 1133 (IgG2a) foram inicialmente selecionados para caracterização adicional baseada em alta titulação (1:2500) com NR6aEGFR e baixo background em células NR6 e NR6wtEGFR no ensaio de hemaglutinação roseta. Um quarto clone, 175 (IgG2a) foi subsequentemente ainda caracterizado e discutido separadamente no Exemplo 23, abaixo. Em uma análise de hemaglutinação subsequente, esses anticorpos mostraram nenhuma reatividade (sobrenadante não diluído < 10%) com a linhagem celular glioblastoma humana nativa U87MG e U87MGwtEGFR, mas foram fortemente reativos com U87MGaEGFR; menos reatividade foi vista com A431. Por contraste, na análise de FACS, 806 foi não reativo com U87MG nativo e intensivamente corou U87MGaEGFR e a um menor grau U87MGwtEGFR indicando ligação de 806 a ambos, ΔEGFR e wtEGFR (ver abaixo).

[0316]Em ensaios de Western blot, mAb124, mAb806 e mAb1133 foram então analisados para reatividade com wtEGFR e ΔEGFR. Lisados detergente foram extraídos a partir de NR6ΔEGFR, U87MGΔEGFRbem como a partir de A431. Todos três mAbs mostraram um padrão de reatividade similar com lisados celulares corando ambas, proteína etEGFR (170 kDa) e ΔEGFR. (140 kDa). Como um reagente de referência, mAbR.I conhecido por ser reativo com o wtEGFR (Waterfield et al. (1982) J. Cell Biochem. 20(2), 149-161) foi usado ao invés de mAb528, que é conhecido ser não reativo na análise de western blot. mAbR.I. mostrou reatividade com selvagem e ΔEGFR. Todos os três clones recentemente gerados mostraram reatividade com ΔEGFR e menos intenso com wtEGFR. DH8.3 foi o único positivo no lisado de U87MGΔEGFRe NR6ΔEGFR.

[0317]Análise imunohistoquímica de clones 124, 806 e 1133 como também mAb528 e mAbDH8.3 em tumores xenotransplantes U87MG, U87MGΔEGFR,e A431 são mostrados na Tabela 1. Todos mAbs mostraram forte coloração de xenotrans- plante U87MGΔEGFR.Somente mAb528 mostrou fraca reatividade no xenotransplante U87MG nativo. Em xenotransplantes A431, mAb528 mostraram forte reatividade homogênea. mAb124, mAb806 e mAb1133 revelaram reatividade com as células localizadas mais basalmente do carcinoma de célula escamosa de A421 e não reagiram com as camadas celulares superiores ou componente queratinizante. DH8.3 foi negativo em xenotransplantes A431. Tabela 1

Análise munohistoquímica de Anticorpos 528, DH8.3, e 124, 806 e 1133

[0318]Menor coloração estromal devido a detecção de anticorpos endógenos de camundongo.

Sequenciamento

[0319]As cadeias pesada variável (VP) e leve variável (VL) de mAb806, mAb124 e mAb1133 foram sequenciadas, e suas regiões determinantes de com- plementariedade (CDRs) identificadas, como segue:

mAb806

[0320]Cadeia VP mAb806: sequência de ácido nucléico (SEQ ID NO:1) e sequência de aminoácidos, com peptídeo sinal (SEQ ID NO:2) são mostrados nas FIGS. 14A e 14B, respectivamente (peptídeo sinal sublinhado na FIG. 14B). Regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 (SEQ ID NOS: 15, 16 e 17, respectivamente) são indicadas por sublinhado na FIG. 16. A sequência de ami- noácidos de cadeia VP mAb806 sem seu peptídeo sinal (SEQ ID NO:11) é mostrada na FIG. 16.

[0321]Cadeia VL mAb806: sequência de ácido nucléico (SEQ ID NO:3) e se-quência de aminoácidos, com peptídeo sinal (SEQ ID NO:4) são mostrados nas FIGS. 15A e 15B, respectivamente (peptídeo sinal sublinhado na FIG. 15B). Regiões determinantes de complementariedade CDR1, CDR2 e CDR3 (SEQ ID NOS: 18, 19 e 20, respectivamente) são indicadas por sublinhado na FIG. 17. A sequência ami- noácido de cadeia VL mAb806 sem seu peptídeo sinal (SEQ ID NO:12) é mostrada na FIG. 17.

mAb124

[0322]Cadeia VP de mAb124: ácido nucléico (SEQ ID NO:21) e sequências de aminoácidos (SEQ ID NO:22) são mostradas na FIGS:51A e 51B, respectivamen-te.Regiões determinantes de complementariedade CDR1, CDR2, e CDR3 (SEQ ID NOS:23, 24, e 25, respectivamente) são indicadas por sublinhado.

[0323]Cadeia VL de mAb124: ácido nucléico (SEQ ID NO:26) e sequências de aminoácidos (SEQ ID NO:27) são mostradas na FIGS:51C e 51D, respectivamen-te.Regiões determinantes de complementariedade CDR1, CDR2, e CDR3 (SEQ ID NOS:28, 29, e 30, respectivamente) são indicadas por sublinhado.

mAb1133

[0324]Cadeia VP de mAb1113: ácido nucléico (SEQ ID NO:31) e sequências de aminoácidos (SEQ ID NO:32) são mostradas na FIGS:52A e 52B, respectivamen-te.Regiões determinantes de complementariedade CDR1, CDR2, e CDR3 (SEQ ID NOS:33, 34, e 35, respectivamente) são indicadas por sublinhado.

[0325]Cadeia VL de mAb1133: ácido nucléico (SEQ ID NO:36) e sequências de aminoácidos (SEQ ID NO:37) são mostradas na FIGS:52C e 52D, respectivamen-te.Regiões determinantes de complementariedade CDR1, CDR2, e CDR3 (SEQ ID NOS:38, 39, e 40, respectivamente) são indicadas por sublinhado.

Exemplo 2 Ligação de Anticorpos a Linhagens Celulares por FACS

[0326]mAb806 foi inicialmente selecionado para caracterização adicional, como revelado aqui e nos seguintes Exemplos. mAb124 e mAb1133 foram também selecionados para caracterização adicional, como discutidos no Exemplo 26 abaixo, e encontraram ter propriedades correspondentes as propriedades únicas do mAb806 aqui discutidas.

[0327]A fim de determinar a especificidade de mAb806, sua ligação às célu-lasU87MG, U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR foi analisada por seleção de célula ati- vada por fluxo (FACS). Brevemente, células foram marcadas com o anticorpo relevante (10 μg/mL) seguido por anti-camundongo IgG de cabra conjugada com fluo- resceína (diluição 1:100; Calbiochem San Diego, CA, EUA; Becton-Dickinson Phar- Mingen, San Diego, CA, EUA) como descrito previamente (Nishikawa et al., 1994). Dados de FACS foram obtidos em um Coulter Epics Elite ESP por observação de um mínimo de 5000 eventos e analisados usando EXPO (versão 2) para Windows. Uma IgG2b irrelevante foi incluído como um isotipo controle para mAb806 e o anticorpo 528 foi incluído como ele reconhece ambos o de2-7 e wtEGFR.

[0328]Somente o anticorpo 528 foi capaz de corar a linhagem celular U87MG parental (FIG. 1) consistente com relatos prévios demonstrando que essas células expressam o wtEGFR (Nishikawa et al, 1994). mAb806 e DH8.3 tiveram níveis de ligação similares ao anticorpo controle, claramente demonstrando que eles são incapazes de ligar ao receptor selvagem (FIG. 1). Ligação do anticorpo isotipo controle às células U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR foi similar àquela observada para as células U87MG.

[0329]Células U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR coradas com mAb806, indicando que mAb806 especificamente reconhece o de2-7 EGFR e EGFR amplificado (FIG.1). Anticorpo DH8.3 corou células U87MG.Δ2-7, confirmando que anticorpo DH8.3 reconhece especificamente o de2-7 EGFR (FIG. 1). Como esperado, o anticorpo 528 corou ambas as linhagens células U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR (FIG. 1). Como esperado, o anticorpo 528 corou U87MG.Δ2-7 com uma intensidade mais alta que a célula parental como ele se liga aos receptores de2-7 e selvagem que são co-expressos nessas células (FIG. 1). Resultados similares foram obtidos usando uma hemadsorção misturada com proteína A que detecta superfície ligada a IgG por aparecimento de Proteína A revestida com hemácias humanas (grupo O) à células alvo. Anticorpo monoclonal 806 foi reativo com células U87MG.Δ2-7, mas não mostrou nenhuma reatividade significante (sobrenadante não diluída menos que 10%) com U87MG expressando EGFR selvagem. Importantemente, mAb806 também ligado a linhagem celular BaF/3.Δ2-7, demonstrando que a co-expressão de wtEGFR não é um requerimento para reatividade mAb806 (FIG. 1).

Exemplo 3 Ligação de Anticorpos em Ensaios

[0330]Para mais caracterizar a especificidade do anticorpo mAb806 e DH8.3, seua ligação foi examinada por ELISA. Dois tipos de ELISA foram usados para determinar a especificidade dos anticorpos. No primeiro ensaio, placas foram revestidas com sEGFR (10 μg/mL em 0,1 M de tampão de carbonato, pH 9.2) por 2 h e então bloqueadas com 2% de albumina sérica humana (HSA) em PBS. sEGFR está no domínio extracelular recombinante (aminoácidos 1-621) do EGFR selvagem, e foi produzido como previamente descrito (Domagala et al (2000) Stoichiometry, kinetic and binding analysis of the interaction between Epidermal Growth Factor (EGF) and the Extracellular Domain of the EGF receptor. Growth Factors. 18, 11-29). Anticorpos foram adicionados aos poços em triplicatas em concentrações crescentes em 2% HSA em salina tamponada com fosfato (PBS). Anticorpo ligado foi detectado por IgG anti-camundongo de ovelha conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Si- lenus, Melbourne, Austrália) usando ABTS (Sigma, Sidnei, Austrália) como um substrato e a medida de absorbância a 405 nm.

[0331]Ambos, anticorpo mAb806 e 528 revelou curvas dose-dependente e de saturação de ligação para imobilizar sEGFR selvagem (FIG. 2A). Como o peptí- deo juncional único encontrado no de2-7 EGFR não está contido dentro de sEGFR, mAb806 deve ser ligado a um epítopo localizado dentro da sequência EGFR selvagem. A ligação do anticorpo 528 foi menos que aquela observada para mAb806, provavelmente porque ele reconhece um determinante conformacional. Como esperado, o anticorpo DH8.3 não se liga ao sEGFR selvagem mesmo em concentrações até 10 μg/mL (FIG. 2A). Embora sEGFR em solução inibiu a ligação do anticorpo 528 ao sEGFR imobilizado em uma forma dose-dependente, ele foi incapaz de inibir a ligação de mAb806 (FIG. 2B). Isto sugere que mAb806 pode somente ligar EGFR selvagem uma vez imobilizado em placas de ELISA, um processo que pode induzir mudanças conformacionais. Resultados similares foram observados usando um BI- Acore embora mAb806 ligado sEGFR imobilizado mas mAb806 imobilizado não foi capaz de ligar sEGFR em solução (FIG. 2C).

[0332]Seguindo desnaturação por aquecimento por 10 min a 95oC, sEGFR em solução foi capaz de inibir a ligação de mAb806 a sEGFR imobilizado (FIG. 2C), confirmando que mAb806 pode ligar ao EGFR selvagem sob certas condições. Inte-ressantemente, o sEGFR desnaturado foi incapaz de inibir a ligação ao anticorpo 528 (FIG. 2C), demonstrando que este anticorpo reconhece um epítopo conformaci- onal. O anticorpo DH8.3 exibiu ligação dose-dependente e saturável ao peptídeo de2-7 EGFR único (FIG. 2D). Nem o anticorpo mAb806 ou 528 ligou ao peptídeo, mesmo em concentrações mais altas que aquelas usadas para obter saturação de ligação do DH8.3, ainda indicando que mAb806 não reconhece um epítopo determinante dentro deste peptídeo.

[0333]No segundo ensaio, o peptídeo específico de2-7 biotinilado (Biotina- LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID NO:5)) foi ligado às placas de ELISA pré-revestidas com estreptavidina (Pierce, Rockford, Illinois). Anticorpos foram ligados e detectados como no primeiro ensaio. Nem o anticorpo mAb806 nem o 528 ligaram ao peptídeo, mesmo em concentrações mais altas que aquelas usadas pra obter saturação de ligação de DH8.3, ainda indicando que mAb806 não reconhece um epítopo determinante dentro deste peptídeo.

[0334]Para ainda demonstrar que mAb806 reconhece um epítopo distinto a partir do peptídeo de junção, experimentos adicionais foram feitos. Peptídeo de2-7 com o C-terminal biotinilado (LEEKKGNYVVTDH-Biotina (SEQ ID NO:6)) foi utilizado nos estudos com mAb806 e mAbL8A4, gerados contra o peptídeo de2-7 (Reist et al. (1995) Cancer Res. 55(19), 4375-4382; Foulon et al. (2000) Cancer Res. 60(16), 4453-4460). Reagentes utilizados nos Estudos de Peptídeo Peptídeo de junção: LEEKKGNYVVTDH-OH (Biosource, Camarillo, CA); Peptídeo C: LEEKKGNYVVTDH(K-Biotina)-OH (Biosource, Camarillo, CA); sEGFR : domínio extracellular solúvel recombinante derivado de célula CHO (aminoácidos 1-621) do EGFR selvagem (LICR Melbourne); mAb806:anticorpo monoclonal de camundongo, IgG2b (LICR NYB); mAbL8A4: anticorpo monoclonal de camundongo, IgG1 (Universidade de Duke); mAb IgG1 isotipo controle; mAb IgG2b isotipo controle.

[0335]Peptídeo C foi imobilizado em um chip microsensor de Estreptavidina em uma densidade de superfície de 350RU (+/- 30RU). Diluições seriadas de mAbs foram testadas para reatividade com o peptídeo. Experimentos de bloqueio usando peptídeo não biotinilado foram feitos para avaliar especificidade.

[0336]mAbL8A4 mostrou forte reatividade com Peptídeo C mesmo em baixas concentrações de anticorpo (6,25 nM) (FIG. 2E). mAb806 não mostrou reativi- dade específica detectável com Peptídeo C até as concentrações de anticorpo de 100 nM (concentração mais alta testada) (FIGS. 2E e 2F). Foi esperado que mAbL8A4 pode reagir com Peptídeo C porque o peptídeo foi usado como imunóge- no na geração de mAbL8A4. Adição do Peptídeo Juncional (não biotinilado, 50 μg/mL) completamente bloqueou a reatividade de mAbL8A4 com Peptídeo C, confirmando a especificidade do anticorpo para o epítopo do peptídeo juncional.

[0337]Em um segundo grupo de experimentos BIAcore, sEGFR foi imobilizado em um chip microsensor CM em uma densidade de superfície de ~4000 RU. Diluições seriadas de mAbs foram testadas para reatividade com eEGFR.

[0338]mAb806 foi fortemente reativo com sEGFR desnaturado enquanto mAbL8A4 não reagiu com sEGFR desnaturado. Reatividade de mAb806 com sEGFR desnaturado diminuiu com concentrações diminuídas de anticorpo. Foi esperado que mAbL8A4 não reagiu com sEGFR porque mAbL8A4 foi gerado usando o peptídeo juncional como o imunógeno e sEGFR não contém o peptídeo juncional.

[0339]Experimentos de imuno-coloração Dot-blot foram também feitos. Diluições seriadas do peptídeo foram pingadas em 0,5 μL em uma membrana de PVDF ou nitrocelulose. Membranas foram bloqueadas com 2% de BSA em PBS, e então experimentadas com anticorpos 806, L8A4, DH8.3 e controle. Anticorpos L8A4 e DH8.3 ligaram ao peptídeo em membranas (dados não mostrados). mAb806 não ligou ao peptídeo em concentrações onde L8A4 claramente mostraram ligação (dado não mostrado). Anticorpos controle foram também negativos para ligação ao pep- tídeo.

[0340]mAb806 ligou ao wtEGFR em lisados de célula seguindo imunoblotting (resultados não mostrados). Isto é diferente a partir de resultados obtidos com anticorpo DH8.3, que reagiu com de2-7 EGFR mas não wtEGFR. Então, mAb806 pode reconhecer o wtEGFR seguindo desnaturação mas não quando o receptor está no estado natural da superfície celular.

Exemplo 4 Análise de Scatchard

[0341]Uma análise Scatchard usando células U87MG.Δ2-7 foi feita seguindo correção para imunoreatividade a fim de determinar a afinidade relativa de cada anticorpo. Anticorpos foram marcados com 125I (Amrad, Melbourne, Austrália) pelo método T Cloramina e imunoreatividade determnada por ensaio Lindmo (Lindmo et al. (1984) Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. J. Immunol. Methods. 72, 77-89).

[0342]Todos os ensaios de ligação foram feitos em 1% de HSA/PBS em 1- 2x106 células U87MG.Δ2-7 ou A431 vivas por 90 min a 4oC com rotação gentil. Uma concentração fixa de 10 ng/mL de anticorpo marcado com 125I foi usada na preseça de concentrações crescentes do anticorpo não marcado apropriado. Ligação não específica foi determinada na presença de 10000 vezes de excesso de anticorpo não marcado. Nem o anticorpo mAb806 ou o DH8.3 radiomarcado com 125I ligado às células U87MG parentais. Após a incubação ser completa, células foram lavadas e contadas para anticoropo marcado 125I ligado usando um contador gama COBRA II (Packard Instrument Company, Meriden, CT, EUA).

[0343]Ambos, anticorpo mAb806 e DH8.3 reteu alta imunoreatividade quando iodinizado e foi tipicamente maior que 90% para mAb806 e 45-50% para o anticorpo DH8.3. mAb806 teve uma afinidade para o receptor de2-7 EGFR de 1,1x109 M-1embora a afinidade de DH8.3 foi algo 10 vezes menor a 1,0x108M-1. Nenhum anticorpo iodinizado ligou as células parentais U87MG. mAb806 reconheceu uma média de 2,4x105de sítios de ligação por célula com o anticorpo DH8.3 ligou uma média de 5,2x105sítios. Então, não houve somente boa concordância no número de receptores entre os anticorpos, mas também com um relato prévio mostrando 2,5x105receptores de2-7 por célula como medida por um anticorpo específico de2-7 EGFR diferente na mesma linhagem celular (Reist et al. (1997) Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenotransplantes after labeling using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 57, 1510-5).

Exemplo 5 Internalização de Anticorpos por Células U87MG.Δ2-7

[0344]A taxa de internalização de anticorpo seguindo ligação a uma célula alvo influencia ambas, propriedades de alvejar tumor e opções terapêuticas. Conse-quentemente, os inventores examinaram a internalização de mAb806 e o anticiorpo DH8.3 seguindo ligação às células U87MG.Δ2-7 por FACS. Células U87MG.Δ2-7 foram incubadas com ou anticorpo mAb806 ou o DH8.3 (10 μg/mL) por 1 h em DMEM a 4oC. Após lavagem, células foram transferidas para DMEM pré-aquecido a 37oC e alíquotas tomadas em vários pontos de tempo seguindo incubação a 37oC. Internalização foi parada por alíquotas imediatamente lavadas em tampão de lavagem gelado (1% HSA/PBS). Ao final do curso de tempo as células foram coradas por FACS como aqui descritos. Porcentagem de internalização foi calculada por comparação da coloração de anticorpo de superfície em vários pontos de tempo para tempo zero usando a fórmula: porcentagem de anticorpo internalizado = (média de fluorescência no tempox - fluorescência do background)/(média de fluroescência no tempoo - fluorescência do background) x 100. Este método foi validado em um ensaio usando um anticorpo iodinizado (mAb806) para medir internalização como previamente descrito (Huang et al. (1997) The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling. J. Biol. Chem. 272, 2927-35). Diferenças na taxa de internalização em diferentes pontos de tempo foram comparadas usando o teste T de Estudante. Através desta pesquisa, dados foram analisados por significância por teste T de Estudante, exceto para ensaios de sobrevivência in vivo, que foram analisados por análise Wilcoxon.

[0345]Ambos os anticorpos mostraram relativamente rápida internalização alcançando níveis de estado fixo em 10 min para mAb806 e 30 min para DH8.3 (FIG. 3). Internalização de DH8.3 foi significantemente mais alta, ambos em termos de taxa (80,5% de DH8.3 internalizado a 10 min comparado a 36,8% para mAb806, p<0,001) e quantidade total internalizada a 60 min (93,5% versus 30,4%, p<0,001). mAb806 mostrou níveis levemente menores de internalização em 30 e 60 minutos comparados ao 20 min em todos os 4 ensaios feitos (FIG. 3). Este resultado também foi confirmada usando um ensaio de internalização baseado em mAb806 iodinizado (dado não mostrado).

Exemplo 6 Análise de Microscopia Eletrônica da Internalização de Anticorpo

[0346]Dado a diferença notada acima nas taxas de internalização entre os anticorpos, uma análise detalhada de tráfego intracelular de anticorpo foi feita usando microscopia eletrônica.

[0347]Células U87MG.Δ2-7 foram crescidas em lâminas revestidas com gelatina (Nunc, Naperville, IL) até 80% de confluência e então lavadas com DMEM gelado. Células foram então incubadas com anticorpo mab806 e DH8.3 em DMEM por 45 min a 4oC. Após lavagem, células foram incubadas por 30 min adicionais com IgG anti-camundongo conjugado com ouro (partículas de 20 nm)(BBInternacional, Cardiff, RU) a 4oC. Seguindo uma lavagem adicional, DMEM pré-aquecido/10% PCS foi adicionado às células, que foram incubadas a 37oC por várias vezes a partir de 1-60 min. Internalização do anticorpo foi parada por meio gelado e células fixadas com 2,5% de glutaraldeído em PBS/0,1% de HSA e então pós-fixada em 2,5% tetróxido de ósmio. Após desidratação através de séries graduadas de acetona, amostras foram embebidas em resina Epon/Araldita, cortada como seções ultrafinas com um micrótomo Reichert Ultracut-S (Leica) e coletadas em grades de níquel. As seções foram coradas com acetato de uranila e levam citrato antes de serem vistas no microscópio eletrônico de transmissão Philips CM12 a 80 kV. Análise estatística dos grãos de ouro contidos dentro dos poços revestidos foi feita usando o teste Qui- quadrado.

[0348]Enquanto o anticorpo DH8.3 foi internalizado predominantemente via poços revestidos, mAb806 pareceu ser internalizado por macropinocitose (FIG. 19). De fato, uma análise detalhada de 32 poços revestidos em células incubadas com mAb806 revelou que nenhum deles continham anticorpo. Em contraste, cerca de 20% de todos os poços revestidos a partir de células incubadas com DH8.3 foram positivos para anticorpo, com um número contendo múltiplos grãos de ouro. Uma análise estatística do número total de grãos de ouro dentro dos poços revestidos encontrou que a diferença foi altamente significante (p<0,001). Aos 20-30 min, ambos anticorpos devem ser vistos nas estruturas que morfolicamente parecem lisos- somos (FIG. 19C). A presença de restos celulares dentro dessas estruturas foi também consistente com sua natureza lisossomal.

Exemplo 7 Biodistribuição de Anticorpos em Camundongos Nude com Tumor

[0349]A biodistribuição do anticorpo mAb806 e o DH8.3 foi comparado em camundongos nude contendo xenotransplantes U87MG em um lado e xenotrans- plantes U87MG.Δ2-7 no outro. Um período de tempo relativamente curto foi escolhido para este estudo como um prévio relato demonstrou que o anticorpo DH8.3 mostra picos de níveis de tumor alvo entre 4-24 h (Hills et al. (1995) Specific targeting of a mutant, activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody. Int. J. Cancer. 63, 537-43).

[0350]Xenotransplantes tumorais foram estabelecidos em camundongos BALB/c nude por injeção s.c. de 3x106de células U87MG, U87MG.Δ2-7 ou A431. Expressao de2-7 em xenotransplantes U87MG.Δ2-7 permanecem estáveis através do período de biodistribuição como medido por imunohistoquímica em vários pontos de tempo (dado não mostrado). Células A431 retêm sua retividade mAb806 quando crescido como xenotransplantes tumorais como determinado por imunohistoquímica. Células U87MG ou A431 foram injetadas em um lado 7-10 dias antes das células U87MG.Δ2-7 forem injetadas no outro lado porque o crescimento mais rápido observado para a xenotransplantes expressando de2-7 EGFR. Anticorpos foram radio- marcados e avaliados para imunoreatividade como descrito acima e foram injetados em camundongos pela via retro-orbital quando tumores foram 100-200 mg em peso. Cada camundongo recebeu dois anticorpos diferentes (2 μg por anticorpo): 2 μCi de mAb806 marcado com 125I e 2 μCi de DH8.3 ou 528 marcado com 131I. A menos que indicado, grupos de 5 camundongos foram sacrificados em vários pontos de tempo pós-injeção e sangua obtido por punção cardíaca. Os tumores de fígado, baço, rins e pulmões foram obtidos por dissecção. Todos os tecidos foram pesados e avaliados pela atividade 125I e 131I usando um contador de canal duplo Window. Dados foram expressos para cada anticorpo como % IG/g de tumores determinados por comparação aos padrões de dose injetados ou convertidos em tumor pelas proporções de sangue/fígado (isto é, % ID/g de tumor dividido por % ID/g de sangue ou fígado). Diferenças entre grupos foram analisados por teste T de Estudante. Após injeção de mAb806 radiomarcado, alguns tumores foram fixados em formalina, embedidos em parafina, cortados em seções de 5 μm e então expostos em filme de raio X (AGFA, Mortsel, Bélgica) para determinar localização de anticorpo por autoradiografia.

[0351]Em termos de %ID/g de tumor, mAb806 alcançou seu nível pico em xenotransplantes U87MG.Δ2-7 de 18,6 %m/g de tumor em 8 h (FIG. 4A), considera-velmente mais alto que qualquer outro tecido exceto sangue. Enquanto DH8.3 também mostrou níveis de tumor pico em 8 h, o nível foi estatisticamente (p < 0,001) menor que 8,8 % m/g de tumor comparado a mAb806 (FIG. 4B). Níveis de ambos anticorpos lentamente declinaram em 24 e 48 h. Autoradiografia de seções de tecido xenotransplante U87MG.Δ2-7 coletadas 8 h após injeção com mAb806 marcado com 125I sozinho, claramente ilustra localização de anticorpo para tumor viável (FIG. 20). Nenhum anticorpo mostrou alvo específico de xenotransplantes parentais U87MG (FIGS. 4A e 4B). Com relação ao tumor para as proporções sangue/fígado, mAb806 mostraram a proporção mais alta a 24 h para ambos, sangue (proporção de 1,3) e fígado (proporção de 6,1) (FIGS. 5A e 5B). O anticorpo DH8.3 teve sua proporção mais alta no sangue em 8 h (proporção de 0,38) e em 24 h no fígado (proporção de 1,5) (FIGS. 5A e 5B), ambos os quais são consideravelmente menores que os valores obtidos para mAb806.

[0352]Como descrito acima, níveis de mAb806 no tumor tiveram puco em 8 horas. Enquanto este pico é relativamente precoce comparado a muitos anticorpos com alvo em tumores, ele é completamente consistente com outros estudos usando os anticorpos de2-7 específicos, em que todos mostraram picos em 4-24 horas pós- injeção quando usando uma dose similar de anticorpo antibody (Hills et al., 1995; Reist et al., 1997; Reist et al. (1996) Radioiodination of internalizing monoclonal antibodies using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 56, 4970-7). De fato, diferente dos relatos anteriores, o ponto de tempo 8 h foi incluído na hipótese que o anticorpo alvo pode rapidamente atingir o pico rapidamente. A % ID/g de tumor vista com mAb806 foi similar àquela relatada para outros anticorpos de2-7 EGFR específicos quando usando técnicas de iodinação padrões (Hills et al., 1995; Huang et al., 1997; Reist et al. (1995) Tumor-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies: use of the tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumor xenotransplantes. Cancer Res. 55, 4375-82).

[0353]A razão para o pico precoce é provavelmente duas vezes. Primeiramente, tumores expressando o de2-7 EGFR, incluindo as células U87MG transfec- tadas, crescem extremamente rápido como xenotransplantes de tumor. Então, mesmo durante o período de tempo relativamente curto usado nestes estudos de biodis- tribuição, o tamanho do tumor aumenta em tal extensão (aumento de 5-10 vezes em massa por 4 dias) que a % ID/g de tumor é reduziada comparado com tumores de crescimento mais lento. Segundo, enquanto a internalização de mAb806 foi relativamente mais lenta comparado a DH8.3, ele é ainda rápido com respeito a muitos outros sistemas de anticorpo/antígeno tumorais. Anticorpos internalizados passam por rápida proteólises com os produtos de degradação sendo excretados a partir da célula (Press et al. (1990) Inhibition of catabolism of radiolabeled antibodies by tumor cells using lysosomotropic amines and carboxylic ionophores. Cancer Res. 50, 1243- 50). Este processoo de internalização, degradação e excreção reduz a quantidade de anticorpo iodinizado retido dentro da célula. Consequentemente, anticorpos internalizados mostram níveis menores de alvo que suas contrapartes não internalizadas. Os dados de microscopia eletrônica relatados aqui demonstram que mAb806 internalizados são rapidamente transportados para lisossomas onde a rápida degradação presumivelmente ocorre. Esta observação é consistente com a rápida expulsão de iodo a partir da célula.

[0354]O anticorpo monoclonal L8A4 previamente descrito direcionado ao peptídeo juncional único encontrado no de2-7 EGFR, se comporta em uma forma similar ao mAb806 (Reist et al (1997) In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody: comparison with its murine parent. Nucl. Med. Biol. 24, 639-47). Usando células U87MG transfectadas com de2-7 EGFR, este anticorpo teve uma taxa de internalização similar (35% em 1 hora comparado a 30% em 1 hora para mAb806) e revelou comparável alvo in vivo quando usando fibroblastos 3T3 transfectado com de2-7 EGFR (pico de 24% IG/g de tumor em 24 horas comparado a 18% ID/g de tumor em 8 horas para mAb806) (Reist et al. (1997) Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenotransplantes after labeling using N-succinimidyl 5- iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 57, 1510-5).

[0355]Interessantemente, retenção in vivo deste anticorpo em tumores xeno- transplantes foi aumentada quando marcado com carboxilato de N-succinimidil 5- iodo-3-piridina (Reist et al, 1997). Este grupo prostético é positivamente carregado no pH lisossomal e então tem retenção celular aumentada (Reist et al. (1996) Radioiodination of internalizing monoclonal antibodies using N-succinimidyl 5-iodo-3- pyridinecarboxylate. Cancer Res. 56, 4970-7). Retenção aumentada é potencialmenteútil quando considerando um anticorpo para radioimunoterapia e este método pode ser utilizado para melhorar a retenção de mAb806 iodinado ou seus fragmento os.

Exemplo 8 Ligação de mAb806 às Células Contendo EGFR Amplificado

[0356]Para examinar se mAb806 pode reconhecer o EGFR expresso em células contendo um gene do receptor amplificado, sua ligação às células A431 foi analisado. Como previamente descrito, células A431 são células de carcinoma escamoso humano e expressam altos níveis de wtEGFR. Baixa, mas altamente reprodutíveis, ligação de mAb806 às células A431 foi observada por análise de FACS (FIG. 6). O anticorpo DH8.3 não se liga às células A431, indicando que a ligação de mAb806 não foi o resultado de baixo nível de expressão de de2-7 EGFR (FIG. 6). Como esperado, o anticorpo anti-EGFR 528 mostrou forte coloração de células A431 (FIG. 6). Dado este resultado, ligação de mAb806 à A431 foi caracterizada por análise Scatchard. Enquanto a ligação de mAb806 iodinado foi comparativamente baixa, é possível ter dados consistentes para Scatchard. A média de três tais experimentos deu um valor para afinidade de 9,5x107M-1com 2,4x105receptores por célula. Então, a afinidade para este receptor foi algo 10 vezes menor que a afinidade para o de2-7 EGFR. Além disso, mAb806 parece somente reconhecer uma pequena porção do EGFR encontrada na superfície das células A321. O anticorpo 528 mediu aproximadamente 2x106receptores por célula o que está em acordo com numerosos outros estudos (Santon et al. (1986) Effects of epidermal growth factor receptor concentration on tumorigenicity of A431 cells in nude mice. Cancer Res. 46, 4701-5).

[0357]Para garantir que esses resultados não foram restritos a linhagem celular A431, a reatividade de mAb806 foi examinada em outras 2 linhagens celulares exibindo a amplificação do gene EGFR. Ambas, a linhagem celular de cabeça e pescoço HN5 (Kwok TT and Sutherland RM (1991) Differences in EGF related radiosensitisation of human squamous carcinoma cells with high and low numbers of EGF receptors. Br. J. Cancer. 64, 251-4) e a linhagem celular de câncer de mama MDA- 468 (Filmus et al. (1985) MDA-468, a human breast cancer cell line with a high number of epidermal growth factor (EGF) receptors, has an amplified EGF receptor gene and is growth inhibited by EGF. Biochem. Biophys. Res. Commun. 128, 898-905) tem sido relatada para conter múltiplas cópias do gene EGFR. Consistente com esses relatos, o anticorpo 528 revelou coloração intensa de ambas as linhagens celulares (FIG. 21). Como com a linhagem celular A431, o mAb806 claramente corou ambas as linhagens celulares, mas em um nível menor que aquele observado com o anticorpo 528 (FIG. 21). Então, ligação mAb806 não é simplesmente restrita às células A431, mas parece ser uma observação geral para células contendo a amplificação do gene EGFR.

[0358]Reconhecimento do sEGFR selvagem por mAb806 claramente requer alguma desnaturação do receptor a fim de expor o epítopo. A extensão de desnatu-raçãorequerida é somente leve como igual absorção do sEGFR selvagem em uma superfície plástica induzida pode ligação robusta do mAb806 em ensaios de ELISA. Como mAb806 somente ligou aproximadamente 10% do EGFR na superfície de células A431, ele é atraente para especular que este subgrupo de receptores pode ter uma conformação alterada similar àquela induzida pelo de2-7 EGFR truncado. De fato, a expressão extremamente alta do EGFR mediada por amplificação gênica em células A431 pode causar alguns receptores serem incorretamente processados, levando a conformação alterada. Interessantemente, imunobloting semi-quantitativo de lisados celulares A431 com mAb806 mostrou que ele pode reconhecer a maioria dos receptores A431 EGF seguindo SDS-PAGE e transferência para western. Este resultado ainda suporta o argumento que mAb806 está ligado a um subgrupo de receptores na superfície de células A431 que têm uma conformação alterada. Essas observações nas células A431 são consistentes com os dados de imunohistoquími- ca demonstrando que mAb806 se liga a gliomas contendo amplificação do gene EGFR. Como mAb806 foi completamente negativo em células U87MG parentais, ele pode parecer que este fenômero pode ser restrito às células contendo EGFR amplificado embora o nível de receptor “desnaturado” na superfície das células U87MG pode ser abaixo do nível de detecção. Entretanto, isto pode parecer improvável, como mAb806 iodinizado não se ligar a concentrados de célula U87MG contendo até 1x107células.

Exemplo 9 Alvo in vivo de Células A431 por mAb806

[0359]Um segundo estudo de biodistribuição foi feito com mAb806 para de-terminar se ele pode direcionar xenotransplantes tumores A431. O estudo foi conduzido por um curso de tempo mais longo a fim de obter mais informação em relação ao direcionamento de xenotransplantes U87MG.Δ2-7 por mAb806, que foram incluídos em todos os camundongos como um controle positivo. Em adição, o anticorpo anti-EGFR 528 foi incluído como um controle positivo para os xenotransplantes A431, desde que um estudo prévio demonstrou baixo mas significante direcionamento deste anticorpo para células A431 crescidas em camundongos nude (Masui et al. (1984) Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies. Cancer Res. 44, 1002-7).

[0360]Durante as primeiras 48 horas, mAb806 revelou propriedades de dire-cionamento quase idênticas àquelas observadas nos experimentos iniciais (FIG. 7A comparada com FIG. 4A). Em termos de % ID/g de turmo, níveis de mAb806 em xe- notransplantes U87MG.Δ2-7 lentamente declinaram após 24 h, mas sempre permanecem mais altos que níveis detectados em tecido normal. Captação nos xenotrans- plantes A431 foi comparativamente baixa, entretanto, existiu um pequeno aumento na % IG/g de tumor durante as primeiras 24 h , não observada em tecidos normais tais como fígado, baço, rim e pulmão (FIG. 7A). Captação do anticorpo 528 foi muito baixa em ambos xenotransplantes quando expressos como % ID/g de tumor (FIG. 7B) parcialmente devido à depuração mais rápida deste anticorpo a partir do san- gue. Autoradiografia de seções de tecido xenotransplante A431 coletada 24 horas após a injeção com mAb806 marcada com 125I, claramente ilustra localização de anticorpo a tumor viável ao redor da periferia do tumor e não em áreas centrais de necrose (FIG. 23). Em termos de proporção tumor para sangue, mAb806 teve seu pico em 72 horas para xenotransplantes U87MG.Δ2-7 e 100 horas para xenotransplantes A431 (FIGS. 8A, B). Enquanto a proporção tumor para sangue para mAb806 nunca ultrapassa 1.0 com respeito ao tumor A431, ele aumenta através de todo o curso do tempo (FIG. 8B) e foi maior que em todos os outros tecidos examinados (dado não mostrado) indicando baixos níveis de direcionamento.

[0361]A proporção tumor para sangue para o anticorpo 528 mostrou um perfil similar ao mAb806, embora níveis mais altos foram notados nos xenotransplantes A431 (FIGS. 8A, B). mAb806 teve um pico de proporção tumor para fígado em xeno- transplantes U87MG.Δ2-7 de 7,6 em 72 horas, claramente demonstrando captação preferencial nesses tumores comparado ao tecido normal (FIG. 8C). Outras proporções tumor para órgão para mAb806 foram similares àquelas observadas no fígado (dado não mostrado). O pico da proporção tumor para fígado para mAb806 em xe- notransplantes A431 foi 2.0 em 100 h, novamente indicando uma leve captação preferencial no tumor comparada com tecido normal (FIG. 8D).

Exemplo 10 Estudos de Terapia

[0362]OS efeitos do mAb806 foram avaliados em dois modelos xenotrans- plantes de doença-a modelo preventivo e um modelo de tumor estabelecido.

Modelos Xenotransplante

[0363]Consistente com prévios relatos (Nishikawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91(16), 7727-7731), células U87MG transfectadas com de2-7 EGFR cresceram mais rapidamente que células parentais e células U87MG transfectadas com wtEGFR. Assim, não foi possível crescer ambos os tipos celulares no mesmo camundongo.

[0364]Células tumorais (3x106) em 100 mL de PBS foram inoculadas subcu- taneamente em ambos os flancos de camundongos nude fêmeas de 4-6 semanas de idade (Animal Research Centre, Western Austrália, Austrália). Eficácia terapêutica de mAb806 foi investigada em ambos, modelos de tumor preventivo e estabelecido. No modelo preventivo, 5 camundongos com dois xenotransplantes cada foram tratados intraperitonealmente com ou 1 ou 0,1 mg de mAb806 ou veículo (PBS), iniciando no dia antes da inoculação da célula tumoral. Tratamento foi continuado por um total de 6 doses, 3 vezes por semana por 2 semanas. No modelo estabelecido, tratamento foi iniciado quando tumores alcançaram um volume médio de 65 ± 6,42 mm3 (U87MG.Δ2-7), 84 ± 9,07 mm3 (U87MG), 73 ± 7,5 mm3 (U87MG.wtEGFR) ou 201 ± 19,09 mm3(tumores A431). Volume de tumor em mm3foi determinado usando a fórmula (comprimento x largura2)/2, onde comprimento foi o eixo mais longo e largura a medida em ângulos diretos ao comprimento (Clark et al. (2000) Therapeutic efficacy of anti-Lewis (y) humanized 3S 193 radioimmunotherapy in a breast cancer model: enhanced activity when combined with Taxol chemotherapy. Clin. Cancer Res. 6, 3621-3628). Dados foram expressos como volume médio do tumor ± EP para cada grupo de tratamento. Análise estatística foi feita em dados pontos de tempo usando teste T de Estudante. Animais foram eutanaziados quando os xenotrans- plantes alcançaram um volume aproximado de 1,5 cm3e os tumores retirados para exame histológico. Este projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal e Centro de Repatriação Médico.

Exame Histológico de Xenotransplantes Tumorais

[0365]Xenotransplantes foram cortados e bi-seccionados. Uma metade foi fixada em 10% de formalina/PBS antes de ser embebida em parafina. Quatro seções micron foram então cortadas e coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para examehistológico de rotina. A outra metade foi embebida em composto Tissur Tek® OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), congelado em nitrogênio líquido e estocado em -80oC. Seções finas (5 mícron) em criostato foram cortadas e fixadas em acetona gelada por 10 min, seguido por secagem em ar por 10 min adicionais. Seções foram bloqueadas em reagente bloqueador de proteína (Lipshaw Immunon, Pittsburgh, EUA) por 10 min e então incubada com anticorpo primário biotinilado (1 mg/mL), por 30 min em temperatura ambiente (TA). Todos os anticorpos foram biotinilados usando o módulo de biotinilação de proteína ECL (Amersham, Baulkham Hills, Austrália), de acordo com as instruções do fabricante. Após lavagem com PBS, seções foram incubadas com um complexo de estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre por um adicional de 30 min (Silenus, Melbourne, Austrália). Seguindo uma lavagem PBS com PBS, as seções foram expostas ao substrato 3-amino-9-etilcarbozol (AEC) (0,1 M de ácido acético, 0,1 M de acetato de sódio, 0,02 M de AEC (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) em presença de peróxido de hidrogênio por 30 min. Seções foram lavadas com água e contra-coradas com hematoxilina por 5 min e montadas.

Eficácia de mAb806 no Modelo Preventivo

[0366]mAb806 foi examinado para eficácia contra tumores U87MG e U87MG.Δ2-7 em um modelo xenotransplante preventivo. Anticorpo ou veículo foram administrados i.p. o dia antes da inoculação tumoral e foi dado 3 vezes por semana por 2 semanas. mAb806 não teve efeito no crescimento de xenotransplantes U87MG parental, que expressa o wtEGFR, em uma dose de 1 mg por injeção (FIG. 9A). Em contraste, mAb806 significantemente inibiu o crescimento de xenotransplan- tes U87MG.Δ2-7 em uma forma dose dependente (FIG. 9B). No dia 20, quando animais controle foram sacrificados, a média do volume do tumor foi 1637 ± 178,98 mm3para o grupo controle, um estatisticamente menor 526 ± 84,74 mm3para o grupo 0,1 mg por injeção (p<0,0001) e 197 ± 42,06 mm3para o grupo 1 mg de injeção (p<0,0001). Grupos de tratamento foram sacrificados no dia 24 em cujo tempo a média de volumes de tumor foi 1287 ± 243.03 mm3para o grupo tratado 0.1 mg e 492 ± 100.8 mm3para o grupo 1 mg.

Eficácia de mAb806 em Modelo Xenotransplante Estabelecido

[0367]Dada a eficácia de mAb806 em modelo xenotransplante preventivo, sua habilidade de inibir o crescimento de xenotransplantes tumor estabelecidos foi então examinada. Tratamento com anticorpo foi como descrito no modelo preventivo exceto que ele começou quando tumores alcançaram um volume de tumor médio de 65 ± 6,42 mm3 para os xenotransplantes U87MG.Δ2-7 e 84 ± 9,07 mm3 para os xe- notransplantes U87MG parentais. Mais uma vez, mAb806 não teve efeito no crescimento dos xenotransplantes U87MG parentais em uma dose de 1 mg por injeção (FIG. 10A). Em contraste, mAb806 significantemente inibiu o crescimento de xeno- transplantes U87MG.Δ2-7 em uma forma dose-dependente (FIG. 10B). No dia 17, um dia antes animais controle foram sacrificados, o volume médio de tumor foi 935 ± 215,04 mm3para o grupo controle, 386 ± 57,51 mm3para o grupo 0,1 mg por injeção (p<0,01) e 217 ± 58,17 mm3para o grupo 1 mg de injeção (p< 0,002).

[0368]Para examinar se a inibição do crescimento observada com mAb806 foi restrita a célula expressando de2-7 EGFR, sua eficácia contra xenotransplantes tumores U87MG.wtEGFR foi examinada em um modelo estabelecido. Essas células serviram como um modelo para tumores contendo amplificação do gene EGFR sem expressão de2-7 EGFR. Tratamento com mAb806 começou quando tumores alcançaram um volume médio de tumor de 73 ± 7,5 mm3. mAb806 significantemente inibiu o crescimento de xenotransplantes U87MG.wtEGFR estabelecidos quando comparado aos tumores controle tratados com veículo (FIG. 10C). No dia que os animais controle foram sacrificados, o volume médio do tumor foi 906 ± 268,9 mm3para o grupo controle e 468 ± 78,38 mm3para o grupo tratado com injeções de 1 mg (p<0,04).

Análise Histológica e Imunohistoquímica de Tumores Estabelecidos

[0369]Para avaliar as potenciais diferenças histológicas entre xenotransplan- tes U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR tratados com mAb806 e controle (coletados nos dias 24 e 42, respectivamente), seções fixadas em formalina e embebidas em parafina foram coradas com H&E. Áreas de necrose foram vistas em seções a partir de ambos xenotransplantes, U87MG.Δ2-7 (coletados 3 dias após o tratamento terminar), e U87MG.wtEGFR (coletado 9 dias após o tratamento terminar) tratados com mAb806. Este resultado foi consistentemente observado em um número de xeno- transplantes tumores (n=4). Entretanto, análise de seçÕes a partir de xenotransplan- tes tratados com controle não revelaram as mesmas áreas de necrose vistas com tratamento mAb806. Seções a partir de mAb806 ou controle tratados com xeno- transplantes U87MG foram também corados com H&E e não revelaram diferenças na viabilidade celular entre os dois grupos, ainda sustentando a hipótese que ligação de mAb806 induz diminuição da viabilidade/necrose celular dentro do xenotransplan- tes tumoral.

[0370]Uma análise imunohistoquímica de seções xenotransplantes U87MG, U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR foi feita para determinar os níveis de expressão de2-7 e wtEGFR seguindo o tratamento mAb806. Seções foram coletadas nos dias 24 e 42 como acima, e foram imunocoradas com os anticorpos 528 ou 806. Como esperados, o anticorpo 528 corou todas as seções xenotransplante com nenhuma diminuição óbvia na intensidade entre os tumores tratados e controle. Coloração das seções U87MG foi indetectável com o mAb806, entretanto coloração positiva de seções xenotransplante U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR foi observada. N!ao existiu diferença na densidade de coloração por mAb806 entre xenotransplantes U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR controle e tratado sugerindo que o tratamento com anticorpo não regulou negativamente a expressão de de2-7 ou wtEGFR.

Tratamento do Xenotransplante A431 com mAb806

[0371]Para demonstrar que os efeitos anti-tumor de mAb806 não foram res-tritosàs células U87MG, o anticorpo foi administrado aos camundongos com xeno- transplantes A431. Essas células contêm um gene EGFR amplificado e expressam aproximadamente 2x106receptores por célula. Como descrito acima, mAb806 se liga a cerca de 10% desses EGFR e direcionam xenotransplantes A431. mAb806 significantemente inibem o crescimento de xenotransplantes A431 quando examinados no modelo xenotransplante preventivo previamente descrito (FIG. 11A). No dia 13, quando animais controle foram sacrificados, o volume médio de tumor foi 1385 ± 147,54 mm3no grupo controle e 260 ± 60,33 mm3para grupos de tratamento com 1 mg por injeção (p<0,0001).

[0372]Em um experimento separado, uma dose de 0,1 mg de mAb também significantemente inibiu o crescimento de xenotransplantes A431 em um modelo preventivo.

[0373]Dada a eficácia do mAb806 no modelo xenotransplante A431 preventivo, sua habilidade em inibir o crescimento de tumores xenotransplantes estabelecidos foi examinada. Tratamento com anticorpo foi como descrito no modelo preventivo, exceto que ele não foi inicado até tumores alcançarem um volume médio de tumor de 201 ± 19,09 mm3. mAb806 significantemente inibiu o crescimento de xeno- transplantes tumorais estabelecidos (FIG. 11B). No dia 13, quando animais controle foram sacrificados, o volume médio de tumor foi 1142 ± 120,06 mm3para o grupo controle e 451 ± 65,58 mm3para o grupo de injeção de 1 mg (p<0,0001).

[0374]Em resumo, os estudos de terapia com mAb806 descritos aqui claramente demonstraram inibição dose-dependente do crescimento do xenotransplante U87MG.Δ2-7. Em contraste, nenhuma inibição de xenotransplantes U87MG parentais foi observada a despeito do fato que eles continuam a expressar o wtEGFR in vivo. mAb806 não somente significativamente reduziu o volume do xenotransplante, ele também induziu significativamente a necrose dentro do tumor. Este é o primeiro relato mostrando terapêutica de sucesso de tal um anticorpo in vivo contra um de2-7 EGFR humano expressando xenotransplantes glioma.

[0375]Amplificação do gene do EGFR tem sido relatada em um número de tumores diferentes e é observada em aproximadamente 50% de gliomas (Voldberg et al, 1997). Tem sido proposto que a subsequente super expressão de EGFR mediada pela amplificação do gene do receptor pode conferir um crescimento vantajoso por aumento da sinalização intracelular e crescimento celular (Filmus et al, 1987). A linhagem celular U87MG foi transfectada com o wtEGFR a fim de produzir uma célula de glioma que mimetiza o processo de amplificação do gene EGFR. Tratamento de xenotransplantes U87MG.wtEGFR estabelecidos com mAb806 resultou em inibição significante do crescimento. Então, mAb806 também medeia atividade antitumor in vivo contra células contendo amplificação do gene EGFR. Interessantemente,inibição de mAb806 de xenotransplantes U87MG.wtEGFR parece ser menos efetivo que aquela observada com tumores U87MG.Δ2-7. Isto provavelmente reflete o fato que mAb806 tem uma afinidade menor para o EGFR amplificado e somente se liga a uma pequena proporção de receptores expressos na superfície celular. Entretanto, deve ser notado que a despeito do pequeno efeito nos volumes xenotrans- plantes U87MG.wt EGFR, tratamento com mAb806 produziu grandes áreas de necrose dentro desses xenotransplantes.

[0376]Para excluir a possibilidade que mAb806 somente medeia inibição do U87MG derivado de linhagens celulares, nós testamos sua eficácia contra xeno- transplantes A431. Esta linhagem celular derivada de carcinoma de célula escamosa contém significante amplificação do gene EGFR que é retida em ambos, in vitro e in vivo. Tratamento de xenotransplantes A431 com mAb806 produziu significante inibição do crescimento em ambos, um modelo preventivo e estabelecido, indicando os efeitos anti-tumor de mAb806 não são restritos para linhagens de célula U87MG transfectadas.

Exemplo 11 Tratamento de Terapia de Combinação de Xenotransplantes A431 com mAb806 e AG1478

[0377]Os efeitos anti-tumor de mAb806 combinados com AG1478 foram testados em camundongos com xenotransplantes A431. AG1478 (4-(3-cloroanilina)-6,7- dimetoxiquinazolina) é um potente e seletivo inibidor da EGFR quinase versus HER2-neu e receptor do fator de crescimento derivado de plaqueta quinase (Calbio- chem Cat. No. 658552). Três controles foram inclusos: tratamento somente com veículo,veículo + mAb806 somente, e veículo + Ag1478 somente. Os resultados são ilustrados na FIG. 12. 0,1 mg de mAb806 foi administrado no dia 1 antes do xeno- transplante e 1, 3, 6, 8 e 10 dias após xenotransplante. 400 μg de Ag1478 foram administrados nos dias 0, 2, 4, 7, 9 e 11 após xenotransplante.

[0378]Ambos, AG1478 e mAb806, quando administrados sozinhos, produziram uma redução significante do volume do tumor. Entretanto, em combinação, a redução do volume do tumor foi muito aumentada.

[0379]Em adição, a ligação de mAb806 para EGFR de células A431 foi avaliada na ausência e presença de AG1478. Células foram colocadas no meio livre sérico por uma noite, então tratadas com AG1478 por 10 min a 37oC, lavado duas vezes em PBS, então lisadas no Tritin 1% e lisados preparados por centrifugação por 10 min a 12000 g. Lisado foi então avaliado para reatividade 806 por um ELISA em uma versão modificada de um ensaio descrito por Schooler e Wiley, Analytical Biochesmistry 277, 135-142 (2000). Placas foram revestidas com 10 μg/mL de mAb806 em PBS/EDTA por uma noite em temperatura ambiente e então lavadas duas vezes. Placas foram então bloqueadas com 10% de albumina sérica/PBS por 2 horas a 37oC e lavada duas vezes. Um lisado celular 1:20 foi adicionado em 10% de albumina sérica/PBS por 1 hora a 37oC, então lavado quatro vezes. Anti-EGFR (SC- 03; Santa Cruz Biotechnology Inc.) em 10% de albumina sérica/PBS foi reagido por 90 minutos em temperatura ambiente, a placa lavada quatro vezes, e o anti-coelho- HRP (1:2000 se da Silenus) em 1-% de albumina sérica/PBS foi adicionado por 90 minutos em temperatura ambiente, lavado quatro vezes, e a cor desenvolvida usando ABTS como um substrato. Foi encontrado que ligação Ab806 é significativamente aumentada em presença de quantidades aumentadas de AG1478 (FIG. 13).

Exemplo 12 Imunoreatividade em Glioblastomas Humanos Pré-Classificados para o Estado de EGFR

[0380]Dado a alta indicência da expressão EGFR, amplificação e mutação em glioblastomas, um estudo imunohistoquímico detalhado foi feito a fim de avaliar a especificidade de 806 em tumores outros que xenotransplantes. Um painel de 16 glioblastomas foi analisado por imunohistoquímica. Este painel de 16 glioblastomas foi pré-classificado por RT-PCR para a presença de EGFR selvagem amplificado e expressão de2-7 EGFR. Seis desses tumores expressaram somente o transcrito wtEGFR, 10 tiveram amplificação do gene wtEGFR com 5 desses mostrando transcritos EGFR selvagens somente, e 5 ambos, EGFR selvagem e gene transcrito de2- 7.

[0381]Análise imunohistoquímica foi feita usando seções de 5 mm de tecido recentemente congelado aplicado à lâmicas histológicas e fixados por 10 minutos em acetona gelada. Anticorpo primário ligado foi detectado com anticorpo anti- camundongo de cavalo biotinilado seguido por uma reação complexo avidina-biotina. Tetra cloridrato de diaminobenzidina (DAB) foi usado como cromógeno. A extensão da reatividade imunohistoquímica em tecidos foi estimada por luz microscópica e graduada de acordo com o número de células imunoreativas em 25% de aumento como segue:

[0382]O anticorpo 528 mostrou intensa reatividade em todos os tumores, enquanto imunocoloração com DH8.3 foi restrita àqueles tumores expressando o de2-7 EGFR (Tabela 2). Consistente com as prévias observações em FACS e ensaios de roseta, mAb806 não reagiu com os glioblastomas expressando o wtEGFR transcrito a partir de genes EGFR não amplificados (Tabela 2). Este padrão de reati- vidade para mAb806 é similar àquela observada nos estudos xenográficos e novamente sugere que este anticorpo reconhece o de2-7 e EGFR amplificado mas não o wtEGFR quando expresso nas superfície celular. Tabela 2 Imunoreatividade de mAbs528, DH8.3 e 806 em glioblastomas pré- classificados para a presença de EGFR selvagem e de2-7 EGFR mutado e para seu estado de amplificação

* coloração focal

Exemplo 13 Imunoreatividade de EGFR em Tecido Normal

[0383]A fim de determinar se o de2-7 EGFR é expresso em tecido normal, um estudo imunohistoquímico com mAb806 e DH8.3 foi conduzido em um painel de 25 tecidos. Não houve forte imunoreatividade com ou mAb806 ou DH8.3 em qualquer tecido testado, sugerindo que o de2-7 EGFR está ausente em tecidos normais (Tabela 3). Existiu alguma variável de coloração presente em tonsilas com mAb806 que foi restrita a camada celular basal das células escamosas da epiderme e mucosa do epitélio. Na placenta, imunocoloração ocasional do epitélio trofoblasto foi observada. Interessantemente, dois tecidos que expressam altos níveis endógenos de wtEGFR, o fígado e pele, falharam em mostram qualquer reatividade mAb806 signi- ficante. Nenhuma reatividade foi observada com as amostras do fígado de forma alguma, e somente fraca e inconsistente reatividade focal foi detectada ocasionalmente (em não mais que 10% de todas as amostras estudadas) em queratinócitos basais em amostras da pele e no epitélio escamoso da mucosa tonsila, ainda demonstrando que este anticorpo não se liga a wtEGFR expresso na superfície das células em qualquer extensão significante (Tabela 3). Todos os tecidos foram positivos para wtEGFR como evidenciado por coloração universal vista com o anticorpo 528 (Tabela 3). Tabela 3 Reatividade de 528, DH8.3 e 806 em tecidos normais

*alguma coloração estromal em vários tecidos

Exemplo 14 Imunoreatividade EGFR em Vários Tumores

[0384]A extensão do de2-7 EGFR em outros tipos de tumores foi examinada usando um painel de 12 diferentes malignidades. O anticorpo 528 mostrou sempre coloração homogênea em muitos tumores analisados, exceto melanoma e seminoma. Quando presente, imunoreatividade DH8.3 foi restrita a célula tumoral focal ocasional indicando que há pouca se há expressão de de2-7 EGFR em tumores fora do cérebro usando este sistema de detecção (Tabela 4). Há também coloração focal de vasos sanguíneos e uma variedade de coloração difusa de tecido conectivo com o anticorpo DH8.3 em alguns tumores (Tabela 4). Esta coloração foi fortemente dependente da concentração de anticorpo usada e foi considerada reatividade de backgroung não específica. O mAb806 mostrou coloração positiva em 64% de tumores de cabeça e pescoço e 50% de carcinomas de pulmão (Tabela 4). Houve pouca reatividade de mAb806 em outra parte exceto em tumores urinários que foram positivos em 30% dos casos.

[0385]Desde que os cânceres de cabeça e pescoço e pulmão foram negativos para o anticorpo DH8.3, a reatividade vista com o mAb nesses tumores pode ser associada com amplificação do gene EGFR. Tabela 4 Anticorpos monoclonais 528, DH8.3 e 806 no painel de tumores

Exemplo 15 Imunoreatividade em Glioblastomas Humanos Não Selecionados para Estado EGFR

[0386]A fim de confirmar a especificidade única e avaliar a reatividade de mAb806, ele foi comparado aos anticorpos 528 e DH8.3 em um painel de 46 glioblastomas não pré-selecionados para o estado EGFR. O anticorpo 528 foi fortemente e homogeneamente positivo em todas as amostras, exceto duas (Nos. 27 e 29) (44/46, 95,7%). Esses dois casos doram também negativos para mAb806 e mAbFH8.3. O mAb806 foi positivo em 27/46 (58,7%) casos, 22 dos quais revelou imunoreatividade homogênea em mais de 50% do tumor. O anticorpo DH8.3 foi positivo em 15/46 (32,6%) glioblastomas, 9 dos quais mostraram imunoreatividade homogênea. A coloração imunoquímica desses tumores não selecionados é tabulada na Tabela 5.

[0387]Houve concordância entre mAb806 e DH8.3 em cada caso, exceto um (No. 35). Uma análise molecular para a presença da amplificação EGFR foi feita em 44 casos (Tabela 5). Desses, 30 casos co-classificados com o padrão de imunorea- tividade de mAb806 previamente estabelecido: por exemplo, 16 casos negativos de mAb806 revelaram nenhuma amplificação de EGFR e 14 casos amplificados de EGFR foram também imunopositivos para mAb806. Entretanto, 13 casos, que mostraram imunoreatividade para 806, foram negativos para amplificação EGFR enquanto um caso EGFR-amplificado foi negativo para mAb806. Análise adicional do estado de mutação desses casos de amplificação negativa e positivos para 806 é descrito abaixo e provê explanação para a maioria dos 13 casos que foram negativos para amplificação EGFR e foram reconhecidos por 806.

[0388]Subsequentemente, uma análise molecular da deleção da mutação por RT-PCR foi feita em 41/46 casos (Tabela 5). Desses, 34 casos co-classicados com DH8.3 específicos para a deleção da mutação: 12 casos foram positivos em ambos, RT-PCR e imunohistoquímica, e 22 casos foram negativo/negativo. Três ca sos (#2, #34 e #40) foram DH8.3 positivo/RT-PCR negativo para a deleção da mutação e três casos (#12, #18 e #39) foram DH8.3 negativo/RT-PCR positivo. Como esperado, baseado em nossas prévias análises de especificidade, imunoreatividade de mAb806 foi vista em todos os tecidos DH8.3 positivo, exceto em um caso (#35).

[0389]Caso #3 também revelou uma mutação (designada A2 na Tabela 5), que incluiu as sequências da mutação de2-7, mas não pareceu ser deleçao de2-7 clássica com perda de 801 bases (dado não mostrado). Este caso foi negativo para reatividade de DH8.3 mas mostrou reatividade com 806, indicando que 806 pode reconhecer uma mutação EGFR adicional e possivelmente única. Tabela 5 Análise Imunohistoquímica de 46 Glioblastomas Não Selecionados com mAbs 528, 806, e DH8.3

. . . . * N = não amplificado, A-amplificado, +WT = selvagem, 5’-mut nd = não feito

[0390]A reatividade do anticorpo 806 co-classificada com EGFR amplificado ou mutante de2-7 em 19/27 ou até 70% dos casos. É notável que 2 desses 8 casos foram também DH8.3 reativo.

Exemplo 16 Tratamento Sistêmico e Análise de Tumores de Glioma Intracraniano

[0391]Para testar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-ΔEGFR, mAb806, nós tratamos camundongos nude tendo xenotransplantes glioma super expressando ΔEGFR intracraniano com injeções intraperitoneais de mAb806, o isotipo controle IgG ou PBS.

[0392]Porque explantes primários de glioblastomas humanos rapidamente perdem a expressão de receptores rearranjados amplificados em cultura, nenhuma linhagem celular de glioblastoma existente exibe tal expressão. Para forçar a manutenção dos níveis de expressão comparáveis com aqueles vistos nos tumores humanos, células U87MG, LN-Z308, e A1207 (dado por Dr. S. Aaronson, Mount Sinai Medical Center, Nova Iorque, NI) foram infectadas com vírus ΔEGFR, ΔEGFR deficiente de quinase (DK), ou EGFR selvagem (wtEGFR), que também conferiram resis- tência ao G418 como previamente descrito (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumor- igenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 7727-7731).

[0393]Populações expressando níveis similares de vários alelos EGFR (esses níveis de expressão correspondem aproximadamente a um nível de amplificação de 25 cópias gênicas; glioblastomas humanos tipicamente têm níveis de amplificação a partir de 10 a 50 cópias gênicas do receptor truncado) foram selecionadas por FACS como previamente descrito (Nishikawa et al, 1994) e designadas como U87MG.ΔEGFR, U87MG.DK, U87MG.wtEGFR, LN-Z308.ΔEGFR, LN-Z308.DK, LN- Z308.wtEGFR, A1207.ΔEGFR, A1207.DK, and A1207.wtEGFR, respectivamente. Cada uma foi mantida em meio contendo G418 (linhagens celulares U87MG, 400 μg/mL; LN-Z308 e linhagens celulares A1207, 800 μg/ml).

[0394]Células U87MG.ΔEGFR (1 x 105) ou 5 x 105 células LN-Z308.ΔEGFR, A1207.ΔEGFR, U87MG, U87MG.DK, e U87MG.wtEGFR em 5 μL de PBS foram im-plantadas em estrato corpóreo direito de cérebros de camundongos nudes como previamente descritos (Mishima et al. (2000) A peptide derived from the non-receptor binding region of urokinase plasminogen activator inhibits glioblastoma growth and angiogenesis in vivo in combination with cisplatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 8484-8489). Terapia sistêmica com mAb806, ou o isotipo IgG2b controle, foi completadapor injeção i.p. de 1 μg de mAbs em um volume de 100 μL dia sim dia não a partir do dia 0 a 14 pós-implante. Para terapia direta de tumores U87MG.ΔEGFR intracerebral, 10 μg de mAb806, ou o isotipo IgG2 controle, em um volume de 5 μL foram injetados no sítio de injeção de tumor dia sim, dia não, começando no dia 1 por 5 dias.

[0395]Animais tratados com PBS ou isotipo IgG controle tiveram uma mediana de sobrevivência de 13 dias, enquanto camundongos tratados com mAb806 tiveram 61,5% de aumento da mediana de sobrevivência para até 21 dias (P<0,001; FIG. 24A).

[0396]Tratamento de camundongos 3 dias pós-implante, após estabelecimento do tumor, também estendeu a mediana de sobrevivência dos animais tratados com mAb806 para 46,1% (a partir de 13 dias a 19 dias; P<0,01) comparado com aquela dos grupos controle (dado não mostrado).

[0397]Para determinar se esses efeitos antitumores de mAb806 se estenderam além dos xenotransplantes U87MG.ΔEGFR, tratamentos similares foram administrados a animais tendo outros xenotransplantes de células de glioma de LN- Z308.ΔEGFR e A1207.ΔEGFR. A mediana de sobrevivência de camundongos tratados com mAb806 tendo xenotransplantes LN-Z308.ΔEGFR foi estendida de 19 dias para controles de 58 dias (P<0,001; FIG. 24B). Consideravelmente, quatro de oito animais tratados mAb806 sobreviveram além de 60 dias (FIG. 24B). A mediada de sobrevivência de animais tendo xenotransplantes A1207.ΔEGFR foi também estendida a partir de 24 dias para controles para 29 dias (P<0,01; dado não mostrado).

Tratamento mAb806 Inibe Crescimento de Tumor Cerebral super expressando ΔEGFR

[0398]Camundongos tendo xenotransplantes U87MG.ΔEGFR e LN- Z308.ΔEGFR foram eutanaziados no dia 9 e dia 15, respectivamente. Seções tumo- rais foram histopatologicamente analisadas e volumes tumorais foram determinados. Consistente com os resultados observados para sobrevivência de animais, tratamento mAb806 significantemente reduziu os volumes em cerca de 90% para U87MG.ΔEGFR (P<0,001; FIG. 24C) e LN-Z308.ΔEGFE por mais que 95% dos xe- notransplantes (P<0,001; FIG. 24D) em comparação àqueles dos grupos controles. Resultados similares foram obtidos para animais tendo tumores A1207.ΔEGFR (65% da redução de volume, P<0,01; dados não mostrados).

Tratamento Intratumoral com mAb806 Estende Sobrevivência de Camundongos com Tumores Cerebrais U87MG.ΔEGFR

[0399]A eficácia da injeção intraturmoral direta de mAb806 para o tratamento de xenotransplantes U87MG.ΔEGFR foi também determinada. Aos animais foram dadas injeções intratumorais de mAb806 ou IgG isotipo controle um dia pós- implante. Animais controle sobreviveram por 15 dias, embora camundongos tratados com mAb806 permaneceram vivos por 18 dias (P<0,01; FIG. 24E). Enquanto o tratamento intratumoral com mAb806 foi um pouco efetivo, ele tem as dificuldades de múltiplas injeções intracranianas e risco aumentado de injeção. Nós então focamos em tratamentos sistêmicos para estudos adicionais.

Tratamento com mAb806 Estendeu Levemente a Sobrevivência de Camundongos com Xenotransplantes Intracranianos U87MG.wtEGFR mas não U87MG ou U87MG.DK

[0400]Para determinar se a inibição do crescimento por mAb806 foi seletiva para tumores expressando ΔEGFR, nós tratamos animais com xenotransplantes cerebrais U87MG, U87MG.DK(ΔEGFR deficiente em quinase) e U87MG.wtEGFR. Tratamento com mAb806 não estendeu a sobrevivência de camundongos implantados com tumores U87MG (FIG. 25A) que expressaram um baixo nível de EGFR selvagem endógeno (wtEGFR) (Huang et al. (1997) The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling. J. Biol. Chem., 272, 2927-2935), ou animais com xenotransplantes U87MG.DK que super expressavam um ΔEGFR deficiente em quinase em adição a um baixo nível de wtEGFR endógeno (FIG. 25B). O tratamento com mAb806 estendeu levemente a sobrevivência de camundongos com tumores U87MG.wtEGFR (P<0,05, mediana de sobrevivência de 23 dias versus 26 dias para os grupos controle) que super expressavam wtEGFR (FIG. 25C).

Reatividade de mAb806 Correlacionada com Eficácia Anti-tumor In vivo

[0401]Para entender o efeito diferencial de mAb806 em tumores expressan- do vários níveis ou diferentes tipos de EGFR, nós determinamos a reatividade de mAb806 com várias células tumorais por análise de FACS. Células coradas foram analisadas com um FACS Calibur usando o programa Cell Quest (Becton-Dickinson PharMingen). Para o primeiro anticorpo, os seguintes mAbs foram utilizados: mAb806, amAb anti-EGFR clone 528, e clone EGFR.1. IgG2a ou IgG2b de camundongo foi usada como um controle isotipo.

[0402]Consistente com prévios relatos (Nishikawa et al. (1994) A mutant epi-dermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumor- igenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 7727-7731), o mAb528 anti-EGFR reconheceu ambos, ΔEGFR e wtEGFR e demonstrou coloração mais forte para células U87MG.ΔEGFR comparado com as células U87MG (FIG. 26A, 528).

[0403]Em contraste, anticorpo EGFR.1 reagiu com wtEGFR mas não com ΔEGFR (Nishikawara et al, 1994), porque células U87MG.ΔEGFR foram tão fracamente reativas quanto as células U87MG (FIG. 26A, painel EGFR.1).

[0404]Este anticorpo EGFR.1 reagiu com U87MG.wtEGFR mais intensivamente que com células U87MG, porque células U87MG.wtEGFR super expressavam wtEGFR (FIG. 26A, painel EGFR.1). Embora mAb806 reagiu intensamente com células U87MG.ΔEGFR e U87MG.DK e não com células U87MG, ele reagiu fracamente com U87MG.wtEGFR, que indicou que mAb806 é seletivo para ΔEGFR com uma fraca reatividade cruzada ao wtEGFR super expresso (FIG. 26A, painel mAb806).

[0405]Este nível de reatividade com U87MG.wtEGFR foi quantitativamente e qualitativamente similar à extensão de sobrevivência mediada pelo tratamento com anticorpo (FIG. 25C).

[0406]Nós ainda determinamos a especificidade de mAb806 por imunopreci- pitação. EGFRs em várias linhagens celulares foram imunoprecipitados com anticorpos mAb806, mAb anti-EGFR clone 528 (Oncogene Research Products, Boston, MA), ou clone EGFR.1 (Oncogene Research Products).

[0407]Brevemente, células foram lisadas com tampão de lise contendo 50 mM de HEPES (pH 7.5), 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 2 mM de EDTA, 0,1% de SDS, 0,5% de deoxicolato de sódio, 10 mM de Ppi sódico, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila, 2 mM de Na3VO4, 5 μg/mL de leupeptina, e 5 μg/mL de aprotinina. Anticorpos foram incubados com lisados celulares a 4oC por 1 h antes da adição de proteína-A e G Sefarose. Imunoprecipitados foram lavados duas vezes com tampão de lise e uma vez com tampão HNTG [50 mM de HEPES (pH 7.5), 150 mM de NaCl, 0,1% de Tritin X-100, e 10% de glicerol], passado por eletroforese, e transferido para membranas de nitrocelulose.

[0408]Blots de proteínas separadas eletroforeticamente foram experimentos com anticorpo anti-EGFR, C13 (provido pelo Dr. G.N. Gill, Universidade da Califórnia, San Diego, CA), usado para detecção de ambos, selvagem e ΔEGFR em imu- noblots (Huang et al, 1997), e proteínas foram visualizadas usando o sistema de detecção de quimioluminescência ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Anticorpos para Bcl-X (anticorpo policlonal de coelho; Transduction Laboratories, Lexington, KY) e fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NI) foram usados para análise de Western blot como previamente descrito (Nagane et al. (1998) Drug resistance of human glioblastoma cells conferred by a tumor-specific mutant epidermal growth factor receptor through modulation of Bcl-XL and caspase-3-like proteases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 5724-5729).

[0409]Consistente com a análise de FACS, anticorpo 528 reconheceu wtEGFR e receptores mutantes (FIG. 26B-painel IP:528), apesar do anticorpo EGFR.1 reagir com wtEGFR mas não com espécies mutantes (FIG. 26B, painel IP:EGFR.1). Além disso, os níveis de receptores mutantes em células U87MG.ΔEGFR e U87MG.DKsão comparáveis com aqueles de wtEGFR nas células U87MG.wtEGFR (FIG. 26B, painel IP:528).

[0410]Entretanto, anticorpo mAb806 foi capaz de precipitar somente uma pequena quantidade de wtEGFR a partir de lisados celulares U87MG.wtEGFR como comparado com a quantidade maior do receptor mutante precipitada a partir de células U87MG.ΔEGFR e U87MG.DK, e uma quantidade não detectável de células U87MG (FIG. 26B, painel IP:mAb806). Coletivamente, esses dados sugerem que mAb806 reconhecem um epítopo em ΔEGFR que também existe em uma pequena fração de wtEGFR somente quando ele é super expresso na superfície celular (ver discussão adicional de e referências ao epítopo mAb806 abaixo).

Tratamento com mAb806 Reduz Auto-fosforilação de ΔEGFR e Regula Negativamente a Expressão de BCI.XL em Tumores Cerebrais U87MG.ΔEGFR

[0411] Os mecanismos sustentando a inibição do crescimento por mAb806 foram depois investigados. Desde que constitutivamente a atividade de quinase ativa e auto-fosforilação da terminação carboxila de ΔEGFR são essenciais para sua função biológica (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-7731; Huang et al., 1997; Nagane et al. (1996) A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis. Cancer Res., 56, 5079-5086; Nagane et al. (2001) Aberrant receptor signaling in human malignant gliomas: mechanisms and therapeutic implications. Cancer Lett. 162 (Suppl.1), S17- S21), o estado de fosforilação de ΔEGFR foi determinado em tumores a partir de animais tratados e controle. Como mostrado na FIG. 27A, tratamento com mAb806 dramaticamente reduziu a auto-fosforilação de ΔEGFR, embora níveis de receptor foram somente levemente diminuídos nos xenotransplantes tratados com mAb806. Nós temos previamente mostrado que a auto-fosforilação do receptor causa regulação positiva do gene anti-apoptótico, Bcl-XL, que desempenha um papel chave na redução da apoptose dos tumores super expressando ΔEGFR (Nagane et al, 1996; Nagane et al, 2001). Assim, o efeito do tratamento de mAb806 na expressão de Bcl- XL foi depois determinado. Tumores ΔEGFR a partir de animais mAb806 mostrada de fato níveis reduzidos de Bcl-XL (FIG. 27A).

Tratamento com mAb806 Diminui o Crescimento e Angiogênese, e Aumenta Apoptose em Tumores U87MG.ΔEGFR

[0412]Na luz da supressão in vivo causada pelo tratamento de mAb806 e seus efeitos bioquímicos na sinalização do receptor, nós determinamos a taxa de proliferação de tumores a partir de camundongos controle ou tratados. O índice proli- ferativo, medido por coloração Ki-67 dos tumores tratados com mAb806, foi significativamente inferior que aquele dos tumores controles (P<0,001; FIG. 28).

[0413]Brevemente, para avaliar angiogênese em tumores, eles foram fixados em uma solução contendo cloreto de zinco, embebidos em parafina, seccionados, e imunocorados usando um anticorpo CD31 anti-camundongo monoclonal (Becton- Dickinson PharMingen; 1:200). Avaliação da proliferação celular de tumor foi feita por imunohistoquímica Ki-67 em tecidos tumorais embebidos em parafina e fixados em formalina. Após a retirada da parafina e reidratação, os cortes de tecido foram incubados com peróxido de hidrogênio 3% em metanol para extinguir a peroxidase endógena. Os cortes foram bloqueados por 30 minutos com soro de cabra e incubados por uma noite com o anticorpo primário a 4oC. As seções foram então lavadas com PBS e incubadas com um anticorpo secundário biotinilado por 30 min. Após várias lavagens com PBS, produtos foram visualizados usando peroxidase de rábano silvestre estreptavidina com diaminobenzidina como cromógeno e hematoxilina como o contra-corante. Como uma medida de proliferação, o índice de marcação Ki- 67 foi determinado como a proporção de núcleos marcados:total em campos de alta- força (3400).

[0414]Aproximadamente 2000 núcleos foram contados em cada caso por amostragem aleatória sistemática. Para coloração de macrófagos e células NK, cor- tes congelados, fixados com solução de paraformaldeído 4% tamponada, foram imunocoradas usando mAbF4/80 biotinilado (Serotec, Raleigh, NC) e anticorpo GM1 anti-asialo policlonal de coelho (Dako Chemicals, Richmond, VA), respectivamente. Angiogênese foi quantificada como área vascular usando análise computadorizada. Para este propósito, seções foram imunocoradas usando anti-CD31 e foram analisadas usando um sistema de análise de imagem computadorizado sem contra- coloração. MVAs foram determinados por captura de imagens digitais dos cortes a 3200 de aumento usando uma câmera colorida CCD como previamente descrito (Mishima et al, 2000). Imagens foram então analisadas usando programa Image Pro Plus versão 4.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) e MVA foi determinado por medida da quantidade total de coloração em cada seção. Quatro campos foram avaliados para cada lâmica. Este valor foi representado como uma porcentagem da área total em cada campo. Resultados foram confirmados em cada experimento por pelo menos dois observadores (K.M., H-J. S.H.).

[0415]Em adição, células apoptóticas em tecido tumoral foram detectadas usando o método TUNEL como descrito previamente (Mishima et al, 2000). Células TUNEL positivas foram contadas em X400. O índice apoptótico foi calculado como uma proporção de número de célula apoptótica: número de célula total em cada campo. Análise do índice apoptótico através de coloração TUNEL demonstrou um aumento significante no número de células apoptóticas em tumores tratados com mAb806 como comparado com os tumores controle (P<0,001; FIG. 28).

[0416]A extensão da vascularização do tumor foi também analisada por imu- nocoloração de tumores a partir de espécimes tratados e controle para CD31. Para quantificar a vascularização do tumor, áreas microvasculares (MVAs) foram medidas usando análise de imagem computadorizada. Tumores tratados com mAb806 mostraram 30% menos MVA que os tumores controle (P<0,001; FIG. 28).

[0417]Para entender se a interação entre receptor e anticorpo pode elicitar uma resposta inflamatória, nós corados cortes de tumor para o marcador de macró- fago F4/80, e o marcador de célula NK, asialo GM1. Macrófagos foram identificados através da matriz tumoral e especialmente acumulados ao redor da periferia do tumor U87MG.ΔEGFR tratado com mAb806 (FIG. 28). Nós observados poucas células NK infiltradas em e ao redor dos tumores e nenhuma diferença significante entre os tumores isotipo controle e tratados com mAb806 (dado não mostrado).

Exemplo 17 Combinação Imunoterápica com mAb806 e mAb528

[0418]Esses experimentos revelados aqui descrevem trabalho in vivo desenhado para determinar a eficácia de anticorpos de acordo com esta invenção.

[0419]Camundongos nude fêmeas, 4-6 semanas de idade, foram usados como animais experimentais. Camundongos receberam inoculações subcutâneas de 3x106células tumorais em cada um de seus flancos.

[0420]Os animais receberam ou células U87MG.D2-7, U87MG.DK ou A431, todas as quais são descritas acima. Terapia começa quando tumores cresceram a um tamanho suficiente.

[0421]Camundongos então receberam injeções de um de (i) salina tampo- nada com fosfato, (ii) mAb806 (0,5 mg/injeção), (iii) mAb528 (0,5 mg/injeção), ou (iv) uma combinação de ambos mAbs. Com respeito a “(iv)”, grupos diferentes de camundongos receberam ou 0,5 mg/injeção de cada Ab, ou 0,25 mg/injeção de cada mAb.

[0422]O primeiro grupo de camundongos examinado foi aquele que recebeu injeções U87MG.D2-7. O protocolo de tratamento começou 9 dias após inoculação, e continuo 3 vezes por semana por 2 semanas (isto é, os animais foram inoculados 9, 11, 13, 16, 18 e 20 dias após eles serem injetados com as células). No início do protocolo de tratamento, a média do diâmetro do tumor foi 115 mm3. Cada grupo continha 50 camundongos, cada um com dois tumores.

[0423]Dentro do grupo de camundongos, cada recebeu a combinação de an-ticorpos (0,5 mg/injeção de cada), existiram regressões completas. Não existiram regressões em quaisquer um dos outros grupos. FIG. 18A mostra os resultados gra-ficamente.

[0424]Em um segundo grupo de camundongos, os materiais injetados foram os mesmos, exceto a combinação que a combinação terapêutica continha 0,25 mg de cada anticorpo por injeção. As injeções foram dadas 10, 12, 14, 17, 19 e 21 dias após inoculação com as células. No início da terapia a média de tamanho do tumor foi 114 mm3. Resultados são mostrados na FIG. 18B.

[0425]O terceiro grupo de camundongos receberam inoculações de U87MG.DK. Injeções terapêuticas começaram 18 dias após inoculação com as células, e continuaram nos dias 20, 22, 25, 27 e 29. A média do tamanho de tumor no início do tratamento foi 107 mm3. FIG. 18C resume os resultados. As injeções terapêuticas foram as mesmas como no primeiro grupo.

[0426]Finalmente, o quarto grupo de camundongos, que foi inoculado com células A431, recebera, injeções como nos grupos I e III, nos dias 8, 10, 12 e 14 após a inoculação. Após o início, a média do tamanho do tumor foi 71 mm3. Resultadossão mostrados na FIG. 18D.

[0427]Os resultados indicam que a terapia de combinação de anticorpo mostrou um efeito sinérgico na redução de tumores. Ver FIG. 18A. Um efeito similar foi visto em uma dose inferior, de acordo com a FIG. 18B, indicando que o efeito não é simplesmente devido aos níveis de dosagem.

[0428]A terapia de combinação não inibiu o crescimento de U87MG.DK (FIG. 18C), indicando que a função imune do anticorpo não foi a causa da diminuição vista nas FIGS. 18A e 18B.

[0429]É notado que, como mostrado na FIG. 18D, a terapia de combinação também exibiu eficácia sinérgica em tumores A431, com 4 doses levando a uma ta xa de 60% de resposta completa. Esses dados sugerem que a molécula de EGFR reconhecida pelo mAb806 é funcionalmente diferente aquela inibida pelo 528.

Exemplo 18 Inibição por mAb806 do Crescimento de Tumores Xenotransplantes

[0430]Como aqui discutido, e adicionalmente demonstrado e discutido neste Exemplo, mAb806 tem sido de modo inesperado encontrado inibir o crescimento de tumores xenotransplantes expressando ou EGFR de2-7 ou amplificado, mas não EGFR selvagem.

[0431]Linhagens celulares e anticorpos foram preparados como descrito no Exemplo 1. Para determinar a especificidade de mAb806, sua ligação às células U87MG, U87MG.D2-7 e U87MG.wtEGFR foi analisada por FACS. Brevemente, cultura parental e linhagens celulares U87MG transfectadas foram analisadas para expressão de EGFR selvagem e de2-7 usando anticorpos 528, 806 e DH8.3. Células (1 3 10 6) foram incubadas com 5 μg/mL do anticorpo apropriado ou um controle negativo combinado com isotipo em PBS contendo 1% de HSA por 30 min a 4oC. Após três lavagens com PBS/1% HSA, células foram incubadas por 30 min adicionais a 4oC com anticorpo anti-camundongo de cabra acoplado a FTTC (diluição 1:100; Cal- biochem, San Diego, CA). Após três lavagens subsequentes, células foram analisadas em um Epics Elite ESP (Beckman Coulter, Hialeah, FL) por observação de um mínimo de 20000 eventos e analisadas usando EXPO (versão 2) para Windows. Uma IgG2b irrelevante (mAb 100-310 direcionado ao antígeno humano A33) foi incubada como um isotipo controle para mAb806, e o anticorpo 528 foi incluída porque ela reconheceu ambos, de2-7 e wtEGFR.

[0432]Somente o anticorpo 528 foi capaz de corar a linhagem celular U87MG parental (FIG. 29),consistente com prévios relatos demonstrando que essas células expressam o wtEGFR (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-7731). mAb806 teve níveis de ligação similares ao anticorpo controle, claramente demonstrando que ele é incapaz de se ligar ao wtEGFR (FIG. 29). Ligação do anticorpo isotipo controle às linhagens celulares U87MG.D2-7 e U87MG.wtEGFR foi similar àquela observada para as células U87MG. mAb806 corou células U87MG.D2-7 e U87MG.wtEGFR, indicando que mAb806 especificamente reconheceu o de2-7 EGFR e um subgrupo do EGFR super expresso (FIG. 29). Como esperado, o anticorpo 528 corou ambas as linhagens celulares U87MG.D2-7 e U87MG.wtEGFR (FIG. 29). A intensidade do anticorpo 528 corando células U87MG.wtEGFR foi muito mais alta que mAb806, sugerindo que mAb806 somente reconhece uma porção do EGFR super expresso. A reatividade de mAb806 observada com células U87MG.wtEGFR é similar àquela obtida com células A431, outra linhagem celular que super expressa o wtEGFR.3.

[0433]Uma análise Scatchard foi feita usando células U87MG.D2-7 e A431 para determinar a afinidade relativa e sítios de ligação para mAb806 em cada linhagem celular. mAb806 teve uma afinidade para o receptor de2-7 EGFR de 1,1x109m- 1e reconheceu uma média (três experimentos separados) de 2,4x105sítios de liga- ção/célula, como notado no Exemplo 4. Em contraste, a afinidade de mAb806 para o wtEGFR em células A431 foi somente 9,5x107M-1, como notado no Exemplo 8. Interessantemente, mAb806 reconheceu 2,3x105 sítios de ligação na superfície de A431, que é algo em 10 vezes menor que o número relatado de EGFR encontrado nessas células. Para confirmar o número de EGFR na superfície de nossas células A431, nós fizemos uma análise Scatchard usando anticorpo 528 marcado com 125I. Como esperado, este anticorpo ligou a aproximadamente 2x106sítios na superfície das células A431. Então, parece que mAb806 somente liga a uma porção dos receptores EGFR na superfície de células A431.

[0434]Importantemente, mAb806 marcado com 125I não se ligou às células U87MG parentais de forma alguma, mesmo quando o número de células foi aumen- tado para 1x107.

[0435]Reatividade de mAb806 foi adicionalmente caracterizada em várias li-nhagens celulares por imunoprecipitação após mAb806, sc-03 (um anticorpo policlo- nal comercial específico para o domínio COOH-terminal do EGFR) e uma IgG2b iso- tipo controle marcados com 35S. Brevemente, células foram marcadas por 16 h com 100 mCi/mL de Marcador Tran 35S(ICN Biomedicals, Irvine, CA) em DMEM sem me- tionina/cisteína suplementado com 5% de SFB dialisado. Após lavagem com PBS, as células foram colocadas em tampão de lise (1% Triton X-100, 30 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 500 μM de fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenosulfonila (AEBSF), 150 nM de aprotinina, 1 μM de inibidor de protease E-64, 0,5 mM de EDTA, e 1 μM de leupeptina, pH 7.4) por 1 h a 4oC. Lisados foram clarificados por centrifugação por 10 min a 12000 g, e então incubados com 5 μg de anticorpo apropriado por 30 min a 4oC antes da adição da Proteína A-Sefarose. Imunoprecipitados foram lavados três vezes com tampão de lise, misturados com tampão de amostra SDS, separados por gel de eletroforese usando um gel 4-20% Tris/glicina que foi então seco, e exposto a filme de Raio X.

[0436]O anticorpo sc-03 imunoprecipitou três bandas a partir de células U87MG.Δ2-7; um doblete correspondendo às 2 bandas de de2-7 EGFR observadas nessas células e uma banda de peso molecular mais lata correspondendo ao wt EGFR (FIGS. 22 e 30). Em contraste, enquanto mAb806 imunoprecipitou as duas bandas de2-7 EGFRm o wtEGFR foi completamente ausente. O padrão visto em U87MG.wtEGFR e células A431 foi essencialmente idêntico. O anticorpo sc-03 imu- noprecipitou uma única banda correspondendo ao wtEGFR a partir de células A431 (FIGS. 22 e 30). mAb806 também imunoprecipitou uma banda única correspondendo ao wtEGFR a partir de células U87MG.wtEGFR e A431 (FIGS. 22 e 30). Consistente com os dados de FACS e Scatchard, a quantidade de EGFR imunoprecipitada por mAb806 foi substancialmente menor que o total de EGFR presente na superfície celular. Dado que mAb806 e sc-03 imunoprecipitaram quantidades similares do de2- 7 EGFR, este resultado sustenta a noção que o anticorpo mAb806 somente reconhecer uma porção do EGFR em células super expressando o receptor. Comparações entre o anticorpo mAb806 e 528 motsrou um padrão idêntico de reatividade (dado não mostrado). Uma IgG2b irrelevante (um isotipo controle para mAb806) não imunoprecipitou EGFR de uma das linhagens celulares (FIGS. 22 e 30). Usando condições idênticas, mAb806 não imunoprecipitou o EGFR a partir de células U87MG parentais (dado não mostrado).

[0437]mAb806 foi também examinado para eficácia contra tumores U87MG e U87MG.Δ2-7 em um modelo xenotransplante preventivo. Anticorpo ou veículo foi administrado i.p. o dia antes da imunoculação do tumor e foi dado três vezes por semana por 2 semanas. Em uma dose de 1 mg/injeção, mAb806 não teve efeito no crescimento de xenotransplantes U87MG parentais que expressam o wtEGFR (FIG. 9A). EM contraste, mAb806 inibiu significantemente o crescimento de xenotransplan- tes U87MG.Δ2-7 em uma forma dose-dependente (FIG. 9B). Vinte dias após inoculação de tumor, quando animais controle foram sacrificados, a média de volume de tumor foi 1600 ± 180 mm3para o grupo controle, uma significantemente menor 500 ± 95 mm3para o grupo 0,1 mg/injeção (P<0,0001) e 200 ±42 mm3para o grupo 1 mg/injeção (P<0,0001). Grupos de tratamento foram sacrificados no dia 24, em cujo tempo a média de volumes de tumores foram 1300 ± 240 mm3para o grupo tratado com 0,1 mg e 500 ± 100 mm3para o grupo 1 mg (P<0,005).

[0438]Dado a eficácia de mAb806 no modelo de xenotransplante preventivo, sua habilidade de inibir o crescimento de tumores xenotransplantes estabelecidos foi examinada. Tratamento de anticorpo foi como descrito no modelo preventivo, exceto que é iniciado quando tumores alcançaram um volume médio de tumor de 65 mm3 (10 dias após implante) para os xenotransplantes U87MG.Δ2-7 e 84 mm3 (19 dias após implante) para os xenotransplantes U87MG parental (ver Exemplo 10). Mais uma vez, mAb806 não teve efeito no crescimento de xenotransplantes U87MG parentais, mesmo em uma dose de 1 mg/injeção (FIG. 10A). Em contraste, mAb806 significantemente inibiu o crescimento de xenotransplantes U87MG.Δ2-7 em uma forma dose-dependente (FIG. 10B). No dia 17, um dia antes dos animais controle serem sacrificados, o volume médio do tumor foi 900 ± 200 mm3para o grupo controle, 400 ± 60 mm3para o grupo 0,1 mg/injeção (P<0,01), e 220 ± 60 mm3para o grupo de 1 mg/injeção (P<0,002). Tratamento de xenotransplantes U87MG.Δ2-7 com um isotipo IgG2b controle não teve efeito no crescimento do tumor (dado não mostrado).

[0439]Para examinar se a inibição de crescimento observada com mAb806 foi restrita às células expressando de2-7 EGFR, sua eficácia contra os xenotrans- plantes U87MG.wtEGFR foi também examinada em um modelo estabelecido. Essas células servem como um modelo para tumores contendo amplificação do gene EGFR sem a expressão de de2-7 EGFR. Tratamento com mAb806 começou quando tumores alcançaram um volume médio de tumor de 73 mm3(22 dias após implante). mAb806 significantemente inibiu o crescimento de xenotransplantes U87MG.etEGFR quando comparado com tumores controle com veículo (FIG. 10C). No dia que animais controle foram sacrificados, o volume médio de tumor foi 1000 ± 300 mm3para o grupo controle e 500 ± 80 mm3para o grupo tratado com 1 mg/injeção (P<0,04).

[0440]Para avaliar diferenças histológicas potenciais entre xenotransplantes U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR controle e tratado com Ab806, cortes fixados em formalina e embebidos em parafina foram corados com H&E (FIG. 31). Áreas de necrose foram vistas em cortes a partir de xenotransplantes U87MG.Δ2-7 tratados com mAb806 (xenotransplantes tratados com mAb806 foram coletados 24 dias após inoculação do tumor e xenotransplantes tratados com veículo em 18 dias), e xeno- transplantes U87MG.wtEGFR (xenotransplantes mAB806 foram coletados 42 dias após inoculação do tumor e xenotransplantes tratados com veículo em 37 dias; FIG. 31). Este resultado foi consistentemente observado em um número de tumores xe- notransplantes (n=4 para cada linhagem celular). Entretanto, cortes a partir de xeno- transplantes U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR tratados com veículo (n=5) não mostraram as mesmas áreas de necrose vistas após o tratamento com mAb806 (FIG. 31). Xenotransplantes tratados com veículo e mAb806 removidos em tempos idênticos também mostraram essas diferenças em necrose tumoral (dado não mostrado). Então, o aumento na necrose observada não foi causada pelos mais longos períodos de crescimento usados para xenotransplantes tratados com mAb806. Além disso, cortes a partir de xenotransplantes U87MG tratados com mAb806 foram também corados com H&E e não revelam quaisquer áreas de necrose (dado não mostrado), adicionalmente sustentando a hipótese que ligação de mAb806 induz viabilidade celular diminuída, resultando em necrose aumentada dentro de tumores xenotrans- plantes.

[0441]Uma análise imunohistoquímica de cortes de xenotransplantes U87MG, U87MG.Δ2-7, e U87MG.wtEGFR foi feita para determinar os níveis de expressão de de2-7 e wt EGFR após tratamento com mAb806 (FIG. 32). Como esperado, o anticorpo 528 corou todos os cortes xenotransplantes com nenhuma diminuição óbvia na intensidade entre tumores tratados e controle (FIG. 32). Coloração dos cortes U87MG foi indetectável com o mAb806; entretanto, coloração positiva de cortes de xenotransplante U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR foi observada (FIG. 32). Não houve diferença na intensidade de coloração mAb806 entre xenotransplantes U87MG.Δ2-7 e U87MG.wtEGFR controle e tratado, sugerindo que o tratamento com anticorpo não leva a seleção de variantes clonais faltando reatividade de mAb806.

[0442]Para demonstrar que os efeitos anti-tumores de mAb806 não foram restritos a células U87MG, o anticorpo foi administrado a camundongos contendo xenotransplantes A431. Essas células contêm um gene EGFR amplificado e ex- pressam aproximadamente 2x106receptores/células. Previamente mostramos que mAb806 se liga ~10% desses EGFRs e direciona xenotransplantes A431 (Garcia et al. (1993) Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell along carcinomas. Cancer Res. 53, 3217-3220). maA806 significantemente inibiu o crescimento de xenotransplantes A431 quando examinado no modelo xenotrans- plante preventivo descrito previamente (FIG. 11A). No dia 13, quando animais controle foram sacrificados, o volume médio do tumor foi 1400 ± 150 mm3 no grupo tratado com veículo e 260 ± 60 mm3 para o grupo de tratamento 1mg/injeção (P<0,0001). Em um experimento separado, uma dose de 0,1 mg de mAb também inibiu significantemente (P<0,05) o crescimento de xenotransplantes A431 em um modelo preventivo (dado não mostrado) (ver Exemplo 10).

[0443]Dado a eficácia de mAb806 no modelo xenotransplante A431 preventivo, sua habilidade de inibir o crescimento de tumores xenotransplantes estabelecidos foi examinada. Tratamento com anticorpo foi como descrito no modelo preventivo, exceto que ele não foi iniciado até tumores alcançarem um volume médio de tumor de 200 ± 20 mm3. mAb806 significantemente inibiu o crescimento de xenotrans- plantes A431 estabelecidos (FIG. 11B). No dia 13, o dia que os animais controle foram sacrificados, o volume médio do tumor foi 1100 ± 100 mm3para o grupo controle e 450 ± 70 mm3para o grupo 1 mg/injeção (P<0,0001).

Exemplo 19 Construção, Expressão e Análise de Anticorpo 806 Quimérico

[0444]Anticorpos quiméricos são uma classe de moléculas em que as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de, por exemplo, um camundongo, rato ou outras espécies são unidas às regiões de cadeia pesada e leve humana; anticorpos quiméricos são produzidos recombinantemente. Uma vantagem de anticorpos quiméricos é que eles podem reduzir efeitos xenoantigênicos, a imunogenicidade inerente de anticorpos não humanos (por exemplo, camundongo, rato ou outras espé- cies). Em adição, anticorpos quiméricos preparados recombinantemente podem sempre ser produzidos em grandes quantidades, particularmente quando utilizando altos níveis de vetores de expressão.

[0445]Para alto nível de produção, o sistema de expressão mamifero mais amplamente usado é um que utiliza o procedimento de amplificação gênica oferecido por células de ovário de hamster Chinês deficientes em dehidrofolato redutase (“dhfr-“). O sistema é bem conhecido pelos versados na técnica. O sistema é baseado no gene dehidrofolato redutase “dhfr”, que codifica a enzima DHFR, que catalisa conversão de dehidrofolato a tetraidrofolato. A fim de alcançar alta produção, células dhfr-CHO são transfectadas com um vetor de expressão contendo um gene DHFR funcional, junto com um gene que codifica uma proteína desejada. Neste caso, a proteína desejada é cadeia pesada e/ou cadeia leve de anticorpo recombinante.

[0446]Aumentando a quantidade de inibidor de DHFR competitivo, metotre- xato (MTX), as células recombinantes desenvolvem resistência por amplificação do gene dhfr. Em casos padrões, a unidade de amplificação empregada é muito maior que o tamanho do gene dhfr, e como um resultado, a cadeia pesada do anticorpo é co-amplificada.

[0447]Quando a produção em larga escala da proteína, tal como a cadeia de anticorpo, é desejada, ambos, o nível de expressão, e a estabilidade das células sendo empregadas, são críticos. Em cultura de longo período, populações de célula CHO recombinantes perdem a homogeneidade com respeito a sua produtividade de anticorpo específica durante a amplificação, mesmo que elas derivem de um clone parental único.

[0448]Vetores de expressão bi-cistrônicos foram pré-pagos para uso na ex-pressão recombinante dos anticorpos quiméricos. Esses vetores de expressão bi- cistrônicos, empregam um “sítio de entrada ribossomal interno” ou “IRES”. Nessas construções para produção de anti-EGFR quimérico, as cadeias de imunoglobulinas e marcadores selecionáveis de cDNA são ligados via um IRES. IRES são elementos de atuação cis que recrutam as pequenas subunidades ribossomais a um códon iniciador interno no mRNA com a ajuda de fatores de atuação trans-celular. IRES facilitam a expressão de duas ou mais proteínas a partir de uma unidade de transcrição policistrônica em células eucarióticas. O uso de vetores de expressão bi-cistrônica em que o gene marcador selecionável é traduzido em uma maneira dependente de cap, e o gene de interesse em uma forma dependente de IRES, tem sido aplicado a uma variedade de métodos experimentais. Elementos IRES têm sido incorporados com sucesso em vetores para transformação celular, produção de animais transgê- nicos, produção de proteína recombinante, terapia gênica, “armadilha” gênica e direcionamentogênico.

Sinopse da Construção de Anticorpo Quimérico 806 (ch806)

[0449]O anticorpo quimérico 806 foi gerado por clonagem de cadeias VP e VL do anticorpo 806 a partir de hibridoma murino parental usando técnicas de biologia molecular padrões. As cadeias VP e VL foram então clonadas nos vetores de expressão mamíferas pREN, a construção das quais são reveladas na SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, e transfectadas em células CHO (DHFR-/-ve) para amplificação e expressão. Brevemente, seguindo tripsinização, 4x106células CHO foram co- transferidas com 10 μg de cada um dos vetores de expressão LC e HC usando ele- troporação sob condições padrões. Seguindo um período de descanso de 10 min em temperatura ambinete, as células foram adicionadas a 15 mL de meio (10% de soro fetal bovino, hipoxantina/timidina suplementada com aditivos) e transferidas para placas de petri de cultura celular de 15x10 cm. As placas foram então colcoadas em uma incubadora sob condições normais por 2 dias.

[0450]Neste ponto, a adição de gentamicina, 5 nM de metotrexato, a substituição do soro fetal bovino com soro fetal bovino dializado e a remoção da hipoxanti- na/timidina, iniciou a seleção para clones que foram transfectados com sucesso com ambas, a LC e HP a partir do meio. No dia 17 seguindo a transfecção, clones individuais crescendo sob seleção foram selecionados e classificados para expressão do anticorpo 806 quimérico. Um ELISA foi utilizado para classificar, e consistiu de revestimento de uma placa de ELISA com receptor EGF solúvel desnaturado (EGFR desnaturado é conhecido permitir ligação 806). Este ensaio permite a classificação de níveis de produção por clones individuais e também para a funcionalidade do anticorpo sendo classificado. Todos os clones mostraram ser produtores funcionais de ch806 e o melhor produtor foi tomado e expandido para amplificação. Para amplificar o nível de ch806 sendo produzido, o clone de mais alta produção foi sujeito a re- seleção sob uma concentração de metotrexato mais alta (100 nM vs. 5 nM). Isto foi empreendido usando os procedimentos acima mencionados.

[0451]Clones crescendo a 100 nM de MTX foram então passados para Biological Production Facility, Ludwig Institute, Melbourne, Austrália, para medida de níveis de produção, retirada de soro, e para fazer banco celular. A linhagem celular tem sido mostrada estavelmente produzir ~10 mg/litro em garrafas cilíndricas.

[0452]A sequência de ácido nucléico do vetor pREN ch806 LC neo é provida na SEQ ID NO:7. A sequência de ácido nucléico do vetor pREN ch806 HC DHFR é provida na SEQ ID NO:8.

[0453]FIG. 33 revela os vetores pREN-HC e pREN-LC, que empregam um IRES. O sistema de vetor bi-cistrônico pREN é descrito e revelado no Pedido de Patente dos Estados Unidos co-pendente No. 60/355.838 depositado em 13 de Fevereiro de 2002, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0454]Ch806 foi avaliado por análise de FACS para demonstrar que 806 quimérico revela especificidade de ligação idêntica àquela do anticorpo parental mu- rino. Análise foi feita usando células selvagens (células U87MG parentais), células super expressando o receptor EGF (células A431 e células U87.wtEGFR) e células UA87.Δ2-7 (dado não mostrado). Especificidade de ligação similar de mAb806 e ch806 foi obtida usando células super expressando EGFR e células expressando o de2-7 EGFR. Nenhuma ligação foi observada em células selvagens. Análise scatchard revelou uma afinidade de ligação para ch806 radiomarcado de 6,4x109M-1 usando células U87Mgde2-7 (dado não mostrado).

[0455]Análise de biodistribuição do anticorpo ch806 foi feita em camundongos nude BALB/c tendo tumores xenotransplantes U87MG-de2-7, e os resultados são mostrados na FIG. 34. Camundongos foram injetados com 5 μg de anticorpo radiomarcado e foram sacrificados em grupos de quatro por ponto de tempo em 8, 24, 48 e 74 horas. Órgãos foram coletados, pesados e radioatividade medida em um contador gama. Ch806 marcado com 125I revela reduzido direcionamento ao tumor comparado ao ch806 marcado com 111In, que tem captação de tumor alta e retenção de tumor cumulativa por um período de tempo de 74 horas. Em 74 horas, o anticorpo marcado com 111In revela aproximadamente 30% IG/grama de tecido e uma proporção tumor para sangue de 4.0 (FIG. 35). O ch806 marcado com 111In mostra alguma retenção não específica no fígado, baço e rins. Isto é comum para o uso desta isotipo e diminui com tempo, que suporta que esta ligação é não específica para ch806 e devido a ligação de 111In.

[0456]Anticorpo quimérico ch806 foi avaliado para eficácia terapêutica em um modelo de tumor estabelecido. 3x106 células U87MG.Δ2-7 em 100 μL de PBS foram inoculados s.c. em ambos os flancos de camundongos nude fêmeas de 4-6 semanas de idade (Animal Research Center, Western Australia, Austrália). O mAb806 foi incluído como um controle positivo. Os resultados são revelados na FIG. 36. Tratamento foi iniciado quando tumores tiveram alcançado um volume médio de 50 mm3e consistiu de 1 mg de ch806 ou mAb806 dado i.p. por um total de 5 injeções nos dias indicados. Volume do tumor em mm3 foi determinado usando a fórmula (comprimento x largura2)/2, onde o comprimento foi o eixo mais comprido e largura a medida dos ângulos retos ao comprimento. Dados foram expressos como volume médio de tumor +/- E.P. para cada grupo de tratamento. O ch806 e mAb806 revelou atividade anti-tumor quase idêntica contra xenotransplantes U87MG.Δ2-7.

Análise da Função Efetora Imune de Ch806 Materiais e Métodos Anticorpos e Linhagens Celulares

[0457]mAb806 monoclonal anti-de2-7 EGFR murino, anticorpo quimérico ch806 (IgG1) e isotipo controle combinado com anticorpo cG250 monoclonal anti- G250 quimérico foram preparados por Biological Production Facility, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Austrália. Ambos, ensaios de citotoxidade dependente de complemento (CDC) e citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC) utilizaram células U87MG.de2-7 e A431 como células alvo. A linhagem celular U87MG.de2-7 previamente descrita é uma linhagem celular astrocitoma humana infectada com um retrovírus contendo o de2-7 EGFR (Nishikawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 91, 7727-31). Células A431 de carcinoma escamoso humano foram adquiridas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Todas as linhagens celulares foram cultivadas em DMEM/F-12 com Glutamax (Lide Technologies, Melbourne, Austrália) suplementado com 10% de SFB inativado por calor (CSL, Melbourne, Austrália), 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estrep- tomicina. Para manter a seleção para células U87MG.de2-7 transfectadas retrovi- ralmente, 400 μg/mL de G418 foi incluso no meio.

Preparação de Células Efetoras de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC)

[0458]PBMCs foram isolados a partir de sangue de doadores voluntários saudáveis. Sangue total heparinizado foi fracionado por densidade na centrifugação em Ficoll-Hypaque (ICN Biomedical Inc., Ohio, EUA). Frações de PBMC foram coletadas e lavadas três vezes com RPMI+ 1640 suplementado com 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, contendo 5% de SFB inativado por calor.

Preparação das Células Alvo

[0459]Ensaios CDC e ADCC foram feitos por uma modificação de um método previamente publicado (Nelson, D. L. et al. (1991) In: J. E. Colignan, A. M. Kruisbeek, D. D. Margulies, E. M. Shevach, and W. Strober (eds.), Current Protocols in Immunology, pp. 7.27.1. Nova Iorque: Greene Publishing Wiley Interscience). Brevemente, 5 x 106 células alvo U87MG.de2-7 e A431 foram marcadas com 50 μCi5lCr (Geneworks, Adelaide, Australia) por 1 x 106 células e incubadas por 2 h a 37°C. As céluals foram então lavadas três vezes com PBS (0.05M, pH 7.4) e uma quarta lavagem com meio de cultura. Alíquotas (1 x 104células/50 μL) das células marcadas foram adicionadas a cada poço de placas de microtitulação de 96 poços (NUNC, Roskilde, Dinamarca).

Ensaio CDC

[0460]A 50 μL de células alvo marcadas, 50 μL de anticorpo ch806 ou isotipo controle cG250 foram adicionados em triplicatas sob a concentração variável de 0,00315-10 μg/mL, e incubadas em gelo por 5 min. Cinquanta μL de complemento de doador saudável recentemente preparado (soro) foi então adicionado para produzir uma diluição final 1:3 do soro. As placas de microtitulação foram incubadas por 4 h a 37oC. Seguindo centrifugação, a liberação de 51Cr no sobrenadante foi contada (Contador Gama automático Cobra II, Canberra Packard, Melbourne, Austrália). Porcentagem de lise específica foi calculada para a liberação de 51Cr experimental, a liberação total (50 μL de células alvo + 100 μL de Tween 20 10%) e espontânea (50 μL de células alvo + 100 μL de meio).

Ensaio ADCC

[0461]ADCC mediada por ch806 efetuada por PBMCs de doador saudável foi medida por dois ensaios de 4 h de liberação de 51Icr. No primeiro ensaio, células alvo marcadas foram plaqueadas com as células efetoras em microplacas de fundo “U” de 96 poços (NUNC, Roskilde, Dinamarca) em proporções de célula efetora/alvo (E:A) de 50:1. Para medidas da atividade de ADCC, 0,00315 - 10 μg/mL (concentração final) de anticorpos teste e controle forma adicionados em triplicata a cada poço. NO segundo ensaio ADCC, a atividade ADCC de ch806 foi comparada com o mAb806 parental murino sob uma variação de proporções célula Efetora:Alvo com a concentração do anticorpo teste constante a 1 μg/mL. Em ambos ensaios, placas de microtitulação foram incubadas a 37oC por 4 horas, então 50 μL de sobrenadamente foi coletado a partir de cada célula e 51Cr liberado foi determinado por contador gama (Contador Gama automático Cobra II, Canberra Packard, Melbourne, Austrália). Controles incluíam os ensaios corrigidos para liberação espontânea (meio sozinho) e liberação total (10% Tween 20/PBS). Controles apropriados com as mesmas subclasses de anticorpo foram corridos em paralelo.

[0462]A porcentagem de lise celular (citotoxidade) foi calculada de acordo com a fórmula:

[0463]A porcentagem (%) de citotoxidade foi representada graficamente versus a concentração de anticorpo (μg/mL).

Resultados

[0464]Os resultados das análises de CDC são apresentados na FIG. 37. Atividade CDC mínima foi observada em presença de até 10 μg/mL de ch806 com CDC comparável àquela observada com isotipo controle cG250.

[0465]ADCC mediada por ch806 nas células alvo U87MG.de2-7 e A431 na proporção E:A de 50:1 é apresentada na FIG. 38. Citotoxidade específica de ch806 efetiva foi revelada contra células U87MG.de2-7 alvo, mas mínima ADCC foi mediada por ch806 em células A431. Os níveis de citotoxidade alcançados refletem o número de sítios de ligação de ch806 nas duas populações celulares. Células U87MG.de2-7 alvo expressam ~1x106de2-7 EGFR que são especificamente reco-nhecidos por ch806, enquanto somente um subgrupo de 1x106moléculas EGFR selvagens expressas em células A431 são reconhecidas por ch806 (ver acima Exemplos).

[0466]Análises ADCC adicionais foram feitas para comparar a ADCC mediada por 1 μg/mL de ch806 em células U87MG.de2-7 alvo com aquela efetuada por 1 μg/mL de mAb806 parental murino. Resultados são apresentados na FIG. 39. Qui- merização de mAb806 efetuou marcado melhoramento de ADCC alcançado pelo mAb murino parental com mais que 30% de citotoxidade efetuada nas proporções E:A 25:1 e 50:1.

[0467]A ausência de função imuno-efetora mAb806 murina parental tem sido marcadamente aumentada sob quimerização. Ch806 medeia boa ADCC, mas mínima atividade CDC.

Exemplo 20 Geração de Anticorpos Anti-Idiotipo para Anticorpo ch806 Quimérico

[0468]Para assistir a avaliação clínica de mAb806 ou ch806, ensaios de la-boratório são requeridos para monitorar a farmacocinética sérica dos anticorpos e quantificar qualquer resposta imune para o anticorpo quimérico camundongo- humano. Anticorpos anti-idiotípicos monoclonais de camundongo (anti-ids) foram gerados e caracterizados para adequabilidade como reagentes de ELISA para medir ch806 em amostras de soros de pacientes e uso como controles positivos em análise de resposta imune do anticorpo anti-quimérico humano. Esses anticorpos anti- idiotipos podem também ser úteis como vacinas terapêuticas ou profiláticas, gerando uma resposta de anticorpo anti-EGFR natural em pacientes.

[0469]Métodos para gerar anticorpos anti-idiotipos são bem conhecidos na técnica (Chatterjee et al., 2001; Uemura et al., 1994; Steffens et al., 1997; Safa e Foon, 2001; Brown e Ling, 1988).

[0470]Brevemente, anticorpos anti-idiotípicos monoclonais de camundongo (anti-ids) foram gerados como segue. Esplenócitos de camundongos imunizados com ch806 foram fusionados com células de plasmacitoma SP2/0-AG14 e hibrido- mas produzindo anticorpo foram selecionados através de ELISA para ligação específica ao ch806 e ligação competitiva para antígeno (FIG. 40). Vinte e cinco hibrido- mas foram inicialmente selecionados e quatro, designados LMH-11, -12, -13 e -14, secretaram anticorpos que demonstraram ligação específica ao ch806, mAb806 e foram capazes de neutralizar a atividade de ligação de antígeno ch806 ou mAb806 (FIG. 41). O reconhecimento de idiotipo ch806/mAb806 ou região CDR foi demonstrado pela falta de reatividade cruzada com IgG humana policlonal purificada.

[0471]Na ausência de antígeno de2-7 EGFR recombinente facilmente disponível para ajudar com a determinação de ch806 nas amostras séricas, a habilidade dos anticorpos ch806 anti-idiotipo novos para se ligarem concorrentemente às regiões variáveis 806 foi explorada no desenvolvimento de um ELISA sensível, específico para medir ch806 em amostras clínicas (FIG. 42). Usando LMH-12 para captura e biotinilado-LMH-12 para detecção, o ELISA validado demonstrou curvas de ligação altamente reprodutíveis para medir ch806 (2 μg/mL - 1,6 ng/mL) nos soros com um limite de detecção de 3 ng/mL (n=12; 1-100 ng/mL, Coeficiente de Variação < 25%; 100 ng/mL - 5 μg/mL, Coeficiente de Variação < 15%). Nenhuma ligação de background foi evidente com os três soros de doadores saudáveis testados e ligação negligível foi observada com o controle isotipo huS193. O hibridoma produz altos níveis de anticorpo LMH-12, e produção em mais larga escada é planejada para permitir a medida de ch806 e quantificação de quaisquer respostas imunes em amostras clínicas (Brown e Ling, 1988).

Resultados

[0472]Imunização de camundongos e seleção de imunoreatividade de hibri- doma clone das amostras de soros pré- e pós-imunização indicaram o desenvolvi- mento de títulos altos de mAbs anti-ch806 e anti-huIgG de camundongo. Vinte e cinco hibridomas produzindo anticorpos que ligam ch806, mas não huIgG, foram inicialmente selecionados. As características de ligação de alguns desses hibridomas são mostradas nas FIGS. 42A e 42B. Quatro desses hibridomas anti-ch806 com alta afinidade de ligação (clones 3E3, SB8, 9D6, e 4D8) foram subsequentemente continuadas para expansão clonal a partir de células únicas por diluição limitante e destinadas ao Ludwig Institute for Cancer Research Melbourne Hybridoma (LMH) -11, - 12, -13 e -13, respectivamente (FIG. 42).

Ligação e Bloqueio das Atividades de Anticorpos Anti-Idiotipo Selecionados

[0473]A habilidade de anticorpos anti-ch806 para concorrentemente ligar dois anticorpos ch806 é uma característica desejável para seu uso como reagentes em um ELISA para determinar níveis de ch806 séricos. Hibridomas clonais, LMH-11, -12, -13 e -14 demonstraram ligação concorrente (dados não mostrados).

[0474]Após a expansão clonal, os sobrenandantes da cultura de hibridoma foram examinados por ELISA para a habilidade de neutralizar a atividade de ligação de antígeno ch806 ou mAb806 com sEGFR621. Resultados demonstraram a atividade antagonista de mAbs anti-idiotipo LMH-11, -12, -13 e -14 com o bloqueio em solução de ambos, ligação de ch806 e mAb806 murino a placas revestidas com sEGFR (FIG. 41 para LMH-11, -12, -13).

[0475]Seguindo a cultura de maior escala em garrafas cilíndricas a especificidade de ligação dos hibridomas clonais estabelecidos, LMH-11, -12, -13 e -14 foram verificadas por ELISA. Anticorpos LMH-11 a -14 foram identificados como IgGlK isotipo por kit de isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo.

Ch806 em Desenvolvimento de Ensaio de ELISA e Farmacocinética de Amostras Séricas Clínicas

[0476]Para ajudar com a determinação de ch806 em amostras séricas, a ha-bilidade dos anticorpos anti-idiotipo ch806 para concorrentemente ligar a região vari- ável 806 foi explorada no desenvolvimento de um ensaio de ELISA sensível e específico para ch806 em amostras clínicas. Os três clones purificados LMH-11, -12 e -13 (FIGS. 49B e 49C, respectivamente foram comparados para sua habilidade em capturar e então ligação de ch806 detectada nos soros. Resultados indicaram usando LMH-12 (10 μg/mL) para capturar e LMH-12 biotinilada para detecção produziu a mais alta sensibilidade para ch806 no soro (3 ng/mL) com ligação de background insignificante.

[0477]Tendo estabelecido as condições ótimas de farmacocinética e ELISA usando 1 μg/mL de LMH-12 anti-idiotipo e 1 μg/mL de LMH-12 biotinilado para captura e detecção, respectivamente, validação do método foi feita. Três ELISAs separados foram feitos em quadruplicata para medir ch806 no soro doador a partir de três doadores saudáveis ou 1% de BSA/meio com controle isotipo hu3S193. Resultados da validação são apresentados na FIG. 43 e demonstram curvas de ligação altamente reprodutíveis para medir ch806 (2 μg/Ml - 1,6 ng/mL) nos soros com um limite de detecção de 3 ng/mL (n=12; 1-100 ng/mL, Coeficiente de Variação < 25%; 100 ng/mL - 5 μg/mL, Coeficiente de Variação < 15%). Nenhuma ligação de background ficou evidente com qualquer dos três soros testados e ligação insignificante foi observada com isotipo controle huS193.

Exemplo 21 Avaliação das Estruturas de Carboidrato e Reconhecimento de Anticorpo

[0478]Experimentos foram feitos para avaliar adicionalmente o papel das es-truturas de carboidratos na ligação e reconhecimento do EGFR, ambos amplificados e de2-7 EGFR, pelo anticorpo mAb806.

[0479]Para determinar se estruturas de carboidrato são diretamente envolvidos no epítopo mAb806, o sEGFR recombinante expresso em células CHO foi tratado com PNGase F para remover glicosilação ligada a N. Seguindo tratamento, a proteína foi corrida em SDS-PAGE, transferida para membrana e feito imunoblot com mAb806 (FIG. 44). Como esperado, o sEGFR deglicosilado correu mais rápido no SDS-PAGE, indicando que os carboidratos foram removidos com sucesso. O anticorpo mAb806 claramente ligaou ao material deglicosilado demonstrando que o epí- topo do anticorpo é peptídeo na natureza e não somente um epítopo de glicosilação.

[0480]Lisados, preparados a partir de linhagens celulares marcadas com 35S, foram imunoprecipitados com diferentes anticorpos direcionados ao EGFR (FIG. 45). Como esperado, o anticorpo 528 imunoprecipitou três bandas a partir de células U87MG.Δ2-7, uma banda superior correspondendo ao EGFR selvagem (wt) e duas bandas inferiores correspondendo ao de2-7 EGFR. Essas duas bandas de2-7 EGFR têm sido relatadas previamente e são assumidas para representar glicosilação diferencial (Chu et al (1997) Biochem. J. Jun 15; 324 (Pt 3): 885-861). Em contraste, mAb806 somente imunoprecipitou as duas bandas de2-7 EGFR, com o receptor selvagem sendo completamente ausente mesmo após a super exposição (dado não mostrado). Interessantemente, mAb806 mostrou reatividade relativa aumentada com a banda de2-7 EGFR inferior mas reatividade diminuída com a banda superior quando comparado ao anticorpo 528. O anticorpo SC-03, um anticorpo policlonal de coelho comercial direcionado ao domínio C-terminal do EGFR, imunoprecipitou as três bandas de EGFR como visto com o anticorpo 528, embora a quantidade total de receptor imunoprecipitado por este anticorpo foi consideravelmente menos. Nenhuma banda foi observada quando usando um anticorpo IgG2b irrelevante para mAb806 (ver Exemplo 18).

[0481]O anticorpo 528 imunoprecipitou uma banda única a partir de células U87MG.wtEGFR correspondendo ao receptor selvagem (Fig. 45). mAb806 também imunoprecipitou uma banda única a partir dessas células, entretanto, esta banda EGFR migrou mais rápido que o receptor reativo 528. O anticorpo SC-03 imunopre- cipitou ambas as bandas EGFR reativas a partir de células U87MG.wtEGFRm confirmando adicionalmente que o mAb806 e 528 reconheceu diferentes formas de EGFR em lisados de célula total a partir dessas células.

[0482]Como observado com células U87MG.wtEGFR, o anticorpo 528 imu- noprecipitou uma banda de EGFR única a partir de células A431 (FIG. 45). A banda de EGFR reativa com 528 é muito ampla nesses géis de baixa porcentagem (6%) e provavelmente reflete a diversidade do receptor de glicosilação. Uma banda de EGFR única foi também vista seguindo imunoprecipitação com mAb806. Enquanto esta banda EGFR não migrou consideravelmente mais rápido que o 528 através de uma banda amplamente reativa, ela foi localizada na direção marginal da banda larga do 528 em uma forma reprodutível. Diferente dos lisados celulares de U87MG.Δ2-7, a quantidade total de EGFR imunoprecipitado por mAb806 a partir de lisados A431 foi consideravelmente menor que com o anticorpo 528, um resultado consistente com nossos dados Scatchard mostrando que mAb806 somente reconheceu uma porção do EGFR na superfície dessas células (ver Exemplo 4). Imuno- precipitação com SC-03 resultou em uma banda de EGFR larga única como para o anticorpo 528. Resultados similares foram obtidos com células HN5 (dado não mostrado). Tomados juntos, esses dados indicam que mAb806 preferivelmente reage com espécies de migração mais rápida do EGFR, que podem representar formas diferentemente glicosiladas do receptor.

[0483]A fim de determinar em qual estágio do processamento do receptor mAb806 a reatividade aparece, um experimento pulso/caça foi conduzido. Células A431 e U87MG.Δ2-7 foram pulsadas por 5 min com 35S metionina/cisteína, então incubadas a 37oC por várias vezes antes da imunoprecipitação com mAb806 ou 528 (FIG. 46). O padrão de imunoprecipitação em células A431 com o anticorpo 528 foi típico para um anticorpo dependente conformacional específico para o EGFR. Uma pequena quantidade de receptor foi imunoprecipitada a 0 min (isto é, após 5 min de pulso) com a quantidade de EGFR marcada aumentando a cada ponto de tempo. Houve também um aumento concomitante no peso molecular do receptor com tem po. Em contraste, o material EGFR reativo com mAb806 foi presente em níveis altos a 0 min, pico em 20 min e então reduzido a cada ponto de tempo adicional. Então, parece que mAb806 preferivelmente reconhece uma forma do EGFR encontrada em um estágio precoce do processamento.

[0484]A reatividade do anticorpo observada nas células U87MG.Δ2-7 marcadas com pulso foi mais complicada. Imunoprecipitação com o anticorpo 528 em 0 min revelou que uma pequena quantidade da banda de2-7 EGFR inferior foi marcada (FIG. 46). A quantidade de banda inferior de2-7 EGFR reativa ao 528 aumentou com tempo, tendo o pico em 60 min e declinando lentamente em 2 e 4 h. Nenhuma quantidade significativa da banda superior marcada de de2-7 EGFR foi detectada até 60 min, após o qual o nível continuou a aumentar até o final do curso de tempo. Isto claramente indica que o de2-7 EGFR superior é a forma mais madura do receptor. Reatividade de mAb806 também variou durante o estudo do curso de tempo, entretanto, mAb806 preferivelmente precipitou a banda inferior do de2-7 EGFR. De fato, não existiram níveis significantes de bandas superiores Ab806 vistas até 4 h após a marcação.

[0485]Os experimentos acima sugerem que mAb806 preferivelmente reage com uma forma de glicosilação mais imatura do de2-7 e wtEGFR. Esta possibilidade foi testada por imunoprecipitação de EGFR a partir de diferentes linhagens celulares marcadas por uma noite com 35S metionina/cisteína e então sujeitando os precipitados resultantes a digestão Endoglicosidase H (Endo H). Esta enzima preferivelmente remove carboidratos do tipo alta manose (isto é, glicosilação imatura) a partir de proteínas enquanto deixando carboidratos complexos (isto é, glicosilação madura) intactos. Imunoprecipitação e digestão com lisados de célula U87MG.Δ2-7 marcada com Endo H com 528, mAb806 e SC-03 deu resultados similares (FIG. 47).

[0486]Como predito, a banda de2-7 EGFR inferior foi completamente sensível a digestão Endo H, migrando mais rápido em SDS-PAGE após digestão Endo H, demonstrando que esta banda representa a forma de alta manose do de2-7 EGFR. A banda de2-7 EGFR superior foi essencialmente resistente a digestão Endo H, indicando que a maioria das estruturas de carboidrato é do tipo complexo. A pequena, mas reprodutível diminuição no peso molecular da banda superior seguindo de digestão enzimática sugere que enquanto os carboidratos na banada de2-7 EGFR superior são predominantemente no tipo complexo, eles possuem algumas estruturas da alta manose. Interessantemente, essas células também expressam pequenas quantidades de wtEGFR endógeno que são claramente visíveis seguindo imunopre- cipitação de 528. Houve também uma pequena, mas notável redução no peso molecular do receptor selvagem seguindo a digestão Endo H, indicando que ele também contém estruturas de alta manose.

[0487]A sensibilidade do wtEGFR imunoprecipitado para a digestão de Endo H foi similar em ambas as células U87MG.wtEGFR e A431 (FIG. 47). A massa de material precipitado pelo anticorpo 528 foi resistente a enzima Endo H embora uma pequena quantidade do material foi da forma alta manose. Mais uma vez existiu uma pequena diminuição no peso molecular do wtEGFR seguindo digestão Endo H, sugerindo que ele não contém algumas estruturas de alta manose. Os resultados usando o anticorpo SC-03 foram similares ao anticorpo 528. Em contraste, a maioria do EGFR precipitado por mAb806 foi sensível ao Endo H em ambas as células U87MG.wtEGFR e A431, confirmando que mAb806 preferivelmente reconhece a forma de alta manose do EGFR. Resultados similares foram obtidos com células HN-5, em que a maioria do material precipitado pelo mAb806 foi sensível à digestão Endo H, enquanto a maioria do material precipitado por mAb528 e SC-03 foi resistente a digestão Endo H (dado não mostrado).

[0488]Iodinação da superfície celular da linhagem celular A431, foi feita com 125I seguido por imunoprecipitação com o anticorpo 806. O protocolo para iodinação de superfície foi como segue: a lise celular, imunoprecipitação, digestão Endo H, SDS PAGE e autoradiografia são como descrito acima. Para marcação, células foram crescidas em meio com 10% de SFB, destacadas com EDTA, lavadas duas vezes com PBS, e então ressuspensas em 400 μL de PBS (aprox. 2-3x106 células). Para isto, foram adicionados 15 μL de 125I (100 mCi/mL estoque), 100 μL de lactoperoxidase bovina (1 mg/mL) do estoque, 10 μL de H2O2 (0,1% do estoque) e estes foram incubados por 5 min. Um adicional de 10 μL de H2O2 foi então adicionado e a incubação continuada por um adicional de 3 min. Células foram então lavadas novamente 3 vezes com PBS e lisadas em Triton 1%. Iodinação de superfície celular da linhagem celular A431 com lactoperoxidase, seguida por imunoprecipitação com o anticorpo 806, mostrou que, similar aos lisados celulares inteiros descritos acima, a forma predominante do EGFR reconhecido pelo 806 ligado na superfície celular das células A431 foi sensível a digestão Endo H (FIG. 48). Isto confirma que a forma do EGFR ligado pelo 806 na superfície celular das células A431 é uma forma sensível a Endo H e então é um tipo alta manose.

Exemplo 22 Anticorpo 806 Humanizado (revestido)

[0489]A. Um vetor de expressão para um anticorpo 806 humanizado (hu806) foi construído. O vetor, denominado 8C65AAG (11891 pb; SEQ ID NO:41), foi designado para conter ambos os genes para o comprimento inteiro hu806 em um cassete de expressão gênico dirigido por promotor GS único (FIGS. 53 e 54).

[0490]A região variável (VP) e constante (CP) de cadeia pesada (SEQ ID NOS: 42 e 43, respectivamente) são mostradas na FIG. 55A, com a região VP CDR1, CDR2 e CDR3 (SEQ ID NO: 44, 45 e 46, respectivamente) indicadas por sublinhado.

[0491]A região variável (VL) e constante (CL) de cadeia leve (SEQ ID NOS: 47 e 48, respectivamente) são mostradas na FIG. 55B, com a região VL CDR1, CDR2 e CDR3 (SEQ ID NO: 49, 50 e 51, respectivamente) indicadas por sublinhado.

[0492]Para obter uma construção de anticorpo 806 humanizado, a tecnologia (v) de revestimento (Daugherty et al. (1991) Polymerase chain reaction facilitates the cloning, CDR-grafting, and rapid expression of a murine monoclonal antibody directed against the CD18 component of leukocyte integrins. Nucleic Acids Res. 19(9), 2471-6; Patente dos EUA 6.797.492 para Daugherty; Padlan, E.A. (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol. Immunol. 28(4-5), 489-98; Patente Européia No. 519596 para Padlan et al.) foi empregada. A fim de minimizar a imunogeni- cidade dos domínios variáveis do anticorpo 806, enquanto preservando propriedades de ligação de ligante, substituição dos resíduos expostos na superfície nas regiões estruturais que diferem daquelas usualmente encontradas nos anticorpos humanos foi empreendida. Para isto ser alcançado, cadeia VL e VP do anticorpo monoclonal de camundongo (mAb) 806 tem sido re-construído por síntese gênica e sobreposição de tecnologia de PCR primer. A cadeia CL (kappa) foi reunida da mesma forma. Para demonstrar a conservação de sítios de ligação intactos, vVL e vVP foramtambém expressos em um formato scFv que demonstrou boa ligação ao peptí- deo sintético que compreende o epítopo antigênico 806 por ELISA e ao domínio ex- tracelular (EGFR) do Receptor EGF recombinante (ECD) como medido por análise de ressonância de plasmon de superfície (SPR).

[0493]As v806VL e v806VP têm sido construídas em um contexto de IgG1 humana de comprimento inteiro usando um códon-otimizado kappa-LC e uma região constante de cadeia pesada IgG1 humana otimizada do sítio de junção e códon re-centemente desenhado para alcançar uma expressão gênica estável nos sistemas de células NS0 e CHO. O sistema de expressão é baseado no sistema de expressão LONZA GS usando os vetores de expressão de cadeia pesada e leve pEE12.4 e pEE6.4 como provido por LONZA Biologics.

[0494]O produto anticorpo hu806 (FIG. 55) obtida por expressão transiente do cetor 8C65AAG foi reativo com EGFR-ECD recombinante por SPR, e com o epí- topo do peptídeo EGFR 806 sintético por ELISA. O vetro 8C65AAG foi transferido para LICR Affiliate Christoph Renner (Universidade de Zurich) para geração de linhagens celulares GS-NS0 hu806 estáveis e para LICR, Melbourne Centre, para geração de linhagens celualres GS-CHO hu806.

Estratégia para construção, amplificação e clonagem de genes de anticorpo hu806 Revestimento e otimização do códon

[0495]Revestimento de anticorpo é uma estratégia de humanização objetivada em respostas de contagem HAMA (anticorpo anti-camundongo humano). mAbs de camundongos são considerados antígenos “estranhos” pelo sistema imune do paciente e uma resposta imune é induzida, mesmo sob uma administração única, prevenindo uso adicionado do reagente nesses pacientes. No primeiro passo do processo de revestimento de mAb806, as sequências de aminoácidos da cadeias VL e VP no mAb806 foram analisadas, e cada resíduos aminoácidos na sequência pro- têica mAb806 foi classificada para exposição na superfície (FIG. 56 e FIG. 57). Somente aqueles aminoácidos que reside no lado externo da molécula de anticorpo foram considerados para possível modificação, como esses foram os únicos que podem ser expostos ao reconhecimento do anticorpo. Usando BLAST, a sequência de proteína do mAb806 foi comparada às três sequências de anticorpo humano (VH36germ, CAD26810, e AAA37941). Sempre que um resíduo da superfície mAb806 não combinar o consenso das sequências do anticorpo humano, este resíduo foi identificado ser mudado para a sequência consenso. Inicialmente 12 aminoá- cidos na VL foram sujeitos a revestimento; e 14 na cadeia VP de ch806 (FIG. 56 e FIG. 57).

[0496]Otimização do códon é um meio de melhorar a expressão heteróloga de anticorpos ou outras proteínas baseadas no códon predisposto do sistema usado para expressar esses anticorpos. Um dos objetivos na criação de hi806 foi utilizar a otimização do códon para melhorar os níveis de expressão para este anticorpo. O sistema de expressão é baseado sob o sistema de expressão LONZA GS usando os vetores de expressão pEE12.4 e pEE6.4 e LC como provido por LONZA Biologics e NS0 e/ou células CHO como células de produção. Então, decisões a cerca de qual códon para uso em um dado aminoácido foram feitas com consideração para se ou não este códon pode ser favorecido nos sistemas de expressão NS0/CHO.

Construção e Amplificação de Sequências de DNA de 806 por PCR

[0497]As sequências revestidas, versões otimizadas do códon das regiões variáveis pesada (VP) e variável leve (VL) do anticorpo hu806 foram sintetizada da seguinte maneira: para cada região (VP ou VL), 8-10 oligonucleotídeos foram designados como iniciadores senso e anti-senso sobrepostos. Esses oligos podem sobrepor cada outro de tal forma a cobrir a sequência VP ou VL hu806 inteira, incluindo a sequência sinal, sequência codificadora, íntrons, e incluem um sítio HindIII na terminação 5’ e um sítio 3’BamHI na terminação 3’. Os mapas de oligonucleotídeos são apresentados nas FIGS. 56B e 57B, e os detalhaes do iniciador são providos abaixo.

[0498]Brevemente, VP ou VL de hu806 foi reunida por PCR como segue: ini-cialmente c806hc- ou c806lcoligos 1, 2, 3, 4, oligos 5, 6 e oligos 7, 8, 9, 10 foram combinados nas três reações separadas. Alíquotas (50 pmol) de cada oligo flanque- ador, e 5 pmol de cada oligo interno foram adicionadis a 50 μL de reação PCR contendo 25 μL de 2x HotStar Taq Master Mix (Qiagen) e 48 μL de água livre de nuclease. O programa termo ciclo foi como segue: 95°C; 15”, [94°C; 30”, 58°C; 30”, 72°C; 30”]x 20 ciclos, 72°C; 10”, 4°C. Os produtos dessas três reações foram cortados após a separação por gel eletroforese. Eles foram então purificados usando uma coluna de sal (Qiagen-Qiaspin Minipreps), e combinados. Esses produtos foram adicionalmente amplificados por PCR usando iniciadores 1 e 10. O produto desta segunda reação inclui sítios de enzima restrição para HindIII e BamHI, permitindo in- serção nos plasmídeos de expressão. Oligonucleotídeos usados em PCR para sintetizar as regiões hu806 V

Hu806 CL:

[0499]Uma versão códon-otimizado da cadeia leve kappa constante (CL) foi preparada em uma forma similar àquela usada para as regiões variáveis. Entretanto, o passo PCR inicial envolveu a criação de somente dois produtos preliminares usando oligos Vklcons-1,2,3,4; e 5,6,7,8. Em adição, os sítios de restrição flanquea- dores para este produto foram BamHI e NotI antes da inserção do plasmídeo. Oligonucleotídeos usados em PCR para sintetizar as regiões hu806 CL

Hu806 CP:

[0500]Uma versão sintética humanizada do gene da cadeia pesada constan- te (CP) IgG1 (SEQ ID NO:80) foi comprada de GeneArt, Regensburg, Alemanha. O gene foi códon-otimizado para expressão em células CHO/NS0. Detalhes da sequência gênica, sítios de restrição etc são mostrados na FIG. 58.

Construção de Plasmídeos de Expressão

[0501]Para transfecção transiente e teste preliminar, sequências VP e VL hu806 preparadas da forma descrita acima foram ligadas em vetores de expressão contendo regiões constantes genéricas. Esses vetores, providos por LICR Affliliate Christoph Renner (Universidade de Zurique, Suíça), foram conhecidos como pEAK8 HC (que continham um CP genérico), ea33-xm-lc (que continha um genérico CL). Vetores foram digeridos usando BamHI e HindIII na presença de CIP; então VP e VL foram ligadas nos vetores correspondentes. Os plasmídeos resultantes foram usados para transformar E. Coli quimicamente competente Top10 (Invitrogen) de acordo com as direções do fabricante. E. Coli transformada foram plaqueadas em placas LB + Ampicilina, clones resistentes foram selecionados por restrição de digestão e PCR. Em geral, oito clones positivos detectados desta forma podem ser isolados e ainda amplificados. DNA purificado a partir dessas colônias foram analisadas por sequen- ciamento de DNA automatizado.

[0502]Versões códon-otimizadas das regiões constantes foram adicionadas a essas construções enzima de restrição-digestão e ligação usando BamHI e NotI. Esses transformantes foram selecionados, sequenciados, e analisados como declarado acima. Antes das cadeias de anticorpo de comprimento inteiro sendo ligadas ao sistema Lonza GS, o sítio BamHI entre as sequências da região variável e constante foram destruídas, em um caso, por digestão usando BamHI, completada usando DNA Polimerase, e ligação na extremidade cega.

[0503]Fragmento os de restrição contendo hu806 (VP + CP) ou hu806 (VL + CL) foram então digeridos com NotI seguido por HingIII. Essas digestões foram designadas para criar uma extremidade cega no sítio NotI, e então foram feitos em sé- ries da seguinte maneira: o plasmídeo foi primeiro digerido com NotI. Plasmídeo complemente digerido (single-cut) foi separado por eletroforese usando um gel de agarose 1%. Este produto foi então cortado e purificado em uma coluna de sal preenchido usando DNA Polimerase. O produto desta reação foi purificado em coluna de sal e então digerido com HindIII. Este produto (~1,3 Kb para hu806 (VP + CP), e ~0,8 Kb para hu806 (VL + CL) foi então separado por gel eletroforese, cortado e purificado.

[0504]Vetores pEE12,4 e pEE6,4 (Lonza Biologics plc, Slough, RU) foram cada digeridos em HindIII e PmlI. Hu806 (VP + CP) foi ligado ao pEE12,4 para criar pEE12,4-hu806H, e hu806 (VL + CL) foi ligado ao pEE6,4 para criar pEE6,4-hu806L.

[0505]Após seleção, um plasmídeo Lonza de gene duplo combinado foi criado para conter ambas, as sequências de cadeia pesada e leve hu806. Brevemente, os vetores pEE12.4-hu806H e pEE6,4-hu806L foram digeridos com enzimas de restrição NotI e SalI. Os fragmento os resultantes, que continham a unidade de transcrição GS e promotor hCMV-MIE, seguido pelo cassete de expressão de cadeia Pesada ou Leve hu806, foram isolados e ligados juntos. O plasmídeo Lonza “combinado” resultante (designado 8C65AAG) foi usado para transfeções transientes de plasmí- deo único em um sistema HEK 293 e transfecções estáveis em sistemas NS0 e CHO. Um mapa de plamídeo é mostrado na FIG. 53.

Modificações para Construções

[0506]A sequência completa verificada de sequências de aminoácidos do hu806 Hc e hu806Lc revestidas são mostradas em comparação ao mAb806 na FIG. 59 e FIG. 60, respectivamente. Flanqueando a sequência hu806 dentro dos apêndices estão asteriscos (*) indicando mudanças de revestimento iniciais e números (18) referem-se as modificações numeradas No. 1 a No. 8 aqui descritas.

[0507]Com relação a FIG. 60, o arquivo de referência (mAb806 LC) incorre-tamente indica Histidina (H), não a correta Tirosina (Y) na posição 91; o sujeito de modificação #1. O arquivo se sequência original incorreto está incluso na FIG. 60, para ilustrar a modificação necessária feita em hu806 na posição 91.

[0508]Um número de modificações foram feitas nas sequências de cDNA de hu806 após a construção inicial e fase de sequenciamento. As razões para fazer essas modificações incluem: introdução de 4 sítios de enzima de restrição para propósitos de modificação de sequência, para corrigir 2 erros aminoácidos na sequência introduzida durante PCR, para corrigir um erro de aminoácido aparecendo a partir da documentação mAb806 inicial, e para construir 4 mudanças de aminoácidos adicionais para efetuar variantes revestidas adicionais. Os 8 estágios seguintes de modificações foram feitos:

1. hu806 VL: CDR3 H91Y

[0509] O documento a partir do qual os oligonucleotídeos originais foram criados incorretamente determinam que existiu um CAC (Histidina, H) na posição 91 no CDR3 da sequência mAb806 VL. Mutagênese sítio-direcionada foi usada para gerar a sequência correta de TAC (Tirosina, Y; Patente WO02/092771). A mudança consequente na sequência de aminoácidos nesta posição foi a partir de CVQHAQF (SEQ ID NO:84) para CVQYAQF (SEQ ID NO:85). O DNA final e sequência de proteína traduzida em comparação ao ch806 são mostrados na FIG. 61.

[0510]Iniciador senso para a modificação de histidina para tirosina da região hu806 VL (PDV1; 40 mer) 5’- CCACATACTACTGCGTCCAGTACGCTCAGTTCCCCTGGAC -3’ (SEQ ID NO:86)

[0511]Iniciador anti-senso para a modificação de histidina para tirosina da região hu806 VL (PDV2; 20 mer) 5’- CTGGACGCAGTAGTATGTGG -3’ (SEQ ID NO:87)

2. Cadeia Pesada hu806: Adição dos Sítios de Restrição DralII e Fsel

[0512]Sítios de enzima de restrição adicionados aos íntrons ao redor das re- giões VP e VL hu806. Esses sítios de restrição (único no sistema de vetor pREN, LICR) foram desenhados para facilitar o processo de fazer modificações para a expressão dos cassetes. A sequência hu806 VP, não incluindo a região sinal inicial, pode ser removida ou inserida por digestão única em DraIII. Em adição, FseI pode ser usada, em acordo com NotI (sistema pREN) ou EcoRI (Sistema Lonza) para cortar a região constante, desempenhando a função de BamHI a partir da sequência original.

[0513]Essas modificações foram alcançadas usando um processo de PCR de dois passos. Os produtos foram então digeridos com HindIII e BglII. Eles foram então ligados em vetores pREN contendo regiões constantes de códon-otimizados, que foram digeridos em HindIII e BamHI. Este processo de re-ligamento destruiu o sítio BamHI.

[0514]Iniciador sendo para a região variável acima do primeiro sítio DraIII (cadeia pesada 806 DraIII Up; 26 mer) 5’- GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTG -3’ (SEQ ID NO:88)

[0515]Iniciador antisendo incorporando o sítio DraIII (cadeia pesada 806 DraIII Down; 28 mer) 5’- CACTGGGTGACTGGCTTCGATGGTGACC -3’ (SEQ ID NO:89)

[0516]Iniciador senso para a região variável HC entre os dois sítios DraIII (cadeia pesada 806 DraIII-FseI Up; 49 mer) 5’- GGTCACCATCGAAGCCAGTCACCCAGTGAAGGGGGCTTCCATCCACTCC -3’ (SEQ ID NO:90)

[0517]Iniciador antisenso incorporando o sítio DraIII II, e o sítio FseI (cadeia pesada 806 DraIII-FseI Downl 44 mer) 5’- CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC -3’ (SEQ ID NO:91)

3. Cadeia Leve hu806: Adição de Sítios de Restrição RsrII e PacI

[0518]Para a cadeia leve hu806, os sítios de restrição adicionados foram RsrII, tendo a mesma função como DraIII na cadeia pesada, e PacI, que combinou a função de FseI.

[0519]Iniciador senso para região variável acima do primeiro sítio RsrII (cadeia leve 806 RsrII Up; 22 mer) 5’- GAGAAGCTTGCCGCCACCATGG -3’ (SEQ ID NO:92)

[0520]Iniciador antisense incorporando o sítio RsrII I (cadeia leve 806 RsrII Down; 25 mer) 5’- CGGTCCGCCCCCTTGACTGGCTTCG -3’ (SEQ ID NO:93)

[0521]Iniciador sendo para a região variável LC entre os dois sítios RsrII (cadeia leve 806 RsrII-PacI Up; 45 mer) 5’- CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTGTC - 3’ (SEQ ID NO:94)

[0522]Iniciador antisenso incorporando o sítio RsrII II, e o sítio PacI (cadeia leve 806 RsrII-PacI Down: 50 mer) 5’- CCAAGATCTTTAATTAACGGACCGCTACTCACGTTTGATTTCCAGTTTTG -3’ (SEQ ID NO:95)

4. VP hu806: Revestimento P85A

[0523]A sequência protêica para o mAb806 parental nos aminoácidos 81-87 da VP é SVTIEDT (SEQ ID NO:96). Como parte do processo de revestimento, iso- leucina e ácido glutâmico nas posições 84 e 85 foram mudados para alanina-prolina para ler SVTAPDT (SEQ ID NO:97; FIG. 56). Sob análise adicional, foi decidido que alanina pode ter sido uma melhor escolha que prolina neste caso. Mutagênese sítio- direcionada foi usada para gerar esta mudança secundária (SVTAADT, SEQ ID NO:98) usando os iniciadores listados abaixo. DNA final e sequências de proteína traduzidas são apresentadas na FIG. 62.

[0524]Iniciador senso (Fx3; 49 mer) 5’- CTGCAGCTGAACTCCGTTACAGCCGCAGACACAGCAACATATTACTGCG -3’ (SEQ ID NO:99)

[0525]Iniciador antisenso (Fx4; 49 mer) 5’- CGCAGTAATATGTTGCTGTGTCTGCGGCTGTAACGGAGTTCAGCTGCAG -3’ (SEQ ID NO:100)

5. VP hu806: Revestimento Adicional

[0526]A sequência da região variável de cadeia pesada hu806 passa por três mutações adicionais seguindo o revestimento inicial: T70S, S76N e Q81K. A mudança na posição 76 a partir de serina para asparagina representou uma correção de volta a sequência original da molécula de mAb806. As mudanças adicionais na estrutura foram inclusas porque elas representam resíduos que não são encontrados em anticorpos de camundongo mas são encontrados em anticorpos humanos. Consequentemente, a sequência protêica TRDTSKSQFFLQ (SEQ ID NO:101) foi revestida a SRDTSKNQFFLK (SEQ ID NO:102). DNA final e sequências de proteína traduzida em comparação ao mAb806 são apresentados na FIG. 62.

[0527]Iniciador senso para o fragmento o PCR 5’ da região variável HC (hu806HCfx2-5p-U; 49 mer) 5’- GGTCACCATCGAAGCCAGTCACCCAGTGAAGGGGGCTTCCATCCACTCC -3’ (SEQ ID NO:103)

[0528]Iniciador antisenso para fragmento o PCR 5’, incorpora primeiras duas mudanças (hu806HCfx2-5p-D; 45mer) 5’- GATTCTTCGACGTGTCCCTTGAGATTGTGATCCGGCTTTTCAGAG -3’ (SEQ ID NO:104)

[0529]Iniciador senso para fragmento o PCR 3’, incorpora todas as mudanças (hu806HCfx2-3p-U; 55mer) 5’- CAAGGGACACGTCGAAGAATCAGTTCTTCCTGAAACTGAACTCCGTTACAGCCG C -3’ (SEQ ID NO:105)

[0530]Iniciador antisense para fragmento o PCR 3’da região variável HC (hu806HCfx2-3p-D; 44mer) 5’- CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC -3’ (SEQ ID NO:106)

6. hu806 VL: revestimento E79Q

[0531]Este foi a única modificação de revestimento da VL pós-construção feita. Na posição 79, mutagênese sítio direcionada foi empregada para corrigir a sequência SSLEPE (SEQ ID NO:107) para SSLQPE (SEQ ID NO:108). DNA final e sequências de proteína traduzida na comparação a ch806 são apresentadas na FIG. 61.

[0532]Iniciador senso para fragmento o PCR 5’ da região variável LC (hu806LC-5p-U; 45mer) 5’- CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTGTC - 3’ (SEQ ID NO:109)

[0533]Iniciador antisense para fragmento PCR 5’, incorpora mutação tencionada (hu806LC-5p-D; 34mer) 5’- CTCTGGTTGTAAGCTAGAGATGGTCAGTGTATAG -3’ (SEQ ID NO:110)

[0534]Iniciador senso para fragmento o PCR 3’ da região variável LC (hu806LC-3p-U; 45mer) 5’- CCATCTCTAGCTTACAACCAGAGGACTTTGCCACATACTACTGCG -3’ (SEQ ID NO:111)

[0535]Iniciador antisense para fragmento PCR 3’ da região variável LC (hu806LC-3p-D; 50mer) 5’- CCAAGATCTTTAATTAACGGACCGCTACTCACGTTTGATTTCCAGTTTTG -3’ (SEQ ID NO:112)

7. Cadeia leve hu806: modificação da junção spliceda região constante kappa

[0536]Este ponto de mutação foi requerido para corrigir um erro na junção da versão códon-otimizada da região constante kappa. Antes desta mudança, a porção da cadeia aminoácida começando com VYACEVYH (SEQ ID NO:113) e continuando para a terminação da molécula pode não ter sido incluída no anticorpo final (FIG. 60).

[0537]Iniciador senso para fragmento PCR 5’ constant LC kappa (F1; 21mer) 5’- GGCGGCACAAAACTGGAAATC -3’ (SEQ ID NO:114)

[0538]Iniciador antisense para fragmento PCR 5’ constante LC kappa, incorpora correção (F2; 59mer) 5' - GATGAGTTACTTCACAGGCATATACTTTGTGCTTTTCATAATCAGCTTTTGACAGT GTC - 3' (SEQ ID NO:115)

[0539]Iniciador senso para fragmento PCR 3’constante LC kappa, incorpora correção (F3; 26mer) 5’- AGTATATGCCTGTGAAGTAACTCATC -3’ (SEQ ID NO:116)

[0540]Iniciador antisense para fragmento PCR 3’ constante LC kappa. (F4; 17mer) 5' - GCCACGATGCGTCCGGC - 3' (SEQ ID NO:117)

8. hu806 VP: N60Q

[0541]Em adição às mudanças de revestimendo feitas no anticorpo 806 nos estágios iniciais da construção, Asparagina na posição 60 em VP CDR2 foi mudada para Glutamina neste ponto. N-Glicosilação segue o esquema: N X S/T, onde X é qualquer aminoácido. A sequência de aminoácidos a partir da posição 60 foi N P S, que segue este esquema. Entretanto, é infrequente o caso que prolina (como em nosso exemplo) ou cisteína é encontrada na posição X para N-glicosilação. Foi de interesse que glicosilação inconsistente pode levar a variações na reatividade do anticorpo. Então, asparagina foi removida, e substituída com o aminoácido mais intimamente relacionado, glutamina, removendo qualquer potencial para este sítio ser glicosilado (FIG. 59 e FIG. 62).

Ligação de Construção 8C65AAG do Anticorpo hu806 Revestido

[0542]Transfecção transiente de células 293FT com o plasmídeo final 8C65AAG foi feita para permitir a preparação de pequenas quantidades de hu806 para verificação de ligação de antígeno inicial. Sobrenadantes de cultura a partir de várias replicatas de pequena escala de transfecções transientes foram agrupadas, concentradas e anticorpo hu806 foi coletado usando passo de cromatografia em proteína-A. Aproximadamente 1-2 μg de anticorpo hu806 foi obtida como medida por um ELISA huIgG1 quantitativo e o anticorpo foi analisado por Biacore para ligar ao EGFR-ECD recombinante (FIG. 63). Imunoglobulina bovina a partir do meio de cultura celular foi co-purificado com hu806 e representou a fração principal de IgG total, limitando avaliação quantitativa de ligação a hu806.

Iniciadores de Sequenciamento

[0543]RenVecUPSTREAM: iniciador senso, inicia o sequenciamento acima da região variável no pico 8, e vetores a33xm. 5’- GCACTTGATGTAATTCTCCTTGG -3’ (SEQ ID NO:118)

[0544]RenVecDwnstrmHC: Iniciador antisenso inicia o sequenciamento aju- sante da região variável no plasmídeo de cadeia pesada pico8. Anelamento dentro da região constante HC não-códon-otimizado. 5’- GAAGTAGTCCTTGACCAGG -3’ (SEQ ID NO:119)

[0545]RenVecDwnstrmLC: Iniciador antisenso inicia o sequenciamento aju- sante da região variável no plasmídeo de cadeia leve a33-xm-lc. Anelamento dentro da região constante LC não-códon-otimizado. 5’- GAAGATGAAGACAGATGGTGCAG -3’ (SEQ ID NO:120)

[0546]Upstrm Lonza: Iniciador senso, inicia sequenciamento acima da região variável em vetores Lonza pEE 12,4 e pEE 6,4. Não pode ser usado com Lonza combinado porque este é uma região duplicada no plasmídeo combinado. 5’- CGGTGGAGGGCAGTGTAGTC -3’ (SEQ ID NO:121)

[0547]Dnstrm 6-4: Iniciador antisenso, inicia sequenciamento jusante da região constante em vetor Lonza pEE 6,4 5’- GTGATGCTATTGCTTTATTTG -3’ (SEQ ID NO:122)

[0548]Dnstrm 12-4: Iniciador antisenso, inicia sequenciamento jusante da região constante em vetor Lonza pEE 12,4 5’- CATACCTACCAGTTCTGCGCC -3’ (SEQ ID NO:123)

[0549]Cod-Opt LC const E: Iniciador senso, interno a região constante v- kappa de cadeia leve códon-otimizado 5’- CCATCCTGTTTGCTTCTTTCC -3’ (SEQ ID NO:124)

[0550]Cod-Opt LC const F: Iniciador antisense, interno a região constante v- kappa de cadeia leve códon-otimizada (vk). 5’- GACAGGGCTGCTGAGTC -3’ (SEQ ID NO:125)

[0551]806HCspec: Iniciador senso, interno e único a versão revestida da região variável 806 HC. 5’- GTGCAGCTCCAAGAGAGTGGAC -3’ (SEQ ID NO:126)

[0552]806LCspec: Iniciador senso, interno e único a versão revestida da re- gião variável 806 LC. 5’- CAGAGTCCATCCAGCATGTC -3’ (SEQ ID NO:127)

[0553]Um documento de texto formatado de GenBank da sequência e anotações de plasmídeo 8C5AAG codificando o IgG1 hu806 é revelado na FIG. 64.

[0554]FIG.53 foi criado usando Vetor NTI (Invitrogen).

[0555]FIGS.59-62 foram criados usando Vetor NTI AlignX.

Discussão

[0556]O revestimento do anticorpo anti-receptor EGF 806 envolveu mutação de 14 aminoácidos na VP (FIG. 59 e FIG. 62), e 12 mudanças para a cadeia VL (FIG> 60 e FIG. 61) com otimização de códon como indicado para expressão em células CHO ou NS0 mamíferas. O vetor do gene duplo final, designado 8C65AAG, tem tido a sequência verificada, e a sequência codificante e tradução controlada. Ligação ao domínio extracelular EGFR recombinante foi confirmado por análises Biacore usando produto hu806 transientemente expresso.

[0557]Clones únicos estáveis produzindo altos níveis de anticorpo hu806 intacto têm sido selecionados no meio livre de glutamina como recomendado por LONZA. Clones estáveis têm sido gradualmente privados de soro para obter culturas livres de soro.

B. Caracterização in vitro e in vivo de hu806

[0558]A produção mais alta de transfectantes hu806 GS-CHO estáveis 14D8, 15B2 e 40A10 e transfectante GS-NS0 hu806 36 foram avançadas, e culturas de pequenas escalas instigadas a permitir a purificação e caracterização do produto hu806 preliminar. Resultados indicaram propriedades fisicoquímicas similares. Con-sequentemente um tanque de cultura de larga escala (15 L) foi experimentado para a mais alta produção de transfectante (GS-CHO hu806 40A10) e o produto purificado passou por caracterização adicional in vitro e estudos de terapia in vivo em modelos xenotransplante U87MG.de2-7 e A431.

Metodologia e Resultados Produção e Processamento Downstream Pequena Escala

[0559]Os experimentos em frascos de agitação foram feitos com frascos de agitação E500 com um volume de cultura celular de 100 mL. FIG. 76 apresenta gráficos da viabilidade celular e de produtividade de anticorpo para os quatro transfec- tantes durante a cultura. Concentração do produto foi estimada por ELISA usando o anticorpo anti-idiotipo 806 LMH-12 (Liu et al. (2003) Generation of anti-idiotype antibodies for application in clinical immunotherapy laboratory analyses. Hybrid Hybri- domics. 22(4), 219-28) como anticorpo de revestimento, e ch806 Lote Clínico: J06024 como padrão. Material coletado foi centrifugado e sobrenadante foi filtrado a 0,2 μm; então os anticorpos foram purificados por afinidade cromatografia de Proteína-A.

Larga Escala

[0560]A linhagem celular transfectante CHO-K1SV expressando o clone candidato hu806 40A10 foi cultivada em um bioreator tanque agitado de 15 L com alimentação com doses de glicose por 16 dias usando CD-CHO (Invitrogen)/25 μM de L-Metionina sulfoximina (MSX; Sigma)/ suplementos GS (Sigma) como o meio base. FIG. 76C apresenta o crescimento celular e produção volumétrica no bioreator do tanque agitador de 15 L. Produção final foi 14,7 L a 58 mg/L por ELISA.

[0561]Material coletado foi centrifugado e sobrenadante foi filtrado a 0,2 μm, então concentrado para 2 L usando membranas 2x30 K em concentrador Pall Cen- trimate. Alíquotas (4x500 mL) foram subsequentemente aplicadas a coluna de Proteína A de 250 mL e eluídas com 50 mM de Citrato, pH 4,5, contendo 200 mM de NaCl. Anticorpo eluído a partir de 4 corridas foi então agrupado, concentrado e diali- sado em PBS, pH 7.4.

[0562]Os produtos hu806 a partir de culturas de pequena e larga escala fo- ram quantificados por OD A280 nm. As amostras de anticorpo recuperadas a parti de rProteína-A foram avaliadas por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (CET) (pequena escala, FIG. 77; larga escalal FIG. 78), 4-20% de Tris-Glicina SDS-PAGE sob condições reduzidas e não reduzidas (FIGS. 79-81), e Foco Isoelétrico foi feito com um sistema de Eletroforese Amersham Multiphor II em uma placa Ampholine PAG (pH 3,5-9,5) de acordo com as instruções do fabricante (FIG. 82).

[0563]Os anticorpos hu806 purificados por afinidade de Proteína-A revelaram picos de proteína dimétricos e idênticos aos perfis de eluição CET para o material de referência clínica ch806. Os perfis do gel SDS-PAGE foram consistentes com uma imunoglobulina. O padrão IEF indicou três isoformas com o pI variando de 8,66 a 8,82 que foi consistente com o pI calculado de 8,4 para a sequência de proteína.

Análise de Ligação Análise de FACS

[0564]As estimativas da concentração de anticorpo para cada amostra pelo OD A280 nm foram utilizadas por análises de FACS com as células A431 da linhagem celular adenocarcinoma (contendo amplificação gênica EGFR). Nós temos previamente observado que mAb806 ligou aproximadamente 10% de ~2x106wtEGFR expressos em células de tumor A431 comparado com mAb528 wt-EGFR específico (Johns et al. (2002) Novel monoclonal antibody specific for the de2-7 epidermal growth factor receptor (EGFR) that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene. Int. J. Cancer. 98(3), 398-408). Células foram coradas com ou uma das quatro amostras hu806, um anticorpo IgG2b irrelevante, ou controle positivo ch806; cada uma foi avaliada em uma concentração de 20 μg/mL. Controle para anticorpo secundário sozinho foi também incluso [anti hi-IgG de cabra (Fc específico) FITC conjugado]. Curvas de ligação de composto em FACS são apresentadas na FIG. 83 e demonstram coloração equivalente para todas as construções.

[0565]As características da ligação celular da amostra hu806 40A10 produzidas por cultura de larga escala também foram avaliadas por FACS para ligação de células A431 bem como U87MG.de2-7 expressando o receptor EGFRcIII variante (Johns et al, 2002). Resultados representativos de análise em duplicata são apresentados na FIG. 84 e FIG. 85, respectivamente. Controles incluíram um anticorpo IgG2b irrelevante (histogramas sombreado), ch806 ou 528 (ligação em ambos, EGFR selvagem e de2-7) como indicado.

[0566]O anticorpo ch806 e o hu806 demonstrou coloração similar das linhagens celulares A431 e U87MG.de2-7 sustentando nossas observações prévias que mAb806 especificamente reconhecem o de2-7 EGFR e um subgrupo de EGFR super expresso (Luwor et al. (2001) Monoclonal antibody 806 inhibits the growth of tumor xenotransplantes expressing either the de2-7 or amplified epidermal growth factor receptor (EGFR) but not wild-type EGFR. Cancer Res. 61(14), 5355-61). Como esperado, o anticorpo 528 corou ambas as linhagens celulares U87MG.de2-7 e A431 (FIGS. 84 e 85).

Análise de Ligação Celular

[0567]As capacidades de ligação de antígeno dos radioimunoconjugados foram avaliadas por ensaios de adsorção celular (Lindmo et al. (1984) Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. J. Immunol. Methods. 72(1), 77-89) usando a linhagem celular de glioma U87MG.de2-7 e células de carcinoma epider- móides A431 expressando o gene EGFR amplificado.

[0568]Frações imunoreativas de radioconjugados hu806 e ch806 foram de-terminadas por ligação às células expressando antígeno em presença de excesso de antígeno. Resultados para ligação celular U87MG.de2-7 de 125I-hu806 e 125I- ch806 são apresentados na FIG. 86A sob a variação de concentração celular de 20x106a 0,03x106células/amostra. Resultados para ligação celular A431 de 125I- hu806 e 125I-ch806 são apresentados na FIG. 86B em uma variação de concentração celular de 200x106a 0,39x106células/amostra.

[0569]Análises Scatchard foram usadas para calcular a constante de associação (Ka) (Lindmo et al, 1984). A ligação de baixos níveis (20 mg) de anticorpo marcado sozinho foi comparada com ligação em presença de anticorpo não marcado em excesso. A fração imunoreativa foi levada em conta no cálculo da quantidade de anticorpo livre reativo como previamente descrito (Clarke et al. (2000) In vivo biodistribution of a humanized anti-Lewis Y monoclonal antibody (hu3S193) in MCF-7 xeno- transplanteed BALB/c nude mice. Cancer Res. 60(17), 4804-11) e ligação específica (nM; anticorpo total x % de ligação) foi colocada em gráfico contra a ligação especí- fica/reação livre (FIGS. 87 e 88). A associação constante foi determinada a partir de inclinação negativa da linha.

[0570]A afinidade de ligação para 125I-hu806 ligando células EGFRvIII em células U87MG.de2-7 foi determinado ser 1,18x109M-1. O Ka para 125I-ch806 foi 1,06x109M-1. Essas observações estão em acordo com os resultados relatados de valores Ka para 111In- e 125I-ch806 de 1,36x109M-1e 1,90x109M-1, respectivamente, que é altamente comparável ao do mAb806 parental murino de 1,1x109M-1(Pa- nousis et al. (2005) Engineering and characterization of chimeric monoclonal antibody 806 (ch806) for targeted immunotherapy of tumours expressing de2-7 EGFR or amplified EGFR. Br. J. Cancer. 92(6), 1069-77).

[0571]A análise Scatchard nas células A431 demonstrou alta afinidade de ligação por ambas construções 806 para uma menor população de EGFR nessas células. O Ka para 125I-ch806 foi 0,61x109M-1; e para 125I-hu806 o Ka = 0,28 x 109M-1.

Análise de Biosensor

[0572]Análises biosensoras foram feitas em um biosensor BIAcore 2000 usando um sensor chip revestido por carboximetildextran (CM5). O chip foi derivado no canal 3 com o peptídeo epítopo 806 (aminoácidos EGFR 287-302; SEQ ID NO:14; ver Pedido de Patente dos EUA No. 11/060.646, depositado em 17 de Fevereiro de 2005; Pedido de Patente Provisória dos EUA No. 60/546.602, depositado em 20 de Fevereiro de 2004; e Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 60/584.623, depositado em 01 de Julho de 2004, a revelação de cada é aqui incorporada em sua totalidade), usando química de acoplamento amina padrão. Canal 2 foi derivado com um antígeno controle usado para sistema de determinação de ade- quabilidade. Canal 1 foi derivado com etanolamina e usado como um canal controle branco para correção de efeitos de índice refrativo. Amostras de hu806 foram diluídas em tampão HBS (10 mM de HEPES, pH 7.4; 150 mM de NaCl; 3,4 mM de di-Na- EDTA; 0,005% Tween-20), e alíquotas (120 μL) contendo 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM e 300 nM foram injetados pelo chip sensor de superfície em uma taxa de fluxo de 30 μL/min. Após a fase de injeção, dissociação foi monitorada por fluxo de tampão HBS pelo chip de superfície por 600 s. Anticorpo ligado foi eluído e o chip de superfície regenerado entre amostras por injeção de 20 μL de 10 mM de solução de hidróxido de sódio. Controle positivo, ch806, foi incluso. Os parâmetros de ligação foram determinados usando o modelo de ligação de equilíbrio do programa BIAevaluation. FIG. 89 apresenta os sensogramas gerados.

[0573]Ligação dose-dependente foi observada com ambos, hu806 e controle positivo, ch806, ou canal 3. Sistema de adequabilidade foi confirmado por ligação dose dependente do anticorpo monoclonal apropriado para controle canal 2. Nenhuma reatividade cruzada foi observada entre hu806 (ou ch806) e o anticorpo controle. Nossas análises determinaram que o KD aparente (1/Ka) foi 37 nM para hu806 e 94 nM para ch806.

Análises de Citotoxidade Celular Dependente de Anticorpo

[0574]Análises ADCC foram feitas usando preparação 10A10 de anticorpo hu806 purificado com células de adenocarcinoma A431 alvo e células efetoras mo- nonucleares de sangue periférico de doador saudável recentemente isoladas. Bre vemente, todas as análises foram feitas em triplicata com 1) 1 μg/mL de cade anticorpo por uma variação de proporções efetor para célula alvo (E:A = 0,78:1 para 100:1) e também 2) em E:A-50:1 por uma variação de concentração de cada anticorpo (3,15 ng/mL - 10 μg/mL). Controles para isotipo de anticorpo, citotoxidade espontânea e total foram inclusas em triplicatas e cálculos para citotoxidade específica foram como previamente descrito (Panousis et al, 2005). Resultados são apresentados na FIG. 90.

[0575]O hu806 consistentemente demonstrou atividade ADCC superior a IgG1 ch806 quimérica. No experimento representativo mostrado, hu806 a 1 μg/mL efetuou um ADCC de 30% de citotoxidade em contraste a 5% de citotoxidade de ch806.

Estudo da Terapia de 806 In vivo

[0576]A eficácia terapêutica de hu806 foi investigada usando xenotransplan- tes glioma U87MG-de2-7 ou adenocarcinoma A431 estabelecidas em camundongos nude BALB/c. Para estabelecer xenotransplantes, camundongos foram injetados subcutaneamente na linha mamária direita e esquerda com 1x106células de adeno-carcinoma A431 ou 1x106de células de glioma U87MG.de2-7 em 100 μL de PBS. O volume do tumor (VT) foi calculado pela fórmula [(comprimento x largura2)/2] onde o comprimento foi o eixo mais comprido e a largura a medida dos ângulos retos ao comprimento. Em um experimento inicial, grupos de cinco camundongos nude BALB/c (n=10 tumores/grupo) com xenotransplantes A431 ou U87MG.de2-7 estabelecidos receberam tratamento de 1 mg de anticorpo hu806 ou 1 mg de ch806 ou veículo controle PBS por injeção IP. Terapia foi administrada nos dias 6, 8, 11, 13, 15 e 18 para A431, e nos dias 4, 6, 8, 11, 13 e 15 para as linhagens celulares U87MG.de2-7 respectivamente. Média ± EPM de volumes de tumores até término dos experimentos devido a considerações éticas de dificuldade do tumor são apresentadas na FIG. 91 para o xenotransplante A431 até o dia 25, e na FIG. 92 para xenotransplantes U87MG.de2-7 até o dia 31.

[0577]Nas avaliações da terapia in vivo com hu806 mostraram uma redução marcada no crescimento xenotransplante A431 comparadas com veículo controle PBS. A curva de crescimento xenotransplante A431 para hu806 foi altamente comparável ao grupo de tratamento ch806. Nos xenograts U87MG.de2-7 estabelecidos, o grupo controle PBS foi eutanaziado no dia 20. A terapia hu806 demonstrou signifi- cante redução no crescimento tumoral pelo dia 20 comparado aos controles PBS (P<0,001), e atraso do crescimento do tumor após o dia 20 similar ao grupo ch806.

Discussão

[0578]Os anticorpos hu806 purificados por afinidade a Proteína-A revelaram perfis de eluição SEC idênticos ao material de referência clínica ch806, e perfis de gel de SDS-PAGE consistente com uma imunoglobulina. O padrão IEF foi consistente com o pI antecipado de 8.4.

[0579]Embora ligação celular Scatchard e análise de ligação de epítopo Biosensor do anticorpo hu806 demonstraram curvas de ligação altamente comparáveis e parâmetros de afinidade ao anticorpo ch806. A afinidade de ligação de hu806 e ch806 ap EGFRvIII e EGFR selvagem super expresso são similares e na baixa variação nanomolar. Ligação celular através de análise de FACS sustentou essas observações.

[0580]Além disso, o hu806 demonstrou marcadamente melhora de ADCC por uma construção ch806 em células A431 positivas para antígeno alvo.

[0581]As avaliações terapêuticas in vivo com hu806 mostraram uma redução marcante no crescimento xenotransplante A431, que foi altamente comparável ao grupo de tratamento ch806. Nos xenotransplantes U87MG.de2-7 estabelecidos, terapia hu806 demonstrou significante redução no crescimento de tumor no dia 20 comparado aos controles PBS e atraso do crescimento de tumor continuado após do dia 20 similar ao grupo ch806.

Exemplo 23 Anticorpo Monoclonal 175

[0582]Como discutido no Exemplo 1, clone 175 (IgG2a) foi selecionado para caracterização adiciona.

a. Materiais e Métodos Linhagens Celulares

[0583]As linhagens celulares U87MG.Δ2-7 (Huang et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 2927-2935) e A431 (Ullrich et al. (1984) Nature. 309, 418-425) transfec- tadas com Δ2-7EGFR têm sido descritas previamente. A linhagem celular de próstata independente de hormônio DU145 (Mickey et al. (1977) Cancer Res. 37, 40494058) foi obtido a partir de ATCC (atcc.org).

[0584]Todas as linhagens celulares foram mantidas em DMEM (Life Techno-logies, Grand Island, NI) contendo 10% de SFB (CSL, Melbourne), 2 mM de glutami- na (Sigma Chemical Co, St. Louis), e penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Grand Island). Em adição, a linhagem celular U87MG.Δ2-7 foi mantida em 400 mg/mL de Geneticina (Life Technologies, Inc, Grand Island). Linhagens celulares BaF/3 (Palacios et al. (1984) Nature. 309, 126-131) e BaF/3 expressando receptores EGF (Walker et al. (2004) J. Biol. Chem. 2(79), 22387-22398) foram mantidas rotineiramente em RPMI 1640 (GIBCO BRL) suplementado com 10% de soro fetal bovino (GIBCO BRL) e 10% de meio condicionado WEHI-3B (Ymer et al. (1985) Nature. 19-25;317, 255-258) como uma fonte de IL-3. Todas as linhagens celulares foram crescidos a 37oC em atmosfera ar/CO2 (95%-5%).

Anticorpos e peptídeos

[0585]mAb806 e mAb175 foram geradas em Ludwig Institute for Cancer Re- serch (LICR) New York Branch e foram produzidos e purificados na Biological Production Facility (Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne). A linhagem de fibroblasto murino NR6AEGFR foi usada como imunógeno. Hibridomas de camundon- go foram gerados por imunização de camundongos BALB/c pro cinco vezes, subcu- taneamente em intervalos de 2- a 3-semanas, com 5x105-2x106células no adjuvante. Adjuvante de Freund completo foi usado para a primeira injeção. Além disso, adjuvante de Freund incompleto (Difco) foi usado. Células de baço a partir de camundongos imunizados foram fusionadas com linhagem celular de mieloma de camundongo SP2/0. Sobrenadantes de clones recentemente gerados foram selecionados nso ensaios de hemadsorção para reatividade com linhagem celular NR6, NR6wtEGFR, e NR6AEGFR e então analisados por ensaios de hemadsorção com linhagens celulares de glioblastoma humano U87MG, U87MGwtEGFR, e U87MGAEGFR.

[0586]mAbs intactos (50 mg) foram digeridos em PBS com papaína ativada por 2-3 horas a 37oC em uma proporção de 1:20 e a papaína foi inativada com iodo- acetamida. A digestão foi então passada por uma coluna de Proteína-A sefarose (Amersham) em tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 8.0, com o fluxo adicional purificado por troca catiônica usando em uma coluna Mono-S (Amersham). Proteína foi então concentrada usando um concentrador de centrífuga MWCO 10.000 (Millipore). Para complexos Fab-peptídeo um excesso molar de peptídeo liofilizado foi adicionado diretamente ao Fab e incubado por 2 horas a 4oC antes de determinar testes de cristalização.

Mapeamento de mAb175 usando fragmento os EGFR expressos em células mamíferas

[0587]O dia antes da transfecção com esses fragmento os, fibroblastos de rim embriônico humano 293T foram plaqueados a 8x105por poço em placas de cultura de tecido de 6 poços contendo 2 mL de meio. Células foram transfectadas com 3-4 μg de plasmídeo DNA complexado com Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 24 a 48 h após transfecção, culturas celulares foram aspiradas e camadas mono-celulares lisadas em 250 μL de tampão de lise (1% de Tritin X-100, 10% de glicerol, 150 mM de NaCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM de EGTA e mistura de Inibidor de Protease Completa (Roche). Alíquotas de li- sado celular (10-15 μL) foram misturadas com tampão de amostra SDS contendo 1,5% de β-mercaptoetanol, desnaturado por aquecimento por 5 min a 100oC e passada em eletroforese em géis NuPAGE Bis-Tris poliacrilamida 10% (Invitrogen). Amostras foram então eletro-transferidas para membranas de nitrocelulose que foram lavadas em tampão TBST (10 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM de NaCl e 0,1% de Tween-20) e bloqueadas em TBST contendo 2,5% de leite desnatado por 30 min em temperatura ambiente. Membranas foram incubadas por uma noite a 4oC com 0,5 μg/mL de mAb175 em tampão de bloqueio. Membranas paralelas foram experimentados por uma noite com mAb 9B11 (1:5000, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts) para detectar o epítopo c-myc. Membranas foram lavadas em TBST, e incubadas em tampão bloqueador contendo IgG anti-camundongo de coelho conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Biorad) em uma diluição de 1:5000 por 2 h em temperatura ambiente. Blots foram então lavados em TBST, e desenvolvidos usando filme autoradiográfico seguindo incubação com Substrato de Quimioluminescência Western Pico (Pierce, Rockford, Illinois).

Mapeamento de mAb175 usando fragmento os EGFR expressos em células mamíferas e levedura

[0588]Uma série de sobreposições de fragmento os ectodomínio EGFR marcados com c-myc, iniciando nos resíduos 274, 282, 290 e 298 e todos terminando no aminoácido 501 e fusionados ao hormônio de crescimento têm sido descrito previamente (Johns et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384). Expressão de proteínas EGFR na superfície de célula de levedura foi feita como previamente descrito (Johns et al., 2004).

[0589]Brevemente, colônias transformadas foram crescidas a 30oC em meio mínimo contendo base nitrogênio de levedura, caseína hidrolisada, dextrose, e tampão fosfato pH 7.4, em uma plataforma de agitação por aproximadamente um dia até uma PD600 de 5-6 ser alcançada. Células de levedura foram então induzidas por proteína reveladas por transferência para meio mínimo contendo galactose, e incubado com agitador a 30oC por 24 h. Culturas foram então estocadas a 4oC até análise. Fluídos de ascites brutos contendo o anticorpo monoclonal c-myc 9E10 foi obtido a partir de Covance (Richmond, CA). 1x106células de levedura foram lavadas com tampão de FACS gelado (PBS contendo 1 mg/mL de BSA) e incubadas com ou ascite anti-c-myc (diluição 1:50), ou anticorpo monoclonal EGFR humano (10 μg/mL) em um volume fina de 50 μL, por 1 h a 4oC. As células foram então lavadas com tampão de FACS gelado e incubadas com IgG anti-camundongo marcada com ficoeritrina (diluição 1:25), em um volume final de 50 μL por 1 h a 4oC, protegido da luz. Após lavagem das células de levedura com tampão de FACS gelado, dados fluorescentes foram obtidos com um citômetro de fluxo Coulter Epics XL (Beckman-Coulter), e analisados com programa de citometria WinMDI (J. Trotter, Universidade Scripps). Para determinação de epítopos lineares versus conformacionais, células de levedura foram aquecidas a 80oC por 30 min, então resfriadas em gelo por 20 min antes de marcação com anticorpos. As séries de mutantes EGFR listadas na Tabela 7 têm sido descrita previamente (Johns et al, 2004).

Ressonância de Plasmon de Superfície (BIAcore)

[0590]Um BIAcore 3000 foi usado para todos os experimentos. Os peptídeos contendo o epítopo mAb806 putativo foram imobilizados em um chip sensor CM5 usando acoplamento amina, tiol ou Pms em uma taxa de fluxo de 5 μL/min (Wade et al. (2006) Anal. Biochem. 348, 315-317). O mAb806 e mAb175 foram passados através do sensor de superfície em uma taxa de fluxo de 5 μL/min a 25oC. As superfícies foram regeneradas entre corridas por injeção de 10 mM de HCl em uma taxa de fluxo de 10 μL/min.

Imunoprecipitação e Western blotting

[0591]Células foram lisadas com tampão de lise (1% de Tritin X-100, 30 mM de HEPES, 150 mM NaCl, 500 mM de fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenosulfonila, 150 nM de aprotinina, 1 mM de inibidor de protease E-64, 0,5 mM de EDTA, e 1 mM de leupeptina, pH 7.4) por 20 minutos, clarificada por centrifugação a 14000x g pro 30 minutos, imunoprecipitadas com os anticorpos relevantes em uma concentração final de 5 μg/mL por 60 minutos e capturadas por esferas de Sefarose-A por uma noite. Amostras foram então eluídas com Tampão Amostra 2X NuPAGE SDS (Invi- trogen), resolvidos em géis NuPAGE (ou 3-8% ou 4-12%), eletro-transferidos para membrana de transferência Immobilon-P (Millipore), e então incubadas com anticorpos relevantes antes da detecção por radiografia de quimioluminescência.

Imunohistoquímica

[0592]Cortes congelados foram corados com 5 μg/mL de mAb175 ou isotipo controle irrelevante por 60 min em temperatura ambiente. Anticorpo ligado foi detectado usando o sistema de detecção Dako Envision + HRP de acordo com instruções do fabricante. Cortes foram finalmente lavados com água, contra corados com he- matoxilina e montados.

Modelos de Xenotransplantes

[0593]Células U87MG.Δ2-7 (3x106) e 100 μL de PBS foram inoculadas s.c. em ambos os flancos de camundongos nude BALB/c fêmeas de 4-6 semanas de idade (Animal Research Centre, Perth, Austrália). Todos os estudos foram conduzidos usando modelos de tumor estabelecidos como previamente relatado (Perera et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11, 6390-6399). O tratamento começou uma vez que os tumores alcançaram o volume médio indicado na legenda da figura apropriada. O volume do tumor em mm3 foi determinado usando a fórmula (comprimento x largu- ra2)/2, onde o comprimento foi o eixo mais longo e a largura foi a medida perpendicular. Dados são expressos como média do volume do tumor ± EP para cada grupo de tratamento. Todos os dados foram analisados para significância por teste de Estudante one-sided onde p<0,05 foi considerado estatisticamente significante. Este projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital de Austin.

Geração e caracterização de linhagens celulares estáveis expressando construções mutantes EGFR

[0594]Mutações do wtEGFR foram geradas usando um kit de mutagênese sítio-direcionada (Stratagene, La Jolla, CA). O padrão para cada mutagênese foi o cDNA do EGFR humano (número de acesso x00588) (Ullrich et al (1984) Nature, 309, 418-425). Sequenciamento nucleotídico automatizado de cada construção foi feita para confirmar a integridade das mutações EGFR. EGFR selvagem e mutante (C173A/C281A) foram transfectados em células BaF/3 por eletroporação.

[0595]Linhagens de células estáveis expressando o EGFR mutante foram obtidas por seleção em meio contendo neomicina. Após seleção final, mRNA foi isolado a partir de cada linhagem celular, sequência reversa transcrita e EGFR amplificada por PCR. Todas as mutações no EGFR expressos foram confirmadas por se- quenciamento dos produtos por PCR. O nível de expressão de EGFR foi determinado pro análise de FACS em um FACStar (Becton e Dickinson, Franklin Lakes, NJ) usando o anticorpo anti-EGFR mAb528 (Masui et al. (1984) Cancer Res. 44, 10021007;Gill et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 7755-7760) a 10 μg/mL em PBS, 5% de SFB, 5 mM de EDTA seguido por Ig anti-camundongo marcado com Alexa 488 (diluição final 1:400). Fluorescência do background foi determinada pela incubação das células com um anticorpo primário combinado com classe irrelevante. Todas as células foram rotineiramente passadas em RPMI, 10% de SFB, 10% de meio condicionado WEHI3B e 1,5 mg/mL G418.

Ativação dependente EGF de EGFR mutante

[0596]Células expressando o wtEGFR ou C27lA/C283A-EGFR foram lavadas e incubadas por 3 h em meio sem soro ou IL-3. Células foram coletadas por centrifugação e ressupensas em meio contendo EGF (100 ng/mL) ou um volume equivalente de PBS. Células foram coletadas após 15 min., concentradas e lisadas diretamente no tampão de amostra SDS/PAGE contendo p-mercaptoetanol. Amostras foram experimentadas com anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnologies) ou anticorpos anti-EGFR (mAb806, produzido no LICR). Bandas reativas foram detectadas usando quimioluminescência.

Efeito de EGF e anticorpos na proliferação celular

[0597]Células crescendo na fase log foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS para remover o IL-3 residual. Células foram ressuspensas em RPMI 1640 mais 10% de SFB e plaqueadas em placas de 96 poços a 105células/poço com veículo somente ou com concentrações crescentes de EGF. Onde apropriado, uma concentração fixada de mAb528 ou mAb806 (2 μg/poço) foi também adicionado às culturas. Proliferação foi determinada usando o ensaio MTT (van de Loosdrecht et al. (1994) J. Immunol. Methods. 174, 311-320).

Reatividade com Anticorpos de Conformação Específica

[0598]Células foram coletadas por centrifugação e coradas com o controle ou anticorpos testes (todos a 10 μg/mL em tampão de FACS pro 40 min no gelo, lavados em tampão de FACS) seguido por Ig anti-camundongo marcado com Alexa 488 (1:400 final, 20 min no gelo). As células foram lavadas com tampão de FACS gelado, coletadas por centrifugação, e analisadas em um FACScan; canal de pico de fluorescência e média de fluorescência foram determinados para cada amostra usando uma ferramenta estatística em Cell Quest (Becton e Dickinson). Fluorescência do background (controle negativo) foi reduzida de todas as medidas. Os valores de fluorescência média foram escolhidos como mais representativo da forma do pico e intensidade de fluorescência e foram usados para derivar a proporção de ligação mAb806 a mAb528.

Determinações da estrutura cristalina de Fab 175, e Fab 806, complexos Fab-peptídeo e a estrutura RMN do epítopo do peptídeo 806 na solução

[0599]Estruturas foram determinadas por substituição molecular e refina- mento convergido com R=0,225/Rlivre=0,289 para Fab806 e R=0,226/Rlivre=0,279 para peptídeo Fab806; R-0,210/Rlivre=0,305 para Fab806 e R=0,203/Rlivre=0,257 para Fab806:peptídeo.

[0600]Cristais de Fab 806 nativo foram crescidos por suspensão da difusão de vapor usando 10 mg/mL de Fab e um reservatório contendo 0,1 M de tampão acetato de sódio pH 4.6, 6-8% de PEG6000 e 15-20% de Isopropanol. Para coleta de dados, cristais foram transferidos para uma solução crioprotetora contendo 0,1 M de tampão de acetato de sódio pH 4.6, 10% de PEG6000, 15-20% de isopropanol e 10% de glicerol. Cristais foram então montados em uma alça de nylon e congelados instantaneamente diretos em nitrogênio líquido.

[0601]Cristais do complexo Fab 806-peptídeo foram crescidos por suspensão da difusão de vapor usando 10 mg/mL de complexo Fab-peptídeo e um reservatório contendo 0,2 M de acetato de amônio, 16-18% de PEG, 5000 monometiléter; a qualidade dos cristais foi então melhorada através de técnicas de plaqueamento. Para coleta de dados, cristais foram transferidos para uma solução crioprotetora consistindo de reservatório suplementado com 25% de glicerol. Cristais foram então montados em uma alça de nylon e congelados rapidamente diretos em nitrogênio líquido.

[0602]Cristais do complexo Fab 175-peptídeo foram inicialmente crescidos por difusão de interface livre usando um sistema de cristalização Topaz (Fluidigm, São Francisco). Microcristais foram crescidos por suspensão da difusão de vapor usando 7 mg/mL de Fab com condições similares, 0,1 M tampão de propano Bis-tris, 0,2 M de acetato de amônio e 18% de pEG 10000. Microcristais foram então melhorados por passos de plaqueamento em formato de Sódio 0,15 m e 15% de PEG 1500 para produzir cristais moldados em pequenas placas. Para coleta de dados, cristais foram transferidos para uma solução crioprotetora consistindo de reservatório suplementado com 25% de glicerol. Cristais foram então montados em uma alça de nylon e rapidamente congelados em nitrogênio líquido.

[0603]Dados de difração em cristais complexos Fab 806 e 175 Fab foram co-letados internamente usando um detector R-AXIS IV em um gerados Rigaku micromax-007 adaptado com ótico AXCO, esses dados foram então processados usando CrystalClear. Dados do complexo Fab 806-peptídeo foram coletados em um detector ADSC quantum315 CCD em linha de irradiação X29, Brookhaven National Laboratory, esses dados foram processados com HKL2000 (Otwinowski, Z. e Minor, W. (1997) Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Academic Press (Nova Iorque)) (estatísticas dos dados coletados são mostradas na Tabela 9). Fab 806 nativo foi esclarecido por substituição molecular usando o programa MOLREP (Vagin, A. e Teplyakov, A. (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025) usando as coordenadas da estrutura Fab, refinamento 2E8 da estrutura foi feito em REFMAC5 (Murshudov et al. (1997) Acta crystallographica 53, 240-255) e modelo de construção em Coot (Emsley, P. e Cowtan, K. (2004) Acta crystallographica 60, 2126-2132).

[0604]Ambas, estruturas de peptídeo 806 e peptídeo Fab 175 foram esclarecidas por substituição molecular usando o programa MOLREP, usando as coordenadas da estrutura Fab 806, refinamento e re-construção foram novamente feitos em REFMAC5, e COOT e O. Validação das estruturas finais foram feitas com PROCHECK (Laskowski et al. (1993) J. Appl. Cryst. 26, 283-291) e WHATCHECK (Hooft et al. (1996) Nature 381, 272).

Estudos de RMN

[0605]Para estudos de RMN, paptídeo marcado com 15N foi produzido re- combinantemente como uma fusão ao domínio SH2 de SHP2 usando o método pre-viamente descrito por Fairlie et al (Fairlie et al. (2002) Protein expression and purification26, 171-178) exceto que a E. Coli foi crescida em meio mínimo de Neidhardt suplementado com 15NH4Cl (Neidhardt et al. (1974) Journal of bacteriology 119, 736-747). O peptídeo foi clivado a partir do parceiro de fusão usando CNBr, purifica- do por HPLC de fase reversa e sua identidade confirmada por espectrometria em massa MALDI-TOF e sequenciamento N-terminal. O resíduo metionina dentro da sequência ligação de anticorpo 806 foi mutada para leucina para permitir a clivagem a partir do parceiro de fusão, mas não dentro do peptídeo propriamente dito.

[0606]Amostras usadas para estudos de RMN foram preparadas em solução H2O contendo 5% de H2O, 70 mM de NaCl e 50 mM de NaPO4 em pH 6.8. Todos os espectros foram adquiridos a 298 K em um espectrômetro Bruker Avance 500 usando um crio-padrão. Avaliações sequenciais do peptídeo na ausência de m806Fab foram estabelecidos usando 2D TOCSY e NOESY bem como espectro TOCSY e NOESY 15N-editado. Interação entre o peptídeo e fAb806 foi examinada por monitorando do espectro 15N HSQC do peptídeo na ausência e presença de fAb806. Perturbação de espectro do espectro 15N HSQC do peptídeo em presença de fAb806 claramente indica que o peptídeo foi capaz de ligar ao fAb806 sob a presença das condições de solução. Conformação detalhada do peptídeo na forma de complexo não foi determinada. Desvios a partir dos valores de mudança química de alças aleatórias para o peptídeo mAb806 são mostrados na FIG. 93.

Biodistribuição do Tumor chAb806 em Pacientes

[0607]Para demonstrar a especificidade do tumor de mAb806 in vivo, uma versão quimérica (ch806) foi construída e produzida sob condições cGMP (Panousis et al. (2005) Br. J. Cancer. 92, 1069-1077). A triagem “primeira administração em humano” de Fase I foi conduzida para avaliar a segurança, biodistribuição e resposta imune de ch806 em pacientes com tumores 806 positivos, e os resultados de segurança, biodistribuição e farmacocinética têm sido relatados previamente (Scott et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4071-4076). Para definir a especificidade de ch806 em tumor comparado ao tecido normal (isto é, fígado) em pacientes, a captação quantitativa de ch806 em tumor e fígado foi feita por cálculo da % da dose injetada (ID) de 111In-ch806 a partir de imagens de câmera gama de corpo inteiro obtidas por uma semana seguindo injeção de 5-7 mCi (200-280 MBq) de 111In- ch806. Cálculos de dosimetria do fígado e tumor foram feitos baseados em regiões de interesse em cada indivíduo paciente. Grupos de dados de infusão de imagem de 111In-ch806, corrigidos para o background e atenuação, permitiu o cálculo de atividade acumulada. Cálculo de dosimetria foi feito para derivar a concentração de 111In- ch806 no tumor e fígado por um período de uma semana pós-injeção.

b. Sequenciamento

[0608]As cadeias pesada e variável (VP) e variável leve (VL) do mAb175 foram sequenciada, e suas regiões determinantes de complementariedade (CDRs) identificadas, como segue:

[0609]Cadeia VP mAb175: sequências de ácido nucléico (SEQ ID NO:128) e aminoácido (SEQ ID NO:129) são mostradas nas FIGS. 74A e 74B, respectivamen-te.Regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2, e CDR3 (SEQ ID NOS: 130, 131 e 132, respectivamente) são indicadas por sublinhado na FIG. 74B.

[0610]Cadeia VL mAb175: sequências de ácido nucléico (SEQ ID NO:133) e aminoácido (SEQ ID NO:134) são mostradas nas FIGS. 75A e 75B, respectivamen-te.Regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2, e CDR3 (SEQ ID NOS: 135, 136 e 137, respectivamente) são indicadas por sublinhado na FIG. 75B.

[0611]Os dados de sequência para mAb175 são baseados em ambos, sequência e dados da estrutura cristal, como a linhagem celular não é clonal, e assim sequências múltiplas têm sido obtidas a partir da linhagem celular. As sequências de mAb175 reveladas têm sido confirmadas por estrutura cristal, e diferem por um ami- noácido único em cada CDR1 e CDR da cadeia VL a partir de sequências prévias baseadas em dados da sequência padrão sozinha. Um isotipo diferente de mAb175 (isotipo IgG2a não usual) tem também sido obtido, baseado na sequência final e dados da estrutura cristal.

Especificidade de mAb175

[0612]Estudos de ligação preliminares sugerem que mAb175 revelou especi-ficidade similar para EGFR como mAb806. Nas regiões CDR ofmAb806 (IgG2b) e mAb175 (IgG2a), as sequências de aminoácidos são quase idênticas, com somente um aminoácido de diferença em cada (FIG> 65; Ver Exemplo 26, abaixo). Todas essas diferenças preservam a carga e tamanho das cadeias laterais. Claramente esses anticorpos têm levantado originados independentemente.

c. Experimentos

[0613]Um grupo de experimentos de imunohistoquímica foram conduzidos para analisar a especificidade de ligação mAb175. Seções coradas de mAb175 de xenotransplantes A431 que super expressam o EGFR (FIG. 66A) e seções de xeno- transplantes de glioma U87MG.Δ2-7 que expressam o Δ2-7EGFR (FIG. 66A). Em contraste, mAb175 não cora seções de xenotransplante U87MG. A linhagem celular U87MG somente expressa níveis modestos do EGFR selvagem (FIG. 66A) e não tem alça autócrina de EGFR detectável. Mais importantemente, mAb175 não se liga as seções de fígado humano normal (FIG. 66B). Então, mAb175 parece demonstrar a mesma especificidade como mAb806, isto é, ele detecta EGFR humano super expresso e truncado, mas não o wtEGFR expresso em níveis modestos.

Identificação do epítopo mAb175

[0614]Desde que mAb175 também se liga a Δ2-7EGFR, em que 6-273 ami- noácidos são deletados, e EGFR1-501, o epítopo mAb175 deve ser contido dentro de resíduos 274-501. Quando determinando o epítopo de mAb806, nós expressamos uma série de fragmento os de EGFR marcados com c-myc fusionados à terminação carbóxi de GH humano, todos terminando no aminoácido 501 (Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550; Johns et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384).

[0615]O mAb175 também reagiu com ambos os fragmento os 274-501 e 282-501 em Western blots, mas não detectou fragmento os começando no aminoá- cido 290 ou 298 (FIG. 73). A presença de todas as proteínas de fusão GH-EGFR foi confirmada usando o anticorpo c-myc. 9EI0 (FIG. 73). Então, um determinante crítico do epítopo mAb175 é localizado perto do aminoácido 290. Finalmente, um fragmento o 274-501 com o epítopo mAb806 deletou (Δ287-302) foi também negativo para ligação de mAb175 (FIG. 73), sugerindo que esta região similarmente determinou a maioria da ligação mAb175.

[0616]Uma segunda abordagem foi usada para caracterizar o epítopo mAb175 adicional. Fragmento os compreendendo domínios extracelulares do EGFR foram expressos na superfície de levedira e testada para mAb175 por imunofluores- cência indireta usando citometria de fluxo. O mAb175 reconheceu o fragmento o de levedura 273-621, que corresponde ao domínio extracelular do Δ2-7 EGFR, mas não para os fragmento os 1-176, 1-294, 294-543, ou 475-621 (FIG. 67A e FIG. 67B). Então, pelo menos parte do epítopo mAb175 deve estar contida dentro da região entre aminoácidos 274-294, concordando com os dados de imunobloting usando fragmento os EGFR. Desde que mAb175 se liga ao fragmento o desnaturado do 273-621 (FIG. 67C), o epítopo deve ser linear na natureza (FIG. 73). Está claro que mAb806 e mAb175 reconhece uma região similar e conformação do EGFR.

[0617]Usando ressonância de plasmon de superfície (BIAcore) a ligação de mAb175 do peptídeo EGFR (287CGADSYEMEEDGVRKC302; SEQ ID NO:138)) foi investigada. O EGFR287-302 foi imobilizado na superfície biosensora usando amina, troca tiol-dissulfeto ou química de acoplamento Pms-Ser. O último método imobiliza o peptídeo exclusivamente através de cisteína N-terminal (Wade et al. (2006) Anal. Biochem. 348, 315-317).

[0618]mAb175 ligou ao EGFR287-302 em todas as orientações (Tabela 6). A afinidade de mAb175 para EGFR287-302 a partir de 35 nM para acoplamento Pms- serina para 154 nM para acoplamento de amina. Em todos os casos a afinidade de ligação do mAb175 para EGFR287-302 foi inferior que aquela obtida para mAb806 (Tabela 6). Nós também determinados a afinidade do mAb175 para dois diferentes fragmento os extracelulares do EGFR. mAb175 ligou o fragmento o 1-501 com uma afinidade similar àquela obtida usando o peptídeo (16 nM versus 35 nM) (Tabela 6). Como esperado, a afinidade de mAb175 contra o domínio extracelular de comprimento inteiro 1-621, que pode formar a conformação unida, foi muito inferior (188 nM). Embora mAb806 e mAb175 tiveram afinidades similares para EGFR287-302, mAb175 parece revelar uma afinidade mais alta para o domínio extracelular do EGFR (Tabela 6). Claramente, o epítopo mAb175 está contido dentro do EGFR287-302 e, como mAb806, a afinidade de ligação ao domínio extracelular do EGFR é depe- dente da conformação. Tabela 6 Determinação BIAcore de afinidades de anticorpo para mAb806 e mAb175 ligando aos epítopos EGFR

[0619]Os painéis de mutantes do fragmento o 273-621, expressos na superfície da levedura (Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550; Johns et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384) foram usados para caracterizar a estrutura fina do epítopo mAb175. mAb175 e mAb806 revelou um padrão próximo de idêntico da rea- tividade dos mutantes (Tabela 7). Rompimento da ligação dissulfeto 287-302 somente tiveram um efeito moderado na reatividade do epítopo como o anticorpo ligado a todos os mutantes em C287 e alguns, mas não todos os mutantes em C302 (Tabela 7). Aminoácidos críticos para ligação de mAb175 incluem E293, G298, V299, R300 e C302 (Tabela 7). mAb175 apareceu moderadamente mais sensível às mutações V299 e D297, mas mAb806 também mostrou ligação reduzida de algumas mutações nesses sítios (Tabela 7). Novamente, o epítopo mAb175 parece ser essencialmente o mesmo como o epítopo reconhecido por mAb806. Tabela 7 Revelação das mutações do Epítopo 287-302 de EGFR em levedura e os índices de ligação para mAb806 e mAb175

Eficácia de mAb175 contra tumores xenotransplantes estimulados por Δ2-7 EGFR ou alça autócrina de EGFR

[0620]A atividade anti-tumor in vivo de mAb806 e mAb175 contra glioma xe- notransplantes U87MG.Δ2-7 foi examinada. Xenotransplantes foram permitidos es-tabelecer por 6 dias antes a terapia de anticorpo (3 vezes por semana por 2 semanas nos dias indicados) começar. Neste ponto, a média do volume tumoral foi 100 mm3(FIG. 68A). Tratamento com mAb175 resultou em uma redução na taxa de crescimento do tumor geral comparada ao tratamento com veículo ou mAb806 e foi altamente significante no dia 19 pós-inoculação (P<0,0001 versus controle e P<0,002 versus mAb806), quando o grupo controle foi sacrificado por razões éticas. A média do volume do tumor neste ponto foi 1530, 300 e 100 mm3para grupos de tratamento veículo, mAb806 e mAb175, respectivamente (FIG. 68A), confirmando a atividade anti-tumor da atividade mAb175 contra xenotransplantes expressando o Δ2-7 EGFR.

[0621]Mesmo através de células U87MG expressam aproximadamente 1x105EGFR por célula, mAb806 não é capaz de reconhecer qualquer do EGFR na superfície, e não surpreendentemente, não inibe o crescimento de U87MG in vivo. Além disso, essas células não co-expressam qualquer ligante EGFR. Um estudo foi conduzido como se o epítopo EGFR fosse transientemente exposto, e assim capaz de ser reconhecido por mAb806 e mAb175 nas células contendo uma alça autócrina EGFR. A linhagem celular de próstata DU145 expressa o wtEGFR em níveis similaresàqueles observados em células U87MG, entretanto, diferente das células U87MG, as células DU145 contêm uma amplificação do gene TGF-α e então exibe uma alça autócrina EGFR/TGF-α. Ambos, mAb175 e 806 se ligam às células DU145 como determinado por análise de FACS (FIG. 68B) e ambos são capazes de imuno- precipitar uma pequena proporção do EGFR extraído a partir dessas células (FIG. 68C). Ambas as técnicas mostraram melhor ligação de mAb175, entretanto, quando comparado ao mAb528, que se liga ao domínio L2, mAb175 e mAb806 somente se liga ao subgrupo de EGFR na superfície nessas células (FIG. 68B e FIG. 68C). Similaresobservações foram vistas com uma segunda linhagem celular de próstata (LnCap); (dados não mostrados) e uma linhagem de cólon (LIM1215), ambas as quais também contêm alças autócrinas EGFR (Sizeland, A. M. e Burgess, A. W. (1992) Mol Cell Biol. 3, 1235-1243; Sizeland, A. M. e Burgess, A. W. (1991) Mol Cell Biol. 11, 4005-4014). Claramente, mAb806 e mAb175 podem reconhecer somente uma pequena proporção do EGFR nas células em presença de uma alça de estimulação autócrina.

[0622]Desde que mAb175 e mAb806 ligam mais efetivamente ao EGFR expresso em células DU145 que células U87MG, um estudo foi conduzido para analisar a atividade anti-tumor desses anticorpos nos xenotransplantes DU145 em camundongos nude. Xenotransplantes foram permitidas estabelecer por 18 dias antes da terapia começada (3 vezes por semana por 3 semanas nos dias indicados). Neste tempo a média do volume de tumor foi 90 mm3(FIG. 68D). Ambos, mAb175 e mAb806 inibiram o crescimento dos xenotransplantes DU145. O grupo controle foi sacrificado no dia 67 e teve uma média de volume do tumor de 1145 mm3comparado com 605 e 815 mm3para os grupos mAb806 e mAb175, respectivamente (p<0,007 e 0,02 respectivamente) (FIG. 68D).

Estrutura 3D de EGFR287-302 em contato com os fragmento os Fab do mAb806 e mAb175

[0623]A fim de entender os detalhes moleculares de como mAb806 e mAb175 podem reconhecer EGFR em algumas, mas não todas as conformações, as estruturas cristalinas dos fragmento os Fab para ambos os anticorpos foram determinadas em complexo com o epítopo EGFR287-302 oxidado (em 2,0 e 2,59 Â de resolução, respectivamente, FIG. 69A & 69B) e sozinho (a 2,3 Â e 2,8 Â de resolução, respectivamente). Em ambos os casos, as estruturas Fab livre e complexadas foram essencialmente as mesmas e as conformações do peptídeo e alças CDR dos anticorpos foram bem definidos (FIG> 69). O epítopo adota uma estrutura de fita β, com um limite da fita apontando em direção ao Fab e V299 isolado no centro do sítio de ligação de antígeno (FIGS. 69C-E). Ambas as terminações do epítopo são expostas ao solvente, consistente com esses anticorpos ligando polipeptídeos muito mais compridos.

[0624]De 20 resíduos de anticorpos em contato com o epítopo existiram so- mente duas substituições entre mAb806 e mAb175 (FIG. 65). Resíduos contato de mAb175 são: cadeia leve S30, S31, N32, Y49, H50, Y91, F94, W96 e cadeia pesada D32, Y33, A34, Y51, S53, Y54, S55, N57, R59, A99, G100, R101; Os resíduos de contato de mAb806 são os mesmos, com diferenças de sequência para a cadeia leve, N30 e cadeia pesada, F33. EGFR287-302 se liga ao Fab através de contatos íntimos entre os resíduos peptídicos 293-302, com a maioria dos contatos estando entre resíduos 297 e 302. A única ponte de hidrogênio entre os principais átomos da cadeia de EGFR287-302 e o Fab são para resíduos 300 e 302 (FIG. 69F). Reconhecimento da sequência do epítopo ocorre através de ligações de hidrogênio da cadeia lateral para resíduos E293 (para H50 e R101 do Fab), D297 (para Y51 e N57), R300 (para D32) e K301 (através de moléculas de água para Y51 e W96). Contatos hidro- fóbicos são feitos em G298, V299 e C302.

[0625]A conformação da estrutura do epítopo entre 293 e 302 foi essencialmente idêntica nos cristais Fab806 e Fab175 (desvio rms = 0,4 Â, para Ca nesses resíduos). Embora constrito pela ligação dissulfeto, N-terminal do peptídeo (287-292) não faz contato significante em um da estrutura do anticorpo e conformações nesta região diferem. Mais interessantemente, a conformação do peptídeo EGFR287-302 em contato com os anticorpos é muito próximo relacionado a conformação EGFR287-302 observada na estrutura das estruturas EGFR unidas ou não unidas (Li et al, 2005; Garrett et al, 2002). Para EGFR287-302 a partir do complexo Fab175, os desvios rms nas posições Cα são 0,66 e 0,76 Â, respectivamente (FIG. 69).

[0626]Para ganhar percepção adicional no reconhecimento de EGFR por mAb806 e mAb175, a conformação do peptídeo EGFR287-302oxidado marcado por 15N foi estudado por espectroscopia RMN em solução, livre e em presença de Fab806 (ver Materiais e Métodos). Para três peptídeos, ressonâncias foram determinadas e comparadas àquelas para alças aleatórias. Essencialmente, o peptídeo livre adotou uma estrutura de alça aleatória, não a fita beta como visto no EGFR nativo (Garrett et al. (2002) Cell 20;110, 763-773).

[0627]Sob adição do Fab, mudanças de ressonância foram observadas. En-tretanto, devido ao fraco sinal elevando a partir da ampliação da linha significante sob adição do Fab e cristalização bem sucedida dos complexos, a estrutura de solução do complexo Fab806-epítopo não foi continuada. Claramente pensado, quando o peptídeo se liga ao fragmento o Fab do mAb806 (ou mAb175), parece que o Fab seleciona ou induz a conformação do peptídeo que combinada este peptídeo no receptor nativo.

[0628]A fim de estudar porque mAb806 e mAb175 reconhecem somente al-gumasconformações de EGFR, o fragmento o Fab do mAb175 foi colocado em um domínio extracelular de EGFR (monômeros unidos ou não) por sobreposição de EGFR287-302. Para um fragmento o Δ2-7 não existiram nenhum encontro estárico sig- nificante com o receptor. Na forma não unida houve áreas de superfície substancialmente mais acessíveis do Fab colocado (920 Â2comparado com550 Â2na forma unida). Então, este antígeno pode fazer contatos adicionais com as regiões não CDR do anticorpo, como tem sido indicado por leveduras de expressão mutantes (Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550). De modo oposto, posicionando o ec- todomínio EGFR inteiro no Fab, existe uma sobreposição espacial substancial com a parte do domínio CR1 precedendo o epítopo (resíduos 187-286) e correndo através do centro do Fab (FIG. 69D e 69E). Então, como o domínio CR1 tem essencialmente a mesma estrutura em conformações unidas e não unidas, mAb806 ou mAb175 será incapaz de ligar uma das duas formas de EGFR. Claramente, deve existir uma diferença entre a orientação do epítopo com respeito ao domínio CR1 em uma das conformações conhecidas do wtEGFR e a orientação que permite a ligação do epítopo. Inspeção do domínio CR1 indicou que a ponte dissulfeto (271-283) precedendo EGFR287-302 forçam o polipeptídeo que bloqueia o acesso ao epítopo; rompe deste dissulfeto, mesmo que não seja envolvido na ligação direta aos anticorpos, pode ser esperado permitir desdobramento parcial do domínio CR1 de forma que mAb175 ou mAb806 pode ganhar acesso ao epítopo.

Quebra da ponte dissulfeto EGFR271-283 aumenta a ligação mAb806

[0629]Ligações dissulfeto em proteínas provêem rigidez estrutural aumentada mas em alguns receptores de superfície celular, particularmente aquelas citoci- nas e fatores de crescimento, quebra transiente de pontos de dissulfeto e troca de dissulfeto pode controlar a função do receptor (Hogg, P. J. (2003) Trends in biochemical sciences 28, 210-214). Desta forma foi um mecanismo pelo qual mAb806 e mAb175 podem ganhar acesso a seu sítio de ligação, é aumentar a acessabilidade do epítopo por tentativa de mutação de cada um ou ambos os resíduos de cisteína nas posições 271 e 283 ara resíduos alanina (C271A/C283A). Os vetores capazes de expressar EGFR-C271A-, C283A- ou C271A/C283A- de comprimento inteiro foram transfectados na linhagem celular Ba/F3 dependente de IL-3. Clones Ba/F3 estáveis, que expressam o mutante EGFR-C271A- e C271A/C283A em níveis equivalentes para o wtEGFR foram selecionados (FIG. 70A. Células Ba/F3 expressando altos níveis de C283A-EGFR mutante não foram observados. Como previamente descritos, wtEGFR reagem pobremente com mAb806; entretanto, os receptores mutante reagiram igualmente fortemente com mAb528, mAb806 e o anticorpo antiFLAG, sugerindo que o receptor é expresso na superfície celular, é dobrado corre-tamente e que o epítopo para mAb806 é completamente acessível em tais casos. Para confirmar que mab806 reconhece o mutante C271A/C283A mais eficientemente que o wtEGFR, a proporção de mAb806 ligou a ligação de mAb528 foi determinada. Desde que ambos, EGFR selvagem e C271A/C283A foram FLAG-marcado no N terminal, a proporção de ligação de mAb806 e mAb528 do anticorpo M2 foi também determinado. Como relatado previamente, mAb806 somente reconheceu uma pequena proporção do wtEGFR total expresso na superfície das células Ba/F3 (a proporção de ligação mAb806/528 é 0,08) (Tabela 8). Em contraste, mAb806 reconhe- ceu virtualmente todos os EGFR mutantes C271A/C283A expressos na superfície celular (uma proporção de ligação mAb806/528 de 1,01) FIG. 70A e Tabela 8). Tabela 8 Reatividade mAb806 com células expressando o EGFR selvagem ou C271A/C283A

* Média para quatro clones independentes

[0630]Mutação de duas cisteínas não compromete ligação EGF ou função do receptor. Células BaF3 expressando o mutante EGFR C271A/C283A prolifera na presença de EGF (FIG. 70B). Um desvio a esquerda na curva dose resposta para EGF em células expressando mutações C271A/C283A foi reprodutivelmente observados, sugerindo ou afinidade mais alta para o ligante, ou potencial de sinalização aumentado para o receptor mutante. Análise de western blotting confirmou que o mutante C271A/C283A é expresso nos níveis similares ao wtEGFR e é tirosina fos- forilado em resposta ao estímulo EGF (FIG. 70C). Consistente com prévios estudos em outras linhagens celulares, mAb806 não teve efeito na proliferação induzida EGF in vitro das células Ba/F3 expressando o wtEGFR, enquanto o ligante bloqueando mAb528 completamente inibe a proliferação induzida por EGF dessas células (FIG. 70D, painel esquerdo). Em contraste, mAb806 totalmente removeu a proliferação induzida por EGF em células BaF3 expressando o mutante C271A/C283A (FIG. 70D, painel direito). Quando a alça de cisteína 271-283 é rompida, não somente faz mAb806 se ligar mais efetivamente, mas uma vez ligado, mAb806 previne proliferação induzida por ligante. Tabela 9 Coleção de dados e Estatístivas de Refinamento Coleção de Dados

Refinamento

Discussão

[0631]Estudos estruturais com o epítopo EGFR287-302 mostram que ambos, mAb806 e mAb175 reconhecem o mesmo motivo estrutural 3D das estruturas wtEGFR, indicando que esta conformação estrutura também ocorre em e é exposta em Δ2-7EGFR. Criticamente, entretanto, a orientação do epítopo nessas estruturas pode prevenir o acesso do anticorpo aos aminoácidos relevantes. Isto é consistente com a observação experimental que mAb806 não se liga ao wtEGFR expresso na superfície celular nos níveis fisiológicos.

[0632]Os resultados com o mutante EGFRC271A/C283A indicam que o domínio CR1 pode se abrir para permitir mAb806 e mAb175 de se ligar estequiometricamen- te a este receptor mutante. Este receptor mutante pode ainda adotar uma conformação nativa como é ele é completamente responssivo ao estímulo de EGF mas, diferente do wtEGFR, é completamente inibido por mAb806. Se uma forma dobrada erroneamente do EGFR com esta ponte dissulfeto quebrada foi para a superfície de células cancerosas, os dados claramente mostram que ele pode ser capaz de iniciar a sinalização celular e pode ser inibido por mAb806 ou mAb175.

[0633]Outra explicação dos dados é que durante a ativação do ligante o re- arranjo estrutural do receptor pode induzir desdobramento local na vizinhança do epítopo, permitindo o receptor adotar uma conformação que permita a ligação. Em estruturas cristalinas, os epítopos ficam perdo do centro físico do ectodomínio EGFR e acesso ao epítopo é bloqueado por ambos, o domínio CR1 dobrado e a estrutura quaternária do ectodomínio EGFR. Nas conformações unidas e não unidas, a integridade do domínio CR1 é estabilizado por interações adicionais com ou os domínios L1:ligante:L2 (não unidos) ou os domínios L2:CR2 (unidos). Entretanto, a região do epítopo tem alguns parâmetros termais mais altos encontrados no ectodomínio: o epítopo mAb806/175 é estruturalmente lábil. Durante a ativação do receptor, quando o receptor passa por uma transição entre as conformações unida e não unida. mAb806 e mab175 pode acessar o epítopo. Então, ao nível molecularm esses mecanismos podem contribuir para a ligação negligível de mAb806 e mAb175 às células normais e níveis substancialmente maiores de ligação às células tumorais que têm o EGFR superexpresso e/ou ativado.

Exemplo 24 Anticorpos Monoclonais 124 e 1133

[0634]Como discutido no Exemplo 1 acima, mAb124 e mAb1133 foram gerados ao mesmo tempo como mAb806 e encontrados revelar propriedades similares, em particular especificidade para o EGFR selvagem super expresso, para as propriedades únicas de mAb806 aqui discutidos.

[0635]Seleções iniciais foram conduzidas em Nova Iorque (Jungbluth et al. (2003) A Monoclonal Antibody Recognizing Human Cancers with Amplification/Over- Expression of the Human Epidermal Growth Factor Receptor PNAS. 100, 639-644). Avaliação do ELISA de competição e analyses Biacore foram conduzidas para determiner se mAb124 e/ou mAb1133 reconhecem um epítopo idêntico ao mAb806 ou um determinante EGFR alternativo.

Análise de FACS

[0636]Ligação de anticorpo às células U87MG.Δ2-7, A431 e HN5 foi avaliada por FACS. Todos os anticorpos revelaram uma especificidade similar tal como do mAb806 com forte ligação ao de2-7 EGFR e baixa ligação ao EGFR selvagem super expresso.

ELISA de competição

[0637]Uma série de ELISAs de competição foi conduzida para determinar se os anticorpos 124 e 1133 competiram com o epítopo mAb806. Brevemente, o domínio solúvel desnaturado de EGFR (sEGFR) foi revestido em plascas de ELISA. Os anticorpos 124 ou 1133 não marcados foram então adicionados através da placa em concentrações crescentes. Seguindo lavegem, mAb806 biotinilado foi adicionado a cada poço para determinar se ele pode ainda se ligar ao sEGFR. Detecção do mAb806 ligado foi alcaçada usando HRP conjugada a estreptavidina. Se um anticorpo se liga ao mesmo (ou sobreposto) epítopo como mAb806, então ligação mAb806 não é esperada.

[0638]Resultados são resumidos na Tabela 10. Um efeito de ligação inibitória dependente de concentração foi observado para mAb124 e mAb1133: ligação de mAb806 aumentou como concentração de anticorpo não marcado foi diminuída, sugerindo que os anticorpos 124 e 1133 reconhecem um epítopo idêntico ao mAb806 ou um em proximidade. Tabela 10 Resumo do ELISA de Competição mAb124 e mAb1133 ligando ao sEGFR

Análise de FACS: Competição de Ligação Celular

[0639]Células U87MG.Δ2-7 foram pré-incubadas com anticorpo não marcado 124, 1133. Controle 806 positivo e controle isotipo foram incluídos no ensaio. Células foram lavadas, então coradas com mAb806 conjugado ao Alexa488 e o nível de ligação 806 foi determinado por FACS.

[0640]Resultados são resumidos na Tabela 11. Os anticorpos 124 e 1133 bloquearam a ligação mAb806 à superfície celular indicando reconhecimento de um epítopo idêntico ao mAb806 ou um na proximidade. Tabela 11 Análise de FACS: Competição de Ligação à Célula U87MG.Δ2-7

Análise BIAcore: Ligação ao epítopo do peptídeo mAb806

[0641]A sequência de aminoácidos EGFR 287CGADSYEMEEDGVRKC302 (SEQ ID NO:14) contendo o epítopo mAb806 foi sintetizado como um peptídeo e imobilizado no chip biosensor. Ligação de anticorpos 124, 1133 e 806 (200 nM) deste peptídeo foi medida. Unidades de ressonância de ligação máxima (UR) obtidas são resumidas na Tabela 12. O 124, 1133 mostrou clara ligação ao peptídeo confirmando reconhecendo o epítopo do peptídeo 806. Tabela 12 Análise BIAcore: Ligação máxima ao epítopo do peptídeo mAb806

Discussão

[0642]Como mostrado neste Exemplo, mAb124 e mAb1133 se ligam ao pep- tídeo EGFR reconhecidos por mAb806 e bloqueiam a ligação de mAb806 ao domínio extracelular de EGFR e células expressando o de2-7 EGFR. Então, esses três anticorpos reconhecem o mesmo determinante em EGFR.

Exemplo 25 Teste Clínico de ch806

[0643]Um estudo clínico foi designado para examinar a especificidade in vivo de ch806 em uma análise de direcionamento/biodistribuição/farmacocinética do tumor em pacientes com diversos tipos de tumor.

1. Materiais e Métodos Desenho da Triagem

[0644]Esta triagem “primeira administração em humano” foi um estudo de Fase I, com escalação de dose, marcação aberta. O objetivo primário foi avaliar a segurança de uma infusão única de ch806 em pacientes com tumores avançados expressando o antígeno 806. Os objetivos do estudo secundário foram determinar a biodistribuição, farmacocinética e captação do tumor de 111In-ch806; determinar a resposta imune do paciente a ch806; e avaliar evidências precoces da atividade clínica de ch806. Uma dose única foi escolhida para este estudo a fim de otimizar a avaliação da especificidade in vivo de ch806 para EGFR expresso no tumor. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Ético e Pesquisa Humana do Hospital de Austin anterior ao início do estudo. A triagem foi feita sob o esquema Australian Therapeutic Goods Administration Clinical Trials Exemption (CTX). Todos os pacientes deram consentimento informado escrito.

[0645]Critérios de eligibilidade incluiam: tumores avançados ou metastáticos positivos para expressão de antígeno 806 baseado em hibridização in-situ cromogê- nica ou imunohisto 24 tem química de amostras de tumor arquivadas (tumores foram definidos como 806 positivo se avaliação imunohistoquímica das amostras de tumores arquivados mostraram quaisquer células positivas para expressão 806, ver abaixo);malignância comprovada por histologia ou citologia; doença mensurável em CT scan com pelo menos uma lesão >2 cm; sobrevivência esperada de pelo menos 3 meses; escala de desenvolvimento Karnofsky (KPS) >70; função hematológica, hepática e renal adequadas; idade 18 anos; e capazes de dar consentimento informado. Critérios de exclusão incluíram: metástases so sistema nervoso central ativo (a menos que adequadamente tratado e estável); quimioterapia, imunoterapia, terapia biológica, ou terapia de radiação dentro de quatro semanas antes do início do estudo; antes da exposição ao anticorpo [a menos que nenhuma evidência de anticorpos anti-quiméricos (HACA)]; falência da completa recuperação a partir dos efeitos da terapia de câncer; uso concorrente dos corticosteróides sistêmicos ou agentes imu- nossupressores; infecção não controlada ou outras doenças sérias; gravidez ou lactação; mulheres com potencial de gravidez não usando meios medicamente aceitáveis de contracepção.

[0646]Pacientes receberam uma infusão única de ch806 traçado marcado com Índio-111 (111In, 200-280 MBq; 5-7 mCi) por infusão intravenosa em salina normal/5% de albumina sérica humana por 60 minutos. O escalonamento da doses planejadas tencionadas aos pacientes foi alistado em um de quatro níveis de dose: 5, 10, 20 e 40 mg/m2. Essas doses foram escolhidas para permitir a avaliação da especificidade do ch806 ao EGFR expresso em tumor, e para determinar se qualquer compartimento de tecido normal se liga do ch806 (e afeta a farmacocinética ou biodistribuição) in vivo. Biodistribuição, farmacocinética, e resposta imune foram avaliados em todos os pacientes.

[0647]Imagem de câmera gama de corpo inteiro para avaliação da biodistri- buição e captação de tumor foi feita no Dia 0, Dia 1, Dia 2 ou 3, Dia 4 ou 5, e Dia 6 ou 7 seguindo infusão 111In-ch806. Amostras de sangue para farmacocinética foram obtidas nesses pontos de tempo, e adicionalmente no Dia 14 (±2 dias) e Dia 21 (±2 dias). Amostras de sangue para avaliação dos níveis HACA foram obtidos no ponto de partida, e semanalmente até o Dia 30. Avaliação de toxidade foi feita em cada visita do estudo. Exame físico e rotina hematológica e bioquímica foram feitos semanalmenteaté o final do estudo (Dia 30). Remontagem foi feita no Dia 30.

Critérios para Escalonamento de Dose

[0648]O primeiro paciente em cada nível de dose foi observado por quatro semanas antes do registro de qualquer paciente adicional. Se nenhuma toxidez limi- tante de dose (DLT) foi observada em qualquer dos 2 primeiros pacientes dentro de 4 semanas de infusão de ch8063, 4 pacientes foram então inseridos na próxima ordem de dosagem mais alta. Se um paciente em qualquer grupo de 2 pacientes expe- rienciaram um DLT dentro de 4 semanas a partir da primeira dose, um adicional de 4 pacientes (máximo de 6) foram colocados neste nível de dosagem. Se não mais que um paciente de 6 em qualquer nível de dose experimentou >Grau 2 de toxidez, pacientes subsequentes foram colocados no próximo nível de dosagem.

[0649]DLT foi definido como toxidez não hematológica de Grau 3, ou toxidez hematológica de Grau 4 como definido pelos Critérios de Terminologia Comum NCI para Eventos Adversos (CTCAE v3.0). Dose tolerada máxima (MTD) foi definida como a dose de ch806 abaixo daquelas onde 2 ou mais pacientes de 6 experimentaram DLT.

Radiomarcação de ch806

[0650]Grau clínico de ch806 foi produzido na Biological Production Facility of the Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Austrália. O anticorpo ch806 foi marcado com 111In (MDS Nordion, Kanata, Canadá) através de íon metálico que- lante bi-funcional CHX-A”-DTPA de acordo com os métodos descritos previamente (Scott et al. (2000) Cancer Res 60, 3254-3261; Scott et al. (2001) J. Clin. Oncol. 19(19), 3976-3987).

Imagem de Câmera Gama

[0651]Imagens do corpo inteiro da biodistribuição de 111In-ch806 foram obtidas em todos os pacientes no Dia 0 após a infusão de 111In-ch806, e em pelo menos 3 ocasiões adicionais até o Dia 7 seguindo infusão. Imagens de tomografia computadorizada de emissão de fóton única (SPECT) de uma região do corpo com tumor conhecido foram também obtidas em pelo menos uma ocasião durante este período. Todas as imagens de câmera gama foram adquiridas em uma câmara gama de dual-headed(Picker International, Cleveland, OH).

Farmacocinética

[0652]Sangue para análise farmacocinética foi coletado no Dia 0 - pré- infusão de 111In-ch806; então aos 5 minutos, 60 minutos, 2 h e 4 h pós-infusão 111In- ch806, Dia 1, Dia 2 ou 3, Dia 4 ou 5, e Dia 6 ou 7. Sangue adicional para farmacoci- nética da proteína ch806 foi também obtida no Dia 14 (± 2 dias) e Dia 21 (± 2 dias) e Dia 30 (± 2 dias).

[0653]Amostras séricas foram aliquotadas em duplicata e contadas em um contador de cintilação gama (Packard Instruments, Melbourne, Austrália), junto com padrões 111In apropriados. Os resultados do soro foram expressos como % de dose injetada por litro (% ID/L). Medida dos níveis de proteína ch806 sérica do paciente seguindo cada infusão foi feita usando um protocolo validado para a medida imuno- química da proteína ch806 no soro humano40. O limite da quantificação para ch806 nas amostras de soro foi 70 ng/mL. Todas as amostras foram avaliadas em triplicata e foram diluídas por um fator de pelo menos 1:2. Níveis séricos medidos de ch806 foram expressos como μg/mL.

[0654]Cálculos farmacocinéticos foram feitos em medidas séricas de 111In- ch806 seguindo a infusão, e ELISA determinou os níveis de protéina ch806 sérica no paciente, usando um programa de curva padrão (WinNonlin Pro Node 5.0.1, Phar- sight Co., Mountain View, CA). Estimativas foram determinadas para os seguintes parâmetros: T/α e T/β (meias-vidas das fases iniciais e terminais da disposição); V1, volume do compartimento central; Cmax (concentração máxima sérica); AUC (área sob a curca de concentração sérica extrapolada para tempo infinito); e CL (depuração sérica total).

Depuração Total do Corpo e Dosimetria Tumoral e de Órgão de 111In-ch806

[0655] Cálculos de dosimetria de órgãos normais (fígado, pulmões, rim e baço) e corpo inteiro foram feitos baseados nas regiões de interesse e dados dos grupos de imagem da infusão 111In-ch806 de cada paciente individual, permitindo cálculo de atividade acumulada e análise usando OLINDA para resultados de dosimetria final (Stabin et al. (2005) J. Nucl. Med. 46(6), 1023-1027). Regiões de interesse foram também definidos para tumours adequados em cada ponto de tempo em grupos de dados de imagem 111In-ch806, corrigidos para o background e atenuação, e cálculo de dosimetria foi feito para derivar a concentração de 111In-ch806 em tu- mor/gm (Scott et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11(13), 4810-4817). Isto foi convertido a μg de ch806/gm de tecido de tumor baseado na dose em mg de proteína ch806 injetada.

Análise HACA

[0656]Amostras de sangue para avaliação HACA foram tomadas antes da infusão ch806, então semanalmente até 30 dias após a infusão ch806. Amostras foram analisadas pro ELISA, e por tecnologia de ressonância de plasmon de superfície usando um instrumento BIAcore 2000, como previamente descrito (Scott et al., 2005; Liu et al. (2003) Hybrid Hybridomics 22(4), 219-28; Ritter et al. (2001) Cancer Res. 61(18), 685-6859).

Método Imunohistoquímico

[0657]Tecido tumoral embebido em parafina fixado em formalina a partir de cada paciente na triagem foi imunocorado como segue: Brevemente, cortes de 4 μm de tecido embebido em parafina foram montados em lâminas SuperFrost® Plus (Menzel-Glaser, Alemanha), desparafinizadas e reidratadas antes do recuperação do antígeno ao microondas em Solução de Recuperação do Alvo pH 6.0 (10 min; Dako, Glostrup, Dinamarca). Cortes foram então tratados com 3% de H2O2 por 10 min, para eliminar peroxidase endógena e incubadas em temperatura ambiente por 60 min com anticorpo m806 (4 μg/mL) ou com concentração apropriada de anticorpo de controle negativo combinado com isotipo (IgG2b; Chemicon, Temecula, CA). Ligaçãode anticorpo foi detectado usando o Kit PowerVision (ImmunoVision Technologies, Brisbane, CA). Para permitir a visualização da imunocoloração, cortes foram incubados com o cromógeno 3-amino-9-etilcarbazol (0,4%, Sigma Chemical Co. MO, EUA) por 10 min e contra-corado com hexatoxilina de Mayer. Controles negativos para o procedimento de imunocoloração foram preparados por omissão do anticorpo primário. Resultados foram expressos como uma porcentagem de células tumorais com coloração positiva.

Método de Hibridização Cromogênica In situ

[0658]Tecido tumoral embebido em parafina fixada em formalina a partir de cada paciente na triagem foi cortado e montado em lâminas SuperFrost® Plus, des- parafinizadas e reidratadas antes do pré-tratamento com o kit de Pré-tratamento de Tecido SpotLight® (Zymed Laboratories Inc. South San Francisco, CA). Cortes foramentão cobertos com o padrão de DNA de EGFR SpotLight®, desnaturado a 95oC por 10 min e incubado por uma noite a 37oC. Seguindo hibridização, lâminas foram lavadas em 0,5 X SSC. Detecção do padrão foi realizada usando Kit de Detecção de Polímero SpotLight® CISH®. Cortes que mostraram grupos de sinais ou >5 sinais individuais em > 25% de células cancerosas foram consideradas ter uma amplificação do gene EGFR que correlacionaram com reatividade m806.

2. Resultados Pacientes

[0659]Oito pacientes (1 fêmea e 7 machos; idade média de 61 anos (variação de 44-75)) completaram a triagem (Tabela 13). Sítios de tumores primários, história terapêutica anterior, e sítios de doença no estudo de entrada são também mostrados na Tabela 13. Todos os 8 pacientes tiveram positividade para o antígeno 806 em tumores arquivados (Tabela 13).

[0660]Todos os pacientes preencheram critérios de inclusão e, exceto para o Paciente o (que teve um tumor cerebral primário), todos tiveram doença metastática no estudo de entrada. Locais de doença classificados como lesões alvos incluíram: pulmão (5 pacientes), cérebro (1 paciente), linfonodos (1 paciente), supraglotis (1 paciente). Outros locais de doença metastática (lesões não alvo) incluíram uma massa supra-renal, osso e linfonodos (Tabela 13). O estado de desempenho mediano Karnofsky foi 90 (variando 80-100). Tabela 16 Características do Paciente

Abreviações: F = fêmea; M = macho; NSCLC = carcinoma de pulmão de cé-lulanão pequena; SCC = carcinoma celular escamoso; RT= radioterapia; CT = qui-mioterapia; LN = linfonodos; PD = doença progressiva; SD = doença estável * positivo para expressão de de2-7 EGFR f positivo para amplificação do gene EGFR

Eventos Adversos e HACA

[0661]Eventos adversos relacionados a ch806 são listados nas Tabelas 17 e 18. Nenhuma infusão relacionada a eventos adversos foi observada. Não houve DLT, e então MTD não foi alcançada. As toxicidades principais que na opinião dos investigadores foram possivelmente atribuíveis ao ch806 foram: prurido transiente, náusea leve, fadiga/letargia, e efeitos possíveis nos níveis de ALP e GGT séricos. Uma elevação CTC grau 2 no nível GGT no Paciente 5 foi observada, entretanto isto foi um background de uma elevação da linha de partida grau 1, e foi transiente na natureza. Três sérios eventos adversos (SAEs) foram relatados, mas nenhum foi atribuído ao ch806. De modo geral, ch806 foi seguro e bem tolerado em todos os níveis de dose com geralmente toxidades menores pretitíveis e controláveis sendo observadas. Escalonamento de dose adicional não foi feito devido a quantidade limitada de cGMP ch806 disponível para triagem.

[0662]Uma resposta imune positiva para ch806 (com concordância de ambas as metodologias, ELISA e BIAcore) foi observada em somente um dos oito pacientes (Paciente 1). Tabela 17 Ocorrência de Eventos Adversos Relacionados ao ch806

* Números representam número de episódeos de qualquer evento em cada nível de dose Tabela 18 Distribuição dos Eventos Adversos Relacionados ao Agente de Estudo

* Número de pacientes

Radiomarcação de ch806

[0663]Existiram um total de 8 infusões de 111In-ch806 administradas durante a triagem. A média (± DP) da pureza radioquímica e imunoreatividade de 111In-ch806 foi medida para ser 99,3 ± 0,1 % e 77,4 ± 7,0%, respectivamente.

Biodistribuição de ch806

[0664]O padrão inicial da biodistribuição de 111In-ch806 em pacientes em todos os níveis de dose foi consistente com atividade de grupo de sangue, que foi gradualmente limpo com o tempo. Ao longo de um período de uma semana pós- injeção, a captação de 111In-ch806 no fígado e baço foi consistente com a depuração normal de metabólitos 111In-quelados através do sistema reticuendotelial. Localização específica de 111In-ch806 foi observada em lesões alvo (>2 cm) de todos os pacientes em todos os níveis de dose (FIG. 94), incluindo lesões alvos localizadas nos pulmões (Pacientes 1, 3, 4, 5 e 7), o abdômen (Pacientes 1 e 2), e a região su- praglótica no lado direito do pescoço (Paciente 6). Alta captação de 111In-ch806 em um tumor cerebral (Paciente 8) foi também demonstrada (FIG. 95). Importantemente, captação de 111In-ch806 em tumor não foi dependente do nível de expressão do an- tígeno 806. Por exemplo, Paciente 4 demonstrou alta captação por ambas as lesões alvo de pulmão, a despeito de <10% de positividade por IHC para a reatividade 806 no tumor arquivado (FIG. 96). Este grau de captação de 111In-ch806 em lesões alvo no Paciente 4 foi comparável ao visto no Paciente 3, onde 50-75% das células tumores foram positivas para coloração com antígeno 806 ou imunohistoquímica de amostra arquivada (FIG. 96).

Farmacocinéticas

[0665]Parâmetros farmacocinéticos T7a e T7β, V1, Cmax, AUC e CL para infusão única de 111In-ch806 de paciente individual são mostrados na Tabela 16. O teste da soma do rank Kruskal-Wallis foi aplicado ao alfa e beta meio vivos, V1 e depuração. Nenhuma diferença significante entre níveis de dose foi observada (P>0,05).

[0666]A curva farmacocinética se adequa a população agrupada. Dados de ELISA são mostrados na FIG. 97. A média ± DP dos parâmetros farmacocinéticos foram T7a 29,16 ± 21,12 h, T7β 172,40 ± 90,85 h, V1 2984,59 ± 91,91 mL, e CL 19,44 ± 4,05 mL/h. Pico medido e através de concentrações séricas de ch806 (Cmax e Cmin) dados são apresentados na Tabela 17 para cada paciente. Como esperado, relações lineares foram observadas para Cmax e Cmin com cada nível de dose. Os valores médios ± DP determinados para os dados farmacocinéticos de ELISa ch806 foram em bom acordo com os valores obtidos para os dados 111In-ch806 farmacoci- néticos (Tabela 16). Tabela 16 Média ± DP de Parâmetros Farmacocinéticos Estimados para 111In-CHX-A”- DTPA-ch806 em cada Nível de Dose e através de todos os Níveis de Dose

Tabela 17 Níveis de Cmax e Cmin Séricos de ch806 Determinados por Análise de ELISA

* Cmax = 60 min pós-injeção.; Cmin = Dia 7 f Dia 8 nível sérico

Dosimetria de 111In-ch806

[0667]Depuração de corpo inteiro foi similar em todos os pacientes através de todos os níveis de dosagem, com um T1/2 biológico (média ± DP) de 948,6 ± 378,6 h. Devido a meia vida física relativamente curta, cálculo de meia-vida biológica foi extremamente sensível a pequenas mudanças na meia-vida efetiva. Não houve diferença estatística significante na depuração de corpo inteiro entre os níveis de dose [teste de soma do rank Kruskal-Wallis: valor de P = 0,54] (FIG.98).

[0668]A depuração de 111In-ch806 a partir de órgãos normais (fígado, pulmões,rim e baço) não mostrou nenhuma diferença entre níveis de dose, e a média efetiva T1/2 foi calculada ser 78,3; 48,6; 69,7 e 66,2 h, respectivamente. Não existiu diferença estatisticamente significante na depuração entre esses órgãos normais. Em particular, depuração hepática não mostrou diferença entre níveis de doses (FIG. 98), indicando nenhum compartimento de antígeno saturado no fígado para ch806.

[0669]Análise de dosimetria tumoral foi completa para 6 pacientes. Pacientes 1 e 2 tiveram lesões alvo perto do reservatório de sangue cardíaco, ou movimento durante as aquisições de imagem, que preveniram análise precisa. A captação do pico medido de 111In-ch806 ocorreu 5-7 dias pós-infusão, e variou de 5,2-13,7x10-3 % de dose injetada/g de tecido tumoral.

Avaliação da Atividade Clínica

[0670]No término deste período de um mês de estudo, 5 pacientes foram encontrados ter doença estável, e 3 pacientes doença progressiva (Tabela 13). Inte-ressantemente, um paciente (Paciente 7, 40 mg/m2de nível de dose) teve evidência clínica de redução transiente de um linfonodo auricular palpável (comprovado ser SCC metastático em aspiração de agulha fina) durante o período de estudo, o que sugere possível atividade biológica do ch806. Entretanto, este paciente teve doença progressiva confirmada por RECIST no término do estudo.

Dados Adicionais

[0671]Oito pacientes (1 fêmea e 7 machos; média de idade de 61 anos (variação de 44-75)) completaram esta fase 1 da triagem como relatado (Scott et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4071-4076). Todos os pacientes preencheram os critérios de inclusão e, excepto para o Paciente 8 (que teve um tumor cerebral primário), todos tiveram doença metastática no estudo de entrada. Captação do Ab pelo tumor foi vista em todos os pacientes, e 111In-ch806, a versão quimerizada de mAb806, demonstrou imediato e alto nível de captação no tumor (FIG. 71). A depuração do 111In-ch806 a partir de órgãos normais (fígadom pulmões, rim e baço) não mostrou nenhuma diferença entre níveis de dosagem (Scott et al, 2007). Em particular, depuração hepática não mostrou diferença entre níveis de dosagem, indicando nenhum compartimento de antígeno saturável no fígado para ch806. Captação hepática total foi um máximo de 14,45 ± 2,43 %ID imediatamente pós-infusão, e declinou para 8,45 ± 1,63 % ID por 72 horas, e 3,18 ± 0,87 % ID por uma semana pós-infusão. Isto foi um contraste marcante para a captação de anticorpos para wtEGFR (por exemplo, 225), que tem sido mostrado alcançar mais de 30% ID no fígado (para uma dose de 40 mg) por mais de 3 dias pós-infusão (Divgi et al. (1991) J. Natl. Cancer Inst. 83, 97-104). A medida do pico de captação de tumor de 111In- ch806 ocorreu 5-7 dias pós-infusão. Cálculo da captação de tumor quantitativo em Pacientes 1 e 3 não podem ser exatamente feitos devido a proximidade da lesão alvo ao reservatório cardíaco de sangue e movimento do paciente. Pico de captação de ch806 no tumor variou de 5,21 a 13,73 x 10-3% ID/g de tecido tumoral. Cálculo da concentração atual de ch806 no tumor mostrou valores de pico de (média ± DP) de 0,85 ± 0 μg/gm (5mg/m2), 0,92 ± 0 μg/gm (10mg/m2), 3,80 ± 1,10 μg/gm (20mg/m2), e 7,05 ± 1,40 μg/gm (40mg/m2).

Discussão

[0672]Como revelado neste Exemplo, este estudo represente a primeira de-monstração relatada de biodistribuição e direcionamento de tumor de um anticorpo quimérico contra um epítopo somente exposto em formas super expressas, mutan- tes ou ativadas por ligante do EGFR. Ch806 mostrou excelente direcionamento aos locais de tumor em todos os pacientes, nenhuma evidência da captação de tecido normal, e nenhuma toxicidade significante. Essas características in vitro e in vivo de ch806 distinguem o mesmo de todos os outros anticorpos direcionados para EGFR.

[0673]Em doses até 40 mg/m2, ch806 foi vem tolerado, nenhum DLT foi ob-servado e MTD não foi alcançado. As toxicidades principais que foram atribuíveis ao ch806 foram prurido transiente, náusea leve, fadiga/letargia, e possíveis efeitos nos níveis de ALP e GGT séricos. A natureza avançada das malignidades do paciente que significava sua doença pode também ter sido fatores contribuintes para esses eventos adversos. Dos eventos adversos que foram possivelmente relatados no estudo da droga, todos foram leves, muitos foram auto-limitantes, e nenhum requereu qualquer tratamento ativo. Importantemente, nenhuma erupção de pele ou distúrbios do trato gastrointestinal foram observados em qualquer paciente, mesmo no nível de dose mais alto. A excelente tolerabilidade de ch806 neste estudo de dose única justifica o próximo passo de teste em triagens de dose repetida.

[0674]A biodistribuição de ch806 em todos os pacientes mostrou depuração gradual da atividade no reservatório de sangue, e nenhum tecido normal teve captação de 111In-ch806. Excelente captação de ch806 pelo tumor foi também evidente em todos os pacientes, incluindo pulmão, linfonodo, e metástases adrenais, e em mesotelioma e glioma. Isto foi observado em todos os níveis de dose incluindo 5 mg/m2(a dose mais baixa estudada), que é um décimo para um vigésimo da dose requerida para visualizar captação em tumor por outros anticorpos para wtREGFR33. Esta diferença na captação de ch806 comparada aos anticorpos para wtEGFR pode ser atribuída a sua captação em tecido substancialmente normal (fígado e pele) ao wtEGFR atuando como um reservatório de antígeno33. Em adição, a localização de 111In-ch806 foi alta mesmo em pacientes com baixa expressão de 806 verificada por imunohistoquímica de amostras tumorais (FIG. 96). A captação de 111In-ch806 em glioma foi particularmente impressiva (FIG. 97), e comparável a qualquer dado publicado em anticorpo direcionado ao tumor cerebral seguindo infusão sistêmica ou mesmo locoregional. Estes dados sustentam a única seletividade de ch806 ao EGFR expresso por uma variação ampla de tumores, e confirma a ausência da captação de tecido normal deste anticorpo em humano.

[0675]Análises farmacocinéticas mostraram que ch806 tem uma meia-vida terminal de mais que uma semana, e nenhuma dependência de dose de depuração sérica de 111In-ch806. Relações lineares também foram observadas para AUC, Cmax e Cmin, com níveis de dose acima de 10 mg/m2alcançaram através de concentrações séricas acim ade 1 μg/mL. Os valores de V1, Cl, T% α e T % β foram consistentes entre os níveis de dose, e em mantendo com anticorpos humanos IgG1 típicos (Scott et al., 2005; Steffens et al. (1997) J. Clin. Oncol 15, 1529-1537; Scott et al. (2001) J. Clin. Oncol. 19(19), 3976-3987). A depuração de ch806 foi também determinado ser mais lenta quando cálculos de ELISA de ch806 foram comparados às medidas de 111In-ch806. Enquanto esta diferença pode ser explicada por pequenos números dos pacientes estudados, os pontos de tempo de amostragem mais longa para o ELISA de ch806 podem sustentar este valor como sendo mais representativo de verdadeira depuração de ch806. Os valores farmacocinéticos para ch806 são comparáveis para outros anticorpos quiméricos relatados para dados (Steffens et al., 1997; Scott et al., 2001), e sustentam um esquema de dose semanalmente de ch806.

[0676]A dosimetria quantitativa e resultados farmacocinéticos indicam que não há compartimento de tecido normal saturável para ch806 para os níveis de dose nesta triagem. Importantamente, a ausência de dependência de dose na farmacoci- nética e depuração do corpo inteiro e órgão hepático está em contraste marcado para todos os estudos relatados de anticorpos para wtEGFR (Baselga J. e Artega C.L. (2005) J. Clin. Oncol. 23, 2445-2449; Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83(2), 97104; Baselga J (2001) Eur. J. Cancer 37 Suppl. 4, S16-22; Gibson et al. (2006) Clin. Colorectal Cancer 6(1), 29-31; Rowinsky et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22, 3003-3015; Tan et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(21), 6517-6522) sustentando a especificidade tumoral e ausência de ligação de tecido normal de ch806 em humanos. Essas observações providas compeliram a evidência do potencial para ch806 (ou formas humanizadas) para seletivamente direcionar EGFR em tumor, evitar a toxidade normal de outros anticorpos EGFR e inibidores de quinase (particularmente pele) (Lacouture AE (2006) Nature Rev. Cancer 6, 803-812; Adams G.P. e Weiner L.M. (2005) Nat. Biotechnol. 23(9), 1147-1157) e alcançar potencialmente melhor efeito terapêutico. Além disso, a possibilidade de distribuição de carga útil (devido a rápida internaliza- ção de mAb806 em células tumorais), e combinação de tratamento com outros biológicos tais como anticorpos EGFR e inibidores de tirosina quinase onde toxicidade combinada é provavelmente minimizada, é fortemente sustentada pelos dados a partir desta triagem. Este estudo provê clara evidência da habilidade de direcionar um epítopo em EGFR que é específica para tumor, e desenvolvimento clínico adicional desta abordagem única para terapia de câncer está em progresso.

Exemplo 26 Comparações de Sequência

[0677] As cadeias VP e cadeia VL de CDRs para cada um de mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, e hu806 são reveladas e aqui comparadas. Tabela 13 Isotipo de Anticorpo Murino e Comparações de Sequência CDR (Kabat)1 A. Cadeia Leve Variável

B. Cadeia Pesada Variável

1diferenças oara as sequências CDR mAb806 são sublinhadas

[0678]Os dados CDRs acima para os respectivos isotipos de anticorpo são baseados em uma análise de Kabat. Como será aparente àqueles versados na técnica, os CDRs podem também ser definidos baseados em outras análises, por exemplo, um composto de definições Kabat e Chothia. Por exemplo, aplicando uma análise de composto Kabat e Chothia para os isotipos acima, as sequências dos CDRs de cadeia VL e cadeias VP CDRs para os respectivos isotipos são como revelados na Tabela 14. Tabela 14 Isotipo de Anticorpo Murino e Comparações de Sequência CDR (Composto Kabat e Chothia)1 A. Cadeia Leve Variável

B. Cadeia Pesada Variável

1diferenças para sequências CDR mAb806 são sublinhadas 2Ver FIG.17 do Pedido de Patente co-pendente dos EUA no. 10/145.598 (Patente dos EUA No. 7.589.180) 3Ver FIG.16 do Pedido de Patente co-pendente dos EUA no. 10/145.598 (Patente dos EUA No. 7.589.180) Tabela 15 Comparações da Sequência CDR mAb806 e hu806 (Kabat)1 A. Cadeia Leve Variável

B. Cadeia Pesada Variável

1diferenças para as sequências mab806 CDR são sublinhadas

[0679]Como mostrado acima, as sequências CDR de isotipos mAb806, mAb175, mAb124 e mAb1133 são idênticas exceto para mudanças de aminoácidos altamente conservadas que podem ser esperadas dar aumento para dobramento da proteína homóloga para reconhecimento de epítopo. Estes dados, cumulativamente com a ligação e outros dados providos nos Exemplos acima, mostram que esses isotipos e o hu806 são variantes de membros da família proximamente relacionadas exibindo as mesmas propriedades únicas discutidas acima para mAb806 (por exemplo,ligação a um epítopo do EGFR que acessível para ligação somente em formas super-expressas, mutadas ou ativadas por ligante do EGFR, resultando em especificidadeúnica para EGFR expresso em tumor, mas não wtEGFR em tecido normal) e demonstrando que anticorpos de sequências de região variável distintas, particularmente de sequências CDR variáveis, têm as mesmas características e capacidades de ligação. Referências Aboud-Pirak, E., Hurwitz, E., Bellot, F., Schlessinger, J., e Sela, M. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86,3778-3781. Aboud-Pirak, E., Hurwitz, E., Pirak, M. E., Bellot, F., Schlessinger, J., e Sela, M. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80, 1605-1611. Arteaga, C. 1. and Baselga, J. (2004) Cancer Cell. 5, 525-531. Ashley, D. M., Batra, S. K., e Bigner, D. D. “Monoclonal antibodies to growth factors and growth factor receptors: their diagnostic and therapeutic potential in brain tumors.” J. Neurooncol., 35 : 259-273,1997. Atlas, I., Mendelsohn, J., Baselga, J., Fair, W. R., Masui, H., e Kumar, R. “Growth regulation of human renal carcinoma cells: role of transforming growth factor a.” Cancer Res., 52 : 3335-3339, 1992. Baselga J, Pfister D, Cooper MR, et al. “Phase I studies of anti-epidermal growth factor receptor chimeric antibody C225 alone and in combination with cisplatin.” J. Clin. Oncol. 2000; 18: 904-14. Baselga, 1. (2006) Science. 312, 1175-1178. Baselga, J. e Arteaga, C. L. (2005) J. Clin. Oncol. 23,2445-2459. Baselga, J. Clinical trials of Herceptin (R) (trastuzumab). Eur. J. Cancer, 37 : 1824,2001. Baselga, J., Norton, L., Albanell, J., Kim, Y. M., e Mendelsohn, J. “Recombinant humanized anti-HER2 antibody (Herceptin) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenotransplantes.” Cancer Res., 58: 2825-2831, 1998. Baselga, J., Norton, L., Masui, H., Pandiella, A., Coplan, K., Miller, W. H., e Mendelsohn, J. “Antitumor effects of doxorubicin in combination with anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.” J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 85: 1327-1333,1993. Baselga, J., Pfister, D., Cooper, M. R., Cohen, R., Burtness, B., Bos, M., D'Andrea, G., Seidman, A., Norton, L., Gunnett, K., Falcey, J., Anderson, V., Waksal, H., e Mendelsohn, J. “Phase I Studies of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Chimeric Antibody C225 Alone and in Combination With Cisplatin.” J. Clin. Oncol. 18 : 904, 2000. Baselga, J., Tripathy, D., Mendelsohn, J., Baughman, S., Benz, C. C, Dantis, L., Sklarin, N. T., Seidman, A. D., Hudis, C. A., Moore, J., Rosen, P. P., Twaddell, T., Henderson, 1. C., e Norton, L. “Phase II study of weekly intravenous recombinant humanized anti-pl85HER2 monoclonal antibody in patients with HER2/neu- overexpressing metastatic breast cancer.” J. Clin. Oncol., 14 : 737-744,1996. Batra SK, Castelino-Prabhu S, Wikstrand CJ, et al. “Epidermal growth factor ligand-independent, unregulated, cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene.” Cell Growth Differ. 1995; 6: 1251-9. Bernier, J. (2006) Expert. Rev Anticancer Ther. 6, 1539-1552. Bhattacharya-Chatterjee, M., S. K. Chatterjee, et al. (2001). "The antiidiotype vaccines for immunotherapy."Curr. Opin. Mol. Ther. 3(1) : 63-9. Biol. Cell. 13,4029-4044. Bouyain, S., Longo, P. A., Li, S., Ferguson, K. M., e Leahy, D. J. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 15024-15029. Brady, L. W., Miyamoto, C., Woo, D. V., Rackover, M., Emrich, J., Bender, H., Dadparvar, S., Steplewski, Z., Koprowski, H., Black, P., et al. “Malignant astrocytomas treated with iodine-125 labeled monoclonal antibody 425 against epidermal growth factor receptor: a Phase I trial.” Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 22 : 225230, 1992. Brown, G. and N. Ling (1988). Murine Monoclonal Antibodies. Antibodies, Volume 1. A Practical Approach. D. Catty. Oxford, England, IRL Press: 81-104. Burgess, A. W., Cho, H. S., Eigenbrot, C., Ferguson, K. M., Garrett, T. P., Leahy, D. J., Lemmon, M. A., Sliwkowski, M. x., Ward, C. W., e Yokoyama, S. (2003) Mol. Cell. 12,541-552. Chao, G., Cochran, 1. R, e Wittrup, K. D. (2004) J. Mol. Biol. 342,539-550. Cho, H. S. e Leahy, D. J. (2002) Science 297, 1330-1333. Cho, H. S., Mason, K., Ramyar, K. x., Stanley, A. M., Gabelli, S. B., DelUley, D. W., Jr., e Leahy, D. J. (2003) Nature 421, 756-760. Clarke, K., et al., ”In vivo biodistribution of a humanized anti-Lewis Y monoclonal antibody (hu3S193) in MCF-7 xenotransplanteed BALB/c nude mice.” Cancer Res, 2000. 60(17): p. 4804-11. Clarke, K., Lee, F. T., Brechbiel, M. W., Smyth, F. E., Old, L. J., e Scott, A. M. “Therapeutic efficacy of anti-Lewis (y) humanized 3S 193 radioimmunotherapy in a breast cancer model: enhanced activity when combined with Taxol chemotherapy.” Clin. Cancer Res., 6 : 3621-3628, 2000. Clayton, A. H., Walker, F., Orchard, S. G., Henderson, C., Fuchs, D., Rothacker, J., Nice, E. C., e Burgess, A. W. (2005) J. Biol. Chem. 280, 30392-30399. Daugherty BL, DeMartino JA, Law MF, Kawka DW, Singer II, Mark GE. “Pol-ymerase chain reaction facilitates the cloning, CDR-grafting, and rapid expression of a murine monoclonal antibody directed against the CD18 component of leukocyte integrins.” Nucleic Acids Res. 1991 19(9):2471-6. de Larco, J. E. and Todaro, G. J. (1978) J. Cell. Physiol. 94, 335-342. de Larco, J. E., Reynolds, R., Carlberg, K., Engle, C., e Todaro, G. J. (1980) J. Biol. Chem. 255,3685-3690. den Eynde, B. e Scott, A. M. Tumor Antigens. In : P. J. Delves and I. M. Roitt (eds.), Encyclopedia of Immunology, Second Edition, pp. 2424 31. London: Academic Press, 1998. DeNardo SJ, Kroger LA, DeNardo GL. “A new era for radiolabeled antibodies in cancer?” Curr. Opin. Immunol. 1999; 11: 563-9. Divgi, C. R., Welt, S., Kris, M., Real, F. X., Yeh, S. D., Gralla, R., Merchant, B., Schweighart, S., Unger, M., Larson, S. M., et al. “Phase I and imaging trial of indium 11-labeled anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody 225 in patients with squamous cell lung carcinoma.” J. Natl. Cancer Inst., 83 : 97-104,1991. Domagala, T., Konstantopoulos, N., Smyth, F., Jorissen, R. N., Fabri, L., Geleick, D., Lax, I., Schlessinger, J., Sawyer, W., Howlett, G. J., Burgess, A. W., e Nice, E. C. “Stoichiometry, kinetic and binding analysis of the interaction between Epidermal Growth Factor (EGF) and the Extracellular Domain of the EGF receptor.” Growth Factors. 18 : 11-29, 2000. Domagala, T., N. Konstantopoulos, et al. (2000)."Stoichiometry, kinetic and binding analysis of the interaction between epidermal growth factor (EGF) and the extracellular domain of the EGF receptor.” Growth Factors 18 (1):11-29. Safa, M. M. e K. A. Foon (2001)."Adjuvant immunotherapy for melanoma and colorectal cancers. "Semin. Oncol. 28 (1) : 68-92. Ekstrand AJ, Sugawa N, James CD, et al. “Amplified and rearranged epidermal growth factor receptor genes in human glioblastomas reveal deletions of sequences encoding portions of the N-or C-terminal tails.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 4309-13. Ekstrand, A. J., James, C. D., Cavenee, W. K., Seliger, B., Pettersson, R. F., e Collins, V. P. (1991) Cancer Res. 51,2164-2172. Emsley, P. e Cowtan, K. (2004) Acta crystallographica 60, 2126-2132. Faillot, T., Magdelenat, H., Mady, E., Stasiecki, P., Fohanno, D., Gropp, P., Poisson, M., e Delattre, J. Y. “A Phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas.” Neurosurgery (Baltimore), 39 : 478-483, 1996. Fairlie, W. D., Uboldi, A. D., De Souza, D. P., Hemmings, G. 1, Nicola, N. A., and Baca, M. (2002) Protein expression and purification 26, 171-178. Fan, Z., e Mendelsohn, J. “Therapeutic application of anti-growth factor receptor antibodies.” Curr. Opin. Oncol., 10 : 67-73,1998. Fan, Z., Baselga, J., Masui, H., e Mendelsohn, J. “Antitumor effect of antiepi- dermal growth factor receptor monoclonal antibodies plus cisdiamminedichloroplatinum on well established A431 cell xenotransplantes.” Cancer Res., 53 : 4637-4642,1993. Fan, Z., Masui, H., Altas, I., e Mendelsohn, J. “Blockade of epidermal growth factor receptor function by bivalent and monovalent fragmento s of225 anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.” Cancer Res., 53: 4322-4328, 1993. Feldkamp, M. M., Lala, P., Lau, N., Roncari, L., e Guha, A. “Expression of ac-tivated-epidermal growth factor receptors, Ras-guanosine triphosphate, and mito- genactivated protein kinase in human glioblastoma multiforme specimens.” Neurosurgery (Baltimore), 45 : 1442-1453, 1999. Ferguson, K. M., Berger, M. B., Mendrola, J. M., Cho, H. S., Leahy, D. J., e Lemmon, M. A. (2003) Mol. Cell 11, 507-517. Fernandes H, Cohen S, Bishayee S. “Glycosylation-induced conformational modification positively regulates receptor-receptor association: a study with an aberrant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII/deEGFR) expressed in cancer cells.” J. Biol. Chem. 2001; 276: 5375-83. Filmus J, Pollak MN, Cailleau R, et al. “MDA-468, a human breast cancer cell line with a high number of epidermal growth factor (EGF) receptors, has an amplified EGF receptor gene and is growth inhibited by EGF.” Biochem. Biophys. Res. Com- mun. 1985; 128: 898-905. Filmus, J., Trent, J. M., Pollak, M. N., e Buick, R. N. “Epidermal growth factor receptor gene-amplified MDA-468 breast cancer cell line and its nonamplified variants.” Mol. Cell. Biol., 7 : 251-257, 1987. Gadella, T. W. J. e Jovin, T. M. (1995) Journal of Cell Biology 129,15431558. Gan H.K., Walker F., Burgess A.W., Rigopoulos A.., Scott A.M. e Johns T.G. “The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Tyrosine Kinase Inhibitor AG1478 Increases the Formation of Inactive Untethered EGFR Dimers: Implications For Combination Therapy With Monoclonal Antibody 806.” J. Biol. Chem. (2007);282(5):2840-50. Garcia de Palazzo, I.E., Adams, G. P., Sundareshan, P., Wong, A. J., Testa, J. R., Bigner, D. D., e Weiner, L. M. “Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-smalt cell along carcinomas.” Cancer Res., 53: 3217-3220, 1993. Garrett, T. P., McKern, N. M., Lou, M., Elleman, T. C., Adams, T. E., Lovrecz, G. 0., Zhu, H. J., Walker, F., Frenkel, M. J., Hoyne, P. A., Jorissen, R. N., Nice, E. C., Burgess, A. W., and Ward, C. W. (2002) Cell, 110, 763-773. Garrett, T. P., McKern, N. M., Lou, M., Elleman, T. C., Adams, T. E., Lovrecz, G. 0., Kofler, M., Jorissen, R. N., Nice, E. c., Burgess, A. W., e Ward, C. W. (2003) Mol. Cell. 11 ,495-505. Gill, G. N., Kawamoto, T., Cochet, C., Le, A., Sato, J. D., Masui, H., McLeod, C., and Mendelsohn, J. (1984) J. Biol. Chem. 259, 7755-7760. Goldstein NI, Prewett M, Zuklys K, et al. “Biological efficacy of a chimeric an-tibody to the epidermal growth factor receptor in a human tumor xenotransplante model.” Clin. Cancer Res. 1995; 1: 1311-8. Grandis, J. R., Melhem, M. F., Gooding, W. E., Day, R., Holst, V. A., Wagener, M. M., Drenning, S. D., e Tweardy, D. J. “Levels of TGP-a and BOFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival.” J. Natl. Cancer Inst., 90: 32CE, 1998. Green, M. C., Murray, J. L., e Hortobagyi, G. N. “Monoclonal antibody therapy for solid tumors.” Cancer Treat. Rev., 26 : 269-286,2000. Gunther, N., Betzel, C., e Weber, W. “The secreted form of the epidermal growth factor receptor. Characterization and crystallization of the receptor ligand complex.” J. Biol. Chem. 265:22082-5, 1990. Halaisch, M. E., Schmidt, U., Botefur, I. C., Holland, J. P., e Ohnuma, T. “Marked inhibition of glioblastoma target cell tumorigenicity in vitro by retrovirus- mediated transfer of a hairpin ribozyme against deletion-mutant epidermal growth factor receptor messenger RNA.” J. Neurosurg., 92: 297-305, 2000. Han, Y., Caday, C. G., Nanda, A., Cavenee, W. K., e Huang, H. J. “Tyrphos- tin AG1478 preferentially inhibits human glioma cells expressing truncated rather than wild-type epidermal growth factor receptors. Cancer Res.” 56:3859-3861, 1996. Harari, D., e Yarden, Y. “Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer.” Oncogene, 19 : 6102-6114,2000. Hills D, Rowlinson-Busza G, Gullick WJ. “Specific targeting of a mutant, activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody.” Int. J. Can cer 1995; 63: 537-43. Hogg, P. J. (2003) Trends in biochemical sciences 28, 210-214. Holbro, T. and Hynes, N. E. (2004) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44:195217., 195-217. Hooft, R. W., Vriend, G., Sander, C., and Abola, E. E. (1996) Nature 381,272. Huang HS, Nagane M, Klingbeil CK, et al. “The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.” J. Biol. Chem. 1997; 272: 2927-35. Humphrey, P. A., Wong, A. 1., Vogelstein, B., Zalutsky, M. R., Fuller, G. N., Archer, G. E., Friedman, H. S., Kwatra, M. M., Bigner, S. H., e Bigner, D. D. “Antisynthetic peptide antibody reacting at the fusion junction of deletion mutant epidermal growth factor receptors in human glioblastoma” (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4207-4211. Johns TG, Perera RM, Vernes SC, Vitali AA, Cao DX, Cavenee WK, Scott AM e Furnari FB. “The efficacy of EGFR-specific antibodies against glioma xeno- transplantes is influenced by receptor levels, activation status and heterodimerization.” Clin. Cancer Res. (2007);13(6): 1911-1925. Johns TG, Stockert E, Ritter G, Jungbluth AA, H-J. Su Huang, Cavenee WK, Smyth FE, Hall CM, Watson N, Nice EC, Gullick WJ, Old LJ, Burgess AW, Scott AM. “Novel monoclonal antibody specific for the DE2-7 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene.” Int. J. Cancer (2002) 98: 398-408 Johns, T.G., Adams, T.E., Cochran, J.R., Hall, N.E., Hoyne, P.A., Olsen, M.J., Kim, YS., Rothacker, J., Nice, E.C., Walker, F., Ritter, G., Jungbluth, A.A., Old, L.J., Ward, C.W., Burgess, A.W., Wittrup, K.D., e Scott, A.M. “Identification of the Epitope for the EGFR-Specific Monoclonal Antibody 806 Reveals that it Preferentially Recognizes an Untethered Form of the Receptor.” J. Biol. Chem. (2004) 279: 3037530384 Johns, T.G., et al., “Novel monoclonal antibody specific for the de2-7 epidermal growth factor receptor (EGFR) that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene.” Int. J. Cancer, 2002. 98(3): p. 398-408. Johns, T.G., Luwor, R.B., Murone, C., Walker, F., Weinstock, J., Vitali, A.A., Perera, R.M., Old, L.J., Nice, E.C., Burgess, A.W. e Scott, A.M. “Anti-tumor efficacy of cytotoxic drugs and the monoclonal antibody 806 is enhanced by the epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor AG1478.” PNAS (2003) 100: 15871-15876 Johns, T.G., Mellman I., Cartwright G.A., Ritter G., Old L.J., Burgess A. W. e Scott A.M. “The anti-tumor monoclonal antibody 806 recognizes a high-mannose form of the EGF receptor that reaches the cell surface when cells over-express the receptor.” FASEB J. (2005) 19(7):780-2. Jorissen, R. N., Walker, F. W., Pouliot, N., Garrett, T. P. J., Ward, C. W., e Burgess, A. W. “Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and sig-naling.” Exp. Cell Res. 284,31-53.2003. Jungbluth, A.A., Stockert, E., Huang, H-J.S., Collins, VP, Coplan, K., Iversen, K., Kolb, D., Johns T.G., Scott A..M., Gullick W.J., Ritter, G., Cohen L., Cavanee W.K., Old, L.J. A “Monoclonal Antibody Recognizing Human Cancers with Amplification/Over- Expression of the Human Epidermal Growth Factor Receptor.” PNAS (2003) 100: 639- 644. Korshunov, A., Golanov, A., Sycheva, R., e Pronin, I. “Prognostic value of tumor associated antigen immunoreactivity and apoptosis in cerebral glioblastomas: an analysis of 163 cases.” J. Clin. Pathol., 52,-574-580, 1999. Kwok TT, Sutherland RM. “Differences in EGF related radiosensitisation of human squamous carcinoma cells with high and low numbers of EGF receptors.” Br. J. Cancer 1991; 64: 251-4. Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S., e Thornton, J. M. (1993) J. Appl. Cryst. 26, 283-291. Lee F.T., Mountain A.J., O’Keefe G.J., Sagona J., Rigopoulos A., Smyth F.E., Govindan S.V., Goldenberg D.M., Old L.J. and Scott A.M. “ImmunoPET detection of xenotransplantes expressing de2-7 EGFR using Iodine-124 labelled ch806 via residualising ligand IMPR4.” J. Nucl. Med. (2006) 47 (5) suppl 1: 429P. Li D., Ji H., Zaghlul S., McNamara K., Liang M.C., Shimamura T., Kubo S., Takahashi M., Chirieac L.R., Padera R.F., Scott A.M., Jungbluth, A.A., Cavenee W.K., Old L.J., Demetri G.D., Wong KK. “Therapeutic anti-EGFR antibody 806 generates responses in murine de novo EGFR mutant-dependent lung carcinomas.” J. Clin. Invest. (2007); 117(2): 346-352. Lindmo, T., et al., “Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.” J. Immunol. Methods, 1984. 72(1): p. 77-89. Liu, Z., Panousis, C., Smyth, F.E., Murphy, R., Wirth, V., Cartwright, G., Johns, T.G., e Scott, A.M. “Generation of Anti-Idiotype Antibodies for Application in Clinical Immunotherapy Laboratory Analyses.” Hybridoma and Hybridomics, (2003) 22 (4): 219- 228. Luwor RB, Johns TG, Murone C, H-J. Su Huang, Cavenee WK, Ritter G, Old LJ, Burgess AW, Scott AM. “Monoclonal Antibody 806 Inhibits the Growth of Tumor Xenotransplantes Expressing Either the DE2-7 or Amplified Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) but not Wild-Type EGFR.” Cancer Research (2001) 61: 53555361. Luwor, R.B., Zhu, H-J., Walker, F., Vitali A.A., Perera, R.M., Burgess, A.W., Scott, A.M. e Johns, T.G. “The Tumor Specific de2-7 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) confers Increased survival in BaF/3 Cells Via a PI-3 Kinase Depend ent Mechanism.” Oncogene (2004) 23: 6095-6104 MacDonald, A., Chisholm, G. D., e Habib, F. K. (1990) Br. J Cancer. 62,579584. Masui, H., Kawamoto, T., Sato, J. D., Wolf, B., Sato, G., e Mendelsohn, J. “Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.” Cancer Res., 44 : 1002-1007, 1984. Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F., and Mischel, P. S. (2007) Clin. Cancer Res. 13,378-381. Mendelsohn, J. “Epidermal growth factor receptor inhibition by a monoclonal antibody as anticancer therapy. Clin. Cancer Res.” 3:2703-2707,1997. Mickey, D. D., Stone, K. R., Wunderli, H., Mickey, G. H., Vollmer, R. T., e Paulson, D. F. (1977) Cancer Res. 37,4049-4058. Mineo C, Gill GN, Anderson RG. “Regulated migration of epidermal growth factor receptor from caveolae.” J. Biol. Chem. 1999; 274: 30636-43. Mishima K, Johns TG, Luwor RB, Scott AM, Stockert E, Jungbluth AA, Ji X, Suvarna P, Voland JR, Old LJ, H-J. Su Huang, Cavenee WK. “Growth Suppression of Intracranial Xenotransplanteed Glioblastomas Overexpressing Mutant Epidermal Growth Factor Receptors by Systemic Administration of Monoclonal Antibody (mAb) 806, a Novel Monoclonal Antibody Directed to the Receptor.” Cancer Research (2001)61:5349-5354. Mishima, K. Nagane, M., Lin, H., Cavenee, W. K., e Huang, H-J. S. “Expression of a tumor-specific mutant epidermal growth factor receptor mediates glioma cell invasion in vivo.” Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 40 : 519,1999. Mishima, K., Mazar, A. P., Gown, A., Skelly, M., Ji, X. D., Wang, X. D., Jones, T. R., Cavenee, W. K., e Huang, H-J. S. “A peptide derived from the nonreceptor-binding region of urokinase plasminogen activator inhibits glioblastoma growth and angiogenesis in vivo in combination with cisplatin.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 8484-8489, 2000. Moscatello, D. K., Holgado-Madruga, M., Godwin, A. K., Ramirez, G., Gunn, G., Zoltick, P. W., Biegel, J. A., Hayes, R. L., e Wong, A. J. “Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors.” Cancer Res., 55 : 5536-5539,1995. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., e Dodson, E. J. (1997) Acta crystallographi- ca 53, 240-255. Nagane, M., Coufal, F., Lin, H., Bogler, O., Cavenee, W. K., e Huang, H. J. “A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis.” Cancer Res. 56 : 5079-86,1996. Nagane, M., Levitzki, A., Gazit, A., Cavenee, W. K., e Huang, H-J. S. “Drug resistance of human glioblastoma cells conferred by a tumor-specific mutant epidermal growth factor receptor through modulation of Bcl-XL and caspase-3-like proteases.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 : 5724-5729, 1998. Nagane, M., Lin, H., Cavenee, W. K., e Huang, H-J. S. “Aberrant receptor signaling in human malignant gliomas: mechanisms and therapeutic implications.” Cancer Lett., 162 (Suppl. 1):S17-S21, 2001. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., e Smith, D. F. (1974) Journal of bacteriology 119, 736-747. Nishikawa, R., Ji, X. D., Harmon, R. C., Lazar, C. S., Gill, G. N., Cavenee, W. K., e Huang, H. J. A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:7727-7731, 1994. Ogiso, H., Ishitani, R, Nureki, 0., Fukai, S., Yamanaka, M., Kim, 1. H., Saito, K., Sakamoto, A., Inoue, M., Shirouzu, M., e Yokoyama, S. (2002) Cell 20; 110, 775787. Okamoto S, Yoshikawa K, Obata Y, et al. “Monoclonal antibody against the fusion junction of a deletion-mutant epidermal growth factor receptor.” Br. J. Cancer 1996; 73: 1366-72. Olapade-Olaopa, E. O., Moscatello, D. K., MacKay, E. H., Horsburgh, T., Sandhu, D. P., Terry, T. R., Wong, A. J., e Habib, F. K. “Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer.” Br. J. Cancer. 82 : 186-94, 2000. Old, L. J. “Immunotherapy for cancer.” Sci. Am., 275 : 102-109,1996. Otwinowski, Z. e Minor, W. (1997) “Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.” Academic Press (New York). Padlan EA. “A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties.” Mol. Immunol. 1991 28(4-5):489-98. Padlan et al., EP 519596, Merck/NIH Palacios, R, Henson, G., Steinmetz, M., e McKeam, J. P. (1984) Nature. 309, 126-131. Panousis, C., Rayzman, V.M., Johns, T.G., Renner C., Liu Z., Cartwright, G., Lee F-T., Wang, D., Gan, H., Cao, D., Kypridis, A., Smyth, F.E., Brechbiel, M.W., Burgess, A.W., Old, L.J. e Scott, A.M. “Engineering and characterization of chimeric monoclonal antibody 806 (ch806) for targeted immunotherapy of tumours expressing de2-7 EGFR or amplified EGFR.” Br. J. Cancer (2005) 92:1069-1077. Patente PCT WO02092771, 2002. Perera R.M., Narita Y., Furnari, F.B., Luwor, R.B., Burgess, A.W., Old, L.J., Cavenee, W.K., Scott, A.M. e Johns, T.G. “A novel EGFR antibody that displays syn-ergistic anti-tumor activity when combined with conventional EGFR therapeutics.” Clinical Cancer Research (2005) 11: 6390-6399. Perera R.M., Zoncu R., Johns T.G., Pypaert M., Lee F.T., Mellman I., Old L.J., Toomre D.K., e Scott A.M. “Internalization, intracellular trafficking, and biodistribution of monoclonal antibody 806: a novel anti-epidermal growth factor receptor antibody.” Neoplasia. (2007); 9(12):1099-110 Perez-Soler, R., Donato, N. J., Shin, D. M., Rosenblum, M. G., Zhang, H. Z., Tornos, C., Brewer, H., Chan, J. C., Lee, J. S., Hong, W. K., et al. “Tumor epidermal growth factor receptor studies in patients with non-small-cell lung cancer or head and neck cancer treated with monoclonal antibody RG 83852.” J. Clin. Oncol., 12 : 730739, 1994. Pietras, R. J., Pegam, M. D-, Finn, R-S., Maneval, D. A., e Slmon, D. J. “Re-mission of human breast cancer xenotransplantes on therapy with humanized monoclonal antibody to HER-2 receptor and DNA-reactive drugs.” Oncogene, 17: 22352249, 1998. Ponten J, Macintyre EH. “Long term culture of normal and neoplastic human glia.” Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1968 ; 74: 465-86. Press, O. W., DeSantes, K., Anderson, S. K., e Geissler, F. “Inhibition of ca-tabolism of radiolabeled antibodies by tumor cells using lysosomotropic amines and carboxylic ionophores.” Cancer Res. 50 : 1243-50,1990. Reist CJ, Batra SK, Pegram CN, et al. “In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody: comparison with its murine parent.” Nucl. Med. Biol. 1997; 24 : 639-47. Reist, C. J., Archer, G. E., Kurpad, S. N., Wikstrand, C. J., Vaidyanathan, G., Willingham, M. C., Moscatello, D. K., Wong, A. J., Bigner, D. D., e Zalutsky, M. R. “Tumor-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies: use of the tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumor xenotransplantes.” Cancer Res., 55 : 4375-4382,1995. Reist, C. J., Archer, G. E., Wikstrand, C. J., Bigner, D. D., e Zalutsky, M. R. “Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenotransplantes after labeling using N-succinimidyl 5-iodo-3- pyridinecarboxylate.” Cancer Res. 57: 1510-5,1997. Reist, C. J., Batra, S. K., Pegram, C. N., Bigner, D. D., e Zalutsky, M. R. “In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody: comparison with its murine parent.” Nucl. Med. Biol. 24 : 63947, 1997. Reist, C. J., Garg, P. K., Alston, K. L., Bigner, D. D., e Zalutsky, M. R. “Radio-iodination of internalizing monoclonal antibodies using N-succinimidyl 5-iodo-3- pyridinecarboxylate.” Cancer Res. 56 : 4970-7, 1996. Rodeck, U., Herlyn, M., Herlyn, D., Molthoff, C., Atkinson, B., Varello, M., Steplewski, Z., e Koprowski, H. “Tumor growth modulation by a monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor: immunologically mediated and effector cellindependent effects.” Cancer Res., 47: 3692-3696, 1987. Salomon, D. S., Brandt, R., Ciardiello, F., e Normanno, N. “Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies.” Crit. Rev. Oncol. Hematol., 19 : 183-232, 1995. Sampson, J. H, Crotty, L. E., Lee, S., Archer, G. E., Ashley, D. M., Wikstrand, C. J., Hale, L. P., Small, C., Dranoff, G., : Friedman, A. H., Friedman, H. S., e Bigner, D. D, “Unarmed, tumor-specific monoclonal antibody effectively treats brain tumors.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 7503-7508, 2000. Santon, J. B., Cronin, M. T., MacLeod, C. L., Mendelsohn, J., Masui, H., e Gill, G. N. “Effects of epidermal growth factor receptor concentration on tumorigenici- ty of A431 cells in nude mice.” Cancer Res. 46 : 4701-5, 1986. Sato, J. D., Le, A. D., e Kawamoto, T. “Derivation and assay of biological effects of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptors.” Methods En- zymol. 146 : 63-81, 1987. Schlessinger, J. (2002) Cell 20; 110,669-672. Scott A.M., Gill S. S., Lee F., Liu Z., Skrinos E., Murone C., Saunder T., Chappell B., Papenfuss A., Old L.J. “A Phase I single dose escalation trial of ch806 in patients with advanced tumors expressing the 806 antigen.” Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol. 24, No. 18S (June 20 Supplement), (2006): 13028. Scott A.M., Lee FT., Tebbutt N., Herbertson R., Gill S.S., Liu Z., Skrinos E., Murone C., Saunder T.H., Chappell B.,. Papenfuss A.T., Poon A.M.T., Hopkins W., Smyth F.E., MacGregor D., Cher L.M., Jungbluth A.A., Ritter, G., Brechbiel M.W., Murphy R., Burgess AW, Hoffman E.W., Johns T.J., Old L.J. “A Phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2007) 104 (10): 4071-6. Epub 2007 February 28. Scott, A. M., e Welt, S. Antibody-based immunological therapy. Curr. Opin. Immunol., 9: 717-722, 1997. Seymour L. “Novel anti-cancer agents in development : exciting prospects and new challenges.” Cancer Treat. Rev. 1999; 25: 301-12. Sizeland, A. M. e Burgess, A. W. (1991) Mol. Cell Bio. 11,4005-4014. Sizeland, A. M. e Burgess, A. W. (1992) Mol. Biol. Cell 3, 1235-1243. Slamon, D. J., Godolphin, W., Jones, L. A., Holt, J. A., Wong, S. G., Keith, D. E., Levin, W. J., Stuart, S. G., Udove, J., Ullrich, A., e Press, M. F. “Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer.” Science (Wash. DC). 244 : 707-712,1989. Sliwkowski, M. X., Lofgren, J. A., Lewis, G. D., Hotaling, T. E., Fendly, B. M., e Fox, J. A. “Nonclinical studies addressing the mechanism of action of trastuzumab (Herceptin).” Semin. Oncol., 26 (Suppl. 12) : 60-70,1999. Sok, J. c., Coppelli, F. M., Thomas, S. M., Lango, M. N., Xi, S., Hunt, J. 1., Freilino, M. 1., Graner, M. W., Wikstrand, C. J., Bigner, D. D., Gooding, W. E., Furnari, F. B., e Grandis, J. R. (2006) Clin. Cancer Res. 12,5064-5073. Stamos, J., Sliwkowski, M. X., e Eigenbrot, C. (2002) J. Biol.. Chem. 277,46265-46272. Sturgis, E. M., Sacks, P. G., Masui, H., Mendelsohn, J., e Schantz, S. P. “Effects of antiepidermal growth factor receptor antibody 528 on the proliferation and differentiation of head and neck cancer.” Otolaryngol. Head Neck Surg. 111 : 63343,1994. Sugawa, N., Ekstrand, A. J., James, C. D., e Collins, V. P. “Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastomas.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 8602-8606, 1990. Tang, C. K., Gong, X. Q., Moscatello, D. K., Wong, A. J., e Lippman, M. E. “Epidermal growth factor receptor in enhances tumorigenicity in human breast cancer.” Cancer Res., 60 : 3081-3087, 2000. Teramoto, T., Onda, M., Tokunaga, A., e Asano, G. “Inhibitory effect of an- tiepidermal growth factor receptor antibody on a human gastric cancer.” Cancer (Phi- la.), 77 : 1639-1645, 1996. Todaro, G. J., Delarco, J. E., e Cohen, S. (1976) Nature 264, 26-31. Trail, P. A., e Bianchi, A. B. “Monoclonal antibody drug conjugates in the treatment of cancer.” Curr. Opin. Immunol., 11: 584-588, 1999. Uemura, H., E. Okajima, et al. (1994)."Internal image anti-idiotype antibodies related to renal- cell carcinoma-associated antigen G250."Int. J. Cancer 56 (4): 60914. Ullrich, A., Coussens, L., Hayflick, J. S., Dull, T. J., Gray, A., Tam, A. W., Lee, J., Yarden, Y., Libermann, T. A., Schlessinger, J., and. (1984) Nature. 309,418425. Vagin, A. e Teplyakov, A. (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025. van de Loosdrecht, A. A., Beelen, R. H., Ossenkoppele, G. J., Broekhoven, M. G., e Langenhuijsen, M. M. (1994) J. Immunol. Methods. 174,311-320. Voldborg, B. R., Damstrup, L., Spang-Thomsen, M., e Poulsen, H. S. “Epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR mutations, function and possible role in clinical trials.” Ann. Oncol., 8 : 1197-1206,1997. Wade, J. D., Hojo, K., Kawasaki, K., Johns, T. G., Catimel, B., Rothacker, J., e Nice, E. C. (2006) Anal. Biochem. 348, 315-317. Waksal, H. W. “Role of an anti-epidermal growth factor receptor in treating cancer.” Cancer Metastasis Rev., 18 : 427-436, 1999. Walker, F., Orchard, S. G., Jorissen, R N., Hall, N. E., Zhang, H. H., Hoyne, P. A., Adams, T. E., Johns, T. G., Ward, C., Garrett, T. P., Zhu, H. 1., Nerrie, M., Scott, A. M., Nice, E. C., and Burgess, A. W. (2004) J. Biol. Chern. 79, 22387-22398. Weiner, L. M. “An overview of monoclonal antibody therapy of cancer.” Semin. Oncol., 26 (Suppl. 12) : 41-50,1999. Wersall, P., Ohlsson, I., Biberfeld, P., Collins, V. P., von Krusenstjerna, S., Larsson, S., Mellstedt, H., e Boethius, J. “Intratumoral infusion of the monoclonal antibody, mAb 425, against the epidermal-growth-factor receptor in patients with advanced malignant glioma.” Cancer Immunol. Immunother., 44 : 157-164,1997. Whitson K.B., Red M.L., Whitson S.R., McCoy A., Vitali A.A., Walker F., Johns T.G., Beth A.H. e Staros J.A. “Functional Effects of Selective Glycosylation at Asn-579 of the Epidermal Growth Factor Receptor.” Biochemistry (2005) 44: 1492014931 Wikstrand, C. J., Cokgor, I., Sampson, J. H., e Bigner, D. D. “Monoclonal antibody therapy of human gliomas: current status and future approaches.” Cancer Metastasis Rev., 18 : 451-464, 1999. Wikstrand, C. J., Hale, L. P., Batra, S. K., Hill, M. L., Humphrey, P. A., Kurpad, S. N., McLendon, R. E., Moscatello, D., Pegram, C. N., Reist, C. J., et al. “Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.” Cancer Res.55 : 3140-3148, 1995. Wikstrand, C. J., McLendon, R. E., Friedman, A. H., e Bigner, D. D. “Cell surface localization and density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor, EGFRvIII.” Cancer Res. 57 : 4130-40, 1997. Wikstrand, C. J., Reist, C. J., Archer, G. E., Zalutsky, M. R., e Bier, D. D. “The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFRvIII): characterization and utilization as an immunotherapeutic target.” J. Neurovirol., 4: 148-158, 1998. Wong, A. J., Ruppert, J. M., Bigner, S. H., Grzeschik, C. H., Humphrey, P. A., Bigner, D. S., e Vogelstein, B. “Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 2965-2969,1992. Yamazaki H, Fukui Y, Ueyama Y, et al. “Amplification of the structurally and functionally altered epidermal growth factor receptor gene (c-erbB) in human brain tumors.” Mol. Cell Biol. 1988; 8:1816-20. Yamazaki H, Ohba Y, Tamaoki N, et al. “A deletion mutation within the ligand binding domain is responsible for activation of epidermal growth factor receptor gene in human brain tumors.” Jpn. J. Cancer Res. 1990; 81 : 773-9. Yarden, Y. and Schlessinger, J. (1987) Biochemistry. 26, 1443-1451. Yarden, Y. and Sliwkowski, M. X. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell BioI. 2, 127-137. Yen, L., Benlimame, N., Nie, Z. R., Xiao, D., Wang, T., Al Moustafa, A. E., Esumi, H., Milanini, J., Hynes, N. E., Pages, G., and Alaoui-Jamali, M. A. (2002) Mol. Biol. Cell. 13(11):4029-44. Ymer, S., Tucker, W. Q., Sanderson, C. 1., Hapel, A. J., Campbell, H. D., and Young, 1. G. (1985) Nature. 19-25;317,255-258. Zhang, x., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., and Kuriyan, J. (2006) Cell. 125, 1137-1149. Burgess AW, Cho HS, Eigenbrot C, Ferguson KM, Garrett TP, Leahy DJ, Lemmon MA, Sliwkowski MX, Ward CW, & Yokoyama S (2003) Mol. Cell. 12:541- 552. Ferguson KM (2008) Annu. Rev. Biophys. 37, 353-373. Mendelsohn J & Baselga J (2006) Semin. Oncol. 33, 369-385. Herbst RS, Kim ES, & Harari PM (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1, 719-732. Lynch DH & Yang XD (2002) Semin. Oncol. 29, 47-50. Baselga J & Arteaga CL (2005) J. Clin. Oncol. 23, 2445-2459. Burgess AW (2008) Growth Factors 26, 263-274. Milano G, Spano JP, & Leyland-Jones B (2008) Br. J. Cancer 99, 1-5. Solomon BM & Jatoi A (2008) Curr. Oncol. Rep. 10, 304-308. Nishikawa R, Ji XD, Harmon RC, Lazar CS, Gill GN, Cavenee WK, & Huang HJ (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 7727-7731. Humphrey PA, Wong AJ, Vogelstein B, Zalutsky MR, Fuller GN, Archer GE, Friedman HS, Kwatra MM, Bigner SH, & Bigner DD (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4207-4211. Johns TG, Stockert E, Ritter G, Jungbluth AA, Huang HJ, Cavenee WK, Smyth FE, Hall CM, Watson N, Nice EC, et al. (2002) Int. J. Cancer. 98, 398-408. Jungbluth AA, Stockert E, Huang HJ, Collins VP, Coplan K, Iversen K, Kolb D, Johns TJ, Scott AM, Gullick WJ, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 639644. Scott AM, Lee FT, Tebbutt N, Herbertson R, Gill SS, Liu Z, Skrinos E, Murone C, Saunder TH, Chappell B, et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 4071-4076. Johns TG, Luwor RB, Murone C, Walker F, Weinstock J, Vitali AA, Perera RM, Jungbluth AA, Stockert E, Old LJ, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 15871-15876. Perera RM, Narita Y, Furnari FB, Gan HK, Murone C, Ahlkvist M, Luwor RB, Burgess AW, Stockert E, Jungbluth AA, et al. (2005) Clin. Cancer. Res. 11, 6390- 6399. Johns TG, Adams TE, Cochran JR, Hall NE, Hoyne PA, Olsen MJ, Kim YS, Rothacker J, Nice EC, Walker F, et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384. Walker F, Orchard SG, Jorissen RN, Hall NE, Zhang HH, Hoyne PA, Adams TE, Johns TG, Ward C, Garrett TP, et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 22387-22398. Sivasubramanian A, Chao G, Pressler HM, Wittrup KD, & Gray JJ (2006) Structure 14, 401-414. Luwor RB, Johns TG, Murone C, Huang HJ, Cavenee WK, Ritter G, Old LJ, Burgess AW, & Scott AM (2001) Cancer Res. 61, 5355-5361. Ching KZ, Ramsey E, Pettigrew N, D'Cunha R, Jason M, & Dodd JG (1993) Mol. Cell Biochem. 126, 151-158. Sizeland AM & Burgess AW (1991) Mol. Cell Biol. 11, 4005-4014. Chao G, Cochran JR, & Wittrup KD (2004) J. Mol Biol. 342, 539-550. Garrett TP, McKern NM, Lou M, Elleman TC, Adams TE, Lovrecz GO, Zhu HJ, Walker F, Frenkel MJ, Hoyne PA, et al. (2002) Cell 110, 763-773. Li S, Schmitz KR, Jeffrey PD, Wiltzius JJ, Kussie P, & Ferguson KM (2005) Cancer Cell. 7, 301-311. Hogg PJ (2003) Trends Biochem. Sci. 28, 210-214. Li S, Kussie P, & Ferguson KM (2008) Structure 16, 216-227. Schmiedel J, Blaukat A, Li S, Knochel T, & Ferguson KM (2008) Cancer Cell 13, 365-373. Sandler AB (2006) Oncology (Williston Park) 20, 35-40. Sampson JH, Crotty LE, Lee S, Archer GE, Ashley DM, Wikstrand CJ, Hale LP, Small C, Dranoff G, Friedman AH, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7503-7508. Ullrich A, Coussens L, Hayflick JS, Dull TJ, Gray A, Tam AW, Lee J, Yarden Y, Libermann TA, & Schlessinger J (1984) Nature. 309, 418-425. Walker F, Hibbs ML, Zhang HH, Gonez LJ, & Burgess AW (1998) Growth Factors 16, 53-67. Wade JD, Hojo K, Kawasaki K, Johns TG, Catimel B, Rothacker J, & Nice EC (2006) Anal. Biochem. 348, 315-317. Vagin AA & Isupov MN (2001) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57, 1451-1456. Murshudov GN, Vagin AA, & Dodson EJ (1997) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 53, 240-255. Ferguson KM, Berger MB, Mendrola JM, Cho HS, Leahy DJ, & Lemmon MA (2003) Mol. Cell 11, 507-517. Rettig WJ, Old LJ (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:481-511. Van den Eynde BJ, Scott AM (1998) in Encyclopedia of Immunology, eds Roitt DPJ, Roitt IM (Academic Press: London), pp 2424-2431. Maloney DG, Grillo-Lopez AJ, White CA, Bodkin D, Schilder RJ, Neidhart JA, Janakiraman N, Foon KA, Liles TM, Dallaire BK, et al. (1997) Blood 90(6):2188-2195. Baselga J, Artega CL (2005) J. Clin. Oncol. 23:2445-2449. Voldborg BR, Damstrup L, Spang-Thomsen M, Poulsen HS (1997) Ann. Oncol. 8(12): 1197-206. Baselga J, Tripathy D, Mendelsohn J, Baughman S, Benz CC, Dantis L, Sklarin NT, Seidman AD, Hudis CA, Moore J, et al. (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744. Welt S, Divgi CR, Real FX, Yeh SD, Garin-Chesa P, Finstad CL, Sakamoto J, Cohen A, Sigurdson ER, Kemeny N, et al. (1990) J. Clin. Oncol. 8(11):1894-906. Scott AM, Lee FT, Jones R, Hopkins W, MacGregor D, Cebon J, Hannah A, U P, Rigopolous A, Sturrock S, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11(13):4810-4817. Steffens MG, Boerman OC, Oosterwijk-Wakka JC, Oosterhof GO, Witjes JA, Koenders EB, Oyen WJ, Buijs WC, Debruyne FM, Corstens FH, et al. (1997) J. Clin. Oncol. 15:1529-1537. Scott AM, Geleick D, Rubira M, Clarke K, Nice EC, Smyth FE, Stockert E, Richards EC, Carr FJ, Harris WJ, et al. (2000) Cancer Res 60:3254-3261. Scott AM, Lee F-T, Hopkins W, Cebon JS, Wheatley JM, Liu Z, Smyth FE, Murone C, Sturrock S, MacGregor D, et al. (2001) J. Clin. Oncol. 19(19):3976-3987. Welt S, Divgi CR, Scott AM, Garin-Chesa P, Finn RD, Graham M, Carswell EA, Cohen A, Larson SM, Old LJ (1994) J. Clin. Oncol. 12:1193-1203. Scott AM, Wiseman G, Welt S, Adjei A, Lee FT, Hopkins W, Divgi CR, Hanson LH, Mitchell P, Gansen DN, et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:1639-47. Sugawa N, Ekstrand AJ, James CD, Collins VP (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 87(21):8602-8606. Wong AJ, Bigner SH, Bigner DD, Kinzler KW, Hamilton SR, Vogelstein B (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6899-6903. Nishikawa R, Ji XD, Harmon RC, Lazar CS, Gill GN, Cavenee WK, Huang HJ (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(16):7727-7731. Hills D, Rowlinson-Busza D, Gullick WJ (1995) Int. J. Cancer 63(4):537-543. Sridhar SS, Seymour L, Shepherd FA (2003) Lancet Oncol. 4(7):397-406. Goldstein NI, Prewett M, Zuklys K, Rockwell P, Mendelsohn J (1995) Clin. Cancer Res. 1(11):1311-1318. Humphrey PA, Wong AJ, Vogelstein B, Zalutsky MR, Fuller GN, Archer GE, Friedman HS, Kwatra MM, Bigner SH, Bigner DD (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(11):4207-4211. Baselga J, Pfister D, Cooper MR, Cohen R, Burtness B, Bos M, D'Andrea G, Seidman A, Norton L, Gunnett K, et al. (2000) J. Clin. Oncol. 18(4):904-914. Graeven U, Kremer B, Sudhoff T, Kiling B, Rojo F, Weber D, Tillner J, Unal C, Schmiegel W (2006) Br. J. Cancer 94(9):1293-1299. Ramos TC, Figueredo J, Catala M, Gonzales S, Selva JC, Cruz TM, Toldeo C, Silva S, Pestano Y, Ramos M, et al. (2006) Cancer Biol. Ther. 5(4):375-379. Johns TG, Stockert E, Ritter G, Jungbluth AA, Huang HJ, Cavenee WK, Smyth FE, Hall CM, Watson N, Nice EC, et al. (2002) Int. J. Cancer 98(3):398-408. Jungbluth AA, Stockert E, Huang HJ, Collins VP, Coplan K, Iversen K, Kolb D, Johns TG, Scott AM, Gullick WJ, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(2): 639-644. Johns TG, Adams TE, Wittrup KD, Hall NE, Hoyne PA, Cochrane JR, Olsen MJ, Kim YS, Rothacker J, Nice EC, et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(29):30375- 30384. Johns TG, Mellman I, Cartwright GA, Ritter G, Old LJ, Burgess AW, Scott AM (2005) FASEB J. 19(7):780-782. Luwor RB, Johns TG, Murone C, Huang HJ, Cavenee WK, Ritter G, Old LJ, Burgess AW, Scott AM (2001) Cancer Res. 61(14): p. 5355-5361. Johns TG, Luwor RB, Murone C, Walker F, Weinstock J, Vitali AA, Perera RM, Jungbluth AA, Stockert E, Old LJ, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(26):15871-15876. Mishima K, Johns TG, Luwor RB, Scott AM, Stockert E, Jungbluth AA, Ji XD, Suvarna P, Voland JR, Old LJ, et al. (2001) Cancer Res. 61(14):5349-5354. Perera RM, Narita Y, Furnari FB, Tavernasi ML, Luwor RB, Burgess AW, Stockert E, Jungbluth AA, Old LJ, Cavenee WK, et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11(17):6390-6399. Panousis C, Rayzman VM, Johns TG, Renner C, Liu Z, Cartwright G, Lee FT, Wang D, Kypridis A, Smyth FE, et al. (2005) Br. J. Cancer. 92(6):1069-1077. Divgi CR, Welt S, Kris M, Real FX, Yeh SD, Gralla R, Merchant B, Schweighart S, Unger M, Larson SM, et al. (1991) J. Natl. Cancer Inst. 83(2):97-104. Baselga J (2001) Eur. J. Cancer 37 Suppl 4:S16-22. Gibson TB, Ranganathan A, Grothey A (2006) Clin. Colorectal Cancer 6(1):29-31. Rowinsky EK, Schwartz GH, Gollob JA, Thompson JA, Vogelzang NJ, Figlin R, Bukowski R, Haas N, Lockbaum P, Li YP, et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:30033015. Tan AR, Moore DF, Hidalgo M, Doroshow JH, Polpin EA, Goodin S, Mauro D, Rubin EH (2006) Clin. Cancer Res. 12(21): 6517-6522. Lacouture AE (2006) Nature Rev. Cancer. 6:803-812. Adams GP, Weiner LM (2005) Nat. Biotechnol. 23(9): 1147-1157. Liu Z, Panousis C, Smyth FE, Murphy R, Wirth V, Cartwright G, Johns TG, Scott AM (2003) Hybrid Hybridomics 22(4):219-28. Stabin MG, Sparks RB, Crowe E (2005) J. Nucl. Med. 46(6):1023-1027. Ritter G, Cohen LS, Williams C Jr, Richards EC, Old LJ, Welt S (2001) Cancer Res. 61(18):685-6859.

[0680]Esta invenção pode ser incorporada em outras formas ou realizadas de outras maneiras sem sair do espírito ou características essenciais da mesma. A presente revelação é então para ser considerada como em todos os aspectos ilustrados e não restritivos, o objetivo da invenção senso indicado pelas Reivindicações em apêndice, e todas as mudanças que vêm dentro do significado e variação de equivalência são tencionadas serem inclusas na mesma.

[0681]Várias referências são citadas através da Especificação e providas em uma lista de referências acima, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Claims (15)

1. Anticorpo anti-Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) iso-lado,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 164 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de ami- noácidos estabelecida na SEQ ID NO: 166.

2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável da cadeia pesada está ligada na sua extremidade C-terminal a uma região constante da cadeia pesada do isotipo IgG.

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito isotipo IgG é um isotipo IgG1.

4. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável da cadeia leve está ligada na sua extremidade C-terminal a uma região constante da cadeia leve kappa.

5. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 43.

6. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma região constante da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 48.

7. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um marcador detectável ou funcional.

8. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito marcador detectável ou funcional é uma droga covalentemen- te ligada.

9. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito marcador funcional é uma droga citotóxica.

10. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito marcador detectável é um radiomarcador.

11. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito radiomarcador é selecionado a partir do grupo que consiste em 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 58Co, 59Fe, 90Y,121I, 124I, 125I, 131I, 111In, 211At, 198Au, 67Cu, 225Ac, 213Bi, 99Tc e 186Re.

12. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito marcador detectável é um agente de imagem.

13. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito agente de imagem é um agente de aprimoramento da imagem de ressonância magnética.

14. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo isolado é peguilado.

15. Imunoconjugado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um agente citotóxico e um anticorpo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

Images