ES2653843T3

ES2653843T3 - Sistemas y procedimientos de producción de proteínas

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Publication number: ES2653843T3
Application number: ES05807248.9T
Authority: ES
Inventors: Yijie Gao; Nicole M. Piche; Mei Geng; Stephen H. Herrmann; Xiaotian Zhong; Ronald Kriz; Zhijian Lu
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2005-09-01
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2025-09-01
Also published as: JP5508460B2; EP2316955B1; JP2012161318A; CA2577073A1; CN101048509A; US20120322104A1; CR8927A; MX2007002379A; NO20071221L; US7514237B2; US20090221035A1; RU2007106442A; US8173394B2; AU2005282746A1; JP2008511335A; WO2006028889A2; US20060053502A1; CA2577073C; BRPI0514870A; IL181278A0

Abstract

Un cultivo celular animal o vegetal transfectado o trasnducido con uno o más vectores de expresión que comprende: (a) al menos un casete de expresión recombinante que codifica dicha proteína de interés; y (b) al menos otro casete de expresión recombinante que codifica: (i) una proteína XBP1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 o un fragmento de la misma, en el que dicha proteína o fragmento de la misma se une a un elemento RPD (ERPD) o a un elemento de respuesta al estrés del RE (ERERE) de dicha célula; o (ii) una proteína ATF6 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o de los restos de aminoácidos 1-366 de SEQ ID NO:9, en el que dicha proteína se une a un elemento RPD (ERPD) o a un elemento de respuesta al estrés del RE (ERERE) de dicha célula; en el que la relación entre el número total de dicho al menos un casete de expresión recombinante y el número total de dicho al menos otro casete de expresión recombinante es al menos 3:1.

Description

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410 (1990), el algoritmo de Needleman, y col, J. MOL. BIOL., 48:444-453 (1970), el algoritmo de Myers y Miller, COMPUTER. APPLE. BIOSCI., 4:11-17 (1988), y el análisis de la matriz de puntos. Los programas informáticos adecuados para este fin incluyen, entre otros, los programas BLAST proporcionados por CNIB, MegAlign proporcionado por DNASTAR (Madison, WI), y el programa GAP de Genetics Computer Group (GCG) (algoritmo de

5 Needleman-Wench). Para el programa GAP, se pueden utilizar valores por defecto (p. ej., la penalización por apertura de huecos en una de las secuencias es 11 y por extensión de huecos es 8). Aminoácidos similares pueden ser definidos por la matriz de sustitución BLOSSOM.

Existen numerosos procedimientos disponibles para la preparación de una variante deseable de un componente de RPD. Por ejemplo, una variante puede derivarse de la proteína original en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 o más 10 sustituciones, deleciones, inserciones, u otras modificaciones de aminoácidos. Las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras. En muchos casos, las sustituciones conservativas de aminoácidos se pueden introducir en una secuencia de proteínas sin cambiar significativamente la estructura o la actividad biológica de la proteína. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden efectuarse sobre la base de similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, 15 pueden efectuarse sustituciones conservadoras de aminoácidos entre aminoácidos con cadenas laterales básicas, tales como lisina (Lys o K), arginina (Arg o R) e histidina (His o H); aminoácidos con cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico (Asp o D) y ácido glutámico (Glu o E); aminoácidos con cadenas laterales polares sin carga, tales como asparagina (Asn o N), glutamina (Gln o Q), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), y tirosina (Tyr o Y); o aminoácidos con cadenas laterales no polares, tales como alanina (Ala o A), glicina (Gly o G), valina (Val o V),

20 leucina (Leu o L), isoleucina (Ile o I), prolina (Pro o P ), fenilalanina (Phe o F), metionina (Met o M), triptófano (Trp o W) o cisteína (Cys o C). Ejemplos de sustituciones de aminoácidos comúnmente utilizados se ilustran en la Tabla 1.

Tabla 1. Ejemplo de sustituciones de aminoácidos

Residuos originales: Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones más conservadoras

Ala (A): Val, Leu, Ile Val

Arg (R): Lys, Gln, Asn Lys

Asn (N): Gln Gln

Asp (D): Glu Glu

Cys (C): Ser, Ala Ser

Gln (Q): Asn Asn

Gly (G): Pro, Ala Ala

His (H): Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile (I): Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu

Leu (L): Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile

Lys (K): Arg, ácido 1,4 diamino-butírico, Gln, Asn Arg

Met (M): Leu, Phe, Ile Leu

Phe (F): Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu

Pro (P): Ala Gly

Ser (S): Thr, Ala, Cys Thr

Thr (T): Ser Ser

Trp (W): Tyr, Phe Tyr

Tyr (Y): Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val (V): Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

Otras sustituciones deseables de aminoácidos también se pueden introducir en un componente de RPD. Por

25 ejemplo, la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un componente de RPD para aumentar su estabilidad. Para otro ejemplo, la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden introducirse para aumentar o disminuir la actividad de RPD de un componente de RPD.

Además, la presente divulgación presenta el uso de polipéptidos que pueden unirse a las secuencias ERPD o ERERE de las células huésped. Estos polipéptidos, solos o en combinación con otra proteína o proteínas, pueden

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En un ejemplo adicional, un casete de expresión recombinante empleado en la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica restos de aminoácidos 1-366 de SEQ ID NO:9. Un ejemplo de dicha secuencia de ácido nucleico es los nucleótidos 1-1.098 de SEQ ID NO:8. Los restos de aminoácidos 1-366 de SEQ ID NO:9 incluyen toda la región de base y la mayoría de la región de cremallera de leucina de la proteína ATF6 humana. Este fragmento ATF6 ha demostrado ser capaz de activar genes GRP78 endógenos. Véase Haze, y col., MOL. BIOL. CELL, 10:3787-3799 (1999).

Los casetes recombinantes que codifican proteínas XBP1 o ATF6 derivados de especies no humanas también pueden ser utilizados en la presente invención. Por ejemplo, las proteínas XBP1 o ATF6 de roedores u otras especies de animales se pueden usar. Estas proteínas XBP1 o ATF6 pueden seleccionarse de manera que la coexpresión de estas proteínas con una proteína de interés mejora el rendimiento de la última proteína en las células huésped.

Un casete de expresión recombinante puede ser incorporado en células huésped mediante una variedad de medios. En una realización, un casete de expresión recombinante se introduce en una célula huésped eucariota mediante el uso de un vector de transfección o transducción. Los vectores adecuados para este fin incluyen, entre otros, vectores de expresión de células de insectos (p. ej., vectores de expresión de baculovirus) o vectores de expresión de mamíferos. Estos vectores se pueden derivar de una variedad de fuentes, tales como episomas, cósmidos, virus,

o combinaciones de los mismos. En muchos casos, estos vectores incluyen marcadores seleccionables para facilitar su incorporación en las células huésped.

En otra realización, un casete de expresión recombinante empleado en la presente invención se construye mediante la modificación de un gen endógeno en las células huésped. El gen endógeno puede codificar una proteína de interés o un componente/modulador de RPD. Muchas porciones en el gen endógeno se pueden modificar para conseguir un efecto de la expresión o la regulación deseada. Por ejemplo, el promotor original de un gen endógeno puede ser reemplazado por un promotor viral para aumentar el nivel de expresión del gen.

Un casete de expresión recombinante puede incorporarse en una célula huésped de diversas formas. Por ejemplo, un casete de expresión recombinante se puede integrar en un cromosoma o en el genoma de una célula huésped. Un casete de expresión recombinante también puede ser transportado por un vector de expresión no integrado en una célula huésped. Los procedimientos de introducción de manera estable o transitoria de un vector o casete de expresión en una célula huésped son conocidos en la técnica. En un ejemplo, el vector o casete de expresión se incorpora en un cromosoma de la célula huésped mediante integración dirigida. Procedimientos adecuados para este fin incluyen, entre otros, el sistema de recombinación Cre-lox y los descritos en las patentes de Estados Unidos n.º 6.656.727, 6.537.542 y 6.541.231.

En muchas realizaciones, una célula modificada por ingeniería genética de la presente invención incluye (1) un primer casete de expresión recombinante que codifica una proteína de interés y (2) un segundo casete de expresión recombinante que codifica un componente/modulador de RPD (p. ej., XBP1 o ATF6). La relación entre el número total del primer casete de expresión recombinante y el número total del segundo casete de expresión recombinante en la célula puede variar, por ejemplo, entre no más de 0,1:1 a al menos 10:1. Los ejemplos no limitantes de relaciones adecuadas incluyen de 0,2:1 a 5:1, de 0,5:1 a 5:1, de 1:1 a 2:1, de 1:1 a 3:1, de 1:1 a 4:1, de 1:1 a 5:1, de

2:1 a 3:1, de 2:1 a 4:1 y de 2:1 a 5:1. El primer y el segundo casetes de expresión recombinantes pueden ser transportados por vectores idénticos o por diferentes vectores y estimulados por los mismos promotores o diferentes promotores que tienen fuerzas idénticas o diferentes fuerzas. En un ejemplo, el promotor en el primer casete de expresión recombinante tiene la misma fuerza o una similar fuerza que el del segundo casete de expresión recombinante, y la relación del número total del primer casete recombinante con respecto al número total del segundo casete recombinante en la célula es al menos 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 o más.

Las células huésped adecuadas para la presente invención incluyen células animales o vegetales. Las células huésped pueden ser células cultivadas, tales como estirpes celulares o cultivos primarios. También pueden ser células de animales o vegetales transgénicos. La selección de células huésped adecuadas y los procedimientos para el cultivo, transfección/transducción, amplificación, selección, producción de producto y purificación son conocidos en la técnica.

En una realización, las células huésped empleadas en la presente invención son células de mamífero. Los ejemplos de células de mamífero adecuados incluyen, entre otros, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células COS, células 293, células CV-1, y otras estirpes celulares de mamífero recogidas por la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Virginia). En ciertos casos, es deseable producir proteínas terapéuticas o profilácticas en células humanas, que proporcionan a menudo modificaciones post-traduccionales deseadas en las proteínas expresadas.

Las células huésped empleadas en la presente invención también pueden ser células híbridas creadas a través de la fusión de dos o más células. En muchos casos, una célula híbrida empleada en la presente invención se genera mediante la fusión de una célula animal (p. ej., una célula de mamífero) y una célula cancerosa/inmortal (p. ej., una célula de mieloma o blastoma). La célula animal y la célula cancerosa/inmortal se pueden derivar de la misma especie. También se pueden derivar de diferentes especies. Cualquier procedimiento conocido en la técnica puede

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ser utilizado para producir células híbridas. Estos procedimientos incluyen, entre otros, electrofusión o fusión química

(p. ej., fusión de polietilenglicol).

Un casete de expresión recombinante puede ser introducido o incorporado en el interior de una célula híbrida antes

o después del evento de fusión. Por ejemplo, un casete de expresión recombinante que codifica una proteína de interés puede ser incorporado en una célula de mamífero antes de que la célula se fusione con una célula cancerosa que expresa un componente o modulador de RPD exógeno. Para otro ejemplo, una célula de mamífero se puede transfectar o transducir en primer lugar con un vector o vectores de expresión recombinantes que codifican una proteína de interés y un componente o modulador de RPD, y luego se fusiona con una célula cancerosa. Otros procedimientos también pueden usarse para preparar células híbridas de la presente invención.

En muchas realizaciones, las células cancerosas/inmortales utilizadas para la preparación de células híbridas son sensibles a uno o más agentes selectivos. Por ejemplo, las células cancerosas/inmortales pueden ser sensibles a un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina, que se conoce como “medio HAT.” Estas células sensibles a HAT se fusionan a células insensibles a medio HAT. Las células híbridas producidas de este modo se seleccionan contra HAT, que mata las células no fusionadas. Las células fusionadas se identifican sistemáticamente por las características deseadas.

La presente invención también presenta animales o plantas que comprenden una célula huésped eucariota de la presente invención. Los procedimientos de incorporación de una célula recombinante en un animal o una planta son muy conocidos en la técnica. En muchas realizaciones, los animales o plantas son animales o plantas transgénicos que incluyen uno o más transgenes que codifican una proteína de interés y un componente/modulador de RPD. Los animales o plantas transgénicos se pueden preparar mediante el uso de técnicas convencionales. En una realización, los animales transgénicos son animales no humanos.

La presente invención presenta además cultivos celulares animales o vegetales que son transfectados o transducidos con uno o más vectores de expresión que codifican (1) una proteína de interés y (2) un componente/modulador de RPD. Los cultivos celulares pueden ser cultivos de células de mamífero, cultivos de células de insectos, cultivos de células vegetales u otros cultivos adecuados para la producción de proteínas de interés. El vector o vectores de expresión se pueden transfectar o transducir de forma transitoria o estable. En una realización, el vector o vectores de expresión empleados comprenden un primer casete de expresión recombinante que codifica una proteína de interés y un segundo casete de expresión recombinante que codifica un componente/modulador de RPD (por ejemplo, XBP1 o ATF6). Los primeros y segundos casetes de expresión pueden ser transportados por los mismos vectores o diferentes vectores. Pueden ser estimulados por los mismos promotores o diferentes promotores. La relación molar entre el primer casete de expresión recombinante y el segundo casete de expresión recombinante puede oscilar, por ejemplo, entre no más de 0,1:1 a al menos 10:1.

En un ejemplo, el promotor empleado por el primer casete recombinante tiene la misma fuerza o una similar fuerza que el promotor empleado por el segundo casete recombinante, y la relación molar entre el primer casete recombinante y el segundo casete recombinante en el cultivo celular oscila de 0,5:1 a 10:1, tal como al menos 1:1,

2:1.: 3:1, 4:1, 5:1 o más.

D.: Composiciones farmacéuticas

Una proteína terapéutica o profiláctica producida por la presente invención se puede utilizar para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente o animal en necesidad del mismo. Una composición farmacéutica de la presente divulgación incluye normalmente una cantidad eficaz de una proteína terapéutica o profiláctica y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen disolventes, solubilizantes, materiales de relleno, estabilizantes, aglutinantes, absorbentes, bases, agentes tamponantes, lubricantes, vehículos de liberación controlada, diluyentes, agentes emulsionantes, humectantes, lubricantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos o antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Los agentes suplementarios también se pueden incorporar en la composición.

Una composición farmacéutica de la presente divulgación puede formularse para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, por inhalación, transdérmica, rectal, transmucosal, tópica y sistémica. En un ejemplo, la administración se lleva a cabo mediante un implante.

Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina; propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfato de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o

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viales de múltiples dosis fabricados de vidrio o plástico.

Una composición farmacéutica de la presente divulgación se puede administrar a un paciente o animal en una dosificación deseada. Una dosificación adecuada puede oscilar, por ejemplo, de 5 mg a 100 mg, de 15 mg a 85 mg, de 30 mg a 70 mg o de 40 mg a 60 mg. Las dosificaciones inferiores a 5 mg o superiores a 100 mg también se pueden utilizar. La composición farmacéutica se puede administrar en una dosis o dosis múltiples. Las dosis pueden administrarse a intervalos tal como una vez al día, una vez por semana o una vez al mes.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de una proteína terapéutica pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o modelos de animales experimentales. Por ejemplo, se pueden determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación de DL50/DE50. En muchos casos, se seleccionan proteínas terapéuticas que exhiben grandes índices terapéuticos.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones para su uso en seres humanos. En una realización, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo que exhibe eficacia terapéutica en al menos 50 % de la población con escasa o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.

El régimen de dosificación para la administración de una proteína terapéutica producida por la presente invención puede ser determinada por el médico tratante en base a varios factores tales como la acción de la proteína, el sitio de la patología, la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, el sexo y la dieta, la gravedad de cualquier inflamación, el tiempo de administración y otros factores clínicos. En un ejemplo, la administración sistémica o inyectable se inicia con una dosis que es mínimamente efectiva, y la dosis se aumenta durante un transcurso temporal pre-seleccionado hasta que se observa un efecto positivo. Posteriormente, los aumentos graduales en la dosificación se limitan a niveles que producen un aumento correspondiente en efecto, teniendo en cuenta que puede aparecer cualquier efecto adverso.

El progreso de un tratamiento se puede controlar mediante la evaluación periódica de una progresión de la enfermedad. El progreso puede monitorizarse, por ejemplo, por rayos X, IRM u otras modalidades de formación de imágenes, análisis de líquido sinovial o examen clínico.

Una proteína terapéutica o profiláctica de interés también se puede introducir en un humano o animal mediante el uso de un vector de administración de genes. Los vectores adecuados para este fin incluyen, entre otros, vectores virales tales como vectores de retrovirus, lentiviral, adenoviral, viral adenoasociado (AAV), herpes viral, alfavirus, astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus o togavirus. Los vectores de expresión encapsulados en liposomas también se pueden utilizar para la administración génica. En muchas realizaciones, el vector de administración de genes codifica tanto la proteína de interés como un modulador de RPD. La co-expresión del modulador de RPD potencia la producción de la proteína de interés en las células objetivo (p. ej., células tumorales u otras células disfuncionales). La proteína de interés y el modulador de RPD también se pueden administrar a las células objetivo mediante el uso de diferentes vectores. La administración de genes puede llevarse a cabo in vivo o ex vivo.

En una realización, se emplean procedimientos de administración de genes específicos de células para la introducción de una proteína terapéutica/profiláctica de interés o un modulador de RPD en las células objetivo. Muchos procedimientos de administración de genes específicos de células conocidos en la técnica se pueden usar para la presente invención. Por ejemplo, un ligando específico de célula (p. ej., un anticuerpo específico a un antígeno de superficie de la célula objetivo) se puede incorporar o conjugar en la envoltura de un vector viral que codifica una proteína terapéutica/profiláctica o un modulador de RPD. Este ligando puede mediar la entrada del vector viral en un tipo celular específico. Los liposomas conjugados con anticuerpo también se pueden utilizar para la administración de vectores de terapia génica a células objetivo específicas.

Queda entendido que las realizaciones descritas anteriormente y los siguientes ejemplos se dan a modo de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del ámbito de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la presente descripción.

E. Ejemplos

Ejemplo 1. Estirpes celulares COS-1 y DUKX

Las células COS-1 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (CACT), Manassas, VA, con el número CACT CRL-1650. Las células CHO DUKX y las células PA DUKX se derivaron de CHO-K1 (número CACT CCL-61), que es un derivado de células de ovario de hámster chino (CHO).

Las células CHO DUXK, que también se refieren como células DUXK B11 o DXB11, son deficientes en la producción de la dihidrofolato reductasa (dhfr), una enzima crítica en el proceso de replicación del ADN. Para

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Las monocapas DUKX dependientes de SFB no adaptadas se pueden utilizar para la transfección de vectores de expresión. Una vez que se logra la expresión de un gen heterólogo y dhfr, cada nueva estirpe celular puede ser adaptada a un crecimiento en suspensión libre de SFB. El periodo de adaptación después de la transfección utilizando células de la monocapa es a menudo largo. Las células DUKX “pre-adaptadas” también se pueden utilizar como células huésped para la transfección. Estas células PA DUKX ofrecen a menudo ventajas desde una perspectiva de tiempo y esfuerzo, ya que el periodo de readaptación al cultivo en suspensión libre después de la transfección suele ser más corto. Véase Sinacore, y col., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 52:518-528 (1996).

Ejemplo 2. Inducción de estrés del RE por la sobreexpresión de BMP6 en células PA DUKX

El vector pSMED2/XBP1 y pSMED2/BMP6 (+) o pSMED2 vacío (-) se co-transfectaron en células PA DUKX. Los vectores de expresión pSMED2/XBP1 y pSMED2/BMP6 codifican XBP1 y BMP6, respectivamente. Ambos vectores son estimulados por un promotor CMV. Las transfecciones se llevaron a cabo en placas de 6 pocillos usando Fugene6 (Roche, Indianápolis, IN). El medio de crecimiento para las células fue el medio Alfa (Gibco) suplementado con nucleósidos y SFB al 10 % (inactivado por calor y dializado) y penicilina/estreptomicina/glutamina (Gibco).

Las células se lisaron en tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) con la adición de NaCl 400 mM y 1 Complete Mini (un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa de Roche, Indianápolis, IN). Los lisados se recogieron a los 7, 24, 31 y 48 h después de la transfección y se ejecutaron en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western (Figura 1). El análisis de membrana Western se realizó usando un tampón de bloqueo de leche en polvo sin grasa al 4 %, ASB al 1 % y Tween 20 al 0,1 % en TFS, y un tampón de lavado de 0,1 % de Tween 20 en TFS. Los anticuerpos se diluyeron en el tampón de bloqueo. La titulación para Western fue anti-XBP1 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology) seguido de anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante 1:5000 (The Jackson Laboratory). La Figura 1 indica que la sobreexpresión de BMP6 en células PA DUKX causó estrés del RE, tal como se mide por el aumento de la proteína XBP1p (aproximadamente 54 kD).

Ejemplo 3. Estirpes celulares transfectadas de manera estable con XBP1

El vector pSMED2/XBP1 se transfectó en células CHO DUKX para crear estirpes celulares estables. El gen DFHR en el vector pSMED2 permite la resistencia a metotrexato (MTX). Las células transfectadas se sembraron en placas en concentraciones de MTX 5, 10, o 20 nM. Se aislaron tres colonias de MTX 5 nM (5-2, 5-4, 5-5), una colonia 10 nM (10-3), y una colonia 20 nM (20-10). Las células de cada colonia se trataron con (+) o sin (-) tunacimicina (Tu), una sustancia química conocida por causar estrés del RE. Los lisados se ejecutaron en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western (Figura 2) utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti-Xbp1 (Santa Cruz Biotechnology). La Figura 2 demuestra que se produjo una XBP1 más madura en estirpes celulares estables cuando las células se estresaron por medio del tratamiento con Tu.

pSMED2/BMP6 se transfectó de manera transitoria a estirpes celulares estables XBP1 (5-2,5-4, y 20-10) y parentales (CHO DUKX). Los medios acondicionados recogidos 48 h después de la transfección se ejecutaron en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western. La membrana Western (Figura 3) se sondó con un anticuerpo monoclonal anti-BMP5 de ratón (1:2000), que reacciona de forma cruzada fuertemente con BMP6. El anticuerpo secundario fue un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5000) (The Jackson Laboratory). Cada carril en la Figura 3 representa un experimento separado para una estirpe celular respectiva. Como se demuestra en la Figura 3, se secretó más BMP6 en estirpes celulares estables XBP1 seleccionadas con MTX 5 nM y 10 nM que en las células parentales.

pSMED2/IL11RFc, que codifica una proteína IL11RFc, también se transfectó transitoriamente en estirpes celulares estables XBP1y parentales. Los medios acondicionados recogidos 48 h después de la transfección se ejecutaron en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western. Las membranas Western (Figura 4) se sondaron con anticuerpo Fc anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (The Jackson Laboratory). Se secretó más IL11RFc en la mayoría de estirpes celulares XBP1 seleccionadas con MTX 5 nM que en las células CHO DUKX.

Ejemplo 4. Comparación de la transfección, eficiencias transcripcionales y traduccionales entre estirpes celulares estables XBP1 y sus células parentales CHO

Las células CHO DUKX 5-2, 20-10 se contaron y cantidades iguales se transfectaron transitoriamente con una construcción que codifica la proteína fluorescente verde (PFV). Las células se visualizaron en un aumento 10 x 10 y la eficiencia de la transfección (% de células que expresan PFV) se determinó comparando las células fluorescentes PFV con respecto a las células totales en tres campos visuales por estirpe celular. El resultado de la comparación indica que la eficiencia de la transfección de PFV es similar en todas las estirpes celulares XBP1 y CHO DUKX ensayadas (Figura 5).

En un experimento adicional, las construcciones que codifican (+) o no codifican (-) PFV se transfectaron transitoriamente en estirpes celulares estables XBP1 y parentales. El lisado celular recogido 48 h después de la transfección se llevó a cabo en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western (Figura 6). Cada carril de la Figura 6 representa un experimento separado. La membrana Western se sondó con un anticuerpo

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policlonal de conejo anti-PFV y anticuerpo monoclonal de ratón anti-actina para el control de carga. Como se ha demostrado en la Figura 6, la suma de las eficiencias de transcripción y traducción para PFV es similar en todas las estirpes celulares investigadas.

Ejemplo 5. Células transfectadas transitoriamente con ATF6

El ADNc etiquetado con Flag del dominio soluble activo de ATF6 se clonó en un vector de expresión inducible Tet/off ptTATOP6 y se transfectó transitoriamente en células COS-1. El vector ptTATOP6 incluye un promotor inducible que controla la expresión de la proteína de fusión que comprende ATF6 y la etiqueta Flag. El lisado celular recogido a las 18, 48 y 60 h después de la transfección se llevó a cabo en un gel de tricina al 10 %, seguido por análisis de membrana Western. La membrana Western (Figura 7) se sondó con un anticuerpo anti-Flag. “V” indica un vector ptTATOP6 vacío, y “P” representa un control positivo de flag. Como se ilustra en la Figura 7, la proteína ATF6 se expresó con éxito en células COS-1 en ausencia de doxiciclina.

Ejemplo 6. La co-expresión de los genes objetivo con XBP1 o ATF6 en relaciones adecuadas potencia la secreción de los genes objetivo en células HEK293

HEK293-FT y HEK293-EBNA se cultivaron y mantuvieron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 37 ºC en medio 293 estilo libre (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero fetal bovino al 5 %.

La expresión transitoria se realizó en centrifugadoras de 50 ml o placas de 24 pocillos, o centrifugadoras de 1 l. Para el volumen de cultivo de 50 ml (o 1 l), se mezclaron 25 µg (o 0,5 mg para 1 l) de ADN plásmido con 400 µg (8 mg para 1 l) de polietilenimina (PEI, 25 kDa, lineal, neutralizada a pH 7,0 por HCl, 1 mg/ml, Polysciences, Warrington, PA) en 2,5 ml (50 ml para 1 l) de medio 293 libre de suero. Las centrifugadoras se incubaron a 37 ºC con una velocidad de rotación de 170 rpm en un agitador P2005 (Bellco) durante 72-144 horas antes de la recogida. Para un formato de placa de 24 pocillos, se mezcló 1 µg de ADN con 8 µg de PEI en 0,5 ml de medio 293 libre de suero. A continuación, las mezclas se mezclaron con 0,5 ml de células HEK293 en medio 293 con SFB al 10 % en la densidad celular de 0,5 x 106 células/ml. Las placas se incubaron a 37 ºC en un agitador orbital (BellCo) con una velocidad de rotación de 300 rpm durante 72 horas antes de la recogida.

pSMED2 y pSMEDA se utilizaron para la construcción de ADN. La proteína 1 relacionada con la familia frizzled secretada y etiquetada con His6 en el extremo C-terminal (sFRP-1) y agrecanasa-2 etiquetada con Flag en el extremo C-terminal (Agg-2) se subclonaron en pSMEDA. El receptor tipo 2 de tirosina quinasa neurotrófico etiquetado con His6 en el extremo C-terminal (TrkB) se subclonó en pSMED2. Estos genes subclonados no tenían ningún dominio transmembranal o citoplásmico, permitiendo de este modo la secreción de los productos expresados.

Prop1 y Prop34-LBD etiquetados con His6 en el extremo C-terminal se subclonaron en pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Prop1 y Prop34-LBD se derivaron de la proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP5) con deleción de los dominios transmembranales y citoplásmicos. Las secuencias de aminoácidos de Prop1 y Prop34-LBD se representan en SEQ ID NOs:10 y 11, respectivamente. SEQ ID NO:10 incluye una etiqueta His6 en los aminoácidos 342-347 y una etiqueta Flag en los aminoácidos 348-356. SEQ ID NO:11 incluye una etiqueta His6 en los aminoácidos 795-800 y una etiqueta V5 en los aminoácidos 778-794.

1 µg de Prop1-his6-Flag en pcDNA3.1 se co-transfectó con 0,3 µg (1:3) o 1 µg (1:1) de XBP1p en un vector pSMED2 en células HEK293T. Tanto pcDNA3.1 como pSMED2 son estimulados por un promotor CMV. Los medios acondicionados se recogieron a las 72 h después de la transfección de ADN. Las muestras se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-His4. Se llevaron a cabo experimentos duplicados (conjunto n.º 1 y conjunto n.º 2). Como se demuestra en la Figura 8A, la co-transfección de XBP1 con Prop1 en las relaciones de 1:1 o 1:3 mejoró drásticamente la expresión de Prop1.

En otro experimento, 1 µg de Prop34-LBD-V5-his6 en pcDNA3.1 se co-transfectó con 0,3 µg (1:3) o 1 µg (1:1) de ATF6 en un vector ptTATOP6 en células HEK293T. Al igual que pSMED2, ptTATOP6 también es estimulado por un promotor CMV. Los medios acondicionados recogidos a las 72 h después de transfección de ADN se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-His4. La Figura 8B muestra que la co-transfección de ATF6 con Prop34-LBD-V5-his6 en la relación de 1:1 o 1:3 potenció significativamente la expresión de Prop34-LBD.

La Figura 9 ilustra los efectos de XBP1p o ATF6 en la expresión de diferentes proteínas objetivo. Prop1-his6-Flag o Prop34-LBD-V5-His6 en pcDNA3.1 se co-transfectaron con XBP1p en un vector pSMED2 o ATF-6 en un vector ptTATOP6 en células HEK293T. Los medios acondicionados recogidos a las 72 h después de la transfección de ADN se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-His4. Las señales se cuantificaron por densitometría como se muestra en la Figura 9. Los resultados indican que XBP1p y ATF-6 tienen diferentes efectos sobre la expresión de Prop1 y Prop34-LBD. Diferentes efectos de potenciación también se observaron para TrkB, sFRP1 y Agg-2 cuando estas proteínas se co-expresaron con XBP1p frente a ATF-6. Por ejemplo, la co-expresión con XBP1p aumentó el rendimiento de TrkB en aproximadamente 5 veces, mientras que solo se observó un aumento de aproximadamente 2 veces cuando TrkB se co-expresó con ATF6.

Claims

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