ES2693232T3 - Agente terapéutico que induce citotoxicidad - Google Patents

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ES2693232T3 ES11845786.0T ES11845786T ES2693232T3 ES 2693232 T3 ES2693232 T3 ES 2693232T3 ES 11845786 T ES11845786 T ES 11845786T ES 2693232 T3 ES2693232 T3 ES 2693232T3
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Takahiro Ishiguro
Atsushi Narita
Akihisa Sakamoto
Yumiko Kawai
Tomoyuki Igawa
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Abstract

Un complejo polipeptídico que comprende: (1) un dominio de unión al antígeno canceroso; (2) uno cualquiera de los dominios Fc de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25 y 26 en el que se muta un aminoácido(s) que forma(n) el dominio Fc, en donde el mutante del dominio Fc ha reducido la actividad de unión al receptor Fcγ por dicha mutación en comparación con el complejo polipeptídico de control que comprende el dominio Fc del mismo isotipo seleccionado de SEQ ID NOs: 23, 24, 25 y 26, y en donde el mutante del dominio Fc ha reducido la actividad de unión a FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, y/o FcγRIIIB; y (3) un dominio de unión a CD3, en donde el dominio de unión a antígeno y el dominio de unión a CD3 son cada uno un Fab monovalente, y en donde (i) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de unión a antígeno está vinculado a uno de los polipéptidos que forman el dominio Fc a través de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab está vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de unión a CD3 está vinculado al otro polipéptido que forma el dominio Fc a través de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab está vinculado a un dominio CL; (ii) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de unión a antígeno está vinculado a uno de los polipéptidos que forman el dominio Fc a través de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab está vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab que forma el dominio de unión a CD3 está vinculado al otro polipéptido que forma el dominio Fc a través de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab está vinculado a un dominio CL; (iii) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de unión a antígeno está vinculado a uno de los polipéptidos que forman el dominio Fc a través de un dominio CH1; el fragmento Fv de cadena ligera del Fab está vinculado a un dominio CL; el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de unión a CD3 está vinculado al otro polipéptido que forma el dominio Fc a través de un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab está vinculado a un dominio CH1; (iv) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de unión a CD3 está vinculado a uno de los polipéptidos que forman el dominio Fc a través de un dominio CH1; el fragmento Fv de cadena ligera del Fab está vinculado a un dominio CL; el fragmento Fv de cadena ligera del Fab que forma el dominio de unión a antígeno está vinculado al otro polipéptido que forma el dominio Fc a través de un dominio CH1; y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab está vinculado a un dominio CL; o (v) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de unión a CD3 está vinculado a uno de los polipéptidos que forman el dominio Fc a través de un dominio CH1; el fragmento Fv de cadena ligera del Fab está vinculado a un dominio CL; el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de unión a antígeno está vinculado al otro polipéptido que forma el dominio Fc a través de un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab está vinculado a un dominio CH1.

Description

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DESCRIPCION
Agente terapeutico que induce citotoxicidad Campo tecnico
La presente invencion se refiere a complejos polipeptfdicos que permiten el tratamiento contra el cancer al tener celulas T cerca de las celulas cancerosas diana y al utilizar la actividad citotoxica de las celulas T contra las celulas cancerosas diana.
La presente invencion tambien se refiere a composiciones farmaceuticas para tratar o prevenir diversos canceres, que contienen un agente terapeutico mencionado anteriormente para inducir citotoxicidad celular como principio activo.
Antecedentes de la tecnica
Hasta la fecha, se han desarrollado multiples anticuerpos terapeuticos que tienen un excelente efecto antitumoral como productos farmaceuticos para tratar el cancer (documento de no patente 1). Estos anticuerpos terapeuticos son conocidos por ejercer su efecto antitumoral en las celulas cancerosas mediante la inhibicion de senales esenciales para el crecimiento de celulas cancerosas, la induccion de senales de muerte celular, la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (CCDA) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (documento de no patente 2). CCDA es una citotoxicidad ejercida por celulas efectoras tales como las celulas NK y macrofagos contra celulas cancerosas diana unidas al anticuerpo cuando la region Fc de un anticuerpo se une a un receptor Fc en las celulas efectoras. Mientras tanto, un complejo de complemento se une al sitio de union del complemento en una estructura de anticuerpo. CDC es la citotoxicidad que se produce cuando un componente del complemento en el complejo forma un poro a traves de la membrana celular de una celula unida al anticuerpo, lo que potencia la entrada de agua o iones en la celula. Aunque los anticuerpos terapeuticos convencionales muestran excelentes actividades, hasta la fecha, la administracion de tales anticuerpos condujo solo a resultados terapeuticos insatisfactorios. Por consiguiente, es deseable desarrollar anticuerpos terapeuticos que ejerzan una mayor actividad de destruccion celular contra el cancer.
Ademas de los anticuerpos mencionados anteriormente que adoptan CCDA como su mecanismo antitumoral reclutando celulas NK o macrofagos como celulas efectoras, los anticuerpos reclutadores de celulas T (anticuerpos TR) que adoptan la citotoxicidad como su mecanismo antitumoral reclutando celulas T como celulas efectoras son conocidos desde la decada de 1980 (documentos de no patente 3 a 5). Un anticuerpo TR es un anticuerpo biespedfico que contiene un anticuerpo contra una cualquiera de las subunidades que forman un complejo receptor de celulas T (CRT) en las celulas T, en particular un anticuerpo que se une a la cadena epsilon CD3, y un anticuerpo que se une a un antigeno en las celulas cancerosas diana. Una celula T se acerca a una celula cancerosa cuando el anticuerpo TR se une a la cadena epsilon CD3 y al antigeno canceroso al mismo tiempo, y esto causa un efecto antitumoral contra la celula cancerosa debido a la actividad citotoxica de la celula T.
Un anticuerpo llamado "anticuerpo trifuncional" tambien se conoce como un anticuerpo TR (documentos de no patente 6 y 7). Un anticuerpo trifuncional es un anticuerpo biespedfico de tipo IgG completo en el que un brazo contiene un Fab que se une a un antigeno canceroso y el otro brazo contiene un Fab que se une a la cadena epsilon CD3. El efecto terapeutico contra la ascitis maligna se ha demostrado mediante la administracion de catumaxomab, que es un anticuerpo trifuncional contra EpCAM, en las cavidades peritoneales de pacientes con ascitis maligna que tienen celulas cancerosas con expresion positiva para EpCAM. El uso de catumaxomab ha sido aprobado en la UE para el tratamiento anterior.
Ademas, recientemente se ha hallado que un anticuerpo TR llamado "acoplador biespedfico de celulas T (BiTE)" exhibe un fuerte efecto antitumoral (documentos de no patente 8 y 9). BiTE es un anticuerpo TR con una forma molecular en la que el scFv de un anticuerpo contra un antfgeno canceroso esta vinculado al scFv de un anticuerpo contra la cadena epsilon CD3 a traves de un enlazador polipeptfdico corto. Se ha notificado que BiTE tiene una actividad antitumoral superior a la de los diversos anticuerpos TR conocidos (documentos de no patente 9 y 10). Espedficamente, en comparacion con otros anticuerpos TR, BiTE ejerce un efecto antitumoral incluso a una concentracion significativamente menor y a una menor relacion de celulas efectoras/celulas cancerosas (relacion ET). Tambien se ha demostrado que el efecto se puede ejercer sin la necesidad de activar celulas efectoras utilizando IL-2, un anticuerpo agonista CD28 o similar por adelantado. Blinatumomab (MT103), que es un BiTE contra CD19, exhibe una actividad citotoxica mucho mas fuerte contra celulas cancerosas in vitro que Rituxan, que es conocido por producir un excelente efecto clmico. Ademas, se ha notificado que blinatumomab muestra un efecto antitumoral extremadamente superior en los ensayos clmicos de fase I y II realizados recientemente (documento de no patente 11).
El hecho de que el catumaxomab se haya aprobado como un agente terapeutico que demuestra el efecto de un farmaco clmico, y que los multiples BiTE, que incluye blinatumomab, ejerzan un fuerte efecto antitumoral, sugiere que los anticuerpos TR que reclutan celulas T como celulas efectoras tienen un potencial significativamente mayor como agente antitumoral en comparacion con los anticuerpos convencionales que utilizan CCDA como su mecanismo de accion.
Sin embargo, se sabe que un anticuerpo trifuncional se une a una celula T y a una celula tal como una celula NK o macrofago al mismo tiempo de manera independiente del antigeno canceroso y, como resultado, los receptores expresados en las celulas se reticulan y la expresion de diversas citoquinas se induce de manera independiente del antigeno canceroso. Se piensa que la administracion sistemica de un anticuerpo trifuncional causa efectos 5 secundarios similares a las tormentas de citoquinas como resultado de tal induccion de la expresion de citoquinas. De hecho, se ha notificado que, en el ensayo clmico de fase I, una dosis muy baja de 5 pg/cuerpo fue la dosis de tolerancia maxima para la administracion sistemica de catumaxomab a pacientes con cancer de pulmon de celulas no pequenas, y que la administracion de una dosis mas alta causa varios efectos secundarios graves (documento de no patente 12). Cuando se administra en una dosis tan baja, catumaxomab nunca puede alcanzar el nivel en sangre 10 efectivo. Es decir, el efecto antitumoral esperado no se puede lograr administrando catumaxomab a una dosis tan baja.
Mientras tanto, a diferencia del catumaxomab, BiTE no tiene un sitio de union al receptor Fcy y, por lo tanto, no reticula los receptores expresados en celulas T y en celulas tales como las celulas NK y macrofagos de una manera dependiente del antigeno canceroso. Por consiguiente, se ha demostrado que BiTE no causa la induccion de 15 citoquinas independiente del antigeno canceroso que se observa cuando se administra catumaxomab. Sin embargo, dado que BiTE es una molecula de anticuerpo modificada de bajo peso molecular sin una region Fc, el problema es que su semivida en sangre despues de la administracion a un paciente es significativamente mas corta que los anticuerpos de tipo IgG utilizados convencionalmente como anticuerpos terapeuticos. De hecho, se ha notificado que la semivida en sangre de BiTE administrado in vivo es de aproximadamente varias horas (Documentos de no 20 patente 13 y 14). En los ensayos clmicos de blinatumomab, se administra mediante infusion intravenosa continua utilizando una minibomba. Este metodo de administracion no solo es extremadamente inconveniente para los pacientes, sino que tambien tiene el riesgo potencial de accidentes medicos debido a un mal funcionamiento del dispositivo o similar. En consecuencia, no se puede decir que tal metodo de administracion sea deseable.
El documento de no patente 15 describe modificaciones clave en el desarrollo de anticuerpos biespedficos que 25 pueden mejorar su eficacia y estabilidad.
El documento de no patente 16 describe la induccion de la inmunidad antitumoral en anticuerpos trifuncionales en pacientes con carcinomatosis peritoneal.
El documento de patente 1 describe regiones constantes de anticuerpo mejoradas.
Documentos de la tecnica anterior
30 [Documentos de no patente]
[Documento de no patente 1] Clin Cancer Res. (2010) 16 (1), 11-20 [Documento de no patente 2] Drug Des Devel Ther (2009) 3, 7-16 [Documento de no patente 3] Nature (1985) 314 (6012), 628-31 [Documento de no patente 4] Int J Cancer (1988) 41 (4), 609-15 35 [Documento de no patente 5] Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83 (5), 1453-7 [Documento de no patente 6] Cancer Treat Rev. (2010) 36 (6), 458-67 [Documento de no patente 7] Expert Opin Biol Ther (2010) 10 (8), 1259-69 [Documento de no patente 8] Proc Natl Acad Sci USA. (1995) 92 (15), 7021-5 [Documento de no patente 9] Drug Discov Today (2005), 10 (18), 1237-44 40 [Documento de no patente 10] Trends Biotechnol (2004) 22 (5), 238-44 [Documento de no patente 11] Science (2008), 321 (5891), 974-7 [Documento de no patente 12] Cancer Immunol Immunother (2007) 56 (10), 1637-44 [Documento de no patente 13] Cancer Immunol Immunother. (2006) 55 (5), 503-14 [Documento de no patente 14] Cancer Immunol Immunother. (2009) 58 (1), 95-109 45 [Documento de no patente 15] Curr Opin Mol Ther (2010) 12(3), 340-349
[Documento de no patente 16] J Exp & Clin Cancer Res (2009), 28(18), 1-10 [Documento de patente]
[Documento de patente 1] WO 2009/041613
Compendio de la invencion
50 [Problemas a resolver por la invencion]
La presente invencion se logro en vista de las circunstancias anteriores. Un objetivo de la presente invencion es proporcionar complejos polipeptfdicos que permitan el tratamiento contra el cancer al tener celulas T cerca de las celulas cancerosas dianas y al utilizar la citotoxicidad de las celulas T contra las celulas cancerosas diana. Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar composiciones farmaceuticas para su uso en el tratamiento o 55 prevencion de diversos canceres, que comprenden un agente terapeutico mencionado anteriormente para inducir citotoxicidad celular como principio activo.
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[Medios para resolver los problemas]
Los presentes inventores descubrieron nuevos complejos polipeptidicos que retienen la fuerte actividad antitumoral que posee BiTE y tienen una larga semivida en sangre, asf como excelentes propiedades de seguridad que no provocan la induccion de una tormenta de citoquinas independiente del antigeno canceroso o similares. Los presentes inventores tambien descubrieron que los complejos polipeptidicos pueden danar varias celulas diana cuando los dominios de union a antigeno de los complejos polipeptfdicos estan sustituidos. Basandose en los hallazgos anteriores, los presentes inventores demostraron que los complejos polipeptfdicos de la presente invencion danan las celulas cancerosas. Los presentes inventores tambien revelaron que se logra una citotoxicidad celular mas eficiente mediante la regulacion de la asociacion de la interfaz CH1/CL y la introduccion de "botones en ojales" (KiH, por sus siglas en ingles) en los complejos polipeptfdicos. Ademas, los presentes inventores demostraron que se pueden tratar o prevenir diversos canceres utilizando agentes terapeuticos para inducir la citotoxicidad celular que comprende un complejo polipeptfdico de la presente invencion como principio activo.
Mas espedficamente, la presente invencion proporciona lo siguiente:
[1] un complejo polipeptfdico que comprende:
(1) un dominio de union al antfgeno canceroso;
(2) uno cualquiera de los dominios Fc de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25 y 26 en el que se muta un aminoacido que forma el dominio Fc, en donde el mutante del dominio Fc ha reducido la actividad de union al receptor Fcy por dicha mutacion en comparacion con el complejo polipeptfdico de control que comprende el dominio Fc del mismo isotipo seleccionado entre SEQ ID NOs: 23, 24, 25 y 26, y en donde el mutante del dominio Fc ha reducido la actividad de union a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA, y/o FcyRIIIB; y
(3) un dominio de union a CD3,
en donde el dominio de union a antfgeno y el dominio de union a CD3 son cada uno un Fab monovalente, y en donde
(i) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL;
(ii) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab esta vinculado a un dominio CL;
(iii) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CH1;
(iv) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab esta vinculado a un dominio CL;
o
(v) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CH1.
[2] el complejo polipeptfdico de [1], en donde el dominio Fc comprende uno cualquiera de los aminoacidos siguientes:
la secuencia de aminoacido de posiciones 118 a 260 (numeracion UE) es la secuencia descrita en SEQ ID NO: 24; o la secuencia de aminoacido de posiciones 261 a 447 (numeracion UE) es la secuencia descrita en SEQ ID NO: 26;
[3] el complejo polipeptfdico de [1], en donde el dominio Fc comprende una mutacion en los aminoacidos de SEQ ID NO: 23 que forman el dominio Fc y en donde los aminoacidos que forman el dominio Fc comprenden una mutacion en una cualquiera de las siguientes posiciones:
220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331 y 332 (numeracion UE);
[4] el complejo polipeptfdico de [3], i) en donde el dominio Fc esta en el dominio Fc que comprende una sustitucion del aminoacido en la posicion 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330 o 331 (numeracion UE) con el aminoacido en una posicion correspondiente (numeracion UE) en IgG2 o IgG4 correspondiente; o
ii) en donde el dominio Fc comprende una mutacion de aminoacidos en la posicion 234, 235, y/o 297 (numeracion UE); y los aminoacidos en la posicion 234, 235, y/o 297 son sustituidos con alanina:
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[5] el complejo polipeptfdico de uno cualquiera de [2] a [4], en donde las secuencias de dos polipeptidos que forman el dominio Fc son diferentes entre sf, y en donde el aminoacido en la posicion 349 es sustituido con cistema y el aminoacido en la posicion 366 (numeracion UE) es sustituido con triptofano entre los residuos de aminoacido de uno de los dos polipeptidos que forman el dominio Fc; y en donde el aminoacido en la posicion 356 es sustituido con cistema, el aminoacido en la posicion 366 es sustituido con serina, el aminoacido en la posicion 368 es sustituido con alanina, y el aminoacido en la posicion 407 (numeracion UE) es sustituido con valina entre los residuos de aminoacidos del otro polipeptido;
[6] el complejo polipeptfdico de uno cualquiera de [2] a [4], en donde las secuencias de dos polipeptidos que forman el dominio Fc son diferentes entre sf, y en donde el aminoacido en la posicion 356 (numeracion UE) es sustituido con lisina entre los residuos de aminoacido de uno de los dos polipeptidos que forman el dominio Fc; el aminoacido en la posicion 439 (numeracion UE) es sustituido con acido glutamico en el otro polipeptido, y el aminoacido en la posicion 435 (numeracion UE) es sustituido con arginina entre los residuos de aminoacidos de cualquiera de los dos polipeptidos;
[7] el complejo polipeptfdico de [5] o [6], en donde la secuencia GK es delecionada de los extremos carboxiterminales de dos polipeptidos que forman el dominio Fc;
[8] un agente terapeutico para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer que comprende como principio activo el complejo polipeptfdico de uno cualquiera de [1] a [7]; y en particular en donde el cancer es cancer hepatico
0 cancer de pulmon.
[Efectos de la invencion]
La presente invencion proporciona nuevos complejos polipeptfdicos que retienen la fuerte actividad antitumoral de BiTE y que tienen una larga semivida en sangre, asf como excelentes propiedades de seguridad que no provocan la induccion de una tormenta de citoquinas independiente del antigeno canceroso. Cuando se sustituye el dominio de union a antigeno de un complejo polipeptfdico de la presente invencion, los agentes terapeuticos que comprenden el complejo polipeptfdico como principio activo para inducir citotoxicidad celular pueden dirigirse y danar varias celulas, incluidas las celulas cancerosas. Por consiguiente, varios canceres pueden ser tratados o prevenidos. Esto permite tratamientos deseables que son altamente seguros y convenientes, y reducen la carga ffsica para los pacientes.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de ERY1 GPC3 (BiTE GPC3), ERY2 GPC3 y un anticuerpo anti-GPC3 de tipo IgG. El cuadrado cerrado (■), el triangulo cerrado (▲) y el cuadrado abierto (□) representan las actividades citotoxicas de ERY1 GPC3 (BiTE GPC3), ERY2 GPC3, el anticuerpo anti- GPC3 de tipo IgG, respectivamente.
La Fig. 2 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de BiTE GPC3 y ERY5 GPC3. El cuadrado cerrado (■) y el cfrculo abierto (o) representan las actividades citotoxicas de BiTE GPC3 y ERY5 GPC3, respectivamente.
La Fig. 3 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de BiTE GPC3 y ERY6 GPC3. El cuadrado cerrado (■) y el triangulo cerrado (▲) representan las actividades citotoxicas de BiTE GPC3 y ERY6 GPC3, respectivamente.
La Fig. 4 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de BiTE GPC3 y ERY7 GPC3. El cuadrado cerrado (■) y el diamante cerrado (♦) representan las actividades citotoxicas de BiTE GPC3 y ERY7 GPC3, respectivamente.
La Fig. 5 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de BiTE GPC3, ERY8-2 GPC3, ERY9-1 GPC3 y ERYl0-1 GPC3. El cuadrado cerrado (■), el triangulo cerrado (▲), el cfrculo abierto (o) y el cuadrado abierto (□) representan las actividades citotoxicas de BiTE GPC3, ERY8-2 GpC3, ERY9-1 GPC3 y eRy10-
1 GPC3, respectivamente.
La Fig. 6 es un grafico que muestra el efecto antitumoral in vivo de ERY8-2 GPC3 en el modelo de premezcla PC- 10. El cuadrado abierto (□) y el diamante cerrado (♦) indican cambios en el volumen tumoral del grupo de administracion ERY7 GPC3 y del grupo de control (administracion de TFS), respectivamente.
La Fig. 7 es un grafico que muestra el efecto antitumoral in vivo de ERY10-1 GPC3 en el modelo de pre-mezcla PC- 10. El cuadrado abierto (□) y el diamante cerrado (♦) indican cambios en el volumen tumoral del grupo de administracion ERY10-1 GPC3 y del grupo de control (administracion de TFS), respectivamente.
La Fig. 8 es un grafico que muestra el efecto antitumoral in vivo de ERY10-1 GPC3 en el modelo de transferencia de celulas T PC-10. El cuadrado abierto (□) y el diamante cerrado (♦) indican cambios en el volumen tumoral del grupo de administracion ERY10-1 GPC3 y del grupo de control (administracion de TFS), respectivamente.
La Fig. 9 es un grafico que muestra el curso temporal de las concentraciones plasmaticas de ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 determinadas utilizando celulas Ba/F3 que expresan GPC3. El diamante cerrado (♦) y el cuadrado
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abierto (□) indican el curso temporal de la concentracion plasmatica para ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3, respectivamente.
La Fig. 10 es un grafico que muestra el curso temporal de las concentraciones plasmaticas de ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 determinadas utilizando celulas Ba/F3 que expresan CD3. El diamante cerrado (♦) y el cuadrado abierto (□) indican el curso temporal de la concentracion plasmatica para ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3, respectivamente.
La Fig. 11 es un grafico que muestra la evaluacion de BiTE GPC3, ERY9-1 GPC3, ERY10-1 GPC3, ERY15-1 GPC3 y catumaxomab por su capacidad para inducir citoquinas de manera independiente del anffgeno canceroso.
La Fig. 12 es un grafico que muestra las citotoxicidades in vitro de ERY18 L1 GPC3, ERY18L2 GPC3, ERY18L3 GPC3, ERY18L4 GPC3 y ERY18S1 GPC3. El triangulo cerrado (▲), el cffculo cerrado (•), el cuadrado cerrado (■), el cuadrado abierto (□), y el diamante abierto (0) representan las actividades citotoxicas de ERY18 L1 GPC3, ERY18 L2 GPC3, ERY18 L3 GPC3, ERY18 L4 GPC3, y ERY18 S1 GPC3, respectivamente.
La Fig. 13 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas in vitro de ERY18 L3 GPC3 y ERY10-1 GPC3. El cuadrado cerrado (■) y el cuadrado abierto (□) representan las actividades citotoxicas de ERY18 L3 GPC3 y ERY10-1 GPC3, respectivamente.
La Fig. 14 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas in vitro de ERY19-3 GPC3 y BiTE GPC3. El cuadrado abierto (□) y el cuadrado cerrado (■) representan las actividades citotoxicas de ERY19-3 GPC3 y BiTE GPC3, respectivamente.
La Fig. 15A es un cromatograma que muestra los resultados del analisis por cromatograffa de exclusion por tamanos de CM en el que se expreso NTA1L/NTA1R/GC33-k0. La Fig. 15B es un cromatograma que muestra los resultados del analisis por cromatograffa de exclusion por tamanos de CM en el que se expreso NTA2L/NTA2R/GC33-k0.
La Fig. 16 muestra diagramas que representan dominios que forman los siguientes complejos polipepffdicos descritos en los Ejemplos en esta memoria: BiTE GPC3, ErY2 GPC3, ERY5 GPC3, ERY6 GpC3, ErY7 GPC3, ERY8-2 GPC3, ERY9-1 GPC3, ERY10-1 GPC3, ERY15 GPC3, ERY18 GPC3 y ERY19-3 GPC3. El dominio con lmeas cruzadas representa la region variable de la cadena P del anticuerpo anffgeno anti-canceffgeno (GPC3, EpCAM, EGFR); el dominio con lmeas diagonales representa la region variable de la cadena L del anticuerpo de anffgeno anti-canceffgeno (GPC3, EpCAM, EGFR); el dominio con lmeas de puntos representa la region variable de la cadena P del anticuerpo anti-CD3; el dominio cerrado representa la region variable de la cadena L del anticuerpo anti-CD3; el dominio abierto representa la region constante del anticuerpo; la cruz representa una mutacion silenciosa de Fc; y la estrella representa una mutacion que promueve la asociacion de Fc heteromerica.
La Fig. 17 muestra diagramas de BiTE GPC3 (A); ERY 10 GPC3 (B); ERY2 GPC3 (C); ERY5 GPC3 (D); ERY6 GPC3 (E); ERY7 GPC3 (F); ERY8-2 GPC3 (G); ERY9-1 GPC3 (H); ERY10-1 GPC3 (I); ERY15 GPC3 (J); ERY18 GPC3 (K); y ERY19-3 GPC3 (L).
La Fig. 18 muestra los residuos de aminoacidos que forman los dominios Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 y su numeracion de la UE de Kabat (en esta memoria, tambien denominado 'INDICE DE LA UE").
La Fig. 19 muestra diagramas que representan dominios que forman los siguientes complejos polipepffdicos descritos en los Ejemplos de esta memoria: ERY17-2 GPC3, ERY17-3 GPC3, ERY17-2 EpCAM y ERY17-3 EpCAM. El dominio con lmeas cruzadas representa la region variable de la cadena P del anticuerpo de anffgeno anti- canceffgeno (GPC3, EpCAM, EGFR); el dominio con lmeas diagonales representa la region variable de la cadena L del anticuerpo de anffgeno anti-canceffgeno (GPC3, EpCAM, EGFR); el dominio con lmeas de puntos representa la region variable de la cadena P del anticuerpo anti-CD3; el dominio cerrado representa la region variable de la cadena L del anticuerpo anti-CD3; el dominio abierto representa la region constante del anticuerpo; la cruz representa una mutacion silenciosa de Fc; y la estrella representa una mutacion que promueve la asociacion de Fc heteromerica.
La Fig. 20 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de BiTE GPC3, ERY17-2 GPC3, ERY17-3 GPC3 y ERY10-1 GPC3. El cuadrado cerrado (■), el triangulo cerrado (▲), el cffculo abierto (o) y el cuadrado abierto (□) representan las actividades citotoxicas de BiTE GPC3, ERY17-2 GPC3, ERY17-3 GpC3 y ERY10-1 GPC3, respectivamente.
La Fig. 21 es un grafico que muestra el efecto antitumoral in vivo de ERY17-2 GPC3 en el modelo de transferencia de celulas T PC-10. El cuadrado abierto (□) y el diamante cerrado (♦) indican cambios en el volumen tumoral del grupo de administracion ERY17-2 GPC3 y del grupo de control (administracion de TFS), respectivamente.
La Fig. 22 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de ERY17-2 GPC3 y ERY17-2- M20 GPC3. El triangulo cerrado (▲) y el cffculo abierto (o) representan las actividades citotoxicas de ERY17-2 GPC3 y ERY17-2-M20 GPC3, respectivamente.
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La Fig. 23 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de ERY17-2 EpCAM y ERY17-3 EpCAM. El triangulo cerrado (▲) y el cuadrado abierto (□) representan las actividades citotoxicas de ERY17-2 EpCAM y ERY17-3 EpCAM, respectivamente.
La Fig. 24 muestra diagramas que representan dominios que forman los siguientes complejos polipeptidicos descritos en los Ejemplos de esta memoria: GM1, GM2 y GM0. "A" muestra un complejo polipeptidico en el que la asociacion de la interfaz CH1/CL esta regulada y se introducen modificaciones de "botones en ojales" (KiH). "B" muestra un complejo polipeptidico que no tiene regulacion de la asociacion de la interfaz CH1/CL o introduccion de modificaciones de KiH. El dominio con lmeas cruzadas representa la region variable de la cadena P del anticuerpo de antfgeno anti-cancengeno (GPC3 o EpCAM); el dominio con lmeas diagonales representa la region variable de la cadena L del anticuerpo de antfgeno anti-cancengeno (GPC3 o EpCAM); el dominio con lmeas de puntos representa la region variable de la cadena P del anticuerpo anti-CD3; el dominio cerrado representa la region variable de la cadena L del anticuerpo anti-CD3; el dominio abierto representa la region constante del anticuerpo; la cruz representa una mutacion silenciosa de Fc; la estrella representa una mutacion que promueve la asociacion de Fc heteromerica; y el sfmbolo en forma de rosca representa una mutacion que regula la interaccion de la interfaz CH1/CL.
La Fig. 25 es un grafico que muestra la comparacion de las actividades citotoxicas de GM1, GM2 y GM0. El triangulo cerrado (▲), el cuadrado abierto (□) y el cfrculo abierto (o) representan las actividades citotoxicas de GM1, GM2 y GM0, respectivamente.
La Fig. 26 es un grafico que muestra la actividad citotoxica de ERY17-2 EGFR. El triangulo cerrado (▲) representa la actividad citotoxica de ERY17-2 EGFR.
Modo para llevar a cabo la invencion
Las definiciones a continuacion se proporcionan para ayudar a comprender la presente invencion.
Anticuerpo
En esta memoria, "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina natural o a una inmunoglobulina producida por smtesis parcial o completa. Los anticuerpos se pueden aislar de fuentes naturales, tales como plasma y suero de origen natural, o sobrenadantes de cultivo de hibridomas productores de anticuerpos. Alternativamente, los anticuerpos pueden sintetizarse parcial o completamente utilizando tecnicas tales como recombinacion genetica. Los anticuerpos preferidos incluyen, por ejemplo, anticuerpos de un isotipo o subclase de inmunoglobulina que pertenecen a los mismos. Las inmunoglobulinas humanas conocidas incluyen anticuerpos de las siguientes nueve clases (isotipos): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM. De estos isotipos, los anticuerpos de la presente invencion incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Los expertos en la tecnica conocen los metodos de produccion de un anticuerpo con actividad de union deseada. A continuacion se muestra un ejemplo que describe un metodo de produccion de un anticuerpo (anticuerpo anti-GPC3) que se une a GPC3, que pertenece a la familia de receptores anclados a GPI (Int J Cancer. (2003) 103(4), 455-65). Los anticuerpos que se unen a un antfgeno distinto de GPC3 tambien se pueden producir segun el ejemplo que se describe a continuacion.
Los anticuerpos anti-GPC3 se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales utilizando metodos conocidos. Los anticuerpos anti-GPC3 producidos preferiblemente son anticuerpos monoclonales derivados de mairnferos. Dichos anticuerpos monoclonales derivados de mairnferos incluyen anticuerpos producidos por hibridomas o celulas huesped transformadas con un vector de expresion que lleva un gen de anticuerpo mediante tecnicas de modificacion por ingeniena genetica.
Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando tecnicas conocidas, por ejemplo, como se describe a continuacion. Espedficamente, los mairnferos se inmunizan mediante metodos de inmunizacion convencionales utilizando una protema GPC3 como antfgeno sensibilizante. Las celulas inmunes resultantes se fusionan con celulas parentales conocidas mediante metodos de fusion de celulas convencionales. Luego, los hibridomas que producen un anticuerpo anti-GPC3 pueden seleccionarse identificando sistematicamente las celulas productoras de anticuerpos monoclonales utilizando metodos de identificacion sistematica convencionales.
Espedficamente, los anticuerpos monoclonales se preparan como se menciona a continuacion. Primero, el gen GPC3 cuya secuencia de nucleotidos se describe en el numero de acceso a RefSeq NM_001164617.1 (SEQ ID NO: 1) puede expresarse para producir una protema GPC3 mostrada en el numero de acceso a RefSeq NP_001158089.1 (SEQ ID NO: 2), que se utilizara como un antfgeno sensibilizante para la preparacion de anticuerpos. Es decir, una secuencia genica que codifica GPC3 se inserta en un vector de expresion conocido, y las celulas huesped apropiadas se transforman con este vector. La protema GPC3 humana deseada se purifica a partir de las celulas huesped o sus sobrenadantes de cultivo mediante metodos conocidos. Por ejemplo, para preparar GPC3 soluble a partir de sobrenadantes de cultivo, los aminoacidos en las posiciones 564 a 580 que forman la region hidrofoba correspondiente a la secuencia de anclaje a GPI utilizada para anclar GPC3 en la membrana
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celular se delecionan de la secuencia polipeptidica GPC3 de la SEQ ID NO: 2, y acto seguido la protema resultante se expresa en lugar de la protema GPC3 de la SEQ ID NO: 2. Alternativamente, es posible utilizar una protema GPC3 natural purificada como antigeno sensibilizante.
La protema GPC3 purificada se puede utilizar como antigeno sensibilizante para la inmunizacion de mai^eras. Tambien se puede utilizar un peptido GPC3 parcial como antigeno sensibilizante. En este caso, se puede preparar un peptido parcial mediante smtesis qrnmica basandose en la secuencia de aminoacidos de GPC3 humana, o insertando un gen de GPC3 parcial en un vector de expresion para su expresion. Alternativamente, se puede producir un peptido parcial degradando una protema GPC3 con una proteasa. La longitud y la region del peptido GPC3 parcial no estan limitadas a realizaciones particulares. Una region preferida puede seleccionarse arbitrariamente a partir de la secuencia de aminoacidos en las posiciones de aminoacidos 564 a 580 en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2. El numero de aminoacidos que forman un peptido que se va a utilizar como un antigeno sensibilizante es preferiblemente al menos cinco o mas, seis o mas, o siete o mas. Mas espedficamente, un peptido de 8 a 50 residuos, mas preferiblemente de 10 a 30 residuos puede utilizarse como un antigeno sensibilizante.
Para sensibilizar el antigeno, alternativamente es posible utilizar una protema de fusion preparada fusionando un polipeptido o peptido parcial deseado de la protema GPC3 con un polipeptido diferente. Por ejemplo, los fragmentos de Fc de anticuerpo y las etiquetas peptfdicas se utilizan preferiblemente para producir protemas de fusion a utilizar como antfgenos sensibilizantes. Los vectores para la expresion de tales protemas de fusion pueden construirse fusionando los genes de marco que codifican dos o mas fragmentos polipeptfdicos deseados e insertando el gen de fusion en un vector de expresion como se ha descrito anteriormente. Los metodos de produccion de protemas de fusion se describen en Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Los metodos de preparacion de GPC3 a utilizar como antfgeno sensibilizante y los metodos de inmunizacion que utilizan GPC3 se describen espedficamente en los documentos WO 2003/000883, WO 2004/022754 y WO 2006/006693.
No existe una limitacion particular sobre los mairnferos a inmunizar con el antfgeno sensibilizante. Sin embargo, es preferible seleccionar los marnfferos considerando su compatibilidad con las celulas parentales que se utilizaran para la fusion celular. En general, se utilizan preferiblemente roedores, tales como ratones, ratas, hamsteres, conejos y monos.
Los animales anteriores se inmunizan con un antfgeno sensibilizante por metodos conocidos. Los metodos de inmunizacion generalmente realizados incluyen, por ejemplo, inyeccion intraperitoneal o subcutanea de un antfgeno sensibilizante en mamfferos. Espedficamente, un antfgeno sensibilizante se diluye apropiadamente con TFS (solucion salina tamponada con fosfato), solucion salina fisiologica o similares. Si se desea, un adyuvante convencional, tal como adyuvante completo de Freund, se mezcla con el antfgeno y la mezcla se emulsiona. Acto seguido, el antfgeno sensibilizante se administra a un mamffero varias veces en intervalos de 4 a 21 dfas. Se pueden utilizar excipientes apropiados en la inmunizacion con el antfgeno sensibilizante. En particular, cuando se utiliza un peptido parcial de bajo peso molecular como antfgeno sensibilizante, a veces es deseable acoplar el peptido de antfgeno sensibilizante a una protema portadora, tal como albumina o hemocianina de la lapa californiana para la inmunizacion.
Alternativamente, los hibridomas que producen un anticuerpo deseado se pueden preparar utilizando inmunizacion con ADN como se menciona a continuacion. La inmunizacion con ADN es un metodo de inmunizacion que confiere inmunoestimulacion mediante la expresion de un antfgeno sensibilizante en un animal inmunizado como resultado de la administracion de un vector de ADN construido para permitir la expresion de un gen que codifica la protema del antfgeno en el animal. En comparacion con los metodos de inmunizacion convencionales en los que se administra un antfgeno proteico a los animales que se van a inmunizar, se espera que la inmunizacion con ADN sea superior en cuanto a que:
- se puede proporcionar una inmunoestimulacion mientras se retiene la estructura de una protema de membrana tal como GPc3; y
- no hay necesidad de purificar el antfgeno para la inmunizacion.
Con el fin de preparar un anticuerpo monoclonal de la presente invencion utilizando inmunizacion con ADN, primero, se administra un ADN que expresa una protema GPC3 a un animal que va a inmunizarse. El ADN que codifica GPC3 se puede sintetizar por metodos conocidos, tales como PCR. El ADN obtenido se inserta en un vector de expresion apropiado, y luego se administra a un animal para ser inmunizado. Preferiblemente, los vectores de expresion utilizados incluyen, por ejemplo, vectores de expresion disponibles comercialmente, tales como pcDNA3.1. Los vectores pueden administrarse a un organismo utilizando metodos convencionales. Por ejemplo, la inmunizacion con ADN se realiza utilizando una pistola de genes para introducir partroulas de oro recubiertas con vectores de expresion en las celulas del cuerpo de un animal que se va a inmunizar. Los anticuerpos que reconocen GPC3 tambien pueden producirse mediante los metodos descritos en el documento WO 2003/104453.
Despues de inmunizar a un mai^ero como se ha descrito anteriormente, se confirma un aumento en el tftulo de un anticuerpo de union a GPC3 en el suero. Luego, las celulas inmunes son recogidas del marnffero y despues se
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someten a fusion celular. En particular, los esplenocitos se utilizan preferiblemente como celulas inmunes.
Una celula de mieloma de mairnfero se utiliza como una celula para fusionarse con el inmunocito mencionado anteriormente. Las celulas de mieloma comprenden preferiblemente un marcador de seleccion adecuado para la identificacion sistematica. Un marcador de seleccion confiere caractensticas a las celulas para su supervivencia (o muerte) en una condicion de cultivo espedfica. La deficiencia de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (de en esta memoria en adelante abreviada como deficiencia de HGPRT) y la deficiencia de timidina quinasa (en lo sucesivo abreviada como deficiencia de TK) se conocen como marcadores de seleccion. Las celulas con deficiencia de HGPRT o TK tienen sensibilidad a la hipoxantina aminopterina y timidina (en adelante abreviada como sensibilidad a HAT). Las celulas sensibles a HAT no pueden sintetizar ADN en un medio de seleccion de HAT y, por lo tanto, se eliminan. Sin embargo, cuando las celulas se fusionan con celulas normales, pueden continuar la smtesis de ADN utilizando la via de recuperacion de las celulas normales y, por lo tanto, pueden crecer incluso en el medio de seleccion con HAT.
Las celulas deficientes en HGPRT y deficientes en TK pueden seleccionarse en un medio que contiene 6-tioguanina, 8-azaguanina (en lo sucesivo abreviado como 8AG), o 5'-bromodeoxiuridina, respectivamente. Las celulas normales se destruyen puesto que incorporan estos analogos de pirimidina en su ADN. Mientras tanto, las celulas que son deficientes en estas enzimas pueden sobrevivir en el medio de seleccion, ya que no pueden incorporar estos analogos de pirimidina. Ademas, un marcador de seleccion denominado resistencia a G418 proporcionado por el gen resistente a neomicina confiere resistencia a los antibioticos 2-deoxistreptamina (analogos de la gentamicina). Se conocen varios tipos de celulas de mieloma que son adecuadas para la fusion celular.
Por ejemplo, pueden utilizarse preferiblemente celulas de mieloma que incluyen las siguientes celulas:
P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550);
P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7);
NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519);
MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);
SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);
FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);
S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);
R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.
Las fusiones celulares entre los inmunocitos y las celulas de mieloma se llevan a cabo esencialmente utilizando metodos conocidos, por ejemplo, un metodo de Kohler y Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73:3-46).
Mas espedficamente, la fusion celular se puede llevar a cabo, por ejemplo, en un medio de cultivo convencional en presencia de un agente promotor de la fusion celular. Los agentes promotores de la fusion incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y virus Sendai (HVJ). Si es necesario, tambien se anade una sustancia auxiliar, tal como dimetilsulfoxido para mejorar la eficiencia de la fusion.
La relacion de inmunocitos a celulas de mieloma puede determinarse a criterio propio, preferiblemente, por ejemplo, una celula de mieloma por cada uno de cada diez inmunocitos. Los medios de cultivo a utilizar en fusiones celulares incluyen, por ejemplo, medios que son adecuados para el cultivo de estirpes celulares de mieloma, tales como medio RPMI1640 y medio MEM, y otros medios de cultivo convencionales utilizados para este tipo de cultivo celular. Ademas, los suplementos de suero tales como suero fetal bovino (SFB) se pueden anadir preferiblemente al medio de cultivo.
Para la fusion celular, las cantidades predeterminadas de las celulas inmunes anteriores y las celulas de mieloma se mezclan bien en el medio de cultivo anterior. Luego, se anade una solucion de PEG (por ejemplo, el peso molecular promedio es de aproximadamente 1.000 a 6.000) precalentada a aproximadamente 37 °C a una concentracion de generalmente 30 % a 60 % (p/v). Esto se mezcla suavemente para producir las celulas de fusion deseadas (hibridomas). Acto seguido, un medio de cultivo apropiado mencionado anteriormente se anade gradualmente a las celulas, y este se centrifuga repetidamente para eliminar el sobrenadante. Por consiguiente, se pueden eliminar los agentes de fusion celular y aquellos que son desfavorables para el cultivo del hibridoma.
Los hibridomas asf obtenidos pueden seleccionarse por cultivo utilizando un medio selectivo convencional, por ejemplo, medio con HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Las celulas distintas de los hibridomas deseados (celulas no fusionadas) pueden destruirse continuando el cultivo en el medio con HAT anterior durante un periodo de tiempo suficiente. Normalmente, el periodo dura varios dfas a varias semanas. Luego, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado se identifican sistematicamente y se clonan individualmente mediante metodos de dilucion limitante convencionales.
Los hibridomas asf obtenidos pueden seleccionarse utilizando un medio de seleccion basado en el marcador de seleccion que posee el mieloma utilizado para la fusion celular. Por ejemplo, las celulas deficientes en HGPRT o TK pueden seleccionarse mediante cultivo utilizando el medio con HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Espedficamente, cuando se utilizan celulas de mieloma sensibles a HAT para la fusion celular, las celulas fusionadas con exito con celulas normales pueden proliferar selectivamente en el medio con HAT.
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Las celulas distintas de los hibridomas deseados (celulas no fusionadas) pueden destruirse continuando el cultivo en el medio con HAT anterior durante un periodo de tiempo suficiente. Espedficamente, los hibridomas deseados pueden seleccionarse por cultivo durante generalmente desde varios dfas hasta varias semanas. Luego, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado se identifican sistematicamente y se clonan individualmente mediante metodos de dilucion limitante convencionales.
Los anticuerpos deseados pueden seleccionarse preferiblemente y clonarse individualmente mediante metodos de identificacion sistematica basandose en una reaccion conocida antigeno/anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de union a GPC3 puede unirse a GPC3 expresada en la superficie celular. Dicho anticuerpo monoclonal puede seleccionarse por clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (CCAF). CCAF es un sistema que evalua la union de un anticuerpo a la superficie celular mediante el analisis de las celulas en contacto con un anticuerpo fluorescente utilizando un rayo laser y la medicion de la fluorescencia emitida por las celulas individuales.
Para identificar sistematicamente hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de la presente invencion por CCAF, primero se preparan celulas que expresan GPC3. Las celulas utilizadas preferiblemente para la identificacion sistematica son celulas de mairnferos en las que GPC3 se expresa de manera forzada. Como control, la actividad de un anticuerpo para unirse a GPC3 de la superficie celular puede detectarse selectivamente utilizando celulas de mamffero no transformadas como celulas huesped. Espedficamente, los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-GPC3 pueden aislarse seleccionando hibridomas que producen un anticuerpo que se une a las celulas forzadas a expresar GPC3, pero no a las celulas huesped.
Alternativamente, la actividad de un anticuerpo para unirse a las celulas que expresan GPC3 inmovilizadas puede evaluarse basandose en el principio de ELISA. Por ejemplo, las celulas que expresan GPC3 se inmovilizan en los pocillos de una placa ELISA. Los sobrenadantes de cultivo de hibridomas se ponen en contacto con las celulas inmovilizadas en los pocillos y se detectan anticuerpos que se unen a las celulas inmovilizadas. Cuando los anticuerpos monoclonales se derivan del raton, los anticuerpos unidos a las celulas pueden detectarse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina de raton. Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado que tiene la capacidad de union al antigeno se seleccionan mediante la identificacion sistematica anterior, y se pueden clonar mediante un metodo de dilucion limitante o similar.
Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales asf preparados pueden pasarse a un medio de cultivo convencional y almacenarse en nitrogeno lfquido durante un largo periodo.
Los hibridomas anteriores se cultivan mediante un metodo convencional, y los anticuerpos monoclonales deseados se pueden preparar a partir de los sobrenadantes de cultivo. Alternativamente, los hibridomas se administran y cultivan en mamfferos compatibles, y los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de la ascitis. El primer metodo es adecuado para preparar anticuerpos con alta pureza.
Tambien se pueden utilizar preferiblemente anticuerpos codificados por genes de anticuerpos que se clonan a partir de celulas productoras de anticuerpos, tales como los hibridomas anteriores. Un gen de anticuerpo clonado se inserta en un vector apropiado, y este se introduce en un huesped para expresar el anticuerpo codificado por el gen. Los metodos para aislar genes de anticuerpos, insertar los genes en vectores y transformar celulas huesped ya se han establecido, por ejemplo, por Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Los metodos para producir anticuerpos recombinantes tambien se conocen como se describe a continuacion.
Por ejemplo, un ADNc que codifica la region variable (region V) de un anticuerpo anti-GPC3 se prepara a partir de celulas de hibridoma que expresan el anticuerpo anti-GPC3. Para este fin, el ARN total se extrae primero de los hibridomas. Los metodos utilizados para extraer los ARNm de las celulas incluyen, por ejemplo:
- el metodo de ultracentrifugacion con guanidina (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299) y
- el metodo AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156-159).
Los ARNm extrafdos se pueden purificar utilizando el kit de purificacion de ARNm (GE Healthcare Bioscience) o similares. Alternativamente, los kits para extraer el total directamente de las celulas, tales como el kit de purificacion de ARNm QuickPrep (GE Healthcare Bioscience), tambien estan disponibles comercialmente. Los ARNm pueden prepararse a partir de hibridomas utilizando tales kits. Los ADNc que codifican la region V del anticuerpo pueden sintetizarse a partir de los ARNm preparados utilizando una transcriptasa inversa. Los ADNc se pueden sintetizar utilizando el kit de smtesis de ADNc de primera cadena de transcriptasa inversa AMV (Seikagaku Co.) o similares. Ademas, el kit de amplificacion de ADNc SMART RACE (Clontech) y el metodo PCR-based 5'-RACE (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) pueden utilizarse apropiadamente para sintetizar y amplificar ADNcs. En tal proceso de smtesis de ADNc, los sitios de enzimas de restriccion apropiados descritos a continuacion pueden introducirse en ambos extremos de un ADNc.
El fragmento de ADNc de interes se purifica a partir del producto de PCR resultante, y luego se liga a un vector de ADN. De este modo, se construye un vector recombinante y se introduce en E. coli o similares. Despues de la seleccion de colonias, el vector recombinante deseado puede prepararse a partir de los E. coli formadores de colonias. Luego, si el vector recombinante tiene la secuencia de nucleotidos de ADNc de interes se somete a ensayo mediante un metodo conocido, como el metodo de terminacion de cadena didesoxinucleotido.
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El metodo 5'-RACE que utiliza cebadores para amplificar el gen de la region variable se utiliza convenientemente para aislar el gen que codifica la region variable. Primero, se construye una biblioteca de ADNc 5'-RACE mediante smtesis de ADNc utilizando ARN ex^dos de celulas de hibridoma como plantilla. Un kit disponible comercialmente, como el kit de amplificacion de ADNc SMART RACE, se utiliza adecuadamente para sintetizar la biblioteca de ADNc 5'-RACE.
El gen del anticuerpo se amplifica por PCR utilizando la biblioteca de ADNc 5'-RACE preparada como plantilla. Los cebadores para amplificar el gen de anticuerpo de raton pueden disenarse basandose en secuencias genicas de anticuerpo conocidas. Las secuencias de nucleotidos de los cebadores vanan en funcion de la subclase de inmunoglobulina. Por lo tanto, es preferible que la subclase se determine de antemano utilizando un kit disponible comercialmente, tal como kit de isotipado del anticuerpo monoclonal de raton Iso Strip (Roche Diagnostics).
Espedficamente, por ejemplo, los cebadores que permiten la amplificacion de los genes que codifican las cadenas pesadas y1, Y2a, Y2b y y3 y las cadenas ligeras k y A se utilizan para aislar genes que codifican IgG de raton. En general, un cebador que se hibrida en un sitio de region constante cercano a la region variable se utiliza como cebador del lado 3' para amplificar un gen de region variable de IgG. Mientras tanto, se utiliza un cebador fijado a un kit de construccion de biblioteca de ADNc 5' RACE como cebador del lado 5'.
Los productos de PCR asf amplificados se utilizan para remodelar inmunoglobulinas compuestas de una combinacion de cadenas pesadas y ligeras. Un anticuerpo deseado puede seleccionarse utilizando la actividad de union a GPC3 de una inmunoglobulina remodelada como indicador. Por ejemplo, cuando el objetivo es aislar un anticuerpo contra GPC3, es mas preferido que la union del anticuerpo a GPC3 sea espedfica. Un anticuerpo de union a GPC3 se puede identificar sistematicamente, por ejemplo, mediante las siguientes etapas:
(1) poner en contacto una celula que expresa GPC3 con un anticuerpo que comprende la region V codificada por un ADNc aislado de un hibridoma;
(2) detectar la union del anticuerpo a la celula que expresa GPC3; y
(3) seleccionar un anticuerpo que se une a la celula que expresa GPC3.
Se conocen metodos para detectar la union de un anticuerpo a celulas que expresan GPC3. Espedficamente, la union de un anticuerpo a las celulas que expresan GPC3 puede detectarse mediante las tecnicas descritas anteriormente, tales como CCAF. Las muestras inmovilizadas de celulas que expresan GPC3 se utilizan apropiadamente para evaluar la actividad de union de un anticuerpo.
Los metodos de identificacion sistematica de anticuerpos preferidos que utilizan la actividad de union como un indicador tambien incluyen metodos de pegado y lavado con vectores de fagos. Los metodos de identificacion sistematica que utilizan vectores de fagos son ventajosos cuando los genes de anticuerpos se afslan de bibliotecas de subclases de cadena pesada y de cadena ligera de una poblacion celular que expresa anticuerpos policlonales. Los genes que codifican las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera se pueden vincular mediante una secuencia enlazadora adecuada para formar un Fv de cadena sencilla (scFv). Los fagos que presentan scFv en su superficie pueden producirse insertando un gen que codifica scFv en un vector de fago. Los fagos se ponen en contacto con un antfgeno de interes. Entonces, un ADN que codifica scFv que tiene la actividad de union de interes puede aislarse recogiendo fagos unidos al antfgeno. Este proceso se puede repetir segun sea necesario para enriquecer scFv que tiene la actividad de union de interes.
Despues del aislamiento del ADNc que codifica la region V del anticuerpo anti-GPC3 de interes, el ADNc se digiere con enzimas de restriccion que reconocen los sitios de restriccion introducidos en ambos extremos del ADNc. Las enzimas de restriccion preferidas reconocen y escinden una secuencia de nucleotidos que se produce en la secuencia de nucleotidos del gen del anticuerpo a baja frecuencia. Ademas, un sitio de restriccion para una enzima que produce un extremo pegajoso se introduce preferiblemente en un vector para insertar un fragmento digerido de una unica copia en la orientacion correcta. El ADNc que codifica la region V del anticuerpo anti-GPC3 se digiere como se ha descrito anteriormente, y se inserta en un vector de expresion apropiado para construir un vector de expresion de anticuerpo. En este caso, si un gen que codifica la region constante del anticuerpo (region C) y un gen que codifica la region V anterior se fusionan en el marco, se obtiene un anticuerpo quimerico. En esta memoria, "anticuerpo quimerico" significa que el origen de la region constante es diferente del de la region variable. Por consiguiente, ademas de los anticuerpos heterocimericos de raton/humano, se incluyen anticuerpos aloquimericos humano/humano en los anticuerpos quimericos de la presente invencion. Se puede construir un vector de expresion de anticuerpo quimerico insertando el gen de la region V anterior en un vector de expresion que ya tiene la region constante. Espedficamente, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento para una enzima de restriccion que escinde el gen de la region V anterior puede colocarse apropiadamente en el lado 5' de un vector de expresion que lleva un ADN que codifica una region constante del anticuerpo deseado (region C). Se construye un vector de expresion de anticuerpo quimerico fusionando en el marco los dos genes digeridos con la misma combinacion de enzimas de restriccion.
Para producir un anticuerpo monoclonal anti-GPC3, los genes de anticuerpos se insertan en un vector de expresion, de modo que los genes se expresan bajo el control de una region reguladora de la expresion. La region reguladora de la expresion para la expresion de anticuerpos incluye, por ejemplo, potenciadores y promotores. Ademas, se
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puede fijar una secuencia de senal apropiada al extremo amino terminal, de modo que el anticuerpo expresado se secreta en el exterior de las celulas. En los Ejemplos descritos a continuacion, se utiliza un peptido que tiene la secuencia de aminoacidos MGWSCIILFLVATATgVhS (SEQ ID NO: 72) como una secuencia de senal. Mientras tanto, pueden fijarse otras secuencias de senal apropiadas. El polipeptido expresado se escinde en el extremo carboxilo terminal de la secuencia anterior, y el polipeptido resultante se secreta en el exterior de las celulas como un polipeptido maduro. Luego, las celulas huesped apropiadas se transforman con el vector de expresion, y se obtienen las celulas recombinantes que expresan el ADN que codifica el anticuerpo anti-GPC3.
Los ADN que codifican la cadena pesada del anticuerpo (cadena P) y la cadena ligera (cadena L) se insertan por separado en diferentes vectores de expresion para expresar el gen del anticuerpo. Una molecula de anticuerpo que tiene las cadenas P y L puede expresarse co-transfectando la misma celula huesped con vectores en los que se insertan los genes de la cadena P y la cadena L respectivamente. Alternativamente, las celulas huesped pueden transformarse con un unico vector de expresion en el que se insertan los ADN que codifican las cadenas P y L (vease el documento WO 94/11523).
Hay varias combinaciones conocidas de celulas huesped/vector de expresion para la preparacion de anticuerpos mediante la introduccion de genes de anticuerpos aislados en huespedes apropiados. Todos estos sistemas de expresion son aplicables al aislamiento de los dominios de union a antigeno y los dominios de union a CD3 de la presente invencion. Las celulas eucariotas apropiadas utilizadas como celulas huesped incluyen celulas de animales, celulas vegetales y celulas fungicas. Espedficamente, las celulas de animales incluyen, por ejemplo, las siguientes celulas.
(1) celulas de mairnfero: CHO, COS, mieloma, renales de hamster recien nacido (BHK), HeLa, Vero, o similares;
(2) celulas de anfibios: ovocitos de Xenopus, o similares; y
(3) celulas de insecto: sf9, sf21, Tn5, o similares.
Ademas, como celula vegetal, se conoce un sistema de expresion genica de anticuerpos que utiliza celulas derivadas del genero Nicotiana, tal como Nicotiana tabacum. Las celulas cultivadas con callo pueden utilizarse apropiadamente para transformar celulas vegetales.
Ademas, las siguientes celulas se pueden utilizar como celulas fungicas:
levaduras: el genero Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae, y el genero Pichia, tal como Pichia pastoris; y
hongos filamentosos: el genero Aspergillus, tal como Aspergillus niger.
Ademas, tambien se conocen sistemas de expresion genica de anticuerpos que utilizan celulas procarioticas. Por ejemplo, cuando se utilizan celulas bacterianas, celulas de E. coli, celulas de Bacillus subtilis, y similares se pueden utilizar adecuadamente. Los vectores de expresion que llevan los genes de anticuerpos de interes se introducen en estas celulas mediante transfeccion. Las celulas transfectadas se cultivan in vitro, y el anticuerpo deseado puede prepararse a partir del cultivo de celulas transformadas.
Ademas de las celulas huesped descritas anteriormente, los animales transgenicos tambien pueden utilizarse para producir un anticuerpo recombinante. Es decir, el anticuerpo se puede obtener de un animal en el que se introduce el gen que codifica el anticuerpo de interes. Por ejemplo, el gen del anticuerpo puede construirse como un gen de fusion insertandolo en el marco de un gen que codifica una protema producida espedficamente en la leche. La p- casema de cabra o similares se puede utilizar, por ejemplo, como la protema secretada en la leche. Los fragmentos de ADN que contienen el gen fusionado insertado con el gen del anticuerpo se inyectan en un embrion de cabra, y luego este embrion se introduce en una cabra. Los anticuerpos deseados se pueden obtener como una protema fusionada con la protema de leche de la leche producida por la cabra transgenica nacida de la cabra receptora del embrion (o de su progenie). Ademas, para aumentar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgenica, se pueden administrar hormonas a la cabra transgenica segun sea necesario (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).
Cuando un complejo de polipeptidos descrito en esta memoria se administra a humanos, un dominio de union a antfgeno derivado de un anticuerpo geneticamente recombinante que se ha modificado artificialmente para reducir la antigenicidad heterologa contra humanos y similares, se puede utilizar adecuadamente como el dominio de union a antfgeno del complejo. Tales anticuerpos geneticamente recombinantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos modificados se producen apropiadamente por metodos conocidos.
Una region variable de anticuerpo utilizada para producir el dominio de union a antfgeno de un complejo polipeptfdico descrito en esta memoria esta generalmente formada por tres regiones determinantes de complementariedad (RDC) que estan separadas por cuatro regiones marco (FRs). RDC es una region que determina esencialmente la especificidad de union de un anticuerpo. Las secuencias de aminoacidos de las RDC son muy diversas. Por otra parte, las secuencias de aminoacidos que forman FR suelen tener una alta identidad incluso entre anticuerpos con diferentes especificidades de union. Por lo tanto, en general, la especificidad de union de un cierto anticuerpo puede introducirse en otro anticuerpo mediante un injerto de RDC.
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Un anticuerpo humanizado tambien se denomina un anticuerpo humano remodelado. Espedficamente, se conocen anticuerpos humanizados preparados injertando la RDC de un anticuerpo animal no humano tal como un anticuerpo de raton a un anticuerpo humano y similares. Tambien se conocen tecnicas comunes de modificacion por ingeniena genetica para obtener anticuerpos humanizados. Espedficamente, por ejemplo, la PCR de extension por solapamiento se conoce como un metodo para injertar una RDC de anticuerpo de raton en una FR humana. En la PCR de extension por solapamiento, se anade una secuencia de nucleotidos que codifica una RDC de anticuerpo de raton a injertar a los cebadores para sintetizar una FR humana de anticuerpo. Los cebadores se preparan para cada una de las cuatro FR. En general, se considera que cuando se injerta una RDC de raton en una FR humana, seleccionar una FR humana que tenga una alta identidad en una FR de raton es ventajoso para mantener la funcion de RDC. Es decir, generalmente es preferible utilizar una FR humana que comprenda una secuencia de aminoacidos que tenga una alta identidad con la secuencia de aminoacidos de la FR adyacente a la RDC de raton que se va a injertar.
Las secuencias de nucleotidos a ligar se disenan de manera que se conecten entre sf en el marco. Las FR humanas se sintetizan individualmente utilizando los cebadores respectivos. Como resultado, se obtienen productos en los que el ADN codificante de RDC de raton esta fijado a los ADN codificantes de FR individuales. Las secuencias de nucleotidos que codifican la RDC de raton de cada producto se disenan de modo que se solapen entre sf. Luego, se lleva a cabo la reaccion de smtesis de la hebra complementaria para hibridar las regiones RDC superpuestas de los productos sintetizados utilizando un gen de anticuerpo humano como plantilla. Las FR humanas se ligan en las secuencias de RDC de raton mediante esta reaccion.
El gen de la region V de longitud completa, en el que se ligan finalmente tres RDC y cuatro FR, se amplifica utilizando cebadores que se hibridan en su extremo 5' o 3', que se anaden con secuencias de reconocimiento de enzimas de restriccion adecuadas. Se puede producir un vector de expresion para el anticuerpo humanizado insertando el ADN obtenido como se ha descrito anteriormente y un ADN que codifica una region C del anticuerpo humano en un vector de expresion de modo que se ligan en el marco. Despues de que el vector recombinante se transfecta en un huesped para establecer celulas recombinantes, las celulas recombinantes se cultivan y el ADN que codifica el anticuerpo humanizado se expresa para producir el anticuerpo humanizado en el cultivo celular (vease, la publicacion de patente europea n.° EP 239400 y la publicacion de patente internacional n.° WO 1996/002576).
Al medir y evaluar cualitativa o cuantitativamente la actividad de union a antfgeno del anticuerpo humanizado producido como se ha descrito anteriormente, se puede seleccionar adecuadamente las FR de anticuerpos humanos que permiten que las RDC formen un sitio de union a antfgeno favorable cuando se ligan a traves de las RDC. Los residuos de aminoacidos en las FR pueden sustituirse segun sea necesario, de modo que las RDC de un anticuerpo humano remodelado forman un sitio de union a antfgeno apropiado. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones de secuencia de aminoacidos en las FR aplicando el metodo de PCR utilizado para injertar una RDC de raton en una FR humana. Mas espedficamente, se pueden introducir mutaciones parciales de la secuencia de nucleotidos en los cebadores que se hibridan en la FR. Las mutaciones de secuencias de nucleotidos se introducen en las FR sintetizadas mediante el uso de dichos cebadores. Las secuencias FR mutantes que tienen las caractensticas deseadas pueden seleccionarse midiendo y evaluando la actividad del anticuerpo mutante sustituido con aminoacido para unirse al antfgeno mediante el metodo mencionado anteriormente (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53: 851856).
Alternativamente, los anticuerpos humanos deseados pueden obtenerse inmunizando animales transgenicos que tienen todo el repertorio de genes de anticuerpos humanos (veanse los documentos WO 1993/012227; Wo 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por inmunizacion con ADN.
Ademas, tambien se conocen tecnicas para preparar anticuerpos humanos por pegado y lavado utilizando bibliotecas de anticuerpos humanos. Por ejemplo, la region V de un anticuerpo humano se expresa como un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en la superficie del fago mediante el metodo de expresion en fagos. Se pueden seleccionar los fagos que expresan un scFv que se une al antfgeno. La secuencia de ADN que codifica la region V del anticuerpo humano que se une al antfgeno se puede determinar analizando los genes de los fagos seleccionados. Se determina la secuencia de ADN del scFv que se une al antfgeno. Se prepara un vector de expresion fusionando la secuencia de la region V en marco con la secuencia de la region C de un anticuerpo humano deseado, e insertandolo en un vector de expresion apropiado. El vector de expresion se introduce en las celulas apropiadas para la expresion como las descritas anteriormente. El anticuerpo humano se puede producir expresando el gen que codifica el anticuerpo humano en las celulas. Estos metodos ya son conocidos (veanse los documentos WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).
Dominio de union a antfgeno
En esta memoria, "dominio de union a antigeno" se refiere a una porcion de anticuerpo que comprende una region que se une espedficamente y es complementaria a la totalidad o a una porcion de un antfgeno. Cuando el peso molecular de un antfgeno es grande, un anticuerpo solo puede unirse a una porcion particular del antfgeno. La porcion particular se llama "epftopo". Se puede proporcionar un dominio de union a antfgeno a partir de uno o mas
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dominios variables de anticuerpo. Preferiblemente, los dominios de union a antigeno contienen tanto la region variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo como la region variable de cadena pesada (VP) del anticuerpo. Dichos dominios de union a antigeno preferibles incluyen, por ejemplo, "Fv de cadena sencilla (scFv)", "anticuerpo de cadena sencilla", "Fv", "Fv2 de cadena sencilla (scFv2)", "Fab" y "F( ab')2".
Los dominios de union a antigeno de los complejos polipeptidicos de la presente invencion pueden unirse al mismo epftopo. El epftopo puede estar presente en una protema que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 o 4. Alternativamente, los dominios de union a antigeno de complejos polipeptfdicos de la presente invencion pueden unirse individualmente a diferentes epftopos. El epftopo puede estar presente en una protema que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 o 4.
Especificidad
"Espedfico" significa que una molecula que se une espedficamente a una o mas parejas de union no muestra ninguna union significativa a otras moleculas aparte de las parejas. Ademas, "espedfico" tambien se utiliza cuando un dominio de union a antigeno es espedfico de un epftopo particular de multiples epftopos contenidos en un antigeno. Cuando un epftopo unido por un dominio de union a antigeno esta contenido en multiples antigenos diferentes, un complejo polipeptfdico que contiene el dominio de union a antigeno puede unirse a varios antigenos que tienen el epftopo.
Antfgeno
En esta memoria, no existe ninguna limitacion particular sobre el antigeno, y es posible utilizar cualquier antigeno excepto para CD3. Tales antigenos incluyen, por ejemplo, receptores, antigenos de cancer, antigenos de CMH y antigenos de diferenciacion. Los receptores incluyen, por ejemplo, aquellos que pertenecen a la familia del receptor del factor de crecimiento hematopoyetico, familia del receptor de citoquinas, familia del receptor de tirosina quinasa, familia del receptor de serina/treonina quinasa, familia del receptor del TNF, familia del receptor acoplado a la protema G, familia del receptor anclado a GPI, familia de receptor de tirosina fosfatasa, familia de factor de adhesion y familia de receptor de hormonas. Los receptores que pertenecen a estas familias de receptores y sus caractensticas se describen en varios documentos, por ejemplo, revisiones tales como Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehensive Biochemistry vol. 18B "Hormones and their Actions Part II' pags. 1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV.; y SAIBO KOGAKu (Cell Technology) Supplementary Volume Handbook Series "Secchaku Inshi Handbook (Handbook for Adhesion factors)" M. Miyasaka Ed. (1994) Shujunsha, Tokio, Japon; y Patthy (Cell (1990) 61(1), 13-14); Ullrich et al., (Cell (1990) 61(2), 203-212); Massague (Cell (1992) 69(6), 10671070); Miyajima et al., (Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331); Taga et al., (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396); Fantl et al., (Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481), Smith et al., (Cell (1994) 76(6) 959-962), Flower DR. Biochim. Biophys Acta, Flower (Biochim. Biophys Acta (1999) 1422(3) 207-234.
Espedficamente, los receptores que pertenecen a las familias de receptores anteriores incluyen preferiblemente, por ejemplo, receptores de eritropoyetina (EPO) humanos y de raton (Blood (1990) 76(1), 31-35; Cell (1989) 57(2), 277285), receptores del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) humanos y de raton (Proc. Natl Acad Sci. USA. (1990) 87(22), 8702-8706; mG-CSFR, Cell (1990) 61(2), 341-350), receptores de trombopoyetina (TPO) humana y de raton (Proc. Natl Acad Sci. USA (1992) 89(12), 5640-5644; EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53), receptores de insulina humana y de raton (Nature (1985) 313(6005), 756-761), receptores de ligando Flt-3 humano y de raton (Proc. Natl Acad Sci. USA (1994) 91(2), 459-463), receptores de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) humano y de raton (Proc. Natl Acad Sci. USA. (1988) 85(10), 3435-3439), receptores de interferon (IFN)-a y -p humano y de raton (Cell (1990) 60(2), 225-234; y Cell (1994) 77(3), 391-400), receptores de leptina humana y de raton, receptores de hormona de crecimiento (GH) humano y de raton, receptores de interleucina (IL)-10 humano y de raton, receptores de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) humano y de raton, receptores del factor inhibidor de la leucemia (LIF) humano y de raton, y receptores del factor neurotrofico ciliar (CNTF) humano y de raton.
Los antfgenos del cancer son antfgenos que se expresan a medida que las celulas se vuelven malignas y tambien se les llama "antfgenos espedficos de tumores" Ademas, las cadenas anormales de azucar que se expresan en la superficie celular o en las moleculas de protemas cuando las celulas se vuelven cancerosas tambien son antfgenos cancerosos, y se denominan "antfgeno de carbohidratos asociados con el cancer". Tales antfgenos del cancer incluyen, por ejemplo, GPC3 (Int J Cancer. (2003) 103(4), 455-65), EpCAM (Proc. Natl Acad Sci. USA. (1989) 86(1), 27-31), EGFR, CA19-9, CA15-3, y sialil SSEA-1 (sLX). GPC3 pertenece a la familia de receptores anclados a GpI mencionada anteriormente y se expresa en varios tipos de cancer, incluido el cancer de Idgado. EpCAM se expresa en multiples tipos de cancer, incluido el cancer de pulmon, y sus secuencias de polinucleotidos y polipeptidos se describen en los numeros de acceso a RefSeq NM_002354.2 (SEQ ID NO: 3) y NP_002345.2 (SEQ iD NO: 4), respectivamente).
En general, los antfgenos de CMH se clasifican en antfgenos del CMH de clase I y clase II. Los antfgenos del CMH de clase I incluyen HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G y -H, mientras que los antfgenos del CMH de clase II incluyen HLA-DR, - DQ y -DP.
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Los antfgenos de diferenciacion incluyen CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126 y CDw130.
Epftopo
"Epftopo" significa un determinate antigenico en un antfgeno, y se refiere a un sitio de antigeno al que se une el dominio de union a antigeno de un complejo polipeptidico descrito en esta memoria. As^ por ejemplo, el epftopo se puede definir segun su estructura. Alternativamente, el epftopo se puede definir segun la actividad de union a antigeno de un complejo polipeptidico que reconoce el epftopo. Cuando el antigeno es un peptido o polipeptido, el epftopo puede ser especificado por los residuos de aminoacidos que forman el epftopo. Alternativamente, cuando el epftopo es una cadena de azucar, el epftopo puede ser especificado por su estructura espedfica de cadena de azucar.
Un epftopo lineal es un epftopo que contiene un epftopo cuya secuencia de aminoacidos primaria es reconocida. Un epftopo lineal de este tipo contiene normalmente al menos tres y lo mas comunmente al menos cinco, por ejemplo, aproximadamente 8 a 10 o 6 a 20 aminoacidos en su secuencia espedfica.
En contraste con el epftopo lineal, "epftopo conformacional" es un epftopo en el que la secuencia de aminoacidos primaria que contiene el epftopo no es el unico determinante del epftopo reconocido (por ejemplo, la secuencia de aminoacidos primaria de un epftopo conformacional no es reconocida necesariamente por un anticuerpo que define el epftopo). Los epftopos conformacionales pueden contener un mayor numero de aminoacidos en comparacion con los epftopos lineales. Un anticuerpo que reconoce el epftopo conformacional reconoce la estructura tridimensional de un peptido o protema. Por ejemplo, cuando una molecula de protema se pliega y forma una estructura tridimensional, los aminoacidos y/o las cadenas principales de los polipeptidos que forman un epftopo conformacional se alinean, y el epftopo se hace reconocible por el anticuerpo. Los metodos para determinar las conformaciones de epftopos incluyen, por ejemplo, cristalograffa de rayos X, resonancia magnetica nuclear bidimensional, marcaje del sitio espedfico con espm y resonancia paramagnetica electronica, pero no estan limitados a estos. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), vol. 66, Morris (ed.).
Los ejemplos de un metodo para evaluar la union del epftopo por un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union al antfgeno GPC3 se describen a continuacion. Segun los ejemplos a continuacion, los metodos para evaluar la union del epftopo por un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno para un antfgeno distinto a GPC3, tambien pueden realizarse de manera apropiada.
Por ejemplo, si un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno GPC3 reconoce un epftopo lineal en la molecula GPC3, se puede confirmar, por ejemplo, como se menciona a continuacion. Un peptido lineal que comprende una secuencia de aminoacidos que forma el dominio extracelular de GPC3 se sintetiza para el fin anterior. El peptido puede sintetizarse qmmicamente, u obtenerse mediante tecnicas de modificacion por ingeniena genetica utilizando una region que codifica la secuencia de aminoacidos correspondiente al dominio extracelular en un ADNc de GPC3. Luego, un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno GPC3 se evalua por su actividad de union hacia un peptido lineal que comprende la secuencia de aminoacidos que forma el dominio extracelular. Por ejemplo, un peptido lineal inmovilizado puede utilizarse como un antfgeno mediante ELISA para evaluar la actividad de union del complejo polipeptidico hacia el peptido. Alternativamente, la actividad de union hacia un peptido lineal puede evaluarse basandose en el nivel en que el peptido lineal inhibe la union del complejo polipeptfdico a celulas que expresan GPC3. Estos ensayos pueden demostrar la actividad de union del complejo polipeptfdico hacia el peptido lineal.
Si un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno GPC3 reconoce un epftopo conformacional se puede evaluar de la siguiente manera. Las celulas que expresan GPC3 se preparan para el fin anterior. Se puede determinar que un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno GPC3 reconoce un epftopo conformacional cuando se une fuertemente a las celulas que expresan GPC3 al contacto, pero no se une esencialmente a un peptido lineal inmovilizado que comprende una secuencia de aminoacidos que forma el dominio extracelular de GPC3. En esta memoria, "no se une esencialmente" significa que la actividad de union es del 80 % o menos, generalmente del 50 % o menos, preferiblemente del 30 % o menos, y particularmente preferiblemente del 15% o menos en comparacion con la actividad de union hacia celulas que expresan GPC3 humana.
Los metodos para analizar la actividad de union de un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno GPC3 hacia celulas que expresan GPC3 incluyen, por ejemplo, los metodos descritos en Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Espedficamente, la evaluacion se puede realizar en base al principio de ELISA o clasificacion celular activada por fluorescencia (CCAF) utilizando celulas que expresan GPC3 como antfgeno.
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En el formato ELISA, la actividad de union de un complejo polipeptidico de ensayo que contiene un dominio de union a antigeno GPC3 hacia celulas que expresan GPC3 puede evaluarse cuantitativamente comparando los niveles de senal generados por la reaccion enzimatica. Espedficamente, se anade un complejo polipeptidico de ensayo a una placa ELISA en la que se inmovilizan las celulas que expresan GPC3. Luego, el complejo polipeptfdico de ensayo unido a las celulas se detecta utilizando un anticuerpo marcado con enzimas que reconoce el complejo polipeptidico de ensayo. Alternativamente, cuando se utiliza CCAF, se prepara una serie de dilucion de un complejo de polipeptido de ensayo, y se puede determinar el tftulo de union del anticuerpo para las celulas que expresan GPC3 para comparar la actividad de union del complejo polipeptfdico de ensayo hacia las celulas que expresan GPC3.
La union de un complejo polipeptfdico de ensayo hacia un antigeno expresado en la superficie de las celulas suspendidas en un tampon o similar puede detectarse utilizando un citometro de flujo. Los citometros de flujo conocidos incluyen, por ejemplo, los siguientes dispositivos:
FACSCanto™II
FACSAria™
FACSArray™
FACSVantage™SE
FACSCalibur™ (todos son nombres comerciales de BD Biosciences)
EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos son nombres comerciales de Beckman Coulter).
Los metodos preferibles para ensayar la actividad de union de un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antigeno GPC3 hacia un antigeno incluyen, por ejemplo, el siguiente metodo. Primero, las celulas que expresan GPC3 reaccionan con un complejo polipeptfdico de ensayo, y luego se tinen con un anticuerpo secundario marcado con FITC que reconoce el complejo polipeptfdico. El complejo polipeptfdico de ensayo se diluye apropiadamente con un tampon adecuado para preparar el complejo a una concentracion deseada. Por ejemplo, el complejo se puede utilizar a una concentracion dentro del intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. Luego, la intensidad de la fluorescencia y el recuento celular se determinan utilizando FACSCalibur (BD). La intensidad de fluorescencia obtenida mediante analisis utilizando el software CELL QUEST (BD), es decir, el valor de la media geometrica, refleja la cantidad de anticuerpo unido a las celulas. Es decir, la actividad de union de un complejo polipeptfdico de ensayo, que se representa por la cantidad del complejo polipeptfdico de ensayo unido, puede determinarse midiendo el valor de la media geometrica.
Si un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno GPC3 comparte un epftopo comun con otro complejo polipeptfdico se puede evaluar en base a la competencia entre los dos complejos por el mismo epftopo. La competencia entre complejos polipeptfdicos puede detectarse mediante un ensayo de bloqueo cruzado o similar. Por ejemplo, el ensayo ELISA competitivo es un ensayo de bloqueo cruzado preferido.
Espedficamente, en el ensayo de bloqueo cruzado, la protema GPC3 inmovilizada en los pocillos de una placa de microtitulacion se pre-incuba en presencia o ausencia de un complejo polipeptfdico competidor candidato, y luego se anade al mismo un complejo polipeptfdico de ensayo. La cantidad de complejo polipeptfdico de ensayo unido a la protema GPC3 en los pocillos se correlaciona indirectamente con la capacidad de union de un complejo polipeptfdico competidor candidato que compite por la union al mismo epftopo. Es decir, cuanto mayor sea la afinidad del complejo polipeptfdico competidor por el mismo epftopo, menor sera la actividad de union del complejo polipeptfdico de ensayo hacia los pocillos recubiertos con protema GPC3.
La cantidad del complejo polipeptfdico de ensayo unido a los pocillos a traves de la protema GPC3 se puede determinar facilmente marcando el complejo polipeptfdico por adelantado. Por ejemplo, un complejo polipeptfdico marcado con biotina se mide utilizando un conjugado de avidina/peroxidasa y un sustrato apropiado. En particular, el ensayo de bloqueo cruzado que utiliza marcadores enzimaticos tales como la peroxidasa se denomina "ensayo de ELISA competitivo". El complejo polipeptfdico tambien puede marcarse con otras sustancias marcadoras que permiten la deteccion o la medicion. Espedficamente, se conocen radiomarcadores, etiquetas fluorescentes y similares.
Cuando el complejo polipeptfdico competidor candidato puede bloquear la union mediante un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno GPC3 en al menos 20 %, preferiblemente al menos 20 a 50 %, y mas preferiblemente al menos 50 % en comparacion con la actividad de union en un experimento de control realizado en ausencia del complejo polipeptfdico competidor, se determina que el complejo polipeptfdico de ensayo se une esencialmente al mismo epftopo unido por el complejo polipeptfdico competidor, o compite por la union al mismo epftopo.
Cuando ya se ha identificado la estructura de un epftopo unido por un complejo polipeptfdico de ensayo que contiene un dominio de union a antfgeno GPC3, se puede evaluar si los complejos polipeptfdico de ensayo y control comparten un epftopo comun al comparar las actividades de union de los dos complejos polipeptfdicos hacia un peptido preparado mediante la introduccion de mutaciones de aminoacidos en el peptido que forma el epftopo.
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Para medir las actividades de union anteriores, por ejemplo, las actividades de union de los complejos polipeptidicos de ensayo y control hacia un peptido lineal en el que se introduce una mutacion se comparan en el formato ELISA anterior. Ademas de los metodos de ELISA, la actividad de union hacia el peptido mutante unido a una columna se puede determinar haciendo fluir complejos polipeptfdicos de ensayo y control en la columna, y luego cuantificando el complejo polipeptfdico eluido en la solucion de elucion. Se conocen metodos para adsorber un peptido mutante a una columna, por ejemplo, en forma de un peptido de fusion GST.
Alternativamente, cuando el epftopo identificado es un epftopo conformacional, se puede evaluar si los complejos polipeptfdicos de ensayo y control comparten un epftopo comun mediante el siguiente metodo. En primer lugar, se preparan celulas que expresan GPC3 y celulas que expresan GPC3 con una mutacion introducida en el epftopo. Los complejos polipeptfdicos de ensayo y control se anaden a una suspension celular preparada suspendiendo estas celulas en un tampon apropiado, tal como TFS. Luego, las suspensiones celulares se lavan adecuadamente con un tampon, y se anaden a las mismas un anticuerpo marcado con FITC que reconoce los complejos polipeptfdicos de ensayo y control. La intensidad de la fluorescencia y el numero de celulas tenidas con el anticuerpo marcado se determinan utilizando FACSCalibur (BD). Los complejos polipeptfdico de ensayo y control se diluyen apropiadamente utilizando un tampon adecuado y se utilizan en las concentraciones deseadas. Por ejemplo, pueden utilizarse en una concentracion dentro del intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. La intensidad de fluorescencia determinada por analisis utilizando el software CELL QUEST (Bd), es decir, el valor de la media geometrica, refleja la cantidad de anticuerpo marcado unido a las celulas. Es decir, las actividades de union de los complejos polipeptfdicos de ensayo y control, que estan representados por la cantidad de anticuerpo marcado, pueden determinarse midiendo el valor de la media geometrica.
En el metodo anterior, si un complejo polipeptfdico "no se une esencialmente a celulas que expresan GPC3 mutante" puede evaluarse, por ejemplo, mediante el siguiente metodo. Primero, los complejos polipeptfdicos de ensayo y control unidos a celulas que expresan GPC3 mutante se tinen con un anticuerpo marcado. Luego, se determina la intensidad de fluorescencia de las celulas. Cuando se utiliza FACSCalibur para la deteccion de fluorescencia por citometna de flujo, la intensidad de fluorescencia determinada se puede analizar utilizando el software CELL QUEST. A partir de los valores de la media geometrica en presencia y ausencia del complejo polipeptfdico, el valor de comparacion (AMedia-Geo) se puede calcular segun la siguiente formula para determinar la relacion de aumento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la union por el complejo polipeptfdico.
AMedia-Geo = Media-Geo en presencia del complejo polipeptidico)/Media-Geo (en ausencia del complejo polipeptfdico)
El valor de comparacion de la media geometrica (valor AMedia-Geo para la molecula de GPC3 mutante) determinado por el analisis anterior, que refleja la cantidad de un complejo polipeptfdico de ensayo unido a celulas que expresan GPC3 mutante, se compara con el valor de comparacion de AMedia-Geo que refleja la cantidad del complejo polipeptfdico de ensayo unido a celulas que expresan GPC3. En este caso, las concentraciones del complejo polipeptfdico de ensayo utilizado para determinar los valores de comparacion de AMedia-Geo para las celulas que expresan GPC3 y las celulas que expresan GPC3 mutante se ajustan de manera particularmente preferible para que sean iguales o esencialmente iguales. Un complejo polipeptfdico que se ha confirmado que reconoce un epftopo en GPC3 se utiliza como un complejo polipeptfdico de control.
Si el valor de comparacion AMedia-Geo de un complejo polipeptfdico de ensayo para celulas que expresan GPC3 mutante es menor que el valor de comparacion AMedia-Geo del complejo polipeptfdico de ensayo para celulas que expresan GPC3 en al menos un 80 %, preferiblemente un 50 %, mas preferiblemente un 30 %, y particularmente de manera preferible 15%, entonces el complejo polipeptfdico de ensayo "no se une esencialmente a celulas que expresan GPC3 mutante". La formula para determinar el valor Media Geo (Media Geometrica) se describe en la Gma del Usuario del Software CELL QUEST (BD biosciences). Cuando la comparacion muestra que los valores de comparacion son esencialmente equivalentes, se puede determinar que el epftopo para los complejos polipeptfdicos de ensayo y control es el mismo.
Fragmento variable (Fv)
En esta memoria, la expresion "fragmento variable (Fv)" se refiere a la unidad minima de un dominio de union a antfgeno derivado de anticuerpo que esta compuesto por un par de la region variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo y la region variable de cadena pesada (VP) del anticuerpo. En 1988, Skerra y Pluckthun descubrieron que pueden prepararse anticuerpos homogeneos y activos a partir de la fraccion de periplasma de E. coli insertando un gen de anticuerpo corriente abajo de una secuencia de senal bacteriana e induciendo la expresion del gen en E. coli (Science (1988) 240(4855), 1038-1041). En el Fv preparado a partir de la fraccion de periplasma, VP se asocia con VL de una manera que se une a un antfgeno.
En esta memoria, Fv incluye preferiblemente, por ejemplo, un par de Fv que es un complejo polipeptfdico o similar que comprende:
(1) un dominio de union a antfgeno bivalente que es un scFv bivalente, en donde un scFv monovalente del scFv bivalente esta vinculado a un polipeptido formando un dominio Fc por un fragmento Fv de cadena pesada que forma
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un dominio de union a CD3, y el otro scFv monovalente esta vinculado al otro polipeptido que forma un dominio Fc por un fragmento Fv de cadena ligera que forma un dominio de union a CD3;
(2) un dominio que comprende un dominio Fc que no tiene actividad de union al receptor Fcy, y que se deriva de aminoacidos que forman el dominio Fc de IgG1, IgG2a, IgG3 o IgG4; y
(3) al menos un dominio de union a CD3 monovalente,
en donde los fragmentos Fv de cadena ligera y de cadena pesada se asocian para formar un dominio de union a CD3 de modo que puede unirse al antfgeno CD3.
scFv, anticuerpo de cadena sencilla y sc(Fv)2
En esta memoria, los terminos "scFv", "anticuerpo de cadena sencilla" y "sc(Fv)2" se refieren a un fragmento de anticuerpo de una unica cadena polipeptidica que contiene regiones variables derivadas de las cadenas pesada y ligera, pero no de la region constante. En general, un anticuerpo de cadena sencilla tambien contiene un enlazador polipeptfdico entre los dominios VP y VL, que permite la formacion de una estructura deseada que se cree que permite la union al antigeno. El anticuerpo de cadena sencilla se discute en detalle por Pluckthun en "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, eds., Springer-Verlag, Nueva York, 269-315 (1994)". Vease tambien la publicacion de patente internacional WO 1988/001649; las patentes de Estados Unidos n.° 4.946.778 y 5.260.203. En una realizacion particular, el anticuerpo de cadena sencilla puede ser biespedfico y/o humanizado.
scFv es un dominio de union a antfgeno en el que VP y VL que forma Fv estan unidos entre sf por un enlazador peptfdico (Proc. Natl Acad Sci. USA. (1988) 85(16), 5879-5883). El enlazador peptfdico puede retener VP y VL en proximidad inmediata.
sc(Fv)2 es un anticuerpo de cadena sencilla en el que cuatro regiones variables de dos VL y dos VP estan vinculadas por enlazadores, tales como los enlazadores peptfdicos, para formar una cadena sencilla (J Immunol. Methods (1999) 231(1-2), 177-189). Las dos VP y dos VL pueden derivarse de diferentes anticuerpos monoclonales. Dicho sc(Fv)2 incluye preferiblemente, por ejemplo, un sc(Fv)2 biespedfico que reconoce dos epttopos presentes en un unico antfgeno como se describe en Journal of Immunology (1994) 152(11), 5368-5374. sc(Fv)2 puede producirse por metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, sc(Fv)2 puede producirse vinculando scFv mediante un enlazador, tal como un enlazador peptfdico.
En esta memoria, la forma de un dominio de union a antfgeno que forma un sc(Fv)2 incluye un anticuerpo en el que las dos unidades VP y las dos unidades VL estan dispuestas en el orden de VP, VL, VP y VL ([VH]-enlazador-[VL]- enlazador-[VP]-enlazador-[VL]) a partir del extremo N-terminal de un polipeptido de cadena sencilla. El orden de las dos unidades Vp y las dos unidades VL no se limita a la forma anterior, y se pueden disponer en cualquier orden. El orden de ejemplo de la forma se enumera a continuacion.
[VL]-enlazador-[VP]-enlazador-[VH]-enlazador-[VL]
[VP]-enlazador-[VL]-enlazador-[VL]-enlazador-[VP]
[VP]-enlazador-[VP]-enlazador-[VL]-enlazador-[VL]
[VL]-enlazador-[VL]-enlazador-[VP]-enlazador-[VP]
[VL]-enlazador-[VP]-enlazador-[VL]- enlazador-[VP]
La forma molecular de sc(Fv)2 tambien se describe en detalle en el documento WO 2006/132352. Segun estas descripciones, los expertos en la tecnica pueden preparar apropiadamente el sc(Fv)2 deseado para producir los complejos polipeptfdicos descritos en esta memoria.
Ademas, los complejos polipeptfdicos de la presente invencion pueden conjugarse con un polfmero portador, tal como PEG o un compuesto organico, tal como un agente anti-cancengeno. Alternativamente, una secuencia de adicion de cadena de azucar se inserta preferiblemente en los complejos polipeptfdicos de modo que la cadena de azucar produzca un efecto deseado.
Los enlazadores que se utilizaran para vincular las regiones variables de un anticuerpo comprenden enlazadores peptfdicos arbitrarios que pueden introducirse mediante modificacion por ingeniena genetica, enlazadores sinteticos y enlazadores descritos, por ejemplo, en Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996. Sin embargo, los enlazadores peptfdicos son preferidos en la presente invencion. La longitud de los enlazadores peptfdicos no esta particularmente limitada, y puede ser seleccionada adecuadamente por los expertos en la tecnica segun el fin. La longitud es preferiblemente de cinco aminoacidos o mas (sin limitacion particular, el lfmite superior es generalmente de 30 aminoacidos o menos, preferiblemente de 20 aminoacidos o menos), y particularmente de manera preferible de 15 aminoacidos. Cuando sc(Fv)2 contiene tres enlazadores peptfdicos, su longitud puede ser igual o diferente.
Por ejemplo, dichos enlazadores peptfdicos incluyen:
Ser
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Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 5)
Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 6)
Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 7)
Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 8)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 9)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 10)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 11)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 12)
(Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 7))n (Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 8))n
en donde n es un numero entero de 1 o mayor. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar la longitud o las secuencias de los enlazadores peptidicos en funcion del fin.
Los enlazadores sinteticos (agentes de reticulacion qmmica) se utilizan de forma rutinaria para reticular peptidos, y por ejemplo:
N-hidroxisuccinimida (NHS), suberato de disuccinimidilo (DSS), bis(sulfosuccinimidil) suberato (BS3), ditiobis(succinimidil propionato) (DSP), ditiobis(sulfosuccinimidil propionato) (DTSSP), etilenglicol bis(succinimidil succinato) (EGS), etilenglicol bis(sulfosuccinimidil succinato) (sulfo-EGS), disuccinimidil tartrato (DST), disufosuccinimidil tartrato (sulfo-DST), bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (BSOCOES),
y bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (sulfo-BSOCOES). Estos agentes de reticulacion estan disponibles comercialmente.
En general, se requieren tres enlazadores para vincular entre sf cuatro regiones variables de anticuerpos. Los enlazadores que se utilizaran pueden ser del mismo tipo o tipos diferentes.
Fab, F(ab')2, y Fab'
"Fab" consiste en una unica cadena ligera y un dominio CH1 y una region variable de una unica cadena pesada. La cadena pesada de la molecula Fab no puede formar enlaces disulfuro con otra molecula de cadena pesada.
"F(ab')2" o "Fab" se produce al tratar una inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) con una proteasa tal como pepsina y papama, y se refiere a un fragmento de anticuerpo generado al digerir una inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) cerca de enlaces disulfuro presentes entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas P. Por ejemplo, la papama escinde IgG corriente arriba de los enlaces disulfuro presentes entre las regiones de bisagra en cada una de las dos cadenas P para generar dos fragmentos de anticuerpos homologos, en los que una cadena L comprende VL (region variable de la cadena L) y CL (region constante de la cadena L) esta vinculada a un fragmento de la cadena P que comprende VP (region variable de la cadena P) y CHy1 (region y1 en una region constante de la cadena P) a traves de un enlace disulfuro en sus regiones C-terminales. Cada uno de estos dos fragmentos de anticuerpos homologos se denomina Fab'.
"F(ab')2" consiste en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que comprenden la region constante de un dominio CH1 y una porcion de dominios CH2, de modo que se forman enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas. El F(ab')2 que forma un complejo polipeptfdico descrito en esta memoria puede producirse preferiblemente de la siguiente manera. Un anticuerpo monoclonal completo o similar que comprende un dominio de union a antfgeno deseado se digiere parcialmente con una proteasa, tal como pepsina; y los fragmentos de Fc se eliminan por adsorcion en una columna de protema A. La proteasa no esta particularmente limitada, siempre que pueda escindir el anticuerpo completo de una manera selectiva para producir F(ab')2 bajo una condicion de reaccion enzimatica de configuracion apropiada, tal como pH. Tales proteasas incluyen, por ejemplo, pepsina y ficina.
Dominio Fc
Un dominio Fc que forma un complejo polipeptfdico descrito en esta memoria puede producirse preferiblemente de la siguiente manera. Un anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal se digiere parcialmente con una proteasa, tal como pepsina. Luego, el fragmento resultante se adsorbe en una columna de protema A o protema G, y se eluye con un tampon de elucion apropiado. La proteasa no esta particularmente limitada, siempre y cuando pueda escindir anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales bajo una condicion de reaccion enzimatica de configuracion apropiada, tal como pH. Tales proteasas incluyen, por ejemplo, pepsina y ficina.
Los complejos polipeptfdicos descritos en esta memoria comprenden un dominio Fc con actividad de union al receptor Fcy reducida, que incluye aminoacidos que forman el dominio Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
El isotipo del anticuerpo se determina segun la estructura de la region constante.
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Las regiones constantes de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 se denominan Cy1, Cy2, Cy3 y Cy4, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de los polipeptidos del dominio Fc que forman Cy1, Cy2, Cy3 y Cy4 humano se ejemplifican en la SEQ ID NO: 23, 24, 25 y 26, respectivamente. La relacion entre los residuos de aminoacidos que forman cada secuencia de aminoacidos y la numeracion de la UE de Kabat (tambien denominada en esta memoria fNDICE DE LA UE) se muestran en la Fig. 18.
El dominio Fc se refiere a la region ademas de F(ab')2 que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que comprenden una porcion de la region constante que comprende un dominio CH1 y una region entre los dominios CH1 y CH2 para que se formen enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas. El dominio Fc que forma un complejo polipeptfdico descrito en esta memoria se puede producir preferiblemente de la siguiente manera. Un anticuerpo monoclonal IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o similar se digiere parcialmente con una proteasa, tal como pepsina, seguido de la elucion de la fraccion adsorbida en una columna de protema A. La proteasa no esta particularmente limitada, siempre que pueda escindir el anticuerpo completo de una manera selectiva para producir F(ab')2 en una condicion de reaccion enzimatica de configuracion apropiada, tal como pH. Tales proteasas incluyen, por ejemplo, pepsina y ficina.
Receptor Fcy
El receptor Fcy se refiere a un receptor capaz de unirse al dominio Fc de los anticuerpos monoclonales IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, e incluye a todos los miembros que pertenecen a la familia de protemas esencialmente codificadas por un gen receptor de Fcy. En humanos, la familia incluye FcyRI (CD64) que incluye las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32) que incluye las isoformas FcYRIIa (incluido el alotipo H131 y R131), FcYRIIb (que incluye FcYRIIb-1 y FcYRiib-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16) que incluye la isoforma FcYRIIIa (incluido el alotipo V158 y F158) y FcYRIIIb (incluido el alotipo FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2); asf como todas las FcyRs no identificadas humanas FcyRs, FcyR, y sus alotipos. Sin embargo, el receptor Fcy no se limita a estos ejemplos. Sin quedar limitado a ello, FcyR incluye aquellos derivados de humanos, ratones, ratas, conejos y monos. FcyR puede derivarse de cualquier organismo. El FcyR de raton incluye, sin quedar limitado a, FcyRI (Cd64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) y FcyRIII-2 (CD16-2), asf como todas las isoformas de raton no identificadas FcyRs, FcyR y sus alotipos. Dichos receptores Fcy preferidos incluyen, por ejemplo, FcyI humano (CD64), FcyIIA (CD32), FcyIIB (CD32), FcyIIIA (CD16) y/o FcyIIiB (CD16). La secuencia de polinucleotidos y la secuencia de aminoacidos de FcyI se muestran en las SEQ ID NOs: 13 (NM_000566.3) y 14 (Np_000557.1), respectivamente; la secuencia de polinucleotidos y la secuencia de aminoacidos de FcyIIA se muestran en las SEQ ID NOs: 15 (BC020823.1) y 16 (AAH20823.1), respectivamente; la secuencia de polinucleotidos y la secuencia de aminoacidos de FcyIIB se muestran en las SEQ ID NOs: 17 (BC146678.1) y 18 (AAI46679.1), respectivamente; la secuencia de polinucleotidos y la secuencia de aminoacidos de FcyIIIA se muestran en las SEQ iD NOs: 19 (BC033678.1) y 20 (AAH33678.1), respectivamente; y la secuencia de polinucleotidos y la secuencia de aminoacidos de FcyIIIB se muestran en las SEQ iD NOs: 21 (BC128562.1) y 22 (AAI28563.1), respectivamente (el numero de acceso a RefSeq se muestra en cada parentesis). Si un receptor Fcy tiene actividad de union al dominio Fc de un anticuerpo monoclonal IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, se puede evaluar mediante ALPHA screen (Ensayo Homogeneo de Proximidad Luminiscente Amplificada), el metodo BIACORE basado en resonancia de plasmon de superficie (RPS) y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 40054010, ademas de los formatos CCAF y ELISA descritos anteriormente.
Mientras tanto, "ligando Fc" o "ligando efector" se refiere a una molecula y preferiblemente a un polipeptido que se une a un dominio Fc del anticuerpo, formando un complejo de ligando Fc/Fc. La molecula puede ser derivada de cualquier organismo. La union de un ligando de Fc a Fc induce preferiblemente una o mas funciones efectoras. Dichos ligandos de Fc incluyen, pero no se limitan a, receptores de Fc, FcyR, FcaR, FceR, FcRn, C1q y C3, lectina de union a manano, receptor de manosa, protema A de Staphylococcus, protema G de Staphylococcus, y FcyR virales. Los ligandos de Fc tambien incluyen homologos del receptor de Fc (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136), que son una familia de receptores de Fc homologos a FcyR. Los ligandos de Fc tambien incluyen moleculas no identificadas que se unen a Fc.
Actividad de union al receptor Fcy
La actividad de union alterada del dominio Fc en cualquiera de los receptores Fcy, FcyI, FcyIIA, FcyIIB, FcyIIIA y/o FcyIIIB puede evaluarse utilizando los formatos CCAF y ELISA descritos anteriormente, asf como ALPHA screen (Ensayo Homogeneo de Proximidad Luminiscente Amplificada) y el metodo BIACORE basado en resonancia de plasmon superficial (RPS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010).
ALPHA screen se realiza mediante la tecnologfa ALPHA basandose en el principio que se describe a continuacion, utilizando dos tipos de perlas: perlas donantes y aceptadoras. Una senal luminiscente se detecta solo cuando las moleculas vinculadas a las perlas donantes interactuan biologicamente con las moleculas vinculadas a las perlas aceptoras y cuando las dos perlas estan ubicadas muy cerca. Excitado por el rayo laser, el fotosensibilizador en una perla donante convierte el oxfgeno alrededor de la perla en oxfgeno singlete excitado. Cuando el oxfgeno singlete se dispersa alrededor de las perlas del donante y alcanza las perlas aceptoras ubicadas muy cerca, se induce una reaccion quimioluminiscente dentro de las perlas aceptoras. Esta reaccion finalmente resulta en la emision de luz. Si las moleculas vinculadas a las perlas del donante no interactuan con las moleculas vinculadas a las perlas aceptoras, el oxfgeno singlete producido por las perlas donantes no alcanza las perlas aceptoras y no se produce
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una reaccion quimioluminiscente.
Por ejemplo, un complejo polipeptidico marcado con biotina se inmoviliza en las perlas donantes y el receptor Fcy marcado con glutation S-transferasa (GST) se inmoviliza en las perlas aceptoras. En ausencia de un complejo polipeptfdico que comprende un dominio Fc mutante competitivo, el receptor Fcy interactua con un complejo polipeptfdico que comprende un dominio Fc de tipo silvestre, induciendo una senal de 520 a 620 nm como resultado. El complejo polipeptfdico que tiene un dominio Fc mutante no marcado compite con el complejo polipeptfdico que comprende un dominio Fc de tipo silvestre para la interaccion con el receptor Fcy. La afinidad de union relativa se puede determinar cuantificando la reduccion de la fluorescencia como resultado de la competencia. Se conocen metodos para biotinilar los complejos polipeptfdicos tales como anticuerpos que utilizan sulfo-NHS-biotina o similares. Los metodos apropiados para anadir la etiqueta GST a un receptor Fcy incluyen metodos que involucran la fusion de polipeptidos que codifican Fcy y GST en marco, que expresan el gen fusionado utilizando celulas introducidas con un vector que lleva el gen, y luego se purifican utilizando una columna de glutation. La senal inducida se puede analizar preferiblemente, por ejemplo, ajustandose a un modelo de competencia de un sitio basado en un analisis de regresion no lineal que utiliza un software, tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).
Una de las sustancias para observar su interaccion esta inmovilizada como un ligando en la capa delgada de oro de un chip sensor. Cuando se proyecta luz en la superficie trasera del chip sensor para que se produzca una reflexion total en la interfaz entre la capa delgada de oro y el vidrio, la intensidad de la luz reflejada se reduce parcialmente en un sitio determinado (senal de RPS). La otra sustancia para observar su interaccion se inyecta como un analito en la superficie del chip sensor. La masa de la molecula de ligando inmovilizada aumenta cuando el analito se une al ligando. Esto altera el mdice de refraccion del disolvente en la superficie del chip sensor. El cambio en el mdice de refraccion provoca un cambio posicional de la senal RPS (a la inversa, la disociacion desplaza la senal a la posicion original). En el sistema Biacore, la cantidad de desplazamiento descrita anteriormente (es decir, el cambio de masa en la superficie del chip sensor) se representa en el eje vertical y, por lo tanto, el cambio de masa a lo largo del tiempo se muestra como datos medidos (sensograma). Los parametros cineticos (constante de velocidad de asociacion (ka) y constante de velocidad de disociacion (kd)) se determinan a partir de la curva del sensograma, y la afinidad (KD) se determina a partir de la relacion entre estas dos constantes. El ensayo de inhibicion se utiliza preferiblemente en los metodos BIACORE. Ejemplos de dicho ensayo de inhibicion se describen en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010.
En esta memoria, "la actividad de union al receptor Fcy se reduce" significa, por ejemplo, que, segun el metodo de analisis descrito anteriormente, la actividad competitiva de un complejo polipeptfdico de ensayo es 50 % o menos, preferiblemente 45 % o menos, 40 % o menos, 35 % o menos, 30 % o menos, 20 % o menos, o 15 % o menos, y particularmente de manera preferible 10 % o menos, 9 % o menos, 8 % o menos, 7 % o menos, 6 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos, o 1 % o menos que la actividad competitiva de un complejo polipeptfdico de control.
Los complejos polipeptfdicos que comprenden el dominio Fc de un anticuerpo monoclonal IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 se pueden utilizar apropiadamente como complejos polipeptfdicos de control. Las estructuras del dominio Fc se muestran en las SEQ ID NOs: 23 (A se anade al extremo N-terminal del numero de acceso a RefSeq AAC82527.1), 24 (A se anade al extremo N-terminal del numero de acceso a RefSeq AAB59393.1), 25 (A se anade al extremo N- terminal del numero de acceso a RefSeq CAA27268.1), y 26 (A se anade al extremo N-terminal del numero de acceso a RefSeq AAB59394.1). Ademas, cuando un complejo polipeptfdico que comprende un mutante en el dominio Fc de un anticuerpo de un isotipo particular se utiliza como sustancia de ensayo, el efecto de la mutacion del mutante en la actividad de union al receptor Fcy se evalua utilizando como control un complejo polipeptfdico que comprende un dominio Fc del mismo isotipo. Como se ha descrito anteriormente, los complejos polipeptfdico que comprenden un mutante del dominio Fc cuya actividad de union al receptor Fcy se ha juzgado como reducida se preparan apropiadamente.
Dichos mutantes conocidos incluyen, por ejemplo, mutantes que tienen una delecion de aminoacidos 231A-238S (numeracion de la UE) (documento WO 2009/011941), asf como mutantes C226S, C229S, P238S, (C220S) (J. Rheumatol (2007) 34, 11); C226S y C229S (Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54); C226S, C229S, E233P, L234V y L235A (Blood (2007) 109, 1185-1192).
Espedficamente, los complejos polipeptfdicos preferidos incluyen aquellos que comprenden un dominio Fc con una sustitucion del aminoacido en la posicion 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331 o 332 (numeracion de la UE) en los aminoacidos que forman el dominio Fc de un anticuerpo de un isotipo particular. El isotipo del anticuerpo a partir del cual se origina el dominio Fc no esta particularmente limitado, y es posible utilizar un dominio Fc apropiado derivado de un anticuerpo monoclonal IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Es preferible utilizar dominios Fc derivados de anticuerpos IgG1.
Los complejos polipeptfdicos preferidos incluyen, por ejemplo, aquellos que comprenden un dominio Fc que tiene una cualquiera de las sustituciones que se muestran a continuacion, cuyas posiciones se especifican segun la numeracion de la UE (cada numero representa la posicion de un residuo de aminoacido en la numeracion de la UE;
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y el s^bolo de aminoacido de una letra antes del numero representa el residuo de aminoacido antes de la sustitucion, mientras que el sfmbolo de aminoacido de una letra despues del numero representa el residuo de aminoacido antes de la sustitucion) en los aminoacidos que forman el dominio Fc del anticuerpo IgG1:
(a) L234F, L235E, P331S;
(b) C226S, C229S, P238S;
(c) C226S, C229S; o
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A,
asf como aquellos que tienen un dominio Fc que tiene una delecion de la secuencia de aminoacidos en las posiciones 23l a 238.
Ademas, los complejos polipeptidicos preferidos tambien incluyen aquellos que comprenden un dominio Fc que tiene una cualquiera de las sustituciones que se muestran a continuacion, cuyas posiciones se especifican segun la numeracion de la UE en los aminoacidos que forman el dominio Fc de un anticuerpo IgG2:
(e) H268Q, V309L, A330S, y P331S;
(f) V234A;
(g) G237A;
(h) V234A y G237A;
(i) A235E y G237A; o
(j) V234A, A235E y G237A. Cada numero representa la posicion de un residuo de aminoacido en la numeracion de la UE; y el sfmbolo de aminoacido de una letra antes del numero representa el residuo de aminoacido antes de la sustitucion, mientras que el sfmbolo de aminoacido de una letra despues del numero representa el residuo de aminoacido antes de la sustitucion.
Ademas, los complejos polipeptfdicos preferidos tambien incluyen aquellos que comprenden un dominio Fc que tiene uno cualquiera de las sustituciones que se muestran a continuacion, cuyas posiciones se especifican segun la numeracion de la UE en los aminoacidos que forman el dominio Fc de un anticuerpo IgG3:
(k) F241A;
(l) D265A; o
(m) V264A. Cada numero representa la posicion de un residuo de aminoacido en la numeracion de la UE; y el sfmbolo de aminoacido de una letra antes del numero representa el residuo de aminoacido antes de la sustitucion, mientras que el sfmbolo de aminoacido de una letra despues del numero representa el residuo de aminoacido antes de la sustitucion.
Ademas, los complejos polipeptfdicos preferidos tambien incluyen aquellos que comprenden un dominio Fc que tiene una cualquiera de las sustituciones que se muestran a continuacion, cuyas posiciones se especifican segun la numeracion de la UE en los aminoacidos que forman el dominio Fc de un anticuerpo IgG4:
(n) L235A, G237A, y E318A;
(o) L235E; o
(p) F234A y L235A. Cada numero representa la posicion de un residuo de aminoacido en la numeracion de la UE; y el sfmbolo de aminoacido de una letra antes del numero representa el residuo de aminoacido antes de la sustitucion, mientras que el sfmbolo de aminoacido de una letra despues del numero representa el residuo de aminoacido antes de la sustitucion.
Los otros complejos polipeptfdicos preferidos incluyen, por ejemplo, aquellos que comprenden un dominio Fc en el que cualquier aminoacido en la posicion 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330 o 331 (numeracion de la UE) en los aminoacidos que forman el dominio Fc de un anticuerpo IgG1 se sustituye con un aminoacido de la posicion correspondiente en la numeracion de la UE en la IgG2 o IgG4 correspondiente.
Los complejos polipeptfdicos preferidos tambien incluyen, por ejemplo, aquellos que comprenden un dominio Fc en el que uno o mas de los aminoacidos en las posiciones 234, 235 y 297 (numeracion de la UE) en los aminoacidos que forman el dominio Fc de un anticuerpo IgGl es sustituido con otros aminoacidos. El tipo de aminoacido despues de la sustitucion no esta particularmente limitado; sin embargo, los complejos polipeptfdicos que comprenden un dominio Fc en el que uno cualquiera o mas de los aminoacidos en las posiciones 234, 235 y 297 estan sustituidos con alanina son particularmente preferidos.
Los complejos polipeptfdicos preferidos tambien incluyen, por ejemplo, aquellos que comprenden un dominio Fc en el que un aminoacido en la posicion 265 (numeracion de la UE) en los aminoacidos que forman el dominio Fc de un anticuerpo IgG1 esta sustituido con otro aminoacido. El tipo de aminoacido despues de la sustitucion no esta particularmente limitado; sin embargo, los complejos polipeptfdicos que comprenden un dominio Fc en el que un aminoacido en la posicion 265 esta sustituido con alanina son particularmente preferidos.
Dominio Fc derivado de un anticuerpo biespedfico
En esta memoria, los dominios Fc apropiados derivados de anticuerpos biespedficos tambien se utilizan como un
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dominio Fc con actividad de union al receptor Fcy reducida. Un anticuerpo biespedfico es un anticuerpo que tiene dos especificidades diferentes. El anticuerpo biespedfico de tipo IgG puede secretarse a partir de hibridomas tffbridos (quadroma) producidos al fusionar dos tipos de hibridomas productores de anticuerpos IgG (Milstein C et al., Nature (1983) 305, 537-540).
Alternativamente, el anticuerpo biespedfico de tipo IgG tambien puede secretarse introduciendo un total de cuatro genes, los genes de las cadenas L y las cadenas P que forman dos tipos de IgG de interes, en las celulas y las que la con-expresan. Sin embargo, en teona, existen diez combinaciones de cadenas P de IgG y cadenas L producidas por tales metodos. Es diffcil purificar la IgG que consiste en una combinacion deseada de cadena P y cadena L de diez tipos de IgG. Ademas, en teona, la cantidad de IgG secretada con una combinacion deseada tambien se reduce significativamente, lo que requiere un cultivo a gran escala. Esto aumenta aun mas el costo de produccion.
En este caso, se puede introducir una sustitucion de aminoacido apropiada en el dominio CH3 formando un dominio Fc de la cadena P para secretar preferentemente IgG con una combinacion heterologa de cadenas P. Espedficamente, este metodo se lleva a cabo sustituyendo un aminoacido que tiene una cadena lateral mas grande (boton (que significa "protuberancia") con un aminoacido en el dominio CH3 de una de las cadenas P, y sustituyendo un aminoacido que tiene una cadena lateral mas pequena (ojal (que significa "vado")) con un aminoacido en el dominio CH3 de la otra cadena P, de modo que el boton se coloca en el ojal. Esto promueve la formacion de la cadena P heteromerica e inhibe simultaneamente la formacion de la cadena P homomerica (documento WO 1996/027011; Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
Por otra parte, con respecto a la cadena L, la region variable de la cadena L es menos polimorfica que la region variable de la cadena P, y por lo tanto, se espera obtener una cadena L comun que pueda conferir capacidad de union a ambas cadenas P. La expresion eficiente de una IgG biespedfica se puede lograr introduciendo los genes de tal cadena L comun y dos cadenas P en las celulas para expresar la IgG (Nature Biotechnology (1998) 16, 677681). Sin embargo, es diffcil darse cuenta de esta idea puesto que la probabilidad de que dos tipos de anticuerpos que contienen la misma cadena L se seleccionen al azar es baja. Por consiguiente, se propone un metodo para seleccionar una cadena L comun que muestre una fuerte capacidad de union a cualquier cadena P diferente (documento WO 2004/065611).
Ademas, tambien hay tecnicas conocidas para producir un anticuerpo biespedfico aplicando metodos para controlar la asociacion de polipeptidos, o la asociacion de mulffmeros heteromeros formados por polipeptidos a la asociacion entre los dos polipeptidos que forman un dominio Fc. Espedficamente, los metodos para controlar la asociacion de polipeptidos se pueden emplear para producir un anticuerpo biespedfico (documento WO 2006/106905), en el que los residuos de aminoacidos que forman la interfaz entre dos polipeptidos que forman el dominio Fc se alteran para inhibir la asociacion entre los dominios Fc que tienen la misma secuencia y para permitir la formacion de complejos polipepffdicos formados por dos dominios Fc de diferentes secuencias.
Los dos polipeptidos descritos anteriormente que forman un dominio Fc derivado de un anticuerpo biespedfico pueden utilizarse apropiadamente como un dominio que abarca un dominio Fc de la presente invencion. Mas espedficamente, tales dos polipeptidos preferidos que forman un dominio Fc incluyen aquellos en los que los aminoacidos en las posiciones 349 y 366 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido son cistema y triptofano, respectivamente, y los aminoacidos en las posiciones 356, 366, 368 y 407 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido son cistema, serina, alanina y valina, respectivamente.
En otra realizacion, los dominios preferidos que abarcan un dominio Fc de la presente invencion incluyen dos polipeptidos que forman un dominio Fc, en el que el aminoacido en la posicion 409 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido es acido aspartico, y el aminoacido en la posicion 399 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido es lisina. En la realizacion anterior, el aminoacido en la posicion 409 puede ser acido glutamico en lugar de acido aspartico, mientras que el aminoacido en la posicion 399 puede ser arginina en lugar de lisina. Ademas, el acido aspartico en la posicion 360 o 392 tambien puede combinarse preferiblemente con lisina en la posicion 399.
En otra realizacion, los dominios preferidos que abarcan un dominio Fc de la presente invencion incluyen dos polipeptidos que forman un dominio Fc, en el que el aminoacido en la posicion 370 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido es acido glutamico, y el aminoacido en la posicion 357 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido es lisina.
En otra realizacion mas, los dominios preferidos que abarcan un dominio Fc de la presente invencion incluyen dos polipeptidos que forman un dominio Fc, en el que el aminoacido en la posicion 439 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido es acido glutamico, y el aminoacido en la posicion 356 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido es lisina.
Ademas, los dominios preferidos que abarcan un dominio Fc de la presente invencion incluyen realizaciones con una combinacion de los mismos:
dos polipeptidos que forman un dominio Fc, en los cuales los aminoacidos en las posiciones 409 y 370 (numeracion
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de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido son acido aspartico y acido glutamico, respectivamente, y los aminoacidos en las posiciones 399 y 357 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido son ambos lisina (en esta realizacion, el acido glutamico en la posicion 370 puede reemplazarse con acido aspartico y acido glutamico en la posicion 370 puede reemplazarse con acido aspartico en la posicion 392); dos polipeptidos que forman un dominio Fc, en el que los aminoacidos en las posiciones 409 y 439 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido son acido aspartico y acido glutamico, respectivamente, y los aminoacidos en las posiciones 399 y 356 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido son ambos lisina (en esta realizacion, la posicion del acido glutamico en 439 puede reemplazarse con acido aspartico en la posicion 360, 392 o 439);
dos polipeptidos que forman un dominio Fc, en el que los aminoacidos en las posiciones 370 y 439 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido son ambos acido glutamico, y los aminoacidos en las posiciones 357 y 356 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido son ambos lisina; y dos polipeptidos que forman un dominio Fc, en el que los aminoacidos en las posiciones 409, 370 y 439 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido son acido aspartico, acido glutamico y acido glutamico, respectivamente, y los aminoacidos en las posiciones 399, 357 y 356 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido son todos lisina (en esta realizacion, el aminoacido en la posicion 370 puede no estar sustituido con acido glutamico; alternativamente, en lugar de sustituir el aminoacido en la posicion 370 con acido glutamico, el acido glutamico en la posicion 439 puede reemplazarse con acido aspartico, o el acido glutamico en la posicion 439 puede reemplazarse con acido aspartico en la posicion 392).
En otra realizacion, los dominios preferidos que abarcan un dominio Fc de la presente invencion incluyen dos polipeptidos que forman un dominio Fc, en el que el aminoacido en la posicion 356 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido es lisina, y los aminoacidos en las posiciones 435 y 439 (numeracion de la UE) en la secuencia de aminoacidos del otro polipeptido son arginina y acido glutamico, respectivamente.
Cuando los dos polipeptidos descritos anteriormente que forman un dominio Fc derivado de un anticuerpo biespedfico se utilizan como un dominio que abarca un dominio Fc de la presente invencion, los dominios de union a antfgeno y/o los dominios de union a CD3 de la presente invencion pueden disponerse en una combinacion deseada
Dominio Fc con heterogeneidad C-terminal reducida
En esta memoria, los dominios Fc con una heterogeneidad C-terminal del dominio Fc mejorada, ademas de la caractenstica descrita anteriormente, se utilizan apropiadamente como dominios Fc con actividad de union al receptor Fcy reducida. Mas espedficamente, la presente invencion proporciona dominios Fc en los que delecionan glicina y lisina en las posiciones 446 y 447 (numeracion de la UE), respectivamente, en las secuencias de aminoacidos de dos polipeptidos que forman un dominio Fc derivado de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Dominio de union al complejo receptor de celulas T
En esta memoria, "dominio de union al complejo receptor de celulas T" se refiere a una porcion de un anticuerpo del complejo receptor de celulas T, que comprende una region que se une espedficamente y es complementaria a la totalidad o a una porcion de un complejo receptor de celulas T. Dicho complejo receptor de celulas T puede ser el propio receptor de celulas T, o una molecula adaptadora que junto con el receptor de celulas T forma el complejo receptor de celulas T. Un adaptador preferido es CD3.
Dominio de union al receptor de celulas T
En esta memoria, "dominio de union al receptor de celulas T" se refiere a una porcion de un anticuerpo receptor de celulas T, que comprende una region que se une espedficamente y es complementaria a la totalidad o a una porcion de un receptor de celulas T.
Es posible utilizar la region variable o la region constante de un receptor de celulas T. Sin embargo, los epftopos preferidos a los que se une un dominio de union a CD3 son aquellos localizados en la region constante. Las secuencias de la region constante incluyen, por ejemplo, las de la cadena a del receptor de celulas T (numero de acceso a RefSeq CAA26636.1; SEQ ID NO: 67), la cadena p del receptor de celulas T (numero de acceso a RefSeq C25777; SEQ ID NO: 68), cadena y1 del receptor de celulas T (numero de acceso a RefSeq A26659; SEQ ID NO: 69), cadena y2 del receptor de celulas T (numero de acceso a RefSeq AAB63312.1; SEQ ID NO: 70) y cadena 6 del receptor de celulas T (numero de acceso a RefSeq AAA61033 .1; SeQ ID NO: 71).
Dominio de union a CD3
En esta memoria, "dominio de union a CD3" se refiere a una porcion de un anticuerpo CD3, que comprende una region que se une espedficamente y es complementaria a la totalidad o a una porcion de CD3. El dominio de union a CD3 se puede derivar de uno o mas dominios variables de anticuerpos. Preferiblemente, el dominio de union a CD3 incluye tanto la region variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo CD3 como la region variable de la cadena pesada (VP) del anticuerpo CD3. Dichos dominios de union a CD3 preferidos incluyen, por ejemplo, "Fv de cadena sencilla (scFv)", "anticuerpo de cadena sencilla", "Fv", "Fv2 de cadena sencilla (scFv2)", "Fab" y "F(ab')2".
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El dominio de union a CD3 de la presente invencion puede unirse a cualquier epftopo, siempre que el epftopo este ubicado dentro de la secuencia de la cadena y, la cadena 6 o la cadena £ formando CD3 humano. En la presente invencion, los dominios de union a CD3 preferidos incluyen aquellos que comprenden una region variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo CD3 y una region variable de cadena pesada (VP) de anticuerpo CD3, que se unen a un epftopo en el dominio extracelular de la cadena £ de un complejo CD3 humano. Dichos dominios de union a CD3 preferidos incluyen aquellos que comprenden una region variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo CD3 y una region variable de cadena pesada (VP) de anticuerpo CD3 de anticuerpo OKT3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4914-4917) o varios anticuerpos CD3 conocidos. Ademas, dichos dominios de union a CD3 apropiados incluyen aquellos derivados de un anticuerpo CD3 con caractensticas deseadas, que se obtienen inmunizando un animal deseado con la cadena y, la cadena 6 o la cadena £ que forma CD3 humano mediante los metodos descritos anteriormente. Los anticuerpos anti-CD3 apropiados de los que se deriva un dominio de union a CD3 incluyen anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados apropiadamente como se ha descrito anteriormente. Las estructuras de la cadena y, la cadena 6 y la cadena £ que forman CD3 se muestran como secuencias de polinucleotidos en SEQ ID NOs: 27 (NM_000073.2), 29 (NM_000732.4) y 31 (NM_000733.3), respectivamente, y como secuencias de polipeptidos en SEQ ID NO: 28 (NP_000064.1), 30 (NP_000723.1) y 32 (NP_000724.1), respectivamente (el numero de acceso a RefSeq se muestra entre parentesis).
Complejo polipeptfdico
La estructura de un complejo polipeptfdico de la presente invencion se define por las reivindicaciones y generalmente contiene
(1) un dominio de union a antfgeno canceroso;
(2) un dominio que comprende un dominio Fc con una actividad de union al receptor Fcy reducida como se define; y
(3) un dominio de union al complejo receptor de celulas T que es un dominio de union a CD3 como se define.
Los otros complejos polipeptfdicos descritos en esta memoria sirven para entender completamente los antecedentes y el campo de la invencion reivindicada, y proporcionar orientacion al experto en la tecnica si es necesario.
Cada uno de los dominios descritos anteriormente puede estar vinculado directamente a un enlace peptfdico. Por ejemplo, (1) F(ab')2 se utiliza como el dominio de union a antigeno, y (2) un dominio Fc con actividad reducida de union al receptor Fcy se utiliza como el dominio que comprende un dominio Fc con actividad reducida de union al receptor Fcy. En este caso, cuando el dominio de union a antigeno de (1) esta vinculado por un enlace peptfdico al dominio que comprende un dominio Fc de (2), el polipeptido vinculado forma una estructura de anticuerpo. Dicho anticuerpo puede prepararse purificando los medios de cultivo del hibridoma descrito anteriormente o purificando los medios de cultivo de celulas huesped deseadas que llevan de manera estable el polinucleotido que codifica el polipeptido formador de anticuerpos.
Generalmente, cuando el dominio de union a CD3 de (3) esta vinculado a la estructura del anticuerpo, el dominio de union a CD3 puede estar vinculado mediante un enlace peptfdico al extremo C-terminal de la region constante de la estructura del anticuerpo. En otra realizacion, el dominio de union a CD3 esta vinculado por un enlace peptfdico al extremo N-terminal de la region variable de la cadena pesada o la region variable de la cadena ligera de la estructura del anticuerpo. En la otra realizacion, el dominio de union a CD3 puede estar vinculado por un enlace peptfdico al extremo C-terminal de la region constante de la cadena ligera de la estructura del anticuerpo. El dominio de union a CD3 a vincular puede tener cualquier estructura deseada; sin embargo, tal dominio de union a CD3 apropiado incluye preferiblemente Fv, y mas preferiblemente scFv. La valencia del dominio de union a CD3 que se une a la estructura del anticuerpo no esta limitada. Para vincular un dominio de union a CD3 divalente a la estructura del anticuerpo, un dominio de union a CD3 monovalente puede estar vinculado a un enlace peptfdico a los respectivos extremos C-terminales de dos dominios Fc que forman la region constante de la estructura del anticuerpo. Alternativamente, para vincular un dominio de union a CD3 divalente a la estructura del anticuerpo, un scFv divalente (es decir, sc(Fv)2) puede estar vinculado a un enlace peptfdico al termino C terminal de uno de los dos dominios Fc. En este caso, el complejo polipeptfdico en el que un scFv divalente (es decir, sc(Fv)2) esta vinculado al extremo C-terminal de solo uno de los dos dominios Fc que forman la region constante de la estructura del anticuerpo se produce de manera eficiente utilizando un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico. Alternativamente, para vincular un dominio de union a CD3 monovalente a la estructura del anticuerpo, un scFv monovalente puede estar vinculado a un enlace peptfdico al extremo C-terminal de uno de los dos dominios Fc. En este caso, un complejo polipeptfdico de la presente invencion en el que un scFv monovalente esta vinculado al extremo C-terminal de solo uno de los dos dominios Fc que forman la region constante de la estructura del anticuerpo se produce de manera eficiente utilizando un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico.
Ademas, cuando el dominio de union a CD3 de (3) esta vinculado a un enlace peptfdico al extremo C-terminal de la region constante de la estructura del anticuerpo, los complejos polipeptfdicos apropiados incluyen aquellos en los que el fragmento Fv de cadena pesada que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al extremo C-terminal de una region constante (dominio CH3) que forma el dominio Fc, y el fragmento Fv de la cadena ligera que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al extremo C-terminal de la otra region constante (dominio CH3) que forma el dominio Fc. En este caso, se inserta un enlazador apropiado tal como Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 7) para vincular el fragmento Fv de la cadena pesada o de la cadena ligera al extremo C-terminal de la region constante
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(dominio CH3). El numero de repeticiones en el enlazador no esta limitado; sin embargo, se selecciona de 1 a 10, preferiblemente de 2 a 8, o mas preferiblemente de 2 a 6. Espedficamente, es posible insertar un enlazador apropiado en el que el numero de repeticiones de [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser] (SEQ ID NO: 7) sea 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
Alternativamente, cuando se produce un complejo polipeptidico en el que el fragmento Fv de cadena pesada que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al extremo C-terminal de una region constante (dominio CH3) que forma el dominio Fc y el fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a CD3 esta vinculado al extremo C- terminal de la otra region constante (dominio CH3) que forma el dominio Fc, se pueden utilizar las alteraciones apropiadas de los residuos de aminoacidos que permiten la formacion de enlaces disulfuro entre el fragmento Fv de cadena pesada y el fragmento Fv de cadena ligera para potenciar la asociacion entre el fragmento Fv de cadena pesada y el fragmento Fv de cadena ligera.
En otra realizacion, cuando se produce un complejo polipeptfdico en el que el fragmento Fv de cadena pesada que forma el dominio de union a cD3 esta vinculado al extremo C-terminal de una region constante (dominio CH3) que forma el dominio Fc y el fragmento Fv de cadena ligera que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al extremo C-terminal de la otra region constante (dominio cH3) que forma el dominio Fc, los dominios CH1 y CL del anticuerpo pueden vincularse a cada uno de los fragmentos Fv de cadena pesada y cada uno de los fragmentos Fv de cadena ligera para potenciar la asociacion entre el fragmento Fv de cadena pesada y el fragmento Fv de cadena ligera.
En otra realizacion, con el fin de vincular un dominio de union a CD3 divalente a la estructura del anticuerpo, un dominio de union a CD3 monovalente puede estar vinculado a un enlace peptfdico a los respectivos extremos C- terminales de dos regiones constantes de cadena ligera o los respectivos extremos N-terminales de las regiones variables de cadena ligera de la estructura del anticuerpo. Alternativamente, con el fin de vincular un dominio de union a CD3 divalente a la estructura del anticuerpo, un scFv divalente (es decir, sc(Fv)2) puede estar vinculado a un enlace peptfdico a los respectivos extremos C-terminales de las dos regiones constantes de cadena ligera o los respectivos extremos N-terminales de regiones variables de cadena ligera. En este caso, los complejos polipeptfdicos en los que se vincula un scFv divalente (es decir, sc(Fv)2) al extremo C- o N-terminal de una de las dos regiones variables de cadena ligera de la estructura del anticuerpo pueden producirse de manera eficiente utilizando un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico. Alternativamente, con el fin de vincular un dominio de union a CD3 monovalente a la estructura del anticuerpo, un scFv monovalente puede estar vinculado a un enlace peptfdico al extremo C- o N-terminal de una de las dos regiones variables de cadena ligera. En este caso, los complejos polipeptfdicos de la presente invencion en los que se vincula un scFv monovalente al extremo N- o C-terminal de una region variable de cadena ligera de las dos regiones variables de cadena ligera de la estructura del anticuerpo pueden producirse eficazmente utilizando un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico.
En otra realizacion, con el fin de vincular un dominio de union a CD3 divalente a la estructura del anticuerpo, un dominio de union a CD3 monovalente puede estar vinculado a un enlace peptfdico a los extremos N-terminales respectivos de dos regiones variables de cadena pesada de la estructura del anticuerpo. Alternativamente, con el fin de vincular un dominio de union a CD3 divalente a la estructura del anticuerpo, un scFv divalente (es decir, sc(Fv)2) puede estar vinculado a un enlace peptfdico al extremo N-terminal de una de las dos regiones variables de cadena pesada. En este caso, los complejos polipeptfdicos en los que se vincula un scFv divalente (es decir, sc(Fv)2) al extremo N-terminal de solo una de las dos regiones variables de cadena pesada de la estructura del anticuerpo pueden producirse de manera eficiente utilizando un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico. Alternativamente, con el fin de vincular un dominio de union a CD3 monovalente a la estructura del anticuerpo, un scFv monovalente puede estar vinculado a un enlace peptfdico al extremo N-terminal de una de las dos regiones variables de cadena pesada. En este caso, los complejos polipeptfdicos de la presente invencion en los que se vincula un scFv monovalente al extremo N-terminal de una de las dos regiones variables de cadena pesada de la estructura del anticuerpo pueden producirse de manera eficiente utilizando un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico.
Ademas, un complejo polipeptfdico descrito anteriormente puede producirse vinculando cada dominio directamente a traves de un enlace peptfdico o mediante un peptido que se une a un enlazador peptfdico. En este caso, el enlazador que se utilizara incluye el enlazador descrito anteriormente como ejemplo y los enlazadores apropiados con una etiqueta peptfdica, por ejemplo, etiqueta His, etiqueta HA, etiqueta myc o etiqueta FLAG. Ademas, se prefiere utilizar la propiedad de union mutua basada en enlaces de hidrogeno, enlaces disulfuro, enlaces covalentes o interaccion ionica, o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, es posible emplear la afinidad entre el anticuerpo CH1 y CL, o los dominios Fc descritos anteriormente derivados de un anticuerpo biespedfico pueden utilizarse para la asociacion heteromerica de los dominios Fc. Ademas, los enlaces disulfuro entre dominios pueden utilizarse preferiblemente como se describe en los Ejemplos.
En otra estructura del complejo polipeptfdico, por ejemplo, un Fv monovalente y un Fab monovalente se utilizan preferiblemente como (1) el dominio de union a antfgeno. En este caso, se utiliza la siguiente estructura. El fragmento Fv de cadena pesada (VP) o el fragmento Fv de cadena ligera (VL) del Fv monovalente esta vinculado por un enlace peptfdico al dominio CH1 de la cadena pesada. El dominio CH1 de la cadena pesada esta vinculado
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por un enlace peptidico a uno de (2) los dos dominios Fc con actividad de union al receptor Fcy reducida que forman el complejo polipeptidico de la presente invencion. El otro fragmento VL o VP del Fv monovalente esta vinculado a traves del enlace peptidico al dominio CH de la cadena ligera que esta vinculado por un enlace disulfuro al dominio CH1 de la cadena pesada. Por lo tanto, VP y VL, respectivamente, vinculadas a los extremos terminales del dominio CH1 de cadena pesada y el dominio CL de cadena ligera forman un dominio de union a anticuerpo. sc(Fv)2, que forma tanto el (1) dominio de union a anticuerpo como (3) el dominio de union a CD3, puede estar vinculado mediante un enlace peptfdico al extremo N-terminal del otro dominio Fc de los dos descritos anteriormente. En este caso, un complejo polipeptfdico que tiene una estructura en la que se vincula el dominio CH1 de la cadena pesada por un enlace peptfdico a uno de los dos dominios Fc que forman el complejo polipeptfdico, y sc(Fv)2 se vincula enlace peptfdico al otro dominio Fc pueden ser producidos utilizando un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico. El complejo polipeptfdico descrito anteriormente puede producirse vinculando cada dominio directamente por un enlace peptfdico o por un peptido que se une a un enlazador peptfdico. En este caso, el enlazador que se utilizara incluye los enlazadores descritos anteriormente como ejemplo y los enlazadores apropiados con una etiqueta peptfdica, por ejemplo, etiqueta His, etiqueta HA, etiqueta myc o etiqueta FLAG.
En otra estructura preferida del complejo polipeptfdico, por ejemplo, tambien se utiliza un scFv divalente como (1) el dominio de union a antigeno. En una realizacion de la estructura, tambien es posible producir un complejo polipeptfdico en el que uno de los scFv divalentes esta vinculado mediante un enlace peptfdico a traves de VP que forma (3) el dominio de union a CD3 a uno de los dos (2) dominios Fc con actividad de union al receptor Fcy reducida, y el otro scFv divalente esta vinculado a un enlace peptfdico a traves de VL formando (3) el dominio de union a CD3 a uno de los dos (2) dominios Fc con actividad de union al receptor Fcy reducida. En este caso, es posible utilizar un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico. El complejo polipeptfdico descrito anteriormente puede producirse vinculando cada dominio directamente por un enlace peptfdico o por un peptido que se une a un enlazador peptfdico. En este caso, el enlazador que se utilizara incluye los enlazadores descritos anteriormente como ejemplo y los enlazadores apropiados con una etiqueta peptfdica, por ejemplo, etiqueta His, etiqueta HA, etiqueta myc o etiqueta FLAG.
En otra realizacion de la estructura en la que se utiliza un scFv divalente como (1) el dominio de union a antfgeno, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que uno de los scFv divalentes esta vinculado al enlace peptfdico que forma scFv (3) el dominio de union a CD3 a uno de los dos (2) dominios Fc con actividad de union al receptor Fcy reducida, y el otro scFv divalente esta vinculado a un enlace peptfdico al otro (2) dominio Fc con receptor Fcy reducido. En este caso, un complejo polipeptfdico en el que el scFv que forma el dominio de union a antigeno esta vinculado mediante un enlace peptfdico a traves de scFv que forma el dominio de union a CD3 a uno de los dos dominios Fc que forman el complejo polipeptfdico, y scFv que forma el dominio de union a antigeno esta vinculado por un enlace peptfdico al otro dominio Fc, puede producirse utilizando un dominio Fc descrito anteriormente derivado de un anticuerpo biespedfico. El complejo polipeptfdico descrito anteriormente puede producirse vinculando cada dominio directamente por un enlace peptfdico o por un peptido que se une a un enlazador peptfdico. En este caso, el enlazador que se utilizara incluye los enlazadores descritos anteriormente como ejemplo y los enlazadores apropiados con una etiqueta peptfdica, por ejemplo, etiqueta His, etiqueta HA, etiqueta myc o etiqueta FLAG.
Segun el complejo polipeptfdico de la presente invencion, tanto el dominio de union a antigeno como el dominio de union al complejo receptor de celulas T son, cada uno, una estructura de Fab monovalente. En una realizacion de la estructura, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que un fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antigeno esta vinculado a traves de un dominio CH1 a un polipeptido que forma un dominio Fc y un fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL, mientras que un fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de union al receptor de celulas T esta vinculado a traves de un dominio CH1 al otro polipeptido que forma el dominio Fc y un fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL.
En otra realizacion de la estructura, tambien es posible producir un complejo polipeptfdico en el que un fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado a traves de un dominio CH1 a un polipeptido que forma un dominio Fc y un fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL, mientras que un fragmento Fv de cadena ligera de un Fab que forma el dominio de union al receptor de celulas T esta vinculado a traves de un dominio CH1 al otro polipeptido que forma el dominio Fc y un fragmento Fv de cadena pesada del Fab esta vinculado a un dominio CL. Alternativamente, tambien es posible producir un complejo polipeptfdico en el que un fragmento Fv de cadena pesada de Fab monovalente que forma el dominio de union al receptor de celulas T se vincula a traves de un dominio CH1 a un polipeptido que forma un dominio Fc y un fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL, mientras que un fragmento Fv de cadena ligera de un Fab que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado a traves de un dominio CH1 al otro polipeptido que forma un dominio Fc y un fragmento Fv de cadena pesada del Fab esta vinculado a un dominio CL
En otra realizacion de la estructura, tambien es posible producir un complejo polipeptfdico en el que un fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado a traves de un dominio CH1 a un polipeptido que forma un dominio Fc y un fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL, mientras que un fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de union al receptor de celulas T esta vinculado a traves de un dominio CL al otro polipeptido que forma un dominio Fc y un fragmento Fv
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Se describe otra estructura del complejo polipeptfdico en el que tanto el dominio de union a antigeno como el dominio de union al complejo receptor de celulas T son cada uno una estructura de Fab monovalente, los polipeptidos preferidos incluyen aquellos que tienen:
(1) un dominio de union a antigeno en el que un fragmento Fv de cadena pesada de una estructura Fab monovalente que se une a un antfgeno se vincula a traves de un dominio CH1 a uno de los polipeptidos descritos anteriormente que forman un dominio Fc y un fragmento Fv de cadena ligera de la estructura Fab esta vinculado a un dominio CL; y
(2) un dominio de union al complejo receptor de celulas T en el que un fragmento Fv de cadena pesada de una estructura Fab monovalente que se une a un complejo receptor de celulas T se vincula a traves de un dominio CH1 al otro polipeptido que forma un dominio Fc y un fragmento Fv de cadena ligera de la estructura Fab esta vinculado a un dominio CL;
y en el que las cargas electricas de los dominios CH1 y CL se controlan de manera que el fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antfgeno se asocie con el fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a antfgeno, o el fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al receptor de celulas T esta asociado con el fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al receptor de celulas T. En esta realizacion, la estructura (estructura con asociacion controlada) del complejo polipeptfdico no se limita a una estructura particular, siempre que las cargas electricas de los dominios CH1 y CL se controlen de manera que el fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union a antfgeno esta asociado con el fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a antfgeno, o el fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al receptor de celulas T esta asociado con el fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al receptor de celulas T.
En una realizacion de la estructura con asociacion controlada, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo receptor de celulas T tengan las mismas cargas electricas que los residuos aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a antfgeno.
En una realizacion de la estructura con asociacion controlada, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antfgeno tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al complejo receptor de celulas T.
En una realizacion de la estructura con asociacion controlada, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo del receptor de celulas T tengan las mismas cargas electricas que el amino los residuos acidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al antfgeno, y los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antfgeno tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al complejo receptor de celulas T.
En otra realizacion de la estructura con asociacion controlada, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo receptor de celulas T tengan las mismas cargas electricas que los residuos aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a antfgeno, y los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo receptor de celulas T tengan cargas electricas opuestas a las de los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al receptor de celulas T.
En otra realizacion de la estructura con asociacion controlada, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo receptor de celulas T tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a antfgeno; los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antfgeno tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al complejo receptor de celulas T; y los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo receptor de celulas T tengan cargas electricas opuestas a las de los residuos de aminoacidos del dominio Cl vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al receptor de celulas T.
En otra realizacion de la estructura con asociacion controlada, es posible producir un complejo polipeptfdico en el
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que los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antigeno tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al complejo receptor de celulas T, y los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antigeno tengan cargas electricas opuestas a las de los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a antigeno.
En una realizacion alternativa de la estructura con asociacion controlada, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo receptor de celulas T tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a antfgeno; los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antfgeno tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al complejo receptor de celulas T; y los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antfgeno tengan cargas electricas opuestas a las de los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al antfgeno.
En otra realizacion de la estructura con asociacion controlada, es posible producir un complejo polipeptfdico en el que los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo receptor de celulas T tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union a antfgeno; los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antfgeno tengan las mismas cargas electricas que los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al complejo receptor de celulas T; los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al complejo receptor de celulas T tengan cargas electricas opuestas a las de los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera dominio de union al receptor de celulas T; y los residuos de aminoacidos del dominio CH1 vinculados al fragmento Fv de cadena pesada del dominio de union al antfgeno tengan cargas electricas opuestas a las de los residuos de aminoacidos del dominio CL vinculados al fragmento Fv de cadena ligera del dominio de union al antfgeno.
Control de cargas electricas de dominios CH1 y CL
Para obtener un complejo polipeptfdico biespedfico que reconozca un epttopo del dominio de union al receptor de celulas T por las cadenas pesada y ligera del dominio de union al receptor de celulas T, y un epftopo de un antfgeno por las cadenas pesada y ligera del dominio de union al antfgeno, teoricamente se producen diez tipos de moleculas de complejos polipeptfdicos si cada una de las cuatro cadenas se expresa al producir el complejo polipeptfdico.
Sin embargo, la molecula de complejo polipeptfdico deseada puede obtenerse preferentemente, por ejemplo, controlando los dominios para inhibir la asociacion entre la cadena pesada del dominio de union al receptor de celulas T y la cadena ligera del dominio de union a antfgeno, y/o la asociacion entre la cadena pesada del dominio de union a antfgeno y la cadena ligera del dominio de union al receptor de celulas T.
Los ejemplos incluyen alteraciones de los residuos de aminoacidos que forman una interfaz entre la cadena pesada CH1 del dominio de union al receptor de celulas T y la cadena ligera CL del dominio de union al antfgeno a residuos de aminoacidos cargados positivamente, y las alteraciones de los residuos de aminoacidos que forman una interfaz entre la cadena pesada CH1 del dominio de union a antfgeno y la cadena ligera CL del dominio de union al receptor de celulas T a residuos de aminoacidos cargados negativamente. Como resultado de tales alteraciones, se inhibe la asociacion no deseada entre la cadena pesada CH1 del dominio de union al receptor de celulas T y la cadena ligera CL del dominio de union al antfgeno ya que las cargas electricas de los residuos de aminoacidos que forman la interfaz son ambas positivas y la asociacion no deseada entre la cadena pesada CH1 del dominio de union a antfgeno y la cadena ligera CL del dominio de union al receptor de celulas T tambien se inhibe ya que las cargas electricas de los residuos de aminoacidos que forman la interfaz son ambas negativas. Un complejo polipeptfdico deseado de la presente invencion puede producirse eficazmente como resultado de la asociacion deseada entre la cadena pesada CH1 del dominio de union al receptor de celulas T y la cadena ligera CL del dominio de union al receptor de celulas T, asf como la asociacion deseada entre la cadena pesada CH1 del dominio de union a antfgeno y la cadena ligera CL del dominio de union a antfgeno. Ademas, la asociacion deseada entre las cadenas ligeras y pesadas de los dominios de union al receptor de celulas T se promueve preferiblemente ya que los residuos de aminoacidos que forman la interfaz tienen cargas electricas opuestas entre sf La asociacion deseada entre las cadenas pesada y ligera de los dominios de union a antfgeno tambien se promueve preferiblemente ya que los residuos de aminoacidos que forman la interfaz tienen cargas electricas opuestas entre sf Esto permite la produccion eficiente de un complejo polipeptfdico de la presente invencion con la asociacion deseada.
Ademas, el control de la asociacion en la presente invencion tambien se puede utilizar para inhibir la asociacion entre los CH1s (las cadenas pesadas del dominio de union al receptor de celulas T y el dominio de union al antfgeno) o entre las CL (las cadenas ligeras del dominio de union al receptor de celulas T y dominio de union a
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antigeno).
Aquellos expertos en la tecnica pueden encontrar apropiadamente en un complejo polipeptidico deseado, cuya asociacion se controla segun la presente invencion, los tipos de residuos de aminoacidos que se encuentran en estrecha proximidad en la interfaz CH1/CL tras la asociacion.
Ademas, al utilizar bases de datos publicas o similares, los expertos en la tecnica pueden encontrar apropiadamente las secuencias de anticuerpo CH1 y CL utilizables en un organismo, tal como ser humano, mono, raton o conejo. Mas espedficamente, la informacion de la secuencia de aminoacidos de CH1 y CL se puede obtener mediante los metodos descritos a continuacion en los Ejemplos.
Espedficamente, como se muestra en los ejemplos que se describen a continuacion, ejemplos espedficos de combinaciones de residuos de aminoacidos que se ubican muy cerca (orientados entre sf o en contacto) en la interfaz CH1/CL tras la asociacion entre CH1 y CL que estan respectivamente vinculados a VP y a VL que forman el dominio de union al receptor de celulas T o el dominio de union a antigeno incluyen:
- lisina (K) en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 (por ejemplo, posicion 147 en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1) y treonina (T) en la posicion 180 (numeracion de la UE) orientadas (en contacto) con CL;
- lisina (K) en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y serina (S) en la posicion 131 (numeracion de la UE) orientadas (en contacto) con CL;
- lisina (K) en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y treonina (T) en la posicion 164 (numeracion de la UE) orientadas (en contacto) con CL;
- lisina (K) en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y asparagina (N) en la posicion 138 (numeracion de la UE) en CL, que se orientan (en contacto) entre sf;
- lisina (K) en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y acido glutamico (E) en la posicion 123 (numeracion de la UE) orientados (en contacto) con CL;
- glutamina (Q) en la posicion 175 (numeracion de la UE) en CH1 y glutamina (Q) en la posicion 160 (numeracion de la UE) orientado (en contacto) con CL; o
- lisina (K) en la posicion 213 (numeracion de la UE) en CH1 y acido glutamico (E) en la posicion 123 (numeracion de la UE) orientado (en contacto) con CL.
Estas posiciones estan numeradas segun el documento de Kabat et al. (Kabat EA et al., 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH).
En esta memoria, los numeros indicados por la numeracion de la UE se asignan segun la numeracion de la UE (Sequences of Proteins of Immunological Interest, publicacion NIH n.° 91-3242). En la presente invencion, "residuo de aminoacido en la posicion X (numeracion de la UE)" y "aminoacido en la posicion X (numeracion de la UE)" (donde X es un numero arbitrario) son intercambiables con "residuo de aminoacido correspondiente a la posicion X (numeracion de la UE)"," aminoacido correspondiente a la posicion X (numeracion de la UE)".
Como se describe en los Ejemplos a continuacion, un complejo polipeptfdico deseado puede obtenerse preferentemente alterando los residuos de aminoacidos y realizando los metodos de la presente invencion.
Se sabe que los residuos de aminoacidos descritos anteriormente estan altamente conservados en seres humanos y ratones (J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120). Por consiguiente, la asociacion entre CH1 y CL en la region constante de un complejo polipeptfdico de la presente invencion distinta de los complejos polipeptidicos descritos en los Ejemplos tambien puede controlarse alterando los residuos de aminoacidos correspondientes a los residuos de aminoacidos descritos anteriormente.
Espedficamente, se describen complejos polipeptfdicos con asociacion controlada entre la cadena pesada y la cadena ligera, en la que uno, dos o mas pares seleccionados del grupo que consiste en los pares de residuos de aminoacidos descritos en (a) a (f) a continuacion tienen las mismas cargas electricas:
(a) el residuo de aminoacido en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y el residuo de aminoacido en la posicion 180 (numeracion de la UE) en CL;
(b) el residuo de aminoacido en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y el residuo de aminoacido en la posicion 131 (numeracion de la UE) en CL;
(c) el residuo de aminoacido en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y el residuo de aminoacido en la posicion 164 (numeracion de la UE) en CL;
(d) el residuo de aminoacido en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y el residuo de aminoacido en la posicion 138 (numeracion de la UE) en CL;
(e) el residuo de aminoacido en la posicion 147 (numeracion de la UE) en CH1 y el residuo de aminoacido en la posicion 123 (numeracion de la UE) en CL; y
(f) el residuo de aminoacido en la posicion 175 (numeracion de la UE) en CH1 y el residuo de aminoacido en la posicion 160 (numeracion de la UE) en CL.
Ademas, en otra realizacion, se describen anticuerpos en los que los residuos de aminoacidos en el par de residuos
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de aminoacidos descritos en (g) a continuacion tienen las mismas cargas electricas:
(g) el residuo de aminoacido en la posicion 213 (numeracion de la UE) en CH1 y el residuo de aminoacido en la posicion 123 (numeracion de la UE) en CL.
Los residuos de aminoacidos en cada uno de los pares descritos anteriormente se ubican muy proximos entre sf tras la asociacion, como se describe en los EJEMPLOS a continuacion. Mediante modelos de homologfa u otros metodos que utilizan software disponible comercialmente, los expertos en la tecnica pueden encontrar apropiadamente las posiciones de aminoacidos de CH1 o CL deseadas correspondientes a los residuos de aminoacidos descritos en (a) a (g) anteriormente, y pueden alterar apropiadamente los residuos de aminoacidos en esas posiciones.
Dicho "residuo de aminoacido electricamente cargado" en un anticuerpo descrito anteriormente se selecciona preferiblemente, por ejemplo, de los residuos de aminoacidos que pertenecen al grupo (X) o (Y) descrito a continuacion:
(X) acido glutamico (E) y acido aspartico (D); y
(Y) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).
En los complejos polipeptfdicos descritos anteriormente, "tiene la misma carga electrica" significa que, por ejemplo, los dos o mas residuos de aminoacidos pertenecen a uno de los grupos (X) e (Y) descritos anteriormente. Por otra parte, "tiene una carga electrica opuesta" significa que, por ejemplo, al menos uno de dos o mas residuos de aminoacidos tiene un residuo de aminoacido que pertenece a uno de los grupos (X) e (Y) descritos anteriormente, mientras que los otros residuos de aminoacidos tienen un residuo de aminoacidos que pertenece al otro grupo.
Los residuos de aminoacidos que "van a alterarse" no estan limitados a los residuos de aminoacidos descritos anteriormente de la region constante. Mediante un modelo de homologfa u otros metodos que utilizan software disponible comercialmente, los expertos en la tecnica pueden identificar apropiadamente los residuos de aminoacidos que forman una interfaz en un polipeptido mutante o multimero heteromerico y alterar adecuadamente los residuos de aminoacidos en esas posiciones para controlar la asociacion.
En las tecnicas para inhibir la asociacion no deseada entre la cadena pesada y la cadena ligera mediante la introduccion de la repulsion de carga en la interfaz entre las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, los residuos de aminoacidos en contacto entre sf en la interfaz entre la region variable de la cadena pesada (VP) y la region variable de la cadena ligera (VL) incluyen, por ejemplo, glutamina (Q) en la posicion 39 (por ejemplo, la posicion 39 en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6 en el documento WO 2006/106905) en la region variable de la cadena pesada FR2 y glutamina (Q) en la posicion 38 (por ejemplo, la posicion 44 en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8 en el documento WO 2006/106905) orientadas (en contacto) con la region variable de la cadena ligera FR2. Tales residuos de aminoacidos preferidos tambien incluyen, por ejemplo, leucina (L) en la posicion 45 (por ejemplo, la posicion 45 en la secuencia de aminoacidos de la sEq ID NO: 6 en el documento WO 2006/106905) en la region variable de la cadena pesada FR2 y prolina (P) en la posicion 44 (por ejemplo, la posicion 44 en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8 en el documento WO 2006/106905) orientadas en la region variable de la cadena ligera FR2. Estas posiciones estan numeradas segun el documento de Kabat et al. (Kabat EA et al.1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH).
Se sabe que los residuos de aminoacidos descritos anteriormente estan altamente conservados en seres humanos y ratones (J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120). Por consiguiente, la asociacion entre VP y VL en regiones variables de anticuerpos distintas de los complejos polipeptfdicos descritos en los Ejemplos tambien puede controlarse alterando los residuos de aminoacidos correspondientes a los residuos de aminoacidos descritos anteriormente.
Mas espedficamente, dichos anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera incluyen aquellos en los que los residuos de aminoacidos de (1) y (2), o (3) y (4) descritos a continuacion tienen las mismas cargas electricas:
(1) el residuo de aminoacido correspondiente a la posicion 39 (numeracion de cadena pesada;
(2) el residuo de aminoacido correspondiente a la posicion 38 (numeracion de cadena ligera;
(3) el residuo de aminoacido correspondiente a la posicion 45 (numeracion de cadena pesada;
(4) el residuo de aminoacido correspondiente a la posicion 44 (numeracion de cadena ligera.
Los residuos de aminoacidos de (1) y (2), o (3) y (4) descritos anteriormente se encuentran muy proximos entre sf en el momento de la asociacion. Mediante modelos de homologfa u otros metodos que utilizan software disponible comercialmente, los expertos en la tecnica pueden identificar adecuadamente las posiciones de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada o cadena ligera que correspondan a los residuos de aminoacidos descritos en
(1) a (4) arriba, y pueden alterar apropiadamente los residuos de aminoacidos en esas posiciones.
la UE) en la region variable de la la UE) en la region variable de la la UE) en la region variable de la la UE) en la region variable de la
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En un anticuerpo descrito anteriormente, el "residuo de aminoacido electricamente cargado" se selecciona preferiblemente, por ejemplo, de los residuos de aminoacidos que pertenecen al grupo (X) o (Y) a continuacion:
(X) acido glutamico (E) y aspartico acido (D); y
(Y) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).
En seres humanos y ratones, en general, los residuos de aminoacidos de (1) a (4) descritos anteriormente son:
(1) glutamina (Q);
(2) glutamina (q);
(3) leucina (L); y
(4) prolina (P), respectivamente.
En una realizacion preferida, los residuos de aminoacidos descritos anteriormente se alteran (por ejemplo, la sustitucion con un aminoacido cargado). Los tipos de residuos de aminoacidos (1) a (4) descritos anteriormente no se limitan a los descritos anteriormente. Estos aminoacidos pueden ser cualquier otro aminoacido correspondiente a los descritos anteriormente. Por ejemplo, en el caso de los humanos, un aminoacido que corresponde al aminoacido en la posicion 38 (numeracion de la UE) en la region variable de la cadena ligera puede ser histidina (H). Al referirse a documentos publicados (por ejemplo, J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120) o similares, los expertos en la tecnica pueden encontrar el tipo de residuo de aminoacido correspondiente a una posicion arbitraria en la cadena ligera, y asf pueden alterar adecuadamente el residuo de aminoacido (por ejemplo, sustitucion con un aminoacido cargado).
En las tecnicas para inhibir la asociacion no deseada entre la cadena pesada y la cadena ligera sustituyendo aminoacidos polares cargados electricamente con los residuos de aminoacidos que forman el nucleo hidrofobo en la interfaz entre las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, los residuos de aminoacidos preferidos capaces de formar el nucleo hidrofobo en la interfaz entre la region variable de la cadena pesada (VP) y la region variable de la cadena ligera (VL) incluyen, por ejemplo, leucina (L) en la posicion 45 en la region variable de la cadena pesada y prolina (P) en la posicion 44 orientadas en la region variable de la cadena ligera.
En general, un "nucleo hidrofobo" se refiere a una porcion donde las cadenas laterales de aminoacidos hidrofobos se ensamblan dentro del polipeptido asociado. Los aminoacidos hidrofobos incluyen, por ejemplo, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano y valina. Mientras tanto, los residuos de aminoacidos distintos de los aminoacidos hidrofobos (por ejemplo, tirosina) tambien pueden participar en la formacion del nucleo hidrofobo. Junto con la superficie hidrofila de la exposicion externa de las cadenas laterales de aminoacidos hidrofilos, el nucleo hidrofobo sirve como fuerza motriz para promover la asociacion de polipeptidos solubles en agua. Cuando los aminoacidos hidrofobos de dos dominios diferentes estan presentes en la superficie molecular y se exponen a moleculas de agua, la entropfa aumenta, lo que resulta en un aumento de la energfa libre. Por lo tanto, los dos dominios se asocian entre sf para disminuir la energfa libre para la estabilizacion. Los aminoacidos hidrofobos en la interfaz estan ocultados dentro de la molecula para formar un nucleo hidrofobo.
Se considera que cuando los aminoacidos hidrofobos que forman un nucleo hidrofobo en la asociacion polipeptfdica se alteran a aminoacidos polares con carga electrica, se inhibe la formacion de nucleo hidrofobo. Esto da lugar a la inhibicion de la asociacion de polipeptidos.
Otras tecnologfas conocidas tambien son aplicables a los complejos polipeptfdicos de la presente invencion. Por ejemplo, para promover la asociacion de la primera VP (VH1) y la primera VL (VL1), y/o la segunda VP (VH2) y la segunda VL (VL2), ademas de las "alteraciones" de la presente invencion, los aminoacidos en una de las regiones variables de la cadena P estan sustituidos con aquellos que tienen una cadena lateral mas grande (boton; protuberancia) y los aminoacidos en la otra region variable de la cadena P estan sustituidos con aquellos que tienen una cadena lateral mas pequena (ojal; vado) de manera que el boton se coloca en el ojal. Esto promueve la asociacion de VH1 y VL1, y/o VH2 y VL2, dando como resultado una inhibicion adicional de la asociacion entre VH1 y VL2 y/o entre los polipeptidos vH2 y VL1 (documento WO 1996/027011; Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
En la produccion de un complejo polipeptfdico descrito anteriormente, cada dominio puede estar vinculado directamente por un enlace peptfdico o por un peptido que se une a un enlazador peptfdico. En este caso, el enlazador que se utilizara incluye el enlazador descrito anteriormente como ejemplo y los enlazadores apropiados con una etiqueta peptfdica, por ejemplo, etiqueta His, etiqueta HA, etiqueta myc o etiqueta FLAG. Ademas, es preferible utilizar la propiedad de union mutua basandose en enlaces de hidrogeno, enlaces disulfuro, enlaces covalentes o interaccion ionica, o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, es posible emplear la afinidad entre CH1 y CL del anticuerpo, o los dominios Fc descritos anteriormente derivados de un anticuerpo biespedfico pueden utilizarse para la asociacion heteromerica de los dominios Fc. Ademas, los enlaces disulfuro entre dominios pueden utilizarse preferiblemente como se describe en los EJEMPLOS.
Los complejos polipeptfdicos de la presente invencion incluyen, por ejemplo, las realizaciones mostradas en las Figs. 17, 19 y 24.
Los complejos polipeptfdicos de la presente invencion pueden producirse por los mismos metodos que los metodos
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descritos anteriormente para producir anticuerpos recombinantes.
Ademas, la presente descripcion se refiere a polinucleotidos que codifican el complejo polipeptidico de la presente invencion. Un complejo polipeptidico de la presente invencion puede insertarse en cualquier vector de expresion. Un huesped apropiado se transforma con el vector de expresion para obtener celulas que expresan el complejo polipeptidico. El complejo polipeptfdico codificado por el polinucleotido se puede obtener cultivando celulas que expresan el complejo polipeptfdico y recogiendo el producto de expresion del sobrenadante del cultivo. Espedficamente, la presente descripcion se refiere a vectores que llevan un polinucleotido que codifica el complejo polipeptfdico de la presente invencion, celulas que contienen los vectores y metodos para producir el complejo polipeptfdico de la presente invencion, en el que las celulas se cultivan y el complejo polipeptfdico se recoge del sobrenadante del cultivo. Los descritos anteriormente pueden obtenerse mediante las mismas tecnologfas descritas anteriormente para los anticuerpos recombinantes.
Composicion farmaceutica
La presente invencion tambien se refiere a agentes terapeuticos para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer, que comprende como principio activo el complejo polipeptfdico de la presente invencion, se administran preferiblemente a sujetos con cancer o con una probabilidad de recurrencia del cancer.
En esta memoria, "que comprende como principio activo" significa que comprende el complejo polipeptfdico como el principio activo principal; sin embargo, la relacion de contenido del complejo polipeptfdico no esta limitada.
Un agente terapeutico para su uso en el tratamiento o prevencion del cancer segun la presente invencion se puede formular con diferentes tipos de complejos polipeptfdicos, si es necesario. Por ejemplo, la accion citotoxica contra las celulas que expresan un antfgeno puede potenciarse mediante un coctel de multiples complejos polipeptfdicos de la presente invencion que se unen al mismo antigeno. Alternativamente, el efecto terapeutico puede aumentarse formulando un complejo polipeptfdico de la presente invencion que comprende un dominio de union a antfgeno que se une a un antfgeno canceroso en combinacion con otros complejos polipeptfdicos que comprenden un dominio de union a antfgeno contra un antfgeno diferente.
Si es necesario, los complejos polipeptfdicos de la presente invencion pueden encapsularse en microcapsulas (microcapsulas fabricadas a partir de hidroximetilcelulosa, gelatina, poli[metilmetacrilato] y similares), y convertirse en componentes de sistemas de entrega de farmacos coloidales (liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartfculas y nanocapsulas) (por ejemplo, vease "Remington's Pharmaceutical Science 16a edicion", Oslo Ed. (1980)). Ademas, se conocen metodos para preparar agentes como agentes de liberacion sostenida, y estos pueden aplicarse a los complejos polipeptfdicos de la presente invencion (J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277; Chemtech. (1982) 12, 98-105; patente de Estados Unidos n.° 3773719; solicitud de patente europea (EP) n.° EP58481 y EP133988; Biopolymers (1983) 22, 547-556).
Los agentes anti-cancengenos para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer segun la presente invencion pueden administrarse por via oral o parenteral a los pacientes. Se prefiere la administracion parental. Espedficamente, dichos metodos de administracion incluyen inyeccion, administracion nasal, administracion transpulmonar y administracion percutanea. Las inyecciones incluyen, por ejemplo, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares, inyecciones intraperitoneales e inyecciones subcutaneas. Por ejemplo, los agentes para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer segun la presente invencion se pueden administrar local o sistemicamente mediante inyeccion. Ademas, los metodos de administracion apropiados se pueden seleccionar segun la edad y los smtomas del paciente. La dosis administrada se puede seleccionar, por ejemplo, del intervalo de 0,0001 mg a 1,000 mg por kg de peso corporal para cada administracion. Alternativamente, la dosis puede seleccionarse, por ejemplo, del intervalo de 0.001 mg/cuerpo a 100.000 mg/cuerpo por paciente. Sin embargo, la dosis de un agente terapeutico para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer segun la presente invencion no se limita a estas dosis.
El agente terapeutico para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer segun la presente invencion puede formularse segun metodos convencionales (por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, ultima edicion, Mark Publishing Company, Easton, EE.UU.), y tambien puede contener vehfculos y aditivos farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, excipientes, agentes colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizantes, tampones, agentes de suspension, agentes isotonicos, aglutinantes, desintegrantes, lubricantes, agentes promotores de la fluidez y correctores, y otros vehfculos de uso comun pueden ser adecuadamente utilizados. Los ejemplos espedficos de los vehfculos incluyen acido silfcico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidon, carmelosa calcica, carmelosa sodica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilacetal dietilaminoacetato, polivinilpirrolidona, gelatina, trigliceridos de cadena media, aceite de ricino 60 endurecido con polioxietileno, sacarosa, carboximetilcelulosa, almidon de mafz, sal inorganica y similares.
La presente descripcion tambien proporciona metodos para danar celulas que expresan un antfgeno canceroso o para suprimir el crecimiento celular poniendo en contacto las celulas que expresan el antfgeno canceroso con un complejo polipeptfdico de la presente invencion que se une al antfgeno canceroso.
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Los anticuerpos monoclonales que se unen al antigeno canceroso se describen anteriormente como un complejo polipeptfdico de union al antigeno canceroso de la presente invencion, que se incluye en los agentes terapeuticos para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer. Las celulas a las que se une un complejo polipeptidico de union a antigeno canceroso de la presente invencion no estan particularmente limitadas, siempre que expresen el antigeno canceroso. Espedficamente, las celulas que expresan antigeno canceroso preferidas incluyen celulas de cancer de ovario, celulas de cancer de prostata, celulas de cancer de mama, celulas de cancer de utero, celulas de cancer de Idgado, celulas de cancer de pulmon, celulas de cancer de pancreas, celulas de cancer de estomago, cancer de vejiga urinaria celulas, y celulas de cancer de colon. Cuando el antigeno canceroso es GPC3, las celulas no estan limitadas siempre que sean celulas cancerosas que expresen GPC3. Sin embargo, las celulas cancerosas preferidas incluyen celulas de hepatocarcinoma, celulas de cancer de pulmon y celulas de cancer de ovario.
El "contacto" puede llevarse a cabo, por ejemplo, anadiendo un complejo polipeptfdico de union a antigeno canceroso de la presente invencion a medios de cultivo de celulas que expresan el antigeno canceroso cultivado in vitro. En este caso, un complejo polipeptfdico a anadir puede utilizarse en una forma apropiada, tal como una solucion o un solido preparado por liofilizacion o similares. Cuando el complejo polipeptfdico de la presente invencion se anade como una solucion acuosa, la solucion puede ser una solucion acuosa pura que contenga el complejo polipeptfdico solo o una solucion que contenga, por ejemplo, un agente tensioactivo, excipiente, agente colorante, agente saborizante, conservante, estabilizador, agente tamponante, agente de suspension, agente isotonizante, aglutinante, desintegrador, lubricante, acelerador de fluidez y corrector descrito anteriormente. La concentracion anadida no esta particularmente limitada; sin embargo, la concentracion final en un medio de cultivo esta preferiblemente en un intervalo de 1 pg/ml a 1 g/ml, mas preferiblemente 1 ng/ml a 1 mg/ml, y aun mas preferiblemente 1 pg/ml a 1 mg/ml.
El "contacto" tambien puede llevarse a cabo mediante administracion a animales no humanos trasplantados con celulas que expresan antfgeno canceroso in vivo o a animales que tienen celulas cancerosas que expresan el antfgeno canceroso de forma endogena. El metodo de administracion puede ser oral o parenteral. La administracion parenteral es particularmente preferida. Espedficamente, el metodo de administracion parenteral incluye inyeccion, administracion nasal, administracion pulmonar y administracion percutanea. Las inyecciones incluyen, por ejemplo, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares, inyecciones intraperitoneales e inyecciones subcutaneas. Por ejemplo, los agentes terapeuticos para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer inducir segun la presente invencion se pueden administrar local o sistemicamente mediante inyeccion. Ademas, se puede seleccionar un metodo de administracion apropiado segun la edad y los smtomas de un sujeto animal. Cuando el complejo polipeptfdico se administra como una solucion acuosa, la solucion puede ser una solucion acuosa pura que contenga el complejo polipeptfdico solo o una solucion que contenga, por ejemplo, un agente tensioactivo, excipiente, agente colorante, agente saborizante, conservante, estabilizador, agente tamponante, agente de suspension, agente isotonizante, aglutinante, desintegrador, lubricante, acelerador de fluidez y corrector descrito anteriormente. La dosis administrada se puede seleccionar, por ejemplo, del intervalo de 0,0001 a 1,000 mg por kg de peso corporal para cada administracion. Alternativamente, la dosis se puede seleccionar, por ejemplo, del intervalo de 0,001 a 100,000 mg/cuerpo para cada paciente. Sin embargo, la dosis de un complejo polipeptfdico de la presente invencion no se limita a estos ejemplos.
Los metodos descritos a continuacion se utilizan preferiblemente como un metodo para evaluar o determinar la citotoxicidad celular causada por el contacto de un complejo polipeptfdico de la presente invencion con celulas que expresan antfgeno a las que se une el dominio de union a antfgeno que forma el complejo polipeptfdico de la presente invencion. Los metodos para evaluar o determinar la actividad citotoxica in vitro incluyen metodos para determinar la actividad de celulas T citotoxicas o similares. Si un complejo polipeptfdico de la presente invencion tiene la actividad de inducir la citotoxicidad celular mediada por celulas T puede determinarse mediante metodos conocidos (vease, por ejemplo, Current protocols in Immunology, Capftulo 7. Inmunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). En el ensayo de citotoxicidad, un complejo polipeptfdico cuyo dominio de union a antfgeno se une a un antfgeno diferente al reconocido por el dominio de union a antfgeno del complejo polipeptfdico de la presente invencion y que no se expresa en las celulas se utiliza como un complejo polipeptfdico de control. El complejo polipeptfdico de control se ensaya de la misma manera. Luego, la actividad se evalua sometiendo a ensayo si un complejo polipeptfdico de la presente invencion exhibe una actividad citotoxica mas potente que la de un complejo polipeptfdico de control.
Mientras tanto, la actividad citotoxica in vivo se evalua o determina, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento. Las celulas que expresan el antfgeno al que se une el dominio de union a antfgeno que forma un complejo polipeptfdico de la presente invencion se trasplantan de forma intracutanea o subcutanea a un sujeto animal no humano. Luego, desde el dfa del trasplante o posteriormente, se administra un complejo polipeptfdico de ensayo en la vena o cavidad peritoneal todos los dfas o a intervalos de varios dfas. El tamano del tumor se mide con el tiempo. La diferencia en el cambio del tamano del tumor se puede definir como la actividad citotoxica. Como en un ensayo in vitro, se administra un complejo polipeptfdico de control. Se puede juzgar que el complejo polipeptfdico de la presente invencion tiene actividad citotoxica cuando el tamano del tumor es menor en el grupo administrado con el complejo polipeptfdico de la presente invencion que en el grupo administrado con el complejo polipeptfdico de control.
Un metodo de MTT y la medicion de la captacion de timidina marcada con isotopos en las celulas se utilizan
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preferiblemente para evaluar o determinar el efecto del contacto con un complejo polipeptidico de la presente invencion para suprimir el crecimiento de celulas que expresan un antigeno al cual se une el dominio de union a antigeno que forma el complejo polipeptidico. Mientras tanto, los mismos metodos descritos anteriormente para evaluar o determinar la actividad citotoxica in vivo pueden utilizarse preferiblemente para evaluar o determinar la actividad de supresion del crecimiento celular in vivo.
La presente invencion tambien describe kits que contienen un complejo polipeptfdico de la presente invencion. Los kits pueden envasarse con un vehmulo o medio farmaceuticamente aceptable adicional, o un manual de instrucciones que describa como utilizar los kits, etc.
Ejemplos
A continuacion, la presente invencion se describe espedficamente con referencia a los Ejemplos, pero no debe interpretarse como limitada a los mismos.
[Ejemplo 1] Construccion y evaluacion de ERY2 GPC3
(1) Esbozo
Existe un metodo bien conocido para prolongar la semivida en sangre de una protema administrada in vivo, que se basa en el reciclado mediado por FcRn utilizando una protema de interes conjugada a un dominio Fc de anticuerpo. Sin embargo, la conjugacion de un tipo natural de Fc a BiTE podna conducir a la induccion de varias citoquinas, ya que una unica molecula se unina a una celula T a traves del scFv anti-CD3 de su fraccion BiTE y simultaneamente al FcgR (receptor Fcy) en la membrana celular de, por ejemplo, una celula NK o macrofago a traves de su dominio Fc, y la reticulacion resultante activana estas celulas de manera independiente del antigeno canceroso. Por consiguiente, se preparo una molecula denominada ERY2, en la que un BiTE esta vinculado mediante un enlazador polipeptfdico a un dominio Fc que tiene una actividad de union al receptor Fcy reducida (Fc silencioso), y la actividad de ERY2 se evaluo comparandola con la de BiTE. El scFv de un anticuerpo epsilon anti-CD3 se vinculo mediante un enlazador peptfdico corto al scFv de un anticuerpo contra Glipicana 3 (Gpc3), que es una protema anclada a GPI conocida por expresarse a un nivel alto en celulas de cancer de Imgado, para producir BiTE contra GPC3 (BiTE GPC3) (Fig. 17A). Luego se vinculo a un Fc silencioso para producir un ErY2 contra GPC3 (ERY2 GPC3) (Fig. 17C). Ademas, se construyo un anticuerpo de tipo IgG anti-GPC3 normal para comparacion. El anticuerpo de tipo IgG anti-GPC3 se preparo como un anticuerpo con contenido reducido de fucosa en su fraccion de cadena de azucar, es decir, un anticuerpo con un bajo contenido de fucosa, que es conocido por tener una actividad CCDA potenciada.
(2) Construccion de BiTE GPC3
Mediante la amplificacion por PCR utilizando un vector de expresion para un anticuerpo anti-GPC3 como plantilla, se obtuvieron ADNcs, codificando cada uno una region variable de la cadena P (VP anti-GPC3) o una region variable de la cadena L (VL anti-GPC3). La PCR se realizo utilizando cebadores que contienen secuencias adicionales apropiadas y los ADNc anteriores como plantillas para construir un fragmento de ADNc que codifica un scFv anti- GPC3 que tiene una secuencia de aminoacidos en la que el VP anti-GPC3 y VL anti-GPC3 se vincularon mediante un enlazador con tres repeticiones de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 7).
Ademas, se prepararon una serie de oligonucleotidos, cada uno de los cuales tema una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia parcial de la region variable de la cadena P (VP M12) o la region variable de la cadena L (VL M12) de un anticuerpo anti-CD3 (M12), y tema secuencias complementarias en los extremos. Los oligonucleotidos se disenaron de manera tal que se vinculanan entre sf mediante las porciones de secuencia complementaria por reaccion de polimerasa para sintetizar un polinucleotido correspondiente a la region variable de la cadena P (VP M12) y la region variable de la cadena L (VL M12). Los oligonucleotidos se mezclaron y luego se ensamblaron juntos mediante PCR para dar dos ADNc que codifican las secuencias de aminoacidos de las regiones variables respectivas. La PCR se realizo utilizando cebadores que contienen secuencias adicionales apropiadas y los ADNc anteriores como plantillas para producir un fragmento de ADNc que codifica scFv M12 que tiene una secuencia amino en la que VL M12 y VP M12 se vincularon mediante un enlazador que tiene tres repeticiones de Gly-Gly-Gly Gly-Ser (SEQ ID NO: 7).
A continuacion, mediante PCR utilizando cebadores que contienen secuencias adicionales apropiadas y los fragmentos de ADNc que codifican scFv anti-GPC3 o scFv M12 como plantillas, se construyo un fragmento de ADNc que codificaba una secuencia de aminoacidos en la que se vincularon scFv anti-GPC3 y scFv M12 mediante un enlazador compuesto por Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 7) y su extremo C-terminal tema una etiqueta His (ocho histidinas) (la secuencia de la SEQ iD NO: 33 sin su amino terminal 19 aminoacidos).
Utilizando cebadores que contienen secuencias adicionales apropiadas y como plantilla, el fragmento de ADNc que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 33 que carece de sus l9 aminoacidos amino terminales, se realizo una PCR para producir un fragmento de ADNc en el que una secuencia de escision EcoRI, secuencia kozac, y una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de senal de secrecion se fijaron al extremo 5' del fragmento de ADNc anterior y una secuencia de escision NotI al extremo 3'. El fragmento de ADNc resultante se
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escindio con EcoRI y Notl, y se inserto en un vector de expresion de celulas de mairnfero para obtener un vector de expresion para BiTE GPC3 (SEQ ID NO: 33; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirven como una secuencia de senal).
El vector se introdujo en celulas CHO DG44 por electroporacion. Despues de limitar la dilucion, las celulas se cultivaron en presencia de 1 mg/ml de Geneticin para aislar estirpes celulares resistentes a los farmacos. El sobrenadante de cultivo de las estirpes celulares obtenidas se analizo mediante inmunoelectrotransferencia utilizando un anticuerpo de etiqueta anti-His para seleccionar una estirpe celular que expresa BiTE GPC3.
El sobrenadante de cultivo obtenido por cultivo celular a gran escala de la estirpe celular descrita anteriormente se cargo en una columna SP sefarosa FF (GE Healthcare). Despues de lavar la columna, se eluyo una fraccion que contema BiTE GPC3 con un gradiente de concentracion de NaCl. La fraccion se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues de lavar la columna, se eluyo una fraccion que contema BiTE GPC3 con un gradiente de concentracion de imidazol. La fraccion se concentro por ultrafiltracion y luego el concentrado se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solo se recogio una fraccion de BiTE GPC3 monomerica para obtener BiTE GPC3 purificado.
(3) Construccion de ERY2 GPC3
La PCR que utiliza cebadores que contienen las mismas secuencias adicionales apropiadas que en el metodo descrito anteriormente y un metodo bien conocido por los expertos en la tecnica, tal como un metodo que utiliza el kit de mutagenesis dirigida al sitio de QuikChange (Stratagene), se realizo para producir vectores de expresion para los cuales se inserto un polinucleotido que codifica GPC3 ERY2_Hk (SEQ ID NO: 34; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirven como una secuencia de senal) o GPC3 ERY2_Hh (SEQ ID NO: 35; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirven como una secuencia de senal).
Estos vectores de expresion fueron co-introducidos en celulas FreeStyle293-F (Invitrogen) para expresar ERY2 GPC3 de forma transitoria. El sobrenadante de cultivo resultante se cargo en una columna Anti FLAG M2 (Sigma). Despues del lavado, la columna se eluyo con 0,1 mg/ml de peptido FLAG (Sigma). Una fraccion que contema ERY2 GPC3 se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un gradiente de concentracion de imidazol. Una fraccion que contema ERY2 GPC3 se concentro por ultrafiltracion y el concentrado se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solamente se recogio una fraccion monomerica de ERY2 GPC3 del eluato para obtener ERY2 GPC3 purificado.
(4) Construccion de anticuerpo anti-GPC3 con un contenido bajo en fucosa
Se introdujo un vector de expresion para un anticuerpo anti-GPC3 (que se refiere como anticuerpo GC33 humanizado en el documento WO 2006/006693) en las celulas CHO DXB11 eliminadas con GDP fucosa (Cancer Sci. (2010) 101(10), 2227-33) por electroporacion. Despues de limitar la dilucion, las celulas se cultivaron en presencia de 0.5 mg/ml de Geneticin para seleccionar lmeas resistentes al farmaco y se obtuvo una estirpe celular que expresaba un anticuerpo anti-GPC3 con un contenido bajo en fucosa. Del sobrenadante de cultivo obtenido cultivando estas celulas, se preparo una fraccion de anticuerpo mediante purificacion por afinidad convencional utilizando protema A Hitrap® (Pharmacia). Luego, la fraccion de anticuerpo se sometio a purificacion por filtracion en gel utilizando Superdex 20026/60 (Pharmacia). Se recogio una fraccion monomerica del eluato para obtener un anticuerpo anti-GPC3 con un contenido bajo en fucosa.
(5) Ensayo de citotoxicidad utilizando celulas mononucleares de sangre periferica humana
(5-1) Preparacion de la suspension de celulas mononucleares de sangre periferica humana (CMSP)
De voluntarios sanos (adultos), se extrajeron 50 ml de sangre periferica utilizando jeringas a las que se anadieron por adelantado 100 pl de 1.000 unidades/ml de solucion de heparina (5.000 unidades Novo-Heparin para inyeccion; Novo Nordisk). La sangre periferica se diluyo dos veces con TFS (-), se dividio en cuatro alfcuotas iguales y se anadio a los tubos de separacion de linfocitos Leucosep (Cat. n.° 227290; Greiner bio-one) que se inyecto con 15 ml de Ficoll-Paque PLUS y se centrifugo previamente. Despues de la centrifugacion (2.150 rpm, 10 minutos, temperatura ambiente) de los tubos de separacion, se recogio una capa de fraccion celular mononuclear. Las celulas en la fraccion de celulas mononucleares se lavaron una vez con medio de Eagle modificado por Dulbecco (SIGMA) que contema un 10 % de SFB (en adelante referido SFB/D-MEM al 10 %), y luego la densidad celular se ajusto a 4 x 106 celulas/ml utilizando SFB/D-MEM al 10%. La suspension celular preparada de este modo se utilizo como una suspension de CMSP humanas en experimentos posteriores.
(5-2) Ensayo de actividad citotoxica
La actividad citotoxica se evaluo en funcion de la tasa de inhibicion del crecimiento celular determinada utilizando el analizador de celulas en tiempo real xCELLigence (Roche Diagnostics). La celula diana utilizada fue la estirpe celular SK-pca13a establecida mediante la expresion forzada de GPC3 humana en la estirpe celular SK-HEP-1. Las celulas SK-pca13a se separaron de las placas y se sembraron en una placa E-Plate 96 (Roche Diagnostics) a 1 x 104 celulas/pocillo (100 pl/pocillo). Acto seguido, se inicio el ensayo de celulas viables utilizando el analizador de
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celulas en tiempo real xCELLigence. Al d^a siguiente, la placa se retiro del analizador celular en tiempo real xCELLigence y se anadieron a la placa 50 jl de cada anticuerpo preparado a diversas concentraciones (0,004, 0,04, 0,4 y 4 nM). Despues de 15 minutos de reaccion a temperatura ambiente, se anadieron 50 jl de suspension de CMSP humanas (2 x 105 celulas/pocillo) preparada en (5-1). La placa se coloco de nuevo en el analizador de celulas en tiempo real xCELLigence para iniciar un ensayo celular viable. La reaccion se llevo a cabo con gas dioxido de carbono al 5 % a 37 °C. La tasa de inhibicion del crecimiento celular (%) se determino segun la formula que se muestra a continuacion utilizando el valor del mdice celular a las 72 horas despues de la adicion de CMSP humanas. El valor del mdice celular utilizado en el calculo se normalizo de tal manera que el valor del mdice celular inmediatamente antes de la adicion del anticuerpo se tomo como 1.
Tasa de inhibicion del crecimiento celular (%) = (A-B) x 100/(A-1)
A indica el valor del mdice celular medio para el pocillo sin anticuerpo (solo la celula diana y las CMSP humanas), mientras que B indica el valor del mdice celular medio para cada pocillo. La medicion se realizo por triplicado.
La actividad citotoxica de BiTE GPC3, ERY2 GPC3 y el anticuerpo de tipo IgG anti-GPC3 se midio utilizando CMSPs (celulas mononucleares de sangre periferica) preparadas a partir de sangre humana como celulas efectoras. BiTE GPC3 mostro una actividad muy fuerte (Fig. 1). Esta actividad fue mucho mas fuerte que la del anticuerpo anti-GPC3 con un contenido bajo en fucosa. Por lo tanto, BiTE GPC3 puede servir como un excelente agente terapeutico contra el cancer que supera el anticuerpo de tipo IgG. Por otra parte, la actividad de ERY2 GPC3 no fue tan fuerte como la de BiTE GPC3, aunque fue mayor que la del anticuerpo de tipo IgG anti-GPC3. Esto sugiere que la mera adicion de Fc a BiTE no permite la creacion de una molecula deseada.
[Ejemplo 2] Construccion y evaluacion de ERY5 GPC3, ERY6 GPC3 y ERY7 GPC3
A continuacion, en un intento por mejorar la actividad espedfica, el dominio de union al antfgeno canceroso (GPC3) se hizo bivalente para potenciar la actividad de union de las celulas cancerosas. Se anadio otro scFv anti-GPC3 a ERY2 GPC3 para construir ERY5 GPC3 (Fig. 17D). Ademas, en lugar del scFv, se anadio un dominio de union a GPC3 de tipo Fab para producir ERY7 gPc3 (Fig. 17F). Ademas, ERY6 GPC3 (Fig. 17E) tambien se construyo en la que el scFv epsilon anti-CD3 de ERY5 GPC3 se dividio en dos brazos.
Espedficamente, se realizo un metodo conocido por los expertos en la tecnica, tal como PCR que utiliza cebadores que contienen las mismas secuencias adicionales apropiadas que en el metodo descrito anteriormente, para producir una serie de vectores de expresion en los que se inserto un polinucleotido que codifica GPC3 ERY5_Hh, GPC3 ERY6_Hk, GPC3 ERY6_Hh, GPC3 ERY7_Hh o GPC3 ERY7_L.
Las siguientes combinaciones de vectores de expresion se introdujeron en las celulas FreeStyle293-F para expresar cada molecula disenada de forma transitoria.
A. Molecula disenada: ERY5 GPC3
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: GPC3 ERY5_Hh (SEQ ID NO: 36; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como secuencia de senal) y GPC3 ERY2_Hk.
B. Molecula disenada: ERY6 GPC3
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: GPC3 ERY6_Hk (SEQ ID NO: 37; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) y GPC3 ERY6_Hh (SEQ ID NO: 38; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal)
C. Molecula disenada: ERY7 GPC3
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: GPC3 ERY7_Hh (SEC ID NO: 39; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY7_L (SEQ ID NO: 40; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como secuencia de senal), y GPC3 ERY2_Hk.
El sobrenadante de cultivo resultante se cargo en una columna Anti FLAG M2 (Sigma). Despues del lavado, la columna se eluyo con 0,1 mg/ml de peptido FLAG (Sigma). Una fraccion que contema la molecula disenada se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un gradiente de concentracion de imidazol. Una fraccion que contema la molecula disenada se concentro por ultrafiltracion. Luego, la fraccion se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solamente se recogio una fraccion de monomero del eluato para obtener cada molecula disenada purificada.
Estos complejos polipeptfdicos se compararon con BiTE GPC3 en terminos de actividad citotoxica. El resultado mostro que la actividad citotoxica de estos complejos polipeptfdicos no era tan alta como la de BiTE GPC3 (Figs. 2 a 4). Este hallazgo sugiere que la adicion de Fc a la estructura BiTE o su estructura mimetica y la configuracion que
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permite la union bivalente a un antfgeno canceroso no permiten la creacion de una molecula deseada.
[Ejemplo 3] Construccion y evaluacion de ERY8-2 GPC3, ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3
(1) Construccion de ERY8-2 GPC3, ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3
A continuacion, se disenaron moleculas que no tienen estructura BiTE pero que poseen la actividad deseada. Se utilizo un antigeno de IgG anti-cancengeno (GPC3) como cadena principal, y se construyo una molecula en la que se anadio un scFv epsilon anti-CD3 a esta cadena principal. El Fc de IgG utilizado como cadena principal era un Fc silencioso que tema una actividad de union a FcgR (receptor Fcy) reducida, como en los casos descritos anteriormente. Se construyeron ERY8-2 GPC3 (Fig. 17G), ERY10-1 GPC3 (Fig. 17I), y ERY9-1 GPC3 (Fig. 17H) en los que el scFv epsilon anti-CD3 se fijo al extremo N-terminal de la cadena P, el extremo C-terminal de la cadena P y el extremo C-terminal de la cadena L del anticuerpo de IgG anti-GPC3, respectivamente.
Espedficamente, mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica, tal como la PCR que utiliza cebadores que contienen las mismas secuencias adicionales apropiadas que en el metodo descrito anteriormente, se construyeron una serie de vectores de expresion en los que se inserto un polinucleotido que codifica GPC3 ERY8-2_Hk (SEQ ID NO: 41; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY8-2_Hh (SEQ ID NO: 42; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como secuencia de senal), GPC3 ERY9-1_H (SEQ ID NO: 43; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como secuencia de senal), GPC3 ERY9-1_L- His (SEQ ID NO: 44; la secuencia madura no contiene los aminoacidos 19 amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY9-1_L-FLAG (SEQ ID NO: 45; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), o GPC3 ERY10-1_Hh (SEQ ID NO: 46; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal.
Las siguientes combinaciones de vectores de expresion se introdujeron en las celulas FreeStyle293-F para expresar cada molecula disenada de forma transitoria.
D. Molecula disenada: ERY8-2 GPC3
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: GPC3 ERY8-2_Hk (SEQ ID NO: 41; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY8-2_Hh (SEQ ID NO: 42; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y GPC3 ERY7_L.
E. Molecula disenada: ERY9-1 GPC3
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: GPC3 ERY9-1_H (SEQ ID NO: 43; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY9-1_L-His (SEQ ID NO: 44; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y GPC3 ERY9-1_L-FLAG (SEQ ID NO: 45; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
F. Molecula disenada: ERY10-1 GPC3
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: GPC3 ERY10-1_Hh (SEQ ID NO: 46; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) y GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L.
El sobrenadante de cultivo resultante se cargo en una columna Anti FLAG M2 (Sigma). Despues del lavado, la columna se eluyo con 0,1 mg/ml de peptido FLAG (Sigma). Una fraccion que contema la molecula disenada se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un gradiente de concentracion de imidazol. Una fraccion que contema la molecula disenada se concentro por ultrafiltracion. Luego, la fraccion se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solamente se recogio una fraccion de monomero del eluato para obtener cada molecula disenada purificada.
Estas moleculas se evaluaron para determinar la actividad citotoxica in vitro. El resultado revelo que todas las moleculas exhibieron una actividad citotoxica comparable o mayor a la de BiTE GPC3 (Fig. 5). En particular, se descubrio que ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 tienen claramente una mayor actividad citotoxica que BiTE GPC3. La presente invencion demuestra por primera vez que las moleculas creadas mediante la adicion de un scFv epsilon anti-CD3 a una IgG antigenica anti-cancengena tambien tienen una actividad citotoxica comparable o mayor que la de BiTE. Particularmente, es sorprendente que las moleculas como ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 exhibieran claramente una mayor actividad citotoxica que BiTE, aunque existfa una gran distancia entre su dominio de union al antfgeno canceroso y el dominio de union a epsilon CD3.
(2) Evaluacion de la eficacia in vivo de ERY8-2 GPC3 y ERY10-1GPC3:
ERY8-2 GPC3 y ERY10-1 GPC3, que demostraron tener una actividad citotoxica comparable o mayor a la de BiTE
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GPC3 en el ensayo in vitro descrito en (1), se evaluaron para determinar la eficacia in vivo. Las celulas de la estirpe celular PC-10 de cancer de pulmon humano que expresan GPC3 se mezclaron con CMSP humanas, y despues se transplantaron a ratones scid NOD. Los ratones se trataron administrando ERY8-2 GPC3 o ERY10-1 GPC3 (denominado modelo de premezcla).
Espedficamente, el ensayo de eficacia para ERY8-2 GPC3 utilizando el modelo de premezcla PC-10 se realizo de la siguiente manera. Las CMSP se aislaron de la sangre extrafda de voluntarios sanos. Las celulas NK se eliminaron de las CMSP utilizando microesferas CD56, humanas (MCAS Miltenyi biotec). La estirpe celular de carcinoma escamoso de pulmon humano PC-10 (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (5 x 106 celulas), CMSP humanas sin celulas NK (4,5 x 106 celulas) y matriz de membrana Matrigel Basement (BD) se mezclaron y luego se trasplantaron por via subcutanea a la region inguinal de ratones scid NOD (CLEA Japan Inc.; hembra, 7 semanas). El dfa del trasplante fue designado el dfa 0. El dfa antes del trasplante, se administro por via intraperitoneal un anticuerpo anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries) a los ratones a 0,2 mg/cabeza. Despues de dos horas de trasplante, se administro por via intraperitoneal ERY8-2 GPC a 30 pg/cabeza. ERY8-2 GPC se administro cinco veces en total durante el periodo de dfas 0 a 4.
Ademas, el ensayo de eficacia para ERY10-1 GPC3 utilizando el modelo de premezcla PC-10 se realizo de la siguiente manera. Las CMSP se aislaron de la sangre extrafda de voluntarios sanos. Las celulas NK se eliminaron de las CMSP utilizando microesferas CD56, humanas (MCAS Miltenyi biotec). La estirpe celular de carcinoma escamoso de pulmon humano PC-10 (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (5 x 106 celulas), CMSP humanas sin celulas nK (4,5 x 106 celulas) y matriz de membrana Matrigel Basement (BD) se mezclaron y luego se trasplantaron por via subcutanea a la region inguinal de ratones scid NOD (CLEA Japan Inc.; hembra, 7 semanas). El dfa del trasplante fue designado el dfa 0. El dfa anterior al trasplante, se administro por via intraperitoneal a los ratones un anticuerpo anti-asialo-GM1 (Wako Pure Chemical Industries) a 0,2 mg/cabeza. Despues de dos horas de trasplante, se administro por via intraperitoneal ERY10-1 GPC a 30 pg/cabeza. ERY10-1 GPC se administro 13 veces en total durante los periodos de los dfas 0 a 4, los dfas 7 a 11 y los dfas 14 a 16.
El resultado mostro que en los grupos de administracion ERY8-2 GPC3 y ERY10-1 GPC3, el crecimiento del tumor se suprimio claramente en comparacion con el grupo de administracion de disolvente (TFS) (Figs. 6 y 7).
Ademas, ERY10-1 GPC3 tambien se evaluo para la eficacia in vivo utilizando un modelo alternativo. Espedficamente, las celulas T se cultivaron cultivando CMSP humanas in vitro y luego se introdujeron en ratones scid NOD que habfan desarrollado tumores originados a partir de PC-10 trasplantado. Los ratones se trataron administrando ERY10-1 GPC3 (denominado modelo de transferencia de celulas T).
Espedficamente, el ensayo de eficacia para ERY10-1 GPC3 utilizando el modelo de transferencia de celulas T PC- 10 se realizo de la siguiente manera. El cultivo de expansion de celulas T se llevo a cabo utilizando un kit de activacion/expansion de celulas T/humano (MACS Miltenyi biotec) y CMSP aisladas de sangre extrafda de voluntarios sanos. Las celulas PC-10 de la estirpe celular de carcinoma escamoso de pulmon humano (Immuno- Biological Laboratories Co., Ltd.) (1 x 107 celulas) se mezclaron con matriz de membrana Matrigel Basement (BD), y luego se transplantaron subcutaneamente a la region inguinal de ratones scid NOD (CLEA Japan Inc.; hembra, 7 semanas). El dfa del trasplante fue designado el dfa 0. El dfa antes del trasplante y los dfas 6, 8, 12, 16 y 20, se administro por via intraperitoneal a los ratones un anticuerpo anti-asialo-GM1 (Wako Pure Chemical Industries) a 0,2 mg/cabeza. En el dfa 6 de trasplante, los ratones se agruparon por el tamano del tumor y el peso corporal, y luego las celulas T preparadas por cultivo de expansion como se ha descrito anteriormente se trasplantaron a 1 x 107 celulas/cabeza en la cavidad peritoneal. Despues de dos horas de trasplante, se administro ERY10-1 GPC por via intraperitoneal a 30 pg/cabeza. ERY10-1 GPC se administro cinco veces en total en los dfas 7, 8, 12, 16 y 17.
El resultado mostro que el grupo de administracion ERY10-1 GPC3 de este modelo tambien exhibio un claro efecto antitumoral en comparacion con el grupo de administracion de disolvente (Fig. 8).
El hallazgo descrito anteriormente demuestra que una serie de moleculas en las que se anade un scFv de un anticuerpo epsilon anti-CD3 a una cadena principal de IgG que tiene un Fc silencioso exhibe un efecto anti-tumoral in vivo.
(3) Evaluacion de la retencion de plasma.
Con el fin de evaluar si las moleculas tales como ERY8-2 GPC3, ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 tienen una semivida en plasma considerablemente mayor que BiTE GPC3, ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 se administraron a 30 pg/cabeza a ratones scid NOD a los que no se les habfan trasplantado celulas cancerosas y se midieron sus concentraciones plasmaticas con el tiempo.
Espedficamente, el analisis de PK se llevo a cabo de la siguiente manera. ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 se administraron por via intraperitoneal a ratones scid NOD (CLEA Japan Inc.; hembra, 8 semanas) a 30 pg/cabeza. La sangre se extrajo de la vena bucal de los ratones utilizando capilares de hematocrito (Terumo) a los 15 minutos, dos horas, 1 dfa, 2 dfas y 7 dfas despues de la administracion. El plasma se preparo a partir de la sangre.
ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 se diluyeron apropiadamente y se anadieron a las celulas Ba/F3 que expresan
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GPC3 (GPC3/BaF) o a las celulas Ba/F3 que expresan epsilon CD3 (CD3/BaF) para permitir que ERY9-1 GPC3 o ERY10-1 GPC3 reaccionen con GPC3/BaF y cD3/BaF. Despues de lavar estas celulas, se anadio un anticuerpo secundario marcado con FITC para una reaccion adicional. Despues de lavar las celulas, la intensidad de fluorescencia de la etiqueta en las celulas se midio utilizando un citometro de flujo Epics XL (Beckman Coulter) para preparar una curva de calibracion para cada anticuerpo.
Con el tiempo, se extrajo sangre de los ratones a los que se les habfa administrado ERY9-1 GPC3 o ERY10-1 GPC3. El plasma se preparo a partir de la sangre y se diluyo apropiadamente. De la misma manera que para la preparacion de las curvas de calibracion descritas anteriormente, las muestras de plasma se hicieron reaccionar con GPC3/BaF o CD3/BaF para determinar la cantidad de plasma ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 unida a cada celula. La concentracion plasmatica de cada anticuerpo se calculo utilizando valores determinados y las curvas de calibracion descritas anteriormente.
El resultado mostro que la concentracion en sangre de ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 permanecio superior a 10 nM despues de dos dfas de la administracion (Figs. 9 y 10). Este hallazgo demuestra que las moleculas como ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 tienen una semivida plasmatica significativamente mejorada en comparacion con BiTE.
(4) Efecto de Fc silencioso en la induccion de citoquinas independiente del antigeno canceroso (4-1) Construccion de ERY15-1 GPC3 con Fc de union a FcgR
ERY15-1 GPC3 que tiene un Fc de union a FcgR (Fig. 17J) se construyo para someter a ensayo si las moleculas tales como ERY8-2GPC3, ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GpC3 inducinan citoquinas de manera independiente del antigeno canceroso.
Espedficamente, como en el metodo descrito anteriormente, la PCR que utiliza cebadores que contienen secuencias adicionales apropiadas y un metodo conocido por los expertos en la tecnica, tal como un metodo que utiliza el kit de mutagenesis dirigida al sitio de QuikChange (Stratagene), se realizo para construir vectores de expresion en los cuales se inserto un polinucleotido que codifica GPC3 ERY15-1_Hh (sEq ID NO: 47; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) o GPC3 ERY15- 1_Hk (SEQ ID NO: 48; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirven como una secuencia de senal.
Los vectores de expresion para GPC3 ERY15-1_Hh (SEQ ID NO: 47; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY15-1_Hk (SEQ ID NO: 48; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y ERY7_L GPC3 se co-introdujeron en las celulas FreeStyle293-F para expresar ERY15-1 GPC3 de forma transitoria. El sobrenadante de cultivo resultante se cargo en una columna Anti FLAG M2 (Sigma). Despues del lavado, la columna se eluyo con 0,1 mg/ml de peptido FLAG (Sigma). Una fraccion que contema ERY15-1 GPC3 se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un gradiente de concentracion de imidazol. Una fraccion que contema ERY15-1 GPC3 se concentro por ultrafiltracion. Luego, la fraccion se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solo se recogio una fraccion monomerica de ERY15-1 GPC3 del eluato para obtener ERY15-1 GpC3 purificado.
(4-2) Ensayo de la capacidad inductora de citoquinas independiente del antfgeno canceroso
La capacidad inductora de citoquinas independiente del antfgeno canceroso de ERY15-1 GPC3 se comparo con las de BiTE GPC3, ERY9-1 GPC3, ERY10-1 GPC3 y catumaxomab. Utilizando el metodo descrito anteriormente, se prepararon CMSP a partir de sangre extrafda de voluntarios sanos. Se anadieron cincuenta pl de cada anticuerpo ajustado a 40 nM a 50 pl de suspension de CMSP humanas (2 x 105 celulas/pocillo), y luego se anadieron 100 pl de SFB al 10 %/D-MEM. La mezcla de reaccion se incubo con gas dioxido de carbono al 5 % a 37 °C. Despues de 72 horas de incubacion, se recogio el sobrenadante de cultivo y se cuantificaron las citoquinas secretadas en el sobrenadante de cultivo mediante un ensayo matriz de perlas citometricas (MPC) utilizando el kit Th1/Th2/Th17 humano (BD). El ensayo se llevo a cabo por triplicado por el metodo segun el protocolo adjunto.
Como resultado, ERY15-1 GPC3 y catumaxomab, que tienen un Fc de union a FcgR, mostraron una clara induccion de citoquinas. Por el contrario, no se observo induccion de citoquinas para BiTE GPC3, que no tiene Fc, y ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3, que poseen un Fc silencioso (Fig. 11). Este resultado sugiere que las moleculas que tienen un Fc silencioso como ERY8-2 GPC3, ERY9-1 GPC3 y ERY10-1 GPC3 son moleculas altamente seguras que no inducen citoquinas de forma independiente del antfgeno canceroso.
[Ejemplo 4] Construccion y evaluacion de ERY18 L1, L2, L3, L4 y S1 GPC3
Se evaluaron las moleculas que tienen un dominio de union a CD3 diferente de la estructura scFv. Se construyo ERY18 GPC3 (Fig. 17K) en el que los dominios VP y VL de un anticuerpo anti-CD3 se vincularon a los extremos C- terminales de las dos cadenas P de una IgG antigenica anti-cancengena (GPC3). En esta construccion, se produjeron una serie de moleculas (ERY18 L1, L2, L3 y L4 GPC3) que tienen de una a cuatro unidades enlazadoras
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(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) en la union. Al mismo tiempo, se construyo otra molecula (ERY18 S1 GPC3) en la que los aminoacidos en las posiciones apropiadas se sustituyeron con Cys para permitir la introduccion de un enlace disulfuro.
Espedficamente, se realizo un metodo conocido por los expertos en la tecnica, como la PCR que utiliza cebadores que contienen secuencias adicionales apropiadas como en el metodo descrito anteriormente, para construir una serie de vectores de expresion en los que se inserto un polinucleotido que codifica GPC3 ERY18 L1_Hh (SEQ ID NO: 49; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY18 L1_Hk (SEQ ID NO: 50; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como secuencia de senal), GPC3 ERY18 L2_Hh (SEQ ID NO: 51; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como secuencia de senal), GPC3 ERY18 L2_Hk (SEQ ID NO: 52; la secuencia madura no contienen los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY18 L3_Hh (SEQ ID NO: 53; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senales), GPC3 ERY18 L3_Hk (SEQ ID NO: 54; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY18 L4_Hh (SEQ ID NO: 55; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY18 L4_Hk (SEQ ID NO: 56; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY18 S1_Hh (SEQ ID NO: 57; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como secuencia de senal), o GPC3 ERY18 S1_Hk (SEA ID NO: 58; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
Las siguientes combinaciones de vectores de expresion se introdujeron en las celulas FreeStyle293-F para expresar cada molecula disenada de forma transitoria.
G. Molecula disenada: ERY18 L1 GPC3
Vectores de expresion: GPC3 ERY18 L1_Hh (SEQ ID NO: 49; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una senal de secuencia), GPC3 ERY18 L1_Hk (SEQ ID NO: 50; la secuencia madura no contiene los aminoacidos 19 amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y ERY7 L GPC3.
H. Molecula disenada: ERY18 L2 GPC3
Vectores de expresion: GPC3 ERY18 L2_Hh (SEQ ID NO: 51; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una senal de secuencia), GPC3 ERY18 L2_Hk (SEQ ID NO: 52; la secuencia madura no contiene los aminoacidos 19 amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y ERY7 L GPC3.
I. Molecula disenada: ERY18 L3 GPC3
Vectores de expresion: GPC3 ERY18 L3_Hh (SEQ ID NO: 53; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY18 L3_Hk (SEQ ID NO: 54; la secuencia madura no contiene los aminoacidos 19 amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y ERY7 L GPC3.
J. Molecula disenada: ERY18 L4 GPC3
Vectores de expresion: GPC3 ERY18 L4_Hh (SEQ ID NO: 55; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY18 L4_Hk (SEQ ID NO: 56; la secuencia madura no contiene los aminoacidos 19 amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y ERY7 L GPC3.
K. Molecula disenada: ERY18 S1 GPC3
Vectores de expresion: GPC3 ERY18 S1_Hh (SEQ ID NO: 57; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY18 S1_Hk (SEQ ID NO: 58; la secuencia madura no contiene los aminoacidos 19 amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y ERY7 L GPC3.
El sobrenadante de cultivo resultante se cargo en una columna Anti FLAG M2 (Sigma). Despues del lavado, la columna se eluyo con 0,1 mg/ml de peptido FLAG (Sigma). Una fraccion que contema la molecula disenada se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un gradiente de concentracion de imidazol. Una fraccion que contema la molecula disenada se concentro por ultrafiltracion. Luego, la fraccion se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solamente se recogio una fraccion de monomero del eluato para obtener cada molecula disenada purificada.
Las moleculas ERY18 L1 GPC3, ERY18L2 GPC3, ERY18L3 GPC3, ERY18L4 GPC3 y ERY18S1 GPC3 se
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evaluaron para determinar su actividad citotoxica in vitro (Figs. 12 y 13). El resultado mostro que todas las moleculas, excepto ERY18 L1 GPC3, teman una actividad comparable a la de ERY10-1 GPC3. Este resultado demuestra que las moleculas que tienen una estructura sin scFv tienen una actividad citotoxica comparable. Se espera que la estructura en la que los dominios VP y VL del anticuerpo CD3 estan vinculados al extremo C-terminal de dos cadenas P de una IgG antigenica anti-cancengena (GPC3) contribuya a la estabilizacion de los complejos polipepffdicos de la presente invencion.
[Ejemplo 5] Construccion y evaluacion de ERY19-3 GPC3
A continuacion, se evaluaron las moleculas que tienen un dominio de union a CD3 tipo Fab. Se construyo ERY19-3 GPC3 (Fig. 17L) en el que los dominios VP y CH1, y los dominios VL y CL del anticuerpo CD3 se vincularon cada uno al extremo C-terminal de las dos cadenas P de un anticuerpo IgG antigenica cancerosa (GPC3). Espedficamente, mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica, como la PCR que utiliza cebadores que contienen secuencias adicionales apropiadas de la misma manera que en el metodo descrito anteriormente, se construyeron vectores de expresion en los que se inserto un polinucleotido que codifica GPC3 ERY19-3_Hh (SEQ ID NO: 59; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) o GPC3 ERY19-3_Hk (SEQ ID NO: 60; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
Los vectores de expresion para GPC3 ERY19-3_Hh (SEQ ID NO: 59; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), GPC3 ERY19-3_Hk (SEQ ID NO: 60; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), y ERY7_L GPC3 se co-introdujeron en celulas FreeStyle293-F para expresar ERY19-3 GPC3 de forma transitoria. El sobrenadante de cultivo resultante se cargo en una columna HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un acido. Una fraccion que contema ERY19-3 GPC3 se concentro por ultrafiltracion y luego se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solo se obtuvo una fraccion monomerica de ERY19-3 GPC3 del eluato para obtener ERY19-3 gPc3 purificado.
La molecula ERY19-3 GPC3 se evaluo para determinar su actividad citotoxica in vitro. El resultado mostro que la molecula tema una actividad comparable a BiTE GPC3 (Fig. 14). Se espera que el dominio de union a CD3 con una estructura similar a Fab contribuya a la estabilizacion de las moleculas del complejo polipepffdico de la presente invencion.
[Ejemplo 6] Preparacion de complejos polipepffdicos utilizando una etapa de purificacion de protema A sola mediante la introduccion de una mutacion en el dominio CH3 de ERY 10-1 GPC3
(1) Esbozo
En ERY10-1 GPC3 preparado en el Ejemplo 3, el dominio CH3 tiene la estructura de botones en ojales. La molecula ERY10-1 GPC3 deseada, en la que las dos cadenas P se asociaron heteromericamente entre sf, se purifico mediante dos tipos de purificacion por afinidad utilizando la etiqueta His y la etiqueta FLAG fijadas al extremo C- terminal de cada cadena P. Si la molecula ERY10-1 GPC3 se produce como un producto farmaceutico, la cromatograffa de protema A se realiza primero en el sobrenadante de cultivo de celulas que expresan ERY10-1 GPC3 para purificar un complejo polipepffdico que tiene un dominio Fc. Esta etapa debe ir seguida de una etapa de purificacion cromatografica adicional utilizando la cromatograffa por afinidad con etiqueta His y la cromatograffa por afinidad con etiqueta FLAG. Esto se traduce en un aumento de los costos para el proceso de purificacion. Por lo tanto, este Ejemplo examino modificaciones moleculares que permiten la purificacion de la molecula ERY10-1 GPC3 deseada que tiene las dos cadenas P asociadas heteromericamente mediante solo cromatograffa de protema A sin utilizar una etiqueta His y una etiqueta FLAG.
Espedficamente, se examinaron las modificaciones para eliminar la union de la protema A en una de las dos cadenas P. Como resultado de dichas modificaciones, cuando las cadenas P que no se unen a la protema A estan asociadas homomericamente, la molecula no puede unirse a la protema A y, por lo tanto, pasa a traves de la cromatograffa de protema A. Por otra parte, una molecula en la que una cadena P que no se une a la protema A esta asociada heteromericamente con una cadena P que se une a la protema A, y una molecula en la que las cadenas P que se unen a la protema A estan asociadas homomericamente, se puede separar utilizando cromatograffa de protema A basada en la diferencia en la afinidad para la protema A. Sin embargo, en el dominio Fc del anticuerpo, el sitio de union para la protema A se superpone con el sitio de union para FcRn, que es crucial para la retencion en plasma del anticuerpo. Por lo tanto, es necesario reducir selectivamente solo la actividad de union a la protema A, mientras se mantiene la actividad de union a FcRn. Como tal modificacion, se descubrio la sustitucion de His en la posicion 435 (numeracion de la UE) con Arg. La combinacion de esta mutacion con las mutaciones descritas en el documento WO 2006/106905 (sustituyendo Asp en la posicion 356 (numeracion de la UE) en una de las cadenas P con Lys, y Lys en la posicion 439 (numeracion de la UE) en la otra cadena P con Glu), que promueve la asociacion heteromerica de las dos cadenas P, se probo si se podfa permitir la purificacion de complejos polipepffdicos tales como ERY10-1 GPC3 utilizando solo la cromatograffa de protema A.
(2) Construccion de vectores de expresion genica de anticuerpos y expresion de anticuerpos respectivos.
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Para la region variable de la cadena P del anticuerpo, se construyo un gen que codifica GC33 (2)H (region variable de la cadena P del anticuerpo glipicana-3 antihumano, SEQ ID NO: 61; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos del amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica. De manera similar, para la cadena L del anticuerpo, se construyo un gen que codifica GC33- k0 (cadena L del anticuerpo glipicana-3 antihumano, SEQ ID NO: 62; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) por un metodo conocido por los expertos en la tecnica. A continuacion, para la region constante de la cadena P del anticuerpo, los genes descritos a continuacion se construyeron mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica.
L. Molecula disenada: LALA-G1d
LALA-G1d (SEQ ID NO: 63; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), en la que Leu en las posiciones 234 y 235 (numeracion de la UE) ha sido sustituido con Ala, Asn en la posicion 297 se ha sustituido con Ala, y Gly y Lys en el extremo C-terminal se ha eliminado en la secuencia de IgG1.
M. Molecula disenada: LALA-G1d-CD3
LALA-G1d-CD3 (SEQ ID NO: 64; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), en la que un scFv CD3 (region variable de la cadena P del anticuerpo CD3 antihumano y la region variable de la cadena L del anticuerpo CD3 antihumano se vinculan entre sf mediante un enlazador polipeptfdico) se ha vinculado al extremo C-terminal de LALA-G1d (SEQ ID NO: 63; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
N. Molecula disenada: LALA-G3S3E-G1d
LALA-G3S3E-G1d (SEQ ID NO: 65; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), en la cual His en la posicion 435 (numeracion de la UE) ha sido sustituido con Arg, y Lys en la posicion 439 (numeracion de la UE) se ha sustituido con Glu en la secuencia de LALA-G1d (SEQ ID NO: 63; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
O. Molecula disenada: LALA-S3K-G1d-CD3
LALA-S3K-G1d-CD3 (SEQ ID NO: 66; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), en la que Asp en la posicion 356 (numeracion de la UE) ha sido sustituida con Lys en la secuencia de LALA-G1d-CD3 (SEQ ID NO: 64; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
Los genes de la cadena P del anticuerpo GPC3 anti-humano NTA1L y NTA1R se construyeron vinculando LALA- G1d-CD3 o LALA-G1d corriente abajo de GC33(2)H, respectivamente. Mientras tanto, los genes de la cadena P del anticuerpo GPC3 anti-humano NTa2l y NTA2R se construyeron vinculando LALA-S3K-G1d-CD3 o LALA-G3S3E- G1d corriente abajo de GC33(2)H, respectivamente.
Los vectores de expresion para NTA1L, NTA1R, NTA2L, NTA2R (cadenas P) y GC33-k0 (cadena L) se construyeron insertando cada gen en un vector de expresion de celulas animales. Estos vectores se combinaron como se muestra a continuacion y se introdujeron en celulas FreeStyle293 (Invitrogen) mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica para expresar de forma transitoria los complejos polipeptfdicos descritos a continuacion. Como se muestra a continuacion, se hace referencia a los complejos polipeptfdicos por los nombres de genes introducidos combinados en el orden de [primera cadena P/segunda cadena P/cadena L].
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
(3) Purificacion de muestras expresadas y evaluacion de la formacion de complejos heteromericos
El sobrenadante de cultivo de celulas FreeStyle293 (en lo sucesivo denominado CM) que contiene un complejo polipeptfdico mostrado a continuacion se utilizo como una muestra.
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
El CM se filtro a traves de un filtro de 00,22 pm y se cargo en una columna de flujo rapido de sefarosa y protema A r (GE Healthcare) equilibrada con D-TFS. Las etapas de lavado 1 y 2 y la etapa de elucion 1 se llevaron a cabo utilizando los tampones mostrados en la Tabla 1. La cantidad de carga de CM se ajusto de modo que la cantidad de carga de anticuerpo fuera 20 mg/ml de resina. Las fracciones eluidas se recogieron y analizaron mediante cromatograffa de exclusion por tamanos para identificar los componentes en las fracciones.
[Tabla 1]
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EQUILIBRIO
D-TFS
LAVADO 1
Acetato de sodio 1 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5
LAVADO 2
HCl 0,3 mM, NaCl 150 mM, pH 3,7
ELUCION 1
HCl 2 mM, pH2,7
El resultado del analisis por cromatograffa de exclusion por tamanos de cada fraccion eluida se muestra en la Fig. 15 y en la Tabla 2. Los valores indican el porcentaje de area de pico de elucion. Cuando se expreso NTA1L/NTA1R/GC33-k0 o NTA2L/NTA2R/GC33-k0, el anticuerpo homomerico anti-GPC3 (NTA1L/GC33-k0 o NTA2L/GC33-k0) era casi indetectable en CM. Mientras tanto, el anticuerpo homomerico anti-GpC3 (NTA2R/GC33- k0) fue solo de aproximadamente 2 % en CM donde se expreso NTA2L/NTA2R/GC33-k0, mientras que fue de aproximadamente 76% en CM donde se expreso NTA1L/NTA1R/GC33-k0. Este resultado demuestra que, cuando His en la posicion 435 (numeracion de la UE) se sustituye con Arg y, para permitir la formacion eficiente de la molecula heteromerica de las respectivas cadenas P, Asp en la posicion 356 (numeracion de la UE) en la secuencia polipeptfdica de una de las cadenas P esta sustituida con Lys y Lys en la posicion 439 (numeracion de la UE) en la secuencia polipeptfdica de la otra cadena P esta sustituida con Glu, los complejos polipeptfdicos heteromericos que tienen la misma forma molecular que ERY10-1 GPC3 se pueden purificar de manera eficiente con una pureza de mas del 98 % solo mediante la etapa de purificacion utilizando la protema A.
[Tabla 2]
anticuerpo homomerico CD3 anticuerpo heteromerico anticuerpo homomerico GPC3
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
0,7 23,5 75,8
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
- 98,2 1,8
[Ejemplo 7] Construccion y evaluacion de ERY 17-2 GPC3 y ERY 17-3 GPC3
(1) Construccion de ERY 17-2 GPC3 y ERY 17-3 GPC3
A continuacion, se construyo una molecula utilizando una IgG antigenica anti-cancengena (GPC3) como una cadena principal y sustituyendo uno de los Fab con un dominio de union a epsilon CD3. Como en los casos descritos anteriormente, el Fc de la IgG de la cadena principal era un Fc silencioso que tema una actividad de union a FcgR (receptor Fcy) reducida. Para los dominios de union a epsilon CD3, los dominios VP y VL de Fab de epsilon anti- CD3 se intercambiaron para producir ERY17-2 GPC3 (Fig. 19A), y los dominios CH1 y CL se intercambiaron para producir ERY17-3 GPC3 (Fig. 19B).
Espedficamente, mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica, como la PCR que utiliza cebadores que contienen las mismas secuencias adicionales apropiadas que en el metodo descrito anteriormente, se construyeron una serie de vectores de expresion en los que se inserto un polinucleotido que codifica ERY17-2_Hh (SEQ ID NO: 73; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), ERY17-2_L (SEQ ID NO: 74; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), ERY17-3_Hh (SEQ ID NO: 75; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), o ERY17-3_L (SEQ ID NO: 76; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
Las siguientes combinaciones de vectores de expresion se introdujeron en las celulas FreeStyle293-F para expresar cada molecula disenada de forma transitoria.
P. Molecula disenada: ERY17-2GPC3
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17-2_Hh (sEq iD NO: 73; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una senal de secuencia), y ERY17-2_L (SEQ ID NO: 74; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
Q. Molecula disenada: ERY17-3 GPC3
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17-3_Hh (SEq iD NO: 75; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una senal de secuencia), y ERY17-3_L (SEQ ID NO: 76; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
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(2) Purificacion de ERY 17-2 GPC3 y ERY 17-3 GPC3
El sobrenadante de cultivo resultante se cargo en una columna Anti FLAG M2 (Sigma). Despues del lavado, la columna se eluyo con 0,1 mg/ml de peptido FLAG (Sigma). Una fraccion que contema la molecula disenada se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un gradiente de concentracion de imidazol. Una fraccion que contema la molecula disenada se concentro por ultrafiltracion. Luego, la fraccion se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solamente se recogio una fraccion de monomero del eluato para obtener cada molecula disenada purificada.
(3) Actividad citotoxica de ERY 17-2 GPC3 y ERY 17-3 GPC3
ERY 17-2 GPC3 y ERY 17-3 GPC3 se evaluaron para determinar su actividad citotoxica in vitro (Fig. 20). El resultado mostro que ambas moleculas exhibieron claramente una mayor actividad citotoxica que BiTE GPC3. Por lo tanto, la presente invencion por primera vez demuestra que las moleculas en las que se utiliza una IgG antigenica anti-cancengena como una cadena principal y uno de los Fab esta sustituido con un dominio de union a epsilon CD3 exhiben una actividad citotoxica comparable o mayor que la de BiTE.
(4) Ensayo de eficacia para ERY17-2 GPC3 utilizando el modelo de transferencia de celulas T PC-10
ERY17-2 GPC3, que demostro tener una actividad citotoxica comparable o superior a la de BiTE GPC3 en el ensayo in vitro, se evaluo la ineficacia in vivo utilizando el modelo de transferencia de celulas T PC-10. Espedficamente, el ensayo de eficacia de ERY17-2 GPC3 utilizando el modelo de transferencia de celulas T PC-10 se llevo a cabo de la siguiente manera. El cultivo de expansion de celulas T se llevo a cabo utilizando un kit de activacion/expansion de celulas T/humano (MACS Miltenyi biotec) y CMSP aisladas de sangre extrafda de voluntarios sanos. Las celulas PC- 10 de la estirpe celular de carcinoma escamoso de pulmon humano (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (1 x 107 celulas) se mezclaron con matriz de membrana Matrigel Basement (BD), y luego se transplantaron subcutaneamente a la region inguinal de ratones scid NOD (CLEA Japan Inc.; hembra, 7 semanas). El dfa del trasplante fue designado el dfa 0. El dfa antes del trasplante y los dfas 13, 17, 21 y 25, se administro a los ratones por via intraperitoneal un anticuerpo anti-asialo-GM1 (Wako Pure Chemical Industries) a 0,2 mg/cabeza. El dfa 13 despues del trasplante, los ratones se agruparon por el tamano del tumor y el peso corporal. En el dfa 14 despues del trasplante, las celulas T preparadas mediante cultivo de expansion como se ha descrito anteriormente se trasplantaron a 3 x 107 celulas/cabeza a la cavidad peritoneal. Despues de dos horas de trasplante, se administro ERY17-2 GPC por via intravenosa a 30 pg/cabeza. ERY17-2 GPC se administro cinco veces en total en los dfas 14, 15, 16, 17 y 18.
El resultado mostro que tambien se observo un claro efecto antitumoral en el grupo de administracion ERY17-2 GPC3 de este modelo, en comparacion con el grupo de administracion de disolvente (Fig. 21).
El descubrimiento descrito anteriormente demuestra que las moleculas en las que se utiliza una IgG antigenica anti- cancengena como cadena principal y uno de los Fab esta sustituido con un dominio de union a epsilon CD3 producen un claro efecto antitumoral in vivo.
[Ejemplo 8] Construccion y evaluacion de ERY17-2-M20 GPC3
(1) Construccion de ERY17-2-M20 GPC3
A continuacion, se construyo una molecula que conserva la actividad deseada incluso despues de las alteraciones en el dominio de union a epsilon de CD3. Se construyo ERY17-2-M20 GPC3 (Fig. 19A) en el que se altero la secuencia del dominio de union a epsilon de CD3. Espedficamente, utilizando como plantilla un vector de expresion para un anticuerpo anti-CD3 (M20), se realizo un metodo conocido por un experto en la tecnica, tal como pCr que utiliza cebadores que contienen las mismas secuencias apropiadas que en los metodos descritos anteriormente para producir una serie de vectores de expresion en los que se inserto un polinucleotido que codifica ERY17-2-M20_Hh (SEQ ID NO: 77; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) o ERY17-2-M20_L (SEQ ID NO: 78; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales (que sirve como secuencia de senal).
(2) Purificacion de ERY17-2-M20 GPC3
Los vectores de expresion para GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17-2-M20_Hh (SEQ ID NO: 77) y ERY17-2- M20_L (SEQ ID nO: 78) se co-introdujeron en celulas FreeStyle293-F para expresar ERY17-2-M20 GPC3 de forma transitoria. El sobrenadante de cultivo resultante se filtro a traves de un filtro de 00,22 pm y luego se cargo en una columna de flujo rapido de protema A r sefarosa equilibrada (GE Healthcare). El ERY17-2-M20 GPC3 purificado se obtuvo lavando las etapas 1 y 2, y la etapa de elucion 1 utilizando los tampones que se muestran en la Tabla 3.
[Tabla 3]
EQUILIBRIO
Medio de expresion FreeStyle 293 (Invitrogen), pen y estrep al 1 % (Invitrogen)
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35
40
45
LAVADO 1
Acetato de sodio 1 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5
LAVADO 2
HCl 0,3 mM, NaCl 150 mM, pH 3,7
ELUCION 1
HCl 2 mM, pH2,7
(3) Actividad citotoxica de ERY17-2-M20 GPC3
ERY17-2-M20 GPC3 se analizo para determinar su actividad citotoxica in vitro y mostro una actividad citotoxica comparable a la de ERY17-2 GPC3 (Fig. 22). Este descubrimiento demuestra que incluso las moleculas que tienen una secuencia alterada en el dominio de union a epsilon de CD3 tienen una actividad citotoxica comparable.
[Ejemplo 9] Construccion y evaluacion de ERY17-2 EpCAM y ERY17-3 EpCAM
(1) Construccion de ERY17-2 EpCAM y ERY17-3 EpCAM
A continuacion, se construyeron moleculas dirigidas a un antigeno canceroso diferente pero que reteman la actividad deseada. Se produjo ERY17-2 EpCAM (Fig. 19A), en el que el Fab anti-GPC3 en ERY17-2 GpC3 se reemplazo con un Fab anti-EpCAM, y ERY17-3 EpCAM (Fig. i9b), en el que el Fab anti-GPC3 en ERY17-3 GPC3 se reemplazo con un Fab anti-EpCAM. Espedficamente, utilizando como plantilla un vector de expresion para un anticuerpo anti- EpCAM, se realizo un metodo conocido por los expertos en la tecnica, como la PCR que utiliza cebadores que contienen las mismas secuencias apropiadas que en el metodo descrito anteriormente para producir una serie de vectores de expresion en los que se inserto un polinucleotido que codifica EpCAM ERY17_Hk (SEQ ID NO: 79; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) o EpCAM ERY17_L (SEQ ID NO: 80; la secuencia madura no contema los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal.
Las siguientes combinaciones de vectores de expresion se introdujeron en las celulas FreeStyle293-F para expresar cada molecula disenada de forma transitoria.
R. Molecula disenada: ERY17-2 EpCAM
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: EpCAM ERY17_Hk (SEQ ID NO: 79; la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), EpCAM ERY17_L (SEQ ID NO: 80; la secuencia no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), ERY17-2_Hh y ERY17-2_L
S. Molecula disenada: ERY17-3 EpCAM
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: EpCAM ERY17_Hk, EpCAM ERY17_L, ERY17-3_Hh y ERY17-3_L
(2) Purificacion de ERY17-2 EpCAM y ERY17-3 EpCAM
El sobrenadante de cultivo resultante se cargo en una columna Anti FLAG M2 (Sigma). Despues del lavado, la columna se eluyo con 0,1 mg/ml de peptido FLAG (Sigma). Una fraccion que contema la molecula disenada se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un gradiente de concentracion de imidazol. Una fraccion que contema la molecula disenada se concentro por ultrafiltracion. Luego, la fraccion se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solamente se recogio una fraccion de monomero del eluato para obtener cada molecula disenada purificada.
(3) Actividad citotoxica de ERY17-2 EpCAM y ERY17-3 EpCAM
ERY17-2 EpCAM y ERY17-3 EpCAM se analizaron para determinar su actividad citotoxica in vitro, y ambos mostraron una fuerte actividad citotoxica (Fig. 23). Por lo tanto, la presente invencion demuestra que las moleculas en las que se utiliza una IgG antigenica anti-cancengena como una cadena principal y uno de los Fabs esta sustituido con un dominio de union a epsilon de CD3 tienen una actividad citotoxica incluso cuando se ha cambiado el tipo de antfgeno canceroso.
[Ejemplo 10] Construccion y evaluacion de anticuerpos biespedficos con asociacion interfacial CH1/CL modulada
(1) Diseno de anticuerpo biespedfico.
Al introducir mutaciones en cada uno de los dominios CH1 y CL de un anticuerpo biespedfico y, por lo tanto, modular la asociacion interfacial CH1/CL con el uso de la repulsion de carga electrica en la interfaz CH1/CL, se puede permitir que ocurra una asociacion espedfica entre la cadena P y la cadena L anti-GPC3 y entre la cadena P y la cadena L anti-CD3. Para modular la asociacion interfacial CH1/CL utilizando repulsion de carga electrica, los residuos de aminoacidos en CH1 de las cadenas P o CL de las cadenas L fueron sustituidos con Lys, que esta
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cargada positivamente, o con Glu, que esta cargada negativamente.
(2) Construccion de vectores de expresion para genes de anticuerpos y expresion de anticuerpos respectivos.
Un anticuerpo biespedfico (fig. 24A) se creo modulando la asociacion interfacial CH1/CL del anticuerpo anti-CD3 M12 (cadena P, SEQ ID NO: 81; cadena L, SEQ ID NO: 82) y el anticuerpo anti-GPC3 GC33(2) (cadena P, SEQ ID NO: 83; cadena L, SEQ ID NO: 84) y la introduccion adicional de modificaciones de botones en ojales (KiH) (documento WO 1996/027011; Ridgway JB et al. (Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant AM et al. (Nat. Biotecnol. (1998) 16, 677-681)) para evitar que las cadenas P se asocien entre sf Tambien se construyo un anticuerpo biespedfico de control (Fig. 24B), en el que no se introdujeron ni la modulacion de la asociacion interfacial CH1/CL ni las modificaciones de botones en ojales (KiH). Espedficamente, los vectores de expresion que tienen como un inserto un polinucleotido que codifica M12_TH2h (SEQ ID NO: 85), en el que varios aminoacidos en CH1 de la cadena P de m12 (SEQ ID NO: 81) fueron sustituidos con Lys, o M12_TL17 (SEQ ID NO: 86), en la que varios aminoacidos en CL de la cadena L (SEQ ID NO: 82) se sustituyeron con Glu, se construyeron mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica. Asimismo, los vectores de expresion que tienen como inserto un polinucleotido que codifica GC33 (2) _TH13k (SEQ ID NO: 87) o GC33 (2) _TH15k (SEQ ID NO: 88), en los cuales varios aminoacidos en CH1 de la cadena P de GC33(2) (SEQ ID NO: 83) se sustituyeron con Glu, o Gc33 (2)_TL16 (SEQ ID NO: 89) o GC33(2)_TL19 (SEQ ID NO: 90), en el cual varios aminoacidos en CL de la cadena L (SeQ ID NO: 84) se sustituyeron con Lys, se construyeron mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica.
Las siguientes combinaciones de vectores de expresion se introdujeron en las celulas FreeStyle293-F para expresar cada molecula disenada de forma transitoria.
T. Molecula disenada: GM1
Vectores de expresion: M12_TH2h (SEQ ID NO: 85), M12_TL17 (SEQ ID NO: 86), GC33(2)_TH13k (SEQ ID NO:
87) y GC33(2)_TL16 (SEQ ID NO: 89)
U. Molecula disenada: GM2
Vectores de expresion: M12_TH2h (SEQ ID NO: 85), M12_TL17 (SEQ ID NO: 86), GC33(2)_TH15k (SEQ ID NO:
88) y GC33(2)_TL19 (SEQ ID NO: 90)
V. Molecula disenada: GM0
Vectores de expresion: cadena P de M12 (SEQ ID NO: 81), cadena L de M12 (SEQ ID NO: 82), cadena P de GC33(2) (SEQ ID NO: 83) y cadena L de GC33(2) (SEQ ID NO: 84).
Del sobrenadante de cultivo resultante, los anticuerpos se purificaron mediante un metodo conocido por los expertos en la tecnica utilizando flujo rapido de protema A r y sefarosa TM (GE Healthcare).
(3) Actividad citotoxica de GM1, GM2 y GM0
Los complejos polipeptfdicos GM1, GM2 y GM0 se evaluaron para determinar su actividad citotoxica in vitro. El resultado mostro que GM1 y GM2 exhibieron una actividad citotoxica comparable, y esta actividad fue claramente mayor que la de GM0 (Fig. 25). Por lo tanto, la presente invencion demuestra que la combinacion de la modulacion de la asociacion interfacial CH1/CL y las modificaciones de KiH permiten una produccion eficiente de anticuerpos biespedficos.
[Ejemplo 11] Construccion y evaluacion de ERY17-2 EGFR (1) Construccion de ERY17-2 EGFR
Ademas, se preparo una molecula que tiene la actividad deseada que se dirige a otro antfgeno cancerosa. Se construyo ERY17-2 EGFR (Fig. 19A) reemplazando el Fab anti-GPC3 de ERY17-2 GPC3 con el Fab anti-EGFR. Espedficamente, utilizando como plantilla un vector de expresion para un anticuerpo anti-EGFR, se realizo un metodo conocido por los expertos en la tecnica, como la PCR que utiliza cebadores que contienen las mismas secuencias apropiadas que en el metodo descrito anteriormente para producir una serie de vectores de expresion en los que se inserto el polinucleotido que codifica EGFR ERY17_Hk (SEQ ID NO: 91: la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal) o EGFR ERY17_L (SEQ ID NO: 92: la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal).
Las siguientes combinaciones de vectores de expresion se introdujeron en las celulas FreeStyle293-F para expresar cada molecula disenada de forma transitoria.
W. Molecula disenada: ERY17-2 EGFR
Polipeptidos codificados por polinucleotidos insertados en vectores de expresion: EGFR ERY17_Hk (SEQ ID NO: 91: la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal),
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EGFR ERY17_L (SEQ ID NO: 92: la secuencia madura no contiene los 19 aminoacidos amino terminales, que sirve como una secuencia de senal), ERY17-2_Hh y ERY17-2_L.
(2) Purificacion de ERY17-2 EGFR
Los sobrenadantes de cultivo resultantes se cargaron en una columna Anti FLAG M2 (Sigma). Despues del lavado, la columna se eluyo con 0,1 mg/ml de peptido FLAG (Sigma). Una fraccion que contema la molecula disenada se cargo en una columna HisTrap HP (GE Healthcare). Despues del lavado, la columna se eluyo con un gradiente de concentracion de imidazol. Una fraccion que contema la molecula disenada se concentro por ultrafiltracion. Luego, la fraccion se cargo en una columna Superdex 200 (GE Healthcare). Solamente se recogio una fraccion de monomero del eluato para obtener cada molecula disenada purificada.
(3) Actividad citotoxica de ERY17-2 EGFR
ERY17-2 EGFR se sometio a ensayo para la actividad citotoxica in vitro, y mostro una fuerte actividad citotoxica (Fig. 26). De este modo, la presente invencion demuestra que las moleculas en las que se utiliza una IgG antigenica anti- cancengena como cadena principal y uno de los Fabs esta sustituido con un dominio de union a epsilon de CD3 tienen una actividad citotoxica incluso cuando el antfgeno canceroso es GPC3 o EpCAM o el tipo de antfgeno canceroso se ha cambiado aun mas.
Aplicabilidad industrial
La presente invencion proporciona nuevos complejos polipeptfdicos que retienen la fuerte actividad antitumoral de BiTE y tienen una larga semivida en sangre, asf como excelentes propiedades de seguridad que no provocan la induccion de una tormenta de citoquinas independiente del antfgeno canceroso o similares. Cuando se sustituye el dominio de union a antfgeno de un complejo polipeptfdico de la presente invencion, los agentes terapeuticos que comprenden el complejo polipeptfdico como ingrediente activo para inducir la citotoxicidad celular, pueden atacar y danar varias celulas, incluidas las celulas cancerosas. Por consiguiente, varios canceres pueden ser tratados o prevenidos. Esto permite tratamientos deseables que son altamente seguros y convenientes, y reduce la carga ffsica de los pacientes.

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    1. Un complejo polipeptfdico que comprende:
    (1) un dominio de union al antigeno canceroso;
    (2) uno cualquiera de los dominios Fc de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25 y 26 en el que se muta un aminoacido(s) que forma(n) el dominio Fc, en donde el mutante del dominio Fc ha reducido la actividad de union al receptor Fcy por dicha mutacion en comparacion con el complejo polipeptidico de control que comprende el dominio Fc del mismo isotipo seleccionado de SEQ ID NOs: 23, 24, 25 y 26, y en donde el mutante del dominio Fc ha reducido la actividad de union a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA, y/o FcyRiIIB; y
    (3) un dominio de union a CD3,
    en donde el dominio de union a antigeno y el dominio de union a CD3 son cada uno un Fab monovalente, y en donde
    (i) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antigeno esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL;
    (ii) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antigeno esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CH1 y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab esta vinculado a un dominio CL;
    (iii) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1; el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CH1;
    (iv) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1; el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; el fragmento Fv de cadena ligera del Fab que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CH1; y el fragmento Fv de cadena pesada del Fab esta vinculado a un dominio CL;
    o
    (v) el fragmento Fv de cadena pesada de un Fab monovalente que forma el dominio de union a CD3 esta vinculado a uno de los polipeptidos que forman el dominio Fc a traves de un dominio CH1; el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CL; el fragmento Fv de cadena pesada del Fab que forma el dominio de union a antfgeno esta vinculado al otro polipeptido que forma el dominio Fc a traves de un dominio CL; y el fragmento Fv de cadena ligera del Fab esta vinculado a un dominio CH1.
  2. 2. El complejo polipeptfdico de la reivindicacion 1, en donde el dominio Fc comprende uno cualquiera de los aminoacidos a continuacion:
    la secuencia de aminoacido de posiciones 118 a 260 (numeracion de la UE) es la secuencia descrita en SEQ ID NO: 24; o
    la secuencia de aminoacido de posiciones 261 a 447 (numeracion de la UE) es la secuencia descrita en SEQ ID NO: 26.
  3. 3. El complejo polipeptfdico de la reivindicacion 1, en donde el dominio Fc comprende una mutacion en los aminoacidos de SEQ ID NO: 23 que forman el dominio Fc y en donde los aminoacidos que forman el dominio Fc comprenden una mutacion en una cualquiera de las siguientes posiciones:
    220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331 y 332 (numeracion de la UE).
  4. 4. El complejo polipeptfdico de la reivindicacion 3,
    i) en donde el dominio Fc esta en el dominio Fc que comprende una sustitucion del aminoacido en la posicion 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330 o 331 (numeracion de la UE) con el aminoacido en una posicion correspondiente (numeracion de la UE) en IgG2 o IgG4 correspondiente;
    o
    ii) en donde el dominio Fc comprende una mutacion de aminoacidos en la posicion 234, 235, o 297 (numeracion de la UE); y el(los) aminoacido(s) en la posicion 234, 235, y/o 297 es(son) sustituido(s) con alanina.
  5. 5. El complejo polipeptfdico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde las secuencias de dos polipeptidos que forman el dominio Fc son diferentes entre sf, y en donde el aminoacido en la posicion 349 es sustituido con cistema y el aminoacido en la posicion 366 (numeracion de la UE) es sustituido con triptofano entre los residuos de aminoacido de uno de los dos polipeptidos que forman el dominio Fc; y en donde el aminoacido en la posicion 356 es sustituido con cistema, el aminoacido en la posicion 366 es sustituido con serina, el aminoacido en la posicion 368 es sustituido con alanina, y el aminoacido en la posicion 407 (numeracion de la UE) es sustituido con valina entre los residuos de aminoacidos del otro polipeptido.
  6. 6. El complejo polipeptidico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde las secuencias de dos polipeptidos que forman el dominio Fc son diferentes entre sf, y en donde el aminoacido en la posicion 356 (numeracion de la UE) es sustituido con lisina entre los residuos de aminoacido de uno de los dos polipeptidos que forman el dominio Fc; el aminoacido en la posicion 439 (numeracion de la UE) es sustituido con acido glutamico en
    5 el otro polipeptido, y el aminoacido en la posicion 435 (numeracion de la UE) es sustituido con arginina entre los residuos de aminoacidos de cualquiera de los dos polipeptidos.
  7. 7. El complejo polipeptfdico de la reivindicacion 5 o 6, en donde la secuencia GK es delecionada de los extremos carboxiterminales de dos polipeptidos que forman el dominio Fc.
  8. 8. Un agente terapeutico para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer, que comprende como principio
    10 activo el complejo polipeptfdico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  9. 9. Un agente terapeutico para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer de la reivindicacion 8, en donde el cancer es cancer hepatico o cancer de pulmon.
    TOSADE (NHIBICION D6 CRECIMIENTO CELULAR
    imagen1
    FIG. 1
    TASADEINMIBJCION DE CRECIMIENTQ CitVUW (%)
    imagen2
    FIG. 2
    TASADE INHIBICION DE CRECIMIENTO CELULAR !
    imagen3
    FIG, 3
    imagen4
    TASADE INHIBICION DE CRECIMIENTO CELULAR
    imagen5
    FIG. 5
    VOLUMEN TUMORAL (mm5)
    imagen6
    imagen7
    FIG. 6
    VOLUMEN TUMORAL (mm5)
    imagen8
    0 10 20 30 40 50 60 70
    imagen9
    DIAS TRAS EL TRASPLANTE
    FIG. 7
    VOLUMEN TUMORAL (mm3)
    imagen10
    DIAS TRAS EL TRASPLANTE
    FIG. 8
    CONCENTRACION EN SANGRE (nM)
    imagen11
    FIG. 9
    CONCENTRACION EN SANGRE(nM)
    imagen12
    FIG. 10
    202
    FIG. 11
    imagen13
    imagen14
    imagen15
    imagen16
    imagen17
    PRODUCCION DE CITOQUINAS EN ELSOBRENADANTE DEL CULTIVO (pgj.nl)
    to oo
    imagen18
    imagen19

    CJ Efl L3 fcJ (2 m □

    F S3 ^ F F F F

    m ^ d* to
    mSAOi INHIBITION DE CRECIMliNTO CilULAR (%)
    140
    120
    100
    80
    60
    40
    20
    0
    -20
    imagen20
    0,001 0,0] 00 I
    CONCENTRATION DE ANTICUERPOS ("Oi
    rip 4 n
    I 1 * 1 mmm
    TASADE INHIBICION DE CRECIMIENTO CELULAR (%)
    imagen21
    FIG. 13
    TASADi INHiBICION DE CRECIMIENTO CELULAR (%)
    140
    120
    100
    80
    60
    40
    20
    0
    -20
    imagen22
  10. 0.001 0,01 0.1 1
    CONCENTRACION DE ANTICUERPOS Tr,'
    FIG. 14
    206
    A.
    NTAlL/NTAlR/GC33-kO
    B.
    NTA2L/NTA2R/GC33-kO
    imagen23
    MINUTOS
    FIG. 15
    imagen24
    imagen25
    imagen26
    FIG. 18
    imagen27
    TASADE INHIBICION DE CRECIMIENTO CELULAR
    imagen28
    FIG. 20
    VOLUMEN TUMORAL (mm
    imagen29
    DIAS TRAS EL TRASPLANTE DEL TUMOR
    FIG. 21
    213
    rl\j» dd
    CENTRACION DE ANTICUERPOS
    1 IS3
    m 00 o —Ak N> —Ik
    O
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    O
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    imagen30
    Q
    TftSADi INHIBICION DE CRECIMIENTO CELULAR
    imagen31
    FIG. 23
    215
    A
    B
    imagen32
    REGION VARIABLE DE LA CADENA P DEL ANTICUERPO DE ANTIGENO ANTI-CANCERIGENO (GPC3, EpCAM)
    o
    • REGION VARIABLE DE LA CADENA L DEL ANTICUERPO DE ANTIGENO ANTI-CANCERIGENO (GPC3, EpCAM)
    imagen33
    o
    REGION VARIABLE DE LA CADENA P DEL ANTICUERPO ANTI-CD3
    imagen34
    imagen35
    REGION VARIABLE DE LA CADENA L DEL ANTICUERPO ANTI-CD3
    REGION CONSTANTE DEL ANTICUERPO
    MUTACION DE Fc SILENCIOSA
    MUTACION OUE PROMUEVE LAASOCIACION DE Fc HETEROMERICA
    CONTROL DE INTERFAZ CH/CL
    FIG. 24
    216
    Z!
    p
    ho
    Ol
    CONCENTRACION DE ANTICUERPOS fnM)
    0,0001 0.001 0.01
    i
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    imagen36
    217
    FIG. 26
  11. 0.001 0.01 0,1 concentracion deanticuerpos inM)
    imagen37
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